細菌の破砕方法
【課題】強固な細胞壁を持つ細菌芽胞内部の構成成分を溶液中に取り出す。
【解決手段】細菌芽胞内部の構成成分を液中に放出させる処理において、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で激しく振とうすることを特徴とする、細菌芽胞の破砕方法、及び破砕用試薬キット。
【解決手段】細菌芽胞内部の構成成分を液中に放出させる処理において、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で激しく振とうすることを特徴とする、細菌芽胞の破砕方法、及び破砕用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の研究やその応用に重要な細菌芽胞内部の構成成分の抽出技術に関する。細菌芽胞内部の構成成分とは、細菌芽胞内部に存在する、水等の溶媒に可溶な物質全てを指すが、本発明において特に重要なものは、細菌の検査や研究に特に有用な核酸、タンパク質、多糖類等の高分子成分である。本発明は、細菌芽胞の菌種同定や遺伝子解析等に際して特に有用であり、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
【背景技術】
【０００２】
細菌は一般的に、それぞれの菌種に特徴的な細胞壁を有しており、研究や検査等の目的で細胞内の核酸やタンパク質を取り出すには特殊な処理が必要である。一般的に研究に用いられる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）やその類縁菌については、分子生物学の実験手法を紹介したＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｌｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）等にも記載されているが、それ以外の菌種については、各分野の研究者が大腸菌の手法等も参考にしながら、独自に工夫をしているのが現状である。
【０００３】
細菌の中には、「芽胞」或いは「胞子」と呼ばれる細胞形態を形成するものがある（以下、「芽胞」と呼ぶ）。特に有名なところでは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）や炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）等のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌があげられる。これらの細菌は貧栄養状態に晒されると不等分裂により芽胞を形成し、貧栄養や乾燥等の悪条件に耐える形態をとる（蛋白質核酸酵素４３巻１２８９頁、１９９８年、共立出版）。芽胞の細胞壁は極めて強固であり、大腸菌などで用いられるリゾチームやプロテアーゼＫ等の各種酵素類、フェノールなどの変性剤、加熱処理等もほとんど効果がない。
【０００４】
一方で細菌芽胞内部の構成成分を取り出すという需要は存在する。枯草菌は納豆生産に使われる納豆菌の類縁菌で、研究用途に広く使用されている。更に重要なのが病原菌である炭疽菌である。炭疽菌は急性敗血症である炭疽の病原体である。炭疽は主に牛や馬等の草食動物に発症し、家畜に被害をもたらすが、人にも感染する人畜共通感染症である。２００１年１０月、アメリカ合衆国において炭疽菌芽胞を郵便物に封入して送りつけるテロ事件が発生した。乾燥に耐える炭疽菌芽胞は扱いが容易で、犯罪に使われやすいと考えられる。不審な粉末の検査のみならず、散布された炭疽菌芽胞をいち早く検知するには、迅速で高感度の検査方法が望まれる。
【０００５】
迅速な検出方法としては、例えば炭疽菌芽胞表面構成成分に特異的に結合する抗体を用いたイムノクロマト法等も挙げられる。しかし、抗原抗体反応は感度に限界があり、例えば散布され拡散した状態等では十分に検出できない恐れがある。その点、核酸検出はポリメラーゼ連鎖反応（いわゆるＰＣＲ）等による検出対象物（すなわち核酸）の増幅が可能であるので、非常に高感度を期待することが出来る。ただ、ＰＣＲを検査に用いることは古くから考案されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０巻１３５０頁、１９８５年）が、迅速性においては、ＰＣＲの温度変化を高速に実現する必要があった。これについては例えば、近年、米国Ｍｅｇａｂａｓｅ社によって、高速なＰＣＲが可能となる装置が開発される等（ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ６，４７２，１８６、或いはＮａｔｕｒｅ ４３５巻２３５頁、２００５年）、ＰＣＲ自体の迅速実行が可能になってきた。これに迅速な核酸抽出技術を組み合わせれば、迅速で高感度な検出システムの完成が期待できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、ＰＣＲ技術を応用して例えば炭疽菌芽胞を検出対象とした高感度な迅速検出システムを構築しようとする場合、細菌芽胞内部の構成成分である核酸を反応可能な状態に取り出す必要があるが、前述したように細菌芽胞に対してはその強固な細胞壁構造故に、有効かつ実用的な核酸抽出技術が存在しなかった。研究の為に遺伝子を取り出す等であれば、芽胞を培養して栄養体（細胞分裂等を行う通常の形態）の状態にして処理すればよい場合もあるが、芽胞状態の迅速検出システムには不向きである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記事情に鑑み、各種酵素処理、化学処理、物理的処理等広範囲に渡り鋭意研究の結果、細菌芽胞懸濁液を微細なガラス粒子と混在させた状態で激しく振とうする手法が有効であることを見出し、その条件を鋭意検討して本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程を備えた細菌芽胞の破砕方法であって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうすることを特徴とする、細菌芽胞の破砕方法である。
さらに、硬質な物質が、直径０．５ｍｍ以下のガラス粒子であることを特徴とする、細菌芽胞の破砕方法である。
さらに、可溶化させる細菌芽胞内部の構成成分が核酸であることを特徴とする、細菌芽胞の破砕方法である。
