肺癌特異的メチル化マーカー遺伝子を利用した肺癌検出方法
本発明は肺癌特異的なバイオマーカーを利用した肺癌の検出方法に関し、より具体的には、肺癌形質転換細胞で５’ＵＴＲまたはエクソン１領域が特異的にメチル化されたＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のメチル化を確認することができる肺癌診断用バイオマーカー及び前記バイオマーカーを利用した肺癌の検出方法に関する。本発明の診断用キットを利用すると、通常の方法より正確でかつ早く肺癌の早期診断が可能であり、肺癌及びその進行段階の予後予測及びモニタリングに応用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肺癌特異的なバイオマーカーを利用した肺癌の検出方法に関し、より具体的には、肺癌形質転換細胞において５’ＵＴＲまたはエクソン１領域が特異的にメチル化されるＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のメチル化を確認することができる肺癌診断用バイオマーカー及び前記バイオマーカーを利用した肺癌及びその進行段階の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、肺癌は非常に稀な腫瘍であったが、２０世紀に入って喫煙が一般的になってから、急激に増加し始めて、欧州においては男女共に多く発生している。韓国では男性に多発する悪性腫瘍であり、女性でも驚く程その頻度が増加している傾向にある。このような肺癌の発生頻度の増加は喫煙、大気汚染及び産業公害増加などに起因する。
【０００３】
医学が発達した今日に至っても癌、特に大多数を占める固形癌（solid tumor：血液癌を除いた癌）の５年間生存する割合は５０％未満で、全体癌患者の約３分の２は進行段階で発見され、その多くは診断後２年以内に死亡する。このように低い癌治療効果は治療法の問題だけでなく、実際癌を早期に診断できる方法と進行中の癌を正確に診断し、治療後の追跡調査が容易でないためである。
【０００４】
最近、癌の診断に遺伝子検査が積極的に試みられており、代表的な方法は血液から白血病の遺伝子指標であるＡＢＬ：ＢＣＲ（Abelson Murine Leukemia Viral Oncogene Homolog:Breakpoint cluster region）融合遺伝子の有無をＰＣＲで探す方法である。また、癌細胞が発現する遺伝子の存在をＲＴ−ＰＣＲ及びブロッティングで把握することによって、血球細胞中に共に存在する癌細胞を診断する方法が試みられている。しかし、前記方法は前立腺癌と黒色種などの一部の癌にだけ適用可能で、偽陽性率（false positive rate）が高く、検査及び判読方法の標準化が難しく、その有用性にも限界があった（Kopreski、M.S. et al., Clin.Cancer Res., 5:1961, 1999, Miyashiro, I. et al., Clin chem., 47:505, 2001）。また、最近血清（serum）や血漿（plasma）内ＤＮＡを使用する遺伝子検査が活発に試みられている。前記癌から遊離されたＤＮＡを持って癌遺伝子（oncogene）と腫瘍抑制遺伝子の突然変異、消失、機能喪失などの癌特異的な遺伝子異常を分析すると癌を診断することができる。
【０００５】
一方、肺癌患者で喀痰や気管支肺胞洗浄液（bronchoalveolar lavage fluid）内に存在する癌細胞及び癌遺伝子の存在を遺伝子検査や抗体検査で探す方法が試みられている（Palmisano, W.A. et al., Cancer Res., 60:5954, 2000, Sueoka, E. et al., Cancer Res., 59:1404, 1999）。しかし、多くの遺伝子の異常を伴って、多様な変移を示す癌を正確に診断するためには多数遺伝子を同時に、そして正確に自動分析できる方法が求められるが、このような方法はまだ確立されていない。
そこで、最近ではＤＮＡメチル化測定を介して、癌を診断する方法が提示されているが、ＤＮＡメチル化は主に特定遺伝子のプロモーター部位のＣｐＧアイランド（CpG island）のシトシン（Cytosine）で起きて、これによって転写因子の結合が妨害を受けて特定遺伝子の発現が遮断されるようなもので、腫瘍抑制遺伝子のプロモーターＣｐＧアイランドのメチル化を検索するのが癌研究に多いに役立ち、これをメチル化特異的ＰＣＲ（methylation specific PCR、以下、「ＭＳＰ」という）や自動塩基分析などの方法で調べて、癌診断とスクリーニングなどに利用しようとする試みが活発に行われている。
【０００６】
プロモーターＣｐＧアイランドのメチル化が発癌を直接誘発するのか、または発癌に２次的な変化を起こすのかに対する論議はあるが、多種の癌において腫瘍抑制遺伝子（tumor suppressor gene）、ＤＮＡ修復遺伝子（DNA repair gene）、細胞周期調節遺伝子などが過剰メチル化（hypermethylation）されていて、これらの遺伝子の発現が遮断されていることが確認され、特に癌発生の初期段階において特定遺伝子のプロモーター部位に過剰メチル化が起きることが知られている。
【０００７】
従って、腫瘍関連遺伝子のプロモーターメチル化が癌の重要な指標であり、これは癌の診断及び早期診断、発癌危険の予測、癌の予後予測、治療後追跡調査、抗癌療法に対する反応予測など多方面に亘って利用することができる。実際、血液や喀痰、唾、大便、尿などから腫瘍関連遺伝子のプロモーターメチル化を調べて、各種癌診療に使おうとする試みが最近活発になっている（Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999, Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000, Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219, 2000）。
【０００８】
現在、肺癌の診断は多様な検査を通してのみ可能で、肺癌と疑われる症状が現れる場合、胸部撮影検査、顕微鏡検査、ビデオ鏡検査、生検、転移の有無確認検査等を介して、肺癌であるか否かを調べて、その進行程度などを判断する。しかし、前記検出方法は高価な装備、高費用、検体採取に困難があるだけでなく、肺癌の初期診断には不向きである。従って、肺癌の場合、腫瘍の大きさが３ｃｍ未満の第１病期の５年生存の可能性は約７０％に達することから、患者の生存期間を延ばすためには病変範囲が小さい時、早期診断するのが最も良い方法である。そこで、既存の各種肺癌検出方法より効率的な検出方法、即ち、早期に診断が可能で、大容量で検体を処理できて、感度及び特異度が高い新しい診断に使う肺癌特異的バイオマーカーの開発が切に求められているのが現状である。
【０００９】
従って、本発明者等は大腸癌特異的発現減少遺伝子ＬＡＭＡ２（laminin Merosin alpha 2）、ＦＡＢＰ４（fatty acid binding protein 4）、ＧＳＴＡ２（glutathione S-transferase A2）、ＳＴＭＮ２（stathmin-like 2）、ＮＲ４Ａ２（nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2）、ＤＳＣＲ１Ｌ１（down syndrome critical region gene 1-like 1）、Ａ２Ｍ（alpha-2-macroglobulin）及びＳＥＰＰ１（selenoprotein P, plasma, 1）のメチル化されたプロモーターを利用した癌診断用マイクロアレイ及び癌診断キットに対し出願して、登録を受けた（韓国登録特許第１０−０６１７６４９号）。
【００１０】
そこで、本発明者等は肺癌を効果的に診断できる診断用キットを開発しようと鋭意努力した結果、肺癌細胞において特異的にメチル化されたＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿０３２０９４）遺伝子のメチル化された５’ＵＴＲまたはメチル化されたエクソン１領域を肺癌特異的バイオマーカーとして利用してメチル化程度を測定することによって、肺癌及びその進行段階を診断できることを確認して本発明の完成に至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、肺癌において特異的にメチル化された遺伝子のメチル化部位を含有する肺癌診断用バイオマーカーを提供することである。
本発明の他の目的は、肺癌診断用バイオマーカーを利用した肺癌及びその進行段階の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は肺癌特異的発現減少遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２、protocadherin gamma subfamily A, 12）のメチル化された５’ＵＴＲまたはメチル化されたエクソン１領域を含む肺癌診断用バイオマーカーを提供する。
【００１３】
本発明はさらに、一つ以上のメチル化されたＣｐＧアイランドを含有して、配列番号２〜４のうちいずれか一つの塩基配列として表される肺癌診断用バイオマーカーを提供する。
【００１４】
本発明はさらに、（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する段階、及び（ｂ）前記分離したＤＮＡからＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）遺伝子の５’ＵＴＲまたはエクソン１領域のメチル化を検出する段階を含む肺癌またはその進行段階の検出方法を提供する。
本発明の他の特徴及び具現例は、下記の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】肺癌診断用メチル化バイオマーカーＰＣＤＨＧＡ１２を探し出す過程を示した模式図である。
【図２】正常細胞及び肺癌細胞株においてＰＣＤＨＧＡ１２のメチル化程度を確認した遺伝子部位（Ａ）とＵＴＲ及びエクソン部位のメチル化程度（Ｂ）をバイサルファイトシーケンシング法で測定した図である。
【図３】正常細胞及び４種の肺癌細胞においてＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のメチル化程度をパイロシーケンシング法で測定した図である。
【図４】５個の正常組織、４個の対を成す肺癌手術組織におけるＰＣＤＨＧＡ１２のメチル化程度をパイロシーケンシング法で測定した図である。
【図５】正常な人（５１人）と肺癌患者（８１人）の喀痰細胞ゲノムＤＮＡを利用してメチル化を測定した図である。
【図６】正常及び肺癌細胞株と正常な人と肺癌患者の喀痰ＤＮＡを利用してＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子プロモーターのメチル化程度を測定した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は一観点において、肺癌特異的発現減少遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）のメチル化された５’ＵＴＲまたはメチル化されたエクソン１領域を含む肺癌診断用バイオマーカーに関する。
【００１７】
本発明において、前記メチル化された５’ＵＴＲ（untranslated region）またはメチル化されたエクソン１領域は、少なくとも一つのメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを含有することを特徴とし、前記５’ＵＴＲ及びエクソン１領域は配列番号１で表されるのを特徴とする。
【００１８】
本発明によるメチル化マーカー遺伝子をスクリーニングする方法は、一様態において（１）形質転換された細胞株及び非形質転換された細胞株を対象に形質転換された細胞株にだけＤＮＡ過剰メチル化された遺伝子を選択する段階、（２）形質転換された肺癌組織細胞及び隣接部位の非形質転換組織細胞の遺伝子発現プロファイルを比較して、非形質転換組織細胞にさらに多く発現する遺伝子のプロファイルを分類する段階、（３）形質転換された肺癌細胞株をメチル化阻害剤で処理し、処理しない形質転換された肺癌細胞株と比較して、メチル化阻害剤を処理した形質転換された肺癌細胞株にさらに多く発現する遺伝子のプロファイルを分類する段階、及び（４）、（１）、（２）及び（３）段階において得た遺伝子プロファイルを比較して、前記３プロファイル全てに存在する遺伝子を非形質転換状態から形質転換された肺癌細胞形態に転換中である細胞のゲノムにおいてメチル化によって調節されるマーカー遺伝子と見なす段階を含む方法が挙げられる。
【００１９】
本発明において、肺癌細胞株のゲノムＤＮＡから前記スクリーニング法でスクリーニングされた肺癌特異的発現減少遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子は５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のＣｐＧアイランドがメチル化されていた。
【００２０】
他の観点において、本発明は一つ以上のメチル化されたＣｐＧアイランドを含有して、配列番号２〜３のうちいずれか一つの塩基配列で表される肺癌診断用バイオマーカーに関する。
【００２１】
本発明において、前記ＤＮＡ断片は肺癌特異的発現減少遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）由来であることを特徴とする。
【００２２】
本発明において、肺癌特異的発現減少遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域は肺癌細胞株において具体的にＲ１（配列番号２）、Ｒ２（配列番号３）及びＲ３（配列番号４）領域がメチル化されていた。
【００２３】
本発明の一様態において、肺癌患者の肺癌組織のＲ１、Ｒ２及びＲ３領域において非常に高い程度のメチル化レベルを示し、互いに対になる肺癌組織と隣接部位の正常組織におけるメチル化程度はＲ１の場合４０個の臨床検体中３４個と高く８５％を占め、R３の場合は３６個と９０％であった。ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１、Ｒ２及びＲ３領域の過剰メチル化を測定することによって肺癌を効率的に診断できるとことを示す。
【００２４】
さらに他の観点において、本発明は（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する段階、及び（ｂ）前記分離したＤＮＡからＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）遺伝子の５’ＵＴＲまたはエクソン１領域のメチル化を検出する段階を含む肺癌、またはその進行段階の検出方法に関する。
本発明において、メチル化の検出は配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される配列を有するＤＮＡ領域において行われるのを特徴とする。
【００２５】
本発明において、前記メチル化測定方法は、ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ（real time methylation specific PCR）、メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＤＮＡチップ基盤検出方法、パイロシーケンシング及びバイサルファイトシーケンシングからなる群から選択されるのを特徴とし、前記臨床サンプルは癌の疑いのある患者または診断対象由来の組織、細胞、血液または尿であることを特徴とする。
【００２６】
本発明の実施の形態で使われた、メチル化バイオマーカー遺伝子の選別方法により肺癌だけでなく、肺癌に進行中の多種異形症段階において多様にメチル化される遺伝子を探し出せ、選別された遺伝子は肺癌スクリーニング、危険性評価、予測、病名確定（disease identification）、疾病のステージ診断及び治療ターゲットの選定にも使用可能である。
【００２７】
肺癌及び多くの段階の異常においてメチル化された遺伝子を確認するのは、正確でかつ効果的に肺癌を早期診断することが可能であり、多重遺伝子を使用したメチル化プロファイル確立及び治療のための新しいターゲットを確認できる。さらに、本発明によるメチル化データは他の非メチル化関連バイオマーカー検出方法と連係するとより一層正確な肺癌診断システムが確立できる。
【００２８】
本発明の方法により、検体から得られた一つ以上の核酸バイオマーカーのメチル化段階を決めることを含むあらゆる段階（stage）またはフェーズ（phase）の肺癌進行を診断することができる。肺癌の各段階の検体から分離した核酸のメチル化段階を肺組織の細胞増殖性異常を持たない検体から得られた一つ以上の核酸のメチル化段階と比較して、検体の肺癌の特定段階を確認できる。前記メチル化段階は過剰メチル化であってもよい。
【００２９】
本発明の一例として、核酸は遺伝子の調節部位においてメチル化できる。他の例において、メチル化は遺伝子の調節部位の外側から始まって、内部に進行されるため、調節部位の郊外周辺においてメチル化を検出することで細胞形質転換に関わる遺伝子を早期診断することができる。
【００３０】
他の例として、本発明においてはＰＣＤＨＧＡ１２（ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）遺伝子５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のメチル化状態をキットを利用して検出することによって、検体に存在する肺組織の細胞成長性異常（異形症）を診断することができる。
【００３１】
本発明の診断用キットを利用すると、検体の肺組織の細胞成長性異常（異形症進行度）を決められる。前記方法は検体から分離した一つ以上の核酸のメチル化状態を決めることを含み、前記一つ以上の核酸のメチル化段階は肺組織の細胞成長性異常傾向（異形症）がない検体から分離した核酸のメチル化段階と比較することを特徴とする。
【００３２】
