細胞調整及び免疫調整のための短い生物活性ペプチド
【解決手段】４〜１４の残基を有するペプチドであって、生物活性を有するペプチドを開示する。これらペプチドは、ペプチドＨＢ−１０７(配列番号１)の短いフラグメントから構成され、それ自体は、抗菌タンパク質セクロピンＢのフラグメントであり、細胞刺激、移動及び抗炎症性を呈する。角化細胞は、これらの影響に極めて敏感であり、開示されたペプチドは、糖尿病潰瘍のような皮膚への損傷を医学的に処置するために役立つ物質である。ペプチドはまた、種々の環境損傷により生ずる皮膚表面のダメージを防いだり逆作用させる効果がある。重要なのは、ペプチドは、ある濃度で、ペプチドＨＢ−１０７とほぼ同等又はそれを越える効果が現れることであり、その結果、効果的な治療をより安価且つより汎用性のあるものとすることができる。これらペプチドの製造及び使用方法についても開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2007年1月5日に出願された米国仮特許出願第60/878,849号の優先権を主張し、これらの開示の引用を以て本願への記載加入とする。
【０００２】
本発明は、生物活性及び治療活性を有するペプチドに関する。特に、本発明は、配列番号１の４〜14の隣接アミノ酸残基を有する短いペプチドに関し、そのペプチドは、ケラチン生成細胞のような細胞に対して増殖、移動及び抗炎症活性を示す。また、本発明は、口腔のような皮膚及び他の関連する体表面に影響を及ぼす多様な傷を治療するペプチドの使用法に関する。
【背景技術】
【０００３】
表皮は４〜５枚の重層からなり、すべての層は、大部分が角化細胞を含んでおり、線維芽細胞のような他の細胞タイプも表皮に存在する。角化細胞は、最深部つまり表皮の基底層から生じ、徐々に皮膚の最も外側部分に移動し、そこで角質化し、最終的に脱落する。この移動中、角質細胞は分化して、角質化のために必要な酵素と構造タンパク質を発現する(Presland and Dale, 2000)。角化細胞は、表皮形成においてすぐれた役割が与えられ、損傷した皮膚治療を主な目的とする。
【０００４】
角化細胞はまた、表皮と連続している粘膜組織の主要な構成物質である(Presland and Dale, 2000)。そのような組織は、表皮の不浸透性の角質化層が欠乏しており、口、鼻、喉、耳、肛門及び性器に関連する上皮内層を形成する。皮膚と同様に、粘膜表面は、体内への病原体の侵入を防ぐため重要であり、従って、これらの組織タイプのいずれの損傷でも、個体の健康が危うくなることがある。
【０００５】
皮膚及び粘膜組織の損傷は、裂傷、火傷及び水ぶくれのように表皮層が破られたときに発生する。損傷にはまた、皮膚の亀裂のない組織損傷のような、打撲や痣が含まれる。癌や自己免疫疾患のような特定の慢性疾患のような皮膚感染症もまた、表皮上に犠牲を強いる。糖尿病や床ずれに関連するような潰瘍は、皮膚損傷の別の形態であり、これらの傷は非常に処置し難いことがあり、炎症を起こし、感染しやすく、長期の治癒課程を必要とする。潰瘍の持続、或いは他のどの慢性傷も、細胞伝達のような、治療を含む細胞過程の失敗のためであると一般的に位置づけられている(Enoch and Price, 2004; Sweitzer et al., 2006)。一つの失敗は損傷の上皮化不能である。傷のへりで角化細胞は増殖可能であるが、痛む部分を覆うために結集しない(Enoch and Price, 2004)。糖尿病性潰瘍に関して、もう一つの失敗は、特定のシグナリング分子の欠乏である。この欠乏は、傷の封鎖をする調整のため必要なリモデル過程を妨げることがある(Sweitzer et al., 2006)。
【０００６】
表皮損傷の他の形態は僅かであり、長い期間掛かり、最終的に、急性の怪我にもかかわらず皮膚機能を損傷するので、傷治癒の時間が延び、不完全となり得る(例えば、傷跡の形成)。皺や乾燥、薄層化、たるみ及び挫傷に対する、より大きな感染性のような表面上の問題は、そのような病気のよくある外部的兆候である。当然のことながら、これらの消耗の兆候はたいてい老化に関係するが、紫外線のような有害因子への長引く露出のため早まることがある。日光により誘発される光反応性プロセスは、減少した皮膚の厚さと弾力に貢献することができ、また、皮膚の強さを増すことに貢献することもできる(Pelicci, 2004; Fisher et al., 2002)。
【０００７】
急性の皮膚及び粘膜の傷の治療は、基底角化細胞の活性化を通じて部分的に組織化され、傷の封鎖を生じるため増殖、移動、及び分化する。この過程は、傷部位にて一連のリモデリング活性を伴う(Enoch and Price, 2004)。傷周辺の角化細胞は増殖し、上皮形成として引用される過程において傷を覆う一つの層を形成するよう移動する。さらに、角化細胞の増殖及び分化により、通常の層化された層を含む表皮層が確立される。炎症活動は傷治癒を促進し、単球への浸透することで感染と闘うことができ、また、傷の上皮形成を活性化させる因子をリリースできる。しかし、炎症活動はまた治癒を悪化させることもある。例えば、傷化に寄与するマクロファージによる線維素沈着である。無菌状態が継続する限り、免疫の関与が抑制される場合、表皮傷の閉鎖はより速く、より少ない傷となることが示されている(Martin and Leibovich, 2005)。表皮の傷で炎症を緩和するための方法は現在検討中である。
【０００８】
皮膚及び関連する粘膜組織における傷治癒の間、角化細胞により上皮生成を刺激するためいくつかの因子が見られる、それは、上皮細胞増殖因子(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、角化細胞増殖因子(KGF)、及び血小板由来増殖因子(PDGF)である(Enoch and Price, 2004)。興味深いことに、皮膚及び粘膜表面に存在するいくつかの抗微生物タンパク質は細胞増殖及び表皮の傷を治癒するために必要な移動を促進する役割を果たすことで知られている(Shaykhiev et al., 2005; Braff and Gallo, 2006; Zhang and Falla, 2006)。
【０００９】
傷治癒の間、特定の成長因子は当然に関与するという知識の元、研究は成長因子をベースにした傷治療法開発、特に一般に慢性の傷治療法に対して向けられている。例えば、PDGF-BBによる糖尿病性潰瘍の治療は、FDA認可を得た(Mustoe et al., 1994; Steed, 1995)。しかしながら、そのような方法を使う大部分の試みは、臨床的に重要な結果を達成できなかった。部分的には、治療タンパク質の使用に関連する困難のためである。一つの問題は、成長因子の傷口への不効率な搬送による。すなわち、これらのタンパク質の局所使用は、ただ外部、大部分は死んだ組織の露出を許すにすぎない。他の欠点は、傷口への搬送後における、成長因子の高不安定性及び低残留性に関している。
【００１０】
表皮の傷を治療するための成長因子及び他のタンパク質の使用に伴う困難性は、含まれるタンパク質の大きさに関する。成長因子治療を広範囲に使用することは、また大きいタンパク質作成に関連する複雑さ及びコスト高に苦しめられる。そのため、傷治療管理におけるタンパク質因子の使用に関して、現在、より高くない、より効果的な作成が追及される。より大きいペプチドが由来するもの(すなわち、親タンパク質)からのより大きいタンパク質の活性を有する短いペプチドは、この要求を満たす。そのような短いペプチドの先例は報告されている(U.S. Pat. Nos. 6,861,406 and 6,693,077; Lee et al., 2004)。より高価でない、より単純な生成、取扱い、操作の直接的な効果に加え、短い生物活性ペプチドは、傷の組織により、より維持され、吸収される。日光への露出及び老齢に関連する皮膚の問題の治療のような急性の及び慢性の傷の治療を超える使用のため、短い生物活性ペプチドの先進的吸収特性はまた、それらに実行可能なオプションとなる。
【発明の概要】
【００１１】
発明の要旨
本発明は、哺乳類の傷治癒を促進するために効果的な短い生物活性ペプチドに関する。単離されたペプチドにより好ましく目標とされる傷は、皮膚に影響し粘膜表面に関連する傷である。特定のメカニズムに限定するものではないが、最適の治癒過程を損ねる可能性のある炎症の抑制と同様に、発明のペプチドは細胞増殖及び移動の促進により、傷治癒に効果を及ぼすことができる。発明のペプチドは生体内及び生体外の両方において役立ち、角化細胞において上記に述べた活性を誘発することが可能である。
【００１２】
本発明の１つの実施例は、配列番号１の４〜14の近接アミノ酸残基を有する短いペプチドを含む単離されたペプチドに関する。そのようなペプチドは、ペプチドＨＢ−１０７の短いフラグメントで表される。その単離されたペプチドは、アミノ酸のLあるいはD鏡像異性形又は、その組み合わせを含むことがある。発明のさらにもう一つの実施例によれば、単離したペプチドは、担体タンパク質へ接合されるか、或いはアミド化或いは脂質化で少し変えられることがある。これらの付加が皮膚及び傷に適用されると、ペプチドの生物活性を強化する。
【００１３】
本発明の好ましい実施例によれば、単離されたペプチドは、アミノ末端部においてメチオニン、バリン、リジン或いはグルタミン酸塩アミノ酸残基を含むことがある。単離したペプチドはまた、カルボキシ末端部においてリジン、バリン、グリシンまたはアスパラギンアミノ酸残基を有することがある。他の好ましい具体例において、単離したペプチドは配列番号3、6、又は12を含むことがある。単離したペプチドのある特定の具体例は、配列番号2、3、5、6、7、8、9、10、11、12又は15であり、そのすべてが一つ或いはそれより多い促進活性を細胞増殖或いは移動及び抗炎症に関して示す。配列番号2、3、5、6、7、9、10、11及び12の特定のペプチドはすべて、細胞増殖活性を有し、そして、配列番号2、3、5、6及び9は最も強い増殖活性を示す。配列番号3及び6のペプチドは細胞増殖活性及び移動活性の両方を有する。一方で、配列番号8及び15は細胞抗炎症活性を有する。
【００１４】
本発明の別の実施例は、薬学的に許容できるキャリア及び一つあるいはそれ以上の前述のペプチドを含む組成物に関する。その混合中のペプチドは、およそ0.1μg/mLからおよそ20μg/mLの濃縮、或いはおよそ0.1μg/mLからおよそ50μg/mLの濃縮内の範囲である。その組成物の好ましい形態はエアゾール、エマルジョン、液体、ローション、クリーム、ペースト、軟膏、粉及び泡である。
【００１５】
本発明はまた、哺乳類における傷治癒のための前述した組成物の使用方法に関するものである。一般的に、治療方法は傷、特に皮膚(角質)及び関連する粘膜組織に対し、効果的な時間、効果的な量のペプチドを含有する組成物を投与することを伴う。そのような傷には、すり傷、水膨れ、火傷、裂傷、潰瘍、あざ、発疹、傷及び老化や環境露出の影響が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】発明のペプチドは、親ペプチドＨＢ−１０７(配列番号1)と揃っていることを示す。
【図２】紫外線B(UVB)露光に反応した皮膚表皮細胞によるＩＬ６発現。細胞は一定時間(35秒間)、UVB照射に曝され、ＩＬ６発現は、UVB照射24時間後、ELISAにより測定される。それぞれの処置は３通りで実行された。実施例４を参照。
【図３】表皮細胞のUVBを誘発するＩＬ６発現に関する短いペプチドの影響。細胞は、35秒間UVB照射に曝され、その後、20時間、細胞は４０μg/mLのペプチド［ＨＢ−１０７(配列番号1)、ＨＢ−８０２(配列番号12)、ＨＢ−１４１０(配列番号15)、ＨＢ−８０１(配列番号31)］を含む完全媒体(血清でない)で培養された。ＩＬ６発現はそれからELISAにより測定された。実施例４を参照。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
米国特許第5,962,410号と第5,861,478号は、本発明の理解に役立つ開示をもたらし、これらの開示は引用を以て本願に記載加入とする。その発明は短い、生物活性ペプチドに関して教示する、たとえば、ペプチドＨＢ−１０７(配列番号１)に由来するペプチド及びその使用法に関してである。ペプチドＨＢ−１０７自体は、セクロピンBの一部分を構成し、それは、蛾の種に存在する抗菌ペプチドである。ＨＢ−１０７はそれが由来するタンパク質の静菌効果を示さないが、表皮の傷治癒特性を示す(Lee at al., 2004)。
【００１８】
本発明のペプチドは、皮膚及び関連する粘膜(例えば、口腔)のような表皮組織の治癒過程のアップレギュレートに重要な活性を開示する。いずれの特定のメカニズムにも制限しないため、これらの特性は角化細胞、傷封鎖(すなわち、上皮形成)に関与する表皮細胞及び表皮の表面の発達に関して引用される。発明のペプチドが、傷治癒に直接関係する角化細胞に関して示す特定の活性は、細胞増殖及び移動促進である(角化細胞による炎症抑制シグナリングのための能力と同様にである)。ＨＢ−１０７は角化細胞においてこれらのすべての活性を誘発することができるが、驚くべきことに、本発明のペプチドは、ＨＢ−１０７より大きいかＨＢ−１０７とほぼ同じ又はそれレベルである。発明のペプチドはＨＢ−１０７の長さの26％〜74％にすぎないため、これらの結果は驚くべきであり、また重要でもある。
【００１９】
このサイズの違いの理由で、発明のペプチドは、PDGF-BBのようなフルサイズのタンパク質及びＨＢ−１０７の生成に比べ、準備がより容易であり、より高価ではない。また、より大きいペプチドと比較して、開示されたペプチドは可溶性であり、操作され(例えば、化学的調整)そして、より単純な方法で保管される。それらの取扱の容易さは、使用される手段及びそれがどのように適用されるかの方法のような多くの薬搬送オプションを可能にする。発明のペプチド及びそのペプチドのより大きな溶解性は、傷部位にて吸収及び保持力増加を通じて治癒可能性を増加させる、そして、部分的な角化細胞及びほかの細胞は、より長い期間より高い濃度のペプチドを浴びる。
【００２０】
