組織因子経路を阻害する薬剤を使用する、肺高血圧症の治療
重度の肺動脈高血圧症(PAH)の改善された非ヒト動物モデル、およびPAHの症状を治療することができる治療剤を試験するためのその使用が開示される。さらに、本出願は、単独でまたは組み合わせて、PAHを治療もしくは予防するために、またはそれに関連した症状の重症度を少なくとも軽減するために使用され得る治療剤のいくつかのクラスの同定にも関する。遺伝子療法アプローチおよび非遺伝子療法アプローチの両方が説明される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトにおいて現れる状態をより厳密に模倣する、肺動脈高血圧症(「PAH」)の動物モデル、PAHを治療または予防することができる治療薬を同定またはスクリーニングするためのそのモデルの使用、ならびに組織因子(「TF」)インヒビターまたはTFを介した経路のインヒビターを用いてPAH(もしくはその症状)を治療または予防する方法に関する。
【０００２】
米国特許仮出願第60/616,567号の優先権の恩典を主張する。
【０００３】
生研究所(National Institutes of Health)からの資金を用いてなされた。米国政府は、本発明においていくつかの権利を保有し得る。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
重度のPAHは、特発型として散発性および家族性に発生する、肺循環中の前毛細管抵抗の著しい上昇である。これはまた、慢性の静脈血栓塞栓症、強皮症、HIV感染症、および肝硬変などの疾患に関連して観察される(Fishman, "Etiology and Pathogenesis of Primary Pulmonary Hypertension： A Perspective," Chest 114(3 Suppl)：242S-247S (1998)（非特許文献１）; Farber et al., "Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(16)：1655-65 (2004)（非特許文献２）)。PAHは、稀であるが破壊的な疾患であり、主に若い女性を冒すが、強皮症患者および肝硬変患者の間のPAH発病率の上昇により、この疾患の人口統計が変化しつつある。生存率は極めてひどく、未治療の進行患者の6ヶ月死亡率は50％である。
【０００５】
1996年のプロスタサイクリン持続注入の広範囲に及ぶ導入は、この疾患の治療に大変革を起こし(Barst et al., "A Comparison of Continuous Intravenous Epoprostenol (Prostacyclin) with Conventional Therapy for Primary Pulmonary Hypertension. The Primary Pulmonary Hypertension Study Group," New Engl. J. Med. 334(5)：296-302 (1996)（非特許文献３）) 、生存率を著しく改善した―現代の療法による3年生存率は60％である(Kawut et al., "New Predictors of Outcome in Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension," Am. J. Cardiol. 95(2)： 199-203 (2005)（非特許文献４）)。
【０００６】
残念ながら、この珍しい疾患の治療に対する規制認可を得ている薬物はまだ5種類しかなく
(Farber et al., "Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(16)：1655-65 (2004)（非特許文献５）; Humbert et al., "Treatment of Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(14)： 1425- 36 (2004)（非特許文献６）)、多くの患者は、利用可能な最善の治療にもかかわらず、肺移植または死亡に至る。さらに、患者の治療が進歩した割には、疾患のプロセスに関する理解は依然として限られている(Newman et al., "Pulmonary Arterial Hypertension：Future Directions： Report of a National Heart, Lung and Blood Institute/Office of Rare Diseases Workshop," Circulation 109(24)：2947-52 (2004)（非特許文献７）)。
【０００７】
多数の病因による進行したPAHでは、内皮増殖および中膜肥厚が、動脈管腔を最終的に閉塞させる。大半の患者は、叢状病変と呼ばれる糸球体様構造中に血管新生の障害も有する(Pietra et al., "Histopathology of Primary Pulmonary Hypertension. A Qualitative and Quantitative Study of Pulmonary Blood Vessels from 58 Patients in the National Heart, Lung, and Blood Institute, Primary Pulmonary Hypertension Registry," Circulation 80(5)： 1198-206 (1989)（非特許文献８）; Meyrick, "The Pathology of Pulmonary Artery Hypertension," Clin. Chest Med. 22(3)：393-404 (2001)（非特許文献９）; Tuder et al., "Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 144(2)：275-85 (1994)（非特許文献１０）)。叢状病変は、全身の動脈循環の疾患ではまったく認められない。しかしながら、これら独特の構造は、珍しい形態の癌である多形性神経膠芽腫における血管との間に類似点を共有しており(Tuder et al., "Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am J Pathol 144(2)：275-85 (1994)（非特許文献１１）)、これらの病変を構成する細胞が、PAH進行の原因である可能性がある。叢状病変は、同心円状の管腔閉塞の発現に先行し、したがって、血管リモデリングに重大な意味を持つという仮説を裏付ける、ヒト剖検研究からのいくらかのデータがある(Cool et al., "Three-Dimensional Reconstruction of Pulmonary Arteries in Plexiform Pulmonary Hypertension Using Cell-Specific Markers. Evidence for a Dynamic and Heterogeneous Process of Pulmonary Endothelial Cell Growth," Am. J. Pathol. 155(2)：411-9 (1999)（非特許文献１２）)。したがって、増殖性の血管病変および同心円状の管腔閉塞が、血管内皮および平滑筋細胞のこの異常な増殖を媒介するメカニズムを研究するための重度PAHの動物モデルにおいて望ましいと思われる(Newman et al., "Pulmonary Arterial Hypertension： Future Directions： Report of a National Heart, Lung and Blood Institute/Office of Rare Diseases Workshop," Circulation 109(24)：2947-52 (2004)（非特許文献１３）; Tuder et al., Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 144(2)：275- 85 (1994)（非特許文献１４）; Humbert et al., "Cellular and Molecular Pathobiology of Pulmonary Arterial Hypertension," J. Amer. Coll. Cardiol. 43(12 Suppl S)：13S-24S (2004)（非特許文献１５）; Rubin et al., "Pulmonary Arterial Hypertension： a Look to the Future," J. Amer. Coll. Cardiol. 43(12 Suppl S)：89S-90S (2004)（非特許文献１６）)。このようなモデルはまた、合理的な薬物開発にも非常に有用であると思われる。
【０００８】
内皮毒素のモノクロタリン(「MCT」)が、PAHの実験モデルを作製するために通常使用され、このモデルの動物は、「でこぼこした(rugged)」外観の内皮および中膜肥厚を発現する。しかしながら、ヒト疾患の2種の病理学的特徴、すなわち同心円状の管腔閉塞および叢状病変は、観察されていない。Botneyによって提唱されたラットモデルでは、左肺切除術に続いて、MCTがラットに投与される。これらの動物は、末梢肺血管の大半において新生内膜形成および同心円状閉塞を伴う、より重度のPAHを発症し(Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol.151(4)：1019-25 (1997)（非特許文献１７）)、ヒトの疾患において認められるものにはるかに似ている。これらのモデルは、血管リモデリングの重要な経路を明確にし、したがって新規な治療戦略を提案するのに有用であったが(Cowan et al., "Elastase and Matrix Metalloproteinase Inhibitors Induce Regression, and Tenascin-C Antisense Prevents Progression, of Vascular Disease," J.Clin. Invest. 105(1)：21-34 (2000)（非特許文献１８）; Nishimura et al., "Simvastatin Rescues Rats from Fatal Pulmonary Hypertension by Inducing Apoptosis of Neointimal Smooth Muscle Cells," Circulation 108(13)： 1640-5 (2003)（非特許文献１９）; Zhao et al., "Rescue of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension Using Bone Marrow-Derived Endothelial-Like Progenitor Cells： Efficacy of Combined Cell and eNOS Gene Therapy in Established Disease," Circ. Res. 96(4)：442-450 (2005)（非特許文献２０）)、ヒト疾患のいくつかの典型的な病理学的特徴を欠くことが、両方のモデルにとって重大な制約である。叢状病変は、これらのラットまたはPAHの他の任意の動物モデルにおいて報告されていない。
【０００９】
したがって、管腔閉塞および叢状(または叢状様(plexiform-like))病変の形成の双方を含む、ヒト患者によって提示される症状をより正確に反映することができる、重度PAHの動物モデルを開発することが望ましいと思われる。このようなモデルは、開発された場合には、PAHを治療もしくは予防(またはその症状を処置)するのに使用され得る治療薬を試験またはスクリーニングするために信頼できる観察結果をより提供しやすいと思われる。
【００１０】
本発明は、当技術分野におけるこれらおよび他の欠陥を克服することを対象としている。
【００１１】
【非特許文献１】Fishman, "Etiology and Pathogenesis of Primary Pulmonary Hypertension： A Perspective," Chest 114(3 Suppl)：242S-247S (1998)
【非特許文献２】Farber et al., "Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(16)：1655-65 (2004)
【非特許文献３】Barst et al., "A Comparison of Continuous Intravenous Epoprostenol (Prostacyclin) with Conventional Therapy for Primary Pulmonary Hypertension. The Primary Pulmonary Hypertension Study Group," New Engl. J. Med. 334(5)：296-302 (1996)
【非特許文献４】Kawut et al., "New Predictors of Outcome in Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension," Am. J. Cardiol. 95(2)： 199-203 (2005)
【非特許文献５】Farber et al., "Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(16)：1655-65 (2004)
【非特許文献６】Humbert et al., "Treatment of Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(14)： 1425- 36 (2004)
【非特許文献７】Newman et al., "Pulmonary Arterial Hypertension：Future Directions： Report of a National Heart, Lung and Blood Institute/Office of Rare Diseases Workshop," Circulation 109(24)：2947-52 (2004)
【非特許文献８】Pietra et al., "Histopathology of Primary Pulmonary Hypertension. A Qualitative and Quantitative Study of Pulmonary Blood Vessels from 58 Patients in the National Heart, Lung, and Blood Institute, Primary Pulmonary Hypertension Registry," Circulation 80(5)： 1198-206 (1989)
【非特許文献９】Meyrick, "The Pathology of Pulmonary Artery Hypertension," Clin. Chest Med. 22(3)：393-404 (2001)
【非特許文献１０】Tuder et al., "Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 144(2)：275-85 (1994)
【非特許文献１１】Tuder et al., "Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am J Pathol 144(2)：275-85 (1994)
【非特許文献１２】Cool et al., "Three-Dimensional Reconstruction of Pulmonary Arteries in Plexiform Pulmonary Hypertension Using Cell-Specific Markers. Evidence for a Dynamic and Heterogeneous Process of Pulmonary Endothelial Cell Growth," Am. J. Pathol. 155(2)：411-9 (1999)
【非特許文献１３】Newman et al., "Pulmonary Arterial Hypertension： Future Directions： Report of a National Heart, Lung and Blood Institute/Office of Rare Diseases Workshop," Circulation 109(24)：2947-52 (2004)
【非特許文献１４】Tuder et al., Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 144(2)：275- 85 (1994)
【非特許文献１５】Humbert et al., "Cellular and Molecular Pathobiology of Pulmonary Arterial Hypertension," J. Amer. Coll. Cardiol. 43(12 Suppl S)：13S-24S (2004)
【非特許文献１６】Rubin et al., "Pulmonary Arterial Hypertension： a Look to the Future," J. Amer. Coll. Cardiol. 43(12 Suppl S)：89S-90S (2004)
【非特許文献１７】Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol.151(4)：1019-25 (1997)
【非特許文献１８】Cowan et al., "Elastase and Matrix Metalloproteinase Inhibitors Induce Regression, and Tenascin-C Antisense Prevents Progression, of Vascular Disease," J.Clin. Invest. 105(1)：21-34 (2000)
【非特許文献１９】Nishimura et al., "Simvastatin Rescues Rats from Fatal Pulmonary Hypertension by Inducing Apoptosis of Neointimal Smooth Muscle Cells," Circulation 108(13)： 1640-5 (2003)
【非特許文献２０】Zhao et al., "Rescue of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension Using Bone Marrow-Derived Endothelial-Like Progenitor Cells： Efficacy of Combined Cell and eNOS Gene Therapy in Established Disease," Circ. Res. 96(4)：442-450 (2005)
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明の第1の局面は、以下の段階を含む、肺組織中の動脈幹に付随する小血管床の減少を抑制する方法に関する：組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害する治療薬を提供する段階;および肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中の血管細胞を治療薬に接触させる段階であって、接触させる段階が小血管床中の血管細胞の減少を抑制する、段階。
【００１３】
本発明の第2の局面は、以下の段階を含む、肺血管組織における新生内膜形成を予防または治療する方法に関する：組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害する治療薬を提供する段階;および(i)新生内膜病変もしくは叢状病変の発生前の血管細胞、または(ii)肺血管組織中の新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物を、治療薬に接触させる段階であって、接触させる段階が新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物の発生を抑制し、または肺血管組織中の既存の新生内膜病変もしくは叢状病変のサイズを縮小させる、段階。
【００１４】
本発明の第3の局面は、以下の段階を含む、肺高血圧症を治療する方法に関する：組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害する治療薬を提供する段階;および肺高血圧症の症状を示す患者に治療薬を投与する段階であって、投与する段階が肺血管組織において叢状病変の程度を低減させ、または小血管の新生内膜閉塞の程度を低減させるのに有効であり、それによって、血管容量を増大させ、かつ肺高血圧症を治療する、段階。
【００１５】
本発明の第4の局面は、以下の段階を含む、肺組織中の動脈幹に付随する小血管床の減少を抑制する方法に関する：(i)組織因子活性もしくは組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子構築物、または(ii)そのポリペプチドを発現するトランスジェニック細胞を提供する段階;および肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中の血管細胞中に遺伝子構築物を導入する段階、または肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中にトランスジェニック細胞を導入する段階のいずれかであって、導入する段階が小血管床中の血管細胞の減少を抑制する、段階。
【００１６】
本発明の第5の局面は、以下の段階を含む、肺血管組織における新生内膜病変形成または叢状病変形成を予防または治療する方法に関する：組織因子活性もしくは組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子構築物、または(ii)そのポリペプチドを発現するトランスジェニック細胞を提供する段階;および(i)新生内膜病変もしくは叢状病変の発生前の肺血管組織中に遺伝子構築物もしくはトランスジェニック細胞を導入する段階、または(ii)新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物中に遺伝子構築物もしくはトランスジェニック細胞を導入する段階のいずれかであって、導入する段階が新生内膜病変形成もしくは叢状病変形成の進行を抑制し、または肺血管組織中の既存の新生内膜病変もしくは叢状病変のサイズを縮小させる、段階。
【００１７】
本発明の第6の局面は、以下の段階を含む、肺高血圧症を治療する方法に関する：組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子構築物を提供する段階;および肺高血圧症の症状を示す患者の肺血管組織中の小血管中に遺伝子構築物を導入する段階またはトランスジェニック細胞を導入する段階のいずれかであって、導入する段階が肺血管組織において叢状病変の程度を低減させ、または小血管の新生内膜閉塞の程度を低減させるのに有効であり、それによって、血管容量を増大させ、かつ肺高血圧症を治療する、段階。
【００１８】
本発明の第7の局面は、肺動脈高血圧症の非ヒト動物モデルに関する。この動物モデルは、肺切除術とそれに続くモノクロタリン投与で処置される幼若動物であり、処置された幼若動物は、治療処置がなされない場合、叢状様病変の形成を含む肺動脈高血圧症の症状を発現する。好ましい態様によれば、動物モデルは、げっ歯動物モデルである。
【００１９】
本発明の第8の局面は、本発明の第7の局面による動物モデルに治療薬を投与する段階、および該投与する段階が肺動脈高血圧症の症状の発現を変化させるかどうかを判定する段階を含む、肺動脈高血圧症を治療する際に使用するための治療薬をスクリーニングする方法に関する。
【００２０】
叢状病変と疾患の進行の関係をより良く理解するために、ヒトにおいて観察されるPAHの形態をより良く再現するラットモデルが開発された。具体的には、このラットモデルは、増殖性の血管病変および肺動脈管腔の閉塞を提示した。これらのラットは、叢状様病変およびヒト疾患に典型的な血行動態変化を示した。これらの動物は、以前の報告(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 151(4)：1019-25 (1997); Faul et al., "Triptolide Attenuates Pulmonary Arterial Hypertension and Neointimal Formation in Rats," Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162(6)：2252-8 (2000))におけるラットよりも短時間で死亡したため、より重症であると思われた。叢状病変のうち一部は、ヒト疾患のものと同様に内皮抗原を発現し、かつそれらは肺動脈に結合されているようであった。TF抗原は、これらのラットの血管および増殖性病変において著しく増加していた。さらに、PAHに罹患しているヒトの肺中の叢状病変、および中膜肥厚を伴う血管において、TF抗原レベルが著しく上昇していた。これは、PAHを治療または予防するためのTF経路インヒビターの実証される用途に論拠を与える。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、重度の肺動脈高血圧症(PAH)の改善されたモデル、およびPAHの症状を治療することができる治療薬を試験するためのその使用に関する。さらに、本出願は、単独でまたは組み合わせて、PAHを治療もしくは予防するために、またはそれに関連した症状の重症度を少なくとも軽減するために使用され得る治療薬のいくつかのクラスの同定にも関する。
【００２２】
本発明の一つの局面は、重度の肺動脈高血圧症の非ヒト動物モデルに関する。このモデルは、肺切除術とそれに続くモノクロタリン(「MCT」)投与で処置された幼若動物を用いて得られる。治療処置がなされない場合、処置された幼若動物は、限定されるわけではないが、上昇した肺血圧(すなわち、対照に比べて)、叢状様病変の形成、血管系の閉塞を伴う新生内膜形成、右心室肥厚、運動不耐性、およびより早期の死亡(すなわち、MCTで処置されていない対照に比べて)を含む、肺動脈高血圧症の徴候および症状を発現する。
【００２３】
モノクロタリンは、好ましくは肺切除術後約5〜約9日目、より好ましくは肺切除術後約6〜約8日目、最も好ましくは肺切除術後7日目に投与される。
【００２４】
非ヒト動物は、限定されるわけではないが、げっ歯類動物、ネコ、イヌ、ブタ、または非ヒト霊長類を含む、任意の動物であり得る。哺乳動物は、好ましくは幼若動物である。好ましい態様によれば、非ヒト動物は、約300g未満、好ましくは約200〜約250gの間の幼若ラットである。
【００２５】
このようにして得られる動物モデルは、ヒトを含む他の動物における肺動脈高血圧症に対する潜在的な治療薬としての治療薬をスクリーニングする際に使用するのに適している。治療剤のスクリーニングは、本発明による動物モデルに治療剤を投与し、次いでその治療剤の投与が肺動脈高血圧症の徴候または症状の発現を変化させるかどうかを判定することによって実施することができる。基本的には、治療剤は、モノクロタリン投与以後の任意の時点に投与することができる。一つのアプローチにおいて、MCT投与のすぐ後(すなわち約2時間〜約7日後、好ましくは約1〜約5日後)に治療剤を投与して、その治療剤がPAHの初期の徴候または症状を停止または改善させる能力を評価することができる。別のアプローチにおいて、MCT投与のかなり後(すなわち約7日〜約14日後、好ましくは約9〜約12日後)に治療剤を投与して、その治療剤がPAHの進行した徴候または症状を停止または改善させる能力を評価することができる。
【００２６】
治療剤の投与は、経口的に、吸入によって、鼻腔内滴下によって、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈注射、動脈内注射、筋肉内注射、胸膜腔内点滴、腹腔内注射、脳室内注射、病巣内注射によって、または粘膜への適用によって実施することができる。投与は反復することができる。すなわち、毎日最高2〜5回、無期限に、または症状の緩和のような所望のエンドポイントを達成するのに適した持続期間もしくは症状が通常現れる定められた期間の間、反復することができる。または、治療剤の投与は、所望のエンドポイントを達成するのに適した持続期間の間、持続的でもよい。
【００２７】
治療剤の有効性の評価は、その治療剤を用いて達成された結果を、公知の基準(すなわち、PAHに罹患している対照動物またはPAHに罹患している対照動物を代表する例示的な組織標本における平均血圧)と比較することによって、または他の点は同一の条件下で飼育された対照動物と比較することによって(すなわち、並行(side-by-side)群の対照動物から得られる試料および測定値に直接比較して)、判定することができる。
【００２８】
実施例において示すように(後述)、本出願者らは、上記のモデルにおいてPAH発症の原因物質として組織因子(TF)を同定した。TFは、凝固カスケードを開始し、かつ発生および腫瘍増殖の双方において血管新生も促進し得る膜貫通型糖タンパク質である(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Mackman, "Regulation of the Tissue Factor Gene," Thromb.Haemost. 78(1)：747-54 (1997); Bachli, "History of Tissue Factor," Brit. J. Haematol. 110(2)：248-55 (2000); Riewald et al., "Orchestration of Coagulation Protease Signaling by Tissue Factor," Trends Cardiovasc. Med. 12(4)： 149-54 (2002))。TF発現は、実験的な動脈傷害の後の動脈壁において著しく上方制御され(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Hatakeyama et al., "Expression of Tissue Factor in the Rabbit Aorta After Balloon Injury," Atherosclerosis 139(2)：265-71 (1998))、かつその阻害により、様々な動物モデルにおける内膜過形成が減少することが示されている(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Taubman et al., "Regulation of the Procoagulant Response to Arterial Injury," Thromb Haemost 82(2)：801-5 (1999)に総説がある)。PAHは、血栓性素因を有する疾患であり(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Pietra et al., "Histopathology of Primary Pulmonary Hypertension. A Qualitative and Quantitative Study of Pulmonary Blood Vessels from 58 Patients in the National Heart, Lung, and Blood Institute, Primary Pulmonary Hypertension Registry," Circulation 80(5)： 1198-206 (1989); Fuster et al., Primary Pulmonary Hypertension： Natural History and the Importance of Thrombosis," Circulation 70(4)：580-7 (1984))、本明細書において実証される結果を考慮すると、TFが疾患の進行において重要な役割を果たしている可能性がある。
【００２９】
したがって、TF活性の阻害またはTFを介した下流のシグナル伝達経路(すなわち、TFによって直接的にまたは間接的に活性化されるもの)の阻害は、PAHに関連した病理学的状態を含む、PAHの徴候または症状を治療または予防するのに使用され得る。本明細書において使用される場合、TF活性の阻害とは、TF酵素活性(通常はXa因子の生成をもたらす)の阻害、細胞質内ドメイン内の細胞内シグナル伝達活性の阻害、または両方を包含すると意図される。特に、TFまたはTFを介した下流のシグナル伝達経路の阻害は、肺組織中の小血管床の減少、ならびに肺血管組織中の新生内膜病変形成および／または叢状様病変形成の群より選択される病理学的状態を抑制するため;ならびに、PAHの重症度を低減させ、または高い肺血圧および運動不耐性を含むPAHの症状を軽減するために使用され得る。
【００３０】