本発明の他の実施の形態においては、前記メチル化遺伝子マーカーを利用して肺癌を形成する可能性がある細胞の早期診断を可能にする。癌細胞においてメチル化されると確認された遺伝子が臨床的にまたは形態学的に正常と見られる細胞においてメチル化されると、前記正常と見られる細胞は癌化が進行しているものである。従って、正常と見られる細胞における肺癌特異的遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域がメチル化されるのを確認することによって肺癌を早期診断することができる。
【００３３】
本発明のメチル化マーカー遺伝子を利用すると、検体から肺組織の細胞成長性異常（異形症進行）を検出することができる。前記方法は検体から分離した一つ以上の核酸を含む試料を一つ以上のメチル化状態を決定できる製剤と接触させることを含む。前記方法は一つ以上の核酸において一つ以上の領域のメチル化状態を確認することを含み、前記核酸のメチル化状態は肺組織の細胞成長性異常（異形症進行）を持たない検体の核酸における同じ領域のメチル化状態と差があることを特徴とする。
【００３４】
本発明のまた他の実施の形態においては正常表現型を現わすサンプルを利用して、前記キットを利用して、マーカー遺伝子５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のメチル化を調べることによって、肺癌に進行される可能性を診断することができる。前記サンプルは固体または液体組織、細胞、尿、血清または血漿を使用できる。
【００３５】
本発明において、前記遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のメチル化の有無を検出する方法は次の段階を含む：（ａ）臨床サンプルからサンプルＤＮＡを分離する段階、（ｂ）前記分離したＤＮＡを亜硫酸水素（bisulfite）で処理する段階、（ｃ）ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のＣｐＧを含む断片を増幅できるプライマーを使用して増幅する段階、及び（ｄ）前記（ｃ）段階において増幅された結果を利用してパイロシーケンシングを行ってメチル化するか否かを決める段階。
【００３６】
本発明の一様態において、前記検出方法はキットを用いて行うことができる。本発明の検出方法に使用されるキットはサンプルを入れる区切られたキャリア手段、非メチル化シトシンを敏感に切断する製剤を含有する１番目の容器、ＣｐＧ含有核酸を増幅するためのプライマーを含有する２番目の容器、及び切断されたまたは切断されない核酸の存在を検出する手段が含まれている３番目の容器を含む一つ以上の容器を含む。本発明において使用されるプライマーは配列番号５〜２１に記載された配列、機能的組合せ及びその断片を含む。機能的組合せまたは断片はゲノム上においてメチル化が起きたか否かを検出するプライマーとして使用される。前記キャリア手段は瓶、チューブのような一つ以上の容器を含有するのに適しており、各容器は本発明の方法に使用される独立的構成要素等を含有する。本発明の明細書において、当該分野において通常の知識を有する者は容器中の必要な製剤を分配できる。例えば、メチル化感受性制限酵素を含有する容器を一つの容器で構成することができる。一つ以上の容器は重要核酸ローカスと相同性を有するプライマーを含むことができる。また、一つ以上の容器はメチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーを含むことができる。
【００３７】
本発明の他の様態において、前記キットを利用して、肺癌を検出する方法は、（１）臨床サンプルからゲノムＤＮＡを分離する段階、（２）前記分離したゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で処理する段階、（３）前記メチル化感受性制限酵素で処理されたゲノムＤＮＡを本発明の肺癌診断用バイオマーカーを増幅させられるプライマーを使用して増幅させる段階、及び（４）前記増幅された産物から肺癌診断用バイオマーカーの存在の有無を判別する段階を経て、バイオマーカー断片が存在する試料を肺癌または肺癌進行段階の試料として診断できて、前記キットは含まれたプライマーを利用したＰＣＲ増幅産物の有無を確認するために肺癌診断用バイオマーカーと厳しい条件でハイブリダイゼーションできる断片をさらに含有してもよい。
【００３８】
また、前記肺癌診断用バイオマーカーの存在の有無を判別する方法としては、バイサルフェート・シークエンス（bisulfate sequencing）、パイロシーケンシング（pyrosequencing）、メチル化特異的ＰＣＲ、メチルライト法（Methylight）、メチル化ＤＮＡ結合（methylated DNA binding）蛋白質を利用したＰＣＲ及びＤＮＡチップなどを使用できる。
【００３９】
本発明において使用された「細胞形質転換」は正常から非正常に、非腫瘍性から腫瘍性に、未分化から分化に、幹細胞から非幹細胞のように細胞の特徴がある形態から他の形態に変わることを意味する。さらに、前記形質転換は細胞の形態、表現型、生化学的性質などによって認識される。
【００４０】
本発明において癌の「早期確認」は、転移する前に癌の可能性を発見することであり、望ましくは検体組織または細胞において形態学的変化が観察される前に発見することである。さらに、細胞形質転換の「早期確認」は細胞が形質転換される形態になる前に初期段階において形質転換が起きる可能性高いことをいう。
【００４１】
本発明において「ハイポメチル化」はＣｐＧアイランドのメチル化を意味する。本発明において、「サンプル」または「検体サンプル」、「臨床検体」、「臨床サンプル」は行われる分析の種類によって、個々人、体液、細胞株、組織培養などから得られる全ての生物学的サンプルを含む幅広い範囲のサンプルを意味する。ほ乳動物から体液及び生検を獲得する方法は通常広く知られている。望ましいソースは肺の生検（biopsy）である。
【００４２】
メチル化バイオマーカーのスクリーニング
本発明においては細胞または組織が形質転換されたり細胞の形態が異なる形態に変化する時にメチル化されたバイオマーカー遺伝子をスクリーニングした。ここで、「形質転換」細胞は正常形態が非正常形態に、非腫瘍性が腫瘍性に、未分化形態が分化形態に変わるなどの細胞または組織の形態が異なる形態に変化することを意味する。
【００４３】
従って、本発明においては肺癌細胞への形質転換においてメチル化調節マーカー遺伝子を体系的な方法で確認した。前記方法の一様態で、（１）形質転換された細胞株及び非形質転換された細胞株を対象にメチル化特異的結合蛋白質のＭＢＤ２ｂｔを利用してメチル化されたＤＮＡだけを選択分離する段階、（２）各々のＤＮＡを増幅して蛍光染料で標識する段階、（３）蛍光染料で標識されたＤＮＡをメチル化を測定できるマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせる段階、（４）ハイブリダイゼーション結果から形質転換細胞から過剰メチル化された遺伝子を選別する段階、（５）形質転換された肺癌組織細胞及び隣接部位の非形質転換組織細胞の遺伝子発現プロファイルを比較して、非形質転換組織細胞にさらに多く発現する遺伝子のプロファイルを分類する段階、（６）形質転換された肺癌細胞株をメチル化阻害剤で処理し、処理しない形質転換された肺癌細胞株と比較して、メチル化阻害剤処理した形質転換された肺癌細胞株においてさらに多く発現する遺伝子のプロファイルを分類する段階、及び（７）、（５）段階及び（６）段階で得た遺伝子プロファイルを比較して、前記３プロファイルに共通的に存在する遺伝子を非形質転換状態で形質転換された肺癌細胞形態に転換中の細胞のゲノムでメチル化によって、調節されるマーカー遺伝子と見なす段階を含む方法が挙げられる。
【００４４】
本発明において、「核酸」または「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポルリヌクレオチドを意味したり、これらの断片、一本鎖または二重鎖のゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、センスまたはアンチセンス鎖のゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡ（peptide nucleic acid）または自然起源または合成起源のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質をいう。核酸がＲＮＡであると、デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＴの代わりに、各々リボヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＵに代替されるということは当該分野において通常の知識を有する者には自明である。
【００４５】
互いに異なってメチル化されたＣｐＧアイランドの存在を検出できる核酸ならいずれのものも使用できる。前記ＣｐＧアイランドは核酸配列においてＣｐＧが豊富な部位である。
【００４６】
メチル化（methylation）
本発明において精製されたり、精製されない形態のいかなる核酸も使用でき、ターゲット部位（例えば、ＣｐＧ−含有核酸）を含有する核酸配列を含有していたり、含有すると推定されるいかなる核酸も使用できる。区別されてメチル化できる核酸部位がＣｐＧアイランドであり、これは他のジヌクレオチドＣｐＧ核酸部位と比較して高いＣｐＧ密度を持つ核酸配列である。二重（doublet）ＣｐＧはＧ*Ｃ塩基対の割合で予測した時、脊椎動物ＤＮＡにおいて２０％程度の確率である。特定部位において、二重ＣｐＧの密度はゲノムの他の部位と比較して、さらに１０倍も高い。ＣｐＧアイランドは平均Ｇ*Ｃ割合が約６０％で、普通のＤＮＡのＧ*Ｃ割合は平均４０％を示す。ＣｐＧアイランドは典型的に約１〜２ｋｂの長さを持って、ヒトゲノムには約４５，０００個のＣｐＧアイランドが存在する。
【００４７】
多くの遺伝子において、ＣｐＧアイランドはプロモーターのアップストリーム（upstream）から始まって、ダウンストリームの転写部位まで拡張される。プロモーターにおいてＣｐＧアイランドのメチル化は、通常、遺伝子の発現を抑制させる。ＣｐＧアイランドはまた、遺伝子コーディング領域の３'領域だけでなく、遺伝子コーディング領域の５'領域を囲んでいてもよい。従って、ＣｐＧアイランドはプロモーター領域を含む調節部位のコーディング配列アップストリーム、コーディング領域（例えば、エクソン領域）、コーディング領域のダウンストリーム、例えば、インヘンス領域及びイントロンを含む多くの領域において発見される。
【００４８】
通常、ＣｐＧ−含有核酸はＤＮＡである。しかし、本発明の方法は、例えば、ＤＮＡまたはＤＮＡとｍＲＮＡを含むＲＮＡを含有する試料を適用でき、ここでＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二重鎖であってもよく、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含有した試料であってもよい。
【００４９】
さらに核酸混合物も使用できる。検出される特異的な核酸配列は大きい分子の分画であってもよく、初めから特異配列が全体核酸配列を構成する分離した分子形態で存在することができる。前記核酸配列は純粋な形態で存在する核酸である必要はなく、核酸は全体ヒトＤＮＡが含まれているように複雑な混合物内の少ない分画であってもよい。試料に含まれた核酸のメチル化程度を測定するのに使用されたり、メチル化されたＣｐＧアイランドを検出するのに使用される試料に含まれた核酸はＳａｍｂｒｏｏｋなど（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989）に記載された多様な方法で抽出される。
【００５０】
核酸は情報をコードしたり核酸の転写を調節するＤＮＡ領域の調節部位を含んでもよい。調節部位は少なくとも一つのプロモーターを含む。「プロモーター」は転写を指示するのに必要最低限の配列であり、プロモーター依存性遺伝子で細胞タイプ特異的、組織特異的または外部シグナルや製剤による誘導性を調節することができる。プロモーターは遺伝子の５'または３'領域に位置する。プロモーター部位の全体または一部分の核酸数はＣｐＧアイランド部位のメチル化を測定するのに適用される。ターゲット遺伝子プロモーターのメチル化は外部から内部に進行する。従って、細胞転換の初期段階はプロモーター部位の外部におけるメチル化を分析することによって検出することができる。
【００５１】
検体から分離した核酸は検体の生物学的試料から得られる。肺癌や肺癌の進行段階を診断したいのであれば、スクレイピングや生検で肺組織から核酸を分離しなければならない。このような試料は当該分野において知らされた様々な医学的処置を介して得られる。
【００５２】
本発明において、「過剰メチル化」または「ハイパーメチル化」とは腫瘍細胞の特定ＣｐＧ位置またはＣｐＧで構成された特定塩基配列の部位におけるメチル化程度が正常細胞に比べて高い状態を示す。
【００５３】
サンプル（sample）
本発明は肺癌の早期確認に対し記述しており、肺癌特異的遺伝子メチル化を利用している。肺癌特異的遺伝子のメチル化は腫瘍部位の付近の組織においても起きた。従って、肺癌の早期確認方法は液体または固体組織を含む全てのサンプルで肺癌特異的遺伝子プロモーターのメチル化の有無を確認できる。前記サンプルは喀痰、血清または血漿を含むが、これに限定されない。
【００５４】
メチル化検出方法
差別的メチル化の検出−メチル化特異的ＰＣＲ
ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理すると、５'−ＣｐＧ'−３部位のシトシンがメチル化された場合にはそのままシトシンとして残り、非メチル化された場合にはウラシルに変わるようになる。従って、バイサルファイト処理後変換された塩基配列を対象に５'−ＣｐＧ−３'塩基配列が存在する部位に該当するＰＣＲプライマーを製作した。この時、メチル化された塩基配列に相当するＰＣＲプライマーと非メチル化された塩基配列に相当する二つの種類のプライマーを製作した。ゲノムＤＮＡをバイサルファイトで変換させた後、前記二つの種類のプライマーを利用してＰＣＲを行うと、メチル化された場合にはメチル化された塩基配列に該当するプライマーを使用したものからＰＣＲ産物が作られるようになり、逆に非メチル化である場合には非メチル化に該当するプライマーを使用したものからＰＣＲ産物が作られる。メチル化の有無はアガロースゲル電気泳動法で定性的に確認できる。
【００５５】
差別的メチル化の検出−リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ
リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲはメチル化特異的ＰＣＲ法をリアルタイム測定方法で転換したものであり、ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理した後、メチル化された塩基配列に相当するＰＣＲプライマーをデザインして、これらプライマーを利用して、リアルタイムＰＣＲを行うものである。この時、増幅された塩基配列と相補的なＴａｎＭａｎプローブを利用して、検出する方法とサイバーグリーン（Sybergreen）を利用して、検出する２種類の方法がある。従って、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲはメチル化されたＤＮＡだけを選択的に定量分析できる。この時、ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化されたＤＮＡサンプルを利用して標準曲線を作成し、標準化のため塩基配列内に５'−ＣｐＧ−３'配列がない遺伝子を陰性対照群として共に増幅してメチル化程度を定量分析した。
【００５６】
差別的メチル化の検出−パイロシーケンシング
パイロシーケンシング法はバイサルファイトシーケンシング法を定量的であるリアルタイムシーケンシングに変換した方法である。バイサルファイトシーケンシング同様、ゲノムＤＮＡをバイサルファイト処理して、転換させた後、５'−ＣｐＧ−３'塩基配列がない部位に相当するＰＣＲプライマーを製作した。ゲノムＤＮＡをバイサルファイトで処理した後、前記ＰＣＲプライマーで増幅した後、シーケンシングプライマーを利用して、リアルタイム塩基配列分析を行った。５'−ＣｐＧ−３'部位においてシトシンとチミンの量を定量的に分析してメチル化程度をメチル化指数で示した。
【００５７】
差別的メチル化の検出−メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲまたは定量ＰＣＲ及びＤＮＡチップ
メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲまたはＤＮＡチップ法はメチル化ＤＮＡにだけ特異的に結合する蛋白質をＤＮＡと混ぜると、メチル化ＤＮＡにだけ特異的に蛋白質が結合するためメチル化ＤＮＡだけを選択的に分離することができる。ゲノムＤＮＡをメチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質と混ぜた後、メチル化されたＤＮＡだけを選択的に分離した。この分離したＤＮＡをプロモーター部位に該当するＰＣＲプライマーを利用して増幅した後、アガロース電気泳動でメチル化の有無を測定した。
【００５８】
また、定量ＰＣＲ法でもメチル化の有無を測定でき、メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質で分離したメチル化ＤＮＡは蛍光染料で標識して、相補的なプローブが集積されたＤＮＡチップにハイブリダイゼーションさせることでメチル化の有無を測定することができる。ここで、メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質はＭｃｒＢｔに制限されない。
【００５９】
差別的メチル化の検出−メチル化感受性制限酵素
差別的メチル化の検出はメチル化されないＣｐＧ部位だけを切断するメチル化感受性制限酵素と核酸サンプルを接触させて非メチル化された核酸を切断することで行える。
【００６０】
別の反応で、前記サンプルをメチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を皆切断するメチル化感受性制限酵素のアイソシゾマー（isoschizomer）と接触させて、メチル化された核酸を切断した。
【００６１】
