線維症の非侵襲性の特異的イメージングのための、ポリペプチド、環状ポリペプチドおよびそれを含む医薬
本発明は、画像診断法、特に、線維症の画像診断法に関する。さらに詳しくは、本発明は、線維症の非侵襲性可視化に適した、ポリペプチド、環状ポリペプチドおよび医薬組成物を提供する。本発明のポリペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−Ｍ−Ｈ−Ｇ−Ｌ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｅ［式中、アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたＰであり；アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたはＬであり；アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり；アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］からなるアミノ酸配列を含み得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、画像診断法、特に、線維症の画像診断法に関する。より詳しくは、本発明は、コラーゲンを特異的に標的とし、線維症の非侵襲性の特異的イメージングに適しているポリペプチド、環状ポリペプチドおよび医薬組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、結合組織による不適当な修復として病理学的に定義されており、基質タンパク質、最も特には、コラーゲンＩおよびＩＩＩ型の合成の増大および分解の減少によって引き起こされる。
【０００３】
線維症は、事実上どの組織および器官系にも影響を及ぼし得る。身体のいかなる部分でも、物理的、熱的、代謝性、虚血性、感染性、炎症性または免疫学的損傷後に過剰の線維症が生じ得、影響を受けた構造、例えば、肺、腎臓、心臓、肝臓、血管系、皮膚、眼、骨髄の破壊を引き起こし得る。線維性組織は、正常な構築物の喪失、間質細胞の不足ならびに高密度な、均一な、ますます安定な細胞外マトリックスによる血管およびその他の必須の実質性の構造の置換を特徴とする。
【０００４】
線維症は、多数の慢性疾患の重要な特徴としてますます認識されており、そのようなものとして、計り知れない健康負荷に相当する。米国政府は、米国における死亡の４５％は、線維症を伴う状態に起因し得ると推定している。
【０００５】
例えば、線維性肝疾患は、世界中で、８番目に最もよくある死亡原因と位置づけられており、毎年、１３０万人の死亡を計上している（ＭｕｒｒａｙおよびＬｏｐｅｚ、１９９７年、Ｌａｎｃｅｔ ３４９、１２６９〜１２７６頁）。線維症の細胞機構は、複雑である。例えば、慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、アルコール性肝疾患または脂肪性肝疾患、薬物誘導性肝疾患または原発性胆汁性肝硬変によって引き起こされる肝臓損傷に応じて、通常は静止状態の肝星状細胞が、活性化されて増殖性筋線維芽細胞となる。結果として、線維症は、組織およびコラーゲン様タンパク質の産生の増大と、これらの化合物の分解の減少によって蓄積し得、その結果、肝臓の機能が損なわれる。特に、ウイルス性慢性肝炎では、線維症の初期の検出は、線維症の発生が、大きな予後不良因子に相当するので、治療上の意思決定にとって臨床上関連がある。
【０００６】
別の例は、加齢と相当に関連している、アテローム性動脈硬化症に関するものである。アテローム性動脈硬化症プラークは、Ｉ型コラーゲンに富んでいる。プラークが、不安定である場合、コラーゲンが血流に曝露されるようになり、動脈血栓症および下流組織の虚血の誘因となる。血栓性虚血性血管事象の危険にある患者を同定するために、不安定動脈硬化病変の非侵襲性分子イメージングは、大いに注目を引く。例えば、最近の研究では、不安定動脈硬化性プラークの非侵襲性イメージングのための、放射標識された可溶性糖タンパク質Ｖｌ（ＧＰＶＩ）物質の実現可能性を評価している。
【０００７】
糖尿病では、間質性線維症を含む糖尿病性心筋症の初期の検出は、心不全の危険のある糖尿病患者の初期の同定のために臨床上注目される。また、特発性拡張型心筋症では、線維症は、主要な予後因子として認識されている。
【０００８】
線維症を診断するために、いくつかのバイオマーカーが探索されてきたが、器官における線維症のｉｎ ｖｉｖｏ可視化のために開発された方法はほとんどない。例えば、最近の研究は、一時的な超音波検査またはＭＲＩ弾性率計測法が、成人患者において肝臓硬直を非侵襲性に測定することによって肝臓線維症を評価するための方法に相当すると示している（ｄｅ Ｌｅｄｉｎｇｈｅｎ Ｖ．ら２００７；Ｔａｌｗａｌｋａｒ ＪＡら２００７年）。また、肝臓線維症の定量化のために、拡散強調ＭＲＩを用いて予備実験が実施された（Ｔａｏｕｌｉ Ｂら、ＡＪＲ Ａｍ Ｊ Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ ２００７年；１８９（４）：７９９〜８０６頁）。
【０００９】
心筋線維症をイメージングするために、ガドリニウム遅延造影（ｄｅｌａｙｅｄ−ｅｎｈａｎｃｅｄ）ＭＲＩを用いていくつかの試みが実施された（Ｔｚｅｌｅｐｉｓ ＧＥら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２００７年；５６（１１）：３８２７〜３６頁）。しかし、これらの技術は、線維症に特異的ではない。またそれらは、多量の線維症が、組織弾性を損なう必要があるので、感度を欠くという欠点を有する可能性がある。線維症の分子イメージングのための特異的イメージングトレーサーは、放射性核種イメージングおよびＭＲＩをはじめ、種々のイメージング様式にとって課題および注目される大きな分野に相当する（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ＭＲＩ ｃｏｎｔｒａｓｔ ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｆｉｂｒｏｓｉｓ、Ｃａｒａｖａｎ Ｐら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２００７年；４６（４３）：８１７１〜７３頁）。ＭＲＩと比較して、特異的放射性核種イメージングは、極めて低いトレーサー用量（ピコまたはナノモル）で、正確な標的対バックグラウンド比を得るのに十分であるので、高い感度と、毒性がないという利点を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｍ−Ｈ−Ｇ−Ｌ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｅ（配列番号１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたＰであり、
Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
Ｘ７は、Ｑ、ＨまたはＬであり；
Ｘ９は、ＷまたはＧであり
Ｘ１０は、ＡまたはＤである］
からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
【００１１】
本発明はまた、本発明のポリペプチドが、２個のシステイン残基の間で結合されたジスルフィドによって環化されている環状ポリペプチドに関する。
【００１２】
本発明はまた、本発明により標識されたポリペプチドまたは標識された環状ポリペプチドを含む造影剤に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の目的は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｍ−Ｈ−Ｇ−Ｌ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｅ（配列番号１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり、
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］
からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
【００１４】
全体として本明細書では、「アミノ酸」とは、天然タンパク質中に見ることができるＬ型のアミノ酸、すなわち、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）およびバリン（Ｖ）を意味すると理解されることを思い起こされたい。しかし、本発明はまた、非天然アミノ酸、すなわち、Ｄ型の前述のアミノ酸ならびにアルギニン、リシン、フェニルアラニンおよびセリンなどのいくつかのアミノ酸のホモ型またはロイシンもしくはバリンのノル型に関する。
【００１５】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥ（配列番号２）、ＲＦＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥ（配列番号３）、ＲＶＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥ（配列番号４）、ＲＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥ（配列番号５）、ＲＶＭＨＧＬＱＬＷＤＤＥ（配列番号６）、ＲＶＭＨＧＬＨＬＷＡＤＥ（配列番号７）、ＦＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥ（配列番号８）、ＰＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥ（配列番号９）およびＲＶＭＨＧＬＬＬＧＡＤＥ（配列番号１０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドが、より良好な親和性でコラーゲンと結合するのを可能にするよう立体構造的に制約され得る。
【００１７】
環化は、当技術分野で周知であり、通常、２つのシステイン残基間で結合されるジスルフィドの組み込みを含む。通常、環は、システイン、ペニシラミン、ホモシステイン、前記のものの組合せの対または側鎖が、１個もしくは２個の硫黄原子のいずれかと連結しているその他の対のアミノ酸間のモノスルフィドまたはジスルフィド橋を含む、側鎖対側鎖環によって形成される。ジスルフィド環状ポリペプチドの合成方法は、当技術分野で周知であり、例えば、ＵＳ３，９２９，７５８、ＵＳ４，２１６，１４１およびＵＳ４，１０２，８７７に記載されている。
【００１８】
したがって、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの環化を可能にするよう、末端にシステイン残基を含み得る。特定の実施形態では、システイン残基は、本発明のポリペプチドの末端とは、１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸分、離れている。通常、アミノ酸は、ポリペプチドのコラーゲン結合を妨げないように選択される。アミノ酸は、グリシンまたはプロリンなどの小さい、中性のアミノ酸の中から選択され得ることが好ましい。プロリンは、構造的に環化に有利に働き得る。別の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの末端をフランキングし、少なくとも１個のシステイン残基を含むトリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｎ末端にＣＧＰトリペプチドおよびＣ末端にＧＰＣトリペプチドを含み得る。
【００１９】
したがって、本発明のポリペプチドは、
ＣＧＰ−Ｘ１−Ｘ２−ＭＨＧＬ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−ＤＥ−ＧＰＣ（配列番号１１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたはＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり；
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］
からなるアミノ酸配列を含み得る。
【００２０】
別の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、
ＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号１２）、ＣＧＰＲＦＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥＧＰＣ（配列番号１３）、ＣＧＰＲＶＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥＧＰＣ（配列番号１４）、ＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥＧＰＣ（配列番号１５）、ＣＧＰＲＶＭＨＧＬＱＬＷＤＤＥＧＰＣ（配列番号１６）、ＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＷＡＤＥＧＰＣ（配列番号１７）、ＣＧＰＦＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号１８）、ＣＧＰＰＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥＧＰＣ（配列番号１９）およびＣＧＰＲＶＭＨＧＬＬＬＧＡＤＥＧＰＣ（配列番号２０）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【００２１】
別の特定の実施形態では、上記のポリペプチドは、ポリペプチドの２個のシステイン残基間のジスルフィド結合によって環化される。
【００２２】
別の特定の実施形態では、本発明は、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００２３】
【化１】
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたはＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり；
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］。
【００２４】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００２５】
【化２】
【００２６】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００２７】
【化３】
【００２８】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００２９】
【化４】
【００３０】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００３１】
【化５】
【００３２】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００３３】
【化６】
【００３４】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００３５】
【化７】
【００３６】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００３７】
【化８】
【００３８】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００３９】
【化９】
【００４０】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００４１】
【化１０】
【００４２】
本発明によって、その他の環化方法が考慮される。例えば、これらの方法として、それだけには限らないが、直交性保護基としてトリメチルシリル（ＴＭＳＥ）エステルを使用するＴＦＡ樹脂上でのペプチド環化を記載するＭａｒｌｏｗｅ（１９９３年、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３：４３７〜４４頁）；オキシム形成による水溶液中での保護されていないペプチドの環化を記載するＰａｌｌｉｎおよびＴａｍ（１９９５年、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２０２１〜２０２２頁）；リシン側鎖アンカリングによる頭尾結合環状ペプチドの固相合成を開示しているＡｌｇｉｎら（１９９４年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３５：９６３３〜９６３６頁）；三次元固相戦略による頭尾結合環状ペプチドの製造を記載しているＫａｔｅｓら（１９９３年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：１５４９〜１５５２頁）；固定化されたペプチドの活性化が、無傷のＮ−保護基とその後の環化につながる除去を用いて実施される、固定化された活性化中間体からの環状ペプチドの合成を記載するＴｕｍｅｌｔｙら（１９９４年、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１０６７〜１０６８頁）；アスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖によって不溶性支持体と結合しているペプチドの頭尾結合環化を開示している、ＭｃＭｕｒｒａｙら（１９９４年、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．７：１９５〜２０６頁）；固体支持体を介してペプチドを環化する代替法を教示する、Ｈｒｕｂｙら（１９９４年、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ２２：２３１〜２４１頁）；ならびにＳｃｈｍｉｄｔおよびＬａｎｇｅｒ（１９９７年、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．４９：６７〜７３頁）によって記載されるものならびにＤａｖｉｅｓ ＪＳ（Ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ ２００３年，８：４７１〜５０１頁）；ならびにＬｉおよびＲｏｌｌｅｒ（ＰＰＣｙｃｌｉｓａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ．Ｃｕｒｒ．Ｔｐ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２年、３：３２５〜４１頁）によって記載されるものが挙げられる。
【００４３】
別の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドまたは環状ポリペプチドは、その末端にスペーサー配列を含み得る。このようなスペーサー配列は、本発明の前記ポリペプチドまたは環状ポリペプチドを、検出可能な物質（例えば、ビオチン部分）を用いて標識するのに適したものであり得る。実際、スペーサー配列は、検出可能な物質の立体障害を防ぐのに有用であり得る。例えば、ビオチンのスペーサー配列は、本発明のポリペプチドまたは環状ポリペプチドのＮ末端と結合され得るＳＧＳＧアミノ酸配列にあり得る。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、
ＳＧＳＧＣＧＰ−Ｘ１−Ｘ２−ＭＨＧＬ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−ＤＥ−ＧＰＣ（配列番号２１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり；
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］
からなるアミノ酸配列を含み得る。
【００４５】
別の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、
ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号２２）；
ＳＧＳＧＣＧＰＲＦＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥＧＰＣ（配列番号２３）；
ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥＧＰＣ（配列番号２４）；
ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥＧＰＣ（配列番号２５）；
ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＱＬＷＤＤＥＧＰＣ（配列番号２６）；
ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＷＡＤＥＧＰＣ（配列番号２７）；
ＳＧＳＧＣＧＰＦＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号２８）；
ＳＧＳＧＣＧＰＰＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥＧＰＣ（配列番号２９）；および
ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＬＬＧＡＤＥＧＰＣ（配列番号３０）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【００４６】
別の特定の実施形態では、本発明は、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００４７】
【化１１】
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり；
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］。
【００４８】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００４９】
【化１２】
【００５０】
以下の制約されたペプチドＳＧＳＧＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣは、「コラジェリン」と名づけられている。
【００５１】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００５２】
【化１３】
【００５３】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００５４】
【化１４】
【００５５】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００５６】
【化１５】
【００５７】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００５８】
【化１６】
【００５９】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００６０】
【化１７】
【００６１】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００６２】
【化１８】
【００６３】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００６４】
【化１９】
【００６５】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００６６】
【化２０】
【００６７】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ペグ化されている。ポリエチレングリコールＰＥＧと、ペプチドのコンジュゲーションは、生物活性期間（半減期）を有意に増大するということは広く実証されている。ＰＥＧは、より安定なコンホメーションを提供し、分子の大きさおよび重量を増大させ、それによって、ペプチドの循環時間を延長する。
【００６８】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、エチレングリコールの反復単位を連結して種々の分子量の直鎖または分岐型のポリマーを形成する方法によって形成される。ＰＥＧは、一般式ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈ（式中、ｎ＞４）の親水性で、生体適合性で、非毒性の水溶性ポリマーである。その分子量は、３００〜４０，０００ダルトンで変わる。
