組換え型ライノウイルスベクター
本発明は、例えばインフルエンザウイルス抗原を含む組換え型ライノウイルスベクターを提供する。本発明はまた、対応する薬学的組成物および方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
発明の背景
地球上の集団がほとんどまたは全く免疫を有しない新しいインフルエンザウイルスのサブタイプが出現すると、インフルエンザの汎流行が起こる。20世紀の間に、インフルエンザの汎流行は、何百万人もの死、社会の破壊、および世界中での深刻な経済的損失を引き起こした。インフルエンザの専門家は、もう一つの汎流行が起こる可能性があることで一致しているが、それがいつかは分かっていない。汎流行が起こった時点での地球全体の準備レベルが、公衆衛生および疾患の経済的影響を左右すると考えられる。今日、世界保健機構(WHO)は、非常に短期間の間に、地球全体で外来患者は少なくとも数百万人、入院は2500万回より多く、そして数百万人が死亡すると推定している。これらの懸念は、2003年にトリH5N1型ウイルスが多くのアジア諸国の家禽において動物間流行レベルに達した後、ヨーロッパおよびアフリカに広がった際に強調された。幸運なことに、そのヒトに対する伝播はこれまでのところ限定的である。報告された感染症246例は高い死亡率に関連し、死亡が144例を占めた(2006年9月14日;世界保健機構(WHO)ウェブサイト)。
【0002】
従来のインフルエンザワクチンは、インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質(HA)に対する中和抗体応答を誘発するように設計されている。HAタンパク質における一定の抗原連続変異により、ワクチン組成物は、予想される循環するウイルス株にマッチするように毎年変化させなければならない。そのようなワクチンアプローチは、汎流行株の単離および同定、ならびに適切なワクチンの構築および製造に長い期間がかかることから、汎流行に直面すると受け入れられない。インフルエンザの汎流行の制御または予防に対するより有効なアプローチは、最近同定された高度に保存されたインフルエンザウイルス免疫決定基に対する防御免疫を誘発することができる「万能」ワクチンの開発を企図する。そのようなワクチンは、インフルエンザA型ウイルス株に対して広い防御を提供するはずである。さらに、そのようなワクチンは、年間を通して製造することができ、備蓄することができ、および/または年間を通して投与することができると考えられる。
【0003】
インフルエンザマトリクスタンパク質M2は、ワクチン開発のための有効な標的として役立つことが証明されている(DeFilette et al., Virology 337: 149-161, 2005)。M2は、インフルエンザA型ウイルスのアミノ酸97個の膜貫通タンパク質である(Lamb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 78:4170-4174, 1981;Lamb et al., Cell 40:627-633, 1985)。成熟タンパク質は、pH誘導型のイオンチャンネル活性を有する(Pinto et al., Cell 69:517-528, 1992;Sugrue et al., Virology 180:617-624, 1991)ホモ四量体を形成する(Holsinger et al., Virology 183:32-43, 1991;Sugrue et al., Virology 180:617-624, 1991)。M2四量体は、感染細胞の細胞質膜において高密度で発現され、同様に成熟ウイルス粒子の膜に低い頻度で組み入れられる(Takeda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:14610-14617, 2003;Zebedee et al., J. Virol. 62:2762-2772, 1998)。M2のN末端のアミノ酸24個のエクトドメイン(M2e)は、A型インフルエンザウイルスの中で高度に保存されている(Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004)。M2eの高度の保存は、最も保存されたウイルスタンパク質であるM1とのその遺伝的関係に起因する拘束(Ito et al., J. Virol. 65:5491-5498, 1991)および自然感染の際にM2e特異的抗体が存在しないこと(Black et al., J. Gen. Virol. 74 (Pt. 1):143-146, 1993)によって説明することができる。
【0004】
NCBIインフルエンザデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/multiple.cgi)からの配列を用いて得られた以下のアライメントにおいて示されるように、トリH5N1インフルエンザウイルスM2eは、典型的なヒトH1、H2、およびH3ウイルスにおいて見いだされるコンセンサス配列に対して進化しているように見え、「ヒト」インフルエンザM2eエピトープを用いて、新規トリウイルスからの防御を含む幅広い防御が可能である可能性があることを示唆している。
【0005】
H1N1 M2e配列に向けてのH5N1 M2eの進化の現象は、最近、インドネシアおよびベトナムにおいてヒトおよびトリから単離されたH5H1株800例の配列の分析に基づいて報告された(Smith et al., Virology 350:258-268, 2006)。進化したトリM2eペプチドEVETPTRNは、抗ヒトM2eモノクローナル抗体(Mab)によって効率よく認識されるが、その「前任である配列」EVETLTRNは認識されなかった(Liu et al., Microbes. Infect. 7:171-177, 2005)。このことは、何らかの「トリインフルエンザ様」の変化がヒトM2e特異的Mabによって提供された防御の有効性を低減させることがこれまでに示されていることから、重要である。興味深いことに、M2eにおけるいくつかの「トリインフルエンザ様」アミノ酸変化は、マウスにおけるヒトH1N1ウイルスの病原性を低減させた(Zharikova et al., J. Virol. 79:6644-6654, 2005)。
【0006】
WHOは、「2004年におけるカナダでのH7N3およびアジアでのH5N1の家禽での大流行の場合のように、異なる国で異なる脅威レベルで汎流行の可能性がある事象が同時に発生する」可能性を強調した(http://www.who.int/en/)。以下のアラインメントにおいて示されるように、M2e H7N7は、H5N1の「ヒト化」変種からアミノ酸1個が異なるに過ぎない。H7N1サブタイプは、種の間で伝播可能であることが証明されており(Koopmans et al., Lancet 363:587-593, 2004)、人々にとって致死的となりうる(Fouchier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 101:1356-1361, 2004)。他の株(H9N2)も同様に家禽に感染して、ヒトへと広がることが可能であることが示された(Cameron et al., Virology 278:36-41, 2000;Li et al., J. Virol. 77:6988-6994, 2003;Wong et al., Chest 129:156-168, 2006)。
【0007】
M2eに基づく組換え型タンパク質ワクチンは、相同および異種インフルエンザA型ウイルス曝露(challenge)の両方に対して防御免疫応答を誘発することが示されている(Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004;Slepushkin et al., Vaccine 13:1399-1402, 1995)。キーホールリンペットヘモシアニンおよび髄膜炎菌(N. meningitides)外膜タンパク質に結合させたM2eペプチドを用いたより最近の研究は、マウスのみならず、フェレットおよびアカゲザルにおいても良好な免疫応答を例証した(Fan et al., Vaccine 22:2993-3003, 2004)。リポソームM2eワクチンによるH1、H5、H6、およびH9インフルエンザA型ウイルスに対する防御が最近、マウスにおいて証明されている(Fan et al., Vaccine 22:2993-3003, 2004)。
【0008】
インフルエンザ抗原のための送達系の開発は、汎流行ワクチンのようなインフルエンザウイルス感染症に対するワクチンを開発するために重要である。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、第一の局面において、本明細書において記述されるようにインフルエンザウイルス抗原(例えば、M2eペプチド)のような抗原を含むライノウイルスベクターを提供する。ベクターは、ヒトにおいて非病原性でありうる(例えば、ヒトライノウイルス14(HRV14))。抗原を、本発明のベクターに、例えば中和免疫原(neutralizing immunogen)I(NimI)、中和免疫原II(NimII)(例えば、NimIIのアミノ酸158位と160位の間)、中和免疫原III(NimIII)、および中和免疫原IV(NimIV)、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される中和免疫原の部位に挿入することができる。抗原(例えば、インフルエンザウイルス抗原)は任意で、一つまたは両方の末端においてリンカー配列と隣接していてもよい。本発明のライノウイルスベクターは、生存型(live)であってもよく、または不活化されていてもよい。
【0010】
第二の局面において、本発明は、本明細書において記述されるライノウイルスベクターと、一つまたは複数の薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む薬学的組成物を提供する。任意で、そのような薬学的組成物にはさらに、アジュバント(例えば、アルミニウムまたはキチンに基づくアジュバント)および/または一つまたは複数のさらなる活性成分(例えば、M2e配列のような抗原配列と融合したB型肝炎コアタンパク質)が含まれうる。
【0011】
第三の局面において、本発明は、本明細書において記述される薬学的組成物を被験体に投与する段階を伴う、被験体(例えば、ヒト被験体)において抗原(例えば、インフルエンザウイルス抗原)に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。一つの例において、被験体はインフルエンザウイルス感染症のような感染症を有しないが、該感染症を発症するリスクを有する。もう一つの例において、被験体は、インフルエンザウイルス感染症のような、それに対してベクターが免疫を誘導する感染症を有する。様々な例において、薬学的組成物は被験体の鼻腔内に投与される。
【0012】
第四の局面において、本発明は、本明細書において記述されるライノウイルスベクターと、一つまたは複数の薬学的に許容される担体または希釈剤とを混合する段階を伴う、本明細書において記述される薬学的組成物を製造する方法を提供する。任意で、これらの方法は、アジュバントの付加、凍結乾燥材料の溶解、および/または他の活性成分との混合を伴いうる。
【0013】
第五の局面において、本発明は、本明細書において記述されるライノウイルスベクターのゲノムをコードするかまたは該ゲノムに対応する核酸分子を提供する。
【0014】
第六の局面において、本発明は、挿入されたインフルエンザウイルス抗原配列(例えば、M2e配列)のような、一つまたは複数の異種抗原配列を含むNimIIペプチドを提供する。
【0015】
第七の局面において、本発明は、インフルエンザウイルス抗原(例えば、インフルエンザウイルスM2e)のような抗原を含む、本明細書において記述されるライノウイルスベクターを、生成する方法を提供する。これらの方法には、以下の段階が含まれうる:(i)挿入された抗原配列(例えば、インフルエンザウイルス抗原配列)を含む感染性のcDNAクローンに基づいて、組換え型ライノウイルスベクターのライブラリーを生成する段階;および(ii)(a)挿入された配列を継代の際に維持する組換え型ウイルスであり、かつ(b)挿入された配列に対する抗体によって中和される組換え型ウイルスを、ライブラリーから選択する段階。これらの方法の一つの例において、ライノウイルスベクターは、ヒトライノウイルス14(HRV14)である。他の例において、挿入された抗原配列は、NimI、NimII、NimIII、およびNimIVからなる群より選択される位置で挿入されている。任意で、挿入された抗原配列は、本明細書において記述されるように、一つまたは両方の末端においてランダムリンカー配列と隣接していてもよい。
【0016】
第八の局面において、本発明は、挿入された抗原(例えば、インフルエンザウイルス抗原)配列を含むライノウイルスベクターを培養する方法を提供する。これらの方法は、HeLa細胞またはMRC-5細胞においてベクターを継代する段階を伴う。
【0017】
本発明は、いくつかの長所を提供する。例えば、M2eのような抗原を送達するために生存型ベクター系を用いることは、以下を含む長所を提供する:(i)ワクチンの1回投与もの少なさで、非常に強く長く持続する抗体応答を誘発できること、および(ii)サブユニットまたは死菌ワクチンと比較して、製造に関して高い規模拡大性があること(すなわち、より少ない費用でより多くの用量)。このように、汎流行の状況において、より多くの人々を、生ワクチンによって比較的短期間で免疫することができる。さらに、本発明のHRVベクターは、鼻腔内に送達することができ、それによって全身性の粘膜免疫応答が得られる。HRV14を用いることは、HRV14がヒト集団において非病原性であり、めったに観察されないことから、さらなる長所を提供し(Andries et al., J. Virol. 64:1117-1123, 1990;Lee et al., Virus Genes 9:177-181, 1995)、これはワクチンのレシピエントにおける既存の抗ベクター免疫の確率を低減させる。さらに、ヒトに感染するために必要なHRVの量は非常に少なく(一培養細胞感染量(TCID50)(Savolainen-Kopra, "Molecular Epidemiology of Human Rhinoviruses," Publications of the National Public Health Institute 2/2006, Helsinki, Finland, 2006))、これはHRVに基づくワクチン製造の費用対効果に関して好都合な特色である。
【0018】
本発明の他の特色および長所は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】HRV14のウイルス粒子(上のパネル)およびゲノム(下のパネル)の略図である。ヒトライノウイルス14(HRV14)カプシドは偽T=3(P=3)イソケドラル(isochedral)対称性を示し、ウイルスタンパク質VP1、VP2、VP3、およびVP4の60コピーと共にRNA-カプシド界面でのVP4からなる(Rossmann et al., Nature 317:145-153, 1985)。VP1〜3タンパク質は、細胞受容体の受容体結合部位、細胞内接着分子1(ICAM-1)(Colonno et al., J. Virol. 63:36-42, 1989)を含有する峡谷部を形成する。三つの主要な中和免疫原(Nim)部位であるNimI(AB)、NimII、およびNimIIIが、中和抗体の結合部位として峡谷部の周縁部の表面で同定された(Sherry et al., J. Virol. 57:246-257, 1986)。HRV14粒子の再構成は、NimI特異的mAb17と共にHRV14結晶構造に基づくキメラプログラムにおいて作製された(タンパク質データバンクデータベース#1RVF)。
【図2】以下の通りに記述される。(A)本試験において作製されたHRV14-M2e構築物。HRV14 cDNAクローンの誘導体、プラスミドpWR1を、M2e挿入変異体の構築のために用いた。(B)HRV14-NimII-XXX17AAおよびHRV14-NimII-XXX23AAウイルスライブラリーと共にpWR1に由来する野生型HRV14によって産生されるプラーク。構築物#1は、本文において考察されてさらなるデータ(図3および4)によって支持されるプラークを生じず、ランダムリンカー戦略がHRVにおける新規エピトープを工学操作する有効な手段であることを示している。
【図3】異なるHRV14-M2e構築物におけるM2e挿入断片の安定性を示す。挿入断片を含有する断片を、プライマー対、P1-up100Fw、VP1-dwn200Rv(緑色)、または14FAflII-1730Rv(赤色)によってRT-PCR増幅するとそれぞれ、「PCR B」(緑色)または「PCR A」(赤色)DNA断片が得られた。これらの断片をXhoIによって消化した。継代2、3、および4回目のHRV14-M2eキメラに関して、および継代4回目のHRV14-NimII-XXX17AAおよびHRV14-NimII-XXX17AAウイルスライブラリーに関するアガロースゲル電気泳動の結果を示す。切断された二つの断片(矢印で示す)は挿入断片含有ウイルスを表す。
【図4】HRV14の受容体結合ドメインによる、NimII部位におけるアミノ酸23個のM2e挿入断片の起こりうる立体干渉を示す。リンカーを有しない挿入断片は、NimIIから枝を出して、写真に示されるように峡谷部の反対側(すなわちNimI部位における)にほぼ達することができると考えられる。その障壁は、峡谷部への受容体の入り口を有効に遮断することができると考えられる。N末端リンカーは、挿入断片の位置を変化させることができ(矢印によって方向が示される)、峡谷部に対するアクセスを開く。HRV14-NimII-M2e(23AA)のVP1-VP4サブユニットに関するこの分子モデルは、Accelrys Discovery Studio(Accelrys Software, Inc)において作製された。これは、利用可能な構造データおよびモデリングソフトウェアにより本発明者らがHRV14に新規エピトープを工学操作することができることを図示する。
【図5】抗M2e Mab 14C2(Abeam, Inc; カタログ# ab5416)によるHRV14、HRV14-NimII-XXX23AAライブラリー、およびHRV14-NimII-XXX17AAライブラリーのプラーク減少中和試験(PRNT)の結果を示す。結果は双方のライブラリーの効率的な中和を証明するが、ベクターウイルス(HRV14)の中和を証明しない。双方のライブラリーの純度(WTの混入がない)も同様にこれらの結果から明白である。
【図6】曝露前の免疫マウスにおけるM2e特異的IgG抗体応答(プールした試料)を示す。エンドポイント力価(ET)を関連する群のタイトルの後に示す。対応する免疫時間を括弧内に示す(d0およびd21はそれぞれ、0日目および21日目を表す)。