特異的プライマーを核酸サンプルに添加して、通常の方法で核酸を増幅させた。メチル化感受性制限酵素を処理したサンプルにおいて増幅産物が存在して、メチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を全て切断するメチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーを処理したサンプルで増幅産物が存在しなければ、分析された核酸部位にメチル化が起きたこととなる。しかし、メチル化感受性制限酵素を処理したサンプルで増幅産物が存在せず、メチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を全て切断するメチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーを処理したサンプルにおいても増幅産物が存在しないということは分析された核酸部位にメチル化が起きなかったこととなる。
【００６２】
ここで、「メチル化感受性制限酵素」は認識部位にＣＧを含んで、Ｃがメチル化ならなかった時と比較してＣがメチル化された時活性を持つ制限酵素である（例えば、ＳｍａＩ）。メチレーション感受性制限酵素の非制約的例として、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ及びＮｏｔＩが含まれる。前記酵素は単独でまたは組み合わせて使用できる。他のメチレーション感受性制限酵素は、例えば、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩが挙げられるが、これに限定されるのではない。
【００６３】
メチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーはメチレーション感受性制限酵素と同じ認識部位を有する制限酵素であるが、メチル化されたＣＧｓと非メチル化されたＣＧｓを全て切断し、例えば、ＭｓｐＩが挙げられる。
【００６４】
本発明のプライマーは増幅されるローカスの各鎖と「実質的に」相補性を持つように製作されて、前記において説明した通り、適当なＧまたはＣヌクレオチドを含む。これは重合反応を行う条件でプライマーが対応する核酸鎖とハイブリダイゼーションされるには十分な相補性を持つことを意味する。本発明のプライマーは増幅過程に使用され、前記増幅過程は、例えば、ＰＣＲと同じターゲットローカスが多くの反応段階を経ながら、幾何級数的な数に増加する酵素連続反応である。典型的には、あるプライマー（アンチセンスプライマー）はローカスのネガティブ（−）鎖に対し相同性を有し、残り一つのプライマー（センスプライマー）はポジティブ（＋）鎖に対し相同性を有する。変成された核酸にプライマーがアニーリングされると、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Klenow）及びヌクレオチドのような酵素及び反応物によって鎖が伸張し、その結果、ターゲットローカス配列を含有する＋と−鎖が新しく合成される。前記新しく合成されたターゲットローカスが鋳型としても使用されて、変成、プライマーアニーリング及び鎖身長のサイクルが繰り返されるとターゲットローカス配列の幾何級数的な合成が進行される。前記連続反応の産物は反応に使用された特異プライマーの末端と対応する末端を持つ独立的な二重鎖核酸である。
【００６５】
前記増幅反応は当該分野において普遍的に使用されているＰＣＲであることが望ましい。しかし、リアルタイムＰＣＲまたは等温酵素を使用した線形増幅のような代替的な方法も使用でき、マルチプレックス増幅反応も使用できる。
【００６６】
差別的メチル化の検出−バイサルファイトシーケンシング法
メチル化ＣｐＧを含有した核酸を検出する他の方法は、核酸を含有した試料を非メチル化シトシンを変形させる製剤と接触させる段階、及びＣｐＧ−特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して試料のＣｐＧ−含有核酸を増幅させる段階を含む。ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーは変形されたメチル化及び非メチル化核酸を区別してメチル化核酸を検出することを特徴とする。前記増幅段階は選択的であり、望ましいが必須ではない。前記方法は変形された（例えば、化学的に変形された）メチル化及び非メチル化ＤＮＡを区別するＰＣＲ反応に依存するものである。前記のような方法は米国特許５，７８６，１４６に開示されており、前記特許にはメチル化核酸の検出のためのバイサルファイトシーケンシングと関連付けられて記載されている。
【００６７】
基質
ターゲット核酸部位が増幅されると核酸配列の存在を検出するために、前記核酸増幅産物は固体支持体（基質）に固定された、周知の遺伝子プローブとハイブリダイゼーションできる。
【００６８】
ここで、「基質」は物質、構造、表面または材料、非生物学的であり、合成されて、無生物、平面、球形または特異的結合、平らな表面の物質を含む混合物手段で、ハイブリダイゼーションまたは酵素認識部位または大多数の他の認識部位または表面、構造または材料で構成された数多くの他の分子種を越える数多くの他の認識部位を含むことができる。前記基質は、例えば、半導体、有機合成メタル、合成半導体、インシュレーター及びドーパント；金属、合金、元素、化合物及びミネラル；合成・分解・エッチングされ、リソグラフされ、プリント・マイクロファブリケーションされたスライド、装置、構造及び表面；産業的、ポリマー、プラスチック、メンブレン、シリコン、シリケート、ガラス、金属及びセラミック；木、紙、カードボード、綿、ウール、布、製織及び非製織繊維、材料及びファブリックであってもよいが、これに限定されるのではない。
【００６９】
いくつかの形態のメンブレンは当該分野において核酸配列に対し付着力を持つと知られている。このようなメンブレンの特異的でかつ非制約的な例としては、ニトロセルロースまたはポリビニルクロライド、ジアゾ化（diazotized）ペーパー及びＧＥＮＥＳＣＲＥＥＮＴＭ、ＺＥＴＡＰＲＯＢＥＴＭ（Biorad）及びＮＹＴＲＡＮＴＭなどの商業的に使用されるメンブレンのような遺伝子発現検出用メンブレンが挙げられる。ビーズ、ガラス、ウェハー及び金属基質も含まれる。このような目的物に核酸を付着させる方法は当該分野においてよく知られている。これと異なって、液体相においてもスクリーニングを行うことができる。
【００７０】
ハイブリダイゼーション条件
核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のストリンジェントなレベルを達成するために使用される条件はハイブリダイズされる核酸の性質によって多様である。例えば、ハイブリダイゼーションされる核酸部位の長さ、相同性程度、ヌクレオチド配列造成（例えば、ＧＣ／ＡＴ造成比）及び核酸タイプ（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）などがハイブリダイゼーション条件の選択において考慮される。さらなる考慮条件は核酸が、例えば、フィルターなどに固定化されているか否かである。
【００７１】
非常に厳しく設定される条件の例は次のようになる：室温の２Ｘ ＳＳＣ／０.１％ ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）、室温の０.２Ｘ ＳＳＣ／０.１％ ＳＤＳ（ストリンジェントが低い条件）、４２℃での０.２Ｘ ＳＳＣ／０.１％ ＳＤＳ（普通のストリンジェントを持つ条件）、６８℃での０.１Ｘ ＳＳＣ（ストリンジェントが高い条件）。
【００７２】
洗浄過程はこれらの中一つの条件を使用して行うことができて、例えば、ストリンジェントが高い条件、または前記条件を各々使用できて、前記記載された順に各々１０〜１５分ずつ、前記記載された条件を全部または一部繰り返して行うことができる。しかし、前記に記述した通り、最適条件は含まれた特別なハイブリダイゼーション反応により多様で、実験を介して決められる。一般に、重要なプローブのハイブリダイゼーションにはストリンジェントが高い条件が使用される。
【００７３】
標識（Label）
重要なプローブは検出することができるように標識され、例えば放射線同位元素、蛍光化合物、バイオ発光化合物、化学発光化合物、金属キレートまたは酵素で標識される。前記のようなプローブを適当に標識するのは当該分野において広く知られた技術であり、通常の方法で行える。
【００７４】
キット（Kit）
本発明によると、検体の細胞成長性異常を検出するのに有用なキットを提供している。本発明のキットはサンプルを入れる区切られたキャリア手段、非メチル化シトシンを敏感に切断する製剤を含有する１番目の容器、ＣｐＧ含有核酸を増幅するためのプライマーを含有する２番目の容器、及び切断されたまたは切断されない核酸の存在を検出する手段が含まれている３番目の容器を含む一つ以上の容器を含む。本発明によって使用されるプライマーは配列番号５〜２１に記載された配列、機能的組合せ及びその断片を含む。機能的組合せまたは断片はゲノム上でメチル化が起きたか否かを検出するプライマーとして使用される。
【００７５】
キャリア手段は瓶、チューブのような一つ以上の容器を含有するのに適しており、各容器は本発明の方法に使用される独立的構成要素を含有する。本発明の明細書において、当分野の通常の知識を有する者は容器中の必要な製剤を分配することができる。例えば、メチル化感受性制限酵素を含有する容器を一つの容器で構成することができる。一つ以上の容器は重要核酸ローカスと相同性を持つプライマーを含むことができる。また、一つ以上の容器はメチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーを含むことができる。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例によって、より一層詳細に説明する。この実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこの実施例に限定されないことは当業界において通常の知識を有する者には自明である。
【００７７】
［実施例１］肺癌細胞株において過剰メチル化されている遺伝子の選別
肺癌において過剰メチル化された遺伝子を選別するために肺癌細胞株Ａ５４９（韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢ）１０１８５）と正常肺細胞株ＮＨＢＥ（Ｃａｍｂｒｅｘ ｃｃ−２５４１）を利用して過剰メチル化された遺伝子を下記の方法で選別した。
【００７８】
先ず、各細胞株のｇＤＮＡ ５００μｇを超音波（sonication）方法（Ｖｉｂｒａ Ｃｅｌｌ、ＳＯＮＩＣＳ）で３００〜４００ｂｐの大きさの切片にし、Ｍｅｔｈｙｌｃａｐｔｕｒｅ(商標)（Ｇｅｎｏｍｉｃｔｒｅｅ、韓国）を利用して、プロトコルに準じて、各細胞株からメチル化ＤＮＡを選択的に分離した。分離したメチル化ＤＮＡをＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ(商標) Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を使用して増幅した後、Ａ５４９及びＮＨＢＥ由来増幅されたメチル化ＤＮＡを各々Ｃｙ５−ｄＵＴＰとＣｙ３−ｄＵＴＰで標識して混合した後、ヒト遺伝体に存在する２７，８００個余りのＣｐＧアイランドに存在するＣｐＧに対するプローブが集積されているＣｐＧマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ、製造国）にＡｇｉｌｅｎｔプロトコルにより混成化反応及びスキャニングを行って、統計的技法を介してＡ５４９において過剰メチル化された候補遺伝子を５０個選別した（図１及び表１）。
【００７９】
【表１】
【００８０】
［実施例２］肺癌組織からメチル化によって発現が抑制される遺伝子選別
肺癌組織からメチル化によって発現が抑制される遺伝子を選別するために、マイクロアレイハイブリダイゼーションを行った。マイクロアレイハイブリダイゼーションは標準プロトコルを利用して行った（Schena et al., Science, 270:467, 1995）。
【００８１】
肺癌患者から対を成すように腫瘍付近組織及び腫瘍組織を分離して、これからトータルＲＮＡを分離した。前記対となった腫瘍付近組織及び腫瘍組織の遺伝子発現レベルの相対的な差を間接的に比較するために、標準比較ＲＮＡ（間接比較）を製作した。標準比較ＲＮＡを製作するために、肺癌細胞株Ａ５４９（韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢ）１０１８５）、胃癌細胞株ＡＧＳ（ＫＣＬＢ ２１７３９）、腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−２（ＫＣＬＢ ３００４７）、結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＫＣＬＢ １０２４７）、子宮頸部癌細胞株Ｈｅｌａ（ＫＣＬＢ １０００２）、血液癌細胞株ＨＫ−６０（ＫＣＬＢ １０２４０）及びＨＴ１０８０（ＫＣＬＢ １０１２１）、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１（ＫＣＬＢ ３００２６）、肝臓癌細胞株ＳＫ−ｈｅｐ１（ＫＣＬＢ ３００５２）、Ｔ細胞由来細胞株Ｍｏｌｔ−４（ＫＣＬＢ ２１５８２）及び脳癌細胞株Ｕ−８７ＭＧ（ＫＣＬＢ ３００１４）等１１個のヒト癌細胞株からトータルＲＮＡを分離した。細胞株及び肺組織の全体ＲＮＡはＴｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を使用して分離した。
【００８２】
標準比較ＲＮＡを製作するために、前記１１個の細胞株から分離したトータルＲＮＡを同量に混合して、内部対照群として使用した。
【００８３】
前記対を成した腫瘍付近組織及び腫瘍組織の相対的遺伝子発現程度を比較するために、非腫瘍及び腫瘍組織から分離したＲＮＡと標準比較ＲＮＡを間接的に比較した。トータルＲＮＡ １００μｇをＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰで標識した。前記標準比較ＲＮＡをＣｙ３で標識し、肺組織から分離したＲＮＡをＣｙ５で標識した。前記Ｃｙ３−及びＣｙ５−で標識されたｃＤＮＡをＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を使用して精製した後、前記精製されたｃＤＮＡを混合して、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、ＵＳＡ）を利用して、最終体積が２７μＬになるよう濃縮した。
【００８４】
ハイブリダイゼーション反応液８０μＬ（前記標識されたｃＤＮＡターゲット２７μＬ、２０Ｘ ＳＳＣ ２０μＬ、１％ ＳＤＳ ８％、ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）２４μＬ及びヒトＣｏｔ１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、ＵＳＡ)２０μｇを１００℃で２分間加熱して、直ちにヒト２２Ｋオリゴヌクレオチド（ＧｅｎｏｍｉｃＴｒｅｅ，Ｉｎｃ．、韓国）マイクロアレイにハイブリダイズさせた。前記ハイブリダイゼーションは湿度調節されたＨｙｂＣｈａｍｂｅｒ Ｘ（ＧｅｎｏｍｉｃＴｒｅｅ，Ｉｎｃ．、韓国）で４２℃で１２〜１６時間行った。前記ハイブリダイゼーション終了後、マイクロアレイスライドをＡｘｏｎ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を利用して判読した。シグナル及びバックグラウンドの蛍光強度はＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ４.０ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して、ターゲット部位内部の全てのピクセルの強度を平均して各プローブに対して測定した。明らかに非正常性を示すスポットは分析から除外した。全てのデータはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ７.２（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を利用して、正規化、統計学的分析及びクラスタ分析を行った。
【００８５】
また、非腫瘍及び腫瘍組織の遺伝子発現レベルの相対的な差を決めるために、間接比較のための統計学的分析（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０.０１）を行った。前記統計学的分析結果から対にされた腫瘍付近組織と比較して、腫瘍組織において２５２個の遺伝子が下降調節（down regulated）された。
【００８６】
［実施例３］脱メチル化によって再活性化される遺伝子選別
実施例１において確認された遺伝子の発現が遺伝子のプロモーターメチル化によって調節されるのか確認するために、肺癌細胞株Ａ５４９（ＫＣＬＢ(韓国細胞株銀行)１０１８５）及びＮＣＩ−Ｈ３５８（ＫＣＬＢ ９０３５８）にジメチル化剤である５−アザ−２−デオキシシチジン（ＤＡＣ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）で２００ｎＭ濃度で３日間処理した。処理しない細胞株と処理した細胞株をＴｒｉ ｒｅａｇｅｎｔで処理してトータルＲＮＡを分離した。
【００８７】
ＤＡＣ処理による遺伝子発現変化を測定するために、非処理細胞株と処理細胞株との間の転写レベルを直接的に比較した。その結果、ＤＡＣ処理しない対照群と比べて、ＤＡＣ処理した場合３６７個の遺伝子が発現上昇することを確認した。前記実施例１で獲得した２５２個の腫瘍抑制遺伝子プロファイルと３６７個のジメチル化によって、２倍以上再発現された遺伝子を比較した結果、１８個の共通した遺伝子を確認した（図１）。
【００８８】
［実施例４］肺癌から過剰メチル化された遺伝子ＰＣＤＨＧＡ１２選別