【００６９】
本発明のポリペプチドのペグ化は、当技術分野で公知の方法によって達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールを、直接的に、または介在性リンカーによってのいずれかでタンパク質と結合してもよい。
【００７０】
１つの非限定的な手順として、遊離アミノまたはカルボキシル基などの反応基によってアミノ酸残基を介してポリエチレングリコールが共有結合によって結合されることがある。ポリエチレングリコールとタンパク質を結合するためのリンカーのない系は、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９〜３０４頁（１９９２年）、Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒ Ｊ． ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１〜１８（１９９８年）、ＵＳ４，００２，５３１、Ｕ．Ｓ．５，３４９，０５２、ＷＯ９５／０６０５８およびＷＯ９８／３２４６６に記載されている。
【００７１】
介在性リンカーを用いずに、ポリエチレングリコールとタンパク質のアミノ酸残基を直接的に結合するための１つの系は、トレシルクロリドを使用するモノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）の修飾によって生じるトレシル化ＭＰＥＧを使用する。タンパク質とトレシル化ＭＰＥＧとの反応の際に、ポリエチレングリコールが、タンパク質のアミン基に直接的に結合される。したがって、本発明は、本発明のタンパク質を、２，２，２−トリフルオレオタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スルホニル基を有するポリエチレングリコール分子と反応させることによって生じるタンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートを含む。
【００７２】
ポリエチレングリコールはまた、いくつかの異なる介在性リンカーを使用してタンパク質と結合してもよい。例えば、ＵＳ５，６１２，４６０には、ポリエチレングリコールとタンパク質を結合するためのウレタンリンカーが開示されている。ポリエチレングリコールが、リンカーによってタンパク質と結合しているタンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートはまた、タンパク質と、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロペニルカルボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカルボネートおよび種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体などとの化合物の反応によって製造してもよい。いくつかのさらなるポリエチレングリコール誘導体およびポリエチレングリコールとタンパク質を結合するための反応化学は、ＷＯ９８／３２４６６に記載されている。
【００７３】
各ポリペプチドと結合しているポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換度）もまた変わり得る。例えば、本発明のｐｅｇ化タンパク質は、平均１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０個またはそれ以上のポリエチレングリコール分子と連結され得る。同様に、タンパク質分子１個あたり１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９または１８〜２０のポリエチレングリコール部分などの範囲内の平均置換度。置換度を決定する方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９〜３０４頁（１９９２年）に論じられている。
【００７４】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、オリゴマー化、好ましくは、二量体化される。
【００７５】
オリゴマー化は、科学文献に広く記載されており、安定なポリマーを形成するための単量体のポリペプチドの特定の構築物からなる。
【００７６】
オリゴマー化は、生物活性の大きさおよび重量を増大させ、それによって、ペプチドの循環時間（半減期）を延長する。
【００７７】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドおよび環状ポリペプチドのＮおよびＣ末端は、任意の当技術分野で周知の方法によって保護してもよい。例えば、本発明のポリペプチドおよび環状ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル官能基は、アミドによって置換されてもよい。
【００７８】
本発明のポリペプチドは、当技術分野でそれ自体公知の任意の技術、例えば、限定するものではないが、単独または組み合わせた、任意の化学的、生物学的、遺伝子的または酵素的技術によって製造してもよい。
【００７９】
所望の配列のアミノ酸配列を知ることで、当業者ならば、ポリペプチドの製造のための標準技術によって前記ポリペプチドを容易に製造できる。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは、市販のペプチド合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａによって製造されたもの）を使用し、製造業者の使用説明書に従って合成できる。
【００８０】
あるいは、本発明のポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術が今では当技術分野で周知であるので、それによって合成してもよい。例えば、これらの断片は、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、発現ベクターに組み込み、このようなベクターを、所望のポリペプチドを発現し、後に、周知の技術を使用してそれから所望のポリペプチドが単離され得る、適した真核生物または原核生物宿主に導入した後に、ＤＮＡ発現産物として得てもよい。
【００８１】
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。
【００８２】
通常、前記核酸分子は、ＤＮＡまたＲＮＡ分子であり、これらは任意の適したベクター、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクター中に含めてもよい。用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入し、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進することができる媒介物を意味する。
【００８３】
そのため、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
【００８４】
このようなベクターは、被験体に投与した際に前記ポリペプチドの発現を引き起こすまたは指示するための、調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを含み得る。ベクターは、１種またはいくつかの複製開始点および／または選択マーカーをさらに含み得る。プロモーター領域は、コード配列に対して相同である場合も、非相同である場合もあり、ｉｎ ｖｉｖｏ使用のためを含めた任意の適当な宿主細胞において遍在性発現、構成的発現、調節された発現および／または組織特異的発現を提供する。プロモーターの例として、細菌プロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーターなど）、ウイルスプロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥなど）、哺乳類遺伝子プロモーター（アルブミン、ＰＧＫなど）等が挙げられる。
【００８５】
プラスミドの例として、複製開始点を含む複製プラスミドまたは例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組込みプラスミドが挙げられる。ウイルスベクターの例として、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、当技術分野で公知の技術によって、例えば、パッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、またはヘルパープラスミドまたはウイルスを用いた一時的なトランスフェクションによって製造してもよい。ウイルスパッケージング細胞の代表的な例として、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製に欠陥のある組換えウイルスを製造するための詳細なプロトコールは、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５，８８２，８７７、ＵＳ６，０１３，５１６、ＵＳ４，８６１，７１９、ＵＳ５，２７８，０５６およびＷＯ９４／１９４７８中に見出すことができる。
【００８６】
本発明のさらなる目的は、本発明による核酸および／またはベクターによってトランスフェクト、感染または形質転換されている細胞に関する。用語「形質転換」とは、宿主細胞が、導入された遺伝子または配列を発現して所望の物質、通常、導入された遺伝子または配列によってコードされるタンパク質または酵素を産生するような、宿主細胞への「外来」（すなわち、外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の導入を意味する。導入されるＤＮＡまたＲＮＡを受け取り、発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。
【００８７】
本発明の核酸を使用して、適した発現系において本発明の組換えポリペプチドを製造してもよい。用語「発現系」とは、適した条件下、例えば、ベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための、宿主細胞および適合するベクターを意味する。
【００８８】
よくある発現系として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクターならびに哺乳類宿主細胞およびベクターが挙げられる。宿主細胞のその他の例として、限定するものではないが、原核細胞（例えば、細菌）および真核細胞（例えば、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる。特定の例として、大腸菌、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母および哺乳類細胞系統（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）が挙げられる。
【００８９】
本発明はまた、本発明によるポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を製造する方法であって、（ｉ）上記のようにｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで組換え核酸またはベクターを、コンピテント宿主細胞に導入するステップと、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養するステップと、（ｉｉｉ）場合によって、前記ポリペプチドを発現し、場合によって、分泌する細胞を選択するステップとからなるステップを含む方法に関する。このような組換え宿主細胞を、先に記載されるような、本発明によるポリペプチドの製造のために使用してもよい。
【００９０】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、（ｉ）前記ポリペプチドの発現を可能にするのに適した条件下で、本発明による形質転換された宿主細胞を培養するステップと、（ｉｉ）発現されたポリペプチドを回収するステップとからなるステップを含む方法に関する。
【００９１】
単離された（例えば、精製された）形態の、または膜または脂質小胞（例えば、リポソーム）などのベクター中に含まれる、本発明のポリペプチドを使用してもよい。
【００９２】
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドまたは環状ポリペプチドは、蛍光分子、放射性分子または当技術分野で公知の任意のその他の標識などの検出可能な分子または物質で標識してもよい。通常、（直接的または間接的のいずれかで）シグナルを提供する標識は、当技術分野で公知である。
【００９３】
本明細書において、本発明のポリペプチドまたは環状ポリペプチドに関して、用語「標識された」とは、検出可能な物質をカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）による本発明のポリペプチドまたは環状ポリペプチドの直接標識を包含するものとする。
【００９４】
検出可能な物質の例として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適した酵素の例として、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適した補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適した蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例として、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる。
【００９５】
検出可能な物質は、放射性金属イオン、すなわち、放射性金属であり得る。適した放射性金属は、６４Ｃｕ、４８Ｖ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、９４ｍＴｃまたは６８Ｇａなどの陽電子放射体、９９ｍＴｃ１１１Ｉｎ１１３ｍＩｎもしくは６７Ｇａなどのγ放射体または６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１３６Ｒｅ１、１８８Ｒｅもしくは１９２Ｉｒなどのβ放射体のいずれかであり得る。
【００９６】
この特定の実施形態では、放射性金属を標識するために、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）または１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）などのポリアミノポリカルボキシレートキレーターも開発された。これらのキレーターは、イメージングに適した放射性同位元素、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）のための１１１Ｉｎおよび陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）のための６８Ｇａを用いる標識を可能にする。ポリアミノポリカルボキシレートはまた、９０Ｙおよび１７７Ｌｕ同位元素のための適したキレーターである。
【００９７】
検出可能な物質は、常磁性金属イオンであり得、適したこのような金属イオンとして、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）１ Ｅｒ（ＩＩ）１ Ｎｉ（ＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）またはＤｙ（ＩＩＩ）が挙げられる。
【００９８】
検出可能な物質は、γ放射性の放射性ハロゲンであり得る。放射性ハロゲンは、１２３Ｉ、１３１Ｉまたは７７Ｂｒから選択されることが適している。
【００９９】
検出可能な物質は、陽電子放射性の放射性非金属であり得る。適したこのような陽電子放射体として、１１Ｃ、２３Ｎ、１５Ｏ、１７Ｆ、１８Ｆ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒまたは１２４Ｉが挙げられる。
【０１００】
検出可能な物質は、過分極ＮＭＲ活性核であり得る。このようなＮＭＲ活性核は、ゼロではない核スピン有し得、１３Ｃ、１５Ｎ、１９Ｆ、２９Ｓｉおよび３１Ｐが挙げられる。用語「過分極」とは、ＮＭＲ活性核の平衡分極化を上回る、その分極化の程度の増強を意味する。１３Ｃの天然の存在量は（１２Ｃと比較して）約１％であり、適した１３Ｃ標識化合物は、過分極される前に少なくとも５％、好ましくは、少なくとも５０％、最も好ましくは、少なくとも９０％の存在量に濃縮されることが適している。本発明の造影剤の少なくとも１個の炭素原子は、１３Ｃが濃縮され、続いて、過分極されることが適している。
【０１０１】
検出可能な物質は、ｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングに適したレポーターであり得、レポーターは、光学イメージング手順において直接的または間接的にのいずれかで検出できる任意の部分である。レポーターは、光散乱体（例えば、着色または非着色粒子）、光吸収体または光放射体であり得る。より好ましくは、レポーターは、発色団または蛍光化合物などの色素である。色素は、紫外光から近赤外の波長を有する電磁スペクトルの光と相互作用する任意の色素であり得る。最も好ましくは、レポーターは、蛍光特性を有する。
【０１０２】
好ましい有機発色団レポーターおよび発蛍光団レポーターとして、広範囲に非局在化した電子系を有する基、例えば、シアニン、メロシアニン、インドシアニン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、トリフェニルメチン、ポルフィリン、ピリリウム色素、チアピリリウム色素、スクアリリウム色素、クロコニウム色素、アズレニウム色素、インドアニリン、ベンゾフェノキサジニウム色素、ベンゾチアフェノチアジニウム色素、アントラキノン、ナフトキノン、インダスレン、フタロイルアクリドン、トリスフェノキノン、アゾ色素、分子内および分子間電荷移動色素および色素複合体、トロポン、テトラジン、ｂ／ｓ（ジチオレン）複合体、ビスベンゼン−ジチオレート複合体、ヨードアニリン色素、ｂ／ｓ（Ｓ，Ｏ−ジチオレン）複合体が挙げられる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および異なる吸収／発光特性を有するＧＦＰの修飾などの蛍光タンパク質も有用である。特定の希土類金属（例えば、ユウロピウム、サマリウム、テルビウムまたはジスプロシウム）の複合体も、蛍光ナノ結晶（量子ドット）がそうであるように特定の関連で使用される。
【０１０３】
使用してよい発色団の特定の例として、フルオレセイン、スルホローダミン１０１（テキサスレッド）、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１９、インドシアニングリーン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、マリーナブルー、パシフィックブルー、オレゴングリーン８８、オレゴングリーン５１４、テトラメチルローダミンおよびアレキサフローラ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）３５０、アレキサフローラ４３０、アレキサフローラ５３２、アレキサフローラ５４６、アレキサフローラ５５５、アレキサフローラ５６８、アレキサフローラ５９４、アレキサフローラ６３３、アレキサフローラ６４７、アレキサフローラ６６０、アレキサフローラ６８０、アレキサフローラ７００およびアレキサフローラ７５０が挙げられる。
【０１０４】
可視領域または近赤外（ＮＩＲ）領域、４００ｎｍから３μｍの間、特に、６００から１３００ｎｍの間に吸収最大を有する色素が、特に好ましい。光学イメージング様式および測定技術として、それだけには限らないが、発光イメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光干渉断層法、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡、光音響イメージング、音響光学イメージング、分光法、反射分光法、干渉分光法、コヒーレンス干渉分光法、拡散光トモグラフィーおよび蛍光媒介性拡散光トモグラフィー（連続波、時間領域および周波数領域系）ならびに光散乱、吸収、分極化、発光寿命、蛍光寿命、量子収率およびクエンチングの測定が挙げられる。
【０１０５】
好ましい検出可能な物質は、投与後に、ｉｎ ｖｉｖｏで非侵襲性の方法で外部から検出できるものである。最も好ましいイメージング部分は、放射性、特に、放射性金属イオン、γ放射性の放射性ハロゲンおよび陽電子放射性の放射性非金属、特に、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）を使用したイメージングに適したものである。
【０１０６】
なおさらなる態様では、本発明の目的は、造影剤として本発明の標識されたポリペプチドまたは環状ポリペプチド使用することに関する。
【０１０７】
用語「造影剤」とは、哺乳類において線維症を標的とするよう設計され、哺乳類の身体へのその投与後にｉｎ ｖｉｖｏで検出できる化合物を指す。
【０１０８】
別のさらなる態様では、本発明は、本発明の標識されたポリペプチドまたは環状ポリペプチドを含む造影剤に関する。
【０１０９】
別のさらなる態様では、本発明は、上記の造影剤を、生体適合性担体とともに含む、哺乳類投与に適した形態の医薬組成物を提供する。好ましい実施形態では、医薬組成物は、放射性医薬組成物である。
【０１１０】
「生体適合性担体」は、造影剤が、組成物が生理学的に容認できる、すなわち、哺乳類身体に毒性または過度の不快感を伴わずに投与できるように懸濁または溶解されている、流体、特に、液体である。生体適合性担体媒体は、注射用担体液体、例えば、滅菌注射水、生理食塩水などの水溶液、１種以上の張度調整剤物質（例えば、生体適合性対イオンを用いた血漿陽イオンの塩）、糖（例えば、グルコースまたはスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトールまたはマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）またはその他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液であることが適している。
【０１１１】
さらなる態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を調製するためのキットを提供する。このようなキットは、本発明の標識されたポリペプチドまたは環状ポリペプチドを含む。したがって、このようなキットを再構成するための反応媒体は、上記で定義される「生体適合性担体」であることが好ましく、水性であることが最も好ましい。適したキット容器は、滅菌完全性および／または放射性安全性、ならびに場合によって、不活性のヘッドスペースガス（例えば、窒素またはアルゴン）の維持を可能にしながら、シリンジによる溶液の付加および除去を可能にする密閉された容器を含む。
【０１１２】
キットは、場合によって、放射保護剤、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤またはフィラーなどのさらなる構成要素をさらに含み得る。
【０１１３】
用語「放射保護剤」とは、非常に反応性に富むフリーラジカル、例えば、水の放射線分解に起因する酸素含有フリーラジカルを捕捉することによって、酸化還元プロセスなどの分解反応を阻害する化合物を意味する。本発明の放射保護剤は、アスコルビン酸、パラアミノ安息香酸（すなわち、４−アミノ安息香酸）、ゲンチジン酸（すなわち、２，５−ジヒドロキシ安息香酸）および生体適合性陽イオンとのそれらの塩から適宜選択される。「生体適合性陽イオン」およびその好ましい実施形態は、上記のとおりである。
【０１１４】
