細胞生育用のポリマー
本発明は、肝細胞及び肝細胞様細胞の付着及び機能発現に用いるポリマー基質を提供する。特に、ポリマー基質はポリウレタンポリマーである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞が付着し、かつ肝細胞が一定期間機能を発現することができる特定のポリマーの提供に関する。肝細胞の付着、及び機能の維持のための特定のポリマーの使用も提供する。機能性の肝細胞の付着及び維持に用いるための本発明のポリマーの被覆により形成されるか又は該被覆を含む装置を更に提供する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤開発のコストは、化合物損耗率により大きく影響を受ける。市場に出回るすべての新薬について、約５０００から１０，０００の化合物が、約２５０に達する動物試験での前臨床試験で試される。動物試験に続いて、約５個の可能性のある薬が、本格的なヒト臨床試験に施され、たった１つが最終的な承認を得る（［１］）。これらの数字は、より正確な毒性予測モデルの開発が必要とされていることを明確に示す。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）由来のヒト幹細胞様細胞（ＨＬＣｓ）の産生は、かかる方法の一つである。本発明者らは、ヒト肝臓機能（［２−６］）の生体外のモデルを最近開発したが、長期に渡りその肝機能が効果的に維持されるかははっきりしていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、肝細胞の付着を可能にする特徴を有し、付着した細胞が良好な肝細胞機能の特性を表すことを示す一群のポリマーの同定に基づく。
【０００４】
第一の態様では、肝細胞及び肝細胞様細胞の付着及び機能発現に用いるポリマー基質を提供する。
【０００５】
本発明者らは、ＰＨＮＧＡＤ、ＭＤＩ及び増量剤を重合することにより形成したポリウレタン表面が、肝内胚葉の再播種に対して支援的な効果を提供することを見出した（肝細胞は通常は再播種できない）。また、ポリウレタン表面は、再播種の後少なくとも１５日間、肝細胞の同一性及び安定な機能発現を維持することを促す効果／役割を果たす。当該分野の研究に利用されるＰＨＮＧＡＤ、ＭＤＩ及び増量剤を重合することにより形成したポリウレタン表面の生理活性な性質はまた、他の真核生物、特に哺乳動物の細胞型に適用可能であり、汎用性があり確立された細胞外支持体を提供する。
【０００６】
本発明の一つの実施形態において、ポリマーはＰＨＮＧＡＤ、ＭＤＩ及び増量剤分子を重合することにより形成したポリウレタンポリマーである。
【０００７】
ＰＨＮＧＡＤはポリ（１，６−ヘキサンジオール／ネオペンチルグリコール／ジ（エチレングリコール）−ａｌｔ−アジピン酸）ジオールである。
【０００８】
ＭＤＩは４，４’−メチレンビス（フェニルイソチアネート）であり、増量剤は弾力性、湿潤性及び／若しくは表面トポグラフィーなどの物理的特性、並びに／又は細胞外マトリックスタンパク質を吸収する能力などの生化学的特性を増加させる働きをする。
【０００９】
適当な増量剤分子としては、１，４−ブタンジオール（ＢＤ）；３−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオール（ＤＭＡＰＤ）；３−ジエチルアミノ−１，２−プロパンジオール（ＤＥＡＰＤ）；（ＢＤ）、２，２，３，３，４，４，５，５−オクタフルオロ−１，６−ヘキサンジオール（ＯＦＨＤ）、１，３−プロピレングリコール（ＰＧ）、１，２−エチレングリコール（ＥＧ）、２−ニトロ−２−メチル−１、３−プロパンジオール（ＮＭＰＤ）、ジエチル−ビス−（ヒドロキシメチル）−マロネート（ＤＨＭ）、１，１２−ドデカンジオール、シクロドデカンジオール、ヒドロキノン−ビス（２−ヒドロキシエチル）エーテル、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＥＨＤ）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロパノールアラニン（ＤＩＰＡ）、エチレンジアミン、ｍ−フェニレン−４−ジアミノスルホン酸（ＰＤＳＡ）が挙げられる。
【００１０】
本発明者らは、三つの構成要素全て（ＰＨＮＧＡＤ、ＭＤＩ及び増量剤）から形成したポリマーが、適切な機能活性を示す肝細胞の付着を可能にすることができるが、一方増量剤を含まず、ＰＨＮＧＡＤ及びＭＤＩのみから形成したポリマーが肝細胞と結合しないことを見出した。
【００１１】
本発明での使用に好適なポリマーをポリマー１３４（図５参照）として本明細書中で識別するが、他の関連のポリマー（ポリマー１０３、１０４及び２４７）−表１参照−も肝細胞の付着及び機能発現の点において適切な特性を表す。
【００１２】
ここで用いるような肝細胞は、被検体の肝臓から、例えば生検により直接得られた肝細胞を含んでよい。しかしながら、好適な肝細胞は、肝細胞又は肝細胞様細胞に分化させた胚性幹細胞又は胚性幹細胞株に由来するものである。かかる細胞の例は、［３］に記載される。また、当技術分野で既知のリプログラムされた成熟細胞から得られる肝細胞様細胞も用いることができる（Takahashi & Yamanaka, (2006), Cell, 126, p663-676. 及び Takahashi et al, (2007), Cell, 131, p861-872.）。
【００１３】
更なる態様では、本明細書に記載したようなポリマーの機能性の肝細胞の付着用での使用を提供する。
【００１４】
本明細書で用いる「機能」又は「機能的」という用語は、肝細胞に通常付随する代謝活性を指す。従って、本発明の肝細胞は、望ましくはより活発な内分泌及び外分泌機能：ヒト血清タンパク質−フィブロネクチン、フィブリノーゲン及びトランスチレチンの産生、及びＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ２などの一つ又は複数のシトクロムｐ４５０酵素の発現の向上を示す。更に、かかる代謝活性は増大されることができ、及び/または細胞を他の基質に付着させるときよりも持続時間を長くすることができる。ＭＧ及び１３４の両方が、再播種の後１５日目に、肝細胞の維持に異なるレベルを示し、１３４はＣＹＰ３Ａ４、フィブロネクチン、フィブリノーゲン及びトランスチレチンについて約２倍の増加、ＣＹＰ１Ａ２について約６倍の増加を示す。
【００１５】
肝細胞は、適当な形状に形成された本発明のポリマーに直接付着させることができる。或いはまた、スピンコーティング、グラフティング又は浸漬コーティングのような適切な技術を用いて、ポリマーを適当な基質に物理的又は化学的に被覆することができる。当業者は、基質を被覆するのに用いる材料の溶液を表面の上に堆積させながら基質を特定のｒｐｍでスピンすることによるスピンコーティングを用いて２Ｄ−及び３Ｄ−の基質を被覆することを理解するであろう。当業者は、浸漬コーティングが基質を被覆するのに用いる材料溶液中に基質を特定の速度で含浸することからなることを理解するであろう。当業者は、グラフティングが基質と用いるべき材料との間の化学的方法からなることを理解するであろう。基質は、ポリマー被覆用の表面を提供する。適当な基質の例は、限定しないが、ポリマー及びセラミック材料、ガラス、セラミック、天然繊維、合成繊維、シリコーン、金属及びそれらの複合体を含む。本発明の一つの実施形態によれば、基質は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスルホン、ＰＶＤＦ、テフロン（登録商標）、それらの複合体、混合物若しくは誘導体、及び肝細胞の固定化及び高密度培養に資する人工肝臓のポリファイバーコア−不織の親水性ポリエステルマトリックス−などのポリマー材料から製造することができる。
【００１６】
ポリマー又はポリマー被覆基質は、任意適当な形状を呈し、多孔性又は無孔性の形状とすることができる。本発明の別の実施形態によれば、ポリマー又はポリマー被覆基質は、糸、シート、フィルム、ゲル、膜、ビーズ、プレート及びこれらに類似の構造の形状とすることができる。本発明の更なる実施形態によれば、ポリマー又はポリマー被覆基質は、ウェル、窪み、台、疎水性又は親水性パッチ、流体が流れるウェル又は物理的な障壁を形成するダイカットされた付着性の貯留池又は積層された詰め物のダイカットといった形状の断続的な隔離された領域を有する平面デバイスの形状で製造してもよい。かかる固体の支持体の例は、限定しないが、マイクロプレート等を含む。
【００１７】
要するに、肝細胞が付着することができる任意適当な構造を想定してよい。例えば、一つの実施形態では、マイクロプレートに形成するか又は薬などの試験を可能にするように肝細胞を規則アッセイを形成することができるよう基質上の分離位置にプリントしたウェルにポリマーを被覆することができる。また、基質を初めに又はポリマーが結合しない領域に細胞の付着を阻害する材料で被覆することが適切な場合がある。
【００１８】
別の実施形態では、ポリマー又はポリマー被覆基質は、添加する薬剤を代謝するのに用いるべく設計される人工肝臓又は解毒臓器として作用するように設計されたデバイスの形状をとることができる。かかるデバイスは、損傷した肝臓を有する被検体の一時的なデバイスとして応用することができると思われる。或いはまた、これを用いて治療上の使用とし得る化学薬品の代謝を同定することができる。
【００１９】
本発明を、実施例により、また図面を参照して、ここに更に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】ポリマーライブラリーのスクリーニングであり、（Ａ）効率的な分化プロトコル［３］を用いて、ｈＥＳＣをＨＥに分化させた。略称−ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子、ＭＥＦ−ＣＭ：マウス胚線維芽細胞馴化培地、ＫＯ ＤＭＥＭ：不活性化ダルベッコの変性イーグル培地、ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド、ＳＲ：血清代替物、Ｌ−１５：ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５、ＦＣＳ：ウシ胎児血清、ＨＧＦ：肝細胞増殖因子、ＯＳＭ：オンコスタチンＭ、ＤＡＰＩ：４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール。
【図１Ｂ】（Ｂ）Ａはポリマーライブラリーに再播種し、その後肝細胞培養培地で８日間培養した細胞の位相差顕微鏡分析（倍率×１０）。Ｂはポリマースポット上に再播種した肝内胚葉（ＨＥ）中のヒトアルブミンについての免疫蛍光分析。Ｃはマトリジェル（登録商標）上に維持されたＨＥ中のヒトアルブミンについての免疫蛍光分析。Ｄはヒトアルブミン染色用のＩｇＧアイソタイプ免疫染色コントロール。Ｌｅｉｃａ ＤＭＩＲＢを用いて撮影した写真を示す；スケールバーは１００μｍ。
【図１Ｃ】（Ｃ）マトリジェル（登録商標）コントロールと比較してヒットしたポリマーの表である。
【図２】マトリジェル（登録商標）及び確定したポリマーマトリックスに対する肝細胞様細胞の機能を示す 確立された手法を用いて、ｈＥＳＣｓを肝細胞様細胞（ＨＬＣ）に分化させた。２３日目に、ｈＥＳＣ由来のＨＬＣを１ｍｌの肝細胞培養培地中で２４時間培養した。以下の初期の培養上清を採取し、血清タンパク質の産生をＥＬＩＳＡにより測定し、ｎｇ／ｍｇ細胞タンパク質として表した。ポリマー１３４に培養したＨＬＣは、肝機能について最大の効果を示し、他のポリマー又はマトリジェル細胞外マトリックスと比較して、フィブリノーゲン（Ａ）、トランスチレチン（Ｂ）及びフィブロネクチン（Ｃ）を２倍超誘導した（ｎ＝３）。
【図３Ａ】マトリジェル又は同定したポリマー上に播種した肝細胞様細胞の形態学的及び機能的分析を示す。（Ａ）肝内胚葉（ＨＥ）の形態は、健常な形態を示すポリマー１３４を除き、調査した全てのポリマーについて顆粒状であった（図４Ａ参照）。
【図３Ｂ】（Ｂ）ｈＥＳＣ由来のＨＥを、製造業者の指示に従って、１００μＭのＣＹＰ１Ａ２ ｐＧｌｏ（登録商標）基質を添加した肝細胞培養培地を用いて培養した。処置後４時間で、５０μｌの上清試料を取り出し、ルミノメーター（ポーラスター オプティマ）で読み取った。ＣＹＰ１Ａ２の活性は、ＭＧ又は試験した他のポリマーよりも１３４で維持した細胞で約６倍高い。活性は、相対発光量（Ｒ．Ｌ．Ｕ．）／ｍｇタンパク質（ｎ＝３）として表す。
