細胞工学用支持体及びその製造方法
【課題】 細胞を支持体の全体に容易に播種することができ、細胞に大きな力が加わることがなく、支持体内の細胞の量も略正確に把握することが可能な厚さ２ｍｍ以上の多孔質細胞支持体とその製造方法を提供する。
【解決手段】 ３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体の厚さ２ｍｍ以上の上部と、２〜３０μｍの平均孔径を有する多孔質生体吸収性高分子体の下部から構成されることを特徴とする細胞工学用支持体とする。
【解決手段】 ３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体の厚さ２ｍｍ以上の上部と、２〜３０μｍの平均孔径を有する多孔質生体吸収性高分子体の下部から構成されることを特徴とする細胞工学用支持体とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織の代替品として使用され、特に形状安定性に優れ且つ内部に細胞を播種及び／または培養させることが可能な生体吸収性高分子材料からなる細胞工学用支持体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、手術，外傷等によって喪失した生体組織を体細胞や幹細胞等によって再構築し、それを患者に移植することにより喪失した生体組織を再生する治療方法が行われている。この治療において生体組織を再生するためには、播種する細胞が生体組織を再建するまでの間に足場となる支持体（マトリックス）が重要となる。
【０００３】
従来の支持体としては、乳酸，グリコール酸，カプロラクトン等から成る生体吸収性高分子材料をジオキサンのような有機溶媒に溶解し、この溶液を凍結乾燥させて作製された孔径が５〜１００μｍ程度のスポンジ状の細胞工学用支持体がある（例えば、特許文献１参照。）。また、このようなスポンジ状の細胞工学用支持体の作製時に溶液中に粒子径が約５０〜約５００μｍの水溶性で無毒性の粒子状物質（例えば、塩化ナトリウム粉末等）を入れ、有機溶媒を取り除いて粒子状物質入りの生分解性高分子体を作製し、その後水を用いて粒子状物質を取り除くことで作製される約５０〜約５００μｍの円形開放大孔と２０μｍ以下の円形開放小孔とを持つ多孔質構造の生体吸収性高分子材料を細胞の支持体がある（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
細胞工学用支持体は細胞が播種された状態で使用されるが、前述した従来の多孔質構造を持つ支持体では、均一に細胞が播種されている状態の支持体とすることが難しいという問題があった。即ち、支持体は小孔構造を有する多孔質の三次元構造であるため、その中心部まで細胞を懸濁した培養液（以後、単に細胞懸濁液と呼ぶことがある）で満たすことが容易ではなく、例えば孔径が２０μｍより小さな支持体に厚さ２ｍｍ以上に渡って全体に細胞を播種することは非常に困難であった。
【０００５】
細胞懸濁液中に支持体を沈めてから大気圧より低い圧力あるいは真空とすることにより支持体中に細胞懸濁液を浸透させる方法も提案されている（例えば、特許文献３の請求項８参照。）。しかし実際には、このように負圧を利用しただけでは支持体全体に細胞懸濁液を浸透させることは難しいため、特許文献３の方法では細胞懸濁液を浸透させる経路をレーザー光等で形成している。また負圧を利用して圧力を大きく変化させることは細胞にとって好ましい状態ではなく、更に、細胞の量は懸濁液中の濃度で規定されるので、負圧を用いた方法では実際に支持体中に含まれた細胞の量を把握することが難しいという問題もあった。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−２３４８４４号公報
【特許文献２】特表２００２−５４１９２５号公報
【特許文献３】特開２００６−５０８７１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は前記の問題を鑑み、細胞を支持体の全体に容易に播種することができ、細胞に大きな力が加わることがなく、支持体内の細胞の量も正確に把握することが可能な厚さ２ｍｍ以上の多孔質細胞支持体とその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、細胞が素通り可能な孔径の３００〜３０００μｍの孔を有する特定の空隙率のブロック状の支持体を用いると容易に支持体全体に細胞を播種することが可能であることを利用し、その底を、細胞は通さず培養液を通す多孔質膜で塞ぐことによって前期課題が解決できることを見いだして本発明を完成させた。
【０００９】
即ち本発明は、３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体の厚さ２ｍｍ以上の上部と、２〜３０μｍの平均孔径を有する多孔質生体吸収性高分子体の下部から構成されることを特徴とする細胞工学用支持体である。このとき、上部：下部の厚さの比が、上部及び底部を通る縦断面で見たときに１００：１〜１０：２であることが好ましい。
【００１０】
更に本発明は、有機溶媒に生体吸収性高分子材料が溶解された溶液にその有機溶媒には溶解せず且つ生体吸収性高分子材料を溶解しない液で溶解する粒径が１００〜２０００μｍの粒子状物質を略均一に混合し凍結した後に乾燥して有機溶媒を取り除くことによって粒子状物質を含有した孔径が５〜５０μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製し、この多孔質生体吸収性高分子を粉砕してから粒子状物質を前記生体吸収性高分子を溶解しない液で溶解して取り除いた後、篩にかけて１００〜３０００μｍの平均粒径の生体吸収性顆粒状多孔質物質とし、これらの生体吸収性顆粒状多孔質物質を所定形状の容器内に入れて加圧し加熱して３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体（上部）を作製し、 一方で、生体吸収性高分子材料を有機溶媒に溶解し、この溶液を凍結乾燥させた後にプレスすることで作製できる平均孔径が２〜３０μｍのメンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体（下部１）、あるいは、生体吸収性高分子材料を有機溶媒に溶解し、粒子径が５０〜５００μｍであって水溶性で無毒性の粒子状物質を入れ、有機溶媒を取り除いて粒子状物質入りの生体吸収性高分子体を作製し、その後水を用いて粒子状物質を溶解させて取り除くことで作製される５０〜５００μｍの円形開放大孔と２〜３０μｍの円形開放小孔とを持つ多孔質生体吸収性高分子体（下部２）を作製し、該上部と、下部１または下部２との接着面を加熱するか用いた生体吸収性高分子材料を溶解させる有機溶媒で溶かして上部と下部とを溶着することを特徴とする細胞工学用支持体の作製方法である。このとき、生体吸収性顆粒状多孔質物質を５００〜３０００ｇ／ｃｍ2で加圧した状態の体積を保って６０〜２００℃の条件で加熱することが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、細胞を支持体の全体に容易に播種することができ、細胞に不要な力が加わることがなく、支持体内に播種された細胞の量も正確に把握することが可能な厚さ２ｍｍ以上の細胞工学用支持体とその製造方法である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明で用いる生体吸収性高分子材料は、生体に安全であり、一定期間体内でその形態を維持できれば特に限定することなく用いることができる。例えば、従来から用いられているポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体，ポリ−ε−カプロラクトン，乳酸−ε−カプロラクトン共重合体，ポリアミノ酸，ポリオルソエステル及びそれらの共重合体中から選択される少なくとも一種を例示することができ、中でもポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体が米国食品医薬庁（ＦＤＡ）から人体に無害な高分子として承認されていること及びその実績の面から最も好ましい。生体吸収性高分子材料の重量平均分子量は５,０００〜２,０００,０００であることが好ましく、より好ましくは１０,０００〜５００,０００である。