さらに、細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程を備えた細菌芽胞の破砕用試薬キットであって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうすることを特徴とする、細菌芽胞の破砕用試薬キットである。
さらに、硬質な物質が、直径０．５ｍｍ以下のガラス粒子であることを特徴とする、細菌芽胞の破砕用試薬キットである。
さらに、可溶化させる細菌芽胞成分が核酸であることを特徴とする、細菌芽胞の破砕用試薬キットである。
さらに、細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程と、可溶化した物質を測定する第三工程とを備えた細菌の検査方法であって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうし、その後、硬質な物質や細胞残渣を除去した上清を測定することを特徴とする細菌の検査方法である。
さらに、検査技術に核酸増幅技術であるポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、請求項７記載の細菌の検査方法である。
さらに、細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程と、可溶化した物質を測定する第三工程とを備えた細菌の検査キットであって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうし、その後、硬質な物質や細胞残渣を除去した上清を測定することを特徴とする細菌の検査キットである。
さらに、検査技術に核酸増幅技術であるポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、の細菌の検査キットである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、極めて高感度で迅速な細菌芽胞の検出システムを提供できることが明らかとなった。本発明の方法は、農林畜産、保健衛生、防衛防犯等、様々な分野で多大の利益をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、細菌芽胞の最も代表的なモデル系である枯草菌芽胞を材料として、様々な処理を施し、どの程度ＰＣＲで検出できる状態になっているかを検証することで、適切な細菌芽胞の核酸抽出方法を探索した。まず細菌細胞壁溶解の定法に従い、リゾチームを始めとする各種溶菌酵素処理を検討したが、芽胞に有効な酵素を見出すことは出来なかった。加えて、酵素処理は時間を要し、迅速という要件に合致しなかった。次に、フェノール等の化学物質による変性処理を検討したが、これも有効なものはなかった。また、化学処理は後工程でこれを除く操作が必要となり、やはり迅速性に欠けるものであった。これらの結果から、何らかの物理エネルギーによる処理が最も適切と考えられた。
【００１１】
物理エネルギーによる代表的なものは熱である。だが、単純な加熱処理（煮沸）は芽胞に対して全く無効であった。もともと細菌芽胞は熱に強いといわれ、死滅させるには高温高圧が必要とされているが、高温高圧では中の核酸が分解してしまい適当ではない。次に水浴中での超音波照射を検討したが、これもあまり有効ではなかった。
【００１２】
検討を続けた結果、細菌芽胞の懸濁液を硬質な物質と混在させて振とうさせる手法に一定の効果を見出した。そこでさらに条件を検討したところ、硬質な物質として球状のガラス粒子が最適であること、ガラス粒子は細かい方が良く、少なくとも直径０．５ｍｍ以下、望ましくは直径０．１ｍｍ程度のものが最適であると判明した。振とう方法としては、卓上のいわゆるボルテックスミキサーでも良いが、強力な振とうが可能な専用の装置が最も効率的であった。また、興味深いことに、振とうの手段として超音波照射も有効であった。超音波自体は芽胞破砕に効果が無かったが、ガラス粒子を振動させる手段として活用できることがわかった。
【００１３】
原理的には、ガラス粒子との「摩擦」が、芽胞の細胞壁を効率よく破砕していると考えられる。つまり、振とうでガラス粒子がぶつかり擦れあい、その間に細菌の芽胞が挟まれて擦られることで細胞壁が破砕され、内容物が溶出されているのである。そのため、砂のような形状よりも球状の粒子の方が良く、また重量当たりの表面積が大きくなる小粒子径の方が良い結果も説明できる。但し、直径０．１ｍｍ未満のガラス粒子は入手が困難な他、粉末としても扱いにくく、更に試料から除去する際に沈殿しにくいため、少なくとも直径０．５ｍｍ以下、望ましくは直径０．１ｍｍ程度が適当と考えられる。また、粒子の材質としては金属も考えられるが、金属は一般にガラスより硬度が低く、適性は劣ると考えられる。また、後の酵素反応を阻害するような金属イオンの溶出も懸念される。結論として、少なくとも直径０．５ｍｍ以下、望ましくは直径０．１ｍｍ程度の球状のガラス粒子を用いて、懸濁液を出来るだけ激しく振とうすることが重要である。
【００１４】
本発明の更なる利点は、処理に一切の化学物質を使用しないことである。そのため、それらを除去する工程が不要である。勿論、血液等、元の試料に多量の夾雑物が含まれている場合はそれらを除く必要があるが、芽胞以外に不純物の少ない懸濁液ならば、本発明の処理後にそのままＰＣＲ等の検査に用いることが出来る。卓上のボルテックスミキサーでも６０秒程度、専用の振とう装置であれば３０秒以内で核酸抽出処理が終了する。前述した高速ＰＣＲ技術と組み合わせれば、全ての工程は１０〜１５分で終了する。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１６】
実施例 枯草菌芽胞を用いた破砕方法の比較
１．枯草菌芽胞の入手
枯草菌芽胞は、懸濁液をメルク社より購入（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｓｐｏｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｒ ｔｅｓｔ、Ｍｅｒｃｋ コード１．１０６４９．）した。この懸濁液を必要に応じて滅菌水で希釈し、様々な破砕処理を検討するサンプルとした。実際に実施した破砕処理や結果は後述する。芽胞破砕の効果を評価するため、破砕後に遠心（１５０００ｒｐｍ ５分）して未破砕の芽胞や破砕残渣、粒子等を加えていればその粒子を沈殿させた上で、芽胞内に存在していたゲノムＤＮＡが上清中にどれだけ溶け出しているかをＰＣＲで検出する。
