肝炎ウイルス吸着剤
【課題】 水溶液、血液又は血漿中に存在する肝炎ウイルスを吸着する肝炎ウイルス吸着剤であって、ウイルス以外の他の成分を吸着させることが少なく、肝炎ウイルスを効率的に吸着する機能を有する肝炎ウイルス吸着剤を提供すること。
【解決手段】 ヘパリンの１級及び２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）又はヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を含有する肝炎ウイルス吸着剤により上記課題を解決する。
【解決手段】 ヘパリンの１級及び２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）又はヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を含有する肝炎ウイルス吸着剤により上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝炎ウイルスを選択的に吸着することができる肝炎ウイルス吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の慢性的感染が原因であり、薬剤による治療法としてペグインターフェロン、リバビリンの併用療法が一般的である。ジェノタイプ１ｂかつ血液中のウイルス量の多い患者では、治療成績は５０％程度であり、肝硬変、肝がんへの移行割合が高いことからより有効な治療法、薬剤の開発が望まれている（非特許文献１）。一般的に薬剤による治療では血中のウイルス量が低い場合、治療成績が高いことが知られている。血中のＨＣＶウイルスを多孔性のフィルターで除去し、薬剤との併用療法を行うと、治療成績が向上するとの報告がある（非特許文献２）。即ち、体内のウイルス量を下げることで、治療成績が向上したものと推定される。
【０００３】
また、一旦血球と血漿を分離した後、血漿成分からウイルスを除去することから、回路構成は複雑で、より簡便に血中からウイルスを除去する方法がさらに望ましいと考えられる。そこで、ＨＣＶに結合するリガンドを用いる事でより簡便にＨＣＶを除去する可能性があり、このＨＣＶの吸着する物質の一つにヘパリンが挙げられる（非特許文献３）。しかし、ヘパリンは、血中のアンチトロンビンIII（ＡＴIII）やＬＤＬの構成蛋白質であるアポリポ蛋白質Ｂ（ＡｐｏＢ）と結合することが知られており、ヘパリンを用いて血中からＨＣＶを吸着除去する際、ＡＴIIIやＡｐｏＢも合わせて吸着するため、ＨＣＶの吸着効率は低下する。
【０００４】
また、ＡＴIIIやＡｐｏＢは、ヘパリンの硫酸基と相互作用することで結合することから、硫酸化度を変更することで、選択性の向上が期待される。
【０００５】
今までに、ヘパリンのＮ−硫酸やＯ−硫酸がＡＴIIIの結合には必須であると報告されているが、残存する水酸基やアミノ基の硫酸化によるＡＴIIIとの結合の影響については報告がない（非特許文献４）。ＬＤＬとの結合には、ヘパリンの硫酸化度が関与し、脱Ｏ−硫酸でＬＤＬとの結合能が低下し、加Ｏ−硫酸でＬＤＬとの結合能が上昇するが、残存するアミノ基の硫酸化によるＬＤＬとの結合の影響については報告がない（非特許文献５）。
【０００６】
ヘパリンの硫酸化度とＨＣＶ、あるいはその外殻蛋白質であるＥ１とＥ２の結合において、脱２−Ｏ−硫酸基や脱６−Ｏ−硫酸基より、脱Ｎ−硫酸基で結合能が低下することから、ＨＣＶとの結合にはＮ−硫酸基の重要性が報告されているが、誘導化されていないヘパリンとの比較や、ＡＴIIIやＬＤＬの吸着に関しての記載はない（非特許文献６）。
【０００７】
特許文献１には、血液、血漿または血清からエンベロープ保有ウイルスを除去するための、少なくとも１種のポリアニオン、１種の沈殿物用のフィルターおよび１種のポリアニオン結合性吸着物質を含む組成物の使用が開示されており、ポリアニオンとして、ヘパリンまたはヘパリン誘導体の使用が記載されている。
【０００８】
また、特許文献２には、生物医学的又は製薬生成物中の発熱原消滅又はウイルス不活性化方法において、該方法が、該生成物を固相に吸着させ、該固相に吸着した該生成物をウイルス不活性化又は発熱原消滅剤と接触させ、固相をウイルス不活性化又は発熱原消滅剤から分離し、固相から不純物及び残留不活性化又は発熱原消滅剤を除去し、且つ固相から生成物を回収する諸工程を有する方法が記載されており、該固相がリガンドを取り付けたアフィニティー樹脂であり、該リガンドがヘパリンであることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−３３４０３７
【特許文献２】特開昭６１−２７５２１０
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ウイルス性肝炎−基礎・臨床研究の進歩−日本臨床６２巻増刊号７（２００４）
【非特許文献２】Ｋ．Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．，３７，７０１（２００７）
【非特許文献３】Ａ．Ｚａｈｎ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｌａｉｎ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８６，６７７（２００５）
【非特許文献４】Ｕ．Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１２３６８（１９８４）
【非特許文献５】Ｍ．Ｇｉｇｌｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１，５９９６（１９９２）
【非特許文献６】Ｈ．Ｂａｒｔｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８０，１０５７９（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、水溶液、血液又は血漿中に存在する肝炎ウイルスを吸着する肝炎ウイルス吸着剤であって、ウイルス以外の他の成分を吸着させることが少なく、肝炎ウイルスを効率的に吸着する機能を有する肝炎ウイルス吸着剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
即ち、本発明は、上記課題を解決する肝炎ウイルス吸着剤であって、
ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）又はヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を含有する肝炎ウイルス吸着剤を用いることに特徴を有する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の肝炎ウイルス吸着剤によれば、アンチトロンビンIII（ＡＴIII）やＬＤＬの構成蛋白質であるアポリポ蛋白質Ｂ（ＡｐｏＢ）等の血液成分を吸着させること少なく、肝炎ウイルスの吸着能の高い肝炎ウイルス吸着剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
即ち、本発明は、