前記１８個の遺伝子のプロモーター部位においてＣｐＧアイランドの存在を確認するために、ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ（http://itsa.ucsf.edu/~urolab/methprimer/index1.html）を利用した。前記１８個の遺伝子中１３個の遺伝子はＣｐＧアイランドを持っていなかったため、前記１３個の遺伝子を共通遺伝子プロファイルから除外した。従って、前記５個の遺伝子中実施例１のＣｐＧマイクロアレイ分析で選別された５０個の遺伝子に含まれているＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子を最終肺癌関連メチル化バイオマーカーで選別した。選択されたＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子は肺癌細胞株において過剰メチル化されており、肺癌組織において下降調節されて（down-regulated）、ジメチル化条件で再活性化され（up-regulated）、プロモーターと５’ＵＴＲ、及びエクソン１にＣｐＧアイランドを含有している多様な条件を満たすことが分かった（表２）。
【００８９】
【表２】
【００９０】
［実施例５］肺癌におけるＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化領域探索
（１）バイサルファイト（bisulfite）クローナルシーケンシングを利用した探索
Ａ５４９及びＮＨＢＥ細胞株を利用して、バイサルファイトクローナルシーケンシング方法でＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域でのメチル化程度を調べた（図２Ａ）。バイサルファイト（bisulfite）を利用してメチル化されないシトシンをウラシルに変形するために、正常細胞株ＮＨＢＥ及び肺癌細胞株Ａ５４９（ＫＣＬＢ １０１８５）から全体ゲノムＤＮＡを分離して、その中ゲノムＤＮＡ ２００ｎｇにＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を利用して、バイサルファイト処理した。ＤＮＡをバイサルファイトで処理すると、非メチル化されたシトシンはウラシルに変形されて、メチル化されたシトシンは変化せずに残るようになる。
前記バイサルファイト処理されたＤＮＡを滅菌蒸溜水２０μＬで湧出させた後、ゲノムＤＮＡ ２０ｎｇを利用して、表３に示した塩基配列を持つプライマーを使用して、ＰＣＲ方法で図２Ａに示したＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１、Ｒ２及びＲ３領域を増幅した。ＰＣＲは９４℃で１分、６６℃で１分、７２℃で１分間処理するのを１サイクルにし、合わせて４０回繰り返し、最終的に７２℃で１０分間伸張させた。
【００９１】
【表３】
【００９２】
前記ＰＣＲ反応を介して増幅されたＤＮＡを精製し、これをＴ／Ａクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）にクローニングした。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３増幅産物から作られたクローンの中各々１０個ずつを選択して、これに対する塩基配列を分析してメチル化の有無を判別した。その結果、ＮＨＢＥに比べてＡ５４９のＲ１、Ｒ２及びＲ３領域が相対的に高いレベルでメチル化されていることを確認した（図２Ｂ）。特に、Ｒ３領域のメチル化程度が最も顕著な差を見せるのを確認した。
【００９３】
（２）パイロシーケンシングを利用した探索
Ａ５４９及びＮＨＢＥ細胞株を利用して、パイロシーケンシング（pyrosequencing）方法でＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域におけるメチル化程度を調べた（図３）。バイサルファイト（bisulfite）を利用してメチル化されないシトシンをウラシルに変形するために、正常細胞株ＮＨＢＥ及び肺癌細胞株Ａ５４９（ＫＣＬＢ １０１８５）から全ゲノムＤＮＡを分離して、その中ゲノムＤＮＡ ２００ｎｇにＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を利用して、バイサルファイト処理した。ＤＮＡをバイサルファイトで処理すると、非メチル化されたシトシンはウラシルに変形されて、メチル化されたシトシンは変化せず残るようになる。
【００９４】
前記バイサルファイト処理されたＤＮＡを滅菌蒸溜水２０μＬで溶出させてパイロシーケンシングを行った。バイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ ２０ｎｇをＰＣＲを利用して増幅した。ＰＣＲは９４℃で１分、６６℃で１分、７２℃で１分間処理するのを１サイクルにして、合わせて４０回繰り返し、最終的に７２℃で１０分間伸張した。以後、ビオチンで標識された鋳型ＤＮＡを精製して、ＰｙｒｏＭａｒｋ ＩＤ（Ｂｉｏｔａｇｅ、スウェーデン）を利用して、塩基配列を分析した。ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子に対するパイロシーケンシングを行うための各部位に対するＰＣＲ及びシーケンシングプライマーはＰＳＱ ａｓｓａｙ ｄｅｓｉｇｎプログラム（Ｂｉｏｔａｇｅ、ＵＳＡ）を利用して設計した。ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子プロモーターのメチル化測定のためのＰＣＲ及びシーケンシングプライマーは表４の通りになる。
【００９５】
【表４】
【００９６】
ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の３個の領域に対する肺癌細胞株における過剰メチル化程度を調べてみるために正常細胞株ＮＨＢＥ（Ｃａｍｂｒｅｘ ＣＣ−２５４１）、肺癌細胞株Ａ５４９（ＫＣＬＢ １０１８５）の他にＮＣＩ−Ｈ１４６（ＫＣＬＢ ３０１７３）、ＮＣＩ−Ｈ３５８（ＫＣＬＢ ９０３５８）及びＨＣＣ１１９５（ＫＣＬＢ ７１１９５）等の肺癌細胞株を対象に実施例５同様にパイロシーケンシングを行った。その結果、全ての癌細胞株においてＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１、Ｒ２、Ｒ３領域で高い頻度で過剰メチル化され、特にＲ３領域における過剰メチル化は全ての肺癌細胞株で高く起きたことが分かった（図３）。
【００９７】
［実施例６］肺癌組織におけるＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化測定
前記実施例から確認された通り、肺癌細胞株において過剰メチル化されており、肺癌組織において発現が下降調節されて、ジメチル化条件で再活性化され、５’ＵＴＲ及びエクソン１にＣｐＧアイランドを含有しており、各種肺癌細胞株でＲ１、Ｒ２、Ｒ３領域に過剰メチル化されているＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子を利用して、肺癌診断用バイオマーカーで使用できるのか検証するために、健康な５人の肺組織と肺癌患者４０人の肺癌組織及びその隣接部位の正常組織臨床検体を利用してＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１とＲ３領域に対してメチル化アッセイを行った。メチル化アッセイはパイロシーケンシング方法を使用して、実施例５に記載された方法で行った。
【００９８】
その結果、図４に示したように、ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１とＲ３領域全てにおいて肺癌組織連隣接部位の正常組織におけるメチル化程度は患者でない正常組織におけるメチル化程度に類似するが、肺癌組織においては非常に高い程度のメチル化レベル（ｐ＝０.０００１）を示した。また、互いに対である肺癌組織と隣接部位の正常組織でのメチル化程度はＲ１の場合４０個の臨床検体中３４個と高く、８５％を占めし、Ｒ３の場合は３６個と９０％であった。従って、ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化は肺癌において非常に高い頻度で起きることが分かり、このような結果はＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化を測定することによって肺癌を効率的に診断できるとことを示す。
【００９９】
［実施例７］非侵襲的臨床検体である喀痰におけるＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化測定
肺癌患者の喀痰においても多様な遺伝子のＤＮＡ過剰メチル化が検出できるとの多くの報告があり、肺癌の早期及び再発有無を喀痰を利用する場合、患者便宜的診断が可能になるため、喀痰サンプルに含まれていた細胞におけるＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化程度を確認した。
【０１００】
５１人の正常なヒトの喀痰と８１人の肺癌患者の喀痰を対象にＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１、Ｒ２及びＲ３領域に対するパイロシーケンシングを実施例５と同様な方法で行った。その結果、正常なヒトの喀痰に比べて、肺癌患者の喀痰においてＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１、Ｒ２及びＲ３領域の過剰メチル化程度が高く測定されることを確認した（図５）。
【０１０１】
また、ＲＯＣ（receiver operating calculatioｎ）カーブ分析を行った結果、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３領域のメチル化指数を各々１３.４９、１５.６２、２５.７７をメチル化指数基準（cut-off）に設定した時、喀痰を対象にした肺癌診断に対する感度（sensitivity）は各々７４.１％、７０.４％、８６.４％であり、これに対する特異度（specificity）は各々６６.７％、７８.４％、８２.４％と非常に優秀なことが明らかになった（表５）。従って、非侵襲的臨床検体の喀痰を利用してＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＤＮＡ過剰メチル化を測定することによって肺癌の早期診断、再発の有無、薬品処理後のモニタリング及び術後の再発有無のモニタリングなど肺癌の多様な診断に適用できると判断される。
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
［実施例８］メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化検出
肺癌診断の感度と特異度が最も優秀なＰＣＤＨＧＡ１２ Ｒ３領域を対象にＭｅｔｈｙｌＣａｐｔｕｒｅ(商標) ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｉｃｔｒｅｅ、韓国）を利用して過剰メチル化検出を行った。ＭｅｔｈｙｌＣａｐｔｕｒｅ(商標) ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔはメチル化されたＤＮＡに特異的に結合するＭＢＤ２ｂｔ蛋白質を利用してメチル化されたＤＮＡだけを選択的に分離した後、ＰＣＲ方法でメチル化を測定できるキットである。細胞株及び喀痰試料からゲノムＤＮＡを抽出し、抽出されたゲノムＤＮＡをＭｓｅＩ−ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ方法やｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを利用して、２００〜６００ｂｐの大きさに切片化した。これを２Ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、競合ＤＮＡ及びＨｉｓ−ＭＢＤ２ｂｔ蛋白質と混ぜて、４℃の条件で４時間反応させた。反応が終了した溶液にマグネチックビーズを添加して、４℃で４５分間反応させて、洗浄液で５回洗浄し、非特異的に結合をしているＤＮＡ切片を取り除いた。最終的にＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を利用してメチル化されたＤＮＡだけを分離精製した。精製されたＤＮＡの１／５体積を取って、遺伝子特異的プライマーでＰＣＲ増幅を行い、電気泳動してメチル化の有無を判別した。ＰＣＤＨＧＡ１２ Ｒ３を増幅するためのプライマーの塩基配列は次のようになる。
【０１０４】
配列番号２０：５‘−ｇａａｇａａａａｇｇｃｔｇｃｔｃａｃｃａ−３’
配列番号２１：５‘−ｔｃｇｃａｔｃｃａｇａａｃｃａｔｃａｃ−３’
【０１０５】
その結果、正常細胞株であるＮＨＢＥにおいては増幅産物が全く観察されなく、肺癌細胞株であるＡ５４９でだけＰＣＤＨＧＡ１２ Ｒ３に対する増幅産物が観察されることによって肺癌特異的なメチル化を確認することができた（図６Ａ）。また、喀痰細胞ゲノムＤＮＡを利用して、正常及び肺癌患者からメチル化を測定した結果、３人の正常喀痰試料においては全く増幅産物が観察されなかったが、３人の肺癌患者試料においては全部メチル化が検出された（図６Ｂ）。従って、メチル化特異的結合蛋白質を利用してＰＣＤＨＧＡ１２ Ｒ３のメチル化を測定できるということを確認した。
【産業上利用の可能性】
【０１０６】
以上、詳細に説明したように、本発明は肺癌特異的マーカー遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のＣｐＧのメチル化を診断できる肺癌診断用キットを提供する効果がある。本発明の診断用キットを利用すると、通常の方法より正確でかつ早く肺癌の早期診断が可能であり、肺癌の予後予測及びモニタリングに応用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は肺癌特異的なバイオマーカーを利用した肺癌の検出方法に関し、より具体的には、肺癌形質転換細胞において５’ＵＴＲまたはエクソン１領域が特異的にメチル化されるＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のメチル化を確認することができる肺癌診断用バイオマーカー及び前記バイオマーカーを利用した肺癌及びその進行段階の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、肺癌は非常に稀な腫瘍であったが、２０世紀に入って喫煙が一般的になってから、急激に増加し始めて、欧州においては男女共に多く発生している。韓国では男性に多発する悪性腫瘍であり、女性でも驚く程その頻度が増加している傾向にある。このような肺癌の発生頻度の増加は喫煙、大気汚染及び産業公害増加などに起因する。
【０００３】
医学が発達した今日に至っても癌、特に大多数を占める固形癌（solid tumor：血液癌を除いた癌）の５年間生存する割合は５０％未満で、全体癌患者の約３分の２は進行段階で発見され、その多くは診断後２年以内に死亡する。このように低い癌治療効果は治療法の問題だけでなく、実際癌を早期に診断できる方法と進行中の癌を正確に診断し、治療後の追跡調査が容易でないためである。
【０００４】
最近、癌の診断に遺伝子検査が積極的に試みられており、代表的な方法は血液から白血病の遺伝子指標であるＡＢＬ：ＢＣＲ（Abelson Murine Leukemia Viral Oncogene Homolog:Breakpoint cluster region）融合遺伝子の有無をＰＣＲで探す方法である。また、癌細胞が発現する遺伝子の存在をＲＴ−ＰＣＲ及びブロッティングで把握することによって、血球細胞中に共に存在する癌細胞を診断する方法が試みられている。しかし、前記方法は前立腺癌と黒色種などの一部の癌にだけ適用可能で、偽陽性率（false positive rate）が高く、検査及び判読方法の標準化が難しく、その有用性にも限界があった（Kopreski、M.S. et al., Clin.Cancer Res., 5:1961, 1999, Miyashiro, I. et al., Clin chem., 47:505, 2001）。また、最近血清（serum）や血漿（plasma）内ＤＮＡを使用する遺伝子検査が活発に試みられている。前記癌から遊離されたＤＮＡを持って癌遺伝子（oncogene）と腫瘍抑制遺伝子の突然変異、消失、機能喪失などの癌特異的な遺伝子異常を分析すると癌を診断することができる。
【０００５】
一方、肺癌患者で喀痰や気管支肺胞洗浄液（bronchoalveolar lavage fluid）内に存在する癌細胞及び癌遺伝子の存在を遺伝子検査や抗体検査で探す方法が試みられている（Palmisano, W.A. et al., Cancer Res., 60:5954, 2000, Sueoka, E. et al., Cancer Res., 59:1404, 1999）。しかし、多くの遺伝子の異常を伴って、多様な変移を示す癌を正確に診断するためには多数遺伝子を同時に、そして正確に自動分析できる方法が求められるが、このような方法はまだ確立されていない。
そこで、最近ではＤＮＡメチル化測定を介して、癌を診断する方法が提示されているが、ＤＮＡメチル化は主に特定遺伝子のプロモーター部位のＣｐＧアイランド（CpG island）のシトシン（Cytosine）で起きて、これによって転写因子の結合が妨害を受けて特定遺伝子の発現が遮断されるようなもので、腫瘍抑制遺伝子のプロモーターＣｐＧアイランドのメチル化を検索するのが癌研究に多いに役立ち、これをメチル化特異的ＰＣＲ（methylation specific PCR、以下、「ＭＳＰ」という）や自動塩基分析などの方法で調べて、癌診断とスクリーニングなどに利用しようとする試みが活発に行われている。
【０００６】
プロモーターＣｐＧアイランドのメチル化が発癌を直接誘発するのか、または発癌に２次的な変化を起こすのかに対する論議はあるが、多種の癌において腫瘍抑制遺伝子（tumor suppressor gene）、ＤＮＡ修復遺伝子（DNA repair gene）、細胞周期調節遺伝子などが過剰メチル化（hypermethylation）されていて、これらの遺伝子の発現が遮断されていることが確認され、特に癌発生の初期段階において特定遺伝子のプロモーター部位に過剰メチル化が起きることが知られている。
【０００７】