【００１７】
２．枯草菌ゲノムＤＮＡを検出するプライマーの合成
ＰＣＲに用いるプライマーとして、配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー１と示す）および配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー２と示す）を合成した。合成はプロリゴ・ジャパン株式会社に依頼した。本プライマーセットを用いたＰＣＲにより、枯草菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に存在する配列９２塩基対を増幅する。
【００１８】
３．ＰＣＲ試薬の調製及びＰＣＲの実施と解析
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績株式会社、コードＱＰＫ−２０１、以下、Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと記載）とプライマーを用いて、ＰＣＲ反応液を調製した。
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ５μＬ
プライマー１ ６ｐｍｏｌ
プライマー２ ６ｐｍｏｌ
枯草菌芽胞破砕液上清 １μＬ
滅菌水にて最終液量１０μＬに調整した。
調製したＰＣＲ反応液を、市販のリアルタイムＰＣＲ装置であるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）に装てんし、以下のような条件で４０サイクルＰＣＲを実施した。
９５℃ １５秒 →（９５℃ １秒／６０℃ １秒／７２℃ １５秒）４０サイクル
装置の使用方法は取扱説明書に従い、付属の解析ソフトウエアで、各サンプルのＣｐ値を算出した。Ｃｐ値とは、増幅の進行に従って増加する蛍光シグナルが、ある閾値を越えた時のサイクル数であり、元のサンプルに含まれる標的ＤＮＡ（この場合は枯草菌のゲノムＤＮＡ）が多いほど、増幅が速く進むためＣｐ値は小さくなる。従って、Ｃｐ値が小さいほど、元のサンプルが濃い、すなわち枯草菌ゲノムＤＮＡが多く溶出されているということになる。原理的には、ＰＣＲは１サイクルで倍にする反応なので、Ｃｐ値が１小さくなると、濃度はおよそ倍ということになる。
【００１９】
４．破砕方法の比較
枯草菌芽胞懸濁液（１０００ＣＦＵ／μＬ、ＣＦＵとはコロニーフォーミングユニットの略で、生菌数を示す）３００μＬを、以下に示す方法で処理し、芽胞破砕の効果を比較した。破砕処理以外は上記１．〜３．のプロセスに従った。ｂ、ｃは容器に２ｍLマイクロチューブを用いたが、ｄはホモジナイザーの形状から１．５ｍLマイクロチューブを使用した。
ａ：未処理（そのまま遠心し、上清をＰＣＲ）
ｂ：ＭａｔｒｉｘＡ（市販キットの破砕剤、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社、コード６９１０−０５０）添加し、ボルテックスミキサー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ２、振とう強度Ｍａｘに設定）で６０秒振とう
ｃ：直径０．１ｍｍガラス粒子（ＷＡＢ社、コードＭＫ−１ＧＸ）２００ｍｇ添加し、ボルテックスミキサー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ２、振とう強度Ｍａｘに設定）で６０秒振とう
ｄ：マイクロチューブ用ホモジナイザー（Ｐｅｓｔｌｅ、東洋紡績株式会社、コードＨＭＸ−３０１）で用手にて上下回転動作を１００回実施
「破砕方法の比較」の結果を表１に示す。芽胞の生成過程で親細胞のゲノムＤＮＡが残るため、未処理のａでもＣｐ値が算出されるが、今回実施した芽胞の破砕処理（ｂ、ｃ、ｄ）はいずれもａよりもＣｐ値が小さくなり、芽胞破砕の効果があったことになる。特に本発明であるｃは他の方法に比べて抜きん出た効果を示しており、未処理に対して５サイクル、すなわち２の５乗＝３２倍の濃度を示している。他の方法（ｂ、ｄ）は本発明に比べ３サイクル遅くなっており、すなわち本発明の８分の１しか破砕できていないことになる。
【００２０】
【表１】
【００２１】
５．ガラス粒子の比較
枯草菌芽胞懸濁液（１００００ＣＦＵ／μＬ）３００μＬを２ｍLマイクロチューブに入れ、以下に示すガラス粒子２００ｍｇを添加し、ボルテックスミキサー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ２、振とう強度Ｍａｘに設定）で６０秒振とうして、芽胞破砕の効果を比較した。破砕処理以外は上記１．〜３．のプロセスに従った。
ａ：未処理
ｂ：ＭＫ−１ＧＸ（ＷＡＢ社、直径０．１ｍｍ）
ｃ：ＧＢ−０１（和研薬株式会社、直径０．１ｍｍ）
ｄ：ＧＢ−０５（和研薬株式会社、直径０．５ｍｍ）
ｅ：ＧＢ−１０（和研薬株式会社、直径１．０ｍｍ）
「ガラス粒子の比較」の結果を表２に示す。直径０．１ｍｍのｂとｃがほぼ同程度であり、メーカーに関わらず直径０．１ｍｍ程度のガラス粒子が最適であることが示された。これにより、特段の効果を得るためには、少なくとも直径０．５ｍｍ以下、望ましくは直径０．１ｍｍ程度のガラス粒子を使用する必要があると考えられる。また、本実験では元の枯草菌懸濁液を４の実験の１０倍濃度にしたが、Ｃｐ値が全体に低くなっただけで、傾向はほぼ同一（未処理に比較して５サイクル程度小さくなる）であった。これは、本発明が広範な芽胞濃度に対応可能であることを示している。
【００２２】
【表２】
【００２３】
６．振とう装置と方法の検討
枯草菌芽胞懸濁液（４００ＣＦＵ／μＬ）３００μＬを２ｍLマイクロチューブに入れ、ガラス粒子ＧＢ−０１ ２００ｍｇを添加したもの（ｃ、ｅ）としないもの（ｂ、ｄ）を用意し、超音波洗浄機（本多電子株式会社、Ｗ−１０３Ｔ）の水浴でチューブの外から超音波を６０秒当てた（ｂ、ｃ）場合と、振とう装置（和研薬株式会社、ＢＳ−１２）で５５００ｒｐｍ ３０秒振とうした場合で比較した。破砕処理以外は上記１．〜３．のプロセスに従った。
ａ：未処理
ｂ：超音波
ｃ：ガラス粒子を加えて超音波
ｄ：振とう装置
ｅ：ガラス粒子を加えて振とう装置
