組換え体Ｈ因子ならびにそのバリアントおよびコンジュゲート
本発明は、組換え体H因子ならびにそのバリアントおよびコンジュゲート、それらの製造方法に関し、加えて前記物質を含む治療用途および治療方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え体H因子ならびにそのバリアントおよびコンジュゲート、それらの製造方法に関し、加えて前記物質を含む治療用途および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系制御糖タンパク質、H因子(factor H（FH)）は、十分な量で生産され、適切な薬動力学的および薬力学的性質が付与されれば、新規生物医薬品（生物治療剤（biotherapeutic agent））として役立つことが、ますます多くの根拠によって示唆されている。この医薬品は、遺伝的に罹患しやすい個体における加齢黄斑変性(AMD)の発症を抑え、AMDならびに非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)およびデンスデポジット病(DDD)として知られる2つの生命を脅かす腎疾患を有する固体における治療を容易にする。さらに推論すれば、この医薬品は、不十分な補体制御が病因または症状に寄与する多数の他の疾患の治療または予防に有益な効果を発揮することができると考えられる。
【０００３】
しかしながら、組換え細胞における遺伝子の過剰発現によってFHを生産する現行の試みは、治療に必要な量を得ることに失敗しており、他方では、FHの適切なバリアントの十分な量をヒト血漿から精製することは、論理的にも技術的にも困難であり、健康リスクが存在する。最小限の免疫原性、長時間の半減期および最大の有効性を有する複数グラム量のFHの生物医薬品グレード組換え体バージョンの、まだ対処されていないさしせまった臨床的および商業的ニーズがある。
【０００４】
FHにおける多型と疾患に対する感受性との間の関連については、文書による十分な裏づけがあり、例えば:Opportunities for new therapies based on the natural regulators of complement activation. Brook E, Herbert AP, Jenkins HT, Soares DC, Barlow PN. ann N Y acad Sci 2005 1056:176-88; Complement factor H: using atomic resolution structure to illuminate disease mechanisms. Barlow PN, Hageman GS, Lea SM. adv Exp Med Biol. 2008 632:117-42; Translational mini-review series on complement factor H: renal diseases associated with complement factor H: novel insights from humans and animals. Pickering MC, Cook HT. Clin Exp Immunol 2008 151:210-30; Translational mini-review series on complement factor H: genetics and disease associations of human complement factor H. de Cordoba SR, de Jorge EG. Clin Exp Immunol. 2008 151:1-13 に概説されている。
【０００５】
これらの概説が公表されて以後、多数のさらなる公表された発見によって、FHベース治療の潜在的標的の範囲は広がっている。最近の2つの例は、FH遺伝子(CFH)多型(Y402H)と心血管疾患(CVD)に対する感受性との間の関連を立証している。Koeijvoets ら(Complement factor H Y402H decreases cardiovascular disease risk in patients with familial hypercholesterolaemia. Koeijvoets KC, Mooijaart SP, Dallinga-Thie GM, Defesche JC, Steyerberg EW, Westendorp RG, Kastelein JJ, van Hagen PM, Sijbrands EJ. Eur Heart J. 2009 30:618-23)は、高コレステロール血症によって早発性CVDのリスクが極めて高い患者の中で、Y402 CFHバリアントはCVDに対する感受性と逆相関することを示し、CFHはCVDのリスクを緩和することを示唆した。透析患者における末期の腎不全に関するBuraczynskaらによる研究(Complement factor H gene polymorphism and risk of cardiovascular disease in end-stage renal disease patients.Buraczynska M, Ksiazek P, Zukowski P, Benedyk-Lorens E, Orlowska-Kowalik G. Clin Immunol. 2009; 132:285-90)において、多変量ロジスティック回帰分析により、Y402H遺伝子型は、心血管合併症と独立して関連していることを示した。H402対立遺伝子の同型接合体では、オッズ比が7.28(95%CI 5.32〜9.95)であった。他の最近の新事実において、Moreno-Navarrete ら(Complement Factor H is expressed in adipose tissue in association with insulin resistance. Moreno-Navarrete JM, Martinez-Barricarte R, Catalan V, Sabater M, Gomez-ambrosi J, Ortega FJ, Ricart W, Bluher M, Fruhbeck G, de Cordoba SR, Fernandez-Real MJ. Diabetes 2009: Epub Oct 15)は、FHが、インスリン抵抗性と関連する脂肪組織において発現されることを示し、補体系の第二経路、肥満および代謝障害の間の関連を示唆した。
【０００６】
治療におけるFHの有効性を見込むデータは、すでに十分示されており、多数の開示、特許出願および会社設立が行われている。US2007/0020647は、種々の真核および原核タンパク質過剰生産ベクターならびに哺乳動物細胞株によるヒトCFHの発現を記載しているが、ヒト肺癌細胞株A549における発現が例示されているに過ぎない。この細胞株から得られる組換え体タンパク質の量は開示されていないが、前例に基づき、それとは反対の根拠がないことを考慮すれば、量は治療目的には不十分であると思われる。WO2007/038995は、aHUSを治療するためのヒトH因子の使用を説明している。この特許出願は、組換え体FHの使用について述べているが、組換え体FHの製造方法のついての詳細な説明はなく、ヒト血漿からのFHの精製に焦点が合わされている。
【０００７】
このように、上記の2つの文書は、組換え体FHを治療に使用するという考えを開示しているが、どちらの文書も、実際には、治療用途に絶対に必須である組換え体FHの大規模製造を教示していない。本明細書で説明するように、このことは簡単な仕事ではない。
【０００８】
機能活性が保持された純粋な組換え体完全長FHの大量(10mgを超える)製造の成功は、科学文献または特許文献において今まで報告されていない。実際、上記の特許を証拠立てるデータは限られており、これらの著者らは、わずかな量(約1mg未満)の組換え体FHを製造する能力を示したに過ぎず、彼らは、この物質を精製または解析したという根拠を示さなかった。さらにまた、文献報告は、同様に、昆虫および哺乳動物細胞からのミリグラム以下の量の組換え体FH(例えば、Biologically active recombinant human complement factor H: synthesis and secretion by the baculovirus system. Sharma AK, Pangburn MK. Gene 1994 143:301-2; Structural and functional characterization of factor H mutations associated with atypical hemolytic uremic syndrome. Sanchez-Corral P, Perez-Caballero D, Huarte O, Simckes AM, Goicoechea E, Lopez-Trascasa M, de Cordoba SR. Am J Hum Genet 2002 71:1285-95.)またはFH分子のフラグメントの発現(例えば、Structure of the N-terminal region of complement factor H and conformational implications of disease-linked sequence variations.Hocking HG, Herbert AP, Kavanagh D, Soares DC, Ferreira VP, Pangburn MK, Uhrin D, Barlow PN.J Biol Chem 2008 283:9475-87)をほのめかしている。
【０００９】
Ormsby, R. J. et al., Expression of human factor H in the methylotrophic yeast Pichia Pastoris. Molecular Immunology Vol 35, p.353, 1998 abstract 92. この論文は、本特許出願の対象である完全長TWENTY(20)CCP H因子タンパク質ではなく、FIVE(5)補体制御タンパク質(CCP)H因子フラグメントを発現するために、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)を用いている。
【００１０】
Ripoche, J. et al., The complete amino acid sequence of human complement Factor H. Biochemical Journal, Vol 249: 593-602, 1988. この論文は、完全長ヒトH因子ヌクレオチド配列を(従って、アミノ酸配列を)記載しており、その配列は、H因子遺伝子にまたがる3つのオーバーラップするcDNAクローンを配列決定することによって得られた。しかしながら、この論文は、機能性ヒトH因子タンパク質を発現するための遺伝子のクローニング方法を記載していない。
【００１１】
EP1336618は、医薬品として使用するための可溶性補体制御因子として完全長またはフラグメントのブタH因子を用いることを記載している。ブタH因子は、ブタ血漿から精製することもできるし、本特許において例示されるように、バキュロウイルスを用いて組換えにより製造されることもできることが示唆されている。しかしながら、標準的な発酵からの完全長ブタH因子の量の定量も示されていないし、完全長タンパク質(フラグメントのみではなくて)の機能性データも示されていない。しかしながら、機能性ヒトH因子を発現する方法の開示もなければ教示もない。
【００１２】
ブタH因子の使用は、本来、異種間人獣共通感染による感染のリスクを有する。さらに、ヒトH因子とブタH因子との間にDNA配列またはアミノ酸の完全な相同性は存在しない(62%の相同性、Hegasy G.A. et al., Pig complement regulator factor H: molecular cloning and functional characterization. Immunogenetics. 2003 Oct;55(7):462-71)。従って、ブタH因子に対する自己抗体ができる可能性が大変高く、そのことが、また一方で治療用途を制限すると考えられる。
【００１３】
WO2008/135237は、H因子のショートコンセンサスリピート(SCR)と病原体認識結合分子、例えば抗体とを結びつける医薬品の使用を記載している。この公報は、100未満のアミノ酸のフラグメント/ペプチド鎖(<2SCR)の使用を具体的に述べている。この公報は、病原体認識結合分子を有する完全長H因子分子の使用を示唆していない。同様に、この公報の重点は、感染または癌の治療のための使用であって、腎疾患または眼科疾患の治療のための使用ではない。
【００１４】
現在、FH補充臨床治療(FH-replacement clinical therapy)は、献血血液で製造したプール血漿を注入することによって行われているが、FHは多くのタンパク質成分の1つに過ぎない。FH Y402アロタイプ(AMDを防ぐ)のみを含む血漿を臨床的にルーチンに得ることは不可能である。プール血漿からのバルクで精製する場合、FHはそのヘテロタイプおよびグリコフォーム変異の両方に関して不均一であり、従って、この物質は治療には不適当である。抗体親和性に基づく精製方法では、一般に、小量(多くて数mg)の物質が得られるに過ぎず、変異の特定部位における単一バリアント(例えばY402)に関して富化することができるが、他の多型部位(例えばV62I)に関しては不均一である。AMD、AHUSおよびDDDの治療に関して提案されているように、反復して用いられる場合、血漿由来ヒトタンパク質の使用は、すべて、いずれにせよ、未知のウイルスおよびプリオンタンパク質の両方による感染ならびに混在する血漿成分に対する感作という許容できないリスクを有する恐れがある。
【００１５】
従って、FHの治療への使用に対する前述の障害の少なくとも1つを回避し、かつ/または緩和することが本発明の目的の1つである。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、例えば、好ましくはピキア・パストリスにトランスフェクトされ、次いでファーメンター中で発現され、一連のクロマトグラフ法を用いて精製されたコドン最適化化学合成遺伝子に基づく、動物およびヒト試験ならびに治療用途に合わせたFHバージョンの高収量製造を提供するために本発明者らによって行われた研究に基づく。
【００１７】
第1の側面において、組換え体哺乳動物FHの製造方法であって、前記哺乳動物FHまたはそのバリアントを得るために、選択した宿主生物における発現のためにその核酸配列がコドン最適化され、適切に設計されたベクターに挿入された、前記哺乳動物のFHまたはそのバリアントをコードするコドン最適化核酸配列を、選択した宿主生物において発現させる段階を含む前記方法が提供される。
【００１８】
好都合には、必要なコドン最適化を行うために、クローニングし変異を導入するのではなく、初めにコドン最適化核酸配列を化学合成することができる。本発明によれば、従来の技術を用いては今まで不可能だった、大量の組換え体哺乳動物FHおよびそのバリアントを生産することが可能である。一般的には、本発明の方法によって、培地1リットル当たり少なくとも0.5mgの組換え体FH(またはそのバリアント)のタンパク質収量を生産することができ、例えば培地1リットル当たり少なくとも1mg、5mg、10mg、50mg、100mg、200mgまたは500mgのタンパク質収量を生産することができる。従って、本発明の方法によれば、工業規模ファーメンターを用いた場合、従来の方法でクローニングされた組換え発現されたFHでは全く不可能だった、数百ミリグラムまたは数グラムまたはキログラム量までもの組換え体FHおよびそのバリアントを生産することが可能であることは明らかであろう。
【００１９】
上記の方法は、細胞および/または細胞が増殖している培地から前記タンパク質を精製することをさらに含むことができる。精製は、一般的には、当該技術分野で公知の高速タンパク質液体クロマトグラフ技術または高速(高圧)液体クロマトグラフ技術などのクロマトグラフ法の使用を含むことができる。例えば、この核酸配列は、FHが培地中に分泌され(前記シグナル配列ペプチドが切除された後)、それによって、それが最初に細胞内P.パストリス(P.pastoris)のタンパク質から分離されるように、FHのN末端に融合される分泌シグナル配列であるアミノ酸残基をコードするように設計されることができる。その後の精製段階において、粗生成物は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム、例えばリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で平衡させたヘパリンセファロースカラムに添着させ、複数倍カラム容積の高塩(例えば1M NaCl)を添加したPBSを用い勾配をかけて溶出することができる。さらなる段階において、前の段階からのFH含有フラクションは、例えばイオン交換樹脂含有カラム、例えば20mMグリシン緩衝液(一般的にはpH9.5、150mM NaCl)で平衡させたGE Healthcare社製MonoQカラムに添着させ、次いで、同じpHで高塩(例えば1M NaCl)を添加した平衡緩衝液を用い、複数倍カラム容積で勾配をかけて溶出することができる。
【００２０】
発現されたタンパク質のリフォールディングは必要なく、タンパク質は培地に分泌されることができ、従って利用しやすく、特定の複合糖質または非天然型アミノ酸残基を組換え生成物に組み込むことができるという理由から、好ましい宿主生物の選択はピキア・パストリスであるが、他の原核宿主生物(例えばエシェリヒア・コリ(Escherichia coli))および真核宿主生物(例えばサッカロミセス・セレビシエ(Sacchyromyces cerevisiae))もまた考えられる。
【００２１】
言及した哺乳動物FHは、ヒトFHまたは他の霊長類FHまたは他の哺乳動物FH、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラクダ、ネコ、モルモットFHなどであることができる。
【００２２】
このデオキシリボ核酸(DNA)配列は、適切に切断された発現ベクターへのクローニングを容易にするために、この核酸の5’および3’末端に特有の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むことができる。好ましい制限部位は、PstI、BamHI、NotIおよびXbaIであるが、当業者は、他の制限部位を容易に考えることができる。
【００２３】
FHをコードする核酸配列は、多くの野生型配列(当該技術分野で多型バリアントとして知られる)の1つに関連することもできるし、変異体配列であることもできる。この配列は、当該技術分野で公知の1以上の一塩基多型を含むことができる。例えば、US2007/0020647は、ヒトCFHにおいてこれまで同定された多くの多型を記載しており(この内容は、参照により本願に組み込まれる)、将来においてより多くのこのような多型バリアントが見出される可能性がある。これらの1以上は、コドン最適化核酸配列に容易に組み込まれることができる。個々に、または組み合わせで、コドン最適化核酸配列に組み込むことができる好ましい一塩基多型は、そのタンパク質配列において以下の変異をコードすることができる:Ile62(Valよりはむしろ)、Tyr402(Hisよりはむしろ)、Glu936(Aspよりはむしろ)および/またはArg1210(Cysよりはむしろ)(数はすべて、シグナル配列切断前のコードされたタンパク質の配列を指す(Swiss-Prot:P08603.4))。このような一塩基多型およびハプロタイプは、平均より低いAMD発症リスクと関連していることが報告されている(Hageman GS et al. a common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration. Proc Natl acad Sci U S a 2005 102:7227-32; Klein RJ et al.Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 2005 308:385-9; Edwards AO et al. Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration. Science 2005 308:421-4; Haines JL et al. Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration. Science 2005 308:419-21; Hageman GS et al. Extended haplotypes in the complement factor H (CFH) and CFH-related (CFHR) family of genes protect against age-related macular degeneration: characterization, ethnic distribution and evolutionary implications. ann Med 2006 38:592-604)。これに代えて、あるいはこれに加えて、FH ポリペプチド配列を特異的に改変するように変異体配列を設計して、例えば、以下にさらに詳細に説明する1以上の天然の(コードされた)または天然にはコードされないバリアントアミノ酸を含ませることができる。
【００２４】
コンジュゲートは、通常は1以上のアミノ酸残基側鎖を介して化学的部分(単数または複数)に共有結合したFHまたはFHのバリアントに対応するポリペプチドからなる分子のことを言い、前記分子の生物医薬特性（生物治療特性（biotherapeutic properties））を改善することを目的としている。結合される部分は、グリコサミノグリカンおよびその誘導体もしくはポリシアル酸、デキストラン(-1,6ポリグルコース)、デキストラン(-1,4ポリグルコース)、ヒアルロン酸およびキトサンを含む天然ポリマー;非天然ポリマー、例えば直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコール、ポリエーテルポリオール、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(エチレンイミン)もしくは直鎖ポリアミドアミンなどの大きなファミリーのいずれか;または疑合成ポリマー、例えばポリ(L-リジン)、ポリ(グルタミン酸)、ポリ(リンゴ酸)およびポリ(アスパルトアミド)を含むことができる(例えば、The dawning era of polymer therapeutics. Duncan R. Nature Reviews Drug Discovery 2003 2:347-360 を参照のこと)。
【００２５】
従来の遺伝子クローニングおよび発現ではなく、本発明は、当該技術分野の遺伝子設計および合成技術(例えば、Gene composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis. Lorimer D, Raymond A Walchli J, Mixon M, Barrow a, Wallace E, Grice R, Burgin A, Stewart L. BMC Biotechnol. 2009 9:36)を用いて、前記FH(およびそのバリアント)をコードするコドン最適化DNA分子を初めに化学合成することに基づく。このように、コドン最適化核酸は、適切な発現ベクターへのクローニングの前に新規合成される。FH遺伝子のコドン最適化を行うための当該技術分野で公知の従来の部位特異的変異誘発技術は、不可能ではないにしても、追加の突然変異を導入するハイリスクのために、部位特異的変異誘発に必要な反復ラウンド中に実行不可能なまでに時間がかかるであろう。しかしながら、生成物において1つまたは組み合わせの部位特異的変異を行わせるために、合成コドン最適化CFHのクローニングに続いて部位特異的変異誘発を用いることはできる。