本発明の造影剤または医薬組成物は、線維症のｉｎ ｖｉｖｏイメージングにとって有用である。したがって、なおさらなる態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断法またはイメージング法、例えば、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴにおいて使用するための本発明の造影剤または医薬組成物を提供する。前記方法は、線維症を伴う状態、例えば、肺線維症、肝臓腎臓線維症、心臓線維症、血管系線維症、皮膚線維症、眼線維症、骨および骨髄線維症のｉｎ ｖｉｖｏ診断またはイメージングに関することが好ましい。特定の実施形態では、本発明の造影剤または医薬組成物は、アテローム性動脈硬化症および心筋梗塞、糖尿病性および特発性心筋症のｉｎ ｖｉｖｏイメージングに適している。
【０１１５】
本発明のこの態様はまた、線維症を伴う状態の患者におけるｉｎ ｖｉｖｏ診断またはイメージングのための方法であって、本発明の医薬組成物の先行投与を含む方法を提供する。本発明によれば、用語「患者」は、線維症に冒された、または冒される可能性が高いヒトまたは非ヒト哺乳類を対象とする。前記患者は、好ましくは、哺乳類、最も好ましくは、ヒトである。「事前に投与された」とは、医薬が患者に、例えば、静脈内注射によって投与される、臨床医が関与するステップが、すでに実施されていることを意味する。
【０１１６】
あるいは、本発明は、患者において線維症を伴う状態をイメージングする方法であって、
ａ）本発明の造影剤または医薬組成物を提供するステップと、
ｂ）前記患者に、前記造影剤または医薬品を投与するステップと、
ｃ）前記患者において、前記造影剤を検出するステップと
からなるステップを含む方法を提供する。
【０１１７】
本発明の別の態様はまた、線維症を伴う状態のｉｎ ｖｉｖｏ画像診断法のための医薬組成物の製造のための、本発明の造影剤の使用を包含する。
【０１１８】
本発明の別の態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのコラーゲンの直接ターゲッティングのための特定のツールとしての造影剤の使用に関する。
【０１１９】
本発明を、以下の図および実施例を考慮してさらに例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】９Ｏ１２．２結合性細菌クローンのイムノブロッティング。Ａ：単離した細菌クローンを溶解し、非還元状態での電気泳動によってタンパク質を分離し、９Ｏ１２．２ＩｇＧを使用してイムノブロットすることによって分析した。ＦｌｉＴｒｘ融合タンパク質の予測質量に相当するＭｒ約６３ｋＤａの陽性バンドを観察すると、これらのクローンによって提示されるペプチドは、９Ｏ１２．２と結合していることが示された。結果は、６種の選択されたクローン（クローン１３、１４、１５、１６、１７、１８からの抽出物について、および無関係の抗体を使用して同一のライブラリーから得られたクローンの溶解物を用いて実施された陰性対照について示されている。Ｂ〜Ｃ：９Ｏ１２．２と結合するコラジェリン（ｃｏｌｌａｇｅｌｉｎ）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ビオチンとカップリングした、クローン１４によって発現される配列に対応するペプチド（コラジェリン）を合成し、ストレプトアビジンコーティングされたセンサーチップ上に固定化した（２０ＲＵの平均）。Ｂでは、漸増濃度の９Ｏ１２．２ＩｇＧを、センサーチップ上に流した（０、１．２５、２．５、５および１０μｇ／ｍｌ）。無関係のペプチドでコーティングされた対照フローセルから得られた非特異的バックグラウンドを差し引いた後の代表的なセンサーグラムが示されている。Ｃ：固定化されたビオチン−コラジェリンを、ＤＴＴを使用してセンサーチップ上で還元した。９Ｏ１２．２ＩｇＧ（８μｇ／ｍｌ）を、センサーチップ上に注入し（黒色センサーグラム）、還元されていないペプチド（灰色センサーグラム）と比較して、還元されたペプチドとは結合しなかった。Ｄ：９Ｏ１２．２ＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）を、組換え可溶性ＧＰＶＩ（２５μｇ／ｍｌ）の存在下で、固定化されたビオチン−コラジェリン上に注入し（灰色センサーグラム）、これは、対照条件（黒色センサーグラム）と比較した場合に、ＩｇＧとペプチドの結合を完全に阻害した。組換えＧＰＶＩは、固定化されたペプチドと結合しなかった（明灰色センサーグラム）。
【図２】コラジェリンとコラーゲンの相互作用：Ａ コラーゲンを、ストレプトアビジンコーティングされたセンサーチップ上に固定化されているビオチン−コラジェリン上に注入した。コラジェリンコーティングされた表面上に約１０ＲＵコラーゲンが結合された（暗色）。フィットも示されている（灰色）。無関係のペプチドでコーティングされた対照フローセルから得られた非特異的バックグラウンドシグナルを差し引いた。Ｂ コラジェリンと、固定化されたコラーゲンの結合。漸増量のビオチン−コラジェリン（２５０、５００μｇ．ｍＬ−１）を、ＣＭ５センサーチップ上に固定化されたコラーゲン上に注入した。ペプチドを用いて得られたセンサーグラムおよび相互作用フィットが、黒色および灰色でそれぞれ示されている。無関係のペプチドを使用して測定される非特異的バックグラウンドを差し引いた。
【図３】コラーゲンとの、および種々の高分子とのペプチド相互作用：Ａ 微量滴定プレートにおける、コラジェリンと、固定化されたコラーゲンの結合。ビオチン−コラジェリンまたは対照ペプチドを、固定化された線維性Ｉ型コラーゲンとともにインキュベートし、ペルオキシダーゼがカップリングしているエクストラビジン（ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎｅ）を使用して、結合しているペプチドを検出した。競合実験では、コラジェリンを組換え可溶性ＧＰＶＩ（５０および２０μｇ．ｍＬ−１）、９０１２ＩｇＧ（５０および２０μｇ．ｍＬ−１）または３Ｊ２４．２ＩｇＧ（５０μｇ．ｍＬ−１）と混合し、その後、コラーゲンでコーティングされたウェルに加えた。Ｂ：ビオチン−コラジェリンまたは対照ペプチド（５０μｇ．ｍＬ−１）と、固定化されたフィブリノゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニンの結合。種々のタンパク質を用いた微量滴定ウェルのコーティングを、コラーゲンと同様に実施した。ペルオキシダーゼがカップリングしているエクストラビジンを使用して、結合しているペプチドを検出した。
【図４】コラジェリンファミリーペプチドとコラーゲンの結合：Ａ ビオチンとカップリングした、２０種の選択されたクローンから同定された９種の配列に対応するペプチドを合成した。１００μｇの各ペプチドを、固定化されたコラーゲンとともにインキュベートし、ペルオキシダーゼがカップリングしたストレプトアビジンを使用して検出した。結果は、三連で行った３実験の平均±ＳＤである。Ｐｃは、環状非関連ペプチドに相当する。＊は、コラジェリンを示す。Ｂ ３種のペプチドについて、ペプチド濃度の関数としてのコラーゲンとの結合が示されている。クローン１６、１９および１４（コラジェリン）の配列に対応する漸増量の合成ペプチドを、コラーゲンがコーティングされたプレート上でインキュベートし、上記のように検出した。
【図５】組織コラーゲンとのペプチド結合の組織化学的分析：Ａ ラットから得た大動脈の凍結切片を、ビオチン−コラジェリンまたは対照ペプチド（３００μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートし、ペルオキシダーゼがカップリングしているストレプトアビジンを使用して検出した。切片を、ヘマトキシリンを用いて対比着色した。連続切片を、コラーゲンについてシリウスレッドを用いて着色した。競合実験では、ペプチドを、抗ＧＰＶＩ ＩｇＧ９Ｏ１２１．２（３００μｇ／ｍＬ）と混合し、その後、大動脈切片に加えた。Ｂ ラット尾腱のパラフィン包埋切片を、上記のように処理した。
【図６】コラジェリン−ストレプトアビジン−Ｔｃ９９ｍを使用する、ｉｎ ｖｉｖｏシンチグラフィー、ｅｘ−ｖｉｖｏ心筋オートラジオグラフィーおよび組織学的検査。Ａ：対照ラット（偽）の平面胸部シンチグラフィー。Ｂ：線維性心筋梗塞を有するラットの平面および断層撮影（矢状図）胸部像：左心室心筋領域中にホットスポット（矢印）が見られる。Ｃ：薄層化線維性（赤）心筋瘢痕（矢印）におけるトレーサー取り込みを確認する、対応する心筋オートラジオグラフィーおよび組織学的検査（コラーゲンに特異的な、レッドシリウス呈色）。Ｄ：対照実験：無関係のＰｃ−ストレプトアビジン−Ｔｃ９９ｍを注射されたラットの心筋瘢痕では、活性は観察されない。
【図７】コラジェリン−Ｔｃ９９ｍを使用する、ｉｎ ｖｉｖｏシンチグラフィー、ｅｘ−ｖｉｖｏ心筋オートラジオグラフィーおよび組織学的検査：Ａ：線維性心筋梗塞を有するラットの平面胸部シンチグラフィー：左心室心筋領域中に明確なホットスポット（矢印）が見られる。Ｂ：薄層化線維性（赤）心筋瘢痕におけるトレーサー取り込みを確認する、対応する心筋オートラジオグラフィーおよび組織学的検査（コラーゲンに特異的なレッドシリウス呈色）。Ｃ：対照実験：無関係のＰｃ−Ｔｃ９９ｍを注射されたラットの心筋梗塞では、極めて低い活性が観察される。
【図８】９９ｍ Ｔｃ−Ｂ−コラジェリン−を使用する、ｉｎ ｖｉｖｏ肺シンチグラフィー。
【図９】９９ｍ Ｔｃ−Ｂ−コラジェリン−を使用する、ｅｘ−ｖｉｖｏ肺オートラジオグラフィー。ブレオマイシン処理した、または対照マウスから得た肺の切片（２０μＭ）を、オートラジオグラフィー（９９ｍ−ＴｃコラジェリンＩＶ投与の３時間後に屠殺）のためにインスタントイメージャー（Ｐａｃｋａｒｄ、ＵＳＡ）において曝露させた。
【図１０】：肺における９９ｍ Ｔｃ−Ｂ−コラジェリンの取り込みおよび線維症の局在の比較。ブレオマイシン処理したマウスから得た肺の切片（２０μＭ）を、オートラジオグラフィー後にシリウスレッドを用いて染色した。線維性コラーゲンの豊富な領域（矢印）を、９９ｍ−Ｔｃ−コラジェリン取り込みと重ね合わせたが、線維症では、対照ペプチドの取り込みはないことが観察される。
【０１２１】
＜実施例１＞
コラーゲン結合活性を用いた、ヒト血小板糖タンパク質Ｖｌのペプチド模倣体の同定および特性決定。線維症の分子イメージングのためのその使用。
材料＆方法：
ＦｌｉＴｒｘ（商標）ペプチドライブラリーおよび抗ＧＰＶＩ抗体：ＦｌｉＴｒｘ（商標）ランダムペプチドディスプレイライブラリーは、ペプチド相互作用のスクリーニングを可能にする大腸菌ベースの系である。ＦｌｉＴｒｘ（商標）ライブラリーは、ｐＦｌｉＴｒｘ（商標）ベクター（Ｌｕ Ｚ．ら１９９５年）で構築した。ランダムドデカペプチドの多様なライブラリー（１０８）は、細菌フラジェリン遺伝子（ｆｌｉＣ）の不要な領域の内側の、チオレドキシンタンパク質（ｔｒｘＡ）の活性部位ループ中に位置している。得られた組換え融合タンパク質（ＦＬＩＴＲＸ）は、細菌細胞表面上に、輸送され、部分的に機能的な鞭毛に組み立てられる。ドデカペプチドは、ジスルフィド橋によって立体構造的に制約されて、細胞表面に表示される。この系に基づいたＦｌｉＴｒｘ（商標）ランダムペプチドライブラリーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手した。
【０１２２】
抗ヒト血小板ＧＰＶＩ９Ｏ１２．２ ＩｇＧおよび可溶性組換えＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、先に記載されたように入手した（Ｌｅｃｕｔ Ｃら２００３年）。
【０１２３】
ランダムペプチドディスプレイライブラリーのスクリーニング：細菌培養および一般的なパニング法を、製造業者のプロトコールに従って実施した。手短には、発現を駆動するバクテリオファージに由来するＰＬプロモーターを含むｐＦｌｉＴｒｘ（商標）ベクターを、大腸菌ＧＩ８２６株（Ｆ、ｌａｃｌｑ、ａｍｐＣ：：Ｐｔｒｐ ｃｌ、ΔｆｌｉＣ、ΔｍｏｔＢ、ｅｄａ：：Ｔｎ１０）で増殖させた。プラスミドをもつ細菌を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する、ＩＭＣ培地［１％ Ｍ９塩（４０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．５ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ）、０．２％カサミノ酸、０．５％グルコース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２］中で、２５℃で一晩増殖させた。ペプチド挿入を含む、チオレドキシン−フラジェリン融合タンパク質の発現を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１００μｇ／ｍＬトリプトファンを含有するＩＭＣ培地５０ｍＬに、１０８個細胞（３ｍＬ）の一晩培養物を加えることによって誘導した。培養物を２５℃で６時間増殖させた。６時間インキュベートした後、１０ｍＬの誘導された大腸菌培養物を採取し、１％の脱脂粉乳、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）およびα−メチルマンノシド１％（最終濃度）に混合した。得られた溶液を、以下のスクリーニングのための準備の整ったペプチドライブラリーとして使用した。
【０１２４】
滅菌組織培養プレート（Ｎｕｎｃ）は、１ｍＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中、２０μｇの９Ｏ１２．２ ＩｇＧを用いて４℃で一晩コーティングした。プレートを、１０ｍＬの滅菌水で洗浄し、穏やかな撹拌下、１０ｍｌのブロッキング溶液（ＩＭＣ培地中、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ｗ／ｖの脱脂粉乳、１％ｗ／ｖのα−メチルマンノシドおよび１００μｇ／ｍＬアンピシリン）とともに１時間インキュベートした。次いで、誘導された細菌培養物のアリコーティング（５ｍｌ）をプレートに加えた。次いで、プレートを、シェーカー上、５０ｒｐｍで１分間穏やかに撹拌し、２５℃で１時間インキュベートした。次いで、細菌懸濁液を破棄し、プレートを、アンピシリンおよびα−メチルマンノシドを含有するＩＭＣ培地４ｍＬとともに５分間穏やかに撹拌することによって洗浄した。さらに４回洗浄した後、ＩＭＣ１ｍＬとともに３０秒間激しく撹拌することによって、結合している細菌を分離した。細菌懸濁液の少量のアリコーティングを、ＩＭＣ培地で希釈し、ＲＭＧ（１％ Ｍ９塩、２％カサミノ酸、０．５％グルコース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１．５％寒天）プレート上に均等に広げ、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。各パニングの後、細菌を−８０℃で凍結した。５ラウンドのバイオパニング後、ＲＭＧプレートから細菌コロニーを無作為に選び取り、さらなる同定のために増幅および誘導した。
【０１２５】
ウエスタンブロッティング分析：ウエスタンブロッティングによる陽性クローンの同定を、原則的に製造業者のプロトコールに従って行った。手短に述べると、増幅されたクローン培養物１０ｍＬを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＲＭ培地（１％ Ｍ９塩、２％カサミノ酸、１％グリセロール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）２ｍｌに移し、振盪しながら３０℃で飽和まで増殖させた。一晩培養物から得た４０μＬのサンプルを、３７℃で、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１００μｇ／ｍＬトリプトファンを含有するＩＭＣ ２ｍＬに、細胞密度がＡ６００ｎｍ０．５〜０．６に達するまで播種した。１．５ｍＬの誘導された細胞培養物を、１０，０００ｇで５分間の遠心分離によって回収した。ペレットを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルローディングバッファーに再懸濁し、５分間煮沸した。タンパク質を１２％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分離し、一晩のパッシブトランスファーによってニトロセルロース上にブロットした。メンブランを２．５％ Ｂｌｏｔｔｏ／ＰＢＳを用いて室温で２時間ブロッキングし、次いで、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、９Ｏ１２ ＩｇＧ、１０μｇ／ｍＬとともに２時間インキュベートした。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、メンブレンを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＡＰ）がコンジュゲートしているウサギ抗マウスＩｇＧとともに室温で１．５時間インキュベートした。さらに３回の洗浄手順の後、結合しているＩｇＧを、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを使用して検出した。
【０１２６】
ＤＮＡ配列決定：選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、プラスミドＤＮＡ抽出の標準プロトコール（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、２００１年）を使用して単離した。ＰＲＩＳＭ３１０自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ、ＣＡ）およびＦＬＩＴｒｘ（商標）フォワード配列決定プライマー（５’−ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＴＧ ＡＣＴ ＧＡＣ ＧＡＣ−３’）を使用して、ヌクレオチド配列を決定した。各選択されたクローンのペプチド配列をＤＮＡ配列決定から推定した。
【０１２７】
ペプチド合成：１０種の同定されたうちの１種の配列を、大規模ペプチド合成およびさらなる特性決定のために選択した。ペプチドを、短い柔軟なスペーサー（ＳＧＳＧ）配列を介して、Ｎ末端で遊離またはビオチン化のいずれかで合成した。環化は、配列をフランキングする、システイン残基（Ｃ５およびＣ２２）のジスルフィド橋形成によって得た。ペプチドのＣ末端のカルボキシル官能基を、アミドで置換した。ペプチドを、半自動化マルチシンセタイザー（ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｈｅｔｉｚｅｒ）ＮＰＳ４０００（ＮｅｏＭＰＳ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）を用い、メリフィールドの固相法によって調製した。そのように得られたペプチドの配列は、ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣであった。合成されたペプチド（ビオチン化または非ビオチン化）の品質は、ＨＰＬＣおよび質量分析によって評価した。前記ポリペプチドは、コラジェリンと名づけた。
【０１２８】
Ｎ末端でビオチン化された、非環状ビオチン化ペプチド（ＳＧＳＧＶＮＶＹＡＶＴＫＥＮＴＩＩＮＰＳＥＮＧＤ）および環状ペプチドＰｃ（ＳＧＳＧＣＧＰＮＤＡＮＨＤＡＶＤＮＡＲＧＰＣ）（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ、Ｃｌａｙｔｏｎ Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、対照実験のための無関係のペプチドとして使用した。
【０１２９】
結合実験：タンパク質標的とのペプチド結合を、表面プラズモン共鳴および固相アッセイを使用して分析した。
【０１３０】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：
Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｏｒｓａｙ、Ｆｒａｎｃｅ）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｐａｒｉｓ ７、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｊａｃｑｕｅｓ Ｍｏｎｏｄ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、合成したペプチドの結合特性を特性決定した。ビオチン化ペプチド（約２０ＲＵ）を、ＳＡ−センサーチップの表面と共有結合によってカップリングした。
【０１３１】
９Ｏ１２．２ＩｇＧを、２５℃で、ＨＢＳ−ＥＰバッファー［０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート２０（ｖ／ｖ）］中、２０μＬ．ｍｉｎ−１の流速で固定化したペプチド上に注入した。グリシン−ＨＣｌ（１０ｍＭ ｐＨ２．５）を、２０μＬ．ｍｉｎ−１で３０秒間注入して、各サンプル間のセンサーチップを再生した。センサーグラムを、ＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．１ソフトウェアを用いて分析した。１．２５〜１０μｇ．ｍＬ−１の範囲の４種の異なるＩｇＧ濃度で、会合および解離速度の分析から速度定数（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ）を推定した。解離定数ＫＤは、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎから算出した。センサーグラムは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．１ソフトウェアを用いて分析した。いくつかの実験では、ＩｇＧの注入に先立って、ペプチドを、センサーチップ上でＤＴＴによって還元した。競合実験は、ＩｇＧを、組換え可溶性ＧＰＶＩ（２５μｇ．ｍＬ−１）と混合することによって実施した。ペプチドとのコラーゲン結合は、ペプチドでコーティングしたセンサーチップ上に、Ｉ型ウマコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｈｏｒｍ、Ｎｙｃｏｍｅｄ． Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＥＢＳ−ＥＰバッファー中、２００μｇ．ｍＬ−１）を注入することによって分析した。
【０１３２】
その他の実験では、線維性コラーゲンを、製造業者の使用説明書に従ってＣＭ５−センサーチップ上に手作業で固定化した（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。ビオチン化ペプチド（１２５；２５０、５００および１０００μｇ／ｍＬ）を、２５℃、２０μＬ．ｍｉｎ−１の流速で固定化されたコラーゲン上に注入した。競合実験では、ペプチドを、表面上への注入に先立って、組換え可溶性ヒトＧＰＶＩ−Ｆｃまたは９Ｏ１２．２ＩｇＧとともにプレインキュベートした。表面プラズモン共鳴強度をモニターし、ＢｉｏＥｖａｌ２．０（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用してデータを分析した。
【０１３３】
固相アッセイ：
タンパク質［Ｉ型ウマ線維性コラーゲン（Ｈｏｒｍ）、ウシフィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ）、ヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、ラットビトロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、マウスラミニン（Ｇｉｂｃｏ）、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ Ｓｉｇｍａ）］を、微量滴定プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ Ｄｙｎｅｘ ｖＷＲ）上に、４℃で２４時間コーティングした（１μｇ／ウェル）。遊離部位がＢＳＡで飽和した後に、ウェルにビオチン化ＦＬｌＧＰＶＩペプチド（５０μｇ／ｍｌ）を２時間加えた。次いで、ウェルと結合しているペプチドを、基質としてエクトラビジン−ＨＲＰおよびオルトフェニルジアミンを使用して検出した。
【０１３４】
組織化学的分析：２−メチルブタン中で凍結した後、ルイスラットから得た胸部大動脈の８μｍの切片を、クリオスタットミクロトームで切断した。内因性ペルオキシダーゼの不活性化、内因性ビオチン部位および非特異的部位を、０．３％ Ｈ２Ｏ２、２０分間、ビオチンブロッキング系（ＤＡＫＯ）および１％ ＢＳＡによってブロッキングした。各ステップの後、切片をＴＢＳ ｐＨ７．６で洗浄した。切片に、ビオチン化ペプチド（２００μｇ／ｍＬ）を４℃で一晩適用した。３回の洗浄ステップの後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ）およびジアミノベンジジンを使用して染色を実施した。切片を、ヘマトキシリン−エオシン（Ｍｅｒｃｋ）を用いて対比着色した。