「振とう装置と方法の検討」の結果を表３に示す。超音波のみ（ｂ）では全く効果がなく、振とうのみ（ｄ）もほとんど効果がないのに対し、ガラス粒子を加えて振とうする本発明（ｅ）は高い効果を示している。ＢＳ−１２は振とう強度が強いので、ボルテックスミキサーよりも短時間に高い効果をあげることが出来た。また、興味深いことに、ガラス粒子を加えて超音波を当てる（ｃ）と比較的高い効果があった。６０秒当てて振とう装置の３０秒に及ばないので効率は劣っているが、ガラスビーズを振とうさせる方法として超音波も有用であることが示されている。
【００２４】
【表３】
【００２５】
７．振とう時間と条件の検討
枯草菌芽胞懸濁液（１００００ＣＦＵ／μＬ）３００μＬを２ｍL或いは１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、ガラス粒子ＧＢ−０１ ２００ｍｇを添加して、振とう装置（和研薬株式会社、ＢＳ−１２）にて５５００ｒｐｍ或いは２０００ｒｐｍで振とうした。この際、一定時間毎に取り出して遠心し、上清を採取して経時的に上清へのゲノムＤＮＡの溶出量を測定した。破砕処理以外は上記１．〜３．のプロセスに従った。
ａ：２ｍＬチューブ使用、５５００ｒｐｍ
ｂ：１．５ｍＬチューブ使用、５５００ｒｐｍ
ｃ：２ｍＬチューブ使用、２０００ｒｐｍ
ｄ：１．５ｍＬチューブ使用、２０００ｒｐｍ
ｅ：１．５ｍＬチューブ使用、ボルテックスミキサー使用（６０秒のみ）
「振とう時間と条件の検討」の結果を表４、グラフを図１に示す。ＢＳ−１２の最大設定振とう強度である５５００ｒｐｍでは、チューブの種類に関わらず、２０秒で大きな破砕効果が得られ、その後は一定となっている。すなわち、２０秒で殆どの芽胞が破砕されたものと考えられる。緩やかな条件である２０００ｒｐｍでは、２０秒でかなりの効果を得ているものの、その後も時間毎に溶出が続いていることがわかる。また、１．５ｍＬよりも２ｍＬチューブの方が効率良く、容器形状は効率に多少の影響をもたらすことが判った。ボルテックスミキサーはＢＳ−１２の２０００ｒｐｍとほぼ同程度の効率と考えられる。本結果より、本発明では適切な振とう条件を確保すれば、僅か２０秒で殆どの芽胞を破砕し、内容物を溶出させることが出来ると判明した。
【００２６】
【表４】
【００２７】
８．振とう装置の検討
枯草菌芽胞懸濁液（１０００ＣＦＵ／μＬ）３００μＬを２ｍLマイクロチューブに入れ、ガラス粒子ＧＢ−０１ ２００ｍｇを添加して、別のメーカーの振とう装置２機種（バイオメディカルサイエンス社 Ｓｈａｋｅｍａｎ ＢＭＳ−ＳＭＮ０２、ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社 ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０）のそれぞれ２条件（設定できる最大と最小の振とう強度）で振とうした。この際、一定時間毎に取り出して遠心し、上清を採取して経時的に上清へのゲノムＤＮＡの溶出量を測定した。破砕処理以外は上記１．〜３．のプロセスに従った。
ａ：ＳＭＮ−０２、３５００ｒｐｍ
ｂ：ＳＭＮ−０２、２５００ｒｐｍ
ｃ：ＦＰ−１２０、６．５ｍ／ｓ
ｄ：ＦＰ−１２０、４．０ｍ／ｓ
「振とう装置の検討」の結果を表５、グラフを図２に示す。両装置とも６０秒程度で一定に達し、殆どの芽胞が破砕されていると考えられる。ＦＰ−１２０の方が若干効率良く、最大強度で４０秒程度で終了している。本結果は、本発明が、ある程度の振とうが可能であれば効率に差はあるものの実施可能であることを示しており、実用上の汎用性を証明するものである。
【００２８】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によって、芽胞を形成する細菌の検出や定量、タイピングなどを迅速・正確に実施することが可能となり、これらの細菌の研究、現地での環境検査、緊急を要する食品検査など幅広い用途分野に利用することが出来、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】「振とう時間と条件の検討」表４の結果をグラフ化したものである。
【図２】「振とう装置の検討」表６の結果をグラフ化したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の研究やその応用に重要な細菌芽胞内部の構成成分の抽出技術に関する。細菌芽胞内部の構成成分とは、細菌芽胞内部に存在する、水等の溶媒に可溶な物質全てを指すが、本発明において特に重要なものは、細菌の検査や研究に特に有用な核酸、タンパク質、多糖類等の高分子成分である。本発明は、細菌芽胞の菌種同定や遺伝子解析等に際して特に有用であり、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
【背景技術】
【０００２】
細菌は一般的に、それぞれの菌種に特徴的な細胞壁を有しており、研究や検査等の目的で細胞内の核酸やタンパク質を取り出すには特殊な処理が必要である。一般的に研究に用いられる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）やその類縁菌については、分子生物学の実験手法を紹介したＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｌｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）等にも記載されているが、それ以外の菌種については、各分野の研究者が大腸菌の手法等も参考にしながら、独自に工夫をしているのが現状である。
【０００３】
細菌の中には、「芽胞」或いは「胞子」と呼ばれる細胞形態を形成するものがある（以下、「芽胞」と呼ぶ）。特に有名なところでは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）や炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）等のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌があげられる。これらの細菌は貧栄養状態に晒されると不等分裂により芽胞を形成し、貧栄養や乾燥等の悪条件に耐える形態をとる（蛋白質核酸酵素４３巻１２８９頁、１９９８年、共立出版）。芽胞の細胞壁は極めて強固であり、大腸菌などで用いられるリゾチームやプロテアーゼＫ等の各種酵素類、フェノールなどの変性剤、加熱処理等もほとんど効果がない。
【０００４】