【図３Ｃ】（Ｃ）ｈＥＳＣ由来のＨＥを、製造業者の指示に従って、５０μＭのＣＹＰ３Ａ４ ｐＧｌｏ（登録商標）基質を添加した肝細胞培養培地を用いて培養した。処置後５時間で、５０μｌの上清試料を取り出し、ルミノメーター（ポーラスター オプティマ）で読み取った。ＣＹＰ３Ａ４活性は、ポリマー１３４よりも低かったが、試験した他のポリマーで維持したＨＥと同程度であった（図４Ｃ参照）。ＣＹＰ３Ａ４活性は、相対発光量（Ｒ．Ｌ．Ｕ．）／ｍｇタンパク質、（ｎ＝３）として表す。
【図３Ｄ】（Ｄ）細胞溶解物をウェスタンブロットし、ヒトプレグナンＸ受容体（ｈＰＸＲ）、ヒトアルブミン及びベータ−アクチンについて検出した。ｈＰＸＲ及びアルブミン産生は、ポリマー２ＢＧ９、２１２及び３ＡＡ７に維持したＨＬＣよりもポリマー９Ｇ７及び２２３に維持したＨＬＣにおいて高かった。
【図４】肝細胞の形態及び機能がマトリジェルと比較してポリマー１３４においては保たれることを示す （Ａ）マトリジェル（ＭＧ）又はポリウレタン１３４に播種したｈＥＳＣ由来のＨＬＣの形態を比較した。一般に、１３４に維持した肝細胞は、きめが粗くなく、より健常に見えた。（Ｂ）タンパク質溶解物を、ＭＧ又は１３４に維持したＨＥから調製した。抽出物をウェスタンブロットし、ブロッキングし、ｐ−Ａｋｔ、ｐ−ＦＡＫ、ｐ−ＥＲＫ、ｐ１５、ｐ２１、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、アルブミン、ｈＰＸＲ及びＣｙｐ３Ａ４について検出した。ＭＧではなく、ポリマー１３４に維持したｈＥＳＣ−ＨＥは、Ａｋｔ、ＦＡＫ及びＥＲＫシグナル伝達；細胞周期阻害剤であるｐ１５及びｐ２１の発現；接着分子であるＥ−カドヘリン及びＮ−カドヘリンの発現、並びにｈＰＸＲ及びＣｙｐ３Ａ４の発現について増加を示した。二つのハウスキーピング遺伝子であるＢ−アクチン及びＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして用いた。同様のＢ−アクチンの発現がＭＧ及び１３４の両方のサンプルにおいて観察されたが、より高いＧＡＰＤＨの発現がＭＧのタンパク質サンプルにおいて検出された。加えて、ポリマー１３４に維持したＨＥは薬剤誘発性のｈＰＸＲの機能と一致したリン酸化上方バンドの存在を示した。アルブミンのレベルは、ポリウレタン１３４及びマトリジェルに維持した肝細胞様細胞においても同等のままであった。（Ｃ）ｈＥＳＣ由来のＨＬＣｓ及び初代ヒト幹細胞を、製造業者の指示に従って、５０μＭのＣＹＰ３Ａ４ ｐＧｌｏ（登録商標）基質を添加したヒト肝細胞培養培地を用いて培養した。処置後５時間で、５０μｌの上清試料を取り出し、ルミノメーター（ポーラスター オプティマ）で読み取った。ＣＹＰ３Ａ４活性は、ＭＧよりも１３４に維持した細胞において高かった。活性を相対発光量（Ｒ．Ｌ．Ｕ．）／ｍｇタンパク質、（＊ｐ＜０．０５、ｔ検定、（ｎ＝３））として表す。
【図５】ポリウレタン１３４及びその構成要素の構造を示す。このポリウレタンの合成については、ポリオールとして２５％のＰＨＮＧＡＤ、ジイソシアネーとして５０％のＭＤＩ及び鎖延長剤として２５％のＢＤを用いた。
【図６】人工肝臓（ＢＡＬ）の未被覆又は被覆ポリファイバーコア（ＰＦＣ）上のいずれかに播種したｈＥＳＣ由来のＨＥを示す。培養２４日目に、細胞を固定し、染色し、電子顕微鏡により観察した。（ａ）はＢＡＬの未被覆ＰＦＣである。（ｂ）は細胞を付着させた未被覆のＰＦＣを示し、（ｃ）はポリマー１３４で被覆したＰＦＣを示し、（ｄ）は細胞を付着させたポリマー１３４で被覆したＰＦＣを示す。パネル中のスケールバーは、５０μｍである。
【図７】の（Ａ）薬物誘導（１７−２１日目）の前に、ｈＥＳＣ由来のＨＥを１ｍｌの肝細胞培養培地中に２４時間培養した。以下の初期の培養上清を採取し、血清タンパク質の産生をＥＬＩＳＡにより測定し、ｎｇ／ｍｌ培養上清（ｎ＝６）として算出したところ、ポリマー１３４において明らかな増加があった。（Ｂ）ｈＥＳＣ由来のＨＥを、人工肝臓（ＢＡＬ）の未被覆（灰色のバー）又は被覆（黒色のバー）のポリファイバーコア（ＰＦＣ）のいずれかに播種した。培養物を、既知のＣＹＰ３Ａ４誘導因子であるフェノバービタル（ＰＢ）（０．４ｍＭ）の存在（＋）又は不在（−）下でＣＹＰ３Ａ４活性の測定の前４８時間培養した。２４日目に、ｈＥＳＣ由来のＨＥを、５０μＭのＣＹＰ３Ａ４ ｐＧｌｏ（登録商標）基質を添加した肝細胞培養培地を用いて培養した。処置後５時間で、ＣＹＰ３Ａ４活性をルミノメーター（ポーラスター オプティマ）で読み取ったところ、ポリマー１３４において明らかな活性の誘導があった。活性の単位は、相対発光量（Ｒ．Ｌ．Ｕ．）／ｍｇタンパク質、＊ｐ＜０．０５、ｔ検定、（ｎ＝４）として表す。
【図８】未被覆（黒色のバー）又は被覆（灰色のバー）の人工肝臓マトリックスのいずれかに播種したｈＥＳＣ由来のＨＥ （Ａ）培養物を塩化アンモニウムの存在下でウレアーゼ活性の測定前４時間培養した。ウレアーゼ活性を、ｍＭ／ｍｇ細胞タンパク質／時間、（ｎ＝１２）、＊ｐ＜０．０５で表した。（Ｂ）未変性およびポリマー被覆の人工肝臓マトリックスに対するＨＥの機能。培地及びフェノバービタルを毎日交換して、フェノバービタル（シグマ）による薬物誘導を２２日目に４８時間行った。コントロール培養物には、フェノバービタルを加えずに、培地を毎日交換した。培養物を既知のＣＹＰ３Ａ４誘導物質であるフェノバービタル（０．４ｍＭ−５ｍＭ）の存在又は非存在下でＣＹＰ３Ａ４活性の測定前４８時間培養した。２４日目に、ｈＥＳＣ由来のＨＥを、５０μＭのＣＹＰ３Ａ４ ｐＧｌｏ（登録商標）基質（プロメガ−非溶解性ＣＹＰ４５０活性測定）を添加した肝細胞培養培地を用いて培養した。処置後５時間で、ＣＹＰ３Ａ４活性をルミノメーター（ポーラスター オプティマ）で読み取った。活性の単位を、相対発光量（Ｒ．Ｌ．Ｕ．）／ｍｇタンパク質、（ｎ＝６）として表す。
【図９】ＭＧ及びポリマー１３４に対するｉＰＳＣ由来のＨＥのＣＹＰ３Ａ４機能 ｉＰＳＣ由来のＨＥをマトリジェル及びポリマー１３４上で培養した。２４日目に、マトリジェル及びポリマー１３４に維持したＨＥがＣＹＰ３Ａ４の機能を示すかどうか評価した。重要なことに、ポリマー１３４に再播種したｉＰＳＣ由来のＨＥは、マトリジェルに再播種したものよりもかなり高い基底レベルのＣＹＰ３Ａ４活性を示した。２４日目に、ｈＥＳＣ由来のＨＥを、５０μＭのＣＹＰ３Ａ４ ｐＧｌｏ（登録商標）基質（プロメガ−非溶解性ＣＹＰ４５０活性測定）を添加した肝細胞培養培地を用いて培養した。処置後５時間で、ＣＹＰ３Ａ４活性をルミノメーター（ポーラスター オプティマ）で読み取った。活性の単位を、相対発光量（Ｒ．Ｌ．Ｕ．）／ｍｇタンパク質（ｎの値をグラフに示す）として表す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（材料及び方法）
ＰＨＮＧＡＤの合成（下記のスキーム１及び２参照）
ジエチレングリコール、１，６−ヘキサンジオール、ネオペンチルグリコール及びアジピン酸をアルドリッチ社から購入した。第一スズオクトアート及びチタン（ＩＶ）ブトキシドは商用グレード（アルドリッチ社）であり、更なる精製なしに使用した。ジイソシアネートとして４，４’−メチレンビス（フェニルイソシアネート）（ＭＤＩ）を用い、鎖延長剤、（３−ジエチルアミノ−１，２−プロパンジオール）（ＤＥＡＰＤ）、１，４−ブタンジオール（ＢＤ）及び２，２，３，３，４，４，５，５−オクタフルオロ−１，６−ヘキサンジオール（ＯＦＨＤ）（アルドリッチ社）をポリウレタン合成に用いた。
【００２２】
あらゆる有機溶媒なしにモノマーの溶融技術を用いて、ＰＨＮＧＡＤポリオールの合成を行った。初めに、全てのモノマーを真空下６０℃で４８時間熱処理して水の除去を確実にした。必要量のモノマー、すなわち１，６−ヘキサンジオール（０．２２モル）、ジ（エチレングリコール）（０．２２モル）、ネオペンチルグリコール（０．２２モル）及びアジピン酸（０．５５モル）を反応用フラスコに加えた。集合物全体を４０℃のオーブンに６時間保持して、化学薬品をフラスコに加える間のあらゆる吸湿を回避した。乾燥後、必要量の触媒、すなわち第一スズオクトアート又はチタン（ＩＶ）ブトキシドのいずれかを針を通して一滴ずつ注入し、反応混合物を１８０℃まで加熱し、Ｎ２雰囲気下で撹拌し、水を冷却器を通して回収した。反応を所望の時間まで行った。ポリオールの分子量分布は、モノマーの組成、触媒、反応時間および反応温度を変化させることにより制御することができる。
【００２３】
ポリオール合成用の代替の方法は、モノマー及び他の添加物を有機溶媒中に溶解する溶解技術である。この場合、反応は、溶融法よりも一層低い温度で行うことができ、溶媒を蒸発により除去することができる。
【００２４】
（ポリウレタンの合成）
ポリウレタンの合成を、二段階重合法により行った。一当量のポリオールをまず二当量のジイソシアネートと、その後一当量の鎖延長剤と反応させてコポリマー生成物を得た。
【００２５】
一つ又は複数の触媒を、ポリウレタン合成に用いることができる。特に好適な触媒は、ジブチルスズジラウレート、ジメチルスズジカルボキシレート、第一スズオクトアート、鉄（III）アセチルアセトネートである。好適な触媒量は、０〜５重量％の範囲である。
【００２６】
加えて、消泡剤又は接着促進剤などの更なる添加物を反応中に加えてもよく、これらは溶液の表面張力を低減し、泡の形成を抑制又は変更する。
【００２７】
Ｎ，Ｎ´−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、トルエン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、クロロホルム、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、１，２−ジクロロエタン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の様々な溶媒を用いることができる。一つ又は複数の溶媒を用いて反応系中の出発物質を溶解することができる。ここで、溶媒は乾燥溶媒とする。二成分溶媒もポリウレタン合成に用いることができる。
【００２８】
ポリウレタン類の合成を様々な温度で行うことができ、特に好適な温度範囲は５０℃〜１４０℃である。反応は、不活性雰囲気下、好適には窒素又はアルゴンのパージにより９６時間まで長く行うことができる。
【００２９】
反応後、ポリウレタンを沈殿により回収した。この場合、沈殿が生じるまで貧溶媒を反応溶液中に滴下することができる。最後に、ポリウレタンを溶液から分離し、分析した。
【００３０】
様々な分析技術及び方法（ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、ＮＭＲ、ＦＴＩＲ分光器、示差走査熱量計（ＤＳＣ）等）を用いてこれら材料を評価してポリマーの分子量分布及び官能基、並びに融点及びガラス転移点等を確認した。
【００３１】
ポリウレタン類の様々な分子量分布（Ｍｗ、Ｍｎ及びＤ）（表２）を、反応条件（反応時間、開始剤の濃度等）を変化させることにより達成することができ、本発明について好適な分子量の範囲の例は、５ｋＤａ〜４００ｋＤａである。
【００３２】
（細胞培養）
ｈＥＳＣ培養を、前述［２，３］のように行った。ｈＥＳＣｓを、既に発表［３］されているようにアクチビン及びｗｎｔ３ａを用いて肝細胞様細胞に分化した。分化処理の９日目に、トリプシン／ＥＤＴＡ（インビトロジェン）での３７℃５分間の培養を用いて、細胞をその基質から剥がした。その後、肝細胞様細胞を、ポリマーアレイ、ポリマー被覆カバースリップ又はマトリジェル被覆プラスチックウェア上に播種した。前述［６］のように、ｉＰＳ細胞株３３Ｄ−６を培養し、増殖させ、そして肝内胚葉に分化させた。分化プロトコルの９日目に、トリプシン／ＥＤＴＡ（インビトロジェン）で５分間培養することにより、細胞をその基質から剥がした。その後、肝細胞様細胞（ＨＬＣｓ）をポリマー１３４又はＭＧに播種し、［６］に記載のＬ−１５成熟培地で培養した。
【００３３】
（免疫染色）
免疫染色を前述［３］のように行った。
【００３４】
（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡを前述［３］のように行った。
【００３５】
（ｐ４５０アッセイ）
ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ２活性は、プロメガ社製のｐＧｌｏキットを用いて評価し、非溶解性ＣＹＰ４５０活性測定に関する製造業者の指示（http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf）に従って行った。ＣＹＰ活性を、相対発光量（ＲＬＵ）／ｍｇタンパク質として表した。