【図7】曝露前の免疫マウスにおけるHRV14特異的IgG抗体応答(プールした試料)を示す。(A)HRV14-M2e(17AA)ウイルスの1、2、または3回投与によって免疫した群;(B)親HRV14ウイルスの1回または2回投与によって免疫した群。
【図8】免疫マウスの個々のM2e特異的IgG抗体応答を示す。
【図9】表4において記述されるように免疫したマウスにおけるM2e特異的抗体アイソタイプIgG1およびIgG2aを示す:(A)IgG1 ELISA(群毎にプールした試料);(B)IgG2a ELISA(群毎にプールした試料);(C)図9Aおよび9Bの力価;(D)群4(赤色;第一および第三の組のデータ)および群7(緑色;第二および第四の組のデータ)のマウスの個々の血清試料(希釈1:2,700)におけるM2e特異的IgG1(点)およびIgG2e(菱形)のレベル(表4を参照されたい)。
【図10】表4において記述されるように免疫したマウスにおけるIgG2aアイソタイプのM2e特異的抗体を示す。(A)M2eペプチドによるELISA(群毎にプールした試料);(B)M2e特異的ペプチドに対するELISAにおいて試験した群4(赤色;第一の組のデータ)および群7(緑色;第二の組のデータ)のマウスの個々の血清試料(希釈1:2,700)(表4を参照されたい)。
【図11】表4(上のパネル)において記述されるように免疫したマウスにおけるIgG2aアイソタイプのM2e特異的抗体を示す。
【図12】PR8インフルエンザA型株による曝露後28日目の全ての群の生存率を示す。
【図13】PR8インフルエンザA型株による曝露後28日目の全ての群の罹病率(図13A);群4(図13B)および群7(図13C)内の個々の体重を示す。
【図14】曝露前の免疫マウスにおけるM2e特異的IgG抗体応答(プールした試料)を示す(群に関しては表5を参照されたい)。
【図15】PR8インフルエンザA型株による非致死的曝露後17日間の全ての群の罹病率(体重の比率)を示す。
【図16】マウス抗HRV14-NimIVHRV6血清によるHRV14およびHRV6のプラーク減少中和試験(PRNT)の結果を示す。これらのデータは、HRV14カプシドのバックグラウンドにおいてNimIVHRV6が免疫優性であることの証明として役立ち、外来性エピトープを挿入するための新規部位を示唆している。
【図17】インフルエンザウイルスの致死的鼻腔内曝露に対するBalb/cマウスの防御を示す:A)曝露後の生存(%)、およびB)曝露後の体重減少。
【図18】HRV14のビリオンタンパク質における挿入部位の略図である。M2eを、NimI、NimII、NimIII、およびNimIVの表示の位置に導入することができる。XXXM2eは本明細書において記述されるM2eライブラリーを意味する。
【図19】本発明に従って作製された二つのキメラにおいて用いられるVP2のNimII内の挿入部位を示す、HRV14構造領域の略図である。これらのキメラ、HRV14-M2e(17AA)およびHRV14-M2e(23AA)のヌクレオチド配列も同様に提供される。
【発明を実施するための形態】
【0020】
詳細な説明
本発明は、万能のインフルエンザウイルス決定基の効率的な送達および提示のためのベクターとしてヒトライノウイルス(HRV)を用いることに基づく万能(汎流行)インフルエンザワクチンを提供する。以下にさらに記述されるように、インフルエンザマトリクスタンパク質2の細胞外ドメイン(M2e)は、本発明に記載の万能インフルエンザ(インフルエンザA型)ワクチンにおいて含まれうる「万能」エピトープである。このアプローチは、局所粘膜免疫を誘導するために鼻腔内投与することができる有効なインフルエンザ汎流行ワクチンを提供する。本発明に記載のワクチンの二つの例、すなわちHRV14-M2e(17AA)およびHRV14-M2e(23AA)を図19に図解する。この図にはこれらのウイルスのヌクレオチド配列が含まれる。これらは、万能インフルエンザワクチン候補体の例である。このような情報に基づいて、当業者は直ちに、これらの実施例において示されるM2e配列、または他のインフルエンザエピトープが含まれるワクチン候補体を構築することができる。ワクチン候補体はまた、以下に詳しく記述されるように他の非インフルエンザエピトープに基づいて構築することができる。本発明のベクター、ワクチン組成物、および方法を以下にさらに記述する。
【0021】
HRVベクター
本発明のベクターは、非病原性血清型ヒトライノウイルス14(HRV14)のようなヒトライノウイルスに基づく。HRV14ウイルス粒子およびゲノム構造を図1に図解する。この図はウイルス構造タンパク質(VP1、VP2、VP3、およびVP4)、非構造タンパク質(P2-A、P2-B、P-2C、P3-A、3B(VPg)、3C、および3D)、ならびにHRV14における主要な中和免疫原性(neutralizing immunogenic)部位(Nim:NimI、NimII、NimIII、およびNimIV)の位置を示す。
【0022】
本発明において用いることができるHRV14の分子クローンの例は、pWR3.26(American Type Culture Collection: ATCC(登録商標)番号:VRMC-7(商標))である。このクローンは、以下により詳細に記述されると共に、Lee et al., J. Virology 67(4):2110-2122, 1993(同様に配列付表3を参照されたい)によって記述されている。HRV14のさらなる起源も同様に本発明において用いることができる(例えば、ATCCアクセッション番号VR284;同様にGenBankアクセッション番号L05355およびK02121;Stanway et al., Nucleic Acids Res. 12(20):7859-7875, 1984;およびCallahan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82(3):732-736, 1985を参照されたい)。HRV14の他に、他のヒトライノウイルス血清型を本発明において用いることができる。当技術分野において公知であるように、100個より多いヒトライノウイルス血清型が存在し、そのいずれもHRV14と同じ方法で感染性クローンの誘導の際に本発明において用いることができる。本明細書ではHRV14に関して記述するが、本発明は、他のライノウイルス血清型にも同様に当てはまる。
【0023】
抗原配列を、本発明に従ってHRVベクターに、以下にさらに記述されるように異なる部位で挿入することができる。一つの例においては、配列をHRV14のような血清型のNimII部位に挿入する。NimII(中和免疫原II)は、VP1のアミノ酸210位ならびにVP2のアミノ酸156、158、159、161、および162位を含むHRV14における免疫優性領域である(Savolainen-Kopra, "Molecular Epidemiology of Human Rhinoviruses," Publications of the National Public Health Institute 2/2006, Helsinki, Finland, 2006)。以下に記述される具体的な例において、配列はVP2のアミノ酸158位と160位の間に挿入される。挿入はNimIIエピトープ内の他の部位でも同様に行うことができる。例えば挿入は、VP2の156、158、159、161、もしくは162位、またはVP1の210位、またはそれらの組み合わせの任意の位置で行うことができる。
【0024】
挿入を単独で、または他の部位(例えば、NimII部位)における挿入と組み合わせて行うことができるさらなる部位には、NimI(AおよびB)、NimIII、およびNimIVが含まれる。このように、挿入は、例えばVP1の91および/または95位(NimIA)、VP1の83、85、138、および/または139位(NimIB)、および/またはVP1の287位(NimIII)で行うことができる(例えば、図18を参照されたい)。NimIVは、VP1のカルボキシル末端領域、HRV14 VP1のアミノ酸274〜289位を表す以下の配列
を含む領域に存在する。この領域における任意のアミノ酸間の挿入が本発明に含まれる。このように、本発明には、例えばアミノ酸274と275位;275と276位;276と277位;277と278位;278と279位;279と280位;280と281位;281と282位;282と283位;283と284位;284と285位;285と286位;286と287位;287と288位;および288と289位の間の挿入が含まれる。これらの挿入の他に、本発明には、この領域における一つまたは複数(例えば、3、4、5、6、7、8、9、または10)個のアミノ酸が欠失している挿入が含まれる。このように、例えば本発明には、アミノ酸274と276位;275と277位;276と278位;277と279位;278と280位;279と281位;280と282位;281と283位;282と284位;283と285位;284と286位;285と287位;286と288位;287と289位;288と290位;および289と291位の間の挿入が含まれる。
【0025】
本発明のベクターは、標準的な分子生物学の方法を用いて作製される。この方法は、HRV14のNimIIにおける挿入を含むベクターの場合について以下に例示する。さらに、および以下に詳細に記述されるように、本発明のベクターは、生存ウイルスの形で投与することができ、または例えば当業者に公知の方法を用いて、投与前にホルマリン不活化もしくは紫外線処置によって不活化することができる。
【0026】
任意で、ベクターは、アミノおよび/またはカルボキシル末端において、挿入されたインフルエンザ配列とHRVベクター配列との間にリンカー配列を含んでいてもよい。これらのリンカー配列は、挿入された配列に対して可動性を提供し、それによって、挿入された配列は、免疫応答を誘導することができるように挿入エピトープを提示することができる。そのようなリンカー配列の例を以下に提供する。特定の挿入断片と共に用いられるリンカー配列の同定は、例えば、本明細書において記述されるように、本発明のライブラリースクリーニング法によって行うことができる。簡単に説明すると、本発明の方法において、有効なリンカー配列の同定に要求される領域においてランダム配列を有するライブラリーを構築する。ライブラリーから生成されたウイルスを、有効なリンカーを同定するために、生存率および挿入された配列の免疫原性に関して試験する。
【0027】
異種ペプチド
本発明のウイルスベクターは、予防的または治療的価値がある任意のペプチドまたはタンパク質を送達するために用いることができる。例えば、本発明のベクターは、HRVタンパク質に挿入される任意のタンパク質に基づく抗原に対する免疫応答(予防的または治療的)の誘導において用いることができる。
【0028】
本発明のベクターにはそれぞれ、一つのエピトープが含まれうる。または、多数のエピトープを、ベクターにおいて一つの部位に(例えば、アミノ酸のポリグリシンの枝のような可動性リンカーによって異なるエピトープを分離することができるポリトープ(polytope)のような)、異なる部位に(例えば異なるNim部位)、またはその任意の組み合わせで挿入することができる。異なるエピトープは、一つの病原体種に由来していてもよく、または異なる種および/または異なる属に由来していてもよい。ベクターには、多数のペプチド、例えば本明細書において記載されるペプチドの多数のコピー、または本明細書において記載されるペプチドなどのペプチドの組み合わせが含まれうる。一例として、ベクターには、ヒトおよびトリM2eペプチド(および/またはそのコンセンサス配列)が含まれうる。
【0029】
本発明において用いることができる抗原は、例えばウイルス、細菌、および寄生虫のような感染物質に由来しうる。そのような感染物質の具体的な例は、ヒトに感染するウイルス(例えば、A型、B型、およびC型株)およびトリインフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルスである。インフルエンザウイルスからの抗原の例には、M2、血球凝集素(HA;例えばH1〜H16のいずれか一つまたはそのサブユニット)(またはHAサブユニットHA1およびHA2)、ノイラミニダーゼ(NA;例えばN1〜N9のいずれか一つ)、M1、核タンパク質(NP)、およびBタンパク質に由来する抗原が含まれる。
【0030】
本発明のベクターに含めることができるさらなる配列は、インフルエンザウイルスM2e配列である。そのような配列の例は、本明細書を通して、および配列付表1において提供される。そのような配列の具体的な例には、以下が含まれる:
。本発明において用いることができるさらなるM2e配列には、インフルエンザB型のBM2タンパク質の細胞外ドメイン(コンセンサスMLEPFQ)およびH5N1トリインフルエンザからのM2eペプチド
からの配列が含まれる。
【0031】
本発明のベクターに含まれるペプチドには、先に記したように完全な配列、または所望の免疫応答を誘導することができるエピトープを含む断片が含まれうる。そのような断片には、例えば、これらのペプチド内からのアミノ酸2〜20個、3〜18個、4〜15個、5〜12個、または6〜10個の断片が含まれてもよい。さらに、さらなるアミノおよび/またはカルボキシル末端アミノ酸配列がそのようなペプチドに含まれうる。このように、ペプチドには、天然に存在する、隣接配列である、または人工的リンカー配列であるか否かによらず、例えばそのようなアミノ酸1〜10個、2〜9個、3〜8個、4〜7個、または5〜6個が含まれうる(以下も同様に参照されたい)。上記の配列のそのような可能性があるペプチド断片は全て、本発明に含まれる。
【0032】
インフルエンザにおいて保存されているペプチドの他の例を本発明において用いることができ、これらには、インフルエンザB型において保存されているNBeペプチド
が含まれる。本発明において用いることができるインフルエンザペプチドならびにそのようなペプチドを誘導することができる(例えば、断片化によって)タンパク質のさらなる例は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2002/0165176号、米国特許出願公開第2003/0175290号、米国特許出願公開第2004/0055024号、米国特許出願公開第2004/0116664号、米国特許出願公開第2004/0219170号、米国特許出願公開第2004/0223976号、米国特許出願公開第2005/0042229号、米国特許出願公開2005/0003349号、米国特許出願公開第2005/0009008号、米国特許出願公開第2005/0186621号、米国特許第4,752,473号、米国特許第5,374,717号、米国特許第6,169,175号、米国特許第6,720,409号、米国特許第6,750,325号、米国特許第6,872,395号、WO 93/15763、WO 94/06468、WO 94/17826、WO 96/10631、WO 99/07839、WO 99/58658、WO 02/14478、WO 2003/102165、WO 2004/053091、WO 2005/055957、ならびに添付の配列付表1および2(およびその中に引用される参考文献)において記述されている。さらに、インフルエンザの保存された免疫原性/防御TおよびB細胞エピトープは、多くの有望な交叉防御エピトープが最近同定されているwww.immuneepitope.orgデータベースから選ぶことができる(Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 104:246-251, 2007、および補助表)。本発明は、オンラインIEDB源からの任意のペプチド、例えばBui et al., 上記において記述された保存されたBおよびT細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスエピトープを使用することができる。
【0033】
寄生虫(例えば、マラリア)、他の病原性ウイルス(例えば、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV;例えばgag)、およびC型肝炎ウイルス(HCV))、および細菌(例えば、ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、およびヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori))のような、他のヒト病原体/獣医学的病原体からの防御エピトープもまた、本発明のベクターに含めることができる。これらおよび他の病原体の様々な適切なエピトープが文献において容易に見いだされうる。例えば、異なるHPV遺伝子型から防御する広範交叉中和抗体を誘導する乳頭腫ウイルスL2タンパク質からの交叉防御エピトープ/ペプチドが、例えばHPV16ウイルスのL2タンパク質のアミノ酸1〜88位、アミノ酸1〜200位、またはアミノ酸17〜36位のように、Schillerおよび共同研究者によって同定されている
。本発明において用いることができるさらなる病原体ならびにこれらの病原体からの抗原およびエピトープの例は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、WO 2004/053091、WO 03/102165、WO 02/14478、および米国特許出願公開第2003/0185854号において提供される。
【0034】
抗原を得ることができる病原体のさらなる例を、以下の表1に記載する。そのような抗原の具体的な例には、表2において記載される抗原が含まれる。さらに、本発明のベクターに挿入することができるエピトープの具体的な例を表3に提供する。表3において認められるように、本発明のベクターにおいて用いられるエピトープは、B細胞エピトープ(すなわち、中和エピトープ)、またはT細胞エピトープ(すなわち、Tヘルパーおよび細胞障害性T細胞特異的エピトープ)でありうる。
【0035】
本発明のベクターは、病原体由来抗原の他に抗原を送達するために用いることができる。例えば、ベクターは、癌に対する免疫療法の方法において用いるための腫瘍関連抗原を送達するために用いることができる。多数の腫瘍関連抗原が当技術分野において公知であり、本発明に従って投与することができる。癌(および対応する腫瘍関連抗原)の例は以下の通りである:黒色腫(NY-ESO-1タンパク質(具体的に、アミノ酸157〜165位に存在するCTLエピトープ)、CAMEL、MART 1、gp100、チロシン関連タンパク質TRP1および2、ならびにMUC1);腺癌(ErbB2タンパク質);結腸直腸癌(17-1A、791Tgp72、および癌胎児抗原);前立腺癌(PSA1およびPSA3)。熱ショックタンパク質(hsp110)も同様にそのような抗原として用いることができる。
【0036】
本発明のもう一つの例においては、それに対する免疫応答が望まれるアレルギー誘発抗原のエピトープをコードする外因性のタンパク質を用いることができる。さらに、本発明のベクターには、ベクターを投与する被験体における特定の細胞(例えば、リガンドに対する受容体が含まれる細胞)に対して抗原のようなペプチドを送達するように、ベクターを標的とするのに用いられるリガンドが含まれうる。
