細胞増殖方法ならびに組織の修復および再生のための医薬
【課題】
本発明の課題は、生体の組織の修復・再生のための安全かつ有効な医薬を提供するために、生体から採取された細胞を、生体外で迅速かつ大量に増殖させることである。
【解決手段】
したがって、本発明は、生体から採取された試料中の細胞を、培地中で培養して増殖させる方法であって、採取された試料に添加される抗凝固剤（例えば、ヘパリンもしくはヘパリン誘導体またはこれらの塩など）の量を該試料の容積に対して５Ｕ／ｍＬ未満とするか、または培養を開始する際の培地中の抗凝固剤の量を０．５Ｕ／ｍＬ未満とすることを特徴とする方法を提供する。
本発明の課題は、生体の組織の修復・再生のための安全かつ有効な医薬を提供するために、生体から採取された細胞を、生体外で迅速かつ大量に増殖させることである。
【解決手段】
したがって、本発明は、生体から採取された試料中の細胞を、培地中で培養して増殖させる方法であって、採取された試料に添加される抗凝固剤（例えば、ヘパリンもしくはヘパリン誘導体またはこれらの塩など）の量を該試料の容積に対して５Ｕ／ｍＬ未満とするか、または培養を開始する際の培地中の抗凝固剤の量を０．５Ｕ／ｍＬ未満とすることを特徴とする方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体から採取した細胞を生体外で迅速かつ大量に増殖させる方法、ならびにかかる方法によって増殖した細胞を含む生体組織の修復および再生のための医薬、ならびにかかる医薬を製造する方法に関する。この方法は、特に間葉系幹細胞の自家移植のために好適であり、特に神経系組織の修復および再生のために適用され得る。
【背景技術】
【０００２】
従来、損傷を受けた神経組織の機能回復は非常に困難と考えられてきたが、近年になって成熟脳においても自己増殖能と多分化能を保持する神経幹細胞が発見されたことを基に、中枢神経系においても再生医療の研究が精力的に行われている。幹細胞を用いる再生医療として最も実用化に近いと考えられているのは、損傷された細胞の補充をおこなう細胞療法である。細胞療法においては、ドナーから提供される細胞（以下、ドナー細胞）を生体外で培養、増殖、および／または分化誘導し、適切な形態においてレシピエントの生体内へ投与することによって、レシピエントの損傷された組織細胞を補充する。
【０００３】
脳神経疾患に対しては、神経系細胞への分化能を有する細胞を組織から抽出後培養し個体へ移植することが、虚血モデル、外傷モデルなどにおいて試みられている。例えば、本発明者らは、骨髄細胞中に神経細胞へ分化し得る細胞を含む細胞分画が存在することを既に見出しており、さらに、ラット脊髄脱髄モデルへこれらの細胞を移植すると脱髄された神経軸索が再有髄化することを確認している（特許文献１）。
【０００４】
疾患の治療、特に、脳梗塞による虚血脳疾患など急性期の症状を有する疾患の治療に用いる場合、ドナー細胞を迅速かつ大量に増殖させることが重要である。生体外で細胞を増殖させるために、細胞の生存率を向上させ、増殖率を高めるために、様々な試みがなされている。
【０００５】
例えば、細胞の増殖率の改善のために、種々の増殖促進物質を添加した培地が使用されている。例えば、特許文献２においては、白血球阻害因子が細胞増殖の速度を増加させることが開示されており、特許文献３においては、造血細胞を増殖させるための組み替えヒト血清アルブミンを含む培地中が開示されている。特許文献４においては、ビタミンＣおよび塩基性繊維芽細胞増殖因子を含む培地中で間葉系幹細胞を培養する方法が開示されている。他の増殖因子（例えば、上皮細胞増殖因子、神経細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、トロンボポエチン、インターロイキンなど）の使用もまた公知である。
【０００６】
より細胞増殖率を高めるような培養基質の開発もなされている。例えば、特許文献５においては、基底膜細胞外基質上で間葉系幹細胞を培養する方法が開示されている。
【０００７】
また、血清も増殖を促進する物質として一般的に使用される。従来、幹細胞の培養においては、細胞増殖因子として１０〜２０％程度のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を始めとする異種動物血清を添加した培地が広く使用されている。しかし、ＦＢＳのような動物血清はロットによる組成の差が大きく、また、ウイルス、プリオンなどの病原体混入の危険性も問題となっている。
【０００８】
このような問題に対応すべく、血清を添加しない培地もまた開発されている（例えば、特許文献２、特許文献３などを参照のこと）。しかし、無血清培地における培養では、血清添加培地と同等の増殖を得ることは困難であるのが現状である。
【０００９】
一方、ヒト血清を使用する試みにおいては、倫理的観点から胎児血清の使用は困難であるため、成人ヒト血清が使用される（例えば、特許文献６〜８を参照のこと）。成人血清を使用する上での利点は、ドナー細胞を採取した個体と同一の個体の血清を用いることが可能な点であり、適合性および安全性の観点から非常に好ましい。
【００１０】
成人血清を使用する場合の問題点は、例えばＦＢＳと比較した場合の増殖促進活性の低さである。成人血清は単独では充分な細胞増殖促進活性を示さず、ＦＢＳと同程度の増殖を得るためには、さらにＦＢＳを添加するか（特許文献６）または他の増殖因子の添加が不可欠である（特許文献７）。しかしながら、増殖因子などの添加によりＦＢＳと同等の効果が得られた場合においてですら、先に述べたような急性期の疾患の治療に対応し得るような迅速かつ大量の増殖は得られていない。
【００１１】
一方、従来、生体から採取した細胞を培養・増殖させる方法においては、血液成分を含む組織または細胞をドナーから採取する際に、血液凝固を阻止するために、ヘパリンが添加される（例えば、特許文献９、非特許文献１、および非特許文献２などを参照のこと）。代表的な場合（例えば、通常の骨髄移植における骨髄細胞採取）においては、細胞液の容積に対するヘパリンの投与量は、数十Ｕ／ｍＬ（約２０〜４０Ｕ／ｍＬ）程度であり、例えば特許文献８は、ヘパリンを５〜１５Ｕ／ｍＬ程度の範囲で含有するヘパリン／緩衝液を骨髄液に添加することを開示している。特許文献２においては、さらに培養培地中にもヘパリンを含有させる方法が開示されている。
【００１２】
ヘパリンは、上記のような血液凝固防止の用途の他に、増殖助剤としてもまた用いられており、例えば特許文献４において、ヘパリンには塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とそのレセプターとの親和性を高める作用があることが開示されている。また、特許文献１０は、ヘパリンを含む硫酸化グリコサミノグリカンの改変体を、神経幹細胞増殖助剤として開示している。しかしながら、これらヘパリンを用いる方法においても、なお十分に迅速かつ大量の増殖率は達成し得ないのが現状である。
【特許文献１】国際公開第WO02/00849A1号パンフレット
【特許文献２】特表2002-518990号公報
【特許文献３】特開2005-204539号公報
【特許文献４】特開2006-136281号公報
【特許文献５】特開2003-52360号公報
【特許文献６】特開平10-179148号公報
【特許文献７】特開2003-235548号公報
【特許文献８】特開2006-55106号公報
【特許文献９】国際公開第WO01/48147A1号パンフレット
【特許文献１０】特開2005-218308号公報
【非特許文献１】高久史麿著、「骨髄移植マニュアル」、初版、内外医学社、1996年、86頁
【非特許文献２】三浦恭定編、「血液幹細胞培養法」、改訂２版１刷、内外医学社、1989年、38頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の課題は、細胞移植のために生体外で細胞を増殖させる場合において、従来技術の問題を解決し、かつ従来の方法より高い増殖率を得、迅速かつ大量に細胞を増殖することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、細胞培養における種々の条件および手順を検証する中で、通常は血液凝固防止の目的で用いられるヘパリンに着目して研究を進めたところ、ヘパリンが細胞増殖に対して著しい阻害作用を及ぼしているという知見を得、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、生体から採取された試料中の細胞を、培地中で培養し増殖させる方法であって、細胞が抗凝固剤と実質的に接触しない、前記方法に関する。
また、本発明は、採取された試料に添加される抗凝固剤の量を該試料の容積に対して５Ｕ／ｍＬ未満とする、前記方法に関する。
さらに、本発明は、培養を開始する際の培地中の抗凝固剤の量を０．５Ｕ／ｍＬ未満とする、前記方法に関する。
また、本発明は、前記抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体またはこれらの塩である、前記細胞増殖方法に関する。
【００１６】
本発明は、血清を含む培地中で細胞を増殖させる、前記方法に関する。
また、本発明は、細胞が由来する動物と同種の動物個体の血清を含有する培地中で細胞を増殖させる、前記方法に関する。
さらに、本発明は、自己血清を含有する培地中で細胞を増殖させる、前記方法に関する。
本発明はまた、培地中の血清含有量が１〜２０容積％である、前記方法に関する。
【００１７】
本発明は、幹細胞を増殖させる、前記方法に関する。
また、本発明は、間葉系幹細胞を増殖させる、前記方法に関する。
さらに、本発明は、ヒトの細胞を増殖させる、前記方法に関する。
本発明は、幹細胞を未分化な状態で増殖させる、前記方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、培地中の間葉系幹細胞の密度が５，５００個／ｃｍ２以上になった時点で継代培養させる、前記方法に関する。
さらに、本発明は、培地の交換を少なくとも週１回は行う、前記方法に関する。
本発明は、細胞の総数が１００，０００，０００個以上になるまで継代培養を繰り返し行う、前記方法に関する。
【００１９】
本発明は、前記のいずれかの方法によって培養された細胞を用いて組織修復・再生用医薬を製造する方法に関する。
また、本発明は、前記のいずれかの方法によって培養された細胞を含む組織修復・再生用医薬に関する。
本発明は、組織が神経系組織であり、細胞が自家の間葉系幹細胞であり、静脈内投与、腰椎穿刺投与、脳内投与、脳室内投与、または動脈内投与される、虚血性神経疾患の処置のための前記医薬に関する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、従来では細胞増殖に必須または有用と考えられてきた抗凝固剤をごく微量で添加するか、または抗凝固剤を実質的に添加せず培養を行うことによって著しい増殖率の改善が得られるという、これまでの常識からは全く予測し得ない驚くべき効果を奏する。ヘパリンなどの抗凝固剤が細胞増殖に作用する機序については必ずしも明らかではないが、抗凝固剤が細胞に添加されると、細胞表面に結合し、これが培養時の細胞の基質への接着を阻害し、それによって細胞の増殖を阻害するなどが一因として考えられるところ、抗凝固剤を実質的に存在させないことにより、細胞増殖が飛躍的に向上したものと推測される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明による細胞増殖の方法について、詳細に説明する。
本発明の方法は、生体から採取された試料中の細胞を、培地中で培養して増殖させる方法であって、細胞が抗凝固剤と実質的に接触しないことを特徴とする。
【００２２】
本発明において用いられる試料とは、増殖能を有し、および／または組織の修復・再生のために有用な細胞を含む体液および／または組織であって、例えば、骨髄液、血液（末梢血もしくは臍帯血）またはリンパ液などの体液、筋肉組織、骨組織、皮膚、リンパ系組織、脈管、または消化器などの組織、または胚（ヒト胚を除く）などが挙げられる。生体から採取された試料は、その試料全体をそのまま、または必要に応じて処理（例えば、不要な成分の除去、特定の細胞分画の精製、酵素処理など）を行い、本発明による増殖方法に供する。
【００２３】
本明細書において「細胞が抗凝固剤と実質的に接触しない」とは、細胞の採取から培養期間全体のいずれかの時点において使用する抗凝固剤の量を実質的に減少させることを意味し、例えば、抗凝固剤を、細胞採取のための容器（採血管など）の内壁を抗凝固剤溶液で濡らす程度に添加するか、もしくは全く添加しないか、または培養を開始する際に試料中の抗凝固剤を実質的に除去した場合に得られる状態を意味する。
【００２４】
より迅速かつ大量に細胞増殖を得るためには、試料を採取する際に添加される抗凝固剤の量が少ないことが好ましく、採取した細胞は、凝血を避けるために採取後速やか（３０分以内）に培養工程に移行させる。より好ましくは、細胞と抗凝固剤とが実質的に接触しないようにする。以上の操作により、従来のおよそ３〜１００倍という驚くべき増殖率が得られる。
【００２５】
本発明の好ましい態様においては、生体から採取された試料に添加される（すなわち、採取された試料が収められる採血管に予め添加される）抗凝固剤の量を、試料の容積に対して５Ｕ／ｍＬ未満、好ましくは２Ｕ／ｍＬ未満、さらに好ましくは０．２Ｕ／ｍＬ未満とする。
【００２６】