TF活性を阻害する例示的な治療剤には、限定されるわけではないが、組換えTFPI(Chiron Corp.から入手可能なTifacogin(商標))のような組織因子経路インヒビター(TFPI)、Ixolaris(NIAIDのIvo Francischetti博士から入手可能)のようなTFPI模倣体、抗TFモノクローナル抗体もしくは抗TFポリクローナル抗体、部位不活性化VIIa因子(Novo Nordisk)、および抗VII因子モノクローナル抗体もしくは抗VII因子ポリクローナル抗体が含まれる。
【００３１】
TFを介した下流のシグナル伝達経路を阻害する例示的な治療剤には、限定されるわけではないが、抗Xa因子抗体(Cuo Pharmaceuticals)、ヒルイジン(hiruidin)(Refludan(商標), Berlex)およびキシメラガトラン(Exanta(商標), Astra Zeneca)などの直接作用型トロンビンインヒビター、ならびにプロテアーゼ活性化受容体(「PAR」)遮断薬が含まれ、プロテアーゼ活性化受容体遮断薬には、低分子、ペプチド、ならびにPAR-1、PAR-2、およびPAR-4のモノクローナルまたはポリクローナルの抗体アンタゴニストが含まれる。
【００３２】
適切なPAR-1アンタゴニストには、限定されるわけではないが、SCH205831(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Chackalamannil et al., "Discovery of Potent Orally Active Thrombin Receptor (Protease Active Receptor 1) Antagonists as Novel Antithrombotic Agents," J. Med. Chem. 48(19)：5884-5887 (2005));FR171113 (その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Kato et al., "Inhibition of Arterial Thrombosis by a Protease- Activated Receptor 1 Antagonist, FR171113, in the Guinea Pig," Eur. J. Pharmacol. 473(2-3)：163-167 (2003)); RWJ58259 (それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Andrade-Gordon et al., "Administration of a Potent Antagonist of Protease- Activated Receptor- 1 (PAR-1) Attenuates Vascular Restenosis Following Balloon Angioplasty in Rats," J. Pharmacol. Exp. Ther. 298(1)：34-42 (2001); Derian et al., "Blockade of Thrombin Receptor Protease-Activated Receptor-1 with a Small Molecule Antagonist Prevents Thrombus Formation and Vascular Occlusion in Nonhuman Primates," J. Pharmacol. Exp. Ther. 304(2)： 855-861 (2003) (正誤表 305(1)：402 (2003)); SCH203099およびSCH79797 (その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ahn et al., "Inhibition of Cellular Action of Thrombin by N3-cyclopropyl-7-[[4-(1-methylethyl)phenyl]methyl]-7H-pyrrolo[3,2- f]quinazoline- 1,3 -diamine (SCH 79797), a Nonpeptide Thrombin Receptor Antagonist," Biochem. Pharmacol. 60(10)：1425-1434 (2000));ならびにペプチド誘導体3-メルカプトプロプリオニル(mercaptoproprionyl)-Phe-Cha-Cha-Arg-Lys-Pro-Asn-Asp-Lys-NH2 (Sigma-Aldrich, Inc.)が含まれる。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体もまた、適切なPAR-1遮断薬であると思われる。
【００３３】
適切なPAR-2アンタゴニストには、限定されるわけではないが、いずれもEntremed, Inc.から入手可能なペプチドp520および低分子547m、ならびに抗PAR-2抗体が含まれる。
【００３４】
適切なPAR-4アンタゴニストには、限定されるわけではないが、YD-3(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Wu et al., "Selective Inhibition of Protease-Activated Receptor 4-dependent Platelet Activation by YD-3," Thrombosis Haemostasis 87：1026-1033 (2002));およびtrans-シンナモイル-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-NH2(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Quinton et al., "Plasmin-mediated Activation of Platelets Occurs by Cleavage of Protease-activated Receptor 4," J. Biol. Chem. 279(18)18434-18439 (2004))が含まれる。
【００３５】
一つの態様によれば、(肺組織中の動脈幹に付随する)小血管床の減少を抑制することができる。この態様において、小血管床中の血管細胞は、治療剤と接触させられ、かつこのような接触段階は、小血管床中の血管細胞の減少を抑制するのに効果的である。血管細胞には、内皮細胞および血管平滑筋細胞の双方が含まれ得る。
【００３６】
別の態様によれば、肺血管組織中の新生内膜病変形成もしくは叢状病変形成が、予防(すなわち発症前に)または治療(すなわち発症後に)され得る。この態様において、肺血管組織中の血管細胞が、新生内膜病変および/もしくは叢状病変の発生前に治療剤に接触させられ、または、肺血管組織中の新生内膜病変および/もしくは叢状病変が治療剤に接触させられ、ここで、該接触段階は、新生内膜病変形成および/もしくは叢状病変形成の進行を抑制し、または肺血管組織中の既存の新生内膜病変および/もしくは叢状病変のサイズを縮小する。
【００３７】
別の態様によれば、PAHの症状を示す患者に治療剤を投与することによって、PAHを治療することができる。治療剤の投与は、肺血管組織において、限定されるわけではないが、増殖性の叢状病変を含むPAHの徴候もしくは症状、または小血管の新生内膜閉塞の程度を低減させるのに有効であり、それによって、血管容量を増大させ、かつ肺高血圧症を治療する。
【００３８】
上記の態様において、血管細胞の接触段階には、哺乳動物内のインビボの内皮細胞、血管平滑筋細胞、または炎症細胞(すなわち、新生内膜形成物の部位(cite)に補充される)が含まれる。患者への投与が企図される。これらは、患者への全身投与を介して、または肺血管組織の血管細胞への標的化された投与を介して遂行され得る。例示的な投与経路には、限定されるわけではないが、経口、吸入、鼻腔内滴下、局所、経皮、非経口、皮下、静脈注射、動脈内注射(肺動脈を介するものなど)、筋肉内注射、胸膜腔内点滴、腹腔内注射、脳室内注射、病巣内注射、または粘膜への適用が含まれる。これらのうちで、静脈内、動脈内(肺)、脳室内、および吸入の投与経路が好ましい。
【００３９】
本発明によって処置される哺乳動物は、げっ歯動物、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、非ヒト霊長類、またはヒトでよい。
【００４０】
治療剤の投与は、必要なだけの頻度、かつPAHまたはその潜在的な病理学的状態に対して効果的な治療を提供するのに適した持続期間、実施することができる。例えば、治療剤の投与は、単一の持続放出投薬製剤を用いて、または複数の1日量の治療剤を用いて実施することができる。当然、投与される量は、治療計画に応じて変動する。
【００４１】
典型的には、治療剤は、治療剤および任意の薬学的に許容される適切な補助剤、担体、賦形剤、または安定化剤を含む薬学的組成物として哺乳動物に投与され、かつ錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、または乳剤など固体形態または液状形態でよい。これらの組成物は、好ましくは、約0.01〜99重量パーセント、より好ましくは約2〜60パーセントの治療剤を、補助剤、担体、および/または賦形剤と共に含む。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な投薬単位が得られると思われる量である。本発明による好ましい組成物は、一つの投薬単位が約1mg〜1000mgの間の治療剤を含むように調製される。
【００４２】
治療剤の投与に加えて、様々な遺伝子療法アプローチが、PAHおよびそれに関連した前述の徴候または症状を治療するために企図される。様々な遺伝子療法アプローチにおいて、遺伝子構築物が、細胞、好ましくは患者細胞をインビボまたはエクスビボのいずれかで形質転換するのに利用される。後者の場合、これらの細胞は、治療対象の患者から採取され、形質転換され、次いでその患者中に再導入される。
【００４３】
これらの状態を治療するための遺伝子療法アプローチは、治療用のタンパク質または核酸をコードする組換え遺伝子(または遺伝子構築物)をその中に含む発現ベクターまたは発現プラスミドを利用する。組換え遺伝子によってコードされる例示的な治療用タンパク質には、限定されるわけではないが、組織因子経路インヒビター(TFPI、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Genbankアクセッション番号NM_006287 (TFPI var. 1)、NM_001032281(TFPI、var. 2)、およびNM_006528 (TFPI2))、Ixolaris (IXO、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Genbankアクセッション番号AF286029)およびIxolaris-2(IXO-2、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Genbankアクセッション番号AY674279)などの組織因子経路インヒビター模倣体、ならびに前述のもののようなPARのペプチドインヒビターが含まれる。
【００４４】
組換え遺伝子は、互いに作動的に結合された、哺乳動物細胞において作動可能な上流のプロモーター、および任意で、他の適切な調節エレメント(すなわちエンハンサーエレメントもしくは誘導エレメント)、治療用のタンパク質または核酸をコードするコード配列(前述)、ならびに下流の転写終結領域を含む。任意の適切な構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが、組換え遺伝子の転写を調節するのに使用され得、かつ当業者なら、現在公知のものであろうと今後開発されるものであろうと、このようなプロモーターを容易に選択し、かつ利用することができる。プロモーターはまた、Tie2プロモーター(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Minami et al., "Ets Motifs are Necessary for Endothelial Cell-specific Expression of a 723-bp Tie-2 Promoter/Enhancer in hprt targeted transgenic mice " Arterioscl.Thromb.Vasc. Biol. 23(11)：2041 -2047 (2003))のような、内皮細胞における発現に特異的なもの、またはSM22 (その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ribault et al., "Chimeric Smooth Muscle-Specific Enhancer/Promoters： Valuable Tools for Adenovirus-mediated Cardiovascular Gene Therapy," Circulation Res. 88(5)：468-475 (2001))のような、血管平滑筋細胞における発現に特異的なものであり得る。例えばTetO応答エレメントを用いることによって、組織特異的プロモーターを誘導性/抑制性にすることもできる。公知の組換え技術を利用して、組換え遺伝子を作製し、発現ベクター中にそれを移入し、かつそのベクターを患者に投与することができる。例示的な手順は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)に記載されている。当業者なら、その中に記載されている手順の公知の変形法を用いて、望ましいように、これらの手順を容易に変更することができる。
【００４５】
組換え遺伝子は、細胞によって取り込まれ得る裸DNAとして、またはウイルス(感染性)ベクターもしくは非感染性の送達運搬体を用いることによって、(形質転換する予定の)標的細胞中に送達され得る
【００４６】
任意の適切なウイルスベクターまたは感染性形質転換ベクターが使用され得る。例示的なウイルスベクターには、限定されるわけではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターが含まれる。
【００４７】
それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Berkner, Biotechniques 6：616-627 (1988)ならびにRosenfeld et al., Science 252：431-434 (1991)、WO 93/07283、WO 93/06223、およびWO 93/07282において提供される開示を考慮すれば、アデノウイルス遺伝子送達運搬体を容易に作製および利用することができる。アデノウイルスベクターのその他のタイプは、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Wickhamらの米国特許第6,057,155号;Boutらの米国特許第6,033,908号;Wilsonらの米国特許第6,001,557号;Chamberlainらの米国特許第5,994,132号;Kochanekらの米国特許第5,981,225号;Spoonerらの米国特許第5,885,808号;およびCurielの米国特許第5,871,727号において記載されている。
【００４８】
アデノ随伴ウイルス遺伝子送達運搬体を構築し、所望のタンパク質もしくはポリペプチドまたは核酸をコードする組換え遺伝子を細胞中に送達するのに使用することができる。インビトロでのアデノ随伴ウイルス遺伝子送達運搬体の使用は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Chatterjee et al., Science 258：1485-1488 (1992); Walsh et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89：7257-7261 (1992); Walsh et al., J. Clin. Invest. 94：1440-1448 (1994); Flotte et al., J. Biol. Chem. 268：3781-3790 (1993); Ponnazhagan et al., J. Exp. Med. 179：733-738 (1994); Miller et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91：10183-10187 (1994); Einerhand et al., Gene Ther. 2：336-343 (1995); Luo et al., Exp. Hematol. 23：1261-1267 (1995); およびZhou et al., Gene Ther. 3：223-229 (1996)において記載されている。これらの運搬体のインビボでの使用は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90：10613- 10617 (1993);およびKaplitt et al., Nature Genet. 8：148-153 (1994)において記載されている。
【００４９】
感染性の形質転換系を形成するように改変されたレトロウイルスベクターもまた、所望のタンパク質もしくはポリペプチドまたは核酸産物をコードする組換え遺伝子を標的細胞中に送達するのに使用され得る。このようなタイプのレトロウイルスベクターの一つが、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Krieglerらの米国特許第5,849,586号において開示されている。
【００５０】
または、いくつかの非感染性送達運搬体が、インビボまたはエクスビボで遺伝子構築物を送達するのに利用可能である。コロイド分散系が、患者に遺伝子構築物を送達するのに使用され得る。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。本発明の好ましいコロイド系は、単層リポソームおよび多重層リポソームを含む脂質調製物である。
【００５１】
リポソームは、インビトロおよびインビボでの送達運搬体として有用な人工膜小胞である。サイズが約0.2〜約4.0μmの範囲である大型単層小胞(LUV)は、実質的な比率のDNA分子含有水性緩衝液を封入し得ることが示されている(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6：77 (1981))。哺乳動物細胞の他に、酵母細胞および細菌細胞におけるポリヌクレオチド送達のためにもリポソームが使用された。リポソームが効率的な導入運搬体となるためには、以下の特徴が存在すべきである：(1)高効率でDNA分子を封入するが、それらの生物活性を損なわないこと;(2)宿主生物の細胞に実質的に結合すること;(3)細胞の細胞質に小胞の水性内容物を高効率で送達すること;および(4)遺伝的情報を正確かつ効果的に発現すること(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Mannino et al., Biotechniques 6：682 (1988))。このようなLUV構造体の他に、様々なカチオン性脂質両親媒性物質を組み入れる多重層脂質調製物および小型の単層脂質調製物をアニオン性DNA分子と混合して、リポソームを形成させることもできる(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Felgner et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 84(21)： 7413 (1987))。
【００５２】
リポソームの組成は、通常、ステロイド、特にコレステロールと通常組み合わせた、リン脂質、特に相転移温度の高いリン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質もまた、使用され得る。リポソームの物理的特徴は、pH、イオン強度、および典型的には2価の陽イオンの存在に依存する。カチオン性脂質両親媒性物質：DNA製剤の適切な組成および調製は、当業者には公知であり、この情報を提供するいくつかの参考文献が入手可能である(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるBennett et al., J.Liposome Research 6(3)：545 (1996))。
【００５３】
リポソーム作製に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドなどのホスファチジル化合物が含まれる。脂質部分が14〜18個の炭素原子、特に16〜18個の炭素原子を含み、かつ飽和されているジアシルホスファチジルグリセロールが特に有用である。例示的なリン脂質には、卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。ポリヌクレオチド送達のための核脂質粒子の調製において有用なカチオン性両親媒性脂質の例には、1価の脂質N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N,-トリメチルアンモニウムメチルスルファート、N-[(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド、ならびにDC-コレステロール、多価脂質のLipofectAMINE(商標)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、Transfectam(登録商標)、および他の両親媒性ポリアミンが含まれる。これらの薬剤は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのようなヘルパー脂質と共に調製され得る。
【００５４】
リポソームのターゲティングは、解剖学的要因および機構的要因に基づいて分類することができる。解剖学的分類は、選択性のレベル、例えば器官特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性に基づいている。機構的ターゲティングは、受動的であるか、または能動的であるかに基づいて区別され得る。受動的ターゲティングは、洞様毛細血管を含む器官中の細網内皮系(RES)の細胞に分散するリポソームの天然の傾向を利用する。これに対して、能動的ターゲティングは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、もしくはタンパク質などの特異的リガンドにリポソームを結合させることによる、または天然に存在する局在化部位以外の器官および細胞型へのターゲティングを実現するためにリポソームの組成もしくはサイズを変更することによる、リポソームの改変を伴う。標的化送達系の表面は、様々な方法で修飾され得る。リポソームの標的化送達系の場合、リポソームの二重層と安定に結合した状態でターゲティングリガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層中に脂質基を組み入れることができる。様々な連結基が、これらの脂質鎖をターゲティングリガンドに結合させるために使用され得る。
【００５５】
DNA送達のためのさらなる代替方法は、生物への遺伝子構築物の急速放出または持続放出のいずれかを提供することができるポリマーマトリックスの使用である。いくつかのポリマーマトリックスが当技術分野において公知であり、かつ日常的技術の域を超えない技術を用いて最適化され得る。
【００５６】
遺伝子構築物は、患者細胞の形質転換がインビボで起こる、患者への直接投与、または前もって採取された患者細胞であって、治療対象の患者中にその後で再導入することができる患者細胞のエクスビボの形質転換のいずれかのために使用され得る。
【００５７】
インビボ形質転換のために遺伝子構築物を投与するための好ましい経路には、(i)患者の右心室または末梢脈中に遺伝子構築物を(感染性ベクターまたは送達運搬体内の成分のいずれかとして)投与する経路、および(ii)吸入によって、遺伝子構築物を(送達運搬体の成分として)投与する経路が含まれる。これらの経路のいずれも、肺組織の小動脈血管中への遺伝子構築物の送達を効果的に引き起こすと思われる。
【００５８】
エクスビボ形質転換を用いる場合、内皮前駆細胞または血管平滑筋前駆細胞を含む前駆幹細胞を患者から採取することが好ましい。採取(および任意で細胞集団を精製した)後、採取した前駆細胞を形質転換し、形質転換体を選択し、次いで形質転換された前駆細胞を患者の肺組織中に再導入する。形質転換細胞の再導入は、好ましくは、右心室投与または末梢静脈内投与によって実施される。内皮前駆細胞のエクスビボ形質転換は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Zhao et al., "Rescue of Monocrotaline- Induced Pulmonary Arterial Hypertension Using Bone Marrow- Derived Endothelial-Like Progenitor Cells：Efficacy of Combined Cell and eNOS Gene Therapy in Established Disease," Circ. Res. 96(4)：442-450 (2005)に記載されている。
【００５９】
一つの態様によれば、(肺組織中の動脈幹に付随する)小血管床の減少は、(i)TF活性もしくはTFを介した下流のシグナル伝達経路のインヒビターをコードする遺伝子構築物、または(ii)TF活性もしくはTFを介した下流のシグナル伝達経路のインヒビターを発現するトランスジェニック細胞のいずれかを提供することによって抑制することができる。遺伝子構築物は、肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中の血管細胞中に(インビボで)導入され得る。または、エクスビボのトランスジェニック血管細胞を、肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中の血管細胞中に導入することもできる。どちらの場合も、小血管床中の形質転換された血管細胞の存在が、治療剤の発現をもたらし、それによって小血管床中の血管細胞(内皮、血管、または両方)の減少を抑制する。
【００６０】
別の態様によれば、肺血管組織における新生内膜形成または叢状形成は、(i)TF活性もしくはTFを介した下流のシグナル伝達経路のインヒビターをコードする遺伝子構築物、または(ii)TF活性もしくはTFを介した下流のシグナル伝達経路のインヒビターを発現するトランスジェニック細胞のいずれかを提供することによって、予防(すなわち発症前に)または治療(すなわち発症後に)することができる。遺伝子構築物またはトランスジェニック血管細胞は、新生内膜病変もしくは叢状病変の発生前、または新生内膜病変もしくは叢状病変中のいずれかで、肺血管組織中に導入することができる。いずれの場合も、肺血管組織中の形質転換細胞の存在が、治療剤の発現をもたらし、それによって新生内膜病変形成もしくは叢状病変形成の進行を抑制し、または肺血管組織中の既存の新生内膜病変もしくは叢状病変のサイズを縮小する。
【００６１】
さらなる態様によれば、PAHは、(i)TF活性もしくはTFを介した下流のシグナル伝達経路のインヒビターをコードする遺伝子構築物、または(ii)TF活性もしくはTFを介した下流のシグナル伝達経路のインヒビターを発現するトランスジェニック細胞のいずれかをコードする遺伝子構築物を用いて治療することができる。遺伝子構築物またはトランスジェニック細胞は、肺血管組織中の小血管中に導入され得る。いずれの場合も、肺血管組織中の形質転換細胞の存在が、治療剤の発現をもたらし、それによって肺血管組織において叢状病変の程度を低減させ、もしくは小血管の新生内膜閉塞の程度を低減させ、またはその両方を低減させる。これは、効果的に血管容量を増大させ、それによって肺高血圧症を治療する。
【００６２】
実施例
以下の実施例は、本発明の態様を例示するために提供されるが、発明の範囲を限定することを決して意図しない。
【００６３】
材料および方法
ヒト対象：コロラド大学(University of Colorado)から予め入手した、肺移植(n=5)または剖検検査(n=5)を受けたPAH患者組織を利用し、かつ調査目的のために組織を使用するためのインフォームドコンセントを得た。肺血管疾患の徴候の無い未使用のドナー肺(n=6)は、対照としての機能を果たした。組織試料を得た患者の特徴を下記の表1に提供する。
【００６４】
（表1）患者の特徴
aIPAH,特発性肺動脈高血圧症(以前のPAH)
b随伴性肺動脈高血圧症
cCVA,脳血管発作
【００６５】
組織病理学：コロラド大学から得たパラフィン包埋ヒト肺組織をミクロトーム上で厚さ5μmの切片に切断した。ヒトおよびラットにおけるTF免疫組織化学では、大腸菌(Escherichia coli)中で発現させられたTF(可溶性TF、sTF)の細胞外ドメイン(第1〜218番残基)に対してウサギ中で産生させたポリクローナル抗ヒトTF抗体を使用した(その全体が参照により本明細書に組み入れられるMarmur et al., "Identification of Active Tissue Factor in Human Coronary Atheroma," Circulation 94(6)： 1226-32 (1996))。
【００６６】
ラット組織を10％中性ホルマリン中で固定、処理し、かつパラフィン包埋した。5μmの切片に切断し、脱パラフィンし、かつ段階的な濃度のアルコールによって再水和させた。3％過酸化水素中でクエンチした後、10mMクエン酸緩衝液、pH6中で、圧力鍋を用いてスライドを抗原賦活処理した。これらのスライドを適切な血清(Vector Laboratories, Burlingame, CA) 中でブロックし、かつ1次抗体を4℃で一晩適用した。ビオチン化2次抗体(Vector Laboratories, Burlingame, CA)、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Jackson Immuno Research, West Grove, PA)、および顕色剤としてのNova Red(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を用いて免疫検出を実施した。次いで、これらのスライドをヘマトキシリン中で対比染色した。適切な陽性対照を各染色に対して使用し、かつ陰性対照のために1次抗体を除外した。
【００６７】
動物：すべての動物試験は、任意の動物実験を開始する前に、ロチェスター大学(University of Rochester)のIACUCによって承認された。200〜250gの間の体重の雄のスプラーグドーリーラットを剪毛し、次いでケタミンおよびキシラジン(0.9％生理食塩水中ケタミン70mg/kgおよびキシラジン50mg/kgを腹腔内送達)で麻酔後、18Gの血管カテーテルを用いて気管内挿管した。24時間の術後鎮痛を提供するために、実験の開始時にフルニキシンを0.1mg/kgの量で皮下投与した。動物に10〜12cc/kg(Harvard Apparatus)で人工呼吸をし(呼吸数70〜90、動物をモニターしながら、自発的な呼吸活動をさせないように調整)、かつ左胸部をベタジン洗浄剤を用いて前処理した。第4または第5肋間腔を確認し、かつ人工呼吸が一時的に中断される間の肺損傷を回避するように注意しながら、切開を実施した。開胸器を用いて胸腔を露出させ、かつ肺を穏やかに持ち上げて肺門構造を露出させた。近位に2つのリガクリップ(Ektacon LS200, Johnson & Johnson)を適用した後、遠位の肺門構造の位置で左肺を切断した。末端および側面に開けられた穴を有するポリエチレンチューブを第6肋間腔を通して挿入し、左肺が元々あった胸腔中に留置した。2本の吸収性縫合糸を用いて肋骨を接近させ、次いで付加的な縫合層によって筋肉および皮下組織を接近させた。胸部造瘻チューブを除去するときに自然に穴が閉じるように、胸部造瘻チューブを組織で慎重に密封するように注意を払った。密封されたら、出来るだけ早い時期に(時には皮下組織が閉じる前に)チューブに吸引を適用した。Antisedan(Orion)を0.2mg/kg筋肉内投与し、かつ9mmのAutoclips(Stoelting)で皮膚を閉じた。人工呼吸器を動物から取り外し、かつ胸部造瘻チューブに吸引を適用している間、自発的呼吸をモニターした。気管内チューブおよび胸部造瘻チューブが除去される前は、ラットは、呼吸するのにかなりの努力を払い、かつテーブル上で起き上がり始める必要があった。ケージに入れる前に、温熱パッド上で3〜4時間、動物を観察した。通常、24時間の周術期間中に30〜40％の死亡率が生じた。偽外科手術の場合、胸壁を切開した。十分に注意しながら、人工呼吸器を停止し、鉗子で胸部を傾け(listed)、第4肋間腔または第5肋間腔中に小さな切開部を作った。肺損傷の徴候が何かあれば、その事例は肺切除術に転用した。より小型のポリエチレンチューブを同じ穴を通して挿入し、肺と胸壁の間に留置した。適宜、1本または2本の縫合糸を用いて肋骨を接近させた。手順の残りの部分は、同一であった。胸部を閉じた後、ただし鎮静を解除する前に、数分間動物に人工呼吸を施して、麻酔下の合計時間が肺切除術の事例とほぼ同じとなるようにした。
【００６８】