【0037】
本発明のベクターに挿入されるペプチドまたはタンパク質の大きさは、当業者によって適切であると決定されうるように、例えば長さがアミノ酸3〜1000個、例えば長さがアミノ酸5〜500個、10〜100個、20〜55個、25〜45個、または35〜40個の範囲でありうる。このように、長さがアミノ酸10〜25個、12〜22個、および15〜20個の範囲のペプチドを本発明において用いることができる。さらに、本発明において記載されたペプチドには、当業者によって適切であると決定されうるように、さらなる配列を含めることができ、または長さを縮小させることができる。本明細書において記載したペプチドは、本明細書において示される本発明のベクター中に存在していてもよく、または一つもしくは複数のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多いアミノ酸)の置換もしくは欠失によって改変されていてもよい。さらに、ペプチドは、より大きいペプチドの状況でベクターに存在することができる。任意で、上記および本明細書において他所で記述したようなペプチドには、上記のようにアミノおよび/またはカルボキシル末端でさらなる配列が含まれ、そのような配列はペプチド配列(すなわち、ペプチドがインフルエンザウイルス(または他の起源)のゲノムにおいて隣接している配列)に本来会合していてもよく、または(例えば、合成リンカー配列)会合していなくてもよい。このように、ペプチドには、一つまたは両方の末端において、例えばアミノ酸1〜25個、2〜20個、3〜15個、4〜10個、または4〜8個の配列が含まれうる。具体的な例として、ペプチドには、アミノおよび/またはカルボキシル末端で1〜3個のリンカー配列が含まれてもよい。
【0038】
投与
免疫法において用いる場合、本発明のベクターは、インフルエンザウイルスのような特定の病原体による感染症のリスクを有する成人または小児における一次予防物質として投与することができる。ベクターはまた、そのペプチド抗原が由来する病原体に対する免疫応答を刺激することによって、感染患者を処置するための二次物質として用いることができる。癌に対する免疫処置の状況においては、癌を発症するリスクを有する被験体または癌を既に有する被験体に対してワクチンを投与することができる。
【0039】
ワクチン応用に関して、任意で、当業者に公知であるアジュバントを用いることができる。アジュバントは、投与経路に基づいて選択される。鼻腔内投与の場合、キチン微粒子(CMP)を用いることができる(Asahi-Ozaki et al., Microbes and Infection 8:2706-2714, 2006;Ozdemir et al., Clinical and Experimental Allergy 36:960-968, 2006;Strong et al., Clinical and Experimental Allergy 32: 1794-1800, 2002)。粘膜経路(例えば、鼻腔内または経口経路)による投与において用いるために適した他のアジュバントには、大腸菌(E. coli)の熱不安定毒素(LT)、またはその変異誘導体が含まれる。不活化ウイルスの場合、例えばアルミニウム化合物(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、またはヒドロキシリン酸アルミニウム化合物)、リポソーム製剤、(例えばQS21)、ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドA、もしくはポリホスファジンのような合成アジュバントを含む非経口アジュバントを用いることができる。
【0040】
さらに、アジュバント活性を有するサイトカインをコードする遺伝子を本発明のベクターに挿入することができる。GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13、またはIL-5のようなサイトカインをコードする遺伝子を外来性抗原遺伝子と共に挿入して、それによって免疫応答の増強が得られるワクチンを産生する、または細胞、液性、もしくは粘膜応答に特異的に向けられる免疫を調節することができる。または、サイトカインは、周知の手段によって(例えば、直接接種、裸のDNA、ウイルスベクターにおいて等)、組換え型ワクチンウイルスと同時に、連続的に、または個々に送達することができる。
【0041】
本発明のウイルスは、他のワクチン接種アプローチと併用して用いることができる。例えば、ウイルスを、同じまたは異なる抗原を含むサブユニットワクチンと併用して投与することができる。本発明の併用法には、他の型の抗原(例えば、サブユニット形態、あるいは肝炎コアタンパク質(例えば、大腸菌において産生される表面上にM2eペプチドを含有するB型肝炎コア粒子(HBc-M2e;Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004;WO 2005/055957;米国特許出願公開第2003/0138769号A1;米国特許出願公開第2004/0146524号A1;米国特許出願公開第2007/0036826号A1))または不活化されたウイルス全体もしくは部分的ウイルスを含む送達媒体)と共に本発明のウイルスを同時投与することが含まれうる。または、本発明のベクターは、本発明のベクターまたは他のアプローチのいずれかを初回免疫として用いた後、他のアプローチを追加免疫として用いる、またはその逆である初回免疫-追加免疫戦略において、他のアプローチ(サブユニットまたはHBcアプローチのような)と併用して用いることができる。さらに、本発明には、初回免疫剤および追加免疫剤の両方として本発明のベクターを使用する初回免疫-追加免疫戦略が含まれる。このように、そのような方法は、本発明に記載のベクターの初回投与の後に、初回投与後1週間または数週間、数ヶ月、または数年の間に行うことができる1回または複数回(例えば、1、2、3、もしくは4回)の追加投与を伴いうる。
【0042】
本発明のベクターは、標準的な方法を用いて哺乳動物(例えば、ヒト被験体)のような被験体に投与することができる。鼻腔内投与の場合、ベクターは、点鼻液の剤形で、またはエアロゾル化もしくは霧状化製剤の吸入によって投与することができる。ウイルスは、凍結乾燥形態であってもよく、または生理食塩液もしくは水のような生理的に適合性の溶液もしくは緩衝液に溶解されていてもよい。標準的な調製および製剤化法は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PAにおいて記述されるように用いることができる。さらに、適切な投与量およびレジメンの決定は当業者によって容易に決定されうる。
【0043】
本発明のベクターは、生または死菌ワクチンとして、ヒトのような被験体に投与することができる。生ワクチンは当業者に公知の方法を用いて鼻腔内投与することができる(例えば、Grunberg et al., Am. J. Respir. Crit. Car. Med. 156:609-616, 1997を参照されたい)。適切な投与量およびレジメンは、当業者によって容易に決定されうる。一例として、用量範囲は例えば、103〜108 pfu/投与でありうる。ワクチンは、例えば1回投与で都合よく投与することができるが、当業者によって必要であると決定されれば、追加免疫も同様に行うことができる。不活化ワクチンに関して、ウイルスを、例えばホルマリンまたはUV処置によって死滅させることができ、任意で適切なアジュバント(例えば、キチンまたは変異LT;上記を参照されたい)と共に約108 pfu/投与で鼻腔内投与することができる。そのようなアプローチにおいて、1回より多い(例えば、2〜3回)投与を行うことが有利である可能性がある。
【0044】
本発明は、部分的に以下の実験実施例に基づく。
【0045】
実験実施例
I.HRV14-NimII-M2eキメラの構築
本発明者らは、HRV14-NimII-M2e組換え型ウイルスを構築した。ウイルスは、抗M2e Mabが組換え型ウイルスの感染性を中和できることによって証明されるように、ビリオン表面上でM2eを発現することが示されている。
【0046】
三つのタイプのHRV14-M2e構築物を作製した(図2)。
1.VP2のアミノ酸159位と160位の間(NimII部位)に挿入されたM2eのアミノ酸23個を有するHRV14-NimII-23AA。
2.HRV14-NimII-XXX23AAライブラリー。この組の構築物(プラスミドライブラリー)は、ペプチドと融合したアミノ酸3個のランダム化N末端リンカーが存在することを除き、第一の構築物と類似であった。このランダム化リンカーは、リンカーアミノ酸をコードするランダム化ヌクレオチド9個を含有する5'(直接)プライマーを用いてM2e配列によって生成された。
3.HRV14-NimII-XXX17AAライブラリー。このライブラリーは、最初と同じ方法で生成されたが、M2eの最初のアミノ酸17個のみを含有する短くなったM2eペプチドを含有した。
【0047】
HRV14感染性クローンへのクローニングプロセスを容易にするために、本発明者らは、そのpUCプラスミド骨格をpEtベクター(Novagen)と置換することによってpWR3.26感染性クローンを改変した。得られたプラスミドpWR1(図2)は、大腸菌においてより安定に維持され、操作がより容易である。ウイルスライブラリー#2および#3のプラーク形態は、HRV14の親とは異なった(図2B)。ライブラリーのプラークサイズは、野生型と類似であるように見えたが、プラークは不透明であった。構築物#1はトランスフェクション時にプラークを形成しなかった。
【0048】
構築されたウイルスの遺伝的安定性をモニターするために、本発明者らは、サイレント変異誘発によってM2e配列の中央部でXhoI切断部位を組み入れた。変異M2e遺伝子を含有するウイルスから得られたRT-PCR断片は、XhoIによって切断されるが、野生型HRV14において産生された対応するDNA産物は消化されないままである(図3)。HRV14-NimII-23AAキメラ構築物(#1)によって、生存しているがむしろ不安定なウイルスが得られた。図3において示されるように、「PCR A」断片の二つのXhoI消化産物は、2回目の継代後で検出可能であるが、その後の継代では検出されない。対照的に、ライブラリー(#2)および(#3)は、M2e挿入断片を安定に維持した:H1 HeLa細胞において4回目の継代時のウイルスライブラリーから得られた断片「PCR B」は、XhoIによって完全に消化された(図3)。構築物#1の不安定性は、受容体結合ドメインによる、挿入されたペプチドの立体干渉による可能性があるが(図4)、これは、構築物#2および#3の場合と同様に、縮重リンカーを提供すると緩和される可能性がある。ランダム化N末端リンカーは、その受容体に対する有効なウイルス結合を可能にする受容体結合ドメインを含有する峡谷部からペプチドを再指向させる(redirect)可能性がある(図4)。
【0049】
本発明者らは、抗M2e Mab(14C2 MAb, Abeam, Inc. カタログ# ab5416)によるウイルスライブラリーの中和試験を行った。ウイルスの中和はまた、ライブラリーの純度(すなわち、野生型HRV14が存在しないこと)を証明するためのツールとして用いることができる。プラーク減少中和試験(PRNT)の結果は、双方のライブラリーに対するMab 14C2の極めて高い特異性および中和能を証明した(図5)。
【0050】
両ライブラリーとも抗M2e Mabによる中和に対して極めて感受性が高いことが示されたが(図5)、対照ウイルス(pWR1)はMabの最低希釈1:10であっても中和されなかった。双方のライブラリーに関する50%中和は、抗体の〜1:2,000,000希釈(14C2の保存液の濃度は1 mg/ml)で観察された。組換え型ウイルスがそのように有効に中和されたことにより、HRV14のNimIIにおいて提示されるM2eペプチドが、抗体によって容易に認識可能な適切な立体構造に存在することが示された。
【0051】
II.安定なHRV14-NimII-M2e組換え体の同定
H1 HeLa細胞において4回継代後、それぞれのライブラリーからの個々のクローン6個をプラーク精製して、さらに4回の継代後、保有された挿入断片のシークエンシングによって特徴付けした。それぞれのライブラリーは、一つの優性で安定に複製するウイルスクローンを生じた。HRV14-NimII-XXX23AAライブラリーから単離されたウイルスは全て、GHTをN末端リンカーとして同じ挿入断片配列GHTSLLKEVETPIRNEWGSRSNDSSDを有したが、HRV14-NimII-XXX17AAライブラリーからのウイルスは全て、QPAをN末端リンカーとして同じ配列QPASLLTEVETPIRNEWGSRを示した。アミノ酸23個の挿入断片を保有する生存クローンは全て、アミノ酸7位(M2e外来性挿入断片における4位)でチロシンからリジンへの置換を有した。アミノ酸17個の挿入断片を保有するクローンは全て、野生型M2e配列を含有した。これらの結果は、遺伝的に安定な組換え型HRV-M2eウイルスが単離されうることを示している。さらなるインビボ試験において、HRV14-M2e(17AA)がインフルエンザA型のPR8株に対する防御を提供できるか否かを、腹腔内投与経路を用いて評価した。
【0052】
III.HRV14-NimII-M2e組換え体によるインビボ試験
A.インビボ実験#1:腹腔内免疫
1.実験設計
9週齢の雌性Balb/cマウス(マウス8匹/群)を0日目に初回免疫した後、21日目に、容量500μLにおいてアジュバント(水酸化アルミニウム)100μgと混合した蔗糖精製HRV-M2e(17AA;表4の脚注(4)を参照されたい)ウイルスを、HRV14-M2e(17AA)の5.0×106 pfu、親HRV14の1.3×107 pfu、または陰性対照としての偽(PBS)のいずれかによって腹腔内投与することによって追加免疫した。ゴールドスタンダードとして、現在のワクチン候補ACAM-FluA(M2e 3コピーを保有する組換え型B型肝炎コア粒子)を用いた。後者は単独、または初回免疫/追加免疫のためにHRV14-M2eまたはHRV14と併用して用いた(表4)。防御を証明するために、マウスを全て35日目にインフルエンザA/PR/8/34(H1N1)ウイルスのLD50の4倍量の曝露に供した。罹病率および死亡率を21日間モニターした。保有されるペプチドに対する血清抗体に関して試験するために、マウスを接種前に採血して(ベースライン)、再度33日目に採血した。血清中のM2e特異的抗体力価を、合成M2eペプチドによってコーティングしたマイクロタイタープレートにおいて行った確立されたELISAによって決定した。M2e特異的総IgG、Ig2a、およびIg2bの力価を決定した。
【0053】
2.結果
a.免疫原性
i.免疫した動物における総IgG
M2e特異的抗体力価を、プールした血清試料(図6)と共に個々の動物試料(図7)を用いて、それぞれの群に関して測定した。プールした試料による結果(図6)は、アミノ酸17個のM2eを保有する組換え型HRV14による初回免疫およびACAM-FluAによる追加免疫が、B型肝炎ウイルスコアM2e組換え型ウイルス様粒子(10μg/投与)の2回投与と同レベルの抗体を誘発することを示した(エンドポイント力価(ET)=218,700)。ACAM-FluAによる追加免疫は、HRV14ベクター(群6;ET=2,700)と比較してHRV14-M2e(17AA)(群4;ET=218,700)によって初回免疫した場合に、約100倍高いM2e特異的応答を誘発した。このように、HRV14-M2eの初回免疫効果は、M2e挿入断片のみに依存してベクターには依存しない。
【0054】
Arnold et al., 2006(Arnold, G. F. and Arnold, E. Chimeric Virus Vaccine. 11/176,182[米国特許出願公開第2006/0088549号A1], 1-57. 4-27-2006. US. 7-7-2005)によってなされた仮定に基づくと、HRV14の109 pfuという免疫量は、タンパク質およそ10μgに対応する。本発明者らは、組換え型HRV-M2eウイルスの一つの免疫量がタンパク質10 ngを表すとほぼ推定した。分子量の差および組換え型B型肝炎コア粒子におけるサブユニットの多重度を考慮に入れて、本発明者らは、HBc-M2eの一つの免疫量が、HRV-M2eよりM2eタンパク質をおよそ10,000倍多く含有すると推測する。HRVベクターを用いて同等の抗体レベルが得られたことはおそらく、より安価な産生方法論を用いてより免疫原性の高い提示システムであることを支持する。
【0055】
M2e抗体レベルは、HRV14-M2e(17AA)の投与回数に反比例した。実際にHRV14-M2e(17AA)ウイルス(群1)の3回投与は、最低のM2e特異的応答を誘発したのに対し(ET=2.700)、2回投与レジメンは、10倍高い応答を誘発し(群2;ET=24,300)、1回投与は2回投与より3倍高い応答を誘発した(群5;ET=72,900)。この相関が抗ベクター免疫によるものか否かを確認するために、本発明者らはHRV14ベクターに対する全ての群の免疫応答を個々に試験した(図7)。HRV14-M2e(17AA)の三つのタイプの投与(1、2、または3回投与)は全て、同等のレベルのHRV14特異的応答(ET=72,900)を示した(図7A)。これは、M2eに対する免疫応答が減少した理由としての抗ベクター免疫に反対し、1回量の投与で十分であることを示唆している。
【0056】
個々の血清試料のM2e特異的ELISA(図8)は、プールした試料について示された同じ群間の差を検出した:群4および群7の個々のマウスにおける平均抗体レベルは、二つの血清希釈液(1:300および1:2,700)で示されたように、調べた他の任意の群より有意に高かった。
【0057】
ii.免疫動物における抗体のIgG2a、IgG2b、およびIgG1サブタイプ
M2eワクチン接種動物における優勢なM2特異的Abアイソタイプは、いくらかのIgG2aを伴うIgG2bであることが示された(Jegerlehner et al., J. Immunol. 172.9:5598-5605, 2004)。これらの二つのアイソタイプは、マウスにおける抗体依存的細胞障害性(ADCC)の最も重要なメディエータであることが示されており(Denkers et al., J. Immunol. 135:2183, 1985)、これはM2e依存的防御に関する主要なメカニズムであると考えられている。本研究において、本発明者らは、IgG1、IgG2a、およびIgG2bアイソタイプ力価に関して、プールした群および個々の血清試料を試験した。
【0058】
群4(HRV14-M2e(17AA)による初回免疫/ACAM-FluAによる追加免疫)および群7(ACAM-FluAによる初回免疫/追加免疫)は、他の群の中でもIgG1およびIgG2a抗体の最高力価を証明した(図9)。IgG1力価は群4より群7において有意に高かったが(図9Aおよび9D)、IgG2a力価は群4において高く(図9Bおよび9D)、一方、群7の動物のIgG2b力価は群4より高かった(図10)。免疫したマウスにおけるIgG2aアイソタイプのM2e特異的抗体を図11に示す。