【００３６】
（ウェスタンブロット）
ウェスタンブロッティングを前述［４］のように行った。タンパク質に対する一次抗体を下記の表に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
（ポリマースクリーニング）
カバースリップを前述［７］のように六つのポリマーで被覆した。
【００３９】
（ＰＨＮＧＡＤ及びＰＵ−１３４の合成）
【化１】
【化２】
【実施例】
【００４０】
（実施例１：ポリマーライブラリーのスクリーニング及び評価）
３８０の一般的なポリウレタン及びポリアクリレートポリマーをアガロース被覆ガラス顕微鏡スライド上に接触プリントすることによりポリマーマイクロアレイを作製した［７，８］。プリント後、スライドを一夜乾燥し、細胞播種前に紫外線照射により滅菌した。本発明者らは、このポリマーライブラリーを胚幹細胞由来の肝臓内胚葉（ＨＥ）の付着、安定化及び機能の向上について調査した。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）のＨＥへの直接分化は、最近開発された高効率の組織培養モデルを用いて開始した（図１Ａ）。肝細胞の寿命（９日目）を選び、ＨＥをその生物学上の細胞外マトリックスから剥離し、ポリマーアレイ／ライブラリーに再播種した。アレイに再播種した後、生体外における肝細胞の同一性及び分化を支持する条件で、ｈＥＳＣ由来のＨＥを更に８日間培養した。この時点で細胞の付着を位相差顕微鏡を用いて記録し（図１Ｂ、Ａ）；肝細胞の表現型及び機能をアルブミン産生により評価し（図１Ｂ、Ｂ）；今日の「究極の判断基準」の条件（マトリジェルにおける培養、図１Ｂ、Ｃ）及びＩｇＧアイソタイプコントロールと比較した（図１Ｂ、Ｄ）。一次スクリーニングにより、ＨＬＣの付着及び同一性を支持するポリマーを同定した（図１Ｃ）。
【００４１】
（実施例２：選択したポリマーの評価）
ヒト−ＥＳＣｓを詳細に述べた通り、分化し、再播種した。細胞機能を再播種後１５日目に評価し、肝細胞特異的な遺伝子のパネルの発現及び必須の血清タンパク質の排出により規定した。この手法を用いて、ポリマー１３４［７］を、フィブリノーゲン［９］（図２Ａ）、トランスチレチン（ＴＴＲ）［１０］（図２Ｂ）及び溶解性フィブロネクチン［１１］（図２Ｃ）の発現の向上を備える最も効率的な細胞支持体として同定した。本発明者らは、二つのＥＣＭ（１５日目）間のＨＬＣの形態の実質的な変化も観察した。マトリジェル又はポリマー２ＢＧ９、２１２、９Ｇ７、３ＡＡ７及び２２３（図３Ａ及び図４Ａ）に継代し、維持したＨＬＣは顆粒状であった。対照的に、１３４に再播種したＨＬＣは、明らかな肝細胞形態を維持した（図４Ａ）。次いで、本発明者らは、異なる細胞外マトリックスに対する主要なシトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）活性を分析した。ＣＹＰ１Ａ２の活性は、標準的なマトリジェル条件又は評価したその他のポリマーと比較してポリマー１３４で約６倍増加した。本発明者らはまた、ＣＹＰ３Ａ４が数ある外分泌経路における基本的な役割を果たし、約５０％の処方薬の代謝に関与するので、ＣＹＰ３Ａ４の機能を調査した。多くの薬が、創薬工程における魅力的な標的分子とするＣＹＰ３Ａ４の阻害活性を有することが知られている［１２］。ポリマー１３４に維持したＨＬＣは、マトリジェル又は試験した他のポリマーに維持した細胞と比較して、ＣＹＰ３Ａ４ ｐ４５０機能に約２倍の増加を示した（図４Ｃ、図３Ｃ）。ヒトプレグナンＸ受容体（ｈＰＸＲ）は、ＣＹＰ３Ａの遺伝子発現の主要な制御因子である［１３］。ｈＰＸＲは、細胞質中に捕捉され［１４］、リガンドが結合する際に解離する。ｈＰＸＲの核移行の間に、これはタンパク質キナーゼＡに依存的な方法でリン酸化される［１２］。核移行すると、ｈＰＸＲはレチノイン酸受容体と二量化し、ＣＹＰ３Ａ遺伝子プロモーター中に含まれるコアエレメントによりＣＹＰ３Ａ発現を制御する［１５］。前述の発見と一致するように、本発明者らは、１３４に維持したＨＬＣが、ＣＹＰ３Ａ４の発現及び活性のピークレベルと一致するｈＰＸＲの発現及びリン酸化レベルの向上を示すことを実証する（図３Ｃ、図４Ｃ）。本発明者らはまた、これらの実験におけるアルブミンの発現を分析し、アルブミンの遺伝子発現がマトリジェルとポリマー１３４に維持したＨＬＣの間で類似していることを示した。しかしながら、アルブミン及びｈＰＸＲの発現は、試験された他のポリマー上ではかなり変化した（図３Ｄ）。
【００４２】
ポリマー１３４及びその有用可能性の観察に続き、更なる関連のポリマー（前ページ７、８に従って調製）を研究し、肝細胞の付着及び維持機能を可能にする他のポリマーを同定した（表２参照）。
【００４３】
（実施例３：ポリマー１３４及びマトリジェルに対するｈＥＳＣ由来のＨＥの詳細な評価）
本発明者らの更なる研究では、二つの細胞外マトリックス、すなわちマトリジェル及びポリマー１３４に対するＨＥの形態、シグナル伝達、遺伝子発現、及び薬物代謝に焦点を当てた。マトリジェルは、生体外で肝細胞の働きを向上させることが以前に示され、今日の「究極の判断基準」とされているため、本発明者らのコントロールとして用いた。本発明者らは、ＨＥ形態の実質的な変化（２４日目）を観察した。すなわち、マトリジェルまたはポリマー２ＢＧ９、２１２、９Ｇ７、３ＡＡ７及び２２３に通し、維持したＨＥは顆粒状であった（図３Ａ及び図４Ａ）。対照的に、１３４に再播種したＨＥは、明白な肝細胞の形態を維持した（図４Ａ）。細胞形態の変化に従って、本発明者らは、一般的な細胞シグナル伝達及び肝細胞遺伝子発現の変化も観測した。ポリマー１３４に維持したｈＥＳＣ−ＨＥは、細胞がその基質にしっかりと付着し、アポトーシスを起こさないことに一致して、ＦＡＫ、Ａｋｔ及びＥＲＫシグナル伝達の向上を示した。これは、マトリジェルに維持したＨＥでは観察されなかった。ポリマー１３４に播種したＨＥは、有糸分裂因子ＥＲＫのレベルの向上を示したが、ＨＥはまた高レベルの細胞周期阻害因子ｐ１５及びｐ２１を発現した。総合すると、これらの結果は、休止／機能的状態で固定された代謝的に活性な肝細胞集団があることと合致する。細胞シグナル伝達及び細胞周期の変化に加えて、本発明者らはまた肝細胞の遺伝子発現における変化を観測した。Ｎ−カドヘリン及びＥ−カドヘリンの両方の発現は、ヒトの肝臓の生物学上で重要な役割を果たす。本発明者らは、ＭＧと比較して、ポリマー１３４に維持したｈＥＳＣ−ＨＥにおけるこれらの両方の分子の発現の向上を観測した。ポリマー１３４に対する上皮側の表現型に加えて、本発明者らは、再播種したＨＥがまたポリマー１３４に対するｈＰＸＲ及びリン酸化−ＰＸＲの発現の増加を示すことを観測した。ｈＰＸＲのレベル増加は、ウェスタンブロッティングにより検出したシトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）３Ａ４のレベルの増加と一致する（図４Ｂ）。ポリマーがＣＹＰ３Ａ４代謝活性に果たす役割を評価するために、本発明者らは異なる細胞外マトリックスに対する主要な活性を分析し、初代ヒト幹細胞と比較した。ポリマー１３４に維持したＨＥは、マトリジェルに維持した初代ヒト幹細胞（ＰＨＨ）と同等のＣＹＰ３Ａ４ ｐ４５０の機能を示し、マトリジェル又は試験した他のポリマーに維持したｈＥＳＣ由来のＨＥと比較して、約２倍のＣＹＰ３Ａ４ ｐ４５０の機能の増加を示した（図４Ｃ及び図３Ｃ）。ＣＹＰ３Ａ４に加えて、本発明者らはＣＹＰ１Ａ２活性も試験したところ、標準的なマトリジェル条件又は評価した他のポリマーと比較して、ポリマー１３４において約６倍誘導された（図３Ｂ）。本発明者らは、これらの実験でアルブミン発現も分析し、アルブミンの発現がマトリジェル及びポリマー１３４に維持したＨＥの間で同等であることを示した（図４Ｂ）。
【００４４】
（実施例４：未変性及びポリマー１３４被覆の人工肝臓マトリックスへのｈＥＳＣ由来のＨＥの付着）
本発明者らは、人工肝臓（ＢＡＬ）デバイスに用いる細胞マトリックスであるポリファイバーコア（ＰＦＣ）を用いた。ＰＦＣを未変性の形状で用いるか、又はポリマー１３４で被覆した。肝細胞の寿命（９日目）を選び、ＨＥをその生物学上の細胞外マトリックスから剥離し、未変性又はポリマー被覆したＰＦＣ上に再播種し、肝細胞の同一性を支持する条件下で更に１５日間（２４日目まで）培養した。２４日目に、本発明者らは未被覆（図６Ａａ）及びポリマーで被覆したＢＡＬマトリックス（図６Ａｃ）に付着したＨＥを固定し、電子顕微鏡により細胞構造を検討した。未被覆ＰＦＣに維持したｈＥＳＣ由来のＨＥは、細胞付着及びストレス繊維に似た細胞突起を示した（図６Ａｂ）が、ポリマー１３４で被覆したＰＦＣに維持したＨＥは、ＢＡＬにおけるＨＥについての流体剪断応力の影響を制限することができる平滑組織のような外観（図６Ａｄ）を示した。
【００４５】
（実施例５：未変性及びポリマー１３４で被覆した人工肝臓マトリックスに対するｈＥＳＣ由来のＨＥ機能）
これらのデータは、ＢＡＬセッティングにおけるポリマー１３４及びｈＥＳＣ由来ＨＥの価値を実証する。ｐ４５０薬物誘導性に加えて、ポリマー１３４は薬物誘導（１７〜２１日目）前に測定したヒトアルブミン産生も促進する（図７Ａ）。本発明者らがＨＥ薬物誘導性を評価する前に、ｈＥＳＣ由来のＨＥを異なるＢＡＬ−ＰＦＣ基質で１３日間培養した。ｈＥＳＣ由来のＨＥを、０．４ｍＭのフェノバービタルで誘導するか、又は毎日培地を交換しながら４８時間コントロール培地で維持した。２４日目に、本発明者らは両方のＰＦＣ支持マトリックスに維持したＨＥがＣＹＰ３Ａ４の薬物誘導を示すかどうか評価した。未被覆のＰＦＣは肝細胞の付着及び機能を支持したが、しかしながら、細胞のニッチは支持しなかった。ＣＹＰ３Ａ４のフェノバービタル薬物誘導（図７Ｂ、マトリックス ＰＢ＋）。対照的に、ポリマー１３４で被覆したものに再播種したｈＥＳＣ由来のＨＥは、ＨＥの付着及びフェノバービタル誘導性ＣＹＰ３Ａ４の薬物代謝の両方を支持した（図７Ｂ、マトリックス ＰＢ＋）。
【００４６】
（実施例６：未変性及びポリマー１３４被覆の人工肝臓マトリックスに対するｈＥＳＣ由来のＨＥの機能）
これらのデータは、ＢＡＬセッティングにおけるポリマー１３４及びｈＥＳＣ由来のＨＥの価値を実証する。ｐ４５０薬物誘導性に加えて、ポリマー１３４はヒトウレアーゼ活性を促進する（２４日目）（図８Ａ）。本発明者らがＨＥの薬物誘導（２２〜２４日目）を評価する前に、ｈＥＳＣ由来のＨＥを異なるＢＡＬ−ＰＦＣマトリックス（＋／− ポリマー１３４）基質に１３日間培養した。ｈＥＳＣ由来のＨＥをある範囲のフェノバービタル濃度（０．４ｍＭ−５ｍＭ）で誘導するか、又は毎日培地を交換しながら４８時間コントロール培地で維持した。２４日目に、本発明者らは両方のＰＦＣ支持マトリックスに維持したＨＥがＣＹＰ３Ａ４の薬物誘導を示すかどうかを評価した。２４日目に、未変性のマトリックスは、肝細胞の付着及び機能発現をＣＹＰ３Ａ４の乏しい薬物誘導で支持した（図８Ｂ、黒色のバー）。対照的に、ポリマー１３４で被覆したマトリックスに再播種したｈＥＳＣ由来のＨＥは、用量依存的なフェノバービタル誘導性のＣＹＰ３Ａ４薬物代謝を示した（図８Ｂ、灰色のバー）。
【００４７】
（実施例７：未変性の基質及びポリマー１３４で被覆したカバーストリップに対するｉＰＳＣ由来のＨＥのＣＹＰ３Ａ４機能）
ポリウレタンマトリックス（ポリマー１３４）は、機能性の高いｉＰＳＣ由来の肝内胚葉（ＨＥ）の培養を促進することによって、肝細胞機能に重要な役割を果たす。図９は、ｉＰＳＣｓをＨＥに分化し、ＨＥの生存及び機能を促進するポリマー１３４に再播種し得ることを示す。ｈＥＳＣ由来のＨＥと同様に、ポリマー１３４で培養したｉＰＳＣ由来のＨＥは、マトリジェルで生育した同じ細胞よりも高い基底レベルのＣＹＰ３Ａ４活性を示した。
【００４８】
結論として、このスクリーニングが、継代の前後に長期の肝細胞分化による機能を促進する新たな分類のポリマーマトリックスを同定することを可能にした。これら特性は、成人のヒト肝細胞に伴う今日の制限を回避し、薬物毒性の生体外モデルの開発に重要な役割を果たし、且つ薬物損耗率の低減を助けることができる。加えて、本発明者らの生体外由来の細胞は、体外デバイスの構築のための資源を提供し、且つヒト肝臓の発生及び疾患の新規な研究を促進する。
【００４９】
（参考文献）
［１］ Pharmaceutical Research and Manufacturers of America (PhRMA). Pharmaceutical Industry Profile 2005.