本発明のペプチドにより誘発された生物活性は、炎症抑制と同様に細胞増殖及び移動である。細胞増殖及び移動の過程は、ペプチドの傷治療機能の仲介で大きな役割をする。そのペプチドは、最初に傷の縁を縁取る角化細胞の移動を促進し、次に、新しい表皮層が傷部位をおおうようこれらの増殖を促進する。そして。3番目の特性である炎症抑制は、サイトカインインターロイキン６(ＩＬ６)分泌に対する開示されたペプチドのマイナス影響を通して、傷における細胞により成し遂げられる。ＩＬ６は、組織の損傷に関する因子に応じて表皮の角化細胞により放出されることが示された(Sugawara et al., 2001)。このサイトカインは、傷への免疫細胞浸透及び実は治癒を悪化させ傷の原因となる過程へ合図をおくる(Martin and Leibovich, 2005; Liechty, 2000)。炎症は傷感染症予防のために重要であるが、炎症阻止に関連し得るどんな不利益をも打ち消す標準的傷治療の間、良い消毒剤供給は行われる。本発明が傷治癒をもたらすことを通じて上記活性は起こりがちであるが、本願はいずれの一連の生物学的メカニズムによっても限定されないことに言及する。
【００２１】
細胞増殖と細胞移動を誘発することに関して、配列番号3(ＨＢ−１０６１)及び配列番号6(ＨＢ−１０７２)のペプチドが好ましい。これらのペプチドは、ＨＢ−１０７による誘発に比べ、細胞増殖中に顕著な増加をもたらす。しかし、これらのペプチドは、ＨＢ−１０７より短い(実施例３参照)。
【００２２】
実施例１及び２。それらは、細胞移動誘発に関し、ＨＢ−１０７と同じくらいの能力がある。配列番号8及び12のペプチドは、細胞の抗炎症活性の誘発についてより好適である(実施例３参照)。
【００２３】
発明のペプチドはまた、太陽照射のようなダメージ物質にさらされた肌、或いは老化した肌に関連する問題について健康に良い結果を示す。単独で変化なく、或いは化学修飾を通じて、及び/また専門的な搬送を通じて、短いペプチドは、表皮をとおして吸収されることが可能である。皮膚希薄化、しわ、弱さ、あれ/硬化の原因と反対のプロセスをもたらすためである。発明は肌保持を促進する大部分の方法は、角化細胞成長に関するペプチドの好ましい結果を通じてである。これらの細胞が皮膚表面の主要構成要素であり、老化で減少し、皮膚にダメージを与えると、ペプチドの促進による皮膚表面の補充が、上記の問題を覆すことが期待される(Enoch and Price, 2004)。ＩＬ６発現は、特定の自己免疫問題を持つ患者において、基本的な表皮が異常に厚くなる過程に関連する(Sato et al., 2001 ; Oyama et al., 1998)。発明のペプチドは、ＩＬ６発現の抑制により、そのような炎症関連の結果を阻止することができる。
【００２４】
指標のみではあるが、発明のペプチドは、モスセクロピンBタンパク質のＨＢ−１０７断片(表1)に由来することができる。これらのペプチドと関連する代謝の特徴は、細胞増殖及び移動、及び/また抗炎症活性を誘導する能力である。発明のペプチドすべては、ＨＢ−１０７(配列番号1)の4‐14の近接するアミノ酸残基を持つ共通の特徴を共有する。それゆえ発明のペプチドは、ＨＢ−１０７(配列番号1)の4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14の近接するアミノ酸残基から構成することができる。
【００２５】
上記アミノ酸混合物を有することを除いて、上述のペプチドは、以下のアミノ酸を付加的に含み得る。(フルネーム/３レタ−省略形/１レタ−省略形)：アラニン/ala/A、アルギニン/arg/R、アスパラギン/asn/N、アスパラギン酸塩/asp/D、システイン/cys/C、グルタミン/gln/Q、グルタミン酸塩/glu/E、グリシン/gly/G、ヒスチジン/his/H、イソロイシン/ile/I、ロイシン/leu/L、リジン/lys/K、メチオニン/met/M、フェニルアラニン/phe/F、プロリン/pro/P、セリン/ser/S、トレオニン/thr/T、トリプトファン/trpAV、チロシン/tyr/Y及びバリン/val/V。これらのアミノ酸残基は、以下のように特徴付けられる:脂肪族化合物(alanine、グリシン、isoleucine、ロイシン、プロリン、 バリン)、芳香族化合物(フェニルアラニン)、トリプトファン、チロシン)、酸性(アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩)、塩基性(アルギニン、ヒスチジン、リジン)、ヒドロキシ酸(極性の)(セリン、トレオニン)、含流(極性の)(システイン、メチオニン)、及びアミド基化物(アスパラギン、グルタミン)。非標準的アミノ酸残基は、セレノシステイン、ピロリジン及び様々な環状アミノ酸を含むが、それには限らない、開示されたペプチドにも引用を以て記載加入とすることができる。
【００２６】
以下のペプチドは、本発明の非限定的な例であり、実例となる目的で示す(表１)。
【表１】
【００２７】
配列番号：2、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12と配列番号：15のペプチドは、上述した一つ或いはそれより多い活性(増殖、移動、抗炎症)に関連するペプチドの例である。配列番号：2、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11と配列番号：12のペプチドは、細胞増殖を誘発可能なペプチドの例である。配列番号3及び配列番号6のペプチドは、細胞増殖と移動を誘発可能なペプチドの例である。配列番号12のペプチドは、増殖及び抗炎症活性両方を示すペプチドの例である。配列番号8及び配列番号15のペプチドは、抗炎症活性を有するペプチドの例である。
【００２８】
それぞれの上述したペプチドは、L-或いはD-アミノ酸性鏡像異性体(1つの鏡像異性体残基を含むか両方の形の組合せ)から成り得る。ペプチドは、以下の非限定的な例において述べるように、化学的に又は酵素的に増加又は調整されるかのどちらかでありうる。ペプチドのカルボキシ末端は酸性(−COOH)であるか或いはアミド化(例えば、-CONH2、-CONHR、又は-CONR2)されている。カルボキシ末端のアミド化は、遊離酸の形態と比較して、発明のペプチドをプロテアーゼ分解により影響され難くし、可溶性を増すことができる。それゆえ、高められた治療能力をもたらす。また、脂質化されたペプチドは、強化された皮膚浸透のために供給されうる。ペプチド修正は、Ｎ末端アミノ基の水素が代わられるように、Ｃ末端カルボキシル基の水酸基(OH)が代わられるように、完全なN-末端のアミノ基が代えられるように、或いは全てのＣ末端カルボキシル基は代わられるようにペプチド修正が、行われるかもしれない。それぞれのペプチドと結びつくアミノ酸の一つ或いはそれより多い分子結合は、非ペプチド接合であるかもしれない。そのような非ペプチド接合は、イミド、エステルヒドラジン、セミカルバジド及びアゾ接合を含むがそれに限らない。
【００２９】
多様な修正は、特有の増殖、移動及び抗炎症活性が持続する限りペプチドに行われることができる。いくつかの修正は、ペプチドの効能を増すために使用されるかもしれないが、他の修正はペプチドの扱いを容易にすることができる。通常は修正されるペプチドの機能グループは、ヒドロキシ基、アミノ、グアニジウム、カルボキシル、アミド、フェノール、イミダゾールリングまたはスルフヒドリルを含む。通常で、これらのクループの非限定的な反応は以下を含む：ハロゲン化アルキルによる水酸基のアセチル化；カルボキシル基のエステル化、アミド化又は水素化(すなわちアルコールへの還元)；アミノ基(例えばペプチドの主要なアミノ基またはリジン残基のアミノ基)の脱アミノ作用、アシル化、アルキル化、アミノ基(例えばペプチドの主要なアミノ基またはリジン残基のアミノ基)のアリール化；チロシンフェノール基のハロゲン化またはニトロ化。
【００３０】
ペプチドは、必要に応じてその可溶特性を調整するためと目標とされた組織においてローカル濃度を増すため、可溶性の或いは不可溶性の担体分子に共役することができる。 可溶性キャリア分子の例は、ポリエチレングリコール(PEG)及びポリビニルピロリドンの高分子化合物を含む。不可溶性キャリア分子の例は、ケイ酸塩、ポリスチレンとセルロースを含む。ペプチドもまた、治療への適用の間及び適用後、安定性を強化するためにマイクロカプセル化するかもしれない。一般的に、ポリエステルとPEGミクロスフィアは、ペプチドをカプセル化して、安定させるのに使用される。
【００３１】
ペプチドのカプセル化のためにミクロスフィアを準備するいろいろな方法は、カプセル化されるペプチドの親水性或いは疎水性によって使用され得る。そのような方法のためのプロトコルの例は、Wang HT et al. (1991, J. Control. Release 17:23-25)及びアメリカ特許第4,324,683号にあり、これら両方の開示は全て引用を以て本願に記載加入とする。生体外でのペプチドの放出研究は、ミクロスフィアの中へ導入された後、ペプチドの相対的可用性を決めるため行われるかもしれない。ミクロスフィア(200mg)は、pH7.2の緩衝生理食塩液(PBS)(2.5ml)の中に吊るされ、7℃で100rpmの環境インキュベーターシェーカー(G-24, New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J.)の中で揺らされた。特定のサンプリング時間(最初の４日間のそれぞれの日及びそれ以降の隔日)に、緩衝液は、完全に除去され、新しいＰＢＳに入れ替えられた。ＰＢＳ中のペプチドの内容物は、ブラッドフォード法又はタンパク質分析に使用される典型的な他の定量分析を使用して測定された。
【００３２】
全ての開示されたペプチドは、先進的な化学技術であるエイペックス396複合ペプチド合成器上で、標準的なFmoc(9-フルオレニルメトキシカルボニル)固相化学を使用して合成され得る。そのエイペックス396は、0.15ミリモルの大きさで同時に40までのペプチドの生成のため40の反応剤を装備した。そのペプチドは、標準的なアミノ酸を使用してアミド化或いは遊離酸配列として準備され得る。樹脂は最初に、N,Nジメチルホルムアミド(DMF)を用いて、洗浄及び予備膨張を行なった。リンクアミド樹脂の膨潤時間は1時間だった。その樹脂からピペリジンが完全に洗浄された後、Fmocは25分間ＤＭＦ中で25％のピペリジンでFmoc保護グループは、除去された。ラセミ化過程を制御するため、Fmocアミノ酸単量体は、1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール(HOBt)或いは0.5M濃度のＤＭＦ中における1-ヒドロキシ-7-aza-ベンゾトリアゾール(HOAt)の等モル溶液中で前もって活性化された。ヒンダード塩基(ジイソプロピルエチルアミン)の使用を基本状態とするアミノ酸の2.5−5.0倍モル過剰及び活性剤として、アミド結合は、O-(7-アザベンゾトリアゾール-l-イル)-l,l,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェイト(HATU)PyBop(登録商標)または2-(lH-ベンゾトリアゾール-l-イル-)-l,l,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリンフォスフェイト(HBTU)を使って実践された。結合時間は、1-1.5時間で、その後、洗浄及びペプチドチェーンの成長及び再結合前に、二重或いは三重の結合を成し遂げるため再結合される。結合能力は、標準的なカイゼルテストを使ってモニターされた。一旦、ペプチド合成が樹脂上で完了されると、最終的なFmocグループは、上記のように除去され、シーケンスはフリーベースとして残された。
【００３３】
ペプチドの酸に不安定な樹脂への結合の分裂は、95％のトリフルオロ酢酸(TFA)及び適当なスカベンジャーを加えた水を使用して達成された。分裂がおよそ30分〜1時間進行された後、放出されたペプチドは、分裂剤からすぐに除去され、減圧下でＴＦＡ除去のためチューブへと移された。それから、そのペプチドは、逆相C18カラム及び質量分光分析を使用する高速実行液体クロマトグラフィー(HPLC)を通じて、精製と分析のため準備された。ＬＣ/MS/MSシステム(ABI API2000)を使用して、主要な配列確認と準備精製は達成された。
【００３４】
上記プルトコルについて、ペプチドは、Merrifield, R.B., Solid Phase Peptide Synthesis L, J. AM. CHEM. SOC. 85:2149-2154 (1963); Carpino, L.A. et al., [(9-Fluorenylmethyl)Oxy] Carbonyl (Fmoc) Amino Acid Chlorides: Synthesis, Characterization, And Application To The Rapid Synthesis Of Short Peptides, J. ORG. CHEM. 37:51 :3732-3734; Merrifield, R.B. et al., Instrument For Automated Synthesis Of Peptides, ANAL. CHEM. 38:1905-1914 (1966); or Kent, S.B.H. et al., High Yield Chemical Synthesis Of Biologically Active Peptides On An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design, IN: PEPTIDES 1984 (Ragnarsson U., ed.) Almqvist and Wiksell Int., Stockholm (Sweden), pp. 185-188に開示され、当業者にしられる何れの方法を使用してでも生産され得る。これらの開示はすべて引用を以て本願に記載加入とする。好ましくは、ペプチドは成長するペプチドチェーンに連続してアミノ酸を追加できる機械で生産される。一方、標準的方法でせいさんされることがあり、それは大量生産が可能である。
【００３５】
使用方法
さらなる現発明の実施例は、製剤或いは治療剤のように、上述のペプチドの使用について教示する。これらの方法は、一つのペプチドまたは複数のペプチドの使用の組合せに関係するかもしれない。
【００３６】