【0059】
b.罹病率および死亡率
RP8株の曝露後28日間、マウスを罹病率および死亡率に関してモニターした。図12において示されるように、群4は、調べた他の全ての群と比較して最高の生存率(80%)を証明したが、群7は陰性対照(PBS)と有意差を示さなかった。群4はまた、罹病率に関しても優れていた;体重変化は他の全ての群ほど有意に劇的ではなかった(図13A、B)。
【0060】
このように、HRV14-M2e(17AA)ウイルスは、マウスにおいて非常に免疫原性で防御的である。これは、従来の組換え型タンパク質レジメンと、初回免疫-追加免疫レジメンにおける二つの組み合わせに対する応答に匹敵する。後者は、組換え型タンパク質単独とは有意に異なる免疫応答を証明した:M2eを保有する組換え型HBc(Acam-FluA)の2回投与は、優勢なIgG1抗体サブタイプを誘発したが、HRV14-M2e(17AA)による初回免疫およびAcam-FluAによる追加免疫は、優勢なサブタイプとしてIgG2aを生成し、これはADCCにとって重要であることが示された。その上、後者の群は、他の全ての群に対して最高の防御を証明した。
【0061】
HRVはマウスにおいて複製しないことから、このモデルにおけるHRV-M2e組換え体の接種は、適した非経口アジュバントと共に行われ、不活化ワクチンによる免疫を模倣することに注目することは重要である。本発明者らは、ヒトにおいて最終的に二つの選択肢を評価することを提唱する:水酸化アルミニウムのような認可が得られた非経口アジュバントと共に同時投与される、生の組換え型HRV14-M2eウイルスワクチンおよび/または不活化ワクチン(例えば、ホルマリン不活化)。
【0062】
B.インビボ実験#2:鼻腔内免疫
1.免疫処置のために用いたウイルス
このインビボ試験において、インフルエンザA型のPR8株による非致死的曝露に対する防御をHRV14-M2e(17AA)が提供できるか否かを、鼻腔内投与経路を用いて評価した。注意:HRV14-M2e(17AA)配列は先に記述された通りであった。
【0063】
2.実験設計
9週齢の雌性Balb/cマウス(マウス8匹/群)を0日目に初回免疫した後、21日目に、容量50μLにおいて大腸菌の熱不安定毒素(LT)5μgと混合した、蔗糖精製HRV14-M2e(17AA)またはHRV14(表5の脚注(3)を参照されたい)ウイルスのいずれかを108 pfu/投与(群3〜6)の鼻腔内投与によって追加免疫した。ゴールドスタンダードとして、M2e 3コピーを保有する組換え型B型肝炎コア粒子(AcamFluA)を含むワクチンを用いた。後者は、単独で、または初回免疫/追加免疫のためにHRV14-M2eまたはHRV14と併用して用いた(表5)。防御を証明するために、35日目に、全てのマウスを、インフルエンザA/PR/8/34(H1N1)ウイルスのLD50の4倍量の曝露に供した。罹病率および死亡率を21日間モニターした。保有されるペプチドに対する血清抗体を調べるために、マウスを接種前に(ベースライン)採血して、33日目に再度採血した。血清中のM2e特異的抗体力価を、合成M2eをコーティングしたマイクロタイタープレートにおいて行う確立されたELISAによって決定した。M2e特異的総IgG、IgG2a、およびIgG2bの力価を決定した。
【0064】
3.結果
a.免疫原性
i.M2e特異的抗体力価
抗体力価を、プールした血清試料を用いてそれぞれの群に関して測定した(図14)。アミノ酸17個のM2eを保有する組換え型HRV14の1回投与およびACAM-FluAによる追加免疫は、B型肝炎ウイルスコア-M2e組換え型ウイルス様粒子(10μg/投与)の2回投与と同等の総IgGレベルを誘発した(エンドポイント力価(ET)>218,700;図14A)。後者の結果は、IP免疫経路について得られたデータと一貫する。HRV14-M2eの1回投与は、AcamFluAの1回投与と同等レベルの総M2e特異的総IgGを誘発した(ET=24,300)。HRV14-M2eウイルス負荷の2分の1への減少は、総IgGレベルに対してあまり影響を及ぼさなかった(群7;ET=24,300)。
【0065】
IP投与の場合と同様に、HRV14-M2eによる初回免疫およびAcamFluAによる追加免疫は、最高レベルのIgG2aを生成した(図14C;ET>>218,700)。HRV14-M2eの1回投与は、AcamFluAの1回投与よりわずかに高いレベルのIgG2aを誘発した(ET=72,900対ET=24,300)。IgG2b(図14B)およびIgG1(図14D)の最高力価は、AcamFluAの2回投与に関して証明された。
【0066】
b.罹病率
マウスを、PR8株による非致死的曝露後17日間罹病率に関してモニターした(図15)。HRV14-M2eの1回投与は、AcamFluAの2回投与、またはHRV14-M2eによる初回免疫およびAcamFluAによる追加免疫と同等の疾患からの防御を提供した。群2のマウス(AcamFluAの1回投与)は、疾患の有意な徴候を示した。対照群(群4)は、曝露後最初の9日間の間に重度の体重減少を証明した。
【0067】
IV.HRV14ウイルスにおける新規優性中和免疫原(NimIV)、新しく発見された外来性エピトープの挿入部位
本発明者らは、新規HRV中和免疫原:中和免疫原IV(Neutralizing Immunogen IV;NimIV)を同定した。これは、エピトープ挿入組換え型ワクチンの開発のために用いることができる。NimIVは非常に免疫原性が高く、マウスにおいて高いウイルス中和力価を誘発する。HRVのNimIVは、構造タンパク質VP1のC末端領域を伴う。このエピトープは、異なるHRV血清型の間で交換することができる。一つのHRVのNimIVがもう一つの血清型ウイルスに導入される場合、これは得られたキメラ組換え体にドナー血清型の中和特徴を付与する。合成NimIVペプチドはELISAおよびウェスタンブロット実験において対応する血清型特異的抗体によって効率よく認識されることが示された。具体的に、HRV14-NimIVHRV6キメラは、HRV14におけるNimIVHRV14をHRV6ウイルスからのNimIVに置換することによって産生された。このウイルスは、抗HRV6ポリクローナル抗体によって効率よく中和され、同様にマウスにおいて抗HRV6中和反応を誘発した。HRV14-NimIVHRV6によって免疫したマウスからの血清の50%中和力価は、HRV6ウイルスに対して〜1:800であり、HRV14に対してはわずか1:400に過ぎなかった(図16)。比較のために、相同なウイルスに対するマウス抗HRV14血清の50%中和力価は1:1400であり、HRV6特異的NimIVが、残りのHRV14 Nim(I、II、およびIII)に対する抗体によるウイルス中和の有効性を有意に低減させたことを示している。
【0068】
V.インフルエンザマウス曝露モデル
ワクチン候補体の防御有効性を、適切なウイルス株を用いてマウスインフルエンザ曝露モデルにおいて試験することができる。本発明者らの試験において用いたプロトタイプインフルエンザ曝露株は、マウス適合株A/PR/8/34(H1N1)である。ウイルスを、American Type Culture Collection(カタログ番号VR-1469、ロット番号2013488)から得て、Balb/cマウスにおいて連続継代することによってインビボ成長に適合させた。マウスでの継代に関して、ウイルスを鼻腔内に接種して肺組織ホモジネートを3日後に調製した。ホモジネートをさらなるマウスにおいて継代5を通して盲継代(blind-passaged)した。さらなる継代を用いて、曝露保存液として役立つ肺ホモジネートのアリコートを調製した。
【0069】
マウスの曝露に関して、ウイルスを50μLの用量で鼻腔内に送達する。嘔吐反射を阻害するためにマウスを接種の際に麻酔して、ウイルスを肺内に通過させる。ウイルスの致死量に感染させたマウスは急速に体重が減少して、ほとんどが接種後7〜9日目に死亡する。マウス適合A/PR/8/34ウイルスの致死量(LD50)の中央値は、生体Balb/cマウスにおいて7.5プラーク形成単位(pfu)であると決定された。典型的な防御実験の結果を図17に示す。マウス10匹の群を水酸化アルミニウムによって偽免疫するか、または水酸化アルミニウムと混合したインフルエンザM2eペプチド免疫原10μgによって免疫した。免疫原は、M2eペプチドを発現するB型肝炎コアタンパク質ウイルス様粒子からなった。マウスを3週間間隔で2回免疫して、マウス適合A/PR/8/34ウイルスのLD50の4倍量を4週間後に鼻腔内に曝露した。偽免疫群のマウスは全て曝露後10日までに死亡したが、免疫群ではマウス1匹が死亡したに過ぎなかった。曝露後の体重減少は両群において起こったが、偽免疫群ではより大きかった。
【0070】
他のインフルエンザウイルス株も同様に、マウスの肺での生育に適合すると考えられる。いくつかの場合において、インビボ適合を行わずに株を用いてもよく、または肺での連続継代後であっても株が十分に病原性とならない可能性がある。この場合、罹病率および死亡率を測定するよりむしろ、本発明者らは、肺および鼻甲介組織におけるウイルス複製を測定する。組織を曝露後3日目に採取して、組織培養培地1 ml中で超音波によって破壊し、プラークアッセイまたはTCID50アッセイによってウイルス濃度に関して力価測定する。
【0071】
(表1)エピトープ/抗原/ペプチドが由来しうる病原体の例の一覧
【0072】
(表2)列挙したウイルスに由来する選択抗原の例
【0073】
(表3)列挙したウイルス/抗原に由来するBおよびT細胞エピトープの例
【0074】
(表4)免疫群(腹腔内試験)
表4の脚注:
(1)ACAM-FluAは、アミノ酸23個のM2eペプチド3コピーを保有するB型肝炎コア抗原(HBc)に基づく現在の万能インフルエンザA型ワクチン候補体である;ゴールドスタンダードとして用いられる;用量=10μg/マウス。
(2)HBcAgは、「裸の」HBc抗原である;ACAM-FluAの担体対照として用いられる;用量=10μg/マウス。
(3)HRV14は、pWR3.26感染性クローン(ATCC)から産生された「野生型」HRV14である;HRV14-M2e(17AA)の担体対照として用いられる。
(4)HRV14M2e(17AA)は、VP2のアミノ酸159位とアミノ酸160位の間(NimII部位)にQPASLLTEVETPIRNEWGSRを保有するHRV14ウイルスである。この挿入断片の最初のアミノ酸3個(QPA)は、先に記述したようにHRV14M2eXXX(17AA)ライブラリーから選択された独自のリンカーを表す。
(5)ADJ=アジュバント(アラムを全ての免疫処置において用いた)。
(6)全ての群を腹腔内投与によって免疫した。
【0075】
(表5)免疫群(鼻腔内試験)
表5の脚注:
(1)ACAM-FluAは、アミノ酸23個のM2eペプチド3コピーを保有するB型肝炎コア抗原(HBc)に基づくインフルエンザA型ワクチンである;ゴールドスタンダードとして用いられる;用量=10μg/マウス。
(2)HRV14は、pWR3.26感染性クローン(ATCC)から産生された「野生型」HRV14である;HRV14-M2e(17AA)の担体対照として用いられる。
(3)HRV14M2e(17AA)は、VP2のアミノ酸159位とアミノ酸160位の間(NimII部位)にQPASLLTEVETPIRNEWGSRを保有するHRV14ウイルスである。この挿入断片の最初のアミノ酸3個(QPA)は、先に記述したようにHRV14M2eXXX(17AA)ライブラリーから選択された独自のリンカーを表す。
(5)ADJ=アジュバント(LT=大腸菌の熱不安定毒素)。
(6)全ての群を鼻孔内投与によって免疫した。
(7)群3、4、5および6は、対応するウイルスの108 pfu/投与によって免疫した。
【0076】
他の態様
本明細書において引用された全ての出版物および特許は、それぞれの個々の出版物または特許が具体的におよび個々に参照により本明細書に組み入れられることが示されるように、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書における「一つ(a)」および「その(the)」のような単数形の使用は、本文が逆を示している場合を除き、対応する複数形を示すことを除外していない。本発明は、理解を明快にする目的で図示および実施例によっていくぶん詳細に記述してきたが、一定の変化および改変をそれらに行ってもよく、それらも添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲に含まれることは、本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかになると考えられる。
【0077】
他の態様は添付の特許請求の範囲に含まれる。
【0078】
ヒトインフルエンザA型株のM2タンパク質の細胞外部分
【0079】
配列付表2
インフルエンザT細胞エピトープ
(表1)核タンパク質のインフルエンザA型ウイルスCTLエピトープ
【0080】
(表2)核タンパク質のインフルエンザA型ウイルスTヘルパーエピトープ
【0081】
(表3)他のウイルスタンパク質のインフルエンザA型ウイルスT細胞エピトープ
【0082】
参考文献
【0083】
配列付表3
ヒトライノウイルス14(HRV14);コードされるアミノ酸配列は、以下に記載した配列(SEQ ID NO:50)のヌクレオチド629〜7168位の翻訳によって得られる。
【背景技術】
【0001】
発明の背景
地球上の集団がほとんどまたは全く免疫を有しない新しいインフルエンザウイルスのサブタイプが出現すると、インフルエンザの汎流行が起こる。20世紀の間に、インフルエンザの汎流行は、何百万人もの死、社会の破壊、および世界中での深刻な経済的損失を引き起こした。インフルエンザの専門家は、もう一つの汎流行が起こる可能性があることで一致しているが、それがいつかは分かっていない。汎流行が起こった時点での地球全体の準備レベルが、公衆衛生および疾患の経済的影響を左右すると考えられる。今日、世界保健機構(WHO)は、非常に短期間の間に、地球全体で外来患者は少なくとも数百万人、入院は2500万回より多く、そして数百万人が死亡すると推定している。これらの懸念は、2003年にトリH5N1型ウイルスが多くのアジア諸国の家禽において動物間流行レベルに達した後、ヨーロッパおよびアフリカに広がった際に強調された。幸運なことに、そのヒトに対する伝播はこれまでのところ限定的である。報告された感染症246例は高い死亡率に関連し、死亡が144例を占めた(2006年9月14日;世界保健機構(WHO)ウェブサイト)。
【0002】
従来のインフルエンザワクチンは、インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質(HA)に対する中和抗体応答を誘発するように設計されている。HAタンパク質における一定の抗原連続変異により、ワクチン組成物は、予想される循環するウイルス株にマッチするように毎年変化させなければならない。そのようなワクチンアプローチは、汎流行株の単離および同定、ならびに適切なワクチンの構築および製造に長い期間がかかることから、汎流行に直面すると受け入れられない。インフルエンザの汎流行の制御または予防に対するより有効なアプローチは、最近同定された高度に保存されたインフルエンザウイルス免疫決定基に対する防御免疫を誘発することができる「万能」ワクチンの開発を企図する。そのようなワクチンは、インフルエンザA型ウイルス株に対して広い防御を提供するはずである。さらに、そのようなワクチンは、年間を通して製造することができ、備蓄することができ、および/または年間を通して投与することができると考えられる。
【0003】
インフルエンザマトリクスタンパク質M2は、ワクチン開発のための有効な標的として役立つことが証明されている(DeFilette et al., Virology 337: 149-161, 2005)。M2は、インフルエンザA型ウイルスのアミノ酸97個の膜貫通タンパク質である(Lamb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 78:4170-4174, 1981;Lamb et al., Cell 40:627-633, 1985)。成熟タンパク質は、pH誘導型のイオンチャンネル活性を有する(Pinto et al., Cell 69:517-528, 1992;Sugrue et al., Virology 180:617-624, 1991)ホモ四量体を形成する(Holsinger et al., Virology 183:32-43, 1991;Sugrue et al., Virology 180:617-624, 1991)。M2四量体は、感染細胞の細胞質膜において高密度で発現され、同様に成熟ウイルス粒子の膜に低い頻度で組み入れられる(Takeda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:14610-14617, 2003;Zebedee et al., J. Virol. 62:2762-2772, 1998)。M2のN末端のアミノ酸24個のエクトドメイン(M2e)は、A型インフルエンザウイルスの中で高度に保存されている(Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004)。M2eの高度の保存は、最も保存されたウイルスタンパク質であるM1とのその遺伝的関係に起因する拘束(Ito et al., J. Virol. 65:5491-5498, 1991)および自然感染の際にM2e特異的抗体が存在しないこと(Black et al., J. Gen. Virol. 74 (Pt. 1):143-146, 1993)によって説明することができる。
【0004】
NCBIインフルエンザデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/multiple.cgi)からの配列を用いて得られた以下のアライメントにおいて示されるように、トリH5N1インフルエンザウイルスM2eは、典型的なヒトH1、H2、およびH3ウイルスにおいて見いだされるコンセンサス配列に対して進化しているように見え、「ヒト」インフルエンザM2eエピトープを用いて、新規トリウイルスからの防御を含む幅広い防御が可能である可能性があることを示唆している。
【0005】
H1N1 M2e配列に向けてのH5N1 M2eの進化の現象は、最近、インドネシアおよびベトナムにおいてヒトおよびトリから単離されたH5H1株800例の配列の分析に基づいて報告された(Smith et al., Virology 350:258-268, 2006)。進化したトリM2eペプチドEVETPTRNは、抗ヒトM2eモノクローナル抗体(Mab)によって効率よく認識されるが、その「前任である配列」EVETLTRNは認識されなかった(Liu et al., Microbes. Infect. 7:171-177, 2005)。このことは、何らかの「トリインフルエンザ様」の変化がヒトM2e特異的Mabによって提供された防御の有効性を低減させることがこれまでに示されていることから、重要である。興味深いことに、M2eにおけるいくつかの「トリインフルエンザ様」アミノ酸変化は、マウスにおけるヒトH1N1ウイルスの病原性を低減させた(Zharikova et al., J. Virol. 79:6644-6654, 2005)。