［２］ Hay DC et al, 2008 Stem Cells. 2008 26(4): 894-902.
［３］ Hay DC et al, 2008 Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 105(34): 12301-6.
［４］ Hay DC et al, Cloning Stem Cells. 2007 (9): 51-62.
［５］ Fletcher J et al, Cloning and Stem Cells. 2008 (10): 331-340.
［６］ Sullivan et al, Hepatology. 2010 51(1): 329-35.
［７］ Pernagallo S et al, Lab Chip. 2009 9: 397-403.
［８］ Uniciti-Broceta et al, J Comb Chem 2008: 10, 24-27.
［９］ Tennent GA et al, Blood. 2007 109 (5): 1971-4.
［１０］ Ingenbleek Y et al, Annu Rev Nutr. 1994 (14): 495-533.
［１１］ Pankov R et al, J Cell Sci. 2002 115 (Pt 20): 3861-3.
［１２］ Keshava C et al, Am J Epidemiol. 2004 160 (9): 825-41.
［１３］ Ding X et al, J Pharmacol Exp Ther. 2005 312 (2): 849-56.
［１４］ Squires EJ et al, J Biol Chem. 2004 279 (47): 49307-14.
［１５］ Orans J et al, Mol Endocrinol. 2005 (12): 2891-900.
【００５０】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞が付着し、かつ肝細胞が一定期間機能を発現することができる特定のポリマーの提供に関する。肝細胞の付着、及び機能の維持のための特定のポリマーの使用も提供する。機能性の肝細胞の付着及び維持に用いるための本発明のポリマーの被覆により形成されるか又は該被覆を含む装置を更に提供する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤開発のコストは、化合物損耗率により大きく影響を受ける。市場に出回るすべての新薬について、約５０００から１０，０００の化合物が、約２５０に達する動物試験での前臨床試験で試される。動物試験に続いて、約５個の可能性のある薬が、本格的なヒト臨床試験に施され、たった１つが最終的な承認を得る（［１］）。これらの数字は、より正確な毒性予測モデルの開発が必要とされていることを明確に示す。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）由来のヒト幹細胞様細胞（ＨＬＣｓ）の産生は、かかる方法の一つである。本発明者らは、ヒト肝臓機能（［２−６］）の生体外のモデルを最近開発したが、長期に渡りその肝機能が効果的に維持されるかははっきりしていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、肝細胞の付着を可能にする特徴を有し、付着した細胞が良好な肝細胞機能の特性を表すことを示す一群のポリマーの同定に基づく。
【０００４】
第一の態様では、肝細胞及び肝細胞様細胞の付着及び機能発現に用いるポリマー基質を提供する。
【０００５】
本発明者らは、ＰＨＮＧＡＤ、ＭＤＩ及び増量剤を重合することにより形成したポリウレタン表面が、肝内胚葉の再播種に対して支援的な効果を提供することを見出した（肝細胞は通常は再播種できない）。また、ポリウレタン表面は、再播種の後少なくとも１５日間、肝細胞の同一性及び安定な機能発現を維持することを促す効果／役割を果たす。当該分野の研究に利用されるＰＨＮＧＡＤ、ＭＤＩ及び増量剤を重合することにより形成したポリウレタン表面の生理活性な性質はまた、他の真核生物、特に哺乳動物の細胞型に適用可能であり、汎用性があり確立された細胞外支持体を提供する。
【０００６】
本発明の一つの実施形態において、ポリマーはＰＨＮＧＡＤ、ＭＤＩ及び増量剤分子を重合することにより形成したポリウレタンポリマーである。
【０００７】
ＰＨＮＧＡＤはポリ（１，６−ヘキサンジオール／ネオペンチルグリコール／ジ（エチレングリコール）−ａｌｔ−アジピン酸）ジオールである。
【０００８】
ＭＤＩは４，４’−メチレンビス（フェニルイソチアネート）であり、増量剤は弾力性、湿潤性及び／若しくは表面トポグラフィーなどの物理的特性、並びに／又は細胞外マトリックスタンパク質を吸収する能力などの生化学的特性を増加させる働きをする。
【０００９】
適当な増量剤分子としては、１，４−ブタンジオール（ＢＤ）；３−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオール（ＤＭＡＰＤ）；３−ジエチルアミノ−１，２−プロパンジオール（ＤＥＡＰＤ）；（ＢＤ）、２，２，３，３，４，４，５，５−オクタフルオロ−１，６−ヘキサンジオール（ＯＦＨＤ）、１，３−プロピレングリコール（ＰＧ）、１，２−エチレングリコール（ＥＧ）、２−ニトロ−２−メチル−１、３−プロパンジオール（ＮＭＰＤ）、ジエチル−ビス−（ヒドロキシメチル）−マロネート（ＤＨＭ）、１，１２−ドデカンジオール、シクロドデカンジオール、ヒドロキノン−ビス（２−ヒドロキシエチル）エーテル、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＥＨＤ）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロパノールアラニン（ＤＩＰＡ）、エチレンジアミン、ｍ−フェニレン−４−ジアミノスルホン酸（ＰＤＳＡ）が挙げられる。
【００１０】
本発明者らは、三つの構成要素全て（ＰＨＮＧＡＤ、ＭＤＩ及び増量剤）から形成したポリマーが、適切な機能活性を示す肝細胞の付着を可能にすることができるが、一方増量剤を含まず、ＰＨＮＧＡＤ及びＭＤＩのみから形成したポリマーが肝細胞と結合しないことを見出した。
【００１１】
本発明での使用に好適なポリマーをポリマー１３４（図５参照）として本明細書中で識別するが、他の関連のポリマー（ポリマー１０３、１０４及び２４７）−表１参照−も肝細胞の付着及び機能発現の点において適切な特性を表す。
【００１２】
ここで用いるような肝細胞は、被検体の肝臓から、例えば生検により直接得られた肝細胞を含んでよい。しかしながら、好適な肝細胞は、肝細胞又は肝細胞様細胞に分化させた胚性幹細胞又は胚性幹細胞株に由来するものである。かかる細胞の例は、［３］に記載される。また、当技術分野で既知のリプログラムされた成熟細胞から得られる肝細胞様細胞も用いることができる（Takahashi & Yamanaka, (2006), Cell, 126, p663-676. 及び Takahashi et al, (2007), Cell, 131, p861-872.）。
【００１３】
更なる態様では、本明細書に記載したようなポリマーの機能性の肝細胞の付着用での使用を提供する。
【００１４】
本明細書で用いる「機能」又は「機能的」という用語は、肝細胞に通常付随する代謝活性を指す。従って、本発明の肝細胞は、望ましくはより活発な内分泌及び外分泌機能：ヒト血清タンパク質−フィブロネクチン、フィブリノーゲン及びトランスチレチンの産生、及びＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ２などの一つ又は複数のシトクロムｐ４５０酵素の発現の向上を示す。更に、かかる代謝活性は増大されることができ、及び/または細胞を他の基質に付着させるときよりも持続時間を長くすることができる。ＭＧ及び１３４の両方が、再播種の後１５日目に、肝細胞の維持に異なるレベルを示し、１３４はＣＹＰ３Ａ４、フィブロネクチン、フィブリノーゲン及びトランスチレチンについて約２倍の増加、ＣＹＰ１Ａ２について約６倍の増加を示す。
【００１５】
肝細胞は、適当な形状に形成された本発明のポリマーに直接付着させることができる。或いはまた、スピンコーティング、グラフティング又は浸漬コーティングのような適切な技術を用いて、ポリマーを適当な基質に物理的又は化学的に被覆することができる。当業者は、基質を被覆するのに用いる材料の溶液を表面の上に堆積させながら基質を特定のｒｐｍでスピンすることによるスピンコーティングを用いて２Ｄ−及び３Ｄ−の基質を被覆することを理解するであろう。当業者は、浸漬コーティングが基質を被覆するのに用いる材料溶液中に基質を特定の速度で含浸することからなることを理解するであろう。当業者は、グラフティングが基質と用いるべき材料との間の化学的方法からなることを理解するであろう。基質は、ポリマー被覆用の表面を提供する。適当な基質の例は、限定しないが、ポリマー及びセラミック材料、ガラス、セラミック、天然繊維、合成繊維、シリコーン、金属及びそれらの複合体を含む。本発明の一つの実施形態によれば、基質は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスルホン、ＰＶＤＦ、テフロン（登録商標）、それらの複合体、混合物若しくは誘導体、及び肝細胞の固定化及び高密度培養に資する人工肝臓のポリファイバーコア−不織の親水性ポリエステルマトリックス−などのポリマー材料から製造することができる。
【００１６】
ポリマー又はポリマー被覆基質は、任意適当な形状を呈し、多孔性又は無孔性の形状とすることができる。本発明の別の実施形態によれば、ポリマー又はポリマー被覆基質は、糸、シート、フィルム、ゲル、膜、ビーズ、プレート及びこれらに類似の構造の形状とすることができる。本発明の更なる実施形態によれば、ポリマー又はポリマー被覆基質は、ウェル、窪み、台、疎水性又は親水性パッチ、流体が流れるウェル又は物理的な障壁を形成するダイカットされた付着性の貯留池又は積層された詰め物のダイカットといった形状の断続的な隔離された領域を有する平面デバイスの形状で製造してもよい。かかる固体の支持体の例は、限定しないが、マイクロプレート等を含む。
【００１７】
