胃腸癌での増殖の徴候及び予後
本発明は、患者における癌、特に胃腸癌、例えば胃癌又は結腸直腸癌などのための予後を判断するための方法及び組成物に関する。具体的には、本発明は、癌、例えば胃癌又は結腸直腸癌などの予後の予測のための遺伝子マーカーの細胞増殖徴候に基づく使用に関する。種々の局面において、本発明は、とりわけ、癌患者の長期生存の可能性を予測する方法、癌患者のための処置計画を決定する方法、癌患者のための個別化されたゲノミクスプロファイルを作成する方法ならびにこれらの方法を行うためのキット及び装置に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、癌、特に胃腸癌の予後を患者において判断するための方法及び組成物に関する。具体的には、本発明は、癌、例えば胃腸癌などの予後を細胞増殖の徴候に基づき判断するための遺伝子マーカーの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
細胞増殖は生体における最も基本的なプロセスであり、そのようなものとして増殖関連遺伝子の発現レベルにより正確に調節される（１）。増殖制御の喪失は癌の特徴であり、従って、成長調節遺伝子が腫瘍中で、隣接する正常組織と比較し、異常に発現されていることは驚くべきことではない（２）。増殖変化は、細胞特性、例えば侵襲及び転移能などにおける他の変化を伴いうるため、患者の転帰に影響を及ぼしうる。この関連は実質的な興味を集めており、多くの試験が、転帰の潜在的な指標としての腫瘍細胞増殖の探索に充てられてきた。
【０００３】
細胞増殖は、通常、フローサイトメトリー又は、より一般的には、組織中で、増殖マーカーの免疫組織化学的評価により判定される（３）。最も広く使用される増殖マーカーはＫｉ−６７であり、休止期Ｇ０を除く全ての細胞周期段階で発現されるタンパク質である（４）。Ｋｉ−６７を使用し、周期中細胞の割合と臨床転帰の間の明らかな関連が、悪性腫瘍、例えば乳癌、肺癌、軟部組織腫瘍、及び星状細胞腫などで確立されている（５）。乳癌では、この関連は、また、マイクロアレイ解析により確認されており、再発の増加リスクにある患者を特定するために用いられてきた増殖遺伝子発現プロファイルを導く（６）。
【０００４】
しかし、結腸直腸癌（ＣＲＣ）では、増殖指数（ＰＩ）は予後因子として矛盾する結果を出しており、従って、臨床状況では適用できない（以下を参照のこと）。試験は、患者の選択、サンプリング方法、カットオフポイントレベル、抗体の選択、染色技術、データが収集及び解釈された方法に関して変動する。これらの試験の方法論的な差異及び異質性は、矛盾する結果を部分的に説明しうる（７）、（８）。Ｋｉ−６７の増殖マーカーとしての使用も制限を有する。Ｋｉ−６７ ＰＩによって活発な周期中細胞の分画が推定されるが、しかし、細胞周期の長さの示唆を与えない（３）、（９）。このように、類似のＰＩを伴う腫瘍が、異なる周期スピードに起因する非類似の速度で増殖しうる。また、Ｋｉ−６７ ｍＲＮＡは静止細胞中では産生されず、タンパク質はある割合の結腸直腸腫瘍で依然として検出可能であり、増殖速度の過大評価を導きうる（１０）。
【０００５】
単一の増殖マーカーを使用した予後の判定はＣＲＣにおいて信頼できるとは思われないため（以下を参照のこと）、胃腸癌の予後を予測するためのさらなるツールの必要性が存在する。本発明は、予後癌マーカー、具体的には胃腸癌予後診断マーカーに基づくさらなる方法及び組成物を提供し、癌の予後診断及び処置を助ける。
【０００６】
発明の概要
本発明の特定の局面では、マイクロアレイ解析を使用し、癌細胞の増殖徴候を提供する遺伝子を同定する。これらの遺伝子、及びそれらの遺伝子によりコードされるタンパク質を、本明細書では胃腸癌増殖マーカー（ＧＣＰＭ）と呼ぶ。本発明の一局面では、予後診断のための癌は、胃腸癌、特に胃癌及び結腸直腸癌である。
【０００７】
特定の局面では、本発明は、サンプル中の少なくとも１つのＧＣＰＭの発現レベルを同定することによる癌の予後を判断するための方法を含む。選択したＧＣＰＭは、細胞増殖、例えば、細胞周期成分に関連するタンパク質をコードする。これらのＧＣＰＭは、予後に基づく特定の癌のための最善の処置計画を決定するための方法において追加の有用性を有する。特定の局面では、ＧＣＰＭレベルは、再発性腫瘍組織と比較し、非再発性腫瘍組織でより高い。これらのマーカーを、単独で、又は、互いに、もしくは他の公知の癌マーカーと組み合わせて使用できる。
【０００８】
追加の局面では、本発明は、以下：（ａ）癌サンプルの提供；（ｂ）サンプル中の少なくとも１つＧＣＰＭファミリーメンバーの発現レベルの検出；及び（ｃ）癌の予後の判断を含む、癌の予後を判断するための方法を含む。
【０００９】
別の局面では、本発明は、少なくとも１つのＧＣＰＭ ＲＮＡ、例えば、少なくとも１つのｍＲＮＡの発現レベルの検出工程を含む。さらなる局面では、本発明は、少なくとも１つのＧＣＰＭタンパク質の発現レベルの検出工程を含む。さらなる局面では、本発明は、少なくとも１つのＧＣＰＭペプチドのレベルの検出工程を含む。さらに別の局面では、本発明は、サンプル中の少なくとも１つのＧＣＰＭファミリーメンバーの発現レベルの検出を含む。追加の局面では、ＧＣＰＭは、細胞増殖、例えば細胞周期成分などに関連する遺伝子である。他の局面では、少なくとも１つのＧＣＰＭは、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される。
【００１０】
さらなる局面では、本発明は、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに示す少なくとも１つのＧＣＰＭの発現レベルを検出するための方法を含む。さらなる局面では、本発明は、ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７の少なくとも１つの発現レベルを検出するための方法を含む。さらなる局面では、本発明は、ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３の少なくとも１つの発現レベルの検出を含む。
【００１１】
追加の局面では、例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択する；ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７から選択する；又は、ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３から選択する、増殖マーカー又はそれらの発現産物の少なくとも２つ、又は少なくとも５つ、又は少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、又は少なくとも７５の発現レベルを決定する。
【００１２】
他の局面では、例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙する；群ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７について列挙する；又は、群ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３について列挙する、全ての増殖マーカー又はそれらの発現産物の発現レベルを決定する。
【００１３】
さらなる局面では、本発明は、癌の処置計画の決定方法を含み、以下：（ａ）癌サンプルの提供；（ｂ）サンプル中の少なくとも１つのＧＣＰＭファミリーメンバーの発現レベルの検出；（ｃ）少なくとも１つのＧＣＰＭファミリーメンバーの発現レベルに基づく癌の予後の判断；及び（ｄ）予後診断に従った処置計画の決定を含む。
【００１４】
さらに別の局面では、本発明は、少なくとも１つのＧＣＰＭを検出するための装置を含み、以下：（ａ）その上に少なくとも１つのＧＣＰＭ捕捉試薬を有する基材；及び（ｂ）少なくとも１つの捕捉ＧＣＰＭ、捕捉試薬、又はその複合体を検出可能な検出器を含む。
【００１５】
本発明の追加の局面は、癌を検出するためのキットを含み、以下：（ａ）ＧＣＰＭ捕捉試薬；（ｂ）捕捉ＧＣＰＭ、捕捉試薬、又はその複合体を検出可能な検出器；及び、場合により、（ｃ）使用説明書を含む。特定の局面では、キットは、また、捕捉されたＧＣＰＭのための基材を含む。
【００１６】
本発明のさらなる局面は、定量的ＰＣＲを使用した少なくとも１つのＧＣＰＭの検出するための方法を含み、以下：（ａ）少なくとも１つのＧＣＰＭに特異的なフォワードプライマー；（ｂ）少なくとも１つのＧＣＰＭに特異的なリバースプライマー；（ｃ）ＰＣＲ試薬；及び、場合により、少なくとも１つの：（ｄ）反応バイアル；及び（ｅ）使用説明書を含む。
【００１７】
本発明の追加の局面は、少なくとも１つのＧＣＰＭタンパク質又はペプチドの存在を検出するためのキットを含み、以下：（ａ）少なくとも１つのＧＣＰＭタンパク質又はペプチドに特異的な抗体又は抗体フラグメント；及び、場合により、少なくとも１つの：（ｂ）抗体又は抗体フラグメントのための標識；及び（ｃ）使用説明書を含む。特定の局面では、キットは、また、少なくとも１つのＧＣＰＭタンパク質又はペプチドのための捕捉薬剤を有する基材を含む。
【００１８】
特定の局面では、本発明は、胃腸癌、特に結腸直腸癌又は胃癌の予後を判断するための方法を含み、以下の工程：（ａ）胃腸癌を有することが疑われる患者からのサンプル、例えば腫瘍サンプルの提供；（ｂ）ＥＬＩＳＡ方法を使用したＧＣＰＭタンパク質の存在の測定を含む。
【００１９】
本発明の追加の局面では、本発明の１つ又は複数のＧＣＰＭを、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに概説する群より選択する。本発明の他の局面及び実施態様を本明細書において以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明を、その特定の実施態様を参照し、及び、図を参照して記載する。
【図１】本明細書で開示する遺伝子増幅徴候（ＧＰＳ）を引き出し、適用するために使用するアプローチの概観。
【図２】Ａは遺伝子増幅徴候の発現レベルに従った２群への７３のコホートＡ腫瘍のＫ平均値クラスタリング。ＢはＫｉ−６７ ＰＩの棒グラフ（%）；垂直線は全サンプルにわたる平均Ｋｉ−６７ ＰＩを表わす。平均値の前後及び平均値以下の増殖指数を伴う腫瘍を、それぞれ赤色及び緑色で示す。結果は、増殖徴候の過剰発現が、より高いＫｉ−６７ ＰＩに常に関連しているわけではないことを示す。
【図３】ＧＰＳ（遺伝子増幅シグナル）の発現レベル及びＫｉ−６７ ＰＩに従ったカプラン・マイヤー生存曲線。全生存期間（ＯＳ）及び無再発生存期間（ＲＦＳ）の両方が、結腸直腸癌コホートＡ（ａ、ｂ）及び結腸直腸癌コホートＢ（ｃ、ｄ）中の低ＧＰＳ発現を伴う患者において有意に短い。差異は、Ｋｉ−６７ ＰＩに従ったコホートＡ患者（ｅ、ｆ）の生存率において観察されなかった。ログランク検定からのＰ値を示す。
【図４】胃癌患者におけるＧＰＳ（遺伝子増幅シグナル）の発現レベルに従ったカプラン・マイヤー生存曲線。全生存期間は、混合病期の３８人の胃癌患者のこのコホート中の低ＧＰＳ発現を伴う患者において有意に短かった。ログランク検定からのＰ値を示す。
【図５】対数期（ＥＰ）の周期中細胞と静止期（ＳＰ）の成長阻止細胞の間での１１のＱＲＴ−ＰＣＲ検証済み遺伝子の発現差異を示す箱髭図プロット。箱範囲は、データの２５〜７５パーセンタイルを含む。箱中の水平線は中央値を表わす。「髭」は最大値及び最小値（外れ値を除く）である。箱の終わりからの四分位範囲の３／２倍以上の任意の点が外れ値であり、ドットで提示する。Ｙ軸は、細胞株ＲＮＡと参照ＲＮＡの間の比率の対数２倍変化を表わす。分析はＳＰＳＳソフトウェアを使用して実施した。
【００２１】
発明の詳細な説明
単一の増殖マーカーは、信頼できるＣＲＣ予後診断を得るために不十分であるため、マイクロアレイによるいくつかの成長関連遺伝子の同時分析を用いて、胃腸腫瘍の増殖状態を判断するためのより定量的で客観的な方法を提供した。表１（以下）は、結腸直腸癌のための予後因子としての増殖指数（ＰＩ）の使用のために示した、以前に発表された矛盾する結果を例証する。
【００２２】
【表１】
【００２３】
対照的に、本開示は、（ｉ）細胞株モデルを使用したＣＲＣ特異的遺伝子増幅徴候（ＧＰＳ）の定義；及び（ｉｉ）患者の転帰の予測におけるＧＰＳの予後の意義及びＣＲＣ患者の２つの独立コホートにおける臨床病理学的変数とのその関連の判断に成功している。
【００２４】
定義
本発明の実施態様を詳細に記載する前に、本明細書で使用する用語のいくつかの定義を提供すると有用でありうる。
【００２５】
本明細書で使用する「抗体」及び類似の用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。これらは、限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単一鎖、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーを含む。抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤのいずれかと関連し、分子中に存在する重鎖の性質により互いに異なる。これらはサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２なども含む。軽鎖はカッパ鎖又はラムダ鎖でよい。本明細書における抗体の参照は、全てのクラス、サブクラス、及び型の参照を含む。また、キメラ抗体、例えば、１を上回る供給源、例えば、マウス配列又はヒト配列に特異的であるモノクローナル抗体又はそのフラグメントが含まれる。さらに、ラクダ抗体、サメ抗体、又はナノボディが含まれる。
【００２６】
「マーカー」という用語は、生物学的現象の存在と定量的又は定性的に関連付けられる分子を指す。「マーカー」の例は、ポリヌクレオチド、例えば遺伝子もしくは遺伝子フラグメント、ＲＮＡもしくはＲＮＡフラグメント；又はポリペプチド、例えばペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、もしくはタンパク質フラグメントなど；又は任意の関連する代謝産物、副産物、又は任意の他の同定分子、例えば抗体もしくは抗体フラグメントなどが、現象の基礎をなす機構に直接的又は間接的に関連するかを問わず、含まれる。本発明のマーカーは、本明細書で開示するヌクレオチド配列（例、ＧｅｎＢａｎｋ配列）、特に、全長配列、任意のコード配列、任意のフラグメント、又はその任意の相補体を含む。
【００２７】
「ＧＣＰＭ」又は「胃腸癌増殖マーカー」又は「ＧＣＰＭファミリーメンバー」という用語は、本明細書に記載する、陽性予後、例えば、再発性癌のより低い可能性に関連する発現増加を伴うマーカーを指すが、しかし、先行技術において胃腸癌の予後に関連することが公知である分子を除くことができる。ＧＣＰＭという用語では、マーカーが胃腸腫瘍だけに特異的であることを必要としないことを理解すべきである。むしろ、ＧＣＰＭの発現は、他の型の腫瘍（悪性腫瘍を含む）において変化しうる。
【００２８】
非限定的なＧＣＰＭの例が、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄにおいて、本明細書で以下に含まれ、そして、限定はされないが、特定の群ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７；ならびに特定の群ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３を含む。
【００２９】
「癌」及び「癌性」という用語は、異常な又は無調節な細胞成長により典型的に特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指す、又は、記載する。癌及び癌病理は、例えば、転移、隣接細胞の正常機能との干渉、異常レベルでのサイトカイン又は他の分泌産物の放出、炎症反応又は免疫学的反応の抑制又は悪化、新生物、前悪性腫瘍、悪性腫瘍、周囲又は遠位の器官又は組織（例えば、リンパ節）などの侵襲に関連しうる。具体的には、胃腸癌、例えば食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、肛門癌、及び直腸癌が含まれ、特に、胃癌及び結腸直腸癌が含まれる。
【００３０】
「結腸直腸癌」という用語は、結腸、直腸、及び／又は肛門の癌、ならびに特に、腺癌を含み、癌腫（例、扁平上皮総排泄腔癌）、メラノーマ、リンパ腫及び肉腫も含みうる。類表皮（非角質化扁平上皮細胞あるいは類基底）癌も含まれる。癌は、特定の型のポリープ又は他の病変、例えば、管状腺腫、腺管絨毛腺腫（例、絨毛腺管状ポリープ）、絨毛（例、乳頭）腺腫（腺癌の有無にかかわらず）、過形成性ポリープ、過誤腫、若年性ポリープ、ポリポイド癌腫、偽ポリープ、脂肪腫、又は平滑筋腫に関連しうる。癌は、家族性ポリポーシス及び関連する状態、例えばガードナー症候群又はポッツ−ジェガース症候群に関連しうる。癌は、例えば、慢性瘻孔、放射線照射された肛門皮膚、白斑症、性病性リンパ肉芽腫、ボーエン病（上皮内癌）、尖圭コンジローマ、又はヒト乳頭腫ウイルスに関連しうる。他の局面では、癌は、基底細胞癌、乳房外ページェット病、総排泄腔癌、又は悪性メラノーマに関連しうる。
【００３１】
「異なって発現される遺伝子」、「遺伝子発現の差異」という用語、及び類似の語句は、発現が、被験体（例、テストサンプル）、具体的には癌、例えば胃腸癌において、対照被験体（例、対照サンプル）でのその発現と比較し、より高い又はより低いレベルまで活性化される遺伝子を指す。これらの用語は、また、発現が、同じ疾患の異なる段階で；再発性疾患又は非再発性疾患において；又はより高いもしくはより低いレベルの増殖を伴う細胞において、より高い又はより低いレベルまで活性化される遺伝子を含む。異なって発現される遺伝子は、ポリヌクレオチドレベル又はポリペプチドレベルで活性化もしくは阻止されうる、又は選択的スプライシングを受けて、異なるポリペプチド産物を生じうる。そのような差異は、例えば、ポリペプチドのｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌、又は他の分配により証明されうる。
【００３２】
遺伝子発現の差異は、２つ又はそれ以上の遺伝子又はそれらの遺伝子産物の間での発現の比較；あるいは２つ又はそれ以上の遺伝子又はそれらの遺伝子産物の間での発現の比率の比較；あるいは同じ遺伝子の２つの異なってプロセシングされた産物（正常な被験者と疾患のある被験者の間で異なる）；あるいは同じ疾患の種々の段階の間；あるいは再発性疾患と非再発性疾患の間；あるいは高レベル増殖を伴う細胞と低レベル増殖を伴う細胞の間；あるいは正常組織と疾患のある組織、具体的には癌、もしくは胃腸癌の間の比較を含みうる。発現差異は、例えば、正常細胞もしくは疾患のある細胞の内、又は異なる疾患事象もしくは疾患段階を経た細胞の内、又は異なる増殖レベルを伴う細胞の内で、遺伝子又はその発現産物における時間的な又は細胞性の発現パターンにおける定量的、ならびに定性的な差異の両方を含む。
【００３３】