【００１３】
本発明に係る細胞工学用支持体において、その上部を構成する３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体は、細胞を自由に通す３００〜３０００μｍの孔を有し空隙率７５〜９７％のブロック状の多孔質生体吸収性の高分子体である。平均孔径が３００μｍより小さいと細胞を自由に通す効果が少なくなり内部まで十分に細胞を播種することができなくなる。３０００μｍよりも大きいと支持体の強度が低下してしまう。なお、生体吸収性高分子材料内に粉末状のリン酸カルシウム、例えばハイドロキシアパタイトやβ三リン酸カルシウムを分散させてもよい。
【００１４】
本発明に係る細胞工学用支持体において、その上部を構成するブロック状生体吸収性高分子体の空隙率は７５〜９７％であることが必要である。本発明で空隙率とは、体積が同じである同じ材料を用いた場合において、孔のあいている材料の重量をＷ1，孔のあいていない材料の重量をＷ2としたときに、（１−Ｗ1／Ｗ2）×１００で示される数値を言う。このブロック状生体吸収性高分子体は、空隙率が７５％未満では空隙が少ないため細胞の培養効率が不足してしまい、９７％を超えると生体吸収性高分子材料が少ないため強度が低下してしまい細胞の足場としての機能を低下させることになり細胞の培養効率が不足するため適切ではない。
【００１５】
上部のブロック状生体吸収性高分子体の破壊強度が０.０５ＭＰａ未満では形状に関係なく生体内で必要とされる形を維持することができず、一方、２ＭＰａを超える破壊強度のものを作製することは難しい。なお、本願での破壊強度とは直径１０ｍｍ×高さ２ｍｍの円柱状の試験体をクロスヘッドスピード１ｍｍ／分で圧縮させた際の圧縮破壊強度を意味する。
【００１６】
上部を構成する、３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体の作製方法は、有機溶媒に生体吸収性高分子材料が溶解された溶液にその有機溶媒には溶解せず且つ生体吸収性高分子材料を溶解しない液で溶解する粒径が１００〜２０００μｍの粒子状物質を略均一に混合し凍結した後に乾燥して有機溶媒を取り除くことによって粒子状物質を含有した孔径が５〜５０μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製し、この多孔質生体吸収性高分子をミル等で粉砕してから粒子状物質を前記生体吸収性高分子を溶解しない液で溶解して取り除いた後、篩にかけて１００〜３０００μｍの平均粒径の生体吸収性顆粒状多孔質物質とし、これらの生体吸収性顆粒状多孔質物質を所定形状の容器内に入れて加圧し加熱して作製する。
【００１７】
加圧の条件は生体吸収性顆粒状多孔質物質の材質，形状や大きさによって異なるが、５００〜３０００ｇ／ｃｍ２であることが好ましい。この加圧条件から外れると、水分に触れたときの体積変化が大きくなってしまう。更に、５００ｇ／ｃｍ２未満ではブロック状細胞工学用支持体の形状安定性が不足してしまう虞があり、３０００ｇ／ｃｍ２を超えると細胞が十分に増殖可能な孔が残り難い。より好ましくは１０００〜２０００ｇ／ｃｍ２である。
【００１８】
加熱の条件も生体吸収性顆粒状多孔質物質の材質，形状や大きさによって異なるが、前記の加圧を行った状態で体積を保って加熱するのであれば６０〜２００℃の範囲であればよい。６０℃未満では顆粒状の生分解性多孔質高分子同士の結合が弱くなり顆粒を集めてブロック体とすることが難かしくなる傾向がある。一方、２００℃を超えると顆粒状の生分解性多孔質高分子が変性してしまう虞がある。
【００１９】
下部の２〜３０μｍ未満の平均孔径を有する多孔質生体吸収性高分子体は、全ての細胞を完全には通過させずに培養液を通すためのフィルターの役目を果たす。
【００２０】
下部の２〜３０μｍ未満の平均孔径を有する多孔質生体吸収性高分子体の作製方法は、生体吸収性高分子材料を有機溶媒に溶解し、この溶液を凍結乾燥させることで作製できる孔径が５〜１００μｍ程度のスポンジ状の多孔質生体吸収性高分子体をプレスして平均孔径が２〜３０μｍのメンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体を得る方法がある。あるいは、溶液中に粒子径が５０〜５００μｍの水溶性で無毒性の粒子状物質（例えば、塩化ナトリウム粉末等）を入れ、有機溶媒を取り除いて粒子状物質入りの生体吸収性高分子体を作製し、その後水を用いて粒子状物質を溶解させて取り除くことで作製される５０〜５００μｍの円形開放大孔と２〜３０μｍの円形開放小孔とを持つ多孔質生体吸収性高分子体を得る方法がある。
【００２１】
本発明において多孔質生体吸収性高分子体１は、細胞懸濁液を上方向から流す際に細胞が全て支持体外に流れ出てしまうことを防ぐために支持体の下部に配置されるものであるから、支持体の形状に合わせる必要があり、下部の全面を覆う形状であることが好ましい。例えば、上部の形状が直方体の支持体であれば、下部は底面全体を覆うように支持体を構成するよう上部に接着（溶着）固定され配置される。上部の形状が球形であれば、少なくとも直径の下から１／４の高さを覆うように下部が配置されていることが好ましい。
【００２２】
上部：下部の厚さの比は上部及び底部を通る縦断面で見たときに１００：１〜１０：２であることが好ましい。
【００２３】
本発明に係る細胞工学用支持体を製造する際に上部を構成するブロック状生体吸収性高分子体と下部を構成する多孔質生体吸収性高分子体を溶着するには、加熱により行う方法と、生体吸収性高分子体を構成する生体吸収性高分子材料を溶解させる有機溶媒を介して行う方法との何れかを採用するのが好ましい。有機溶媒としては予め生体吸収性高分子材料を溶解させたものを使用してもよい。
【００２４】
本発明に係る細胞工学用支持体の使用時に播種される細胞は、例えば、表皮細胞，ケラチン生成細胞，脂肪細胞，肝細胞，神経細胞，神経膠細胞，星状膠細胞，上皮細胞，乳房表皮細胞，鳥細胞，内皮細胞，間葉細胞，真皮線維芽細胞，間皮細胞，造骨細胞，平滑筋細胞，横紋筋細胞，靭帯線維芽細胞，腱線維芽細胞及び軟骨細胞，骨髄細胞，骨芽細胞，歯胚細胞，歯根膜細胞，歯髄細胞，体性幹細胞，またはＥＳ細胞等が用いられる。
【００２５】