本発明の別の好ましい態様においては、生体から採取された試料中の細胞を培養する際に、培地中に存在する抗凝固剤の量が、培地の容積に対して０．５Ｕ／ｍＬ未満、好ましくは０．２Ｕ／ｍＬ未満、最も好ましくは０．０２Ｕ／ｍＬ未満である。より具体的には、培養を開始する際の抗凝固剤の量が培地の容積に対して０．５Ｕ／ｍＬ未満になるように、予め試料採取のための採血管に投与する抗凝固剤の量を抑えるか、および／または、培地中に添加する抗凝固剤の量を調整する。
【００２７】
また、本明細書において「抗凝固剤」とは、体液中または培地中に存在する場合、細胞表面に結合して、細胞外マトリクスに存在する抗血液凝固作用を有するタンパク質と相互作用し、細胞と細胞外マトリクス、細胞同士または細胞と基質とが接着することを阻害する物質を指し、典型的には、例えば、ヘパリンおよびヘパリン誘導体（例えば、特開2005-218308A号公報において開示される、ヘパリンを構成するＤ−グルコサミンの６位を脱硫酸したグリコサミノグリカンなど）またはそれらの塩が用いられる。
【００２８】
本発明の方法において細胞を増殖させるための培地は、細胞培養の分野において通常使用される培地であれば特に限定されないが、より迅速かつ大量の増殖を得るためには、血清含有培地が好ましい。血清含有培地は、本明細書において以下の他の箇所に記載するような標準培地を基に、培地に対して１２％未満の量で血清を加えたものを使用する。血清を提供する個体の負担を考えると血清量は少なければ少ないほど好ましいが、所望の迅速な細胞増殖促進作用が得られる範囲内であることを考慮すると、１％〜２０容積％であることが好ましく、より好ましくは３〜１２％であり、さらに好ましくは５〜１０％である。
【００２９】
本発明の方法において使用される血清は、哺乳動物の血清であり、好ましくは培養される細胞が由来する動物と同種の動物個体の血清（同種血清）であるが、さらに好ましくは培養される細胞が由来する個体の血清（自己血清）であるが、これらに限定されない。培養される細胞がヒト細胞である場合、成人ヒト血清が使用されることが好ましいが、採取が困難である場合、異種動物血清（例えばＦＢＳ）を使用してもよい。ただし、例えばＦＢＳに比べ、ヒト血清を用いた場合に、抗凝固剤を添加しないことによる本発明の効果は、より顕著に現れる。血清は、末梢血由来の血清であっても、臍帯血由来の血清であってもよい。血清は、細胞の由来する個体の血清（自己血清）であることが好ましいが、採取が困難である場合は同種の他個体の血清（他家血清）でもよい。
【００３０】
本発明の方法によって増殖させる細胞は、血液成分を含む試料から調製し、付着させて培養する細胞であればよく、例えば、間葉系細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、角膜幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞などの体性幹細胞、胎児幹細胞などの胚性幹細胞単核細胞（ヒト胚を除く）の他、骨芽細胞、繊維芽細胞、靱帯細胞、上皮細胞、血管内皮細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の方法は、その一態様において、幹細胞を増殖させるために好適であり、例えば、間葉系幹細胞を増殖させるために用いられる。
間葉系幹細胞とは、間葉系組織の間質細胞の中に微量に存在する多分化能および自己複製能を有する幹細胞であり、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などの結合組織細胞に分化するだけでなく、神経細胞や心筋細胞への分化能を有することが近年見出されている。
【００３２】
一態様において、本発明の方法を、ヒトの細胞を増殖させるために用いてもよい。
本発明の別の態様において、増殖させる細胞はヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、チンパンジーなどの霊長類、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなど）の細胞であってもよい。
【００３３】
さらに、本発明の方法の一態様において、幹細胞を未分化な状態で増殖させてもよい。
一般に、幹細胞は、未分化な状態の方が増殖率および生体内導入後の生存率が高い。例えば、虚血性脳疾患の処置など、迅速かつ大量の細胞増殖が必要とされる場合においては、採取した幹細胞を未分化な状態のままで増殖させることによって、短期間に必要な細胞数を得ることができる。
あるいは、一定の細胞種へ分化した細胞が所望である場合、幹細胞または芽細胞を未分化な状態で大量に増殖させ、次いで、所望の細胞種への分化を誘導する既知の成長因子の添加またはかかる性質を有する遺伝子の導入などによる分化誘導を行うことによって、大量の分化した細胞を得てもよい。
【００３４】
本発明の一態様において、培地中の間葉系幹細胞の密度が５，５００個／ｃｍ２以上になった時で継代培養させることが好ましい。
培地における細胞の密度は、細胞の性質および分化の方向性に影響を与える。例えば、間葉系幹細胞を培養する場合、培地中の細胞の密度が８，５００個／ｃｍ２を超えると、細胞の性質が変化してしまうため、最大でも８，５００個／ｃｍ２以下で継代培養させることが好ましく、より好ましくは、５，５００個／ｃｍ２以上になった時点で継代培養させる。
【００３５】
また、本発明の好ましい態様において、培地は、少なくとも週１回交換する。
培地の交換は、細胞の培養および増殖に必要な栄養素、成長因子、増殖因子などを供給するため、また、細胞の代謝によって生成する乳酸などの老廃物を除去し、培地のｐＨを一定に保つために必要である。培地交換の周期は、細胞の種類、培養条件などに依存して選択されるが、特に、ヒト血清含有培地を使用する場合、血清ドナーの負担を考慮して、なるべく少ない回数であることが望ましく、例えば、本発明の方法によって間葉系幹細胞を培養する場合、少なくとも週１回、より好ましくは週１〜２回の培地交換を行う。本発明の方法によって、必要な細胞数を得るまでにかかる培養日数が短縮されるため、培地交換によって使用される血清の量を抑えることができる。
【００３６】
本発明の方法の好ましい一態様において、細胞の総数が１００，０００，０００個以上になるまで継代培養を繰り返し行うことができる。
本発明の方法を用いて細胞を培養することにより、通常より３〜１００倍高い増殖率が得られるため、短期間に大量の細胞を得ることができる。必要とされる細胞数は、その細胞を使用する目的に応じて変化し得るが、例えば、脳梗塞による虚血性脳疾患の治療のための移植に必要とされる間葉系幹細胞の数は、１０，０００，０００個以上と考えられている。本発明の方法を用いた場合、典型的には、１２日間で１０，０００，０００個の間葉系幹細胞を得ることができる。このような細胞増殖の迅速化はこれまで実現されておらず、本発明の方法によって初めて可能になった。血清含有培地において実質的にヘパリンを含有させないで培養することによりこのような迅速な細胞増殖が可能であることは、当業者にとって極めて驚くべきことである。
【００３７】
一局面において、本発明の方法によって培養させた細胞は、組織修復・再生のための医薬の製造に用いられてもよい。
本発明の増殖方法で得た細胞を有効成分として含む治療薬を被験体に投与することによって、機能を喪失した対象の組織を修復、再生させることができる。特に、間葉系幹細胞を用いる場合、虚血性脳疾患の脳組織を修復、再生させることが可能である（国際公開WO02/00849A1号公報を参照のこと）。本明細書において言及される場合、組織の修復、再生とは、機能の修復、再生と同義であり、治療効果としては、例えば、神経系組織を修復・再生する場合、神経の保護作用（例えば、軸索の再有髄化）、神経栄養作用（例えば、神経膠細胞の補充）、脳血管新生作用、神経再生等を含む。すなわち、本発明の方法によって増殖させた細胞を含む医薬の治療効果の実体としては、組織の修復、再生を、現象としては、その組織の機能障害の修復、再生を意味している。増殖させた細胞を組織の修復・再生のために使用する場合、ドナー細胞のソースがＨＩＶ、ＡＴＬ、ＨＢ、ＨＣ、梅毒、ヒトパルボウイルスＢ１９などに感染していないことが、予め末梢血により確認されていることが必要である。
【００３８】
また、一態様において、本発明の方法によって増殖させた細胞を、疾患または病原体感染の診断に使用することも可能である。例えば、被験体から採取して体外で増殖させた細胞中に含まれる癌関連遺伝子の状態を調べることによって発癌の危険性を診断することができる。
また、被験体がプリオン病に感染している場合、通常の検査方法では検出が困難であるが、本発明の方法によって細胞を増殖させることで、迅速に検出感度以上まで異常プリオンを増幅させ、プリオン病の診断を行うことができる。
あるいは、本発明の方法によって増殖させた細胞を、インビボまたはインビトロ実験に使用してもよい。
【００３９】
本発明の方法によって増殖させた細胞を含む組織修復・再生用医薬としては、例えば、本発明の方法を用いて生体外増幅された細胞と薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤および／または基材からなる、注射（例えば、神経前駆細胞、造血幹細胞、肝細胞、膵細胞、リンパ球細胞などを含む注射）および移植用インプラント、（例えば、心筋細胞シート、人工皮膚、人工角膜、人工歯根、人工関節など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明の方法によって培養させた細胞を含む医薬は、神経系組織の修復・再生のために用いられてもよい。例えば、自家の間葉系幹細胞を増殖させて、虚血性神経疾患の処置のための医薬に用いてもよい。好ましい一態様において、前記医薬に含まれる細胞は、細胞が投与される被験体に由来する細胞（自家細胞）である。
【００４１】
かかる細胞療法の対象となる神経系疾患としては、例えば、中枢性および末梢性の脱髄疾患、中枢性および末梢性の変性疾患、脳卒中（脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血を含む）、脳腫瘍、痴呆を含む高次機能障害、精神疾患、てんかん、外傷性の神経系疾患（頭部外傷、脳挫傷、脊髄損傷を含む）、脊髄梗塞、ならびにクロイツフェルトヤコブ病、クールー病、牛海綿状脳症、スクレイピーなどのプリオン病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明の方法によって増殖される細胞は、神経系疾患以外の疾患の処置においても有用である。例えば、急性白血病の治療のために、造血幹細胞を生体外増幅して骨髄中に移植してもよい。通常の骨髄移植においては、自家移植の場合でレシピエントの体重あたり典型的には２×１０８個、他家移植の場合４×１０８個の細胞数が必要とされ、細胞ドナーから採取される骨髄液の量は１０００ｍＬに及ぶこともあり得るが、本発明の方法を用いて生体外で細胞を迅速に増殖させることにより、細胞ドナーの身体的な負担を軽減することができる。また、ウイルス感染などの治療のために、患者の末梢血から採取したＴリンパ球を、本発明の方法を用いて生体外で増幅し、同一患者に移植してもよい。
【００４３】
組織の修復・再生のための細胞補充に用いられるドナー細胞のソースは、自家または他家の組織幹細胞もしくは体性幹細胞または胚性幹細胞に求め得るが、倫理的な問題、感染症の危険性、または免疫抑制剤使用の必要性などの困難を考慮すると、自家細胞、とりわけ、非侵襲的にドナー細胞を確保できる体性幹細胞（例えば、骨髄細胞）を使用する自家移植療法が望ましい。自家移植療法が困難な場合には、他人または他の動物由来の細胞を利用することも可能である。ドナー細胞は、培養を開始する際の試料中に含まれる抗凝固剤の量が５Ｕ／ｍＬ未満であれば、培養の直前に採取された試料に含まれる細胞であっても、凍結保存した細胞であってもよい。例えば、国際公開WO 2005/001732A1号公報に記載の治療用細胞の配送支援システムを用いる治療モデルのように、予め自家細胞を増殖し、凍結保存して、疾患時に投与してもよい。
【００４４】
あるいは、本発明の一態様においては、予めドナー細胞を冷蔵または凍結保存し、一定の時間の後で培養・増殖させることも可能である。そのような処置が必要となる場合、例えば、臨床で細胞を採取する場所（病院など）と細胞処理施設との間の距離が離れている場合、試料採取時に血液凝固を阻止するために試料に一定量（２０〜４０Ｕ／ｍＬ）の抗凝固剤を添加して、冷蔵または凍結保存し、培養を開始する前に、例えば、Ｆｉｃｏｌ遠心分離などによって所望の細胞を試料から単離し、洗浄することで、抗凝固剤を除去する。
【００４５】
細胞のソースは、修復・再生の対象とする特定の組織の細胞種へ分化することが既に分かっている細胞、例えば、同じ胚葉系の細胞または全能性幹細胞を含むものであることが望ましいが、ある程度他の胚葉へ分化している幹細胞（例えば、胎児肝細胞）が、神経系細胞など他の組織の細胞に再分化することも見出されている（例えば、WO 02/00849A1号公報に記載の細胞）ことを考慮すれば、公知の分化誘導因子などを用いて所望の細胞種への分化を誘導することができるものであれば、異なる胚葉系の細胞を含む組織であってもよい。
【００４６】
修復の対象となる組織が神経系の場合、ドナー細胞のソースとして、例えば、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児胚、脳などに由来する細胞が挙げられる。修復の対象となる組織が造血組織の場合、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児胚などに含まれる、造血幹細胞、臍帯血幹細胞などが挙げられる。