「発現」という用語は、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生、特に、遺伝子又は遺伝子の部分からのＲＮＡ（例、ｍＲＮＡ）の産生を含み、そして、ＲＮＡ又は遺伝子又は遺伝子の部分によりコードされるタンパク質の産生、及び発現に関連する検出可能物質の出現を含む。例えば、複合体の形成（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ヌクレオチド相互作用などから）が、「発現」という用語の範囲内に含まれる。別の例は、結合リガンド（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ又は抗体など）の遺伝子又は他のオリゴヌクレオチド、タンパク質又はタンパク質フラグメントへの結合及び結合リガンドの可視化である。このように、マイクロアレイ上、ハイブリダイゼーションブロット（例えばノーザンブロットなど）上、又は免疫ブロット（例えばウエスタンブロットなど）上、又はビーズアレイ上のスポット、又はＰＣＲ解析による強度増加が、基礎をなす生物学的分子の「発現」という用語内に含まれる。
【００３４】
「胃癌」という用語は、胃及び周辺組織の癌、特に腺癌を含み、リンパ腫及び平滑筋肉腫も含みうる。癌は、胃潰瘍又は胃ポリープに関連しうるが、突出性、穿通性、拡散性、又はこれらのカテゴリーの組み合わせとして分類されうる、又は、あるいは、表在性（隆起、扁平、又は陥凹）又は窩性（ｅｘｃａｖａｔｅｄ）として分類されうる。
【００３５】
「長期生存」という用語を本明細書で使用し、外科手術又は他の処置後、少なくとも５年間、より好ましくは少なくとも８年間、最も好ましくは少なくとも１０年間の生存を指す。
【００３６】
「マイクロアレイ」という用語は、基材上の捕捉剤、好ましくはポリヌクレオチド（例、プローブ）又はポリペプチドの秩序された配置を指す。例えば、Microarray Analysis, M. Schena, John Wiley & Sons, 2002;Microarray Biochip Technology, M. Schena, ed., Eaton Publishing, 2000;Guide to Analysis of DNA Microarray Data, S. Knudsen, John Wiley & Sons, 2004;及びProtein Microarray Technology, D. Kambhampati, ed., John Wiley & Sons, 2004を参照のこと。
【００３７】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチド、典型的にはプローブ又はプライマー（限定はされないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本又は二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、及び二本鎖ＤＮＡを含む）を指す。オリゴヌクレオチド、例えば一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどは、しばしば化学的方法により、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用し、又は種々の他の方法（インビトロ発現系、組換え技術、ならびに細胞及び生物での発現を含む）により合成される。
【００３８】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数又は複数で使用する場合、一般的に、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、未改変ＲＮＡもしくはＤＮＡ又は改変ＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる。これは、限定はされないが、一本及び二本鎖ＤＮＡ、一本及び二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本及び二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本及び二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖もしくは、より典型的には、二本鎖でありうる、又は一本及び二本鎖領域を含みうるＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。また、ＲＮＡもしくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域が含まれる。具体的には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡが含まれる。用語は、１つ又は複数の修飾塩基（例えば、トリチウム塩基など）、又は通常ではない塩基（例えばイノシンなど）を含むＤＮＡ及びＲＮＡを含む。本発明のポリヌクレオチドは、コード配列もしくは非コード配列、又はセンス配列もしくはアンチセンス配列を包含しうる。
【００３９】
本明細書で使用する「ポリペプチド」は、オリゴペプチド、ペプチド、もしくはタンパク質の配列、又はそのフラグメント、及び天然、組換え、合成、又は半合成の分子を指す。「ポリペプチド」を本明細書で挙げて、天然タンパク質分子のアミノ酸配列を指す場合、「ポリペプチド」及び類似の用語は、アミノ酸配列を、全長分子のための完全な天然アミノ酸配列に限定することを意味しない。「ポリペプチド」又は類似の用語への各参照は、本明細書において、全長配列、ならびに任意のフラグメント、派性物、又はその変異体を含むことを理解すべきである。
【００４０】
「予後」という用語は、医学的転帰（例、長期生存の可能性）の予測を指す；ネガティブな予後、又は不良転帰は、再発、疾患進行（例、腫瘍の成長もしくは転移、又は薬物耐性）、又は死亡の予測を含む；ポジティブな予後、又は良好転帰は、疾患寛解（例、無疾患状態）、回復（例、腫瘍退縮）、又は安定化の予測を含む。
「予後徴候」、「徴候」などの用語は、２つ又はそれ以上のマーカー、例えばＧＣＰＭのセットを指し、セットとして一緒に分析された場合、事象、例えば、結腸直腸癌の予後転帰の判断又は予測が可能になる。２つ又はそれ以上のマーカーを含む徴候の使用によって、個々の変動の効果が低下し、よりしっかりとした予測を可能にする。ＧＣＰＭの非限定的な例は、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに含まれ、本明細書において以下で、限定はされないが、特定の群ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７；ならびに特定の群ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３を含む。
【００４１】
本発明に関連して、任意の特定セットに列挙するマーカー（例、任意の徴候）の「少なくとも１つ」、「少なくとも２つ」、「少なくとも５つ」などへの参照は、列挙するマーカーの任意の１つ又は任意の及び全ての組み合わせを意味する。
【００４２】
「予測方法」という用語は、予測モデルを特定するために使用できる、統計、機械学習、人工知能、及びデータマイニングの分野からのより広範な属の方法を網羅するように定義する。これらは、詳細な説明のセクションにおいてさらに考察される。
【００４３】
「予測モデル」という用語は、予測方法をデータ収集に適用することにより得られる特定の数学的モデルを指す。本明細書で詳述する例では、そのようなデータセットは、再発性及び非再発性の結腸直腸癌患者から採取された組織サンプル（それらについて、各サンプルのクラス（再発性又は非再発性）が公知である）中での遺伝子活性の測定からなる。そのようなモデルを使用し、（１）未知の再発状態のサンプルを再発性又は非再発性の１つであると分類できる、又は（２）未知サンプル中での遺伝子の特定の収集物のｍＲＮＡ発現レベル又は発現産物の測定に基づき、未知のサンプルが再発性である可能性を表わす確率的予測できる（即ち、確率として解釈すべき割合又はパーセントをいずれかを産生できる）。これらの遺伝子特異的な測定値をどのように組み合わせて、分類及び確率的予測を産生するのかについての正確な詳細は、モデルを構築するために使用する予測方法の特定の機構に依存的である。
【００４４】
「増殖」という用語は、増加した細胞のサイズ又は細胞数を導くプロセスを指し、腫瘍又は細胞の成長、血管新生、神経支配、及び転移の１つ又は複数を含むことができる。
【００４５】
「ｑＰＣＲ」又は「ＱＰＣＲ」という用語は、例えば、PCR Technique: Quantitative PCR, J. W. Larrick, ed., Eaton Publishing, 1997、及びA-Z of Quantitative PCR, S. Bustin, ed., IUL Press, 2004に記載する定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。
【００４６】
「腫瘍」という用語は、全ての新生細胞の成長及び増殖（悪性又は良性を問わない）、ならびに全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。
【００４７】
「感度」、「特異性」（又は「選択性」）、及び「分類率」は、予測モデルの有効性の記載に適用される場合、以下を意味する：「感度」は、陽性であると（モデルにより）予測されてもいる真に陽性のサンプルの割合を意味する。癌の再発についてのテストでは、それは、モデルにより再発性であると予測された再発性腫瘍の割合でありうる。「特異性」又は「選択性」は、陰性であると（モデルにより）予測されてもいる真に陰性のサンプルの割合を意味する。ＣＲＣ再発についてのテストでは、モデルにより非再発性であると予測される非再発性腫瘍の割合でありうる。「分類率」は、予測モデルにより（陽性又は陰性として）正確に分類される全てのサンプルの割合である。
【００４８】
「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシーな条件」は、本明細書で定義する通り、典型的に：（１）洗浄のための低イオン強度及び高温、例えば、５０℃の０．０１５M塩化ナトリウム／０．００１５Mクエン酸ナトリウム／０．１%ドデシル硫酸ナトリウムを用いる；（２）ハイブリダイゼーション中に変性剤（例えばホルムアミドなど）、例えば、４２℃の７５０mM塩化ナトリウム、７５mMクエン酸ナトリウムを伴うｐＨ６．５の０．１%ウシ血清アルブミン／０．１% Ｆｉｃｏｌｌ／０．１%ポリビニルピロリドン／５０mMリン酸ナトリウム緩衝液を伴う５０%（ｖ／ｖ）ホルムアミドを用いる；又は（３）４２℃の５０%ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５M ＮａＣｌ、０．０７５Mクエン酸ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１%ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理済みサケ精子ＤＮＡ（５０μg/ml）、０．１% ＳＤＳ、及び１０%硫酸デキストランを用い、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）及び５５℃の５０%ホルムアミド中での洗浄、５５℃のＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣを含む高ストリンジェンシーな洗浄が続く。
【００４９】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989により記載される通りに同定でき、洗浄溶液の使用及び上に記載するものほどストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件（例、温度、イオン強度、及び% ＳＤＳ）を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、以下：２０%ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０%硫酸デキストラン、及び２０mg/ml変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での、３７℃での一晩インキュベーションであり、約３７〜５０℃の１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄が続く。当業者は、プローブ長などの要因を適応させるために必要な、温度、イオン強度などをどのように調整するのかを認識するであろう。
【００５０】
本発明の実施では、特記なき場合、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、及び生化学の従来技術を用い、それらは当技術分野の範囲内である。そのような技術は、文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al., 1989; Oligonucleotide Synthesis, MJ Gait, ed., 1984; Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed., 1987; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 4th edition, D. M. Weir & CC.Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987; Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., 1987; 及びPCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., 1994において十分に説明される。
【００５１】
本発明の実施態様の説明
細胞増殖は、一部の悪性腫瘍における転帰の指標である。結腸直腸癌では、しかし、結果の不一致が報告されている。これらの結果は単一の増殖マーカーに基づくため、本発明は、この限界を克服し、より確定的な結論に達し、そして結腸直腸癌での細胞増殖の予後診断的な役割を決定するためのマイクロアレイの使用を開示する。本明細書で示すマイクロアレイベースの増殖試験は、結腸直腸癌における増殖徴候の低下率が不良転帰と関連することを示す。本発明は、従って、癌からの早期死亡の高リスクにある患者を特定するために使用できる。
【００５２】
本発明は、疾患の予後、例えば、胃腸腫瘍を含む腫瘍の再発の可能性の判断のためのマーカーを提供する。本発明の方法を使用し、多数のマーカーが胃腸癌の進行に関連し、癌の予後の判断に使用できることが見出されている。種々の病期の結腸直腸癌を伴う患者から採取したサンプルでのマイクロアレイは、特定パターンのマーカー発現が癌の予後に関連するとの驚くべき発見を導いている。
【００５３】
特定のＧＣＰＭ、例えば、細胞増殖に関連するマーカーにおける増加は、ポジティブな予後を示している。これは、特に胃腸癌、例えば胃癌又は結腸直腸癌などでの、標準的処置後での癌再発の可能性の減少を含みうる。逆に、これらのマーカーにおける減少はネガティブな予後を示している。これは、特に胃腸癌、例えば胃癌又は結腸直腸癌などでの、疾患進行又は癌再発の可能性の増加を含みうる。発現における減少は、例えば、テストサンプル（例、腫瘍サンプル）のポジティブな予後に関連するサンプルとの比較により判断できる。発現における増加は、例えば、テストサンプル（例、腫瘍サンプル）のネガティブな予後に関連するサンプルとの比較により判断できる。
【００５４】
例えば、予後診断を得るために、患者のサンプル（例、腫瘍サンプル）を、既知の患者の転帰を伴うサンプルと比較できる。患者のサンプルが、良好転帰を伴うサンプルと同程度であり、及び／又は不良転帰を伴うサンプルよりも高いＧＣＰＭの発現増加を示す場合、ポジティブな予後を意味する。患者のサンプルが、不良転帰を伴うサンプルと同程度であり、及び／又は良好転帰を伴うサンプルよりも低いＧＣＰＭの発現減少を示す場合、ネガティブな予後を意味する。あるいは、患者のサンプルを、活発に増殖中／非増殖中の腫瘍細胞のサンプルと比較できる。患者のサンプルが、活発に増殖中の細胞と同程度であり、及び／又は非増殖中の細胞よりも高いＧＣＰＭの発現増加を示す場合、ポジティブな予後を意味する。患者のサンプルが、非増殖中の細胞と同程度であり、及び／又は活発に増殖中の細胞よりも低いＧＣＰＭの発現減少を示す場合、ネガティブな予後を意味する。
【００５５】
本発明は、種々の病期の腫瘍を伴う癌患者から同定され、表Ｃに概説され、結腸直腸癌について予後診断的であることが示されている遺伝子のセットを提供する。これらの遺伝子は全て細胞増殖に関連し、細胞増殖遺伝子と癌予後診断でのそれらの有用性との間の関係を確立する。また、表Ｃに列挙する予後徴候における遺伝子も追加の細胞増殖遺伝子と相関することが見出されている。これらの知見に基づき、本発明は、表Ｄに示し、高増殖群と低増殖群の間で異なって発現される、予後診断マーカーとしての使用のための細胞周期遺伝子のセットも提供する。さらに、予後と細胞増殖関連遺伝子の間の相関に関する驚くべき知見に基づき、本発明は、高増殖状態及び低増殖状態の間で異なって発現される増殖関連遺伝子のセット（表Ａ）ならびに公知の増殖関連遺伝子（表Ｂ）も提供する。表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、及び表Ｄに概説する遺伝子は、胃腸癌予後診断マーカー（ｇＣＰＭｓ）のセットを提供する。
【００５６】
１つのアプローチとして、マーカー（例、ＧＣＰＭ）のパネルの発現を、予後スコアを出すための線形判別分析（ＬＤＡ）を含む技術により分析できる。選択されたマーカーパネル及び予後スコア計算は、広範な実験室テスト及び複数の独立した臨床開発試験に由来しうる。
【００５７】
開示したＧＣＰＭは、従って、癌の予後を判断し、その腫瘍に特有の処置計画を確立するための有用なツールを提供する。特に、ポジティブな予後が、患者により使用され、標準的又はより侵襲性の低い処置選択肢を追及することを決断できる。ネガティブな予後が、患者により使用され、処置を終了する又は高度に侵襲性のもしくは実験的な処置を追及することを決断できる。また、患者は、細胞増殖又は細胞増殖マーカー（例、ＧＣＰＭ）の発現へのその影響に基づき処置を選ぶことができる。本発明に従い、高い増殖性を伴う細胞を特異的に標的にする又は細胞増殖マーカー（例、ＧＣＰＭ）の発現を特異的に減少させる処置が、胃腸癌、例えば結腸直腸癌又は胃癌などを伴う患者には好まれないことがある。
【００５８】
ＧＣＰＭのレベルを、腫瘍組織、腫瘍の近位にある組織、リンパ節サンプル、血液サンプル、血清サンプル、尿サンプル、又は糞便サンプルにおいて、任意の適した技術を使用して検出でき、限定はされないが、オリゴヌクレオチドプローブ、定量的ＰＣＲ、又はマーカーに対して産生された抗体を含みうる。サンプル中での１つのＧＣＰＭの発現レベルは、その被験者における再発の可能性を示しうる。しかし、複数のＧＣＰＭの発現の存在及び量を分析し、増殖徴候を構築することにより、予後診断の感度及び正確性が増加することが理解される。従って、本発明の複数のマーカーを使用し、癌の予後を判断できる。
【００５９】
本発明は、マーカー、特に、ＧＣＰＭのセットに関し、その発現は、具体的には無癌生存に関する、予後値を有する。特定の局面では、癌は、胃腸癌、特に、胃癌又は結腸直腸癌であり、さらなる局面では、結腸直腸癌は腺癌である。
【００６０】