一方で細菌芽胞内部の構成成分を取り出すという需要は存在する。枯草菌は納豆生産に使われる納豆菌の類縁菌で、研究用途に広く使用されている。更に重要なのが病原菌である炭疽菌である。炭疽菌は急性敗血症である炭疽の病原体である。炭疽は主に牛や馬等の草食動物に発症し、家畜に被害をもたらすが、人にも感染する人畜共通感染症である。２００１年１０月、アメリカ合衆国において炭疽菌芽胞を郵便物に封入して送りつけるテロ事件が発生した。乾燥に耐える炭疽菌芽胞は扱いが容易で、犯罪に使われやすいと考えられる。不審な粉末の検査のみならず、散布された炭疽菌芽胞をいち早く検知するには、迅速で高感度の検査方法が望まれる。
【０００５】
迅速な検出方法としては、例えば炭疽菌芽胞表面構成成分に特異的に結合する抗体を用いたイムノクロマト法等も挙げられる。しかし、抗原抗体反応は感度に限界があり、例えば散布され拡散した状態等では十分に検出できない恐れがある。その点、核酸検出はポリメラーゼ連鎖反応（いわゆるＰＣＲ）等による検出対象物（すなわち核酸）の増幅が可能であるので、非常に高感度を期待することが出来る。ただ、ＰＣＲを検査に用いることは古くから考案されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０巻１３５０頁、１９８５年）が、迅速性においては、ＰＣＲの温度変化を高速に実現する必要があった。これについては例えば、近年、米国Ｍｅｇａｂａｓｅ社によって、高速なＰＣＲが可能となる装置が開発される等（ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ６，４７２，１８６、或いはＮａｔｕｒｅ ４３５巻２３５頁、２００５年）、ＰＣＲ自体の迅速実行が可能になってきた。これに迅速な核酸抽出技術を組み合わせれば、迅速で高感度な検出システムの完成が期待できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、ＰＣＲ技術を応用して例えば炭疽菌芽胞を検出対象とした高感度な迅速検出システムを構築しようとする場合、細菌芽胞内部の構成成分である核酸を反応可能な状態に取り出す必要があるが、前述したように細菌芽胞に対してはその強固な細胞壁構造故に、有効かつ実用的な核酸抽出技術が存在しなかった。研究の為に遺伝子を取り出す等であれば、芽胞を培養して栄養体（細胞分裂等を行う通常の形態）の状態にして処理すればよい場合もあるが、芽胞状態の迅速検出システムには不向きである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記事情に鑑み、各種酵素処理、化学処理、物理的処理等広範囲に渡り鋭意研究の結果、細菌芽胞懸濁液を微細なガラス粒子と混在させた状態で激しく振とうする手法が有効であることを見出し、その条件を鋭意検討して本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程を備えた細菌芽胞の破砕方法であって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうすることを特徴とする、細菌芽胞の破砕方法である。
さらに、硬質な物質が、直径０．５ｍｍ以下のガラス粒子であることを特徴とする、細菌芽胞の破砕方法である。
さらに、可溶化させる細菌芽胞内部の構成成分が核酸であることを特徴とする、細菌芽胞の破砕方法である。
さらに、細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程を備えた細菌芽胞の破砕用試薬キットであって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうすることを特徴とする、細菌芽胞の破砕用試薬キットである。
さらに、硬質な物質が、直径０．５ｍｍ以下のガラス粒子であることを特徴とする、細菌芽胞の破砕用試薬キットである。
さらに、可溶化させる細菌芽胞成分が核酸であることを特徴とする、細菌芽胞の破砕用試薬キットである。
さらに、細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程と、可溶化した物質を測定する第三工程とを備えた細菌の検査方法であって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうし、その後、硬質な物質や細胞残渣を除去した上清を測定することを特徴とする細菌の検査方法である。
さらに、検査技術に核酸増幅技術であるポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、請求項７記載の細菌の検査方法である。
さらに、細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程と、可溶化した物質を測定する第三工程とを備えた細菌の検査キットであって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうし、その後、硬質な物質や細胞残渣を除去した上清を測定することを特徴とする細菌の検査キットである。
さらに、検査技術に核酸増幅技術であるポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、の細菌の検査キットである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、極めて高感度で迅速な細菌芽胞の検出システムを提供できることが明らかとなった。本発明の方法は、農林畜産、保健衛生、防衛防犯等、様々な分野で多大の利益をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、細菌芽胞の最も代表的なモデル系である枯草菌芽胞を材料として、様々な処理を施し、どの程度ＰＣＲで検出できる状態になっているかを検証することで、適切な細菌芽胞の核酸抽出方法を探索した。まず細菌細胞壁溶解の定法に従い、リゾチームを始めとする各種溶菌酵素処理を検討したが、芽胞に有効な酵素を見出すことは出来なかった。加えて、酵素処理は時間を要し、迅速という要件に合致しなかった。次に、フェノール等の化学物質による変性処理を検討したが、これも有効なものはなかった。また、化学処理は後工程でこれを除く操作が必要となり、やはり迅速性に欠けるものであった。これらの結果から、何らかの物理エネルギーによる処理が最も適切と考えられた。
【００１１】