１．ヘパリン誘導体を含有する肝炎ウイルス吸着剤であって、該ヘパリン誘導体が、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）、又は
ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）であることを特徴とする肝炎ウイルス吸着剤、
２．肝炎ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである１．に記載の肝炎ウイルス吸着剤、
３．１．又は２．に記載の肝炎ウイルス吸着剤を用いた肝炎ウイルスの除去方法、
に関する。
【００１５】
本発明で使用されるヘパリンは、小腸、筋肉、肺、脾や肥満細胞など体内で幅広く存在し、化学的にはグリコサミノグリカンであるヘパラン硫酸の一種であり、β−Ｄ−グルクロン酸、或いはα−Ｌ−イズロン酸とＤ−グルコサミンが１，４−結合により重合した高分子であって、ヘパラン硫酸と比べて硫酸化の度合いが特に高いという特徴を有する。
本発明において用いられるヘパリンは、これらの通常公知のヘパリンでよい。
【００１６】
本発明に用いられるヘパリン誘導体は、上記ヘパリンを、該ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）又は該ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）であることに特徴を有する。硫酸エステル化は通常公知の方法で行うことができる。
【００１７】
ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）を合成する場合には、例えば、ヘパリンのアルカリ塩類をイオン交換樹脂（Ｈ＋）等に通じ、アミン類と処理することによりヘパリンアミン塩を調整する。その後に、硫酸化剤で処理して目的とするヘパリン誘導体（Ａ）とすることができる。硫酸化剤としては、公知慣用のＳＯ３・ピリジン等が好ましい。
【００１８】
また、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を合成する場合には、例えば、ヘパリンＮ−アセチル基をヒドラジン等で脱アセチル化した後に、硫酸化剤で処理して目的とするヘパリン誘導体（Ｂ）とすることができる。硫酸化剤としては、公知慣用のＳＯ３・ＮＭｅ３等が好ましい。
【００１９】
本発明のヘパリン誘導体（Ａ）及び（Ｂ）は、肝炎ウイルスを効率よく吸着することができるが、血液成分であるアンチトロンビンIII（ＡＴIII）やＬＤＬの構成蛋白質であるアポリポ蛋白質Ｂ（ＡｐｏＢ）等の血液成分を吸着させることが少なく、肝炎ウイルスの吸着能の高い肝炎ウイルス吸着剤を提供することができ、本発明の肝炎ウイルス吸着剤は、肝炎患者に対して負荷が小さい特徴を有する。
【００２０】
本発明のヘパリン誘導体のＨＣＶ吸着能を評価するため、ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）に対する吸着能を評価した。Ｅ２蛋白質は脂質膜と共に、ウイルス粒子の外被（エンベロープ）を構成し、ウイルスのエントリーに重要な役割を果たす蛋白質であって、Ｅ２蛋白質への吸着能を評価することにより、ＨＣＶへの吸着能の評価が可能となる蛋白質である。
【００２１】
また、本発明の肝炎ウイルス吸着剤の生理学的に許容される塩も本発明の範囲に含まれる。ここでいう生理学的に許容される塩とは、例えば上記に示される化合物のアルカリ付加塩であり、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩等の無毒の塩が挙げられる。
【００２２】
本発明の肝炎ウイルス吸着剤は、経口又は非経口投与（例えば静脈内投与、皮下投与、経皮投与又は直腸内投与等）することが出来、投与に際してはそれぞれの投与法に適した製剤形態に調製することができる。
【００２３】
かかる製剤は、その用途に応じて錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、トローチ剤、舌下錠、坐剤、軟膏剤、注射剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤等の製剤形体に調製することができる。
【００２４】
これらの調製に際しては、例えばこの種の薬剤に通常使用されている無毒の賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、保存剤、酸化防止剤、等張化剤、緩衝剤、コーティング剤、矯味剤、溶解補助剤、基剤、分散剤、安定化剤、着色剤等の添加剤を使用して公知の方法により製剤化することができる。
【００２５】
前記使用し得る無毒性の添加剤の具体例を列挙すると、以下のようである。
まず、賦形剤としては、でんぷん及びその誘導体（デキストリン、カルボキシメチルスターチ等）、セルロース及びその誘導体（メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、糖類（乳糖、白等、ブドウ糖等）、ケイ酸及びケイ酸塩類（天然ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム）、炭酸塩（炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム等）、水酸化アルミニウム・マグネシウム、合成ヒドロタルサイト、ポリオキシエチレン誘導体、モノステアリン酸グリセリン、モノオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
【００２６】
結合剤としては、でんぷん及びその誘導体（アルファー化デンプン、デキストリン等）、セルロース及びその誘導体（エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、糖類（ブドウ糖、白糖等）、エタノール、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
【００２７】
崩壊剤としては、でんぷん及びその誘導体（カルボキシメチルスターチ、ヒドロキシプロピルスターチ等）、セルロース及びその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、炭酸塩（炭酸カルシウム、炭酸水素カルシウム等）、トラガント、ゼラチン、寒天等が挙げられる。
【００２８】
滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸及びその塩類（軽質無水ケイ酸、天然ケイ酸アルミニウム等）、酸化チタン、リン酸水素カルシウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、マクロゴール等が挙げられる。
【００２９】
保存剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、亜硫酸塩類（亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム等）、リン酸塩類（リン酸ナトリウム、ポリリン酸カルシウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等）、アルコール類（クロロブタノール、ベンジルアルコール等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸グリセリン、糖類等が挙げられる。