【００２６】
所望の宿主生物、例えばP.パストリスにおいて、哺乳動物FHおよびそのバリアントの発現レベルを高めるためにコドン最適化が行われる。前記最適化は、以下:選択した宿主生物のコドンバイアスとマッチするようにコドンバイアスを適合させること;高(>80%)または低(<30%)GC含量の領域を避けること;潜在的内部TATAボックス、chi部位およびリボソーム侵入部位をいずれも最小限にすること;配列のATリッチもしくはGCリッチストレッチを最小限にし、反復配列およびRNA二次構造を避け、(潜在的)スプライス供与および/またはスプライス受容部位をいずれも最小限にすること;および、クローニングを容易にするために、核酸の末端の5’および3’末端においてのみ任意の所望の制限エンドヌクレアーゼ部位が見いだされることを確かにすることの1以上を含む。好ましくは、核酸配列を最適化する際に、上記考察のすべてが考慮される。当業者は、選択した宿主のコドンバイアスに関する当該技術分野の従来の知識および他の教示(例えば、Codon bias and heterologous protein expression. Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J. Trends Biotechnol 2004 22:346-53)に基づいて元のFH配列にこのような改変を行うことができる。特定の会社、例えばGeneart社(レーゲンスブルク、ドイツ)、GeneScript社(ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国)およびDNA2.0社(メンロパーク、カリフォルニア州、米国)は、特定の宿主生物における発現に合わせた核酸配列を最適化し合成するサービスを提供している。
【００２７】
好ましい実施形態において、哺乳動物FHをコードするDNA配列は、宿主であるP.パストリスでの発現に最適化されたCFH配列である。図1において、P.パストリスコドン最適化ヒトCFH配列(位置402においてYを、位置62においてIを、位置936においてEをコードする)が野生型cDNA配列と比較される。P.パストリスにおける過剰生産のための配列をさらに最適化するために、コドン最適化配列を改変しうることは明らかであろう。さらに、種々のアロタイプの発現を可能にするために、配列を容易に改変することができる。さらに、FHタンパク質のアミノ酸残基配列を特異的に変えるために、特定のヌクレオチド塩基を改変ことができる。例えば、特定のアミノ酸残基を、例えば、改変グリコシル化パターン;低い免疫原性;血漿半減期の増加;および/または薬動力学的および/または薬力学的性質を改善するように設計された部位特異的結合、をもたらす1または組み合わせまでもの改変を有する組換え体FHタンパク質の作成を可能にするように、希少であるか、または天然に存在しないアミノ酸残基である代替アミノ酸残基と置換させることができる。任意のコドン最適化を考慮に入れながら、すべてのこのような改変を行うことができることは明らかであろう。
【００２８】
従って、他の側面において、本発明は、FHポリペプチドまたはそのバリアントを発現することができる核酸配列であって、宿主生物、例えばP.パストリスにおける発現のためにコドン最適化された前記核酸配列を提供する。本発明による核酸配列から得られる哺乳動物FHポリペプチドまたはそのバリアントもまた提供される。
【００２９】
好ましくは、配列はP.パストリスによる発現のためにコドン最適化されている。この場合、核酸配列は、図1に示したコドン最適化ヒト配列であることもできるし、図5に示した配列のいずれかであることもできるし、それらと実質的に同様であることもできる。実質的に同様なとは、図1または5に示された配列と、70%、75%、80%、85%、90%、95%を超えて、あるいは99%を超えてまでも同一であることと理解される。
【００３０】
本発明はまた、本発明のコドン最適化されたFHをコードするDNA配列を含むベクター、前記組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞ならびに、組換え技術によってコードされたFHおよびFH様ポリペプチドの製造および精製ならびに前記ポリペプチドの複合生成物に関する。
【００３１】
組換え構築物は、公知の技術、例えば感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション、エレクトロポレーションおよび形質転換を用いて宿主細胞に導入することができる。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターであることができる。レトロウイルスベクターは複製コンピテントであるかまたは複製欠損型であることができる。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に相補宿主細胞においてのみ起こる。
【００３２】
目的とするポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクター内に含まれることができる。一般に、プラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物の形態で、あるいは荷電脂質との複合体で導入される。ベクターがウイルスである場合、in vitroで適切なパッケージング細胞株を用いて目的とするポリヌクレオチドをパッケージングすることができ、次いで宿主細胞に形質導入されることができる。
【００３３】
目的とするポリヌクレオチドに対するシス作用調節領域を含むベクターが好ましい。適切なトランス作用因子は、宿主によって供給されるか、相補ベクターによって供給されるか、または宿主への導入時にベクター自身によって供給されることができる。
【００３４】
この点における特定の好ましい実施形態において、ベクターは特異的発現を提供し、誘導性および/または細胞型特異的であることができる。適切なベクターは、操作が容易な環境要因、例えば温度および栄養素添加物によって誘導されるものを含む。
【００３５】
本発明に有用な発現ベクターは、染色体由来、エピゾーム由来およびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピゾーム、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス由来のベクターならびにそれらの組み合わせ由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミドを含む。
【００３６】
DNAインサートは適切なプロモーターに作動可能に連結されていなければならない。本発明に使用するのに適した既知の細菌プロモーターは、E.コリ(E. coli)lacIおよびlacZプロモーター、T3およびT7プロモーター、gptプロモーター、ファージλPRおよびPLプロモーターならびにtacおよびtrpプロモーターを含む。適切な真核生物プロモーターは、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、レトロウイルス長端末反復(LTR)プロモーター、例えばラウス肉腫ウイルスのプロモーターおよびメタロチオネインプロモーター(例えばマウスメタロチオネイン-Iプロモーター)を含む。P.パストリスに特異的なプロモーターは、アルコールオキシダーゼ1(AOX1)、AOX2(共にメタノール誘導性)、CUP1(銅誘導性)、GAP(グリセロール誘導性、種々の炭素源に対して構成的活性型)、FLD1(ホルムアルデヒド脱水素酵素遺伝子)http://faculty.kgi.edu/cregg/PP strains.htm - pblhisix、PEX8 (中程度の プロモーター)http://faculty.kgi.edu/cregg/PP strains.htm - pblhisix、YPT1(中程度のプロモーター、種々の炭素源に対して構成的活性型)http://faculty.kgi.edu/cregg/PP strains.htm - pblhisix、DAS1 (ジヒドロキシアセトン シンターゼ)http://faculty.kgi.edu/cregg/PP strains.htm - pblhisix、ADH1(アルコール脱水素酵素)http://faculty.kgi.edu/cregg/PP strains.htm - pblhisixおよびPGK1(3-ホスホグリセリン酸キナーゼ)を含む。他の適切なプロモーターは当業者に公知であり、例えば、Cereghino and Cregg, 1999, Current Opinion in Biotechnology, 10, p422-427 を参照のこと。
【００３７】
発現構築物は、さらに、転写開始点、転写終結点および、転写領域内の翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳される核酸配列の開始部分に翻訳開始AUGを含み、終末部分に適切に配置された終止コドンを含む。遺伝子発現レベルおよび組換え体タンパク質収量を最大化するために、合成遺伝子を用いれば、インサートのこれらの特徴を最適化することは容易である。
【００３８】
前述のように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも1つの選択マーカーを含む。このようなマーカーは、真核細胞の培養のためには、例えばジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシンまたはゼオシン耐性を含み、E.コリおよび他の細菌の培養のためには、例えばテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【００３９】
適切な宿主の代表例は、細菌細胞、例えばE.コリ、ストレプトミセス(Streptomyces)およびサルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella Typhimurium)細胞;真菌細胞、例えばP.パストリス、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyceslactis)およびサッカロミセス・セレビシエなどの酵母細胞;昆虫細胞、例えばドロソフィラ・メラノガスターS2(Drosophila melanogastor S2)およびスポドプテラ・フルギペルダ9(Spodoptera frugiperda9)細胞;動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣、COSおよびBowes黒色腫細胞;ならびに植物細胞を含む。上記の宿主細胞の適切な培地および培養条件は当該技術分野で公知である。最も好ましくは、宿主生物は、メチロトローフ酵母P.パストリスである。哺乳動物またはヒト様N-グリカンに付着するように代謝を操作したP.パストリス株は好ましいと考えられる。Wildt and Gerngross, 2005, Nature Reviews, 3, p119-128, Li et al, 2006, Nature Biotechnology, 24, p210-215, Cereghino, et al, 2002, Current Oinion in Biotechnology, 13, p329-332 を参照のこと。
【００４０】
細菌に使用するのに好ましいベクターは、Qiagen社から入手できるpA2、pQE70、pQE60およびpQE-9;Stratageneから入手できるpBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A;ならびにPharmacia社から入手できるptrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5を含む。好ましい真核ベクターには、Stratagene社から入手できるpWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG;ならびにPharmacia社から入手できるpSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVLがある。P.パストリスに使用するのに好ましいベクターは、Invitrogen社からのpPIC9K、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pGaPZ、pGaPZalpha、pPICZalpha-A、pPICZalpha-B、pPICZalpha-C、pPICZalpha-E、pPICZalpha-E/Uni、pPIC3.5、pPIC9、pPICZ-A、pPICZ-B、pPICZ-C、pPICZ-Eを含む。他の適切なベクターは、当業者には明らかであろう。
【００４１】
前述のように、宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって行うことができる。このような方法は、多くの標準的実験マニュアル、例えばDavis LGG et al., Basic Methods in Molecular Biology, (2nd Ed., McGraw-Hill, 1995) に記載されている。
【００４２】
前述のように、本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは、所定の宿主細胞型において、プロモーターの転写活性を増加させる、通例約10〜約300bpのDNAのシス作用性エレメントである。エンハンサーの例は、複製起点の後期側(late side)のbp100〜270に位置するSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。
【００４３】
翻訳されたタンパク質の小胞体内腔、細胞膜周辺腔または細胞外環境への分泌のために、発現されるポリペプチドに適切な分泌シグナルを組み込むことができる。このシグナルは、ポリペプチドにとって内因性であることもできるし、異種であることもできる。P.パストリスに用いることができるこのような配列の例は、天然ヒトもしくはマウス(または他の哺乳動物)FH分泌シグナルおよび酵母α交配因子を含む。
【００４４】
目的とするポリペプチドは、改変体、例えば融合タンパク質で発現させることができ、分泌シグナルばかりでなく、追加の異種機能領域も含ませることができる。従って、例えば、精製中または、その後の取り扱いおよび貯蔵中に、安定性および宿主細胞における持続性を改善するために、ポリペプチドのN末端に追加のアミノ酸残基、特に荷電アミノ酸残基の領域を加えることができる。同様に、精製を容易にするためにポリペプチドにペプチド部分を融合させることができる。このような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去することができる。特に、分泌または排泄を行うために、安定性を改善するために、そして精製を容易にするためにポリペプチドにペプチド部分を付加させることは、当該技術分野では珍しくなく、常法である。
【００４５】
FHタンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿法もしくはエタノール沈殿法、酸抽出法、陰イオン交換もしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法によって組換え細胞培養物から回収し精製することができる。ヘパリン親和性に続いてイオン交換クロマトグラフィーが最も好ましい。
【００４６】
タンパク質の構造的完全性または機能的特性に著しく有害な影響を与えないでFHポリペプチドのアミノ酸残基配列を選択的に改変できることは、当業者には明らかであろう。このような配列における相違を考慮する場合、その生物活性に必須なタンパク質の領域があることを思い出さなければならない。タンパク質のフォールディングまたはその折りたたみ構造の安定化のために必須な残基もまた存在する。残基の一部は、例えばグリカンをAsn側鎖に共有結合させる酵素によって認識されるグリコシル化部位として役立つ。一般に、構造または機能に直接または間接に寄与する残基を、科学的に類似した他の残基によって安全に置換することが可能である(これは保存的置換として知られる)。構造的完全性部位または機能性部位に寄与しないアミノ酸残基の場合、このような残基を異なる化学的性質のアミノ酸残基によって安全に置換することが可能である(非保存的置換)。
【００４７】
従って、本発明はさらに、バリアントが実質的にFH様生物活性を示すFHポリペプチドの変異を含む。バリアントは、保存的置換(例えば、ある親水性残基と他の親水性残基との置換またはある疎水性残基と他の疎水性残基との置換)を含むことができるが、強親水性残基と強疎水性残基との置換(逆もまた同様)を含むことはないと考えられる。バリアントは、N-グリコシル化部位の欠損をもたらすN-グリコシル化部位内の保存的置換を含むことができる。バリアントはまた、FH分子内の20タンパク質ドメインの1以上の欠失を含むこともできる。例えば、ドメイン8〜18の間およびそれを含む1つまたはドメインの組み合わせ[例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10または11ドメイン]の欠失は、ドメイン1〜4、6〜7(または6〜8)および19〜20に位置する機能的に必須の個別の結合部位に有害な影響を有さないと考えられる。バリアントはまた、ドメイン5〜18の間およびそれを含むFHの領域からのドメインの1つまたは組み合わせを含むことができる。なぜなら、これによっては、C3b-結合部位(1〜4および19〜20)およびFH内の2つの細胞表面認識部位の1つ(19〜20)は保存され(例えば、A new map of glycosaminoglycan and C3b-binding sites on factor H. Schmidt CQ, Herbert AP, Kavanagh D, Gandy C, Fenton CJ, Blaum BS, Lyon M, Uhrin D, Barlow PN. J Immunol, 2008, 181:2610-9 を参照のこと)は保存され、これらの結合部位間の空間配置または結合の柔軟性を最適化することによって機能活性を高めることが可能だからである。バリアントはまた、例えばFHの領域のドメイン8〜18または5〜18からの1以上の欠失されたドメインが、他のタンパク質由来の1以上の同様なドメイン、例えばI型またはII型補体受容体からのドメインと置換されたハイブリッドを含むことができ、あるいは、それらが広範囲の他のタンパク質、例えば細胞外マトリックスまたは凝固もしくは補体カスケードのタンパク質由来の1以上の似ていないドメインによって置換されることもできる。
【００４８】
一般的に見られる保存的置換は、脂肪族アミノ酸Ala、Val、LeuおよびIleの中の1つから他への置換;ヒドロキシル残基であるSerとThrとの交換;酸性残基であるAspとGluとの交換;アミド残基であるAsnとGlnとの間の置換;塩基性残基であるLysとArgとの交換;および芳香族残基であるPheとTyrの間の置換である。非保存的置換は、天然にコードされたアミノ酸残基および天然にはコードされない(非天然)アミノ酸残基の両方の置換を含むことができる。非天然アミノ酸残基は、化学的部分(例えばポリエチレングリコール(PEG)および他のポリマー)との結合のための、またはFHの治療効果を高めるための生化学基(例えばグリカン)との結合のための部位特異的結合部位として役立つものであることができる。
【００４９】
上記に詳細に述べたように、どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントである(すなわち、機能に顕著に有害な効果を有さない)と考えられるかに関するさらなる指針は、Bowie, et al., “Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to amino acid Substitutions,” Science 247:1306-1310 (1990) において見出すことができる。
【００５０】
凝集を防ぎ、タンパク質分解を最小限にする置換もまた目的とされる。タンパク質の凝集は、活性の減少をもたらすばかりでなく、医薬製剤を製造する場合に問題となる場合がある。なぜなら、凝集体は免疫原性となる場合があるからである(例えば、Pinckard et al., Clin Exp. Immunol, 1967, 2:331-340; Robbins et al., Diabetes, 1987, 36:838-845; Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 1993, 10:307-377 を参照のこと)。凝集は、表面残基の変化、例えば疎水性パッチの除去によって(疎水性残基と極性残基との置換によって)最小限にすることもできるし、電荷反転(例えばAspをArgに置換するかまたはGluをLysに置換することによって)または欠失(例えばSerをAspに置換する)によって表面の静電学を変化させることによって最小限にすることもできる。タンパク質分解は、標的タンパク質の損失をもたらし、従って収率は低下し、精製もより困難となる。タンパク質分解は、コンピュータ予測または経験的手段によってタンパク質分解部位を認識し、その保存的置換によって低下させることができる。
【００５１】
哺乳動物FHの特定の妥当性を有する可能な改変は、FHタンパク質のグリコシル化を最小限にするために1以上のAsn残基をGln残基に変異させることを含む。あるいは、FHタンパク質の1つまたは2つまでものAsn残基を、多数の非天然アミノ酸残基のいずれか、例えばp-(プロパルゴキシ)-フェニルアラニン(pPpa)残基に置換することができる(Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Young TS, ahmad I, Brock A, Schultz PG. Biochemistry 2009 48:2643-53)。このような非天然残基は、当該技術分野で公知のPEG化またはシアリル化技術によってさらに改変することができる。
【００５２】
従って、他の側面において、本発明は、変異が、天然FHと比較して前記FHバリアントの1以上の生物学的特性を調節するように設計された1以上のアミノ酸残基置換を含むコドン最適化核酸から得られた組換え発現された哺乳動物FH、特にヒトFHのバリアントを提供する。
【００５３】
当然のことながら、前記アミノ酸置換(単数または複数)は、当該技術分野で公知のように、FHタンパク質の多型変化には関連しない。前記置換(単数または複数)は、天然FHと比較して、例えば前記FHバリアントの免疫原性および/または生理学的特性の調節をもたらす可能性がある。典型的な改変は、前記FHバリアントのグリコシル化状態を変えるために、かつ/または前記置換部位で分子、例えばPEGまたはポリシアリル鎖によってバリアントが特異的に改変されるために、当該技術分野で公知の化学を用いて前記FHバリアントをさらに改変するために、1以上のAsn残基を他のアミノ酸残基、例えばGlnまたは天然に存在しないアミノ酸残基、例えばpPpaと置換することを含む。
【００５４】