現発明のペプチドは、皮膚(表皮、真皮と下皮)及び関連する粘膜組織の傷治療のために使用され得る。ここで使用されるように、”関連する粘膜組織”という用語は、皮膚に似た方法で組織化されるどんな組織にも関連し、上皮細胞が含まれる。角化細胞は、そのような上皮細胞の非限定的な例である。そのような組織の例は、口、鼻咽頭、耳、尿生殖器表面、同様に目の眼瞼結膜である。関連する粘膜組織の他の例は、食道、胃、小腸、大腸(内腔)と直腸を含む消化管の全ての内壁(すなわちルーメン)を含む。これらの後者の例は、非常に皮膚に影響を及ぼすことができる傷/障害を受け、そして、本発明の目標となりうる。これらの組織に影響を及ぼすことができる傷/障害/負傷の例、及び本発明のペプチドの治療に敏感に反応する例は、すり傷、水膨れ、火傷、裂傷、パンク、潰瘍、あざ、発疹と傷跡である。外科手術後の組織外傷もまた、ペプチドで治療することができる。
【００３７】
本発明のペプチドは、上述した組織全ての老化の効果を防ぐか或いは戻すために使用され得る。関連する方法で、日光のような多様な外部物質への露出によりダメージを受けた組織に適用され得る。露出及び老化に関連する虚弱の例は、シワの寄った皮膚、乾燥、希薄化、たるみ、及び挫傷のより大きい感染性である。本発明は、より若い見かけ及び肌ざわり及びより良い機能をもたらすための化粧品として使用することが可能である
【００３８】
本発明のペプチドを使用して効果的に治療される他の組織の問題は、アレルギー或いは自己免疫に関する。そのような病気は、皮膚炎、乾癬、硬皮症、天疱瘡と炎症性腸疾患を含む。
【００３９】
上記の治療方法において、ペプチドを搬送するために使用する混合物は、エアゾール、エマルジョン、液体、ローション、クリーム、ペースト、軟膏、粉または泡、または他の薬学的に許容できる製剤であるかもしれない。さらに、より製剤に関係しない方法で搬送される。例えば、消イオンされた/蒸留された水、PBSまたは標準的な医学食塩液である。一般的に、薬学的に許容できる製剤は、人の皮膚上で使用するのに適するどんなキャリアも含む。そのように薬学的に許容できるキャリアは、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、二酸化ケイ素、アルミナ、澱粉及び等しいキャリアと賦形剤を含む。その製剤は、さらに、コスメティックアピールを有し、及び/また、レチノイドまたは、発明のペプチドの治療効果にふさわしい活動をする他のペプチドのような他の物質を含むこともできる。抗生物質は、感染を避けるために製剤に加えられるかもしれない。そしてそれにより、最大の治療プロセスを起こさせる。混合物におけるペプチド濃度は、約0.1μg/mLから50μg/mL或いは約0.1μg/mL〜約20μg/mLであるが、傷/組織状態の性質、発明のペプチドの生物活性及び混合剤吸収を強化するどんな佐剤及び技術の使用によっても、使用される最終的な濃度はこれらの範囲を超えて変化するかもしれない。
【００４０】
本発明の混合物は、一つ或いはそれ以上の付加的なエージェントを含むことが可能である。
【００４１】
本発明の好ましい実施例において、人のケラチン組織に接触する混合物において、発明のペプチドに加えてのいずれの成分もケラチン組織に適用するためにふさわしくあるべきである。つまり、混合物に導入されるとき、他の成分のようなものは、不適切な毒性、非互換性、不安定性、アレルギーの反応及び医学の判断内で同様の反応をしめす。CTFA化粧品ハンドブック、第２版(1992)は、広く多様な非制限的な化粧品及び薬剤が一般にスキンケア業界で使用され、それは、本発明の混合物における使用にふさわしいと述べる。これらの成分分類例は以下を含む：研磨材、吸収材、香料のような美的な混合物、顔料、色彩/着色剤、エッセンシャルオイル、肌清涼剤、アストリンゼン、他(例えばクローブ油、メントール、樟脳、ユーカリ油、オイゲノール、メンソール乳酸塩、ウィッチへーゼル蒸留液)、反白色剤、反にきびエージェント、抗菌薬(例えばヨードプロピルブチルカルバメート)、酸化防止剤、バインダー、生物学的添加物、バッファエージェント、膨張性薬剤キレート試薬、化学添加物、化粧用殺生物剤、変性剤、薬アストリンゼン、外用鎮痛薬、被膜形成剤或いは被膜形成原料、不透明化剤、pH調整剤、推進剤、還元剤、金属イオン封鎖剤、皮膚漂泊剤及びライトニング剤(例えば、ヒドロキノン、コジック酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸リン酸塩マグネシウム、アスコルビン酸グルコサミン)、スキン・コンディショナー(例えば、湿潤剤)、皮膚沈静剤 及び/或いは、治癒剤(例えば、パンテノール及びその派生物、アロエベラ、パントテン酸及びその派生物、アラントイン、ビサボロール及び、グリチルリチン酸2カリウム)、皮膚治療剤、増粘剤及びビタミン及びその派生物。
【００４２】
本発明のペプチド及び関連する混合物の投与は、人や動物を含むすべての哺乳類におこなうことができる。適用は、組織移植片、組織培養生成物、酸素及びドレッシングのような、典型的な或いは/及び実験的な材料を組み合わせて作ることができる。一般的に、混合物は、局所に、経口で、経皮で全身に、あるいは傷部位に発明のペプチドを搬送するのに役立つ技術の当業者が知るいかなる方法ででも投与することができる。混合物はまた、生体内又は生体外において、培養で成長している患者の移植片或いは組織のどちらかに適用され得る。
【００４３】
それらの小さいサイズのために、ペプチドは自身の皮膚を通る幾つかのレペルの浸透性により増える可能性を期待される。一方、ある技術はこの動きを拡大するために使用され得る。たとえば、親油性(無極性の)グループはペプチドに加えられることが可能である、すなわち、ペプチドは脂肪親和性の賦形剤において皮膚へ運ばれることが可能である、下層の表皮層に移動させるため角質層へペプチドのアクセス性を強化するためである。このような脂肪親和性の改質は、薬剤の補助とみなされるかもしれない。既知の溶媒と界面活性剤のような浸透性エンハンサーは、賦形剤の中でよりよい吸収をさせるために使用され得る。目的とする組織/傷口へのペプチドのアクセス強化に役立つことが期待される特別な技術は、イオン導入、電気泳動と超音波を含む。イオン導入装置は、電解質溶液に浸された２つの電極から成り、皮膚のうえに配置される。電流が、電極に適用される時、電界がペプチドの搬送を導く角質層全体に生成される。エレクトロポーレーションは、脂質の二重層をとおって浸透を増すため高電圧パルスの適用を含む。これは、電流のアプリケーションの強度及び期間においてイオン導入とは異なる(イオン導入は、比較的一定である低電圧電界を使用する)。エレクトロポーレーションの高電圧パルスは、高レベルの浸透性強化をもたらす脂質薄板膜において水孔の可逆的形成を誘導すると信じられている。超音波は、16kHzを超える頻度で皮膚に適用され、それは、音波を通して組織の圧縮と拡大を引き起こす。結果として生じる圧力バリエーションは、ペプチドの浸透を強化するかもしれないたくさんの過程(例えば侵食、混合、温度上昇)を生じる。
【００４４】
全ての上記のペプチド製剤と使用は、よく知られた技術です。 発明のペプチドの使用及び準備の追加の方法は、例えば、アメリカ特許第6,492,326及び6,974,799であり、これらの開示は引用を以て本願に記載加入とする。
【００４５】
以下の例は、発明の特定の好ましい実施例を示すために含まれる。
【実施例】
【００４６】
実施例１：細胞増殖を促進するペプチドの識別
予め、ＨＢ−１０７(配列番号1)ペプチドフラグメントが、体内にいて創傷治癒を促進することを示すために、ＨＢ−１０７配列中に、創傷治癒及び関連するプロセスを同じように又はより刺激する短いペプチドフラグメントがさらに存在するとの仮説を立てた。この疑問を検証するために、ＨＢ−１０７のペプチドフラグメントの重複セットを標準固相ペプチド化学を用いて生成した。これらのペプチドを次に、濃度０.２２、２.１５、２１.５及び４６.４μｇ／ｍｌで細胞増殖活性のために分析した。ペプチドの多くは、夫々７アミノと６アミノを含有するのみであるペプチドＨＢ−１０６１(配列番号3)及びHD−１０７２(配列番号6)を含め、低濃度で表皮角化細胞の増殖が顕著に増大した(表２)。幾つかの他のペプチドは、ＨＢ−１０７の刺激活性とほぼ同等又はそれ以上のレベルの刺激活性を呈した(表２)。結果として、発明のペプチドの多くによって誘発される細胞増殖は、親ＨＢ−１０７ペプチドによって誘発されるレベルを超えていた。重要なのは、これらのフラグメントの内の幾つかは、ＨＢ−１０７よりも極めて短いことである。
【表２】
【００４７】
細胞増殖分析は、次の実験的プロトコルから進めた。
【００４８】
マウス角化細胞株を用いた細胞増殖分析
【００４９】
目的：培養下で表皮角化細胞に適用したときに、被験物質の抗増殖能又は細胞傷害能を判断する。
【００５０】
テストシステム：マウス角化細胞株ＰＡＭ２１２又は初代正常ヒト表皮角化細胞(NHEK：Clonetics社製)の何れかが望ましいモデルであるが、他の細胞を用いることもできる。
試薬：
【００５１】
１．細胞成長培地：１０％の牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM-10)、ペニシリン(100units/ml)、ストレプトマイシン(0.1mg/mL)及びゲンタマイシン(50μg/ml)、又は、ヒト細胞の角化細胞培地(KGM:Clonetics社製)
【００５２】
２．媒介培地：１.０％の牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM-1)、ペニシリン(100units/ml)及びストレプトマイシン(0.1mg/mL)、又は、ヒト細胞の角化細胞基礎培地(KBM:Clonetics社製)
【００５３】
３．ニュートラルレッド原液：ニュートラルレッド粉末をダルベッコ-リン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に濃度３mg/mlとなるように添加した。得られた溶液を無菌濾過した。
【００５４】
４．ニュートラルレッド培地：ニュートラルレッド原液に最終濃度５０μg/mLとなるようにDMEM又はKBMを添加した。
【００５５】
５．ＭＴＴ培地：ＭＴＴ(3-(4,5-ジメチルチアゾール2-yl)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)粉末を１mg/mLでDMEM又はKBMに添加し、濾過又は遠心分離により沈殿物を除去した。ＭＴＴ溶液は、２４時間以内に使用した。
【００５６】
６．水溶液中、ホルムアルデヒド１％及び塩化カルシウム１％からなる定着液
【００５７】
７．PBSの洗浄液
【００５８】
８．溶解液：ニュートラルレッド用の水溶液又はＭＴＴ処置細胞用の酸性イソプロパノール中、氷酢酸１.０％及びエタノール５０％
細胞プレーティング
【００５９】
角化細胞は、毎日、顕微鏡によって観察した。培養物が５０〜７０％密集すると、プレート中の培地を吸引し、０.２５％トリプシン／EDTAを添加した(ヒト細胞用に0.05％トリプシン)。細胞が丸くなると、約１０％のウシ血清を補足した等量のDMEM又はKBMを添加し、又は、トリプシン中和溶液(TNS:Clonetics社製)を用いて、トリプシンを中和した。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを１mlのDMEM-1又はKBM中で再懸濁させた。細胞懸濁をカウントするために血球計を用い、DMEM-1又はKBMを用いて、１ml中の細胞の総数が１.５〜２.５×１０4cells/mLとなるように調整した。細胞は、次に、各ウェルに細胞懸濁液２００μLを添加することで、３.５〜５.０×１０3の濃度で９６ウェルプレート中にプレーティングした。主として、中央の６０ウェルを使用し、外側のウェルは、DMEM又はPBSを注いで、蒸発効果を最小化させた。
サンプル調製
【００６０】
被験物質の原液は、DMEM-1又はKBMを用いて準備し、これ以降、すべての他の希釈液はこの溶液から作成した。主として、各希釈液は、細胞培養に用いる前に、０.２μmのフィルターを通して濾過した。１.０％(w/v又はv/v)溶液又は懸濁液を準備し、培養培地中で、１０倍又は３倍の連続希釈法を用いた。
投薬
【００６１】
細胞は、確実に細胞接着又は細胞分裂させるために、プレーティングの後、１８〜２４時間経過してから観察し、次に、培地の１００μLを吸引して、各ウェルに１００μL残した。次に、各被験物質希釈液の２倍の濃度で１００μLを複製ウェルに添加した。陰性対照として、ビークル培地(DMEM-1又はKBM)１００μLを対照ウェルに添加した。マイクロプレートは、投薬の後４８〜７２時間、３７℃、５.０％ＣＯ2で培養し、細胞を平穏な状況で増殖させた。この４８〜７２時間曝した後、すべての培地を吸引し、以下に示す方法の一つを用いて増殖を評価した。
【００６２】
オプションＡ：ニュートラルレッド摂取。培地を曝露及び吸引した後、ニュートラルレッド培地２００μLを直ちに各ウェルに添加する。マイクロプレートは、さらに３時間培養器に戻しておく。この染色摂取期間の後、マイクロプレートを培養器から取り出し、静かに裏返し、ニュートラルレッド培地を採集皿に移す。次に、細胞を約１分間定着液で定着させる。定着液を移し出して、マイクロプレートを洗浄液で３回静かに洗浄する。洗浄液を移して、２００μLの溶解液を添加する。最低１５分の後、各ウェルの内容物をサイドピペットで取り出し、各ウェルの色分布が同等となるようにして、アリコートを分光光度計を用いて下記の方法で読み出す。
【００６３】
オプションＢ：ＭＴＴ変換分析。培地の曝露及び吸引の後、２００μLのＭＴＴ分析培地を各ウェルに直ちに添加する(MITは被験物質が直接MITを減じない場合にのみ使用し、範囲測定試験又はMIT適合性試験により決定される)。マイクロプレートは、さらに３時間培養器に戻しておく。この染色摂取期間の後、マイクロプレートを培養器から取り出し、静かに裏返し、ＭＴＴ培地を採集皿に移す。次に、細胞を洗浄液で３回静かに洗浄する。洗浄液を移して、２００μLの溶解液を添加する。最低６０分溶解させた後、各ウェルをサイドピペットで取り出し、各ウェルの色分布が同等となるようにして、吸光度を分光光度計を用いて下記の方法で読み出す。
【００６４】
オプションＣ：フローサイトメトリーに基づく分析。曝露の後、培地を１０μMのブロモデオキシウリジン(BrdU)で調製し、３７℃で４５分間培養する。この培養の間、BrdU、チミジン類似体を増殖細胞のＤＮＡに組み入れる。次に細胞をトリプシン処理により採取する。遠心分離の後、細胞ペレットを洗浄し、ＤＮＡ特異(レッド)蛍光染料ヨウ化プロピジウムで染色する。増殖細胞は、BrdU特異蛍光(グリーン)抗体で染色する。細胞周期分析も、BrdUに染色陽性の増殖細胞の量も、フローサイトメトリーを用いて分析する(注：フローサイトメトリーの検討では、細胞は２４ウェル又は６cmプレートで培養される)。