従って、腫瘍関連遺伝子のプロモーターメチル化が癌の重要な指標であり、これは癌の診断及び早期診断、発癌危険の予測、癌の予後予測、治療後追跡調査、抗癌療法に対する反応予測など多方面に亘って利用することができる。実際、血液や喀痰、唾、大便、尿などから腫瘍関連遺伝子のプロモーターメチル化を調べて、各種癌診療に使おうとする試みが最近活発になっている（Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999, Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000, Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219, 2000）。
【０００８】
現在、肺癌の診断は多様な検査を通してのみ可能で、肺癌と疑われる症状が現れる場合、胸部撮影検査、顕微鏡検査、ビデオ鏡検査、生検、転移の有無確認検査等を介して、肺癌であるか否かを調べて、その進行程度などを判断する。しかし、前記検出方法は高価な装備、高費用、検体採取に困難があるだけでなく、肺癌の初期診断には不向きである。従って、肺癌の場合、腫瘍の大きさが３ｃｍ未満の第１病期の５年生存の可能性は約７０％に達することから、患者の生存期間を延ばすためには病変範囲が小さい時、早期診断するのが最も良い方法である。そこで、既存の各種肺癌検出方法より効率的な検出方法、即ち、早期に診断が可能で、大容量で検体を処理できて、感度及び特異度が高い新しい診断に使う肺癌特異的バイオマーカーの開発が切に求められているのが現状である。
【０００９】
従って、本発明者等は大腸癌特異的発現減少遺伝子ＬＡＭＡ２（laminin Merosin alpha 2）、ＦＡＢＰ４（fatty acid binding protein 4）、ＧＳＴＡ２（glutathione S-transferase A2）、ＳＴＭＮ２（stathmin-like 2）、ＮＲ４Ａ２（nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2）、ＤＳＣＲ１Ｌ１（down syndrome critical region gene 1-like 1）、Ａ２Ｍ（alpha-2-macroglobulin）及びＳＥＰＰ１（selenoprotein P, plasma, 1）のメチル化されたプロモーターを利用した癌診断用マイクロアレイ及び癌診断キットに対し出願して、登録を受けた（韓国登録特許第１０−０６１７６４９号）。
【００１０】
そこで、本発明者等は肺癌を効果的に診断できる診断用キットを開発しようと鋭意努力した結果、肺癌細胞において特異的にメチル化されたＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿０３２０９４）遺伝子のメチル化された５’ＵＴＲまたはメチル化されたエクソン１領域を肺癌特異的バイオマーカーとして利用してメチル化程度を測定することによって、肺癌及びその進行段階を診断できることを確認して本発明の完成に至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、肺癌において特異的にメチル化された遺伝子のメチル化部位を含有する肺癌診断用バイオマーカーを提供することである。
本発明の他の目的は、肺癌診断用バイオマーカーを利用した肺癌及びその進行段階の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は肺癌特異的発現減少遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２、protocadherin gamma subfamily A, 12）のメチル化された５’ＵＴＲまたはメチル化されたエクソン１領域を含む肺癌診断用バイオマーカーを提供する。
【００１３】
本発明はさらに、一つ以上のメチル化されたＣｐＧアイランドを含有して、配列番号２〜４のうちいずれか一つの塩基配列として表される肺癌診断用バイオマーカーを提供する。
【００１４】
本発明はさらに、（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する段階、及び（ｂ）前記分離したＤＮＡからＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）遺伝子の５’ＵＴＲまたはエクソン１領域のメチル化を検出する段階を含む肺癌またはその進行段階の検出方法を提供する。
本発明の他の特徴及び具現例は、下記の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】肺癌診断用メチル化バイオマーカーＰＣＤＨＧＡ１２を探し出す過程を示した模式図である。
【図２】正常細胞及び肺癌細胞株においてＰＣＤＨＧＡ１２のメチル化程度を確認した遺伝子部位（Ａ）とＵＴＲ及びエクソン部位のメチル化程度（Ｂ）をバイサルファイトシーケンシング法で測定した図である。
【図３】正常細胞及び４種の肺癌細胞においてＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のメチル化程度をパイロシーケンシング法で測定した図である。
【図４】５個の正常組織、４個の対を成す肺癌手術組織におけるＰＣＤＨＧＡ１２のメチル化程度をパイロシーケンシング法で測定した図である。
【図５】正常な人（５１人）と肺癌患者（８１人）の喀痰細胞ゲノムＤＮＡを利用してメチル化を測定した図である。
【図６】正常及び肺癌細胞株と正常な人と肺癌患者の喀痰ＤＮＡを利用してＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子プロモーターのメチル化程度を測定した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は一観点において、肺癌特異的発現減少遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）のメチル化された５’ＵＴＲまたはメチル化されたエクソン１領域を含む肺癌診断用バイオマーカーに関する。
【００１７】
本発明において、前記メチル化された５’ＵＴＲ（untranslated region）またはメチル化されたエクソン１領域は、少なくとも一つのメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを含有することを特徴とし、前記５’ＵＴＲ及びエクソン１領域は配列番号１で表されるのを特徴とする。
【００１８】
本発明によるメチル化マーカー遺伝子をスクリーニングする方法は、一様態において（１）形質転換された細胞株及び非形質転換された細胞株を対象に形質転換された細胞株にだけＤＮＡ過剰メチル化された遺伝子を選択する段階、（２）形質転換された肺癌組織細胞及び隣接部位の非形質転換組織細胞の遺伝子発現プロファイルを比較して、非形質転換組織細胞にさらに多く発現する遺伝子のプロファイルを分類する段階、（３）形質転換された肺癌細胞株をメチル化阻害剤で処理し、処理しない形質転換された肺癌細胞株と比較して、メチル化阻害剤を処理した形質転換された肺癌細胞株にさらに多く発現する遺伝子のプロファイルを分類する段階、及び（４）、（１）、（２）及び（３）段階において得た遺伝子プロファイルを比較して、前記３プロファイル全てに存在する遺伝子を非形質転換状態から形質転換された肺癌細胞形態に転換中である細胞のゲノムにおいてメチル化によって調節されるマーカー遺伝子と見なす段階を含む方法が挙げられる。
【００１９】
本発明において、肺癌細胞株のゲノムＤＮＡから前記スクリーニング法でスクリーニングされた肺癌特異的発現減少遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子は５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のＣｐＧアイランドがメチル化されていた。
【００２０】
他の観点において、本発明は一つ以上のメチル化されたＣｐＧアイランドを含有して、配列番号２〜３のうちいずれか一つの塩基配列で表される肺癌診断用バイオマーカーに関する。
【００２１】
本発明において、前記ＤＮＡ断片は肺癌特異的発現減少遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）由来であることを特徴とする。
【００２２】
本発明において、肺癌特異的発現減少遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域は肺癌細胞株において具体的にＲ１（配列番号２）、Ｒ２（配列番号３）及びＲ３（配列番号４）領域がメチル化されていた。
【００２３】
本発明の一様態において、肺癌患者の肺癌組織のＲ１、Ｒ２及びＲ３領域において非常に高い程度のメチル化レベルを示し、互いに対になる肺癌組織と隣接部位の正常組織におけるメチル化程度はＲ１の場合４０個の臨床検体中３４個と高く８５％を占め、R３の場合は３６個と９０％であった。ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１、Ｒ２及びＲ３領域の過剰メチル化を測定することによって肺癌を効率的に診断できるとことを示す。
【００２４】
さらに他の観点において、本発明は（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する段階、及び（ｂ）前記分離したＤＮＡからＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）遺伝子の５’ＵＴＲまたはエクソン１領域のメチル化を検出する段階を含む肺癌、またはその進行段階の検出方法に関する。
本発明において、メチル化の検出は配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される配列を有するＤＮＡ領域において行われるのを特徴とする。
【００２５】
本発明において、前記メチル化測定方法は、ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ（real time methylation specific PCR）、メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＤＮＡチップ基盤検出方法、パイロシーケンシング及びバイサルファイトシーケンシングからなる群から選択されるのを特徴とし、前記臨床サンプルは癌の疑いのある患者または診断対象由来の組織、細胞、血液または尿であることを特徴とする。
【００２６】
本発明の実施の形態で使われた、メチル化バイオマーカー遺伝子の選別方法により肺癌だけでなく、肺癌に進行中の多種異形症段階において多様にメチル化される遺伝子を探し出せ、選別された遺伝子は肺癌スクリーニング、危険性評価、予測、病名確定（disease identification）、疾病のステージ診断及び治療ターゲットの選定にも使用可能である。
【００２７】
肺癌及び多くの段階の異常においてメチル化された遺伝子を確認するのは、正確でかつ効果的に肺癌を早期診断することが可能であり、多重遺伝子を使用したメチル化プロファイル確立及び治療のための新しいターゲットを確認できる。さらに、本発明によるメチル化データは他の非メチル化関連バイオマーカー検出方法と連係するとより一層正確な肺癌診断システムが確立できる。
【００２８】
本発明の方法により、検体から得られた一つ以上の核酸バイオマーカーのメチル化段階を決めることを含むあらゆる段階（stage）またはフェーズ（phase）の肺癌進行を診断することができる。肺癌の各段階の検体から分離した核酸のメチル化段階を肺組織の細胞増殖性異常を持たない検体から得られた一つ以上の核酸のメチル化段階と比較して、検体の肺癌の特定段階を確認できる。前記メチル化段階は過剰メチル化であってもよい。
【００２９】
本発明の一例として、核酸は遺伝子の調節部位においてメチル化できる。他の例において、メチル化は遺伝子の調節部位の外側から始まって、内部に進行されるため、調節部位の郊外周辺においてメチル化を検出することで細胞形質転換に関わる遺伝子を早期診断することができる。
【００３０】
他の例として、本発明においてはＰＣＤＨＧＡ１２（ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）遺伝子５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のメチル化状態をキットを利用して検出することによって、検体に存在する肺組織の細胞成長性異常（異形症）を診断することができる。
【００３１】
本発明の診断用キットを利用すると、検体の肺組織の細胞成長性異常（異形症進行度）を決められる。前記方法は検体から分離した一つ以上の核酸のメチル化状態を決めることを含み、前記一つ以上の核酸のメチル化段階は肺組織の細胞成長性異常傾向（異形症）がない検体から分離した核酸のメチル化段階と比較することを特徴とする。
【００３２】
本発明の他の実施の形態においては、前記メチル化遺伝子マーカーを利用して肺癌を形成する可能性がある細胞の早期診断を可能にする。癌細胞においてメチル化されると確認された遺伝子が臨床的にまたは形態学的に正常と見られる細胞においてメチル化されると、前記正常と見られる細胞は癌化が進行しているものである。従って、正常と見られる細胞における肺癌特異的遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域がメチル化されるのを確認することによって肺癌を早期診断することができる。
【００３３】
本発明のメチル化マーカー遺伝子を利用すると、検体から肺組織の細胞成長性異常（異形症進行）を検出することができる。前記方法は検体から分離した一つ以上の核酸を含む試料を一つ以上のメチル化状態を決定できる製剤と接触させることを含む。前記方法は一つ以上の核酸において一つ以上の領域のメチル化状態を確認することを含み、前記核酸のメチル化状態は肺組織の細胞成長性異常（異形症進行）を持たない検体の核酸における同じ領域のメチル化状態と差があることを特徴とする。
【００３４】
本発明のまた他の実施の形態においては正常表現型を現わすサンプルを利用して、前記キットを利用して、マーカー遺伝子５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のメチル化を調べることによって、肺癌に進行される可能性を診断することができる。前記サンプルは固体または液体組織、細胞、尿、血清または血漿を使用できる。
【００３５】
本発明において、前記遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のメチル化の有無を検出する方法は次の段階を含む：（ａ）臨床サンプルからサンプルＤＮＡを分離する段階、（ｂ）前記分離したＤＮＡを亜硫酸水素（bisulfite）で処理する段階、（ｃ）ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のＣｐＧを含む断片を増幅できるプライマーを使用して増幅する段階、及び（ｄ）前記（ｃ）段階において増幅された結果を利用してパイロシーケンシングを行ってメチル化するか否かを決める段階。
【００３６】
本発明の一様態において、前記検出方法はキットを用いて行うことができる。本発明の検出方法に使用されるキットはサンプルを入れる区切られたキャリア手段、非メチル化シトシンを敏感に切断する製剤を含有する１番目の容器、ＣｐＧ含有核酸を増幅するためのプライマーを含有する２番目の容器、及び切断されたまたは切断されない核酸の存在を検出する手段が含まれている３番目の容器を含む一つ以上の容器を含む。本発明において使用されるプライマーは配列番号５〜２１に記載された配列、機能的組合せ及びその断片を含む。機能的組合せまたは断片はゲノム上においてメチル化が起きたか否かを検出するプライマーとして使用される。前記キャリア手段は瓶、チューブのような一つ以上の容器を含有するのに適しており、各容器は本発明の方法に使用される独立的構成要素等を含有する。本発明の明細書において、当該分野において通常の知識を有する者は容器中の必要な製剤を分配できる。例えば、メチル化感受性制限酵素を含有する容器を一つの容器で構成することができる。一つ以上の容器は重要核酸ローカスと相同性を有するプライマーを含むことができる。また、一つ以上の容器はメチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーを含むことができる。
【００３７】
本発明の他の様態において、前記キットを利用して、肺癌を検出する方法は、（１）臨床サンプルからゲノムＤＮＡを分離する段階、（２）前記分離したゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で処理する段階、（３）前記メチル化感受性制限酵素で処理されたゲノムＤＮＡを本発明の肺癌診断用バイオマーカーを増幅させられるプライマーを使用して増幅させる段階、及び（４）前記増幅された産物から肺癌診断用バイオマーカーの存在の有無を判別する段階を経て、バイオマーカー断片が存在する試料を肺癌または肺癌進行段階の試料として診断できて、前記キットは含まれたプライマーを利用したＰＣＲ増幅産物の有無を確認するために肺癌診断用バイオマーカーと厳しい条件でハイブリダイゼーションできる断片をさらに含有してもよい。
【００３８】
また、前記肺癌診断用バイオマーカーの存在の有無を判別する方法としては、バイサルフェート・シークエンス（bisulfate sequencing）、パイロシーケンシング（pyrosequencing）、メチル化特異的ＰＣＲ、メチルライト法（Methylight）、メチル化ＤＮＡ結合（methylated DNA binding）蛋白質を利用したＰＣＲ及びＤＮＡチップなどを使用できる。
【００３９】
本発明において使用された「細胞形質転換」は正常から非正常に、非腫瘍性から腫瘍性に、未分化から分化に、幹細胞から非幹細胞のように細胞の特徴がある形態から他の形態に変わることを意味する。さらに、前記形質転換は細胞の形態、表現型、生化学的性質などによって認識される。
【００４０】
本発明において癌の「早期確認」は、転移する前に癌の可能性を発見することであり、望ましくは検体組織または細胞において形態学的変化が観察される前に発見することである。さらに、細胞形質転換の「早期確認」は細胞が形質転換される形態になる前に初期段階において形質転換が起きる可能性高いことをいう。
【００４１】