従って、標的FH様ポリペプチドは、(i)アミノ酸残基の1以上が、保存または非保存アミノ酸残基によって置換され、前記置換アミノ酸残基が、その遺伝コードによってコードされたものであることもないこともできるもの;または(ii)アミノ酸残基の1以上が、他の分子と結合しているかまたは置換基を含むもの;または(iii)成熟ポリペプチドが、他の化合物(単数または複数)、例えばポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、PEGもしくはポリシアル酸)に共有結合していることができるもの;または(iv)IgG Fc融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌シグナル配列または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列などの追加のアミノ酸残基が成熟ポリペプチドに融合されているもの;または(v)グリコシル化部位における置換または新規グリコシル化部位(もしくはグリカンとの化学結合に適した非天然アミノ酸)の導入または操作されたグリコシル化経路を有するP.パストリス株の使用による結合グリカンの改変(FHの天然糖型と比較して)パターンを有するもの;または(vi)ドメインがFHの中央部分から除去され、他のタンパク質からの相同のドメインで置換されていても置換されていなくてもよいドメイン欠失もしくはハイブリッドバリアント、であることができる。このようなフラグメント、誘導体、コンジュゲートおよびアナログは、本明細書に記載の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
【００５５】
本発明の組換え発現された哺乳動物FHポリペプチドおよびバリアントには種々の応用が可能である。例えば、ポリペプチド/バリアントは、遺伝的に罹患しやすい個体において、加齢黄斑変性(AMD)を治療または予防するか、またはこの疾患の進行を予防または抑制することができ、AMDを有する固体の治療ばかりでなく、非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)およびデンスデポジット病(DDD)として知られる2つの生命を脅かす腎疾患の治療/予防を容易にする。本発明の組換え発現された哺乳動物FHは、不十分な補体制御が病因または症状に寄与する多数の他の疾患または病状、例えばアルツハイマー病、虚血、子癇前症、早期流産、敗血症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスおよび移植片拒絶の治療または予防に有益な効果を発揮することができると考えられる。例えば、虚血再潅流障害:(Shah KG et al, J Surg Res. 2010 163 1:110-117; Yang J et al, ann Surg. 2009 249 2:310-317; Zhang F et al, Regul Pept. 2009 8 52(1-3):82-87、臓器移植: Atkinson C, et al, J Immunol. 2010 185 11:7007-7013、早期流産: Lynch AM, et al, Obstet Gynecol. 2011 117 1:75-83 および 子癇前症 Qing X et al, Kidney0 Int. 2010 Oct 13. [Epub ahead of print]を参照のこと。
【００５６】
本発明による組換え体FHポリペプチドおよびバリアントは、研究に応用することもできるし、キットなどにも応用することができる。
【００５７】
本発明による特に好ましいFH分子およびバリアントについて、以下に詳細に説明する。
【００５８】
発明の詳細な説明
次に、本発明を以下の図面を参照としてさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】天然ヒトFHのDNA配列(Swiss-Prot:P08603.4);本発明のP.パストリスコドン最適化ヒトFH配列;ならびに野生型(cDNA由来)およびコドン最適化FH遺伝子配列のアラインメントを示す図である。
【図２】非コドン最適化FH遺伝子発現からのウェスタンドットブロット結果を示す図である。
【図３】組換え体補体H因子の生成および分析を示す図である。
【図３Ａ】塩勾配(20mMグリシン緩衝液、pH9.5、0.12〜1M NaCl;右y軸に伝導率)を用いる、陰イオン交換カラム(MonoQ)(左y軸にミリ吸光度単位でのA280)からの溶離を示す図である。
【図３Ｂ】MonoQカラムから溶離したフラクション(図3A参照)をSDS-PAGEに供し、クマシーブルーでタンパク質バンドを視覚化した図である。レーン1〜8(還元条件-すなわちジスルフィドが存在しない)は溶出量23〜30に相当する。ポリペプチド鎖の“クリッピング”は明らかではなかった。レーン9は、右側に示した分子量マーカー(MW)を含む。レーン3’、4’および5’は、レーン3、4および5に対応するが、非還元条件下で行ったものである。レーン3’、4’および5’におけるより速く(レーン3、4および5と比較して)移動するバンドは、ジスルフィド結合を含むタンパク質に典型的である。
【図３Ｃ】FHのC末端CCPモジュール(ドメイン)内のエピトープを認識する2つの抗体をウェスタンブロットで用いた図である。血漿FH(左レーン)および組換え体rFH(中央レーン)を(i)Mab-SC47686_L20/3または(ii)Mab-Abnova-0167で検出した。MWは分子量マーカーである。右側のゲル(ii)を参照のこと。
【図３Ｄ】C3bからiC3bの因子I触媒切断の補因子として機能するFH(レーン1〜5)およびrFH(レーン7〜11)の能力を、SDS-PAGEを用い、続いてクマシーブルー染色を用いてα’鎖の43kDAおよび68kDAタンパク質分解フラグメントを視覚化することによって評価した図である。インキュベーション時間は、示されているように0分から30分であった。FHの両方のバージョンは、この半定量的アッセイにおいて同様な活性を示し、C3bのα’鎖は5分以内に完全にプロセシングされている。MWは、(上部から)250、150、100、75、50、37、25および20kDAの分子量マーカーである。
【図３Ｅ】図3Dとの比較のために、同じ濃度の可溶性補体受容体1型(sCR1)の補因子活性を同じ時間間隔で追跡した図である。sCR1は、α’鎖のC3dgおよび30kDAフラグメントのさらなる分解を促進したが、(図3Dから)rFHも血漿由来FHもそうではなかったことに注意されたい(文献と一致)。MWは図3Dと同様である。
【図３Ｆ】因子Dおよび因子Bが、CM5(Biacore社)センサーチップにアミンで連結されたC3b上を流れるときにC3bBb(コンベルターゼ)複合体の形成をモニターするために表面プラズモン共鳴を用いた。その後の応答における減少は、Bbがチップ表面から放出されるときの複合体の減衰を反映している。減衰速度は、参照FHまたはrFHの流れを開始することによって加速される(この場合は、210秒で自然減衰プロセスに入る)。同じ濃度(0.5μM)においては、このアッセイにおいて、血漿由来FHよりもrFHがより有効な減衰加速剤である。対照タンパク質であるBSAおよびFHモジュール19〜20は、減衰に対して効果を示さない。
【図３Ｇ】G(i)および(ii)は、ACM5センサーチップ(Biacore社)に連結されたC3bに対する(i)rFHおよび(ii)血漿由来FHの親和性を測定するためのSPRの使用を示す図である。固定されたC3bの1540応答単位に対して流した濃度シリーズ(5.4μM、1.0μM、0.5μM、0.1μM)に関して2連センサグラムが示されている。(iii)および(iv)は、C3bの1540RU(各プロットにおける下の曲線)または3030RU(各プロットにおける上の曲線)のいずれかを用いた、2つの異なるフローセルに関する、応答単位対(iii)rFHまたは(iv)血漿由来FH濃度のプロットである。破線の垂直線は、両方のプロットに同時に当てはめたKDを示し、rFHに関しては1.4μM、血漿由来FHに関しては2.9μMを与えた。
【図３Ｈ】候補組換え体FH(ピークaおよびcは、それぞれ2価および1価の種に相当する)および内部標準(IgG1;ピークbおよびdは、それぞれ2価および1価の種に相当する)をMALDI-ToF質量分析計で分析した図である。
【図３Ｉ】rFHをPBS中、濃度1mg/mlで動的光散乱を行った図である。
【図３Ｊ】ヒツジ赤血球を1.5μM FHモジュール6〜8(陰性対照)、0.4μM血漿由来FHまたは0.4mM rFHを含む生理的緩衝液中でインキュベートし、FHを枯渇させたヒト血清に暴露(37℃で20分間)した図である。反応をクエンチし、A412を測定した。結果は4つの実験の平均(±標準偏差値)で示した。
【図４Ａ】特定のSNPおよび8つのN-結合型グリカンを示すヒトH因子(FH)の概略図である。
【図４Ｂ】種々のFH分子およびバリアントが本発明に従って製造できるように設計されたベクター(プラスミド)マップの概略図である。ベクター4(pPICZα-Bに基づく)以外はすべてpPIC3.5Kに基づく。ベクター番号1〜3および11は、ヒト分泌シグナルペプチド(hum.signal pept.)のDNAを組み込んでいるが、ベクター番号7、9および10はマウス等価物を組み込んでいる。他の4つのベクターは、EAジペプチドあり(ベクター番号4)またはなし(ベクター5、6および8)で酵母α因子ペプチドのDNAを組み込んでいる。コードされたFHのバリアント(図5における配列)を示す-保護(prot.)およびハプロタイプの恐れがあるものはテキスト中に詳述してある;“all-Q”および“1アンバーQ”または“2アンバーQ”は、それぞれ、テキストの記載に従って、Asn残基に対するGlnおよび1または2pPa残基(例えば)の置換を指す;“デルタ10〜15”は、テキストの記載に従って、FHドメイン10〜15の除去を示す;K/Rは、テキストの記載に従って、リジンおよびアルギニンのグルタミンによる置換を示す。
【図５】ベクター番号1〜11に挿入された(a)ヒトおよび(b)マウスFHバリアントをコードするDNA配列の概要を示す図である。
【図６】FHの2つの組換え体バリアントの発現を示す図である。rhFHの“all-Q”変異体の試料(左側ゲル)は、SDS-PAGE中、還元(R)および非還元(NR)条件下で単一バンドで移動する(クマシーブルーで染色)。Endo Hf(77kDA)処理では、移動率に変化を生じない。このことは、“all-Q”変異体がN-グリコシル化部位を有さず、グリカンフリーであることと一致している。比較のために(中央ゲル)、rhFH(精製前)は、Endo Hfで処理されるまで、ぼやけたバンドで移動する(右側ゲル)。“デルタ10〜15”rFHの試料を陰イオン交換カラムから溶出し、6つのピークのフラクションを採取し、還元(R)または(4つのフラクションに関して)非還元(NR)条件下(右側ゲル)SDS-PAGEを行い、次いでクマシーブルーで染色した。MWは、ゲルの左および右に示された分子量マーカーである。
【図７】FHの医薬品バージョンへの経路の概略図である。
【実施例１】
【００６０】
FHをコードする非コドン最適化DNAの発現の試み
ヒトFHをコードするDNAをcDNAから増幅し、酵母発現ベクターpPICZalphaBに挿入し、KM71H P.パストリス細胞を正しく形質転換した。形質転換細胞内の遺伝子の複数コピーの存在と合致する細胞コロニーを高抗生物質含有プレート上で増殖させた。しかしながら、ミニスケール培養において、FH発現の根拠を検出することができなかった(SDS-PAGE、クマシーブルーで染色)。シェーカーフラスコ培養においても、検出可能な組換え体FHは生産されなかった。次いで、理想的な発現条件下(酸素および栄養素レベルがほぼ最適のレベル維持された1リットルのファーメンターにおいて達成できる)、より感度の高い検出法(ウエスタンドットブロット、図2参照)を用いて、形質転換細胞によるタンパク質発現が検出できるかどうかをチェックした。これらの段階および、さらに大きなスケール(3リットル)の発酵を用いても、組換え体FH生成物は検出できなかった。
【００６１】
さらに少量の組換え体FHの発現の根拠を見出すさらなる試みにおいて、上清の一部を濃縮し(ウエスタンドットブロットのために)、一方で残りを希釈し(塩濃度を低下させるために)、pH6でHiTrap(GE Healthcare社)ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラムに添着した。1M NaCl(HiTrapヘパリンカラムに用いられる平衡緩衝液中)による1段階溶離(少量ですべてのタンパク質を洗い落すことが期待される)からの試料もまたウエスタンドットブロットでアッセイした。
【００６２】
市販のポリクローナル抗FH抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した二次抗体の両方を用いて、標準的なウェスタンブロット法により検出を試みた。陽性対照(一次抗FH抗体、二次抗体およびComplement Technology社(テキサス州)から購入したヒト血漿由来FHからなる)を除いては陽性シグナルは検出できなかった(図2参照)。
【００６３】
このように、ジスルフィドを含む細胞外タンパク質に特に適していることが知られ、FHの短いセグメントの発現に使用されている異種発現系の使用にもかかわらず、FHをコードするDNAから複数グラム量の組換え体FHはもちろん、複数ミリグラム量の組換え体FHの提供は決して簡単なことではないことが明らかとなった。
【実施例２】
【００６４】
コドン最適化ヒトH因子の開発、精製および分析
P.パストリスにおけるヒトFH発現を目的としたコドン最適化は、本発明者らとGeneart社(レーゲンスブルク、ドイツ)との間で協議し、彼らの独自の技術およびGeneOptimizer(登録商標)ソフトウェアを用いて行った。
【００６５】
P.パストリスにおける発現のための、ヒトFHのコドン最適化型の核酸配列は、天然DNA配列とは大きく異なっている(76%の配列同一性を有する)(図1参照)。
【００６６】
コドン最適化DNA配列は、Geneart社によって合成された。次いでこれを、適切な制限酵素を用いて切断した、Invitrogen社が得たP.パストリスベース発現ベクター、pPICZαBベクターにクローニングした。
【００６７】
このベクターをE.コリにトランスフォームし、DNAを増幅し、数十μgのプラスミドDNAを得た。これを精製し、線状化し(相同組換えを促進するために)、次いでP.パストリスKM71H株に形質転換した(エレクトロポレーションを用いて)。一連の濃度の抗生物質マーカーを含む富栄養培地プレート上に形質転換酵母を線条接種することによって、発現プラスミドを含むP.パストリスクローンの選択を行った。高抗生物質含有プレート上で増殖したコロニーをタンパク質発現に関してスクリーニングした。
【００６８】
濾過して細胞を除去した後、ファーメンターからの上清を蒸留水で5倍に希釈し、自己注入XK-Heparinカラム(Heparin FastFlow樹脂-GE Healthcare社製)に添着させた。20mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)から1M NaClで置換した同じ緩衝液への直線勾配を用い、6倍のカラム容積で溶離を達成した。タンパク質を含むフラクションをプールし、エンドグリコシダーゼH-マンノース結合タンパク質融合タンパク質(Endo Hf、New England Biolabs社)を用い、37℃で試料をインキュベートすることによってグリカンを除去した。次いで、タンパク質をコンカナバリンA(GE Healthcare社)カラムに適用し、次いでP.パストリス由来グリカンおよびEndo Hfを除去するためにマンノース結合樹脂(New England Biolabs社)に適用した。Endo Hfに代わるものとして、組換え生成物においてグリカンをより保持させるためにエキソグリコシダーゼを用いることができ、これにより溶解性を高めることができる。
【００６９】
自己注入Poros-Heparinクロマトグラフィーカラムを用い、PBSからPBSプラス1M NaClへの直線勾配を用い、20倍カラム容積で溶出して試料をさらに精製した。最終精製段階には、MonoQカラムによる陰イオン交換を必要とした。20mMグリシン緩衝液(pH9.5)から1M NaClを添加した同じ緩衝液への勾配を用い、20倍カラム容積でタンパク質を溶出した。
【００７０】
このような精製の例示的な結果とそれに続く広範な生物物理学的分析、機能性分析および検証を図3に示す。この手順からのタンパク質の収量は、最適化しないで、1リットルからタンパク質約1.5〜2.5mgであった。
【実施例３】
【００７１】
コドン最適化DNAを用いるヒトおよびマウスFHバリアントのさらなる開発;治療効果を高めるための精緻化
第1段階において、P.パストリスにおける合成コドン最適化遺伝子の発現の有用性および多機能性をさらに例示するために、本発明者らは、一連の11プラスミドベクター(ベクター番号1から11まで)を設計した(図4)。この一連のベクターは、標的FHバリアントのそれぞれに関して容易に探究することができる分泌経路の数を最大化するために、ベクター間のFHをコードするDNAを“カットアンドペーストすること”を可能にするように設計された。この目的は、ヒトFHに加えてマウスFHを生産することであった。なぜなら、マウスFHはマウスにおける試験に必要だからである。
【００７２】
第2段階において、(i)所望のアミノ酸残基配列、(ii)適切なエンドヌクレアーゼ制限部位の必要条件、(iii)増殖培地への分泌を促進するための、標的タンパク質のN末端における適切な分泌シグナル配列(ペプチド)の組み込み(iv)FH由来の生物医薬品を最適化するために必要な情報を蓄積することを目的とする、図7に概略を示した戦略の追及、に基づいて、コドン最適化を目的とする11DNAインサート(配列情報に関しては図5参照)が本発明者らによって設計された。
【００７３】
第3段階において、構築物番号1から11までを作成するためのコドン最適化および遺伝子合成(図5に概略を示す)は、Geneart社(レーゲンスブルク、ドイツ)が独自の技術およびGeneOptimizer(登録商標)ソフトウェアを用いて行った。Geneart社はまた、この11構築物を発明者が提供したプラスミドに組み込んで、ベクター番号1から11までを作成することを請け負った(図4)。
【００７４】
実施例2に記載した組換え体ヒト(rhFH)の製造において、rhFHの分泌を命令し、それによって精製を容易にするために我々はプレプロリーダー(シグナル)配列を用いた。その研究において、エンドペプチダーゼ(kex2プロテアーゼ)切断部位によって標的配列からプロ領域を分離し、次いで切断部位の接触性を高めるために2つのGlu-Alaジペプチドを導入した。天然配列の生成には、kex2プロテアーゼによってプロ領域を除去し、次いでste13遺伝子生成物のジペプジルアミノペプチダーゼ作用によってGlu-Ala除去することをあてにした。ste13による不十分な切断は、時には潜在的に免疫原性であるN末端Glu-Ala対をもたらす場合がある。この可能性を排除するために、ベクター番号1の作成中に前記Glu-Alaジペプチドの1つまたは両方をコードするコドンを避け、さらに、hFHの天然分泌シグナル配列および酵母分泌経路酵素によるプロセシングを利用するために構築物1を設計した。従って、ベクター番号1を用いることによって、我々の最初の組換え体hFHに含まれていたN末端発現アーチファクト(NH2-Glu-Ala)は存在せず、前もって存在するクローニングアーチファクト(Ala-Gly)の存在は回避される。さらに、ベクター番号1を用いることによって、rhFHは、実質的に変異されて保護ハプロタイプ(I62、Y402)を生じる(IY-hFHの作成)。
【００７５】
ピキア・パストリスは、通常、Asn-Xaa-Thr/Serシークオンに高マンノース型N-グリカンを導入し、不均一で、潜在的に免疫原性を有する生成物を生じる。これらのグリカンは、末端シアル酸を欠き、肝アシアロ糖タンパク質受容体による迅速なクリアランスに感受性を有すると考えられる。他方では、グリコシル化は組換え体タンパク質のフォールディングおよび安定性を助けることができ、元の研究では、我々は、発現後、精製前、または第1精製段階後に酵素的にrhFHからP.パストリスN-グリカンを除去した。構築物番号2は、N-グリコシル化部位におけるAsn残基がGln残基に置換されるように設計した(図5)(allQ-IY-hFHを作成)。従って、ベクター番号2によって、関連性のあるAsn残基をGln残基に変異させることによって、9つの(潜在的)N-グリコシル化シークオンの中から、通常はふさがっている8つを欠くFHを生産する結果を評価することが可能である。従って、ベクター番号2を用いて、我々は、保護ハプロタイプに対応するが、N-グリコシル化部位を有さないallQ-IY-hFHを生産し、分泌させ(ヒト-FH分泌シグナル配列によって)、精製した(図6参照)。Endo Hfでの処理の前後でのSDS-PAGE上の移動に差異が観察されないことを基に、この物質はグリカンを含まないことを我々は明らかにした。
【００７６】
構築物3は、IY-hFHにおける潜在的にN-グリコシル化されるAsn残基と非天然アミノ酸、例えばp-(プロパルゴキシ)フェニルアラニン(pPpa)との置換を可能にするためにアンバーコドンを利用する(unN-IY-hFHの作成)(図5参照)。低い長期免疫原性および半減期の増加は、患者におけるヒトFH機能の補充に適した生物医薬品の本質的特性である。この点に関して、ポリ(エチレン)グリコール(PEG)の結合は証明された戦略である(例えば、PEGylation, successful approach to drug delivery. Veronese FM, Pasut G. Drug Discov Today. 2005; 10:1451-8 を参照のこと)。PEG化の代替物は、高用量および反復投与が関係する場合にPEGよりも利点を有しうる生体内分解性 ポリシアル酸 鎖との結合を含む(例えば、Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids. Gregoriadis G, Jain S, Papaioannou I, Laing P. Int J Pharm 2005 300:125-30 を参照のこと)。当然のことながら、生物医薬品として潜在性を改善するために、多数の他のポリマーをhFHに結合させることができる。例えば、第一級アミンに対して無作為に行うPEG化またはポリシアリル化は簡単ではあるが、しばしば、不均一な生成物およびタンパク質の結合領域に立体障害をもたらす。部位特異的改変がはるかに望ましい。P.パストリスを我々の好ましい発現系として使用することによって、我々はこの望ましい選択肢を利用することができる。実際、非酵母真核発現系に対するP.パストリスの大変顕著な利点は、1つまたは場合により2つの関連性のあるAsn残基を天然にはコードされないアミノ酸残基に容易に置換できる可能性である(このことは他の真核発現系でも可能であるが、より簡単ではなく、必要な収量でタンパク質を生産することが予想されない)。
【００７７】