【００４７】
神経系組織の修復のために骨髄由来の間葉系幹細胞を利用する場合、以下のような利点が存在する：１）顕著な効果が期待できる、２）副作用の危険性が低い、３）充分なドナー細胞の供給が期待できる、４）非侵襲的な治療であり自家移植が可能であるので、５）感染症のリスクが低い、６）免疫拒絶反応の心配がない、７）倫理的問題がない、８）社会的に受け入れられやすい、９）一般的な医療として広く定着しやすいなど。さらに、骨髄移植療法は既に臨床の現場で用いられている治療であり、安全性も確認されている。また、骨髄由来の幹細胞は遊走性が高く、局所への移植ばかりか、静脈内投与によっても目的の損傷組織へ到達し、治療効果が期待できる。
【００４８】
骨髄液の採取は、例えば、採取源となる動物（ヒトを含む）を麻酔（局所または全身麻酔）し、胸骨または腸骨に針を刺し、シリンジで吸引することにより行うことができる。また、出生児に臍帯に直接針を刺し、注射器で吸引して、臍帯血を採取保存しておくことは、確立された技術となっている。従来の方法においては、採取した骨髄液中で血液成分の凝固が起こることを防ぐために抗凝固剤を用いるが、本発明の方法においては、抗凝固剤を使用しないことは、先に述べたとおりである。
【００４９】
本発明の方法によって増殖された細胞を含む医薬を損傷組織へ送達する方法として、例えば、外科的手段による局所移植、静脈内投与、腰椎穿刺投与、局所注入投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、脳内投与、脳室内投与、または静脈投与などが考えられる。また、本発明の方法によって増殖された細胞を、インプラント、細胞シート基材、人工関節などに含有または播種させて生体内へ移植してもよい。
【００５０】
患者への細胞の注射による移植は、例えば、神経系の修復のために用いられる場合、移植する細胞を、人工脳脊髄液や生理食塩水などを用いて浮遊させた状態で注射器に溜め、手術により損傷した神経組織を露出し、この損傷部位に注射針で直接注入することにより行うことができる。組織内を移動することができる程度に遊走性の高い細胞（例えば、WO 02/00849A1号公報に記載の細胞など）の場合、損傷部位の近傍へ移植してもよく、また、脳脊髄液中への注入によっても効果が期待できる。この場合、通常の腰椎穿刺で細胞を注入することができるため、患者の手術の必要はなく、局所麻酔のみですむため、病室で患者を処置できる点で好適である。さらに、静脈内への注入でも効果が期待できる。したがって、通常の輸血の要領での移植が可能となり、病棟での移植操作が可能である点で好適である。
【００５１】
本発明による細胞の増殖に好適な培地は、細胞の種類、所望の分化の方向およびレベル、ならびに必要とされる増殖率などに応じて選択される。例えば、神経系の修復に用いるために間葉系幹細胞を増殖させる場合に好適な培地としては、以下に示すダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の他、神経前駆細胞標準培地（ＮＰＢＭ：Clontech製）、αＭＥＭ培地などが挙げられるが、これらに限定されない。このような標準培地を基に、上記のように血清を添加し、さらに必要に応じてアミノ酸等の栄養因子、抗生物質、増殖因子および／または成長因子などを加える。
【００５２】
標準培地の具体例としては、以下の成分を以下の濃度（ｍｇ／Ｌ）で含むダルベッコ改変培地が挙げられる：
ＣａＣｌ２（無水物）：１６０〜２４０
ＫＣＬ：３２０〜４８０
Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ：０．０８〜１．２
ＭｇＳＯ４（無水物）：８０〜１２０
ＮａＣｌ：５１２０〜７６８０
ＮａＨＣＯ３：２９６０〜４４４０
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ：１００〜１５０
Ｄ−グルコース：３６００〜５４００
フェノールレッド：１２〜１８
ピルビン酸ナトリウム：８８〜１３２
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ：６７〜１０１
Ｌ−システィン・２ＨＣｌ：５０〜７６
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ：３４〜５０
Ｌ−イソロイシン：８４〜１２６
Ｌ−ロイシン：８４〜１２６
Ｌ−リジン・ＨＣｌ：１１７〜１７５
Ｌ−メチオニン：２４〜３６
Ｌ−フェニルアラニン：５３〜７９
Ｌ−セリン：３４〜５０
Ｌ−スレオニン：７６〜１１４
Ｌ−トリプトファン：１３〜１９
Ｌ−チロシン（２ナトリウム塩）：８３〜１２５
Ｌ−バリン：７５〜１１３
塩化コリン：３．２〜４．８
Ｄ−Ｃａ−パントテン酸：３．２〜４．８
葉酸：３．２〜４．８
ｉ−イノシトール：５．８〜８．６
ナイアシンアミド：３．２〜４．８
ピリドキサール・ＨＣｌ：３．２〜４．８
リボフラビン：０．３〜０．５
チアミン・ＨＣｌ：３．２〜４．８
【００５３】
所望により、細胞培養の分野において通常使用される抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を、単独でまたは併用して使用してもよい。複数の抗生物質を併用することが好ましく、例えば、ペニシリンとストレプトマイシンとを併用する場合、培地に対して各０．５〜２容積％であり、好ましくは０．８〜１．２容積％である。
【００５４】
培地に含有される低分子アミノ酸としては、Ｌ-アラニン、Ｌ−アスパラギンサン、Ｌ−システイン、Ｌ-グルタミン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスコルビン酸、およびＬ−グルタミン酸が挙げられる。これらのアミノ酸は、細胞培養の分野において通常使用される培地中に栄養素として含まれているものである。
【００５５】
さらに、本発明者らは、グルタミンを培地総量の０．１〜２％（重量／容積）で添加することが、間葉系幹細胞の迅速な増殖にとって不可欠であり、さらに、培養中のグルタミンが０．１〜２％（重量／容積）を保つように補充を行うことが、迅速な増殖をさらに促進することを見出した。
【００５６】
上記の標準培地に、必要に応じて増殖・成長因子および／または分化誘導因子を添加してもよい。増殖・成長因子および分化誘導因子は、所望の分化の方向およびレベル、必要な増殖率などに応じて選択される。例えば、アスコルビン酸およびニコチンアミドなどのビタミン類、ＮＧＦおよびＢＤＮＦなどの神経栄養因子、ＢＭＰなどの骨形成因子、上皮細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、ＩＬ−２などのサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明の細胞培養方法は、具体的には例えば以下のように行う。
１．上記のようにヘパリン液にて内壁を濡らしたシリンジにて生体から採取した試料を、１００倍以下の希釈率、好ましくは１０倍以下の希釈率、さらに好ましくは約２倍〜６倍程度の希釈率で、予め３７±０．５℃に保った培地中に加え、培養ディッシュに播種し、３７±０．５℃、５％の炭酸ガス中でインキュベートする。培地の交換は少なくとも週１回、典型的には週１〜２回行う。培地は、好適な標準培地に血清および必要な助剤を添加して調製し、ろ過滅菌機により滅菌し、小分けして４℃の保冷庫に保管したものを、予め３７±０．５℃に保って使用する。３７．５℃を超えると死滅細胞が増え、３６．５℃未満では生育が遅い。炭酸ガス濃度は５±１％の範囲が好ましい。全ての工程で細胞に接触する溶液を同様の温度範囲に保つことが、増殖の迅速化を促進する。
【００５８】
２．細胞が培養ディッシュ基材に付着した後、培地および培地中に浮遊している血球成分を吸引して分離、除去する。次いで、洗浄液としてリン酸緩衝食塩水を用いて、付着している幹細胞表面を洗浄する。
【００５９】
３．継代は、ディッシュ内の細胞が５,５００個/ｃｍ２以上となる時点を目安として、細胞密度が８，５００個／ｃｍ２を超えないように、コンフルエントの６０〜８０％、好ましくは６５〜７５％になった時点で行う。継代の際は、主としてトリプシンおよび必要に応じてＥＤＴＡ(エチレンジアミンテトラ酢酸)からなる剥離剤を、ディッシュ１枚あたり３ｍＬ添加して、３７±５℃で３〜５分間のインキュベーションの後、付着した幹細胞が剥離したことを確認する。分離液を傾斜法にて培地と置換して、培地中の細胞を所定の遠沈管に移し遠心分離により細胞を遠沈させて継代する。少なくとも間葉系幹細胞の総数が１００,０００,０００個以上になるまで、培養、培地交換、継代のサイクルを繰り返す。培地の交換は、少なくとも週１回は行う。
【００６０】
以上のサイクルを繰り返すことで、迅速に目的とする細胞数が得られる（例えば、間葉系幹細胞の場合、１×１０８個の細胞を２週間以内に得ることができる）。
【００６１】
所望により、増殖後の細胞の剥離を容易にする細胞足場材を使用することも可能である。好適な足場材の例としては、多孔質の無機系セラミックス、マイクロピラー（例えば、日立製作所製ナノピラー細胞培養シート）、不織布、ハニカム膜フィルム等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明の一つの局面において、培養される細胞は、予め、例えば、ＢＤＮＦ遺伝子、ＰＬＧＦ遺伝子、ＧＤＮＦ遺伝子、若しくはＩＬ−２遺伝子などの、増殖および分化を誘導する遺伝子を導入されていてもよい。あるいは、培養される細胞は、テロメラーゼ遺伝子などの不死化遺伝子が導入された不死化した細胞であってもよい。かかる遺伝子の導入については、例えばWO03/038075A1号公報などにおいて開示されている。
【００６３】
上記で例として挙げたような培地、足場剤、助剤、増殖因子および／または遺伝子導入などから、所望の増殖率および／または特定の細胞種への分化を誘導するような組み合わせを選択することは、当業者の能力の範囲内である。
【００６４】
増殖された細胞の細胞種の確認を行うことが望ましい場合、当該分野において公知の手段（例えば、フルオサイトメトリー・セルソーターなど）を用いて、細胞表面抗原発現またはサイトカイン産生の解析などにより細胞種を決定する。所望の細胞に特異的なマーカー抗原は、文献などにおいて公知であり、例えば、間葉系幹細胞のマーカーとしてＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ９、ＣＤ１５７、ＣＤ１６６などが公知である。かかる文献から所望の細胞に特異的なマーカーを選択して組み合わせることは、当業者が有する通常の技術の範囲内である。
【００６５】
本発明の方法によって増殖させた細胞は、そのまま組織の修復・再生のために投与することも可能であるが、治療効率を向上させるために、任意に種々の薬剤を添加した組成物として、あるいは遺伝子導入により改変し、投与または移植することも考えられる。例えば、本発明の方法によって増殖させた細胞の組織内でのさらなる増殖率を向上させる物質、所望の細胞への分化を促進する物質、もしくは組織内での生存率を向上させる物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入；移植される細胞が損傷した生体組織から受ける悪影響を阻止する効果を有する物質の添加、および／またはかかる遺伝子の導入；ドナー細胞の寿命を延長する物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入；細胞周期を調節する物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入；免疫細胞の抑制を目的とした物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入；エネルギー代謝を活発にする物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入；ドナー細胞の組織内での遊走能を向上させる物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入；血流を向上させる物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入などが考えられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例は、本発明の方法による細胞の増殖、および本発明の方法によって増殖された細胞を含む組織の修復・再生のための医薬について、さらに具体的に説明するものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。細胞培養および／または細胞療法の分野において通常の知識および技術を有する者は、本発明の精神を逸脱しない範囲で、多様な改変を行うことができる。
【００６７】
実施例１
内壁を予め微量のヘパリン（骨髄液１ｍＬあたり０．１Ｕ）で濡らした採血管を用いて、脳疾患患者から骨髄液を６０ｍＬ採取し、２１０ｍＬの培地中に添加し、総量２７０ｍＬとした。この骨髄液含有培養液を１８等分して、１５ｍＬずつ１５０ｍｍ径のディッシュ（IWAKI製Tissue culture dish #3030-150）中に播種し、培地を５ｍＬずつ添加して１ディッシュあたり総量２０ｍＬとした。播種後、９ディッシュずつ、別々のインキュベーターに静置して、３７±０．５℃、５％の炭酸ガス雰囲気下で培養した。骨髄液は、予め末梢血の検査によって、ＨＩＶ、ＡＴＬ、ＨＢ、ＨＣ、梅毒、ヒトパルボウイルスＢ１９等に感染していないことを確認した。