本発明に係る細胞工学用支持体の使用方法は、先ず予め必要とされる形状に作製された細胞工学用支持体に水，生理食塩水，培養液等の水溶液を満たし、その後、支持体を水分吸収体上に静置する。水分吸収体は支持体から適宜水分を吸収可能な素材であれば特に限定されずに使用される。例えば、セルロース系，紙系の濾紙，水分吸収性高分子材，無機質あるいは有機質材料からなる多孔質ブロック材が好ましい。
【００２６】
静置後には支持体から水分が多く吸収される前に速やかに、予め調整された細胞懸濁液を支持体の上側から支持体に向かって滴下させる。このとき、細胞懸濁液が支持体の外側を伝わって水分吸収体に流れることを防ぐように滴下速度を調整する。
【００２７】
この方法によれば、細胞工学用支持体中に予め含まれていた水溶液が吸収体に吸収されると共に上側から滴下された細胞懸濁液が外圧を加えなくても容易に支持体中に水溶液と入れ替わるように支持体中に浸透していくため、細胞に外圧を加えることなく支持体内に細胞懸濁液を均一に入れることが可能である。また、下部に細胞が通過しない層があるために細胞懸濁液中の細胞全てを支持体中へ入れることが可能であり、結果として支持体内に入れた細胞の量も正確に把握することが可能となるのである。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例により具体的に示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
＜細胞工学用支持体＞
＜実施例１＞
ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ブロック＋ＰＬＧＡメンブレン
分子量２５０，０００のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径５００μｍの塩化ナトリウムと混合した後、凍結乾燥してジオキサンを除去して塩化ナトリウム粒子を含む平均孔径２５μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製した。この多孔質生体吸収性高分子を粉砕してから水を用いて塩化ナトリウム粒子を取り除いた後、３００〜７１０μｍの篩に順次かけて平均粒径４９０μｍの生体吸収性顆粒状多孔質物質とした。この生体吸収性顆粒状多孔質物質を型に入れ１５００ｇ／ｃｍ２の圧力を保ったまま、温度１０５℃で加熱することによって、孔のサイズが平均５４０μｍ，空隙率８５％，直径９ｍｍで厚さ３ｍｍ，破壊強度が０．２５ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子（上部）を作製した。なお、各実施例に記載の破壊強度は第１５段落に記載した条件で測定した。
一方で、分子量２５０，０００のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、型に流し込んで凍結乾燥してから厚さが１／１０になるようプレスし、厚さ０．２ｍｍのメンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体（下部１）を作製した。このメンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体の平均孔径は２０μｍであった。
メンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体（下部１）φ９ｍｍの円盤に成形したものを上部の下に配置してから温度６８℃で加熱することによって、上部と下部からなる細胞工学用支持体を作製した。
【００３０】
＜実施例２＞
ポリL-乳酸（ＰＬＬＡ）ブロック＋ＰＬＬＡメンブレン
分子量２５０，０００のポリＬ−乳酸をクロロホルムに溶解させた後、粒径５００μｍの塩化ナトリウムと混合した後、凍結乾燥してジオキサンを除去して塩化ナトリウム粒子を含む孔径２０μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製した。この多孔質生体吸収性高分子を粉砕してから水を用いて塩化ナトリウム粒子を取り除いた後、７１０〜１０００の篩にかけて平均粒径８４０μｍの生体吸収性顆粒状多孔質物質とした。この生体吸収性顆粒状多孔質物質を型に入れ８００ｇ／ｃｍ２の圧力を保ったまま、温度１８０℃で加熱することによって、孔のサイズが平均４６０μｍ，空隙率８７％，直径９ｍｍで厚さ２ｍｍ，破壊強度が０．８ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子（上部）を作製した。
一方で、分子量２５０，０００のポリＬ−乳酸をクロロホルムに溶解させた後、型に流し込んで凍結乾燥してから厚さが１／１０になるようプレスし、厚さ０．１５ｍｍのメンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体（下部１）を作製した。
メンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体（下部１）φ９ｍｍの円盤に成形したものを上部の下に配置してから温度１８０℃で加熱することによって、上部と下部からなる細胞工学用支持体を作製した。
【００３１】
＜実施例３＞
ハイドロキシアパタイト含有ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ブロック＋ＰＬＬＡメンブレン
分子量２５０，０００のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体をテトラヒロドフランに溶解させた後、粒径２０μｍのハイドロキシアパタイトと粒径５００μｍの塩化ナトリウムと混合した後、凍結乾燥してジオキサンを除去して塩化ナトリウム粒子を含む平均孔径３１μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製した。この多孔質生体吸収性高分子を粉砕してから水を用いて塩化ナトリウム粒子を取り除いた後、１５０〜７１０μｍの篩にかけて平均粒径３２０μｍの生体吸収性顆粒状多孔質物質とした。この生体吸収性顆粒状多孔質物質を型に入れ８００ｇ／ｃｍ２の圧力を保ったまま温度１１０℃で加熱することによって、孔のサイズが平均６２０μｍ，空隙率７８％，直径９ｍｍで厚さ２ｍｍ，破壊強度が０．３５ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子（上部）を作製した。
一方で、分子量２５０，０００のポリＬ−乳酸をジオキサンに溶解させた、粒径５００μｍの塩化ナトリウムと混合した後に型に流し込んで凍結乾燥し、その後、水を用いて塩化ナトリウム粒子を取り除き乾燥させて、厚さ０．２ｍｍの薄いスポンジ状の多孔質生体吸収性高分子体（下部２）を作製した。この多孔質生体吸収性高分子体は、平均３００μｍの円形開放大孔と平均８μｍの円形開放小孔とを有していた。
薄いスポンジ状の多孔質生体吸収性高分子体（下部２）φ９ｍｍの円盤に成形したものを上部の下に配置してから温度８０℃で加熱することによって、上部と下部からなる細胞工学用支持体を作製した。
【００３２】
＜細胞の準備＞
細胞１ ヒト腸骨骨髄液から採取した間葉系幹細胞