従って、ベクター番号3でP.パストリスをトランスフェクトすることによって、必要なtRNAおよびアミノアシルtRNAトランスフェラーゼを有するプラスミドに加えて、改変残基をマスクし、グリコシル化部位を除去する一方で、タンパク質の他の生物医薬特性を潜在的に高める化学合成ポリマーとの部位特異的共有結合改変の選択肢を我々は導入する。これらの残基は、他のタンパク質に対する結合に直接に関与しないことに留意すべきである。なぜなら、それらは通常はN-グリコシル化され、C3bまたはGAG-結合に関与しないことを我々が前もって示したFHのモジュール内に位置するからである。用いられる非天然アミノ酸の組み込みのための系は、“クリック”ケミストリーを用いる側鎖改変に適したpPpaの組み込みのためにSchultzによって開発された系である(Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic meast Pichia pastoris. Young TS, ahmad I, Brock A, Schultz PG. Biochemistry 2009 48:2643-2653)。これには、進化分子工学を用いてE.コリにおいて開発された直交tRNA/tRNAおよびアミノアシル-tRNA合成酵素の対を利用する。これによって、まず第一に、unN-IY-hFHの生物学的および生物物理学的特性をIY-FH(酵素による脱グリコシル化後)およびallQ-IY-hFHのそれらと比較することが可能になる。当然のことながら、結合のための代替化学経路を提供する、pPpaの代わりの他の非天然アミノ酸を組み込ませることができる。例えば、我々は、アゾ基または他の反応性基を有する非天然アミノ酸を組み込むことができる。多くのこのような可能性は、Youngらよる上記の論文に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本願に組み込まれる。N-グリコシル化部位におけるAsn残基以外の他の残基、例えば、Asn残基の2残基後に見いだされるSerまたはThr残基を非天然アミノ酸と置換することができることもまた明らかであろう。
【００７８】
続いて、unN-IY-hFHをPEG化して我々の候補医薬品であるPEG化-hFHを作成するためにクリックケミストリーが用いられる(図7)。比較のために、我々はallQ-IY-hFH内のLys残基を非特異的にPEG化する(PEGX-hFHの作成)。これらのタンパク質の作成は次のとおりである。アゾ誘導体化PEGは市販されており、これらはCu(I)触媒アジド-アルキン環化付加において、pPpaのプロパルギル基と反応して高収量の1,2,3-トリアゾールを与える。当然のことながら、pPpaの代わりにアゾ-アミノ酸残基を組み込み、次いでコンジュゲートとしてプロパルギル-PEGを使用することが可能である。他のポリマーとの結合もまた同様に実行可能であることもまた明らかであろう。このようにして、我々は、部位特異的にFHのPEG化バージョンを作成する。種々の鎖長および分枝鎖の使用を探査することが可能である。部位特異的結合生成物と比較のために、我々は、組換え体タンパク質の第一級アミンにスクシンアミドエステル活性化PEGを無作為に結合させる確立されたプロトコルを用いる(Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions. Veronese FM. Biomaterials. 2001, 22:405-17 およびその中の引用文献を参照のこと)。適切な化学量論比で活性化PEGの均一な調製物を用い、生成物を分取し分析することによって、モノ/ジPEG化タンパク質の確定した位置異性体が得られる。これらの操作をIY-hFHに行ってPEGX-IY-hFHを作成する。このように、部位特異的PEG化と無作為PEG化の相対的利点を比較することが可能である。当然のことながら、PEG化の代わりにポリシアリル化に同様なアプローチを容易に広げることができる。
【００７９】
種々の生成物、例えばhFH、IY-hFH、allQ-IY-hFH、unN-IY-hFH、PEG-hFHおよびPEGX-hFHの比較に関しては、我々はそれらのC3b-およびGAG-結合特性ならびに生物活性を探究する。従って、以下に関して、純粋かつ立証された試料を試験する:(i)C3bの因子I触媒切断の補因子として機能する能力(図3D参照)(Enzymic assay of C3b receptor on intact cells and solubilised cells. Sim E, Sim RB. Biochem J. 1983, 210: 567-76);(ii)表面プラズモン共鳴(SPR)センサーチップに固定したC3bBbの減衰の加速を促進する能力(Decay-accelerating factor must bind both components of the complement alternative pathway C3 convertase to mediate efficient decay. Harris CL, Pettigrew DM, Lea SM, Morgan BP. J Immunol. 2007 178:352-9)(図3F参照);(iii)SPRによって測定される、センサーチップに固定されたC3bに対する親和性(A new map of glycosaminoglycan and C3b-binding sites on factor H. Schmidt CQ, Herbert AP, Kavanagh D, Gandy C, Fenton CJ, Blaum BS, Lyon M, Uhrin D, Barlow PN. J Immunol. 2008 181:2610-9)(図3G参照;(iv)ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーまたはゲル移動度シフトアッセイによって測定されるGAGに対する親和性(Disease-associated sequence variations congregate in a polyanion recognition patch on human factor H revealed in three-dimensional structure. Herbert AP, Uhrin D, Lyon M, Pangburn MK, Barlow PN. J Biol Chem. 2006 281:16512-20);(v)FH枯渇ヒト血清(Complement Technologies社から入手できる)により補体媒介溶血からヒツジ赤血球を保護する能力-ヒトFHの標準的生物学的アッセイ(Critical role of the C-terminal domains of factor H in regulating complement activation at cell surfaces. Ferreira VP, Herbert AP, Hocking HG, Barlow PN, Pangburn MK. J Immunol. 2006 177:6308-16)(see Figure 3J);(vi) 補体媒介損傷からヒト細胞を保護する能力(Role of membrane cofactor protein (CD46) in regulation of C4b and C3b deposited on cells. Barilla-LaBarca MK, Liszewski MK, Lambris JD, Hourcade D, Atkinson JP. J Immunol. 2002 168:6298-304; Inhibiting complement activation on cells at the step of C3 cleavage. Liszewski MK, Fang CJ, Atkinson JP. Vaccine. 2008, 26 Suppl 8:I22-7。
【００８０】
構築物番号4において、2つのアンバーコドンが組み込まれており、タンパク質生成物は、一対のコンジュゲートの部位特異的配置に適している。この構築物を用いれば、第2PEG化部位導入の実現可能性を探究することが可能であるが、一般に各非天然アミノ酸残基組み込みに伴う収率の減少が予想される。この例において、我々は、タンパク質の中央の隣接するモジュール(モジュール12および13)において結合部位を選択した。これらの部位をFH分子の他の部分にある結合部位を障害しないでPEG化できるばかりでなく、蛍光顕微鏡検査および組織学ならびに診断法に潜在的用途を有するヒトFHの蛍光バージョンをもたらす蛍光プローブの結合のために使用することもできる。あるいは、これらの部位は、プローブ間の距離測定を提供し、推論によって、FHの有効性を最適化する目的でタンパク質工学アプローチの仮設および設計を作成するのに役立つ構造情報を提供する電子常磁性共鳴分光に利用できる常磁性部分との結合に使用できる。
【００８１】
ベクター4および5は、酵母α因子分泌シグナルペプチドをコードするDNAを組み込んでいる。なぜなら、そのことは、天然ヒトFH分泌シグナルペプチドに対応する経路以外の分泌経路を探究するのに潜在的に有利だからである。ベクター4はNH2-Glu-Alaに対応したコドンを組み込んでいるが、ベクター5はそうではない。それによって、分泌シグナルペプチドのタンパク質分解プロセシングの効率に関してGlu-Alaスペーサーの役割を試験する機会が提供される。
【００８２】
ベクター6(α因子/無EA戦略を使用)は、FH欠失の例をコードする構築物を組み込んでいる。この用語は、NおよびC末端の近位の2つの主要なC3bおよびGAG-結合部位を結び付けている領域内で1以上の中央ドメイン(またはモジュール)を欠いているFHのバージョンのことを言う。このような欠失は、研究および治療用途のためのhFHのよりコンパクトなバージョンを作成する機会を意味する。この例(ベクター6)においては、モジュール10〜15が欠失されている(結果については図6を参照のこと)。FH構造のモジュール方式を考慮すれば、任意の数または組み合わせのモジュールを欠失させること(あるいは、いずれかの末端でFHを短縮させてFH短縮体を作成すること)が可能であることは明らかであろう。これらの欠失されるドメインのいずれかと、他のタンパク質からの相同または非相同ドメインとを置換することも容易である。ベクター11は、我々の戦略を用いて、有用な量で容易に生産することができるFH変異体の例の製造のために設計された。この例において、9つの塩基性アミノ酸残基がGln(中性)残基に置換されている。この場合に選択された塩基性アミノ酸は、ヒトFHのモジュール13で著しく正に荷電したパッチを形成している(The central portion of factor H (modules 10-15) is compact and contains a structurally deviant CCP module. Schmidt CQ, Herbert AP, Mertens HD, Guariento M, Soares DC, Uhrin D, Rowe AJ, Svergun DI, Barlow PN. J Mol Biol. 2009 Epub. Oct 14.)。このことは、偶然に進化したとは考えづらく、FHの生物学的作用機構において今だ理解されていない結合の役割が存在する可能性がある。従って、我々は、治療用タンパク質を製造し、そして構造機能相関に光明を投じ、そしてその故に優れた治療効果を有するFHのデザイナーバージョンの操作に光明を投じるアッセイのためのFHのバージョンを製造するために、我々のタンパク質製造戦略を利用する。
【００８３】
7から10まで番号付けされたベクターのサブセットは、コドン最適化DNAを用いてP.パストリスにおいてマウスFH(mFH)を製造するために設計された。これらのタンパク質生成物は、疾患のマウスベースモデルにおいて生物医薬品としてのFHの評価に役立つ。ベクター7、9および10は、天然mFH分泌シグナル配列を利用し、ベクター8は、酵母α因子分泌シグナルのためのDNAを含む(Glu-Ala無し)。構築物7は、野生型mFHをコードし、構築物8および9は、ヒトFHのallQ-およびunN-(すなわちアンバー)バージョンのマウス等価物をコードする(すなわちヒトバージョンにおけるように、mFHのN-グリコシル化部位の1つまたは2つが、部位特異的結合部位として再操作されている)(allQ-mFHおよびunN-mFH)。PEG化(またはポリシアリル化されたタンパク質)は、hFHに関して記載されているように構築された。構築物10は、mFHの2つのアンバーコドンバージョンをコードし、残りのグリコシル化部位(モジュール1〜4および19〜20におけるグリコシル化部位を除く)において、AsnがGlnに置換されている。
【００８４】
ベクター1〜11のタンパク質生成物の臨床的可能性を評価するために、我々はベクター7〜10の生成物から始め、これらを(i)制御されていない血漿C3活性化を有し、DDD(Uncontrolled C3 activation causes membranoproliferative glomerulonephritis in mice deficient in complement factor H. Pickering MC, Cook HT, Warren J, Bygrave AE, Moss J, Walport MJ, Botto M. Nat Genet 2002 31:424-8)および網膜の異常(Complement factor H deficiency in aged mice causes retinal abnormalities and visual dysfunction. Coffey PJ, Gias C, McDermott CJ, Lundh P, Pickering MC, Sethi C, Bird A, Fitzke FW, Maass A, Chen LL, Holder GE, Luthert PJ, Salt TE, Moss SE, Greenwood J. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:16651-6) を発症するFH-ノックアウトマウス(FH-/-)、ならびに(ii)AHUS(Spontaneous hemolytic uremic syndrome triggered by complement factor H lacking surface recognition domains. Pickering MC, de Jorge EG, Martinez-Barricarte R, Recalde S, Garcia-Layana a, Rose KL, Moss J, Walport MJ, Cook HT, de Cordoba SR, Botto M. J Exp Med 2007 204:1249-56.)を発症するFHトランスジェニックマウス(CFH-/-デルタ16〜20(ここでは、事実上、モジュール1〜15からなる短縮型FHが完全長FHに置き換わっている)において試験する。タンパク質収率、バイオアッセイおよび標準的な毒物学研究を含む一連の考察に基づいて、我々は最良の候補(単数または複数)を選択する。例えば、allQ-mFH、PEG-mFHおよび/またはPEGX-mFH(低い免疫原性を有すると推定される)がFH-/-マウスにi.v./i.p.注入される。血清において最大の補体制御を達成し、mFH半減期を評価するのに必要なmFHの最適の1回量を滴定するために、補体成分C3、因子Bおよび天然に発現されるマウスFH(ならびに組換え体mFH)のレベルがELISAによって測定される。最適化された投与計画を用いて、我々はDDDおよび網膜の異常に対してmFHの有効性を評価する。8ヶ月(腎臓)/24ヶ月(網膜)にわたってFH-/-マウスの生存、腎機能(尿アルブミン、血清尿素)および網膜の異常(行動検査および電気生理学的検査)を評価し、未処理のFH-/-マウスと比較する。これら2群における糸球体および網膜の病状における差異を評価するために、組織学的検査(光学顕微鏡法、免疫蛍光法ならびに蛍光および電子顕微鏡検査)を用いる。これらのFH欠損マウスにおけるmFHに対する抗体の生成はELISAベースアッセイで評価される。aHUSにおける我々の生成物(単数または複数)の有用性は、CFH-/-デルタ16〜20マウスにおける類似の実験によって決定される。
【００８５】
10リットル発酵当たりタンパク質数グラムの範囲の製造レベルを達成するために、さらなるDNA操作および発酵技術の最適化によってhFHの収率を改善することを我々は続けている。P.パストリスに関する文献において、1リットル当たりタンパク質100〜500mgの発現レベルが報告されている。収率を改善するための利用可能な多数の戦略は、RNA二次構造を減少させるためのDNA配列のさらなる改善;可能であれば、潜在的タンパク質分解部位の除去;複数組み込み事象に起因する高コピー数形質転換細胞の広範囲のスクリーニングおよび選択;タンパク質分解を最小限にするための培養条件、例えば撹拌、酸素供給、pH、温度および試薬(例えばEDTA、アミン塩、カザミノ酸)の添加の選択;グリセロール/メタノールの供給タイミングおよび速度(例えば、Expression of recombinant proteins in Pichia pastoris. Li P, anumanthan a, Gao XG, Ilangovan K, Suzara VV, Duzgune N, Renugopalakrishnan V.appl Biochem Biotechnol. 2007 142:105-24 に概説されている)を含む。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え体H因子ならびにそのバリアントおよびコンジュゲート、それらの製造方法に関し、加えて前記物質を含む治療用途および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系制御糖タンパク質、H因子(factor H（FH)）は、十分な量で生産され、適切な薬動力学的および薬力学的性質が付与されれば、新規生物医薬品（生物治療剤（biotherapeutic agent））として役立つことが、ますます多くの根拠によって示唆されている。この医薬品は、遺伝的に罹患しやすい個体における加齢黄斑変性(AMD)の発症を抑え、AMDならびに非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)およびデンスデポジット病(DDD)として知られる2つの生命を脅かす腎疾患を有する固体における治療を容易にする。さらに推論すれば、この医薬品は、不十分な補体制御が病因または症状に寄与する多数の他の疾患の治療または予防に有益な効果を発揮することができると考えられる。
【０００３】
しかしながら、組換え細胞における遺伝子の過剰発現によってFHを生産する現行の試みは、治療に必要な量を得ることに失敗しており、他方では、FHの適切なバリアントの十分な量をヒト血漿から精製することは、論理的にも技術的にも困難であり、健康リスクが存在する。最小限の免疫原性、長時間の半減期および最大の有効性を有する複数グラム量のFHの生物医薬品グレード組換え体バージョンの、まだ対処されていないさしせまった臨床的および商業的ニーズがある。
【０００４】
FHにおける多型と疾患に対する感受性との間の関連については、文書による十分な裏づけがあり、例えば:Opportunities for new therapies based on the natural regulators of complement activation. Brook E, Herbert AP, Jenkins HT, Soares DC, Barlow PN. ann N Y acad Sci 2005 1056:176-88; Complement factor H: using atomic resolution structure to illuminate disease mechanisms. Barlow PN, Hageman GS, Lea SM. adv Exp Med Biol. 2008 632:117-42; Translational mini-review series on complement factor H: renal diseases associated with complement factor H: novel insights from humans and animals. Pickering MC, Cook HT. Clin Exp Immunol 2008 151:210-30; Translational mini-review series on complement factor H: genetics and disease associations of human complement factor H. de Cordoba SR, de Jorge EG. Clin Exp Immunol. 2008 151:1-13 に概説されている。
【０００５】
これらの概説が公表されて以後、多数のさらなる公表された発見によって、FHベース治療の潜在的標的の範囲は広がっている。最近の2つの例は、FH遺伝子(CFH)多型(Y402H)と心血管疾患(CVD)に対する感受性との間の関連を立証している。Koeijvoets ら(Complement factor H Y402H decreases cardiovascular disease risk in patients with familial hypercholesterolaemia. Koeijvoets KC, Mooijaart SP, Dallinga-Thie GM, Defesche JC, Steyerberg EW, Westendorp RG, Kastelein JJ, van Hagen PM, Sijbrands EJ. Eur Heart J. 2009 30:618-23)は、高コレステロール血症によって早発性CVDのリスクが極めて高い患者の中で、Y402 CFHバリアントはCVDに対する感受性と逆相関することを示し、CFHはCVDのリスクを緩和することを示唆した。透析患者における末期の腎不全に関するBuraczynskaらによる研究(Complement factor H gene polymorphism and risk of cardiovascular disease in end-stage renal disease patients.Buraczynska M, Ksiazek P, Zukowski P, Benedyk-Lorens E, Orlowska-Kowalik G. Clin Immunol. 2009; 132:285-90)において、多変量ロジスティック回帰分析により、Y402H遺伝子型は、心血管合併症と独立して関連していることを示した。H402対立遺伝子の同型接合体では、オッズ比が7.28(95%CI 5.32〜9.95)であった。他の最近の新事実において、Moreno-Navarrete ら(Complement Factor H is expressed in adipose tissue in association with insulin resistance. Moreno-Navarrete JM, Martinez-Barricarte R, Catalan V, Sabater M, Gomez-ambrosi J, Ortega FJ, Ricart W, Bluher M, Fruhbeck G, de Cordoba SR, Fernandez-Real MJ. Diabetes 2009: Epub Oct 15)は、FHが、インスリン抵抗性と関連する脂肪組織において発現されることを示し、補体系の第二経路、肥満および代謝障害の間の関連を示唆した。
【０００６】
治療におけるFHの有効性を見込むデータは、すでに十分示されており、多数の開示、特許出願および会社設立が行われている。US2007/0020647は、種々の真核および原核タンパク質過剰生産ベクターならびに哺乳動物細胞株によるヒトCFHの発現を記載しているが、ヒト肺癌細胞株A549における発現が例示されているに過ぎない。この細胞株から得られる組換え体タンパク質の量は開示されていないが、前例に基づき、それとは反対の根拠がないことを考慮すれば、量は治療目的には不十分であると思われる。WO2007/038995は、aHUSを治療するためのヒトH因子の使用を説明している。この特許出願は、組換え体FHの使用について述べているが、組換え体FHの製造方法のついての詳細な説明はなく、ヒト血漿からのFHの精製に焦点が合わされている。
【０００７】
このように、上記の2つの文書は、組換え体FHを治療に使用するという考えを開示しているが、どちらの文書も、実際には、治療用途に絶対に必須である組換え体FHの大規模製造を教示していない。本明細書で説明するように、このことは簡単な仕事ではない。