【００６８】
培地は、ダルベッコ改変イーグル培地５００ｍＬに、自己末梢血由来の血清５６．８ｍＬ、抗生物質５．７ｍＬ（ペニシリン１０，０００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍＬよりなる）、およびグルタミン５．７ｍＬ（２９２．３ｍｇ／Ｌ）を添加して調製し、ろ過滅菌し、小分けして４℃の保冷庫に保管したものを、予め３７℃に保って使用した。
【００６９】
４日目に培養容器に付着した間葉系幹細胞を洗浄するに当たって、培地および培地中に浮遊している血球成分を吸引して分離、除去し、次いで洗浄液としてリン酸緩衝食塩水５ｍＬを用いて、付着している間葉系幹細胞表面を６回洗浄した。
【００７０】
８日目に第一継代を行うにあたり、リン酸緩衝食塩水５ｍＬを用いて洗浄後、付着した幹細胞を剥離するために、分離液（０．２５％トリプシン−２．２１ｍＭ ＥＤＴＡ）４ｍＬをディッシュに添加し、３分間３７℃でインキュベートし、剥れを確認した。付着分離させた分離液に同量の培地を加え、傾斜法にて全量を回収した。ディッシュ９枚分の細胞を遠沈管９本に移して、遠心分離機により８００ｒｐｍで５分間遠心した。分離後各遠沈管の上澄み液を除去し、ＤＭＥＭを加えて細胞を集めた。集めた細胞溶液を、再度８００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心分離後、各遠沈管の上澄み液を除去し、培地３００ｍＬを加えて細胞を集めた。この細胞溶液をディッシュ１５枚に小分けして継代し、初代培養と同様に３７±０．５℃、炭酸ガス濃度５％中でインキュベートした。同様の継代操作を残り９ディッシュについても行った。
【００７１】
１３日目に、洗浄、剥離、遠心分離を上記と同様に行い、小分けしたもので細胞数を血球計測盤で計測したところ、１．１×１０６個に達していたので、更に継代させた。培養を継続し、２０日目に同様の細胞数計測を行ったところ、細胞総数が１．０×１０８に達したので、洗浄、剥離、遠心分離を行い、凍結保存液（通常の濾過滅菌したＲＰＭＩ２０．５ｍＬと、患者から採取した自己血清２０．５ｍＬ、デキストラン５ｍＬ、ＤＭＳＯ ５ｍＬ）に懸濁して−１５０℃度で凍結した。細胞中の間葉系幹細胞の比率は９８％以上（ＣＤ１０５陽性（陽性率＝９９．９％）、ＣＤ３４陰性（陰性率＝９８．８％）、ＣＤ４５陰性（陰性率＝９８．５％）であった。
【００７２】
比較例１
試料中のへパリンの含量を２ｍＬ（２６７Ｕ／ｍＬ）に変えた他は全て実施例１と同様の条件で培養を行った。結果を図１および図２に示す。ヘパリンを極微量（０．１Ｕ／ｍＬ）しか添加しない場合、培養開始から４日後で、８×１０５個の増殖を得、一方、２ｍＬのヘパリンを添加した場合、２×１０４個の増殖を得、ヘパリンが微量である場合において約４０倍の増殖率を得た（図１および図２）。培養を続けた場合、培養開始から１２日後での細胞数は、ヘパリンを極微量添加した細胞で１．４×１０７個まで増加し、一方、ヘパリン２ｍＬを添加した細胞は、２．９×１０６個であった（図１）。これらの結果は、ヘパリンの添加が細胞増殖に対して阻害効果を及ぼすことを示すとともに、抗凝固剤の添加量がごく微量であるかまたは実質的に添加しなくとも、本発明の方法によって細胞を迅速に増殖させることが可能であることを確認し、さらに、試料中のヘパリンの量を極微量とすることによって、著しい増殖率の改善を得ることを示す。
【００７３】
比較例２
ヒト末梢血由来の血清の代わりにＦＢＳを用いる他は全て実施例1と同様の条件で、８日間培養を行った。細胞数計測による間葉系幹細胞の増殖速度の比較を、図３に示す。本発明の条件下においてヒト間葉系幹細胞を培養する場合、ヒト成人血清を用いた場合、ＦＢＳを用いた場合と比較して、培養開始から５日後で約２．６倍、８日後で約６倍の増殖率を得た。この結果は、ヒト骨髄細胞の培養において、試料中のヘパリンの量を極微量とすることによって、ヒト成人血清を使用してＦＢＳより高い増殖率が得られることを示す。
【００７４】
比較例３
ラット間葉系幹細胞を用いて実験を行った。ラット大腿骨２本から採取した骨髄細胞を、実施例１と同様の培地にヘパリンをそれぞれ１Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ、または１０００Ｕ／ｍＬで添加して培養した。ヒト末梢血由来の血清の代わりにＦＢＳを用いる他は、全て実施例１と同様の条件で培養を行った。結果を図４に示す。培地中のヘパリンの濃度が高くなるほど、増殖に対する阻害効果が高くなることが示された。
【００７５】
比較例４
ラット間葉系細胞を用いて、以下のように実験を行った。１群：ラット大腿骨１本より、ＤＭＥＭ４ｍＬを用いて骨髄液を押し出し、合計４ｍＬ強の試料を得た。この試料を、ヘパリン１６０Ｕを添加したＤＭＥＭ３６ｍＬに加え、培養を開始した。培地中のヘパリン濃度は、４Ｕ／ｍＬであった。２群：ラット大腿骨１本より、ヘパリン１６０Ｕを添加したＤＭＥＭ４ｍＬを用いて骨髄液を押し出し、合計４ｍＬ強の試料を得た。この試料を、このまま高濃度のヘパリンに曝した状態で、５分間室温で放置した後、ＤＭＥＭ３６ｍＬに加え、培養を開始した。培地中のヘパリン濃度は、４Ｕ／ｍＬであった。これら２群の細胞数の変化を、図５に示す。１群において、２群と比較して著しい増殖率の低下が観察された。この結果は、試料採取の際（または培養に移行する前）に細胞試料にヘパリンを添加した場合、培養時の培地中にヘパリンを添加した場合と比較して、ヘパリンが細胞増殖に及ぼす阻害効果がより顕著になることを示唆する。
【００７６】
実施例２
標準培地としてＤＭＥＭの代わりにαＭＥＭ培地を使用した他は、全て実施例１と同様の条件で培養を行った。結果を図６に示す。αＭＥＭ培地を用いる場合においても、ヘパリンの量を抑えることにより、ヒト血清を用いてＦＢＳよりも迅速な増殖が得られることを確認した。
【００７７】
比較例５
培地中にグルタミンを含まない以外はすべて実施例１と同様にして７日間培養した。細胞数計測による間葉系幹細胞の増殖速度の比較を、図７に示す。培養開始から１週間後で、グルタミンを使用する場合において約１．６倍の増殖率が観察された。この結果は、間葉系幹細胞の迅速な増殖のために、グルタミンの添加が必要であることを示す。
【００７８】
実施例３
患者（５２歳、男性）は、虚血性神経疾患（脳梗塞：右内頸動脈閉塞）で、２００７年２月４日に左半身麻痺を発症し、同年２月１９日、札幌医科大学付属病院へ転院した。治療前の症状として；左半身麻痺、特に上肢に強い麻痺があり；手を開いたり握ったりすることが全く出来ず；物（積木など）を握ったり離したりすることが出来ず；腕を肩の位置より高く上げることが出来ず；手首を曲げたり伸ばしたりすることも出来なかった。この患者から、実施例１に記載のとおりに間葉系幹細胞を採取して増殖させ、その全量に、凍結保存液（通常の濾過滅菌したＲＰＭＩ２０．５ｍＬと、患者から採取した自己血清２０．５ｍＬ、デキストラン５ｍＬ、ＤＭＳＯ ５ｍＬ）を加え、治療薬を製造した。この治療薬を、３月１９日に上記の患者に静脈内に３０分間で投与した。副作用は全く認められなかった。
【００７９】
結果
この患者は、細胞治療前は左手指全５指の運動機能不全であったが、細胞投与の翌朝には全く動かなかった左手の指が動くようになり、握ったり開いたりができるようになった。1週間後には運動機能改善が見られ、ステイック運搬運動が可能となった。２週間後には、脳梗塞が著明に縮小していることがＭＲＩによって確認された（図９）。また、手を握ったり開いたりすることが、より早くできるようになり、積木をつまんだり、離したりすることもできるようになった。腕も肩の位置より高く上げ、「バンザイ」することが出来るようになった。肘の曲げ伸ばしおよび手首の曲げ伸ばしも出来るようになった。細胞治療の前後にわたるこの患者の脳梗塞レベルの推移を、脳梗塞の評価のための周知のスケール（ＮＩＨＳＳ：米国立衛生研究所脳卒中スケール、ＪＳＳ：日本脳卒中学会脳卒中スケール、ＭＲＳ：修正ランキンスケール）を用いて図８に示す。
【００８０】
図９は、この患者の脳ＭＲＩ画像である。右大脳の脳梗塞で障害された部位（白色部分）の減縮がみられ、上記の運動機能回復と合わせて、本治療薬の投与が顕著な改善効果を示すことが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は、組織の修復・再生に顕著な効果を示す治療薬の迅速な提供を可能とするものであり、この治療薬提供の迅速化により、特に早期の細胞療法が有効な疾患、例えば脳神経に損傷を受けた患者の脳神経再生などに甚大な効果を有し、さらに、細胞提供者の不足および身体的負担を軽減する。本発明の方法によって製造される医薬は、治療薬としての効果は言うまでもなく、迅速に提供されることにより治療効果を増幅し、患者のＱＯＬを著しく改善するとともに、介護者の負担および介護費用を軽減させることよって、社会的負担の低減にもつながるものであり、老齢化社会に光明を投げかけるものである。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、骨髄液に添加するヘパリンの量を０．１Ｕ／ｍＬまたは２６７Ｕ／ｍＬとした場合のヒト間葉系幹細胞の増殖を示すグラフである。
【図２】図２は、骨髄液に極微量または２ｍＬのヘパリンを添加した場合の、培養開始から４日後での細胞数を示すグラフである。
【図３】図３は、ヘパリンの添加量を０．１Ｕ／ｍＬとして、ヒト成人血清またはＦＢＳを添加した培地中での間葉系幹細胞増殖を示すグラフである。
【図４】図４は、ラット間葉系幹細胞を、表示量のヘパリンを添加して１０％ＦＢＳ含有培地で培養した場合の増殖率を示すグラフである。
【図５】図５は、ラット間葉系幹細胞を、ヘパリンを添加した培地中で培養した場合、または、同量のヘパリンを骨髄液中に添加してその後培地中で培養した場合の増殖率を示すグラフである。
【図６】図６は、ヘパリンの添加量を０．１Ｕ／ｍＬとして、ヒト成人自己血清またはＦＢＳのいずれかを添加したαＭＥＭ培地中でのヒト間葉系幹細胞の増殖を示すグラフである。
【図７】図７は、ヘパリンの添加量を０．１Ｕ／ｍＬ未満として、グルタミンを添加した場合またはグルタミン無添加の場合の、ヒト間葉系幹細胞の増殖を示すグラフである。
【図８】図８は、虚血性能疾患患者の細胞治療の前後にわたる脳梗塞レベル（ＮＩＨＳＳ：米国立衛生研究所脳卒中スケール、ＪＳＳ：日本脳卒中学会脳卒中スケール、ＭＲＳ：修正ランキンスケール）の推移を示すグラフである。
【図９】図９は、間葉系幹細胞の自家移植を行う前および移植の２週間後における虚血性能疾患患者の脳ＭＲＩ画像である。損傷部位は白色部分として示される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体から採取した細胞を生体外で迅速かつ大量に増殖させる方法、ならびにかかる方法によって増殖した細胞を含む生体組織の修復および再生のための医薬、ならびにかかる医薬を製造する方法に関する。この方法は、特に間葉系幹細胞の自家移植のために好適であり、特に神経系組織の修復および再生のために適用され得る。
【背景技術】
【０００２】
従来、損傷を受けた神経組織の機能回復は非常に困難と考えられてきたが、近年になって成熟脳においても自己増殖能と多分化能を保持する神経幹細胞が発見されたことを基に、中枢神経系においても再生医療の研究が精力的に行われている。幹細胞を用いる再生医療として最も実用化に近いと考えられているのは、損傷された細胞の補充をおこなう細胞療法である。細胞療法においては、ドナーから提供される細胞（以下、ドナー細胞）を生体外で培養、増殖、および／または分化誘導し、適切な形態においてレシピエントの生体内へ投与することによって、レシピエントの損傷された組織細胞を補充する。
【０００３】
脳神経疾患に対しては、神経系細胞への分化能を有する細胞を組織から抽出後培養し個体へ移植することが、虚血モデル、外傷モデルなどにおいて試みられている。例えば、本発明者らは、骨髄細胞中に神経細胞へ分化し得る細胞を含む細胞分画が存在することを既に見出しており、さらに、ラット脊髄脱髄モデルへこれらの細胞を移植すると脱髄された神経軸索が再有髄化することを確認している（特許文献１）。
【０００４】
疾患の治療、特に、脳梗塞による虚血脳疾患など急性期の症状を有する疾患の治療に用いる場合、ドナー細胞を迅速かつ大量に増殖させることが重要である。生体外で細胞を増殖させるために、細胞の生存率を向上させ、増殖率を高めるために、様々な試みがなされている。
【０００５】
例えば、細胞の増殖率の改善のために、種々の増殖促進物質を添加した培地が使用されている。例えば、特許文献２においては、白血球阻害因子が細胞増殖の速度を増加させることが開示されており、特許文献３においては、造血細胞を増殖させるための組み替えヒト血清アルブミンを含む培地中が開示されている。特許文献４においては、ビタミンＣおよび塩基性繊維芽細胞増殖因子を含む培地中で間葉系幹細胞を培養する方法が開示されている。他の増殖因子（例えば、上皮細胞増殖因子、神経細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、トロンボポエチン、インターロイキンなど）の使用もまた公知である。
【０００６】
より細胞増殖率を高めるような培養基質の開発もなされている。例えば、特許文献５においては、基底膜細胞外基質上で間葉系幹細胞を培養する方法が開示されている。
【０００７】