データの分析
【００６５】
染色摂取の検討：染色に基づく評価項目において、ウェルの光学濃度は、Titertek Multiskan MCC/340を用いて、ニュートラルレッドの６２０nmの参照波長又はMITの６７０nmから６８０nmの参照波長における吸光度を差し引いて、波長５４０nmで読み出す。吸光度値のプリントアウトは、プレートリーダによって作成する。平均吸光度及び標準偏差は、各処置グループに対して計算し、結果を対照吸光度のパーセントで表わす。
EC50計算：各テストサンプルについて、データを対照吸光度対濃度のパーセントでプロットする。EC50は、エクセル5.0グラフでデータを通じて引いた回帰線から推定する。さらに、EC50は、エクセル5.0グラフによって、又は、エクセル5.0マクロを用いることによってもたらされる回帰線に対する方程式を用いて計算する。
【００６６】
フローサイトメトリー検討：フローサイトメトリー分析において、BrdU標識に陽性のパーセントを判断し、増殖指数(すなわち、採取の際に活発に増殖している細胞のパーセンテージ)を計算する。サンプル中の生存細胞のパーセントやアポトーシス細胞のパーセンテージのような他のパラメータで判断することもできる。
【００６７】
実施例２：細胞移動を促進するペプチドの識別
細胞増殖だけでは、創傷治癒に役立つには十分ではない。損傷を受けた状態で、創傷に隣接する細胞が増殖する；そのような損傷(又は古い機能異常の組織の慢性病巣)の近くで新たに形成された細胞の移動は、等しく重要である。この問題を対処するために、単一組織培養スクラッチテストに基づいて角化細胞移動分析を用いて、ＨＢ−１０７とそのペプチドフラグメントを観察した。この分析は、ＨＢ−１０７２(配列番号6)やＨＢ−１０６１(配列番号3)のようなペプチドが親ＨＢ−１０７ペプチドと同様に細胞移動を増大させることができることを示した(表３)。ＨＢ−１０７２とＨＢ−１０６１ペプチドは、ＨＢ−１０７の一部と重複しており、アナログＨＢ−１０６２(配列番号4)は、細胞に移動活性を示さないことに気付いたことは興味深いものである。この分析のプロトコルは標準的であり、Shanleyらによって記述されており(2004, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45:1088-1094)、この論文の引用を以て全文の記載加入とする。
【表３】
【００６８】
実施例３：静止細胞中で抗炎症活動を促進するペプチドの識別
治癒の割合いの増大に加えて、ペプチドＨＢ−１０７は、創傷に関連する炎症のレベルを減少させることが示されている。そのような活動を呈する小ペプチドフラグメントを識別するために、ＨＢ−１０７のフラグメントが、主要な炎症性サイトカインＩＬ６を減じる活動を探った。ペプチドフラグメントＨＢ−８０２(配列番号12)とＨＢ−１０７６(配列番号8)は、ＩＬ６発現のレベルが、ＨＢ−１０７親ペプチドと同程度まで減じられたことがわかった(表４)。この分析のプロトコルは標準的であり、Murakamiらによって記述されており(2004, J.Immunol. 172:3070-3037)、この論文の引用を以て全文の記載加入とする。
【表４】
【００６９】
実施例４：細胞中の紫外線Ｂ(UVB)誘発炎症活動を抑制するペプチドの識別
ある小ペプチドが、静止細胞中で抗炎症活動を促進することができることを前提として(実施例３参照)、小ペプチドが、UVB放射に曝された細胞中で、そにょうな活動を促進できることは興味深いものである。UVB放射は、肌にダメージを与え、肌のエージングを促進する。ダメージを受けた組織中の炎症は、その組織のエージングの一因であるので、紫外線光により誘発されるダメージに由来する表皮炎症の現象は、そのエージング効果を小さくすることとなる。
【００７０】
ＨＢ−１０７のペプチドフラグメントが、紫外線光に曝された細胞中で抗炎症活動を誘発するかどうかを判断するために、分析を行なった。ヒト皮膚表皮細胞(ATCC CRL-2592)を６ウェルプレートに蒔き(seeded)、１０％のウシ胎仔血清を補足した１.５g/L重炭酸ナトリウムと４.５g/Lグルコース(完全培地)を含むように調製された４mMのＬグルタミンと共に、DMEM中で９５％密集を越えるまで成長させた。UVB処置の前に、細胞を５時間血清飢餓とした。UVBは、UVLMSランプ(４Wモデル、３UVアッセンブリ、カナダUpland社製)を用い、３０２nmの放射波長にセットして生成した。UVランプは、組織培養プレート(６ウェルプレート)の上１２cmに配置し、２ウェルは、１度均質UVB照射となるように処置した。細胞は、PBS中でUVB照射(450μW/cm2、放射計を用いた測定)に曝され、有毒光化学の紫外線光誘発生成を回避した。ＩＬ６発現を、UVBに反応した細胞炎症活動の指標として測定した。図２に示すように、皮膚表皮細胞中のＩＬ６発現は、UVBの用量依存の方法で誘発されており、これにより、紫外線光が皮膚表皮細胞中の細胞の炎症プロセスを促進することが証明された。
【００７１】
個々のペプチドを皮膚表皮細胞中で検査し、皮膚表皮細胞中のUVB誘発ＩＬ６発現でその効果を判断した。細胞は、PBS中で３５秒間UVB(450μW/cm2)に曝され、その後、PBSを４０μg/mlのペプチドの存在又は不存在下で血清なしの完全培地と置き換え、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養した。次に、ヒトＩＬ６用のELISA(CellSciences社製、マサチューセッツ州)の前に、上澄培地を採取し、10,000rpmで遠心分離して、残骸を除去した。ＨＢ−１０７ペプチド内の特定のシーケンスは、強力な炎症刺激の影響を受けて、細胞中でのＩＬ６発現を著しく減少できることがわかった(表５、図３にグラフを用いて結果を示す)。
【表５】
【００７２】
この研究による結果は、ＨＢ−１４１０(PKEK, 配列番号15)のようなペプチドが、紫外線照射に応じて上皮細胞により生成されたＩＬ６のレベルを著しく下げる能力のあることを示す。この活動は、日光にさらされたあとのスキンケアのための特別な応用である、そして、傷や老化に由来する多様な皮膚状態において、関連する炎症の減少に向けての広い応用でもある。ペプチド配列の少しの変化でさえ、上皮細胞におけるＩＬ６発現へ向けて著しくペプチドの抑制活性を変化することができることへの言及が興味深い(例えば、ＨＢ−１４１０の抑制活性と、ＨＢ−８０１(PKEKV)及びＨＢ−８０２(MPKEK)の比較)。興味深いことに、ＨＢ−８０２は休止している細胞においてＩＬ６を減少するための能力を示した(表4、実施例３参照)。
【００７３】
ここで開示され、クレーム化された全ての構成及び方法は、この開示からみると、不適当な実験なしで作成され、達成され得る。好ましい実施例という観点で本発明の構成及び/或いは方法が述べられたが、バリエーションがこの構成及び方法、及び過程、即ち本願の範囲及び内容、精神から離れることなくここで述べられた一連の方法の過程で適用され得ることは当業者にとって明白である。より具体的には、化学的そして生理学的に関連する特定の製剤がここで述べられた製剤に代用され得る、そして同じ、又は似たような結果をもたらす。当業者にとって明白な全てのそのような似た代用品は、この発明の範囲内であるとみなされる。
【００７４】
本願中の全ての特許及び公開は全て引用をもって本願に記載加入される。
【００７５】
参考文献
Braff MH, Gallo RL (2006). Antimicrobial peptides: an essential component of the skin defensive barrier. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 306:91-110.
Enoch S, Price P (2004). Cellular, molecular and biochemical differences in the pathophysiology of healing between acute wounds, chronic wounds and wounds in the aged. World Wide Wounds. Online: www.worldwidewounds.com.
Fisher GJ, Kang S, Varani J, Bata-Csorgo Z, Wan Y, Datta S, Voorhees JJ (2002). Mechanisms ofphotoaging and chronological skin aging. Arch. Dermatol. 138:1462-1470.
Kyte J, Doolittle RF (1982). A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. MoI. Biol. 157:105-132.
Lee PH, Rudisill JA, Lin KH, Zhang L, Harris SM, Falla TJ, Gallo RL (2004). HB-107, a nonbacteriostatic fragment of the antimicrobial peptide cecropin B, accelerates murine wound repair. Wound Repair Regen. 12:351-358.
Liechty KW, Adzick NS, Crombleholme TM (2000). Diminished interleukin 6 (IL-6) production during scarless human fetal wound repair. Cytokine. 12:671-676.
Martin P, Leibovich SJ (2005). Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends Cell Biol. 15:599-607.
Mustoe TA, Cutler NR, Allman RM, Goode PS, Deuel TF, Prause JA, Bear M, Serdar CM, Pierce GF (1994). A phase II study to evaluate recombinant platelet-derived growth factor-BB in the treatment of stage 3 and 4 pressure ulcers. Arch. Surg. 129:213-219.
Oyama N, Sekimata M, Nihei Y, Iwatsuki K, Homma Y, Kaneko F (1998). Different growth properties in response to epidermal growth factor and interleukin-6 of primary keratinocytes derived from normal and psoriatic lesional skin. J. Dermatol. Sci. 16:120- 128.
Pelicci PG (2004). Do tumor-suppressive mechanisms contribute to organism aging by inducing stem cell senescence? J. Clin. Invest. 113:4-7.
Presland RB, Dale BA (2000). Epithelial structural proteins of the skin and oral cavity: function in health and disease. CHt. Rev. Oral Biol. Med. 11 :383-408.
Sato S, Hasegawa M, Takehara K (2001). Serum levels of interleukin-6 and interleukin-10 correlate with total skin thickness score in patients with systemic sclerosis. J. Dermatol. Sci. 27:140-146.
Shaykhiev R, Beisswenger C, Kandler K, Senske J, Puchner A, Damm T, Behr J, BaIs R (2005). Human endogenous antibiotic LL-37 stimulates airway epithelial cell proliferation and wound closure. Am J. Physiol. Lung Cell MoI. Physiol. 289:L842-L848.
Steed DL (1995). Clinical evaluation of recombinant human platelet-derived growth factor for the treatment of lower extremity diabetic ulcers. Diabetic Ulcer Study Group. J. Vase. Surg. 21 :71-78.
Sugawara T, Gallucci RM, Simeonova PP, Luster MI (2001). Regulation and role of interleukin 6 in wounded human epithelial keratinocytes. Cytokine. 15:328-336.
Sweitzer SM, Fann SA, Borg TK, Baynes JW, Yost MJ (2006). What is the future of diabetic wound care? Diabetes Educ. 32:197-210.
Zhang L, Falla TJ (2006). Antimicrobial peptides: therapeutic potential. Expert Opin. Pharmacother. 7:653-663.