【０００８】
機能活性が保持された純粋な組換え体完全長FHの大量(10mgを超える)製造の成功は、科学文献または特許文献において今まで報告されていない。実際、上記の特許を証拠立てるデータは限られており、これらの著者らは、わずかな量(約1mg未満)の組換え体FHを製造する能力を示したに過ぎず、彼らは、この物質を精製または解析したという根拠を示さなかった。さらにまた、文献報告は、同様に、昆虫および哺乳動物細胞からのミリグラム以下の量の組換え体FH(例えば、Biologically active recombinant human complement factor H: synthesis and secretion by the baculovirus system. Sharma AK, Pangburn MK. Gene 1994 143:301-2; Structural and functional characterization of factor H mutations associated with atypical hemolytic uremic syndrome. Sanchez-Corral P, Perez-Caballero D, Huarte O, Simckes AM, Goicoechea E, Lopez-Trascasa M, de Cordoba SR. Am J Hum Genet 2002 71:1285-95.)またはFH分子のフラグメントの発現(例えば、Structure of the N-terminal region of complement factor H and conformational implications of disease-linked sequence variations.Hocking HG, Herbert AP, Kavanagh D, Soares DC, Ferreira VP, Pangburn MK, Uhrin D, Barlow PN.J Biol Chem 2008 283:9475-87)をほのめかしている。
【０００９】
Ormsby, R. J. et al., Expression of human factor H in the methylotrophic yeast Pichia Pastoris. Molecular Immunology Vol 35, p.353, 1998 abstract 92. この論文は、本特許出願の対象である完全長TWENTY(20)CCP H因子タンパク質ではなく、FIVE(5)補体制御タンパク質(CCP)H因子フラグメントを発現するために、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)を用いている。
【００１０】
Ripoche, J. et al., The complete amino acid sequence of human complement Factor H. Biochemical Journal, Vol 249: 593-602, 1988. この論文は、完全長ヒトH因子ヌクレオチド配列を(従って、アミノ酸配列を)記載しており、その配列は、H因子遺伝子にまたがる3つのオーバーラップするcDNAクローンを配列決定することによって得られた。しかしながら、この論文は、機能性ヒトH因子タンパク質を発現するための遺伝子のクローニング方法を記載していない。
【００１１】
EP1336618は、医薬品として使用するための可溶性補体制御因子として完全長またはフラグメントのブタH因子を用いることを記載している。ブタH因子は、ブタ血漿から精製することもできるし、本特許において例示されるように、バキュロウイルスを用いて組換えにより製造されることもできることが示唆されている。しかしながら、標準的な発酵からの完全長ブタH因子の量の定量も示されていないし、完全長タンパク質(フラグメントのみではなくて)の機能性データも示されていない。しかしながら、機能性ヒトH因子を発現する方法の開示もなければ教示もない。
【００１２】
ブタH因子の使用は、本来、異種間人獣共通感染による感染のリスクを有する。さらに、ヒトH因子とブタH因子との間にDNA配列またはアミノ酸の完全な相同性は存在しない(62%の相同性、Hegasy G.A. et al., Pig complement regulator factor H: molecular cloning and functional characterization. Immunogenetics. 2003 Oct;55(7):462-71)。従って、ブタH因子に対する自己抗体ができる可能性が大変高く、そのことが、また一方で治療用途を制限すると考えられる。
【００１３】
WO2008/135237は、H因子のショートコンセンサスリピート(SCR)と病原体認識結合分子、例えば抗体とを結びつける医薬品の使用を記載している。この公報は、100未満のアミノ酸のフラグメント/ペプチド鎖(<2SCR)の使用を具体的に述べている。この公報は、病原体認識結合分子を有する完全長H因子分子の使用を示唆していない。同様に、この公報の重点は、感染または癌の治療のための使用であって、腎疾患または眼科疾患の治療のための使用ではない。
【００１４】
現在、FH補充臨床治療(FH-replacement clinical therapy)は、献血血液で製造したプール血漿を注入することによって行われているが、FHは多くのタンパク質成分の1つに過ぎない。FH Y402アロタイプ(AMDを防ぐ)のみを含む血漿を臨床的にルーチンに得ることは不可能である。プール血漿からのバルクで精製する場合、FHはそのヘテロタイプおよびグリコフォーム変異の両方に関して不均一であり、従って、この物質は治療には不適当である。抗体親和性に基づく精製方法では、一般に、小量(多くて数mg)の物質が得られるに過ぎず、変異の特定部位における単一バリアント(例えばY402)に関して富化することができるが、他の多型部位(例えばV62I)に関しては不均一である。AMD、AHUSおよびDDDの治療に関して提案されているように、反復して用いられる場合、血漿由来ヒトタンパク質の使用は、すべて、いずれにせよ、未知のウイルスおよびプリオンタンパク質の両方による感染ならびに混在する血漿成分に対する感作という許容できないリスクを有する恐れがある。
【００１５】
従って、FHの治療への使用に対する前述の障害の少なくとも1つを回避し、かつ/または緩和することが本発明の目的の1つである。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、例えば、好ましくはピキア・パストリスにトランスフェクトされ、次いでファーメンター中で発現され、一連のクロマトグラフ法を用いて精製されたコドン最適化化学合成遺伝子に基づく、動物およびヒト試験ならびに治療用途に合わせたFHバージョンの高収量製造を提供するために本発明者らによって行われた研究に基づく。
【００１７】
第1の側面において、組換え体哺乳動物FHの製造方法であって、前記哺乳動物FHまたはそのバリアントを得るために、選択した宿主生物における発現のためにその核酸配列がコドン最適化され、適切に設計されたベクターに挿入された、前記哺乳動物のFHまたはそのバリアントをコードするコドン最適化核酸配列を、選択した宿主生物において発現させる段階を含む前記方法が提供される。
【００１８】
好都合には、必要なコドン最適化を行うために、クローニングし変異を導入するのではなく、初めにコドン最適化核酸配列を化学合成することができる。本発明によれば、従来の技術を用いては今まで不可能だった、大量の組換え体哺乳動物FHおよびそのバリアントを生産することが可能である。一般的には、本発明の方法によって、培地1リットル当たり少なくとも0.5mgの組換え体FH(またはそのバリアント)のタンパク質収量を生産することができ、例えば培地1リットル当たり少なくとも1mg、5mg、10mg、50mg、100mg、200mgまたは500mgのタンパク質収量を生産することができる。従って、本発明の方法によれば、工業規模ファーメンターを用いた場合、従来の方法でクローニングされた組換え発現されたFHでは全く不可能だった、数百ミリグラムまたは数グラムまたはキログラム量までもの組換え体FHおよびそのバリアントを生産することが可能であることは明らかであろう。
【００１９】
上記の方法は、細胞および/または細胞が増殖している培地から前記タンパク質を精製することをさらに含むことができる。精製は、一般的には、当該技術分野で公知の高速タンパク質液体クロマトグラフ技術または高速(高圧)液体クロマトグラフ技術などのクロマトグラフ法の使用を含むことができる。例えば、この核酸配列は、FHが培地中に分泌され(前記シグナル配列ペプチドが切除された後)、それによって、それが最初に細胞内P.パストリス(P.pastoris)のタンパク質から分離されるように、FHのN末端に融合される分泌シグナル配列であるアミノ酸残基をコードするように設計されることができる。その後の精製段階において、粗生成物は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム、例えばリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で平衡させたヘパリンセファロースカラムに添着させ、複数倍カラム容積の高塩(例えば1M NaCl)を添加したPBSを用い勾配をかけて溶出することができる。さらなる段階において、前の段階からのFH含有フラクションは、例えばイオン交換樹脂含有カラム、例えば20mMグリシン緩衝液(一般的にはpH9.5、150mM NaCl)で平衡させたGE Healthcare社製MonoQカラムに添着させ、次いで、同じpHで高塩(例えば1M NaCl)を添加した平衡緩衝液を用い、複数倍カラム容積で勾配をかけて溶出することができる。
【００２０】
発現されたタンパク質のリフォールディングは必要なく、タンパク質は培地に分泌されることができ、従って利用しやすく、特定の複合糖質または非天然型アミノ酸残基を組換え生成物に組み込むことができるという理由から、好ましい宿主生物の選択はピキア・パストリスであるが、他の原核宿主生物(例えばエシェリヒア・コリ(Escherichia coli))および真核宿主生物(例えばサッカロミセス・セレビシエ(Sacchyromyces cerevisiae))もまた考えられる。
【００２１】
言及した哺乳動物FHは、ヒトFHまたは他の霊長類FHまたは他の哺乳動物FH、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラクダ、ネコ、モルモットFHなどであることができる。
【００２２】
このデオキシリボ核酸(DNA)配列は、適切に切断された発現ベクターへのクローニングを容易にするために、この核酸の5’および3’末端に特有の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むことができる。好ましい制限部位は、PstI、BamHI、NotIおよびXbaIであるが、当業者は、他の制限部位を容易に考えることができる。
【００２３】
FHをコードする核酸配列は、多くの野生型配列(当該技術分野で多型バリアントとして知られる)の1つに関連することもできるし、変異体配列であることもできる。この配列は、当該技術分野で公知の1以上の一塩基多型を含むことができる。例えば、US2007/0020647は、ヒトCFHにおいてこれまで同定された多くの多型を記載しており(この内容は、参照により本願に組み込まれる)、将来においてより多くのこのような多型バリアントが見出される可能性がある。これらの1以上は、コドン最適化核酸配列に容易に組み込まれることができる。個々に、または組み合わせで、コドン最適化核酸配列に組み込むことができる好ましい一塩基多型は、そのタンパク質配列において以下の変異をコードすることができる:Ile62(Valよりはむしろ)、Tyr402(Hisよりはむしろ)、Glu936(Aspよりはむしろ)および/またはArg1210(Cysよりはむしろ)(数はすべて、シグナル配列切断前のコードされたタンパク質の配列を指す(Swiss-Prot:P08603.4))。このような一塩基多型およびハプロタイプは、平均より低いAMD発症リスクと関連していることが報告されている(Hageman GS et al. a common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration. Proc Natl acad Sci U S a 2005 102:7227-32; Klein RJ et al.Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 2005 308:385-9; Edwards AO et al. Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration. Science 2005 308:421-4; Haines JL et al. Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration. Science 2005 308:419-21; Hageman GS et al. Extended haplotypes in the complement factor H (CFH) and CFH-related (CFHR) family of genes protect against age-related macular degeneration: characterization, ethnic distribution and evolutionary implications. ann Med 2006 38:592-604)。これに代えて、あるいはこれに加えて、FH ポリペプチド配列を特異的に改変するように変異体配列を設計して、例えば、以下にさらに詳細に説明する1以上の天然の(コードされた)または天然にはコードされないバリアントアミノ酸を含ませることができる。
【００２４】
コンジュゲートは、通常は1以上のアミノ酸残基側鎖を介して化学的部分(単数または複数)に共有結合したFHまたはFHのバリアントに対応するポリペプチドからなる分子のことを言い、前記分子の生物医薬特性（生物治療特性（biotherapeutic properties））を改善することを目的としている。結合される部分は、グリコサミノグリカンおよびその誘導体もしくはポリシアル酸、デキストラン(-1,6ポリグルコース)、デキストラン(-1,4ポリグルコース)、ヒアルロン酸およびキトサンを含む天然ポリマー;非天然ポリマー、例えば直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコール、ポリエーテルポリオール、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(エチレンイミン)もしくは直鎖ポリアミドアミンなどの大きなファミリーのいずれか;または疑合成ポリマー、例えばポリ(L-リジン)、ポリ(グルタミン酸)、ポリ(リンゴ酸)およびポリ(アスパルトアミド)を含むことができる(例えば、The dawning era of polymer therapeutics. Duncan R. Nature Reviews Drug Discovery 2003 2:347-360 を参照のこと)。
【００２５】
従来の遺伝子クローニングおよび発現ではなく、本発明は、当該技術分野の遺伝子設計および合成技術(例えば、Gene composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis. Lorimer D, Raymond A Walchli J, Mixon M, Barrow a, Wallace E, Grice R, Burgin A, Stewart L. BMC Biotechnol. 2009 9:36)を用いて、前記FH(およびそのバリアント)をコードするコドン最適化DNA分子を初めに化学合成することに基づく。このように、コドン最適化核酸は、適切な発現ベクターへのクローニングの前に新規合成される。FH遺伝子のコドン最適化を行うための当該技術分野で公知の従来の部位特異的変異誘発技術は、不可能ではないにしても、追加の突然変異を導入するハイリスクのために、部位特異的変異誘発に必要な反復ラウンド中に実行不可能なまでに時間がかかるであろう。しかしながら、生成物において1つまたは組み合わせの部位特異的変異を行わせるために、合成コドン最適化CFHのクローニングに続いて部位特異的変異誘発を用いることはできる。
【００２６】
所望の宿主生物、例えばP.パストリスにおいて、哺乳動物FHおよびそのバリアントの発現レベルを高めるためにコドン最適化が行われる。前記最適化は、以下:選択した宿主生物のコドンバイアスとマッチするようにコドンバイアスを適合させること;高(>80%)または低(<30%)GC含量の領域を避けること;潜在的内部TATAボックス、chi部位およびリボソーム侵入部位をいずれも最小限にすること;配列のATリッチもしくはGCリッチストレッチを最小限にし、反復配列およびRNA二次構造を避け、(潜在的)スプライス供与および/またはスプライス受容部位をいずれも最小限にすること;および、クローニングを容易にするために、核酸の末端の5’および3’末端においてのみ任意の所望の制限エンドヌクレアーゼ部位が見いだされることを確かにすることの1以上を含む。好ましくは、核酸配列を最適化する際に、上記考察のすべてが考慮される。当業者は、選択した宿主のコドンバイアスに関する当該技術分野の従来の知識および他の教示(例えば、Codon bias and heterologous protein expression. Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J. Trends Biotechnol 2004 22:346-53)に基づいて元のFH配列にこのような改変を行うことができる。特定の会社、例えばGeneart社(レーゲンスブルク、ドイツ)、GeneScript社(ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国)およびDNA2.0社(メンロパーク、カリフォルニア州、米国)は、特定の宿主生物における発現に合わせた核酸配列を最適化し合成するサービスを提供している。
【００２７】
好ましい実施形態において、哺乳動物FHをコードするDNA配列は、宿主であるP.パストリスでの発現に最適化されたCFH配列である。図1において、P.パストリスコドン最適化ヒトCFH配列(位置402においてYを、位置62においてIを、位置936においてEをコードする)が野生型cDNA配列と比較される。P.パストリスにおける過剰生産のための配列をさらに最適化するために、コドン最適化配列を改変しうることは明らかであろう。さらに、種々のアロタイプの発現を可能にするために、配列を容易に改変することができる。さらに、FHタンパク質のアミノ酸残基配列を特異的に変えるために、特定のヌクレオチド塩基を改変ことができる。例えば、特定のアミノ酸残基を、例えば、改変グリコシル化パターン;低い免疫原性;血漿半減期の増加;および/または薬動力学的および/または薬力学的性質を改善するように設計された部位特異的結合、をもたらす1または組み合わせまでもの改変を有する組換え体FHタンパク質の作成を可能にするように、希少であるか、または天然に存在しないアミノ酸残基である代替アミノ酸残基と置換させることができる。任意のコドン最適化を考慮に入れながら、すべてのこのような改変を行うことができることは明らかであろう。
【００２８】
従って、他の側面において、本発明は、FHポリペプチドまたはそのバリアントを発現することができる核酸配列であって、宿主生物、例えばP.パストリスにおける発現のためにコドン最適化された前記核酸配列を提供する。本発明による核酸配列から得られる哺乳動物FHポリペプチドまたはそのバリアントもまた提供される。
【００２９】
好ましくは、配列はP.パストリスによる発現のためにコドン最適化されている。この場合、核酸配列は、図1に示したコドン最適化ヒト配列であることもできるし、図5に示した配列のいずれかであることもできるし、それらと実質的に同様であることもできる。実質的に同様なとは、図1または5に示された配列と、70%、75%、80%、85%、90%、95%を超えて、あるいは99%を超えてまでも同一であることと理解される。
【００３０】
本発明はまた、本発明のコドン最適化されたFHをコードするDNA配列を含むベクター、前記組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞ならびに、組換え技術によってコードされたFHおよびFH様ポリペプチドの製造および精製ならびに前記ポリペプチドの複合生成物に関する。
【００３１】
組換え構築物は、公知の技術、例えば感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション、エレクトロポレーションおよび形質転換を用いて宿主細胞に導入することができる。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターであることができる。レトロウイルスベクターは複製コンピテントであるかまたは複製欠損型であることができる。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に相補宿主細胞においてのみ起こる。
【００３２】
目的とするポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクター内に含まれることができる。一般に、プラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物の形態で、あるいは荷電脂質との複合体で導入される。ベクターがウイルスである場合、in vitroで適切なパッケージング細胞株を用いて目的とするポリヌクレオチドをパッケージングすることができ、次いで宿主細胞に形質導入されることができる。
【００３３】
目的とするポリヌクレオチドに対するシス作用調節領域を含むベクターが好ましい。適切なトランス作用因子は、宿主によって供給されるか、相補ベクターによって供給されるか、または宿主への導入時にベクター自身によって供給されることができる。
【００３４】
この点における特定の好ましい実施形態において、ベクターは特異的発現を提供し、誘導性および/または細胞型特異的であることができる。適切なベクターは、操作が容易な環境要因、例えば温度および栄養素添加物によって誘導されるものを含む。
【００３５】
本発明に有用な発現ベクターは、染色体由来、エピゾーム由来およびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピゾーム、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス由来のベクターならびにそれらの組み合わせ由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミドを含む。
【００３６】