【0006】
WHOは、「2004年におけるカナダでのH7N3およびアジアでのH5N1の家禽での大流行の場合のように、異なる国で異なる脅威レベルで汎流行の可能性がある事象が同時に発生する」可能性を強調した(http://www.who.int/en/)。以下のアラインメントにおいて示されるように、M2e H7N7は、H5N1の「ヒト化」変種からアミノ酸1個が異なるに過ぎない。H7N1サブタイプは、種の間で伝播可能であることが証明されており(Koopmans et al., Lancet 363:587-593, 2004)、人々にとって致死的となりうる(Fouchier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 101:1356-1361, 2004)。他の株(H9N2)も同様に家禽に感染して、ヒトへと広がることが可能であることが示された(Cameron et al., Virology 278:36-41, 2000;Li et al., J. Virol. 77:6988-6994, 2003;Wong et al., Chest 129:156-168, 2006)。
【0007】
M2eに基づく組換え型タンパク質ワクチンは、相同および異種インフルエンザA型ウイルス曝露(challenge)の両方に対して防御免疫応答を誘発することが示されている(Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004;Slepushkin et al., Vaccine 13:1399-1402, 1995)。キーホールリンペットヘモシアニンおよび髄膜炎菌(N. meningitides)外膜タンパク質に結合させたM2eペプチドを用いたより最近の研究は、マウスのみならず、フェレットおよびアカゲザルにおいても良好な免疫応答を例証した(Fan et al., Vaccine 22:2993-3003, 2004)。リポソームM2eワクチンによるH1、H5、H6、およびH9インフルエンザA型ウイルスに対する防御が最近、マウスにおいて証明されている(Fan et al., Vaccine 22:2993-3003, 2004)。
【0008】
インフルエンザ抗原のための送達系の開発は、汎流行ワクチンのようなインフルエンザウイルス感染症に対するワクチンを開発するために重要である。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、第一の局面において、本明細書において記述されるようにインフルエンザウイルス抗原(例えば、M2eペプチド)のような抗原を含むライノウイルスベクターを提供する。ベクターは、ヒトにおいて非病原性でありうる(例えば、ヒトライノウイルス14(HRV14))。抗原を、本発明のベクターに、例えば中和免疫原(neutralizing immunogen)I(NimI)、中和免疫原II(NimII)(例えば、NimIIのアミノ酸158位と160位の間)、中和免疫原III(NimIII)、および中和免疫原IV(NimIV)、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される中和免疫原の部位に挿入することができる。抗原(例えば、インフルエンザウイルス抗原)は任意で、一つまたは両方の末端においてリンカー配列と隣接していてもよい。本発明のライノウイルスベクターは、生存型(live)であってもよく、または不活化されていてもよい。
【0010】
第二の局面において、本発明は、本明細書において記述されるライノウイルスベクターと、一つまたは複数の薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む薬学的組成物を提供する。任意で、そのような薬学的組成物にはさらに、アジュバント(例えば、アルミニウムまたはキチンに基づくアジュバント)および/または一つまたは複数のさらなる活性成分(例えば、M2e配列のような抗原配列と融合したB型肝炎コアタンパク質)が含まれうる。
【0011】
第三の局面において、本発明は、本明細書において記述される薬学的組成物を被験体に投与する段階を伴う、被験体(例えば、ヒト被験体)において抗原(例えば、インフルエンザウイルス抗原)に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。一つの例において、被験体はインフルエンザウイルス感染症のような感染症を有しないが、該感染症を発症するリスクを有する。もう一つの例において、被験体は、インフルエンザウイルス感染症のような、それに対してベクターが免疫を誘導する感染症を有する。様々な例において、薬学的組成物は被験体の鼻腔内に投与される。
【0012】
第四の局面において、本発明は、本明細書において記述されるライノウイルスベクターと、一つまたは複数の薬学的に許容される担体または希釈剤とを混合する段階を伴う、本明細書において記述される薬学的組成物を製造する方法を提供する。任意で、これらの方法は、アジュバントの付加、凍結乾燥材料の溶解、および/または他の活性成分との混合を伴いうる。
【0013】
第五の局面において、本発明は、本明細書において記述されるライノウイルスベクターのゲノムをコードするかまたは該ゲノムに対応する核酸分子を提供する。
【0014】
第六の局面において、本発明は、挿入されたインフルエンザウイルス抗原配列(例えば、M2e配列)のような、一つまたは複数の異種抗原配列を含むNimIIペプチドを提供する。
【0015】
第七の局面において、本発明は、インフルエンザウイルス抗原(例えば、インフルエンザウイルスM2e)のような抗原を含む、本明細書において記述されるライノウイルスベクターを、生成する方法を提供する。これらの方法には、以下の段階が含まれうる:(i)挿入された抗原配列(例えば、インフルエンザウイルス抗原配列)を含む感染性のcDNAクローンに基づいて、組換え型ライノウイルスベクターのライブラリーを生成する段階;および(ii)(a)挿入された配列を継代の際に維持する組換え型ウイルスであり、かつ(b)挿入された配列に対する抗体によって中和される組換え型ウイルスを、ライブラリーから選択する段階。これらの方法の一つの例において、ライノウイルスベクターは、ヒトライノウイルス14(HRV14)である。他の例において、挿入された抗原配列は、NimI、NimII、NimIII、およびNimIVからなる群より選択される位置で挿入されている。任意で、挿入された抗原配列は、本明細書において記述されるように、一つまたは両方の末端においてランダムリンカー配列と隣接していてもよい。
【0016】
第八の局面において、本発明は、挿入された抗原(例えば、インフルエンザウイルス抗原)配列を含むライノウイルスベクターを培養する方法を提供する。これらの方法は、HeLa細胞またはMRC-5細胞においてベクターを継代する段階を伴う。
【0017】
本発明は、いくつかの長所を提供する。例えば、M2eのような抗原を送達するために生存型ベクター系を用いることは、以下を含む長所を提供する:(i)ワクチンの1回投与もの少なさで、非常に強く長く持続する抗体応答を誘発できること、および(ii)サブユニットまたは死菌ワクチンと比較して、製造に関して高い規模拡大性があること(すなわち、より少ない費用でより多くの用量)。このように、汎流行の状況において、より多くの人々を、生ワクチンによって比較的短期間で免疫することができる。さらに、本発明のHRVベクターは、鼻腔内に送達することができ、それによって全身性の粘膜免疫応答が得られる。HRV14を用いることは、HRV14がヒト集団において非病原性であり、めったに観察されないことから、さらなる長所を提供し(Andries et al., J. Virol. 64:1117-1123, 1990;Lee et al., Virus Genes 9:177-181, 1995)、これはワクチンのレシピエントにおける既存の抗ベクター免疫の確率を低減させる。さらに、ヒトに感染するために必要なHRVの量は非常に少なく(一培養細胞感染量(TCID50)(Savolainen-Kopra, "Molecular Epidemiology of Human Rhinoviruses," Publications of the National Public Health Institute 2/2006, Helsinki, Finland, 2006))、これはHRVに基づくワクチン製造の費用対効果に関して好都合な特色である。
【0018】
本発明の他の特色および長所は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】HRV14のウイルス粒子(上のパネル)およびゲノム(下のパネル)の略図である。ヒトライノウイルス14(HRV14)カプシドは偽T=3(P=3)イソケドラル(isochedral)対称性を示し、ウイルスタンパク質VP1、VP2、VP3、およびVP4の60コピーと共にRNA-カプシド界面でのVP4からなる(Rossmann et al., Nature 317:145-153, 1985)。VP1〜3タンパク質は、細胞受容体の受容体結合部位、細胞内接着分子1(ICAM-1)(Colonno et al., J. Virol. 63:36-42, 1989)を含有する峡谷部を形成する。三つの主要な中和免疫原(Nim)部位であるNimI(AB)、NimII、およびNimIIIが、中和抗体の結合部位として峡谷部の周縁部の表面で同定された(Sherry et al., J. Virol. 57:246-257, 1986)。HRV14粒子の再構成は、NimI特異的mAb17と共にHRV14結晶構造に基づくキメラプログラムにおいて作製された(タンパク質データバンクデータベース#1RVF)。
【図2】以下の通りに記述される。(A)本試験において作製されたHRV14-M2e構築物。HRV14 cDNAクローンの誘導体、プラスミドpWR1を、M2e挿入変異体の構築のために用いた。(B)HRV14-NimII-XXX17AAおよびHRV14-NimII-XXX23AAウイルスライブラリーと共にpWR1に由来する野生型HRV14によって産生されるプラーク。構築物#1は、本文において考察されてさらなるデータ(図3および4)によって支持されるプラークを生じず、ランダムリンカー戦略がHRVにおける新規エピトープを工学操作する有効な手段であることを示している。
【図3】異なるHRV14-M2e構築物におけるM2e挿入断片の安定性を示す。挿入断片を含有する断片を、プライマー対、P1-up100Fw、VP1-dwn200Rv(緑色)、または14FAflII-1730Rv(赤色)によってRT-PCR増幅するとそれぞれ、「PCR B」(緑色)または「PCR A」(赤色)DNA断片が得られた。これらの断片をXhoIによって消化した。継代2、3、および4回目のHRV14-M2eキメラに関して、および継代4回目のHRV14-NimII-XXX17AAおよびHRV14-NimII-XXX17AAウイルスライブラリーに関するアガロースゲル電気泳動の結果を示す。切断された二つの断片(矢印で示す)は挿入断片含有ウイルスを表す。
【図4】HRV14の受容体結合ドメインによる、NimII部位におけるアミノ酸23個のM2e挿入断片の起こりうる立体干渉を示す。リンカーを有しない挿入断片は、NimIIから枝を出して、写真に示されるように峡谷部の反対側(すなわちNimI部位における)にほぼ達することができると考えられる。その障壁は、峡谷部への受容体の入り口を有効に遮断することができると考えられる。N末端リンカーは、挿入断片の位置を変化させることができ(矢印によって方向が示される)、峡谷部に対するアクセスを開く。HRV14-NimII-M2e(23AA)のVP1-VP4サブユニットに関するこの分子モデルは、Accelrys Discovery Studio(Accelrys Software, Inc)において作製された。これは、利用可能な構造データおよびモデリングソフトウェアにより本発明者らがHRV14に新規エピトープを工学操作することができることを図示する。
【図5】抗M2e Mab 14C2(Abeam, Inc; カタログ# ab5416)によるHRV14、HRV14-NimII-XXX23AAライブラリー、およびHRV14-NimII-XXX17AAライブラリーのプラーク減少中和試験(PRNT)の結果を示す。結果は双方のライブラリーの効率的な中和を証明するが、ベクターウイルス(HRV14)の中和を証明しない。双方のライブラリーの純度(WTの混入がない)も同様にこれらの結果から明白である。
【図6】曝露前の免疫マウスにおけるM2e特異的IgG抗体応答(プールした試料)を示す。エンドポイント力価(ET)を関連する群のタイトルの後に示す。対応する免疫時間を括弧内に示す(d0およびd21はそれぞれ、0日目および21日目を表す)。
【図7】曝露前の免疫マウスにおけるHRV14特異的IgG抗体応答(プールした試料)を示す。(A)HRV14-M2e(17AA)ウイルスの1、2、または3回投与によって免疫した群;(B)親HRV14ウイルスの1回または2回投与によって免疫した群。
【図8】免疫マウスの個々のM2e特異的IgG抗体応答を示す。
【図9】表4において記述されるように免疫したマウスにおけるM2e特異的抗体アイソタイプIgG1およびIgG2aを示す:(A)IgG1 ELISA(群毎にプールした試料);(B)IgG2a ELISA(群毎にプールした試料);(C)図9Aおよび9Bの力価;(D)群4(赤色;第一および第三の組のデータ)および群7(緑色;第二および第四の組のデータ)のマウスの個々の血清試料(希釈1:2,700)におけるM2e特異的IgG1(点)およびIgG2e(菱形)のレベル(表4を参照されたい)。
【図10】表4において記述されるように免疫したマウスにおけるIgG2aアイソタイプのM2e特異的抗体を示す。(A)M2eペプチドによるELISA(群毎にプールした試料);(B)M2e特異的ペプチドに対するELISAにおいて試験した群4(赤色;第一の組のデータ)および群7(緑色;第二の組のデータ)のマウスの個々の血清試料(希釈1:2,700)(表4を参照されたい)。
【図11】表4(上のパネル)において記述されるように免疫したマウスにおけるIgG2aアイソタイプのM2e特異的抗体を示す。
【図12】PR8インフルエンザA型株による曝露後28日目の全ての群の生存率を示す。
【図13】PR8インフルエンザA型株による曝露後28日目の全ての群の罹病率(図13A);群4(図13B)および群7(図13C)内の個々の体重を示す。
【図14】曝露前の免疫マウスにおけるM2e特異的IgG抗体応答(プールした試料)を示す(群に関しては表5を参照されたい)。
【図15】PR8インフルエンザA型株による非致死的曝露後17日間の全ての群の罹病率(体重の比率)を示す。
【図16】マウス抗HRV14-NimIVHRV6血清によるHRV14およびHRV6のプラーク減少中和試験(PRNT)の結果を示す。これらのデータは、HRV14カプシドのバックグラウンドにおいてNimIVHRV6が免疫優性であることの証明として役立ち、外来性エピトープを挿入するための新規部位を示唆している。
【図17】インフルエンザウイルスの致死的鼻腔内曝露に対するBalb/cマウスの防御を示す:A)曝露後の生存(%)、およびB)曝露後の体重減少。
【図18】HRV14のビリオンタンパク質における挿入部位の略図である。M2eを、NimI、NimII、NimIII、およびNimIVの表示の位置に導入することができる。XXXM2eは本明細書において記述されるM2eライブラリーを意味する。
【図19】本発明に従って作製された二つのキメラにおいて用いられるVP2のNimII内の挿入部位を示す、HRV14構造領域の略図である。これらのキメラ、HRV14-M2e(17AA)およびHRV14-M2e(23AA)のヌクレオチド配列も同様に提供される。
【発明を実施するための形態】
【0020】
詳細な説明
本発明は、万能のインフルエンザウイルス決定基の効率的な送達および提示のためのベクターとしてヒトライノウイルス(HRV)を用いることに基づく万能(汎流行)インフルエンザワクチンを提供する。以下にさらに記述されるように、インフルエンザマトリクスタンパク質2の細胞外ドメイン(M2e)は、本発明に記載の万能インフルエンザ(インフルエンザA型)ワクチンにおいて含まれうる「万能」エピトープである。このアプローチは、局所粘膜免疫を誘導するために鼻腔内投与することができる有効なインフルエンザ汎流行ワクチンを提供する。本発明に記載のワクチンの二つの例、すなわちHRV14-M2e(17AA)およびHRV14-M2e(23AA)を図19に図解する。この図にはこれらのウイルスのヌクレオチド配列が含まれる。これらは、万能インフルエンザワクチン候補体の例である。このような情報に基づいて、当業者は直ちに、これらの実施例において示されるM2e配列、または他のインフルエンザエピトープが含まれるワクチン候補体を構築することができる。ワクチン候補体はまた、以下に詳しく記述されるように他の非インフルエンザエピトープに基づいて構築することができる。本発明のベクター、ワクチン組成物、および方法を以下にさらに記述する。
【0021】
HRVベクター
本発明のベクターは、非病原性血清型ヒトライノウイルス14(HRV14)のようなヒトライノウイルスに基づく。HRV14ウイルス粒子およびゲノム構造を図1に図解する。この図はウイルス構造タンパク質(VP1、VP2、VP3、およびVP4)、非構造タンパク質(P2-A、P2-B、P-2C、P3-A、3B(VPg)、3C、および3D)、ならびにHRV14における主要な中和免疫原性(neutralizing immunogenic)部位(Nim:NimI、NimII、NimIII、およびNimIV)の位置を示す。
【0022】
本発明において用いることができるHRV14の分子クローンの例は、pWR3.26(American Type Culture Collection: ATCC(登録商標)番号:VRMC-7(商標))である。このクローンは、以下により詳細に記述されると共に、Lee et al., J. Virology 67(4):2110-2122, 1993(同様に配列付表3を参照されたい)によって記述されている。HRV14のさらなる起源も同様に本発明において用いることができる(例えば、ATCCアクセッション番号VR284;同様にGenBankアクセッション番号L05355およびK02121;Stanway et al., Nucleic Acids Res. 12(20):7859-7875, 1984;およびCallahan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82(3):732-736, 1985を参照されたい)。HRV14の他に、他のヒトライノウイルス血清型を本発明において用いることができる。当技術分野において公知であるように、100個より多いヒトライノウイルス血清型が存在し、そのいずれもHRV14と同じ方法で感染性クローンの誘導の際に本発明において用いることができる。本明細書ではHRV14に関して記述するが、本発明は、他のライノウイルス血清型にも同様に当てはまる。