一局面では、本発明は、癌の再発を伴わない癌患者の長期生存の可能性を予測する方法に関し、患者から得られたサンプル中での１つ又は複数の増殖マーカー又はそれらの発現産物の発現レベル（サンプル中での全てのＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物、又はＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている）の決定を含み、ここで増殖マーカーは、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙する１つ又は複数のマーカーの転写物である。特定の局面では、１つ又は複数のＧＣＰＭの発現レベルにおける減少は、癌の再発を伴わない長期生存の可能性の減少を示し、１つ又は複数のＧＣＰＭの発現レベルにおける増加は、癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加を示す。
【００６１】
さらなる局面では、１つ又は複数、例えば少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つ、又は少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、又は少なくとも７５の増殖マーカー又はそれらの発現産物の発現レベルが決定され、例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される；ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７から選択される；又はＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３から選択される。
【００６２】
別の局面では、方法は、全ての増殖マーカー又はそれらの発現産物の発現レベルの決定を含み、例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙される；群ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７について列挙される；又は群ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３について列挙される。
【００６３】
本発明は、セット中の全てのマーカーのアッセイのための保管されたパラフィン包埋生検材料の使用を含み、従って、大半の広く利用可能な型の生検材料に適合する。それは、また、腫瘍組織回収のいくつかの異なる方法、例えば、コア生検又は穿刺吸引に適合する。さらなる局面では、ＲＮＡを患者の固定ワックス包埋癌組織標本から単離する。単離は、当技術分野において公知の任意の技術により、例えば、コア生検組織又は穿刺吸引細胞から実施してよい。
【００６４】
別の局面では、本発明は、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される２つ又はそれ以上のマーカーにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイに関する；ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７から選択される；又はＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３から選択される。
【００６５】
特定の局面では、アレイは、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーの少なくとも３つ、又は少なくとも５つ、又は少なくとも１０、又は少なくとも１５、又は少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、又は少なくとも７５又は全てとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む；群ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７に列挙される；又は群ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３に列挙される。
【００６６】
別の特定の局面では、アレイは、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーの全セットとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む；群ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７について列挙される；又は群ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３に列挙される。
【００６７】
ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、又はオリゴヌクレオチドにしてよく、それらをディスプレイする固形表面は例えばガラスでよい。ポリヌクレオチドは、本明細書で開示するマーカーの１つ又は複数、例えば、全長配列、任意のコード配列、任意のフラグメント、又はそれらの任意の相補体にハイブリダイズできる。
【００６８】
さらに別の局面では、本発明は、癌の再発を伴わない、癌と診断された患者の長期生存の可能性を予測する方法に関し、以下の工程：（１）患者から得られたサンプル中での、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーの全セット又はサブセットのＲＮＡ転写物又は発現産物の発現レベル（サンプル中での全てのＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物、又はＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている）の決定；（２）工程（１）で得られたデータを統計分析にかけること；及び（３）長期生存の可能性が増加又は減少しているかの判断を含む。
【００６９】
さらに別の局面では、本発明は、患者、例えば、癌患者についての個別化されたゲノミクスプロファイルの作成方法に関し、以下の工程：（ａ）患者から得られたサンプルを発現解析にかけること；（ｂ）表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄのいずれかに列挙するマーカーセットから選択された１つ又は複数のマーカーの発現レベルの決定、ここで発現レベルは対照遺伝子に対して正規化され、場合により参照セット中で見出される量と比較する；及び（ｃ）発現解析により得られたデータをまとめる報告の作成を含む。報告は、例えば、患者の長期生存の可能性の予測及び／又は患者の処置法のための推奨事項を含んでよい。
【００７０】
追加の局面では、本発明は以下：（ａ）患者から得られたサンプルを、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択された少なくとも１つのマーカーのＲＮＡ転写物、又はその産物の発現レベルの定量的分析にかけること；及び（ｂ）癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加を有する可能性が高い患者を特定すること（マーカー、又はそれらの産物の正規化された発現レベルが、上に定めた発現閾値を上回る場合）を含む予後診断方法に関する。代わりの局面では、工程（ｂ）は、癌の再発を伴わない長期生存の可能性の減少を有する可能性の高い患者を特定することを含む（マーカー、又はそれらの産物の正規化された発現レベルが、定めた発現閾値を下回る場合）。
【００７１】
特に、増殖マーカーの比較的低い発現は、不良転帰に関連する。これは、疾患進行、又は、特に胃腸癌、例えば胃癌もしくは結腸直腸癌などでの癌の再発の可能性の増加を含みうる。対照的に、増殖マーカーの比較的高い発現は良好転帰と関連する。これは、特に胃腸癌、例えば胃癌又は結腸直腸癌などでの、標準的処置後での癌再発の可能性の減少を含みうる。低発現は、例えば、テストサンプル（例、腫瘍サンプル）の、ポジティブな予後に関連するサンプルとの比較により判断できる。高発現は、例えば、テストサンプル（例、腫瘍サンプル）の、ネガティブな予後に関連するサンプルとの比較により判断できる。
【００７２】
例えば、予後診断を得るために、患者のサンプル（例、腫瘍サンプル）を、患者の転帰が既知であるサンプルと比較できる。患者のサンプルが、良好転帰を伴うサンプルと同程度であり、及び／又は不良転帰を伴うサンプルよりも高いＧＣＰＭの高発現を示す場合、ポジティブな予後を意味する。患者のサンプルが、不良転帰を伴うサンプルと同程度であり、及び／又は良好転帰を伴うサンプルよりも低いＧＣＰＭの低発現を示す場合、ネガティブな予後を意味する。あるいは、患者のサンプルを、活発に増殖中／非増殖中の腫瘍細胞のサンプルと比較できる。患者のサンプルが、活発に増殖中の細胞と同程度であり、及び／又は非増殖中の細胞よりも高いＧＣＰＭの高発現を示す場合、ポジティブな予後を意味する。患者のサンプルが、非増殖中の細胞と同程度であり、及び／又は活発に増殖中の細胞よりも低いＧＣＰＭの低発現を示す場合、ネガティブな予後を意味する。
【００７３】
さらなる例として、患者のサンプル（例、腫瘍サンプル）からの２つ又はそれ以上のＧＣＰＭを含む予後徴候の発現レベルを、再発性／非再発性癌のサンプルと比較できる。患者のサンプルが、非再発性癌のサンプルとの比較により発現の増加又は減少、及び／又は再発性癌のサンプルと同程度の発現を示す場合、ネガティブな予後を意味する。患者のサンプルが、非再発性癌のサンプルと同程度であるＧＣＰＭの発現、及び／又は再発性癌のサンプルよりも低い又は高い発現を示す場合、ポジティブな予後を意味する。
【００７４】
１つのアプローチとして、予測方法を、予測モデルを生成するために、マーカーのパネル、例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに概説するＧＣＰＭのパネルに適用できる。これは、２つ又はそれ以上のＧＣＰＭを含む予後徴候の生成を含む。
【００７５】
表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄにおける開示したＧＣＰＭは、従って、癌の予後の判断、及びその腫瘍に特有の処置計画、又は処置法の確立のための予後徴候を生成するためのマーカーの有用なセットを提供する。特に、ポジティブな予後が、患者により使用され、標準的又はより侵襲性の低い処置選択肢を追及することを決断できる。ネガティブな予後が、患者により使用され、処置を終了する又は高度に侵襲性のもしくは実験的な処置を追及することを決断できる。また、患者は、予後診断マーカー（例、ＧＣＰＭ）の発現へのその影響に基づき処置を選ぶことができる。
【００７６】
ＧＣＰＭのレベルを、腫瘍組織、腫瘍の近位にある組織、リンパ節サンプル、血液サンプル、血清サンプル、尿サンプル、又は糞便サンプルにおいて、任意の適した技術を使用して検出でき、限定はされないが、オリゴヌクレオチドプローブ、定量的ＰＣＲ、又はマーカーに対して産生された抗体を含みうる。予測徴候の形態での複数のＧＣＰＭの発現の存在及び量を分析し、予後徴候を構築することにより、予後診断の感度及び正確性が増加されることが理解される。従って、本発明の複数のマーカーを使用し、癌の予後を判断できる。
【００７７】
本発明は、セット中のマーカーのアッセイのための保管されたパラフィン包埋生検材料の使用を含み、従って、大半の広く利用可能な型の生検材料に適合する。それは、また、腫瘍組織回収のいくつかの異なる方法、例えば、コア生検又は穿刺吸引に適合する。特定の局面では、ＲＮＡを患者の固定ワックス包埋癌組織標本から単離する。単離は、当技術分野において公知の任意の技術により、例えば、コア生検組織又は穿刺吸引細胞から実施してよい。
【００７８】
一局面では、本発明は、予後、例えば、癌の再発を伴わない癌患者の長期生存の可能性を予測する方法に関し、患者から得られたサンプル中での１つ又は複数の予後診断マーカー又はそれらの発現産物の発現レベル（サンプル中での他のＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物、又はＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている）の決定を含む。特定の局面では、予後診断マーカーは、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙する１つ又は複数のマーカーであり、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーに由来する１つ又は複数の予後徴候として含まれる。
【００７９】
さらなる局面では、予後診断マーカー又はそれらの発現産物の発現レベルを、例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカー、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーに由来する予後徴候について決定する。別の局面では、方法は、予後診断マーカーの全セット又はそれらの発現産物（例、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカー、又は表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、もしくは表Ｄに列挙するマーカーに由来する予後徴候について）の発現レベルの決定を含む。
【００８０】
追加の局面では、本発明は、２つ又はそれ以上のマーカー（例、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、もしくは表Ｄに列挙するマーカー、又は表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、もしくは表Ｄに列挙するマーカーに由来する予後徴候について）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイ（例、マイクロアレイ）に関する。特定の局面では、アレイは、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーに由来する予後徴候、又は例えば、予後徴候についてハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。別の特定の局面では、アレイは、マーカーの全セット（例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーについて、又は、例えば、予後徴候について）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【００８１】
これらのアレイでは、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、又はオリゴヌクレオチドにしてよく、それらをディスプレイする固形表面は例えばガラスでよい。ポリヌクレオチドは、本明細書で開示するマーカーの１つ又は複数のマーカー、例えば、全長配列、任意のコード配列、任意のフラグメント、又はそれらの任意の相補体にハイブリダイズできる。特定の局面では、１つ又は複数のＧＣＰＭの発現レベルにおける増加又は減少は、長期生存の可能性の減少（例、癌の再発に起因する）を示し、１つ又は複数のＧＣＰＭの発現レベルにおける増加又は減少の欠如は、癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加を示す。
【００８２】
さらなる局面では、本発明は、以下：（１）抽出緩衝液／試薬及びプロトコール；（２）逆転写緩衝液／試薬及びプロトコール；ならびに（３）定量的ＰＣＲ緩衝液／試薬及びプロトコール（先の方法のいずれかの実施に適する）の１つ又は複数を含むキットに関する。本発明の他の局面及び利点を、本明細書に含まれる説明及び実施例において例示する。
【００８３】
【表２】
表Ａ：高及び低増殖状態にある細胞株間で異なって発現される増殖関連遺伝子
コンフルエント（低増殖）及び半コンフルエント（高増殖）状態にある細胞株間で異なって発現された遺伝子（図１を参照のこと）を、30K MWG Biotechアレイでのマイクロアレイ解析により同定した。表Ａは、細胞増殖関連として遺伝子オントロジー分析により分類されたこれらの遺伝子のサブセットを含む。
【００８４】
【表３】
表Ｂ：公知の細胞増殖関連遺伝子遺伝子
オントロジー分析により細胞増殖関連として分類され、Affymetrix HG-U133プラットフォーム上に存在する全ての遺伝子
【００８５】
予後診断マーカー検出への一般的アプローチ
以下のアプローチ：ＧＣＰＭに選択的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したマイクロアレイアプローチ；ＧＣＰＭ特異的プライマー及びプローブを使用した腫瘍サンプルでのリアルタイムｑＰＣＲ；リンパ節、血液、血清、糞便、又は尿サンプルでの、ＧＣＰＭ特異的プライマー及びプローブを使用したリアルタイムｑＰＣＲ；酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）；抗マーカー抗体を使用した免疫組織化学的検査；及びコンピュータを使用したアレイ又はｑＰＣＲの分析は、ＧＣＰＭファミリーメンバーを含む増殖マーカーを検出するために使用できる非限定的な方法である。
【００８６】
他の有用な方法は、ノーザンブロッティング及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Parker and Barnes, Methods in Molecular Biology 106: 247-283 (1999)）；ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Hod, BioTechniques 13: 852-854 (1992)）；逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ； Weis et al., Trends in Genetics 8: 263-264 (1992)）；遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ； Velculescu et al., Science 270: 484-487 (1995)；及びVelculescu et al., Cell 88: 243-51 (1997)）、MassARRAY技術（Sequenom, San Diego, CA）、及び大規模並列徴候シークエンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による遺伝子発現解析（ＭＰＳＳ； Brenner et al., Nature Biotechnology 18: 630-634 (2000)）を含む。あるいは、特定の複合体（ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖、又はＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む）を認識できる抗体を用いてよい。
【００８７】