【０１３５】
ラット尾腱を切除し、−２０℃でｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴを用いて包埋した。２０μＭの切片を切断し、さらに上記のように処理した。
【０１３６】
あるいは、凍結切片を、ホルモールを用いて１０分間固定した。再水和後、シリウスレッドを使用してコラーゲンを着色した。
【０１３７】
ペプチド放射標識：ストレプトアビジンのテクネチウム−９９ｍを用いる標識：手短には、ストレプトアビジンを、１ｍｇ．ｍＬ−１の濃度に０．０１％酢酸に溶解した。標識のために、反応物を、以下の順で１分間混合した：最初に、１０μＬのストレプトアビジン、続いて、４μＬのスズ（ｓｎ−ＰＹＰ）および２μＬのＫＢＨ４（０．１Ｎ ＮａＯＨ中、１０ｍｇ／ｍｌ）、および５０〜１００μＬ中、７４０ＭＢｑのテクネチウム−９９ｍ。３０分後、溶液は注射の準備が整った。品質管理は、メチル−セトン（ｍｅｔｈｙｌ−ｃｅｔｏｎｅ）を使用するペーパークロマトグラフィーを用いて実施した。標識されたストレプトアビジンは、移動できなかった。遊離テクネチウムは、溶媒フロントとともに移動した。３０分で、９６％を上回る高効率の標識が得られた。注射の直前に、標識されたストレプトアビジンを、ビオチン−コラジェリンと、１対４のモル比で混合した。
【０１３８】
コラジェリンＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣを、上記と同一手順、濃度（１０μＬの０．０１％コラジェリン１ｍｇ．ｍＬ−１）および対照を使用して直接標識した。いずれの場合にも、３０分で９６％を上回る高効率の標識が得られた。
【０１３９】
対照分析のためには、上記の手順を使用して、９９ｍＴｃ−ストレプトアビジンを用いて、または直接的に、Ｔｃ−９９ｍによって放射標識した後に、環状Ｐｃビオチン化ペプチドを使用した。
【０１４０】
標識されたストレプトアビジンおよびペプチドは、少なくとも３時間安定であり、次いで、６時間で４０〜５０％の遊離テクネチウムを伴って減少した。標識された生成物を、７０ＭＢｑ／動物の用量で静脈内に注射した。
【０１４１】
ｉｎ ｖｉｖｏシンチグラフィーイメージング：雄のウィスターラット（Ａｒｌａｎｄ、Ｆｒａｎｃｅ）を、１２：１２時間、明−暗周期で、温度および湿度を制御した環境に収容し、標準ラット固形飼料および水を、自由に給餌した。記載されるように（Ｆｉｓｈｂｅｉｎ ＭＣ．ら１９７８年；Ｓａｒｄａ−Ｍａｎｔｅｌ Ｌ．ら２００６年）、ラットを麻酔［１ｍｌ／ｋｇ ｉｐケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ ５００、Ｍｅｒｉａｌ）および０．５ｍｌ／ｋｇ ｉｐ キシラジン（２％Ｒｏｍｐｕｎ、Ｂａｙｅｒ）］および陽圧換気下におきながら、左下行冠動脈の持続的結紮によって、左心室の心筋梗塞を得た。このプロトコールは、Ｆｒｅｎｃｈ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｄｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｅｓの承認（承認番号７５−２１４）の下、実施される。２種類の対照動物を使用した：健常なラットおよび簡単な開胸術（ｔｈｒｏｒａｃｏｔｏｍｙ）が実施された（偽手術された）ラット。
【０１４２】
放射線核種イメージングは、病変が治癒されるよう、冠動脈結紮（または開胸術）の３〜４週間後に実施した。標識されたペプチドを、放射標識の２時間以内に麻酔をかけた動物（ペントバルビタール６ｍｇ／１００ｇ、ＢＷ、Ｃｅｖａ Ｓａｎｔｅ Ａｎｉｍａｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ腹膜内注射）に静脈内投与した。ペントバルビタール麻酔（４ｍｇ／１００ｇ ＢＷ、Ｃｅｖａ Ｓａｎｔｅ Ａｎｉｍａｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）下で、９９ｍＴｃ−ストレプトアビジン−ビオチン化ペプチド（７４ＭＢｑ）の注射の０〜２時間、４時間、６時間、１０時間および２４時間後、９９ｍＴｃ−ビオチン化ペプチド（７４ＭＢｑ）の注射の０〜２時間および４時間後にシンチグラフィー像を得た。平面および断層撮影１時間獲得を、２パラレル低エネルギー用高分解能コリメーター（マトリックス１２８×１２８、１４０ＫｅＶを中心とした１５％エネルギーウィンドウ）を備えた、専用の小動物γＩＭＡＧＥＲ−Ｓ／ＣＴシステム（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｍｅｓｕｒｅｓ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して実施した。左心領域におけるＡＮＸ取り込みを、視覚的に評価した。また、心臓にわたる、および右肺にわたる２つの注目する領域が、シンチグラムで描かれた。注目する各領域で、１ピクセルあたりの平均活性（ｃｐｍ）を決定した。次いで、心臓対肺活性比（ＨＬＲ）を、平面像で、ならびに横断断層撮影像で算出した。
【０１４３】
定量的オートラジオグラフィーおよび組織学的検査：動物を屠殺した後、心臓を採取および凍結し、次いで、クリオスタットで、２０マイクロメーター厚の心筋切片を、心室の短軸に対して垂直に切断し、次いで、ラジオイメージャー（ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒ）（インスタントイメージャー、Ｐａｃｋａｒｄ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＵＳＡ）中で１２時間曝露した。組織と等価のホモジネートの活性標準を用いて、先に報告されたように実施した較正研究によれば、５０カウント／ｍｍ２の９９ｍＴｃ−アネキシンＶは、オートラジオグラフィーで２１０ｋＢｑ／ｍｇに近似した（Ｐｅｔｅｇｎｉｅｆ Ｙ．ら１９９８年）。次いで、アセトン（−２０℃）中で固定された、オートラジオグラフィーのために使用した心筋切片ならびに５マイクロメートルの連続心臓切片を、ヘマトキシリン−エオシンおよびシリウスレッドで染色して、線維性心筋瘢痕の位置および程度を決定した。
【０１４４】
結果：
９Ｏ１２．２−結合性ペプチドの同定：９Ｏ１２．２ ＩｇＧを使用する、ドデカマーに制約されたペプチドのコンビナトリアルライブラリーの５ラウンドのバイオパニング後、いくつかの個々の細菌クローンが得られた。１２のクローンを選択し、ｌｇＧ９Ｏ１２．２を使用するイムノブロッティングによって分析した（図１Ａ）。これらのクローンは、９Ｏ１２．２によって標識された融合鞭毛タンパク質を産生し、このことは、抗体によって認識されるペプチドを含むことを示す。
【０１４５】
２０クローンのＤＮＡ配列決定の結果、表１）に示される９ペプチド配列が同定された。
【０１４６】
【表１】
【０１４７】
これらの配列は、１〜４個の残基で互いに異なっている。これらの配列のうち、データベースに登録されたものはなかった。
【０１４８】
対応するクローンが、９Ｏ１２．２を用いるイムノブロッティングにおいて、より強いシグナルを生じたので（図１Ａ）、クローン１４の配列を合成のために選択した。以下の制約されたペプチドＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（コラジェリンとして設計された）を合成し、Ｎ末端と連結しているビオチンとコンジュゲートするか、しなかった（「ビオチン−コラジェリン」を設計した）。両ペプチドの純度は、９５％よりも高いと、ＨＰＬＣ分析によって測定された。それらの分子量は、それぞれ２１５５および２４０５Ｄａであった。
【０１４９】
ペプチドを、９Ｏ１２．２ＩｇＧと結合するその能力、および固相アッセイにおいてＧＰＶＩと競合するその能力について分析した。表面プラズモン共鳴を使用して、９Ｏ１２．２ＩｇＧは、固定化されたビオチン−コラジェリンと用量依存的に結合するとわかった（図１Ｂ）。推定されるＫＤは、１０−６Ｍであった。ビオチン−コラジェリンをジスルフィド橋還元に付すと、これは、９Ｏ１２．２エピトープが、立体構造的であるというこれまでに報告された知見（Ｌｅｃｕｔ Ｃ．ら２００３年）と一致して、９Ｏ１２．２ＩｇＧと結合する能力を喪失した（図１Ｃ）。さらに、９Ｏ１２．２は、組換え可溶性ＧＰＶＩ（ＧＰＶＩ−Ｆｃ）の存在下でペプチドと結合できず（図１Ｄ）、このことは、ＧＰＶＩおよびコラジェリンは、９Ｏ１２．２との結合について競合したということを示した。
【０１５０】
コラーゲンとの結合：これらのデータが、コラジェリンは、ＧＰＶＩに対する９Ｏ１２．２のエピトープを少なくとも部分的に摸倣すると仮定することにつながった。９Ｏ１２．２は、コラーゲンとのＧＰＶＩ結合を中和するので、本発明者らは、コラジェリンは、ＧＰＶＩのコラーゲン結合部位を少なくとも部分的に摸倣できると仮定した。したがって、本発明者らは、コラジェリンのコラーゲンと相互作用する能力を調べた。
【０１５１】
本発明者らは、ビオチン−コラジェリンが固定化されている、ストレプトアビジンコーティングしたセンサーチップを使用して、Ｉ型コラーゲンと表面の結合を観察した（図２Ａ）。次いで、アミンカップリング手順によって、Ｉ型コラーゲンをＣＭ５センサーチップ上に固定化した。本発明者らは、漸増濃度のビオチン−コラジェリン（１２５；２５０、５００および１０００μｇ／ｍＬ）を使用して、用量依存性結合を観察した。センサーグラムの分析によって、１．１０−７ＭというＫＤを算出することが可能であった（図２Ｂ）。
【０１５２】
微量滴定プレート上に固定化されているコラーゲンを使用して、コラーゲンとのペプチド相互作用をさらに分析した。無関係のペプチドと比較した場合には、ビオチン−コラジェリン（５０μｇ／ｍＬ）は、コラーゲンと有意に結合した（図３Ａ）。結合は、組換え可溶性ＧＰＶＩの存在下、または９Ｏ１２．２ＩｇＧの存在下で完全に阻害された（図３Ａ）。対照的に、９Ｏ１２．２とは異なるエピトープと結合し、コラーゲンとのＧＰＶＩ相互作用を中和しない（Ｌａｇｒｕｅ−Ｌａｋ−Ｈａｌ ＡＨ．ら２００１年）、二次抗ＧＰＶＩモノクローナル抗体、３Ｊ２４．２は、ビオチン−コラジェリンとコラーゲンの結合を阻害しなかった。結局、これらの結果は、コラジェリンおよびＧＰＶＩは、コラーゲンの表面の同一部位または重複する部位と結合するということを実証する。このペプチドは、そのコラーゲン結合特性のために、コラジェリンと名づけられた。
【０１５３】
本発明者らは、コラジェリンの特異性を正確に言うために、細胞外マトリックスに由来する種々の固定化された高分子：フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびマウスラミニン、または血管病変部位に蓄積される高分子（フィブリノゲン／フィブリン）と結合するその能力を調べた（図３Ｂ）。コラジェリンは、フィブリノゲン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンと、ウシ血清アルブミンよりも大幅には結合しなかった。対照的に、これは、ＧＰＶＩアクセサリーリガンドとしてこれまでに同定されたラミニンと結合した（Ｉｎｏｕｅ Ｏ．ら２００６年）。この結果は、ラミニンおよびコラーゲンと相互作用するＧＰＶＩの部位は、コラジェリンによって摸倣される共通構造を共有することを示す。さらに、ラミニンは、ＳＰＲ分析によってコラジェリンと結合するとわかり、算出されたＫＤは、１．８３ １０−５Ｍであった。対照的に、非関連ペプチドは、これらのタンパク質のいずれとも結合しなかった。
【０１５４】
９Ｏ１２．２を用いて同定されたその他のクローンの配列に対応する８種の合成ペプチドを合成し、コラーゲンと結合するその能力について調べた。すべては、対照の非関連ペプチドと比較した場合に、コラーゲンと結合するとわかり、可変効率を有していた（図４）。
【０１５５】
コラジェリンを用いる、コラーゲンのｅｘ ｖｉｖｏ標識：ＧＰＶＩは、血管損傷部位でコラーゲンと結合するので、本発明者らは、組織化学分析によって、コラジェリンが血管コラーゲンと相互作用できるかどうかを調べた。
【０１５６】
ラット大動脈のパラフィン包埋切片の凍結切片を、ビオチン化コラジェリンＩまたは無関係のペプチドとともにインキュベートした。ペルオキシダーゼがカップリングしているエクストラビジンを使用して、結合しているペプチドを検出した（図５Ａ）。コラジェリンを含む大動脈切片では褐色が発色したが、無関係のペプチドを含むものでは発色しなかった。標識は、固定された切片上よりも、ラット大動脈の凍結切片で、より明確であった（図７Ｂ）。コラジェリンでの標識は、シリウスレッドを用いるコラーゲンの呈色と一致していた。抗ＧＰＶＩ ＩｇＧ９Ｏ１２．２の存在下では、コラジェリンを用いる標識の強度が低下し、このことは、ペプチドおよび血管マトリックス間の相互作用の特異性を示す。
【０１５７】
多量のＩ型コラーゲンを含むラット尾の切片を使用して、コラジェリンの、非血管コラーゲンと相互作用する能力を、次に調べた（図５Ｂ）。コラジェリンとともに、シリウスレッドで着色された線維の強い標識が観察されたが、対照ペプチドとともには観察されなかった。
【０１５８】
線維症のｉｎ ｖｉｖｏ同位体分子イメージング：コラジェリンは、組織化学分析で、コラーゲンを強く標識したので、本発明者らは、コラーゲン蓄積の部位で ｉｎ ｖｉｖｏで保持されるであろうと仮説をたてた。したがって、コラジェリンを標識し、治癒した心筋梗塞を呈するラットにおいて静脈内注射した。
【０１５９】
第１に、８匹のラット（４匹は心筋梗塞を有し、４匹は、偽手術された）に、混合Ｔｃ−９９ｍ標識したストレプトアビジン−ビオチン化コラジェリンを投与した。放射性トレーサーは、高い非特異的肝臓取り込みを示し、緩慢な血液クリアランスを示した（注射の１２時間後まで、高い血液プール活性が見られた）。視覚的には、平面および断層撮影像によって、注射の４時間〜６時間後に、心筋梗塞を有するすべてのラットにおいて心臓領域において大幅なトレーサー取り込みが示されたのに対し（図６Ｂ）、すべての偽手術されたラットの心臓領域ではトレーサー取り込みは観察されなかった。平面シンチグラフィー像での心臓対肺比は、心筋梗塞を有するラットでは、２．７６＋／−０．３６であり、対して、偽手術されたラットでは、１．９５＋／−０．２８であった（ｐ＝０．００３）。注射の６時間後に得た心臓の凍結切片では、シグナルは、コラジェリン／Ｔｃ−９９ｍストレプトアビジン混合物で処理したラットの梗塞領域において顕著であり、梗塞心筋対遠隔心筋の比は、２．００＋／−０．７０であった（図６Ｃ）。梗塞領域は、コラーゲンが豊富であったと、シリウスレッドを用いた組織学的検査によって示された。対照実験は、非特異的９９ｍＴｃ−ストレプトアビジン−ビオチン−ペプチドを使用して、６匹の心筋瘢痕を有するラットで実施し、注射の６時間後に得たオートラジオグラフィーデータは、梗塞において、非特異的トレーサー取り込みを示さなかったか、軽度の非特異的トレーサー取り込みを示し、コラジェリンを用いて得たものよりも低い梗塞心筋対遠隔心筋の比を有していた（１．８２＋／−０．３２対２．６１＋／−０．１９、ｐ＜０．０１）（図６Ｄ）。
【０１６０】
第２に、１２匹のラット（８匹は心筋梗塞を有し、４匹は偽手術された）に、９９ｍＴｃ−コラジェリンを注射した。放射性トレーサーによって、初期の（＜５分）胆汁中排泄および迅速な血液クリアランスが示された。視覚的には、トレーサー注射の１時間後に、心筋梗塞を有する５／８匹のラットの心臓領域において平面および断層撮影像で大幅なトレーサー取り込みが明確に見られた（図７Ａ）。心筋梗塞を有する２匹のその他のラットの心臓領域では、イメージングは、疑わしいものであり、１匹では、陰性であった。６／１０匹の手術されたラット（４匹は心筋梗塞を有し、２匹は偽手術された）の皮膚瘢痕および／または皮下胸部瘢痕において、トレーサー取り込みの増大も観察された。平面シンチグラフィー像での心臓対肺の比は、心筋梗塞を有するラットでは２．０８＋／−０．１７であり、対して、偽手術されたラットでは１．４５＋／−０．０３であった（ｐ＝０．０３）。注射の６時間後に得た心臓の凍結切片では、シグナルは、処理したラットの梗塞領域において顕著であり、梗塞心筋対遠隔心筋の比は、３．０６＋／−０．４５であった（図７Ｂ）。梗塞領域は、コラーゲンが豊富であったと、シリウスレッドを用いた組織学的検査によって示された。対照実験は、非特異的９９ｍＴｃ−ペプチドを使用して実施し、注射の４時間後に得たオートラジオグラフィーデータは、心筋組織において極めて低い絶対トレーサー取り込み（９９ｍＴｃ−コラジェリンを用いて観察されたものの１０％）、および正常心筋と比較して、梗塞におけるトレーサー取り込みの軽度の増大を示し、これは、軽度の非特異的トレーサー蓄積に対応した（梗塞心筋対遠隔心筋：１．７）（図７Ｃ）。
【０１６１】
＜実施例２＞
９９ＭＴＣ標識コラジェリンを使用するシンチグラフィーによる肺線維症のイメージング：
方法：
６〜７週齢の、雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ＩＮＳＥＲＭルールに従って維持した。０日目に、マウスに、８０μｇの塩酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ Ｂｅｌｌｏｎ、Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を気管内に投与した。死亡率を、１４日間にわたって毎日評価した。未処理マウスを対照として使用した。
【０１６２】
１４日目にマウスに、９９ｍＴｃ−Ｂ−コラジェリンまたは９９ｍＴｃ−Ｂ−Ｐｃ（３ＭＢｑ）の１回静脈内注射を投与した。次いで、Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ専用の小動物γカメラを使用して、トレーサー注射の１時間後に、平面全身シンチグラフィーイメージング（６０分間）を実施した。
【０１６３】
実験の最後に、動物を屠殺し、ガンマカウンティング、オートラジオグラフィーおよび組織学的検査（シリウスレッド呈色）のために肺を解剖した。
【０１６４】
結果：
シンチグラフィー：ブレオマイシンを投与されたマウスの肺領域において、相当な９９ｍＴｃ−Ｂ−コラジェリン取り込みが観察され（肺／筋肉バックグラウンド活性比：３．６５±０．３４）、これは、対照マウスの肺領域において観察されたものよりも高く（肺／筋肉バックグラウンド活性比：１．５６±０．０１、ｐ＜０．０２）、ブレオマイシンマウスの肺領域における９９ｍＴｃ−Ｂ−Ｐｃ取り込みよりも高かった（肺／筋肉バックグラウンド活性比：２．２０±０．１１、ｐ＜０．０３）（図８）。
【０１６５】
オートラジオグラフィー：オートラジオグラフィー研究によって、対照と比較して、肺線維症を有するマウスの肺の切片で、より高い９９ｍＴｃ−Ｂ−コラジェリン取り込みが確認され（平均カウント／ｍｍ２：１４０±３２対６１±１０、ＮＳ）、シリウスレッド呈色のものと対応する不均一な分布を有していた。この結果は、線維症への特異的９９ｍＴｃ−Ｂ−コラジェリン取り込みを高度に示唆する（図９）。
【０１６６】
線維性肺における対照ペプチドの取り込みは、９９ｍＴｃ−Ｂ−コラジェリンのものよりも大幅に低かったと、６５±１０カウント／ｍｍ２の活性によって示された。さらに、対照ペプチド取り込みは、レッドシリウス呈色と相関していなかった（図１０）。
【０１６７】
結論：
９９ｍＴｃ標識コラジェリンは、マウスにおける肺線維症の、効率的で、特異的なイメージングを可能にする。
【０１６８】
参考文献：
【０１６９】
【表２】
【０１７０】
【表３】
【０１７１】
【表４】
【０１７２】
【表５】
【０１７３】
【表６】
【０１７４】
【表７】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、画像診断法、特に、線維症の画像診断法に関する。より詳しくは、本発明は、コラーゲンを特異的に標的とし、線維症の非侵襲性の特異的イメージングに適しているポリペプチド、環状ポリペプチドおよび医薬組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、結合組織による不適当な修復として病理学的に定義されており、基質タンパク質、最も特には、コラーゲンＩおよびＩＩＩ型の合成の増大および分解の減少によって引き起こされる。
【０００３】
線維症は、事実上どの組織および器官系にも影響を及ぼし得る。身体のいかなる部分でも、物理的、熱的、代謝性、虚血性、感染性、炎症性または免疫学的損傷後に過剰の線維症が生じ得、影響を受けた構造、例えば、肺、腎臓、心臓、肝臓、血管系、皮膚、眼、骨髄の破壊を引き起こし得る。線維性組織は、正常な構築物の喪失、間質細胞の不足ならびに高密度な、均一な、ますます安定な細胞外マトリックスによる血管およびその他の必須の実質性の構造の置換を特徴とする。
【０００４】
線維症は、多数の慢性疾患の重要な特徴としてますます認識されており、そのようなものとして、計り知れない健康負荷に相当する。米国政府は、米国における死亡の４５％は、線維症を伴う状態に起因し得ると推定している。
【０００５】
例えば、線維性肝疾患は、世界中で、８番目に最もよくある死亡原因と位置づけられており、毎年、１３０万人の死亡を計上している（ＭｕｒｒａｙおよびＬｏｐｅｚ、１９９７年、Ｌａｎｃｅｔ ３４９、１２６９〜１２７６頁）。線維症の細胞機構は、複雑である。例えば、慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、アルコール性肝疾患または脂肪性肝疾患、薬物誘導性肝疾患または原発性胆汁性肝硬変によって引き起こされる肝臓損傷に応じて、通常は静止状態の肝星状細胞が、活性化されて増殖性筋線維芽細胞となる。結果として、線維症は、組織およびコラーゲン様タンパク質の産生の増大と、これらの化合物の分解の減少によって蓄積し得、その結果、肝臓の機能が損なわれる。特に、ウイルス性慢性肝炎では、線維症の初期の検出は、線維症の発生が、大きな予後不良因子に相当するので、治療上の意思決定にとって臨床上関連がある。
【０００６】
別の例は、加齢と相当に関連している、アテローム性動脈硬化症に関するものである。アテローム性動脈硬化症プラークは、Ｉ型コラーゲンに富んでいる。プラークが、不安定である場合、コラーゲンが血流に曝露されるようになり、動脈血栓症および下流組織の虚血の誘因となる。血栓性虚血性血管事象の危険にある患者を同定するために、不安定動脈硬化病変の非侵襲性分子イメージングは、大いに注目を引く。例えば、最近の研究では、不安定動脈硬化性プラークの非侵襲性イメージングのための、放射標識された可溶性糖タンパク質Ｖｌ（ＧＰＶＩ）物質の実現可能性を評価している。
【０００７】
糖尿病では、間質性線維症を含む糖尿病性心筋症の初期の検出は、心不全の危険のある糖尿病患者の初期の同定のために臨床上注目される。また、特発性拡張型心筋症では、線維症は、主要な予後因子として認識されている。
【０００８】
線維症を診断するために、いくつかのバイオマーカーが探索されてきたが、器官における線維症のｉｎ ｖｉｖｏ可視化のために開発された方法はほとんどない。例えば、最近の研究は、一時的な超音波検査またはＭＲＩ弾性率計測法が、成人患者において肝臓硬直を非侵襲性に測定することによって肝臓線維症を評価するための方法に相当すると示している（ｄｅ Ｌｅｄｉｎｇｈｅｎ Ｖ．ら２００７；Ｔａｌｗａｌｋａｒ ＪＡら２００７年）。また、肝臓線維症の定量化のために、拡散強調ＭＲＩを用いて予備実験が実施された（Ｔａｏｕｌｉ Ｂら、ＡＪＲ Ａｍ Ｊ Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ ２００７年；１８９（４）：７９９〜８０６頁）。
【０００９】
心筋線維症をイメージングするために、ガドリニウム遅延造影（ｄｅｌａｙｅｄ−ｅｎｈａｎｃｅｄ）ＭＲＩを用いていくつかの試みが実施された（Ｔｚｅｌｅｐｉｓ ＧＥら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２００７年；５６（１１）：３８２７〜３６頁）。しかし、これらの技術は、線維症に特異的ではない。またそれらは、多量の線維症が、組織弾性を損なう必要があるので、感度を欠くという欠点を有する可能性がある。線維症の分子イメージングのための特異的イメージングトレーサーは、放射性核種イメージングおよびＭＲＩをはじめ、種々のイメージング様式にとって課題および注目される大きな分野に相当する（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ＭＲＩ ｃｏｎｔｒａｓｔ ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｆｉｂｒｏｓｉｓ、Ｃａｒａｖａｎ Ｐら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２００７年；４６（４３）：８１７１〜７３頁）。ＭＲＩと比較して、特異的放射性核種イメージングは、極めて低いトレーサー用量（ピコまたはナノモル）で、正確な標的対バックグラウンド比を得るのに十分であるので、高い感度と、毒性がないという利点を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｍ−Ｈ−Ｇ−Ｌ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｅ（配列番号１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたＰであり、
Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
Ｘ７は、Ｑ、ＨまたはＬであり；
Ｘ９は、ＷまたはＧであり
Ｘ１０は、ＡまたはＤである］
からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
【００１１】
本発明はまた、本発明のポリペプチドが、２個のシステイン残基の間で結合されたジスルフィドによって環化されている環状ポリペプチドに関する。
【００１２】
本発明はまた、本発明により標識されたポリペプチドまたは標識された環状ポリペプチドを含む造影剤に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の目的は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｍ−Ｈ−Ｇ−Ｌ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｅ（配列番号１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり、
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］
からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
【００１４】
全体として本明細書では、「アミノ酸」とは、天然タンパク質中に見ることができるＬ型のアミノ酸、すなわち、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）およびバリン（Ｖ）を意味すると理解されることを思い起こされたい。しかし、本発明はまた、非天然アミノ酸、すなわち、Ｄ型の前述のアミノ酸ならびにアルギニン、リシン、フェニルアラニンおよびセリンなどのいくつかのアミノ酸のホモ型またはロイシンもしくはバリンのノル型に関する。
【００１５】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥ（配列番号２）、ＲＦＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥ（配列番号３）、ＲＶＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥ（配列番号４）、ＲＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥ（配列番号５）、ＲＶＭＨＧＬＱＬＷＤＤＥ（配列番号６）、ＲＶＭＨＧＬＨＬＷＡＤＥ（配列番号７）、ＦＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥ（配列番号８）、ＰＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥ（配列番号９）およびＲＶＭＨＧＬＬＬＧＡＤＥ（配列番号１０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドが、より良好な親和性でコラーゲンと結合するのを可能にするよう立体構造的に制約され得る。
【００１７】
環化は、当技術分野で周知であり、通常、２つのシステイン残基間で結合されるジスルフィドの組み込みを含む。通常、環は、システイン、ペニシラミン、ホモシステイン、前記のものの組合せの対または側鎖が、１個もしくは２個の硫黄原子のいずれかと連結しているその他の対のアミノ酸間のモノスルフィドまたはジスルフィド橋を含む、側鎖対側鎖環によって形成される。ジスルフィド環状ポリペプチドの合成方法は、当技術分野で周知であり、例えば、ＵＳ３，９２９，７５８、ＵＳ４，２１６，１４１およびＵＳ４，１０２，８７７に記載されている。
【００１８】
したがって、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの環化を可能にするよう、末端にシステイン残基を含み得る。特定の実施形態では、システイン残基は、本発明のポリペプチドの末端とは、１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸分、離れている。通常、アミノ酸は、ポリペプチドのコラーゲン結合を妨げないように選択される。アミノ酸は、グリシンまたはプロリンなどの小さい、中性のアミノ酸の中から選択され得ることが好ましい。プロリンは、構造的に環化に有利に働き得る。別の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの末端をフランキングし、少なくとも１個のシステイン残基を含むトリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｎ末端にＣＧＰトリペプチドおよびＣ末端にＧＰＣトリペプチドを含み得る。
【００１９】
したがって、本発明のポリペプチドは、
ＣＧＰ−Ｘ１−Ｘ２−ＭＨＧＬ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−ＤＥ−ＧＰＣ（配列番号１１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたはＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり；
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］
からなるアミノ酸配列を含み得る。
【００２０】
別の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、
ＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号１２）、ＣＧＰＲＦＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥＧＰＣ（配列番号１３）、ＣＧＰＲＶＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥＧＰＣ（配列番号１４）、ＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥＧＰＣ（配列番号１５）、ＣＧＰＲＶＭＨＧＬＱＬＷＤＤＥＧＰＣ（配列番号１６）、ＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＷＡＤＥＧＰＣ（配列番号１７）、ＣＧＰＦＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号１８）、ＣＧＰＰＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥＧＰＣ（配列番号１９）およびＣＧＰＲＶＭＨＧＬＬＬＧＡＤＥＧＰＣ（配列番号２０）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【００２１】
別の特定の実施形態では、上記のポリペプチドは、ポリペプチドの２個のシステイン残基間のジスルフィド結合によって環化される。
【００２２】
別の特定の実施形態では、本発明は、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００２３】
【化１】
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたはＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり；
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］。
【００２４】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００２５】
【化２】
【００２６】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００２７】
【化３】
【００２８】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００２９】
【化４】
【００３０】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００３１】
【化５】
【００３２】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００３３】
【化６】
【００３４】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００３５】
【化７】
【００３６】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００３７】
【化８】
【００３８】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００３９】
【化９】
【００４０】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００４１】
【化１０】
【００４２】
本発明によって、その他の環化方法が考慮される。例えば、これらの方法として、それだけには限らないが、直交性保護基としてトリメチルシリル（ＴＭＳＥ）エステルを使用するＴＦＡ樹脂上でのペプチド環化を記載するＭａｒｌｏｗｅ（１９９３年、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３：４３７〜４４頁）；オキシム形成による水溶液中での保護されていないペプチドの環化を記載するＰａｌｌｉｎおよびＴａｍ（１９９５年、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２０２１〜２０２２頁）；リシン側鎖アンカリングによる頭尾結合環状ペプチドの固相合成を開示しているＡｌｇｉｎら（１９９４年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３５：９６３３〜９６３６頁）；三次元固相戦略による頭尾結合環状ペプチドの製造を記載しているＫａｔｅｓら（１９９３年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：１５４９〜１５５２頁）；固定化されたペプチドの活性化が、無傷のＮ−保護基とその後の環化につながる除去を用いて実施される、固定化された活性化中間体からの環状ペプチドの合成を記載するＴｕｍｅｌｔｙら（１９９４年、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１０６７〜１０６８頁）；アスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖によって不溶性支持体と結合しているペプチドの頭尾結合環化を開示している、ＭｃＭｕｒｒａｙら（１９９４年、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．７：１９５〜２０６頁）；固体支持体を介してペプチドを環化する代替法を教示する、Ｈｒｕｂｙら（１９９４年、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ２２：２３１〜２４１頁）；ならびにＳｃｈｍｉｄｔおよびＬａｎｇｅｒ（１９９７年、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．４９：６７〜７３頁）によって記載されるものならびにＤａｖｉｅｓ ＪＳ（Ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ ２００３年，８：４７１〜５０１頁）；ならびにＬｉおよびＲｏｌｌｅｒ（ＰＰＣｙｃｌｉｓａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ．Ｃｕｒｒ．Ｔｐ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２年、３：３２５〜４１頁）によって記載されるものが挙げられる。
【００４３】
別の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドまたは環状ポリペプチドは、その末端にスペーサー配列を含み得る。このようなスペーサー配列は、本発明の前記ポリペプチドまたは環状ポリペプチドを、検出可能な物質（例えば、ビオチン部分）を用いて標識するのに適したものであり得る。実際、スペーサー配列は、検出可能な物質の立体障害を防ぐのに有用であり得る。例えば、ビオチンのスペーサー配列は、本発明のポリペプチドまたは環状ポリペプチドのＮ末端と結合され得るＳＧＳＧアミノ酸配列にあり得る。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、
ＳＧＳＧＣＧＰ−Ｘ１−Ｘ２−ＭＨＧＬ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−ＤＥ−ＧＰＣ（配列番号２１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり；
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］
からなるアミノ酸配列を含み得る。
【００４５】
別の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、
ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号２２）；
ＳＧＳＧＣＧＰＲＦＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥＧＰＣ（配列番号２３）；
ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥＧＰＣ（配列番号２４）；
ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥＧＰＣ（配列番号２５）；
ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＱＬＷＤＤＥＧＰＣ（配列番号２６）；
ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＷＡＤＥＧＰＣ（配列番号２７）；
ＳＧＳＧＣＧＰＦＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（配列番号２８）；
ＳＧＳＧＣＧＰＰＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥＧＰＣ（配列番号２９）；および
ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＬＬＧＡＤＥＧＰＣ（配列番号３０）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【００４６】
別の特定の実施形態では、本発明は、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００４７】
【化１１】
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり；
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］。
【００４８】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００４９】
【化１２】
【００５０】
以下の制約されたペプチドＳＧＳＧＣＰＧＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣは、「コラジェリン」と名づけられている。
【００５１】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００５２】
【化１３】
【００５３】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００５４】
【化１４】
【００５５】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００５６】
【化１５】
【００５７】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００５８】
【化１６】
【００５９】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００６０】
【化１７】
【００６１】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００６２】
【化１８】
【００６３】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００６４】
【化１９】
【００６５】
別の特定の実施形態では、本発明はさらに、次式を有する環状ポリペプチドに関する：
【００６６】
【化２０】
【００６７】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ペグ化されている。ポリエチレングリコールＰＥＧと、ペプチドのコンジュゲーションは、生物活性期間（半減期）を有意に増大するということは広く実証されている。ＰＥＧは、より安定なコンホメーションを提供し、分子の大きさおよび重量を増大させ、それによって、ペプチドの循環時間を延長する。
【００６８】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、エチレングリコールの反復単位を連結して種々の分子量の直鎖または分岐型のポリマーを形成する方法によって形成される。ＰＥＧは、一般式ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈ（式中、ｎ＞４）の親水性で、生体適合性で、非毒性の水溶性ポリマーである。その分子量は、３００〜４０，０００ダルトンで変わる。
【００６９】
本発明のポリペプチドのペグ化は、当技術分野で公知の方法によって達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールを、直接的に、または介在性リンカーによってのいずれかでタンパク質と結合してもよい。
【００７０】
１つの非限定的な手順として、遊離アミノまたはカルボキシル基などの反応基によってアミノ酸残基を介してポリエチレングリコールが共有結合によって結合されることがある。ポリエチレングリコールとタンパク質を結合するためのリンカーのない系は、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９〜３０４頁（１９９２年）、Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒ Ｊ． ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１〜１８（１９９８年）、ＵＳ４，００２，５３１、Ｕ．Ｓ．５，３４９，０５２、ＷＯ９５／０６０５８およびＷＯ９８／３２４６６に記載されている。
【００７１】
介在性リンカーを用いずに、ポリエチレングリコールとタンパク質のアミノ酸残基を直接的に結合するための１つの系は、トレシルクロリドを使用するモノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）の修飾によって生じるトレシル化ＭＰＥＧを使用する。タンパク質とトレシル化ＭＰＥＧとの反応の際に、ポリエチレングリコールが、タンパク質のアミン基に直接的に結合される。したがって、本発明は、本発明のタンパク質を、２，２，２−トリフルオレオタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スルホニル基を有するポリエチレングリコール分子と反応させることによって生じるタンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートを含む。
【００７２】
ポリエチレングリコールはまた、いくつかの異なる介在性リンカーを使用してタンパク質と結合してもよい。例えば、ＵＳ５，６１２，４６０には、ポリエチレングリコールとタンパク質を結合するためのウレタンリンカーが開示されている。ポリエチレングリコールが、リンカーによってタンパク質と結合しているタンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートはまた、タンパク質と、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロペニルカルボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカルボネートおよび種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体などとの化合物の反応によって製造してもよい。いくつかのさらなるポリエチレングリコール誘導体およびポリエチレングリコールとタンパク質を結合するための反応化学は、ＷＯ９８／３２４６６に記載されている。
【００７３】
各ポリペプチドと結合しているポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換度）もまた変わり得る。例えば、本発明のｐｅｇ化タンパク質は、平均１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０個またはそれ以上のポリエチレングリコール分子と連結され得る。同様に、タンパク質分子１個あたり１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９または１８〜２０のポリエチレングリコール部分などの範囲内の平均置換度。置換度を決定する方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９〜３０４頁（１９９２年）に論じられている。
【００７４】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、オリゴマー化、好ましくは、二量体化される。
【００７５】
オリゴマー化は、科学文献に広く記載されており、安定なポリマーを形成するための単量体のポリペプチドの特定の構築物からなる。
【００７６】
オリゴマー化は、生物活性の大きさおよび重量を増大させ、それによって、ペプチドの循環時間（半減期）を延長する。
【００７７】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドおよび環状ポリペプチドのＮおよびＣ末端は、任意の当技術分野で周知の方法によって保護してもよい。例えば、本発明のポリペプチドおよび環状ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル官能基は、アミドによって置換されてもよい。
【００７８】
本発明のポリペプチドは、当技術分野でそれ自体公知の任意の技術、例えば、限定するものではないが、単独または組み合わせた、任意の化学的、生物学的、遺伝子的または酵素的技術によって製造してもよい。
【００７９】
所望の配列のアミノ酸配列を知ることで、当業者ならば、ポリペプチドの製造のための標準技術によって前記ポリペプチドを容易に製造できる。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは、市販のペプチド合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａによって製造されたもの）を使用し、製造業者の使用説明書に従って合成できる。
【００８０】