1週間後、皮下注射剤としてMCT(DMSO中に溶解、60mg/ml)を動物に与えた(溶媒群の動物は、同体積のDMSOのみで処置した)。これらをモニターし、かつ28日間、通常の固形飼料および水を与えた(図2を作製するために利用した動物群において、肺切除術およびMCTで最初に処置した動物のうち2匹は、18日目および23日目に自然発生的に死亡し、残りの動物4匹は24日目に屠殺した)。
【００６９】
MCT処置後5日目および10日目、ならびにその後、疾患が進行するに従ってより頻繁に、運動能力をモニターした。走らなくなると軽い電気ショックで刺激を与えるトレッドミル(Columbus Instruments)上にラットを置いた。各試験は、16分間続いた：10m/分で2分、15m/分で4分、20m/分で5分、および25m/分で5分。最大走行距離は、305mであった。この手順は、地域のIACUCによって具体的に承認されている。
【００７０】
外科手術の前に、ラットは、最初のオリエンテーションおよびその後の2種の本格的なトレーニングセッションを受けた;これは、ベースライン時の動物間のばらつきを最小化するのに役立った。最初に、最大値の70％のグリッド強度および2Hzの周波数を使用した。刺激グリッドを回避するように動物を訓練し、かつこの段階で、10秒間動物に刺激を与えた後、グリッドのスイッチを切った。動物がトレッドミル上で遅れた場合、または動物が刺激グリッド上に座った場合には、ブラシを用いて、走り続けるように促した。MCTまたは溶媒の注射後10日目に、刺激用のプロトコールを変更した。この時点までに、一部のラットは臨床的に有意な疾患を発症した。さらに、ラットにトレッドミルを5回経験させ、刺激グリットを十分に嫌悪させて、それらの嫌悪を判定する際に刺激の強度はもはやそれほど重要ではないようにした。目標は最大下の労作(具体的には疲はいではない)であるため、動物が疲れた場合には、動物が運動よりも刺激を選択するように促した。動物は、最初の3分間、普通の刺激を受けた。3分の時点で、刺激グリッドの強度を最大強度の25％に下げ、かつ5秒間ラットに刺激を与えた後、グリッドのスイッチを切った。7分の時点では、グリッドのスイッチを切る前に、3秒間しかラットに刺激を与える必要が無かった。
【００７１】
屠殺時、ケタミンおよびキシラジン(ケタミン80mg/kgおよびキシラジン30mg/kgを腹腔内投与)でラットを麻酔した。腹部、胸部、および頚部全体を剪毛した。経皮的気管開口術を速やかに実施し、かつ動物に仰臥位で人工呼吸を施した。胸郭を腋窩中央切開し、肺実質に対する損傷を回避するよう注意しながら、一つの単位として前胸郭全体を持ち上げた。1本の6-0シルク縫合糸を左心室を通して慎重に配置して心臓にいくらかの張力を与え、かつ21Gの針を用いて、右心室の流出路に近い右心室壁を突き刺した。液体で満たされたカテーテルを同じ穴の中に直ちに挿入し、かつMacintoshコンピューターに連結されたPower Lab装置で圧力測定を実施した。アナログ信号を100Hzでデジタル化し、かつ10〜60秒間の再現性心周期を記録した。次いで、主肺動脈中にカテーテルを進めた後、さらに測定を実施した。
【００７２】
左心房を切断し、かつ主肺動脈を介してリン酸緩衝化生理食塩水で肺を灌流した。一部の動物において、以前に説明されているように(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Zhao et al., "Rescue of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension Using Bone Marrow-Derived Endothelial-Like Progenitor Cells： Efficacy of Combined Cell and eNOS Gene Therapy in Established Disease," Circ. Res. 96(4)：442-450 (2005))、0.2ミクロンのフルオレセインマイクロスフェア(Molecular Probes, Eugene, Oregon)を1％低融点アガロース中に懸濁させ、かつ生理食塩水による洗浄後、注入した。次いで、均一な膨張を提供するために20cmカラムを用いて、4％パラホルムアルデヒドで肺を膨張固定した。心臓を取り出し、心腔を計量した。パラホルムアルデヒド処理の48〜72時間後に、肺を70％エタノールに移した。さらに24時間後、右下葉組織をブロック状に切断し、かつパラフィン包埋した。
【００７３】
VEGF-R2(flk-1)抗体をSanta Cruzから購入し、vWF抗体をDakoから購入した。
【００７４】
統計学的解析：血行動態データをMacLabソフトウェアを用いて解析して、図2に示す要約データを得た。代表的な自動記録装置の記録(少なくとも4回の心周期)を強調表示した;次いで、コンピューターのソフトウェアにより、不偏平均値およびピーク圧力を生成した。αレベル0.05での分散分析によって、4種の群(偽手術＋溶媒、偽手術＋MCT、肺切除術+溶媒、肺切除術+MCT)を最初に比較した。これらの群が異なっていた場合には、多重比較用のボンフェローニ補正(Unistat Light, London, England)を用いて群間比較を実施した。同じ統計解析を下記の表2に示す心臓重量データに対して実施した。
【００７５】
（表2）肺切除ラットへのMCT投与後に、重度の右心室肥厚が観察された
【００７６】
重度PAHにおいて中隔は右心室(RV)の機能的部分となるため、(RV＋中隔)重量/左心室重量としてRV肥厚を算出した。RV肥厚は、偽処置の後にモノクロタリンを与えられた動物において発生したが、右心室肥厚の程度は、肺切除術後にモノクロタリンを与えられた動物においてはるかに大きかった(**p<0.03、一元配置分散分析(one way ANOVA)とそれに続く、ボンフェローニ補正を用いた2群間の事後検定)。
【００７７】
実施例1：重度PAHおよび叢状様病変は、肺切除ラットへのMCT投与後に発生する
若年ラット(200g、約6週齢)を左肺切除術または偽手術に供した。1週間後、1回量のMCT(60mg/kg、皮下)または溶媒を注射した。より高齢のラットを用いた最初の報告では、MCT投与後28日目に屠殺した動物から得られるデータを示していた(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 151(4)：1019-25 (1997); Faul et al., "Triptolide Attenuates Pulmonary Arterial Hypertension and Neointimal Formation in Rats," Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162(6)：2252-8 (2000))。28日間の実験を計画したが、肺切除術+MCT群において24日目より前に2件の自然発生的死亡が起こったため、肺切除術+MCTで処置した残りのラットを、当初計画したよりも早く24日目に屠殺した。図1は、これらのラット(n=3)の平均PA圧力が、偽手術の後にMCTで処置したラット(n=8;p<0.03)と比べて、よりひどく上昇していたことを示す。興味深いことに、肺切除術+溶媒の処置は、偽手術および溶媒で処置された動物(n=6)と比べて、平均PA圧力に影響を及ぼさなかった(n=6)。重度のPAHにおいて中隔は右心室(RV)の機能的部分となるため、(RV＋中隔)重量/左心室重量としてRV肥厚を算出した。表2は、RV肥厚が平均PA圧力の増加に伴って起こったことを実証する。RV肥厚は、偽手術+MCT(p<0.03)と比べて、肺切除術+MCTで処置した動物において増大していた。
【００７８】
MCTまたは溶媒を注射する前の「0日」目に3回、かつその後、残りの17日間の全体を通して定期的に、運動能力を評価した。訓練された後の試験の成績は、一貫性が高かった。肺切除術/MCTラットは、MCT後10日目に運動能力を失い始め、17日目までに、ほぼすべての肺切除術/MCTラットは、16分のプロトコールを完了することができなくなった。一方、肺切除術/溶媒群および偽手術/MCT群のラットは、一貫して運動プロトコールを完了した。肺切除術/MCT群で運動ができなくなり、かつ早期の死亡が起こったため、17日後に実験を終了した。これらのデータは、トレッドミル試験がPAHの発症に高感度であり、かつPAHを軽減するように設計された治療処置の有効性を追跡するための非侵襲性の道具となることを示唆する。
【００７９】
肺胞上皮は、偽手術または肺切除術後にMCTで傷害された動物において比較的よく維持されていた(図2Aおよび図3Aを参照されたい)。両方の群が、重度の中膜肥厚を示した(図2B)。以前に報告されているように(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 151(4)：1019-25 (1997); Faul et al., "Triptolide Attenuates Pulmonary Arterial Hypertension and Neointimal Formation in Rats," Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162(6)：2252-8 (2000))、より小さな細動脈が、肺切除術およびMCTで処置された動物において頻繁に閉塞していた(図2C)。これは、偽手術+MCT動物では認められなかった。この研究における示差的な調査結果は、高頻度の血管周囲の増殖性病変であり(図2D、2E、および図3を参照されたい)、これらはPAHヒト患者から得られる病変に著しく類似しているようであった(図2Dおよび2Eを図4Dおよび4Eと比較されたい)。したがって、これらの病変を、「叢状様」と呼ぶ。
【００８０】
これらの叢状様病変の起源を決定するために、安楽死時にフルオレセイン微粒子を含む溶液で主肺動脈を洗浄した(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Zhao et al., "Rescue of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension Using Bone Marrow-Derived Endothelial-Like Progenitor Cells： Efficacy of Combined Cell and eNOS Gene Therapy in Established Disease," Circ.Res. 96(4)：442-450 (2005); Han et al., "Defective Lung Vascular Development and Fatal Respiratory Distress in Endothelial NO Synthase-Deficient Mice： a Model of Alveolar Capillary Dysplasia?" Circ. Res. 94(8)： 1115-23 (2004))。図3に示すように、これらの微粒子は、叢状様病変の空隙内の小さな黄色の粒子として認められる。これは、これらの病変が、主肺動脈と通じている血管構造体を含むことを示唆する。ヒト由来の叢状様病変は、内皮細胞用のマーカー(フォンウィレブランド因子、vWF)および血管平滑筋用のマーカー(平滑筋α-アクチン、SMA)の双方で染色される(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Cool et al., "Three-Dimensional Reconstruction of Pulmonary Arteries in Plexiform Pulmonary Hypertension Using Cell-Specific Markers. Evidence for a Dynamic and Heterogeneous Process of Pulmonary Endothelial Cell Growth," Am. J. Pathol. 155(2)：411-9 (1999))。ラット由来の叢状様病変における細胞表現型をより上手く特徴付けるために、血管内皮増殖因子受容体-2(VEGF-R2)およびvWFに対する抗体を用いて、連続切片において免疫染色を実施した。ラットの叢状様病変は、血管路に沿って並ぶvWF発現細胞を含んでいた(図3C)のに対し、VEGF-R2に対して染色を示している未成熟な内皮細胞は、より均一に分布していた(図3D)。この染色パターンは、ヒト叢状病変に関して報告されたものに類似している(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Cool et al., "Three-Dimensional Reconstruction of Pulmonary Arteries in Plexiform Pulmonary Hypertension Using Cell-Specific Markers. Evidence for a Dynamic and Heterogeneous Process of Pulmonary Endothelial Cell Growth," Am. J. Pathol. 155(2)：411-9 (1999))。したがって、このモデルは、ヒト特発性PAHにおいて認められる病理学的特徴のうちの多くを再現する。
【００８１】
実施例2：組織因子は、肺切除術およびMCTで処置されたラットの血管および叢状様病変において誘導される
組織因子(TF)は、凝固カスケードを開始し、かつ発生および腫瘍増殖の双方において血管新生も促進し得る膜貫通型糖タンパク質である(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Mackman, "Regulation of the Tissue Factor Gene," Thromb.Haemost. 78(1)：747-54 (1997); Bachli, "History of Tissue Factor," Brit. J. Haematol. 110(2)：248-55 (2000); Riewald et al., "Orchestration of Coagulation Protease Signaling by Tissue Factor," Trends Cardiovasc. Med. 12(4)： 149-54 (2002))。PAHは、血栓性素因が認識される疾患であるため、TFタンパク質の可溶性部分に対して産生させたポリクローナル抗体で肺組織を染色した。肺切除術とそれに続く溶媒処置を受けたラットは、正常なPA圧力を有し(図1)、中膜のTF染色はほとんどなかった(図2A)。一方、肺切除術の後にMCTに供された若年ラットは、肥大した血管壁(図2B)中、およびほぼ閉塞した血管(図2C)中に著しいTF染色を示した。TF染色は、叢状様病変の全体の血管細胞中で強かった(図2Dおよび2E)。
【００８２】
実施例3：組織因子抗原は、PAH患者の叢状病変中で著しく増加している
TFと叢状様病変の関連が認められることの妥当性を確認するために、ヒト疾患におけるTFの存在を、移植を受けているPAH患者から得た肺組織(n=5)または剖検での肺組織(n=5)を用いて評価した。正常ヒト組織は、組織自体(n=6)とは関係の無い技術上の理由によって肺が移植用に使用されない場合に得た。患者は、コロラド大学肺高血圧症センター(University of Colorado Pulmonary Hypertension Cente)で追跡した;関連する臨床データは上記の表1に記載されている。この群は、特発性疾患の患者、および強皮症、食欲抑制薬、またはHIVに関連したPAH患者を含む。正常患者の血管中膜中には、組織因子(TF)はほとんど全く認められなかったが、内皮の弱い染色が時折示された(図1A);一方、PAH患者は、比較的初期の異常を伴う血管中でさえ、中膜の顕著なTF染色を示した(図1B)。TF染色は、典型的な同心円状増殖によって閉塞された血管において強く(図1C)、大半の叢状病変において特に濃かった(図1Dおよび1E)。すべての患者は、現代の手法を踏まえてワルファリン抗凝固薬を与えられたことに留意すべきである(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Humbert et al., "Treatment of Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(14)： 1425-36 (2004); Rich et al., "The Effect of High Doses of Calcium-Channel Blockers on Survival in Primary Pulmonary Hypertension," New Engl. J. Med. 327(2)：76-81 (1992))。
【００８３】
実施例1〜3の考察
これは、同心円状の管腔閉塞および叢状病変、すなわちヒト疾患の2つの重要な組織学的特徴を有する実験用PAHモデルの最初の報告である。肺切除術後1週間目にMCTに供した若年ラットは、以前に報告されているように(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," A m. J. Pathol. 151(4)：1019-25 (1997))、偽手術の後にMCTで処置されたラットよりはるかに程度の高い肺高血圧症およびRV肥厚を発症した。これらのラットは、以前の報告におけるラットより早期に死亡したことから、叢状様病変が、より重症な表現型の一部分であると考えられている。
【００８４】
肺切除術後1週間目のMCT投与は、他の著者らによるラットにおいてPAHを模擬するために他の著者らによって使用されていた(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 151(4)： 1019-25 (1997); Nishimura et al., "Simvastatin Rescues Rats from Fatal Pulmonary Hypertension by Inducing Apoptosis of Neointimal Smooth Muscle Cells," Circulation 108(13)： 1640-5 (2003))。しかしながら、これら以前の研究は、350〜400g(約12週齢)の動物の使用を含み、かつラットはMCT処置の後に叢状病変を提示しなかった。一方、本研究は、より若年の動物(200g、6週齢)の選択を含み、かつヒトPAH疾患において発見されるものに著しく類似した血管病理の観察結果は、予想外であり劇的であった。ラットは、(対側肺切除術後の)肺増殖に対して優れた能力を有し、これは25年超前から認識されている(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Brody, "Time Course of and Stimuli to Compensatory Growth of the Lung after Pneumonectomy," J. Clin. Invest. 56(4)： 897-904 (1975))。より若年のラットの方が、内皮傷害(MCT)および肺切除術の組み合わされた刺激に応答した血管細胞増殖を示す傾向が高い。上記に示した結果を前提とすると、本明細書において説明するラットモデルは、ヒト疾患に特徴的な血管細胞増殖の根拠を成すメカニズムを研究するために適切な道具であると考えられる(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Tuder et al., "Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am.J. Pathol. 144(2)：275- 85 (1994); Cool et al., "Three-Dimensional Reconstruction of Pulmonary Arteries in Plexiform Pulmonary Hypertension Using Cell-Specific Markers. Evidence for a Dynamic and Heterogeneous Process of Pulmonary Endothelial Cell Growth," Am. J. Pathol. 155(2)：411-9 (1999); Tuder et al., "Expression of Angiogenesis-Related Molecules in Plexiform Lesions in Severe Pulmonary Hypertension： Evidence for a Process of Disordered Angiogenesis," J. Pathol. 195(3)：367-74 (2001); Tuder et al., Monoclonal Endothelial Cells in Appetite Suppressant-Associated Pulmonary Hypertension," Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158(6)： 1999-2001 (1998))。
【００８５】
Coolらは、未成熟な内皮細胞(または造血系統に由来するもの)を、より成熟した内皮表現型を有するものから識別するために、2種の内皮抗原(vWFおよびVEGF-R2)を使用した(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Cool et al., "Three- Dimensional Reconstruction of Pulmonary Arteries in Plexiform Pulmonary Hypertension Using Cell-Specific Markers. Evidence for a Dynamic and Heterogeneous Process of Pulmonary Endothelial Cell Growth," Am. J. Pathol. 155(2)：411-9 (1999))。この報告では、VEGF-R2で染色された未成熟な内皮細胞がヒト叢状病変の全体にわたって存在したのに対し、vWFを発現している成熟内皮細胞は、血管腔の管腔に沿って並んでいるのが認められただけであった。図3に提示したデータにより、これらの病変のうちの一部が大量の内皮細胞を有していることが示唆され、かつ内皮細胞染色のパターンにより、未成熟な内皮細胞および成熟内皮細胞が、ヒト疾患と同様に存在していることが示唆される。Coolら(上記)によって報告されたヒト剖検データにより、これらの病変が、同心円状の管腔閉塞に先行する病理の有効な要素である可能性が示唆される。この報告において、叢状病変は分岐点で現れ、かつ抗原発現のパターンにより、最も活発に増殖する細胞が、せん断応力の高い領域に存在することが示唆された。3次元再構築により、叢状病変中で活発に分裂している細胞が、最終的に「燃え尽きて(burned out)」、分岐点のすぐ近くの同心円状の「オニオンスキン」病変によって管腔を閉塞させることが示された。したがって、本明細書において説明する若年ラットモデルは、叢状病変が、同心円状の管腔閉塞を招く病理の重要な要素であることの確認を可能にするはずである。
【００８６】
上記のデータはまた、ヒトにおいて回答するのが以前は困難であった、叢状病変に関する別の疑問も検討している。強いVEGF抗原染色およびVEGFメッセージを有する内皮細胞の存在に刺激されて、数名の研究者は、叢状病変は混乱した血管新生の一形態であると提唱した(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Tuder et al., "Expression of Angiogenesis-Related Molecules in Plexiform Lesions in Severe Pulmonary Hypertension： Evidence for a Process of Disordered Angiogenesis," J. Pathol. 195(3)：367-74 (2001))。この提唱には、これらの叢状病変が肺動脈循環に連結されているという仮説が、暗に含まれている。ヒトでは、この仮説を直接検証することが不可能であったが、造影CTおよびMRIの解像度の最近の進歩により、生存患者における病変の直接的可視化が容易になる可能性がある。それでもなお、若年げっ歯動物モデルにおいて、血管に見える構造体は、屠殺時に主肺動脈を介して送達されたマイクロスフェアを含んでいる(図3)。これは、これらの構造体が肺循環に連結されていること、およびそれらが、以前に仮説を立てられたように混乱した血管新生を示すことの証拠を提供する。
【００８７】
PAHに罹患した患者およびラットにおいてTF発現が増大したという調査結果は、20年超前の剖検研究において最初に観察されたインサイチューの血栓症に対する説明を連想させる(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Fuster et al., Primary Pulmonary Hypertension： Natural History and the Importance of Thrombosis," Circulation 70(4)：580-7 (1984))。大部分は臨床的なデータのその最初の報告では、すべての患者が剖検されたわけではなかった。しかしながら、臨床的基準に基づくと、これらの患者は、原発性肺高血圧症(現在は特発性PAHと呼ばれている)に罹患しており、さらにインサイチューの血栓症が、実施された剖検における主要な調査結果であった。第2の一連の剖検では、初期のNHLBI Primary Pulmonary Hypertension Registryの患者58名から得た標本が検査された(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Pietra et al., "Histopathology of Primary Pulmonary Hypertension. A Qualitative and Quantitative Study of Pulmonary Blood Vessels from 58 Patients in the National Heart, Lung, and Blood Institute, Primary Pulmonary Hypertension Registry," Circulation 80(5)： 1198-206 (1989))。この注意深く選択された特発性疾患患者の群において、患者19名が血栓性病変を有していた。再疎通された血栓が、叢状病変を有する患者25名中9名で観察され(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Pietra et al., "Histopathology of Primary Pulmonary Hypertension. A Qualitative and Quantitative Study of Pulmonary Blood Vessels from 58 Patients in the National Heart, Lung, and Blood Institute, Primary Pulmonary Hypertension Registry," Circulation 80(5)： 1198- 206 (1989))、インサイチューの血栓症および叢状病変が、特発性疾患に罹患している一部の患者において共存していることが実証された。
【００８８】
2つの異なる観察データのセットにより、ワルファリンによる抗凝血が有益であり得ることが示唆されたため(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Kawut et al., "New Predictors of Outcome in Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension," Am. J. Cardiol. 95(2)： 199- 203 (2005); Rich et al., "The Effect of High Doses of Calcium-Channel Blockers on Survival in Primary Pulmonary Hypertension," New Engl. J. Med. 327(2)：76-81 (1992))、臨床的データもまた、PAHが血栓性素因を有する疾患であるという見解を裏付けている。1つ目は、Richらによって報告された(前掲)、1990年代初期に実施された高用量のカルシウムチャネル遮断薬のプロスペクティブな観察的試験における死亡決定因子の検査であった。ワルファリンを与えられたすべての患者が肺スキャンを受け、「非均一な」肺血流が示唆されたが、肺塞栓症を診断するための臨床的基準を満たしたものは一人もいなかった。ワルファリン使用は、5年目の死亡率の低下と関連付けられた。プロスタノイド療法は、血小板凝集、および内皮活性化に関する血清の役割を減少させる(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Friedman et al., "Continuous Infusion of Prostacyclin Normalizes Plasma Markers of Endothelial Cell Injury and Platelet Aggregation in Primary Pulmonary Hypertension," Circulation 96(9)：2782-4 (1997))ため、したがって、プロスタサイクリンの時代には、ワルファリンにはそれほどの利益が期待されなかった可能性がある。しかしながら、Kawutによる一番最近の報告(前掲)では、Columbia Presbyterian (1994〜2002)から連続的に得た患者における生存状況を観察し、かつプロスタサイクリンのような進歩した療法で治療される患者を含んだ。Kawutらは、患者をワルファリンでも処置した場合の生存利益をやはり認めた。
【００８９】
TFは、通常、動脈壁の内膜および中膜中に非常に低いレベルで存在している。動脈管腔表面でTF発現が増大すると、PAHにおいて一般に認められるインサイチューの血栓症に罹患しやすくなると思われる。したがって、重度のPAHに罹患しているラットおよびヒトの動脈壁においてTF発現が増大しているという調査結果(上記の実施例2〜3を参照されたい)は、PAHにおいて認められる血栓性素因に対する解釈を示唆する。
【００９０】
TFの増加は、PAHの病因において他の役割を果たしている可能性がある。TFの活性化により、Xa因子およびトロンビンが生成し、これらはどちらも、プロテアーゼ活性化受容体(PAR)ファミリーのメンバーを介して血管内皮細胞(EC)および平滑筋細胞(SMC)における細胞内シグナル伝達を調節する(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Riewald et al., Orchestration of Coagulation Protease Signaling by Tissue Factor," Trends Cardiovasc.Med. 12(4)：149-54 (2002); Coughlin, "Protease-Activated Receptors in Vascular Biology," Thromb. Haemost. 86(1)：298-307 (2001))。トロンビンは、そのGタンパク質共役型PAR受容体との相互作用を介して、内皮の透過性を増大させ、かつSMCの遊走および増殖を促進する(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Patterson et al., "New Tricks for Old Dogs： Nonthrombotic Effects of Thrombin in Vessel Wall Biology," Circ. Res. 88(10)：987-97 (2001))。PAR活性化はまた、接着分子発現も媒介し、したがって炎症細胞動員に影響を及ぼす(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Rahman et al., "Protein Kinase C-Delta Regulates Thrombin-Induced ICAM-1 Gene Expression in Endothelial Cells via Activation of p38 Mitogen-Activated Protein Kinase," Mol. Cell Biol. 21(16)：5554-65 (2001); Rahman et al., "G-alpha(q) and G-betagamma Regulate PAR-1 Signaling of Thrombin-Induced NF-KappaB Activation and ICAM-1 Transcription in Endothelial Cells," Circ. Res. 91(5)：398-405 (2002))。大動脈に由来するSMCおよびECにおいて、TF発現は、剪断、ひずみ、低酸素、増殖因子(VEGF)、およびケモカインMCP-1に対して感受性である(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Schecter et al., "Tissue Factor is Induced by Monocyte Chemoattractant Protein-1 in Human Aortic Smooth Muscle and THP-1 Cells," J. Biol. Chem. 272(45)：28568-73 (1997); Yan et al., "Protein Kinase C-Beta and Oxygen Deprivation. A Novel Egr-1-Dependent Pathway for Fibrin Deposition in Hypoxemic Vasculature," J. Biol. Chem. 275(16)：11921-8 (2000); Lin et al., "Shear Stress Induction of the Tissue Factor Gene," J. Clin. Invest. 99(4)：737-44 (1997); Silverman et al., "Tissue Factor Expression is Differentially Modulated by Cyclic Mechanical Strain in Various Human Endothelial Cells," Blood Coagul. Fibrinolysis 7(3)：281-8 (1996))。これらの因子はPHの病因に関与していると考えられるため、TF発現の増大は、PAHにおける血管リモデリングを促進すると既に考えられているいくつかのシグナルの下流のメディエータである可能性がある。