また、血清も増殖を促進する物質として一般的に使用される。従来、幹細胞の培養においては、細胞増殖因子として１０〜２０％程度のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を始めとする異種動物血清を添加した培地が広く使用されている。しかし、ＦＢＳのような動物血清はロットによる組成の差が大きく、また、ウイルス、プリオンなどの病原体混入の危険性も問題となっている。
【０００８】
このような問題に対応すべく、血清を添加しない培地もまた開発されている（例えば、特許文献２、特許文献３などを参照のこと）。しかし、無血清培地における培養では、血清添加培地と同等の増殖を得ることは困難であるのが現状である。
【０００９】
一方、ヒト血清を使用する試みにおいては、倫理的観点から胎児血清の使用は困難であるため、成人ヒト血清が使用される（例えば、特許文献６〜８を参照のこと）。成人血清を使用する上での利点は、ドナー細胞を採取した個体と同一の個体の血清を用いることが可能な点であり、適合性および安全性の観点から非常に好ましい。
【００１０】
成人血清を使用する場合の問題点は、例えばＦＢＳと比較した場合の増殖促進活性の低さである。成人血清は単独では充分な細胞増殖促進活性を示さず、ＦＢＳと同程度の増殖を得るためには、さらにＦＢＳを添加するか（特許文献６）または他の増殖因子の添加が不可欠である（特許文献７）。しかしながら、増殖因子などの添加によりＦＢＳと同等の効果が得られた場合においてですら、先に述べたような急性期の疾患の治療に対応し得るような迅速かつ大量の増殖は得られていない。
【００１１】
一方、従来、生体から採取した細胞を培養・増殖させる方法においては、血液成分を含む組織または細胞をドナーから採取する際に、血液凝固を阻止するために、ヘパリンが添加される（例えば、特許文献９、非特許文献１、および非特許文献２などを参照のこと）。代表的な場合（例えば、通常の骨髄移植における骨髄細胞採取）においては、細胞液の容積に対するヘパリンの投与量は、数十Ｕ／ｍＬ（約２０〜４０Ｕ／ｍＬ）程度であり、例えば特許文献８は、ヘパリンを５〜１５Ｕ／ｍＬ程度の範囲で含有するヘパリン／緩衝液を骨髄液に添加することを開示している。特許文献２においては、さらに培養培地中にもヘパリンを含有させる方法が開示されている。
【００１２】
ヘパリンは、上記のような血液凝固防止の用途の他に、増殖助剤としてもまた用いられており、例えば特許文献４において、ヘパリンには塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とそのレセプターとの親和性を高める作用があることが開示されている。また、特許文献１０は、ヘパリンを含む硫酸化グリコサミノグリカンの改変体を、神経幹細胞増殖助剤として開示している。しかしながら、これらヘパリンを用いる方法においても、なお十分に迅速かつ大量の増殖率は達成し得ないのが現状である。
【特許文献１】国際公開第WO02/00849A1号パンフレット
【特許文献２】特表2002-518990号公報
【特許文献３】特開2005-204539号公報
【特許文献４】特開2006-136281号公報
【特許文献５】特開2003-52360号公報
【特許文献６】特開平10-179148号公報
【特許文献７】特開2003-235548号公報
【特許文献８】特開2006-55106号公報
【特許文献９】国際公開第WO01/48147A1号パンフレット
【特許文献１０】特開2005-218308号公報
【非特許文献１】高久史麿著、「骨髄移植マニュアル」、初版、内外医学社、1996年、86頁
【非特許文献２】三浦恭定編、「血液幹細胞培養法」、改訂２版１刷、内外医学社、1989年、38頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の課題は、細胞移植のために生体外で細胞を増殖させる場合において、従来技術の問題を解決し、かつ従来の方法より高い増殖率を得、迅速かつ大量に細胞を増殖することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、細胞培養における種々の条件および手順を検証する中で、通常は血液凝固防止の目的で用いられるヘパリンに着目して研究を進めたところ、ヘパリンが細胞増殖に対して著しい阻害作用を及ぼしているという知見を得、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、生体から採取された試料中の細胞を、培地中で培養し増殖させる方法であって、細胞が抗凝固剤と実質的に接触しない、前記方法に関する。
また、本発明は、採取された試料に添加される抗凝固剤の量を該試料の容積に対して５Ｕ／ｍＬ未満とする、前記方法に関する。
さらに、本発明は、培養を開始する際の培地中の抗凝固剤の量を０．５Ｕ／ｍＬ未満とする、前記方法に関する。
また、本発明は、前記抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体またはこれらの塩である、前記細胞増殖方法に関する。
【００１６】
本発明は、血清を含む培地中で細胞を増殖させる、前記方法に関する。
また、本発明は、細胞が由来する動物と同種の動物個体の血清を含有する培地中で細胞を増殖させる、前記方法に関する。
さらに、本発明は、自己血清を含有する培地中で細胞を増殖させる、前記方法に関する。
本発明はまた、培地中の血清含有量が１〜２０容積％である、前記方法に関する。
【００１７】
本発明は、幹細胞を増殖させる、前記方法に関する。
また、本発明は、間葉系幹細胞を増殖させる、前記方法に関する。
さらに、本発明は、ヒトの細胞を増殖させる、前記方法に関する。
本発明は、幹細胞を未分化な状態で増殖させる、前記方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、培地中の間葉系幹細胞の密度が５，５００個／ｃｍ２以上になった時点で継代培養させる、前記方法に関する。
さらに、本発明は、培地の交換を少なくとも週１回は行う、前記方法に関する。
本発明は、細胞の総数が１００，０００，０００個以上になるまで継代培養を繰り返し行う、前記方法に関する。
【００１９】
本発明は、前記のいずれかの方法によって培養された細胞を用いて組織修復・再生用医薬を製造する方法に関する。
また、本発明は、前記のいずれかの方法によって培養された細胞を含む組織修復・再生用医薬に関する。
本発明は、組織が神経系組織であり、細胞が自家の間葉系幹細胞であり、静脈内投与、腰椎穿刺投与、脳内投与、脳室内投与、または動脈内投与される、虚血性神経疾患の処置のための前記医薬に関する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、従来では細胞増殖に必須または有用と考えられてきた抗凝固剤をごく微量で添加するか、または抗凝固剤を実質的に添加せず培養を行うことによって著しい増殖率の改善が得られるという、これまでの常識からは全く予測し得ない驚くべき効果を奏する。ヘパリンなどの抗凝固剤が細胞増殖に作用する機序については必ずしも明らかではないが、抗凝固剤が細胞に添加されると、細胞表面に結合し、これが培養時の細胞の基質への接着を阻害し、それによって細胞の増殖を阻害するなどが一因として考えられるところ、抗凝固剤を実質的に存在させないことにより、細胞増殖が飛躍的に向上したものと推測される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明による細胞増殖の方法について、詳細に説明する。
本発明の方法は、生体から採取された試料中の細胞を、培地中で培養して増殖させる方法であって、細胞が抗凝固剤と実質的に接触しないことを特徴とする。
【００２２】
本発明において用いられる試料とは、増殖能を有し、および／または組織の修復・再生のために有用な細胞を含む体液および／または組織であって、例えば、骨髄液、血液（末梢血もしくは臍帯血）またはリンパ液などの体液、筋肉組織、骨組織、皮膚、リンパ系組織、脈管、または消化器などの組織、または胚（ヒト胚を除く）などが挙げられる。生体から採取された試料は、その試料全体をそのまま、または必要に応じて処理（例えば、不要な成分の除去、特定の細胞分画の精製、酵素処理など）を行い、本発明による増殖方法に供する。
【００２３】
本明細書において「細胞が抗凝固剤と実質的に接触しない」とは、細胞の採取から培養期間全体のいずれかの時点において使用する抗凝固剤の量を実質的に減少させることを意味し、例えば、抗凝固剤を、細胞採取のための容器（採血管など）の内壁を抗凝固剤溶液で濡らす程度に添加するか、もしくは全く添加しないか、または培養を開始する際に試料中の抗凝固剤を実質的に除去した場合に得られる状態を意味する。
【００２４】
より迅速かつ大量に細胞増殖を得るためには、試料を採取する際に添加される抗凝固剤の量が少ないことが好ましく、採取した細胞は、凝血を避けるために採取後速やか（３０分以内）に培養工程に移行させる。より好ましくは、細胞と抗凝固剤とが実質的に接触しないようにする。以上の操作により、従来のおよそ３〜１００倍という驚くべき増殖率が得られる。
【００２５】
本発明の好ましい態様においては、生体から採取された試料に添加される（すなわち、採取された試料が収められる採血管に予め添加される）抗凝固剤の量を、試料の容積に対して５Ｕ／ｍＬ未満、好ましくは２Ｕ／ｍＬ未満、さらに好ましくは０．２Ｕ／ｍＬ未満とする。
【００２６】
本発明の別の好ましい態様においては、生体から採取された試料中の細胞を培養する際に、培地中に存在する抗凝固剤の量が、培地の容積に対して０．５Ｕ／ｍＬ未満、好ましくは０．２Ｕ／ｍＬ未満、最も好ましくは０．０２Ｕ／ｍＬ未満である。より具体的には、培養を開始する際の抗凝固剤の量が培地の容積に対して０．５Ｕ／ｍＬ未満になるように、予め試料採取のための採血管に投与する抗凝固剤の量を抑えるか、および／または、培地中に添加する抗凝固剤の量を調整する。
【００２７】
また、本明細書において「抗凝固剤」とは、体液中または培地中に存在する場合、細胞表面に結合して、細胞外マトリクスに存在する抗血液凝固作用を有するタンパク質と相互作用し、細胞と細胞外マトリクス、細胞同士または細胞と基質とが接着することを阻害する物質を指し、典型的には、例えば、ヘパリンおよびヘパリン誘導体（例えば、特開2005-218308A号公報において開示される、ヘパリンを構成するＤ−グルコサミンの６位を脱硫酸したグリコサミノグリカンなど）またはそれらの塩が用いられる。
【００２８】
本発明の方法において細胞を増殖させるための培地は、細胞培養の分野において通常使用される培地であれば特に限定されないが、より迅速かつ大量の増殖を得るためには、血清含有培地が好ましい。血清含有培地は、本明細書において以下の他の箇所に記載するような標準培地を基に、培地に対して１２％未満の量で血清を加えたものを使用する。血清を提供する個体の負担を考えると血清量は少なければ少ないほど好ましいが、所望の迅速な細胞増殖促進作用が得られる範囲内であることを考慮すると、１％〜２０容積％であることが好ましく、より好ましくは３〜１２％であり、さらに好ましくは５〜１０％である。
【００２９】
本発明の方法において使用される血清は、哺乳動物の血清であり、好ましくは培養される細胞が由来する動物と同種の動物個体の血清（同種血清）であるが、さらに好ましくは培養される細胞が由来する個体の血清（自己血清）であるが、これらに限定されない。培養される細胞がヒト細胞である場合、成人ヒト血清が使用されることが好ましいが、採取が困難である場合、異種動物血清（例えばＦＢＳ）を使用してもよい。ただし、例えばＦＢＳに比べ、ヒト血清を用いた場合に、抗凝固剤を添加しないことによる本発明の効果は、より顕著に現れる。血清は、末梢血由来の血清であっても、臍帯血由来の血清であってもよい。血清は、細胞の由来する個体の血清（自己血清）であることが好ましいが、採取が困難である場合は同種の他個体の血清（他家血清）でもよい。
【００３０】
本発明の方法によって増殖させる細胞は、血液成分を含む試料から調製し、付着させて培養する細胞であればよく、例えば、間葉系細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、角膜幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞などの体性幹細胞、胎児幹細胞などの胚性幹細胞単核細胞（ヒト胚を除く）の他、骨芽細胞、繊維芽細胞、靱帯細胞、上皮細胞、血管内皮細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の方法は、その一態様において、幹細胞を増殖させるために好適であり、例えば、間葉系幹細胞を増殖させるために用いられる。
間葉系幹細胞とは、間葉系組織の間質細胞の中に微量に存在する多分化能および自己複製能を有する幹細胞であり、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などの結合組織細胞に分化するだけでなく、神経細胞や心筋細胞への分化能を有することが近年見出されている。
【００３２】
一態様において、本発明の方法を、ヒトの細胞を増殖させるために用いてもよい。
本発明の別の態様において、増殖させる細胞はヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、チンパンジーなどの霊長類、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなど）の細胞であってもよい。