DNAインサートは適切なプロモーターに作動可能に連結されていなければならない。本発明に使用するのに適した既知の細菌プロモーターは、E.コリ(E. coli)lacIおよびlacZプロモーター、T3およびT7プロモーター、gptプロモーター、ファージλPRおよびPLプロモーターならびにtacおよびtrpプロモーターを含む。適切な真核生物プロモーターは、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、レトロウイルス長端末反復(LTR)プロモーター、例えばラウス肉腫ウイルスのプロモーターおよびメタロチオネインプロモーター(例えばマウスメタロチオネイン-Iプロモーター)を含む。P.パストリスに特異的なプロモーターは、アルコールオキシダーゼ1(AOX1)、AOX2(共にメタノール誘導性)、CUP1(銅誘導性)、GAP(グリセロール誘導性、種々の炭素源に対して構成的活性型)、FLD1(ホルムアルデヒド脱水素酵素遺伝子)http://faculty.kgi.edu/cregg/PP strains.htm - pblhisix、PEX8 (中程度の プロモーター)http://faculty.kgi.edu/cregg/PP strains.htm - pblhisix、YPT1(中程度のプロモーター、種々の炭素源に対して構成的活性型)http://faculty.kgi.edu/cregg/PP strains.htm - pblhisix、DAS1 (ジヒドロキシアセトン シンターゼ)http://faculty.kgi.edu/cregg/PP strains.htm - pblhisix、ADH1(アルコール脱水素酵素)http://faculty.kgi.edu/cregg/PP strains.htm - pblhisixおよびPGK1(3-ホスホグリセリン酸キナーゼ)を含む。他の適切なプロモーターは当業者に公知であり、例えば、Cereghino and Cregg, 1999, Current Opinion in Biotechnology, 10, p422-427 を参照のこと。
【００３７】
発現構築物は、さらに、転写開始点、転写終結点および、転写領域内の翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳される核酸配列の開始部分に翻訳開始AUGを含み、終末部分に適切に配置された終止コドンを含む。遺伝子発現レベルおよび組換え体タンパク質収量を最大化するために、合成遺伝子を用いれば、インサートのこれらの特徴を最適化することは容易である。
【００３８】
前述のように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも1つの選択マーカーを含む。このようなマーカーは、真核細胞の培養のためには、例えばジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシンまたはゼオシン耐性を含み、E.コリおよび他の細菌の培養のためには、例えばテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【００３９】
適切な宿主の代表例は、細菌細胞、例えばE.コリ、ストレプトミセス(Streptomyces)およびサルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella Typhimurium)細胞;真菌細胞、例えばP.パストリス、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyceslactis)およびサッカロミセス・セレビシエなどの酵母細胞;昆虫細胞、例えばドロソフィラ・メラノガスターS2(Drosophila melanogastor S2)およびスポドプテラ・フルギペルダ9(Spodoptera frugiperda9)細胞;動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣、COSおよびBowes黒色腫細胞;ならびに植物細胞を含む。上記の宿主細胞の適切な培地および培養条件は当該技術分野で公知である。最も好ましくは、宿主生物は、メチロトローフ酵母P.パストリスである。哺乳動物またはヒト様N-グリカンに付着するように代謝を操作したP.パストリス株は好ましいと考えられる。Wildt and Gerngross, 2005, Nature Reviews, 3, p119-128, Li et al, 2006, Nature Biotechnology, 24, p210-215, Cereghino, et al, 2002, Current Oinion in Biotechnology, 13, p329-332 を参照のこと。
【００４０】
細菌に使用するのに好ましいベクターは、Qiagen社から入手できるpA2、pQE70、pQE60およびpQE-9;Stratageneから入手できるpBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A;ならびにPharmacia社から入手できるptrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5を含む。好ましい真核ベクターには、Stratagene社から入手できるpWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG;ならびにPharmacia社から入手できるpSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVLがある。P.パストリスに使用するのに好ましいベクターは、Invitrogen社からのpPIC9K、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pGaPZ、pGaPZalpha、pPICZalpha-A、pPICZalpha-B、pPICZalpha-C、pPICZalpha-E、pPICZalpha-E/Uni、pPIC3.5、pPIC9、pPICZ-A、pPICZ-B、pPICZ-C、pPICZ-Eを含む。他の適切なベクターは、当業者には明らかであろう。
【００４１】
前述のように、宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって行うことができる。このような方法は、多くの標準的実験マニュアル、例えばDavis LGG et al., Basic Methods in Molecular Biology, (2nd Ed., McGraw-Hill, 1995) に記載されている。
【００４２】
前述のように、本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは、所定の宿主細胞型において、プロモーターの転写活性を増加させる、通例約10〜約300bpのDNAのシス作用性エレメントである。エンハンサーの例は、複製起点の後期側(late side)のbp100〜270に位置するSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。
【００４３】
翻訳されたタンパク質の小胞体内腔、細胞膜周辺腔または細胞外環境への分泌のために、発現されるポリペプチドに適切な分泌シグナルを組み込むことができる。このシグナルは、ポリペプチドにとって内因性であることもできるし、異種であることもできる。P.パストリスに用いることができるこのような配列の例は、天然ヒトもしくはマウス(または他の哺乳動物)FH分泌シグナルおよび酵母α交配因子を含む。
【００４４】
目的とするポリペプチドは、改変体、例えば融合タンパク質で発現させることができ、分泌シグナルばかりでなく、追加の異種機能領域も含ませることができる。従って、例えば、精製中または、その後の取り扱いおよび貯蔵中に、安定性および宿主細胞における持続性を改善するために、ポリペプチドのN末端に追加のアミノ酸残基、特に荷電アミノ酸残基の領域を加えることができる。同様に、精製を容易にするためにポリペプチドにペプチド部分を融合させることができる。このような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去することができる。特に、分泌または排泄を行うために、安定性を改善するために、そして精製を容易にするためにポリペプチドにペプチド部分を付加させることは、当該技術分野では珍しくなく、常法である。
【００４５】
FHタンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿法もしくはエタノール沈殿法、酸抽出法、陰イオン交換もしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法によって組換え細胞培養物から回収し精製することができる。ヘパリン親和性に続いてイオン交換クロマトグラフィーが最も好ましい。
【００４６】
タンパク質の構造的完全性または機能的特性に著しく有害な影響を与えないでFHポリペプチドのアミノ酸残基配列を選択的に改変できることは、当業者には明らかであろう。このような配列における相違を考慮する場合、その生物活性に必須なタンパク質の領域があることを思い出さなければならない。タンパク質のフォールディングまたはその折りたたみ構造の安定化のために必須な残基もまた存在する。残基の一部は、例えばグリカンをAsn側鎖に共有結合させる酵素によって認識されるグリコシル化部位として役立つ。一般に、構造または機能に直接または間接に寄与する残基を、科学的に類似した他の残基によって安全に置換することが可能である(これは保存的置換として知られる)。構造的完全性部位または機能性部位に寄与しないアミノ酸残基の場合、このような残基を異なる化学的性質のアミノ酸残基によって安全に置換することが可能である(非保存的置換)。
【００４７】
従って、本発明はさらに、バリアントが実質的にFH様生物活性を示すFHポリペプチドの変異を含む。バリアントは、保存的置換(例えば、ある親水性残基と他の親水性残基との置換またはある疎水性残基と他の疎水性残基との置換)を含むことができるが、強親水性残基と強疎水性残基との置換(逆もまた同様)を含むことはないと考えられる。バリアントは、N-グリコシル化部位の欠損をもたらすN-グリコシル化部位内の保存的置換を含むことができる。バリアントはまた、FH分子内の20タンパク質ドメインの1以上の欠失を含むこともできる。例えば、ドメイン8〜18の間およびそれを含む1つまたはドメインの組み合わせ[例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10または11ドメイン]の欠失は、ドメイン1〜4、6〜7(または6〜8)および19〜20に位置する機能的に必須の個別の結合部位に有害な影響を有さないと考えられる。バリアントはまた、ドメイン5〜18の間およびそれを含むFHの領域からのドメインの1つまたは組み合わせを含むことができる。なぜなら、これによっては、C3b-結合部位(1〜4および19〜20)およびFH内の2つの細胞表面認識部位の1つ(19〜20)は保存され(例えば、A new map of glycosaminoglycan and C3b-binding sites on factor H. Schmidt CQ, Herbert AP, Kavanagh D, Gandy C, Fenton CJ, Blaum BS, Lyon M, Uhrin D, Barlow PN. J Immunol, 2008, 181:2610-9 を参照のこと)は保存され、これらの結合部位間の空間配置または結合の柔軟性を最適化することによって機能活性を高めることが可能だからである。バリアントはまた、例えばFHの領域のドメイン8〜18または5〜18からの1以上の欠失されたドメインが、他のタンパク質由来の1以上の同様なドメイン、例えばI型またはII型補体受容体からのドメインと置換されたハイブリッドを含むことができ、あるいは、それらが広範囲の他のタンパク質、例えば細胞外マトリックスまたは凝固もしくは補体カスケードのタンパク質由来の1以上の似ていないドメインによって置換されることもできる。
【００４８】
一般的に見られる保存的置換は、脂肪族アミノ酸Ala、Val、LeuおよびIleの中の1つから他への置換;ヒドロキシル残基であるSerとThrとの交換;酸性残基であるAspとGluとの交換;アミド残基であるAsnとGlnとの間の置換;塩基性残基であるLysとArgとの交換;および芳香族残基であるPheとTyrの間の置換である。非保存的置換は、天然にコードされたアミノ酸残基および天然にはコードされない(非天然)アミノ酸残基の両方の置換を含むことができる。非天然アミノ酸残基は、化学的部分(例えばポリエチレングリコール(PEG)および他のポリマー)との結合のための、またはFHの治療効果を高めるための生化学基(例えばグリカン)との結合のための部位特異的結合部位として役立つものであることができる。
【００４９】
上記に詳細に述べたように、どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントである(すなわち、機能に顕著に有害な効果を有さない)と考えられるかに関するさらなる指針は、Bowie, et al., “Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to amino acid Substitutions,” Science 247:1306-1310 (1990) において見出すことができる。
【００５０】
凝集を防ぎ、タンパク質分解を最小限にする置換もまた目的とされる。タンパク質の凝集は、活性の減少をもたらすばかりでなく、医薬製剤を製造する場合に問題となる場合がある。なぜなら、凝集体は免疫原性となる場合があるからである(例えば、Pinckard et al., Clin Exp. Immunol, 1967, 2:331-340; Robbins et al., Diabetes, 1987, 36:838-845; Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 1993, 10:307-377 を参照のこと)。凝集は、表面残基の変化、例えば疎水性パッチの除去によって(疎水性残基と極性残基との置換によって)最小限にすることもできるし、電荷反転(例えばAspをArgに置換するかまたはGluをLysに置換することによって)または欠失(例えばSerをAspに置換する)によって表面の静電学を変化させることによって最小限にすることもできる。タンパク質分解は、標的タンパク質の損失をもたらし、従って収率は低下し、精製もより困難となる。タンパク質分解は、コンピュータ予測または経験的手段によってタンパク質分解部位を認識し、その保存的置換によって低下させることができる。
【００５１】
哺乳動物FHの特定の妥当性を有する可能な改変は、FHタンパク質のグリコシル化を最小限にするために1以上のAsn残基をGln残基に変異させることを含む。あるいは、FHタンパク質の1つまたは2つまでものAsn残基を、多数の非天然アミノ酸残基のいずれか、例えばp-(プロパルゴキシ)-フェニルアラニン(pPpa)残基に置換することができる(Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Young TS, ahmad I, Brock A, Schultz PG. Biochemistry 2009 48:2643-53)。このような非天然残基は、当該技術分野で公知のPEG化またはシアリル化技術によってさらに改変することができる。
【００５２】
従って、他の側面において、本発明は、変異が、天然FHと比較して前記FHバリアントの1以上の生物学的特性を調節するように設計された1以上のアミノ酸残基置換を含むコドン最適化核酸から得られた組換え発現された哺乳動物FH、特にヒトFHのバリアントを提供する。
【００５３】
当然のことながら、前記アミノ酸置換(単数または複数)は、当該技術分野で公知のように、FHタンパク質の多型変化には関連しない。前記置換(単数または複数)は、天然FHと比較して、例えば前記FHバリアントの免疫原性および/または生理学的特性の調節をもたらす可能性がある。典型的な改変は、前記FHバリアントのグリコシル化状態を変えるために、かつ/または前記置換部位で分子、例えばPEGまたはポリシアリル鎖によってバリアントが特異的に改変されるために、当該技術分野で公知の化学を用いて前記FHバリアントをさらに改変するために、1以上のAsn残基を他のアミノ酸残基、例えばGlnまたは天然に存在しないアミノ酸残基、例えばpPpaと置換することを含む。
【００５４】
従って、標的FH様ポリペプチドは、(i)アミノ酸残基の1以上が、保存または非保存アミノ酸残基によって置換され、前記置換アミノ酸残基が、その遺伝コードによってコードされたものであることもないこともできるもの;または(ii)アミノ酸残基の1以上が、他の分子と結合しているかまたは置換基を含むもの;または(iii)成熟ポリペプチドが、他の化合物(単数または複数)、例えばポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、PEGもしくはポリシアル酸)に共有結合していることができるもの;または(iv)IgG Fc融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌シグナル配列または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列などの追加のアミノ酸残基が成熟ポリペプチドに融合されているもの;または(v)グリコシル化部位における置換または新規グリコシル化部位(もしくはグリカンとの化学結合に適した非天然アミノ酸)の導入または操作されたグリコシル化経路を有するP.パストリス株の使用による結合グリカンの改変(FHの天然糖型と比較して)パターンを有するもの;または(vi)ドメインがFHの中央部分から除去され、他のタンパク質からの相同のドメインで置換されていても置換されていなくてもよいドメイン欠失もしくはハイブリッドバリアント、であることができる。このようなフラグメント、誘導体、コンジュゲートおよびアナログは、本明細書に記載の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
【００５５】
本発明の組換え発現された哺乳動物FHポリペプチドおよびバリアントには種々の応用が可能である。例えば、ポリペプチド/バリアントは、遺伝的に罹患しやすい個体において、加齢黄斑変性(AMD)を治療または予防するか、またはこの疾患の進行を予防または抑制することができ、AMDを有する固体の治療ばかりでなく、非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)およびデンスデポジット病(DDD)として知られる2つの生命を脅かす腎疾患の治療/予防を容易にする。本発明の組換え発現された哺乳動物FHは、不十分な補体制御が病因または症状に寄与する多数の他の疾患または病状、例えばアルツハイマー病、虚血、子癇前症、早期流産、敗血症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスおよび移植片拒絶の治療または予防に有益な効果を発揮することができると考えられる。例えば、虚血再潅流障害:(Shah KG et al, J Surg Res. 2010 163 1:110-117; Yang J et al, ann Surg. 2009 249 2:310-317; Zhang F et al, Regul Pept. 2009 8 52(1-3):82-87、臓器移植: Atkinson C, et al, J Immunol. 2010 185 11:7007-7013、早期流産: Lynch AM, et al, Obstet Gynecol. 2011 117 1:75-83 および 子癇前症 Qing X et al, Kidney0 Int. 2010 Oct 13. [Epub ahead of print]を参照のこと。
【００５６】
本発明による組換え体FHポリペプチドおよびバリアントは、研究に応用することもできるし、キットなどにも応用することができる。
【００５７】
本発明による特に好ましいFH分子およびバリアントについて、以下に詳細に説明する。
【００５８】
発明の詳細な説明
次に、本発明を以下の図面を参照としてさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】天然ヒトFHのDNA配列(Swiss-Prot:P08603.4);本発明のP.パストリスコドン最適化ヒトFH配列;ならびに野生型(cDNA由来)およびコドン最適化FH遺伝子配列のアラインメントを示す図である。
【図２】非コドン最適化FH遺伝子発現からのウェスタンドットブロット結果を示す図である。
【図３】組換え体補体H因子の生成および分析を示す図である。
【図３Ａ】塩勾配(20mMグリシン緩衝液、pH9.5、0.12〜1M NaCl;右y軸に伝導率)を用いる、陰イオン交換カラム(MonoQ)(左y軸にミリ吸光度単位でのA280)からの溶離を示す図である。
【図３Ｂ】MonoQカラムから溶離したフラクション(図3A参照)をSDS-PAGEに供し、クマシーブルーでタンパク質バンドを視覚化した図である。レーン1〜8(還元条件-すなわちジスルフィドが存在しない)は溶出量23〜30に相当する。ポリペプチド鎖の“クリッピング”は明らかではなかった。レーン9は、右側に示した分子量マーカー(MW)を含む。レーン3’、4’および5’は、レーン3、4および5に対応するが、非還元条件下で行ったものである。レーン3’、4’および5’におけるより速く(レーン3、4および5と比較して)移動するバンドは、ジスルフィド結合を含むタンパク質に典型的である。
【図３Ｃ】FHのC末端CCPモジュール(ドメイン)内のエピトープを認識する2つの抗体をウェスタンブロットで用いた図である。血漿FH(左レーン)および組換え体rFH(中央レーン)を(i)Mab-SC47686_L20/3または(ii)Mab-Abnova-0167で検出した。MWは分子量マーカーである。右側のゲル(ii)を参照のこと。
【図３Ｄ】C3bからiC3bの因子I触媒切断の補因子として機能するFH(レーン1〜5)およびrFH(レーン7〜11)の能力を、SDS-PAGEを用い、続いてクマシーブルー染色を用いてα’鎖の43kDAおよび68kDAタンパク質分解フラグメントを視覚化することによって評価した図である。インキュベーション時間は、示されているように0分から30分であった。FHの両方のバージョンは、この半定量的アッセイにおいて同様な活性を示し、C3bのα’鎖は5分以内に完全にプロセシングされている。MWは、(上部から)250、150、100、75、50、37、25および20kDAの分子量マーカーである。
【図３Ｅ】図3Dとの比較のために、同じ濃度の可溶性補体受容体1型(sCR1)の補因子活性を同じ時間間隔で追跡した図である。sCR1は、α’鎖のC3dgおよび30kDAフラグメントのさらなる分解を促進したが、(図3Dから)rFHも血漿由来FHもそうではなかったことに注意されたい(文献と一致)。MWは図3Dと同様である。
【図３Ｆ】因子Dおよび因子Bが、CM5(Biacore社)センサーチップにアミンで連結されたC3b上を流れるときにC3bBb(コンベルターゼ)複合体の形成をモニターするために表面プラズモン共鳴を用いた。その後の応答における減少は、Bbがチップ表面から放出されるときの複合体の減衰を反映している。減衰速度は、参照FHまたはrFHの流れを開始することによって加速される(この場合は、210秒で自然減衰プロセスに入る)。同じ濃度(0.5μM)においては、このアッセイにおいて、血漿由来FHよりもrFHがより有効な減衰加速剤である。対照タンパク質であるBSAおよびFHモジュール19〜20は、減衰に対して効果を示さない。
【図３Ｇ】G(i)および(ii)は、ACM5センサーチップ(Biacore社)に連結されたC3bに対する(i)rFHおよび(ii)血漿由来FHの親和性を測定するためのSPRの使用を示す図である。固定されたC3bの1540応答単位に対して流した濃度シリーズ(5.4μM、1.0μM、0.5μM、0.1μM)に関して2連センサグラムが示されている。(iii)および(iv)は、C3bの1540RU(各プロットにおける下の曲線)または3030RU(各プロットにおける上の曲線)のいずれかを用いた、2つの異なるフローセルに関する、応答単位対(iii)rFHまたは(iv)血漿由来FH濃度のプロットである。破線の垂直線は、両方のプロットに同時に当てはめたKDを示し、rFHに関しては1.4μM、血漿由来FHに関しては2.9μMを与えた。