ヒト腸骨骨髄液から採取した細胞を１０％ＦＢＳ，ＤＭＥＭ培地で懸濁した後、有核細胞数１×１０５細胞個／１０ｃｍ２を培養皿へ移し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、非接着細胞（造血系細胞）を除いた。以後３日に１回の割合で培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から３ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をCoulterカウンター（Ｚ１シングル，ベックマンコールター社製）で計測し、そして５，０００細胞個／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
【００３３】
細胞２ ウサギの大腿骨・脛骨から採取した間葉系幹細胞
６週齢のウサギの大腿骨，脛骨から筋肉及び靭帯などを除いてこれを切除し、その両端を切断し、αＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，３２単位／ｍｌ ペンシリン，５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で骨髄内を洗浄した。よく懸濁して骨髄液をほぐした後、３００×ｇで５分間遠心分離して細胞を分離した。前記骨髄から約７×１０７個の有核細胞を得た。骨髄から採取した細胞をＷＢＣ３．７５×１０７細胞個／７５ｃｍ２で培養フラスコへ移し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、以後３日に１回の割合で培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から３ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をCoulterカウンター（Ｚ１シングル，ベックマンコールター社製）で計測し、そして５，０００細胞個／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
【００３４】
上記の通り準備した細胞支持体をDMEM倍地中に浸漬させて減圧状態とし，培地を内部まで浸潤させた後，吸水体の上に移動して，上記の通り準備した移植細胞を滴下することにより播種し、各々の条件下で培養し、細胞移植治療材料を作製した。
【００３５】
＜細胞の播種方法１＞
軟骨分化用培養液（αＭＥＭ，グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ，１０−７Ｍ デキサメサゾン，５０ｍｇ／ｍｌ アスコルビン酸２リン酸，１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−ｂ，６．２５ｍｇ／ｍｌ インスリン，６．２５ｍｇ／ｍｌ トランスフェリン，６．２５ｎｇ／ｍｌ セレン酸，５．３３ｍｇ／ｍｌ リノレイン酸，１．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン）に２００,０００細胞個／ｍｌの密度で懸濁させた移植細胞１（０．５ｍｌ）を細胞工学用支持体上に滴下して播種し、容器に培地とともに入れて３７℃にて３日毎に培地を交換しながら４週間培養して骨組織再生用細胞移植体を作製した。
細胞に大きな力が加わることがなく細胞を細胞工学用支持体の全体に容易に播種することができ、細胞が外部に漏れ出ていないため支持体内に播種した細胞の量も正確に把握することが可能である。
【００３６】
＜細胞の播種方法２＞
軟骨分化用培養液（αＭＥＭ，グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ，１０−７Ｍ デキサメサゾン，５０ｎｇ／ｍｌ アスコルビン酸２リン酸，１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−ｂ，６．２５ｍｇ／ｍｌ インスリン，６．２５ｍｇ／ｍｌ トランスフェリン，６．２５ｎｇ／ｍｌ セレン酸，５．３３ｍｇ／ｍｌ リノレイン酸，１．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン）に２００,０００細胞個／ｍｌの密度で懸濁させた移植細胞２（０．５ｍｌ）を細胞支持体２上に滴下して播種し、容器に培地とともに入れて３７℃にて３日毎に培地を交換しながら４週間培養して骨組織再生用細胞移植体を作製した。
細胞に大きな力が加わることがなく細胞を細胞工学用支持体の全体に容易に播種することができ、細胞が外部に漏れ出ていないため支持体内に播種した細胞の量も正確に把握することが可能である。
【００３７】
＜細胞の播種方法３＞
骨分化用培養液（αＭＥＭ，グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ，１０％ＦＢＳ，１０−７Ｍ デキサメサゾン，５０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸２リン酸，１０ｍＭ βグリセロリン酸）に２００,０００細胞個／ｍｌの密度で懸濁させた移植細胞１（０．５ｍｌ）を細胞支持体３上に滴下して播種し、容器に培地とともに入れて３７℃にて３日毎に培地を交換しながら４週間培養して骨組織再生用細胞移植体を作製した。
細胞に大きな力が加わることがなく細胞を細胞工学用支持体の全体に容易に播種することができ、細胞が外部に漏れ出ていないため支持体内に播種した細胞の量も正確に把握することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織の代替品として使用され、特に形状安定性に優れ且つ内部に細胞を播種及び／または培養させることが可能な生体吸収性高分子材料からなる細胞工学用支持体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、手術，外傷等によって喪失した生体組織を体細胞や幹細胞等によって再構築し、それを患者に移植することにより喪失した生体組織を再生する治療方法が行われている。この治療において生体組織を再生するためには、播種する細胞が生体組織を再建するまでの間に足場となる支持体（マトリックス）が重要となる。
【０００３】
従来の支持体としては、乳酸，グリコール酸，カプロラクトン等から成る生体吸収性高分子材料をジオキサンのような有機溶媒に溶解し、この溶液を凍結乾燥させて作製された孔径が５〜１００μｍ程度のスポンジ状の細胞工学用支持体がある（例えば、特許文献１参照。）。また、このようなスポンジ状の細胞工学用支持体の作製時に溶液中に粒子径が約５０〜約５００μｍの水溶性で無毒性の粒子状物質（例えば、塩化ナトリウム粉末等）を入れ、有機溶媒を取り除いて粒子状物質入りの生分解性高分子体を作製し、その後水を用いて粒子状物質を取り除くことで作製される約５０〜約５００μｍの円形開放大孔と２０μｍ以下の円形開放小孔とを持つ多孔質構造の生体吸収性高分子材料を細胞の支持体がある（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
細胞工学用支持体は細胞が播種された状態で使用されるが、前述した従来の多孔質構造を持つ支持体では、均一に細胞が播種されている状態の支持体とすることが難しいという問題があった。即ち、支持体は小孔構造を有する多孔質の三次元構造であるため、その中心部まで細胞を懸濁した培養液（以後、単に細胞懸濁液と呼ぶことがある）で満たすことが容易ではなく、例えば孔径が２０μｍより小さな支持体に厚さ２ｍｍ以上に渡って全体に細胞を播種することは非常に困難であった。
【０００５】