【００３０】
酸化防止剤としては、亜硫酸塩類（亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等）、ロンガリット、エリソルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸、システイン、チオグリセロール、ブチルヒドロキシアニゾール、ジブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ｄｌ−α−トコフェロール等が挙げられる。
【００３１】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、デキストリン、グリセリン、ブドウ糖等が挙げられる。
緩衝剤としては、炭酸ナトリウム、塩酸、ホウ酸、リン酸塩（リン酸水素ナトリウム等）等が挙げられる。
【００３２】
コーティング剤としては、セルロース誘導体（ヒドロキシプロピルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）、セラック、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジン類（ポリ−２−ビニルピリジン、ポリ−２−ビニル−５−エチルピリジン等）、ポリビニルアセチルジエチルアミノアセテート、ポリビニルアルコールフタレート、メタアクリレート・メタアクリル酸共重合体等が挙げられる。
【００３３】
矯味剤としては、糖類（ブドウ糖、白糖、乳糖等）、サッカリンナトリウム、糖アルコール類等が挙げられる。
【００３４】
溶解補助剤としては、エチレンジアミン、ニコチン酸アミド、サッカリンナトリウム、クエン酸、クエン酸塩類、安息香酸ナトリウム、石鹸類、ポリビニルピロリドン、ポリソルベート類、ソルビタン脂肪酸エステル類、グリセリン、ポリプレングリコール、ベンジルアルコール等が挙げられる。
【００３５】
基剤としては、脂肪類（豚脂等）、植物油（オリーブ油、ゴマ油等）、動物油、ラノリン酸、ワセリン、パラフィン、ロウ、樹脂、ベントナイト、グリセリン、グリコール油、高級アルコール類（ステアリルアルコール、セタノール等）等が挙げられる。
【００３６】
分散剤として、アラビアゴム、トラガント、セルロース誘導体（メチルセルロース等）、ステアリン酸ポリエステル類、セスキオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸アルミニウム、アルギン酸ナトリウム、ポリソルベート類、ソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
【００３７】
最後に安定化剤としては、亜硫酸塩類（亜硫酸水素ナトリウム等）、窒素、二酸化炭素等が挙げられる。また、かかる製剤中における本発明による吸着剤の含有量は、その剤型に応じて異なるが、一般に０．０１〜１００重量％の濃度で含有している事が望ましい。
【実施例】
【００３８】
以下、具体例により、本発明を更に詳しく説明する。
【００３９】
（製造例１）硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）の調整例
ヘパリンナトリウム塩１ｇをイオン交換樹脂（Ｈ＋）５０ｍＬに通し、溶出液をトリブチルアミン−エタノール溶液で中和した。過剰なトリブチルアミンをＥｔ２Ｏで抽出除去し、残った水層を凍結乾燥し、ヘパリンのトリブチルアンモニウム塩１．７ｇを調製した。
次に、ＳＯ３・Ｐｙ ２．８ｇの無水ＤＭＦ１００ｍＬ溶液を、上記調製したヘパリンのｎ−トリブチルアンモニウム塩（８００ｍｇ）を溶解したＤＭＦ６０ｍＬに滴下したのち、混合液を４０℃で１時間反応させた。反応液を冷水に入れ、１Ｍ−ＮａＯＨで中和後、限外ろ過により脱塩、精製し、凍結乾燥を行い、硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）を４７０ｍｇ得た。
【００４０】
（製造例２）Ｎ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）の調整例
ヘパリン４００ｍｇと硫酸ヒドラジン６０ｍｇをヒドラジン１水和物６ｍＬに溶解し、９０℃で２４時間反応させた。反応液をＥｔＯＨに滴下し、生じた沈殿をろ取した。得られた白色固体を水に溶解し、０．５Ｍ−ＨＩＯ３水溶液で処理し、生じたヨウ素をＥｔ２Ｏで抽出して取り除いた。水層を１Ｍ−ＮａＯＨで中和後、限外ろ過により脱塩、精製し、凍結乾燥を行い、２００ｍｇ得た。
次に、脱ＮＡｃ体４０ｍｇ、炭酸ナトリウム４０ｍｇ、ＳＯ３・ＮＭｅ３４０ｍｇをＨ２Ｏ ８ｍＬに溶解し、５５℃で２４ｈ反応させた。限外ろ過により脱塩、精製し、凍結乾燥を行い、Ｎ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を２５ｍｇ得た。
【００４１】
（実施例１）ＡＴIIIの結合活性
ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．４ ２４０μＬに溶解し、正常ヒト血漿３０μＬとＡＴIII液（１単位／ｍＬ）３０μＬを添加し、３７℃で３分間加温する。ファクターＸａ液（７．１ｎｋａｔ Ｓ−２２２２／ｍＬ）７５μＬを添加し、３７℃で３０秒間加温する。基質液（Ｓ−２２２２、積水メディカル製）１５０μＬを添加し、３７℃で３分間加温する。５０％酢酸液２２５μＬで反応を停止し、４０５ｎｍで吸光度を測定する。ＡＴIIIの結合活性が既知のヘパリンと吸光度を比較して結合活性を算出する。
【００４２】
（実施例２）
実施例１において、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）の替わりに、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を用いた他は、実施例１と同様にして、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）におけるＡＴIIIの結合活性を算出した。
【００４３】
（実施例３）Ｅ２吸着能（Ｅ２吸着阻害活性）
ヘパリン固定化プレート（ＢＤ社製）にヘパリン２５μｇ／ｍＬ、１００μＬをプレートのウエルに分注する。４℃で一晩放置し、０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。１％ＢＳＡ−ＰＢＳ ２００μＬをウエルに分注し、室温で１時間放置する。０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。