【0023】
抗原配列を、本発明に従ってHRVベクターに、以下にさらに記述されるように異なる部位で挿入することができる。一つの例においては、配列をHRV14のような血清型のNimII部位に挿入する。NimII(中和免疫原II)は、VP1のアミノ酸210位ならびにVP2のアミノ酸156、158、159、161、および162位を含むHRV14における免疫優性領域である(Savolainen-Kopra, "Molecular Epidemiology of Human Rhinoviruses," Publications of the National Public Health Institute 2/2006, Helsinki, Finland, 2006)。以下に記述される具体的な例において、配列はVP2のアミノ酸158位と160位の間に挿入される。挿入はNimIIエピトープ内の他の部位でも同様に行うことができる。例えば挿入は、VP2の156、158、159、161、もしくは162位、またはVP1の210位、またはそれらの組み合わせの任意の位置で行うことができる。
【0024】
挿入を単独で、または他の部位(例えば、NimII部位)における挿入と組み合わせて行うことができるさらなる部位には、NimI(AおよびB)、NimIII、およびNimIVが含まれる。このように、挿入は、例えばVP1の91および/または95位(NimIA)、VP1の83、85、138、および/または139位(NimIB)、および/またはVP1の287位(NimIII)で行うことができる(例えば、図18を参照されたい)。NimIVは、VP1のカルボキシル末端領域、HRV14 VP1のアミノ酸274〜289位を表す以下の配列
を含む領域に存在する。この領域における任意のアミノ酸間の挿入が本発明に含まれる。このように、本発明には、例えばアミノ酸274と275位;275と276位;276と277位;277と278位;278と279位;279と280位;280と281位;281と282位;282と283位;283と284位;284と285位;285と286位;286と287位;287と288位;および288と289位の間の挿入が含まれる。これらの挿入の他に、本発明には、この領域における一つまたは複数(例えば、3、4、5、6、7、8、9、または10)個のアミノ酸が欠失している挿入が含まれる。このように、例えば本発明には、アミノ酸274と276位;275と277位;276と278位;277と279位;278と280位;279と281位;280と282位;281と283位;282と284位;283と285位;284と286位;285と287位;286と288位;287と289位;288と290位;および289と291位の間の挿入が含まれる。
【0025】
本発明のベクターは、標準的な分子生物学の方法を用いて作製される。この方法は、HRV14のNimIIにおける挿入を含むベクターの場合について以下に例示する。さらに、および以下に詳細に記述されるように、本発明のベクターは、生存ウイルスの形で投与することができ、または例えば当業者に公知の方法を用いて、投与前にホルマリン不活化もしくは紫外線処置によって不活化することができる。
【0026】
任意で、ベクターは、アミノおよび/またはカルボキシル末端において、挿入されたインフルエンザ配列とHRVベクター配列との間にリンカー配列を含んでいてもよい。これらのリンカー配列は、挿入された配列に対して可動性を提供し、それによって、挿入された配列は、免疫応答を誘導することができるように挿入エピトープを提示することができる。そのようなリンカー配列の例を以下に提供する。特定の挿入断片と共に用いられるリンカー配列の同定は、例えば、本明細書において記述されるように、本発明のライブラリースクリーニング法によって行うことができる。簡単に説明すると、本発明の方法において、有効なリンカー配列の同定に要求される領域においてランダム配列を有するライブラリーを構築する。ライブラリーから生成されたウイルスを、有効なリンカーを同定するために、生存率および挿入された配列の免疫原性に関して試験する。
【0027】
異種ペプチド
本発明のウイルスベクターは、予防的または治療的価値がある任意のペプチドまたはタンパク質を送達するために用いることができる。例えば、本発明のベクターは、HRVタンパク質に挿入される任意のタンパク質に基づく抗原に対する免疫応答(予防的または治療的)の誘導において用いることができる。
【0028】
本発明のベクターにはそれぞれ、一つのエピトープが含まれうる。または、多数のエピトープを、ベクターにおいて一つの部位に(例えば、アミノ酸のポリグリシンの枝のような可動性リンカーによって異なるエピトープを分離することができるポリトープ(polytope)のような)、異なる部位に(例えば異なるNim部位)、またはその任意の組み合わせで挿入することができる。異なるエピトープは、一つの病原体種に由来していてもよく、または異なる種および/または異なる属に由来していてもよい。ベクターには、多数のペプチド、例えば本明細書において記載されるペプチドの多数のコピー、または本明細書において記載されるペプチドなどのペプチドの組み合わせが含まれうる。一例として、ベクターには、ヒトおよびトリM2eペプチド(および/またはそのコンセンサス配列)が含まれうる。
【0029】
本発明において用いることができる抗原は、例えばウイルス、細菌、および寄生虫のような感染物質に由来しうる。そのような感染物質の具体的な例は、ヒトに感染するウイルス(例えば、A型、B型、およびC型株)およびトリインフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルスである。インフルエンザウイルスからの抗原の例には、M2、血球凝集素(HA;例えばH1〜H16のいずれか一つまたはそのサブユニット)(またはHAサブユニットHA1およびHA2)、ノイラミニダーゼ(NA;例えばN1〜N9のいずれか一つ)、M1、核タンパク質(NP)、およびBタンパク質に由来する抗原が含まれる。
【0030】
本発明のベクターに含めることができるさらなる配列は、インフルエンザウイルスM2e配列である。そのような配列の例は、本明細書を通して、および配列付表1において提供される。そのような配列の具体的な例には、以下が含まれる:
。本発明において用いることができるさらなるM2e配列には、インフルエンザB型のBM2タンパク質の細胞外ドメイン(コンセンサスMLEPFQ)およびH5N1トリインフルエンザからのM2eペプチド
からの配列が含まれる。
【0031】
本発明のベクターに含まれるペプチドには、先に記したように完全な配列、または所望の免疫応答を誘導することができるエピトープを含む断片が含まれうる。そのような断片には、例えば、これらのペプチド内からのアミノ酸2〜20個、3〜18個、4〜15個、5〜12個、または6〜10個の断片が含まれてもよい。さらに、さらなるアミノおよび/またはカルボキシル末端アミノ酸配列がそのようなペプチドに含まれうる。このように、ペプチドには、天然に存在する、隣接配列である、または人工的リンカー配列であるか否かによらず、例えばそのようなアミノ酸1〜10個、2〜9個、3〜8個、4〜7個、または5〜6個が含まれうる(以下も同様に参照されたい)。上記の配列のそのような可能性があるペプチド断片は全て、本発明に含まれる。
【0032】
インフルエンザにおいて保存されているペプチドの他の例を本発明において用いることができ、これらには、インフルエンザB型において保存されているNBeペプチド
が含まれる。本発明において用いることができるインフルエンザペプチドならびにそのようなペプチドを誘導することができる(例えば、断片化によって)タンパク質のさらなる例は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2002/0165176号、米国特許出願公開第2003/0175290号、米国特許出願公開第2004/0055024号、米国特許出願公開第2004/0116664号、米国特許出願公開第2004/0219170号、米国特許出願公開第2004/0223976号、米国特許出願公開第2005/0042229号、米国特許出願公開2005/0003349号、米国特許出願公開第2005/0009008号、米国特許出願公開第2005/0186621号、米国特許第4,752,473号、米国特許第5,374,717号、米国特許第6,169,175号、米国特許第6,720,409号、米国特許第6,750,325号、米国特許第6,872,395号、WO 93/15763、WO 94/06468、WO 94/17826、WO 96/10631、WO 99/07839、WO 99/58658、WO 02/14478、WO 2003/102165、WO 2004/053091、WO 2005/055957、ならびに添付の配列付表1および2(およびその中に引用される参考文献)において記述されている。さらに、インフルエンザの保存された免疫原性/防御TおよびB細胞エピトープは、多くの有望な交叉防御エピトープが最近同定されているwww.immuneepitope.orgデータベースから選ぶことができる(Bui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 104:246-251, 2007、および補助表)。本発明は、オンラインIEDB源からの任意のペプチド、例えばBui et al., 上記において記述された保存されたBおよびT細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスエピトープを使用することができる。
【0033】
寄生虫(例えば、マラリア)、他の病原性ウイルス(例えば、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV;例えばgag)、およびC型肝炎ウイルス(HCV))、および細菌(例えば、ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、およびヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori))のような、他のヒト病原体/獣医学的病原体からの防御エピトープもまた、本発明のベクターに含めることができる。これらおよび他の病原体の様々な適切なエピトープが文献において容易に見いだされうる。例えば、異なるHPV遺伝子型から防御する広範交叉中和抗体を誘導する乳頭腫ウイルスL2タンパク質からの交叉防御エピトープ/ペプチドが、例えばHPV16ウイルスのL2タンパク質のアミノ酸1〜88位、アミノ酸1〜200位、またはアミノ酸17〜36位のように、Schillerおよび共同研究者によって同定されている
。本発明において用いることができるさらなる病原体ならびにこれらの病原体からの抗原およびエピトープの例は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、WO 2004/053091、WO 03/102165、WO 02/14478、および米国特許出願公開第2003/0185854号において提供される。
【0034】
抗原を得ることができる病原体のさらなる例を、以下の表1に記載する。そのような抗原の具体的な例には、表2において記載される抗原が含まれる。さらに、本発明のベクターに挿入することができるエピトープの具体的な例を表3に提供する。表3において認められるように、本発明のベクターにおいて用いられるエピトープは、B細胞エピトープ(すなわち、中和エピトープ)、またはT細胞エピトープ(すなわち、Tヘルパーおよび細胞障害性T細胞特異的エピトープ)でありうる。
【0035】
本発明のベクターは、病原体由来抗原の他に抗原を送達するために用いることができる。例えば、ベクターは、癌に対する免疫療法の方法において用いるための腫瘍関連抗原を送達するために用いることができる。多数の腫瘍関連抗原が当技術分野において公知であり、本発明に従って投与することができる。癌(および対応する腫瘍関連抗原)の例は以下の通りである:黒色腫(NY-ESO-1タンパク質(具体的に、アミノ酸157〜165位に存在するCTLエピトープ)、CAMEL、MART 1、gp100、チロシン関連タンパク質TRP1および2、ならびにMUC1);腺癌(ErbB2タンパク質);結腸直腸癌(17-1A、791Tgp72、および癌胎児抗原);前立腺癌(PSA1およびPSA3)。熱ショックタンパク質(hsp110)も同様にそのような抗原として用いることができる。
【0036】
本発明のもう一つの例においては、それに対する免疫応答が望まれるアレルギー誘発抗原のエピトープをコードする外因性のタンパク質を用いることができる。さらに、本発明のベクターには、ベクターを投与する被験体における特定の細胞(例えば、リガンドに対する受容体が含まれる細胞)に対して抗原のようなペプチドを送達するように、ベクターを標的とするのに用いられるリガンドが含まれうる。
【0037】
本発明のベクターに挿入されるペプチドまたはタンパク質の大きさは、当業者によって適切であると決定されうるように、例えば長さがアミノ酸3〜1000個、例えば長さがアミノ酸5〜500個、10〜100個、20〜55個、25〜45個、または35〜40個の範囲でありうる。このように、長さがアミノ酸10〜25個、12〜22個、および15〜20個の範囲のペプチドを本発明において用いることができる。さらに、本発明において記載されたペプチドには、当業者によって適切であると決定されうるように、さらなる配列を含めることができ、または長さを縮小させることができる。本明細書において記載したペプチドは、本明細書において示される本発明のベクター中に存在していてもよく、または一つもしくは複数のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれより多いアミノ酸)の置換もしくは欠失によって改変されていてもよい。さらに、ペプチドは、より大きいペプチドの状況でベクターに存在することができる。任意で、上記および本明細書において他所で記述したようなペプチドには、上記のようにアミノおよび/またはカルボキシル末端でさらなる配列が含まれ、そのような配列はペプチド配列(すなわち、ペプチドがインフルエンザウイルス(または他の起源)のゲノムにおいて隣接している配列)に本来会合していてもよく、または(例えば、合成リンカー配列)会合していなくてもよい。このように、ペプチドには、一つまたは両方の末端において、例えばアミノ酸1〜25個、2〜20個、3〜15個、4〜10個、または4〜8個の配列が含まれうる。具体的な例として、ペプチドには、アミノおよび/またはカルボキシル末端で1〜3個のリンカー配列が含まれてもよい。
【0038】
投与
免疫法において用いる場合、本発明のベクターは、インフルエンザウイルスのような特定の病原体による感染症のリスクを有する成人または小児における一次予防物質として投与することができる。ベクターはまた、そのペプチド抗原が由来する病原体に対する免疫応答を刺激することによって、感染患者を処置するための二次物質として用いることができる。癌に対する免疫処置の状況においては、癌を発症するリスクを有する被験体または癌を既に有する被験体に対してワクチンを投与することができる。
【0039】
ワクチン応用に関して、任意で、当業者に公知であるアジュバントを用いることができる。アジュバントは、投与経路に基づいて選択される。鼻腔内投与の場合、キチン微粒子(CMP)を用いることができる(Asahi-Ozaki et al., Microbes and Infection 8:2706-2714, 2006;Ozdemir et al., Clinical and Experimental Allergy 36:960-968, 2006;Strong et al., Clinical and Experimental Allergy 32: 1794-1800, 2002)。粘膜経路(例えば、鼻腔内または経口経路)による投与において用いるために適した他のアジュバントには、大腸菌(E. coli)の熱不安定毒素(LT)、またはその変異誘導体が含まれる。不活化ウイルスの場合、例えばアルミニウム化合物(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、またはヒドロキシリン酸アルミニウム化合物)、リポソーム製剤、(例えばQS21)、ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドA、もしくはポリホスファジンのような合成アジュバントを含む非経口アジュバントを用いることができる。
【0040】
さらに、アジュバント活性を有するサイトカインをコードする遺伝子を本発明のベクターに挿入することができる。GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13、またはIL-5のようなサイトカインをコードする遺伝子を外来性抗原遺伝子と共に挿入して、それによって免疫応答の増強が得られるワクチンを産生する、または細胞、液性、もしくは粘膜応答に特異的に向けられる免疫を調節することができる。または、サイトカインは、周知の手段によって(例えば、直接接種、裸のDNA、ウイルスベクターにおいて等)、組換え型ワクチンウイルスと同時に、連続的に、または個々に送達することができる。
【0041】
本発明のウイルスは、他のワクチン接種アプローチと併用して用いることができる。例えば、ウイルスを、同じまたは異なる抗原を含むサブユニットワクチンと併用して投与することができる。本発明の併用法には、他の型の抗原(例えば、サブユニット形態、あるいは肝炎コアタンパク質(例えば、大腸菌において産生される表面上にM2eペプチドを含有するB型肝炎コア粒子(HBc-M2e;Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004;WO 2005/055957;米国特許出願公開第2003/0138769号A1;米国特許出願公開第2004/0146524号A1;米国特許出願公開第2007/0036826号A1))または不活化されたウイルス全体もしくは部分的ウイルスを含む送達媒体)と共に本発明のウイルスを同時投与することが含まれうる。または、本発明のベクターは、本発明のベクターまたは他のアプローチのいずれかを初回免疫として用いた後、他のアプローチを追加免疫として用いる、またはその逆である初回免疫-追加免疫戦略において、他のアプローチ(サブユニットまたはHBcアプローチのような)と併用して用いることができる。さらに、本発明には、初回免疫剤および追加免疫剤の両方として本発明のベクターを使用する初回免疫-追加免疫戦略が含まれる。このように、そのような方法は、本発明に記載のベクターの初回投与の後に、初回投与後1週間または数週間、数ヶ月、または数年の間に行うことができる1回または複数回(例えば、1、2、3、もしくは4回)の追加投与を伴いうる。