要するに、肝細胞が付着することができる任意適当な構造を想定してよい。例えば、一つの実施形態では、マイクロプレートに形成するか又は薬などの試験を可能にするように肝細胞を規則アッセイを形成することができるよう基質上の分離位置にプリントしたウェルにポリマーを被覆することができる。また、基質を初めに又はポリマーが結合しない領域に細胞の付着を阻害する材料で被覆することが適切な場合がある。
【００１８】
別の実施形態では、ポリマー又はポリマー被覆基質は、添加する薬剤を代謝するのに用いるべく設計される人工肝臓又は解毒臓器として作用するように設計されたデバイスの形状をとることができる。かかるデバイスは、損傷した肝臓を有する被検体の一時的なデバイスとして応用することができると思われる。或いはまた、これを用いて治療上の使用とし得る化学薬品の代謝を同定することができる。
【００１９】
本発明を、実施例により、また図面を参照して、ここに更に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】ポリマーライブラリーのスクリーニングであり、（Ａ）効率的な分化プロトコル［３］を用いて、ｈＥＳＣをＨＥに分化させた。略称−ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子、ＭＥＦ−ＣＭ：マウス胚線維芽細胞馴化培地、ＫＯ ＤＭＥＭ：不活性化ダルベッコの変性イーグル培地、ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド、ＳＲ：血清代替物、Ｌ−１５：ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５、ＦＣＳ：ウシ胎児血清、ＨＧＦ：肝細胞増殖因子、ＯＳＭ：オンコスタチンＭ、ＤＡＰＩ：４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール。
【図１Ｂ】（Ｂ）Ａはポリマーライブラリーに再播種し、その後肝細胞培養培地で８日間培養した細胞の位相差顕微鏡分析（倍率×１０）。Ｂはポリマースポット上に再播種した肝内胚葉（ＨＥ）中のヒトアルブミンについての免疫蛍光分析。Ｃはマトリジェル（登録商標）上に維持されたＨＥ中のヒトアルブミンについての免疫蛍光分析。Ｄはヒトアルブミン染色用のＩｇＧアイソタイプ免疫染色コントロール。Ｌｅｉｃａ ＤＭＩＲＢを用いて撮影した写真を示す；スケールバーは１００μｍ。
【図１Ｃ】（Ｃ）マトリジェル（登録商標）コントロールと比較してヒットしたポリマーの表である。
【図２】マトリジェル（登録商標）及び確定したポリマーマトリックスに対する肝細胞様細胞の機能を示す 確立された手法を用いて、ｈＥＳＣｓを肝細胞様細胞（ＨＬＣ）に分化させた。２３日目に、ｈＥＳＣ由来のＨＬＣを１ｍｌの肝細胞培養培地中で２４時間培養した。以下の初期の培養上清を採取し、血清タンパク質の産生をＥＬＩＳＡにより測定し、ｎｇ／ｍｇ細胞タンパク質として表した。ポリマー１３４に培養したＨＬＣは、肝機能について最大の効果を示し、他のポリマー又はマトリジェル細胞外マトリックスと比較して、フィブリノーゲン（Ａ）、トランスチレチン（Ｂ）及びフィブロネクチン（Ｃ）を２倍超誘導した（ｎ＝３）。
【図３Ａ】マトリジェル又は同定したポリマー上に播種した肝細胞様細胞の形態学的及び機能的分析を示す。（Ａ）肝内胚葉（ＨＥ）の形態は、健常な形態を示すポリマー１３４を除き、調査した全てのポリマーについて顆粒状であった（図４Ａ参照）。
【図３Ｂ】（Ｂ）ｈＥＳＣ由来のＨＥを、製造業者の指示に従って、１００μＭのＣＹＰ１Ａ２ ｐＧｌｏ（登録商標）基質を添加した肝細胞培養培地を用いて培養した。処置後４時間で、５０μｌの上清試料を取り出し、ルミノメーター（ポーラスター オプティマ）で読み取った。ＣＹＰ１Ａ２の活性は、ＭＧ又は試験した他のポリマーよりも１３４で維持した細胞で約６倍高い。活性は、相対発光量（Ｒ．Ｌ．Ｕ．）／ｍｇタンパク質（ｎ＝３）として表す。
【図３Ｃ】（Ｃ）ｈＥＳＣ由来のＨＥを、製造業者の指示に従って、５０μＭのＣＹＰ３Ａ４ ｐＧｌｏ（登録商標）基質を添加した肝細胞培養培地を用いて培養した。処置後５時間で、５０μｌの上清試料を取り出し、ルミノメーター（ポーラスター オプティマ）で読み取った。ＣＹＰ３Ａ４活性は、ポリマー１３４よりも低かったが、試験した他のポリマーで維持したＨＥと同程度であった（図４Ｃ参照）。ＣＹＰ３Ａ４活性は、相対発光量（Ｒ．Ｌ．Ｕ．）／ｍｇタンパク質、（ｎ＝３）として表す。
【図３Ｄ】（Ｄ）細胞溶解物をウェスタンブロットし、ヒトプレグナンＸ受容体（ｈＰＸＲ）、ヒトアルブミン及びベータ−アクチンについて検出した。ｈＰＸＲ及びアルブミン産生は、ポリマー２ＢＧ９、２１２及び３ＡＡ７に維持したＨＬＣよりもポリマー９Ｇ７及び２２３に維持したＨＬＣにおいて高かった。
【図４】肝細胞の形態及び機能がマトリジェルと比較してポリマー１３４においては保たれることを示す （Ａ）マトリジェル（ＭＧ）又はポリウレタン１３４に播種したｈＥＳＣ由来のＨＬＣの形態を比較した。一般に、１３４に維持した肝細胞は、きめが粗くなく、より健常に見えた。（Ｂ）タンパク質溶解物を、ＭＧ又は１３４に維持したＨＥから調製した。抽出物をウェスタンブロットし、ブロッキングし、ｐ−Ａｋｔ、ｐ−ＦＡＫ、ｐ−ＥＲＫ、ｐ１５、ｐ２１、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、アルブミン、ｈＰＸＲ及びＣｙｐ３Ａ４について検出した。ＭＧではなく、ポリマー１３４に維持したｈＥＳＣ−ＨＥは、Ａｋｔ、ＦＡＫ及びＥＲＫシグナル伝達；細胞周期阻害剤であるｐ１５及びｐ２１の発現；接着分子であるＥ−カドヘリン及びＮ−カドヘリンの発現、並びにｈＰＸＲ及びＣｙｐ３Ａ４の発現について増加を示した。二つのハウスキーピング遺伝子であるＢ−アクチン及びＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして用いた。同様のＢ−アクチンの発現がＭＧ及び１３４の両方のサンプルにおいて観察されたが、より高いＧＡＰＤＨの発現がＭＧのタンパク質サンプルにおいて検出された。加えて、ポリマー１３４に維持したＨＥは薬剤誘発性のｈＰＸＲの機能と一致したリン酸化上方バンドの存在を示した。アルブミンのレベルは、ポリウレタン１３４及びマトリジェルに維持した肝細胞様細胞においても同等のままであった。（Ｃ）ｈＥＳＣ由来のＨＬＣｓ及び初代ヒト幹細胞を、製造業者の指示に従って、５０μＭのＣＹＰ３Ａ４ ｐＧｌｏ（登録商標）基質を添加したヒト肝細胞培養培地を用いて培養した。処置後５時間で、５０μｌの上清試料を取り出し、ルミノメーター（ポーラスター オプティマ）で読み取った。ＣＹＰ３Ａ４活性は、ＭＧよりも１３４に維持した細胞において高かった。活性を相対発光量（Ｒ．Ｌ．Ｕ．）／ｍｇタンパク質、（＊ｐ＜０．０５、ｔ検定、（ｎ＝３））として表す。
【図５】ポリウレタン１３４及びその構成要素の構造を示す。このポリウレタンの合成については、ポリオールとして２５％のＰＨＮＧＡＤ、ジイソシアネーとして５０％のＭＤＩ及び鎖延長剤として２５％のＢＤを用いた。
【図６】人工肝臓（ＢＡＬ）の未被覆又は被覆ポリファイバーコア（ＰＦＣ）上のいずれかに播種したｈＥＳＣ由来のＨＥを示す。培養２４日目に、細胞を固定し、染色し、電子顕微鏡により観察した。（ａ）はＢＡＬの未被覆ＰＦＣである。（ｂ）は細胞を付着させた未被覆のＰＦＣを示し、（ｃ）はポリマー１３４で被覆したＰＦＣを示し、（ｄ）は細胞を付着させたポリマー１３４で被覆したＰＦＣを示す。パネル中のスケールバーは、５０μｍである。
【図７】の（Ａ）薬物誘導（１７−２１日目）の前に、ｈＥＳＣ由来のＨＥを１ｍｌの肝細胞培養培地中に２４時間培養した。以下の初期の培養上清を採取し、血清タンパク質の産生をＥＬＩＳＡにより測定し、ｎｇ／ｍｌ培養上清（ｎ＝６）として算出したところ、ポリマー１３４において明らかな増加があった。（Ｂ）ｈＥＳＣ由来のＨＥを、人工肝臓（ＢＡＬ）の未被覆（灰色のバー）又は被覆（黒色のバー）のポリファイバーコア（ＰＦＣ）のいずれかに播種した。培養物を、既知のＣＹＰ３Ａ４誘導因子であるフェノバービタル（ＰＢ）（０．４ｍＭ）の存在（＋）又は不在（−）下でＣＹＰ３Ａ４活性の測定の前４８時間培養した。２４日目に、ｈＥＳＣ由来のＨＥを、５０μＭのＣＹＰ３Ａ４ ｐＧｌｏ（登録商標）基質を添加した肝細胞培養培地を用いて培養した。処置後５時間で、ＣＹＰ３Ａ４活性をルミノメーター（ポーラスター オプティマ）で読み取ったところ、ポリマー１３４において明らかな活性の誘導があった。活性の単位は、相対発光量（Ｒ．Ｌ．Ｕ．）／ｍｇタンパク質、＊ｐ＜０．０５、ｔ検定、（ｎ＝４）として表す。
【図８】未被覆（黒色のバー）又は被覆（灰色のバー）の人工肝臓マトリックスのいずれかに播種したｈＥＳＣ由来のＨＥ （Ａ）培養物を塩化アンモニウムの存在下でウレアーゼ活性の測定前４時間培養した。ウレアーゼ活性を、ｍＭ／ｍｇ細胞タンパク質／時間、（ｎ＝１２）、＊ｐ＜０．０５で表した。（Ｂ）未変性およびポリマー被覆の人工肝臓マトリックスに対するＨＥの機能。培地及びフェノバービタルを毎日交換して、フェノバービタル（シグマ）による薬物誘導を２２日目に４８時間行った。コントロール培養物には、フェノバービタルを加えずに、培地を毎日交換した。培養物を既知のＣＹＰ３Ａ４誘導物質であるフェノバービタル（０．４ｍＭ−５ｍＭ）の存在又は非存在下でＣＹＰ３Ａ４活性の測定前４８時間培養した。２４日目に、ｈＥＳＣ由来のＨＥを、５０μＭのＣＹＰ３Ａ４ ｐＧｌｏ（登録商標）基質（プロメガ−非溶解性ＣＹＰ４５０活性測定）を添加した肝細胞培養培地を用いて培養した。処置後５時間で、ＣＹＰ３Ａ４活性をルミノメーター（ポーラスター オプティマ）で読み取った。活性の単位を、相対発光量（Ｒ．Ｌ．Ｕ．）／ｍｇタンパク質、（ｎ＝６）として表す。
【図９】ＭＧ及びポリマー１３４に対するｉＰＳＣ由来のＨＥのＣＹＰ３Ａ４機能 ｉＰＳＣ由来のＨＥをマトリジェル及びポリマー１３４上で培養した。２４日目に、マトリジェル及びポリマー１３４に維持したＨＥがＣＹＰ３Ａ４の機能を示すかどうか評価した。重要なことに、ポリマー１３４に再播種したｉＰＳＣ由来のＨＥは、マトリジェルに再播種したものよりもかなり高い基底レベルのＣＹＰ３Ａ４活性を示した。２４日目に、ｈＥＳＣ由来のＨＥを、５０μＭのＣＹＰ３Ａ４ ｐＧｌｏ（登録商標）基質（プロメガ−非溶解性ＣＹＰ４５０活性測定）を添加した肝細胞培養培地を用いて培養した。処置後５時間で、ＣＹＰ３Ａ４活性をルミノメーター（ポーラスター オプティマ）で読み取った。活性の単位を、相対発光量（Ｒ．Ｌ．Ｕ．）／ｍｇタンパク質（ｎの値をグラフに示す）として表す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（材料及び方法）