細胞懸濁液中に支持体を沈めてから大気圧より低い圧力あるいは真空とすることにより支持体中に細胞懸濁液を浸透させる方法も提案されている（例えば、特許文献３の請求項８参照。）。しかし実際には、このように負圧を利用しただけでは支持体全体に細胞懸濁液を浸透させることは難しいため、特許文献３の方法では細胞懸濁液を浸透させる経路をレーザー光等で形成している。また負圧を利用して圧力を大きく変化させることは細胞にとって好ましい状態ではなく、更に、細胞の量は懸濁液中の濃度で規定されるので、負圧を用いた方法では実際に支持体中に含まれた細胞の量を把握することが難しいという問題もあった。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−２３４８４４号公報
【特許文献２】特表２００２−５４１９２５号公報
【特許文献３】特開２００６−５０８７１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は前記の問題を鑑み、細胞を支持体の全体に容易に播種することができ、細胞に大きな力が加わることがなく、支持体内の細胞の量も正確に把握することが可能な厚さ２ｍｍ以上の多孔質細胞支持体とその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、細胞が素通り可能な孔径の３００〜３０００μｍの孔を有する特定の空隙率のブロック状の支持体を用いると容易に支持体全体に細胞を播種することが可能であることを利用し、その底を、細胞は通さず培養液を通す多孔質膜で塞ぐことによって前期課題が解決できることを見いだして本発明を完成させた。
【０００９】
即ち本発明は、３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体の厚さ２ｍｍ以上の上部と、２〜３０μｍの平均孔径を有する多孔質生体吸収性高分子体の下部から構成されることを特徴とする細胞工学用支持体である。このとき、上部：下部の厚さの比が、上部及び底部を通る縦断面で見たときに１００：１〜１０：２であることが好ましい。
【００１０】
更に本発明は、有機溶媒に生体吸収性高分子材料が溶解された溶液にその有機溶媒には溶解せず且つ生体吸収性高分子材料を溶解しない液で溶解する粒径が１００〜２０００μｍの粒子状物質を略均一に混合し凍結した後に乾燥して有機溶媒を取り除くことによって粒子状物質を含有した孔径が５〜５０μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製し、この多孔質生体吸収性高分子を粉砕してから粒子状物質を前記生体吸収性高分子を溶解しない液で溶解して取り除いた後、篩にかけて１００〜３０００μｍの平均粒径の生体吸収性顆粒状多孔質物質とし、これらの生体吸収性顆粒状多孔質物質を所定形状の容器内に入れて加圧し加熱して３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体（上部）を作製し、 一方で、生体吸収性高分子材料を有機溶媒に溶解し、この溶液を凍結乾燥させた後にプレスすることで作製できる平均孔径が２〜３０μｍのメンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体（下部１）、あるいは、生体吸収性高分子材料を有機溶媒に溶解し、粒子径が５０〜５００μｍであって水溶性で無毒性の粒子状物質を入れ、有機溶媒を取り除いて粒子状物質入りの生体吸収性高分子体を作製し、その後水を用いて粒子状物質を溶解させて取り除くことで作製される５０〜５００μｍの円形開放大孔と２〜３０μｍの円形開放小孔とを持つ多孔質生体吸収性高分子体（下部２）を作製し、該上部と、下部１または下部２との接着面を加熱するか用いた生体吸収性高分子材料を溶解させる有機溶媒で溶かして上部と下部とを溶着することを特徴とする細胞工学用支持体の作製方法である。このとき、生体吸収性顆粒状多孔質物質を５００〜３０００ｇ／ｃｍ2で加圧した状態の体積を保って６０〜２００℃の条件で加熱することが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、細胞を支持体の全体に容易に播種することができ、細胞に不要な力が加わることがなく、支持体内に播種された細胞の量も正確に把握することが可能な厚さ２ｍｍ以上の細胞工学用支持体とその製造方法である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明で用いる生体吸収性高分子材料は、生体に安全であり、一定期間体内でその形態を維持できれば特に限定することなく用いることができる。例えば、従来から用いられているポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体，ポリ−ε−カプロラクトン，乳酸−ε−カプロラクトン共重合体，ポリアミノ酸，ポリオルソエステル及びそれらの共重合体中から選択される少なくとも一種を例示することができ、中でもポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体が米国食品医薬庁（ＦＤＡ）から人体に無害な高分子として承認されていること及びその実績の面から最も好ましい。生体吸収性高分子材料の重量平均分子量は５,０００〜２,０００,０００であることが好ましく、より好ましくは１０,０００〜５００,０００である。
【００１３】
本発明に係る細胞工学用支持体において、その上部を構成する３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体は、細胞を自由に通す３００〜３０００μｍの孔を有し空隙率７５〜９７％のブロック状の多孔質生体吸収性の高分子体である。平均孔径が３００μｍより小さいと細胞を自由に通す効果が少なくなり内部まで十分に細胞を播種することができなくなる。３０００μｍよりも大きいと支持体の強度が低下してしまう。なお、生体吸収性高分子材料内に粉末状のリン酸カルシウム、例えばハイドロキシアパタイトやβ三リン酸カルシウムを分散させてもよい。
【００１４】
本発明に係る細胞工学用支持体において、その上部を構成するブロック状生体吸収性高分子体の空隙率は７５〜９７％であることが必要である。本発明で空隙率とは、体積が同じである同じ材料を用いた場合において、孔のあいている材料の重量をＷ1，孔のあいていない材料の重量をＷ2としたときに、（１−Ｗ1／Ｗ2）×１００で示される数値を言う。このブロック状生体吸収性高分子体は、空隙率が７５％未満では空隙が少ないため細胞の培養効率が不足してしまい、９７％を超えると生体吸収性高分子材料が少ないため強度が低下してしまい細胞の足場としての機能を低下させることになり細胞の培養効率が不足するため適切ではない。
【００１５】
上部のブロック状生体吸収性高分子体の破壊強度が０.０５ＭＰａ未満では形状に関係なく生体内で必要とされる形を維持することができず、一方、２ＭＰａを超える破壊強度のものを作製することは難しい。なお、本願での破壊強度とは直径１０ｍｍ×高さ２ｍｍの円柱状の試験体をクロスヘッドスピード１ｍｍ／分で圧縮させた際の圧縮破壊強度を意味する。
【００１６】