【技術分野】
【０００１】
本願は、2007年1月5日に出願された米国仮特許出願第60/878,849号の優先権を主張し、これらの開示の引用を以て本願への記載加入とする。
【０００２】
本発明は、生物活性及び治療活性を有するペプチドに関する。特に、本発明は、配列番号１の４〜14の隣接アミノ酸残基を有する短いペプチドに関し、そのペプチドは、ケラチン生成細胞のような細胞に対して増殖、移動及び抗炎症活性を示す。また、本発明は、口腔のような皮膚及び他の関連する体表面に影響を及ぼす多様な傷を治療するペプチドの使用法に関する。
【背景技術】
【０００３】
表皮は４〜５枚の重層からなり、すべての層は、大部分が角化細胞を含んでおり、線維芽細胞のような他の細胞タイプも表皮に存在する。角化細胞は、最深部つまり表皮の基底層から生じ、徐々に皮膚の最も外側部分に移動し、そこで角質化し、最終的に脱落する。この移動中、角質細胞は分化して、角質化のために必要な酵素と構造タンパク質を発現する(Presland and Dale, 2000)。角化細胞は、表皮形成においてすぐれた役割が与えられ、損傷した皮膚治療を主な目的とする。
【０００４】
角化細胞はまた、表皮と連続している粘膜組織の主要な構成物質である(Presland and Dale, 2000)。そのような組織は、表皮の不浸透性の角質化層が欠乏しており、口、鼻、喉、耳、肛門及び性器に関連する上皮内層を形成する。皮膚と同様に、粘膜表面は、体内への病原体の侵入を防ぐため重要であり、従って、これらの組織タイプのいずれの損傷でも、個体の健康が危うくなることがある。
【０００５】
皮膚及び粘膜組織の損傷は、裂傷、火傷及び水ぶくれのように表皮層が破られたときに発生する。損傷にはまた、皮膚の亀裂のない組織損傷のような、打撲や痣が含まれる。癌や自己免疫疾患のような特定の慢性疾患のような皮膚感染症もまた、表皮上に犠牲を強いる。糖尿病や床ずれに関連するような潰瘍は、皮膚損傷の別の形態であり、これらの傷は非常に処置し難いことがあり、炎症を起こし、感染しやすく、長期の治癒課程を必要とする。潰瘍の持続、或いは他のどの慢性傷も、細胞伝達のような、治療を含む細胞過程の失敗のためであると一般的に位置づけられている(Enoch and Price, 2004; Sweitzer et al., 2006)。一つの失敗は損傷の上皮化不能である。傷のへりで角化細胞は増殖可能であるが、痛む部分を覆うために結集しない(Enoch and Price, 2004)。糖尿病性潰瘍に関して、もう一つの失敗は、特定のシグナリング分子の欠乏である。この欠乏は、傷の封鎖をする調整のため必要なリモデル過程を妨げることがある(Sweitzer et al., 2006)。
【０００６】
表皮損傷の他の形態は僅かであり、長い期間掛かり、最終的に、急性の怪我にもかかわらず皮膚機能を損傷するので、傷治癒の時間が延び、不完全となり得る(例えば、傷跡の形成)。皺や乾燥、薄層化、たるみ及び挫傷に対する、より大きな感染性のような表面上の問題は、そのような病気のよくある外部的兆候である。当然のことながら、これらの消耗の兆候はたいてい老化に関係するが、紫外線のような有害因子への長引く露出のため早まることがある。日光により誘発される光反応性プロセスは、減少した皮膚の厚さと弾力に貢献することができ、また、皮膚の強さを増すことに貢献することもできる(Pelicci, 2004; Fisher et al., 2002)。
【０００７】
急性の皮膚及び粘膜の傷の治療は、基底角化細胞の活性化を通じて部分的に組織化され、傷の封鎖を生じるため増殖、移動、及び分化する。この過程は、傷部位にて一連のリモデリング活性を伴う(Enoch and Price, 2004)。傷周辺の角化細胞は増殖し、上皮形成として引用される過程において傷を覆う一つの層を形成するよう移動する。さらに、角化細胞の増殖及び分化により、通常の層化された層を含む表皮層が確立される。炎症活動は傷治癒を促進し、単球への浸透することで感染と闘うことができ、また、傷の上皮形成を活性化させる因子をリリースできる。しかし、炎症活動はまた治癒を悪化させることもある。例えば、傷化に寄与するマクロファージによる線維素沈着である。無菌状態が継続する限り、免疫の関与が抑制される場合、表皮傷の閉鎖はより速く、より少ない傷となることが示されている(Martin and Leibovich, 2005)。表皮の傷で炎症を緩和するための方法は現在検討中である。
【０００８】
皮膚及び関連する粘膜組織における傷治癒の間、角化細胞により上皮生成を刺激するためいくつかの因子が見られる、それは、上皮細胞増殖因子(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、角化細胞増殖因子(KGF)、及び血小板由来増殖因子(PDGF)である(Enoch and Price, 2004)。興味深いことに、皮膚及び粘膜表面に存在するいくつかの抗微生物タンパク質は細胞増殖及び表皮の傷を治癒するために必要な移動を促進する役割を果たすことで知られている(Shaykhiev et al., 2005; Braff and Gallo, 2006; Zhang and Falla, 2006)。
【０００９】
傷治癒の間、特定の成長因子は当然に関与するという知識の元、研究は成長因子をベースにした傷治療法開発、特に一般に慢性の傷治療法に対して向けられている。例えば、PDGF-BBによる糖尿病性潰瘍の治療は、FDA認可を得た(Mustoe et al., 1994; Steed, 1995)。しかしながら、そのような方法を使う大部分の試みは、臨床的に重要な結果を達成できなかった。部分的には、治療タンパク質の使用に関連する困難のためである。一つの問題は、成長因子の傷口への不効率な搬送による。すなわち、これらのタンパク質の局所使用は、ただ外部、大部分は死んだ組織の露出を許すにすぎない。他の欠点は、傷口への搬送後における、成長因子の高不安定性及び低残留性に関している。
【００１０】
表皮の傷を治療するための成長因子及び他のタンパク質の使用に伴う困難性は、含まれるタンパク質の大きさに関する。成長因子治療を広範囲に使用することは、また大きいタンパク質作成に関連する複雑さ及びコスト高に苦しめられる。そのため、傷治療管理におけるタンパク質因子の使用に関して、現在、より高くない、より効果的な作成が追及される。より大きいペプチドが由来するもの(すなわち、親タンパク質)からのより大きいタンパク質の活性を有する短いペプチドは、この要求を満たす。そのような短いペプチドの先例は報告されている(U.S. Pat. Nos. 6,861,406 and 6,693,077; Lee et al., 2004)。より高価でない、より単純な生成、取扱い、操作の直接的な効果に加え、短い生物活性ペプチドは、傷の組織により、より維持され、吸収される。日光への露出及び老齢に関連する皮膚の問題の治療のような急性の及び慢性の傷の治療を超える使用のため、短い生物活性ペプチドの先進的吸収特性はまた、それらに実行可能なオプションとなる。
【発明の概要】
【００１１】
発明の要旨
本発明は、哺乳類の傷治癒を促進するために効果的な短い生物活性ペプチドに関する。単離されたペプチドにより好ましく目標とされる傷は、皮膚に影響し粘膜表面に関連する傷である。特定のメカニズムに限定するものではないが、最適の治癒過程を損ねる可能性のある炎症の抑制と同様に、発明のペプチドは細胞増殖及び移動の促進により、傷治癒に効果を及ぼすことができる。発明のペプチドは生体内及び生体外の両方において役立ち、角化細胞において上記に述べた活性を誘発することが可能である。
【００１２】
本発明の１つの実施例は、配列番号１の４〜14の近接アミノ酸残基を有する短いペプチドを含む単離されたペプチドに関する。そのようなペプチドは、ペプチドＨＢ−１０７の短いフラグメントで表される。その単離されたペプチドは、アミノ酸のLあるいはD鏡像異性形又は、その組み合わせを含むことがある。発明のさらにもう一つの実施例によれば、単離したペプチドは、担体タンパク質へ接合されるか、或いはアミド化或いは脂質化で少し変えられることがある。これらの付加が皮膚及び傷に適用されると、ペプチドの生物活性を強化する。
【００１３】
本発明の好ましい実施例によれば、単離されたペプチドは、アミノ末端部においてメチオニン、バリン、リジン或いはグルタミン酸塩アミノ酸残基を含むことがある。単離したペプチドはまた、カルボキシ末端部においてリジン、バリン、グリシンまたはアスパラギンアミノ酸残基を有することがある。他の好ましい具体例において、単離したペプチドは配列番号3、6、又は12を含むことがある。単離したペプチドのある特定の具体例は、配列番号2、3、5、6、7、8、9、10、11、12又は15であり、そのすべてが一つ或いはそれより多い促進活性を細胞増殖或いは移動及び抗炎症に関して示す。配列番号2、3、5、6、7、9、10、11及び12の特定のペプチドはすべて、細胞増殖活性を有し、そして、配列番号2、3、5、6及び9は最も強い増殖活性を示す。配列番号3及び6のペプチドは細胞増殖活性及び移動活性の両方を有する。一方で、配列番号8及び15は細胞抗炎症活性を有する。
【００１４】
本発明の別の実施例は、薬学的に許容できるキャリア及び一つあるいはそれ以上の前述のペプチドを含む組成物に関する。その混合中のペプチドは、およそ0.1μg/mLからおよそ20μg/mLの濃縮、或いはおよそ0.1μg/mLからおよそ50μg/mLの濃縮内の範囲である。その組成物の好ましい形態はエアゾール、エマルジョン、液体、ローション、クリーム、ペースト、軟膏、粉及び泡である。
【００１５】
本発明はまた、哺乳類における傷治癒のための前述した組成物の使用方法に関するものである。一般的に、治療方法は傷、特に皮膚(角質)及び関連する粘膜組織に対し、効果的な時間、効果的な量のペプチドを含有する組成物を投与することを伴う。そのような傷には、すり傷、水膨れ、火傷、裂傷、潰瘍、あざ、発疹、傷及び老化や環境露出の影響が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】発明のペプチドは、親ペプチドＨＢ−１０７(配列番号1)と揃っていることを示す。
【図２】紫外線B(UVB)露光に反応した皮膚表皮細胞によるＩＬ６発現。細胞は一定時間(35秒間)、UVB照射に曝され、ＩＬ６発現は、UVB照射24時間後、ELISAにより測定される。それぞれの処置は３通りで実行された。実施例４を参照。
【図３】表皮細胞のUVBを誘発するＩＬ６発現に関する短いペプチドの影響。細胞は、35秒間UVB照射に曝され、その後、20時間、細胞は４０μg/mLのペプチド［ＨＢ−１０７(配列番号1)、ＨＢ−８０２(配列番号12)、ＨＢ−１４１０(配列番号15)、ＨＢ−８０１(配列番号31)］を含む完全媒体(血清でない)で培養された。ＩＬ６発現はそれからELISAにより測定された。実施例４を参照。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
米国特許第5,962,410号と第5,861,478号は、本発明の理解に役立つ開示をもたらし、これらの開示は引用を以て本願に記載加入とする。その発明は短い、生物活性ペプチドに関して教示する、たとえば、ペプチドＨＢ−１０７(配列番号１)に由来するペプチド及びその使用法に関してである。ペプチドＨＢ−１０７自体は、セクロピンBの一部分を構成し、それは、蛾の種に存在する抗菌ペプチドである。ＨＢ−１０７はそれが由来するタンパク質の静菌効果を示さないが、表皮の傷治癒特性を示す(Lee at al., 2004)。
【００１８】
本発明のペプチドは、皮膚及び関連する粘膜(例えば、口腔)のような表皮組織の治癒過程のアップレギュレートに重要な活性を開示する。いずれの特定のメカニズムにも制限しないため、これらの特性は角化細胞、傷封鎖(すなわち、上皮形成)に関与する表皮細胞及び表皮の表面の発達に関して引用される。発明のペプチドが、傷治癒に直接関係する角化細胞に関して示す特定の活性は、細胞増殖及び移動促進である(角化細胞による炎症抑制シグナリングのための能力と同様にである)。ＨＢ−１０７は角化細胞においてこれらのすべての活性を誘発することができるが、驚くべきことに、本発明のペプチドは、ＨＢ−１０７より大きいかＨＢ−１０７とほぼ同じ又はそれレベルである。発明のペプチドはＨＢ−１０７の長さの26％〜74％にすぎないため、これらの結果は驚くべきであり、また重要でもある。
【００１９】
このサイズの違いの理由で、発明のペプチドは、PDGF-BBのようなフルサイズのタンパク質及びＨＢ−１０７の生成に比べ、準備がより容易であり、より高価ではない。また、より大きいペプチドと比較して、開示されたペプチドは可溶性であり、操作され(例えば、化学的調整)そして、より単純な方法で保管される。それらの取扱の容易さは、使用される手段及びそれがどのように適用されるかの方法のような多くの薬搬送オプションを可能にする。発明のペプチド及びそのペプチドのより大きな溶解性は、傷部位にて吸収及び保持力増加を通じて治癒可能性を増加させる、そして、部分的な角化細胞及びほかの細胞は、より長い期間より高い濃度のペプチドを浴びる。
【００２０】
本発明のペプチドにより誘発された生物活性は、炎症抑制と同様に細胞増殖及び移動である。細胞増殖及び移動の過程は、ペプチドの傷治療機能の仲介で大きな役割をする。そのペプチドは、最初に傷の縁を縁取る角化細胞の移動を促進し、次に、新しい表皮層が傷部位をおおうようこれらの増殖を促進する。そして。3番目の特性である炎症抑制は、サイトカインインターロイキン６(ＩＬ６)分泌に対する開示されたペプチドのマイナス影響を通して、傷における細胞により成し遂げられる。ＩＬ６は、組織の損傷に関する因子に応じて表皮の角化細胞により放出されることが示された(Sugawara et al., 2001)。このサイトカインは、傷への免疫細胞浸透及び実は治癒を悪化させ傷の原因となる過程へ合図をおくる(Martin and Leibovich, 2005; Liechty, 2000)。炎症は傷感染症予防のために重要であるが、炎症阻止に関連し得るどんな不利益をも打ち消す標準的傷治療の間、良い消毒剤供給は行われる。本発明が傷治癒をもたらすことを通じて上記活性は起こりがちであるが、本願はいずれの一連の生物学的メカニズムによっても限定されないことに言及する。
【００２１】
細胞増殖と細胞移動を誘発することに関して、配列番号3(ＨＢ−１０６１)及び配列番号6(ＨＢ−１０７２)のペプチドが好ましい。これらのペプチドは、ＨＢ−１０７による誘発に比べ、細胞増殖中に顕著な増加をもたらす。しかし、これらのペプチドは、ＨＢ−１０７より短い(実施例３参照)。
【００２２】
実施例１及び２。それらは、細胞移動誘発に関し、ＨＢ−１０７と同じくらいの能力がある。配列番号8及び12のペプチドは、細胞の抗炎症活性の誘発についてより好適である(実施例３参照)。
【００２３】
発明のペプチドはまた、太陽照射のようなダメージ物質にさらされた肌、或いは老化した肌に関連する問題について健康に良い結果を示す。単独で変化なく、或いは化学修飾を通じて、及び/また専門的な搬送を通じて、短いペプチドは、表皮をとおして吸収されることが可能である。皮膚希薄化、しわ、弱さ、あれ/硬化の原因と反対のプロセスをもたらすためである。発明は肌保持を促進する大部分の方法は、角化細胞成長に関するペプチドの好ましい結果を通じてである。これらの細胞が皮膚表面の主要構成要素であり、老化で減少し、皮膚にダメージを与えると、ペプチドの促進による皮膚表面の補充が、上記の問題を覆すことが期待される(Enoch and Price, 2004)。ＩＬ６発現は、特定の自己免疫問題を持つ患者において、基本的な表皮が異常に厚くなる過程に関連する(Sato et al., 2001 ; Oyama et al., 1998)。発明のペプチドは、ＩＬ６発現の抑制により、そのような炎症関連の結果を阻止することができる。
【００２４】
指標のみではあるが、発明のペプチドは、モスセクロピンBタンパク質のＨＢ−１０７断片(表1)に由来することができる。これらのペプチドと関連する代謝の特徴は、細胞増殖及び移動、及び/また抗炎症活性を誘導する能力である。発明のペプチドすべては、ＨＢ−１０７(配列番号1)の4‐14の近接するアミノ酸残基を持つ共通の特徴を共有する。それゆえ発明のペプチドは、ＨＢ−１０７(配列番号1)の4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14の近接するアミノ酸残基から構成することができる。
【００２５】