【００９１】
TFインヒビターは、全身循環の血管に対する実験的傷害後の内膜過形成を著しく減弱させる：ラットにおいて頚動脈傷害後に組換え組織因子経路インヒビター(TFPI)を全身注入すると、28日目に測定した新生内膜形成は低減していた(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Han et al., "Structural Requirements for TFPI-Mediated Inhibition of Neointimal Thickening After Balloon Injury in the Rat," Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19(10)：2563-7 (1999))。TFPIの局所的な遺伝子導入により、バルーン傷害後のウサギの頚動脈における新生内膜形成が低減した(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Zoldhelyi et al., "Local Gene Transfer of Tissue Factor Pathway Inhibitor Regulates Intimal Hyperplasia in Atherosclerotic Arteries," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(7)：4078-83 (2001))。冠動脈形成術とそれに続く長期のTFPI注入を受けたブタの28日時点の新生内膜形成は著しく少なかった(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Roque et al., "Inhibition of Tissue Factor Reduces Thrombus Formation and Intimal Hyperplasia After Porcine Coronary Angioplasty," J. Amer. Coll. Cardiol. 36(7)：2303-10 (2000))。最後に、ミニ遺伝子上のヒトTFを低レベルで発現するホモ接合性ノックアウトマウスの致死的表現型をレスキューすることによって、TF欠損マウスが作製された。野生型同腹子と比較すると、大腿動脈をワイヤー傷害した後の新生内膜形成は、TF欠損マウスにおいて著しく低減していた。重要なことには、このモデルは野生型動物においてでさえ、ほとんど血栓症を示さず、したがって、TFの凝血促進効果の減少は、新生内膜の変化を説明するものではなさそうである(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Pyo et al., "Mice Deficient in Tissue Factor Demonstrate Attenuated Intimal Hyperplasia in Response to Vascular Injury and Decreased Smooth Muscle Cell Migration," Thromb.Haemost. 92(3)：451-8 (2004))。TF欠損モデルにおける新生内膜形成の変化は、トロンビンまたはXa因子によって媒介されるTFの下流シグナル伝達作用に起因したという仮説が立てられた。
【００９２】
TF活性は血管新生に関係があるとされているため、増大したTF活性は、叢状病変において認められる混乱した血管新生および細胞増殖(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Mackman, "Role of Tissue Factor in Hemostasis, Thrombosis, and Vascular Development," Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24(6)： 1015-22 (2004))ならびに全身循環に対する傷害後の細胞増殖(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Pyo et al., "Mice Deficient in Tissue Factor Demonstrate Attenuated Intimal Hyperplasia in Response to Vascular Injury and Decreased Smooth Muscle Cell Migration," Thromb. Haemost. 92(3)：451-8 (2004))を媒介する可能性がある。
【００９３】
要約すると、上記の実施例は、重度の血行動態変化、新生内膜形成、および叢状様病変を有するPAHのラットモデルを示す。これらの病変は、ヒト叢状病変に類似したパターンの内皮の抗原染色を示し、かつそれらは主肺動脈に連結している。これらのラットの叢状様病変および血管において強いTF染色が存在した。このラットモデルにより、重度PAHにおいて叢状病変およびそれらの原因となる関係を生じさせるシグナル伝達の調査が可能になると考えられる。最終的に、このモデルは、新規な治療戦略が病変を予防する能力、またはさらに、確立された叢状病変の退縮を引き起こす能力を試験するための手段を提供する。
【００９４】
実施例4：ラットモデルにおいてPAHを治療するための組織因子経路インヒビターの投与
Ixolaris(IXO)は、吸血性(hemophagic)マダニ(ixodid tick)のイキソデス・スカプラリス(Ixodes scapularis)の唾液から単離されたTFPI模倣体である(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Lai et al., "A Thrombin Inhibitor from the Ixodid Tick, Amblyomma hebraeum," Gene 342(2)：243-249 (2004))。このタンパク質は、国立アレルギー感染症研究所(National Institutes of Allergy and Infectious Disease)のIvo Francischetti博士によってクローニングされ、かつバキュロウイルス系において組換えによって大量に作製された。本明細書において説明する研究用の試薬は彼によって提供された。TFPI模倣体として、IXOは、近位(すなわちXa因子の生成)で作用して、TF活性を妨害する。
【００９５】
MCT後5日目に開始し、かつ8日間継続して、IXO(毎日40μg/kgを皮下投与)で肺切除術/MCTラット3匹を処置した。対照と比較すると、これらのラットは運動能力において実質的な改善を示し(図5)、かつこれらのうち1匹も、早期の死亡を予測する成績である7分の閾値を下回らなかった。21日目に屠殺した1匹のIXO処置ラットは、現在使用されている経口的PAH療法の主力薬であるボセンタン(毎日100mg/kg)で見出された結果と同様、PA圧力の中等度の上昇しか示さなかった(図6)。組織像は著しく改善していた(図7)：叢状病変は無く、管腔の狭小化は低減し、かつ閉塞した血管は稀であった。これは、同様に分析したどの肺切除術/MCTラットとも異なっていた。他の2匹のIXO処置ラットは、20日目にそれらが死亡したため、評価することができなかった。この死亡は、それらの運動成績および17日目に7分より長く走行できるラットにおいて自発的死亡は稀にしか観察されないという事実を考慮すれば、非常に驚くべきことであった。これは、それらの死亡が、頭蓋内出血などIXO毒性に起因した可能性があることを示唆する。または、IXO処置を13日目に中止したため、疾患の再燃および死亡が起こった可能性もある。
【００９６】
この実験は、IXOの有効性対毒性を評価するために、より長期のIXO投与および変更した投薬量を用いて反復される。
【００９７】
実施例5：ラットモデルにおいてPAHを治療するためのモノクローナル抗体の投与
結合してTF活性を妨害するもの、および結合するがTF活性を妨害しないもの(対照)を含む、Daniel Kirchhofer博士によって提供された1組の種特異的モノクローナル抗体(Genentech)を、前述のラットPAHモデルにおいて試験する。表面プラズモン共鳴結合実験において、6H4モノクローナル抗体が、約1nMのKDで結合するのに対し、5A4モノクローナル抗体が、約100pMのKD値を有することが実証された。VIIa/TF複合体の酵素活性を測定するためのインビトロ実験により、6H4のIC50が用量5μg/mlであるのに対し、5A4の方が効力が弱く、IC50は40μg/mlであることが実証された。さらに、両方の抗体が(10mg/kgで)、尾部出血後の失血に対して同様かつ著しい効果を有した(一次的失血および二次的失血を合わせた量が90μlから600μlに増加した)。
【００９８】
これらのモノクローナル抗体を個別にラットPAHモデルに投与する。これは、MCT後5日目に開始し、かつ数日間のうちの1日に終了する(すなわち、9日目、13日目、17日目、21日目など)。PA圧力をすべてのラットにおいてモニターし、肺切除術後28日目にこれらのラットを屠殺する。PAHの組織学的証拠を得るために肺組織試料を検査する。6H4モノクローナル抗体および5A4モノクローナル抗体の一方または両方が、TFを阻害し、かつPAH症状および組織学的混乱を改善することが予想される。
【００９９】
実施例6：PAHラットモデルへの形質転換細胞の投与としての、TFPIを発現する内皮前駆細胞のエクスビボの形質転換
その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Zhao et al."Rescue of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension Using Bone Marrow-Derived Endothelial-Like Progenitor Cells： Efficacy of Combined Cell and eNOS Gene Therapy in Established Disease," Circ.Res. 96(4)：442-450 (2005)において報告されている手順を用いて、内皮前駆細胞を単離し、かつトランスフェクトする。エクスビボでトランスフェクトした細胞を、末梢静脈内経路を介して、または右心室カテーテル法によって、ラットPAHモデルに投与する。細胞の導入は、MCT後5日目に開始し、かつ数日間のうちの1日に終了する(すなわち、MCT後9日目、13日目、17日目、21日目など)。前述したように、運動能力を測定する。PA圧力をすべてのラットにおいてモニターし、肺切除術後28日目にこれらのラットを屠殺する。PAHの組織学的証拠を得るために肺組織試料を検査する。エクスビボの形質転換により、TFが阻害され、かつPAH症状および組織学的混乱が改善することが予想される。
【０１００】
本発明を例示するために詳細に説明したが、このような詳細は単にその目的のために過ぎず、かつ以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって変更され得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】肺切除術の後のモノクロタリン治療が動物の重度の肺動脈高血圧症の発症に与える影響を(モノクロタリンを与えられた偽手術動物と比較して)例示するグラフである。麻酔後に、気管切開によってラットに人工呼吸をし、かつ開胸した。液体で満たされたカテーテルで右心室壁に穴を開け、カテーテルを肺動脈中に進める前に圧力測定を実施した。予想されたとおり、偽手術＋溶媒(n=6)で処置されたラットは、正常な肺圧力を有した。驚くべきことに、肺切除術＋溶媒処置の動物もまた、正常な肺血行動態を有した(n=6)。偽手術後のMCT処置は、他のラット(n=8)によって示されたように中等症のPAHをもたらし、肺切除術後にMCTを与えられたラット(n=3)は、肺圧のほぼ全身的な上昇を示した(p<.03、ANOVAとそれに続くボンフェローニの多重比較)。データは、平均値±SEMとして示す;RVSP：右心室収縮期圧;平均PA：平均肺動脈圧。
【図２】A〜Eは、肺切除術後のMCT処置の組織学的影響、具体的には新生内膜の変化および組織因子で濃く染色された叢状様病変の発生を示す。組織因子に対するポリクローナル抗体でラット肺組織を免疫染色した。顕微鏡写真はすべて20倍で撮影した。顕色剤はNovoRedであり、したがって、ピンク色または赤色の染色はすべて組織因子抗原の結果である。Aは、肺切除術の後に溶媒(DMSO)注射で処置されたラットに由来する細動脈の画像であり、組織学的に正常な血管における弱いTF反応性を示している。B〜Eに示される血管は、肺切除術の後にMCTで処置したラットに由来する。Bは、内皮を伴う肥大した小さな細動脈、およびTFで濃く染色されている中膜を示す。Cは、内膜過形成および中膜肥厚によってほとんど閉塞した一対の血管を示す。TF染色が、血管壁の全体にわたって認められる。D〜Eは、2匹の異なる動物に由来する増殖性の叢状様病変を示す。
【図３】A〜Dは、重度の肺動脈高血圧症のラットモデルにおける叢状様病変の組織学的解析を示す。これらの病変は、成熟内皮細胞マーカーおよび未成熟内皮細胞マーカーの双方に対して血管路(channel)および血管細胞の染色を示す。Aは、閉塞した細動脈に近接した叢状様病変を示す10倍の顕微鏡写真である。屠殺時にフルオレセイン微粒子を肺に灌流しており、これらの粒子により、この病変中で連絡している血管路が確認される(B、40倍、矢印)。フォンウィレブランド因子(「vWF」)(C)および血管内皮増殖因子受容体-2(「VEGF-R2」)(D)に対する抗体で連続切片を免疫染色した。図2および4のように、NovoRedを顕色剤として使用した。したがって、ピンク色および赤色の染色はすべて、抗原に起因する。2種の異なる内皮細胞マーカーは、vWF(+)細胞が経路に沿って並ぶ(C)のに対し、VEGF-R2抗体は、未成熟内皮細胞および炎症細胞の散在した集団を染色する(D)ことを示す。連続切片中の様々な場所に経路が出現することにより、混乱した血管路の痕跡が確認される。
【図４】A〜Eは、肺動脈高血圧症のヒト患者の叢状病変における組織因子抗原の発現レベルを示す。次いで、TFに対するポリクローナル抗体で免疫染色したヒト肺の顕微鏡写真(すべて倍率20倍)をNovo-Redで顕出させた;したがって、ピンク色および赤色の染色はすべて、TF抗原に起因する。図4Aは、弱い内皮染色および目立たない中膜を有する、正常肺に由来する肺細動脈を示す。TF陽性の細胞を隣接した上皮中に見出すことができ、かつTF陽性の単球を肺胞腔中に見出すことができる。Bは、比較的早期の疾患(中膜肥厚)の血管の中膜および内皮におけるTF染色を示す。Cは、同心円状のオニオンスキン病変の中心における中程度の染色を示し、D〜Eは、2種の異なる叢状病変における強く、かつ散在した染色を示す。気管支上皮はTFを正常に発現し、陽性対照(Epi)として示される(D)。B〜Eの顕微鏡写真は、表1に記載する4名の異なる患者に由来する(以下の実施例を参照されたい)。
【図５】4種のラット群：肺切除術/溶媒;肺切除術/MCT;偽手術/MCT;および肺切除術/MCT/IXOからのラットに対するトレッドミル試験の結果を示すグラフである。
【図６】図に示したように処置し、かつ21日目に屠殺したラットから得た肺動脈(「PA」)および右心室(「RV」)圧力の自動記録装置の記録を示す一連のグラフである。
【図７】21日目に屠殺した肺切除術/MCT/IXOラットから得た肺組織試料に対するエラスチン-トリクローム染色の画像である(倍率4倍)。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトにおいて現れる状態をより厳密に模倣する、肺動脈高血圧症(「PAH」)の動物モデル、PAHを治療または予防することができる治療薬を同定またはスクリーニングするためのそのモデルの使用、ならびに組織因子(「TF」)インヒビターまたはTFを介した経路のインヒビターを用いてPAH(もしくはその症状)を治療または予防する方法に関する。
【０００２】
米国特許仮出願第60/616,567号の優先権の恩典を主張する。
【０００３】
生研究所(National Institutes of Health)からの資金を用いてなされた。米国政府は、本発明においていくつかの権利を保有し得る。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
重度のPAHは、特発型として散発性および家族性に発生する、肺循環中の前毛細管抵抗の著しい上昇である。これはまた、慢性の静脈血栓塞栓症、強皮症、HIV感染症、および肝硬変などの疾患に関連して観察される(Fishman, "Etiology and Pathogenesis of Primary Pulmonary Hypertension： A Perspective," Chest 114(3 Suppl)：242S-247S (1998)（非特許文献１）; Farber et al., "Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(16)：1655-65 (2004)（非特許文献２）)。PAHは、稀であるが破壊的な疾患であり、主に若い女性を冒すが、強皮症患者および肝硬変患者の間のPAH発病率の上昇により、この疾患の人口統計が変化しつつある。生存率は極めてひどく、未治療の進行患者の6ヶ月死亡率は50％である。
【０００５】
1996年のプロスタサイクリン持続注入の広範囲に及ぶ導入は、この疾患の治療に大変革を起こし(Barst et al., "A Comparison of Continuous Intravenous Epoprostenol (Prostacyclin) with Conventional Therapy for Primary Pulmonary Hypertension. The Primary Pulmonary Hypertension Study Group," New Engl. J. Med. 334(5)：296-302 (1996)（非特許文献３）) 、生存率を著しく改善した―現代の療法による3年生存率は60％である(Kawut et al., "New Predictors of Outcome in Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension," Am. J. Cardiol. 95(2)： 199-203 (2005)（非特許文献４）)。
【０００６】
残念ながら、この珍しい疾患の治療に対する規制認可を得ている薬物はまだ5種類しかなく
(Farber et al., "Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(16)：1655-65 (2004)（非特許文献５）; Humbert et al., "Treatment of Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(14)： 1425- 36 (2004)（非特許文献６）)、多くの患者は、利用可能な最善の治療にもかかわらず、肺移植または死亡に至る。さらに、患者の治療が進歩した割には、疾患のプロセスに関する理解は依然として限られている(Newman et al., "Pulmonary Arterial Hypertension：Future Directions： Report of a National Heart, Lung and Blood Institute/Office of Rare Diseases Workshop," Circulation 109(24)：2947-52 (2004)（非特許文献７）)。
【０００７】
多数の病因による進行したPAHでは、内皮増殖および中膜肥厚が、動脈管腔を最終的に閉塞させる。大半の患者は、叢状病変と呼ばれる糸球体様構造中に血管新生の障害も有する(Pietra et al., "Histopathology of Primary Pulmonary Hypertension. A Qualitative and Quantitative Study of Pulmonary Blood Vessels from 58 Patients in the National Heart, Lung, and Blood Institute, Primary Pulmonary Hypertension Registry," Circulation 80(5)： 1198-206 (1989)（非特許文献８）; Meyrick, "The Pathology of Pulmonary Artery Hypertension," Clin. Chest Med. 22(3)：393-404 (2001)（非特許文献９）; Tuder et al., "Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 144(2)：275-85 (1994)（非特許文献１０）)。叢状病変は、全身の動脈循環の疾患ではまったく認められない。しかしながら、これら独特の構造は、珍しい形態の癌である多形性神経膠芽腫における血管との間に類似点を共有しており(Tuder et al., "Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am J Pathol 144(2)：275-85 (1994)（非特許文献１１）)、これらの病変を構成する細胞が、PAH進行の原因である可能性がある。叢状病変は、同心円状の管腔閉塞の発現に先行し、したがって、血管リモデリングに重大な意味を持つという仮説を裏付ける、ヒト剖検研究からのいくらかのデータがある(Cool et al., "Three-Dimensional Reconstruction of Pulmonary Arteries in Plexiform Pulmonary Hypertension Using Cell-Specific Markers. Evidence for a Dynamic and Heterogeneous Process of Pulmonary Endothelial Cell Growth," Am. J. Pathol. 155(2)：411-9 (1999)（非特許文献１２）)。したがって、増殖性の血管病変および同心円状の管腔閉塞が、血管内皮および平滑筋細胞のこの異常な増殖を媒介するメカニズムを研究するための重度PAHの動物モデルにおいて望ましいと思われる(Newman et al., "Pulmonary Arterial Hypertension： Future Directions： Report of a National Heart, Lung and Blood Institute/Office of Rare Diseases Workshop," Circulation 109(24)：2947-52 (2004)（非特許文献１３）; Tuder et al., Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 144(2)：275- 85 (1994)（非特許文献１４）; Humbert et al., "Cellular and Molecular Pathobiology of Pulmonary Arterial Hypertension," J. Amer. Coll. Cardiol. 43(12 Suppl S)：13S-24S (2004)（非特許文献１５）; Rubin et al., "Pulmonary Arterial Hypertension： a Look to the Future," J. Amer. Coll. Cardiol. 43(12 Suppl S)：89S-90S (2004)（非特許文献１６）)。このようなモデルはまた、合理的な薬物開発にも非常に有用であると思われる。
【０００８】
内皮毒素のモノクロタリン(「MCT」)が、PAHの実験モデルを作製するために通常使用され、このモデルの動物は、「でこぼこした(rugged)」外観の内皮および中膜肥厚を発現する。しかしながら、ヒト疾患の2種の病理学的特徴、すなわち同心円状の管腔閉塞および叢状病変は、観察されていない。Botneyによって提唱されたラットモデルでは、左肺切除術に続いて、MCTがラットに投与される。これらの動物は、末梢肺血管の大半において新生内膜形成および同心円状閉塞を伴う、より重度のPAHを発症し(Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol.151(4)：1019-25 (1997)（非特許文献１７）)、ヒトの疾患において認められるものにはるかに似ている。これらのモデルは、血管リモデリングの重要な経路を明確にし、したがって新規な治療戦略を提案するのに有用であったが(Cowan et al., "Elastase and Matrix Metalloproteinase Inhibitors Induce Regression, and Tenascin-C Antisense Prevents Progression, of Vascular Disease," J.Clin. Invest. 105(1)：21-34 (2000)（非特許文献１８）; Nishimura et al., "Simvastatin Rescues Rats from Fatal Pulmonary Hypertension by Inducing Apoptosis of Neointimal Smooth Muscle Cells," Circulation 108(13)： 1640-5 (2003)（非特許文献１９）; Zhao et al., "Rescue of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension Using Bone Marrow-Derived Endothelial-Like Progenitor Cells： Efficacy of Combined Cell and eNOS Gene Therapy in Established Disease," Circ. Res. 96(4)：442-450 (2005)（非特許文献２０）)、ヒト疾患のいくつかの典型的な病理学的特徴を欠くことが、両方のモデルにとって重大な制約である。叢状病変は、これらのラットまたはPAHの他の任意の動物モデルにおいて報告されていない。
【０００９】
したがって、管腔閉塞および叢状(または叢状様(plexiform-like))病変の形成の双方を含む、ヒト患者によって提示される症状をより正確に反映することができる、重度PAHの動物モデルを開発することが望ましいと思われる。このようなモデルは、開発された場合には、PAHを治療もしくは予防(またはその症状を処置)するのに使用され得る治療薬を試験またはスクリーニングするために信頼できる観察結果をより提供しやすいと思われる。
【００１０】
本発明は、当技術分野におけるこれらおよび他の欠陥を克服することを対象としている。
【００１１】
【非特許文献１】Fishman, "Etiology and Pathogenesis of Primary Pulmonary Hypertension： A Perspective," Chest 114(3 Suppl)：242S-247S (1998)
【非特許文献２】Farber et al., "Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(16)：1655-65 (2004)
【非特許文献３】Barst et al., "A Comparison of Continuous Intravenous Epoprostenol (Prostacyclin) with Conventional Therapy for Primary Pulmonary Hypertension. The Primary Pulmonary Hypertension Study Group," New Engl. J. Med. 334(5)：296-302 (1996)
【非特許文献４】Kawut et al., "New Predictors of Outcome in Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension," Am. J. Cardiol. 95(2)： 199-203 (2005)
【非特許文献５】Farber et al., "Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(16)：1655-65 (2004)
【非特許文献６】Humbert et al., "Treatment of Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(14)： 1425- 36 (2004)
【非特許文献７】Newman et al., "Pulmonary Arterial Hypertension：Future Directions： Report of a National Heart, Lung and Blood Institute/Office of Rare Diseases Workshop," Circulation 109(24)：2947-52 (2004)
【非特許文献８】Pietra et al., "Histopathology of Primary Pulmonary Hypertension. A Qualitative and Quantitative Study of Pulmonary Blood Vessels from 58 Patients in the National Heart, Lung, and Blood Institute, Primary Pulmonary Hypertension Registry," Circulation 80(5)： 1198-206 (1989)
【非特許文献９】Meyrick, "The Pathology of Pulmonary Artery Hypertension," Clin. Chest Med. 22(3)：393-404 (2001)
【非特許文献１０】Tuder et al., "Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 144(2)：275-85 (1994)
【非特許文献１１】Tuder et al., "Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am J Pathol 144(2)：275-85 (1994)
【非特許文献１２】Cool et al., "Three-Dimensional Reconstruction of Pulmonary Arteries in Plexiform Pulmonary Hypertension Using Cell-Specific Markers. Evidence for a Dynamic and Heterogeneous Process of Pulmonary Endothelial Cell Growth," Am. J. Pathol. 155(2)：411-9 (1999)
【非特許文献１３】Newman et al., "Pulmonary Arterial Hypertension： Future Directions： Report of a National Heart, Lung and Blood Institute/Office of Rare Diseases Workshop," Circulation 109(24)：2947-52 (2004)