物理エネルギーによる代表的なものは熱である。だが、単純な加熱処理（煮沸）は芽胞に対して全く無効であった。もともと細菌芽胞は熱に強いといわれ、死滅させるには高温高圧が必要とされているが、高温高圧では中の核酸が分解してしまい適当ではない。次に水浴中での超音波照射を検討したが、これもあまり有効ではなかった。
【００１２】
検討を続けた結果、細菌芽胞の懸濁液を硬質な物質と混在させて振とうさせる手法に一定の効果を見出した。そこでさらに条件を検討したところ、硬質な物質として球状のガラス粒子が最適であること、ガラス粒子は細かい方が良く、少なくとも直径０．５ｍｍ以下、望ましくは直径０．１ｍｍ程度のものが最適であると判明した。振とう方法としては、卓上のいわゆるボルテックスミキサーでも良いが、強力な振とうが可能な専用の装置が最も効率的であった。また、興味深いことに、振とうの手段として超音波照射も有効であった。超音波自体は芽胞破砕に効果が無かったが、ガラス粒子を振動させる手段として活用できることがわかった。
【００１３】
原理的には、ガラス粒子との「摩擦」が、芽胞の細胞壁を効率よく破砕していると考えられる。つまり、振とうでガラス粒子がぶつかり擦れあい、その間に細菌の芽胞が挟まれて擦られることで細胞壁が破砕され、内容物が溶出されているのである。そのため、砂のような形状よりも球状の粒子の方が良く、また重量当たりの表面積が大きくなる小粒子径の方が良い結果も説明できる。但し、直径０．１ｍｍ未満のガラス粒子は入手が困難な他、粉末としても扱いにくく、更に試料から除去する際に沈殿しにくいため、少なくとも直径０．５ｍｍ以下、望ましくは直径０．１ｍｍ程度が適当と考えられる。また、粒子の材質としては金属も考えられるが、金属は一般にガラスより硬度が低く、適性は劣ると考えられる。また、後の酵素反応を阻害するような金属イオンの溶出も懸念される。結論として、少なくとも直径０．５ｍｍ以下、望ましくは直径０．１ｍｍ程度の球状のガラス粒子を用いて、懸濁液を出来るだけ激しく振とうすることが重要である。
【００１４】
本発明の更なる利点は、処理に一切の化学物質を使用しないことである。そのため、それらを除去する工程が不要である。勿論、血液等、元の試料に多量の夾雑物が含まれている場合はそれらを除く必要があるが、芽胞以外に不純物の少ない懸濁液ならば、本発明の処理後にそのままＰＣＲ等の検査に用いることが出来る。卓上のボルテックスミキサーでも６０秒程度、専用の振とう装置であれば３０秒以内で核酸抽出処理が終了する。前述した高速ＰＣＲ技術と組み合わせれば、全ての工程は１０〜１５分で終了する。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１６】
実施例 枯草菌芽胞を用いた破砕方法の比較
１．枯草菌芽胞の入手
枯草菌芽胞は、懸濁液をメルク社より購入（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｓｐｏｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｒ ｔｅｓｔ、Ｍｅｒｃｋ コード１．１０６４９．）した。この懸濁液を必要に応じて滅菌水で希釈し、様々な破砕処理を検討するサンプルとした。実際に実施した破砕処理や結果は後述する。芽胞破砕の効果を評価するため、破砕後に遠心（１５０００ｒｐｍ ５分）して未破砕の芽胞や破砕残渣、粒子等を加えていればその粒子を沈殿させた上で、芽胞内に存在していたゲノムＤＮＡが上清中にどれだけ溶け出しているかをＰＣＲで検出する。
【００１７】
２．枯草菌ゲノムＤＮＡを検出するプライマーの合成
ＰＣＲに用いるプライマーとして、配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー１と示す）および配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー２と示す）を合成した。合成はプロリゴ・ジャパン株式会社に依頼した。本プライマーセットを用いたＰＣＲにより、枯草菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に存在する配列９２塩基対を増幅する。
【００１８】
３．ＰＣＲ試薬の調製及びＰＣＲの実施と解析
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡績株式会社、コードＱＰＫ−２０１、以下、Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと記載）とプライマーを用いて、ＰＣＲ反応液を調製した。
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ５μＬ
プライマー１ ６ｐｍｏｌ
プライマー２ ６ｐｍｏｌ
枯草菌芽胞破砕液上清 １μＬ
滅菌水にて最終液量１０μＬに調整した。
調製したＰＣＲ反応液を、市販のリアルタイムＰＣＲ装置であるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）に装てんし、以下のような条件で４０サイクルＰＣＲを実施した。
９５℃ １５秒 →（９５℃ １秒／６０℃ １秒／７２℃ １５秒）４０サイクル
装置の使用方法は取扱説明書に従い、付属の解析ソフトウエアで、各サンプルのＣｐ値を算出した。Ｃｐ値とは、増幅の進行に従って増加する蛍光シグナルが、ある閾値を越えた時のサイクル数であり、元のサンプルに含まれる標的ＤＮＡ（この場合は枯草菌のゲノムＤＮＡ）が多いほど、増幅が速く進むためＣｐ値は小さくなる。従って、Ｃｐ値が小さいほど、元のサンプルが濃い、すなわち枯草菌ゲノムＤＮＡが多く溶出されているということになる。原理的には、ＰＣＲは１サイクルで倍にする反応なので、Ｃｐ値が１小さくなると、濃度はおよそ倍ということになる。
【００１９】
４．破砕方法の比較
枯草菌芽胞懸濁液（１０００ＣＦＵ／μＬ、ＣＦＵとはコロニーフォーミングユニットの略で、生菌数を示す）３００μＬを、以下に示す方法で処理し、芽胞破砕の効果を比較した。破砕処理以外は上記１．〜３．のプロセスに従った。ｂ、ｃは容器に２ｍLマイクロチューブを用いたが、ｄはホモジナイザーの形状から１．５ｍLマイクロチューブを使用した。
ａ：未処理（そのまま遠心し、上清をＰＣＲ）
ｂ：ＭａｔｒｉｘＡ（市販キットの破砕剤、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社、コード６９１０−０５０）添加し、ボルテックスミキサー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ２、振とう強度Ｍａｘに設定）で６０秒振とう