次に、適宜希釈したヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）と５μｇ／ｍＬ ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）（Ａｂｃａｍ製）液を等量混合し、室温で１時間放置したものをウエルに１００μＬ分注し、室温で１時間攪拌する。０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。ペルオキシダーゼ標識化抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体溶液（Ｒｏｃｈｅ製）をウエルに１００μＬ分注し、室温で１時間攪拌する。０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。ＴＭＢ基質液（ＰＩＥＲＣＥ社）をウエルに１００μＬ分注し、室温で１０分間攪拌する。０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸をウエルに１００μＬ添加して、４５０ｎｍで吸光度を測定する。
【００４４】
ヘパリン誘導体溶液の代わりにＰＢＳとＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）溶液を混合したものを同様に測定する。下記の式からヘパリン誘導体がＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）の吸着を阻害した割合を算出する。さらに、５０％阻害した濃度からＥ２吸着阻害活性を算出する。この値は小さいほどヘパリン誘導体のＥ２結合能が高い。
Ｅ２吸着阻害活性（％）＝１００−（ヘパリン誘導体液＋ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）液）の吸光度／ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）液の吸光度
【００４５】
（実施例４）
実施例３において、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）の替わりに、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を用いた他は、実施例３と同様にして、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）におけるＥ２吸着阻害活性を測定した。
【００４６】
（実施例５）ＡｐｏＢ吸着能（ＡｐｏＢによるＥ２吸着阻害活性）
ヘパリン固定化プレート（ＢＤ社製）にヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）２５μｇ／ｍＬ、１００μＬをプレートのウエルに分注する。４℃で一晩放置し、０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。１％ＢＳＡ−ＰＢＳ ２００μＬをウエルに分注し、室温で１時間放置する。０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。次に、５μｇ／ｍＬ ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）（Ａｂｃａｍ製）液とＡｐｏＢ溶液（５μｇ／ｍＬ、または５０μｇ／ｍＬ）を等量混合したものをウエルに１００μＬ分注し、室温で１時間攪拌する。０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。ペルオキシダーゼ標識化抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体溶液（Ｒｏｃｈｅ製）をウエルに１００μＬ分注し、室温で１時間攪拌する。
【００４７】
０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。ＴＭＢ基質液（ＰＩＥＲＣＥ社）をウエルに１００μＬ分注し、室温で１０分間攪拌する。０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸をウエルに１００μＬ添加して、４５０ｎｍで吸光度を測定する。ＡｐｏＢ溶液の代わりにＰＢＳとＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）溶液を混合したものを同様に測定する。下記の式からＡｐｏＢがＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）の吸着を阻害した割合を算出する。この値は小さいほどヘパリン誘導体とＡｐｏＢの結合が低い。
ＡｐｏＢによるＥ２吸着阻害活性（％）＝１００−（ＡｐｏＢ液＋ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）液）の吸光度／ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）液の吸光度
【００４８】
（実施例６）
実施例５において、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）の替わりに、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を用いた他は、実施例５と同様にして、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）におけるＡｐｏＢによるＥ２吸着阻害活性を測定した。
【００４９】
（比較例１）〜（比較例１５）
下記表１に示すヘパリン誘導体について、上記実施例１〜６に準じて、比較試験を行った。
結果を、表１に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
本実施例及び比較例に記載のヘパリン誘導体は以下の通りである。
・ヘパリン誘導体（Ａ）：水酸基残基を硫酸化（Ｎｅｏｐａｒｉｎ社製）
・ヘパリン誘導体（Ｂ）：アセチル化アミノ基を硫酸化アミノ基に変換（Ｎｅｏｐａｒｉｎ社製）
・ヘパリン：ブタ腸粘膜由来（ＬＤＯ社製）
・２−Ｏ−Ｄｅｓｕｌｆａｔｅｄ ヘパリン：脱２−Ｏ−硫酸基（Ｎｅｏｐａｒｉｎ社製）
・６−Ｏ−Ｄｅｓｕｌｆａｔｅｄ ヘパリン：脱６−Ｏ−硫酸基（Ｎｅｏｐａｒｉｎ社製）
・Ｄｅ−Ｎ−ｓｕｌｆａｔｅｄ ヘパリン：硫酸化アミノ基を脱硫酸（Ｎｅｏｐａｒｉｎ社製）
・アセチル化ヘパリン：ヘパリンの遊離アミノ基を、無水酢酸／酢酸ナトリウムでアセチル化
【００５２】
本結果より、本発明のヘパリン誘導体（Ａ）及び（Ｂ）は、比較例の何れのヘパリン又はヘパリン誘導体より、Ｅ２に対する高い吸着効果を有し、また効率的にＥ２を吸着することが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の肝炎ウイルス吸着剤は、肝炎ウイルスを効率的に吸着する機能を有する肝炎ウイルス吸着する機能を有し肝炎ウイルス治療剤への利用が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝炎ウイルスを選択的に吸着することができる肝炎ウイルス吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の慢性的感染が原因であり、薬剤による治療法としてペグインターフェロン、リバビリンの併用療法が一般的である。ジェノタイプ１ｂかつ血液中のウイルス量の多い患者では、治療成績は５０％程度であり、肝硬変、肝がんへの移行割合が高いことからより有効な治療法、薬剤の開発が望まれている（非特許文献１）。一般的に薬剤による治療では血中のウイルス量が低い場合、治療成績が高いことが知られている。血中のＨＣＶウイルスを多孔性のフィルターで除去し、薬剤との併用療法を行うと、治療成績が向上するとの報告がある（非特許文献２）。即ち、体内のウイルス量を下げることで、治療成績が向上したものと推定される。