あるいは、本発明のポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術が今では当技術分野で周知であるので、それによって合成してもよい。例えば、これらの断片は、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、発現ベクターに組み込み、このようなベクターを、所望のポリペプチドを発現し、後に、周知の技術を使用してそれから所望のポリペプチドが単離され得る、適した真核生物または原核生物宿主に導入した後に、ＤＮＡ発現産物として得てもよい。
【００８１】
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。
【００８２】
通常、前記核酸分子は、ＤＮＡまたＲＮＡ分子であり、これらは任意の適したベクター、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクター中に含めてもよい。用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入し、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進することができる媒介物を意味する。
【００８３】
そのため、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
【００８４】
このようなベクターは、被験体に投与した際に前記ポリペプチドの発現を引き起こすまたは指示するための、調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを含み得る。ベクターは、１種またはいくつかの複製開始点および／または選択マーカーをさらに含み得る。プロモーター領域は、コード配列に対して相同である場合も、非相同である場合もあり、ｉｎ ｖｉｖｏ使用のためを含めた任意の適当な宿主細胞において遍在性発現、構成的発現、調節された発現および／または組織特異的発現を提供する。プロモーターの例として、細菌プロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーターなど）、ウイルスプロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥなど）、哺乳類遺伝子プロモーター（アルブミン、ＰＧＫなど）等が挙げられる。
【００８５】
プラスミドの例として、複製開始点を含む複製プラスミドまたは例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組込みプラスミドが挙げられる。ウイルスベクターの例として、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、当技術分野で公知の技術によって、例えば、パッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、またはヘルパープラスミドまたはウイルスを用いた一時的なトランスフェクションによって製造してもよい。ウイルスパッケージング細胞の代表的な例として、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製に欠陥のある組換えウイルスを製造するための詳細なプロトコールは、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５，８８２，８７７、ＵＳ６，０１３，５１６、ＵＳ４，８６１，７１９、ＵＳ５，２７８，０５６およびＷＯ９４／１９４７８中に見出すことができる。
【００８６】
本発明のさらなる目的は、本発明による核酸および／またはベクターによってトランスフェクト、感染または形質転換されている細胞に関する。用語「形質転換」とは、宿主細胞が、導入された遺伝子または配列を発現して所望の物質、通常、導入された遺伝子または配列によってコードされるタンパク質または酵素を産生するような、宿主細胞への「外来」（すなわち、外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の導入を意味する。導入されるＤＮＡまたＲＮＡを受け取り、発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。
【００８７】
本発明の核酸を使用して、適した発現系において本発明の組換えポリペプチドを製造してもよい。用語「発現系」とは、適した条件下、例えば、ベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための、宿主細胞および適合するベクターを意味する。
【００８８】
よくある発現系として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクターならびに哺乳類宿主細胞およびベクターが挙げられる。宿主細胞のその他の例として、限定するものではないが、原核細胞（例えば、細菌）および真核細胞（例えば、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる。特定の例として、大腸菌、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母および哺乳類細胞系統（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）が挙げられる。
【００８９】
本発明はまた、本発明によるポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を製造する方法であって、（ｉ）上記のようにｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで組換え核酸またはベクターを、コンピテント宿主細胞に導入するステップと、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養するステップと、（ｉｉｉ）場合によって、前記ポリペプチドを発現し、場合によって、分泌する細胞を選択するステップとからなるステップを含む方法に関する。このような組換え宿主細胞を、先に記載されるような、本発明によるポリペプチドの製造のために使用してもよい。
【００９０】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、（ｉ）前記ポリペプチドの発現を可能にするのに適した条件下で、本発明による形質転換された宿主細胞を培養するステップと、（ｉｉ）発現されたポリペプチドを回収するステップとからなるステップを含む方法に関する。
【００９１】
単離された（例えば、精製された）形態の、または膜または脂質小胞（例えば、リポソーム）などのベクター中に含まれる、本発明のポリペプチドを使用してもよい。
【００９２】
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドまたは環状ポリペプチドは、蛍光分子、放射性分子または当技術分野で公知の任意のその他の標識などの検出可能な分子または物質で標識してもよい。通常、（直接的または間接的のいずれかで）シグナルを提供する標識は、当技術分野で公知である。
【００９３】
本明細書において、本発明のポリペプチドまたは環状ポリペプチドに関して、用語「標識された」とは、検出可能な物質をカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）による本発明のポリペプチドまたは環状ポリペプチドの直接標識を包含するものとする。
【００９４】
検出可能な物質の例として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適した酵素の例として、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適した補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適した蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例として、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる。
【００９５】
検出可能な物質は、放射性金属イオン、すなわち、放射性金属であり得る。適した放射性金属は、６４Ｃｕ、４８Ｖ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、９４ｍＴｃまたは６８Ｇａなどの陽電子放射体、９９ｍＴｃ１１１Ｉｎ１１３ｍＩｎもしくは６７Ｇａなどのγ放射体または６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１３６Ｒｅ１、１８８Ｒｅもしくは１９２Ｉｒなどのβ放射体のいずれかであり得る。
【００９６】
この特定の実施形態では、放射性金属を標識するために、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）または１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）などのポリアミノポリカルボキシレートキレーターも開発された。これらのキレーターは、イメージングに適した放射性同位元素、例えば、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）のための１１１Ｉｎおよび陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）のための６８Ｇａを用いる標識を可能にする。ポリアミノポリカルボキシレートはまた、９０Ｙおよび１７７Ｌｕ同位元素のための適したキレーターである。
【００９７】
検出可能な物質は、常磁性金属イオンであり得、適したこのような金属イオンとして、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）１ Ｅｒ（ＩＩ）１ Ｎｉ（ＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）またはＤｙ（ＩＩＩ）が挙げられる。
【００９８】
検出可能な物質は、γ放射性の放射性ハロゲンであり得る。放射性ハロゲンは、１２３Ｉ、１３１Ｉまたは７７Ｂｒから選択されることが適している。
【００９９】
検出可能な物質は、陽電子放射性の放射性非金属であり得る。適したこのような陽電子放射体として、１１Ｃ、２３Ｎ、１５Ｏ、１７Ｆ、１８Ｆ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒまたは１２４Ｉが挙げられる。
【０１００】
検出可能な物質は、過分極ＮＭＲ活性核であり得る。このようなＮＭＲ活性核は、ゼロではない核スピン有し得、１３Ｃ、１５Ｎ、１９Ｆ、２９Ｓｉおよび３１Ｐが挙げられる。用語「過分極」とは、ＮＭＲ活性核の平衡分極化を上回る、その分極化の程度の増強を意味する。１３Ｃの天然の存在量は（１２Ｃと比較して）約１％であり、適した１３Ｃ標識化合物は、過分極される前に少なくとも５％、好ましくは、少なくとも５０％、最も好ましくは、少なくとも９０％の存在量に濃縮されることが適している。本発明の造影剤の少なくとも１個の炭素原子は、１３Ｃが濃縮され、続いて、過分極されることが適している。
【０１０１】
検出可能な物質は、ｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングに適したレポーターであり得、レポーターは、光学イメージング手順において直接的または間接的にのいずれかで検出できる任意の部分である。レポーターは、光散乱体（例えば、着色または非着色粒子）、光吸収体または光放射体であり得る。より好ましくは、レポーターは、発色団または蛍光化合物などの色素である。色素は、紫外光から近赤外の波長を有する電磁スペクトルの光と相互作用する任意の色素であり得る。最も好ましくは、レポーターは、蛍光特性を有する。
【０１０２】
好ましい有機発色団レポーターおよび発蛍光団レポーターとして、広範囲に非局在化した電子系を有する基、例えば、シアニン、メロシアニン、インドシアニン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、トリフェニルメチン、ポルフィリン、ピリリウム色素、チアピリリウム色素、スクアリリウム色素、クロコニウム色素、アズレニウム色素、インドアニリン、ベンゾフェノキサジニウム色素、ベンゾチアフェノチアジニウム色素、アントラキノン、ナフトキノン、インダスレン、フタロイルアクリドン、トリスフェノキノン、アゾ色素、分子内および分子間電荷移動色素および色素複合体、トロポン、テトラジン、ｂ／ｓ（ジチオレン）複合体、ビスベンゼン−ジチオレート複合体、ヨードアニリン色素、ｂ／ｓ（Ｓ，Ｏ−ジチオレン）複合体が挙げられる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および異なる吸収／発光特性を有するＧＦＰの修飾などの蛍光タンパク質も有用である。特定の希土類金属（例えば、ユウロピウム、サマリウム、テルビウムまたはジスプロシウム）の複合体も、蛍光ナノ結晶（量子ドット）がそうであるように特定の関連で使用される。
【０１０３】
使用してよい発色団の特定の例として、フルオレセイン、スルホローダミン１０１（テキサスレッド）、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１９、インドシアニングリーン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、マリーナブルー、パシフィックブルー、オレゴングリーン８８、オレゴングリーン５１４、テトラメチルローダミンおよびアレキサフローラ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）３５０、アレキサフローラ４３０、アレキサフローラ５３２、アレキサフローラ５４６、アレキサフローラ５５５、アレキサフローラ５６８、アレキサフローラ５９４、アレキサフローラ６３３、アレキサフローラ６４７、アレキサフローラ６６０、アレキサフローラ６８０、アレキサフローラ７００およびアレキサフローラ７５０が挙げられる。
【０１０４】
可視領域または近赤外（ＮＩＲ）領域、４００ｎｍから３μｍの間、特に、６００から１３００ｎｍの間に吸収最大を有する色素が、特に好ましい。光学イメージング様式および測定技術として、それだけには限らないが、発光イメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光干渉断層法、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡、光音響イメージング、音響光学イメージング、分光法、反射分光法、干渉分光法、コヒーレンス干渉分光法、拡散光トモグラフィーおよび蛍光媒介性拡散光トモグラフィー（連続波、時間領域および周波数領域系）ならびに光散乱、吸収、分極化、発光寿命、蛍光寿命、量子収率およびクエンチングの測定が挙げられる。
【０１０５】
好ましい検出可能な物質は、投与後に、ｉｎ ｖｉｖｏで非侵襲性の方法で外部から検出できるものである。最も好ましいイメージング部分は、放射性、特に、放射性金属イオン、γ放射性の放射性ハロゲンおよび陽電子放射性の放射性非金属、特に、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）を使用したイメージングに適したものである。
【０１０６】
なおさらなる態様では、本発明の目的は、造影剤として本発明の標識されたポリペプチドまたは環状ポリペプチド使用することに関する。
【０１０７】
用語「造影剤」とは、哺乳類において線維症を標的とするよう設計され、哺乳類の身体へのその投与後にｉｎ ｖｉｖｏで検出できる化合物を指す。
【０１０８】
別のさらなる態様では、本発明は、本発明の標識されたポリペプチドまたは環状ポリペプチドを含む造影剤に関する。
【０１０９】
別のさらなる態様では、本発明は、上記の造影剤を、生体適合性担体とともに含む、哺乳類投与に適した形態の医薬組成物を提供する。好ましい実施形態では、医薬組成物は、放射性医薬組成物である。
【０１１０】
「生体適合性担体」は、造影剤が、組成物が生理学的に容認できる、すなわち、哺乳類身体に毒性または過度の不快感を伴わずに投与できるように懸濁または溶解されている、流体、特に、液体である。生体適合性担体媒体は、注射用担体液体、例えば、滅菌注射水、生理食塩水などの水溶液、１種以上の張度調整剤物質（例えば、生体適合性対イオンを用いた血漿陽イオンの塩）、糖（例えば、グルコースまたはスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトールまたはマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）またはその他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液であることが適している。
【０１１１】
さらなる態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を調製するためのキットを提供する。このようなキットは、本発明の標識されたポリペプチドまたは環状ポリペプチドを含む。したがって、このようなキットを再構成するための反応媒体は、上記で定義される「生体適合性担体」であることが好ましく、水性であることが最も好ましい。適したキット容器は、滅菌完全性および／または放射性安全性、ならびに場合によって、不活性のヘッドスペースガス（例えば、窒素またはアルゴン）の維持を可能にしながら、シリンジによる溶液の付加および除去を可能にする密閉された容器を含む。
【０１１２】
キットは、場合によって、放射保護剤、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤またはフィラーなどのさらなる構成要素をさらに含み得る。
【０１１３】
用語「放射保護剤」とは、非常に反応性に富むフリーラジカル、例えば、水の放射線分解に起因する酸素含有フリーラジカルを捕捉することによって、酸化還元プロセスなどの分解反応を阻害する化合物を意味する。本発明の放射保護剤は、アスコルビン酸、パラアミノ安息香酸（すなわち、４−アミノ安息香酸）、ゲンチジン酸（すなわち、２，５−ジヒドロキシ安息香酸）および生体適合性陽イオンとのそれらの塩から適宜選択される。「生体適合性陽イオン」およびその好ましい実施形態は、上記のとおりである。
【０１１４】
本発明の造影剤または医薬組成物は、線維症のｉｎ ｖｉｖｏイメージングにとって有用である。したがって、なおさらなる態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断法またはイメージング法、例えば、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴにおいて使用するための本発明の造影剤または医薬組成物を提供する。前記方法は、線維症を伴う状態、例えば、肺線維症、肝臓腎臓線維症、心臓線維症、血管系線維症、皮膚線維症、眼線維症、骨および骨髄線維症のｉｎ ｖｉｖｏ診断またはイメージングに関することが好ましい。特定の実施形態では、本発明の造影剤または医薬組成物は、アテローム性動脈硬化症および心筋梗塞、糖尿病性および特発性心筋症のｉｎ ｖｉｖｏイメージングに適している。
【０１１５】
本発明のこの態様はまた、線維症を伴う状態の患者におけるｉｎ ｖｉｖｏ診断またはイメージングのための方法であって、本発明の医薬組成物の先行投与を含む方法を提供する。本発明によれば、用語「患者」は、線維症に冒された、または冒される可能性が高いヒトまたは非ヒト哺乳類を対象とする。前記患者は、好ましくは、哺乳類、最も好ましくは、ヒトである。「事前に投与された」とは、医薬が患者に、例えば、静脈内注射によって投与される、臨床医が関与するステップが、すでに実施されていることを意味する。
【０１１６】
あるいは、本発明は、患者において線維症を伴う状態をイメージングする方法であって、
ａ）本発明の造影剤または医薬組成物を提供するステップと、
ｂ）前記患者に、前記造影剤または医薬品を投与するステップと、
ｃ）前記患者において、前記造影剤を検出するステップと
からなるステップを含む方法を提供する。
【０１１７】
本発明の別の態様はまた、線維症を伴う状態のｉｎ ｖｉｖｏ画像診断法のための医薬組成物の製造のための、本発明の造影剤の使用を包含する。
【０１１８】
本発明の別の態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのコラーゲンの直接ターゲッティングのための特定のツールとしての造影剤の使用に関する。
【０１１９】
本発明を、以下の図および実施例を考慮してさらに例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】９Ｏ１２．２結合性細菌クローンのイムノブロッティング。Ａ：単離した細菌クローンを溶解し、非還元状態での電気泳動によってタンパク質を分離し、９Ｏ１２．２ＩｇＧを使用してイムノブロットすることによって分析した。ＦｌｉＴｒｘ融合タンパク質の予測質量に相当するＭｒ約６３ｋＤａの陽性バンドを観察すると、これらのクローンによって提示されるペプチドは、９Ｏ１２．２と結合していることが示された。結果は、６種の選択されたクローン（クローン１３、１４、１５、１６、１７、１８からの抽出物について、および無関係の抗体を使用して同一のライブラリーから得られたクローンの溶解物を用いて実施された陰性対照について示されている。Ｂ〜Ｃ：９Ｏ１２．２と結合するコラジェリン（ｃｏｌｌａｇｅｌｉｎ）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ビオチンとカップリングした、クローン１４によって発現される配列に対応するペプチド（コラジェリン）を合成し、ストレプトアビジンコーティングされたセンサーチップ上に固定化した（２０ＲＵの平均）。Ｂでは、漸増濃度の９Ｏ１２．２ＩｇＧを、センサーチップ上に流した（０、１．２５、２．５、５および１０μｇ／ｍｌ）。無関係のペプチドでコーティングされた対照フローセルから得られた非特異的バックグラウンドを差し引いた後の代表的なセンサーグラムが示されている。Ｃ：固定化されたビオチン−コラジェリンを、ＤＴＴを使用してセンサーチップ上で還元した。９Ｏ１２．２ＩｇＧ（８μｇ／ｍｌ）を、センサーチップ上に注入し（黒色センサーグラム）、還元されていないペプチド（灰色センサーグラム）と比較して、還元されたペプチドとは結合しなかった。Ｄ：９Ｏ１２．２ＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）を、組換え可溶性ＧＰＶＩ（２５μｇ／ｍｌ）の存在下で、固定化されたビオチン−コラジェリン上に注入し（灰色センサーグラム）、これは、対照条件（黒色センサーグラム）と比較した場合に、ＩｇＧとペプチドの結合を完全に阻害した。組換えＧＰＶＩは、固定化されたペプチドと結合しなかった（明灰色センサーグラム）。
【図２】コラジェリンとコラーゲンの相互作用：Ａ コラーゲンを、ストレプトアビジンコーティングされたセンサーチップ上に固定化されているビオチン−コラジェリン上に注入した。コラジェリンコーティングされた表面上に約１０ＲＵコラーゲンが結合された（暗色）。フィットも示されている（灰色）。無関係のペプチドでコーティングされた対照フローセルから得られた非特異的バックグラウンドシグナルを差し引いた。Ｂ コラジェリンと、固定化されたコラーゲンの結合。漸増量のビオチン−コラジェリン（２５０、５００μｇ．ｍＬ−１）を、ＣＭ５センサーチップ上に固定化されたコラーゲン上に注入した。ペプチドを用いて得られたセンサーグラムおよび相互作用フィットが、黒色および灰色でそれぞれ示されている。無関係のペプチドを使用して測定される非特異的バックグラウンドを差し引いた。
【図３】コラーゲンとの、および種々の高分子とのペプチド相互作用：Ａ 微量滴定プレートにおける、コラジェリンと、固定化されたコラーゲンの結合。ビオチン−コラジェリンまたは対照ペプチドを、固定化された線維性Ｉ型コラーゲンとともにインキュベートし、ペルオキシダーゼがカップリングしているエクストラビジン（ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎｅ）を使用して、結合しているペプチドを検出した。競合実験では、コラジェリンを組換え可溶性ＧＰＶＩ（５０および２０μｇ．ｍＬ−１）、９０１２ＩｇＧ（５０および２０μｇ．ｍＬ−１）または３Ｊ２４．２ＩｇＧ（５０μｇ．ｍＬ−１）と混合し、その後、コラーゲンでコーティングされたウェルに加えた。Ｂ：ビオチン−コラジェリンまたは対照ペプチド（５０μｇ．ｍＬ−１）と、固定化されたフィブリノゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニンの結合。種々のタンパク質を用いた微量滴定ウェルのコーティングを、コラーゲンと同様に実施した。ペルオキシダーゼがカップリングしているエクストラビジンを使用して、結合しているペプチドを検出した。