ＰＨＮＧＡＤの合成（下記のスキーム１及び２参照）
ジエチレングリコール、１，６−ヘキサンジオール、ネオペンチルグリコール及びアジピン酸をアルドリッチ社から購入した。第一スズオクトアート及びチタン（ＩＶ）ブトキシドは商用グレード（アルドリッチ社）であり、更なる精製なしに使用した。ジイソシアネートとして４，４’−メチレンビス（フェニルイソシアネート）（ＭＤＩ）を用い、鎖延長剤、（３−ジエチルアミノ−１，２−プロパンジオール）（ＤＥＡＰＤ）、１，４−ブタンジオール（ＢＤ）及び２，２，３，３，４，４，５，５−オクタフルオロ−１，６−ヘキサンジオール（ＯＦＨＤ）（アルドリッチ社）をポリウレタン合成に用いた。
【００２２】
あらゆる有機溶媒なしにモノマーの溶融技術を用いて、ＰＨＮＧＡＤポリオールの合成を行った。初めに、全てのモノマーを真空下６０℃で４８時間熱処理して水の除去を確実にした。必要量のモノマー、すなわち１，６−ヘキサンジオール（０．２２モル）、ジ（エチレングリコール）（０．２２モル）、ネオペンチルグリコール（０．２２モル）及びアジピン酸（０．５５モル）を反応用フラスコに加えた。集合物全体を４０℃のオーブンに６時間保持して、化学薬品をフラスコに加える間のあらゆる吸湿を回避した。乾燥後、必要量の触媒、すなわち第一スズオクトアート又はチタン（ＩＶ）ブトキシドのいずれかを針を通して一滴ずつ注入し、反応混合物を１８０℃まで加熱し、Ｎ２雰囲気下で撹拌し、水を冷却器を通して回収した。反応を所望の時間まで行った。ポリオールの分子量分布は、モノマーの組成、触媒、反応時間および反応温度を変化させることにより制御することができる。
【００２３】
ポリオール合成用の代替の方法は、モノマー及び他の添加物を有機溶媒中に溶解する溶解技術である。この場合、反応は、溶融法よりも一層低い温度で行うことができ、溶媒を蒸発により除去することができる。
【００２４】
（ポリウレタンの合成）
ポリウレタンの合成を、二段階重合法により行った。一当量のポリオールをまず二当量のジイソシアネートと、その後一当量の鎖延長剤と反応させてコポリマー生成物を得た。
【００２５】
一つ又は複数の触媒を、ポリウレタン合成に用いることができる。特に好適な触媒は、ジブチルスズジラウレート、ジメチルスズジカルボキシレート、第一スズオクトアート、鉄（III）アセチルアセトネートである。好適な触媒量は、０〜５重量％の範囲である。
【００２６】
加えて、消泡剤又は接着促進剤などの更なる添加物を反応中に加えてもよく、これらは溶液の表面張力を低減し、泡の形成を抑制又は変更する。
【００２７】
Ｎ，Ｎ´−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、トルエン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、クロロホルム、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、１，２−ジクロロエタン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の様々な溶媒を用いることができる。一つ又は複数の溶媒を用いて反応系中の出発物質を溶解することができる。ここで、溶媒は乾燥溶媒とする。二成分溶媒もポリウレタン合成に用いることができる。
【００２８】
ポリウレタン類の合成を様々な温度で行うことができ、特に好適な温度範囲は５０℃〜１４０℃である。反応は、不活性雰囲気下、好適には窒素又はアルゴンのパージにより９６時間まで長く行うことができる。
【００２９】
反応後、ポリウレタンを沈殿により回収した。この場合、沈殿が生じるまで貧溶媒を反応溶液中に滴下することができる。最後に、ポリウレタンを溶液から分離し、分析した。
【００３０】
様々な分析技術及び方法（ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、ＮＭＲ、ＦＴＩＲ分光器、示差走査熱量計（ＤＳＣ）等）を用いてこれら材料を評価してポリマーの分子量分布及び官能基、並びに融点及びガラス転移点等を確認した。
【００３１】
ポリウレタン類の様々な分子量分布（Ｍｗ、Ｍｎ及びＤ）（表２）を、反応条件（反応時間、開始剤の濃度等）を変化させることにより達成することができ、本発明について好適な分子量の範囲の例は、５ｋＤａ〜４００ｋＤａである。
【００３２】
（細胞培養）
ｈＥＳＣ培養を、前述［２，３］のように行った。ｈＥＳＣｓを、既に発表［３］されているようにアクチビン及びｗｎｔ３ａを用いて肝細胞様細胞に分化した。分化処理の９日目に、トリプシン／ＥＤＴＡ（インビトロジェン）での３７℃５分間の培養を用いて、細胞をその基質から剥がした。その後、肝細胞様細胞を、ポリマーアレイ、ポリマー被覆カバースリップ又はマトリジェル被覆プラスチックウェア上に播種した。前述［６］のように、ｉＰＳ細胞株３３Ｄ−６を培養し、増殖させ、そして肝内胚葉に分化させた。分化プロトコルの９日目に、トリプシン／ＥＤＴＡ（インビトロジェン）で５分間培養することにより、細胞をその基質から剥がした。その後、肝細胞様細胞（ＨＬＣｓ）をポリマー１３４又はＭＧに播種し、［６］に記載のＬ−１５成熟培地で培養した。
【００３３】
（免疫染色）
免疫染色を前述［３］のように行った。
【００３４】
（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡを前述［３］のように行った。
【００３５】
（ｐ４５０アッセイ）
ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ２活性は、プロメガ社製のｐＧｌｏキットを用いて評価し、非溶解性ＣＹＰ４５０活性測定に関する製造業者の指示（http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf）に従って行った。ＣＹＰ活性を、相対発光量（ＲＬＵ）／ｍｇタンパク質として表した。
【００３６】
（ウェスタンブロット）
ウェスタンブロッティングを前述［４］のように行った。タンパク質に対する一次抗体を下記の表に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
（ポリマースクリーニング）
カバースリップを前述［７］のように六つのポリマーで被覆した。
【００３９】
（ＰＨＮＧＡＤ及びＰＵ−１３４の合成）
【化１】
【化２】
【実施例】
【００４０】
（実施例１：ポリマーライブラリーのスクリーニング及び評価）
３８０の一般的なポリウレタン及びポリアクリレートポリマーをアガロース被覆ガラス顕微鏡スライド上に接触プリントすることによりポリマーマイクロアレイを作製した［７，８］。プリント後、スライドを一夜乾燥し、細胞播種前に紫外線照射により滅菌した。本発明者らは、このポリマーライブラリーを胚幹細胞由来の肝臓内胚葉（ＨＥ）の付着、安定化及び機能の向上について調査した。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）のＨＥへの直接分化は、最近開発された高効率の組織培養モデルを用いて開始した（図１Ａ）。肝細胞の寿命（９日目）を選び、ＨＥをその生物学上の細胞外マトリックスから剥離し、ポリマーアレイ／ライブラリーに再播種した。アレイに再播種した後、生体外における肝細胞の同一性及び分化を支持する条件で、ｈＥＳＣ由来のＨＥを更に８日間培養した。この時点で細胞の付着を位相差顕微鏡を用いて記録し（図１Ｂ、Ａ）；肝細胞の表現型及び機能をアルブミン産生により評価し（図１Ｂ、Ｂ）；今日の「究極の判断基準」の条件（マトリジェルにおける培養、図１Ｂ、Ｃ）及びＩｇＧアイソタイプコントロールと比較した（図１Ｂ、Ｄ）。一次スクリーニングにより、ＨＬＣの付着及び同一性を支持するポリマーを同定した（図１Ｃ）。
【００４１】
（実施例２：選択したポリマーの評価）
ヒト−ＥＳＣｓを詳細に述べた通り、分化し、再播種した。細胞機能を再播種後１５日目に評価し、肝細胞特異的な遺伝子のパネルの発現及び必須の血清タンパク質の排出により規定した。この手法を用いて、ポリマー１３４［７］を、フィブリノーゲン［９］（図２Ａ）、トランスチレチン（ＴＴＲ）［１０］（図２Ｂ）及び溶解性フィブロネクチン［１１］（図２Ｃ）の発現の向上を備える最も効率的な細胞支持体として同定した。本発明者らは、二つのＥＣＭ（１５日目）間のＨＬＣの形態の実質的な変化も観察した。マトリジェル又はポリマー２ＢＧ９、２１２、９Ｇ７、３ＡＡ７及び２２３（図３Ａ及び図４Ａ）に継代し、維持したＨＬＣは顆粒状であった。対照的に、１３４に再播種したＨＬＣは、明らかな肝細胞形態を維持した（図４Ａ）。次いで、本発明者らは、異なる細胞外マトリックスに対する主要なシトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）活性を分析した。ＣＹＰ１Ａ２の活性は、標準的なマトリジェル条件又は評価したその他のポリマーと比較してポリマー１３４で約６倍増加した。本発明者らはまた、ＣＹＰ３Ａ４が数ある外分泌経路における基本的な役割を果たし、約５０％の処方薬の代謝に関与するので、ＣＹＰ３Ａ４の機能を調査した。多くの薬が、創薬工程における魅力的な標的分子とするＣＹＰ３Ａ４の阻害活性を有することが知られている［１２］。ポリマー１３４に維持したＨＬＣは、マトリジェル又は試験した他のポリマーに維持した細胞と比較して、ＣＹＰ３Ａ４ ｐ４５０機能に約２倍の増加を示した（図４Ｃ、図３Ｃ）。ヒトプレグナンＸ受容体（ｈＰＸＲ）は、ＣＹＰ３Ａの遺伝子発現の主要な制御因子である［１３］。ｈＰＸＲは、細胞質中に捕捉され［１４］、リガンドが結合する際に解離する。ｈＰＸＲの核移行の間に、これはタンパク質キナーゼＡに依存的な方法でリン酸化される［１２］。核移行すると、ｈＰＸＲはレチノイン酸受容体と二量化し、ＣＹＰ３Ａ遺伝子プロモーター中に含まれるコアエレメントによりＣＹＰ３Ａ発現を制御する［１５］。前述の発見と一致するように、本発明者らは、１３４に維持したＨＬＣが、ＣＹＰ３Ａ４の発現及び活性のピークレベルと一致するｈＰＸＲの発現及びリン酸化レベルの向上を示すことを実証する（図３Ｃ、図４Ｃ）。本発明者らはまた、これらの実験におけるアルブミンの発現を分析し、アルブミンの遺伝子発現がマトリジェルとポリマー１３４に維持したＨＬＣの間で類似していることを示した。しかしながら、アルブミン及びｈＰＸＲの発現は、試験された他のポリマー上ではかなり変化した（図３Ｄ）。