【００３３】
さらに、本発明の方法の一態様において、幹細胞を未分化な状態で増殖させてもよい。
一般に、幹細胞は、未分化な状態の方が増殖率および生体内導入後の生存率が高い。例えば、虚血性脳疾患の処置など、迅速かつ大量の細胞増殖が必要とされる場合においては、採取した幹細胞を未分化な状態のままで増殖させることによって、短期間に必要な細胞数を得ることができる。
あるいは、一定の細胞種へ分化した細胞が所望である場合、幹細胞または芽細胞を未分化な状態で大量に増殖させ、次いで、所望の細胞種への分化を誘導する既知の成長因子の添加またはかかる性質を有する遺伝子の導入などによる分化誘導を行うことによって、大量の分化した細胞を得てもよい。
【００３４】
本発明の一態様において、培地中の間葉系幹細胞の密度が５，５００個／ｃｍ２以上になった時で継代培養させることが好ましい。
培地における細胞の密度は、細胞の性質および分化の方向性に影響を与える。例えば、間葉系幹細胞を培養する場合、培地中の細胞の密度が８，５００個／ｃｍ２を超えると、細胞の性質が変化してしまうため、最大でも８，５００個／ｃｍ２以下で継代培養させることが好ましく、より好ましくは、５，５００個／ｃｍ２以上になった時点で継代培養させる。
【００３５】
また、本発明の好ましい態様において、培地は、少なくとも週１回交換する。
培地の交換は、細胞の培養および増殖に必要な栄養素、成長因子、増殖因子などを供給するため、また、細胞の代謝によって生成する乳酸などの老廃物を除去し、培地のｐＨを一定に保つために必要である。培地交換の周期は、細胞の種類、培養条件などに依存して選択されるが、特に、ヒト血清含有培地を使用する場合、血清ドナーの負担を考慮して、なるべく少ない回数であることが望ましく、例えば、本発明の方法によって間葉系幹細胞を培養する場合、少なくとも週１回、より好ましくは週１〜２回の培地交換を行う。本発明の方法によって、必要な細胞数を得るまでにかかる培養日数が短縮されるため、培地交換によって使用される血清の量を抑えることができる。
【００３６】
本発明の方法の好ましい一態様において、細胞の総数が１００，０００，０００個以上になるまで継代培養を繰り返し行うことができる。
本発明の方法を用いて細胞を培養することにより、通常より３〜１００倍高い増殖率が得られるため、短期間に大量の細胞を得ることができる。必要とされる細胞数は、その細胞を使用する目的に応じて変化し得るが、例えば、脳梗塞による虚血性脳疾患の治療のための移植に必要とされる間葉系幹細胞の数は、１０，０００，０００個以上と考えられている。本発明の方法を用いた場合、典型的には、１２日間で１０，０００，０００個の間葉系幹細胞を得ることができる。このような細胞増殖の迅速化はこれまで実現されておらず、本発明の方法によって初めて可能になった。血清含有培地において実質的にヘパリンを含有させないで培養することによりこのような迅速な細胞増殖が可能であることは、当業者にとって極めて驚くべきことである。
【００３７】
一局面において、本発明の方法によって培養させた細胞は、組織修復・再生のための医薬の製造に用いられてもよい。
本発明の増殖方法で得た細胞を有効成分として含む治療薬を被験体に投与することによって、機能を喪失した対象の組織を修復、再生させることができる。特に、間葉系幹細胞を用いる場合、虚血性脳疾患の脳組織を修復、再生させることが可能である（国際公開WO02/00849A1号公報を参照のこと）。本明細書において言及される場合、組織の修復、再生とは、機能の修復、再生と同義であり、治療効果としては、例えば、神経系組織を修復・再生する場合、神経の保護作用（例えば、軸索の再有髄化）、神経栄養作用（例えば、神経膠細胞の補充）、脳血管新生作用、神経再生等を含む。すなわち、本発明の方法によって増殖させた細胞を含む医薬の治療効果の実体としては、組織の修復、再生を、現象としては、その組織の機能障害の修復、再生を意味している。増殖させた細胞を組織の修復・再生のために使用する場合、ドナー細胞のソースがＨＩＶ、ＡＴＬ、ＨＢ、ＨＣ、梅毒、ヒトパルボウイルスＢ１９などに感染していないことが、予め末梢血により確認されていることが必要である。
【００３８】
また、一態様において、本発明の方法によって増殖させた細胞を、疾患または病原体感染の診断に使用することも可能である。例えば、被験体から採取して体外で増殖させた細胞中に含まれる癌関連遺伝子の状態を調べることによって発癌の危険性を診断することができる。
また、被験体がプリオン病に感染している場合、通常の検査方法では検出が困難であるが、本発明の方法によって細胞を増殖させることで、迅速に検出感度以上まで異常プリオンを増幅させ、プリオン病の診断を行うことができる。
あるいは、本発明の方法によって増殖させた細胞を、インビボまたはインビトロ実験に使用してもよい。
【００３９】
本発明の方法によって増殖させた細胞を含む組織修復・再生用医薬としては、例えば、本発明の方法を用いて生体外増幅された細胞と薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤および／または基材からなる、注射（例えば、神経前駆細胞、造血幹細胞、肝細胞、膵細胞、リンパ球細胞などを含む注射）および移植用インプラント、（例えば、心筋細胞シート、人工皮膚、人工角膜、人工歯根、人工関節など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明の方法によって培養させた細胞を含む医薬は、神経系組織の修復・再生のために用いられてもよい。例えば、自家の間葉系幹細胞を増殖させて、虚血性神経疾患の処置のための医薬に用いてもよい。好ましい一態様において、前記医薬に含まれる細胞は、細胞が投与される被験体に由来する細胞（自家細胞）である。
【００４１】
かかる細胞療法の対象となる神経系疾患としては、例えば、中枢性および末梢性の脱髄疾患、中枢性および末梢性の変性疾患、脳卒中（脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血を含む）、脳腫瘍、痴呆を含む高次機能障害、精神疾患、てんかん、外傷性の神経系疾患（頭部外傷、脳挫傷、脊髄損傷を含む）、脊髄梗塞、ならびにクロイツフェルトヤコブ病、クールー病、牛海綿状脳症、スクレイピーなどのプリオン病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明の方法によって増殖される細胞は、神経系疾患以外の疾患の処置においても有用である。例えば、急性白血病の治療のために、造血幹細胞を生体外増幅して骨髄中に移植してもよい。通常の骨髄移植においては、自家移植の場合でレシピエントの体重あたり典型的には２×１０８個、他家移植の場合４×１０８個の細胞数が必要とされ、細胞ドナーから採取される骨髄液の量は１０００ｍＬに及ぶこともあり得るが、本発明の方法を用いて生体外で細胞を迅速に増殖させることにより、細胞ドナーの身体的な負担を軽減することができる。また、ウイルス感染などの治療のために、患者の末梢血から採取したＴリンパ球を、本発明の方法を用いて生体外で増幅し、同一患者に移植してもよい。
【００４３】
組織の修復・再生のための細胞補充に用いられるドナー細胞のソースは、自家または他家の組織幹細胞もしくは体性幹細胞または胚性幹細胞に求め得るが、倫理的な問題、感染症の危険性、または免疫抑制剤使用の必要性などの困難を考慮すると、自家細胞、とりわけ、非侵襲的にドナー細胞を確保できる体性幹細胞（例えば、骨髄細胞）を使用する自家移植療法が望ましい。自家移植療法が困難な場合には、他人または他の動物由来の細胞を利用することも可能である。ドナー細胞は、培養を開始する際の試料中に含まれる抗凝固剤の量が５Ｕ／ｍＬ未満であれば、培養の直前に採取された試料に含まれる細胞であっても、凍結保存した細胞であってもよい。例えば、国際公開WO 2005/001732A1号公報に記載の治療用細胞の配送支援システムを用いる治療モデルのように、予め自家細胞を増殖し、凍結保存して、疾患時に投与してもよい。
【００４４】
あるいは、本発明の一態様においては、予めドナー細胞を冷蔵または凍結保存し、一定の時間の後で培養・増殖させることも可能である。そのような処置が必要となる場合、例えば、臨床で細胞を採取する場所（病院など）と細胞処理施設との間の距離が離れている場合、試料採取時に血液凝固を阻止するために試料に一定量（２０〜４０Ｕ／ｍＬ）の抗凝固剤を添加して、冷蔵または凍結保存し、培養を開始する前に、例えば、Ｆｉｃｏｌ遠心分離などによって所望の細胞を試料から単離し、洗浄することで、抗凝固剤を除去する。
【００４５】
細胞のソースは、修復・再生の対象とする特定の組織の細胞種へ分化することが既に分かっている細胞、例えば、同じ胚葉系の細胞または全能性幹細胞を含むものであることが望ましいが、ある程度他の胚葉へ分化している幹細胞（例えば、胎児肝細胞）が、神経系細胞など他の組織の細胞に再分化することも見出されている（例えば、WO 02/00849A1号公報に記載の細胞）ことを考慮すれば、公知の分化誘導因子などを用いて所望の細胞種への分化を誘導することができるものであれば、異なる胚葉系の細胞を含む組織であってもよい。
【００４６】
修復の対象となる組織が神経系の場合、ドナー細胞のソースとして、例えば、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児胚、脳などに由来する細胞が挙げられる。修復の対象となる組織が造血組織の場合、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児胚などに含まれる、造血幹細胞、臍帯血幹細胞などが挙げられる。
【００４７】
神経系組織の修復のために骨髄由来の間葉系幹細胞を利用する場合、以下のような利点が存在する：１）顕著な効果が期待できる、２）副作用の危険性が低い、３）充分なドナー細胞の供給が期待できる、４）非侵襲的な治療であり自家移植が可能であるので、５）感染症のリスクが低い、６）免疫拒絶反応の心配がない、７）倫理的問題がない、８）社会的に受け入れられやすい、９）一般的な医療として広く定着しやすいなど。さらに、骨髄移植療法は既に臨床の現場で用いられている治療であり、安全性も確認されている。また、骨髄由来の幹細胞は遊走性が高く、局所への移植ばかりか、静脈内投与によっても目的の損傷組織へ到達し、治療効果が期待できる。
【００４８】
骨髄液の採取は、例えば、採取源となる動物（ヒトを含む）を麻酔（局所または全身麻酔）し、胸骨または腸骨に針を刺し、シリンジで吸引することにより行うことができる。また、出生児に臍帯に直接針を刺し、注射器で吸引して、臍帯血を採取保存しておくことは、確立された技術となっている。従来の方法においては、採取した骨髄液中で血液成分の凝固が起こることを防ぐために抗凝固剤を用いるが、本発明の方法においては、抗凝固剤を使用しないことは、先に述べたとおりである。
【００４９】
本発明の方法によって増殖された細胞を含む医薬を損傷組織へ送達する方法として、例えば、外科的手段による局所移植、静脈内投与、腰椎穿刺投与、局所注入投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、脳内投与、脳室内投与、または静脈投与などが考えられる。また、本発明の方法によって増殖された細胞を、インプラント、細胞シート基材、人工関節などに含有または播種させて生体内へ移植してもよい。
【００５０】
患者への細胞の注射による移植は、例えば、神経系の修復のために用いられる場合、移植する細胞を、人工脳脊髄液や生理食塩水などを用いて浮遊させた状態で注射器に溜め、手術により損傷した神経組織を露出し、この損傷部位に注射針で直接注入することにより行うことができる。組織内を移動することができる程度に遊走性の高い細胞（例えば、WO 02/00849A1号公報に記載の細胞など）の場合、損傷部位の近傍へ移植してもよく、また、脳脊髄液中への注入によっても効果が期待できる。この場合、通常の腰椎穿刺で細胞を注入することができるため、患者の手術の必要はなく、局所麻酔のみですむため、病室で患者を処置できる点で好適である。さらに、静脈内への注入でも効果が期待できる。したがって、通常の輸血の要領での移植が可能となり、病棟での移植操作が可能である点で好適である。
【００５１】
本発明による細胞の増殖に好適な培地は、細胞の種類、所望の分化の方向およびレベル、ならびに必要とされる増殖率などに応じて選択される。例えば、神経系の修復に用いるために間葉系幹細胞を増殖させる場合に好適な培地としては、以下に示すダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の他、神経前駆細胞標準培地（ＮＰＢＭ：Clontech製）、αＭＥＭ培地などが挙げられるが、これらに限定されない。このような標準培地を基に、上記のように血清を添加し、さらに必要に応じてアミノ酸等の栄養因子、抗生物質、増殖因子および／または成長因子などを加える。
【００５２】
標準培地の具体例としては、以下の成分を以下の濃度（ｍｇ／Ｌ）で含むダルベッコ改変培地が挙げられる：
ＣａＣｌ２（無水物）：１６０〜２４０
ＫＣＬ：３２０〜４８０
Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ：０．０８〜１．２
ＭｇＳＯ４（無水物）：８０〜１２０
ＮａＣｌ：５１２０〜７６８０
ＮａＨＣＯ３：２９６０〜４４４０
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ：１００〜１５０