【非特許文献１４】Tuder et al., Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 144(2)：275- 85 (1994)
【非特許文献１５】Humbert et al., "Cellular and Molecular Pathobiology of Pulmonary Arterial Hypertension," J. Amer. Coll. Cardiol. 43(12 Suppl S)：13S-24S (2004)
【非特許文献１６】Rubin et al., "Pulmonary Arterial Hypertension： a Look to the Future," J. Amer. Coll. Cardiol. 43(12 Suppl S)：89S-90S (2004)
【非特許文献１７】Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol.151(4)：1019-25 (1997)
【非特許文献１８】Cowan et al., "Elastase and Matrix Metalloproteinase Inhibitors Induce Regression, and Tenascin-C Antisense Prevents Progression, of Vascular Disease," J.Clin. Invest. 105(1)：21-34 (2000)
【非特許文献１９】Nishimura et al., "Simvastatin Rescues Rats from Fatal Pulmonary Hypertension by Inducing Apoptosis of Neointimal Smooth Muscle Cells," Circulation 108(13)： 1640-5 (2003)
【非特許文献２０】Zhao et al., "Rescue of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension Using Bone Marrow-Derived Endothelial-Like Progenitor Cells： Efficacy of Combined Cell and eNOS Gene Therapy in Established Disease," Circ. Res. 96(4)：442-450 (2005)
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明の第1の局面は、以下の段階を含む、肺組織中の動脈幹に付随する小血管床の減少を抑制する方法に関する：組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害する治療薬を提供する段階;および肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中の血管細胞を治療薬に接触させる段階であって、接触させる段階が小血管床中の血管細胞の減少を抑制する、段階。
【００１３】
本発明の第2の局面は、以下の段階を含む、肺血管組織における新生内膜形成を予防または治療する方法に関する：組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害する治療薬を提供する段階;および(i)新生内膜病変もしくは叢状病変の発生前の血管細胞、または(ii)肺血管組織中の新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物を、治療薬に接触させる段階であって、接触させる段階が新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物の発生を抑制し、または肺血管組織中の既存の新生内膜病変もしくは叢状病変のサイズを縮小させる、段階。
【００１４】
本発明の第3の局面は、以下の段階を含む、肺高血圧症を治療する方法に関する：組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害する治療薬を提供する段階;および肺高血圧症の症状を示す患者に治療薬を投与する段階であって、投与する段階が肺血管組織において叢状病変の程度を低減させ、または小血管の新生内膜閉塞の程度を低減させるのに有効であり、それによって、血管容量を増大させ、かつ肺高血圧症を治療する、段階。
【００１５】
本発明の第4の局面は、以下の段階を含む、肺組織中の動脈幹に付随する小血管床の減少を抑制する方法に関する：(i)組織因子活性もしくは組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子構築物、または(ii)そのポリペプチドを発現するトランスジェニック細胞を提供する段階;および肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中の血管細胞中に遺伝子構築物を導入する段階、または肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中にトランスジェニック細胞を導入する段階のいずれかであって、導入する段階が小血管床中の血管細胞の減少を抑制する、段階。
【００１６】
本発明の第5の局面は、以下の段階を含む、肺血管組織における新生内膜病変形成または叢状病変形成を予防または治療する方法に関する：組織因子活性もしくは組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子構築物、または(ii)そのポリペプチドを発現するトランスジェニック細胞を提供する段階;および(i)新生内膜病変もしくは叢状病変の発生前の肺血管組織中に遺伝子構築物もしくはトランスジェニック細胞を導入する段階、または(ii)新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物中に遺伝子構築物もしくはトランスジェニック細胞を導入する段階のいずれかであって、導入する段階が新生内膜病変形成もしくは叢状病変形成の進行を抑制し、または肺血管組織中の既存の新生内膜病変もしくは叢状病変のサイズを縮小させる、段階。
【００１７】
本発明の第6の局面は、以下の段階を含む、肺高血圧症を治療する方法に関する：組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子構築物を提供する段階;および肺高血圧症の症状を示す患者の肺血管組織中の小血管中に遺伝子構築物を導入する段階またはトランスジェニック細胞を導入する段階のいずれかであって、導入する段階が肺血管組織において叢状病変の程度を低減させ、または小血管の新生内膜閉塞の程度を低減させるのに有効であり、それによって、血管容量を増大させ、かつ肺高血圧症を治療する、段階。
【００１８】
本発明の第7の局面は、肺動脈高血圧症の非ヒト動物モデルに関する。この動物モデルは、肺切除術とそれに続くモノクロタリン投与で処置される幼若動物であり、処置された幼若動物は、治療処置がなされない場合、叢状様病変の形成を含む肺動脈高血圧症の症状を発現する。好ましい態様によれば、動物モデルは、げっ歯動物モデルである。
【００１９】
本発明の第8の局面は、本発明の第7の局面による動物モデルに治療薬を投与する段階、および該投与する段階が肺動脈高血圧症の症状の発現を変化させるかどうかを判定する段階を含む、肺動脈高血圧症を治療する際に使用するための治療薬をスクリーニングする方法に関する。
【００２０】
叢状病変と疾患の進行の関係をより良く理解するために、ヒトにおいて観察されるPAHの形態をより良く再現するラットモデルが開発された。具体的には、このラットモデルは、増殖性の血管病変および肺動脈管腔の閉塞を提示した。これらのラットは、叢状様病変およびヒト疾患に典型的な血行動態変化を示した。これらの動物は、以前の報告(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 151(4)：1019-25 (1997); Faul et al., "Triptolide Attenuates Pulmonary Arterial Hypertension and Neointimal Formation in Rats," Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162(6)：2252-8 (2000))におけるラットよりも短時間で死亡したため、より重症であると思われた。叢状病変のうち一部は、ヒト疾患のものと同様に内皮抗原を発現し、かつそれらは肺動脈に結合されているようであった。TF抗原は、これらのラットの血管および増殖性病変において著しく増加していた。さらに、PAHに罹患しているヒトの肺中の叢状病変、および中膜肥厚を伴う血管において、TF抗原レベルが著しく上昇していた。これは、PAHを治療または予防するためのTF経路インヒビターの実証される用途に論拠を与える。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、重度の肺動脈高血圧症(PAH)の改善されたモデル、およびPAHの症状を治療することができる治療薬を試験するためのその使用に関する。さらに、本出願は、単独でまたは組み合わせて、PAHを治療もしくは予防するために、またはそれに関連した症状の重症度を少なくとも軽減するために使用され得る治療薬のいくつかのクラスの同定にも関する。
【００２２】
本発明の一つの局面は、重度の肺動脈高血圧症の非ヒト動物モデルに関する。このモデルは、肺切除術とそれに続くモノクロタリン(「MCT」)投与で処置された幼若動物を用いて得られる。治療処置がなされない場合、処置された幼若動物は、限定されるわけではないが、上昇した肺血圧(すなわち、対照に比べて)、叢状様病変の形成、血管系の閉塞を伴う新生内膜形成、右心室肥厚、運動不耐性、およびより早期の死亡(すなわち、MCTで処置されていない対照に比べて)を含む、肺動脈高血圧症の徴候および症状を発現する。
【００２３】
モノクロタリンは、好ましくは肺切除術後約5〜約9日目、より好ましくは肺切除術後約6〜約8日目、最も好ましくは肺切除術後7日目に投与される。
【００２４】
非ヒト動物は、限定されるわけではないが、げっ歯類動物、ネコ、イヌ、ブタ、または非ヒト霊長類を含む、任意の動物であり得る。哺乳動物は、好ましくは幼若動物である。好ましい態様によれば、非ヒト動物は、約300g未満、好ましくは約200〜約250gの間の幼若ラットである。
【００２５】
このようにして得られる動物モデルは、ヒトを含む他の動物における肺動脈高血圧症に対する潜在的な治療薬としての治療薬をスクリーニングする際に使用するのに適している。治療剤のスクリーニングは、本発明による動物モデルに治療剤を投与し、次いでその治療剤の投与が肺動脈高血圧症の徴候または症状の発現を変化させるかどうかを判定することによって実施することができる。基本的には、治療剤は、モノクロタリン投与以後の任意の時点に投与することができる。一つのアプローチにおいて、MCT投与のすぐ後(すなわち約2時間〜約7日後、好ましくは約1〜約5日後)に治療剤を投与して、その治療剤がPAHの初期の徴候または症状を停止または改善させる能力を評価することができる。別のアプローチにおいて、MCT投与のかなり後(すなわち約7日〜約14日後、好ましくは約9〜約12日後)に治療剤を投与して、その治療剤がPAHの進行した徴候または症状を停止または改善させる能力を評価することができる。
【００２６】
治療剤の投与は、経口的に、吸入によって、鼻腔内滴下によって、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈注射、動脈内注射、筋肉内注射、胸膜腔内点滴、腹腔内注射、脳室内注射、病巣内注射によって、または粘膜への適用によって実施することができる。投与は反復することができる。すなわち、毎日最高2〜5回、無期限に、または症状の緩和のような所望のエンドポイントを達成するのに適した持続期間もしくは症状が通常現れる定められた期間の間、反復することができる。または、治療剤の投与は、所望のエンドポイントを達成するのに適した持続期間の間、持続的でもよい。
【００２７】
治療剤の有効性の評価は、その治療剤を用いて達成された結果を、公知の基準(すなわち、PAHに罹患している対照動物またはPAHに罹患している対照動物を代表する例示的な組織標本における平均血圧)と比較することによって、または他の点は同一の条件下で飼育された対照動物と比較することによって(すなわち、並行(side-by-side)群の対照動物から得られる試料および測定値に直接比較して)、判定することができる。
【００２８】
実施例において示すように(後述)、本出願者らは、上記のモデルにおいてPAH発症の原因物質として組織因子(TF)を同定した。TFは、凝固カスケードを開始し、かつ発生および腫瘍増殖の双方において血管新生も促進し得る膜貫通型糖タンパク質である(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Mackman, "Regulation of the Tissue Factor Gene," Thromb.Haemost. 78(1)：747-54 (1997); Bachli, "History of Tissue Factor," Brit. J. Haematol. 110(2)：248-55 (2000); Riewald et al., "Orchestration of Coagulation Protease Signaling by Tissue Factor," Trends Cardiovasc. Med. 12(4)： 149-54 (2002))。TF発現は、実験的な動脈傷害の後の動脈壁において著しく上方制御され(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Hatakeyama et al., "Expression of Tissue Factor in the Rabbit Aorta After Balloon Injury," Atherosclerosis 139(2)：265-71 (1998))、かつその阻害により、様々な動物モデルにおける内膜過形成が減少することが示されている(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Taubman et al., "Regulation of the Procoagulant Response to Arterial Injury," Thromb Haemost 82(2)：801-5 (1999)に総説がある)。PAHは、血栓性素因を有する疾患であり(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Pietra et al., "Histopathology of Primary Pulmonary Hypertension. A Qualitative and Quantitative Study of Pulmonary Blood Vessels from 58 Patients in the National Heart, Lung, and Blood Institute, Primary Pulmonary Hypertension Registry," Circulation 80(5)： 1198-206 (1989); Fuster et al., Primary Pulmonary Hypertension： Natural History and the Importance of Thrombosis," Circulation 70(4)：580-7 (1984))、本明細書において実証される結果を考慮すると、TFが疾患の進行において重要な役割を果たしている可能性がある。
【００２９】
したがって、TF活性の阻害またはTFを介した下流のシグナル伝達経路(すなわち、TFによって直接的にまたは間接的に活性化されるもの)の阻害は、PAHに関連した病理学的状態を含む、PAHの徴候または症状を治療または予防するのに使用され得る。本明細書において使用される場合、TF活性の阻害とは、TF酵素活性(通常はXa因子の生成をもたらす)の阻害、細胞質内ドメイン内の細胞内シグナル伝達活性の阻害、または両方を包含すると意図される。特に、TFまたはTFを介した下流のシグナル伝達経路の阻害は、肺組織中の小血管床の減少、ならびに肺血管組織中の新生内膜病変形成および／または叢状様病変形成の群より選択される病理学的状態を抑制するため;ならびに、PAHの重症度を低減させ、または高い肺血圧および運動不耐性を含むPAHの症状を軽減するために使用され得る。
【００３０】
TF活性を阻害する例示的な治療剤には、限定されるわけではないが、組換えTFPI(Chiron Corp.から入手可能なTifacogin(商標))のような組織因子経路インヒビター(TFPI)、Ixolaris(NIAIDのIvo Francischetti博士から入手可能)のようなTFPI模倣体、抗TFモノクローナル抗体もしくは抗TFポリクローナル抗体、部位不活性化VIIa因子(Novo Nordisk)、および抗VII因子モノクローナル抗体もしくは抗VII因子ポリクローナル抗体が含まれる。
【００３１】
TFを介した下流のシグナル伝達経路を阻害する例示的な治療剤には、限定されるわけではないが、抗Xa因子抗体(Cuo Pharmaceuticals)、ヒルイジン(hiruidin)(Refludan(商標), Berlex)およびキシメラガトラン(Exanta(商標), Astra Zeneca)などの直接作用型トロンビンインヒビター、ならびにプロテアーゼ活性化受容体(「PAR」)遮断薬が含まれ、プロテアーゼ活性化受容体遮断薬には、低分子、ペプチド、ならびにPAR-1、PAR-2、およびPAR-4のモノクローナルまたはポリクローナルの抗体アンタゴニストが含まれる。
【００３２】
適切なPAR-1アンタゴニストには、限定されるわけではないが、SCH205831(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Chackalamannil et al., "Discovery of Potent Orally Active Thrombin Receptor (Protease Active Receptor 1) Antagonists as Novel Antithrombotic Agents," J. Med. Chem. 48(19)：5884-5887 (2005));FR171113 (その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Kato et al., "Inhibition of Arterial Thrombosis by a Protease- Activated Receptor 1 Antagonist, FR171113, in the Guinea Pig," Eur. J. Pharmacol. 473(2-3)：163-167 (2003)); RWJ58259 (それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Andrade-Gordon et al., "Administration of a Potent Antagonist of Protease- Activated Receptor- 1 (PAR-1) Attenuates Vascular Restenosis Following Balloon Angioplasty in Rats," J. Pharmacol. Exp. Ther. 298(1)：34-42 (2001); Derian et al., "Blockade of Thrombin Receptor Protease-Activated Receptor-1 with a Small Molecule Antagonist Prevents Thrombus Formation and Vascular Occlusion in Nonhuman Primates," J. Pharmacol. Exp. Ther. 304(2)： 855-861 (2003) (正誤表 305(1)：402 (2003)); SCH203099およびSCH79797 (その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ahn et al., "Inhibition of Cellular Action of Thrombin by N3-cyclopropyl-7-[[4-(1-methylethyl)phenyl]methyl]-7H-pyrrolo[3,2- f]quinazoline- 1,3 -diamine (SCH 79797), a Nonpeptide Thrombin Receptor Antagonist," Biochem. Pharmacol. 60(10)：1425-1434 (2000));ならびにペプチド誘導体3-メルカプトプロプリオニル(mercaptoproprionyl)-Phe-Cha-Cha-Arg-Lys-Pro-Asn-Asp-Lys-NH2 (Sigma-Aldrich, Inc.)が含まれる。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体もまた、適切なPAR-1遮断薬であると思われる。
【００３３】
適切なPAR-2アンタゴニストには、限定されるわけではないが、いずれもEntremed, Inc.から入手可能なペプチドp520および低分子547m、ならびに抗PAR-2抗体が含まれる。
【００３４】
適切なPAR-4アンタゴニストには、限定されるわけではないが、YD-3(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Wu et al., "Selective Inhibition of Protease-Activated Receptor 4-dependent Platelet Activation by YD-3," Thrombosis Haemostasis 87：1026-1033 (2002));およびtrans-シンナモイル-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-NH2(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Quinton et al., "Plasmin-mediated Activation of Platelets Occurs by Cleavage of Protease-activated Receptor 4," J. Biol. Chem. 279(18)18434-18439 (2004))が含まれる。
【００３５】
一つの態様によれば、(肺組織中の動脈幹に付随する)小血管床の減少を抑制することができる。この態様において、小血管床中の血管細胞は、治療剤と接触させられ、かつこのような接触段階は、小血管床中の血管細胞の減少を抑制するのに効果的である。血管細胞には、内皮細胞および血管平滑筋細胞の双方が含まれ得る。
【００３６】
別の態様によれば、肺血管組織中の新生内膜病変形成もしくは叢状病変形成が、予防(すなわち発症前に)または治療(すなわち発症後に)され得る。この態様において、肺血管組織中の血管細胞が、新生内膜病変および/もしくは叢状病変の発生前に治療剤に接触させられ、または、肺血管組織中の新生内膜病変および/もしくは叢状病変が治療剤に接触させられ、ここで、該接触段階は、新生内膜病変形成および/もしくは叢状病変形成の進行を抑制し、または肺血管組織中の既存の新生内膜病変および/もしくは叢状病変のサイズを縮小する。
【００３７】
別の態様によれば、PAHの症状を示す患者に治療剤を投与することによって、PAHを治療することができる。治療剤の投与は、肺血管組織において、限定されるわけではないが、増殖性の叢状病変を含むPAHの徴候もしくは症状、または小血管の新生内膜閉塞の程度を低減させるのに有効であり、それによって、血管容量を増大させ、かつ肺高血圧症を治療する。
【００３８】
上記の態様において、血管細胞の接触段階には、哺乳動物内のインビボの内皮細胞、血管平滑筋細胞、または炎症細胞(すなわち、新生内膜形成物の部位(cite)に補充される)が含まれる。患者への投与が企図される。これらは、患者への全身投与を介して、または肺血管組織の血管細胞への標的化された投与を介して遂行され得る。例示的な投与経路には、限定されるわけではないが、経口、吸入、鼻腔内滴下、局所、経皮、非経口、皮下、静脈注射、動脈内注射(肺動脈を介するものなど)、筋肉内注射、胸膜腔内点滴、腹腔内注射、脳室内注射、病巣内注射、または粘膜への適用が含まれる。これらのうちで、静脈内、動脈内(肺)、脳室内、および吸入の投与経路が好ましい。
【００３９】
本発明によって処置される哺乳動物は、げっ歯動物、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、非ヒト霊長類、またはヒトでよい。
【００４０】
治療剤の投与は、必要なだけの頻度、かつPAHまたはその潜在的な病理学的状態に対して効果的な治療を提供するのに適した持続期間、実施することができる。例えば、治療剤の投与は、単一の持続放出投薬製剤を用いて、または複数の1日量の治療剤を用いて実施することができる。当然、投与される量は、治療計画に応じて変動する。
【００４１】
典型的には、治療剤は、治療剤および任意の薬学的に許容される適切な補助剤、担体、賦形剤、または安定化剤を含む薬学的組成物として哺乳動物に投与され、かつ錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、または乳剤など固体形態または液状形態でよい。これらの組成物は、好ましくは、約0.01〜99重量パーセント、より好ましくは約2〜60パーセントの治療剤を、補助剤、担体、および/または賦形剤と共に含む。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な投薬単位が得られると思われる量である。本発明による好ましい組成物は、一つの投薬単位が約1mg〜1000mgの間の治療剤を含むように調製される。
【００４２】
治療剤の投与に加えて、様々な遺伝子療法アプローチが、PAHおよびそれに関連した前述の徴候または症状を治療するために企図される。様々な遺伝子療法アプローチにおいて、遺伝子構築物が、細胞、好ましくは患者細胞をインビボまたはエクスビボのいずれかで形質転換するのに利用される。後者の場合、これらの細胞は、治療対象の患者から採取され、形質転換され、次いでその患者中に再導入される。
【００４３】
これらの状態を治療するための遺伝子療法アプローチは、治療用のタンパク質または核酸をコードする組換え遺伝子(または遺伝子構築物)をその中に含む発現ベクターまたは発現プラスミドを利用する。組換え遺伝子によってコードされる例示的な治療用タンパク質には、限定されるわけではないが、組織因子経路インヒビター(TFPI、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Genbankアクセッション番号NM_006287 (TFPI var. 1)、NM_001032281(TFPI、var. 2)、およびNM_006528 (TFPI2))、Ixolaris (IXO、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Genbankアクセッション番号AF286029)およびIxolaris-2(IXO-2、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Genbankアクセッション番号AY674279)などの組織因子経路インヒビター模倣体、ならびに前述のもののようなPARのペプチドインヒビターが含まれる。
【００４４】
組換え遺伝子は、互いに作動的に結合された、哺乳動物細胞において作動可能な上流のプロモーター、および任意で、他の適切な調節エレメント(すなわちエンハンサーエレメントもしくは誘導エレメント)、治療用のタンパク質または核酸をコードするコード配列(前述)、ならびに下流の転写終結領域を含む。任意の適切な構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが、組換え遺伝子の転写を調節するのに使用され得、かつ当業者なら、現在公知のものであろうと今後開発されるものであろうと、このようなプロモーターを容易に選択し、かつ利用することができる。プロモーターはまた、Tie2プロモーター(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Minami et al., "Ets Motifs are Necessary for Endothelial Cell-specific Expression of a 723-bp Tie-2 Promoter/Enhancer in hprt targeted transgenic mice " Arterioscl.Thromb.Vasc. Biol. 23(11)：2041 -2047 (2003))のような、内皮細胞における発現に特異的なもの、またはSM22 (その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ribault et al., "Chimeric Smooth Muscle-Specific Enhancer/Promoters： Valuable Tools for Adenovirus-mediated Cardiovascular Gene Therapy," Circulation Res. 88(5)：468-475 (2001))のような、血管平滑筋細胞における発現に特異的なものであり得る。例えばTetO応答エレメントを用いることによって、組織特異的プロモーターを誘導性/抑制性にすることもできる。公知の組換え技術を利用して、組換え遺伝子を作製し、発現ベクター中にそれを移入し、かつそのベクターを患者に投与することができる。例示的な手順は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)に記載されている。当業者なら、その中に記載されている手順の公知の変形法を用いて、望ましいように、これらの手順を容易に変更することができる。
【００４５】
組換え遺伝子は、細胞によって取り込まれ得る裸DNAとして、またはウイルス(感染性)ベクターもしくは非感染性の送達運搬体を用いることによって、(形質転換する予定の)標的細胞中に送達され得る
【００４６】
任意の適切なウイルスベクターまたは感染性形質転換ベクターが使用され得る。例示的なウイルスベクターには、限定されるわけではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターが含まれる。
【００４７】
それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Berkner, Biotechniques 6：616-627 (1988)ならびにRosenfeld et al., Science 252：431-434 (1991)、WO 93/07283、WO 93/06223、およびWO 93/07282において提供される開示を考慮すれば、アデノウイルス遺伝子送達運搬体を容易に作製および利用することができる。アデノウイルスベクターのその他のタイプは、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Wickhamらの米国特許第6,057,155号;Boutらの米国特許第6,033,908号;Wilsonらの米国特許第6,001,557号;Chamberlainらの米国特許第5,994,132号;Kochanekらの米国特許第5,981,225号;Spoonerらの米国特許第5,885,808号;およびCurielの米国特許第5,871,727号において記載されている。
【００４８】
アデノ随伴ウイルス遺伝子送達運搬体を構築し、所望のタンパク質もしくはポリペプチドまたは核酸をコードする組換え遺伝子を細胞中に送達するのに使用することができる。インビトロでのアデノ随伴ウイルス遺伝子送達運搬体の使用は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Chatterjee et al., Science 258：1485-1488 (1992); Walsh et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89：7257-7261 (1992); Walsh et al., J. Clin. Invest. 94：1440-1448 (1994); Flotte et al., J. Biol. Chem. 268：3781-3790 (1993); Ponnazhagan et al., J. Exp. Med. 179：733-738 (1994); Miller et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91：10183-10187 (1994); Einerhand et al., Gene Ther. 2：336-343 (1995); Luo et al., Exp. Hematol. 23：1261-1267 (1995); およびZhou et al., Gene Ther. 3：223-229 (1996)において記載されている。これらの運搬体のインビボでの使用は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90：10613- 10617 (1993);およびKaplitt et al., Nature Genet. 8：148-153 (1994)において記載されている。