本発明において「ハイポメチル化」はＣｐＧアイランドのメチル化を意味する。本発明において、「サンプル」または「検体サンプル」、「臨床検体」、「臨床サンプル」は行われる分析の種類によって、個々人、体液、細胞株、組織培養などから得られる全ての生物学的サンプルを含む幅広い範囲のサンプルを意味する。ほ乳動物から体液及び生検を獲得する方法は通常広く知られている。望ましいソースは肺の生検（biopsy）である。
【００４２】
メチル化バイオマーカーのスクリーニング
本発明においては細胞または組織が形質転換されたり細胞の形態が異なる形態に変化する時にメチル化されたバイオマーカー遺伝子をスクリーニングした。ここで、「形質転換」細胞は正常形態が非正常形態に、非腫瘍性が腫瘍性に、未分化形態が分化形態に変わるなどの細胞または組織の形態が異なる形態に変化することを意味する。
【００４３】
従って、本発明においては肺癌細胞への形質転換においてメチル化調節マーカー遺伝子を体系的な方法で確認した。前記方法の一様態で、（１）形質転換された細胞株及び非形質転換された細胞株を対象にメチル化特異的結合蛋白質のＭＢＤ２ｂｔを利用してメチル化されたＤＮＡだけを選択分離する段階、（２）各々のＤＮＡを増幅して蛍光染料で標識する段階、（３）蛍光染料で標識されたＤＮＡをメチル化を測定できるマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせる段階、（４）ハイブリダイゼーション結果から形質転換細胞から過剰メチル化された遺伝子を選別する段階、（５）形質転換された肺癌組織細胞及び隣接部位の非形質転換組織細胞の遺伝子発現プロファイルを比較して、非形質転換組織細胞にさらに多く発現する遺伝子のプロファイルを分類する段階、（６）形質転換された肺癌細胞株をメチル化阻害剤で処理し、処理しない形質転換された肺癌細胞株と比較して、メチル化阻害剤処理した形質転換された肺癌細胞株においてさらに多く発現する遺伝子のプロファイルを分類する段階、及び（７）、（５）段階及び（６）段階で得た遺伝子プロファイルを比較して、前記３プロファイルに共通的に存在する遺伝子を非形質転換状態で形質転換された肺癌細胞形態に転換中の細胞のゲノムでメチル化によって、調節されるマーカー遺伝子と見なす段階を含む方法が挙げられる。
【００４４】
本発明において、「核酸」または「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポルリヌクレオチドを意味したり、これらの断片、一本鎖または二重鎖のゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、センスまたはアンチセンス鎖のゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡ（peptide nucleic acid）または自然起源または合成起源のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質をいう。核酸がＲＮＡであると、デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＴの代わりに、各々リボヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＵに代替されるということは当該分野において通常の知識を有する者には自明である。
【００４５】
互いに異なってメチル化されたＣｐＧアイランドの存在を検出できる核酸ならいずれのものも使用できる。前記ＣｐＧアイランドは核酸配列においてＣｐＧが豊富な部位である。
【００４６】
メチル化（methylation）
本発明において精製されたり、精製されない形態のいかなる核酸も使用でき、ターゲット部位（例えば、ＣｐＧ−含有核酸）を含有する核酸配列を含有していたり、含有すると推定されるいかなる核酸も使用できる。区別されてメチル化できる核酸部位がＣｐＧアイランドであり、これは他のジヌクレオチドＣｐＧ核酸部位と比較して高いＣｐＧ密度を持つ核酸配列である。二重（doublet）ＣｐＧはＧ*Ｃ塩基対の割合で予測した時、脊椎動物ＤＮＡにおいて２０％程度の確率である。特定部位において、二重ＣｐＧの密度はゲノムの他の部位と比較して、さらに１０倍も高い。ＣｐＧアイランドは平均Ｇ*Ｃ割合が約６０％で、普通のＤＮＡのＧ*Ｃ割合は平均４０％を示す。ＣｐＧアイランドは典型的に約１〜２ｋｂの長さを持って、ヒトゲノムには約４５，０００個のＣｐＧアイランドが存在する。
【００４７】
多くの遺伝子において、ＣｐＧアイランドはプロモーターのアップストリーム（upstream）から始まって、ダウンストリームの転写部位まで拡張される。プロモーターにおいてＣｐＧアイランドのメチル化は、通常、遺伝子の発現を抑制させる。ＣｐＧアイランドはまた、遺伝子コーディング領域の３'領域だけでなく、遺伝子コーディング領域の５'領域を囲んでいてもよい。従って、ＣｐＧアイランドはプロモーター領域を含む調節部位のコーディング配列アップストリーム、コーディング領域（例えば、エクソン領域）、コーディング領域のダウンストリーム、例えば、インヘンス領域及びイントロンを含む多くの領域において発見される。
【００４８】
通常、ＣｐＧ−含有核酸はＤＮＡである。しかし、本発明の方法は、例えば、ＤＮＡまたはＤＮＡとｍＲＮＡを含むＲＮＡを含有する試料を適用でき、ここでＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二重鎖であってもよく、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含有した試料であってもよい。
【００４９】
さらに核酸混合物も使用できる。検出される特異的な核酸配列は大きい分子の分画であってもよく、初めから特異配列が全体核酸配列を構成する分離した分子形態で存在することができる。前記核酸配列は純粋な形態で存在する核酸である必要はなく、核酸は全体ヒトＤＮＡが含まれているように複雑な混合物内の少ない分画であってもよい。試料に含まれた核酸のメチル化程度を測定するのに使用されたり、メチル化されたＣｐＧアイランドを検出するのに使用される試料に含まれた核酸はＳａｍｂｒｏｏｋなど（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989）に記載された多様な方法で抽出される。
【００５０】
核酸は情報をコードしたり核酸の転写を調節するＤＮＡ領域の調節部位を含んでもよい。調節部位は少なくとも一つのプロモーターを含む。「プロモーター」は転写を指示するのに必要最低限の配列であり、プロモーター依存性遺伝子で細胞タイプ特異的、組織特異的または外部シグナルや製剤による誘導性を調節することができる。プロモーターは遺伝子の５'または３'領域に位置する。プロモーター部位の全体または一部分の核酸数はＣｐＧアイランド部位のメチル化を測定するのに適用される。ターゲット遺伝子プロモーターのメチル化は外部から内部に進行する。従って、細胞転換の初期段階はプロモーター部位の外部におけるメチル化を分析することによって検出することができる。
【００５１】
検体から分離した核酸は検体の生物学的試料から得られる。肺癌や肺癌の進行段階を診断したいのであれば、スクレイピングや生検で肺組織から核酸を分離しなければならない。このような試料は当該分野において知らされた様々な医学的処置を介して得られる。
【００５２】
本発明において、「過剰メチル化」または「ハイパーメチル化」とは腫瘍細胞の特定ＣｐＧ位置またはＣｐＧで構成された特定塩基配列の部位におけるメチル化程度が正常細胞に比べて高い状態を示す。
【００５３】
サンプル（sample）
本発明は肺癌の早期確認に対し記述しており、肺癌特異的遺伝子メチル化を利用している。肺癌特異的遺伝子のメチル化は腫瘍部位の付近の組織においても起きた。従って、肺癌の早期確認方法は液体または固体組織を含む全てのサンプルで肺癌特異的遺伝子プロモーターのメチル化の有無を確認できる。前記サンプルは喀痰、血清または血漿を含むが、これに限定されない。
【００５４】
メチル化検出方法
差別的メチル化の検出−メチル化特異的ＰＣＲ
ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理すると、５'−ＣｐＧ'−３部位のシトシンがメチル化された場合にはそのままシトシンとして残り、非メチル化された場合にはウラシルに変わるようになる。従って、バイサルファイト処理後変換された塩基配列を対象に５'−ＣｐＧ−３'塩基配列が存在する部位に該当するＰＣＲプライマーを製作した。この時、メチル化された塩基配列に相当するＰＣＲプライマーと非メチル化された塩基配列に相当する二つの種類のプライマーを製作した。ゲノムＤＮＡをバイサルファイトで変換させた後、前記二つの種類のプライマーを利用してＰＣＲを行うと、メチル化された場合にはメチル化された塩基配列に該当するプライマーを使用したものからＰＣＲ産物が作られるようになり、逆に非メチル化である場合には非メチル化に該当するプライマーを使用したものからＰＣＲ産物が作られる。メチル化の有無はアガロースゲル電気泳動法で定性的に確認できる。
【００５５】
差別的メチル化の検出−リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ
リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲはメチル化特異的ＰＣＲ法をリアルタイム測定方法で転換したものであり、ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理した後、メチル化された塩基配列に相当するＰＣＲプライマーをデザインして、これらプライマーを利用して、リアルタイムＰＣＲを行うものである。この時、増幅された塩基配列と相補的なＴａｎＭａｎプローブを利用して、検出する方法とサイバーグリーン（Sybergreen）を利用して、検出する２種類の方法がある。従って、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲはメチル化されたＤＮＡだけを選択的に定量分析できる。この時、ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化されたＤＮＡサンプルを利用して標準曲線を作成し、標準化のため塩基配列内に５'−ＣｐＧ−３'配列がない遺伝子を陰性対照群として共に増幅してメチル化程度を定量分析した。
【００５６】
差別的メチル化の検出−パイロシーケンシング
パイロシーケンシング法はバイサルファイトシーケンシング法を定量的であるリアルタイムシーケンシングに変換した方法である。バイサルファイトシーケンシング同様、ゲノムＤＮＡをバイサルファイト処理して、転換させた後、５'−ＣｐＧ−３'塩基配列がない部位に相当するＰＣＲプライマーを製作した。ゲノムＤＮＡをバイサルファイトで処理した後、前記ＰＣＲプライマーで増幅した後、シーケンシングプライマーを利用して、リアルタイム塩基配列分析を行った。５'−ＣｐＧ−３'部位においてシトシンとチミンの量を定量的に分析してメチル化程度をメチル化指数で示した。
【００５７】
差別的メチル化の検出−メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲまたは定量ＰＣＲ及びＤＮＡチップ
メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲまたはＤＮＡチップ法はメチル化ＤＮＡにだけ特異的に結合する蛋白質をＤＮＡと混ぜると、メチル化ＤＮＡにだけ特異的に蛋白質が結合するためメチル化ＤＮＡだけを選択的に分離することができる。ゲノムＤＮＡをメチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質と混ぜた後、メチル化されたＤＮＡだけを選択的に分離した。この分離したＤＮＡをプロモーター部位に該当するＰＣＲプライマーを利用して増幅した後、アガロース電気泳動でメチル化の有無を測定した。
【００５８】
また、定量ＰＣＲ法でもメチル化の有無を測定でき、メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質で分離したメチル化ＤＮＡは蛍光染料で標識して、相補的なプローブが集積されたＤＮＡチップにハイブリダイゼーションさせることでメチル化の有無を測定することができる。ここで、メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質はＭｃｒＢｔに制限されない。
【００５９】
差別的メチル化の検出−メチル化感受性制限酵素
差別的メチル化の検出はメチル化されないＣｐＧ部位だけを切断するメチル化感受性制限酵素と核酸サンプルを接触させて非メチル化された核酸を切断することで行える。
【００６０】
別の反応で、前記サンプルをメチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を皆切断するメチル化感受性制限酵素のアイソシゾマー（isoschizomer）と接触させて、メチル化された核酸を切断した。
【００６１】
特異的プライマーを核酸サンプルに添加して、通常の方法で核酸を増幅させた。メチル化感受性制限酵素を処理したサンプルにおいて増幅産物が存在して、メチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を全て切断するメチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーを処理したサンプルで増幅産物が存在しなければ、分析された核酸部位にメチル化が起きたこととなる。しかし、メチル化感受性制限酵素を処理したサンプルで増幅産物が存在せず、メチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を全て切断するメチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーを処理したサンプルにおいても増幅産物が存在しないということは分析された核酸部位にメチル化が起きなかったこととなる。
【００６２】
ここで、「メチル化感受性制限酵素」は認識部位にＣＧを含んで、Ｃがメチル化ならなかった時と比較してＣがメチル化された時活性を持つ制限酵素である（例えば、ＳｍａＩ）。メチレーション感受性制限酵素の非制約的例として、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ及びＮｏｔＩが含まれる。前記酵素は単独でまたは組み合わせて使用できる。他のメチレーション感受性制限酵素は、例えば、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩが挙げられるが、これに限定されるのではない。
【００６３】
メチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーはメチレーション感受性制限酵素と同じ認識部位を有する制限酵素であるが、メチル化されたＣＧｓと非メチル化されたＣＧｓを全て切断し、例えば、ＭｓｐＩが挙げられる。
【００６４】
本発明のプライマーは増幅されるローカスの各鎖と「実質的に」相補性を持つように製作されて、前記において説明した通り、適当なＧまたはＣヌクレオチドを含む。これは重合反応を行う条件でプライマーが対応する核酸鎖とハイブリダイゼーションされるには十分な相補性を持つことを意味する。本発明のプライマーは増幅過程に使用され、前記増幅過程は、例えば、ＰＣＲと同じターゲットローカスが多くの反応段階を経ながら、幾何級数的な数に増加する酵素連続反応である。典型的には、あるプライマー（アンチセンスプライマー）はローカスのネガティブ（−）鎖に対し相同性を有し、残り一つのプライマー（センスプライマー）はポジティブ（＋）鎖に対し相同性を有する。変成された核酸にプライマーがアニーリングされると、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Klenow）及びヌクレオチドのような酵素及び反応物によって鎖が伸張し、その結果、ターゲットローカス配列を含有する＋と−鎖が新しく合成される。前記新しく合成されたターゲットローカスが鋳型としても使用されて、変成、プライマーアニーリング及び鎖身長のサイクルが繰り返されるとターゲットローカス配列の幾何級数的な合成が進行される。前記連続反応の産物は反応に使用された特異プライマーの末端と対応する末端を持つ独立的な二重鎖核酸である。
【００６５】
前記増幅反応は当該分野において普遍的に使用されているＰＣＲであることが望ましい。しかし、リアルタイムＰＣＲまたは等温酵素を使用した線形増幅のような代替的な方法も使用でき、マルチプレックス増幅反応も使用できる。
【００６６】
差別的メチル化の検出−バイサルファイトシーケンシング法
メチル化ＣｐＧを含有した核酸を検出する他の方法は、核酸を含有した試料を非メチル化シトシンを変形させる製剤と接触させる段階、及びＣｐＧ−特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して試料のＣｐＧ−含有核酸を増幅させる段階を含む。ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーは変形されたメチル化及び非メチル化核酸を区別してメチル化核酸を検出することを特徴とする。前記増幅段階は選択的であり、望ましいが必須ではない。前記方法は変形された（例えば、化学的に変形された）メチル化及び非メチル化ＤＮＡを区別するＰＣＲ反応に依存するものである。前記のような方法は米国特許５，７８６，１４６に開示されており、前記特許にはメチル化核酸の検出のためのバイサルファイトシーケンシングと関連付けられて記載されている。
【００６７】
基質
ターゲット核酸部位が増幅されると核酸配列の存在を検出するために、前記核酸増幅産物は固体支持体（基質）に固定された、周知の遺伝子プローブとハイブリダイゼーションできる。
【００６８】
ここで、「基質」は物質、構造、表面または材料、非生物学的であり、合成されて、無生物、平面、球形または特異的結合、平らな表面の物質を含む混合物手段で、ハイブリダイゼーションまたは酵素認識部位または大多数の他の認識部位または表面、構造または材料で構成された数多くの他の分子種を越える数多くの他の認識部位を含むことができる。前記基質は、例えば、半導体、有機合成メタル、合成半導体、インシュレーター及びドーパント；金属、合金、元素、化合物及びミネラル；合成・分解・エッチングされ、リソグラフされ、プリント・マイクロファブリケーションされたスライド、装置、構造及び表面；産業的、ポリマー、プラスチック、メンブレン、シリコン、シリケート、ガラス、金属及びセラミック；木、紙、カードボード、綿、ウール、布、製織及び非製織繊維、材料及びファブリックであってもよいが、これに限定されるのではない。