【０００３】
また、一旦血球と血漿を分離した後、血漿成分からウイルスを除去することから、回路構成は複雑で、より簡便に血中からウイルスを除去する方法がさらに望ましいと考えられる。そこで、ＨＣＶに結合するリガンドを用いる事でより簡便にＨＣＶを除去する可能性があり、このＨＣＶの吸着する物質の一つにヘパリンが挙げられる（非特許文献３）。しかし、ヘパリンは、血中のアンチトロンビンIII（ＡＴIII）やＬＤＬの構成蛋白質であるアポリポ蛋白質Ｂ（ＡｐｏＢ）と結合することが知られており、ヘパリンを用いて血中からＨＣＶを吸着除去する際、ＡＴIIIやＡｐｏＢも合わせて吸着するため、ＨＣＶの吸着効率は低下する。
【０００４】
また、ＡＴIIIやＡｐｏＢは、ヘパリンの硫酸基と相互作用することで結合することから、硫酸化度を変更することで、選択性の向上が期待される。
【０００５】
今までに、ヘパリンのＮ−硫酸やＯ−硫酸がＡＴIIIの結合には必須であると報告されているが、残存する水酸基やアミノ基の硫酸化によるＡＴIIIとの結合の影響については報告がない（非特許文献４）。ＬＤＬとの結合には、ヘパリンの硫酸化度が関与し、脱Ｏ−硫酸でＬＤＬとの結合能が低下し、加Ｏ−硫酸でＬＤＬとの結合能が上昇するが、残存するアミノ基の硫酸化によるＬＤＬとの結合の影響については報告がない（非特許文献５）。
【０００６】
ヘパリンの硫酸化度とＨＣＶ、あるいはその外殻蛋白質であるＥ１とＥ２の結合において、脱２−Ｏ−硫酸基や脱６−Ｏ−硫酸基より、脱Ｎ−硫酸基で結合能が低下することから、ＨＣＶとの結合にはＮ−硫酸基の重要性が報告されているが、誘導化されていないヘパリンとの比較や、ＡＴIIIやＬＤＬの吸着に関しての記載はない（非特許文献６）。
【０００７】
特許文献１には、血液、血漿または血清からエンベロープ保有ウイルスを除去するための、少なくとも１種のポリアニオン、１種の沈殿物用のフィルターおよび１種のポリアニオン結合性吸着物質を含む組成物の使用が開示されており、ポリアニオンとして、ヘパリンまたはヘパリン誘導体の使用が記載されている。
【０００８】
また、特許文献２には、生物医学的又は製薬生成物中の発熱原消滅又はウイルス不活性化方法において、該方法が、該生成物を固相に吸着させ、該固相に吸着した該生成物をウイルス不活性化又は発熱原消滅剤と接触させ、固相をウイルス不活性化又は発熱原消滅剤から分離し、固相から不純物及び残留不活性化又は発熱原消滅剤を除去し、且つ固相から生成物を回収する諸工程を有する方法が記載されており、該固相がリガンドを取り付けたアフィニティー樹脂であり、該リガンドがヘパリンであることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−３３４０３７
【特許文献２】特開昭６１−２７５２１０
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ウイルス性肝炎−基礎・臨床研究の進歩−日本臨床６２巻増刊号７（２００４）
【非特許文献２】Ｋ．Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．，３７，７０１（２００７）
【非特許文献３】Ａ．Ｚａｈｎ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｌａｉｎ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８６，６７７（２００５）
【非特許文献４】Ｕ．Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１２３６８（１９８４）
【非特許文献５】Ｍ．Ｇｉｇｌｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１，５９９６（１９９２）
【非特許文献６】Ｈ．Ｂａｒｔｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８０，１０５７９（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、水溶液、血液又は血漿中に存在する肝炎ウイルスを吸着する肝炎ウイルス吸着剤であって、ウイルス以外の他の成分を吸着させることが少なく、肝炎ウイルスを効率的に吸着する機能を有する肝炎ウイルス吸着剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
即ち、本発明は、上記課題を解決する肝炎ウイルス吸着剤であって、
ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）又はヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を含有する肝炎ウイルス吸着剤を用いることに特徴を有する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の肝炎ウイルス吸着剤によれば、アンチトロンビンIII（ＡＴIII）やＬＤＬの構成蛋白質であるアポリポ蛋白質Ｂ（ＡｐｏＢ）等の血液成分を吸着させること少なく、肝炎ウイルスの吸着能の高い肝炎ウイルス吸着剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
即ち、本発明は、
１．ヘパリン誘導体を含有する肝炎ウイルス吸着剤であって、該ヘパリン誘導体が、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）、又は
ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）であることを特徴とする肝炎ウイルス吸着剤、
２．肝炎ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである１．に記載の肝炎ウイルス吸着剤、
３．１．又は２．に記載の肝炎ウイルス吸着剤を用いた肝炎ウイルスの除去方法、
に関する。
【００１５】
本発明で使用されるヘパリンは、小腸、筋肉、肺、脾や肥満細胞など体内で幅広く存在し、化学的にはグリコサミノグリカンであるヘパラン硫酸の一種であり、β−Ｄ−グルクロン酸、或いはα−Ｌ−イズロン酸とＤ−グルコサミンが１，４−結合により重合した高分子であって、ヘパラン硫酸と比べて硫酸化の度合いが特に高いという特徴を有する。
本発明において用いられるヘパリンは、これらの通常公知のヘパリンでよい。
【００１６】
本発明に用いられるヘパリン誘導体は、上記ヘパリンを、該ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）又は該ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）であることに特徴を有する。硫酸エステル化は通常公知の方法で行うことができる。
【００１７】
ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）を合成する場合には、例えば、ヘパリンのアルカリ塩類をイオン交換樹脂（Ｈ＋）等に通じ、アミン類と処理することによりヘパリンアミン塩を調整する。その後に、硫酸化剤で処理して目的とするヘパリン誘導体（Ａ）とすることができる。硫酸化剤としては、公知慣用のＳＯ３・ピリジン等が好ましい。
【００１８】
また、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を合成する場合には、例えば、ヘパリンＮ−アセチル基をヒドラジン等で脱アセチル化した後に、硫酸化剤で処理して目的とするヘパリン誘導体（Ｂ）とすることができる。硫酸化剤としては、公知慣用のＳＯ３・ＮＭｅ３等が好ましい。
【００１９】
本発明のヘパリン誘導体（Ａ）及び（Ｂ）は、肝炎ウイルスを効率よく吸着することができるが、血液成分であるアンチトロンビンIII（ＡＴIII）やＬＤＬの構成蛋白質であるアポリポ蛋白質Ｂ（ＡｐｏＢ）等の血液成分を吸着させることが少なく、肝炎ウイルスの吸着能の高い肝炎ウイルス吸着剤を提供することができ、本発明の肝炎ウイルス吸着剤は、肝炎患者に対して負荷が小さい特徴を有する。
【００２０】
本発明のヘパリン誘導体のＨＣＶ吸着能を評価するため、ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）に対する吸着能を評価した。Ｅ２蛋白質は脂質膜と共に、ウイルス粒子の外被（エンベロープ）を構成し、ウイルスのエントリーに重要な役割を果たす蛋白質であって、Ｅ２蛋白質への吸着能を評価することにより、ＨＣＶへの吸着能の評価が可能となる蛋白質である。
【００２１】
また、本発明の肝炎ウイルス吸着剤の生理学的に許容される塩も本発明の範囲に含まれる。ここでいう生理学的に許容される塩とは、例えば上記に示される化合物のアルカリ付加塩であり、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩等の無毒の塩が挙げられる。
【００２２】
本発明の肝炎ウイルス吸着剤は、経口又は非経口投与（例えば静脈内投与、皮下投与、経皮投与又は直腸内投与等）することが出来、投与に際してはそれぞれの投与法に適した製剤形態に調製することができる。
【００２３】
かかる製剤は、その用途に応じて錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、トローチ剤、舌下錠、坐剤、軟膏剤、注射剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤等の製剤形体に調製することができる。
【００２４】
これらの調製に際しては、例えばこの種の薬剤に通常使用されている無毒の賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、保存剤、酸化防止剤、等張化剤、緩衝剤、コーティング剤、矯味剤、溶解補助剤、基剤、分散剤、安定化剤、着色剤等の添加剤を使用して公知の方法により製剤化することができる。
【００２５】
前記使用し得る無毒性の添加剤の具体例を列挙すると、以下のようである。
まず、賦形剤としては、でんぷん及びその誘導体（デキストリン、カルボキシメチルスターチ等）、セルロース及びその誘導体（メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、糖類（乳糖、白等、ブドウ糖等）、ケイ酸及びケイ酸塩類（天然ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム）、炭酸塩（炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム等）、水酸化アルミニウム・マグネシウム、合成ヒドロタルサイト、ポリオキシエチレン誘導体、モノステアリン酸グリセリン、モノオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
【００２６】
結合剤としては、でんぷん及びその誘導体（アルファー化デンプン、デキストリン等）、セルロース及びその誘導体（エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、糖類（ブドウ糖、白糖等）、エタノール、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
【００２７】
崩壊剤としては、でんぷん及びその誘導体（カルボキシメチルスターチ、ヒドロキシプロピルスターチ等）、セルロース及びその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、炭酸塩（炭酸カルシウム、炭酸水素カルシウム等）、トラガント、ゼラチン、寒天等が挙げられる。
【００２８】
滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸及びその塩類（軽質無水ケイ酸、天然ケイ酸アルミニウム等）、酸化チタン、リン酸水素カルシウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、マクロゴール等が挙げられる。
【００２９】
保存剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、亜硫酸塩類（亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム等）、リン酸塩類（リン酸ナトリウム、ポリリン酸カルシウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等）、アルコール類（クロロブタノール、ベンジルアルコール等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸グリセリン、糖類等が挙げられる。
【００３０】
酸化防止剤としては、亜硫酸塩類（亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等）、ロンガリット、エリソルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸、システイン、チオグリセロール、ブチルヒドロキシアニゾール、ジブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ｄｌ−α−トコフェロール等が挙げられる。
【００３１】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、デキストリン、グリセリン、ブドウ糖等が挙げられる。
緩衝剤としては、炭酸ナトリウム、塩酸、ホウ酸、リン酸塩（リン酸水素ナトリウム等）等が挙げられる。
【００３２】
コーティング剤としては、セルロース誘導体（ヒドロキシプロピルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）、セラック、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジン類（ポリ−２−ビニルピリジン、ポリ−２−ビニル−５−エチルピリジン等）、ポリビニルアセチルジエチルアミノアセテート、ポリビニルアルコールフタレート、メタアクリレート・メタアクリル酸共重合体等が挙げられる。