一次データを収集し、倍率変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）分析を実施できる（例えば、腫瘍組織及び非腫瘍組織におけるマーカー発現レベルの比較による；マーカー発現レベルと、再発腫瘍及び非再発腫瘍において測定されたレベルとの比較による；マーカー発現レベルと、転移を伴う又は伴わない腫瘍において測定したレベルとの比較による；マーカー発現レベルと、異なって病期分類された腫瘍において測定されたレベルとの比較による；マーカー発現レベルと、異なる増殖レベルを伴う細胞において測定されたレベルとの比較による）。ネガティブ又はポジティブな予後をこの分析に基づいて判断する。腫瘍マーカー発現のさらなる分析は、発現の増加又は減少を示すそれらのマーカーと、公知の胃腸腫瘍の発現プロファイルとのマッチングを含み、予後診断を提供する。
【００８８】
発現が増加していると結論付けるための閾値は、例えば、少なくとも１．５倍又は２倍の増加、そして代わりの実施態様では、少なくとも３倍の増加、４倍の増加、又は５倍の増加として提供する。発現が減少していると結論付けるための閾値は、例えば、少なくとも１．５倍又は２倍の減少、そして代わりの実施態様では、少なくとも３倍の減少、４倍の減少、又は５倍の減少として提供する。発現の増加又は減少が生じたと結論付けるための他の閾値を、本発明の精神から逸脱することなく選択できることが理解できる。
【００８９】
発現が増加していると結論付けるための閾値が、特定のマーカー及び、また、適用すべき特定の予測モデルに依存的であることも理解されうる。閾値は、一般的に、最低誤差率を伴う最高の感度及び選択性を達成するために設定するが、特定の臨床状況では変動が望ましくなりうる。所望の閾値を、任意の予測モデルの統計的変動性を考慮に入れて、十分なサイズの集団を分析することにより決定し、予測モデルを産生するために使用するサンプルのサイズから算出する。同じことを、発現が減少していると結論付けるための閾値の決定に適用する。発現の増加又は減少が生じていると結論付けるための他の閾値、又は閾値を確立するための方法を、本発明の精神から逸脱することなく選択できることが理解できる。
【００９０】
予測モデルが、その出力として、数値、例えば、スコア、可能性値、又は確率を産生しうることも可能である。これらの場合では、閾値を、予測モデルにより産生された結果を適用することが可能であり、そしてこれらの場合では、類似の原理を、発現値について閾値を設定するために使用されるものとして適用する。
【００９１】
ひとたび腫瘍サンプル中の１つ又は複数の増殖マーカーの発現レベルが得られれば、癌再発の可能性を次に判断できる。本発明によると、ネガティブな予後は少なくとも１つの増殖マーカーの発現減少に関連し、ポジティブな予後は少なくとも１つの増殖マーカーの発現増加に関連する。種々の局面では、発現における増加は、本明細書で開示するマーカーの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は７５により示される。他の局面では、発現における減少は、本明細書で開示するマーカーの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は７５により示される。
【００９２】
同定された遺伝子から、１つ又は複数のＧＣＰＭを含む増殖徴候を使用し、１つ又は複数の遺伝子の発現レベルを開示した増殖徴候と比較することにより、癌の予後を決定できる。開示した増殖徴候と腫瘍サンプル中での１つ又は複数のＧＣＰＭの発現を比較することにより、癌再発の可能性を判断できる。予後を確定するための予後徴候の発現レベルの比較を、先に記載した予測モデルを適用することにより行うことができる。
【００９３】
癌再発の可能性を判断することは、医師にとって大きな価値がある。再発の高い可能性は、より長期の又はより高用量の処置を与えるべきであることを意味し、患者は癌の再発の徴候についてより厳密にモニタリングされるべきである。正確な予後診断は、患者にも利益となる。それによって、患者は、患者の配偶者、家族、及び友人と共に、処置に関する決断、ならびに患者の将来及び生活様式の変化に関する決断を下すことも可能になる。従って、本発明は、また、腫瘍サンプル中のマーカーの発現を増殖徴候の差異とマッチングすることにより確立される予後診断に基づき、特定の癌のための処置計画を確立する方法を提供する。
【００９４】
マーカーの選択、又は増殖徴候の構築は、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに開示するＧＣＰＭに制限すべきではなく、しかし、開示した徴候からの１つ又は複数のＧＣＰＭの使用を含みうること、又は、新たな徴候を、開示したマーカーリストから選択されたＧＣＰＭを使用して確立できることが理解される。任意の徴候の必要条件は、それが、医師が処置計画を確立するために十分な正確性で再発の可能性を予測することである。
【００９５】
驚くべきことに、ＧＣＰＭの多くが細胞増殖の増加レベルに関連し、ポジティブな予後にも関連することが発見された。同様に、ＧＣＰＭの発現レベルの減少とネガティブな予後、例えば、胃腸癌再発の可能性増加との間の密接な相関が存在することが見出されている。従って、本発明は、また、細胞増殖に関連するマーカー、例えば、細胞周期成分のＧＣＰＭとしての使用を提供する。
【００９６】
本明細書に記載する通り、癌再発の可能性の判断は、１つ又は複数の増殖特異的マーカーの発現を測定することにより遂行できる。本明細書で提供する方法は、高感度なアッセイも含む。特に、ｑＰＣＲは極めて高感度であり、サンプル中の非常に低コピー数（例、１〜１００）のマーカーを検出するために使用できる。そのような感度により、胃腸癌の予後は、信頼でき、正確になり、テストが簡単になる。
【００９７】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
上に列挙する技術の内、最も高感度で最もフレキシブルな定量方法はＲＴ−ＰＣＲであり、正常組織及び腫瘍組織中で、薬物処置を伴う又は伴わない、異なるサンプル集団においてＲＮＡレベルを比較するために、発現のパターンを特徴付けるために、密接に関連するＲＮＡの間で識別するために、そしてＲＮＡ構造を解析するために使用できる。
【００９８】
ＲＴ−ＰＣＲでは、第１工程は標的サンプルからのＲＮＡの単離である。出発材料は、典型的に、ヒト腫瘍又は腫瘍細胞株、ならびにそれぞれ対応する正常組織又は細胞株から単離される全ＲＮＡである。ＲＮＡは、種々のサンプル、例えば、乳房、肺、大腸（例、大腸又は小腸）、結腸直腸、胃、食道、肛門、直腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾、胸腺、精巣、卵巣、子宮などからの腫瘍サンプル、原発腫瘍からの組織、又は腫瘍細胞株から、及び健康なドナーからのプールサンプルから単離できる。ＲＮＡの供給源が腫瘍である場合、ＲＮＡは、例えば、凍結又は保管されたパラフィン包埋、固定（例、ホルマリン固定）組織サンプルから抽出できる。
【００９９】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングでの第１工程は、ＲＮＡ鋳型のｃＤＮＡへの逆転写であり、ＰＣＲ反応でのその指数関数的増幅が続く。２つの最も一般に使用される逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉｌｏ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）及びモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写工程では、典型的に、発現プロファイリングの状況及び目的に依存して、特定のプライマー、ランダムヘキサマー、又はオリゴｄＴプライマーを使用してプライミングする。例えば、抽出ＲＮＡは、製造業者の説明書に従って、GeneAmp RNA PCR kit（Perkin Elmer, CA, USA）を使用して逆転写できる。派生するｃＤＮＡは、次に、続くＰＣＲ反応において鋳型として使用できる。
【０１００】
ＰＣＲ工程では種々の熱安定性ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを使用できるが、典型的には、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠く）を用いる。このように、ＴａｑＭａｎ（ｇ）ＰＣＲでは、典型的に、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するＴａｑポリメラーゼ又はＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用するが、しかし、等価な５’ヌクレアーゼ活性を伴う任意の酵素を使用できる。
【０１０１】
２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを生成する。第３のオリゴヌクレオチド、又はプローブは、２つのＰＣＲプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。このプローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素により伸長可能ではなく、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素で標識される。レポーター色素からの任意のレーザー誘導性発光は、２つの色素が、それらがプローブ上に存在する際に近接して位置する場合、クエンチング色素によりクエンチされる。増幅反応中、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的な様式でプローブを切断する。結果として生じるプローブフラグメントは、溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルには第２のフルオロフォアのクエンチング効果がない。１分子のレポーター色素が、合成された各々の新分子について遊離され、未クエンチリポーター色素の検出は、データの定量的解釈のための基礎を提供する。
【０１０２】
TaqMan RT-PCRは、市販の機器、例えば、ABI PRISM 7700tam Sequence Detection System(Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)、又はLightcycler(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)などを使用して実施できる。好ましい実施形態では、５’ヌクレアーゼ手順を、リアルタイム定量的ＰＣＲ装置（例えば、ABI PRISM 7700tam Sequence Detection Systemなど）で行なう。システムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、及びコンピュータから成る。このシステムでは、サーモサイクラー上の９６ウェルフォーマット中でサンプルを増幅する。増幅中、レーザー誘導性蛍光シグナルが、ファイバー光ケーブルを通じて、全９６個ウェルについてリアルタイムで収集され、ＣＣＤで検出される。このシステムは、機器を作動させ、データを分析するためのソフトウェアを含む。
【０１０３】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔ、又は閾値サイクルとして表される。上で考察した通り、蛍光値は、サイクル毎に記録され、増幅反応中のその点までに増幅された生成物の量を表す。蛍光シグナルが、統計的に有意であるとして最初に記録される点が、閾値サイクルである。
【０１０４】
誤差及びサンプル間変動の効果を最小化するために、ＲＴ−ＰＣＲは、通常、内部標準を使用して実施される。理想的な内部標準は、異なる組織間で一定レベルで発現され、実験的処理による影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びβ−アクチンのｍＲＮＡである。
【０１０５】
リアルタイム定量的ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲ技術のより最近のバリエーションは、リアルタイム定量的ＰＣＲであり、二重標識蛍光発生プローブ（即ち、TaqMan@プローブ）を通じてＰＣＲ産物の蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、定量的競合ＰＣＲ及び定量的比較ＰＣＲの両方に適合する。前者は各標的配列のための内部コンペティターを正規化のために使用し、後者はサンプル内に含まれる正規化遺伝子、又はＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する。さらなる詳細については、例えば、Held et al., Genome Research 6: 986-994 (1996)を参照のこと。
【０１０６】
発現レベルは、固定パラフィン包埋組織をＲＮＡ供給源として使用して決定できる。本発明の一局面によると、ＰＣＲプライマー及びプローブを、増幅すべき遺伝子中に存在するイントロン配列に基づいて設計する。この実施態様では、プライマー／プローブ設計の第一工程は、遺伝子内のイントロン配列の描写である。これは、例えばKent, W. J., Genome Res.12 (4): 656-64 (2002)により開発されたＤＮＡ ＢＬＡＴソフトウエアなど、公的に利用可能なソフトウエアにより、又はそのバリエーションを含むＢＬＡＳＴソフトウエアにより行うことができる。続く工程は、ＰＣＲプライマー及びプローブ設計の十分に確立された方法に従う。
【０１０７】
非特異的シグナルを回避するために、プライマー及びプローブを設計する際にイントロン内の反復配列をマスクすることが有用である。これは、Baylor College of Medicineを通じてオンラインで利用可能なRepeat Maskerプログラムを使用することにより簡単に遂行でき、反復エレメントのライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復エレメントがマスクされているクエリー配列を戻す。マスクされた配列を次に使用し、任意の市販の、又は、そうでなければ公的に利用可能なプライマー／プローブ設計パッケージ（例えばPrimer Express（Applied Biosystems）；ＭＧＢ ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Applied Biosystems）；一般ユーザー及び生物学者プログラマーのためのＷＷＷ上のＰｒｉｍｅｒ３（Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 (Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)）など）を使用して、プライマー及びプローブの配列を設計できる。
【０１０８】
ＰＣＲプライマー設計において最も重要だと考えられている要素は、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、及びＧ／Ｃ含量、特異性、相補的プライマー配列、及び３’末端配列を含む。一般に、最適なＰＣＲプライマーは一般的に長さ１７〜３０塩基あり、約２０〜８０%、例えば、約５０〜６０%のＧ＋Ｃ塩基を含む。５０と８０℃の間のＴｍ、例えば、約５０〜７０℃が典型的に好ましい。ＰＣＲプライマー及びプローブ設計のためのさらなるガイドラインについては、例えば、Dieffenbach, C. W. et al., General Concepts for PCR Primer Design in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp.133-155;Innis and Gelfand, Optimization of PCRs in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp.5-11;及びPlasterer, T. N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70: 520-527 (1997)を参照のこと。これらの全開示が参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【０１０９】
マイクロアレイ解析
遺伝子発現の差異は、また、マイクロアレイ技術を使用して同定又は確認できる。このように、ＧＣＰＭの発現プロファイルは、新鮮な腫瘍組織又はパラフィン包埋腫瘍組織のいずれかにおいて、マイクロアレイ技術を使用して測定できる。この方法では、目的のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを含む）を、マイクロチップ基材上に配置、又は整列させる。整列させた配列（即ち、捕捉プローブ）を、次に、目的の細胞又は組織からの特異的ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる。ＲＴ−ＰＣＲ方法と同様に、ＲＮＡの供給源は、典型的に、ヒト腫瘍又は腫瘍細胞株、及び対応する正常組織又は正常細胞株から単離された全ＲＮＡである。このように、ＲＮＡは、種々の原発腫瘍又は腫瘍細胞株から単離できる。ＲＮＡの供給源が原発腫瘍である場合、ＲＮＡは、例えば、凍結又は保管されたパラフィン包埋固定（例、ホルマリン固定）組織サンプルから抽出でき、これらは日常的に調製され、日々の診療で保存される。
【０１１０】
マイクロアレイ技術の特定の実施形態では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅インサートを基材に適用する。基材は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は７５までのヌクレオチド配列を含みうる。他の局面では、基材は少なくとも１０，０００のヌクレオチド配列を含みうる。マイクロアレイ配列は、マイクロチップ上に固定され、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適する。他の実施態様として、マイクロアレイのための標的は、少なくとも５０、１００、２００、４００、５００、１０００、もしくは２０００塩基長；又は５０〜１００、１００〜２００、１００〜５００、１００〜１０００、１００〜２０００、もしくは５００〜５０００塩基長でありうる。さらなる実施態様として、マイクロアレイのための捕捉プローブは、少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、８０、もしくは１００塩基長；又は１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜５０、１０〜７５、１０〜８０、もしくは２０〜８０塩基長でありうる。
【０１１１】
蛍光標識ｃＤＮＡプローブは、目的の組織から抽出したＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの取り込みを介して生成されうる。チップに適用された標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットに特異性を伴ってハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄の後、チップを、共焦点レーザー顕微鏡又は別の検出方法（例えば、ＣＣＤカメラなど）によりスキャンする。整列した各エレメントのハイブリダイゼーションの定量によって、対応するｍＲＮＡ量の判定が可能になる。２色蛍光を用いて、ＲＮＡの２つの供給源から生成した別々に標識されたｃＤＮＡプローブは、対でアレイにハイブリダイズされる。各々の特定遺伝子に対応する２つの供給源からの転写物の相対量は、このように、同時に決定される。