ｃ：直径０．１ｍｍガラス粒子（ＷＡＢ社、コードＭＫ−１ＧＸ）２００ｍｇ添加し、ボルテックスミキサー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ２、振とう強度Ｍａｘに設定）で６０秒振とう
ｄ：マイクロチューブ用ホモジナイザー（Ｐｅｓｔｌｅ、東洋紡績株式会社、コードＨＭＸ−３０１）で用手にて上下回転動作を１００回実施
「破砕方法の比較」の結果を表１に示す。芽胞の生成過程で親細胞のゲノムＤＮＡが残るため、未処理のａでもＣｐ値が算出されるが、今回実施した芽胞の破砕処理（ｂ、ｃ、ｄ）はいずれもａよりもＣｐ値が小さくなり、芽胞破砕の効果があったことになる。特に本発明であるｃは他の方法に比べて抜きん出た効果を示しており、未処理に対して５サイクル、すなわち２の５乗＝３２倍の濃度を示している。他の方法（ｂ、ｄ）は本発明に比べ３サイクル遅くなっており、すなわち本発明の８分の１しか破砕できていないことになる。
【００２０】
【表１】
【００２１】
５．ガラス粒子の比較
枯草菌芽胞懸濁液（１００００ＣＦＵ／μＬ）３００μＬを２ｍLマイクロチューブに入れ、以下に示すガラス粒子２００ｍｇを添加し、ボルテックスミキサー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ２、振とう強度Ｍａｘに設定）で６０秒振とうして、芽胞破砕の効果を比較した。破砕処理以外は上記１．〜３．のプロセスに従った。
ａ：未処理
ｂ：ＭＫ−１ＧＸ（ＷＡＢ社、直径０．１ｍｍ）
ｃ：ＧＢ−０１（和研薬株式会社、直径０．１ｍｍ）
ｄ：ＧＢ−０５（和研薬株式会社、直径０．５ｍｍ）
ｅ：ＧＢ−１０（和研薬株式会社、直径１．０ｍｍ）
「ガラス粒子の比較」の結果を表２に示す。直径０．１ｍｍのｂとｃがほぼ同程度であり、メーカーに関わらず直径０．１ｍｍ程度のガラス粒子が最適であることが示された。これにより、特段の効果を得るためには、少なくとも直径０．５ｍｍ以下、望ましくは直径０．１ｍｍ程度のガラス粒子を使用する必要があると考えられる。また、本実験では元の枯草菌懸濁液を４の実験の１０倍濃度にしたが、Ｃｐ値が全体に低くなっただけで、傾向はほぼ同一（未処理に比較して５サイクル程度小さくなる）であった。これは、本発明が広範な芽胞濃度に対応可能であることを示している。
【００２２】
【表２】
【００２３】
６．振とう装置と方法の検討
枯草菌芽胞懸濁液（４００ＣＦＵ／μＬ）３００μＬを２ｍLマイクロチューブに入れ、ガラス粒子ＧＢ−０１ ２００ｍｇを添加したもの（ｃ、ｅ）としないもの（ｂ、ｄ）を用意し、超音波洗浄機（本多電子株式会社、Ｗ−１０３Ｔ）の水浴でチューブの外から超音波を６０秒当てた（ｂ、ｃ）場合と、振とう装置（和研薬株式会社、ＢＳ−１２）で５５００ｒｐｍ ３０秒振とうした場合で比較した。破砕処理以外は上記１．〜３．のプロセスに従った。
ａ：未処理
ｂ：超音波
ｃ：ガラス粒子を加えて超音波
ｄ：振とう装置
ｅ：ガラス粒子を加えて振とう装置
「振とう装置と方法の検討」の結果を表３に示す。超音波のみ（ｂ）では全く効果がなく、振とうのみ（ｄ）もほとんど効果がないのに対し、ガラス粒子を加えて振とうする本発明（ｅ）は高い効果を示している。ＢＳ−１２は振とう強度が強いので、ボルテックスミキサーよりも短時間に高い効果をあげることが出来た。また、興味深いことに、ガラス粒子を加えて超音波を当てる（ｃ）と比較的高い効果があった。６０秒当てて振とう装置の３０秒に及ばないので効率は劣っているが、ガラスビーズを振とうさせる方法として超音波も有用であることが示されている。
【００２４】
【表３】
【００２５】
７．振とう時間と条件の検討
枯草菌芽胞懸濁液（１００００ＣＦＵ／μＬ）３００μＬを２ｍL或いは１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、ガラス粒子ＧＢ−０１ ２００ｍｇを添加して、振とう装置（和研薬株式会社、ＢＳ−１２）にて５５００ｒｐｍ或いは２０００ｒｐｍで振とうした。この際、一定時間毎に取り出して遠心し、上清を採取して経時的に上清へのゲノムＤＮＡの溶出量を測定した。破砕処理以外は上記１．〜３．のプロセスに従った。
ａ：２ｍＬチューブ使用、５５００ｒｐｍ
ｂ：１．５ｍＬチューブ使用、５５００ｒｐｍ
ｃ：２ｍＬチューブ使用、２０００ｒｐｍ
ｄ：１．５ｍＬチューブ使用、２０００ｒｐｍ
ｅ：１．５ｍＬチューブ使用、ボルテックスミキサー使用（６０秒のみ）
「振とう時間と条件の検討」の結果を表４、グラフを図１に示す。ＢＳ−１２の最大設定振とう強度である５５００ｒｐｍでは、チューブの種類に関わらず、２０秒で大きな破砕効果が得られ、その後は一定となっている。すなわち、２０秒で殆どの芽胞が破砕されたものと考えられる。緩やかな条件である２０００ｒｐｍでは、２０秒でかなりの効果を得ているものの、その後も時間毎に溶出が続いていることがわかる。また、１．５ｍＬよりも２ｍＬチューブの方が効率良く、容器形状は効率に多少の影響をもたらすことが判った。ボルテックスミキサーはＢＳ−１２の２０００ｒｐｍとほぼ同程度の効率と考えられる。本結果より、本発明では適切な振とう条件を確保すれば、僅か２０秒で殆どの芽胞を破砕し、内容物を溶出させることが出来ると判明した。
【００２６】
【表４】
【００２７】
８．振とう装置の検討
枯草菌芽胞懸濁液（１０００ＣＦＵ／μＬ）３００μＬを２ｍLマイクロチューブに入れ、ガラス粒子ＧＢ−０１ ２００ｍｇを添加して、別のメーカーの振とう装置２機種（バイオメディカルサイエンス社 Ｓｈａｋｅｍａｎ ＢＭＳ−ＳＭＮ０２、ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社 ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０）のそれぞれ２条件（設定できる最大と最小の振とう強度）で振とうした。この際、一定時間毎に取り出して遠心し、上清を採取して経時的に上清へのゲノムＤＮＡの溶出量を測定した。破砕処理以外は上記１．〜３．のプロセスに従った。
ａ：ＳＭＮ−０２、３５００ｒｐｍ
ｂ：ＳＭＮ−０２、２５００ｒｐｍ
ｃ：ＦＰ−１２０、６．５ｍ／ｓ
ｄ：ＦＰ−１２０、４．０ｍ／ｓ