Ｄ−グルコース：３６００〜５４００
フェノールレッド：１２〜１８
ピルビン酸ナトリウム：８８〜１３２
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ：６７〜１０１
Ｌ−システィン・２ＨＣｌ：５０〜７６
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ：３４〜５０
Ｌ−イソロイシン：８４〜１２６
Ｌ−ロイシン：８４〜１２６
Ｌ−リジン・ＨＣｌ：１１７〜１７５
Ｌ−メチオニン：２４〜３６
Ｌ−フェニルアラニン：５３〜７９
Ｌ−セリン：３４〜５０
Ｌ−スレオニン：７６〜１１４
Ｌ−トリプトファン：１３〜１９
Ｌ−チロシン（２ナトリウム塩）：８３〜１２５
Ｌ−バリン：７５〜１１３
塩化コリン：３．２〜４．８
Ｄ−Ｃａ−パントテン酸：３．２〜４．８
葉酸：３．２〜４．８
ｉ−イノシトール：５．８〜８．６
ナイアシンアミド：３．２〜４．８
ピリドキサール・ＨＣｌ：３．２〜４．８
リボフラビン：０．３〜０．５
チアミン・ＨＣｌ：３．２〜４．８
【００５３】
所望により、細胞培養の分野において通常使用される抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を、単独でまたは併用して使用してもよい。複数の抗生物質を併用することが好ましく、例えば、ペニシリンとストレプトマイシンとを併用する場合、培地に対して各０．５〜２容積％であり、好ましくは０．８〜１．２容積％である。
【００５４】
培地に含有される低分子アミノ酸としては、Ｌ-アラニン、Ｌ−アスパラギンサン、Ｌ−システイン、Ｌ-グルタミン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスコルビン酸、およびＬ−グルタミン酸が挙げられる。これらのアミノ酸は、細胞培養の分野において通常使用される培地中に栄養素として含まれているものである。
【００５５】
さらに、本発明者らは、グルタミンを培地総量の０．１〜２％（重量／容積）で添加することが、間葉系幹細胞の迅速な増殖にとって不可欠であり、さらに、培養中のグルタミンが０．１〜２％（重量／容積）を保つように補充を行うことが、迅速な増殖をさらに促進することを見出した。
【００５６】
上記の標準培地に、必要に応じて増殖・成長因子および／または分化誘導因子を添加してもよい。増殖・成長因子および分化誘導因子は、所望の分化の方向およびレベル、必要な増殖率などに応じて選択される。例えば、アスコルビン酸およびニコチンアミドなどのビタミン類、ＮＧＦおよびＢＤＮＦなどの神経栄養因子、ＢＭＰなどの骨形成因子、上皮細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、ＩＬ−２などのサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明の細胞培養方法は、具体的には例えば以下のように行う。
１．上記のようにヘパリン液にて内壁を濡らしたシリンジにて生体から採取した試料を、１００倍以下の希釈率、好ましくは１０倍以下の希釈率、さらに好ましくは約２倍〜６倍程度の希釈率で、予め３７±０．５℃に保った培地中に加え、培養ディッシュに播種し、３７±０．５℃、５％の炭酸ガス中でインキュベートする。培地の交換は少なくとも週１回、典型的には週１〜２回行う。培地は、好適な標準培地に血清および必要な助剤を添加して調製し、ろ過滅菌機により滅菌し、小分けして４℃の保冷庫に保管したものを、予め３７±０．５℃に保って使用する。３７．５℃を超えると死滅細胞が増え、３６．５℃未満では生育が遅い。炭酸ガス濃度は５±１％の範囲が好ましい。全ての工程で細胞に接触する溶液を同様の温度範囲に保つことが、増殖の迅速化を促進する。
【００５８】
２．細胞が培養ディッシュ基材に付着した後、培地および培地中に浮遊している血球成分を吸引して分離、除去する。次いで、洗浄液としてリン酸緩衝食塩水を用いて、付着している幹細胞表面を洗浄する。
【００５９】
３．継代は、ディッシュ内の細胞が５,５００個/ｃｍ２以上となる時点を目安として、細胞密度が８，５００個／ｃｍ２を超えないように、コンフルエントの６０〜８０％、好ましくは６５〜７５％になった時点で行う。継代の際は、主としてトリプシンおよび必要に応じてＥＤＴＡ(エチレンジアミンテトラ酢酸)からなる剥離剤を、ディッシュ１枚あたり３ｍＬ添加して、３７±５℃で３〜５分間のインキュベーションの後、付着した幹細胞が剥離したことを確認する。分離液を傾斜法にて培地と置換して、培地中の細胞を所定の遠沈管に移し遠心分離により細胞を遠沈させて継代する。少なくとも間葉系幹細胞の総数が１００,０００,０００個以上になるまで、培養、培地交換、継代のサイクルを繰り返す。培地の交換は、少なくとも週１回は行う。
【００６０】
以上のサイクルを繰り返すことで、迅速に目的とする細胞数が得られる（例えば、間葉系幹細胞の場合、１×１０８個の細胞を２週間以内に得ることができる）。
【００６１】
所望により、増殖後の細胞の剥離を容易にする細胞足場材を使用することも可能である。好適な足場材の例としては、多孔質の無機系セラミックス、マイクロピラー（例えば、日立製作所製ナノピラー細胞培養シート）、不織布、ハニカム膜フィルム等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明の一つの局面において、培養される細胞は、予め、例えば、ＢＤＮＦ遺伝子、ＰＬＧＦ遺伝子、ＧＤＮＦ遺伝子、若しくはＩＬ−２遺伝子などの、増殖および分化を誘導する遺伝子を導入されていてもよい。あるいは、培養される細胞は、テロメラーゼ遺伝子などの不死化遺伝子が導入された不死化した細胞であってもよい。かかる遺伝子の導入については、例えばWO03/038075A1号公報などにおいて開示されている。
【００６３】
上記で例として挙げたような培地、足場剤、助剤、増殖因子および／または遺伝子導入などから、所望の増殖率および／または特定の細胞種への分化を誘導するような組み合わせを選択することは、当業者の能力の範囲内である。
【００６４】
増殖された細胞の細胞種の確認を行うことが望ましい場合、当該分野において公知の手段（例えば、フルオサイトメトリー・セルソーターなど）を用いて、細胞表面抗原発現またはサイトカイン産生の解析などにより細胞種を決定する。所望の細胞に特異的なマーカー抗原は、文献などにおいて公知であり、例えば、間葉系幹細胞のマーカーとしてＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ９、ＣＤ１５７、ＣＤ１６６などが公知である。かかる文献から所望の細胞に特異的なマーカーを選択して組み合わせることは、当業者が有する通常の技術の範囲内である。
【００６５】
本発明の方法によって増殖させた細胞は、そのまま組織の修復・再生のために投与することも可能であるが、治療効率を向上させるために、任意に種々の薬剤を添加した組成物として、あるいは遺伝子導入により改変し、投与または移植することも考えられる。例えば、本発明の方法によって増殖させた細胞の組織内でのさらなる増殖率を向上させる物質、所望の細胞への分化を促進する物質、もしくは組織内での生存率を向上させる物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入；移植される細胞が損傷した生体組織から受ける悪影響を阻止する効果を有する物質の添加、および／またはかかる遺伝子の導入；ドナー細胞の寿命を延長する物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入；細胞周期を調節する物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入；免疫細胞の抑制を目的とした物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入；エネルギー代謝を活発にする物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入；ドナー細胞の組織内での遊走能を向上させる物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入；血流を向上させる物質の添加、および／またはかかる効果を有する遺伝子の導入などが考えられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例は、本発明の方法による細胞の増殖、および本発明の方法によって増殖された細胞を含む組織の修復・再生のための医薬について、さらに具体的に説明するものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。細胞培養および／または細胞療法の分野において通常の知識および技術を有する者は、本発明の精神を逸脱しない範囲で、多様な改変を行うことができる。
【００６７】
実施例１
内壁を予め微量のヘパリン（骨髄液１ｍＬあたり０．１Ｕ）で濡らした採血管を用いて、脳疾患患者から骨髄液を６０ｍＬ採取し、２１０ｍＬの培地中に添加し、総量２７０ｍＬとした。この骨髄液含有培養液を１８等分して、１５ｍＬずつ１５０ｍｍ径のディッシュ（IWAKI製Tissue culture dish #3030-150）中に播種し、培地を５ｍＬずつ添加して１ディッシュあたり総量２０ｍＬとした。播種後、９ディッシュずつ、別々のインキュベーターに静置して、３７±０．５℃、５％の炭酸ガス雰囲気下で培養した。骨髄液は、予め末梢血の検査によって、ＨＩＶ、ＡＴＬ、ＨＢ、ＨＣ、梅毒、ヒトパルボウイルスＢ１９等に感染していないことを確認した。
【００６８】
培地は、ダルベッコ改変イーグル培地５００ｍＬに、自己末梢血由来の血清５６．８ｍＬ、抗生物質５．７ｍＬ（ペニシリン１０，０００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍＬよりなる）、およびグルタミン５．７ｍＬ（２９２．３ｍｇ／Ｌ）を添加して調製し、ろ過滅菌し、小分けして４℃の保冷庫に保管したものを、予め３７℃に保って使用した。
【００６９】
４日目に培養容器に付着した間葉系幹細胞を洗浄するに当たって、培地および培地中に浮遊している血球成分を吸引して分離、除去し、次いで洗浄液としてリン酸緩衝食塩水５ｍＬを用いて、付着している間葉系幹細胞表面を６回洗浄した。
【００７０】
８日目に第一継代を行うにあたり、リン酸緩衝食塩水５ｍＬを用いて洗浄後、付着した幹細胞を剥離するために、分離液（０．２５％トリプシン−２．２１ｍＭ ＥＤＴＡ）４ｍＬをディッシュに添加し、３分間３７℃でインキュベートし、剥れを確認した。付着分離させた分離液に同量の培地を加え、傾斜法にて全量を回収した。ディッシュ９枚分の細胞を遠沈管９本に移して、遠心分離機により８００ｒｐｍで５分間遠心した。分離後各遠沈管の上澄み液を除去し、ＤＭＥＭを加えて細胞を集めた。集めた細胞溶液を、再度８００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心分離後、各遠沈管の上澄み液を除去し、培地３００ｍＬを加えて細胞を集めた。この細胞溶液をディッシュ１５枚に小分けして継代し、初代培養と同様に３７±０．５℃、炭酸ガス濃度５％中でインキュベートした。同様の継代操作を残り９ディッシュについても行った。
【００７１】
１３日目に、洗浄、剥離、遠心分離を上記と同様に行い、小分けしたもので細胞数を血球計測盤で計測したところ、１．１×１０６個に達していたので、更に継代させた。培養を継続し、２０日目に同様の細胞数計測を行ったところ、細胞総数が１．０×１０８に達したので、洗浄、剥離、遠心分離を行い、凍結保存液（通常の濾過滅菌したＲＰＭＩ２０．５ｍＬと、患者から採取した自己血清２０．５ｍＬ、デキストラン５ｍＬ、ＤＭＳＯ ５ｍＬ）に懸濁して−１５０℃度で凍結した。細胞中の間葉系幹細胞の比率は９８％以上（ＣＤ１０５陽性（陽性率＝９９．９％）、ＣＤ３４陰性（陰性率＝９８．８％）、ＣＤ４５陰性（陰性率＝９８．５％）であった。
【００７２】
比較例１
試料中のへパリンの含量を２ｍＬ（２６７Ｕ／ｍＬ）に変えた他は全て実施例１と同様の条件で培養を行った。結果を図１および図２に示す。ヘパリンを極微量（０．１Ｕ／ｍＬ）しか添加しない場合、培養開始から４日後で、８×１０５個の増殖を得、一方、２ｍＬのヘパリンを添加した場合、２×１０４個の増殖を得、ヘパリンが微量である場合において約４０倍の増殖率を得た（図１および図２）。培養を続けた場合、培養開始から１２日後での細胞数は、ヘパリンを極微量添加した細胞で１．４×１０７個まで増加し、一方、ヘパリン２ｍＬを添加した細胞は、２．９×１０６個であった（図１）。これらの結果は、ヘパリンの添加が細胞増殖に対して阻害効果を及ぼすことを示すとともに、抗凝固剤の添加量がごく微量であるかまたは実質的に添加しなくとも、本発明の方法によって細胞を迅速に増殖させることが可能であることを確認し、さらに、試料中のヘパリンの量を極微量とすることによって、著しい増殖率の改善を得ることを示す。
【００７３】
比較例２
ヒト末梢血由来の血清の代わりにＦＢＳを用いる他は全て実施例1と同様の条件で、８日間培養を行った。細胞数計測による間葉系幹細胞の増殖速度の比較を、図３に示す。本発明の条件下においてヒト間葉系幹細胞を培養する場合、ヒト成人血清を用いた場合、ＦＢＳを用いた場合と比較して、培養開始から５日後で約２．６倍、８日後で約６倍の増殖率を得た。この結果は、ヒト骨髄細胞の培養において、試料中のヘパリンの量を極微量とすることによって、ヒト成人血清を使用してＦＢＳより高い増殖率が得られることを示す。