【０１１２】
小型スケールのハイブリダイゼーションは、多数の遺伝子での発現パターンの簡便で迅速な評価を与える。そのような方法は、稀な転写物（１細胞当たり数コピーで発現され、発現レベルにおいて少なくとも約２倍の差異で再現性を持って検出される）を検出するために必要とされる感度を有することが示されている（Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (2): 106-149 (1996)）。マイクロアレイ解析は、例えば、Affymetrix GenChip技術又はIncyteのマイクロアレイ技術を使用することにより、製造業者のプロトコールに従って、市販の機器により実施できる。遺伝子発現の大規模解析のためのマイクロアレイ方法の開発によって、種々の腫瘍型での癌分類及び転帰予測の分子マーカーを体系的に探索することが可能になる。
【０１１３】
ＲＮＡの単離、精製、及び増幅
ｍＲＮＡ抽出のための一般的方法は当技術分野において周知であり、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)を含む、分子生物学の標準的テキストに開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出のための方法は、例えば、Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987)、及びDe Sandres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995)に開示されている。特に、ＲＮＡ単離は、例えばＱｉａｇｅｎなどの製造業者からの精製キット、緩衝液セット、及びプロテアーゼを使用し、製造業者の説明書に従って実施できる。例えば、培養中の細胞からの全ＲＮＡを、Qiagen RNeasyミニカラムを使用して単離できる。他の市販のＲＮＡ単離キットは、MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit（EPICENTRE(D, Madison, WI)）、及びParaffin Block RNA Isolation Kit（Ambion, Inc.）を含む。組織サンプルからの全ＲＮＡをRNA Stat-60（Tel-Test）を使用して単離できる。腫瘍から調製したＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心法により単離できる。
【０１１４】
ＲＮＡ供給源として固定パラフィン包埋組織を使用して遺伝子発現をプロファイリングするための代表的なプロトコールの工程（ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長、及び増幅を含む）が、種々の刊行された学術論文（例えば：T. E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)）に与えられる。簡単に説明すると、代表的なプロセスは、パラフィン包埋腫瘍組織サンプルを厚さ約１０μmの切片に切断することから開始する。ＲＮＡを次に抽出し、そしてタンパク質及びＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の分析後、必要な場合、ＲＮＡ修復及び／又は増幅の工程を含めてよく、ＲＮＡは遺伝子特異的プロモーターを使用して逆転写し、ＲＴ−ＰＣＲが続く。最後に、データを解析し、検証した腫瘍サンプルで同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づき、患者に利用可能な最善の処置選択肢を特定する。
【０１１５】
免疫組織化学及びプロテオミクス
免疫組織化学的方法は、また、本発明の増殖マーカーの発現レベルを検出するのに適する。このように、抗体又は抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、及び最も好ましくは各マーカーに特異的なモノクローナル抗体を使用して、発現を検出する。抗体は、抗体自体を、例えば、放射性標識、蛍光標識、ハプテン標識（例えば、ビオチン）、又は酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）での直接標識により検出できる。あるいは、未標識一次抗体を標識二次抗体（一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清、又はモノクローナル抗体を含む）と共に使用する。免疫組織化学プロトコール及びキットは、当技術分野において周知であり、市販されている。
【０１１６】
プロテオミクスを使用し、特定の時点でサンプル（例、組織、生体、又は細胞培養物）中に存在するポリペプチドを分析できる。特に、プロテオミクス技術を使用し、サンプル中でのタンパク質発現の包括的変化を評価できる（「発現プロテオミクス」とも呼ばれる）。プロテオミクス分析は、典型的に、以下：（１）サンプル中の個々のタンパク質の２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ ＰＡＧＥ）による分離；（２）ゲルから回収された個々のタンパク質の同定（例、質量分析又はＮ末端シークエンシング）、及び（３）バイオインフォマティクスを使用したデータの分析を含む。プロテオミクス方法は、遺伝子発現プロファイリングの他の方法への価値ある補完であり、単独又は他の方法との組み合わせで使用し、本発明の増殖マーカーの産物を検出できる。
【０１１７】
異なって発現される遺伝子の選択
有意と見なされる遺伝子の選択への早期アプローチは、目的の２群間での所定の遺伝子の「倍率変化」を単に見ることを含む。このアプローチでは最も目覚ましく変化すると思われる遺伝子に焦点を合わせ、基礎統計の考察によって、分散（又はノイズレベル）が非常に高い場合（マイクロアレイ実験でしばしば見られる）、外見的に大きな倍率変化が偶然だけにより頻繁に起こりうることを認める。
【０１１８】
マイクロアレイ実験、例えば本明細書に記載するものなどは、典型的に、数千の遺伝子の同時測定を含む。２群間（例えば、再発性腫瘍及び非再発性腫瘍）で特定の遺伝子について発現レベルを比較している場合、有意性についての典型的な検定（例えば、ｔ検定など）は適切ではない。これは、数千の実験のアンサンブルで（この状況では、各遺伝子が「実験」を構成する）、少なくとも１つの実験が有意性についての通常の基準を偶然だけにより合格する確率は本質的に単一であるからである。有意性についての検定では、典型的に、「帰無仮説」が正確である確率を算出する。２群を比較する場合、帰無仮説は、２群間に差異が存在しないことである。統計的検定が、ある閾値（通常、０．０５又は０．０１）を下回る帰無仮説についての確率を産生する場合、本発明者らは帰無仮説を拒絶し、２群が有意に異なるとの仮説を受け入れることが述べられている。明らかに、そのような検定では、偶然だけによる帰無仮説の拒絶が、２０分の１（又は１００分の１）で予測されうる。ｔ検定、又は有意性についての他の類似の統計的検定の使用は、マイクロアレイとの関連で失敗し、ずっと多くの偽陽性（又は第一種過誤）を産生する。
【０１１９】
この型の状況では、複数の仮説を同時に検定し、典型的な複数の比較手順、例えばボンフェローニの方法（４３）などを適用する。しかし、そのような検定は、大半のマイクロアレイ実験で保存的すぎ、多くの偽陰性（第二種）過誤をもたらす。
【０１２０】
より最近のアプローチは、所定の検定が有意である確率を適用する試みを使用せず、実験のサブセットを選択する手段を確立し、第一種過誤の予測される割合（又は偽発見率；４７）が制御されるようにする。それは、この研究で使用されてきたこのアプローチであり、種々の実行、即ち、BRB Array Tools（４８）、及びBioconductor（Ｒ統計的環境を使用する；１０、３９）のlimma（１１、４２）パッケージを用いて提供される方法を介する。
【０１２１】
データマイニングのための一般的方法論：予後徴候の生成
データマイニングは、「知識」の抽出、換言すると、「ノウハウ」、又は（通常）大量のデータ（データセット）からの予測能を記載するために使用する用語である。これは、予後徴候を生成するためにこの試験で使用するアプローチである。この試験の場合、「ノウハウ」は、所定のセットの遺伝子発現測定値からの予後、又は「徴候」を的確に予測するための能力である（一般的にこのセクションにおいて、及び、実施例のセクションにおいて詳細に記載される）。
【０１２２】
この試験で使用される方法で使用される特定の詳細を、実施例１７〜２０に記載する。しかし、データマイニング方法（実施例に記載の方法、及び本明細書に記載の方法の両方）のいずれの適用も、この一般的プロトコールに従う。
【０１２３】
データマイニング（４９）、及び関連するトピック機械学習（４０）は複雑で反復的な数学的課題であり、１つ又は複数の適切なコンピューターソフトウェアパッケージ（以下を参照のこと）の使用を含む。ソフトウェアの使用は他方で有利である（仮に正確な方法論に固執する場合、データマイニング技術の使用に成功するために、各技術の背後にある理論の複雑さに完全に精通する必要はない）。不利点は、データマイニングの適用がしばしば「ブラックボックス」と見なされうることである：データを挿入し、回答を受け取る。これをどのように達成するかは、エンドユーザーからしばしばマスクされている（これは、記載の技術の多くの場合であり、データマイニングのための選ばれた統計的方法にしばしば影響を与えうる）。例えば、ニューラルネットワーク及びサポートベクターマシンは、特に複雑な実行を有し、エンドユーザーが決断を産生するために使用する「規則」を抽出することを非常に困難にする。他方で、ｋ−最近隣法及び線形判別分析は、ユーザーから隠されていない意思決定のための非常に透明なプロセスを有する。
【０１２４】
データマイニングで使用する２つの型のアプローチが存在する：教師あり（supervised）アプローチ及び教師なし（unsupervised）アプローチ。教師ありアプローチでは、データと関連付けれらる情報は公知である（例えば、カテゴリーデータ（例、再発性腫瘍対非再発性腫瘍））。必要とされるものは、観察された応答（例、再発性対非再発性）と入力変数を関連付ける能力である。教師なしアプローチでは、データセット内のクラスは事前に公知ではなく、データマイニング方法論を用いて、データセット内のクラス又は構造を見出すことを試みる。
【０１２５】
本実施例では教師ありアプローチが使用されたが、本明細書で詳細に考察され、他の技術のいずれかが使用されうると理解される。
【０１２６】
全プロトコールは以下の工程を含む：
【０１２７】
● データ表示。これは、選ばれたデータマイニング技術で作業を成功する可能性が最も高い形態へのデータ変換を含む。データが数値である、例えば研究中のデータが遺伝子発現の相対レベルを表わすこの試験などの場合では、これはかなり単純である。データが大きなダイナミックレンジ（即ち、多くの桁）を対象とする場合、しばしばデータの対数を取る。データが、別々の日での別々の研究者による別々のサンプルでの多くの測定値を対象とする場合、特別な注意を払い、系統誤差が最小化されることを保証しなければならない。系統誤差（即ち、プロトコールの差異、マシンの差異、操作者の差異、及び他の定量可能因子に起因する誤差）の最小化は、本明細書で「正規化」と呼ばれるプロセスである。
【０１２８】
● 特性選択。典型的に、データセットは、日常的に測定するために実際的でありうるより多くのデータエレメント、及び、追加で、予測モデルを産生するために必要とされる情報を提供しない多くのエレメントを含む。予測モデルがデータセットを記載する実際の能力は、データセットの全次元の特定のサブセットに由来する。これらの次元は、データセットの最も重要な成分（又は特性）である。マイクロアレイデータに関連し、データセットの次元は個々の遺伝子であることに注意すること。特性選択は、本明細書の記載に関連し、最も「異なって発現」されるそれらの遺伝子を見出すことを含む。より一般的な意味で、それは有意性についての特定の統計的検定に合格するそれらの群を含み、即ち、研究中の１つ又は他の群において一貫してより高い又はより低い特定の変数のレベルである。時折、特性は、最も大きな分散を示すそれらの変数（又は次元）である。
【０１２９】
特性選択の適用は、予測モデルを作るために使用される方法に完全に非依存的であり、所望の結果を達成するための多大の実験を含む。本発明内で、有意な遺伝子、及びより早期の成功モデル（ＮＺ分類子）と相関する遺伝子の選択は、特性選択を伴った。また、データ整理の方法（例えば主成分分析など）をデータセットに適用できる。
【０１３０】
● 訓練。ひとたびクラス（例、再発／非再発）及びデータセットの特性が確立されており、データがデータマイニングのための入力として容認できる形態で表わされた場合、低下したデータセット（特性により記載される）を選択肢の予測モデルに適用する。このモデルのための入力は、通常、多次元数値入力の形態であり（ベクターとして公知）、出力情報（クラスラベル又は応答）と関連する。訓練プロセスにおいて、選択されたデータを、連続的（ニューラルネットワークなどの技術において）又は全体として（特定の形態の回帰を適用する技術、例えば線形モデル、線形判別分析、サポートベクターマシンにおいて）のいずれかで予測モデル中に入力する。特定の例（例、ｋ−最近隣法）では、データセット（又は特性選択後に得られるデータセットのサブセット）はそれ自体がモデルである。考察した通り、効果的モデルを、詳細な数学の最小限の理解により、種々のソフトウェアパッケージの使用を通じて確立でき、ここでモデルのパラメータは、成功の結果を導く可能性が最も高いように専門分析者により事前に決定されている。
【０１３１】
● バリデーション。これは、データマイニングプロトコールの重要な構成要素であり、この不正確な適用は頻繁に誤差を招く。データセットの部分は別に、特性選択及び訓練とは別に設定すべきであり、予測モデルの成功をテストする。さらに、バリデーションの結果を使用して、特性選択及びモデルの訓練をもたらす場合、それを現実の状況に適用する前にモデルをテストするためのさらなるバリデーションセットを得る。このプロセスがモデルに厳密に従わない場合、現実世界の状況において失敗する可能性が高い。バリデーションの方法を、以下により詳細に記載する。
【０１３２】
● 適用。ひとたにモデルが構築され、バリデーションされれば、それはエンドユーザーに利用可能な特定の方法でパッケージしなければならない。これは、しばしば、特定の形態のスプレッドシートアプリケーション（その中にモデルを包埋している）、統計ソフトウェアパッケージのスクリプト記述、又は情報技術スタッフによるハードコードされたアプリケーション中へのモデルのリファクタリングの実行を含む。
【０１３３】
頻繁に使用されるソフトウェアパッケージの例：
− スプレッドシートプラグイン（複数の業者から得られる）
− Ｒ統計環境
− 市販パッケージMatLab、S-plus、SAS、SPSS、STATA
− フリーのオープンソースソフトウェア、例えばOctave（MatLab clone）など
− 多くの多様なＣ＋＋ライブラリー、市販のクローズソース設定における予測モデルの実行のために使用できる。
【０１３４】
データマイニング方法の例
方法は、最初にデータマイニングプロセスの工程（上記）を実施し、次に適切な公知のソフトウェアパッケージを適用することによることができる。データマイニングのプロセスのさらなる説明が、多くの極めて良く書かれたテキストに詳細に記載される（４９）。
【０１３５】
● 線形モデル（４９、５０）：データを線形回帰モデルの入力として処理し、その中ではクラスラベル又は応答変数が出力である。クラスラベル、又は他のカテゴリーデータを、数値（通常は整数）に変換しなければならない。一般化された線形モデルでは、クラスラベル又は応答変数は、それ自体が入力データに直線的に関連せず、しかし、「リンク関数」の使用を通じて変換される。ロジスティック回帰は一般化された線形モデルの最も共通の形態である。
【０１３６】
● 線形判別分析（４９、５１、５２）：データを直線的に分離可能である場合（即ち、データの群又はクラスを超平面（閾値のｎ次元延長である）により分離できる）、この技術を適用できる。変数の組み合わせを使用してクラスを分離し、群間分散を最大化し、そして群内分散を最小化する。この副産物は、分類規則の形成である。この規則の未知クラスのサンプルへの適用によって、そのサンプルのために作るべきクラスメンバーシップの予測又は分類が可能になる。線形判別分析、例えばマイクロアレイ解析のために共通に使用される最短収縮重心法（ｎｅａｒｅｓｔ ｓｈｒｕｎｋｅｎ ｃｅｎｔｒｏｉｄ）の変動が存在する。
【０１３７】
● サポートベクターマシン（５３）：変数のコレクションを、加重のコレクションと併用し、それらの加重変数に関するクラス間の分離を最大化するモデルを決定する。このモデルのサンプルへの適用によって、次に、そのサンプルでのクラスメンバーシップの分類又は予測が産生される。
【０１３８】
● ニューラルネットワーク（５２）：データをノードのネットワーク（生物学的ニューロンと表面的に似ている）中への入力として処理し、それらが連結されている全てのノードからの入力を適用し、そして入力が出力に変換される。通常、ニューラルネットワークでは「乗加算（ｍｕｌｔｉｐｌｙ ａｎｄ ｓｕｍ）」アルゴリズムを使用し、複数の連結入力ノードからの入力を単一出力に変換する。ノードは、そのノードへの入力が特定の閾値を超えない場合、必ずしも出力を産生しないであろう。各ノードは、その入力として、いくつかの他のノードからの出力を有しており、通常、最終出力ノードはカテゴリー変数に関連付けられている。ノードの数、及びノードのトポロジーは、ほとんど無限の方法で変動でき、他の方法ではカテゴリー化することが可能ではないであろう、極めてのノイズのあるデータを分類する能力を提供する。ニューラルネットワークの最も共通の実行は、多層パーセプトロンである。
【０１３９】
● 分類ツリー及び回帰ツリー（５４）：これらでは、変数を使用し、サンプルのクラスを決定するために段階的方法で従うことができる規則の階層を定義する。典型的プロセスでは、特定クラス出力、又は判別能力の具体的記載を導く一連の規則が作られる。例の分類ツリーは、例えば以下：
if gene A> x and gene Y > x and gene Z = z
then
class A
else if geneA = q
then
class B
のアルゴリズムの実行である。
【０１４０】
● 最短距離法（５１、５２）
予測又は分類は、サンプル（未知のクラス）をその周囲のもの（公知のクラス）と比較することにより行い、近似を距離関数により定義する。多くの異なる距離関数を定義することが可能である。通常使用される距離関数は、ユークリッド距離（ピタゴラス距離の（三角測量と同様の）ｎ次元への延長）、種々の形態の相関（ピアソン相関係数を含む）である。また、通常は、意味のある距離メトリックにより相互に連結されないであろうデータポイントをユーグリッド空間に変換する変換関数が存在し、ユーグリッド距離を次に適用できる（例、マハラノビス距離）。距離メトリックは非常に複雑でありうるが、ｋ−最近接法の基本となる前提は非常に単純であり、本質的に「未知の入力と最も類似のｋ−データベクターを見出し、それらがいずれのクラスに対応するかを見出し、そして未知の入力がいずれのクラスであるのかに関して投票する」との再記載である。