【００４２】
ポリマー１３４及びその有用可能性の観察に続き、更なる関連のポリマー（前ページ７、８に従って調製）を研究し、肝細胞の付着及び維持機能を可能にする他のポリマーを同定した（表２参照）。
【００４３】
（実施例３：ポリマー１３４及びマトリジェルに対するｈＥＳＣ由来のＨＥの詳細な評価）
本発明者らの更なる研究では、二つの細胞外マトリックス、すなわちマトリジェル及びポリマー１３４に対するＨＥの形態、シグナル伝達、遺伝子発現、及び薬物代謝に焦点を当てた。マトリジェルは、生体外で肝細胞の働きを向上させることが以前に示され、今日の「究極の判断基準」とされているため、本発明者らのコントロールとして用いた。本発明者らは、ＨＥ形態の実質的な変化（２４日目）を観察した。すなわち、マトリジェルまたはポリマー２ＢＧ９、２１２、９Ｇ７、３ＡＡ７及び２２３に通し、維持したＨＥは顆粒状であった（図３Ａ及び図４Ａ）。対照的に、１３４に再播種したＨＥは、明白な肝細胞の形態を維持した（図４Ａ）。細胞形態の変化に従って、本発明者らは、一般的な細胞シグナル伝達及び肝細胞遺伝子発現の変化も観測した。ポリマー１３４に維持したｈＥＳＣ−ＨＥは、細胞がその基質にしっかりと付着し、アポトーシスを起こさないことに一致して、ＦＡＫ、Ａｋｔ及びＥＲＫシグナル伝達の向上を示した。これは、マトリジェルに維持したＨＥでは観察されなかった。ポリマー１３４に播種したＨＥは、有糸分裂因子ＥＲＫのレベルの向上を示したが、ＨＥはまた高レベルの細胞周期阻害因子ｐ１５及びｐ２１を発現した。総合すると、これらの結果は、休止／機能的状態で固定された代謝的に活性な肝細胞集団があることと合致する。細胞シグナル伝達及び細胞周期の変化に加えて、本発明者らはまた肝細胞の遺伝子発現における変化を観測した。Ｎ−カドヘリン及びＥ−カドヘリンの両方の発現は、ヒトの肝臓の生物学上で重要な役割を果たす。本発明者らは、ＭＧと比較して、ポリマー１３４に維持したｈＥＳＣ−ＨＥにおけるこれらの両方の分子の発現の向上を観測した。ポリマー１３４に対する上皮側の表現型に加えて、本発明者らは、再播種したＨＥがまたポリマー１３４に対するｈＰＸＲ及びリン酸化−ＰＸＲの発現の増加を示すことを観測した。ｈＰＸＲのレベル増加は、ウェスタンブロッティングにより検出したシトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）３Ａ４のレベルの増加と一致する（図４Ｂ）。ポリマーがＣＹＰ３Ａ４代謝活性に果たす役割を評価するために、本発明者らは異なる細胞外マトリックスに対する主要な活性を分析し、初代ヒト幹細胞と比較した。ポリマー１３４に維持したＨＥは、マトリジェルに維持した初代ヒト幹細胞（ＰＨＨ）と同等のＣＹＰ３Ａ４ ｐ４５０の機能を示し、マトリジェル又は試験した他のポリマーに維持したｈＥＳＣ由来のＨＥと比較して、約２倍のＣＹＰ３Ａ４ ｐ４５０の機能の増加を示した（図４Ｃ及び図３Ｃ）。ＣＹＰ３Ａ４に加えて、本発明者らはＣＹＰ１Ａ２活性も試験したところ、標準的なマトリジェル条件又は評価した他のポリマーと比較して、ポリマー１３４において約６倍誘導された（図３Ｂ）。本発明者らは、これらの実験でアルブミン発現も分析し、アルブミンの発現がマトリジェル及びポリマー１３４に維持したＨＥの間で同等であることを示した（図４Ｂ）。
【００４４】
（実施例４：未変性及びポリマー１３４被覆の人工肝臓マトリックスへのｈＥＳＣ由来のＨＥの付着）
本発明者らは、人工肝臓（ＢＡＬ）デバイスに用いる細胞マトリックスであるポリファイバーコア（ＰＦＣ）を用いた。ＰＦＣを未変性の形状で用いるか、又はポリマー１３４で被覆した。肝細胞の寿命（９日目）を選び、ＨＥをその生物学上の細胞外マトリックスから剥離し、未変性又はポリマー被覆したＰＦＣ上に再播種し、肝細胞の同一性を支持する条件下で更に１５日間（２４日目まで）培養した。２４日目に、本発明者らは未被覆（図６Ａａ）及びポリマーで被覆したＢＡＬマトリックス（図６Ａｃ）に付着したＨＥを固定し、電子顕微鏡により細胞構造を検討した。未被覆ＰＦＣに維持したｈＥＳＣ由来のＨＥは、細胞付着及びストレス繊維に似た細胞突起を示した（図６Ａｂ）が、ポリマー１３４で被覆したＰＦＣに維持したＨＥは、ＢＡＬにおけるＨＥについての流体剪断応力の影響を制限することができる平滑組織のような外観（図６Ａｄ）を示した。
【００４５】
（実施例５：未変性及びポリマー１３４で被覆した人工肝臓マトリックスに対するｈＥＳＣ由来のＨＥ機能）
これらのデータは、ＢＡＬセッティングにおけるポリマー１３４及びｈＥＳＣ由来ＨＥの価値を実証する。ｐ４５０薬物誘導性に加えて、ポリマー１３４は薬物誘導（１７〜２１日目）前に測定したヒトアルブミン産生も促進する（図７Ａ）。本発明者らがＨＥ薬物誘導性を評価する前に、ｈＥＳＣ由来のＨＥを異なるＢＡＬ−ＰＦＣ基質で１３日間培養した。ｈＥＳＣ由来のＨＥを、０．４ｍＭのフェノバービタルで誘導するか、又は毎日培地を交換しながら４８時間コントロール培地で維持した。２４日目に、本発明者らは両方のＰＦＣ支持マトリックスに維持したＨＥがＣＹＰ３Ａ４の薬物誘導を示すかどうか評価した。未被覆のＰＦＣは肝細胞の付着及び機能を支持したが、しかしながら、細胞のニッチは支持しなかった。ＣＹＰ３Ａ４のフェノバービタル薬物誘導（図７Ｂ、マトリックス ＰＢ＋）。対照的に、ポリマー１３４で被覆したものに再播種したｈＥＳＣ由来のＨＥは、ＨＥの付着及びフェノバービタル誘導性ＣＹＰ３Ａ４の薬物代謝の両方を支持した（図７Ｂ、マトリックス ＰＢ＋）。
【００４６】
（実施例６：未変性及びポリマー１３４被覆の人工肝臓マトリックスに対するｈＥＳＣ由来のＨＥの機能）
これらのデータは、ＢＡＬセッティングにおけるポリマー１３４及びｈＥＳＣ由来のＨＥの価値を実証する。ｐ４５０薬物誘導性に加えて、ポリマー１３４はヒトウレアーゼ活性を促進する（２４日目）（図８Ａ）。本発明者らがＨＥの薬物誘導（２２〜２４日目）を評価する前に、ｈＥＳＣ由来のＨＥを異なるＢＡＬ−ＰＦＣマトリックス（＋／− ポリマー１３４）基質に１３日間培養した。ｈＥＳＣ由来のＨＥをある範囲のフェノバービタル濃度（０．４ｍＭ−５ｍＭ）で誘導するか、又は毎日培地を交換しながら４８時間コントロール培地で維持した。２４日目に、本発明者らは両方のＰＦＣ支持マトリックスに維持したＨＥがＣＹＰ３Ａ４の薬物誘導を示すかどうかを評価した。２４日目に、未変性のマトリックスは、肝細胞の付着及び機能発現をＣＹＰ３Ａ４の乏しい薬物誘導で支持した（図８Ｂ、黒色のバー）。対照的に、ポリマー１３４で被覆したマトリックスに再播種したｈＥＳＣ由来のＨＥは、用量依存的なフェノバービタル誘導性のＣＹＰ３Ａ４薬物代謝を示した（図８Ｂ、灰色のバー）。
【００４７】
（実施例７：未変性の基質及びポリマー１３４で被覆したカバーストリップに対するｉＰＳＣ由来のＨＥのＣＹＰ３Ａ４機能）
ポリウレタンマトリックス（ポリマー１３４）は、機能性の高いｉＰＳＣ由来の肝内胚葉（ＨＥ）の培養を促進することによって、肝細胞機能に重要な役割を果たす。図９は、ｉＰＳＣｓをＨＥに分化し、ＨＥの生存及び機能を促進するポリマー１３４に再播種し得ることを示す。ｈＥＳＣ由来のＨＥと同様に、ポリマー１３４で培養したｉＰＳＣ由来のＨＥは、マトリジェルで生育した同じ細胞よりも高い基底レベルのＣＹＰ３Ａ４活性を示した。
【００４８】
結論として、このスクリーニングが、継代の前後に長期の肝細胞分化による機能を促進する新たな分類のポリマーマトリックスを同定することを可能にした。これら特性は、成人のヒト肝細胞に伴う今日の制限を回避し、薬物毒性の生体外モデルの開発に重要な役割を果たし、且つ薬物損耗率の低減を助けることができる。加えて、本発明者らの生体外由来の細胞は、体外デバイスの構築のための資源を提供し、且つヒト肝臓の発生及び疾患の新規な研究を促進する。
【００４９】
（参考文献）
［１］ Pharmaceutical Research and Manufacturers of America (PhRMA). Pharmaceutical Industry Profile 2005.
［２］ Hay DC et al, 2008 Stem Cells. 2008 26(4): 894-902.
［３］ Hay DC et al, 2008 Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 105(34): 12301-6.
［４］ Hay DC et al, Cloning Stem Cells. 2007 (9): 51-62.
［５］ Fletcher J et al, Cloning and Stem Cells. 2008 (10): 331-340.
［６］ Sullivan et al, Hepatology. 2010 51(1): 329-35.
［７］ Pernagallo S et al, Lab Chip. 2009 9: 397-403.
［８］ Uniciti-Broceta et al, J Comb Chem 2008: 10, 24-27.
［９］ Tennent GA et al, Blood. 2007 109 (5): 1971-4.
［１０］ Ingenbleek Y et al, Annu Rev Nutr. 1994 (14): 495-533.
［１１］ Pankov R et al, J Cell Sci. 2002 115 (Pt 20): 3861-3.
［１２］ Keshava C et al, Am J Epidemiol. 2004 160 (9): 825-41.
［１３］ Ding X et al, J Pharmacol Exp Ther. 2005 312 (2): 849-56.
［１４］ Squires EJ et al, J Biol Chem. 2004 279 (47): 49307-14.
［１５］ Orans J et al, Mol Endocrinol. 2005 (12): 2891-900.