【図３Ｈ】候補組換え体FH(ピークaおよびcは、それぞれ2価および1価の種に相当する)および内部標準(IgG1;ピークbおよびdは、それぞれ2価および1価の種に相当する)をMALDI-ToF質量分析計で分析した図である。
【図３Ｉ】rFHをPBS中、濃度1mg/mlで動的光散乱を行った図である。
【図３Ｊ】ヒツジ赤血球を1.5μM FHモジュール6〜8(陰性対照)、0.4μM血漿由来FHまたは0.4mM rFHを含む生理的緩衝液中でインキュベートし、FHを枯渇させたヒト血清に暴露(37℃で20分間)した図である。反応をクエンチし、A412を測定した。結果は4つの実験の平均(±標準偏差値)で示した。
【図４Ａ】特定のSNPおよび8つのN-結合型グリカンを示すヒトH因子(FH)の概略図である。
【図４Ｂ】種々のFH分子およびバリアントが本発明に従って製造できるように設計されたベクター(プラスミド)マップの概略図である。ベクター4(pPICZα-Bに基づく)以外はすべてpPIC3.5Kに基づく。ベクター番号1〜3および11は、ヒト分泌シグナルペプチド(hum.signal pept.)のDNAを組み込んでいるが、ベクター番号7、9および10はマウス等価物を組み込んでいる。他の4つのベクターは、EAジペプチドあり(ベクター番号4)またはなし(ベクター5、6および8)で酵母α因子ペプチドのDNAを組み込んでいる。コードされたFHのバリアント(図5における配列)を示す-保護(prot.)およびハプロタイプの恐れがあるものはテキスト中に詳述してある;“all-Q”および“1アンバーQ”または“2アンバーQ”は、それぞれ、テキストの記載に従って、Asn残基に対するGlnおよび1または2pPa残基(例えば)の置換を指す;“デルタ10〜15”は、テキストの記載に従って、FHドメイン10〜15の除去を示す;K/Rは、テキストの記載に従って、リジンおよびアルギニンのグルタミンによる置換を示す。
【図５】ベクター番号1〜11に挿入された(a)ヒトおよび(b)マウスFHバリアントをコードするDNA配列の概要を示す図である。
【図６】FHの2つの組換え体バリアントの発現を示す図である。rhFHの“all-Q”変異体の試料(左側ゲル)は、SDS-PAGE中、還元(R)および非還元(NR)条件下で単一バンドで移動する(クマシーブルーで染色)。Endo Hf(77kDA)処理では、移動率に変化を生じない。このことは、“all-Q”変異体がN-グリコシル化部位を有さず、グリカンフリーであることと一致している。比較のために(中央ゲル)、rhFH(精製前)は、Endo Hfで処理されるまで、ぼやけたバンドで移動する(右側ゲル)。“デルタ10〜15”rFHの試料を陰イオン交換カラムから溶出し、6つのピークのフラクションを採取し、還元(R)または(4つのフラクションに関して)非還元(NR)条件下(右側ゲル)SDS-PAGEを行い、次いでクマシーブルーで染色した。MWは、ゲルの左および右に示された分子量マーカーである。
【図７】FHの医薬品バージョンへの経路の概略図である。
【実施例１】
【００６０】
FHをコードする非コドン最適化DNAの発現の試み
ヒトFHをコードするDNAをcDNAから増幅し、酵母発現ベクターpPICZalphaBに挿入し、KM71H P.パストリス細胞を正しく形質転換した。形質転換細胞内の遺伝子の複数コピーの存在と合致する細胞コロニーを高抗生物質含有プレート上で増殖させた。しかしながら、ミニスケール培養において、FH発現の根拠を検出することができなかった(SDS-PAGE、クマシーブルーで染色)。シェーカーフラスコ培養においても、検出可能な組換え体FHは生産されなかった。次いで、理想的な発現条件下(酸素および栄養素レベルがほぼ最適のレベル維持された1リットルのファーメンターにおいて達成できる)、より感度の高い検出法(ウエスタンドットブロット、図2参照)を用いて、形質転換細胞によるタンパク質発現が検出できるかどうかをチェックした。これらの段階および、さらに大きなスケール(3リットル)の発酵を用いても、組換え体FH生成物は検出できなかった。
【００６１】
さらに少量の組換え体FHの発現の根拠を見出すさらなる試みにおいて、上清の一部を濃縮し(ウエスタンドットブロットのために)、一方で残りを希釈し(塩濃度を低下させるために)、pH6でHiTrap(GE Healthcare社)ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラムに添着した。1M NaCl(HiTrapヘパリンカラムに用いられる平衡緩衝液中)による1段階溶離(少量ですべてのタンパク質を洗い落すことが期待される)からの試料もまたウエスタンドットブロットでアッセイした。
【００６２】
市販のポリクローナル抗FH抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した二次抗体の両方を用いて、標準的なウェスタンブロット法により検出を試みた。陽性対照(一次抗FH抗体、二次抗体およびComplement Technology社(テキサス州)から購入したヒト血漿由来FHからなる)を除いては陽性シグナルは検出できなかった(図2参照)。
【００６３】
このように、ジスルフィドを含む細胞外タンパク質に特に適していることが知られ、FHの短いセグメントの発現に使用されている異種発現系の使用にもかかわらず、FHをコードするDNAから複数グラム量の組換え体FHはもちろん、複数ミリグラム量の組換え体FHの提供は決して簡単なことではないことが明らかとなった。
【実施例２】
【００６４】
コドン最適化ヒトH因子の開発、精製および分析
P.パストリスにおけるヒトFH発現を目的としたコドン最適化は、本発明者らとGeneart社(レーゲンスブルク、ドイツ)との間で協議し、彼らの独自の技術およびGeneOptimizer(登録商標)ソフトウェアを用いて行った。
【００６５】
P.パストリスにおける発現のための、ヒトFHのコドン最適化型の核酸配列は、天然DNA配列とは大きく異なっている(76%の配列同一性を有する)(図1参照)。
【００６６】
コドン最適化DNA配列は、Geneart社によって合成された。次いでこれを、適切な制限酵素を用いて切断した、Invitrogen社が得たP.パストリスベース発現ベクター、pPICZαBベクターにクローニングした。
【００６７】
このベクターをE.コリにトランスフォームし、DNAを増幅し、数十μgのプラスミドDNAを得た。これを精製し、線状化し(相同組換えを促進するために)、次いでP.パストリスKM71H株に形質転換した(エレクトロポレーションを用いて)。一連の濃度の抗生物質マーカーを含む富栄養培地プレート上に形質転換酵母を線条接種することによって、発現プラスミドを含むP.パストリスクローンの選択を行った。高抗生物質含有プレート上で増殖したコロニーをタンパク質発現に関してスクリーニングした。
【００６８】
濾過して細胞を除去した後、ファーメンターからの上清を蒸留水で5倍に希釈し、自己注入XK-Heparinカラム(Heparin FastFlow樹脂-GE Healthcare社製)に添着させた。20mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)から1M NaClで置換した同じ緩衝液への直線勾配を用い、6倍のカラム容積で溶離を達成した。タンパク質を含むフラクションをプールし、エンドグリコシダーゼH-マンノース結合タンパク質融合タンパク質(Endo Hf、New England Biolabs社)を用い、37℃で試料をインキュベートすることによってグリカンを除去した。次いで、タンパク質をコンカナバリンA(GE Healthcare社)カラムに適用し、次いでP.パストリス由来グリカンおよびEndo Hfを除去するためにマンノース結合樹脂(New England Biolabs社)に適用した。Endo Hfに代わるものとして、組換え生成物においてグリカンをより保持させるためにエキソグリコシダーゼを用いることができ、これにより溶解性を高めることができる。
【００６９】
自己注入Poros-Heparinクロマトグラフィーカラムを用い、PBSからPBSプラス1M NaClへの直線勾配を用い、20倍カラム容積で溶出して試料をさらに精製した。最終精製段階には、MonoQカラムによる陰イオン交換を必要とした。20mMグリシン緩衝液(pH9.5)から1M NaClを添加した同じ緩衝液への勾配を用い、20倍カラム容積でタンパク質を溶出した。
【００７０】
このような精製の例示的な結果とそれに続く広範な生物物理学的分析、機能性分析および検証を図3に示す。この手順からのタンパク質の収量は、最適化しないで、1リットルからタンパク質約1.5〜2.5mgであった。
【実施例３】
【００７１】
コドン最適化DNAを用いるヒトおよびマウスFHバリアントのさらなる開発;治療効果を高めるための精緻化
第1段階において、P.パストリスにおける合成コドン最適化遺伝子の発現の有用性および多機能性をさらに例示するために、本発明者らは、一連の11プラスミドベクター(ベクター番号1から11まで)を設計した(図4)。この一連のベクターは、標的FHバリアントのそれぞれに関して容易に探究することができる分泌経路の数を最大化するために、ベクター間のFHをコードするDNAを“カットアンドペーストすること”を可能にするように設計された。この目的は、ヒトFHに加えてマウスFHを生産することであった。なぜなら、マウスFHはマウスにおける試験に必要だからである。
【００７２】
第2段階において、(i)所望のアミノ酸残基配列、(ii)適切なエンドヌクレアーゼ制限部位の必要条件、(iii)増殖培地への分泌を促進するための、標的タンパク質のN末端における適切な分泌シグナル配列(ペプチド)の組み込み(iv)FH由来の生物医薬品を最適化するために必要な情報を蓄積することを目的とする、図7に概略を示した戦略の追及、に基づいて、コドン最適化を目的とする11DNAインサート(配列情報に関しては図5参照)が本発明者らによって設計された。
【００７３】
第3段階において、構築物番号1から11までを作成するためのコドン最適化および遺伝子合成(図5に概略を示す)は、Geneart社(レーゲンスブルク、ドイツ)が独自の技術およびGeneOptimizer(登録商標)ソフトウェアを用いて行った。Geneart社はまた、この11構築物を発明者が提供したプラスミドに組み込んで、ベクター番号1から11までを作成することを請け負った(図4)。
【００７４】
実施例2に記載した組換え体ヒト(rhFH)の製造において、rhFHの分泌を命令し、それによって精製を容易にするために我々はプレプロリーダー(シグナル)配列を用いた。その研究において、エンドペプチダーゼ(kex2プロテアーゼ)切断部位によって標的配列からプロ領域を分離し、次いで切断部位の接触性を高めるために2つのGlu-Alaジペプチドを導入した。天然配列の生成には、kex2プロテアーゼによってプロ領域を除去し、次いでste13遺伝子生成物のジペプジルアミノペプチダーゼ作用によってGlu-Ala除去することをあてにした。ste13による不十分な切断は、時には潜在的に免疫原性であるN末端Glu-Ala対をもたらす場合がある。この可能性を排除するために、ベクター番号1の作成中に前記Glu-Alaジペプチドの1つまたは両方をコードするコドンを避け、さらに、hFHの天然分泌シグナル配列および酵母分泌経路酵素によるプロセシングを利用するために構築物1を設計した。従って、ベクター番号1を用いることによって、我々の最初の組換え体hFHに含まれていたN末端発現アーチファクト(NH2-Glu-Ala)は存在せず、前もって存在するクローニングアーチファクト(Ala-Gly)の存在は回避される。さらに、ベクター番号1を用いることによって、rhFHは、実質的に変異されて保護ハプロタイプ(I62、Y402)を生じる(IY-hFHの作成)。
【００７５】
ピキア・パストリスは、通常、Asn-Xaa-Thr/Serシークオンに高マンノース型N-グリカンを導入し、不均一で、潜在的に免疫原性を有する生成物を生じる。これらのグリカンは、末端シアル酸を欠き、肝アシアロ糖タンパク質受容体による迅速なクリアランスに感受性を有すると考えられる。他方では、グリコシル化は組換え体タンパク質のフォールディングおよび安定性を助けることができ、元の研究では、我々は、発現後、精製前、または第1精製段階後に酵素的にrhFHからP.パストリスN-グリカンを除去した。構築物番号2は、N-グリコシル化部位におけるAsn残基がGln残基に置換されるように設計した(図5)(allQ-IY-hFHを作成)。従って、ベクター番号2によって、関連性のあるAsn残基をGln残基に変異させることによって、9つの(潜在的)N-グリコシル化シークオンの中から、通常はふさがっている8つを欠くFHを生産する結果を評価することが可能である。従って、ベクター番号2を用いて、我々は、保護ハプロタイプに対応するが、N-グリコシル化部位を有さないallQ-IY-hFHを生産し、分泌させ(ヒト-FH分泌シグナル配列によって)、精製した(図6参照)。Endo Hfでの処理の前後でのSDS-PAGE上の移動に差異が観察されないことを基に、この物質はグリカンを含まないことを我々は明らかにした。
【００７６】
構築物3は、IY-hFHにおける潜在的にN-グリコシル化されるAsn残基と非天然アミノ酸、例えばp-(プロパルゴキシ)フェニルアラニン(pPpa)との置換を可能にするためにアンバーコドンを利用する(unN-IY-hFHの作成)(図5参照)。低い長期免疫原性および半減期の増加は、患者におけるヒトFH機能の補充に適した生物医薬品の本質的特性である。この点に関して、ポリ(エチレン)グリコール(PEG)の結合は証明された戦略である(例えば、PEGylation, successful approach to drug delivery. Veronese FM, Pasut G. Drug Discov Today. 2005; 10:1451-8 を参照のこと)。PEG化の代替物は、高用量および反復投与が関係する場合にPEGよりも利点を有しうる生体内分解性 ポリシアル酸 鎖との結合を含む(例えば、Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids. Gregoriadis G, Jain S, Papaioannou I, Laing P. Int J Pharm 2005 300:125-30 を参照のこと)。当然のことながら、生物医薬品として潜在性を改善するために、多数の他のポリマーをhFHに結合させることができる。例えば、第一級アミンに対して無作為に行うPEG化またはポリシアリル化は簡単ではあるが、しばしば、不均一な生成物およびタンパク質の結合領域に立体障害をもたらす。部位特異的改変がはるかに望ましい。P.パストリスを我々の好ましい発現系として使用することによって、我々はこの望ましい選択肢を利用することができる。実際、非酵母真核発現系に対するP.パストリスの大変顕著な利点は、1つまたは場合により2つの関連性のあるAsn残基を天然にはコードされないアミノ酸残基に容易に置換できる可能性である(このことは他の真核発現系でも可能であるが、より簡単ではなく、必要な収量でタンパク質を生産することが予想されない)。
【００７７】
従って、ベクター番号3でP.パストリスをトランスフェクトすることによって、必要なtRNAおよびアミノアシルtRNAトランスフェラーゼを有するプラスミドに加えて、改変残基をマスクし、グリコシル化部位を除去する一方で、タンパク質の他の生物医薬特性を潜在的に高める化学合成ポリマーとの部位特異的共有結合改変の選択肢を我々は導入する。これらの残基は、他のタンパク質に対する結合に直接に関与しないことに留意すべきである。なぜなら、それらは通常はN-グリコシル化され、C3bまたはGAG-結合に関与しないことを我々が前もって示したFHのモジュール内に位置するからである。用いられる非天然アミノ酸の組み込みのための系は、“クリック”ケミストリーを用いる側鎖改変に適したpPpaの組み込みのためにSchultzによって開発された系である(Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic meast Pichia pastoris. Young TS, ahmad I, Brock A, Schultz PG. Biochemistry 2009 48:2643-2653)。これには、進化分子工学を用いてE.コリにおいて開発された直交tRNA/tRNAおよびアミノアシル-tRNA合成酵素の対を利用する。これによって、まず第一に、unN-IY-hFHの生物学的および生物物理学的特性をIY-FH(酵素による脱グリコシル化後)およびallQ-IY-hFHのそれらと比較することが可能になる。当然のことながら、結合のための代替化学経路を提供する、pPpaの代わりの他の非天然アミノ酸を組み込ませることができる。例えば、我々は、アゾ基または他の反応性基を有する非天然アミノ酸を組み込むことができる。多くのこのような可能性は、Youngらよる上記の論文に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本願に組み込まれる。N-グリコシル化部位におけるAsn残基以外の他の残基、例えば、Asn残基の2残基後に見いだされるSerまたはThr残基を非天然アミノ酸と置換することができることもまた明らかであろう。
【００７８】
続いて、unN-IY-hFHをPEG化して我々の候補医薬品であるPEG化-hFHを作成するためにクリックケミストリーが用いられる(図7)。比較のために、我々はallQ-IY-hFH内のLys残基を非特異的にPEG化する(PEGX-hFHの作成)。これらのタンパク質の作成は次のとおりである。アゾ誘導体化PEGは市販されており、これらはCu(I)触媒アジド-アルキン環化付加において、pPpaのプロパルギル基と反応して高収量の1,2,3-トリアゾールを与える。当然のことながら、pPpaの代わりにアゾ-アミノ酸残基を組み込み、次いでコンジュゲートとしてプロパルギル-PEGを使用することが可能である。他のポリマーとの結合もまた同様に実行可能であることもまた明らかであろう。このようにして、我々は、部位特異的にFHのPEG化バージョンを作成する。種々の鎖長および分枝鎖の使用を探査することが可能である。部位特異的結合生成物と比較のために、我々は、組換え体タンパク質の第一級アミンにスクシンアミドエステル活性化PEGを無作為に結合させる確立されたプロトコルを用いる(Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions. Veronese FM. Biomaterials. 2001, 22:405-17 およびその中の引用文献を参照のこと)。適切な化学量論比で活性化PEGの均一な調製物を用い、生成物を分取し分析することによって、モノ/ジPEG化タンパク質の確定した位置異性体が得られる。これらの操作をIY-hFHに行ってPEGX-IY-hFHを作成する。このように、部位特異的PEG化と無作為PEG化の相対的利点を比較することが可能である。当然のことながら、PEG化の代わりにポリシアリル化に同様なアプローチを容易に広げることができる。
【００７９】
種々の生成物、例えばhFH、IY-hFH、allQ-IY-hFH、unN-IY-hFH、PEG-hFHおよびPEGX-hFHの比較に関しては、我々はそれらのC3b-およびGAG-結合特性ならびに生物活性を探究する。従って、以下に関して、純粋かつ立証された試料を試験する:(i)C3bの因子I触媒切断の補因子として機能する能力(図3D参照)(Enzymic assay of C3b receptor on intact cells and solubilised cells. Sim E, Sim RB. Biochem J. 1983, 210: 567-76);(ii)表面プラズモン共鳴(SPR)センサーチップに固定したC3bBbの減衰の加速を促進する能力(Decay-accelerating factor must bind both components of the complement alternative pathway C3 convertase to mediate efficient decay. Harris CL, Pettigrew DM, Lea SM, Morgan BP. J Immunol. 2007 178:352-9)(図3F参照);(iii)SPRによって測定される、センサーチップに固定されたC3bに対する親和性(A new map of glycosaminoglycan and C3b-binding sites on factor H. Schmidt CQ, Herbert AP, Kavanagh D, Gandy C, Fenton CJ, Blaum BS, Lyon M, Uhrin D, Barlow PN. J Immunol. 2008 181:2610-9)(図3G参照;(iv)ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーまたはゲル移動度シフトアッセイによって測定されるGAGに対する親和性(Disease-associated sequence variations congregate in a polyanion recognition patch on human factor H revealed in three-dimensional structure. Herbert AP, Uhrin D, Lyon M, Pangburn MK, Barlow PN. J Biol Chem. 2006 281:16512-20);(v)FH枯渇ヒト血清(Complement Technologies社から入手できる)により補体媒介溶血からヒツジ赤血球を保護する能力-ヒトFHの標準的生物学的アッセイ(Critical role of the C-terminal domains of factor H in regulating complement activation at cell surfaces. Ferreira VP, Herbert AP, Hocking HG, Barlow PN, Pangburn MK. J Immunol. 2006 177:6308-16)(see Figure 3J);(vi) 補体媒介損傷からヒト細胞を保護する能力(Role of membrane cofactor protein (CD46) in regulation of C4b and C3b deposited on cells. Barilla-LaBarca MK, Liszewski MK, Lambris JD, Hourcade D, Atkinson JP. J Immunol. 2002 168:6298-304; Inhibiting complement activation on cells at the step of C3 cleavage. Liszewski MK, Fang CJ, Atkinson JP. Vaccine. 2008, 26 Suppl 8:I22-7。
【００８０】
構築物番号4において、2つのアンバーコドンが組み込まれており、タンパク質生成物は、一対のコンジュゲートの部位特異的配置に適している。この構築物を用いれば、第2PEG化部位導入の実現可能性を探究することが可能であるが、一般に各非天然アミノ酸残基組み込みに伴う収率の減少が予想される。この例において、我々は、タンパク質の中央の隣接するモジュール(モジュール12および13)において結合部位を選択した。これらの部位をFH分子の他の部分にある結合部位を障害しないでPEG化できるばかりでなく、蛍光顕微鏡検査および組織学ならびに診断法に潜在的用途を有するヒトFHの蛍光バージョンをもたらす蛍光プローブの結合のために使用することもできる。あるいは、これらの部位は、プローブ間の距離測定を提供し、推論によって、FHの有効性を最適化する目的でタンパク質工学アプローチの仮設および設計を作成するのに役立つ構造情報を提供する電子常磁性共鳴分光に利用できる常磁性部分との結合に使用できる。