【０１４１】
● 他の方法：
− ベイジアン・ネットワーク
有向非巡回グラフを使用し、それらの同時確率分布との併用で変数のコレクションを表わし、それを次に使用し、サンプルについてのクラスメンバーシップの確率を決定する。
− 独立成分分析、ここでは独立シグナル（例、クラスメンバーシップ）を変数のコレクションから（成分中に）単離する。これらの成分を次に使用し、サンプルについてのクラスメンバーシップの分類又は予測を産生できる。
集合学習法は、予測方法のコレクションを合わせ、サンプルについてのクラスメンバーシップの同時分類又は予測を産生する。
【０１４２】
探索できるこれらの方法論の多くのバリエーションが存在し、多くの新たな方法論が常に定義され、開発されている。容認できる結果を得るために、これらの方法論のいずれかを適用できることが理解される。全ての結果が包括的バリデーション計画を介してテストされることを保証することにより、注意し、過剰適合を回避しなければならない。
【０１４３】
バリデーション
記載の予測モデルのいずれかの適用は、方法を新たなデータセット（例えば臨床試験からのデータなど）に適用できる前に、訓練及びクロスバリデーション（４３、５５）の両方を含む。訓練は、目的のデータセットのサブセット（この場合では、結腸直腸癌からの遺伝子発現測定）を取ることを含み、テスト中のクラス（この場合では、再発性腫瘍及び非再発性腫瘍）にわたり層別化する。この訓練セットを使用し、予測モデル（上で定義する）を生成し、それをデータの残り（テストセット）についてテストする。
【０１４４】
テストセットにおいてより良好な成績を得るために予測モデルのパラメータを変更することが可能であるが、しかし、これは過剰適合として公知の状況を導き、ここでは予測モデルが訓練データセットに作用するが、しかし、任意の外部データセットには作用しない。これを回避するために、バリデーションのプロセスに従う。典型的に適用される２つの主な型のバリデーションが存在し、第１（ホールドアウトバリデーション）はデータセットを３群に分割することを含む：テスト、訓練、及びバリデーション。バリデーションセットは、訓練プロセス中へのいかなる入力も有さず、パラメータの任意の調整又は他の改良が、テストセット（バリデーションセットではない）への適用中に起こらなければならない。第２の主な型はクロスバリデーションであり、それは、以下に記載するいくつかの異なる方法で適用できる。
【０１４５】
２つの主な亜型のクロスバリデーションが存在する：Ｋ倍クロスバリデーション及び１個抜き（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ）クロスバリデーション。
【０１４６】
Ｋ倍クロスバリデーション：データセットをＫサブサンプルに分け、各サブサンプルがオリジナルとほとんど同じ割合のクラスグループを含む。各回のバリデーション中に、Ｋサブサンプルの１つを取っておき、そして訓練はデータセットの残りを使用して達成する。その回での訓練の有効性は、１個抜き群の分類がどの程度正確であるかにより測る。この手順はＫ回繰り返し、そして全有効性が、公知のクラスを伴う予測クラスの比較により確認される。
【０１４７】
１個抜きクロスバリデーション：通常使用されるＫ倍クロスバリデーションの変動（Ｋ＝ｎ；ｎはサンプル数である）。
【０１４８】
ＣＣＰＭＳの組み合わせは、例えば表１及び２に上に記載するものなどであり、予後診断のための予測モデルを構築するために使用できる。
【０１４９】
予後徴候
予後徴候は、１つ又は複数のこれらのマーカーを含み、徴候に由来する１つ又は複数の予測モデルの適用を通じて患者の転帰を判断するために使用できる。特に、臨床医又は研究者は、徴候における１つ又は複数の発現差異（例、発現の増加又は減少）を判断し、予測モデルを適用し、それによりネガティブな予後（患者の疾患再発の可能性）又は、代わりにポジティブな予後（寛解の継続）の可能性を予測できる。
【０１５０】
さらなる局面では、本発明は、癌の処置計画の決定方法を含み、以下：（ａ）癌サンプルの提供；（ｂ）サンプル中のＧｇＣＰＭファミリーメンバーの発現レベルの検出；（ｃ）ＣＣＰＭファミリーメンバーの発現レベルに基づく癌の予後の判断；及び（ｄ）予後診断に従った処置計画の決定を含む。
【０１５１】
さらなる局面では、本発明は、ＧＣＰＭを検出するための装置を含み、以下：その上にＧＣＰＭ捕捉試薬を有する基材；及び基材に関連する検出器を含む、検出器は捕捉試薬に関連するＧＣＰＭを検出可能である。追加の局面は、癌を検出するためのキットを含み、以下：基材；ＧＣＰＭ捕捉試薬；及び使用説明書を含む。本発明のさらなる局面は、ｑＰＣＲを使用してａＧＣＰＭを検出するための方法を含み、以下：ＣＣＰＭに特異的なフォワードプライマー；ＧＣＰＭに特異的なリバースプライマー；ＰＣＲ試薬；反応バイアル；及び使用説明書を含む。
【０１５２】
本発明の追加の局面は、ＧＣＰＭポリペプチド又はペプチドの存在を検出するためのキットを含み、以下：ＧＣＰＭポリペプチド又はペプチドのための捕捉試薬を有する基材；ＧＣＰＭポリペプチド又はペプチドに特異的な抗体；ＧＣＰＭポリペプチド又はペプチドのための結合抗体を標識可能な試薬；及び使用説明書を含む。
【０１５３】
さらなる局面では、本発明は、結腸直腸癌の予後を判断するための方法を含み、以下の工程：結腸直腸癌を有することが疑われる患者からの腫瘍サンプルの提供；ＥＬＩＳＡ方法を使用したＧＣＰＭポリペプチドの存在の測定を含む。本発明の特定の局面では、本発明のＧＣＰＭは、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに示すマーカーから選択される。さらなる局面では、ＧＣＰＭは予後徴候に含まれる。
【０１５４】
胃腸癌、例、胃癌及び結腸直腸癌について本明細書で例示され、本発明のＧＣＰＭでは、他の癌（例、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌（例えば腺癌及び、特に、小細胞肺癌など）、リンパ腫、神経膠腫、芽細胞腫（例、髄芽細胞腫）、及び中皮腫）の予後診断のための使用も見出され、減少した又は低い発現はポジティブな予後に関連し、増加した又は高い発現はネガティブな予後に関連する。
【０１５５】
実施例
本明細書に記載する実施例は、本発明の実施態様を例証する目的のためである。分析の他の実施態様、方法、及び型は、分子診断技術における当業者の範囲内であり、本明細書では詳細に記載する必要はない。当技術分野の範囲内の他の実施態様は、本発明の一部と見なされる。
【０１５６】
実施例１：細胞培養
実験計画を図１に示す。１０の結腸直腸細胞株を培養し、半コンフルエンス及び完全コンフルエンスで回収した。２つの成長段階の遺伝子発現プロファイルを３０，０００オリゴヌクレオチドアレイで解析し、遺伝子増幅徴候（ＧＰＳ；表Ｃ）を、異なって発現される遺伝子の遺伝子オントロジー分析により同定した。教師なしクラスタリングを次に使用し、ＧＰＳ発現の類似性に基づき、臨床の結腸直腸サンプルの２つのコホート（コホートＡ：７３オリゴアレイ上の病期Ｉ−ＩＶ、コホートＢ：５５ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ上の病期ＩＩ）を独立的に二分した。Ｋｉ−６７免疫染色は、コホートＡ腫瘍からの組織切片でも実施した。これに従い、増殖活性と臨床病理学的パラメータの間の相関を研究した。
【０１５７】
異なる病期に由来する１０の結腸直腸癌細胞株が、本試験に含まれた：ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−８、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、Ｌｓ１７４Ｔ、ＳＫ−ＣＯ−１、ＳＷ４８、ＳＷ４８０、及びＳＷ６２０（ATCC, Manassas, VA）。細胞を、３７℃の５% ＣＯ２加湿空気中で、１０%ウシ胎児血清、１００IU/mlペニシリン及び１００μg/mlストレプトマイシン（GIBCO-Invitrogen, CA）を添加したアルファ最小必須培地中で培養した。２つの細胞培養物を、各細胞株について確立した。第１の培養物を、半コンフルエント（５０〜６０%）に達した時に回収した。第２の培養物中の細胞が完全コンフルエントに達した際（顕微鏡的及び肉眼的の両方で判断した）、培地を交換し、そして細胞を２４時間後に回収し、成長阻止細胞からＲＮＡを調製した。アレイ実験を、各細胞培養物から抽出したＲＮＡで行った。また、第２の培養実験を同じ手順に従って行い、抽出ＲＮＡを色素逆転（ｄｙｅ−ｒｅｖｅｒｓｅｄ）ハイブリダイゼーションのために使用した。
【０１５８】
実施例２：患者
２つのコホートの患者を解析した。コホートＡは、ダニディン及びオークランドの病院で１９９５〜２０００年の間に外科手術を受けた７３人のニュージーランドの結腸直腸癌患者を含んだ。これらの患者は前向きコホート試験の一部であり、全ての病期を含んだ。腫瘍サンプルを手術現場から新たに収集し、液体窒素中で急速凍結し、そして−８０℃で保存した。標本は１人の病理学者（Ｈ−Ｓ Ｙ）により精査され、ＴＮＭシステム（３４）に従って病期分類された。７３人の患者の内、３２人が疾患再発を発生し、４１人が最低５年間の追跡調査後に無再発のままであった。全生存期間の中央値は、再発性患者及び無再発患者でそれぞれ２９．５ヶ月間及び６６ヶ月間であった。２０人の患者が５−ＦＵベースの術後アジュバント化学療法を受け、１２人の患者が放射線療法を受けた（術前７人及び術後５人）。
【０１５９】
コホートＢは、Technical University of Munichで１９９５〜２００１年に外科手術を受けた５５人のドイツ人結腸直腸癌患者の群を含み、新鮮凍結サンプルを組織バンクに保存した。５５人全てが病期ＩＩ疾患を有し、２６人が疾患再発を発生し（生存期間の中央値４７ヶ月）及び２９人が無再発のままであった（生存期間の中央値８２ヶ月）。患者のいずれも化学療法又は放射線療法を受けなかった。両コホートの臨床病理学的変数を、表２の一部としてまとめる。
【０１６０】
【表４】
【０１６１】
実施例３：アレイの調製及び遺伝子発現解析
コホートＡの腫瘍及び細胞株：組織サンプル及び細胞株をホモジナイズし、そしてＲＮＡをTri-Reagent（Progenz, Auckland, NZ）を使用して抽出した。ＲＮＡを次に、RNeasy mini column（Qiagen, Victoria, Australia）を使用し、製造業者のプロトコールに従って精製した。各培養物又は腫瘍サンプルから抽出した１０マイクログラムの全ＲＮＡを、オリゴｄＴプライミングし、そしてｃＤＮＡ合成をａａ−ｄＵＴＰ及びSuperscript II RNase H-Reverse Transcriptase（Invitrogen）の存在下で行った。Ｃｙ色素を、間接的アミノ−アリルｃＤＮＡ標識方法を使用してｃＤＮＡ中に取り込ませた。１２の異なる細胞株のプールに由来するｃＤＮＡを、全てのハイブリダイゼーションのための参照として使用した。個々の結腸直腸癌の細胞株又は組織サンプルからのＣｙ５−ｄＵＴＰタグ付きｃＤＮＡを、参照サンプルからのＣｙ３−ｄＵＴＰタグ付きｃＤＮＡと合わせた。混合物を次にQiaQuick PCR purification Kit（Qiagen, Victoria, Australia）を使用して精製し、MWG 30K Oligo Set（MWG Biotech, NC）でスポットしたマイクロアレイに同時ハイブリダイズした。第２の培養実験からのｃＤＮＡサンプルを、追加で、リバース標識を使用してマイクロアレイで分析した。
【０１６２】
アレイをGenePix 4000B Microarray Scannerでスキャンし、データをGenePix Pro 4.1 Microarray Acquisition and Analysis Software（Axon, CA）を使用して解析した。各チャネルからの前景強度をｌｏｇ２変換し、ＳＮＯＭＡＤソフトウェア（３５）を使用して正規化した。正規化値を照合し、BRB-Array Tools Version 3.2（Dr. Richard Simon and Amy Peng Lam, Biometric Research Branch, National Cancer Instituteにより開発）を使用して選別した。低強度遺伝子、及び組織サンプル又は細胞株にわたる測定値の２０%超が失われている遺伝子は、さらなる解析から除外した。
【０１６３】
コホートＢ腫瘍：全ＲＮＡを各腫瘍からRNeasy Mini Kitを使用して抽出し、RNeasy Columns（Qiagen, Hilden, Germany）で精製した。１０マイクログラムの全ＲＮＡを使用し、SuperScript II reverse transcriptase（GIBCO-Invitrogen, NY）及びオリゴｄＴ−Ｔ７プライマー（Eurogentec, Koeln, Germany）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ビオチン化ｃＲＮＡを、二本鎖ｃＤＮＡからPromega RiboMax T7-kit（Promega, Madison, WI）及びBiotin-NTP labelling mix（Loxo, Dossenheim, Germany）を使用して合成した。次に、ビオチン化ｃＲＮＡを精製し、断片化した。断片化ｃＲＮＡをAffymetrix HGU133A GeneChips（Affymetrix, Santa Clara, CA）にハイブリダイズし、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで染色した。アレイを次にＨＰアルゴンイオンレーザー共焦点顕微鏡を用いてスキャンし、デジタル画像データをAffymetrix（登録商標）Microarray Suite 5.0 Softwareを使用して処理した。全てのAffymetrix U133A GeneChipが、異常な特徴を伴うスキャンを除去するための品質管理に合格した。バックグラウンド補正及び正規化を、Ｒコンピュータ環境中で、Bioconductor package affy中で実行されたロバストマルチアレイアベレージ関数を使用して実施した。
【０１６４】
実施例４：定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
１１の遺伝子（ＭＡＤ２Ｌ１、ＰＯＬＥ２、ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＲＡＮＳＥＨ２Ａ、ＴＯＰＫ、ＫＰＮＡ２、Ｇ２２Ｐ１、ＰＣＮＡ、及びＧＭＮＮ）の発現を、細胞培養物からのｃＤＮＡを使用してバリデーションした。全ＲＮＡ（２μg）をSuperscript II RNase H-Reverse Transcriptase kit（Invitrogen）及びオリゴｄＴプラマー（Invitrogen）を使用して逆転写した。ＱＰＣＲを、ABI Prism 7900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems）で、Taqman Gene Expression Assays（Applied Biosystems）を使用して実施した。相対的倍率変化を、内部コントロールとしてTopoisomerase 3Aを伴う２−ΔΔＣＴ方法３６を使用して算出した。参照ＲＮＡを、異なる実験間の比較を可能にするための検量用試料として使用した。
【０１６５】
実施例５：免疫組織化学的分析
Ｋｉ−６７抗原（MIB-1; DakoCytomation, Denmark）の免疫組織化学的発現を、コホートＡからの７３のパラフィン包埋した原発結腸直腸腫瘍の４μm切片上で研究した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノール中の０．３%過酸化水素でブロックし、抗原を沸騰中のクエン酸緩衝液（ｐＨ６）中に回収した。非特異的結合部位を、１% ＢＳＡを含む５%通常ヤギ血清でブロックした。一次抗体（１：５０希釈）をEnVision system（Dako EnVision, CA）及びDAB substrate kit（Vector laboratories, CA）を使用して検出した。５つの高倍率視野を１０×１０顕微鏡グリッドを使用して選択し、細胞計数を手動で、盲検様式で、臨床病理学的データの知識なしに実施した。Ｋｉ−６７増殖指数（ＰＩ）を、各腫瘍での陽性染色された核のパーセントで提示した。
【０１６６】
実施例６：統計分析
統計分析をSPSS（登録商標）version 14.0.0（SPSS Inc., Chicago, IL）を使用して実施した。Ｋｉ−６７増殖指数を平均値±ＳＤで提示した。フィッシャー直接検定又はクラスカル・ワリス検定を使用し、分類された群間での差異を、ＧＰＳ又はＫｉ−６７ ＰＩの発現対臨床病理学的パラメータに基づいて評価した。Ｐ値≦０．０５を有意と見なした。全生存期間（ＯＳ）及び無再発生存期間（ＲＦＳ）を、カプラン・マイヤー法（３７）を使用してプロットした。ログランク検定を使用し、分類された群間での生存時間における差異を検定した。相対リスク及び関連する信頼区間も、各変数について、Ｃｏｘ単変量モデルを使用して推定し、そして多変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルを、単変量解析において有意であった予測変数を伴う前向き段階的回帰を使用して開発した。Ｋ−平均クラスタリング方法を使用し、ＧＰＳの発現レベルに基づいて臨床サンプルを分類した。
【０１６７】
実施例７：結腸直腸細胞株モデルを使用した遺伝子増幅徴候（ＧＰＳ）の同定
遺伝子増幅徴候（ＧＰＳ）を引き出し、適用するために使用するアプローチの概観を図１にまとめる。ＧＰＳは、３８の有糸分裂の細胞周期遺伝子（表Ｃ）を含め、半コンフルエント培養中での周期中の細胞において比較的過剰発現されていた。低増殖は、低ＧＰＳ発現により定義され、好ましくない臨床病理学的変数、より短い全生存、及び無再発生存と関連した（ｐ＜０．０５）。関連は、Ｋｉ−６７増殖指数と臨床病理学的変数又は臨床転帰の間に見出されなかった。
【０１６８】
【表５】
【０１６９】
ＧＰＳは、その発現がＣＲＣ細胞増殖速度と相関する遺伝子のサブセットとして同定された。マイクロアレイの統計分析（ＳＡＭ；参考文献３８）を使用し、指数関数的に成長する（半コンフルエント）ＣＲＣ細胞株と非周期中（完全コンフルエント）のＣＲＣ細胞株の間で異なって発現される（ＤＥ）遺伝子を同定した（図１、段階１）。遺伝子特異的色素バイアス及び変動の他の源について調整するために、各培養セットを独立的に分析した。分析は５０２のＤＥ遺伝子に限定され、それらでは有意な発現差異が両方の培養セットにおいて２つの成長期の間で観察された（偽発見率＜１%）。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を、ＥＡＳＥ３９を使用して行い、ＤＥ遺伝子において有意に反映される生物学的プロセスカテゴリーを特定した。細胞増殖関連カテゴリーは、指数関数的に成長する細胞において上方調節される遺伝子に主に起因して過剰提示された。有糸分裂の細胞周期カテゴリー（ＧＯ：００００２７８）をＧＰＳと定義した。なぜなら、（ｉ）この生物学的プロセスは最も過剰提示されるＧＯ期間であり（ＥＡＳＥスコア＝５．５２１１）；及び（ｉｉ）３８の有糸分裂の細胞周期遺伝子の全て（表Ｃ）が、成長阻止細胞と比較し、急速成長中により高いレベルで発現されたからである。ＧＰＳからの１１の遺伝子の発現をＱＰＣＲにより判定し、アレイデータから得られる換算値と相関した。従って、ＱＰＣＲによって、増殖徴候遺伝子の発現上昇がＣＲＣ細胞株における増殖増加と相関することが確認された（図５）。