【００３３】
矯味剤としては、糖類（ブドウ糖、白糖、乳糖等）、サッカリンナトリウム、糖アルコール類等が挙げられる。
【００３４】
溶解補助剤としては、エチレンジアミン、ニコチン酸アミド、サッカリンナトリウム、クエン酸、クエン酸塩類、安息香酸ナトリウム、石鹸類、ポリビニルピロリドン、ポリソルベート類、ソルビタン脂肪酸エステル類、グリセリン、ポリプレングリコール、ベンジルアルコール等が挙げられる。
【００３５】
基剤としては、脂肪類（豚脂等）、植物油（オリーブ油、ゴマ油等）、動物油、ラノリン酸、ワセリン、パラフィン、ロウ、樹脂、ベントナイト、グリセリン、グリコール油、高級アルコール類（ステアリルアルコール、セタノール等）等が挙げられる。
【００３６】
分散剤として、アラビアゴム、トラガント、セルロース誘導体（メチルセルロース等）、ステアリン酸ポリエステル類、セスキオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸アルミニウム、アルギン酸ナトリウム、ポリソルベート類、ソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
【００３７】
最後に安定化剤としては、亜硫酸塩類（亜硫酸水素ナトリウム等）、窒素、二酸化炭素等が挙げられる。また、かかる製剤中における本発明による吸着剤の含有量は、その剤型に応じて異なるが、一般に０．０１〜１００重量％の濃度で含有している事が望ましい。
【実施例】
【００３８】
以下、具体例により、本発明を更に詳しく説明する。
【００３９】
（製造例１）硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）の調整例
ヘパリンナトリウム塩１ｇをイオン交換樹脂（Ｈ＋）５０ｍＬに通し、溶出液をトリブチルアミン−エタノール溶液で中和した。過剰なトリブチルアミンをＥｔ２Ｏで抽出除去し、残った水層を凍結乾燥し、ヘパリンのトリブチルアンモニウム塩１．７ｇを調製した。
次に、ＳＯ３・Ｐｙ ２．８ｇの無水ＤＭＦ１００ｍＬ溶液を、上記調製したヘパリンのｎ−トリブチルアンモニウム塩（８００ｍｇ）を溶解したＤＭＦ６０ｍＬに滴下したのち、混合液を４０℃で１時間反応させた。反応液を冷水に入れ、１Ｍ−ＮａＯＨで中和後、限外ろ過により脱塩、精製し、凍結乾燥を行い、硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）を４７０ｍｇ得た。
【００４０】
（製造例２）Ｎ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）の調整例
ヘパリン４００ｍｇと硫酸ヒドラジン６０ｍｇをヒドラジン１水和物６ｍＬに溶解し、９０℃で２４時間反応させた。反応液をＥｔＯＨに滴下し、生じた沈殿をろ取した。得られた白色固体を水に溶解し、０．５Ｍ−ＨＩＯ３水溶液で処理し、生じたヨウ素をＥｔ２Ｏで抽出して取り除いた。水層を１Ｍ−ＮａＯＨで中和後、限外ろ過により脱塩、精製し、凍結乾燥を行い、２００ｍｇ得た。
次に、脱ＮＡｃ体４０ｍｇ、炭酸ナトリウム４０ｍｇ、ＳＯ３・ＮＭｅ３４０ｍｇをＨ２Ｏ ８ｍＬに溶解し、５５℃で２４ｈ反応させた。限外ろ過により脱塩、精製し、凍結乾燥を行い、Ｎ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を２５ｍｇ得た。
【００４１】
（実施例１）ＡＴIIIの結合活性
ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．４ ２４０μＬに溶解し、正常ヒト血漿３０μＬとＡＴIII液（１単位／ｍＬ）３０μＬを添加し、３７℃で３分間加温する。ファクターＸａ液（７．１ｎｋａｔ Ｓ−２２２２／ｍＬ）７５μＬを添加し、３７℃で３０秒間加温する。基質液（Ｓ−２２２２、積水メディカル製）１５０μＬを添加し、３７℃で３分間加温する。５０％酢酸液２２５μＬで反応を停止し、４０５ｎｍで吸光度を測定する。ＡＴIIIの結合活性が既知のヘパリンと吸光度を比較して結合活性を算出する。
【００４２】
（実施例２）
実施例１において、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）の替わりに、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を用いた他は、実施例１と同様にして、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）におけるＡＴIIIの結合活性を算出した。
【００４３】
（実施例３）Ｅ２吸着能（Ｅ２吸着阻害活性）
ヘパリン固定化プレート（ＢＤ社製）にヘパリン２５μｇ／ｍＬ、１００μＬをプレートのウエルに分注する。４℃で一晩放置し、０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。１％ＢＳＡ−ＰＢＳ ２００μＬをウエルに分注し、室温で１時間放置する。０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。
次に、適宜希釈したヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）と５μｇ／ｍＬ ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）（Ａｂｃａｍ製）液を等量混合し、室温で１時間放置したものをウエルに１００μＬ分注し、室温で１時間攪拌する。０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。ペルオキシダーゼ標識化抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体溶液（Ｒｏｃｈｅ製）をウエルに１００μＬ分注し、室温で１時間攪拌する。０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。ＴＭＢ基質液（ＰＩＥＲＣＥ社）をウエルに１００μＬ分注し、室温で１０分間攪拌する。０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸をウエルに１００μＬ添加して、４５０ｎｍで吸光度を測定する。
【００４４】
ヘパリン誘導体溶液の代わりにＰＢＳとＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）溶液を混合したものを同様に測定する。下記の式からヘパリン誘導体がＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）の吸着を阻害した割合を算出する。さらに、５０％阻害した濃度からＥ２吸着阻害活性を算出する。この値は小さいほどヘパリン誘導体のＥ２結合能が高い。
Ｅ２吸着阻害活性（％）＝１００−（ヘパリン誘導体液＋ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）液）の吸光度／ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）液の吸光度
【００４５】
（実施例４）
