本発明は、少なくとも2つの別個の単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を発現する細胞ライブラリーを作製するための方法を提供する。ここで該結合タンパク質は、異なる標的エピトープを有する。そのようなライブラリーは、ポリペプチド鎖をコードする核酸配列を宿主細胞のゲノム内へ組み込み、そしてこれらの核酸の組み込みに成功した細胞を選択することによって作製される。選択された細胞は、好ましくはクローニング工程に供される。結合タンパク質の混合物は、該混合物の構成成分各々を個別に生成する必要なく生成される。これとともに、異なる標的エピトープを有する少なくとも2つの単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を本質的に各細胞がコードする細胞ライブラリーも提供され、異なる標的エピトープを有する少なくとも2つの別個の単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を含む組成物を作製する方法もまた提供される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる標的エピトープを有する少なくとも2つの別個の単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を各細胞がコードする細胞ライブラリーを作製するための方法であって、トランスフェクトする工程、および全細胞のゲノム内へ該少なくとも2つの単一ポリペプチド鎖をコードする核酸配列を組み込むことを可能にする工程、および成功した組み込みを選択する工程を含む方法。
【請求項２】
トランスフェクトされた細胞がクローニング工程に供される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
単一ポリペプチド鎖結合タンパク質をコードする核酸配列が、結果として生じる結合タンパク質を同一精製方法によって精製できるように、少なくとも70％相同である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
少なくとも2つの結合タンパク質が別個の核酸配列によってコードされる、請求項1、2または3記載の方法。
【請求項５】
少なくとも2つの結合タンパク質をコードする少なくとも2つの核酸配列が、異なる調節エレメントの制御下にある、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
異なる調節エレメントが、プロモーター、好ましくは誘導性のプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、安定化抗リプレッサー（stabilizing anti-repressor）エレメント、内部リボソーム進入部位、マトリックス付着領域、ユビキタスクロマチンオープニングエレメント（ubiquitous chromatin opening element）、境界エレメント、遺伝子座制御領域、またはスカフォールド（scaffold）付着領域から選択される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
異なる調節エレメントが、異なる結合タンパク質の異なる発現レベルをもたらす、請求項5または6記載の方法。
【請求項８】
各細胞が、2〜10個の異なる別個の単一アミノ酸鎖結合タンパク質をコードする、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
少なくとも2つの単一ポリペプチド鎖をコードする少なくとも2つの核酸配列が、同一核酸の一部である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも2つの単一ポリペプチド鎖をコードする少なくとも2つの核酸配列が、2つの異なる核酸の一部である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
各細胞が不死化細胞である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
核酸配列が局在化シグナル、好ましくは分泌シグナルを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
核酸配列が、細胞膜において結果として生じる結合タンパク質を局在化かつ固定するためのコード配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
核酸配列が少なくとも1つの選択性マーカーを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
結合タンパク質をコードする核酸配列の部位特異的組み込みのための手段が提供される、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
手段が相同組み換えのための手段である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
請求項1〜16のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、異なる標的エピトープを有する少なくとも2つの単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を本質的に各細胞がコードする、細胞ライブラリー。
【請求項１８】
異なる標的エピトープを有する少なくとも2つの別個の単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を発現する細胞を生成するための方法であって、請求項17記載のライブラリーを該異なる標的エピトープと接触させる工程、および該標的エピトープを認識する結合タンパク質を発現する細胞を選択する工程を含む方法。
【請求項１９】
スクリーニングおよび/または選択のための手段としてバイオアッセイを実施する工程を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
異なる標的エピトープを有する少なくとも2つの別個の単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を発現し、かつ該標的エピトープのうちの少なくとも1つを含む分子の機能に拮抗することのできる細胞を生成するための方法であって、請求項17記載のライブラリーを該異なる標的エピトープと接触させる工程、および該標的エピトープを認識する結合タンパク質を発現する細胞をスクリーニングかつ選択する工程、および拮抗活性を測定するバイオアッセイを実施する工程を含む方法。
【請求項２１】
異なる標的エピトープを有する少なくとも2つの別個の単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を発現し、かつ該標的エピトープのうちの少なくとも1つを含む分子の機能を活性化できる細胞を生成するための方法であって、請求項17記載のライブラリーを該異なる標的エピトープと接触させる工程、および該標的エピトープを認識する結合タンパク質を発現する細胞をスクリーニングかつ選択する工程、および活性化活性を測定するバイオアッセイを実施する工程を含む方法。
【請求項２２】
細胞が真核細胞である、請求項17記載の細胞ライブラリー。
【請求項２３】
異なる標的エピトープを有する少なくとも2つの別個の単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を含む組成物を作製するための方法であって、1つの細胞において該結合タンパク質をコードする少なくとも2つの核酸配列を発現させる工程を含み、該核酸配列は、結果として生じる結合タンパク質を同一精製方法によって精製できるように、少なくとも70％相同である、方法。
【請求項２４】
少なくとも2つの結合タンパク質が別個の核酸配列によってコードされる、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも2つの結合タンパク質をコードする少なくとも2つの核酸配列が、異なる調節エレメントの制御下にある、請求項23〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
異なる調節エレメントが、プロモーター、好ましくは誘導性のプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、安定化抗リプレッサーエレメント、内部リボソーム進入部位、マトリックス付着領域、ユビキタスクロマチンオープニングエレメント、境界エレメント、遺伝子座制御領域、またはスカフォールド付着領域から選択される、請求項23〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
異なる調節エレメントが、異なる結合タンパク質の異なる発現レベルをもたらす、請求項23〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
各細胞が、2〜10個の異なる別個の単一アミノ酸鎖結合タンパク質をコードする、請求項23〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも2つの単一ポリペプチド鎖をコードする少なくとも2つの核酸配列が、同一核酸の一部である、請求項23〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも2つの単一ポリペプチド鎖をコードする少なくとも2つの核酸配列が、2つの異なる核酸の一部である、請求項23〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
核酸配列が局在化シグナル、好ましくは分泌シグナルを含む、請求項23〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
核酸配列が、細胞膜において結果として生じる結合タンパク質を局在化かつ固定するためのコード配列を含む、請求項23〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
請求項23〜32のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、異なる標的エピトープを有する少なくとも2つの単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を含む、組成物。
【請求項３４】
少なくとも2つの別個の単一鎖結合ポリペプチドをコードする核酸を産生細胞内へ移入する工程をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項３５】
請求項18または34記載の方法によって得ることができる細胞。
【請求項３６】
請求項35記載の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３７】
異なる標的エピトープを有する少なくとも2つの別個の単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を含む組成物を作製するための方法であって、請求項35記載の細胞を培養する工程、異なる標的エピトープを有する該少なくとも2つの別個の単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を該細胞が発現するのを可能にする工程、および異なる標的エピトープを有する該少なくとも2つの別個の単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を収集する工程を含む方法。
【請求項３８】
請求項37のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、異なる標的エピトープを有する少なくとも2つの別個の単一ポリペプチド鎖結合タンパク質を含む、組成物。
【請求項３９】
細胞を第2の細胞と融合させる工程をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項４０】
第2の細胞が請求項35記載の細胞である、請求項39記載の方法。

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図７Ｃ】

【図８】

【図９】

【公表番号】特表２００７−５２０２１８（Ｐ２００７−５２０２１８Ａ）
【公表日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５０９７５（Ｐ２００６−５５０９７５）
【出願日】平成１７年１月１９日（２００５．１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００５／００００３６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６８６２２
【国際公開日】平成１７年７月２８日（２００５．７．２８）
【出願人】（５０６２４９２００）
【Ｆターム（参考）】