【図４】コラジェリンファミリーペプチドとコラーゲンの結合：Ａ ビオチンとカップリングした、２０種の選択されたクローンから同定された９種の配列に対応するペプチドを合成した。１００μｇの各ペプチドを、固定化されたコラーゲンとともにインキュベートし、ペルオキシダーゼがカップリングしたストレプトアビジンを使用して検出した。結果は、三連で行った３実験の平均±ＳＤである。Ｐｃは、環状非関連ペプチドに相当する。＊は、コラジェリンを示す。Ｂ ３種のペプチドについて、ペプチド濃度の関数としてのコラーゲンとの結合が示されている。クローン１６、１９および１４（コラジェリン）の配列に対応する漸増量の合成ペプチドを、コラーゲンがコーティングされたプレート上でインキュベートし、上記のように検出した。
【図５】組織コラーゲンとのペプチド結合の組織化学的分析：Ａ ラットから得た大動脈の凍結切片を、ビオチン−コラジェリンまたは対照ペプチド（３００μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートし、ペルオキシダーゼがカップリングしているストレプトアビジンを使用して検出した。切片を、ヘマトキシリンを用いて対比着色した。連続切片を、コラーゲンについてシリウスレッドを用いて着色した。競合実験では、ペプチドを、抗ＧＰＶＩ ＩｇＧ９Ｏ１２１．２（３００μｇ／ｍＬ）と混合し、その後、大動脈切片に加えた。Ｂ ラット尾腱のパラフィン包埋切片を、上記のように処理した。
【図６】コラジェリン−ストレプトアビジン−Ｔｃ９９ｍを使用する、ｉｎ ｖｉｖｏシンチグラフィー、ｅｘ−ｖｉｖｏ心筋オートラジオグラフィーおよび組織学的検査。Ａ：対照ラット（偽）の平面胸部シンチグラフィー。Ｂ：線維性心筋梗塞を有するラットの平面および断層撮影（矢状図）胸部像：左心室心筋領域中にホットスポット（矢印）が見られる。Ｃ：薄層化線維性（赤）心筋瘢痕（矢印）におけるトレーサー取り込みを確認する、対応する心筋オートラジオグラフィーおよび組織学的検査（コラーゲンに特異的な、レッドシリウス呈色）。Ｄ：対照実験：無関係のＰｃ−ストレプトアビジン−Ｔｃ９９ｍを注射されたラットの心筋瘢痕では、活性は観察されない。
【図７】コラジェリン−Ｔｃ９９ｍを使用する、ｉｎ ｖｉｖｏシンチグラフィー、ｅｘ−ｖｉｖｏ心筋オートラジオグラフィーおよび組織学的検査：Ａ：線維性心筋梗塞を有するラットの平面胸部シンチグラフィー：左心室心筋領域中に明確なホットスポット（矢印）が見られる。Ｂ：薄層化線維性（赤）心筋瘢痕におけるトレーサー取り込みを確認する、対応する心筋オートラジオグラフィーおよび組織学的検査（コラーゲンに特異的なレッドシリウス呈色）。Ｃ：対照実験：無関係のＰｃ−Ｔｃ９９ｍを注射されたラットの心筋梗塞では、極めて低い活性が観察される。
【図８】９９ｍ Ｔｃ−Ｂ−コラジェリン−を使用する、ｉｎ ｖｉｖｏ肺シンチグラフィー。
【図９】９９ｍ Ｔｃ−Ｂ−コラジェリン−を使用する、ｅｘ−ｖｉｖｏ肺オートラジオグラフィー。ブレオマイシン処理した、または対照マウスから得た肺の切片（２０μＭ）を、オートラジオグラフィー（９９ｍ−ＴｃコラジェリンＩＶ投与の３時間後に屠殺）のためにインスタントイメージャー（Ｐａｃｋａｒｄ、ＵＳＡ）において曝露させた。
【図１０】：肺における９９ｍ Ｔｃ−Ｂ−コラジェリンの取り込みおよび線維症の局在の比較。ブレオマイシン処理したマウスから得た肺の切片（２０μＭ）を、オートラジオグラフィー後にシリウスレッドを用いて染色した。線維性コラーゲンの豊富な領域（矢印）を、９９ｍ−Ｔｃ−コラジェリン取り込みと重ね合わせたが、線維症では、対照ペプチドの取り込みはないことが観察される。
【０１２１】
＜実施例１＞
コラーゲン結合活性を用いた、ヒト血小板糖タンパク質Ｖｌのペプチド模倣体の同定および特性決定。線維症の分子イメージングのためのその使用。
材料＆方法：
ＦｌｉＴｒｘ（商標）ペプチドライブラリーおよび抗ＧＰＶＩ抗体：ＦｌｉＴｒｘ（商標）ランダムペプチドディスプレイライブラリーは、ペプチド相互作用のスクリーニングを可能にする大腸菌ベースの系である。ＦｌｉＴｒｘ（商標）ライブラリーは、ｐＦｌｉＴｒｘ（商標）ベクター（Ｌｕ Ｚ．ら１９９５年）で構築した。ランダムドデカペプチドの多様なライブラリー（１０８）は、細菌フラジェリン遺伝子（ｆｌｉＣ）の不要な領域の内側の、チオレドキシンタンパク質（ｔｒｘＡ）の活性部位ループ中に位置している。得られた組換え融合タンパク質（ＦＬＩＴＲＸ）は、細菌細胞表面上に、輸送され、部分的に機能的な鞭毛に組み立てられる。ドデカペプチドは、ジスルフィド橋によって立体構造的に制約されて、細胞表面に表示される。この系に基づいたＦｌｉＴｒｘ（商標）ランダムペプチドライブラリーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手した。
【０１２２】
抗ヒト血小板ＧＰＶＩ９Ｏ１２．２ ＩｇＧおよび可溶性組換えＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、先に記載されたように入手した（Ｌｅｃｕｔ Ｃら２００３年）。
【０１２３】
ランダムペプチドディスプレイライブラリーのスクリーニング：細菌培養および一般的なパニング法を、製造業者のプロトコールに従って実施した。手短には、発現を駆動するバクテリオファージに由来するＰＬプロモーターを含むｐＦｌｉＴｒｘ（商標）ベクターを、大腸菌ＧＩ８２６株（Ｆ、ｌａｃｌｑ、ａｍｐＣ：：Ｐｔｒｐ ｃｌ、ΔｆｌｉＣ、ΔｍｏｔＢ、ｅｄａ：：Ｔｎ１０）で増殖させた。プラスミドをもつ細菌を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する、ＩＭＣ培地［１％ Ｍ９塩（４０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．５ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ）、０．２％カサミノ酸、０．５％グルコース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２］中で、２５℃で一晩増殖させた。ペプチド挿入を含む、チオレドキシン−フラジェリン融合タンパク質の発現を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１００μｇ／ｍＬトリプトファンを含有するＩＭＣ培地５０ｍＬに、１０８個細胞（３ｍＬ）の一晩培養物を加えることによって誘導した。培養物を２５℃で６時間増殖させた。６時間インキュベートした後、１０ｍＬの誘導された大腸菌培養物を採取し、１％の脱脂粉乳、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）およびα−メチルマンノシド１％（最終濃度）に混合した。得られた溶液を、以下のスクリーニングのための準備の整ったペプチドライブラリーとして使用した。
【０１２４】
滅菌組織培養プレート（Ｎｕｎｃ）は、１ｍＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中、２０μｇの９Ｏ１２．２ ＩｇＧを用いて４℃で一晩コーティングした。プレートを、１０ｍＬの滅菌水で洗浄し、穏やかな撹拌下、１０ｍｌのブロッキング溶液（ＩＭＣ培地中、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ｗ／ｖの脱脂粉乳、１％ｗ／ｖのα−メチルマンノシドおよび１００μｇ／ｍＬアンピシリン）とともに１時間インキュベートした。次いで、誘導された細菌培養物のアリコーティング（５ｍｌ）をプレートに加えた。次いで、プレートを、シェーカー上、５０ｒｐｍで１分間穏やかに撹拌し、２５℃で１時間インキュベートした。次いで、細菌懸濁液を破棄し、プレートを、アンピシリンおよびα−メチルマンノシドを含有するＩＭＣ培地４ｍＬとともに５分間穏やかに撹拌することによって洗浄した。さらに４回洗浄した後、ＩＭＣ１ｍＬとともに３０秒間激しく撹拌することによって、結合している細菌を分離した。細菌懸濁液の少量のアリコーティングを、ＩＭＣ培地で希釈し、ＲＭＧ（１％ Ｍ９塩、２％カサミノ酸、０．５％グルコース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１．５％寒天）プレート上に均等に広げ、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。各パニングの後、細菌を−８０℃で凍結した。５ラウンドのバイオパニング後、ＲＭＧプレートから細菌コロニーを無作為に選び取り、さらなる同定のために増幅および誘導した。
【０１２５】
ウエスタンブロッティング分析：ウエスタンブロッティングによる陽性クローンの同定を、原則的に製造業者のプロトコールに従って行った。手短に述べると、増幅されたクローン培養物１０ｍＬを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＲＭ培地（１％ Ｍ９塩、２％カサミノ酸、１％グリセロール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）２ｍｌに移し、振盪しながら３０℃で飽和まで増殖させた。一晩培養物から得た４０μＬのサンプルを、３７℃で、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１００μｇ／ｍＬトリプトファンを含有するＩＭＣ ２ｍＬに、細胞密度がＡ６００ｎｍ０．５〜０．６に達するまで播種した。１．５ｍＬの誘導された細胞培養物を、１０，０００ｇで５分間の遠心分離によって回収した。ペレットを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルローディングバッファーに再懸濁し、５分間煮沸した。タンパク質を１２％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分離し、一晩のパッシブトランスファーによってニトロセルロース上にブロットした。メンブランを２．５％ Ｂｌｏｔｔｏ／ＰＢＳを用いて室温で２時間ブロッキングし、次いで、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、９Ｏ１２ ＩｇＧ、１０μｇ／ｍＬとともに２時間インキュベートした。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、メンブレンを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＡＰ）がコンジュゲートしているウサギ抗マウスＩｇＧとともに室温で１．５時間インキュベートした。さらに３回の洗浄手順の後、結合しているＩｇＧを、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを使用して検出した。
【０１２６】
ＤＮＡ配列決定：選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、プラスミドＤＮＡ抽出の標準プロトコール（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、２００１年）を使用して単離した。ＰＲＩＳＭ３１０自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ、ＣＡ）およびＦＬＩＴｒｘ（商標）フォワード配列決定プライマー（５’−ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＴＧ ＡＣＴ ＧＡＣ ＧＡＣ−３’）を使用して、ヌクレオチド配列を決定した。各選択されたクローンのペプチド配列をＤＮＡ配列決定から推定した。
【０１２７】
ペプチド合成：１０種の同定されたうちの１種の配列を、大規模ペプチド合成およびさらなる特性決定のために選択した。ペプチドを、短い柔軟なスペーサー（ＳＧＳＧ）配列を介して、Ｎ末端で遊離またはビオチン化のいずれかで合成した。環化は、配列をフランキングする、システイン残基（Ｃ５およびＣ２２）のジスルフィド橋形成によって得た。ペプチドのＣ末端のカルボキシル官能基を、アミドで置換した。ペプチドを、半自動化マルチシンセタイザー（ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｈｅｔｉｚｅｒ）ＮＰＳ４０００（ＮｅｏＭＰＳ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）を用い、メリフィールドの固相法によって調製した。そのように得られたペプチドの配列は、ＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣであった。合成されたペプチド（ビオチン化または非ビオチン化）の品質は、ＨＰＬＣおよび質量分析によって評価した。前記ポリペプチドは、コラジェリンと名づけた。
【０１２８】
Ｎ末端でビオチン化された、非環状ビオチン化ペプチド（ＳＧＳＧＶＮＶＹＡＶＴＫＥＮＴＩＩＮＰＳＥＮＧＤ）および環状ペプチドＰｃ（ＳＧＳＧＣＧＰＮＤＡＮＨＤＡＶＤＮＡＲＧＰＣ）（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ、Ｃｌａｙｔｏｎ Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、対照実験のための無関係のペプチドとして使用した。
【０１２９】
結合実験：タンパク質標的とのペプチド結合を、表面プラズモン共鳴および固相アッセイを使用して分析した。
【０１３０】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：
Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｏｒｓａｙ、Ｆｒａｎｃｅ）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｐａｒｉｓ ７、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｊａｃｑｕｅｓ Ｍｏｎｏｄ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、合成したペプチドの結合特性を特性決定した。ビオチン化ペプチド（約２０ＲＵ）を、ＳＡ−センサーチップの表面と共有結合によってカップリングした。
【０１３１】
９Ｏ１２．２ＩｇＧを、２５℃で、ＨＢＳ−ＥＰバッファー［０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート２０（ｖ／ｖ）］中、２０μＬ．ｍｉｎ−１の流速で固定化したペプチド上に注入した。グリシン−ＨＣｌ（１０ｍＭ ｐＨ２．５）を、２０μＬ．ｍｉｎ−１で３０秒間注入して、各サンプル間のセンサーチップを再生した。センサーグラムを、ＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．１ソフトウェアを用いて分析した。１．２５〜１０μｇ．ｍＬ−１の範囲の４種の異なるＩｇＧ濃度で、会合および解離速度の分析から速度定数（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ）を推定した。解離定数ＫＤは、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎから算出した。センサーグラムは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．１ソフトウェアを用いて分析した。いくつかの実験では、ＩｇＧの注入に先立って、ペプチドを、センサーチップ上でＤＴＴによって還元した。競合実験は、ＩｇＧを、組換え可溶性ＧＰＶＩ（２５μｇ．ｍＬ−１）と混合することによって実施した。ペプチドとのコラーゲン結合は、ペプチドでコーティングしたセンサーチップ上に、Ｉ型ウマコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｈｏｒｍ、Ｎｙｃｏｍｅｄ． Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＥＢＳ−ＥＰバッファー中、２００μｇ．ｍＬ−１）を注入することによって分析した。
【０１３２】
その他の実験では、線維性コラーゲンを、製造業者の使用説明書に従ってＣＭ５−センサーチップ上に手作業で固定化した（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。ビオチン化ペプチド（１２５；２５０、５００および１０００μｇ／ｍＬ）を、２５℃、２０μＬ．ｍｉｎ−１の流速で固定化されたコラーゲン上に注入した。競合実験では、ペプチドを、表面上への注入に先立って、組換え可溶性ヒトＧＰＶＩ−Ｆｃまたは９Ｏ１２．２ＩｇＧとともにプレインキュベートした。表面プラズモン共鳴強度をモニターし、ＢｉｏＥｖａｌ２．０（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用してデータを分析した。
【０１３３】
固相アッセイ：
タンパク質［Ｉ型ウマ線維性コラーゲン（Ｈｏｒｍ）、ウシフィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ）、ヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、ラットビトロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、マウスラミニン（Ｇｉｂｃｏ）、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ Ｓｉｇｍａ）］を、微量滴定プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ Ｄｙｎｅｘ ｖＷＲ）上に、４℃で２４時間コーティングした（１μｇ／ウェル）。遊離部位がＢＳＡで飽和した後に、ウェルにビオチン化ＦＬｌＧＰＶＩペプチド（５０μｇ／ｍｌ）を２時間加えた。次いで、ウェルと結合しているペプチドを、基質としてエクトラビジン−ＨＲＰおよびオルトフェニルジアミンを使用して検出した。
【０１３４】
組織化学的分析：２−メチルブタン中で凍結した後、ルイスラットから得た胸部大動脈の８μｍの切片を、クリオスタットミクロトームで切断した。内因性ペルオキシダーゼの不活性化、内因性ビオチン部位および非特異的部位を、０．３％ Ｈ２Ｏ２、２０分間、ビオチンブロッキング系（ＤＡＫＯ）および１％ ＢＳＡによってブロッキングした。各ステップの後、切片をＴＢＳ ｐＨ７．６で洗浄した。切片に、ビオチン化ペプチド（２００μｇ／ｍＬ）を４℃で一晩適用した。３回の洗浄ステップの後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ）およびジアミノベンジジンを使用して染色を実施した。切片を、ヘマトキシリン−エオシン（Ｍｅｒｃｋ）を用いて対比着色した。
【０１３５】
ラット尾腱を切除し、−２０℃でｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴを用いて包埋した。２０μＭの切片を切断し、さらに上記のように処理した。
【０１３６】
あるいは、凍結切片を、ホルモールを用いて１０分間固定した。再水和後、シリウスレッドを使用してコラーゲンを着色した。
【０１３７】
ペプチド放射標識：ストレプトアビジンのテクネチウム−９９ｍを用いる標識：手短には、ストレプトアビジンを、１ｍｇ．ｍＬ−１の濃度に０．０１％酢酸に溶解した。標識のために、反応物を、以下の順で１分間混合した：最初に、１０μＬのストレプトアビジン、続いて、４μＬのスズ（ｓｎ−ＰＹＰ）および２μＬのＫＢＨ４（０．１Ｎ ＮａＯＨ中、１０ｍｇ／ｍｌ）、および５０〜１００μＬ中、７４０ＭＢｑのテクネチウム−９９ｍ。３０分後、溶液は注射の準備が整った。品質管理は、メチル−セトン（ｍｅｔｈｙｌ−ｃｅｔｏｎｅ）を使用するペーパークロマトグラフィーを用いて実施した。標識されたストレプトアビジンは、移動できなかった。遊離テクネチウムは、溶媒フロントとともに移動した。３０分で、９６％を上回る高効率の標識が得られた。注射の直前に、標識されたストレプトアビジンを、ビオチン−コラジェリンと、１対４のモル比で混合した。
【０１３８】
コラジェリンＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣを、上記と同一手順、濃度（１０μＬの０．０１％コラジェリン１ｍｇ．ｍＬ−１）および対照を使用して直接標識した。いずれの場合にも、３０分で９６％を上回る高効率の標識が得られた。
【０１３９】
対照分析のためには、上記の手順を使用して、９９ｍＴｃ−ストレプトアビジンを用いて、または直接的に、Ｔｃ−９９ｍによって放射標識した後に、環状Ｐｃビオチン化ペプチドを使用した。
【０１４０】
標識されたストレプトアビジンおよびペプチドは、少なくとも３時間安定であり、次いで、６時間で４０〜５０％の遊離テクネチウムを伴って減少した。標識された生成物を、７０ＭＢｑ／動物の用量で静脈内に注射した。
【０１４１】
ｉｎ ｖｉｖｏシンチグラフィーイメージング：雄のウィスターラット（Ａｒｌａｎｄ、Ｆｒａｎｃｅ）を、１２：１２時間、明−暗周期で、温度および湿度を制御した環境に収容し、標準ラット固形飼料および水を、自由に給餌した。記載されるように（Ｆｉｓｈｂｅｉｎ ＭＣ．ら１９７８年；Ｓａｒｄａ−Ｍａｎｔｅｌ Ｌ．ら２００６年）、ラットを麻酔［１ｍｌ／ｋｇ ｉｐケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ ５００、Ｍｅｒｉａｌ）および０．５ｍｌ／ｋｇ ｉｐ キシラジン（２％Ｒｏｍｐｕｎ、Ｂａｙｅｒ）］および陽圧換気下におきながら、左下行冠動脈の持続的結紮によって、左心室の心筋梗塞を得た。このプロトコールは、Ｆｒｅｎｃｈ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｄｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｅｓの承認（承認番号７５−２１４）の下、実施される。２種類の対照動物を使用した：健常なラットおよび簡単な開胸術（ｔｈｒｏｒａｃｏｔｏｍｙ）が実施された（偽手術された）ラット。
【０１４２】
放射線核種イメージングは、病変が治癒されるよう、冠動脈結紮（または開胸術）の３〜４週間後に実施した。標識されたペプチドを、放射標識の２時間以内に麻酔をかけた動物（ペントバルビタール６ｍｇ／１００ｇ、ＢＷ、Ｃｅｖａ Ｓａｎｔｅ Ａｎｉｍａｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ腹膜内注射）に静脈内投与した。ペントバルビタール麻酔（４ｍｇ／１００ｇ ＢＷ、Ｃｅｖａ Ｓａｎｔｅ Ａｎｉｍａｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）下で、９９ｍＴｃ−ストレプトアビジン−ビオチン化ペプチド（７４ＭＢｑ）の注射の０〜２時間、４時間、６時間、１０時間および２４時間後、９９ｍＴｃ−ビオチン化ペプチド（７４ＭＢｑ）の注射の０〜２時間および４時間後にシンチグラフィー像を得た。平面および断層撮影１時間獲得を、２パラレル低エネルギー用高分解能コリメーター（マトリックス１２８×１２８、１４０ＫｅＶを中心とした１５％エネルギーウィンドウ）を備えた、専用の小動物γＩＭＡＧＥＲ−Ｓ／ＣＴシステム（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｍｅｓｕｒｅｓ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して実施した。左心領域におけるＡＮＸ取り込みを、視覚的に評価した。また、心臓にわたる、および右肺にわたる２つの注目する領域が、シンチグラムで描かれた。注目する各領域で、１ピクセルあたりの平均活性（ｃｐｍ）を決定した。次いで、心臓対肺活性比（ＨＬＲ）を、平面像で、ならびに横断断層撮影像で算出した。
【０１４３】
定量的オートラジオグラフィーおよび組織学的検査：動物を屠殺した後、心臓を採取および凍結し、次いで、クリオスタットで、２０マイクロメーター厚の心筋切片を、心室の短軸に対して垂直に切断し、次いで、ラジオイメージャー（ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒ）（インスタントイメージャー、Ｐａｃｋａｒｄ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＵＳＡ）中で１２時間曝露した。組織と等価のホモジネートの活性標準を用いて、先に報告されたように実施した較正研究によれば、５０カウント／ｍｍ２の９９ｍＴｃ−アネキシンＶは、オートラジオグラフィーで２１０ｋＢｑ／ｍｇに近似した（Ｐｅｔｅｇｎｉｅｆ Ｙ．ら１９９８年）。次いで、アセトン（−２０℃）中で固定された、オートラジオグラフィーのために使用した心筋切片ならびに５マイクロメートルの連続心臓切片を、ヘマトキシリン−エオシンおよびシリウスレッドで染色して、線維性心筋瘢痕の位置および程度を決定した。