上部を構成する、３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体の作製方法は、有機溶媒に生体吸収性高分子材料が溶解された溶液にその有機溶媒には溶解せず且つ生体吸収性高分子材料を溶解しない液で溶解する粒径が１００〜２０００μｍの粒子状物質を略均一に混合し凍結した後に乾燥して有機溶媒を取り除くことによって粒子状物質を含有した孔径が５〜５０μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製し、この多孔質生体吸収性高分子をミル等で粉砕してから粒子状物質を前記生体吸収性高分子を溶解しない液で溶解して取り除いた後、篩にかけて１００〜３０００μｍの平均粒径の生体吸収性顆粒状多孔質物質とし、これらの生体吸収性顆粒状多孔質物質を所定形状の容器内に入れて加圧し加熱して作製する。
【００１７】
加圧の条件は生体吸収性顆粒状多孔質物質の材質，形状や大きさによって異なるが、５００〜３０００ｇ／ｃｍ２であることが好ましい。この加圧条件から外れると、水分に触れたときの体積変化が大きくなってしまう。更に、５００ｇ／ｃｍ２未満ではブロック状細胞工学用支持体の形状安定性が不足してしまう虞があり、３０００ｇ／ｃｍ２を超えると細胞が十分に増殖可能な孔が残り難い。より好ましくは１０００〜２０００ｇ／ｃｍ２である。
【００１８】
加熱の条件も生体吸収性顆粒状多孔質物質の材質，形状や大きさによって異なるが、前記の加圧を行った状態で体積を保って加熱するのであれば６０〜２００℃の範囲であればよい。６０℃未満では顆粒状の生分解性多孔質高分子同士の結合が弱くなり顆粒を集めてブロック体とすることが難かしくなる傾向がある。一方、２００℃を超えると顆粒状の生分解性多孔質高分子が変性してしまう虞がある。
【００１９】
下部の２〜３０μｍ未満の平均孔径を有する多孔質生体吸収性高分子体は、全ての細胞を完全には通過させずに培養液を通すためのフィルターの役目を果たす。
【００２０】
下部の２〜３０μｍ未満の平均孔径を有する多孔質生体吸収性高分子体の作製方法は、生体吸収性高分子材料を有機溶媒に溶解し、この溶液を凍結乾燥させることで作製できる孔径が５〜１００μｍ程度のスポンジ状の多孔質生体吸収性高分子体をプレスして平均孔径が２〜３０μｍのメンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体を得る方法がある。あるいは、溶液中に粒子径が５０〜５００μｍの水溶性で無毒性の粒子状物質（例えば、塩化ナトリウム粉末等）を入れ、有機溶媒を取り除いて粒子状物質入りの生体吸収性高分子体を作製し、その後水を用いて粒子状物質を溶解させて取り除くことで作製される５０〜５００μｍの円形開放大孔と２〜３０μｍの円形開放小孔とを持つ多孔質生体吸収性高分子体を得る方法がある。
【００２１】
本発明において多孔質生体吸収性高分子体１は、細胞懸濁液を上方向から流す際に細胞が全て支持体外に流れ出てしまうことを防ぐために支持体の下部に配置されるものであるから、支持体の形状に合わせる必要があり、下部の全面を覆う形状であることが好ましい。例えば、上部の形状が直方体の支持体であれば、下部は底面全体を覆うように支持体を構成するよう上部に接着（溶着）固定され配置される。上部の形状が球形であれば、少なくとも直径の下から１／４の高さを覆うように下部が配置されていることが好ましい。
【００２２】
上部：下部の厚さの比は上部及び底部を通る縦断面で見たときに１００：１〜１０：２であることが好ましい。
【００２３】
本発明に係る細胞工学用支持体を製造する際に上部を構成するブロック状生体吸収性高分子体と下部を構成する多孔質生体吸収性高分子体を溶着するには、加熱により行う方法と、生体吸収性高分子体を構成する生体吸収性高分子材料を溶解させる有機溶媒を介して行う方法との何れかを採用するのが好ましい。有機溶媒としては予め生体吸収性高分子材料を溶解させたものを使用してもよい。
【００２４】
本発明に係る細胞工学用支持体の使用時に播種される細胞は、例えば、表皮細胞，ケラチン生成細胞，脂肪細胞，肝細胞，神経細胞，神経膠細胞，星状膠細胞，上皮細胞，乳房表皮細胞，鳥細胞，内皮細胞，間葉細胞，真皮線維芽細胞，間皮細胞，造骨細胞，平滑筋細胞，横紋筋細胞，靭帯線維芽細胞，腱線維芽細胞及び軟骨細胞，骨髄細胞，骨芽細胞，歯胚細胞，歯根膜細胞，歯髄細胞，体性幹細胞，またはＥＳ細胞等が用いられる。
【００２５】
本発明に係る細胞工学用支持体の使用方法は、先ず予め必要とされる形状に作製された細胞工学用支持体に水，生理食塩水，培養液等の水溶液を満たし、その後、支持体を水分吸収体上に静置する。水分吸収体は支持体から適宜水分を吸収可能な素材であれば特に限定されずに使用される。例えば、セルロース系，紙系の濾紙，水分吸収性高分子材，無機質あるいは有機質材料からなる多孔質ブロック材が好ましい。
【００２６】
静置後には支持体から水分が多く吸収される前に速やかに、予め調整された細胞懸濁液を支持体の上側から支持体に向かって滴下させる。このとき、細胞懸濁液が支持体の外側を伝わって水分吸収体に流れることを防ぐように滴下速度を調整する。
【００２７】
この方法によれば、細胞工学用支持体中に予め含まれていた水溶液が吸収体に吸収されると共に上側から滴下された細胞懸濁液が外圧を加えなくても容易に支持体中に水溶液と入れ替わるように支持体中に浸透していくため、細胞に外圧を加えることなく支持体内に細胞懸濁液を均一に入れることが可能である。また、下部に細胞が通過しない層があるために細胞懸濁液中の細胞全てを支持体中へ入れることが可能であり、結果として支持体内に入れた細胞の量も正確に把握することが可能となるのである。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例により具体的に示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
＜細胞工学用支持体＞
＜実施例１＞
ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ブロック＋ＰＬＧＡメンブレン
分子量２５０，０００のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径５００μｍの塩化ナトリウムと混合した後、凍結乾燥してジオキサンを除去して塩化ナトリウム粒子を含む平均孔径２５μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製した。この多孔質生体吸収性高分子を粉砕してから水を用いて塩化ナトリウム粒子を取り除いた後、３００〜７１０μｍの篩に順次かけて平均粒径４９０μｍの生体吸収性顆粒状多孔質物質とした。この生体吸収性顆粒状多孔質物質を型に入れ１５００ｇ／ｃｍ２の圧力を保ったまま、温度１０５℃で加熱することによって、孔のサイズが平均５４０μｍ，空隙率８５％，直径９ｍｍで厚さ３ｍｍ，破壊強度が０．２５ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子（上部）を作製した。なお、各実施例に記載の破壊強度は第１５段落に記載した条件で測定した。
一方で、分子量２５０，０００のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、型に流し込んで凍結乾燥してから厚さが１／１０になるようプレスし、厚さ０．２ｍｍのメンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体（下部１）を作製した。このメンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体の平均孔径は２０μｍであった。
メンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体（下部１）φ９ｍｍの円盤に成形したものを上部の下に配置してから温度６８℃で加熱することによって、上部と下部からなる細胞工学用支持体を作製した。
【００３０】
＜実施例２＞
ポリL-乳酸（ＰＬＬＡ）ブロック＋ＰＬＬＡメンブレン
分子量２５０，０００のポリＬ−乳酸をクロロホルムに溶解させた後、粒径５００μｍの塩化ナトリウムと混合した後、凍結乾燥してジオキサンを除去して塩化ナトリウム粒子を含む孔径２０μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製した。この多孔質生体吸収性高分子を粉砕してから水を用いて塩化ナトリウム粒子を取り除いた後、７１０〜１０００の篩にかけて平均粒径８４０μｍの生体吸収性顆粒状多孔質物質とした。この生体吸収性顆粒状多孔質物質を型に入れ８００ｇ／ｃｍ２の圧力を保ったまま、温度１８０℃で加熱することによって、孔のサイズが平均４６０μｍ，空隙率８７％，直径９ｍｍで厚さ２ｍｍ，破壊強度が０．８ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子（上部）を作製した。
一方で、分子量２５０，０００のポリＬ−乳酸をクロロホルムに溶解させた後、型に流し込んで凍結乾燥してから厚さが１／１０になるようプレスし、厚さ０．１５ｍｍのメンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体（下部１）を作製した。
メンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体（下部１）φ９ｍｍの円盤に成形したものを上部の下に配置してから温度１８０℃で加熱することによって、上部と下部からなる細胞工学用支持体を作製した。
【００３１】
＜実施例３＞
ハイドロキシアパタイト含有ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ブロック＋ＰＬＬＡメンブレン
分子量２５０，０００のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体をテトラヒロドフランに溶解させた後、粒径２０μｍのハイドロキシアパタイトと粒径５００μｍの塩化ナトリウムと混合した後、凍結乾燥してジオキサンを除去して塩化ナトリウム粒子を含む平均孔径３１μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製した。この多孔質生体吸収性高分子を粉砕してから水を用いて塩化ナトリウム粒子を取り除いた後、１５０〜７１０μｍの篩にかけて平均粒径３２０μｍの生体吸収性顆粒状多孔質物質とした。この生体吸収性顆粒状多孔質物質を型に入れ８００ｇ／ｃｍ２の圧力を保ったまま温度１１０℃で加熱することによって、孔のサイズが平均６２０μｍ，空隙率７８％，直径９ｍｍで厚さ２ｍｍ，破壊強度が０．３５ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子（上部）を作製した。
一方で、分子量２５０，０００のポリＬ−乳酸をジオキサンに溶解させた、粒径５００μｍの塩化ナトリウムと混合した後に型に流し込んで凍結乾燥し、その後、水を用いて塩化ナトリウム粒子を取り除き乾燥させて、厚さ０．２ｍｍの薄いスポンジ状の多孔質生体吸収性高分子体（下部２）を作製した。この多孔質生体吸収性高分子体は、平均３００μｍの円形開放大孔と平均８μｍの円形開放小孔とを有していた。
薄いスポンジ状の多孔質生体吸収性高分子体（下部２）φ９ｍｍの円盤に成形したものを上部の下に配置してから温度８０℃で加熱することによって、上部と下部からなる細胞工学用支持体を作製した。
【００３２】
＜細胞の準備＞
細胞１ ヒト腸骨骨髄液から採取した間葉系幹細胞
ヒト腸骨骨髄液から採取した細胞を１０％ＦＢＳ，ＤＭＥＭ培地で懸濁した後、有核細胞数１×１０５細胞個／１０ｃｍ２を培養皿へ移し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、非接着細胞（造血系細胞）を除いた。以後３日に１回の割合で培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から３ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をCoulterカウンター（Ｚ１シングル，ベックマンコールター社製）で計測し、そして５，０００細胞個／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
【００３３】
細胞２ ウサギの大腿骨・脛骨から採取した間葉系幹細胞
６週齢のウサギの大腿骨，脛骨から筋肉及び靭帯などを除いてこれを切除し、その両端を切断し、αＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，３２単位／ｍｌ ペンシリン，５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で骨髄内を洗浄した。よく懸濁して骨髄液をほぐした後、３００×ｇで５分間遠心分離して細胞を分離した。前記骨髄から約７×１０７個の有核細胞を得た。骨髄から採取した細胞をＷＢＣ３．７５×１０７細胞個／７５ｃｍ２で培養フラスコへ移し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、以後３日に１回の割合で培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から３ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をCoulterカウンター（Ｚ１シングル，ベックマンコールター社製）で計測し、そして５，０００細胞個／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
【００３４】
上記の通り準備した細胞支持体をDMEM倍地中に浸漬させて減圧状態とし，培地を内部まで浸潤させた後，吸水体の上に移動して，上記の通り準備した移植細胞を滴下することにより播種し、各々の条件下で培養し、細胞移植治療材料を作製した。
【００３５】
＜細胞の播種方法１＞
軟骨分化用培養液（αＭＥＭ，グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ，１０−７Ｍ デキサメサゾン，５０ｍｇ／ｍｌ アスコルビン酸２リン酸，１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−ｂ，６．２５ｍｇ／ｍｌ インスリン，６．２５ｍｇ／ｍｌ トランスフェリン，６．２５ｎｇ／ｍｌ セレン酸，５．３３ｍｇ／ｍｌ リノレイン酸，１．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン）に２００,０００細胞個／ｍｌの密度で懸濁させた移植細胞１（０．５ｍｌ）を細胞工学用支持体上に滴下して播種し、容器に培地とともに入れて３７℃にて３日毎に培地を交換しながら４週間培養して骨組織再生用細胞移植体を作製した。