【００４９】
感染性の形質転換系を形成するように改変されたレトロウイルスベクターもまた、所望のタンパク質もしくはポリペプチドまたは核酸産物をコードする組換え遺伝子を標的細胞中に送達するのに使用され得る。このようなタイプのレトロウイルスベクターの一つが、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Krieglerらの米国特許第5,849,586号において開示されている。
【００５０】
または、いくつかの非感染性送達運搬体が、インビボまたはエクスビボで遺伝子構築物を送達するのに利用可能である。コロイド分散系が、患者に遺伝子構築物を送達するのに使用され得る。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。本発明の好ましいコロイド系は、単層リポソームおよび多重層リポソームを含む脂質調製物である。
【００５１】
リポソームは、インビトロおよびインビボでの送達運搬体として有用な人工膜小胞である。サイズが約0.2〜約4.0μmの範囲である大型単層小胞(LUV)は、実質的な比率のDNA分子含有水性緩衝液を封入し得ることが示されている(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6：77 (1981))。哺乳動物細胞の他に、酵母細胞および細菌細胞におけるポリヌクレオチド送達のためにもリポソームが使用された。リポソームが効率的な導入運搬体となるためには、以下の特徴が存在すべきである：(1)高効率でDNA分子を封入するが、それらの生物活性を損なわないこと;(2)宿主生物の細胞に実質的に結合すること;(3)細胞の細胞質に小胞の水性内容物を高効率で送達すること;および(4)遺伝的情報を正確かつ効果的に発現すること(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Mannino et al., Biotechniques 6：682 (1988))。このようなLUV構造体の他に、様々なカチオン性脂質両親媒性物質を組み入れる多重層脂質調製物および小型の単層脂質調製物をアニオン性DNA分子と混合して、リポソームを形成させることもできる(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Felgner et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 84(21)： 7413 (1987))。
【００５２】
リポソームの組成は、通常、ステロイド、特にコレステロールと通常組み合わせた、リン脂質、特に相転移温度の高いリン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質もまた、使用され得る。リポソームの物理的特徴は、pH、イオン強度、および典型的には2価の陽イオンの存在に依存する。カチオン性脂質両親媒性物質：DNA製剤の適切な組成および調製は、当業者には公知であり、この情報を提供するいくつかの参考文献が入手可能である(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるBennett et al., J.Liposome Research 6(3)：545 (1996))。
【００５３】
リポソーム作製に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドなどのホスファチジル化合物が含まれる。脂質部分が14〜18個の炭素原子、特に16〜18個の炭素原子を含み、かつ飽和されているジアシルホスファチジルグリセロールが特に有用である。例示的なリン脂質には、卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。ポリヌクレオチド送達のための核脂質粒子の調製において有用なカチオン性両親媒性脂質の例には、1価の脂質N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N,-トリメチルアンモニウムメチルスルファート、N-[(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド、ならびにDC-コレステロール、多価脂質のLipofectAMINE(商標)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、Transfectam(登録商標)、および他の両親媒性ポリアミンが含まれる。これらの薬剤は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのようなヘルパー脂質と共に調製され得る。
【００５４】
リポソームのターゲティングは、解剖学的要因および機構的要因に基づいて分類することができる。解剖学的分類は、選択性のレベル、例えば器官特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性に基づいている。機構的ターゲティングは、受動的であるか、または能動的であるかに基づいて区別され得る。受動的ターゲティングは、洞様毛細血管を含む器官中の細網内皮系(RES)の細胞に分散するリポソームの天然の傾向を利用する。これに対して、能動的ターゲティングは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、もしくはタンパク質などの特異的リガンドにリポソームを結合させることによる、または天然に存在する局在化部位以外の器官および細胞型へのターゲティングを実現するためにリポソームの組成もしくはサイズを変更することによる、リポソームの改変を伴う。標的化送達系の表面は、様々な方法で修飾され得る。リポソームの標的化送達系の場合、リポソームの二重層と安定に結合した状態でターゲティングリガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層中に脂質基を組み入れることができる。様々な連結基が、これらの脂質鎖をターゲティングリガンドに結合させるために使用され得る。
【００５５】
DNA送達のためのさらなる代替方法は、生物への遺伝子構築物の急速放出または持続放出のいずれかを提供することができるポリマーマトリックスの使用である。いくつかのポリマーマトリックスが当技術分野において公知であり、かつ日常的技術の域を超えない技術を用いて最適化され得る。
【００５６】
遺伝子構築物は、患者細胞の形質転換がインビボで起こる、患者への直接投与、または前もって採取された患者細胞であって、治療対象の患者中にその後で再導入することができる患者細胞のエクスビボの形質転換のいずれかのために使用され得る。
【００５７】
インビボ形質転換のために遺伝子構築物を投与するための好ましい経路には、(i)患者の右心室または末梢脈中に遺伝子構築物を(感染性ベクターまたは送達運搬体内の成分のいずれかとして)投与する経路、および(ii)吸入によって、遺伝子構築物を(送達運搬体の成分として)投与する経路が含まれる。これらの経路のいずれも、肺組織の小動脈血管中への遺伝子構築物の送達を効果的に引き起こすと思われる。
【００５８】
エクスビボ形質転換を用いる場合、内皮前駆細胞または血管平滑筋前駆細胞を含む前駆幹細胞を患者から採取することが好ましい。採取(および任意で細胞集団を精製した)後、採取した前駆細胞を形質転換し、形質転換体を選択し、次いで形質転換された前駆細胞を患者の肺組織中に再導入する。形質転換細胞の再導入は、好ましくは、右心室投与または末梢静脈内投与によって実施される。内皮前駆細胞のエクスビボ形質転換は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Zhao et al., "Rescue of Monocrotaline- Induced Pulmonary Arterial Hypertension Using Bone Marrow- Derived Endothelial-Like Progenitor Cells：Efficacy of Combined Cell and eNOS Gene Therapy in Established Disease," Circ. Res. 96(4)：442-450 (2005)に記載されている。
【００５９】
一つの態様によれば、(肺組織中の動脈幹に付随する)小血管床の減少は、(i)TF活性もしくはTFを介した下流のシグナル伝達経路のインヒビターをコードする遺伝子構築物、または(ii)TF活性もしくはTFを介した下流のシグナル伝達経路のインヒビターを発現するトランスジェニック細胞のいずれかを提供することによって抑制することができる。遺伝子構築物は、肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中の血管細胞中に(インビボで)導入され得る。または、エクスビボのトランスジェニック血管細胞を、肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中の血管細胞中に導入することもできる。どちらの場合も、小血管床中の形質転換された血管細胞の存在が、治療剤の発現をもたらし、それによって小血管床中の血管細胞(内皮、血管、または両方)の減少を抑制する。
【００６０】
別の態様によれば、肺血管組織における新生内膜形成または叢状形成は、(i)TF活性もしくはTFを介した下流のシグナル伝達経路のインヒビターをコードする遺伝子構築物、または(ii)TF活性もしくはTFを介した下流のシグナル伝達経路のインヒビターを発現するトランスジェニック細胞のいずれかを提供することによって、予防(すなわち発症前に)または治療(すなわち発症後に)することができる。遺伝子構築物またはトランスジェニック血管細胞は、新生内膜病変もしくは叢状病変の発生前、または新生内膜病変もしくは叢状病変中のいずれかで、肺血管組織中に導入することができる。いずれの場合も、肺血管組織中の形質転換細胞の存在が、治療剤の発現をもたらし、それによって新生内膜病変形成もしくは叢状病変形成の進行を抑制し、または肺血管組織中の既存の新生内膜病変もしくは叢状病変のサイズを縮小する。
【００６１】
さらなる態様によれば、PAHは、(i)TF活性もしくはTFを介した下流のシグナル伝達経路のインヒビターをコードする遺伝子構築物、または(ii)TF活性もしくはTFを介した下流のシグナル伝達経路のインヒビターを発現するトランスジェニック細胞のいずれかをコードする遺伝子構築物を用いて治療することができる。遺伝子構築物またはトランスジェニック細胞は、肺血管組織中の小血管中に導入され得る。いずれの場合も、肺血管組織中の形質転換細胞の存在が、治療剤の発現をもたらし、それによって肺血管組織において叢状病変の程度を低減させ、もしくは小血管の新生内膜閉塞の程度を低減させ、またはその両方を低減させる。これは、効果的に血管容量を増大させ、それによって肺高血圧症を治療する。
【００６２】
実施例
以下の実施例は、本発明の態様を例示するために提供されるが、発明の範囲を限定することを決して意図しない。
【００６３】
材料および方法
ヒト対象：コロラド大学(University of Colorado)から予め入手した、肺移植(n=5)または剖検検査(n=5)を受けたPAH患者組織を利用し、かつ調査目的のために組織を使用するためのインフォームドコンセントを得た。肺血管疾患の徴候の無い未使用のドナー肺(n=6)は、対照としての機能を果たした。組織試料を得た患者の特徴を下記の表1に提供する。
【００６４】
（表1）患者の特徴
aIPAH,特発性肺動脈高血圧症(以前のPAH)
b随伴性肺動脈高血圧症
cCVA,脳血管発作
【００６５】
組織病理学：コロラド大学から得たパラフィン包埋ヒト肺組織をミクロトーム上で厚さ5μmの切片に切断した。ヒトおよびラットにおけるTF免疫組織化学では、大腸菌(Escherichia coli)中で発現させられたTF(可溶性TF、sTF)の細胞外ドメイン(第1〜218番残基)に対してウサギ中で産生させたポリクローナル抗ヒトTF抗体を使用した(その全体が参照により本明細書に組み入れられるMarmur et al., "Identification of Active Tissue Factor in Human Coronary Atheroma," Circulation 94(6)： 1226-32 (1996))。
【００６６】
ラット組織を10％中性ホルマリン中で固定、処理し、かつパラフィン包埋した。5μmの切片に切断し、脱パラフィンし、かつ段階的な濃度のアルコールによって再水和させた。3％過酸化水素中でクエンチした後、10mMクエン酸緩衝液、pH6中で、圧力鍋を用いてスライドを抗原賦活処理した。これらのスライドを適切な血清(Vector Laboratories, Burlingame, CA) 中でブロックし、かつ1次抗体を4℃で一晩適用した。ビオチン化2次抗体(Vector Laboratories, Burlingame, CA)、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Jackson Immuno Research, West Grove, PA)、および顕色剤としてのNova Red(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を用いて免疫検出を実施した。次いで、これらのスライドをヘマトキシリン中で対比染色した。適切な陽性対照を各染色に対して使用し、かつ陰性対照のために1次抗体を除外した。
【００６７】
動物：すべての動物試験は、任意の動物実験を開始する前に、ロチェスター大学(University of Rochester)のIACUCによって承認された。200〜250gの間の体重の雄のスプラーグドーリーラットを剪毛し、次いでケタミンおよびキシラジン(0.9％生理食塩水中ケタミン70mg/kgおよびキシラジン50mg/kgを腹腔内送達)で麻酔後、18Gの血管カテーテルを用いて気管内挿管した。24時間の術後鎮痛を提供するために、実験の開始時にフルニキシンを0.1mg/kgの量で皮下投与した。動物に10〜12cc/kg(Harvard Apparatus)で人工呼吸をし(呼吸数70〜90、動物をモニターしながら、自発的な呼吸活動をさせないように調整)、かつ左胸部をベタジン洗浄剤を用いて前処理した。第4または第5肋間腔を確認し、かつ人工呼吸が一時的に中断される間の肺損傷を回避するように注意しながら、切開を実施した。開胸器を用いて胸腔を露出させ、かつ肺を穏やかに持ち上げて肺門構造を露出させた。近位に2つのリガクリップ(Ektacon LS200, Johnson & Johnson)を適用した後、遠位の肺門構造の位置で左肺を切断した。末端および側面に開けられた穴を有するポリエチレンチューブを第6肋間腔を通して挿入し、左肺が元々あった胸腔中に留置した。2本の吸収性縫合糸を用いて肋骨を接近させ、次いで付加的な縫合層によって筋肉および皮下組織を接近させた。胸部造瘻チューブを除去するときに自然に穴が閉じるように、胸部造瘻チューブを組織で慎重に密封するように注意を払った。密封されたら、出来るだけ早い時期に(時には皮下組織が閉じる前に)チューブに吸引を適用した。Antisedan(Orion)を0.2mg/kg筋肉内投与し、かつ9mmのAutoclips(Stoelting)で皮膚を閉じた。人工呼吸器を動物から取り外し、かつ胸部造瘻チューブに吸引を適用している間、自発的呼吸をモニターした。気管内チューブおよび胸部造瘻チューブが除去される前は、ラットは、呼吸するのにかなりの努力を払い、かつテーブル上で起き上がり始める必要があった。ケージに入れる前に、温熱パッド上で3〜4時間、動物を観察した。通常、24時間の周術期間中に30〜40％の死亡率が生じた。偽外科手術の場合、胸壁を切開した。十分に注意しながら、人工呼吸器を停止し、鉗子で胸部を傾け(listed)、第4肋間腔または第5肋間腔中に小さな切開部を作った。肺損傷の徴候が何かあれば、その事例は肺切除術に転用した。より小型のポリエチレンチューブを同じ穴を通して挿入し、肺と胸壁の間に留置した。適宜、1本または2本の縫合糸を用いて肋骨を接近させた。手順の残りの部分は、同一であった。胸部を閉じた後、ただし鎮静を解除する前に、数分間動物に人工呼吸を施して、麻酔下の合計時間が肺切除術の事例とほぼ同じとなるようにした。
【００６８】
1週間後、皮下注射剤としてMCT(DMSO中に溶解、60mg/ml)を動物に与えた(溶媒群の動物は、同体積のDMSOのみで処置した)。これらをモニターし、かつ28日間、通常の固形飼料および水を与えた(図2を作製するために利用した動物群において、肺切除術およびMCTで最初に処置した動物のうち2匹は、18日目および23日目に自然発生的に死亡し、残りの動物4匹は24日目に屠殺した)。
【００６９】
MCT処置後5日目および10日目、ならびにその後、疾患が進行するに従ってより頻繁に、運動能力をモニターした。走らなくなると軽い電気ショックで刺激を与えるトレッドミル(Columbus Instruments)上にラットを置いた。各試験は、16分間続いた：10m/分で2分、15m/分で4分、20m/分で5分、および25m/分で5分。最大走行距離は、305mであった。この手順は、地域のIACUCによって具体的に承認されている。
【００７０】
外科手術の前に、ラットは、最初のオリエンテーションおよびその後の2種の本格的なトレーニングセッションを受けた;これは、ベースライン時の動物間のばらつきを最小化するのに役立った。最初に、最大値の70％のグリッド強度および2Hzの周波数を使用した。刺激グリッドを回避するように動物を訓練し、かつこの段階で、10秒間動物に刺激を与えた後、グリッドのスイッチを切った。動物がトレッドミル上で遅れた場合、または動物が刺激グリッド上に座った場合には、ブラシを用いて、走り続けるように促した。MCTまたは溶媒の注射後10日目に、刺激用のプロトコールを変更した。この時点までに、一部のラットは臨床的に有意な疾患を発症した。さらに、ラットにトレッドミルを5回経験させ、刺激グリットを十分に嫌悪させて、それらの嫌悪を判定する際に刺激の強度はもはやそれほど重要ではないようにした。目標は最大下の労作(具体的には疲はいではない)であるため、動物が疲れた場合には、動物が運動よりも刺激を選択するように促した。動物は、最初の3分間、普通の刺激を受けた。3分の時点で、刺激グリッドの強度を最大強度の25％に下げ、かつ5秒間ラットに刺激を与えた後、グリッドのスイッチを切った。7分の時点では、グリッドのスイッチを切る前に、3秒間しかラットに刺激を与える必要が無かった。
【００７１】
屠殺時、ケタミンおよびキシラジン(ケタミン80mg/kgおよびキシラジン30mg/kgを腹腔内投与)でラットを麻酔した。腹部、胸部、および頚部全体を剪毛した。経皮的気管開口術を速やかに実施し、かつ動物に仰臥位で人工呼吸を施した。胸郭を腋窩中央切開し、肺実質に対する損傷を回避するよう注意しながら、一つの単位として前胸郭全体を持ち上げた。1本の6-0シルク縫合糸を左心室を通して慎重に配置して心臓にいくらかの張力を与え、かつ21Gの針を用いて、右心室の流出路に近い右心室壁を突き刺した。液体で満たされたカテーテルを同じ穴の中に直ちに挿入し、かつMacintoshコンピューターに連結されたPower Lab装置で圧力測定を実施した。アナログ信号を100Hzでデジタル化し、かつ10〜60秒間の再現性心周期を記録した。次いで、主肺動脈中にカテーテルを進めた後、さらに測定を実施した。
【００７２】
左心房を切断し、かつ主肺動脈を介してリン酸緩衝化生理食塩水で肺を灌流した。一部の動物において、以前に説明されているように(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Zhao et al., "Rescue of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension Using Bone Marrow-Derived Endothelial-Like Progenitor Cells： Efficacy of Combined Cell and eNOS Gene Therapy in Established Disease," Circ. Res. 96(4)：442-450 (2005))、0.2ミクロンのフルオレセインマイクロスフェア(Molecular Probes, Eugene, Oregon)を1％低融点アガロース中に懸濁させ、かつ生理食塩水による洗浄後、注入した。次いで、均一な膨張を提供するために20cmカラムを用いて、4％パラホルムアルデヒドで肺を膨張固定した。心臓を取り出し、心腔を計量した。パラホルムアルデヒド処理の48〜72時間後に、肺を70％エタノールに移した。さらに24時間後、右下葉組織をブロック状に切断し、かつパラフィン包埋した。
【００７３】
VEGF-R2(flk-1)抗体をSanta Cruzから購入し、vWF抗体をDakoから購入した。
【００７４】
統計学的解析：血行動態データをMacLabソフトウェアを用いて解析して、図2に示す要約データを得た。代表的な自動記録装置の記録(少なくとも4回の心周期)を強調表示した;次いで、コンピューターのソフトウェアにより、不偏平均値およびピーク圧力を生成した。αレベル0.05での分散分析によって、4種の群(偽手術＋溶媒、偽手術＋MCT、肺切除術+溶媒、肺切除術+MCT)を最初に比較した。これらの群が異なっていた場合には、多重比較用のボンフェローニ補正(Unistat Light, London, England)を用いて群間比較を実施した。同じ統計解析を下記の表2に示す心臓重量データに対して実施した。
【００７５】
（表2）肺切除ラットへのMCT投与後に、重度の右心室肥厚が観察された
【００７６】
重度PAHにおいて中隔は右心室(RV)の機能的部分となるため、(RV＋中隔)重量/左心室重量としてRV肥厚を算出した。RV肥厚は、偽処置の後にモノクロタリンを与えられた動物において発生したが、右心室肥厚の程度は、肺切除術後にモノクロタリンを与えられた動物においてはるかに大きかった(**p<0.03、一元配置分散分析(one way ANOVA)とそれに続く、ボンフェローニ補正を用いた2群間の事後検定)。
【００７７】
実施例1：重度PAHおよび叢状様病変は、肺切除ラットへのMCT投与後に発生する
若年ラット(200g、約6週齢)を左肺切除術または偽手術に供した。1週間後、1回量のMCT(60mg/kg、皮下)または溶媒を注射した。より高齢のラットを用いた最初の報告では、MCT投与後28日目に屠殺した動物から得られるデータを示していた(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 151(4)：1019-25 (1997); Faul et al., "Triptolide Attenuates Pulmonary Arterial Hypertension and Neointimal Formation in Rats," Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162(6)：2252-8 (2000))。28日間の実験を計画したが、肺切除術+MCT群において24日目より前に2件の自然発生的死亡が起こったため、肺切除術+MCTで処置した残りのラットを、当初計画したよりも早く24日目に屠殺した。図1は、これらのラット(n=3)の平均PA圧力が、偽手術の後にMCTで処置したラット(n=8;p<0.03)と比べて、よりひどく上昇していたことを示す。興味深いことに、肺切除術+溶媒の処置は、偽手術および溶媒で処置された動物(n=6)と比べて、平均PA圧力に影響を及ぼさなかった(n=6)。重度のPAHにおいて中隔は右心室(RV)の機能的部分となるため、(RV＋中隔)重量/左心室重量としてRV肥厚を算出した。表2は、RV肥厚が平均PA圧力の増加に伴って起こったことを実証する。RV肥厚は、偽手術+MCT(p<0.03)と比べて、肺切除術+MCTで処置した動物において増大していた。
【００７８】
MCTまたは溶媒を注射する前の「0日」目に3回、かつその後、残りの17日間の全体を通して定期的に、運動能力を評価した。訓練された後の試験の成績は、一貫性が高かった。肺切除術/MCTラットは、MCT後10日目に運動能力を失い始め、17日目までに、ほぼすべての肺切除術/MCTラットは、16分のプロトコールを完了することができなくなった。一方、肺切除術/溶媒群および偽手術/MCT群のラットは、一貫して運動プロトコールを完了した。肺切除術/MCT群で運動ができなくなり、かつ早期の死亡が起こったため、17日後に実験を終了した。これらのデータは、トレッドミル試験がPAHの発症に高感度であり、かつPAHを軽減するように設計された治療処置の有効性を追跡するための非侵襲性の道具となることを示唆する。
【００７９】
肺胞上皮は、偽手術または肺切除術後にMCTで傷害された動物において比較的よく維持されていた(図2Aおよび図3Aを参照されたい)。両方の群が、重度の中膜肥厚を示した(図2B)。以前に報告されているように(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 151(4)：1019-25 (1997); Faul et al., "Triptolide Attenuates Pulmonary Arterial Hypertension and Neointimal Formation in Rats," Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162(6)：2252-8 (2000))、より小さな細動脈が、肺切除術およびMCTで処置された動物において頻繁に閉塞していた(図2C)。これは、偽手術+MCT動物では認められなかった。この研究における示差的な調査結果は、高頻度の血管周囲の増殖性病変であり(図2D、2E、および図3を参照されたい)、これらはPAHヒト患者から得られる病変に著しく類似しているようであった(図2Dおよび2Eを図4Dおよび4Eと比較されたい)。したがって、これらの病変を、「叢状様」と呼ぶ。
【００８０】
これらの叢状様病変の起源を決定するために、安楽死時にフルオレセイン微粒子を含む溶液で主肺動脈を洗浄した(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Zhao et al., "Rescue of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension Using Bone Marrow-Derived Endothelial-Like Progenitor Cells： Efficacy of Combined Cell and eNOS Gene Therapy in Established Disease," Circ.Res. 96(4)：442-450 (2005); Han et al., "Defective Lung Vascular Development and Fatal Respiratory Distress in Endothelial NO Synthase-Deficient Mice： a Model of Alveolar Capillary Dysplasia?" Circ. Res. 94(8)： 1115-23 (2004))。図3に示すように、これらの微粒子は、叢状様病変の空隙内の小さな黄色の粒子として認められる。これは、これらの病変が、主肺動脈と通じている血管構造体を含むことを示唆する。ヒト由来の叢状様病変は、内皮細胞用のマーカー(フォンウィレブランド因子、vWF)および血管平滑筋用のマーカー(平滑筋α-アクチン、SMA)の双方で染色される(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Cool et al., "Three-Dimensional Reconstruction of Pulmonary Arteries in Plexiform Pulmonary Hypertension Using Cell-Specific Markers. Evidence for a Dynamic and Heterogeneous Process of Pulmonary Endothelial Cell Growth," Am. J. Pathol. 155(2)：411-9 (1999))。ラット由来の叢状様病変における細胞表現型をより上手く特徴付けるために、血管内皮増殖因子受容体-2(VEGF-R2)およびvWFに対する抗体を用いて、連続切片において免疫染色を実施した。ラットの叢状様病変は、血管路に沿って並ぶvWF発現細胞を含んでいた(図3C)のに対し、VEGF-R2に対して染色を示している未成熟な内皮細胞は、より均一に分布していた(図3D)。この染色パターンは、ヒト叢状病変に関して報告されたものに類似している(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Cool et al., "Three-Dimensional Reconstruction of Pulmonary Arteries in Plexiform Pulmonary Hypertension Using Cell-Specific Markers. Evidence for a Dynamic and Heterogeneous Process of Pulmonary Endothelial Cell Growth," Am. J. Pathol. 155(2)：411-9 (1999))。したがって、このモデルは、ヒト特発性PAHにおいて認められる病理学的特徴のうちの多くを再現する。
【００８１】
実施例2：組織因子は、肺切除術およびMCTで処置されたラットの血管および叢状様病変において誘導される
組織因子(TF)は、凝固カスケードを開始し、かつ発生および腫瘍増殖の双方において血管新生も促進し得る膜貫通型糖タンパク質である(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Mackman, "Regulation of the Tissue Factor Gene," Thromb.Haemost. 78(1)：747-54 (1997); Bachli, "History of Tissue Factor," Brit. J. Haematol. 110(2)：248-55 (2000); Riewald et al., "Orchestration of Coagulation Protease Signaling by Tissue Factor," Trends Cardiovasc. Med. 12(4)： 149-54 (2002))。PAHは、血栓性素因が認識される疾患であるため、TFタンパク質の可溶性部分に対して産生させたポリクローナル抗体で肺組織を染色した。肺切除術とそれに続く溶媒処置を受けたラットは、正常なPA圧力を有し(図1)、中膜のTF染色はほとんどなかった(図2A)。一方、肺切除術の後にMCTに供された若年ラットは、肥大した血管壁(図2B)中、およびほぼ閉塞した血管(図2C)中に著しいTF染色を示した。TF染色は、叢状様病変の全体の血管細胞中で強かった(図2Dおよび2E)。
【００８２】
実施例3：組織因子抗原は、PAH患者の叢状病変中で著しく増加している
TFと叢状様病変の関連が認められることの妥当性を確認するために、ヒト疾患におけるTFの存在を、移植を受けているPAH患者から得た肺組織(n=5)または剖検での肺組織(n=5)を用いて評価した。正常ヒト組織は、組織自体(n=6)とは関係の無い技術上の理由によって肺が移植用に使用されない場合に得た。患者は、コロラド大学肺高血圧症センター(University of Colorado Pulmonary Hypertension Cente)で追跡した;関連する臨床データは上記の表1に記載されている。この群は、特発性疾患の患者、および強皮症、食欲抑制薬、またはHIVに関連したPAH患者を含む。正常患者の血管中膜中には、組織因子(TF)はほとんど全く認められなかったが、内皮の弱い染色が時折示された(図1A);一方、PAH患者は、比較的初期の異常を伴う血管中でさえ、中膜の顕著なTF染色を示した(図1B)。TF染色は、典型的な同心円状増殖によって閉塞された血管において強く(図1C)、大半の叢状病変において特に濃かった(図1Dおよび1E)。すべての患者は、現代の手法を踏まえてワルファリン抗凝固薬を与えられたことに留意すべきである(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Humbert et al., "Treatment of Pulmonary Arterial Hypertension," New Engl. J. Med. 351(14)： 1425-36 (2004); Rich et al., "The Effect of High Doses of Calcium-Channel Blockers on Survival in Primary Pulmonary Hypertension," New Engl. J. Med. 327(2)：76-81 (1992))。
【００８３】
実施例1〜3の考察