【０１４４】
結果：
９Ｏ１２．２−結合性ペプチドの同定：９Ｏ１２．２ ＩｇＧを使用する、ドデカマーに制約されたペプチドのコンビナトリアルライブラリーの５ラウンドのバイオパニング後、いくつかの個々の細菌クローンが得られた。１２のクローンを選択し、ｌｇＧ９Ｏ１２．２を使用するイムノブロッティングによって分析した（図１Ａ）。これらのクローンは、９Ｏ１２．２によって標識された融合鞭毛タンパク質を産生し、このことは、抗体によって認識されるペプチドを含むことを示す。
【０１４５】
２０クローンのＤＮＡ配列決定の結果、表１）に示される９ペプチド配列が同定された。
【０１４６】
【表１】
【０１４７】
これらの配列は、１〜４個の残基で互いに異なっている。これらの配列のうち、データベースに登録されたものはなかった。
【０１４８】
対応するクローンが、９Ｏ１２．２を用いるイムノブロッティングにおいて、より強いシグナルを生じたので（図１Ａ）、クローン１４の配列を合成のために選択した。以下の制約されたペプチドＳＧＳＧＣＧＰＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥＧＰＣ（コラジェリンとして設計された）を合成し、Ｎ末端と連結しているビオチンとコンジュゲートするか、しなかった（「ビオチン−コラジェリン」を設計した）。両ペプチドの純度は、９５％よりも高いと、ＨＰＬＣ分析によって測定された。それらの分子量は、それぞれ２１５５および２４０５Ｄａであった。
【０１４９】
ペプチドを、９Ｏ１２．２ＩｇＧと結合するその能力、および固相アッセイにおいてＧＰＶＩと競合するその能力について分析した。表面プラズモン共鳴を使用して、９Ｏ１２．２ＩｇＧは、固定化されたビオチン−コラジェリンと用量依存的に結合するとわかった（図１Ｂ）。推定されるＫＤは、１０−６Ｍであった。ビオチン−コラジェリンをジスルフィド橋還元に付すと、これは、９Ｏ１２．２エピトープが、立体構造的であるというこれまでに報告された知見（Ｌｅｃｕｔ Ｃ．ら２００３年）と一致して、９Ｏ１２．２ＩｇＧと結合する能力を喪失した（図１Ｃ）。さらに、９Ｏ１２．２は、組換え可溶性ＧＰＶＩ（ＧＰＶＩ−Ｆｃ）の存在下でペプチドと結合できず（図１Ｄ）、このことは、ＧＰＶＩおよびコラジェリンは、９Ｏ１２．２との結合について競合したということを示した。
【０１５０】
コラーゲンとの結合：これらのデータが、コラジェリンは、ＧＰＶＩに対する９Ｏ１２．２のエピトープを少なくとも部分的に摸倣すると仮定することにつながった。９Ｏ１２．２は、コラーゲンとのＧＰＶＩ結合を中和するので、本発明者らは、コラジェリンは、ＧＰＶＩのコラーゲン結合部位を少なくとも部分的に摸倣できると仮定した。したがって、本発明者らは、コラジェリンのコラーゲンと相互作用する能力を調べた。
【０１５１】
本発明者らは、ビオチン−コラジェリンが固定化されている、ストレプトアビジンコーティングしたセンサーチップを使用して、Ｉ型コラーゲンと表面の結合を観察した（図２Ａ）。次いで、アミンカップリング手順によって、Ｉ型コラーゲンをＣＭ５センサーチップ上に固定化した。本発明者らは、漸増濃度のビオチン−コラジェリン（１２５；２５０、５００および１０００μｇ／ｍＬ）を使用して、用量依存性結合を観察した。センサーグラムの分析によって、１．１０−７ＭというＫＤを算出することが可能であった（図２Ｂ）。
【０１５２】
微量滴定プレート上に固定化されているコラーゲンを使用して、コラーゲンとのペプチド相互作用をさらに分析した。無関係のペプチドと比較した場合には、ビオチン−コラジェリン（５０μｇ／ｍＬ）は、コラーゲンと有意に結合した（図３Ａ）。結合は、組換え可溶性ＧＰＶＩの存在下、または９Ｏ１２．２ＩｇＧの存在下で完全に阻害された（図３Ａ）。対照的に、９Ｏ１２．２とは異なるエピトープと結合し、コラーゲンとのＧＰＶＩ相互作用を中和しない（Ｌａｇｒｕｅ−Ｌａｋ−Ｈａｌ ＡＨ．ら２００１年）、二次抗ＧＰＶＩモノクローナル抗体、３Ｊ２４．２は、ビオチン−コラジェリンとコラーゲンの結合を阻害しなかった。結局、これらの結果は、コラジェリンおよびＧＰＶＩは、コラーゲンの表面の同一部位または重複する部位と結合するということを実証する。このペプチドは、そのコラーゲン結合特性のために、コラジェリンと名づけられた。
【０１５３】
本発明者らは、コラジェリンの特異性を正確に言うために、細胞外マトリックスに由来する種々の固定化された高分子：フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびマウスラミニン、または血管病変部位に蓄積される高分子（フィブリノゲン／フィブリン）と結合するその能力を調べた（図３Ｂ）。コラジェリンは、フィブリノゲン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンと、ウシ血清アルブミンよりも大幅には結合しなかった。対照的に、これは、ＧＰＶＩアクセサリーリガンドとしてこれまでに同定されたラミニンと結合した（Ｉｎｏｕｅ Ｏ．ら２００６年）。この結果は、ラミニンおよびコラーゲンと相互作用するＧＰＶＩの部位は、コラジェリンによって摸倣される共通構造を共有することを示す。さらに、ラミニンは、ＳＰＲ分析によってコラジェリンと結合するとわかり、算出されたＫＤは、１．８３ １０−５Ｍであった。対照的に、非関連ペプチドは、これらのタンパク質のいずれとも結合しなかった。
【０１５４】
９Ｏ１２．２を用いて同定されたその他のクローンの配列に対応する８種の合成ペプチドを合成し、コラーゲンと結合するその能力について調べた。すべては、対照の非関連ペプチドと比較した場合に、コラーゲンと結合するとわかり、可変効率を有していた（図４）。
【０１５５】
コラジェリンを用いる、コラーゲンのｅｘ ｖｉｖｏ標識：ＧＰＶＩは、血管損傷部位でコラーゲンと結合するので、本発明者らは、組織化学分析によって、コラジェリンが血管コラーゲンと相互作用できるかどうかを調べた。
【０１５６】
ラット大動脈のパラフィン包埋切片の凍結切片を、ビオチン化コラジェリンＩまたは無関係のペプチドとともにインキュベートした。ペルオキシダーゼがカップリングしているエクストラビジンを使用して、結合しているペプチドを検出した（図５Ａ）。コラジェリンを含む大動脈切片では褐色が発色したが、無関係のペプチドを含むものでは発色しなかった。標識は、固定された切片上よりも、ラット大動脈の凍結切片で、より明確であった（図７Ｂ）。コラジェリンでの標識は、シリウスレッドを用いるコラーゲンの呈色と一致していた。抗ＧＰＶＩ ＩｇＧ９Ｏ１２．２の存在下では、コラジェリンを用いる標識の強度が低下し、このことは、ペプチドおよび血管マトリックス間の相互作用の特異性を示す。
【０１５７】
多量のＩ型コラーゲンを含むラット尾の切片を使用して、コラジェリンの、非血管コラーゲンと相互作用する能力を、次に調べた（図５Ｂ）。コラジェリンとともに、シリウスレッドで着色された線維の強い標識が観察されたが、対照ペプチドとともには観察されなかった。
【０１５８】
線維症のｉｎ ｖｉｖｏ同位体分子イメージング：コラジェリンは、組織化学分析で、コラーゲンを強く標識したので、本発明者らは、コラーゲン蓄積の部位で ｉｎ ｖｉｖｏで保持されるであろうと仮説をたてた。したがって、コラジェリンを標識し、治癒した心筋梗塞を呈するラットにおいて静脈内注射した。
【０１５９】
第１に、８匹のラット（４匹は心筋梗塞を有し、４匹は、偽手術された）に、混合Ｔｃ−９９ｍ標識したストレプトアビジン−ビオチン化コラジェリンを投与した。放射性トレーサーは、高い非特異的肝臓取り込みを示し、緩慢な血液クリアランスを示した（注射の１２時間後まで、高い血液プール活性が見られた）。視覚的には、平面および断層撮影像によって、注射の４時間〜６時間後に、心筋梗塞を有するすべてのラットにおいて心臓領域において大幅なトレーサー取り込みが示されたのに対し（図６Ｂ）、すべての偽手術されたラットの心臓領域ではトレーサー取り込みは観察されなかった。平面シンチグラフィー像での心臓対肺比は、心筋梗塞を有するラットでは、２．７６＋／−０．３６であり、対して、偽手術されたラットでは、１．９５＋／−０．２８であった（ｐ＝０．００３）。注射の６時間後に得た心臓の凍結切片では、シグナルは、コラジェリン／Ｔｃ−９９ｍストレプトアビジン混合物で処理したラットの梗塞領域において顕著であり、梗塞心筋対遠隔心筋の比は、２．００＋／−０．７０であった（図６Ｃ）。梗塞領域は、コラーゲンが豊富であったと、シリウスレッドを用いた組織学的検査によって示された。対照実験は、非特異的９９ｍＴｃ−ストレプトアビジン−ビオチン−ペプチドを使用して、６匹の心筋瘢痕を有するラットで実施し、注射の６時間後に得たオートラジオグラフィーデータは、梗塞において、非特異的トレーサー取り込みを示さなかったか、軽度の非特異的トレーサー取り込みを示し、コラジェリンを用いて得たものよりも低い梗塞心筋対遠隔心筋の比を有していた（１．８２＋／−０．３２対２．６１＋／−０．１９、ｐ＜０．０１）（図６Ｄ）。
【０１６０】
第２に、１２匹のラット（８匹は心筋梗塞を有し、４匹は偽手術された）に、９９ｍＴｃ−コラジェリンを注射した。放射性トレーサーによって、初期の（＜５分）胆汁中排泄および迅速な血液クリアランスが示された。視覚的には、トレーサー注射の１時間後に、心筋梗塞を有する５／８匹のラットの心臓領域において平面および断層撮影像で大幅なトレーサー取り込みが明確に見られた（図７Ａ）。心筋梗塞を有する２匹のその他のラットの心臓領域では、イメージングは、疑わしいものであり、１匹では、陰性であった。６／１０匹の手術されたラット（４匹は心筋梗塞を有し、２匹は偽手術された）の皮膚瘢痕および／または皮下胸部瘢痕において、トレーサー取り込みの増大も観察された。平面シンチグラフィー像での心臓対肺の比は、心筋梗塞を有するラットでは２．０８＋／−０．１７であり、対して、偽手術されたラットでは１．４５＋／−０．０３であった（ｐ＝０．０３）。注射の６時間後に得た心臓の凍結切片では、シグナルは、処理したラットの梗塞領域において顕著であり、梗塞心筋対遠隔心筋の比は、３．０６＋／−０．４５であった（図７Ｂ）。梗塞領域は、コラーゲンが豊富であったと、シリウスレッドを用いた組織学的検査によって示された。対照実験は、非特異的９９ｍＴｃ−ペプチドを使用して実施し、注射の４時間後に得たオートラジオグラフィーデータは、心筋組織において極めて低い絶対トレーサー取り込み（９９ｍＴｃ−コラジェリンを用いて観察されたものの１０％）、および正常心筋と比較して、梗塞におけるトレーサー取り込みの軽度の増大を示し、これは、軽度の非特異的トレーサー蓄積に対応した（梗塞心筋対遠隔心筋：１．７）（図７Ｃ）。
【０１６１】
＜実施例２＞
９９ＭＴＣ標識コラジェリンを使用するシンチグラフィーによる肺線維症のイメージング：
方法：
６〜７週齢の、雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ＩＮＳＥＲＭルールに従って維持した。０日目に、マウスに、８０μｇの塩酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ Ｂｅｌｌｏｎ、Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を気管内に投与した。死亡率を、１４日間にわたって毎日評価した。未処理マウスを対照として使用した。
【０１６２】
１４日目にマウスに、９９ｍＴｃ−Ｂ−コラジェリンまたは９９ｍＴｃ−Ｂ−Ｐｃ（３ＭＢｑ）の１回静脈内注射を投与した。次いで、Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ専用の小動物γカメラを使用して、トレーサー注射の１時間後に、平面全身シンチグラフィーイメージング（６０分間）を実施した。
【０１６３】
実験の最後に、動物を屠殺し、ガンマカウンティング、オートラジオグラフィーおよび組織学的検査（シリウスレッド呈色）のために肺を解剖した。
【０１６４】
結果：
シンチグラフィー：ブレオマイシンを投与されたマウスの肺領域において、相当な９９ｍＴｃ−Ｂ−コラジェリン取り込みが観察され（肺／筋肉バックグラウンド活性比：３．６５±０．３４）、これは、対照マウスの肺領域において観察されたものよりも高く（肺／筋肉バックグラウンド活性比：１．５６±０．０１、ｐ＜０．０２）、ブレオマイシンマウスの肺領域における９９ｍＴｃ−Ｂ−Ｐｃ取り込みよりも高かった（肺／筋肉バックグラウンド活性比：２．２０±０．１１、ｐ＜０．０３）（図８）。
【０１６５】
オートラジオグラフィー：オートラジオグラフィー研究によって、対照と比較して、肺線維症を有するマウスの肺の切片で、より高い９９ｍＴｃ−Ｂ−コラジェリン取り込みが確認され（平均カウント／ｍｍ２：１４０±３２対６１±１０、ＮＳ）、シリウスレッド呈色のものと対応する不均一な分布を有していた。この結果は、線維症への特異的９９ｍＴｃ−Ｂ−コラジェリン取り込みを高度に示唆する（図９）。
【０１６６】
線維性肺における対照ペプチドの取り込みは、９９ｍＴｃ−Ｂ−コラジェリンのものよりも大幅に低かったと、６５±１０カウント／ｍｍ２の活性によって示された。さらに、対照ペプチド取り込みは、レッドシリウス呈色と相関していなかった（図１０）。
【０１６７】
結論：
９９ｍＴｃ標識コラジェリンは、マウスにおける肺線維症の、効率的で、特異的なイメージングを可能にする。
【０１６８】
参考文献：
【０１６９】
【表２】
【０１７０】
【表３】
【０１７１】
【表４】
【０１７２】
【表５】
【０１７３】
【表６】
【０１７４】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ１−Ｘ２−Ｍ−Ｈ−Ｇ−Ｌ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｅ（配列番号１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたＰであり、
Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
Ｘ７は、Ｑ、ＨまたはＬであり；
Ｘ９は、ＷまたはＧであり
Ｘ１０は、ＡまたはＤである］
からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
ＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥ（配列番号２）、ＲＦＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥ（配列番号３）、ＲＶＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥ（配列番号４）、ＲＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥ（配列番号５）、ＲＶＭＨＧＬＱＬＷＤＤＥ（配列番号６）、ＲＶＭＨＧＬＨＬＷＡＤＥ（配列番号７）、ＦＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥ（配列番号８）、ＰＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥ（配列番号９）およびＲＶＭＨＧＬＬＬＧＡＤＥ（配列番号１０）からなる群において選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２において示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＣＧＰ−Ｘ１−Ｘ２−ＭＨＧＬ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−ＤＥ−ＧＰＣ （配列番号１１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたはＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり；
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］。
からなるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＳＧＳＧＣＧＰ−Ｘ１−Ｘ２−ＭＨＧＬ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−ＤＥ−ＧＰＣ（配列番号２１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたはＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり；
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］
からなるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項４または５に記載のポリペプチドが、２個のシステイン残基間で結合されるジスルフィドによって環化されている環状ポリペプチド。
【請求項７】
次式を有する、請求項６に記載の環状ポリペプチド。
【化１】
【請求項８】
次式を有する、請求項６に記載の環状ポリペプチド。
【化２】
【請求項９】
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸または請求項１０に記載のベクターによって形質転換されている宿主細胞。
【請求項１２】
検出可能な物質で標識されている、請求項１から５のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項６から８のいずれかに記載の環状ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載の、標識されたポリペプチドまたは標識された環状ポリペプチドを含む造影剤。
【請求項１４】
請求項１３に記載の造影剤を含む医薬組成物。
【請求項１５】
線維症を伴う状態のｉｎ ｖｉｖｏ診断またはイメージングのための、請求項１３に記載の造影剤または請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記の線維症を伴う状態が、肺線維症、肝腎線維症、心臓線維症、血管系線維症、皮膚線維症、眼線維症、骨および骨髄線維症からなる群から選択される、請求項１５に記載の造影剤または請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１】
Ｘ１−Ｘ２−Ｍ−Ｈ−Ｇ−Ｌ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｄ−Ｅ（配列番号１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたＰであり、
Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
Ｘ７は、Ｑ、ＨまたはＬであり；
Ｘ９は、ＷまたはＧであり
Ｘ１０は、ＡまたはＤである］
からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
ＲＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥ（配列番号２）、ＲＦＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥ（配列番号３）、ＲＶＭＨＧＬＱＬＷＡＤＥ（配列番号４）、ＲＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥ（配列番号５）、ＲＶＭＨＧＬＱＬＷＤＤＥ（配列番号６）、ＲＶＭＨＧＬＨＬＷＡＤＥ（配列番号７）、ＦＶＭＨＧＬＨＬＧＤＤＥ（配列番号８）、ＰＶＭＨＧＬＨＬＷＤＤＥ（配列番号９）およびＲＶＭＨＧＬＬＬＧＡＤＥ（配列番号１０）からなる群において選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２において示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＣＧＰ−Ｘ１−Ｘ２−ＭＨＧＬ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−ＤＥ−ＧＰＣ （配列番号１１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたはＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり；
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］。
からなるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＳＧＳＧＣＧＰ−Ｘ１−Ｘ２−ＭＨＧＬ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ９−Ｘ１０−ＤＥ−ＧＰＣ（配列番号２１）
［式中、
アミノ酸Ｘ１は、Ｒ、ＦまたはＰであり；
アミノ酸Ｘ２は、ＦまたはＶであり；
アミノ酸Ｘ７は、Ｑ、ＨまたはＬであり；
アミノ酸Ｘ９は、ＷまたはＧであり；
アミノ酸Ｘ１０は、ＡまたはＤである］
からなるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項４または５に記載のポリペプチドが、２個のシステイン残基間で結合されるジスルフィドによって環化されている環状ポリペプチド。
【請求項７】
次式を有する、請求項６に記載の環状ポリペプチド。
【化１】
【請求項８】
次式を有する、請求項６に記載の環状ポリペプチド。
【化２】
【請求項９】
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸または請求項１０に記載のベクターによって形質転換されている宿主細胞。
【請求項１２】
検出可能な物質で標識されている、請求項１から５のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項６から８のいずれかに記載の環状ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載の、標識されたポリペプチドまたは標識された環状ポリペプチドを含む造影剤。
【請求項１４】
請求項１３に記載の造影剤を含む医薬組成物。
【請求項１５】
線維症を伴う状態のｉｎ ｖｉｖｏ診断またはイメージングのための、請求項１３に記載の造影剤または請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記の線維症を伴う状態が、肺線維症、肝腎線維症、心臓線維症、血管系線維症、皮膚線維症、眼線維症、骨および骨髄線維症からなる群から選択される、請求項１５に記載の造影剤または請求項１５に記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１１−５０５８２０（Ｐ２０１１−５０５８２０Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３７４４２（Ｐ２０１０−５３７４４２）
【出願日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６７２７５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７４６２８
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５９９１７６５０６）アンセルム（アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） (23)
【出願人】（５１０１６４２５６）ユニヴェルシテ パリ ディドロ−パリ セットゥ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６７２７５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７４６２８
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５９９１７６５０６）アンセルム（アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） (23)
【出願人】（５１０１６４２５６）ユニヴェルシテ パリ ディドロ−パリ セットゥ (2)
【Ｆターム（参考）】
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