細胞に大きな力が加わることがなく細胞を細胞工学用支持体の全体に容易に播種することができ、細胞が外部に漏れ出ていないため支持体内に播種した細胞の量も正確に把握することが可能である。
【００３６】
＜細胞の播種方法２＞
軟骨分化用培養液（αＭＥＭ，グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ，１０−７Ｍ デキサメサゾン，５０ｎｇ／ｍｌ アスコルビン酸２リン酸，１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−ｂ，６．２５ｍｇ／ｍｌ インスリン，６．２５ｍｇ／ｍｌ トランスフェリン，６．２５ｎｇ／ｍｌ セレン酸，５．３３ｍｇ／ｍｌ リノレイン酸，１．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン）に２００,０００細胞個／ｍｌの密度で懸濁させた移植細胞２（０．５ｍｌ）を細胞支持体２上に滴下して播種し、容器に培地とともに入れて３７℃にて３日毎に培地を交換しながら４週間培養して骨組織再生用細胞移植体を作製した。
細胞に大きな力が加わることがなく細胞を細胞工学用支持体の全体に容易に播種することができ、細胞が外部に漏れ出ていないため支持体内に播種した細胞の量も正確に把握することが可能である。
【００３７】
＜細胞の播種方法３＞
骨分化用培養液（αＭＥＭ，グルコース４．５ｍｇ／ｍｌ，１０％ＦＢＳ，１０−７Ｍ デキサメサゾン，５０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸２リン酸，１０ｍＭ βグリセロリン酸）に２００,０００細胞個／ｍｌの密度で懸濁させた移植細胞１（０．５ｍｌ）を細胞支持体３上に滴下して播種し、容器に培地とともに入れて３７℃にて３日毎に培地を交換しながら４週間培養して骨組織再生用細胞移植体を作製した。
細胞に大きな力が加わることがなく細胞を細胞工学用支持体の全体に容易に播種することができ、細胞が外部に漏れ出ていないため支持体内に播種した細胞の量も正確に把握することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体の厚さ２ｍｍ以上の上部と、２〜３０μｍの平均孔径を有する多孔質生体吸収性高分子体の下部から構成されることを特徴とする細胞工学用支持体。
【請求項２】
上部：下部の厚さの比が、上部及び下部を通る縦断面で見た時に１００：１〜１０：２である請求項１に記載の細胞工学用支持体。
【請求項３】
有機溶媒に生体吸収性高分子材料が溶解された溶液にその有機溶媒には溶解せず且つ生体吸収性高分子材料を溶解しない液で溶解する粒径が１００〜２０００μｍの粒子状物質を略均一に混合し凍結した後に乾燥して有機溶媒を取り除くことによって粒子状物質を含有した孔径が５〜５０μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製し、この多孔質生体吸収性高分子を粉砕してから粒子状物質を前記生体吸収性高分子を溶解しない液で溶解して取り除いた後、篩にかけて１００〜３０００μｍの平均粒径の生体吸収性顆粒状多孔質物質とし、これらの生体吸収性顆粒状多孔質物質を所定形状の容器内に入れて加圧し加熱して３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体（上部）を作製し、
一方で、生体吸収性高分子材料を有機溶媒に溶解し、この溶液を凍結乾燥させた後にプレスすることで作製できる平均孔径が２〜３０μｍのメンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体（下部１）、
あるいは、生体吸収性高分子材料を有機溶媒に溶解し、粒子径が約５０〜約５００μｍであって水溶性で無毒性の粒子状物質を入れ、有機溶媒を取り除いて粒子状物質入りの生体吸収性高分子体を作製し、その後水を用いて粒子状物質を溶解させて取り除くことで作製される５０〜５００μｍの円形開放大孔と２〜３０μｍの円形開放小孔とを持つ多孔質生体吸収性高分子体（下部２）を作製し、
該上部と、下部１または下部２との接着面を加熱するか用いた生体吸収性高分子材料を溶解させる有機溶媒で溶かして上部と下部とを溶着することを特徴とする細胞工学用支持体の作製方法。
【請求項４】
生体吸収性顆粒状多孔質物質を５００〜３０００ｇ／ｃｍ2で加圧した状態の体積を保って６０〜２００℃で加熱する請求項３に記載の細胞工学用支持体の作製方法。
【請求項１】
３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体の厚さ２ｍｍ以上の上部と、２〜３０μｍの平均孔径を有する多孔質生体吸収性高分子体の下部から構成されることを特徴とする細胞工学用支持体。
【請求項２】
上部：下部の厚さの比が、上部及び下部を通る縦断面で見た時に１００：１〜１０：２である請求項１に記載の細胞工学用支持体。
【請求項３】
有機溶媒に生体吸収性高分子材料が溶解された溶液にその有機溶媒には溶解せず且つ生体吸収性高分子材料を溶解しない液で溶解する粒径が１００〜２０００μｍの粒子状物質を略均一に混合し凍結した後に乾燥して有機溶媒を取り除くことによって粒子状物質を含有した孔径が５〜５０μｍの小孔構造を有する多孔質生体吸収性高分子を作製し、この多孔質生体吸収性高分子を粉砕してから粒子状物質を前記生体吸収性高分子を溶解しない液で溶解して取り除いた後、篩にかけて１００〜３０００μｍの平均粒径の生体吸収性顆粒状多孔質物質とし、これらの生体吸収性顆粒状多孔質物質を所定形状の容器内に入れて加圧し加熱して３００〜３０００μｍの平均孔径を有し空隙率７５〜９７％であって破壊強度が０.０５〜２ＭＰａのブロック状生体吸収性高分子体（上部）を作製し、
一方で、生体吸収性高分子材料を有機溶媒に溶解し、この溶液を凍結乾燥させた後にプレスすることで作製できる平均孔径が２〜３０μｍのメンブレン状の多孔質生体吸収性高分子体（下部１）、
あるいは、生体吸収性高分子材料を有機溶媒に溶解し、粒子径が約５０〜約５００μｍであって水溶性で無毒性の粒子状物質を入れ、有機溶媒を取り除いて粒子状物質入りの生体吸収性高分子体を作製し、その後水を用いて粒子状物質を溶解させて取り除くことで作製される５０〜５００μｍの円形開放大孔と２〜３０μｍの円形開放小孔とを持つ多孔質生体吸収性高分子体（下部２）を作製し、
該上部と、下部１または下部２との接着面を加熱するか用いた生体吸収性高分子材料を溶解させる有機溶媒で溶かして上部と下部とを溶着することを特徴とする細胞工学用支持体の作製方法。
【請求項４】
生体吸収性顆粒状多孔質物質を５００〜３０００ｇ／ｃｍ2で加圧した状態の体積を保って６０〜２００℃で加熱する請求項３に記載の細胞工学用支持体の作製方法。
【公開番号】特開２０１２−２０５６５５（Ｐ２０１２−２０５６５５Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７２０６１（Ｐ２０１１−７２０６１）
【出願日】平成２３年３月２９日（２０１１．３．２９）
【出願人】（０００１８１２１７）株式会社ジーシー (279)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２９日（２０１１．３．２９）
【出願人】（０００１８１２１７）株式会社ジーシー (279)
【Ｆターム（参考）】
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