【００５０】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞及び肝細胞様細胞の付着及び機能発現に用いるポリウレタンポリマー。
【請求項２】
前記ポリマーがポリ（１，６−ヘキサンジオール／ネオペンチルグリコール／ジ（エチレングリコール）−ａｌｔ−アジピン酸）ジオール（ＰＨＮＧＡＤ）、４，４’−メチレンビス（フェニルイソチアネート）（ＭＤＩ）及び増量剤を重合することにより形成される請求項１に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項３】
前記増量剤が１，４−ブタンジオール（ＢＤ）；３−ジメチルアミノ−１、２−プロパンジオール（ＤＭＡＰＤ）；３−ジエチルアミノ−１，２−プロパンジオール（ＤＥＡＰＤ）；（ＢＤ）、２，２，３，３，４，４，５，５−オクタフルオロ−１，６−ヘキサンジオール（ＯＦＨＤ）、１，３−プロピレングリコール（ＰＧ）、１，２−エチレングリコール（ＥＧ）、２−ニトロ−２−メチル−１、３−プロパンジオール（ＮＭＰＤ）、ジエチル−ビス−（ヒドロキシメチル）−マロネート（ＤＨＭ）、１，１２−ドデカンジオール、シクロドデカンジオール、ヒドロキノン−ビス（２−ヒドロキシエチル）エーテル、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＥＨＤ）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロパノールアラニン（ＤＩＰＡ）、エチレンジアミン、ｍ−フェニレン−４−ジアミノスルホン酸（ＰＤＳＡ）からなる群から選択される請求項２に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項４】
前記ポリマーが表２に示すポリマー１０３；１０４；１３４及び２４７からなる群から選択される前記請求項のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項５】
前記肝細胞が、肝臓、胚性幹細胞および胚性幹細胞株から得た肝細胞、肝細胞に分化された再プログラム化細胞及び／又は肝細胞様細胞である前記請求項のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項６】
機能性の肝細胞の付着についてのポリウレタンポリマーの使用。
【請求項７】
前記肝細胞をポリマーに直接付着する請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ポリウレタンポリマーを適当な基質に物理的若しくは化学的に被覆する請求項１〜５に記載のポリウレタンポリマー、又は請求項６若しくは７に記載の使用。
【請求項９】
前記適当な基質がポリマー及びセラミック材料、ガラス、セラミック、天然繊維、合成繊維、シリコーン、金属及びその複合体からなる群から選択される請求項８に記載のポリウレタンポリマー又は使用。
【請求項１０】
前記適当な基質がポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスルホン、ＰＶＤＦ、テフロン（登録商標）及びその複合体、混合物若しくは誘導体からなる群から選択される材料から作製される請求項８又は９に記載のポリウレタンポリマー又は使用。
【請求項１１】
前記ポリウレタンポリマー又はポリウレタンポリマーで被覆した基質が糸、シート、フィルム、ゲル、膜、ビーズ又はプレートの形状である請求項８〜１０のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー又は使用。
【請求項１２】
前記ポリウレタンポリマー又はポリウレタンポリマーで被覆した基質が、ウェル、窪み、台、疎水性／親水性パッチ、又はウェルを形成するダイカットされた付着性の貯留池／積層されたガスケットの形状で断続的な隔離された領域を有する平面デバイスを形成する請求項８〜１１のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー又は使用。
【請求項１３】
前記適当な基質が人工肝臓のポリファイバーコアである請求項８〜１２のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー又は使用。
【請求項１４】
結合又は付着した肝細胞を含むポリウレタンポリマー。
【請求項１５】
前記ポリマーがポリ（１，６−ヘキサンジオール／ネオペンチルグリコール／ジ（エチレングリコール）−ａｌｔ−アジピン酸）ジオール（ＰＨＮＧＡＤ）、４，４’‐メチレンビス（フェニルイソチアネート）（ＭＤＩ）及び増量剤を重合することにより形成される請求項１４に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項１６】
前記増量剤が１，４−ブタンジオール（ＢＤ）；３−ジメチルアミノ−１、２−プロパンジオール（ＤＭＡＰＤ）；３−ジエチルアミノ−１，２−プロパンジオール（ＤＥＡＰＤ）；（ＢＤ）、２，２，３，３，４，４，５，５−オクタフルオロ−１，６−ヘキサンジオール（ＯＦＨＤ）、１，３−プロピレングリコール（ＰＧ）、１，２−エチレングリコール（ＥＧ）、２−ニトロ−２−メチル−１、３−プロパンジオール（ＮＭＰＤ）、ジエチル−ビス−（ヒドロキシメチル）−マロネート（ＤＨＭ）、１，１２−ドデカンジオール、シクロドデカンジオール、ヒドロキノン−ビス（２−ヒドロキシエチル）エーテル、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＥＨＤ）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロパノールアラニン（ＤＩＰＡ）、エチレンジアミン、ｍ−フェニレン−４−ジアミノスルホン酸（ＰＤＳＡ）からなる群から選択される請求項１５に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項１７】
前記ポリマーが表２に示すポリマー１０３；１０４；１３４及び２４７からなる群から選択される請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項１８】
前記肝細胞が機能性である請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項１９】
ポリウレタンポリマーで被覆した細胞培養用基質。
【請求項２０】
前記基質がポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスルホン、ＰＶＤＦ、テフロン（登録商標）およびその複合体、混合物若しくは誘導体からなる群から選択した材料からなる請求項１９に記載の基質。
【請求項２１】
ポリウレタンポリマーを含む人工の肝臓又は解毒臓器。
【請求項２２】
前記ポリウレタンポリマーがポリ（１，６−ヘキサンジオール／ネオペンチルグリコール／ジ（エチレングリコール）−ａｌｔ−アジピン酸）ジオール（ＰＨＮＧＡＤ）、４，４’‐メチレンビス（フェニルイソチアネート）（ＭＤＩ）及び増量剤を重合することにより形成される請求項２１に記載の人工の肝臓又は解毒臓器。
【請求項２３】
前記増量剤が１，４−ブタンジオール（ＢＤ）；３−ジメチルアミノ−１、２−プロパンジオール（ＤＭＡＰＤ）；３−ジエチルアミノ−１，２−プロパンジオール（ＤＥＡＰＤ）；（ＢＤ）、２，２，３，３，４，４，５，５−オクタフルオロ−１，６−ヘキサンジオール（ＯＦＨＤ）、１，３−プロピレングリコール（ＰＧ）、１，２−エチレングリコール（ＥＧ）、２−ニトロ−２−メチル−１、３−プロパンジオール（ＮＭＰＤ）、ジエチル−ビス−（ヒドロキシメチル）−マロネート（ＤＨＭ）、１，１２−ドデカンジオール、シクロドデカンジオール、ヒドロキノン−ビス（２−ヒドロキシエチル）エーテル、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＥＨＤ）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロパノールアラニン（ＤＩＰＡ）、エチレンジアミン、ｍ−フェニレン−４−ジアミノスルホン酸（ＰＤＳＡ）からなる群から選択される請求項２２に記載の人工の肝臓又は解毒臓器。
【請求項２４】
前記ポリマーが表２に示すポリマー１０３；１０４；１３４及び２４７からなる群から選択される請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の人工の肝臓又は解毒臓器。
【請求項２５】
肝臓、胚性幹細胞、再プログラム化細胞、胚性幹細胞株及び／又は肝細胞様細胞から得た肝細胞を更に含む請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の人工の肝臓又は解毒臓器。
【請求項１】
肝細胞及び肝細胞様細胞の付着及び機能発現に用いるポリウレタンポリマー。
【請求項２】
前記ポリマーがポリ（１，６−ヘキサンジオール／ネオペンチルグリコール／ジ（エチレングリコール）−ａｌｔ−アジピン酸）ジオール（ＰＨＮＧＡＤ）、４，４’−メチレンビス（フェニルイソチアネート）（ＭＤＩ）及び増量剤を重合することにより形成される請求項１に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項３】
前記増量剤が１，４−ブタンジオール（ＢＤ）；３−ジメチルアミノ−１、２−プロパンジオール（ＤＭＡＰＤ）；３−ジエチルアミノ−１，２−プロパンジオール（ＤＥＡＰＤ）；（ＢＤ）、２，２，３，３，４，４，５，５−オクタフルオロ−１，６−ヘキサンジオール（ＯＦＨＤ）、１，３−プロピレングリコール（ＰＧ）、１，２−エチレングリコール（ＥＧ）、２−ニトロ−２−メチル−１、３−プロパンジオール（ＮＭＰＤ）、ジエチル−ビス−（ヒドロキシメチル）−マロネート（ＤＨＭ）、１，１２−ドデカンジオール、シクロドデカンジオール、ヒドロキノン−ビス（２−ヒドロキシエチル）エーテル、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＥＨＤ）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロパノールアラニン（ＤＩＰＡ）、エチレンジアミン、ｍ−フェニレン−４−ジアミノスルホン酸（ＰＤＳＡ）からなる群から選択される請求項２に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項４】
前記ポリマーが表２に示すポリマー１０３；１０４；１３４及び２４７からなる群から選択される前記請求項のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項５】
前記肝細胞が、肝臓、胚性幹細胞および胚性幹細胞株から得た肝細胞、肝細胞に分化された再プログラム化細胞及び／又は肝細胞様細胞である前記請求項のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項６】
機能性の肝細胞の付着についてのポリウレタンポリマーの使用。
【請求項７】
前記肝細胞をポリマーに直接付着する請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ポリウレタンポリマーを適当な基質に物理的若しくは化学的に被覆する請求項１〜５に記載のポリウレタンポリマー、又は請求項６若しくは７に記載の使用。
【請求項９】
前記適当な基質がポリマー及びセラミック材料、ガラス、セラミック、天然繊維、合成繊維、シリコーン、金属及びその複合体からなる群から選択される請求項８に記載のポリウレタンポリマー又は使用。
【請求項１０】
前記適当な基質がポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスルホン、ＰＶＤＦ、テフロン（登録商標）及びその複合体、混合物若しくは誘導体からなる群から選択される材料から作製される請求項８又は９に記載のポリウレタンポリマー又は使用。
【請求項１１】
前記ポリウレタンポリマー又はポリウレタンポリマーで被覆した基質が糸、シート、フィルム、ゲル、膜、ビーズ又はプレートの形状である請求項８〜１０のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー又は使用。
【請求項１２】
前記ポリウレタンポリマー又はポリウレタンポリマーで被覆した基質が、ウェル、窪み、台、疎水性／親水性パッチ、又はウェルを形成するダイカットされた付着性の貯留池／積層されたガスケットの形状で断続的な隔離された領域を有する平面デバイスを形成する請求項８〜１１のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー又は使用。
【請求項１３】
前記適当な基質が人工肝臓のポリファイバーコアである請求項８〜１２のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー又は使用。
【請求項１４】
結合又は付着した肝細胞を含むポリウレタンポリマー。
【請求項１５】
前記ポリマーがポリ（１，６−ヘキサンジオール／ネオペンチルグリコール／ジ（エチレングリコール）−ａｌｔ−アジピン酸）ジオール（ＰＨＮＧＡＤ）、４，４’‐メチレンビス（フェニルイソチアネート）（ＭＤＩ）及び増量剤を重合することにより形成される請求項１４に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項１６】
前記増量剤が１，４−ブタンジオール（ＢＤ）；３−ジメチルアミノ−１、２−プロパンジオール（ＤＭＡＰＤ）；３−ジエチルアミノ−１，２−プロパンジオール（ＤＥＡＰＤ）；（ＢＤ）、２，２，３，３，４，４，５，５−オクタフルオロ−１，６−ヘキサンジオール（ＯＦＨＤ）、１，３−プロピレングリコール（ＰＧ）、１，２−エチレングリコール（ＥＧ）、２−ニトロ−２−メチル−１、３−プロパンジオール（ＮＭＰＤ）、ジエチル−ビス−（ヒドロキシメチル）−マロネート（ＤＨＭ）、１，１２−ドデカンジオール、シクロドデカンジオール、ヒドロキノン−ビス（２−ヒドロキシエチル）エーテル、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＥＨＤ）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロパノールアラニン（ＤＩＰＡ）、エチレンジアミン、ｍ−フェニレン−４−ジアミノスルホン酸（ＰＤＳＡ）からなる群から選択される請求項１５に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項１７】
前記ポリマーが表２に示すポリマー１０３；１０４；１３４及び２４７からなる群から選択される請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項１８】
前記肝細胞が機能性である請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のポリウレタンポリマー。
【請求項１９】
ポリウレタンポリマーで被覆した細胞培養用基質。
【請求項２０】
前記基質がポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスルホン、ＰＶＤＦ、テフロン（登録商標）およびその複合体、混合物若しくは誘導体からなる群から選択した材料からなる請求項１９に記載の基質。
【請求項２１】
ポリウレタンポリマーを含む人工の肝臓又は解毒臓器。
【請求項２２】
前記ポリウレタンポリマーがポリ（１，６−ヘキサンジオール／ネオペンチルグリコール／ジ（エチレングリコール）−ａｌｔ−アジピン酸）ジオール（ＰＨＮＧＡＤ）、４，４’‐メチレンビス（フェニルイソチアネート）（ＭＤＩ）及び増量剤を重合することにより形成される請求項２１に記載の人工の肝臓又は解毒臓器。
【請求項２３】
前記増量剤が１，４−ブタンジオール（ＢＤ）；３−ジメチルアミノ−１、２−プロパンジオール（ＤＭＡＰＤ）；３−ジエチルアミノ−１，２−プロパンジオール（ＤＥＡＰＤ）；（ＢＤ）、２，２，３，３，４，４，５，５−オクタフルオロ−１，６−ヘキサンジオール（ＯＦＨＤ）、１，３−プロピレングリコール（ＰＧ）、１，２−エチレングリコール（ＥＧ）、２−ニトロ−２−メチル−１、３−プロパンジオール（ＮＭＰＤ）、ジエチル−ビス−（ヒドロキシメチル）−マロネート（ＤＨＭ）、１，１２−ドデカンジオール、シクロドデカンジオール、ヒドロキノン−ビス（２−ヒドロキシエチル）エーテル、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２，２，３，３−テトラフルオロ−１，４−ブタンジオール、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＥＨＤ）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロパノールアラニン（ＤＩＰＡ）、エチレンジアミン、ｍ−フェニレン−４−ジアミノスルホン酸（ＰＤＳＡ）からなる群から選択される請求項２２に記載の人工の肝臓又は解毒臓器。
【請求項２４】
前記ポリマーが表２に示すポリマー１０３；１０４；１３４及び２４７からなる群から選択される請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の人工の肝臓又は解毒臓器。
【請求項２５】
肝臓、胚性幹細胞、再プログラム化細胞、胚性幹細胞株及び／又は肝細胞様細胞から得た肝細胞を更に含む請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の人工の肝臓又は解毒臓器。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１２−５２０６６７（Ｐ２０１２−５２０６６７Ａ）
【公表日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５００３１０（Ｐ２０１２−５００３１０）
【出願日】平成２２年３月１９日（２０１０．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０００５２３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０６３４５
【国際公開日】平成２２年９月２３日（２０１０．９．２３）
【出願人】（５１００５５３２３）ユニヴァーシティ コート オブ ザ ユニバーシティ オブ エディンバラ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１９日（２０１０．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０００５２３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０６３４５
【国際公開日】平成２２年９月２３日（２０１０．９．２３）
【出願人】（５１００５５３２３）ユニヴァーシティ コート オブ ザ ユニバーシティ オブ エディンバラ (6)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]