これは、同心円状の管腔閉塞および叢状病変、すなわちヒト疾患の2つの重要な組織学的特徴を有する実験用PAHモデルの最初の報告である。肺切除術後1週間目にMCTに供した若年ラットは、以前に報告されているように(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," A m. J. Pathol. 151(4)：1019-25 (1997))、偽手術の後にMCTで処置されたラットよりはるかに程度の高い肺高血圧症およびRV肥厚を発症した。これらのラットは、以前の報告におけるラットより早期に死亡したことから、叢状様病変が、より重症な表現型の一部分であると考えられている。
【００８４】
肺切除術後1週間目のMCT投与は、他の著者らによるラットにおいてPAHを模擬するために他の著者らによって使用されていた(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Okada et al., "Pulmonary Hemodynamics Modify the Rat Pulmonary Artery Response to Injury. A Neointimal Model of Pulmonary Hypertension," Am. J. Pathol. 151(4)： 1019-25 (1997); Nishimura et al., "Simvastatin Rescues Rats from Fatal Pulmonary Hypertension by Inducing Apoptosis of Neointimal Smooth Muscle Cells," Circulation 108(13)： 1640-5 (2003))。しかしながら、これら以前の研究は、350〜400g(約12週齢)の動物の使用を含み、かつラットはMCT処置の後に叢状病変を提示しなかった。一方、本研究は、より若年の動物(200g、6週齢)の選択を含み、かつヒトPAH疾患において発見されるものに著しく類似した血管病理の観察結果は、予想外であり劇的であった。ラットは、(対側肺切除術後の)肺増殖に対して優れた能力を有し、これは25年超前から認識されている(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Brody, "Time Course of and Stimuli to Compensatory Growth of the Lung after Pneumonectomy," J. Clin. Invest. 56(4)： 897-904 (1975))。より若年のラットの方が、内皮傷害(MCT)および肺切除術の組み合わされた刺激に応答した血管細胞増殖を示す傾向が高い。上記に示した結果を前提とすると、本明細書において説明するラットモデルは、ヒト疾患に特徴的な血管細胞増殖の根拠を成すメカニズムを研究するために適切な道具であると考えられる(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Tuder et al., "Exuberant Endothelial Cell Growth and Elements of Inflammation are Present in Plexiform Lesions of Pulmonary Hypertension," Am.J. Pathol. 144(2)：275- 85 (1994); Cool et al., "Three-Dimensional Reconstruction of Pulmonary Arteries in Plexiform Pulmonary Hypertension Using Cell-Specific Markers. Evidence for a Dynamic and Heterogeneous Process of Pulmonary Endothelial Cell Growth," Am. J. Pathol. 155(2)：411-9 (1999); Tuder et al., "Expression of Angiogenesis-Related Molecules in Plexiform Lesions in Severe Pulmonary Hypertension： Evidence for a Process of Disordered Angiogenesis," J. Pathol. 195(3)：367-74 (2001); Tuder et al., Monoclonal Endothelial Cells in Appetite Suppressant-Associated Pulmonary Hypertension," Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158(6)： 1999-2001 (1998))。
【００８５】
Coolらは、未成熟な内皮細胞(または造血系統に由来するもの)を、より成熟した内皮表現型を有するものから識別するために、2種の内皮抗原(vWFおよびVEGF-R2)を使用した(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Cool et al., "Three- Dimensional Reconstruction of Pulmonary Arteries in Plexiform Pulmonary Hypertension Using Cell-Specific Markers. Evidence for a Dynamic and Heterogeneous Process of Pulmonary Endothelial Cell Growth," Am. J. Pathol. 155(2)：411-9 (1999))。この報告では、VEGF-R2で染色された未成熟な内皮細胞がヒト叢状病変の全体にわたって存在したのに対し、vWFを発現している成熟内皮細胞は、血管腔の管腔に沿って並んでいるのが認められただけであった。図3に提示したデータにより、これらの病変のうちの一部が大量の内皮細胞を有していることが示唆され、かつ内皮細胞染色のパターンにより、未成熟な内皮細胞および成熟内皮細胞が、ヒト疾患と同様に存在していることが示唆される。Coolら(上記)によって報告されたヒト剖検データにより、これらの病変が、同心円状の管腔閉塞に先行する病理の有効な要素である可能性が示唆される。この報告において、叢状病変は分岐点で現れ、かつ抗原発現のパターンにより、最も活発に増殖する細胞が、せん断応力の高い領域に存在することが示唆された。3次元再構築により、叢状病変中で活発に分裂している細胞が、最終的に「燃え尽きて(burned out)」、分岐点のすぐ近くの同心円状の「オニオンスキン」病変によって管腔を閉塞させることが示された。したがって、本明細書において説明する若年ラットモデルは、叢状病変が、同心円状の管腔閉塞を招く病理の重要な要素であることの確認を可能にするはずである。
【００８６】
上記のデータはまた、ヒトにおいて回答するのが以前は困難であった、叢状病変に関する別の疑問も検討している。強いVEGF抗原染色およびVEGFメッセージを有する内皮細胞の存在に刺激されて、数名の研究者は、叢状病変は混乱した血管新生の一形態であると提唱した(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Tuder et al., "Expression of Angiogenesis-Related Molecules in Plexiform Lesions in Severe Pulmonary Hypertension： Evidence for a Process of Disordered Angiogenesis," J. Pathol. 195(3)：367-74 (2001))。この提唱には、これらの叢状病変が肺動脈循環に連結されているという仮説が、暗に含まれている。ヒトでは、この仮説を直接検証することが不可能であったが、造影CTおよびMRIの解像度の最近の進歩により、生存患者における病変の直接的可視化が容易になる可能性がある。それでもなお、若年げっ歯動物モデルにおいて、血管に見える構造体は、屠殺時に主肺動脈を介して送達されたマイクロスフェアを含んでいる(図3)。これは、これらの構造体が肺循環に連結されていること、およびそれらが、以前に仮説を立てられたように混乱した血管新生を示すことの証拠を提供する。
【００８７】
PAHに罹患した患者およびラットにおいてTF発現が増大したという調査結果は、20年超前の剖検研究において最初に観察されたインサイチューの血栓症に対する説明を連想させる(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Fuster et al., Primary Pulmonary Hypertension： Natural History and the Importance of Thrombosis," Circulation 70(4)：580-7 (1984))。大部分は臨床的なデータのその最初の報告では、すべての患者が剖検されたわけではなかった。しかしながら、臨床的基準に基づくと、これらの患者は、原発性肺高血圧症(現在は特発性PAHと呼ばれている)に罹患しており、さらにインサイチューの血栓症が、実施された剖検における主要な調査結果であった。第2の一連の剖検では、初期のNHLBI Primary Pulmonary Hypertension Registryの患者58名から得た標本が検査された(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Pietra et al., "Histopathology of Primary Pulmonary Hypertension. A Qualitative and Quantitative Study of Pulmonary Blood Vessels from 58 Patients in the National Heart, Lung, and Blood Institute, Primary Pulmonary Hypertension Registry," Circulation 80(5)： 1198-206 (1989))。この注意深く選択された特発性疾患患者の群において、患者19名が血栓性病変を有していた。再疎通された血栓が、叢状病変を有する患者25名中9名で観察され(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Pietra et al., "Histopathology of Primary Pulmonary Hypertension. A Qualitative and Quantitative Study of Pulmonary Blood Vessels from 58 Patients in the National Heart, Lung, and Blood Institute, Primary Pulmonary Hypertension Registry," Circulation 80(5)： 1198- 206 (1989))、インサイチューの血栓症および叢状病変が、特発性疾患に罹患している一部の患者において共存していることが実証された。
【００８８】
2つの異なる観察データのセットにより、ワルファリンによる抗凝血が有益であり得ることが示唆されたため(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Kawut et al., "New Predictors of Outcome in Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension," Am. J. Cardiol. 95(2)： 199- 203 (2005); Rich et al., "The Effect of High Doses of Calcium-Channel Blockers on Survival in Primary Pulmonary Hypertension," New Engl. J. Med. 327(2)：76-81 (1992))、臨床的データもまた、PAHが血栓性素因を有する疾患であるという見解を裏付けている。1つ目は、Richらによって報告された(前掲)、1990年代初期に実施された高用量のカルシウムチャネル遮断薬のプロスペクティブな観察的試験における死亡決定因子の検査であった。ワルファリンを与えられたすべての患者が肺スキャンを受け、「非均一な」肺血流が示唆されたが、肺塞栓症を診断するための臨床的基準を満たしたものは一人もいなかった。ワルファリン使用は、5年目の死亡率の低下と関連付けられた。プロスタノイド療法は、血小板凝集、および内皮活性化に関する血清の役割を減少させる(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Friedman et al., "Continuous Infusion of Prostacyclin Normalizes Plasma Markers of Endothelial Cell Injury and Platelet Aggregation in Primary Pulmonary Hypertension," Circulation 96(9)：2782-4 (1997))ため、したがって、プロスタサイクリンの時代には、ワルファリンにはそれほどの利益が期待されなかった可能性がある。しかしながら、Kawutによる一番最近の報告(前掲)では、Columbia Presbyterian (1994〜2002)から連続的に得た患者における生存状況を観察し、かつプロスタサイクリンのような進歩した療法で治療される患者を含んだ。Kawutらは、患者をワルファリンでも処置した場合の生存利益をやはり認めた。
【００８９】
TFは、通常、動脈壁の内膜および中膜中に非常に低いレベルで存在している。動脈管腔表面でTF発現が増大すると、PAHにおいて一般に認められるインサイチューの血栓症に罹患しやすくなると思われる。したがって、重度のPAHに罹患しているラットおよびヒトの動脈壁においてTF発現が増大しているという調査結果(上記の実施例2〜3を参照されたい)は、PAHにおいて認められる血栓性素因に対する解釈を示唆する。
【００９０】
TFの増加は、PAHの病因において他の役割を果たしている可能性がある。TFの活性化により、Xa因子およびトロンビンが生成し、これらはどちらも、プロテアーゼ活性化受容体(PAR)ファミリーのメンバーを介して血管内皮細胞(EC)および平滑筋細胞(SMC)における細胞内シグナル伝達を調節する(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Riewald et al., Orchestration of Coagulation Protease Signaling by Tissue Factor," Trends Cardiovasc.Med. 12(4)：149-54 (2002); Coughlin, "Protease-Activated Receptors in Vascular Biology," Thromb. Haemost. 86(1)：298-307 (2001))。トロンビンは、そのGタンパク質共役型PAR受容体との相互作用を介して、内皮の透過性を増大させ、かつSMCの遊走および増殖を促進する(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Patterson et al., "New Tricks for Old Dogs： Nonthrombotic Effects of Thrombin in Vessel Wall Biology," Circ. Res. 88(10)：987-97 (2001))。PAR活性化はまた、接着分子発現も媒介し、したがって炎症細胞動員に影響を及ぼす(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Rahman et al., "Protein Kinase C-Delta Regulates Thrombin-Induced ICAM-1 Gene Expression in Endothelial Cells via Activation of p38 Mitogen-Activated Protein Kinase," Mol. Cell Biol. 21(16)：5554-65 (2001); Rahman et al., "G-alpha(q) and G-betagamma Regulate PAR-1 Signaling of Thrombin-Induced NF-KappaB Activation and ICAM-1 Transcription in Endothelial Cells," Circ. Res. 91(5)：398-405 (2002))。大動脈に由来するSMCおよびECにおいて、TF発現は、剪断、ひずみ、低酸素、増殖因子(VEGF)、およびケモカインMCP-1に対して感受性である(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Schecter et al., "Tissue Factor is Induced by Monocyte Chemoattractant Protein-1 in Human Aortic Smooth Muscle and THP-1 Cells," J. Biol. Chem. 272(45)：28568-73 (1997); Yan et al., "Protein Kinase C-Beta and Oxygen Deprivation. A Novel Egr-1-Dependent Pathway for Fibrin Deposition in Hypoxemic Vasculature," J. Biol. Chem. 275(16)：11921-8 (2000); Lin et al., "Shear Stress Induction of the Tissue Factor Gene," J. Clin. Invest. 99(4)：737-44 (1997); Silverman et al., "Tissue Factor Expression is Differentially Modulated by Cyclic Mechanical Strain in Various Human Endothelial Cells," Blood Coagul. Fibrinolysis 7(3)：281-8 (1996))。これらの因子はPHの病因に関与していると考えられるため、TF発現の増大は、PAHにおける血管リモデリングを促進すると既に考えられているいくつかのシグナルの下流のメディエータである可能性がある。
【００９１】
TFインヒビターは、全身循環の血管に対する実験的傷害後の内膜過形成を著しく減弱させる：ラットにおいて頚動脈傷害後に組換え組織因子経路インヒビター(TFPI)を全身注入すると、28日目に測定した新生内膜形成は低減していた(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Han et al., "Structural Requirements for TFPI-Mediated Inhibition of Neointimal Thickening After Balloon Injury in the Rat," Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19(10)：2563-7 (1999))。TFPIの局所的な遺伝子導入により、バルーン傷害後のウサギの頚動脈における新生内膜形成が低減した(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Zoldhelyi et al., "Local Gene Transfer of Tissue Factor Pathway Inhibitor Regulates Intimal Hyperplasia in Atherosclerotic Arteries," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(7)：4078-83 (2001))。冠動脈形成術とそれに続く長期のTFPI注入を受けたブタの28日時点の新生内膜形成は著しく少なかった(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Roque et al., "Inhibition of Tissue Factor Reduces Thrombus Formation and Intimal Hyperplasia After Porcine Coronary Angioplasty," J. Amer. Coll. Cardiol. 36(7)：2303-10 (2000))。最後に、ミニ遺伝子上のヒトTFを低レベルで発現するホモ接合性ノックアウトマウスの致死的表現型をレスキューすることによって、TF欠損マウスが作製された。野生型同腹子と比較すると、大腿動脈をワイヤー傷害した後の新生内膜形成は、TF欠損マウスにおいて著しく低減していた。重要なことには、このモデルは野生型動物においてでさえ、ほとんど血栓症を示さず、したがって、TFの凝血促進効果の減少は、新生内膜の変化を説明するものではなさそうである(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Pyo et al., "Mice Deficient in Tissue Factor Demonstrate Attenuated Intimal Hyperplasia in Response to Vascular Injury and Decreased Smooth Muscle Cell Migration," Thromb.Haemost. 92(3)：451-8 (2004))。TF欠損モデルにおける新生内膜形成の変化は、トロンビンまたはXa因子によって媒介されるTFの下流シグナル伝達作用に起因したという仮説が立てられた。
【００９２】
TF活性は血管新生に関係があるとされているため、増大したTF活性は、叢状病変において認められる混乱した血管新生および細胞増殖(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Mackman, "Role of Tissue Factor in Hemostasis, Thrombosis, and Vascular Development," Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24(6)： 1015-22 (2004))ならびに全身循環に対する傷害後の細胞増殖(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Pyo et al., "Mice Deficient in Tissue Factor Demonstrate Attenuated Intimal Hyperplasia in Response to Vascular Injury and Decreased Smooth Muscle Cell Migration," Thromb. Haemost. 92(3)：451-8 (2004))を媒介する可能性がある。
【００９３】
要約すると、上記の実施例は、重度の血行動態変化、新生内膜形成、および叢状様病変を有するPAHのラットモデルを示す。これらの病変は、ヒト叢状病変に類似したパターンの内皮の抗原染色を示し、かつそれらは主肺動脈に連結している。これらのラットの叢状様病変および血管において強いTF染色が存在した。このラットモデルにより、重度PAHにおいて叢状病変およびそれらの原因となる関係を生じさせるシグナル伝達の調査が可能になると考えられる。最終的に、このモデルは、新規な治療戦略が病変を予防する能力、またはさらに、確立された叢状病変の退縮を引き起こす能力を試験するための手段を提供する。
【００９４】
実施例4：ラットモデルにおいてPAHを治療するための組織因子経路インヒビターの投与
Ixolaris(IXO)は、吸血性(hemophagic)マダニ(ixodid tick)のイキソデス・スカプラリス(Ixodes scapularis)の唾液から単離されたTFPI模倣体である(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Lai et al., "A Thrombin Inhibitor from the Ixodid Tick, Amblyomma hebraeum," Gene 342(2)：243-249 (2004))。このタンパク質は、国立アレルギー感染症研究所(National Institutes of Allergy and Infectious Disease)のIvo Francischetti博士によってクローニングされ、かつバキュロウイルス系において組換えによって大量に作製された。本明細書において説明する研究用の試薬は彼によって提供された。TFPI模倣体として、IXOは、近位(すなわちXa因子の生成)で作用して、TF活性を妨害する。
【００９５】
MCT後5日目に開始し、かつ8日間継続して、IXO(毎日40μg/kgを皮下投与)で肺切除術/MCTラット3匹を処置した。対照と比較すると、これらのラットは運動能力において実質的な改善を示し(図5)、かつこれらのうち1匹も、早期の死亡を予測する成績である7分の閾値を下回らなかった。21日目に屠殺した1匹のIXO処置ラットは、現在使用されている経口的PAH療法の主力薬であるボセンタン(毎日100mg/kg)で見出された結果と同様、PA圧力の中等度の上昇しか示さなかった(図6)。組織像は著しく改善していた(図7)：叢状病変は無く、管腔の狭小化は低減し、かつ閉塞した血管は稀であった。これは、同様に分析したどの肺切除術/MCTラットとも異なっていた。他の2匹のIXO処置ラットは、20日目にそれらが死亡したため、評価することができなかった。この死亡は、それらの運動成績および17日目に7分より長く走行できるラットにおいて自発的死亡は稀にしか観察されないという事実を考慮すれば、非常に驚くべきことであった。これは、それらの死亡が、頭蓋内出血などIXO毒性に起因した可能性があることを示唆する。または、IXO処置を13日目に中止したため、疾患の再燃および死亡が起こった可能性もある。
【００９６】
この実験は、IXOの有効性対毒性を評価するために、より長期のIXO投与および変更した投薬量を用いて反復される。
【００９７】
実施例5：ラットモデルにおいてPAHを治療するためのモノクローナル抗体の投与
結合してTF活性を妨害するもの、および結合するがTF活性を妨害しないもの(対照)を含む、Daniel Kirchhofer博士によって提供された1組の種特異的モノクローナル抗体(Genentech)を、前述のラットPAHモデルにおいて試験する。表面プラズモン共鳴結合実験において、6H4モノクローナル抗体が、約1nMのKDで結合するのに対し、5A4モノクローナル抗体が、約100pMのKD値を有することが実証された。VIIa/TF複合体の酵素活性を測定するためのインビトロ実験により、6H4のIC50が用量5μg/mlであるのに対し、5A4の方が効力が弱く、IC50は40μg/mlであることが実証された。さらに、両方の抗体が(10mg/kgで)、尾部出血後の失血に対して同様かつ著しい効果を有した(一次的失血および二次的失血を合わせた量が90μlから600μlに増加した)。
【００９８】
これらのモノクローナル抗体を個別にラットPAHモデルに投与する。これは、MCT後5日目に開始し、かつ数日間のうちの1日に終了する(すなわち、9日目、13日目、17日目、21日目など)。PA圧力をすべてのラットにおいてモニターし、肺切除術後28日目にこれらのラットを屠殺する。PAHの組織学的証拠を得るために肺組織試料を検査する。6H4モノクローナル抗体および5A4モノクローナル抗体の一方または両方が、TFを阻害し、かつPAH症状および組織学的混乱を改善することが予想される。
【００９９】
実施例6：PAHラットモデルへの形質転換細胞の投与としての、TFPIを発現する内皮前駆細胞のエクスビボの形質転換
その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Zhao et al."Rescue of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension Using Bone Marrow-Derived Endothelial-Like Progenitor Cells： Efficacy of Combined Cell and eNOS Gene Therapy in Established Disease," Circ.Res. 96(4)：442-450 (2005)において報告されている手順を用いて、内皮前駆細胞を単離し、かつトランスフェクトする。エクスビボでトランスフェクトした細胞を、末梢静脈内経路を介して、または右心室カテーテル法によって、ラットPAHモデルに投与する。細胞の導入は、MCT後5日目に開始し、かつ数日間のうちの1日に終了する(すなわち、MCT後9日目、13日目、17日目、21日目など)。前述したように、運動能力を測定する。PA圧力をすべてのラットにおいてモニターし、肺切除術後28日目にこれらのラットを屠殺する。PAHの組織学的証拠を得るために肺組織試料を検査する。エクスビボの形質転換により、TFが阻害され、かつPAH症状および組織学的混乱が改善することが予想される。
【０１００】
本発明を例示するために詳細に説明したが、このような詳細は単にその目的のために過ぎず、かつ以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって変更され得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】肺切除術の後のモノクロタリン治療が動物の重度の肺動脈高血圧症の発症に与える影響を(モノクロタリンを与えられた偽手術動物と比較して)例示するグラフである。麻酔後に、気管切開によってラットに人工呼吸をし、かつ開胸した。液体で満たされたカテーテルで右心室壁に穴を開け、カテーテルを肺動脈中に進める前に圧力測定を実施した。予想されたとおり、偽手術＋溶媒(n=6)で処置されたラットは、正常な肺圧力を有した。驚くべきことに、肺切除術＋溶媒処置の動物もまた、正常な肺血行動態を有した(n=6)。偽手術後のMCT処置は、他のラット(n=8)によって示されたように中等症のPAHをもたらし、肺切除術後にMCTを与えられたラット(n=3)は、肺圧のほぼ全身的な上昇を示した(p<.03、ANOVAとそれに続くボンフェローニの多重比較)。データは、平均値±SEMとして示す;RVSP：右心室収縮期圧;平均PA：平均肺動脈圧。
【図２】A〜Eは、肺切除術後のMCT処置の組織学的影響、具体的には新生内膜の変化および組織因子で濃く染色された叢状様病変の発生を示す。組織因子に対するポリクローナル抗体でラット肺組織を免疫染色した。顕微鏡写真はすべて20倍で撮影した。顕色剤はNovoRedであり、したがって、ピンク色または赤色の染色はすべて組織因子抗原の結果である。Aは、肺切除術の後に溶媒(DMSO)注射で処置されたラットに由来する細動脈の画像であり、組織学的に正常な血管における弱いTF反応性を示している。B〜Eに示される血管は、肺切除術の後にMCTで処置したラットに由来する。Bは、内皮を伴う肥大した小さな細動脈、およびTFで濃く染色されている中膜を示す。Cは、内膜過形成および中膜肥厚によってほとんど閉塞した一対の血管を示す。TF染色が、血管壁の全体にわたって認められる。D〜Eは、2匹の異なる動物に由来する増殖性の叢状様病変を示す。
【図３】A〜Dは、重度の肺動脈高血圧症のラットモデルにおける叢状様病変の組織学的解析を示す。これらの病変は、成熟内皮細胞マーカーおよび未成熟内皮細胞マーカーの双方に対して血管路(channel)および血管細胞の染色を示す。Aは、閉塞した細動脈に近接した叢状様病変を示す10倍の顕微鏡写真である。屠殺時にフルオレセイン微粒子を肺に灌流しており、これらの粒子により、この病変中で連絡している血管路が確認される(B、40倍、矢印)。フォンウィレブランド因子(「vWF」)(C)および血管内皮増殖因子受容体-2(「VEGF-R2」)(D)に対する抗体で連続切片を免疫染色した。図2および4のように、NovoRedを顕色剤として使用した。したがって、ピンク色および赤色の染色はすべて、抗原に起因する。2種の異なる内皮細胞マーカーは、vWF(+)細胞が経路に沿って並ぶ(C)のに対し、VEGF-R2抗体は、未成熟内皮細胞および炎症細胞の散在した集団を染色する(D)ことを示す。連続切片中の様々な場所に経路が出現することにより、混乱した血管路の痕跡が確認される。
【図４】A〜Eは、肺動脈高血圧症のヒト患者の叢状病変における組織因子抗原の発現レベルを示す。次いで、TFに対するポリクローナル抗体で免疫染色したヒト肺の顕微鏡写真(すべて倍率20倍)をNovo-Redで顕出させた;したがって、ピンク色および赤色の染色はすべて、TF抗原に起因する。図4Aは、弱い内皮染色および目立たない中膜を有する、正常肺に由来する肺細動脈を示す。TF陽性の細胞を隣接した上皮中に見出すことができ、かつTF陽性の単球を肺胞腔中に見出すことができる。Bは、比較的早期の疾患(中膜肥厚)の血管の中膜および内皮におけるTF染色を示す。Cは、同心円状のオニオンスキン病変の中心における中程度の染色を示し、D〜Eは、2種の異なる叢状病変における強く、かつ散在した染色を示す。気管支上皮はTFを正常に発現し、陽性対照(Epi)として示される(D)。B〜Eの顕微鏡写真は、表1に記載する4名の異なる患者に由来する(以下の実施例を参照されたい)。