【００７４】
比較例３
ラット間葉系幹細胞を用いて実験を行った。ラット大腿骨２本から採取した骨髄細胞を、実施例１と同様の培地にヘパリンをそれぞれ１Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ、または１０００Ｕ／ｍＬで添加して培養した。ヒト末梢血由来の血清の代わりにＦＢＳを用いる他は、全て実施例１と同様の条件で培養を行った。結果を図４に示す。培地中のヘパリンの濃度が高くなるほど、増殖に対する阻害効果が高くなることが示された。
【００７５】
比較例４
ラット間葉系細胞を用いて、以下のように実験を行った。１群：ラット大腿骨１本より、ＤＭＥＭ４ｍＬを用いて骨髄液を押し出し、合計４ｍＬ強の試料を得た。この試料を、ヘパリン１６０Ｕを添加したＤＭＥＭ３６ｍＬに加え、培養を開始した。培地中のヘパリン濃度は、４Ｕ／ｍＬであった。２群：ラット大腿骨１本より、ヘパリン１６０Ｕを添加したＤＭＥＭ４ｍＬを用いて骨髄液を押し出し、合計４ｍＬ強の試料を得た。この試料を、このまま高濃度のヘパリンに曝した状態で、５分間室温で放置した後、ＤＭＥＭ３６ｍＬに加え、培養を開始した。培地中のヘパリン濃度は、４Ｕ／ｍＬであった。これら２群の細胞数の変化を、図５に示す。１群において、２群と比較して著しい増殖率の低下が観察された。この結果は、試料採取の際（または培養に移行する前）に細胞試料にヘパリンを添加した場合、培養時の培地中にヘパリンを添加した場合と比較して、ヘパリンが細胞増殖に及ぼす阻害効果がより顕著になることを示唆する。
【００７６】
実施例２
標準培地としてＤＭＥＭの代わりにαＭＥＭ培地を使用した他は、全て実施例１と同様の条件で培養を行った。結果を図６に示す。αＭＥＭ培地を用いる場合においても、ヘパリンの量を抑えることにより、ヒト血清を用いてＦＢＳよりも迅速な増殖が得られることを確認した。
【００７７】
比較例５
培地中にグルタミンを含まない以外はすべて実施例１と同様にして７日間培養した。細胞数計測による間葉系幹細胞の増殖速度の比較を、図７に示す。培養開始から１週間後で、グルタミンを使用する場合において約１．６倍の増殖率が観察された。この結果は、間葉系幹細胞の迅速な増殖のために、グルタミンの添加が必要であることを示す。
【００７８】
実施例３
患者（５２歳、男性）は、虚血性神経疾患（脳梗塞：右内頸動脈閉塞）で、２００７年２月４日に左半身麻痺を発症し、同年２月１９日、札幌医科大学付属病院へ転院した。治療前の症状として；左半身麻痺、特に上肢に強い麻痺があり；手を開いたり握ったりすることが全く出来ず；物（積木など）を握ったり離したりすることが出来ず；腕を肩の位置より高く上げることが出来ず；手首を曲げたり伸ばしたりすることも出来なかった。この患者から、実施例１に記載のとおりに間葉系幹細胞を採取して増殖させ、その全量に、凍結保存液（通常の濾過滅菌したＲＰＭＩ２０．５ｍＬと、患者から採取した自己血清２０．５ｍＬ、デキストラン５ｍＬ、ＤＭＳＯ ５ｍＬ）を加え、治療薬を製造した。この治療薬を、３月１９日に上記の患者に静脈内に３０分間で投与した。副作用は全く認められなかった。
【００７９】
結果
この患者は、細胞治療前は左手指全５指の運動機能不全であったが、細胞投与の翌朝には全く動かなかった左手の指が動くようになり、握ったり開いたりができるようになった。1週間後には運動機能改善が見られ、ステイック運搬運動が可能となった。２週間後には、脳梗塞が著明に縮小していることがＭＲＩによって確認された（図９）。また、手を握ったり開いたりすることが、より早くできるようになり、積木をつまんだり、離したりすることもできるようになった。腕も肩の位置より高く上げ、「バンザイ」することが出来るようになった。肘の曲げ伸ばしおよび手首の曲げ伸ばしも出来るようになった。細胞治療の前後にわたるこの患者の脳梗塞レベルの推移を、脳梗塞の評価のための周知のスケール（ＮＩＨＳＳ：米国立衛生研究所脳卒中スケール、ＪＳＳ：日本脳卒中学会脳卒中スケール、ＭＲＳ：修正ランキンスケール）を用いて図８に示す。
【００８０】
図９は、この患者の脳ＭＲＩ画像である。右大脳の脳梗塞で障害された部位（白色部分）の減縮がみられ、上記の運動機能回復と合わせて、本治療薬の投与が顕著な改善効果を示すことが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は、組織の修復・再生に顕著な効果を示す治療薬の迅速な提供を可能とするものであり、この治療薬提供の迅速化により、特に早期の細胞療法が有効な疾患、例えば脳神経に損傷を受けた患者の脳神経再生などに甚大な効果を有し、さらに、細胞提供者の不足および身体的負担を軽減する。本発明の方法によって製造される医薬は、治療薬としての効果は言うまでもなく、迅速に提供されることにより治療効果を増幅し、患者のＱＯＬを著しく改善するとともに、介護者の負担および介護費用を軽減させることよって、社会的負担の低減にもつながるものであり、老齢化社会に光明を投げかけるものである。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、骨髄液に添加するヘパリンの量を０．１Ｕ／ｍＬまたは２６７Ｕ／ｍＬとした場合のヒト間葉系幹細胞の増殖を示すグラフである。
【図２】図２は、骨髄液に極微量または２ｍＬのヘパリンを添加した場合の、培養開始から４日後での細胞数を示すグラフである。
【図３】図３は、ヘパリンの添加量を０．１Ｕ／ｍＬとして、ヒト成人血清またはＦＢＳを添加した培地中での間葉系幹細胞増殖を示すグラフである。
【図４】図４は、ラット間葉系幹細胞を、表示量のヘパリンを添加して１０％ＦＢＳ含有培地で培養した場合の増殖率を示すグラフである。
【図５】図５は、ラット間葉系幹細胞を、ヘパリンを添加した培地中で培養した場合、または、同量のヘパリンを骨髄液中に添加してその後培地中で培養した場合の増殖率を示すグラフである。
【図６】図６は、ヘパリンの添加量を０．１Ｕ／ｍＬとして、ヒト成人自己血清またはＦＢＳのいずれかを添加したαＭＥＭ培地中でのヒト間葉系幹細胞の増殖を示すグラフである。
【図７】図７は、ヘパリンの添加量を０．１Ｕ／ｍＬ未満として、グルタミンを添加した場合またはグルタミン無添加の場合の、ヒト間葉系幹細胞の増殖を示すグラフである。
【図８】図８は、虚血性能疾患患者の細胞治療の前後にわたる脳梗塞レベル（ＮＩＨＳＳ：米国立衛生研究所脳卒中スケール、ＪＳＳ：日本脳卒中学会脳卒中スケール、ＭＲＳ：修正ランキンスケール）の推移を示すグラフである。
【図９】図９は、間葉系幹細胞の自家移植を行う前および移植の２週間後における虚血性能疾患患者の脳ＭＲＩ画像である。損傷部位は白色部分として示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取された試料中の細胞を、培地中で培養して増殖させる方法であって、細胞が抗凝固剤と実質的に接触しない、前記方法。
【請求項２】
採取された試料に添加される抗凝固剤の量を該試料の容積に対して５Ｕ／ｍＬ未満とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養を開始する際の培地中の抗凝固剤の量を０．５Ｕ／ｍＬ未満とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体またはこれらの塩である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
培地が、血清を含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
血清が、細胞が由来する動物と同種の動物個体の血清である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
血清が、自己血清である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
培地中の血清含有量が、１〜２０容積％である、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
細胞が、幹細胞である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、ヒト細胞である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
細胞を未分化な状態で増殖させる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
培地中の間葉系幹細胞の密度が５，５００個／ｃｍ２以上になった時点で継代培養させる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
培地の交換を少なくとも週１回は行う、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細胞の総数が１００，０００，０００個以上になるまで継代培養を繰り返し行う、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法によって増殖した細胞を用いて、組織修復・再生用治療薬を製造する方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法によって増殖した細胞を含む、組織修復・再生用医薬。
【請求項１８】
組織が神経系組織であり、細胞が自家の間葉系幹細胞であり、静脈内投与、腰椎穿刺投与、脳内投与、脳室内投与、または動脈内投与される、虚血性神経疾患の処置のための、請求項１７に記載の医薬。
【請求項１】
生体から採取された試料中の細胞を、培地中で培養して増殖させる方法であって、細胞が抗凝固剤と実質的に接触しない、前記方法。
【請求項２】
採取された試料に添加される抗凝固剤の量を該試料の容積に対して５Ｕ／ｍＬ未満とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養を開始する際の培地中の抗凝固剤の量を０．５Ｕ／ｍＬ未満とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体またはこれらの塩である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
培地が、血清を含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
血清が、細胞が由来する動物と同種の動物個体の血清である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
血清が、自己血清である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
培地中の血清含有量が、１〜２０容積％である、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
細胞が、幹細胞である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、ヒト細胞である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
細胞を未分化な状態で増殖させる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
培地中の間葉系幹細胞の密度が５，５００個／ｃｍ２以上になった時点で継代培養させる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
培地の交換を少なくとも週１回は行う、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細胞の総数が１００，０００，０００個以上になるまで継代培養を繰り返し行う、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法によって増殖した細胞を用いて、組織修復・再生用治療薬を製造する方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法によって増殖した細胞を含む、組織修復・再生用医薬。
【請求項１８】
組織が神経系組織であり、細胞が自家の間葉系幹細胞であり、静脈内投与、腰椎穿刺投与、脳内投与、脳室内投与、または動脈内投与される、虚血性神経疾患の処置のための、請求項１７に記載の医薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００９−６５８８４（Ｐ２００９−６５８８４Ａ）
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３６４９９（Ｐ２００７−２３６４９９）
【出願日】平成１９年９月１２日（２００７．９．１２）
【出願人】（３０７０１４５５５）北海道公立大学法人 札幌医科大学 (31)
【出願人】（５０６１００４９５）ＮＣメディカルリサーチ株式会社 (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１２日（２００７．９．１２）
【出願人】（３０７０１４５５５）北海道公立大学法人 札幌医科大学 (31)
【出願人】（５０６１００４９５）ＮＣメディカルリサーチ株式会社 (10)
【Ｆターム（参考）】
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