上記アミノ酸混合物を有することを除いて、上述のペプチドは、以下のアミノ酸を付加的に含み得る。(フルネーム/３レタ−省略形/１レタ−省略形)：アラニン/ala/A、アルギニン/arg/R、アスパラギン/asn/N、アスパラギン酸塩/asp/D、システイン/cys/C、グルタミン/gln/Q、グルタミン酸塩/glu/E、グリシン/gly/G、ヒスチジン/his/H、イソロイシン/ile/I、ロイシン/leu/L、リジン/lys/K、メチオニン/met/M、フェニルアラニン/phe/F、プロリン/pro/P、セリン/ser/S、トレオニン/thr/T、トリプトファン/trpAV、チロシン/tyr/Y及びバリン/val/V。これらのアミノ酸残基は、以下のように特徴付けられる:脂肪族化合物(alanine、グリシン、isoleucine、ロイシン、プロリン、 バリン)、芳香族化合物(フェニルアラニン)、トリプトファン、チロシン)、酸性(アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩)、塩基性(アルギニン、ヒスチジン、リジン)、ヒドロキシ酸(極性の)(セリン、トレオニン)、含流(極性の)(システイン、メチオニン)、及びアミド基化物(アスパラギン、グルタミン)。非標準的アミノ酸残基は、セレノシステイン、ピロリジン及び様々な環状アミノ酸を含むが、それには限らない、開示されたペプチドにも引用を以て記載加入とすることができる。
【００２６】
以下のペプチドは、本発明の非限定的な例であり、実例となる目的で示す(表１)。
【表１】
【００２７】
配列番号：2、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12と配列番号：15のペプチドは、上述した一つ或いはそれより多い活性(増殖、移動、抗炎症)に関連するペプチドの例である。配列番号：2、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11と配列番号：12のペプチドは、細胞増殖を誘発可能なペプチドの例である。配列番号3及び配列番号6のペプチドは、細胞増殖と移動を誘発可能なペプチドの例である。配列番号12のペプチドは、増殖及び抗炎症活性両方を示すペプチドの例である。配列番号8及び配列番号15のペプチドは、抗炎症活性を有するペプチドの例である。
【００２８】
それぞれの上述したペプチドは、L-或いはD-アミノ酸性鏡像異性体(1つの鏡像異性体残基を含むか両方の形の組合せ)から成り得る。ペプチドは、以下の非限定的な例において述べるように、化学的に又は酵素的に増加又は調整されるかのどちらかでありうる。ペプチドのカルボキシ末端は酸性(−COOH)であるか或いはアミド化(例えば、-CONH2、-CONHR、又は-CONR2)されている。カルボキシ末端のアミド化は、遊離酸の形態と比較して、発明のペプチドをプロテアーゼ分解により影響され難くし、可溶性を増すことができる。それゆえ、高められた治療能力をもたらす。また、脂質化されたペプチドは、強化された皮膚浸透のために供給されうる。ペプチド修正は、Ｎ末端アミノ基の水素が代わられるように、Ｃ末端カルボキシル基の水酸基(OH)が代わられるように、完全なN-末端のアミノ基が代えられるように、或いは全てのＣ末端カルボキシル基は代わられるようにペプチド修正が、行われるかもしれない。それぞれのペプチドと結びつくアミノ酸の一つ或いはそれより多い分子結合は、非ペプチド接合であるかもしれない。そのような非ペプチド接合は、イミド、エステルヒドラジン、セミカルバジド及びアゾ接合を含むがそれに限らない。
【００２９】
多様な修正は、特有の増殖、移動及び抗炎症活性が持続する限りペプチドに行われることができる。いくつかの修正は、ペプチドの効能を増すために使用されるかもしれないが、他の修正はペプチドの扱いを容易にすることができる。通常は修正されるペプチドの機能グループは、ヒドロキシ基、アミノ、グアニジウム、カルボキシル、アミド、フェノール、イミダゾールリングまたはスルフヒドリルを含む。通常で、これらのクループの非限定的な反応は以下を含む：ハロゲン化アルキルによる水酸基のアセチル化；カルボキシル基のエステル化、アミド化又は水素化(すなわちアルコールへの還元)；アミノ基(例えばペプチドの主要なアミノ基またはリジン残基のアミノ基)の脱アミノ作用、アシル化、アルキル化、アミノ基(例えばペプチドの主要なアミノ基またはリジン残基のアミノ基)のアリール化；チロシンフェノール基のハロゲン化またはニトロ化。
【００３０】
ペプチドは、必要に応じてその可溶特性を調整するためと目標とされた組織においてローカル濃度を増すため、可溶性の或いは不可溶性の担体分子に共役することができる。 可溶性キャリア分子の例は、ポリエチレングリコール(PEG)及びポリビニルピロリドンの高分子化合物を含む。不可溶性キャリア分子の例は、ケイ酸塩、ポリスチレンとセルロースを含む。ペプチドもまた、治療への適用の間及び適用後、安定性を強化するためにマイクロカプセル化するかもしれない。一般的に、ポリエステルとPEGミクロスフィアは、ペプチドをカプセル化して、安定させるのに使用される。
【００３１】
ペプチドのカプセル化のためにミクロスフィアを準備するいろいろな方法は、カプセル化されるペプチドの親水性或いは疎水性によって使用され得る。そのような方法のためのプロトコルの例は、Wang HT et al. (1991, J. Control. Release 17:23-25)及びアメリカ特許第4,324,683号にあり、これら両方の開示は全て引用を以て本願に記載加入とする。生体外でのペプチドの放出研究は、ミクロスフィアの中へ導入された後、ペプチドの相対的可用性を決めるため行われるかもしれない。ミクロスフィア(200mg)は、pH7.2の緩衝生理食塩液(PBS)(2.5ml)の中に吊るされ、7℃で100rpmの環境インキュベーターシェーカー(G-24, New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J.)の中で揺らされた。特定のサンプリング時間(最初の４日間のそれぞれの日及びそれ以降の隔日)に、緩衝液は、完全に除去され、新しいＰＢＳに入れ替えられた。ＰＢＳ中のペプチドの内容物は、ブラッドフォード法又はタンパク質分析に使用される典型的な他の定量分析を使用して測定された。
【００３２】
全ての開示されたペプチドは、先進的な化学技術であるエイペックス396複合ペプチド合成器上で、標準的なFmoc(9-フルオレニルメトキシカルボニル)固相化学を使用して合成され得る。そのエイペックス396は、0.15ミリモルの大きさで同時に40までのペプチドの生成のため40の反応剤を装備した。そのペプチドは、標準的なアミノ酸を使用してアミド化或いは遊離酸配列として準備され得る。樹脂は最初に、N,Nジメチルホルムアミド(DMF)を用いて、洗浄及び予備膨張を行なった。リンクアミド樹脂の膨潤時間は1時間だった。その樹脂からピペリジンが完全に洗浄された後、Fmocは25分間ＤＭＦ中で25％のピペリジンでFmoc保護グループは、除去された。ラセミ化過程を制御するため、Fmocアミノ酸単量体は、1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール(HOBt)或いは0.5M濃度のＤＭＦ中における1-ヒドロキシ-7-aza-ベンゾトリアゾール(HOAt)の等モル溶液中で前もって活性化された。ヒンダード塩基(ジイソプロピルエチルアミン)の使用を基本状態とするアミノ酸の2.5−5.0倍モル過剰及び活性剤として、アミド結合は、O-(7-アザベンゾトリアゾール-l-イル)-l,l,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェイト(HATU)PyBop(登録商標)または2-(lH-ベンゾトリアゾール-l-イル-)-l,l,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリンフォスフェイト(HBTU)を使って実践された。結合時間は、1-1.5時間で、その後、洗浄及びペプチドチェーンの成長及び再結合前に、二重或いは三重の結合を成し遂げるため再結合される。結合能力は、標準的なカイゼルテストを使ってモニターされた。一旦、ペプチド合成が樹脂上で完了されると、最終的なFmocグループは、上記のように除去され、シーケンスはフリーベースとして残された。
【００３３】
ペプチドの酸に不安定な樹脂への結合の分裂は、95％のトリフルオロ酢酸(TFA)及び適当なスカベンジャーを加えた水を使用して達成された。分裂がおよそ30分〜1時間進行された後、放出されたペプチドは、分裂剤からすぐに除去され、減圧下でＴＦＡ除去のためチューブへと移された。それから、そのペプチドは、逆相C18カラム及び質量分光分析を使用する高速実行液体クロマトグラフィー(HPLC)を通じて、精製と分析のため準備された。ＬＣ/MS/MSシステム(ABI API2000)を使用して、主要な配列確認と準備精製は達成された。
【００３４】
上記プルトコルについて、ペプチドは、Merrifield, R.B., Solid Phase Peptide Synthesis L, J. AM. CHEM. SOC. 85:2149-2154 (1963); Carpino, L.A. et al., [(9-Fluorenylmethyl)Oxy] Carbonyl (Fmoc) Amino Acid Chlorides: Synthesis, Characterization, And Application To The Rapid Synthesis Of Short Peptides, J. ORG. CHEM. 37:51 :3732-3734; Merrifield, R.B. et al., Instrument For Automated Synthesis Of Peptides, ANAL. CHEM. 38:1905-1914 (1966); or Kent, S.B.H. et al., High Yield Chemical Synthesis Of Biologically Active Peptides On An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design, IN: PEPTIDES 1984 (Ragnarsson U., ed.) Almqvist and Wiksell Int., Stockholm (Sweden), pp. 185-188に開示され、当業者にしられる何れの方法を使用してでも生産され得る。これらの開示はすべて引用を以て本願に記載加入とする。好ましくは、ペプチドは成長するペプチドチェーンに連続してアミノ酸を追加できる機械で生産される。一方、標準的方法でせいさんされることがあり、それは大量生産が可能である。
【００３５】
使用方法
さらなる現発明の実施例は、製剤或いは治療剤のように、上述のペプチドの使用について教示する。これらの方法は、一つのペプチドまたは複数のペプチドの使用の組合せに関係するかもしれない。
【００３６】
現発明のペプチドは、皮膚(表皮、真皮と下皮)及び関連する粘膜組織の傷治療のために使用され得る。ここで使用されるように、”関連する粘膜組織”という用語は、皮膚に似た方法で組織化されるどんな組織にも関連し、上皮細胞が含まれる。角化細胞は、そのような上皮細胞の非限定的な例である。そのような組織の例は、口、鼻咽頭、耳、尿生殖器表面、同様に目の眼瞼結膜である。関連する粘膜組織の他の例は、食道、胃、小腸、大腸(内腔)と直腸を含む消化管の全ての内壁(すなわちルーメン)を含む。これらの後者の例は、非常に皮膚に影響を及ぼすことができる傷/障害を受け、そして、本発明の目標となりうる。これらの組織に影響を及ぼすことができる傷/障害/負傷の例、及び本発明のペプチドの治療に敏感に反応する例は、すり傷、水膨れ、火傷、裂傷、パンク、潰瘍、あざ、発疹と傷跡である。外科手術後の組織外傷もまた、ペプチドで治療することができる。
【００３７】
本発明のペプチドは、上述した組織全ての老化の効果を防ぐか或いは戻すために使用され得る。関連する方法で、日光のような多様な外部物質への露出によりダメージを受けた組織に適用され得る。露出及び老化に関連する虚弱の例は、シワの寄った皮膚、乾燥、希薄化、たるみ、及び挫傷のより大きい感染性である。本発明は、より若い見かけ及び肌ざわり及びより良い機能をもたらすための化粧品として使用することが可能である
【００３８】
本発明のペプチドを使用して効果的に治療される他の組織の問題は、アレルギー或いは自己免疫に関する。そのような病気は、皮膚炎、乾癬、硬皮症、天疱瘡と炎症性腸疾患を含む。
【００３９】
上記の治療方法において、ペプチドを搬送するために使用する混合物は、エアゾール、エマルジョン、液体、ローション、クリーム、ペースト、軟膏、粉または泡、または他の薬学的に許容できる製剤であるかもしれない。さらに、より製剤に関係しない方法で搬送される。例えば、消イオンされた/蒸留された水、PBSまたは標準的な医学食塩液である。一般的に、薬学的に許容できる製剤は、人の皮膚上で使用するのに適するどんなキャリアも含む。そのように薬学的に許容できるキャリアは、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、二酸化ケイ素、アルミナ、澱粉及び等しいキャリアと賦形剤を含む。その製剤は、さらに、コスメティックアピールを有し、及び/また、レチノイドまたは、発明のペプチドの治療効果にふさわしい活動をする他のペプチドのような他の物質を含むこともできる。抗生物質は、感染を避けるために製剤に加えられるかもしれない。そしてそれにより、最大の治療プロセスを起こさせる。混合物におけるペプチド濃度は、約0.1μg/mLから50μg/mL或いは約0.1μg/mL〜約20μg/mLであるが、傷/組織状態の性質、発明のペプチドの生物活性及び混合剤吸収を強化するどんな佐剤及び技術の使用によっても、使用される最終的な濃度はこれらの範囲を超えて変化するかもしれない。
【００４０】
本発明の混合物は、一つ或いはそれ以上の付加的なエージェントを含むことが可能である。
【００４１】
本発明の好ましい実施例において、人のケラチン組織に接触する混合物において、発明のペプチドに加えてのいずれの成分もケラチン組織に適用するためにふさわしくあるべきである。つまり、混合物に導入されるとき、他の成分のようなものは、不適切な毒性、非互換性、不安定性、アレルギーの反応及び医学の判断内で同様の反応をしめす。CTFA化粧品ハンドブック、第２版(1992)は、広く多様な非制限的な化粧品及び薬剤が一般にスキンケア業界で使用され、それは、本発明の混合物における使用にふさわしいと述べる。これらの成分分類例は以下を含む：研磨材、吸収材、香料のような美的な混合物、顔料、色彩/着色剤、エッセンシャルオイル、肌清涼剤、アストリンゼン、他(例えばクローブ油、メントール、樟脳、ユーカリ油、オイゲノール、メンソール乳酸塩、ウィッチへーゼル蒸留液)、反白色剤、反にきびエージェント、抗菌薬(例えばヨードプロピルブチルカルバメート)、酸化防止剤、バインダー、生物学的添加物、バッファエージェント、膨張性薬剤キレート試薬、化学添加物、化粧用殺生物剤、変性剤、薬アストリンゼン、外用鎮痛薬、被膜形成剤或いは被膜形成原料、不透明化剤、pH調整剤、推進剤、還元剤、金属イオン封鎖剤、皮膚漂泊剤及びライトニング剤(例えば、ヒドロキノン、コジック酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸リン酸塩マグネシウム、アスコルビン酸グルコサミン)、スキン・コンディショナー(例えば、湿潤剤)、皮膚沈静剤 及び/或いは、治癒剤(例えば、パンテノール及びその派生物、アロエベラ、パントテン酸及びその派生物、アラントイン、ビサボロール及び、グリチルリチン酸2カリウム)、皮膚治療剤、増粘剤及びビタミン及びその派生物。
【００４２】
本発明のペプチド及び関連する混合物の投与は、人や動物を含むすべての哺乳類におこなうことができる。適用は、組織移植片、組織培養生成物、酸素及びドレッシングのような、典型的な或いは/及び実験的な材料を組み合わせて作ることができる。一般的に、混合物は、局所に、経口で、経皮で全身に、あるいは傷部位に発明のペプチドを搬送するのに役立つ技術の当業者が知るいかなる方法ででも投与することができる。混合物はまた、生体内又は生体外において、培養で成長している患者の移植片或いは組織のどちらかに適用され得る。
【００４３】