【0042】
本発明のベクターは、標準的な方法を用いて哺乳動物(例えば、ヒト被験体)のような被験体に投与することができる。鼻腔内投与の場合、ベクターは、点鼻液の剤形で、またはエアロゾル化もしくは霧状化製剤の吸入によって投与することができる。ウイルスは、凍結乾燥形態であってもよく、または生理食塩液もしくは水のような生理的に適合性の溶液もしくは緩衝液に溶解されていてもよい。標準的な調製および製剤化法は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PAにおいて記述されるように用いることができる。さらに、適切な投与量およびレジメンの決定は当業者によって容易に決定されうる。
【0043】
本発明のベクターは、生または死菌ワクチンとして、ヒトのような被験体に投与することができる。生ワクチンは当業者に公知の方法を用いて鼻腔内投与することができる(例えば、Grunberg et al., Am. J. Respir. Crit. Car. Med. 156:609-616, 1997を参照されたい)。適切な投与量およびレジメンは、当業者によって容易に決定されうる。一例として、用量範囲は例えば、103〜108 pfu/投与でありうる。ワクチンは、例えば1回投与で都合よく投与することができるが、当業者によって必要であると決定されれば、追加免疫も同様に行うことができる。不活化ワクチンに関して、ウイルスを、例えばホルマリンまたはUV処置によって死滅させることができ、任意で適切なアジュバント(例えば、キチンまたは変異LT;上記を参照されたい)と共に約108 pfu/投与で鼻腔内投与することができる。そのようなアプローチにおいて、1回より多い(例えば、2〜3回)投与を行うことが有利である可能性がある。
【0044】
本発明は、部分的に以下の実験実施例に基づく。
【0045】
実験実施例
I.HRV14-NimII-M2eキメラの構築
本発明者らは、HRV14-NimII-M2e組換え型ウイルスを構築した。ウイルスは、抗M2e Mabが組換え型ウイルスの感染性を中和できることによって証明されるように、ビリオン表面上でM2eを発現することが示されている。
【0046】
三つのタイプのHRV14-M2e構築物を作製した(図2)。
1.VP2のアミノ酸159位と160位の間(NimII部位)に挿入されたM2eのアミノ酸23個を有するHRV14-NimII-23AA。
2.HRV14-NimII-XXX23AAライブラリー。この組の構築物(プラスミドライブラリー)は、ペプチドと融合したアミノ酸3個のランダム化N末端リンカーが存在することを除き、第一の構築物と類似であった。このランダム化リンカーは、リンカーアミノ酸をコードするランダム化ヌクレオチド9個を含有する5'(直接)プライマーを用いてM2e配列によって生成された。
3.HRV14-NimII-XXX17AAライブラリー。このライブラリーは、最初と同じ方法で生成されたが、M2eの最初のアミノ酸17個のみを含有する短くなったM2eペプチドを含有した。
【0047】
HRV14感染性クローンへのクローニングプロセスを容易にするために、本発明者らは、そのpUCプラスミド骨格をpEtベクター(Novagen)と置換することによってpWR3.26感染性クローンを改変した。得られたプラスミドpWR1(図2)は、大腸菌においてより安定に維持され、操作がより容易である。ウイルスライブラリー#2および#3のプラーク形態は、HRV14の親とは異なった(図2B)。ライブラリーのプラークサイズは、野生型と類似であるように見えたが、プラークは不透明であった。構築物#1はトランスフェクション時にプラークを形成しなかった。
【0048】
構築されたウイルスの遺伝的安定性をモニターするために、本発明者らは、サイレント変異誘発によってM2e配列の中央部でXhoI切断部位を組み入れた。変異M2e遺伝子を含有するウイルスから得られたRT-PCR断片は、XhoIによって切断されるが、野生型HRV14において産生された対応するDNA産物は消化されないままである(図3)。HRV14-NimII-23AAキメラ構築物(#1)によって、生存しているがむしろ不安定なウイルスが得られた。図3において示されるように、「PCR A」断片の二つのXhoI消化産物は、2回目の継代後で検出可能であるが、その後の継代では検出されない。対照的に、ライブラリー(#2)および(#3)は、M2e挿入断片を安定に維持した:H1 HeLa細胞において4回目の継代時のウイルスライブラリーから得られた断片「PCR B」は、XhoIによって完全に消化された(図3)。構築物#1の不安定性は、受容体結合ドメインによる、挿入されたペプチドの立体干渉による可能性があるが(図4)、これは、構築物#2および#3の場合と同様に、縮重リンカーを提供すると緩和される可能性がある。ランダム化N末端リンカーは、その受容体に対する有効なウイルス結合を可能にする受容体結合ドメインを含有する峡谷部からペプチドを再指向させる(redirect)可能性がある(図4)。
【0049】
本発明者らは、抗M2e Mab(14C2 MAb, Abeam, Inc. カタログ# ab5416)によるウイルスライブラリーの中和試験を行った。ウイルスの中和はまた、ライブラリーの純度(すなわち、野生型HRV14が存在しないこと)を証明するためのツールとして用いることができる。プラーク減少中和試験(PRNT)の結果は、双方のライブラリーに対するMab 14C2の極めて高い特異性および中和能を証明した(図5)。
【0050】
両ライブラリーとも抗M2e Mabによる中和に対して極めて感受性が高いことが示されたが(図5)、対照ウイルス(pWR1)はMabの最低希釈1:10であっても中和されなかった。双方のライブラリーに関する50%中和は、抗体の〜1:2,000,000希釈(14C2の保存液の濃度は1 mg/ml)で観察された。組換え型ウイルスがそのように有効に中和されたことにより、HRV14のNimIIにおいて提示されるM2eペプチドが、抗体によって容易に認識可能な適切な立体構造に存在することが示された。
【0051】
II.安定なHRV14-NimII-M2e組換え体の同定
H1 HeLa細胞において4回継代後、それぞれのライブラリーからの個々のクローン6個をプラーク精製して、さらに4回の継代後、保有された挿入断片のシークエンシングによって特徴付けした。それぞれのライブラリーは、一つの優性で安定に複製するウイルスクローンを生じた。HRV14-NimII-XXX23AAライブラリーから単離されたウイルスは全て、GHTをN末端リンカーとして同じ挿入断片配列GHTSLLKEVETPIRNEWGSRSNDSSDを有したが、HRV14-NimII-XXX17AAライブラリーからのウイルスは全て、QPAをN末端リンカーとして同じ配列QPASLLTEVETPIRNEWGSRを示した。アミノ酸23個の挿入断片を保有する生存クローンは全て、アミノ酸7位(M2e外来性挿入断片における4位)でチロシンからリジンへの置換を有した。アミノ酸17個の挿入断片を保有するクローンは全て、野生型M2e配列を含有した。これらの結果は、遺伝的に安定な組換え型HRV-M2eウイルスが単離されうることを示している。さらなるインビボ試験において、HRV14-M2e(17AA)がインフルエンザA型のPR8株に対する防御を提供できるか否かを、腹腔内投与経路を用いて評価した。
【0052】
III.HRV14-NimII-M2e組換え体によるインビボ試験
A.インビボ実験#1:腹腔内免疫
1.実験設計
9週齢の雌性Balb/cマウス(マウス8匹/群)を0日目に初回免疫した後、21日目に、容量500μLにおいてアジュバント(水酸化アルミニウム)100μgと混合した蔗糖精製HRV-M2e(17AA;表4の脚注(4)を参照されたい)ウイルスを、HRV14-M2e(17AA)の5.0×106 pfu、親HRV14の1.3×107 pfu、または陰性対照としての偽(PBS)のいずれかによって腹腔内投与することによって追加免疫した。ゴールドスタンダードとして、現在のワクチン候補ACAM-FluA(M2e 3コピーを保有する組換え型B型肝炎コア粒子)を用いた。後者は単独、または初回免疫/追加免疫のためにHRV14-M2eまたはHRV14と併用して用いた(表4)。防御を証明するために、マウスを全て35日目にインフルエンザA/PR/8/34(H1N1)ウイルスのLD50の4倍量の曝露に供した。罹病率および死亡率を21日間モニターした。保有されるペプチドに対する血清抗体に関して試験するために、マウスを接種前に採血して(ベースライン)、再度33日目に採血した。血清中のM2e特異的抗体力価を、合成M2eペプチドによってコーティングしたマイクロタイタープレートにおいて行った確立されたELISAによって決定した。M2e特異的総IgG、Ig2a、およびIg2bの力価を決定した。
【0053】
2.結果
a.免疫原性
i.免疫した動物における総IgG
M2e特異的抗体力価を、プールした血清試料(図6)と共に個々の動物試料(図7)を用いて、それぞれの群に関して測定した。プールした試料による結果(図6)は、アミノ酸17個のM2eを保有する組換え型HRV14による初回免疫およびACAM-FluAによる追加免疫が、B型肝炎ウイルスコアM2e組換え型ウイルス様粒子(10μg/投与)の2回投与と同レベルの抗体を誘発することを示した(エンドポイント力価(ET)=218,700)。ACAM-FluAによる追加免疫は、HRV14ベクター(群6;ET=2,700)と比較してHRV14-M2e(17AA)(群4;ET=218,700)によって初回免疫した場合に、約100倍高いM2e特異的応答を誘発した。このように、HRV14-M2eの初回免疫効果は、M2e挿入断片のみに依存してベクターには依存しない。
【0054】
Arnold et al., 2006(Arnold, G. F. and Arnold, E. Chimeric Virus Vaccine. 11/176,182[米国特許出願公開第2006/0088549号A1], 1-57. 4-27-2006. US. 7-7-2005)によってなされた仮定に基づくと、HRV14の109 pfuという免疫量は、タンパク質およそ10μgに対応する。本発明者らは、組換え型HRV-M2eウイルスの一つの免疫量がタンパク質10 ngを表すとほぼ推定した。分子量の差および組換え型B型肝炎コア粒子におけるサブユニットの多重度を考慮に入れて、本発明者らは、HBc-M2eの一つの免疫量が、HRV-M2eよりM2eタンパク質をおよそ10,000倍多く含有すると推測する。HRVベクターを用いて同等の抗体レベルが得られたことはおそらく、より安価な産生方法論を用いてより免疫原性の高い提示システムであることを支持する。
【0055】
M2e抗体レベルは、HRV14-M2e(17AA)の投与回数に反比例した。実際にHRV14-M2e(17AA)ウイルス(群1)の3回投与は、最低のM2e特異的応答を誘発したのに対し(ET=2.700)、2回投与レジメンは、10倍高い応答を誘発し(群2;ET=24,300)、1回投与は2回投与より3倍高い応答を誘発した(群5;ET=72,900)。この相関が抗ベクター免疫によるものか否かを確認するために、本発明者らはHRV14ベクターに対する全ての群の免疫応答を個々に試験した(図7)。HRV14-M2e(17AA)の三つのタイプの投与(1、2、または3回投与)は全て、同等のレベルのHRV14特異的応答(ET=72,900)を示した(図7A)。これは、M2eに対する免疫応答が減少した理由としての抗ベクター免疫に反対し、1回量の投与で十分であることを示唆している。
【0056】
個々の血清試料のM2e特異的ELISA(図8)は、プールした試料について示された同じ群間の差を検出した:群4および群7の個々のマウスにおける平均抗体レベルは、二つの血清希釈液(1:300および1:2,700)で示されたように、調べた他の任意の群より有意に高かった。
【0057】
ii.免疫動物における抗体のIgG2a、IgG2b、およびIgG1サブタイプ
M2eワクチン接種動物における優勢なM2特異的Abアイソタイプは、いくらかのIgG2aを伴うIgG2bであることが示された(Jegerlehner et al., J. Immunol. 172.9:5598-5605, 2004)。これらの二つのアイソタイプは、マウスにおける抗体依存的細胞障害性(ADCC)の最も重要なメディエータであることが示されており(Denkers et al., J. Immunol. 135:2183, 1985)、これはM2e依存的防御に関する主要なメカニズムであると考えられている。本研究において、本発明者らは、IgG1、IgG2a、およびIgG2bアイソタイプ力価に関して、プールした群および個々の血清試料を試験した。
【0058】
群4(HRV14-M2e(17AA)による初回免疫/ACAM-FluAによる追加免疫)および群7(ACAM-FluAによる初回免疫/追加免疫)は、他の群の中でもIgG1およびIgG2a抗体の最高力価を証明した(図9)。IgG1力価は群4より群7において有意に高かったが(図9Aおよび9D)、IgG2a力価は群4において高く(図9Bおよび9D)、一方、群7の動物のIgG2b力価は群4より高かった(図10)。免疫したマウスにおけるIgG2aアイソタイプのM2e特異的抗体を図11に示す。
【0059】
b.罹病率および死亡率
RP8株の曝露後28日間、マウスを罹病率および死亡率に関してモニターした。図12において示されるように、群4は、調べた他の全ての群と比較して最高の生存率(80%)を証明したが、群7は陰性対照(PBS)と有意差を示さなかった。群4はまた、罹病率に関しても優れていた;体重変化は他の全ての群ほど有意に劇的ではなかった(図13A、B)。
【0060】
このように、HRV14-M2e(17AA)ウイルスは、マウスにおいて非常に免疫原性で防御的である。これは、従来の組換え型タンパク質レジメンと、初回免疫-追加免疫レジメンにおける二つの組み合わせに対する応答に匹敵する。後者は、組換え型タンパク質単独とは有意に異なる免疫応答を証明した:M2eを保有する組換え型HBc(Acam-FluA)の2回投与は、優勢なIgG1抗体サブタイプを誘発したが、HRV14-M2e(17AA)による初回免疫およびAcam-FluAによる追加免疫は、優勢なサブタイプとしてIgG2aを生成し、これはADCCにとって重要であることが示された。その上、後者の群は、他の全ての群に対して最高の防御を証明した。
【0061】
HRVはマウスにおいて複製しないことから、このモデルにおけるHRV-M2e組換え体の接種は、適した非経口アジュバントと共に行われ、不活化ワクチンによる免疫を模倣することに注目することは重要である。本発明者らは、ヒトにおいて最終的に二つの選択肢を評価することを提唱する:水酸化アルミニウムのような認可が得られた非経口アジュバントと共に同時投与される、生の組換え型HRV14-M2eウイルスワクチンおよび/または不活化ワクチン(例えば、ホルマリン不活化)。
【0062】
B.インビボ実験#2:鼻腔内免疫
1.免疫処置のために用いたウイルス
このインビボ試験において、インフルエンザA型のPR8株による非致死的曝露に対する防御をHRV14-M2e(17AA)が提供できるか否かを、鼻腔内投与経路を用いて評価した。注意:HRV14-M2e(17AA)配列は先に記述された通りであった。
【0063】
2.実験設計
9週齢の雌性Balb/cマウス(マウス8匹/群)を0日目に初回免疫した後、21日目に、容量50μLにおいて大腸菌の熱不安定毒素(LT)5μgと混合した、蔗糖精製HRV14-M2e(17AA)またはHRV14(表5の脚注(3)を参照されたい)ウイルスのいずれかを108 pfu/投与(群3〜6)の鼻腔内投与によって追加免疫した。ゴールドスタンダードとして、M2e 3コピーを保有する組換え型B型肝炎コア粒子(AcamFluA)を含むワクチンを用いた。後者は、単独で、または初回免疫/追加免疫のためにHRV14-M2eまたはHRV14と併用して用いた(表5)。防御を証明するために、35日目に、全てのマウスを、インフルエンザA/PR/8/34(H1N1)ウイルスのLD50の4倍量の曝露に供した。罹病率および死亡率を21日間モニターした。保有されるペプチドに対する血清抗体を調べるために、マウスを接種前に(ベースライン)採血して、33日目に再度採血した。血清中のM2e特異的抗体力価を、合成M2eをコーティングしたマイクロタイタープレートにおいて行う確立されたELISAによって決定した。M2e特異的総IgG、IgG2a、およびIgG2bの力価を決定した。
【0064】
3.結果
a.免疫原性
i.M2e特異的抗体力価
抗体力価を、プールした血清試料を用いてそれぞれの群に関して測定した(図14)。アミノ酸17個のM2eを保有する組換え型HRV14の1回投与およびACAM-FluAによる追加免疫は、B型肝炎ウイルスコア-M2e組換え型ウイルス様粒子(10μg/投与)の2回投与と同等の総IgGレベルを誘発した(エンドポイント力価(ET)>218,700;図14A)。後者の結果は、IP免疫経路について得られたデータと一貫する。HRV14-M2eの1回投与は、AcamFluAの1回投与と同等レベルの総M2e特異的総IgGを誘発した(ET=24,300)。HRV14-M2eウイルス負荷の2分の1への減少は、総IgGレベルに対してあまり影響を及ぼさなかった(群7;ET=24,300)。
【0065】
IP投与の場合と同様に、HRV14-M2eによる初回免疫およびAcamFluAによる追加免疫は、最高レベルのIgG2aを生成した(図14C;ET>>218,700)。HRV14-M2eの1回投与は、AcamFluAの1回投与よりわずかに高いレベルのIgG2aを誘発した(ET=72,900対ET=24,300)。IgG2b(図14B)およびIgG1(図14D)の最高力価は、AcamFluAの2回投与に関して証明された。
【0066】
b.罹病率
マウスを、PR8株による非致死的曝露後17日間罹病率に関してモニターした(図15)。HRV14-M2eの1回投与は、AcamFluAの2回投与、またはHRV14-M2eによる初回免疫およびAcamFluAによる追加免疫と同等の疾患からの防御を提供した。群2のマウス(AcamFluAの1回投与)は、疾患の有意な徴候を示した。対照群(群4)は、曝露後最初の9日間の間に重度の体重減少を証明した。
【0067】
IV.HRV14ウイルスにおける新規優性中和免疫原(NimIV)、新しく発見された外来性エピトープの挿入部位