【００６９】
いくつかの形態のメンブレンは当該分野において核酸配列に対し付着力を持つと知られている。このようなメンブレンの特異的でかつ非制約的な例としては、ニトロセルロースまたはポリビニルクロライド、ジアゾ化（diazotized）ペーパー及びＧＥＮＥＳＣＲＥＥＮＴＭ、ＺＥＴＡＰＲＯＢＥＴＭ（Biorad）及びＮＹＴＲＡＮＴＭなどの商業的に使用されるメンブレンのような遺伝子発現検出用メンブレンが挙げられる。ビーズ、ガラス、ウェハー及び金属基質も含まれる。このような目的物に核酸を付着させる方法は当該分野においてよく知られている。これと異なって、液体相においてもスクリーニングを行うことができる。
【００７０】
ハイブリダイゼーション条件
核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のストリンジェントなレベルを達成するために使用される条件はハイブリダイズされる核酸の性質によって多様である。例えば、ハイブリダイゼーションされる核酸部位の長さ、相同性程度、ヌクレオチド配列造成（例えば、ＧＣ／ＡＴ造成比）及び核酸タイプ（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）などがハイブリダイゼーション条件の選択において考慮される。さらなる考慮条件は核酸が、例えば、フィルターなどに固定化されているか否かである。
【００７１】
非常に厳しく設定される条件の例は次のようになる：室温の２Ｘ ＳＳＣ／０.１％ ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）、室温の０.２Ｘ ＳＳＣ／０.１％ ＳＤＳ（ストリンジェントが低い条件）、４２℃での０.２Ｘ ＳＳＣ／０.１％ ＳＤＳ（普通のストリンジェントを持つ条件）、６８℃での０.１Ｘ ＳＳＣ（ストリンジェントが高い条件）。
【００７２】
洗浄過程はこれらの中一つの条件を使用して行うことができて、例えば、ストリンジェントが高い条件、または前記条件を各々使用できて、前記記載された順に各々１０〜１５分ずつ、前記記載された条件を全部または一部繰り返して行うことができる。しかし、前記に記述した通り、最適条件は含まれた特別なハイブリダイゼーション反応により多様で、実験を介して決められる。一般に、重要なプローブのハイブリダイゼーションにはストリンジェントが高い条件が使用される。
【００７３】
標識（Label）
重要なプローブは検出することができるように標識され、例えば放射線同位元素、蛍光化合物、バイオ発光化合物、化学発光化合物、金属キレートまたは酵素で標識される。前記のようなプローブを適当に標識するのは当該分野において広く知られた技術であり、通常の方法で行える。
【００７４】
キット（Kit）
本発明によると、検体の細胞成長性異常を検出するのに有用なキットを提供している。本発明のキットはサンプルを入れる区切られたキャリア手段、非メチル化シトシンを敏感に切断する製剤を含有する１番目の容器、ＣｐＧ含有核酸を増幅するためのプライマーを含有する２番目の容器、及び切断されたまたは切断されない核酸の存在を検出する手段が含まれている３番目の容器を含む一つ以上の容器を含む。本発明によって使用されるプライマーは配列番号５〜２１に記載された配列、機能的組合せ及びその断片を含む。機能的組合せまたは断片はゲノム上でメチル化が起きたか否かを検出するプライマーとして使用される。
【００７５】
キャリア手段は瓶、チューブのような一つ以上の容器を含有するのに適しており、各容器は本発明の方法に使用される独立的構成要素を含有する。本発明の明細書において、当分野の通常の知識を有する者は容器中の必要な製剤を分配することができる。例えば、メチル化感受性制限酵素を含有する容器を一つの容器で構成することができる。一つ以上の容器は重要核酸ローカスと相同性を持つプライマーを含むことができる。また、一つ以上の容器はメチル化感受性制限酵素のアイソシゾマーを含むことができる。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例によって、より一層詳細に説明する。この実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこの実施例に限定されないことは当業界において通常の知識を有する者には自明である。
【００７７】
［実施例１］肺癌細胞株において過剰メチル化されている遺伝子の選別
肺癌において過剰メチル化された遺伝子を選別するために肺癌細胞株Ａ５４９（韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢ）１０１８５）と正常肺細胞株ＮＨＢＥ（Ｃａｍｂｒｅｘ ｃｃ−２５４１）を利用して過剰メチル化された遺伝子を下記の方法で選別した。
【００７８】
先ず、各細胞株のｇＤＮＡ ５００μｇを超音波（sonication）方法（Ｖｉｂｒａ Ｃｅｌｌ、ＳＯＮＩＣＳ）で３００〜４００ｂｐの大きさの切片にし、Ｍｅｔｈｙｌｃａｐｔｕｒｅ(商標)（Ｇｅｎｏｍｉｃｔｒｅｅ、韓国）を利用して、プロトコルに準じて、各細胞株からメチル化ＤＮＡを選択的に分離した。分離したメチル化ＤＮＡをＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ(商標) Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を使用して増幅した後、Ａ５４９及びＮＨＢＥ由来増幅されたメチル化ＤＮＡを各々Ｃｙ５−ｄＵＴＰとＣｙ３−ｄＵＴＰで標識して混合した後、ヒト遺伝体に存在する２７，８００個余りのＣｐＧアイランドに存在するＣｐＧに対するプローブが集積されているＣｐＧマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ、製造国）にＡｇｉｌｅｎｔプロトコルにより混成化反応及びスキャニングを行って、統計的技法を介してＡ５４９において過剰メチル化された候補遺伝子を５０個選別した（図１及び表１）。
【００７９】
【表１】
【００８０】
［実施例２］肺癌組織からメチル化によって発現が抑制される遺伝子選別
肺癌組織からメチル化によって発現が抑制される遺伝子を選別するために、マイクロアレイハイブリダイゼーションを行った。マイクロアレイハイブリダイゼーションは標準プロトコルを利用して行った（Schena et al., Science, 270:467, 1995）。
【００８１】
肺癌患者から対を成すように腫瘍付近組織及び腫瘍組織を分離して、これからトータルＲＮＡを分離した。前記対となった腫瘍付近組織及び腫瘍組織の遺伝子発現レベルの相対的な差を間接的に比較するために、標準比較ＲＮＡ（間接比較）を製作した。標準比較ＲＮＡを製作するために、肺癌細胞株Ａ５４９（韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢ）１０１８５）、胃癌細胞株ＡＧＳ（ＫＣＬＢ ２１７３９）、腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−２（ＫＣＬＢ ３００４７）、結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＫＣＬＢ １０２４７）、子宮頸部癌細胞株Ｈｅｌａ（ＫＣＬＢ １０００２）、血液癌細胞株ＨＫ−６０（ＫＣＬＢ １０２４０）及びＨＴ１０８０（ＫＣＬＢ １０１２１）、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１（ＫＣＬＢ ３００２６）、肝臓癌細胞株ＳＫ−ｈｅｐ１（ＫＣＬＢ ３００５２）、Ｔ細胞由来細胞株Ｍｏｌｔ−４（ＫＣＬＢ ２１５８２）及び脳癌細胞株Ｕ−８７ＭＧ（ＫＣＬＢ ３００１４）等１１個のヒト癌細胞株からトータルＲＮＡを分離した。細胞株及び肺組織の全体ＲＮＡはＴｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を使用して分離した。
【００８２】
標準比較ＲＮＡを製作するために、前記１１個の細胞株から分離したトータルＲＮＡを同量に混合して、内部対照群として使用した。
【００８３】
前記対を成した腫瘍付近組織及び腫瘍組織の相対的遺伝子発現程度を比較するために、非腫瘍及び腫瘍組織から分離したＲＮＡと標準比較ＲＮＡを間接的に比較した。トータルＲＮＡ １００μｇをＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰで標識した。前記標準比較ＲＮＡをＣｙ３で標識し、肺組織から分離したＲＮＡをＣｙ５で標識した。前記Ｃｙ３−及びＣｙ５−で標識されたｃＤＮＡをＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を使用して精製した後、前記精製されたｃＤＮＡを混合して、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、ＵＳＡ）を利用して、最終体積が２７μＬになるよう濃縮した。
【００８４】
ハイブリダイゼーション反応液８０μＬ（前記標識されたｃＤＮＡターゲット２７μＬ、２０Ｘ ＳＳＣ ２０μＬ、１％ ＳＤＳ ８％、ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）２４μＬ及びヒトＣｏｔ１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、ＵＳＡ)２０μｇを１００℃で２分間加熱して、直ちにヒト２２Ｋオリゴヌクレオチド（ＧｅｎｏｍｉｃＴｒｅｅ，Ｉｎｃ．、韓国）マイクロアレイにハイブリダイズさせた。前記ハイブリダイゼーションは湿度調節されたＨｙｂＣｈａｍｂｅｒ Ｘ（ＧｅｎｏｍｉｃＴｒｅｅ，Ｉｎｃ．、韓国）で４２℃で１２〜１６時間行った。前記ハイブリダイゼーション終了後、マイクロアレイスライドをＡｘｏｎ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を利用して判読した。シグナル及びバックグラウンドの蛍光強度はＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ４.０ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して、ターゲット部位内部の全てのピクセルの強度を平均して各プローブに対して測定した。明らかに非正常性を示すスポットは分析から除外した。全てのデータはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ７.２（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を利用して、正規化、統計学的分析及びクラスタ分析を行った。
【００８５】
また、非腫瘍及び腫瘍組織の遺伝子発現レベルの相対的な差を決めるために、間接比較のための統計学的分析（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０.０１）を行った。前記統計学的分析結果から対にされた腫瘍付近組織と比較して、腫瘍組織において２５２個の遺伝子が下降調節（down regulated）された。
【００８６】
［実施例３］脱メチル化によって再活性化される遺伝子選別
実施例１において確認された遺伝子の発現が遺伝子のプロモーターメチル化によって調節されるのか確認するために、肺癌細胞株Ａ５４９（ＫＣＬＢ(韓国細胞株銀行)１０１８５）及びＮＣＩ−Ｈ３５８（ＫＣＬＢ ９０３５８）にジメチル化剤である５−アザ−２−デオキシシチジン（ＤＡＣ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）で２００ｎＭ濃度で３日間処理した。処理しない細胞株と処理した細胞株をＴｒｉ ｒｅａｇｅｎｔで処理してトータルＲＮＡを分離した。
【００８７】
ＤＡＣ処理による遺伝子発現変化を測定するために、非処理細胞株と処理細胞株との間の転写レベルを直接的に比較した。その結果、ＤＡＣ処理しない対照群と比べて、ＤＡＣ処理した場合３６７個の遺伝子が発現上昇することを確認した。前記実施例１で獲得した２５２個の腫瘍抑制遺伝子プロファイルと３６７個のジメチル化によって、２倍以上再発現された遺伝子を比較した結果、１８個の共通した遺伝子を確認した（図１）。
【００８８】
［実施例４］肺癌から過剰メチル化された遺伝子ＰＣＤＨＧＡ１２選別
前記１８個の遺伝子のプロモーター部位においてＣｐＧアイランドの存在を確認するために、ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ（http://itsa.ucsf.edu/~urolab/methprimer/index1.html）を利用した。前記１８個の遺伝子中１３個の遺伝子はＣｐＧアイランドを持っていなかったため、前記１３個の遺伝子を共通遺伝子プロファイルから除外した。従って、前記５個の遺伝子中実施例１のＣｐＧマイクロアレイ分析で選別された５０個の遺伝子に含まれているＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子を最終肺癌関連メチル化バイオマーカーで選別した。選択されたＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子は肺癌細胞株において過剰メチル化されており、肺癌組織において下降調節されて（down-regulated）、ジメチル化条件で再活性化され（up-regulated）、プロモーターと５’ＵＴＲ、及びエクソン１にＣｐＧアイランドを含有している多様な条件を満たすことが分かった（表２）。
【００８９】
【表２】
【００９０】
［実施例５］肺癌におけるＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化領域探索
（１）バイサルファイト（bisulfite）クローナルシーケンシングを利用した探索
Ａ５４９及びＮＨＢＥ細胞株を利用して、バイサルファイトクローナルシーケンシング方法でＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域でのメチル化程度を調べた（図２Ａ）。バイサルファイト（bisulfite）を利用してメチル化されないシトシンをウラシルに変形するために、正常細胞株ＮＨＢＥ及び肺癌細胞株Ａ５４９（ＫＣＬＢ １０１８５）から全体ゲノムＤＮＡを分離して、その中ゲノムＤＮＡ ２００ｎｇにＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を利用して、バイサルファイト処理した。ＤＮＡをバイサルファイトで処理すると、非メチル化されたシトシンはウラシルに変形されて、メチル化されたシトシンは変化せずに残るようになる。
前記バイサルファイト処理されたＤＮＡを滅菌蒸溜水２０μＬで湧出させた後、ゲノムＤＮＡ ２０ｎｇを利用して、表３に示した塩基配列を持つプライマーを使用して、ＰＣＲ方法で図２Ａに示したＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１、Ｒ２及びＲ３領域を増幅した。ＰＣＲは９４℃で１分、６６℃で１分、７２℃で１分間処理するのを１サイクルにし、合わせて４０回繰り返し、最終的に７２℃で１０分間伸張させた。
【００９１】
【表３】
【００９２】
前記ＰＣＲ反応を介して増幅されたＤＮＡを精製し、これをＴ／Ａクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）にクローニングした。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３増幅産物から作られたクローンの中各々１０個ずつを選択して、これに対する塩基配列を分析してメチル化の有無を判別した。その結果、ＮＨＢＥに比べてＡ５４９のＲ１、Ｒ２及びＲ３領域が相対的に高いレベルでメチル化されていることを確認した（図２Ｂ）。特に、Ｒ３領域のメチル化程度が最も顕著な差を見せるのを確認した。
【００９３】
（２）パイロシーケンシングを利用した探索
Ａ５４９及びＮＨＢＥ細胞株を利用して、パイロシーケンシング（pyrosequencing）方法でＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域におけるメチル化程度を調べた（図３）。バイサルファイト（bisulfite）を利用してメチル化されないシトシンをウラシルに変形するために、正常細胞株ＮＨＢＥ及び肺癌細胞株Ａ５４９（ＫＣＬＢ １０１８５）から全ゲノムＤＮＡを分離して、その中ゲノムＤＮＡ ２００ｎｇにＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を利用して、バイサルファイト処理した。ＤＮＡをバイサルファイトで処理すると、非メチル化されたシトシンはウラシルに変形されて、メチル化されたシトシンは変化せず残るようになる。
【００９４】
前記バイサルファイト処理されたＤＮＡを滅菌蒸溜水２０μＬで溶出させてパイロシーケンシングを行った。バイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ ２０ｎｇをＰＣＲを利用して増幅した。ＰＣＲは９４℃で１分、６６℃で１分、７２℃で１分間処理するのを１サイクルにして、合わせて４０回繰り返し、最終的に７２℃で１０分間伸張した。以後、ビオチンで標識された鋳型ＤＮＡを精製して、ＰｙｒｏＭａｒｋ ＩＤ（Ｂｉｏｔａｇｅ、スウェーデン）を利用して、塩基配列を分析した。ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子に対するパイロシーケンシングを行うための各部位に対するＰＣＲ及びシーケンシングプライマーはＰＳＱ ａｓｓａｙ ｄｅｓｉｇｎプログラム（Ｂｉｏｔａｇｅ、ＵＳＡ）を利用して設計した。ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子プロモーターのメチル化測定のためのＰＣＲ及びシーケンシングプライマーは表４の通りになる。
【００９５】
【表４】
【００９６】
ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の３個の領域に対する肺癌細胞株における過剰メチル化程度を調べてみるために正常細胞株ＮＨＢＥ（Ｃａｍｂｒｅｘ ＣＣ−２５４１）、肺癌細胞株Ａ５４９（ＫＣＬＢ １０１８５）の他にＮＣＩ−Ｈ１４６（ＫＣＬＢ ３０１７３）、ＮＣＩ−Ｈ３５８（ＫＣＬＢ ９０３５８）及びＨＣＣ１１９５（ＫＣＬＢ ７１１９５）等の肺癌細胞株を対象に実施例５同様にパイロシーケンシングを行った。その結果、全ての癌細胞株においてＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１、Ｒ２、Ｒ３領域で高い頻度で過剰メチル化され、特にＲ３領域における過剰メチル化は全ての肺癌細胞株で高く起きたことが分かった（図３）。
【００９７】
［実施例６］肺癌組織におけるＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化測定
前記実施例から確認された通り、肺癌細胞株において過剰メチル化されており、肺癌組織において発現が下降調節されて、ジメチル化条件で再活性化され、５’ＵＴＲ及びエクソン１にＣｐＧアイランドを含有しており、各種肺癌細胞株でＲ１、Ｒ２、Ｒ３領域に過剰メチル化されているＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子を利用して、肺癌診断用バイオマーカーで使用できるのか検証するために、健康な５人の肺組織と肺癌患者４０人の肺癌組織及びその隣接部位の正常組織臨床検体を利用してＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１とＲ３領域に対してメチル化アッセイを行った。メチル化アッセイはパイロシーケンシング方法を使用して、実施例５に記載された方法で行った。
【００９８】
その結果、図４に示したように、ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１とＲ３領域全てにおいて肺癌組織連隣接部位の正常組織におけるメチル化程度は患者でない正常組織におけるメチル化程度に類似するが、肺癌組織においては非常に高い程度のメチル化レベル（ｐ＝０.０００１）を示した。また、互いに対である肺癌組織と隣接部位の正常組織でのメチル化程度はＲ１の場合４０個の臨床検体中３４個と高く、８５％を占めし、Ｒ３の場合は３６個と９０％であった。従って、ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化は肺癌において非常に高い頻度で起きることが分かり、このような結果はＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化を測定することによって肺癌を効率的に診断できるとことを示す。
【００９９】
［実施例７］非侵襲的臨床検体である喀痰におけるＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化測定
肺癌患者の喀痰においても多様な遺伝子のＤＮＡ過剰メチル化が検出できるとの多くの報告があり、肺癌の早期及び再発有無を喀痰を利用する場合、患者便宜的診断が可能になるため、喀痰サンプルに含まれていた細胞におけるＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化程度を確認した。
【０１００】
５１人の正常なヒトの喀痰と８１人の肺癌患者の喀痰を対象にＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１、Ｒ２及びＲ３領域に対するパイロシーケンシングを実施例５と同様な方法で行った。その結果、正常なヒトの喀痰に比べて、肺癌患者の喀痰においてＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＲ１、Ｒ２及びＲ３領域の過剰メチル化程度が高く測定されることを確認した（図５）。
【０１０１】
また、ＲＯＣ（receiver operating calculatioｎ）カーブ分析を行った結果、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３領域のメチル化指数を各々１３.４９、１５.６２、２５.７７をメチル化指数基準（cut-off）に設定した時、喀痰を対象にした肺癌診断に対する感度（sensitivity）は各々７４.１％、７０.４％、８６.４％であり、これに対する特異度（specificity）は各々６６.７％、７８.４％、８２.４％と非常に優秀なことが明らかになった（表５）。従って、非侵襲的臨床検体の喀痰を利用してＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のＤＮＡ過剰メチル化を測定することによって肺癌の早期診断、再発の有無、薬品処理後のモニタリング及び術後の再発有無のモニタリングなど肺癌の多様な診断に適用できると判断される。
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
［実施例８］メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の過剰メチル化検出
肺癌診断の感度と特異度が最も優秀なＰＣＤＨＧＡ１２ Ｒ３領域を対象にＭｅｔｈｙｌＣａｐｔｕｒｅ(商標) ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｉｃｔｒｅｅ、韓国）を利用して過剰メチル化検出を行った。ＭｅｔｈｙｌＣａｐｔｕｒｅ(商標) ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔはメチル化されたＤＮＡに特異的に結合するＭＢＤ２ｂｔ蛋白質を利用してメチル化されたＤＮＡだけを選択的に分離した後、ＰＣＲ方法でメチル化を測定できるキットである。細胞株及び喀痰試料からゲノムＤＮＡを抽出し、抽出されたゲノムＤＮＡをＭｓｅＩ−ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ方法やｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを利用して、２００〜６００ｂｐの大きさに切片化した。これを２Ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、競合ＤＮＡ及びＨｉｓ−ＭＢＤ２ｂｔ蛋白質と混ぜて、４℃の条件で４時間反応させた。反応が終了した溶液にマグネチックビーズを添加して、４℃で４５分間反応させて、洗浄液で５回洗浄し、非特異的に結合をしているＤＮＡ切片を取り除いた。最終的にＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を利用してメチル化されたＤＮＡだけを分離精製した。精製されたＤＮＡの１／５体積を取って、遺伝子特異的プライマーでＰＣＲ増幅を行い、電気泳動してメチル化の有無を判別した。ＰＣＤＨＧＡ１２ Ｒ３を増幅するためのプライマーの塩基配列は次のようになる。
【０１０４】
配列番号２０：５‘−ｇａａｇａａａａｇｇｃｔｇｃｔｃａｃｃａ−３’
配列番号２１：５‘−ｔｃｇｃａｔｃｃａｇａａｃｃａｔｃａｃ−３’
【０１０５】
その結果、正常細胞株であるＮＨＢＥにおいては増幅産物が全く観察されなく、肺癌細胞株であるＡ５４９でだけＰＣＤＨＧＡ１２ Ｒ３に対する増幅産物が観察されることによって肺癌特異的なメチル化を確認することができた（図６Ａ）。また、喀痰細胞ゲノムＤＮＡを利用して、正常及び肺癌患者からメチル化を測定した結果、３人の正常喀痰試料においては全く増幅産物が観察されなかったが、３人の肺癌患者試料においては全部メチル化が検出された（図６Ｂ）。従って、メチル化特異的結合蛋白質を利用してＰＣＤＨＧＡ１２ Ｒ３のメチル化を測定できるということを確認した。
【産業上利用の可能性】
【０１０６】
以上、詳細に説明したように、本発明は肺癌特異的マーカー遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のＣｐＧのメチル化を診断できる肺癌診断用キットを提供する効果がある。本発明の診断用キットを利用すると、通常の方法より正確でかつ早く肺癌の早期診断が可能であり、肺癌の予後予測及びモニタリングに応用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌特異的に下方制御される遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）のメチル化された５’ＵＴＲまたはメチル化されたエクソン１領域を含む肺癌診断用バイオマーカー。
【請求項２】
少なくとも一つのメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを含有する配列番号１で表されることを特徴とする請求項１に記載の肺癌診断用バイオマーカー。
【請求項３】
一つ以上のメチル化されたＣｐＧアイランドを含有して、配列番号２で表される肺癌診断用バイオマーカー。
【請求項４】
一つ以上のメチル化されたＣｐＧアイランドを含有して、配列番号３で表される肺癌診断用バイオマーカー。
【請求項５】
一つ以上のメチル化されたＣｐＧアイランドを含有して、配列番号４で表される肺癌診断用バイオマーカー。
【請求項６】
肺癌特異的発現減少遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）由来であることを特徴とする請求項３〜５のいずれか一項に記載の肺癌診断用バイオマーカー。
【請求項７】
次の段階を含む肺癌、またはその進行段階の検出方法：
（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する段階、及び
（ｂ）前記分離したＤＮＡからＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のメチル化を検出する段階。
【請求項８】
ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のメチル化の検出は配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ領域で行うことを特徴とする請求項７に記載の肺癌、またはその進行段階の検出方法。
【請求項９】
次の段階を含む肺癌、またはその進行段階の検出方法：
（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する段階、及び
（ｂ）前記分離したＤＮＡからＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）遺伝子の５’ＵＴＲ部位のメチル化を検出する段階。
【請求項１０】
ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の５’ＵＴＲ部位のメチル化の検出は配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡ領域で行うことを特徴とする肺癌、またはその進行段階の検出方法。
【請求項１１】
次の段階を含む肺癌、またはその進行段階の検出方法：
（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する段階、及び
（ｂ）前記分離したＤＮＡからＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）遺伝子のエクソン１領域のメチル化を検出する段階。
【請求項１２】
ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のエクソン１領域のメチル化の検出は配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡ領域で行うことを特徴とする肺癌、またはその進行段階の検出方法。
【請求項１３】
前記メチル化検出は、ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＤＮＡチップ、パイロシーケンシング及びバイサルファイトシーケンシングからなる群から選択される方法によって行うことを特徴とする請求項７、９及び１１のいずれか一項に記載の肺癌、またはその進行段階の検出方法。
【請求項１４】
前記臨床サンプルは癌疑いのある患者または診断対象由来の組織、喀痰、細胞、血液または尿からなる群から選択されることを特徴とする請求項７、９及び１１のいずれか一項に記載の肺癌、またはその進行段階の検出方法。
【請求項１】
肺癌特異的に下方制御される遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）のメチル化された５’ＵＴＲまたはメチル化されたエクソン１領域を含む肺癌診断用バイオマーカー。
【請求項２】
少なくとも一つのメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを含有する配列番号１で表されることを特徴とする請求項１に記載の肺癌診断用バイオマーカー。
【請求項３】
一つ以上のメチル化されたＣｐＧアイランドを含有して、配列番号２で表される肺癌診断用バイオマーカー。
【請求項４】
一つ以上のメチル化されたＣｐＧアイランドを含有して、配列番号３で表される肺癌診断用バイオマーカー。
【請求項５】
一つ以上のメチル化されたＣｐＧアイランドを含有して、配列番号４で表される肺癌診断用バイオマーカー。
【請求項６】
肺癌特異的発現減少遺伝子のＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）由来であることを特徴とする請求項３〜５のいずれか一項に記載の肺癌診断用バイオマーカー。
【請求項７】
次の段階を含む肺癌、またはその進行段階の検出方法：
（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する段階、及び
（ｂ）前記分離したＤＮＡからＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のメチル化を検出する段階。
【請求項８】
ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の５’ＵＴＲ及びエクソン１領域のメチル化の検出は配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ領域で行うことを特徴とする請求項７に記載の肺癌、またはその進行段階の検出方法。
【請求項９】
次の段階を含む肺癌、またはその進行段階の検出方法：
（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する段階、及び
（ｂ）前記分離したＤＮＡからＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）遺伝子の５’ＵＴＲ部位のメチル化を検出する段階。
【請求項１０】
ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子の５’ＵＴＲ部位のメチル化の検出は配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡ領域で行うことを特徴とする肺癌、またはその進行段階の検出方法。
【請求項１１】
次の段階を含む肺癌、またはその進行段階の検出方法：
（ａ）臨床サンプルからＤＮＡを分離する段階、及び
（ｂ）前記分離したＤＮＡからＰＣＤＨＧＡ１２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_０３２０９４、プロトカドヘリンγサブファミリーＡ１２）遺伝子のエクソン１領域のメチル化を検出する段階。
【請求項１２】
ＰＣＤＨＧＡ１２遺伝子のエクソン１領域のメチル化の検出は配列番号３または配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡ領域で行うことを特徴とする肺癌、またはその進行段階の検出方法。
【請求項１３】
前記メチル化検出は、ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＤＮＡチップ、パイロシーケンシング及びバイサルファイトシーケンシングからなる群から選択される方法によって行うことを特徴とする請求項７、９及び１１のいずれか一項に記載の肺癌、またはその進行段階の検出方法。
【請求項１４】
前記臨床サンプルは癌疑いのある患者または診断対象由来の組織、喀痰、細胞、血液または尿からなる群から選択されることを特徴とする請求項７、９及び１１のいずれか一項に記載の肺癌、またはその進行段階の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５１５０８１（Ｐ２０１１−５１５０８１Ａ）
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５５０５８８（Ｐ２０１０−５５０５８８）
【出願日】平成２１年２月１８日（２００９．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／０００７７７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１３７７１
【国際公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【出願人】（５１０１４９３６７）ゲノミクトリー インコーポレーテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＯＭＩＣＴＲＥＥ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１８日（２００９．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／０００７７７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１３７７１
【国際公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【出願人】（５１０１４９３６７）ゲノミクトリー インコーポレーテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＯＭＩＣＴＲＥＥ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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