【０１７０】
実施例８：遺伝子増幅徴候の発現レベルに従ったＣＲＣサンプルの分類
ＣＲＣ腫瘍の相対的増殖状態及び臨床適用のためのＧＰＳの有用性を検証するために、２つのコホートからのＣＲＣ腫瘍をＧＰＳ発現に基づき２つのクラスターに層別化した（図１、段階２）。ＧＰＳを定義する３８の遺伝子の発現値を、腫瘍のマイクロアレイ生成発現プロファイルから最初に得た。各コホートからの腫瘍を、次に、それらのＧＰＳ発現レベルの類似性に基づき、Ｋ平均教師なしクラスタリングを使用し、２つのクラスター（Ｋ＝２）に別々に分類した。全ての選別された遺伝子を使用した、２つの定義されたクラスター間でのＤＥ遺伝子の分析によって、ＧＰＳが、両方のコホートにおいて、クラスター２（下パネル）と比較し、クラスター１（図２Ａ、上パネル）において上方制御された遺伝子のリスト内に含まれることが明らかになった。このように、クラスター１の腫瘍は高ＧＰＳ発現により特徴付けられ、クラスター２の腫瘍は低ＧＰＳ発現により特徴付けられる。
【０１７１】
実施例９：低い遺伝子増幅徴候は、好ましくない臨床病理学的変数と関連する。
表２には、ＧＰＳ発現レベルと臨床病理学的変数の間の関連をまとめている。関連は、両方のコホートにおける、低い増殖活性（低ＧＰＳ発現により定義される）と再発の増加リスクの間に観察された（コホートＡ及びＢについてそれぞれＰ＝０．０３及び＜０．００１）。コホートＡでは、低ＧＰＳ発現が、より高い病期及びリンパ節転移とも関連した（それぞれＰ＝０．００６及び０．０３）。また、コホートＡからのリンパ侵襲を伴う腫瘍は、統計的有意性に達することはないにもかかわらず（Ｐ＝０．０６）、リンパ侵襲を伴わない腫瘍よりも増殖性が低い傾向にあった。関連は、ＧＰＳ発現レベルと、腫瘍部位、年齢、性別、分化の程度、Ｔ病期、血管侵襲、リンパ球浸潤、及び腫瘍辺縁の間に見出されなかった。
【０１７２】
実施例１０：遺伝子増幅徴候によって臨床転帰が予測される。
患者の転帰を予測する際のＧＰＳの性能を検証するために、カプラン・マイヤー生存分析を使用し、低ＧＰＳ腫瘍と高ＧＰＳ腫瘍の間でＲＦＳ及びＯＳを比較した（図３）。全ての患者を術後６０ヶ月目に打ち切った。結腸直腸癌コホートＡでは、ＯＳ及びＲＦＳは、低ＧＰＳ発現を伴う患者においてより短かった（それぞれログランク検定Ｐ＝０．０４及び０．０１）。結腸直腸癌コホートＢでは、低ＧＰＳ発現も減少したＯＳ（Ｐ＝０．０００４）及びＲＦＳ（Ｐ＝０．０００２）と関連した。単変量解析においてＯＳ及びＲＦＳを予測するパラメータを多変量モデルにおいて研究した場合、病期は５年ＯＳの独立した予測因子だけであり、病期及びＴ病期はコホートＡにおけるＲＦＳの独立した予測因子であった。コホートＢでは、低ＧＰＳ発現及びリンパ侵襲が、ＯＳ及びＲＦＳの両方への独立した寄与を示した。生存分析がリンパ侵襲を伴わないコホートＢ患者に限定された場合、低ＧＰＳは依然としてより短いＯＳ及びＲＦＳに関連し、予測因子としてのＧＰＳの独立性が確認された。生存と単変数及び多変数関連の分析を表３にまとめる。
【０１７３】
低ＧＰＳ発現は、また、胃癌を伴う患者における減少した５年全生存率と関連した（ｐ＝０．００８）。低ＧＰＳ及び高ＧＰＳの胃腫瘍の全生存期間を比較したカプラン・マイヤー生存プロットを図４に示す。
【０１７４】
【表６】
【０１７５】
実施例１１：Ｋｉ−６７は、臨床病理学的変数又は生存に関連しない。
Ｋｉ−６７免疫染色は、コホートＡ腫瘍だけからの組織切片で実施した。なぜなら、パラフィン包埋サンプルがコホートＢについて利用不可能であったからである（図１、段階３）。核染色は７３すべてのＣＲＣ腫瘍で検出された。Ｋｉ−６７ ＰＩは２５%から９６%に及び、平均値は７６．３±１７．５であった。平均Ｋｉ−６７値をカットオフポイントとして使用し、腫瘍を、低ＰＩ又は高ＰＩを伴う２群に割り当てた。Ｋｉ−６７ ＰＩは、臨床病理学的変数（表２）又は生存のいずれとも関連しなかった（図３）。生存分析が最高Ｋｉ−６７値及び最低Ｋｉ−６７値を伴う患者に限定される場合、統計的差異は観察されなかった（データ示さず）。これらの結果の要約は、成長関連遺伝子の低発現が結腸直腸癌における不良転帰と関連することを示し、Ｋｉ−６７は関連を検出するために十分に高感度ではなかった。これらの知見は、癌からの早期死亡の高リスクにある患者を特定するための追加基準として使用できる。
【０１７６】
実施例１２：相関する細胞増殖遺伝子の選択
コホートＢ（５５人のドイツ人ＣＲＣ患者；表２）を、最初に、３８の遺伝子細胞増殖徴候（表Ｃ）及びＫ平均クラスタリング方法（ピアソン非中央、１０００順列、同じクラスターで発生する閾値を８０%に設定）を使用し、低増殖群と高増殖群に分類した。マイクロアレイの統計分析（ＳＡＭ）を次に適用し、全ての選別された遺伝子（１６０４１の遺伝子）が分析のために含まれた場合に低増殖群と高増殖群の間で異なって発現される（ＦＤＲ＝０）遺伝子を同定した。７５４の遺伝子が、高増殖群で過剰発現されることが見出された。ＧＡＴＨＥＲ遺伝子オントロジープログラムを次に使用し、異なって発現される遺伝子のリスト内で最も過剰提示される遺伝子オントロジーカテゴリーを同定した。細胞周期カテゴリーは、異なって発現される遺伝子のリスト内で最も過剰提示されるカテゴリーであった。低増殖群と高増殖群の間で異なって発現される１０２の細胞周期遺伝子を（元の３８の遺伝子徴候に加えて）表Ｄに示す。
【０１７７】
【表７】
【０１７８】
結論
本発明は、遺伝子増幅徴候と主要な臨床病理学的変数ならびに結腸直腸癌での転帰の間の関連を報告した最初のものである。開示した試験では、インビトロ由来の複数遺伝子増幅徴候を使用し、Ｋｉ−６７免疫染色により増殖状態を研究した。本明細書の結果によると、腫瘍でのＧＰＳの低発現は、２つの独立した患者のコホートにおける再発のより高いリスク及びより短い生存期間と関連した。対照的に、Ｋｉ−６７増殖指数は、臨床的に関連するエンドポイントのいずれとも関連しなかった。
【０１７９】
結腸直腸ＧＰＳは３８の有糸分裂の細胞周期遺伝子を包含し、遺伝子の中心セット（ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３）を含み、それらは、乳房（４０）、（４１）、卵巣（４２）、肝臓（４３）、急性リンパ芽球白血病（４４）、神経芽細胞腫（４５）、肺偏平上皮細胞癌（４６）、頭頚部（４７）、前立腺（４８）、及び胃（４９）の腫瘍について定義された増殖徴候の一部である。これは保存された発現パターンを表わす。なぜなら、これらの遺伝子の大半が、速く成長する腫瘍において高度に過剰発現され、高い割合の迅速な周期中の細胞を反映することが見出されているからである（５０）。従って、結腸直腸ＧＰＳの発現レベルは、腫瘍の増殖状態のための測定を提供する。
【０１８０】
この試験では、不良転帰に関連するいくつかの臨床病理学的変数（病期、リンパ節転移、及びリンパ侵襲）が、コホートＡ患者での低ＧＰＳ発現と関連した。コホートＢ（病期ＩＩ腫瘍から完全になる）では、試験ではＧＰＳとリンパ侵襲の間の関連を判定した。この関連は、このコホートにおけるリンパ侵襲を伴う少数の腫瘍のため、統計的有意性に達することはできなかった（５／５５）。理論により束縛されることなく、より進行性の腫瘍での低ＧＰＳ発現は、ＣＲＣ進行が増殖亢進により促進されないことを示しうる。増殖加速は依然として腫瘍形成の初期段階中での重要な促進力でありうるが、より進行性の疾患が遺伝子不安定性などのプロセスにより依存的であり、連続的選択を可能にすることが可能である。本発明者らの知見と一致して、２つの大規模試験では、ＣＤＫ２、サイクリンＥ及びＡの発現減少と進行段階の深部浸潤及びリンパ節転移の間の関連が報告された（５１）、（５２）。
【０１８１】
低ＧＰＳと好ましくない臨床病理学的変数の間の関係によって、ＧＰＳも患者の転帰を予測することが示唆された。実際に、コホートＡ及びＢの両方において、低ＧＰＳ発現が、再発のより高いリスク及びより短い無再発全生存と関連した。コホートＢでは、全ての患者が病期ＩＩの腫瘍を有したが、関連は多変量解析中のままであった。しかし、コホートＡにおいて、患者は病期Ｉ−ＩＶの疾患を有したが、関連は腫瘍の病期に非依存的ではなかった。再発を伴う及び伴わない患者数は、コホートＡにおける疾患の各病期内にあり、恐らくは、ＧＰＳと生存の間の非依存的な関連を実証するために不十分であった。コホートＢにおいて、低ＧＰＳ発現及びリンパ侵襲は、多変量解析中の独立した予測因子のままであり、ＧＰＳが同じ病期内のＣＲＣ患者の転帰の予測を改善しうることを示唆した。驚くべきことではないが、リンパ節の存在及び遠隔臓器の関与は、転帰の最も強力な予測因子であった。なぜなら、これらは腫瘍転移の直接的な顕在化であるからである。
【０１８２】
放射線療法又は化学療法での処置は、コホートＡ患者のそれぞれ１８%及び２７%で使用され、この試験での起こりうる交絡因子であった。理論的には、ＧＰＳ発現上昇に関連する生存の改善は、癌処置に対する速く増殖する腫瘍のより良好な応答を反映しうる（５３）、（５４）。しかし、相関は処置とＧＰＳ発現の間に見出されなかった。さらに、コホートＢの患者はアジュバント療法を受けておらず、ＧＰＳと生存の間の関連が処置に非依存的であることを示す。この試験は、腫瘍増殖と化学療法又は放射線療法への反応の間の関係を研究するように計画されていなかったことを指摘すべきである。
【０１８３】
症例数も、本試験における臨床病理学的変数とＫｉ−６７ ＰＩを用いた生存の間の関連の欠如を説明しうる。上記の通り、Ｋｉ−６７及びＣＲＣ転帰に関する他の試験では、一貫性のない知見が報告されている。しかし、最大の症例数を伴う３つの他のＣＲＣ試験では、低いＫｉ−６７ ＰＩが不良予後に関連した（２７）、（２９）、（３０）。本発明者らは、ＧＰＳを適用して同じ結論に達したが、しかし、ずっと小さな症例数に基づいていた。複数遺伝子発現解析は、従って、Ｋｉ−６７ ＰＩよりも、増殖と予後の間の関係を判定するためのより高感度なツールであった。
【０１８４】
低ＧＰＳを伴う腫瘍における好ましくない予後の背後にある生物学的根拠は、さらなる研究を含みうる。低ＧＰＳ腫瘍における不良臨床転帰に潜在的に寄与しうる機構は、以下を含む：（ｉ）迅速に増殖する腫瘍へのより効果的な免疫応答；（ｉｉ）癌細胞をアポトーシスに対してより抵抗性にし、侵襲性を増加させうるが、しかし、また、円滑な複製機構を乱すより高レベルの遺伝子損傷；（ｉｉｉ）徐々に分裂し、正常幹細胞と類似であるが、しかし、高い転移能を有する癌幹細胞数の増加；及び（ｉｖ）高い増殖速度を有するが、しかし、比較的良好な予後を有する高い割合のマイクロサテライト不安定腫瘍。
【０１８５】
要約すると、本発明は、結腸直腸癌における細胞増殖の予後診断的な役割に関連する先の矛盾する結果を明らかにしている。ＧＰＳはＣＲＣ細胞株を使用して開発されており、２つの独立した患者コホートに適用されてきた。ＣＲＣにおける成長関連遺伝子の低発現は、より進行性の腫瘍病期（コホートＡ）及び同じ病期内の不良臨床転帰（コホートＢ）と関連することが見出された。複数遺伝子発現解析は、転帰を予測するための、長期確立された増殖マーカーＫｉ−６７よりもより強力な指標として示された。今後の試験のために、ＣＲＣが、他の通常の上皮癌、例えば乳癌及び肺癌（例、Ｋｉ−６７を参照のこと）とは異なるという根拠を決定することが有用でありうる。これは、重要な基礎をなす生物学的機構への洞察を提供する可能性が高い。実際的観点から、所定の病理学的段階内での再発リスクを層別化する能力によって、アジュバント療法をより正確に標的とすることが可能になりうる。このように、ＧＰＳ発現を、結腸直腸癌からの再発及び死亡の高リスクにある患者を特定するための従来の病期分類への補助として使用できる。
【０１８６】
上の明細書中で言及する全ての刊行物及び特許は、本明細書において参照により組み入れられる。
【０１８７】
先の記載において、公知の等価物を有する整数又は成分を参照し、そのような等価物は本明細書において個々に示されるかのように組み入れられる。
【０１８８】
本発明は、実施例により、及び、その可能な実施態様を参照し、記載されているが、その範囲又は精神から逸脱することなく改善及び／又は改変してよいことを理解すべきである。
【０１８９】
【表８】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、癌、特に胃腸癌の予後を患者において判断するための方法及び組成物に関する。具体的には、本発明は、癌、例えば胃腸癌などの予後を細胞増殖の徴候に基づき判断するための遺伝子マーカーの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
細胞増殖は生体における最も基本的なプロセスであり、そのようなものとして増殖関連遺伝子の発現レベルにより正確に調節される（１）。増殖制御の喪失は癌の特徴であり、従って、成長調節遺伝子が腫瘍中で、隣接する正常組織と比較し、異常に発現されていることは驚くべきことではない（２）。増殖変化は、細胞特性、例えば侵襲及び転移能などにおける他の変化を伴いうるため、患者の転帰に影響を及ぼしうる。この関連は実質的な興味を集めており、多くの試験が、転帰の潜在的な指標としての腫瘍細胞増殖の探索に充てられてきた。
【０００３】
細胞増殖は、通常、フローサイトメトリー又は、より一般的には、組織中で、増殖マーカーの免疫組織化学的評価により判定される（３）。最も広く使用される増殖マーカーはＫｉ−６７であり、休止期Ｇ０を除く全ての細胞周期段階で発現されるタンパク質である（４）。Ｋｉ−６７を使用し、周期中細胞の割合と臨床転帰の間の明らかな関連が、悪性腫瘍、例えば乳癌、肺癌、軟部組織腫瘍、及び星状細胞腫などで確立されている（５）。乳癌では、この関連は、また、マイクロアレイ解析により確認されており、再発の増加リスクにある患者を特定するために用いられてきた増殖遺伝子発現プロファイルを導く（６）。
【０００４】
しかし、結腸直腸癌（ＣＲＣ）では、増殖指数（ＰＩ）は予後因子として矛盾する結果を出しており、従って、臨床状況では適用できない（以下を参照のこと）。試験は、患者の選択、サンプリング方法、カットオフポイントレベル、抗体の選択、染色技術、データが収集及び解釈された方法に関して変動する。これらの試験の方法論的な差異及び異質性は、矛盾する結果を部分的に説明しうる（７）、（８）。Ｋｉ−６７の増殖マーカーとしての使用も制限を有する。Ｋｉ−６７ ＰＩによって活発な周期中細胞の分画が推定されるが、しかし、細胞周期の長さの示唆を与えない（３）、（９）。このように、類似のＰＩを伴う腫瘍が、異なる周期スピードに起因する非類似の速度で増殖しうる。また、Ｋｉ−６７ ｍＲＮＡは静止細胞中では産生されず、タンパク質はある割合の結腸直腸腫瘍で依然として検出可能であり、増殖速度の過大評価を導きうる（１０）。
【０００５】
単一の増殖マーカーを使用した予後の判定はＣＲＣにおいて信頼できるとは思われないため（以下を参照のこと）、胃腸癌の予後を予測するためのさらなるツールの必要性が存在する。本発明は、予後癌マーカー、具体的には胃腸癌予後診断マーカーに基づくさらなる方法及び組成物を提供し、癌の予後診断及び処置を助ける。
【０００６】
発明の概要
本発明の特定の局面では、マイクロアレイ解析を使用し、癌細胞の増殖徴候を提供する遺伝子を同定する。これらの遺伝子、及びそれらの遺伝子によりコードされるタンパク質を、本明細書では胃腸癌増殖マーカー（ＧＣＰＭ）と呼ぶ。本発明の一局面では、予後診断のための癌は、胃腸癌、特に胃癌及び結腸直腸癌である。
【０００７】
特定の局面では、本発明は、サンプル中の少なくとも１つのＧＣＰＭの発現レベルを同定することによる癌の予後を判断するための方法を含む。選択したＧＣＰＭは、細胞増殖、例えば、細胞周期成分に関連するタンパク質をコードする。これらのＧＣＰＭは、予後に基づく特定の癌のための最善の処置計画を決定するための方法において追加の有用性を有する。特定の局面では、ＧＣＰＭレベルは、再発性腫瘍組織と比較し、非再発性腫瘍組織でより高い。これらのマーカーを、単独で、又は、互いに、もしくは他の公知の癌マーカーと組み合わせて使用できる。
【０００８】
追加の局面では、本発明は、以下：（ａ）癌サンプルの提供；（ｂ）サンプル中の少なくとも１つＧＣＰＭファミリーメンバーの発現レベルの検出；及び（ｃ）癌の予後の判断を含む、癌の予後を判断するための方法を含む。
【０００９】
別の局面では、本発明は、少なくとも１つのＧＣＰＭ ＲＮＡ、例えば、少なくとも１つのｍＲＮＡの発現レベルの検出工程を含む。さらなる局面では、本発明は、少なくとも１つのＧＣＰＭタンパク質の発現レベルの検出工程を含む。さらなる局面では、本発明は、少なくとも１つのＧＣＰＭペプチドのレベルの検出工程を含む。さらに別の局面では、本発明は、サンプル中の少なくとも１つのＧＣＰＭファミリーメンバーの発現レベルの検出を含む。追加の局面では、ＧＣＰＭは、細胞増殖、例えば細胞周期成分などに関連する遺伝子である。他の局面では、少なくとも１つのＧＣＰＭは、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される。
【００１０】
さらなる局面では、本発明は、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに示す少なくとも１つのＧＣＰＭの発現レベルを検出するための方法を含む。さらなる局面では、本発明は、ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７の少なくとも１つの発現レベルを検出するための方法を含む。さらなる局面では、本発明は、ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３の少なくとも１つの発現レベルの検出を含む。
【００１１】
追加の局面では、例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択する；ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７から選択する；又は、ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３から選択する、増殖マーカー又はそれらの発現産物の少なくとも２つ、又は少なくとも５つ、又は少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、又は少なくとも７５の発現レベルを決定する。
【００１２】
他の局面では、例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙する；群ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７について列挙する；又は、群ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３について列挙する、全ての増殖マーカー又はそれらの発現産物の発現レベルを決定する。
【００１３】
さらなる局面では、本発明は、癌の処置計画の決定方法を含み、以下：（ａ）癌サンプルの提供；（ｂ）サンプル中の少なくとも１つのＧＣＰＭファミリーメンバーの発現レベルの検出；（ｃ）少なくとも１つのＧＣＰＭファミリーメンバーの発現レベルに基づく癌の予後の判断；及び（ｄ）予後診断に従った処置計画の決定を含む。