「振とう装置の検討」の結果を表５、グラフを図２に示す。両装置とも６０秒程度で一定に達し、殆どの芽胞が破砕されていると考えられる。ＦＰ−１２０の方が若干効率良く、最大強度で４０秒程度で終了している。本結果は、本発明が、ある程度の振とうが可能であれば効率に差はあるものの実施可能であることを示しており、実用上の汎用性を証明するものである。
【００２８】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によって、芽胞を形成する細菌の検出や定量、タイピングなどを迅速・正確に実施することが可能となり、これらの細菌の研究、現地での環境検査、緊急を要する食品検査など幅広い用途分野に利用することが出来、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】「振とう時間と条件の検討」表４の結果をグラフ化したものである。
【図２】「振とう装置の検討」表６の結果をグラフ化したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程を備えた細菌芽胞の破砕方法であって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうすることを特徴とする、細菌芽胞の破砕方法。
【請求項２】
硬質な物質が、直径０．５ｍｍ以下のガラス粒子であることを特徴とする、請求項１記載の細菌芽胞の破砕方法。
【請求項３】
可溶化させる細菌芽胞内部の構成成分が核酸であることを特徴とする、請求項１記載の細菌芽胞の破砕方法。
【請求項４】
細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程を備えた細菌芽胞の破砕用試薬キットであって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうすることを特徴とする、細菌芽胞の破砕用試薬キット。
【請求項５】
硬質な物質が、直径０．５ｍｍ以下のガラス粒子であることを特徴とする、請求項４記載の細菌芽胞の破砕用試薬キット。
【請求項６】
可溶化させる細菌芽胞成分が核酸であることを特徴とする、請求項４記載の細菌芽胞の破砕用試薬キット。
【請求項７】
細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程と、可溶化した物質を測定する第三工程とを備えた細菌の検査方法であって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうし、その後、硬質な物質や細胞残渣を除去した上清を測定することを特徴とする細菌の検査方法。
【請求項８】
検査技術に核酸増幅技術であるポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、請求項７記載の細菌の検査方法。
【請求項９】
細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程と、可溶化した物質を測定する第三工程とを備えた細菌の検査キットであって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうし、その後、硬質な物質や細胞残渣を除去した上清を測定することを特徴とする細菌の検査キット。
【請求項１０】
検査技術に核酸増幅技術であるポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、請求項７記載の細菌の検査キット。
【請求項１】
細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程を備えた細菌芽胞の破砕方法であって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうすることを特徴とする、細菌芽胞の破砕方法。
【請求項２】
硬質な物質が、直径０．５ｍｍ以下のガラス粒子であることを特徴とする、請求項１記載の細菌芽胞の破砕方法。
【請求項３】
可溶化させる細菌芽胞内部の構成成分が核酸であることを特徴とする、請求項１記載の細菌芽胞の破砕方法。
【請求項４】
細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程を備えた細菌芽胞の破砕用試薬キットであって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうすることを特徴とする、細菌芽胞の破砕用試薬キット。
【請求項５】
硬質な物質が、直径０．５ｍｍ以下のガラス粒子であることを特徴とする、請求項４記載の細菌芽胞の破砕用試薬キット。
【請求項６】
可溶化させる細菌芽胞成分が核酸であることを特徴とする、請求項４記載の細菌芽胞の破砕用試薬キット。
【請求項７】
細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程と、可溶化した物質を測定する第三工程とを備えた細菌の検査方法であって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうし、その後、硬質な物質や細胞残渣を除去した上清を測定することを特徴とする細菌の検査方法。
【請求項８】
検査技術に核酸増幅技術であるポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、請求項７記載の細菌の検査方法。
【請求項９】
細菌芽胞の細胞壁を破砕する第一工程と、細菌芽胞内部の構成成分を液中に可溶化させる第二工程と、可溶化した物質を測定する第三工程とを備えた細菌の検査キットであって、細菌芽胞懸濁液を硬質な物質と混在させた状態で振とうし、その後、硬質な物質や細胞残渣を除去した上清を測定することを特徴とする細菌の検査キット。
【請求項１０】
検査技術に核酸増幅技術であるポリメラーゼ連鎖反応を用いることを特徴とする、請求項７記載の細菌の検査キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１４８５６３（Ｐ２００８−１４８５６３Ａ）
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３３６６５７（Ｐ２００６−３３６６５７）
【出願日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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