本発明者らは、新規HRV中和免疫原:中和免疫原IV(Neutralizing Immunogen IV;NimIV)を同定した。これは、エピトープ挿入組換え型ワクチンの開発のために用いることができる。NimIVは非常に免疫原性が高く、マウスにおいて高いウイルス中和力価を誘発する。HRVのNimIVは、構造タンパク質VP1のC末端領域を伴う。このエピトープは、異なるHRV血清型の間で交換することができる。一つのHRVのNimIVがもう一つの血清型ウイルスに導入される場合、これは得られたキメラ組換え体にドナー血清型の中和特徴を付与する。合成NimIVペプチドはELISAおよびウェスタンブロット実験において対応する血清型特異的抗体によって効率よく認識されることが示された。具体的に、HRV14-NimIVHRV6キメラは、HRV14におけるNimIVHRV14をHRV6ウイルスからのNimIVに置換することによって産生された。このウイルスは、抗HRV6ポリクローナル抗体によって効率よく中和され、同様にマウスにおいて抗HRV6中和反応を誘発した。HRV14-NimIVHRV6によって免疫したマウスからの血清の50%中和力価は、HRV6ウイルスに対して〜1:800であり、HRV14に対してはわずか1:400に過ぎなかった(図16)。比較のために、相同なウイルスに対するマウス抗HRV14血清の50%中和力価は1:1400であり、HRV6特異的NimIVが、残りのHRV14 Nim(I、II、およびIII)に対する抗体によるウイルス中和の有効性を有意に低減させたことを示している。
【0068】
V.インフルエンザマウス曝露モデル
ワクチン候補体の防御有効性を、適切なウイルス株を用いてマウスインフルエンザ曝露モデルにおいて試験することができる。本発明者らの試験において用いたプロトタイプインフルエンザ曝露株は、マウス適合株A/PR/8/34(H1N1)である。ウイルスを、American Type Culture Collection(カタログ番号VR-1469、ロット番号2013488)から得て、Balb/cマウスにおいて連続継代することによってインビボ成長に適合させた。マウスでの継代に関して、ウイルスを鼻腔内に接種して肺組織ホモジネートを3日後に調製した。ホモジネートをさらなるマウスにおいて継代5を通して盲継代(blind-passaged)した。さらなる継代を用いて、曝露保存液として役立つ肺ホモジネートのアリコートを調製した。
【0069】
マウスの曝露に関して、ウイルスを50μLの用量で鼻腔内に送達する。嘔吐反射を阻害するためにマウスを接種の際に麻酔して、ウイルスを肺内に通過させる。ウイルスの致死量に感染させたマウスは急速に体重が減少して、ほとんどが接種後7〜9日目に死亡する。マウス適合A/PR/8/34ウイルスの致死量(LD50)の中央値は、生体Balb/cマウスにおいて7.5プラーク形成単位(pfu)であると決定された。典型的な防御実験の結果を図17に示す。マウス10匹の群を水酸化アルミニウムによって偽免疫するか、または水酸化アルミニウムと混合したインフルエンザM2eペプチド免疫原10μgによって免疫した。免疫原は、M2eペプチドを発現するB型肝炎コアタンパク質ウイルス様粒子からなった。マウスを3週間間隔で2回免疫して、マウス適合A/PR/8/34ウイルスのLD50の4倍量を4週間後に鼻腔内に曝露した。偽免疫群のマウスは全て曝露後10日までに死亡したが、免疫群ではマウス1匹が死亡したに過ぎなかった。曝露後の体重減少は両群において起こったが、偽免疫群ではより大きかった。
【0070】
他のインフルエンザウイルス株も同様に、マウスの肺での生育に適合すると考えられる。いくつかの場合において、インビボ適合を行わずに株を用いてもよく、または肺での連続継代後であっても株が十分に病原性とならない可能性がある。この場合、罹病率および死亡率を測定するよりむしろ、本発明者らは、肺および鼻甲介組織におけるウイルス複製を測定する。組織を曝露後3日目に採取して、組織培養培地1 ml中で超音波によって破壊し、プラークアッセイまたはTCID50アッセイによってウイルス濃度に関して力価測定する。
【0071】
(表1)エピトープ/抗原/ペプチドが由来しうる病原体の例の一覧
【0072】
(表2)列挙したウイルスに由来する選択抗原の例
【0073】
(表3)列挙したウイルス/抗原に由来するBおよびT細胞エピトープの例
【0074】
(表4)免疫群(腹腔内試験)
表4の脚注:
(1)ACAM-FluAは、アミノ酸23個のM2eペプチド3コピーを保有するB型肝炎コア抗原(HBc)に基づく現在の万能インフルエンザA型ワクチン候補体である;ゴールドスタンダードとして用いられる;用量=10μg/マウス。
(2)HBcAgは、「裸の」HBc抗原である;ACAM-FluAの担体対照として用いられる;用量=10μg/マウス。
(3)HRV14は、pWR3.26感染性クローン(ATCC)から産生された「野生型」HRV14である;HRV14-M2e(17AA)の担体対照として用いられる。
(4)HRV14M2e(17AA)は、VP2のアミノ酸159位とアミノ酸160位の間(NimII部位)にQPASLLTEVETPIRNEWGSRを保有するHRV14ウイルスである。この挿入断片の最初のアミノ酸3個(QPA)は、先に記述したようにHRV14M2eXXX(17AA)ライブラリーから選択された独自のリンカーを表す。
(5)ADJ=アジュバント(アラムを全ての免疫処置において用いた)。
(6)全ての群を腹腔内投与によって免疫した。
【0075】
(表5)免疫群(鼻腔内試験)
表5の脚注:
(1)ACAM-FluAは、アミノ酸23個のM2eペプチド3コピーを保有するB型肝炎コア抗原(HBc)に基づくインフルエンザA型ワクチンである;ゴールドスタンダードとして用いられる;用量=10μg/マウス。
(2)HRV14は、pWR3.26感染性クローン(ATCC)から産生された「野生型」HRV14である;HRV14-M2e(17AA)の担体対照として用いられる。
(3)HRV14M2e(17AA)は、VP2のアミノ酸159位とアミノ酸160位の間(NimII部位)にQPASLLTEVETPIRNEWGSRを保有するHRV14ウイルスである。この挿入断片の最初のアミノ酸3個(QPA)は、先に記述したようにHRV14M2eXXX(17AA)ライブラリーから選択された独自のリンカーを表す。
(5)ADJ=アジュバント(LT=大腸菌の熱不安定毒素)。
(6)全ての群を鼻孔内投与によって免疫した。
(7)群3、4、5および6は、対応するウイルスの108 pfu/投与によって免疫した。
【0076】
他の態様
本明細書において引用された全ての出版物および特許は、それぞれの個々の出版物または特許が具体的におよび個々に参照により本明細書に組み入れられることが示されるように、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書における「一つ(a)」および「その(the)」のような単数形の使用は、本文が逆を示している場合を除き、対応する複数形を示すことを除外していない。本発明は、理解を明快にする目的で図示および実施例によっていくぶん詳細に記述してきたが、一定の変化および改変をそれらに行ってもよく、それらも添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲に含まれることは、本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかになると考えられる。
【0077】
他の態様は添付の特許請求の範囲に含まれる。
【0078】
ヒトインフルエンザA型株のM2タンパク質の細胞外部分
【0079】
配列付表2
インフルエンザT細胞エピトープ
(表1)核タンパク質のインフルエンザA型ウイルスCTLエピトープ
【0080】
(表2)核タンパク質のインフルエンザA型ウイルスTヘルパーエピトープ
【0081】
(表3)他のウイルスタンパク質のインフルエンザA型ウイルスT細胞エピトープ
【0082】
参考文献
【0083】
配列付表3
ヒトライノウイルス14(HRV14);コードされるアミノ酸配列は、以下に記載した配列(SEQ ID NO:50)のヌクレオチド629〜7168位の翻訳によって得られる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インフルエンザウイルス抗原を含むライノウイルスベクター。
【請求項2】
ヒトにおいて病原性ではない、請求項1記載のライノウイルスベクター。
【請求項3】
ヒトライノウイルス14(HRV14)である、請求項2記載のライノウイルスベクター。
【請求項4】
インフルエンザウイルス抗原がM2eペプチドを含む、請求項1記載のライノウイルスベクター。
【請求項5】
インフルエンザ抗原が、中和免疫原(neutralizing immunogen)I(NimI)、中和免疫原II(NimII)、中和免疫原III(NimIII)、および中和免疫原IV(NimIV)、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される中和免疫原の部位に挿入されている、請求項1記載のライノウイルスベクター。
【請求項6】
インフルエンザウイルス抗原が中和免疫原II(NimII)の部位に挿入されている、請求項5記載のライノウイルスベクター。
【請求項7】
インフルエンザ抗原がNimIIのアミノ酸158位と160位の間に挿入されている、請求項6記載のライノウイルスベクター。
【請求項8】
インフルエンザウイルス抗原が、一つまたは両方の末端においてリンカー配列と隣接している、請求項1記載のライノウイルスベクター。
【請求項9】
生存型(live)である、請求項1記載のライノウイルスベクター。
【請求項10】
不活化されている、請求項1記載のライノウイルスベクター。
【請求項11】
請求項1〜10のいずれか一項記載のライノウイルスベクターと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項12】
アジュバントをさらに含む、請求項11記載の薬学的組成物。
【請求項13】
一つまたは複数のさらなる活性成分をさらに含む、請求項11記載の薬学的組成物。
【請求項14】
M2e配列と融合したB型肝炎コアタンパク質をさらに含む、請求項13記載の薬学的組成物。
【請求項15】
請求項11〜14のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項16】
被験体が、インフルエンザウイルス感染症を有しないが、該感染症を発症するリスクを有する、請求項15記載の方法。
【請求項17】
被験体がインフルエンザウイルス感染症を有する、請求項15記載の方法。
【請求項18】
組成物が被験体の鼻腔内に投与される、請求項15記載の方法。
【請求項19】
被験体がヒトである、請求項15記載の方法。
【請求項20】
請求項1記載のライノウイルスベクターと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを混合する段階を含む、薬学的組成物を製造する方法。
【請求項21】
請求項1記載のライノウイルスベクターのゲノムをコードするか、または該ゲノムに対応する、核酸分子。
【請求項22】
挿入されたインフルエンザ抗原を含む、NimIIペプチド。
【請求項23】
(i)挿入されたインフルエンザウイルス抗原配列を含む感染性のcDNAクローンに基づいて、組換え型ライノウイルスベクターのライブラリーを生成する段階;および
(ii)(a)挿入された配列を継代の際に維持する組換え型ウイルスであり、かつ(b)挿入された配列に対する抗体によって中和される組換え型ウイルスを、ライブラリーから選択する段階
を含む、インフルエンザウイルス抗原を含むライノウイルスベクターを生成する方法。
【請求項24】
ライノウイルスベクターがヒトライノウイルス14(HRV14)である、請求項23記載の方法。
【請求項25】
挿入されたインフルエンザ抗原配列が、NimI、NimII、NimIII、およびNimIVからなる群より選択される位置に挿入されている、請求項23記載の方法。
【請求項26】
挿入されたインフルエンザウイルス抗原配列が、M2e配列である、請求項23記載の方法。
【請求項27】
挿入されたインフルエンザ抗原配列が、一つまたは両方の末端においてランダムリンカー配列と隣接している、請求項23記載の方法。
【請求項28】
HeLa細胞またはMRC-5細胞でベクターを継代する段階を含む、インフルエンザウイルス抗原を含むライノウイルスベクターを培養する方法。
【請求項29】
本明細書において記述される病原体、癌、またはアレルゲンに基づく抗原を含む、ライノウイルスベクター。
【請求項30】
請求項29記載のライノウイルスベクターを含む、薬学的組成物。
【請求項31】
本明細書において記述される病原体、癌、またはアレルゲンに基づく抗原に由来する抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項29または請求項30記載のベクターまたは組成物を投与する段階を含む、方法。
【請求項1】
インフルエンザウイルス抗原を含むライノウイルスベクター。
【請求項2】
ヒトにおいて病原性ではない、請求項1記載のライノウイルスベクター。
【請求項3】
ヒトライノウイルス14(HRV14)である、請求項2記載のライノウイルスベクター。
【請求項4】
インフルエンザウイルス抗原がM2eペプチドを含む、請求項1記載のライノウイルスベクター。
【請求項5】
インフルエンザ抗原が、中和免疫原(neutralizing immunogen)I(NimI)、中和免疫原II(NimII)、中和免疫原III(NimIII)、および中和免疫原IV(NimIV)、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される中和免疫原の部位に挿入されている、請求項1記載のライノウイルスベクター。
【請求項6】
インフルエンザウイルス抗原が中和免疫原II(NimII)の部位に挿入されている、請求項5記載のライノウイルスベクター。
【請求項7】
インフルエンザ抗原がNimIIのアミノ酸158位と160位の間に挿入されている、請求項6記載のライノウイルスベクター。
【請求項8】
インフルエンザウイルス抗原が、一つまたは両方の末端においてリンカー配列と隣接している、請求項1記載のライノウイルスベクター。
【請求項9】
生存型(live)である、請求項1記載のライノウイルスベクター。
【請求項10】
不活化されている、請求項1記載のライノウイルスベクター。
【請求項11】
請求項1〜10のいずれか一項記載のライノウイルスベクターと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項12】
アジュバントをさらに含む、請求項11記載の薬学的組成物。
【請求項13】
一つまたは複数のさらなる活性成分をさらに含む、請求項11記載の薬学的組成物。
【請求項14】
M2e配列と融合したB型肝炎コアタンパク質をさらに含む、請求項13記載の薬学的組成物。
【請求項15】
請求項11〜14のいずれか一項記載の薬学的組成物を被験体に投与する段階を含む、被験体におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項16】
被験体が、インフルエンザウイルス感染症を有しないが、該感染症を発症するリスクを有する、請求項15記載の方法。
【請求項17】
被験体がインフルエンザウイルス感染症を有する、請求項15記載の方法。
【請求項18】
組成物が被験体の鼻腔内に投与される、請求項15記載の方法。
【請求項19】
被験体がヒトである、請求項15記載の方法。
【請求項20】
請求項1記載のライノウイルスベクターと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを混合する段階を含む、薬学的組成物を製造する方法。
【請求項21】
請求項1記載のライノウイルスベクターのゲノムをコードするか、または該ゲノムに対応する、核酸分子。
【請求項22】
挿入されたインフルエンザ抗原を含む、NimIIペプチド。
【請求項23】
(i)挿入されたインフルエンザウイルス抗原配列を含む感染性のcDNAクローンに基づいて、組換え型ライノウイルスベクターのライブラリーを生成する段階;および
(ii)(a)挿入された配列を継代の際に維持する組換え型ウイルスであり、かつ(b)挿入された配列に対する抗体によって中和される組換え型ウイルスを、ライブラリーから選択する段階
を含む、インフルエンザウイルス抗原を含むライノウイルスベクターを生成する方法。
【請求項24】
ライノウイルスベクターがヒトライノウイルス14(HRV14)である、請求項23記載の方法。
【請求項25】
挿入されたインフルエンザ抗原配列が、NimI、NimII、NimIII、およびNimIVからなる群より選択される位置に挿入されている、請求項23記載の方法。
【請求項26】
挿入されたインフルエンザウイルス抗原配列が、M2e配列である、請求項23記載の方法。
【請求項27】
挿入されたインフルエンザ抗原配列が、一つまたは両方の末端においてランダムリンカー配列と隣接している、請求項23記載の方法。
【請求項28】
HeLa細胞またはMRC-5細胞でベクターを継代する段階を含む、インフルエンザウイルス抗原を含むライノウイルスベクターを培養する方法。
【請求項29】
本明細書において記述される病原体、癌、またはアレルゲンに基づく抗原を含む、ライノウイルスベクター。
【請求項30】
請求項29記載のライノウイルスベクターを含む、薬学的組成物。
【請求項31】
本明細書において記述される病原体、癌、またはアレルゲンに基づく抗原に由来する抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項29または請求項30記載のベクターまたは組成物を投与する段階を含む、方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図2】
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【図6】
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【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【公表番号】特表2010−504760(P2010−504760A)
【公表日】平成22年2月18日(2010.2.18)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−530464(P2009−530464)
【出願日】平成19年10月1日(2007.10.1)
【国際出願番号】PCT/US2007/021102
【国際公開番号】WO2008/100290
【国際公開日】平成20年8月21日(2008.8.21)
【出願人】(503389389)サノフィ パスツール バイオロジクス カンパニー (17)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成22年2月18日(2010.2.18)
【国際特許分類】
【出願日】平成19年10月1日(2007.10.1)
【国際出願番号】PCT/US2007/021102
【国際公開番号】WO2008/100290
【国際公開日】平成20年8月21日(2008.8.21)
【出願人】(503389389)サノフィ パスツール バイオロジクス カンパニー (17)
【Fターム(参考)】
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