【００８１】
ベクター4および5は、酵母α因子分泌シグナルペプチドをコードするDNAを組み込んでいる。なぜなら、そのことは、天然ヒトFH分泌シグナルペプチドに対応する経路以外の分泌経路を探究するのに潜在的に有利だからである。ベクター4はNH2-Glu-Alaに対応したコドンを組み込んでいるが、ベクター5はそうではない。それによって、分泌シグナルペプチドのタンパク質分解プロセシングの効率に関してGlu-Alaスペーサーの役割を試験する機会が提供される。
【００８２】
ベクター6(α因子/無EA戦略を使用)は、FH欠失の例をコードする構築物を組み込んでいる。この用語は、NおよびC末端の近位の2つの主要なC3bおよびGAG-結合部位を結び付けている領域内で1以上の中央ドメイン(またはモジュール)を欠いているFHのバージョンのことを言う。このような欠失は、研究および治療用途のためのhFHのよりコンパクトなバージョンを作成する機会を意味する。この例(ベクター6)においては、モジュール10〜15が欠失されている(結果については図6を参照のこと)。FH構造のモジュール方式を考慮すれば、任意の数または組み合わせのモジュールを欠失させること(あるいは、いずれかの末端でFHを短縮させてFH短縮体を作成すること)が可能であることは明らかであろう。これらの欠失されるドメインのいずれかと、他のタンパク質からの相同または非相同ドメインとを置換することも容易である。ベクター11は、我々の戦略を用いて、有用な量で容易に生産することができるFH変異体の例の製造のために設計された。この例において、9つの塩基性アミノ酸残基がGln(中性)残基に置換されている。この場合に選択された塩基性アミノ酸は、ヒトFHのモジュール13で著しく正に荷電したパッチを形成している(The central portion of factor H (modules 10-15) is compact and contains a structurally deviant CCP module. Schmidt CQ, Herbert AP, Mertens HD, Guariento M, Soares DC, Uhrin D, Rowe AJ, Svergun DI, Barlow PN. J Mol Biol. 2009 Epub. Oct 14.)。このことは、偶然に進化したとは考えづらく、FHの生物学的作用機構において今だ理解されていない結合の役割が存在する可能性がある。従って、我々は、治療用タンパク質を製造し、そして構造機能相関に光明を投じ、そしてその故に優れた治療効果を有するFHのデザイナーバージョンの操作に光明を投じるアッセイのためのFHのバージョンを製造するために、我々のタンパク質製造戦略を利用する。
【００８３】
7から10まで番号付けされたベクターのサブセットは、コドン最適化DNAを用いてP.パストリスにおいてマウスFH(mFH)を製造するために設計された。これらのタンパク質生成物は、疾患のマウスベースモデルにおいて生物医薬品としてのFHの評価に役立つ。ベクター7、9および10は、天然mFH分泌シグナル配列を利用し、ベクター8は、酵母α因子分泌シグナルのためのDNAを含む(Glu-Ala無し)。構築物7は、野生型mFHをコードし、構築物8および9は、ヒトFHのallQ-およびunN-(すなわちアンバー)バージョンのマウス等価物をコードする(すなわちヒトバージョンにおけるように、mFHのN-グリコシル化部位の1つまたは2つが、部位特異的結合部位として再操作されている)(allQ-mFHおよびunN-mFH)。PEG化(またはポリシアリル化されたタンパク質)は、hFHに関して記載されているように構築された。構築物10は、mFHの2つのアンバーコドンバージョンをコードし、残りのグリコシル化部位(モジュール1〜4および19〜20におけるグリコシル化部位を除く)において、AsnがGlnに置換されている。
【００８４】
ベクター1〜11のタンパク質生成物の臨床的可能性を評価するために、我々はベクター7〜10の生成物から始め、これらを(i)制御されていない血漿C3活性化を有し、DDD(Uncontrolled C3 activation causes membranoproliferative glomerulonephritis in mice deficient in complement factor H. Pickering MC, Cook HT, Warren J, Bygrave AE, Moss J, Walport MJ, Botto M. Nat Genet 2002 31:424-8)および網膜の異常(Complement factor H deficiency in aged mice causes retinal abnormalities and visual dysfunction. Coffey PJ, Gias C, McDermott CJ, Lundh P, Pickering MC, Sethi C, Bird A, Fitzke FW, Maass A, Chen LL, Holder GE, Luthert PJ, Salt TE, Moss SE, Greenwood J. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:16651-6) を発症するFH-ノックアウトマウス(FH-/-)、ならびに(ii)AHUS(Spontaneous hemolytic uremic syndrome triggered by complement factor H lacking surface recognition domains. Pickering MC, de Jorge EG, Martinez-Barricarte R, Recalde S, Garcia-Layana a, Rose KL, Moss J, Walport MJ, Cook HT, de Cordoba SR, Botto M. J Exp Med 2007 204:1249-56.)を発症するFHトランスジェニックマウス(CFH-/-デルタ16〜20(ここでは、事実上、モジュール1〜15からなる短縮型FHが完全長FHに置き換わっている)において試験する。タンパク質収率、バイオアッセイおよび標準的な毒物学研究を含む一連の考察に基づいて、我々は最良の候補(単数または複数)を選択する。例えば、allQ-mFH、PEG-mFHおよび/またはPEGX-mFH(低い免疫原性を有すると推定される)がFH-/-マウスにi.v./i.p.注入される。血清において最大の補体制御を達成し、mFH半減期を評価するのに必要なmFHの最適の1回量を滴定するために、補体成分C3、因子Bおよび天然に発現されるマウスFH(ならびに組換え体mFH)のレベルがELISAによって測定される。最適化された投与計画を用いて、我々はDDDおよび網膜の異常に対してmFHの有効性を評価する。8ヶ月(腎臓)/24ヶ月(網膜)にわたってFH-/-マウスの生存、腎機能(尿アルブミン、血清尿素)および網膜の異常(行動検査および電気生理学的検査)を評価し、未処理のFH-/-マウスと比較する。これら2群における糸球体および網膜の病状における差異を評価するために、組織学的検査(光学顕微鏡法、免疫蛍光法ならびに蛍光および電子顕微鏡検査)を用いる。これらのFH欠損マウスにおけるmFHに対する抗体の生成はELISAベースアッセイで評価される。aHUSにおける我々の生成物(単数または複数)の有用性は、CFH-/-デルタ16〜20マウスにおける類似の実験によって決定される。
【００８５】
10リットル発酵当たりタンパク質数グラムの範囲の製造レベルを達成するために、さらなるDNA操作および発酵技術の最適化によってhFHの収率を改善することを我々は続けている。P.パストリスに関する文献において、1リットル当たりタンパク質100〜500mgの発現レベルが報告されている。収率を改善するための利用可能な多数の戦略は、RNA二次構造を減少させるためのDNA配列のさらなる改善;可能であれば、潜在的タンパク質分解部位の除去;複数組み込み事象に起因する高コピー数形質転換細胞の広範囲のスクリーニングおよび選択;タンパク質分解を最小限にするための培養条件、例えば撹拌、酸素供給、pH、温度および試薬(例えばEDTA、アミン塩、カザミノ酸)の添加の選択;グリセロール/メタノールの供給タイミングおよび速度(例えば、Expression of recombinant proteins in Pichia pastoris. Li P, anumanthan a, Gao XG, Ilangovan K, Suzara VV, Duzgune N, Renugopalakrishnan V.appl Biochem Biotechnol. 2007 142:105-24 に概説されている)を含む。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え体哺乳動物ＦＨの製造方法であって、前記哺乳動物ｆＨまたはそのバリアントを得るために、前記哺乳動物のＦＨまたはそのバリアントをコードするコドン最適化核酸配列であって、選択した宿主生物における発現のためにその核酸配列がコドン最適化され且つ適切に設計されたベクターに挿入された前記配列を、選択した宿主生物において発現させる段階を含む前記方法。
【請求項２】
培地１リットル当たり少なくとも０．５ｍｇの組換え体ＦＨ（またはそのバリアント）を生産する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞および／または細胞が増殖している培地から前記タンパク質を精製することをさらに含む、請求項１〜２記載の方法。
【請求項４】
精製が、高速タンパク質液体クロマトグラフ技術または高速（高圧）液体クロマトグラフ技術などのクロマトグラフ法の使用を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
宿主生物がピキア・パストリスである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物ＦＨが、ヒトＦＨまたは他の霊長類ＦＨまたは他の哺乳動物ＦＨ、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラクダ、ネコ、モルモットなどのＦＨである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
タンパク質配列における以下の変異：Ｉｌｅ６２（Ｖａｌよりはむしろ）、Ｔｙｒ４０２（Ｈｉｓよりはむしろ）、Ｇｌｕ９３６（Ａｓｐよりはむしろ）および／またはＡｒｇ１２１０（Ｃｙｓよりはむしろ）を含む、１以上の一塩基多型が、コドン最適化核酸配列に組み込まれる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＦＨ配列が、１以上の天然の（コードされた）または天然にはコードされないバリアントアミノ酸を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＦＨまたはバリアントが、例えばグリコサミノグリカンおよびその誘導体もしくはポリシアル酸、デキストラン（−１，６ポリグルコース）、デキストラン（−１，４ポリグルコース）、ヒアルロン酸およびキトサンを含む天然ポリマー；非天然ポリマー、例えば直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコール、ポリエーテルポリオール、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンイミン）もしくは直鎖ポリアミドアミンなどの大きなファミリーのいずれか；または疑合成ポリマー、例えばポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（リンゴ酸）およびポリ（アスパルトアミド）などの、前記分子の生物治療特性を改善することを目的とする化学的部分と結合される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＦＨ配列が、図１に示した配列または、図５に示した配列のいずれかである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＦＨポリペプチドまたはそのバリアントを発現することができる核酸配列であって、宿主生物、例えばＰ．パストリスにおける、培養物１Ｌ当たり０．５ｍｇを超える量で発現するためにコドン最適化された、前記核酸配列。
【請求項１２】
図１に示した配列または、図５に示した配列のいずれかと少なくとも７０％又は８０％同一である、請求項１１記載の配列。
【請求項１３】
請求項１１又は１２記載の配列を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１１又は１２記載の核酸配列から発現された、または請求項１３記載のベクターから発現された、組換え発現された哺乳動物ＦＨ、特にヒトＦＨ。
【請求項１５】
変異が、天然ＦＨと比較して前記ＦＨバリアントの１以上の生物学的特性を調節するように設計された１以上のアミノ酸残基置換を含む、組換え発現された哺乳動物ＦＨ、特にヒトＦＨ、のバリアント。
【請求項１６】
前記１以上のアミノ酸置換の導入の後に、請求項１１又は１２記載の核酸配列から得られたか、または請求項１３記載のベクターから発現された、請求項１５記載の組換え発現された哺乳動物ＦＨ、特にヒトＦＨ、のバリアント。
【請求項１７】
ＦＨ様ポリペプチドが、（ｉ）アミノ酸残基の１以上が、保存または非保存アミノ酸残基によって置換され、前記置換アミノ酸残基が、その遺伝コードによってコードされたものであることもないこともできるもの；または（ｉｉ）アミノ酸残基の１以上が、他の分子と結合しているかまたは置換基を含むもの；または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、他の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ＰＥＧもしくはポリシアル酸）に共有結合していることができるもの；または（ｉｖ）ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌シグナル配列または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列などの追加のアミノ酸残基が成熟ポリペプチドに融合されているもの；または（ｖ）グリコシル化部位における置換または新規グリコシル化部位（もしくはグリカンとの化学結合に適した非天然アミノ酸）の導入または操作されたグリコシル化経路を有するＰ．パストリス株の使用による結合グリカンの改変（ＦＨの天然糖型と比較して）パターンを有するもの；または（ｖｉ）ドメインがＦＨの中央部分から除去され、他のタンパク質からの相同のドメインで置換されていても置換されていなくてもよいドメイン欠失もしくはハイブリッドバリアントであることができる、請求項１６記載の組換え体ｆＨ。
【請求項１８】
予防または治療に使用するための、請求項１４〜１７のいずれかに記載の組換え発現されたＦＨ。
【請求項１９】
ＡＭＤ、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）またはデンスデポジット病（ＤＤＤ）の予防または治療に使用するための、請求項１８記載の組換え発現されたＦＨ。
【請求項２０】
予防または治療のための医薬の製造のための、請求項１４〜１７のいずれかに記載の組換え発現されたＦＨの使用。
【請求項１】
組換え体哺乳動物ＦＨの製造方法であって、前記哺乳動物ｆＨまたはそのバリアントを得るために、前記哺乳動物のＦＨまたはそのバリアントをコードするコドン最適化核酸配列であって、選択した宿主生物における発現のためにその核酸配列がコドン最適化され且つ適切に設計されたベクターに挿入された前記配列を、選択した宿主生物において発現させる段階を含む前記方法。
【請求項２】
培地１リットル当たり少なくとも０．５ｍｇの組換え体ＦＨ（またはそのバリアント）を生産する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞および／または細胞が増殖している培地から前記タンパク質を精製することをさらに含む、請求項１〜２記載の方法。
【請求項４】
精製が、高速タンパク質液体クロマトグラフ技術または高速（高圧）液体クロマトグラフ技術などのクロマトグラフ法の使用を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
宿主生物がピキア・パストリスである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物ＦＨが、ヒトＦＨまたは他の霊長類ＦＨまたは他の哺乳動物ＦＨ、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラクダ、ネコ、モルモットなどのＦＨである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
タンパク質配列における以下の変異：Ｉｌｅ６２（Ｖａｌよりはむしろ）、Ｔｙｒ４０２（Ｈｉｓよりはむしろ）、Ｇｌｕ９３６（Ａｓｐよりはむしろ）および／またはＡｒｇ１２１０（Ｃｙｓよりはむしろ）を含む、１以上の一塩基多型が、コドン最適化核酸配列に組み込まれる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＦＨ配列が、１以上の天然の（コードされた）または天然にはコードされないバリアントアミノ酸を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＦＨまたはバリアントが、例えばグリコサミノグリカンおよびその誘導体もしくはポリシアル酸、デキストラン（−１，６ポリグルコース）、デキストラン（−１，４ポリグルコース）、ヒアルロン酸およびキトサンを含む天然ポリマー；非天然ポリマー、例えば直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコール、ポリエーテルポリオール、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンイミン）もしくは直鎖ポリアミドアミンなどの大きなファミリーのいずれか；または疑合成ポリマー、例えばポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（リンゴ酸）およびポリ（アスパルトアミド）などの、前記分子の生物治療特性を改善することを目的とする化学的部分と結合される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＦＨ配列が、図１に示した配列または、図５に示した配列のいずれかである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＦＨポリペプチドまたはそのバリアントを発現することができる核酸配列であって、宿主生物、例えばＰ．パストリスにおける、培養物１Ｌ当たり０．５ｍｇを超える量で発現するためにコドン最適化された、前記核酸配列。
【請求項１２】
図１に示した配列または、図５に示した配列のいずれかと少なくとも７０％又は８０％同一である、請求項１１記載の配列。
【請求項１３】
請求項１１又は１２記載の配列を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１１又は１２記載の核酸配列から発現された、または請求項１３記載のベクターから発現された、組換え発現された哺乳動物ＦＨ、特にヒトＦＨ。
【請求項１５】
変異が、天然ＦＨと比較して前記ＦＨバリアントの１以上の生物学的特性を調節するように設計された１以上のアミノ酸残基置換を含む、組換え発現された哺乳動物ＦＨ、特にヒトＦＨ、のバリアント。
【請求項１６】
前記１以上のアミノ酸置換の導入の後に、請求項１１又は１２記載の核酸配列から得られたか、または請求項１３記載のベクターから発現された、請求項１５記載の組換え発現された哺乳動物ＦＨ、特にヒトＦＨ、のバリアント。
【請求項１７】
ＦＨ様ポリペプチドが、（ｉ）アミノ酸残基の１以上が、保存または非保存アミノ酸残基によって置換され、前記置換アミノ酸残基が、その遺伝コードによってコードされたものであることもないこともできるもの；または（ｉｉ）アミノ酸残基の１以上が、他の分子と結合しているかまたは置換基を含むもの；または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、他の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ＰＥＧもしくはポリシアル酸）に共有結合していることができるもの；または（ｉｖ）ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌シグナル配列または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列などの追加のアミノ酸残基が成熟ポリペプチドに融合されているもの；または（ｖ）グリコシル化部位における置換または新規グリコシル化部位（もしくはグリカンとの化学結合に適した非天然アミノ酸）の導入または操作されたグリコシル化経路を有するＰ．パストリス株の使用による結合グリカンの改変（ＦＨの天然糖型と比較して）パターンを有するもの；または（ｖｉ）ドメインがＦＨの中央部分から除去され、他のタンパク質からの相同のドメインで置換されていても置換されていなくてもよいドメイン欠失もしくはハイブリッドバリアントであることができる、請求項１６記載の組換え体ｆＨ。
【請求項１８】
予防または治療に使用するための、請求項１４〜１７のいずれかに記載の組換え発現されたＦＨ。
【請求項１９】
ＡＭＤ、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）またはデンスデポジット病（ＤＤＤ）の予防または治療に使用するための、請求項１８記載の組換え発現されたＦＨ。
【請求項２０】
予防または治療のための医薬の製造のための、請求項１４〜１７のいずれかに記載の組換え発現されたＦＨの使用。
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５１５４７４（Ｐ２０１３−５１５４７４Ａ）
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４５４３６（Ｐ２０１２−５４５４３６）
【出願日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００２３３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７７１０２
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５０４３７３２９９）ザ ユニヴァーシティ コート オブ ザ ユニヴァーシティ オブ エディンバラ (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００２３３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７７１０２
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５０４３７３２９９）ザ ユニヴァーシティ コート オブ ザ ユニヴァーシティ オブ エディンバラ (11)
【Ｆターム（参考）】
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