それらの小さいサイズのために、ペプチドは自身の皮膚を通る幾つかのレペルの浸透性により増える可能性を期待される。一方、ある技術はこの動きを拡大するために使用され得る。たとえば、親油性(無極性の)グループはペプチドに加えられることが可能である、すなわち、ペプチドは脂肪親和性の賦形剤において皮膚へ運ばれることが可能である、下層の表皮層に移動させるため角質層へペプチドのアクセス性を強化するためである。このような脂肪親和性の改質は、薬剤の補助とみなされるかもしれない。既知の溶媒と界面活性剤のような浸透性エンハンサーは、賦形剤の中でよりよい吸収をさせるために使用され得る。目的とする組織/傷口へのペプチドのアクセス強化に役立つことが期待される特別な技術は、イオン導入、電気泳動と超音波を含む。イオン導入装置は、電解質溶液に浸された２つの電極から成り、皮膚のうえに配置される。電流が、電極に適用される時、電界がペプチドの搬送を導く角質層全体に生成される。エレクトロポーレーションは、脂質の二重層をとおって浸透を増すため高電圧パルスの適用を含む。これは、電流のアプリケーションの強度及び期間においてイオン導入とは異なる(イオン導入は、比較的一定である低電圧電界を使用する)。エレクトロポーレーションの高電圧パルスは、高レベルの浸透性強化をもたらす脂質薄板膜において水孔の可逆的形成を誘導すると信じられている。超音波は、16kHzを超える頻度で皮膚に適用され、それは、音波を通して組織の圧縮と拡大を引き起こす。結果として生じる圧力バリエーションは、ペプチドの浸透を強化するかもしれないたくさんの過程(例えば侵食、混合、温度上昇)を生じる。
【００４４】
全ての上記のペプチド製剤と使用は、よく知られた技術です。 発明のペプチドの使用及び準備の追加の方法は、例えば、アメリカ特許第6,492,326及び6,974,799であり、これらの開示は引用を以て本願に記載加入とする。
【００４５】
以下の例は、発明の特定の好ましい実施例を示すために含まれる。
【実施例】
【００４６】
実施例１：細胞増殖を促進するペプチドの識別
予め、ＨＢ−１０７(配列番号1)ペプチドフラグメントが、体内にいて創傷治癒を促進することを示すために、ＨＢ−１０７配列中に、創傷治癒及び関連するプロセスを同じように又はより刺激する短いペプチドフラグメントがさらに存在するとの仮説を立てた。この疑問を検証するために、ＨＢ−１０７のペプチドフラグメントの重複セットを標準固相ペプチド化学を用いて生成した。これらのペプチドを次に、濃度０.２２、２.１５、２１.５及び４６.４μｇ／ｍｌで細胞増殖活性のために分析した。ペプチドの多くは、夫々７アミノと６アミノを含有するのみであるペプチドＨＢ−１０６１(配列番号3)及びHD−１０７２(配列番号6)を含め、低濃度で表皮角化細胞の増殖が顕著に増大した(表２)。幾つかの他のペプチドは、ＨＢ−１０７の刺激活性とほぼ同等又はそれ以上のレベルの刺激活性を呈した(表２)。結果として、発明のペプチドの多くによって誘発される細胞増殖は、親ＨＢ−１０７ペプチドによって誘発されるレベルを超えていた。重要なのは、これらのフラグメントの内の幾つかは、ＨＢ−１０７よりも極めて短いことである。
【表２】
【００４７】
細胞増殖分析は、次の実験的プロトコルから進めた。
【００４８】
マウス角化細胞株を用いた細胞増殖分析
【００４９】
目的：培養下で表皮角化細胞に適用したときに、被験物質の抗増殖能又は細胞傷害能を判断する。
【００５０】
テストシステム：マウス角化細胞株ＰＡＭ２１２又は初代正常ヒト表皮角化細胞(NHEK：Clonetics社製)の何れかが望ましいモデルであるが、他の細胞を用いることもできる。
試薬：
【００５１】
１．細胞成長培地：１０％の牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM-10)、ペニシリン(100units/ml)、ストレプトマイシン(0.1mg/mL)及びゲンタマイシン(50μg/ml)、又は、ヒト細胞の角化細胞培地(KGM:Clonetics社製)
【００５２】
２．媒介培地：１.０％の牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM-1)、ペニシリン(100units/ml)及びストレプトマイシン(0.1mg/mL)、又は、ヒト細胞の角化細胞基礎培地(KBM:Clonetics社製)
【００５３】
３．ニュートラルレッド原液：ニュートラルレッド粉末をダルベッコ-リン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に濃度３mg/mlとなるように添加した。得られた溶液を無菌濾過した。
【００５４】
４．ニュートラルレッド培地：ニュートラルレッド原液に最終濃度５０μg/mLとなるようにDMEM又はKBMを添加した。
【００５５】
５．ＭＴＴ培地：ＭＴＴ(3-(4,5-ジメチルチアゾール2-yl)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)粉末を１mg/mLでDMEM又はKBMに添加し、濾過又は遠心分離により沈殿物を除去した。ＭＴＴ溶液は、２４時間以内に使用した。
【００５６】
６．水溶液中、ホルムアルデヒド１％及び塩化カルシウム１％からなる定着液
【００５７】
７．PBSの洗浄液
【００５８】
８．溶解液：ニュートラルレッド用の水溶液又はＭＴＴ処置細胞用の酸性イソプロパノール中、氷酢酸１.０％及びエタノール５０％
細胞プレーティング
【００５９】
角化細胞は、毎日、顕微鏡によって観察した。培養物が５０〜７０％密集すると、プレート中の培地を吸引し、０.２５％トリプシン／EDTAを添加した(ヒト細胞用に0.05％トリプシン)。細胞が丸くなると、約１０％のウシ血清を補足した等量のDMEM又はKBMを添加し、又は、トリプシン中和溶液(TNS:Clonetics社製)を用いて、トリプシンを中和した。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを１mlのDMEM-1又はKBM中で再懸濁させた。細胞懸濁をカウントするために血球計を用い、DMEM-1又はKBMを用いて、１ml中の細胞の総数が１.５〜２.５×１０4cells/mLとなるように調整した。細胞は、次に、各ウェルに細胞懸濁液２００μLを添加することで、３.５〜５.０×１０3の濃度で９６ウェルプレート中にプレーティングした。主として、中央の６０ウェルを使用し、外側のウェルは、DMEM又はPBSを注いで、蒸発効果を最小化させた。
サンプル調製
【００６０】
被験物質の原液は、DMEM-1又はKBMを用いて準備し、これ以降、すべての他の希釈液はこの溶液から作成した。主として、各希釈液は、細胞培養に用いる前に、０.２μmのフィルターを通して濾過した。１.０％(w/v又はv/v)溶液又は懸濁液を準備し、培養培地中で、１０倍又は３倍の連続希釈法を用いた。
投薬
【００６１】
細胞は、確実に細胞接着又は細胞分裂させるために、プレーティングの後、１８〜２４時間経過してから観察し、次に、培地の１００μLを吸引して、各ウェルに１００μL残した。次に、各被験物質希釈液の２倍の濃度で１００μLを複製ウェルに添加した。陰性対照として、ビークル培地(DMEM-1又はKBM)１００μLを対照ウェルに添加した。マイクロプレートは、投薬の後４８〜７２時間、３７℃、５.０％ＣＯ2で培養し、細胞を平穏な状況で増殖させた。この４８〜７２時間曝した後、すべての培地を吸引し、以下に示す方法の一つを用いて増殖を評価した。
【００６２】
オプションＡ：ニュートラルレッド摂取。培地を曝露及び吸引した後、ニュートラルレッド培地２００μLを直ちに各ウェルに添加する。マイクロプレートは、さらに３時間培養器に戻しておく。この染色摂取期間の後、マイクロプレートを培養器から取り出し、静かに裏返し、ニュートラルレッド培地を採集皿に移す。次に、細胞を約１分間定着液で定着させる。定着液を移し出して、マイクロプレートを洗浄液で３回静かに洗浄する。洗浄液を移して、２００μLの溶解液を添加する。最低１５分の後、各ウェルの内容物をサイドピペットで取り出し、各ウェルの色分布が同等となるようにして、アリコートを分光光度計を用いて下記の方法で読み出す。
【００６３】
オプションＢ：ＭＴＴ変換分析。培地の曝露及び吸引の後、２００μLのＭＴＴ分析培地を各ウェルに直ちに添加する(MITは被験物質が直接MITを減じない場合にのみ使用し、範囲測定試験又はMIT適合性試験により決定される)。マイクロプレートは、さらに３時間培養器に戻しておく。この染色摂取期間の後、マイクロプレートを培養器から取り出し、静かに裏返し、ＭＴＴ培地を採集皿に移す。次に、細胞を洗浄液で３回静かに洗浄する。洗浄液を移して、２００μLの溶解液を添加する。最低６０分溶解させた後、各ウェルをサイドピペットで取り出し、各ウェルの色分布が同等となるようにして、吸光度を分光光度計を用いて下記の方法で読み出す。
【００６４】
オプションＣ：フローサイトメトリーに基づく分析。曝露の後、培地を１０μMのブロモデオキシウリジン(BrdU)で調製し、３７℃で４５分間培養する。この培養の間、BrdU、チミジン類似体を増殖細胞のＤＮＡに組み入れる。次に細胞をトリプシン処理により採取する。遠心分離の後、細胞ペレットを洗浄し、ＤＮＡ特異(レッド)蛍光染料ヨウ化プロピジウムで染色する。増殖細胞は、BrdU特異蛍光(グリーン)抗体で染色する。細胞周期分析も、BrdUに染色陽性の増殖細胞の量も、フローサイトメトリーを用いて分析する(注：フローサイトメトリーの検討では、細胞は２４ウェル又は６cmプレートで培養される)。
データの分析
【００６５】
染色摂取の検討：染色に基づく評価項目において、ウェルの光学濃度は、Titertek Multiskan MCC/340を用いて、ニュートラルレッドの６２０nmの参照波長又はMITの６７０nmから６８０nmの参照波長における吸光度を差し引いて、波長５４０nmで読み出す。吸光度値のプリントアウトは、プレートリーダによって作成する。平均吸光度及び標準偏差は、各処置グループに対して計算し、結果を対照吸光度のパーセントで表わす。
EC50計算：各テストサンプルについて、データを対照吸光度対濃度のパーセントでプロットする。EC50は、エクセル5.0グラフでデータを通じて引いた回帰線から推定する。さらに、EC50は、エクセル5.0グラフによって、又は、エクセル5.0マクロを用いることによってもたらされる回帰線に対する方程式を用いて計算する。
【００６６】
フローサイトメトリー検討：フローサイトメトリー分析において、BrdU標識に陽性のパーセントを判断し、増殖指数(すなわち、採取の際に活発に増殖している細胞のパーセンテージ)を計算する。サンプル中の生存細胞のパーセントやアポトーシス細胞のパーセンテージのような他のパラメータで判断することもできる。
【００６７】
実施例２：細胞移動を促進するペプチドの識別
細胞増殖だけでは、創傷治癒に役立つには十分ではない。損傷を受けた状態で、創傷に隣接する細胞が増殖する；そのような損傷(又は古い機能異常の組織の慢性病巣)の近くで新たに形成された細胞の移動は、等しく重要である。この問題を対処するために、単一組織培養スクラッチテストに基づいて角化細胞移動分析を用いて、ＨＢ−１０７とそのペプチドフラグメントを観察した。この分析は、ＨＢ−１０７２(配列番号6)やＨＢ−１０６１(配列番号3)のようなペプチドが親ＨＢ−１０７ペプチドと同様に細胞移動を増大させることができることを示した(表３)。ＨＢ−１０７２とＨＢ−１０６１ペプチドは、ＨＢ−１０７の一部と重複しており、アナログＨＢ−１０６２(配列番号4)は、細胞に移動活性を示さないことに気付いたことは興味深いものである。この分析のプロトコルは標準的であり、Shanleyらによって記述されており(2004, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45:1088-1094)、この論文の引用を以て全文の記載加入とする。
【表３】
【００６８】
実施例３：静止細胞中で抗炎症活動を促進するペプチドの識別
治癒の割合いの増大に加えて、ペプチドＨＢ−１０７は、創傷に関連する炎症のレベルを減少させることが示されている。そのような活動を呈する小ペプチドフラグメントを識別するために、ＨＢ−１０７のフラグメントが、主要な炎症性サイトカインＩＬ６を減じる活動を探った。ペプチドフラグメントＨＢ−８０２(配列番号12)とＨＢ−１０７６(配列番号8)は、ＩＬ６発現のレベルが、ＨＢ−１０７親ペプチドと同程度まで減じられたことがわかった(表４)。この分析のプロトコルは標準的であり、Murakamiらによって記述されており(2004, J.Immunol. 172:3070-3037)、この論文の引用を以て全文の記載加入とする。
【表４】
【００６９】
実施例４：細胞中の紫外線Ｂ(UVB)誘発炎症活動を抑制するペプチドの識別
ある小ペプチドが、静止細胞中で抗炎症活動を促進することができることを前提として(実施例３参照)、小ペプチドが、UVB放射に曝された細胞中で、そにょうな活動を促進できることは興味深いものである。UVB放射は、肌にダメージを与え、肌のエージングを促進する。ダメージを受けた組織中の炎症は、その組織のエージングの一因であるので、紫外線光により誘発されるダメージに由来する表皮炎症の現象は、そのエージング効果を小さくすることとなる。
【００７０】
ＨＢ−１０７のペプチドフラグメントが、紫外線光に曝された細胞中で抗炎症活動を誘発するかどうかを判断するために、分析を行なった。ヒト皮膚表皮細胞(ATCC CRL-2592)を６ウェルプレートに蒔き(seeded)、１０％のウシ胎仔血清を補足した１.５g/L重炭酸ナトリウムと４.５g/Lグルコース(完全培地)を含むように調製された４mMのＬグルタミンと共に、DMEM中で９５％密集を越えるまで成長させた。UVB処置の前に、細胞を５時間血清飢餓とした。UVBは、UVLMSランプ(４Wモデル、３UVアッセンブリ、カナダUpland社製)を用い、３０２nmの放射波長にセットして生成した。UVランプは、組織培養プレート(６ウェルプレート)の上１２cmに配置し、２ウェルは、１度均質UVB照射となるように処置した。細胞は、PBS中でUVB照射(450μW/cm2、放射計を用いた測定)に曝され、有毒光化学の紫外線光誘発生成を回避した。ＩＬ６発現を、UVBに反応した細胞炎症活動の指標として測定した。図２に示すように、皮膚表皮細胞中のＩＬ６発現は、UVBの用量依存の方法で誘発されており、これにより、紫外線光が皮膚表皮細胞中の細胞の炎症プロセスを促進することが証明された。
【００７１】
個々のペプチドを皮膚表皮細胞中で検査し、皮膚表皮細胞中のUVB誘発ＩＬ６発現でその効果を判断した。細胞は、PBS中で３５秒間UVB(450μW/cm2)に曝され、その後、PBSを４０μg/mlのペプチドの存在又は不存在下で血清なしの完全培地と置き換え、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養した。次に、ヒトＩＬ６用のELISA(CellSciences社製、マサチューセッツ州)の前に、上澄培地を採取し、10,000rpmで遠心分離して、残骸を除去した。ＨＢ−１０７ペプチド内の特定のシーケンスは、強力な炎症刺激の影響を受けて、細胞中でのＩＬ６発現を著しく減少できることがわかった(表５、図３にグラフを用いて結果を示す)。
【表５】
【００７２】
この研究による結果は、ＨＢ−１４１０(PKEK, 配列番号15)のようなペプチドが、紫外線照射に応じて上皮細胞により生成されたＩＬ６のレベルを著しく下げる能力のあることを示す。この活動は、日光にさらされたあとのスキンケアのための特別な応用である、そして、傷や老化に由来する多様な皮膚状態において、関連する炎症の減少に向けての広い応用でもある。ペプチド配列の少しの変化でさえ、上皮細胞におけるＩＬ６発現へ向けて著しくペプチドの抑制活性を変化することができることへの言及が興味深い(例えば、ＨＢ−１４１０の抑制活性と、ＨＢ−８０１(PKEKV)及びＨＢ−８０２(MPKEK)の比較)。興味深いことに、ＨＢ−８０２は休止している細胞においてＩＬ６を減少するための能力を示した(表4、実施例３参照)。
【００７３】
ここで開示され、クレーム化された全ての構成及び方法は、この開示からみると、不適当な実験なしで作成され、達成され得る。好ましい実施例という観点で本発明の構成及び/或いは方法が述べられたが、バリエーションがこの構成及び方法、及び過程、即ち本願の範囲及び内容、精神から離れることなくここで述べられた一連の方法の過程で適用され得ることは当業者にとって明白である。より具体的には、化学的そして生理学的に関連する特定の製剤がここで述べられた製剤に代用され得る、そして同じ、又は似たような結果をもたらす。当業者にとって明白な全てのそのような似た代用品は、この発明の範囲内であるとみなされる。
【００７４】
本願中の全ての特許及び公開は全て引用をもって本願に記載加入される。
【００７５】
参考文献