【図５】4種のラット群：肺切除術/溶媒;肺切除術/MCT;偽手術/MCT;および肺切除術/MCT/IXOからのラットに対するトレッドミル試験の結果を示すグラフである。
【図６】図に示したように処置し、かつ21日目に屠殺したラットから得た肺動脈(「PA」)および右心室(「RV」)圧力の自動記録装置の記録を示す一連のグラフである。
【図７】21日目に屠殺した肺切除術/MCT/IXOラットから得た肺組織試料に対するエラスチン-トリクローム染色の画像である(倍率4倍)。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、肺血管組織における新生内膜病変形成または叢状病変形成を予防または治療する方法：
組織因子活性もしくは組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害する治療剤を提供する段階;および
(i)新生内膜病変もしくは叢状病変の発生前の血管細胞、または
(ii)肺血管組織中の新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物を、該治療剤に接触させる段階であって、該接触させる段階が新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物の発生を抑制し、または肺血管組織中の既存の新生内膜病変もしくは叢状病変のサイズを縮小させる、段階。
【請求項２】
治療薬が、組織因子経路インヒビター(TFPI)、TFPI模倣体、抗TFモノクローナル抗体もしくは抗TFポリクローナル抗体、部位不活性化VIIa因子、抗VII因子モノクローナル抗体もしくは抗VII因子ポリクローナル抗体、抗Xa因子モノクローナル抗体もしくは抗Xa因子ポリクローナル抗体、直接作用型トロンビンインヒビター、またはプロテアーゼ活性化受容体遮断薬である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
治療薬が、組換えTFPI、Ixolaris、ヒルイジン(hiruidin)、およびキシメルガトラバン(ximelgatraban)、SCH205831、FR171113、RWJ58259、SCH203099、SCH79797、3-メルカプトプロプリオニル(mercaptoproprionyl)-Phe-Cha-Cha-Arg-Lys-Pro-Asn-Asp-Lys-NH2、ペプチドp520、低分子547m、YD-3、ならびにtrans-シンナモイル-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-NH2の群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
血管細胞が、内皮細胞、血管平滑筋細胞、炎症細胞、またはそれらの組合せである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
血管細胞または新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物が、哺乳動物中のインビボである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物が、げっ歯動物、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、非ヒト霊長類、またはヒトである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
以下の段階を含む、肺高血圧症を治療する方法：
組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害する治療薬を提供する段階;および
肺高血圧症の症状を示す患者に該治療薬を投与する段階であって、該投与する段階が肺血管組織において叢状病変の程度を低減させ、または小血管の新生内膜閉塞の程度を低減させるのに有効であり、それによって、血管容量を増大させ、かつ肺高血圧症を治療する、段階。
【請求項８】
治療薬が、組織因子経路インヒビター(TFPI)、TFPI模倣体、抗TFモノクローナル抗体もしくは抗TFポリクローナル抗体、部位不活性化VIIa因子、抗VII因子モノクローナル抗体もしくは抗VII因子ポリクローナル抗体、抗Xa因子モノクローナル抗体もしくは抗Xa因子ポリクローナル抗体、直接作用型トロンビンインヒビター、またはプロテアーゼ活性化受容体遮断薬である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
治療薬が、組換えTFPI、Ixolaris、ヒルイジン、およびキシメルガトラバン、SCH205831、FR171113、RWJ58259、SCH203099、SCH79797、3-メルカプトプロプリオニル-Phe-Cha-Cha-Arg-Lys-Pro-Asn-Asp-Lys-NH2、ペプチドp520、低分子547m、YD-3、ならびにtrans-シンナモイル-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-NH2の群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
叢状病変または新生内膜の閉塞が、内皮細胞、血管平滑筋細胞、炎症細胞、またはそれらの組合せを含む、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
叢状病変または新生内膜閉塞が、哺乳動物中のインビボである、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物が、げっ歯動物、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、非ヒト霊長類、またはヒトである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
投与する段階が、経口的に、吸入によって、鼻腔内滴下によって、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈注射によって、動脈内注射によって、筋肉内注射によって、胸膜腔内点滴によって、腹腔内注射によって、脳室内に、病巣内に、または粘膜への適用によって実施される、請求項7記載の方法。
【請求項１４】
以下の段階を含む、肺組織中の動脈幹に付随する小血管床の減少を抑制する方法：
組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害する治療薬を提供する段階;および
肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中の血管細胞を治療薬に接触させる段階であって、該接触させる段階が小血管床中の血管細胞の減少を抑制する、段階。
【請求項１５】
治療薬が、組織因子経路インヒビター(TFPI)、TFPI模倣体、抗TFモノクローナル抗体もしくは抗TFポリクローナル抗体、部位不活性化VIIa因子、抗VII因子モノクローナル抗体もしくは抗VII因子ポリクローナル抗体、抗Xa因子モノクローナル抗体もしくは抗Xa因子ポリクローナル抗体、直接作用型トロンビンインヒビター、またはプロテアーゼ活性化受容体遮断薬である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
治療薬が、組換えTFPI、Ixolaris、ヒルイジン、およびキシメルガトラバン、SCH205831、FR171113、RWJ58259、SCH203099、SCH79797、3-メルカプトプロプリオニル-Phe-Cha-Cha-Arg-Lys-Pro-Asn-Asp-Lys-NH2、ペプチドp520、低分子547m、YD-3、ならびにtrans-シンナモイル-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-NH2の群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
血管細胞が、内皮細胞、血管平滑筋細胞、炎症細胞、またはそれらの組合せである、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
血管細胞が、哺乳動物中のインビボである、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物が、げっ歯動物、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、非ヒト霊長類、またはヒトである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
以下の段階を含む、肺組織中の動脈幹に付随する小血管床の減少を抑制する方法：
(i)組織因子活性もしくは組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子構築物、または
(ii)該ポリペプチドを発現するトランスジェニック細胞を提供する段階;および
肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中の血管細胞中に遺伝子構築物を導入する段階、または肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中にトランスジェニック細胞を導入する段階のいずれかであって、該導入する段階が小血管床中の血管細胞の減少を抑制する、段階。
【請求項２１】
遺伝子構築物を用いて実施される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
導入する段階が、罹患哺乳動物の右心室または末梢脈中に遺伝子構築物を投与する段階を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
導入する段階が、遺伝子構造物を含む組成物を吸入によって投与する段階を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
トランスジェニック細胞を用いて実施される、請求項20記載の方法。
【請求項２５】
トランスジェニック細胞が、血管平滑筋前駆細胞または内皮前駆細胞である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子構築物が、TFPI、TFPI模倣体、またはペプチドPARアンタゴニストをコードする、請求項20記載の方法。
【請求項２７】
以下の段階を含む、肺血管組織における新生内膜病変形成または叢状病変形成を予防または治療する方法：
組織因子活性もしくは組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子構築物、または(ii)該ポリペプチドを発現するトランスジェニック細胞を提供する段階;および
(i)新生内膜病変もしくは叢状病変の発生前の肺血管組織中に遺伝子構築物もしくはトランスジェニック細胞を導入する段階、または
(ii)新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物中に遺伝子構築物もしくはトランスジェニック細胞を導入する段階のいずれかであって、該導入する段階が新生内膜病変形成もしくは叢状病変形成の進行を抑制し、または肺血管組織中の既存の新生内膜病変もしくは叢状病変のサイズを縮小させる、段階。
【請求項２８】
遺伝子構築物を用いて実施される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
導入する段階が、罹患哺乳動物の右心室または末梢脈中に遺伝子構築物を投与する段階を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
導入する段階が、遺伝子構造物を含む組成物を吸入によって投与する段階を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
トランスジェニック細胞を用いて実施される、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
トランスジェニック細胞が、平滑筋前駆細胞または内皮前駆細胞である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
遺伝子構築物が、TFPI、TFPI模倣体、不活性化VIIa因子、またはペプチドPARアンタゴニストをコードする、請求項27記載の方法。
【請求項３４】
以下の段階を含む、肺高血圧症を治療する方法：
組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子構築物を提供する段階;および
肺高血圧症の症状を示す患者の肺血管組織中の小血管中に遺伝子構築物を導入する段階またはトランスジェニック細胞を導入する段階のいずれかであって、該導入する段階が肺血管組織において叢状病変の程度を低減させ、または小血管の新生内膜閉塞の程度を低減させるのに有効であり、それによって、血管容量を増大させ、かつ肺高血圧症を治療する、段階。
【請求項３５】
遺伝子構築物を用いて実施される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
導入する段階が、罹患哺乳動物の右心室または末梢脈中に遺伝子構築物を投与する段階を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
導入する段階が、遺伝子構造物を含む組成物を吸入によって投与する段階を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
トランスジェニック細胞を用いて実施される、請求項34記載の方法。
【請求項３９】
トランスジェニック細胞が、平滑筋前駆細胞または内皮前駆細胞である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
遺伝子構築物が、TFPI、TFPI模倣体、またはペプチドPARアンタゴニストをコードする、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
肺切除術とそれに続くモノクロタリン投与で幼若げっ歯動物を処置することによって得られる、体重約300g未満の幼若げっ歯動物を含む重度の肺動脈高血圧症のげっ歯動物モデルであって、処置された幼若げっ歯動物は、治療処置がなされない場合、叢状様病変の形成を含む肺動脈高血圧症の症状を発現するげっ歯動物モデル。
【請求項４２】
幼若げっ歯動物がラットである、請求項41記載のげっ歯動物モデル。
【請求項４３】
モノクロタリンが、肺切除術後約5〜約9日目に投与される、請求項41記載のげっ歯動物モデル。
【請求項４４】
幼若げっ歯動物が、約200〜約250gの間である、請求項41記載のげっ歯動物モデル。
【請求項４５】
処置された幼若げっ歯動物が、血管系の新生内膜閉塞および血行動態の変化を示す、請求項41記載のげっ歯動物モデル。
【請求項４６】
以下の段階を含む、肺動脈高血圧症を治療する際に使用するための治療薬をスクリーニングする方法：
請求項41記載のげっ歯動物モデルに治療薬を投与する段階、および
該投与する段階が肺動脈高血圧症の症状の発現を変化させるかどうかを判定する段階。
【請求項４７】
治療薬を投与する段階が、モノクロタリン投与の後である、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
治療薬を投与する段階が、経口的に、吸入によって、鼻腔内滴下によって、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈注射によって、動脈内注射によって、筋肉内注射によって、胸膜腔内点滴によって、腹腔内注射によって、脳室内に、病巣内に、または粘膜への適用によって実施される、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
投与する段階が反復される、請求項47記載の方法。
【請求項５０】
判定段階が、治療薬を与えられるげっ歯動物モデルを、何も与えられないげっ歯動物モデルと比較する段階を含む、請求項46記載の方法。
【請求項１】
以下の段階を含む、肺血管組織における新生内膜病変形成または叢状病変形成を予防または治療する方法：
組織因子活性もしくは組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害する治療剤を提供する段階;および
(i)新生内膜病変もしくは叢状病変の発生前の血管細胞、または
(ii)肺血管組織中の新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物を、該治療剤に接触させる段階であって、該接触させる段階が新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物の発生を抑制し、または肺血管組織中の既存の新生内膜病変もしくは叢状病変のサイズを縮小させる、段階。
【請求項２】
治療薬が、組織因子経路インヒビター(TFPI)、TFPI模倣体、抗TFモノクローナル抗体もしくは抗TFポリクローナル抗体、部位不活性化VIIa因子、抗VII因子モノクローナル抗体もしくは抗VII因子ポリクローナル抗体、抗Xa因子モノクローナル抗体もしくは抗Xa因子ポリクローナル抗体、直接作用型トロンビンインヒビター、またはプロテアーゼ活性化受容体遮断薬である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
治療薬が、組換えTFPI、Ixolaris、ヒルイジン(hiruidin)、およびキシメルガトラバン(ximelgatraban)、SCH205831、FR171113、RWJ58259、SCH203099、SCH79797、3-メルカプトプロプリオニル(mercaptoproprionyl)-Phe-Cha-Cha-Arg-Lys-Pro-Asn-Asp-Lys-NH2、ペプチドp520、低分子547m、YD-3、ならびにtrans-シンナモイル-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-NH2の群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
血管細胞が、内皮細胞、血管平滑筋細胞、炎症細胞、またはそれらの組合せである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
血管細胞または新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物が、哺乳動物中のインビボである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物が、げっ歯動物、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、非ヒト霊長類、またはヒトである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
以下の段階を含む、肺高血圧症を治療する方法：
組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害する治療薬を提供する段階;および
肺高血圧症の症状を示す患者に該治療薬を投与する段階であって、該投与する段階が肺血管組織において叢状病変の程度を低減させ、または小血管の新生内膜閉塞の程度を低減させるのに有効であり、それによって、血管容量を増大させ、かつ肺高血圧症を治療する、段階。
【請求項８】
治療薬が、組織因子経路インヒビター(TFPI)、TFPI模倣体、抗TFモノクローナル抗体もしくは抗TFポリクローナル抗体、部位不活性化VIIa因子、抗VII因子モノクローナル抗体もしくは抗VII因子ポリクローナル抗体、抗Xa因子モノクローナル抗体もしくは抗Xa因子ポリクローナル抗体、直接作用型トロンビンインヒビター、またはプロテアーゼ活性化受容体遮断薬である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
治療薬が、組換えTFPI、Ixolaris、ヒルイジン、およびキシメルガトラバン、SCH205831、FR171113、RWJ58259、SCH203099、SCH79797、3-メルカプトプロプリオニル-Phe-Cha-Cha-Arg-Lys-Pro-Asn-Asp-Lys-NH2、ペプチドp520、低分子547m、YD-3、ならびにtrans-シンナモイル-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-NH2の群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
叢状病変または新生内膜の閉塞が、内皮細胞、血管平滑筋細胞、炎症細胞、またはそれらの組合せを含む、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
叢状病変または新生内膜閉塞が、哺乳動物中のインビボである、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物が、げっ歯動物、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、非ヒト霊長類、またはヒトである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
投与する段階が、経口的に、吸入によって、鼻腔内滴下によって、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈注射によって、動脈内注射によって、筋肉内注射によって、胸膜腔内点滴によって、腹腔内注射によって、脳室内に、病巣内に、または粘膜への適用によって実施される、請求項7記載の方法。
【請求項１４】
以下の段階を含む、肺組織中の動脈幹に付随する小血管床の減少を抑制する方法：
組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害する治療薬を提供する段階;および
肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中の血管細胞を治療薬に接触させる段階であって、該接触させる段階が小血管床中の血管細胞の減少を抑制する、段階。
【請求項１５】
治療薬が、組織因子経路インヒビター(TFPI)、TFPI模倣体、抗TFモノクローナル抗体もしくは抗TFポリクローナル抗体、部位不活性化VIIa因子、抗VII因子モノクローナル抗体もしくは抗VII因子ポリクローナル抗体、抗Xa因子モノクローナル抗体もしくは抗Xa因子ポリクローナル抗体、直接作用型トロンビンインヒビター、またはプロテアーゼ活性化受容体遮断薬である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
治療薬が、組換えTFPI、Ixolaris、ヒルイジン、およびキシメルガトラバン、SCH205831、FR171113、RWJ58259、SCH203099、SCH79797、3-メルカプトプロプリオニル-Phe-Cha-Cha-Arg-Lys-Pro-Asn-Asp-Lys-NH2、ペプチドp520、低分子547m、YD-3、ならびにtrans-シンナモイル-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-NH2の群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
血管細胞が、内皮細胞、血管平滑筋細胞、炎症細胞、またはそれらの組合せである、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
血管細胞が、哺乳動物中のインビボである、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物が、げっ歯動物、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、非ヒト霊長類、またはヒトである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
以下の段階を含む、肺組織中の動脈幹に付随する小血管床の減少を抑制する方法：
(i)組織因子活性もしくは組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子構築物、または
(ii)該ポリペプチドを発現するトランスジェニック細胞を提供する段階;および
肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中の血管細胞中に遺伝子構築物を導入する段階、または肺組織中の動脈幹に付随する小血管床中にトランスジェニック細胞を導入する段階のいずれかであって、該導入する段階が小血管床中の血管細胞の減少を抑制する、段階。
【請求項２１】
遺伝子構築物を用いて実施される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
導入する段階が、罹患哺乳動物の右心室または末梢脈中に遺伝子構築物を投与する段階を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
導入する段階が、遺伝子構造物を含む組成物を吸入によって投与する段階を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
トランスジェニック細胞を用いて実施される、請求項20記載の方法。
【請求項２５】
トランスジェニック細胞が、血管平滑筋前駆細胞または内皮前駆細胞である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子構築物が、TFPI、TFPI模倣体、またはペプチドPARアンタゴニストをコードする、請求項20記載の方法。
【請求項２７】
以下の段階を含む、肺血管組織における新生内膜病変形成または叢状病変形成を予防または治療する方法：
組織因子活性もしくは組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子構築物、または(ii)該ポリペプチドを発現するトランスジェニック細胞を提供する段階;および
(i)新生内膜病変もしくは叢状病変の発生前の肺血管組織中に遺伝子構築物もしくはトランスジェニック細胞を導入する段階、または
(ii)新生内膜病変形成物もしくは叢状病変形成物中に遺伝子構築物もしくはトランスジェニック細胞を導入する段階のいずれかであって、該導入する段階が新生内膜病変形成もしくは叢状病変形成の進行を抑制し、または肺血管組織中の既存の新生内膜病変もしくは叢状病変のサイズを縮小させる、段階。
【請求項２８】
遺伝子構築物を用いて実施される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
導入する段階が、罹患哺乳動物の右心室または末梢脈中に遺伝子構築物を投与する段階を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
導入する段階が、遺伝子構造物を含む組成物を吸入によって投与する段階を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
トランスジェニック細胞を用いて実施される、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
トランスジェニック細胞が、平滑筋前駆細胞または内皮前駆細胞である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
遺伝子構築物が、TFPI、TFPI模倣体、不活性化VIIa因子、またはペプチドPARアンタゴニストをコードする、請求項27記載の方法。
【請求項３４】
以下の段階を含む、肺高血圧症を治療する方法：
組織因子活性または組織因子を介した下流のシグナル伝達経路を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子構築物を提供する段階;および
肺高血圧症の症状を示す患者の肺血管組織中の小血管中に遺伝子構築物を導入する段階またはトランスジェニック細胞を導入する段階のいずれかであって、該導入する段階が肺血管組織において叢状病変の程度を低減させ、または小血管の新生内膜閉塞の程度を低減させるのに有効であり、それによって、血管容量を増大させ、かつ肺高血圧症を治療する、段階。
【請求項３５】
遺伝子構築物を用いて実施される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
導入する段階が、罹患哺乳動物の右心室または末梢脈中に遺伝子構築物を投与する段階を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
導入する段階が、遺伝子構造物を含む組成物を吸入によって投与する段階を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
トランスジェニック細胞を用いて実施される、請求項34記載の方法。
【請求項３９】
トランスジェニック細胞が、平滑筋前駆細胞または内皮前駆細胞である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
遺伝子構築物が、TFPI、TFPI模倣体、またはペプチドPARアンタゴニストをコードする、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
肺切除術とそれに続くモノクロタリン投与で幼若げっ歯動物を処置することによって得られる、体重約300g未満の幼若げっ歯動物を含む重度の肺動脈高血圧症のげっ歯動物モデルであって、処置された幼若げっ歯動物は、治療処置がなされない場合、叢状様病変の形成を含む肺動脈高血圧症の症状を発現するげっ歯動物モデル。
【請求項４２】
幼若げっ歯動物がラットである、請求項41記載のげっ歯動物モデル。
【請求項４３】
モノクロタリンが、肺切除術後約5〜約9日目に投与される、請求項41記載のげっ歯動物モデル。
【請求項４４】
幼若げっ歯動物が、約200〜約250gの間である、請求項41記載のげっ歯動物モデル。
【請求項４５】
処置された幼若げっ歯動物が、血管系の新生内膜閉塞および血行動態の変化を示す、請求項41記載のげっ歯動物モデル。
【請求項４６】
以下の段階を含む、肺動脈高血圧症を治療する際に使用するための治療薬をスクリーニングする方法：
請求項41記載のげっ歯動物モデルに治療薬を投与する段階、および
該投与する段階が肺動脈高血圧症の症状の発現を変化させるかどうかを判定する段階。
【請求項４７】
治療薬を投与する段階が、モノクロタリン投与の後である、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
治療薬を投与する段階が、経口的に、吸入によって、鼻腔内滴下によって、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈注射によって、動脈内注射によって、筋肉内注射によって、胸膜腔内点滴によって、腹腔内注射によって、脳室内に、病巣内に、または粘膜への適用によって実施される、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
投与する段階が反復される、請求項47記載の方法。
【請求項５０】
判定段階が、治療薬を与えられるげっ歯動物モデルを、何も与えられないげっ歯動物モデルと比較する段階を含む、請求項46記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００８−５１５９０８（Ｐ２００８−５１５９０８Ａ）
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３５８１２（Ｐ２００７−５３５８１２）
【出願日】平成１７年１０月６日（２００５．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３５９９０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４２０１７
【国際公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【出願人】（３０３０３６４９６）ユニバーシティー オブ ロチェスター (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月６日（２００５．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３５９９０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４２０１７
【国際公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【出願人】（３０３０３６４９６）ユニバーシティー オブ ロチェスター (6)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]