実施例３において、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）の替わりに、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を用いた他は、実施例３と同様にして、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）におけるＥ２吸着阻害活性を測定した。
【００４６】
（実施例５）ＡｐｏＢ吸着能（ＡｐｏＢによるＥ２吸着阻害活性）
ヘパリン固定化プレート（ＢＤ社製）にヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）２５μｇ／ｍＬ、１００μＬをプレートのウエルに分注する。４℃で一晩放置し、０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。１％ＢＳＡ−ＰＢＳ ２００μＬをウエルに分注し、室温で１時間放置する。０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。次に、５μｇ／ｍＬ ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）（Ａｂｃａｍ製）液とＡｐｏＢ溶液（５μｇ／ｍＬ、または５０μｇ／ｍＬ）を等量混合したものをウエルに１００μＬ分注し、室温で１時間攪拌する。０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。ペルオキシダーゼ標識化抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体溶液（Ｒｏｃｈｅ製）をウエルに１００μＬ分注し、室温で１時間攪拌する。
【００４７】
０．１％ツイーン２０−ＰＢＳ４００μＬで３回洗浄する。ＴＭＢ基質液（ＰＩＥＲＣＥ社）をウエルに１００μＬ分注し、室温で１０分間攪拌する。０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸をウエルに１００μＬ添加して、４５０ｎｍで吸光度を測定する。ＡｐｏＢ溶液の代わりにＰＢＳとＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）溶液を混合したものを同様に測定する。下記の式からＡｐｏＢがＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）の吸着を阻害した割合を算出する。この値は小さいほどヘパリン誘導体とＡｐｏＢの結合が低い。
ＡｐｏＢによるＥ２吸着阻害活性（％）＝１００−（ＡｐｏＢ液＋ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）液）の吸光度／ＨＣＶ Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）液の吸光度
【００４８】
（実施例６）
実施例５において、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）の替わりに、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）を用いた他は、実施例５と同様にして、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）におけるＡｐｏＢによるＥ２吸着阻害活性を測定した。
【００４９】
（比較例１）〜（比較例１５）
下記表１に示すヘパリン誘導体について、上記実施例１〜６に準じて、比較試験を行った。
結果を、表１に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
本実施例及び比較例に記載のヘパリン誘導体は以下の通りである。
・ヘパリン誘導体（Ａ）：水酸基残基を硫酸化（Ｎｅｏｐａｒｉｎ社製）
・ヘパリン誘導体（Ｂ）：アセチル化アミノ基を硫酸化アミノ基に変換（Ｎｅｏｐａｒｉｎ社製）
・ヘパリン：ブタ腸粘膜由来（ＬＤＯ社製）
・２−Ｏ−Ｄｅｓｕｌｆａｔｅｄ ヘパリン：脱２−Ｏ−硫酸基（Ｎｅｏｐａｒｉｎ社製）
・６−Ｏ−Ｄｅｓｕｌｆａｔｅｄ ヘパリン：脱６−Ｏ−硫酸基（Ｎｅｏｐａｒｉｎ社製）
・Ｄｅ−Ｎ−ｓｕｌｆａｔｅｄ ヘパリン：硫酸化アミノ基を脱硫酸（Ｎｅｏｐａｒｉｎ社製）
・アセチル化ヘパリン：ヘパリンの遊離アミノ基を、無水酢酸／酢酸ナトリウムでアセチル化
【００５２】
本結果より、本発明のヘパリン誘導体（Ａ）及び（Ｂ）は、比較例の何れのヘパリン又はヘパリン誘導体より、Ｅ２に対する高い吸着効果を有し、また効率的にＥ２を吸着することが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の肝炎ウイルス吸着剤は、肝炎ウイルスを効率的に吸着する機能を有する肝炎ウイルス吸着する機能を有し肝炎ウイルス治療剤への利用が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリン誘導体を含有する肝炎ウイルス吸着剤であって、該ヘパリン誘導体が、
ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）、又は
ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）であることを特徴とする肝炎ウイルス吸着剤。
【請求項２】
肝炎ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである請求項１に記載の肝炎ウイルス吸着剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の肝炎ウイルス吸着剤を用いた肝炎ウイルスの除去方法。
【請求項１】
ヘパリン誘導体を含有する肝炎ウイルス吸着剤であって、該ヘパリン誘導体が、
ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ａ）、又は
ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体（Ｂ）であることを特徴とする肝炎ウイルス吸着剤。
【請求項２】
肝炎ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである請求項１に記載の肝炎ウイルス吸着剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の肝炎ウイルス吸着剤を用いた肝炎ウイルスの除去方法。
【公開番号】特開２０１１−１９５４６４（Ｐ２０１１−１９５４６４Ａ）
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６０６８２（Ｐ２０１０−６０６８２）
【出願日】平成２２年３月１７日（２０１０．３．１７）
【出願人】（０００００２８８６）ＤＩＣ株式会社 (2,597)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１７日（２０１０．３．１７）
【出願人】（０００００２８８６）ＤＩＣ株式会社 (2,597)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]