Braff MH, Gallo RL (2006). Antimicrobial peptides: an essential component of the skin defensive barrier. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 306:91-110.
Enoch S, Price P (2004). Cellular, molecular and biochemical differences in the pathophysiology of healing between acute wounds, chronic wounds and wounds in the aged. World Wide Wounds. Online: www.worldwidewounds.com.
Fisher GJ, Kang S, Varani J, Bata-Csorgo Z, Wan Y, Datta S, Voorhees JJ (2002). Mechanisms ofphotoaging and chronological skin aging. Arch. Dermatol. 138:1462-1470.
Kyte J, Doolittle RF (1982). A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. MoI. Biol. 157:105-132.
Lee PH, Rudisill JA, Lin KH, Zhang L, Harris SM, Falla TJ, Gallo RL (2004). HB-107, a nonbacteriostatic fragment of the antimicrobial peptide cecropin B, accelerates murine wound repair. Wound Repair Regen. 12:351-358.
Liechty KW, Adzick NS, Crombleholme TM (2000). Diminished interleukin 6 (IL-6) production during scarless human fetal wound repair. Cytokine. 12:671-676.
Martin P, Leibovich SJ (2005). Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends Cell Biol. 15:599-607.
Mustoe TA, Cutler NR, Allman RM, Goode PS, Deuel TF, Prause JA, Bear M, Serdar CM, Pierce GF (1994). A phase II study to evaluate recombinant platelet-derived growth factor-BB in the treatment of stage 3 and 4 pressure ulcers. Arch. Surg. 129:213-219.
Oyama N, Sekimata M, Nihei Y, Iwatsuki K, Homma Y, Kaneko F (1998). Different growth properties in response to epidermal growth factor and interleukin-6 of primary keratinocytes derived from normal and psoriatic lesional skin. J. Dermatol. Sci. 16:120- 128.
Pelicci PG (2004). Do tumor-suppressive mechanisms contribute to organism aging by inducing stem cell senescence? J. Clin. Invest. 113:4-7.
Presland RB, Dale BA (2000). Epithelial structural proteins of the skin and oral cavity: function in health and disease. CHt. Rev. Oral Biol. Med. 11 :383-408.
Sato S, Hasegawa M, Takehara K (2001). Serum levels of interleukin-6 and interleukin-10 correlate with total skin thickness score in patients with systemic sclerosis. J. Dermatol. Sci. 27:140-146.
Shaykhiev R, Beisswenger C, Kandler K, Senske J, Puchner A, Damm T, Behr J, BaIs R (2005). Human endogenous antibiotic LL-37 stimulates airway epithelial cell proliferation and wound closure. Am J. Physiol. Lung Cell MoI. Physiol. 289:L842-L848.
Steed DL (1995). Clinical evaluation of recombinant human platelet-derived growth factor for the treatment of lower extremity diabetic ulcers. Diabetic Ulcer Study Group. J. Vase. Surg. 21 :71-78.
Sugawara T, Gallucci RM, Simeonova PP, Luster MI (2001). Regulation and role of interleukin 6 in wounded human epithelial keratinocytes. Cytokine. 15:328-336.
Sweitzer SM, Fann SA, Borg TK, Baynes JW, Yost MJ (2006). What is the future of diabetic wound care? Diabetes Educ. 32:197-210.
Zhang L, Falla TJ (2006). Antimicrobial peptides: therapeutic potential. Expert Opin. Pharmacother. 7:653-663.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ペプチドであって、ペプチドは、配列番号１の４〜１４の隣接アミノ酸残基からなる単離ペプチド。
【請求項２】
ペプチドは、Ｌアミノ酸鏡像体及びＤアミノ酸鏡像体の何れか又は両方である請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドは、担体分子と結合、アミノ化又は脂質化される請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
アミノ末端部が、メチオニン、バリン、リジン或いはグルタミン酸塩アミノ酸残基である請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
カルボキシ末端部が、リジン、バリン、グリシンまたはアスパラギンアミノ酸残基である請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
ペプチドは、配列番号３を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
ペプチドは、配列番号６を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
ペプチドは、配列番号１２を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は、配列番号１５である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は、配列番号１２である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、又は、配列番号９である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
ペプチドは、配列番号３又は配列番号６である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１３】
ペプチドは、配列番号１２である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
ペプチドは、配列番号８又は配列番号１５である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１５】
請求項１に記載の少なくとも１のペプチドと薬学的に許容できるキャリアを含む組成物。
【請求項１６】
ペプチドは、約０.１μg/mLから約５０μg/mLの濃度範囲で存在する請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ペプチドは、約０.１μg/mLから約２０μg/mLの濃度範囲で存在する請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
組成物は、エアゾール、エマルジョン、液体、ローション、クリーム、ペースト、軟膏、粉又は泡の形態である請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１５である請求項１５に記載のペプチド。
【請求項２０】
哺乳類の創傷を治癒する方法であって、哺乳類の創傷に、治療に効果的な量の請求項１５に記載の組成物を、効果的な時間投与することを含んでいる、哺乳類の創傷を治癒する方法。
【請求項２１】
組成物は、創傷に投与され、前記哺乳類の皮膚又は粘膜組織に影響を与える請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
組成物は、擦り傷、水膨れ、やけど、裂傷、潰瘍、打撲、発疹、傷跡、又は、エージング若しくは環境曝露による影響に起因する創傷に投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
治療に効果的な量の組成物は、約０.１μg/mLから約５０μg/mLの濃度範囲のペプチドを含んでいる請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
組成物のペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は、配列番号１５である請求項２０に記載の方法。
【請求項１】
単離ペプチドであって、ペプチドは、配列番号１の４〜１４の隣接アミノ酸残基からなる単離ペプチド。
【請求項２】
ペプチドは、Ｌアミノ酸鏡像体及びＤアミノ酸鏡像体の何れか又は両方である請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドは、担体分子と結合、アミノ化又は脂質化される請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
アミノ末端部が、メチオニン、バリン、リジン或いはグルタミン酸塩アミノ酸残基である請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
カルボキシ末端部が、リジン、バリン、グリシンまたはアスパラギンアミノ酸残基である請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
ペプチドは、配列番号３を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
ペプチドは、配列番号６を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
ペプチドは、配列番号１２を含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は、配列番号１５である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は、配列番号１２である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、又は、配列番号９である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
ペプチドは、配列番号３又は配列番号６である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１３】
ペプチドは、配列番号１２である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
ペプチドは、配列番号８又は配列番号１５である請求項１に記載のペプチド。
【請求項１５】
請求項１に記載の少なくとも１のペプチドと薬学的に許容できるキャリアを含む組成物。
【請求項１６】
ペプチドは、約０.１μg/mLから約５０μg/mLの濃度範囲で存在する請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ペプチドは、約０.１μg/mLから約２０μg/mLの濃度範囲で存在する請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
組成物は、エアゾール、エマルジョン、液体、ローション、クリーム、ペースト、軟膏、粉又は泡の形態である請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１５である請求項１５に記載のペプチド。
【請求項２０】
哺乳類の創傷を治癒する方法であって、哺乳類の創傷に、治療に効果的な量の請求項１５に記載の組成物を、効果的な時間投与することを含んでいる、哺乳類の創傷を治癒する方法。
【請求項２１】
組成物は、創傷に投与され、前記哺乳類の皮膚又は粘膜組織に影響を与える請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
組成物は、擦り傷、水膨れ、やけど、裂傷、潰瘍、打撲、発疹、傷跡、又は、エージング若しくは環境曝露による影響に起因する創傷に投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
治療に効果的な量の組成物は、約０.１μg/mLから約５０μg/mLの濃度範囲のペプチドを含んでいる請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
組成物のペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は、配列番号１５である請求項２０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５１５６７９（Ｐ２０１０−５１５６７９Ａ）
【公表日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４４８５５（Ｐ２００９−５４４８５５）
【出願日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２６３６８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８５４９４
【国際公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【出願人】（３０９０２１４９０）へリックス バイオメディックス インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２６３６８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８５４９４
【国際公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【出願人】（３０９０２１４９０）へリックス バイオメディックス インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]