【００１４】
さらに別の局面では、本発明は、少なくとも１つのＧＣＰＭを検出するための装置を含み、以下：（ａ）その上に少なくとも１つのＧＣＰＭ捕捉試薬を有する基材；及び（ｂ）少なくとも１つの捕捉ＧＣＰＭ、捕捉試薬、又はその複合体を検出可能な検出器を含む。
【００１５】
本発明の追加の局面は、癌を検出するためのキットを含み、以下：（ａ）ＧＣＰＭ捕捉試薬；（ｂ）捕捉ＧＣＰＭ、捕捉試薬、又はその複合体を検出可能な検出器；及び、場合により、（ｃ）使用説明書を含む。特定の局面では、キットは、また、捕捉されたＧＣＰＭのための基材を含む。
【００１６】
本発明のさらなる局面は、定量的ＰＣＲを使用した少なくとも１つのＧＣＰＭの検出するための方法を含み、以下：（ａ）少なくとも１つのＧＣＰＭに特異的なフォワードプライマー；（ｂ）少なくとも１つのＧＣＰＭに特異的なリバースプライマー；（ｃ）ＰＣＲ試薬；及び、場合により、少なくとも１つの：（ｄ）反応バイアル；及び（ｅ）使用説明書を含む。
【００１７】
本発明の追加の局面は、少なくとも１つのＧＣＰＭタンパク質又はペプチドの存在を検出するためのキットを含み、以下：（ａ）少なくとも１つのＧＣＰＭタンパク質又はペプチドに特異的な抗体又は抗体フラグメント；及び、場合により、少なくとも１つの：（ｂ）抗体又は抗体フラグメントのための標識；及び（ｃ）使用説明書を含む。特定の局面では、キットは、また、少なくとも１つのＧＣＰＭタンパク質又はペプチドのための捕捉薬剤を有する基材を含む。
【００１８】
特定の局面では、本発明は、胃腸癌、特に結腸直腸癌又は胃癌の予後を判断するための方法を含み、以下の工程：（ａ）胃腸癌を有することが疑われる患者からのサンプル、例えば腫瘍サンプルの提供；（ｂ）ＥＬＩＳＡ方法を使用したＧＣＰＭタンパク質の存在の測定を含む。
【００１９】
本発明の追加の局面では、本発明の１つ又は複数のＧＣＰＭを、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに概説する群より選択する。本発明の他の局面及び実施態様を本明細書において以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明を、その特定の実施態様を参照し、及び、図を参照して記載する。
【図１】本明細書で開示する遺伝子増幅徴候（ＧＰＳ）を引き出し、適用するために使用するアプローチの概観。
【図２】Ａは遺伝子増幅徴候の発現レベルに従った２群への７３のコホートＡ腫瘍のＫ平均値クラスタリング。ＢはＫｉ−６７ ＰＩの棒グラフ（%）；垂直線は全サンプルにわたる平均Ｋｉ−６７ ＰＩを表わす。平均値の前後及び平均値以下の増殖指数を伴う腫瘍を、それぞれ赤色及び緑色で示す。結果は、増殖徴候の過剰発現が、より高いＫｉ−６７ ＰＩに常に関連しているわけではないことを示す。
【図３】ＧＰＳ（遺伝子増幅シグナル）の発現レベル及びＫｉ−６７ ＰＩに従ったカプラン・マイヤー生存曲線。全生存期間（ＯＳ）及び無再発生存期間（ＲＦＳ）の両方が、結腸直腸癌コホートＡ（ａ、ｂ）及び結腸直腸癌コホートＢ（ｃ、ｄ）中の低ＧＰＳ発現を伴う患者において有意に短い。差異は、Ｋｉ−６７ ＰＩに従ったコホートＡ患者（ｅ、ｆ）の生存率において観察されなかった。ログランク検定からのＰ値を示す。
【図４】胃癌患者におけるＧＰＳ（遺伝子増幅シグナル）の発現レベルに従ったカプラン・マイヤー生存曲線。全生存期間は、混合病期の３８人の胃癌患者のこのコホート中の低ＧＰＳ発現を伴う患者において有意に短かった。ログランク検定からのＰ値を示す。
【図５】対数期（ＥＰ）の周期中細胞と静止期（ＳＰ）の成長阻止細胞の間での１１のＱＲＴ−ＰＣＲ検証済み遺伝子の発現差異を示す箱髭図プロット。箱範囲は、データの２５〜７５パーセンタイルを含む。箱中の水平線は中央値を表わす。「髭」は最大値及び最小値（外れ値を除く）である。箱の終わりからの四分位範囲の３／２倍以上の任意の点が外れ値であり、ドットで提示する。Ｙ軸は、細胞株ＲＮＡと参照ＲＮＡの間の比率の対数２倍変化を表わす。分析はＳＰＳＳソフトウェアを使用して実施した。
【００２１】
発明の詳細な説明
単一の増殖マーカーは、信頼できるＣＲＣ予後診断を得るために不十分であるため、マイクロアレイによるいくつかの成長関連遺伝子の同時分析を用いて、胃腸腫瘍の増殖状態を判断するためのより定量的で客観的な方法を提供した。表１（以下）は、結腸直腸癌のための予後因子としての増殖指数（ＰＩ）の使用のために示した、以前に発表された矛盾する結果を例証する。
【００２２】
【表１】
【００２３】
対照的に、本開示は、（ｉ）細胞株モデルを使用したＣＲＣ特異的遺伝子増幅徴候（ＧＰＳ）の定義；及び（ｉｉ）患者の転帰の予測におけるＧＰＳの予後の意義及びＣＲＣ患者の２つの独立コホートにおける臨床病理学的変数とのその関連の判断に成功している。
【００２４】
定義
本発明の実施態様を詳細に記載する前に、本明細書で使用する用語のいくつかの定義を提供すると有用でありうる。
【００２５】
本明細書で使用する「抗体」及び類似の用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。これらは、限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単一鎖、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーを含む。抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤのいずれかと関連し、分子中に存在する重鎖の性質により互いに異なる。これらはサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２なども含む。軽鎖はカッパ鎖又はラムダ鎖でよい。本明細書における抗体の参照は、全てのクラス、サブクラス、及び型の参照を含む。また、キメラ抗体、例えば、１を上回る供給源、例えば、マウス配列又はヒト配列に特異的であるモノクローナル抗体又はそのフラグメントが含まれる。さらに、ラクダ抗体、サメ抗体、又はナノボディが含まれる。
【００２６】
「マーカー」という用語は、生物学的現象の存在と定量的又は定性的に関連付けられる分子を指す。「マーカー」の例は、ポリヌクレオチド、例えば遺伝子もしくは遺伝子フラグメント、ＲＮＡもしくはＲＮＡフラグメント；又はポリペプチド、例えばペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、もしくはタンパク質フラグメントなど；又は任意の関連する代謝産物、副産物、又は任意の他の同定分子、例えば抗体もしくは抗体フラグメントなどが、現象の基礎をなす機構に直接的又は間接的に関連するかを問わず、含まれる。本発明のマーカーは、本明細書で開示するヌクレオチド配列（例、ＧｅｎＢａｎｋ配列）、特に、全長配列、任意のコード配列、任意のフラグメント、又はその任意の相補体を含む。
【００２７】
「ＧＣＰＭ」又は「胃腸癌増殖マーカー」又は「ＧＣＰＭファミリーメンバー」という用語は、本明細書に記載する、陽性予後、例えば、再発性癌のより低い可能性に関連する発現増加を伴うマーカーを指すが、しかし、先行技術において胃腸癌の予後に関連することが公知である分子を除くことができる。ＧＣＰＭという用語では、マーカーが胃腸腫瘍だけに特異的であることを必要としないことを理解すべきである。むしろ、ＧＣＰＭの発現は、他の型の腫瘍（悪性腫瘍を含む）において変化しうる。
【００２８】
非限定的なＧＣＰＭの例が、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄにおいて、本明細書で以下に含まれ、そして、限定はされないが、特定の群ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７；ならびに特定の群ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３を含む。
【００２９】
「癌」及び「癌性」という用語は、異常な又は無調節な細胞成長により典型的に特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指す、又は、記載する。癌及び癌病理は、例えば、転移、隣接細胞の正常機能との干渉、異常レベルでのサイトカイン又は他の分泌産物の放出、炎症反応又は免疫学的反応の抑制又は悪化、新生物、前悪性腫瘍、悪性腫瘍、周囲又は遠位の器官又は組織（例えば、リンパ節）などの侵襲に関連しうる。具体的には、胃腸癌、例えば食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、肛門癌、及び直腸癌が含まれ、特に、胃癌及び結腸直腸癌が含まれる。
【００３０】
「結腸直腸癌」という用語は、結腸、直腸、及び／又は肛門の癌、ならびに特に、腺癌を含み、癌腫（例、扁平上皮総排泄腔癌）、メラノーマ、リンパ腫及び肉腫も含みうる。類表皮（非角質化扁平上皮細胞あるいは類基底）癌も含まれる。癌は、特定の型のポリープ又は他の病変、例えば、管状腺腫、腺管絨毛腺腫（例、絨毛腺管状ポリープ）、絨毛（例、乳頭）腺腫（腺癌の有無にかかわらず）、過形成性ポリープ、過誤腫、若年性ポリープ、ポリポイド癌腫、偽ポリープ、脂肪腫、又は平滑筋腫に関連しうる。癌は、家族性ポリポーシス及び関連する状態、例えばガードナー症候群又はポッツ−ジェガース症候群に関連しうる。癌は、例えば、慢性瘻孔、放射線照射された肛門皮膚、白斑症、性病性リンパ肉芽腫、ボーエン病（上皮内癌）、尖圭コンジローマ、又はヒト乳頭腫ウイルスに関連しうる。他の局面では、癌は、基底細胞癌、乳房外ページェット病、総排泄腔癌、又は悪性メラノーマに関連しうる。
【００３１】
「異なって発現される遺伝子」、「遺伝子発現の差異」という用語、及び類似の語句は、発現が、被験体（例、テストサンプル）、具体的には癌、例えば胃腸癌において、対照被験体（例、対照サンプル）でのその発現と比較し、より高い又はより低いレベルまで活性化される遺伝子を指す。これらの用語は、また、発現が、同じ疾患の異なる段階で；再発性疾患又は非再発性疾患において；又はより高いもしくはより低いレベルの増殖を伴う細胞において、より高い又はより低いレベルまで活性化される遺伝子を含む。異なって発現される遺伝子は、ポリヌクレオチドレベル又はポリペプチドレベルで活性化もしくは阻止されうる、又は選択的スプライシングを受けて、異なるポリペプチド産物を生じうる。そのような差異は、例えば、ポリペプチドのｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌、又は他の分配により証明されうる。
【００３２】
遺伝子発現の差異は、２つ又はそれ以上の遺伝子又はそれらの遺伝子産物の間での発現の比較；あるいは２つ又はそれ以上の遺伝子又はそれらの遺伝子産物の間での発現の比率の比較；あるいは同じ遺伝子の２つの異なってプロセシングされた産物（正常な被験者と疾患のある被験者の間で異なる）；あるいは同じ疾患の種々の段階の間；あるいは再発性疾患と非再発性疾患の間；あるいは高レベル増殖を伴う細胞と低レベル増殖を伴う細胞の間；あるいは正常組織と疾患のある組織、具体的には癌、もしくは胃腸癌の間の比較を含みうる。発現差異は、例えば、正常細胞もしくは疾患のある細胞の内、又は異なる疾患事象もしくは疾患段階を経た細胞の内、又は異なる増殖レベルを伴う細胞の内で、遺伝子又はその発現産物における時間的な又は細胞性の発現パターンにおける定量的、ならびに定性的な差異の両方を含む。
【００３３】
「発現」という用語は、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生、特に、遺伝子又は遺伝子の部分からのＲＮＡ（例、ｍＲＮＡ）の産生を含み、そして、ＲＮＡ又は遺伝子又は遺伝子の部分によりコードされるタンパク質の産生、及び発現に関連する検出可能物質の出現を含む。例えば、複合体の形成（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ヌクレオチド相互作用などから）が、「発現」という用語の範囲内に含まれる。別の例は、結合リガンド（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ又は抗体など）の遺伝子又は他のオリゴヌクレオチド、タンパク質又はタンパク質フラグメントへの結合及び結合リガンドの可視化である。このように、マイクロアレイ上、ハイブリダイゼーションブロット（例えばノーザンブロットなど）上、又は免疫ブロット（例えばウエスタンブロットなど）上、又はビーズアレイ上のスポット、又はＰＣＲ解析による強度増加が、基礎をなす生物学的分子の「発現」という用語内に含まれる。
【００３４】
「胃癌」という用語は、胃及び周辺組織の癌、特に腺癌を含み、リンパ腫及び平滑筋肉腫も含みうる。癌は、胃潰瘍又は胃ポリープに関連しうるが、突出性、穿通性、拡散性、又はこれらのカテゴリーの組み合わせとして分類されうる、又は、あるいは、表在性（隆起、扁平、又は陥凹）又は窩性（ｅｘｃａｖａｔｅｄ）として分類されうる。
【００３５】
「長期生存」という用語を本明細書で使用し、外科手術又は他の処置後、少なくとも５年間、より好ましくは少なくとも８年間、最も好ましくは少なくとも１０年間の生存を指す。
【００３６】
「マイクロアレイ」という用語は、基材上の捕捉剤、好ましくはポリヌクレオチド（例、プローブ）又はポリペプチドの秩序された配置を指す。例えば、Microarray Analysis, M. Schena, John Wiley & Sons, 2002;Microarray Biochip Technology, M. Schena, ed., Eaton Publishing, 2000;Guide to Analysis of DNA Microarray Data, S. Knudsen, John Wiley & Sons, 2004;及びProtein Microarray Technology, D. Kambhampati, ed., John Wiley & Sons, 2004を参照のこと。
【００３７】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチド、典型的にはプローブ又はプライマー（限定はされないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本又は二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、及び二本鎖ＤＮＡを含む）を指す。オリゴヌクレオチド、例えば一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどは、しばしば化学的方法により、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用し、又は種々の他の方法（インビトロ発現系、組換え技術、ならびに細胞及び生物での発現を含む）により合成される。
【００３８】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数又は複数で使用する場合、一般的に、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、未改変ＲＮＡもしくはＤＮＡ又は改変ＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる。これは、限定はされないが、一本及び二本鎖ＤＮＡ、一本及び二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本及び二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本及び二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖もしくは、より典型的には、二本鎖でありうる、又は一本及び二本鎖領域を含みうるＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。また、ＲＮＡもしくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域が含まれる。具体的には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡが含まれる。用語は、１つ又は複数の修飾塩基（例えば、トリチウム塩基など）、又は通常ではない塩基（例えばイノシンなど）を含むＤＮＡ及びＲＮＡを含む。本発明のポリヌクレオチドは、コード配列もしくは非コード配列、又はセンス配列もしくはアンチセンス配列を包含しうる。
【００３９】
本明細書で使用する「ポリペプチド」は、オリゴペプチド、ペプチド、もしくはタンパク質の配列、又はそのフラグメント、及び天然、組換え、合成、又は半合成の分子を指す。「ポリペプチド」を本明細書で挙げて、天然タンパク質分子のアミノ酸配列を指す場合、「ポリペプチド」及び類似の用語は、アミノ酸配列を、全長分子のための完全な天然アミノ酸配列に限定することを意味しない。「ポリペプチド」又は類似の用語への各参照は、本明細書において、全長配列、ならびに任意のフラグメント、派性物、又はその変異体を含むことを理解すべきである。
【００４０】
「予後」という用語は、医学的転帰（例、長期生存の可能性）の予測を指す；ネガティブな予後、又は不良転帰は、再発、疾患進行（例、腫瘍の成長もしくは転移、又は薬物耐性）、又は死亡の予測を含む；ポジティブな予後、又は良好転帰は、疾患寛解（例、無疾患状態）、回復（例、腫瘍退縮）、又は安定化の予測を含む。
「予後徴候」、「徴候」などの用語は、２つ又はそれ以上のマーカー、例えばＧＣＰＭのセットを指し、セットとして一緒に分析された場合、事象、例えば、結腸直腸癌の予後転帰の判断又は予測が可能になる。２つ又はそれ以上のマーカーを含む徴候の使用によって、個々の変動の効果が低下し、よりしっかりとした予測を可能にする。ＧＣＰＭの非限定的な例は、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに含まれ、本明細書において以下で、限定はされないが、特定の群ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７；ならびに特定の群ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３を含む。
【００４１】
本発明に関連して、任意の特定セットに列挙するマーカー（例、任意の徴候）の「少なくとも１つ」、「少なくとも２つ」、「少なくとも５つ」などへの参照は、列挙するマーカーの任意の１つ又は任意の及び全ての組み合わせを意味する。
【００４２】
「予測方法」という用語は、予測モデルを特定するために使用できる、統計、機械学習、人工知能、及びデータマイニングの分野からのより広範な属の方法を網羅するように定義する。これらは、詳細な説明のセクションにおいてさらに考察される。
【００４３】
「予測モデル」という用語は、予測方法をデータ収集に適用することにより得られる特定の数学的モデルを指す。本明細書で詳述する例では、そのようなデータセットは、再発性及び非再発性の結腸直腸癌患者から採取された組織サンプル（それらについて、各サンプルのクラス（再発性又は非再発性）が公知である）中での遺伝子活性の測定からなる。そのようなモデルを使用し、（１）未知の再発状態のサンプルを再発性又は非再発性の１つであると分類できる、又は（２）未知サンプル中での遺伝子の特定の収集物のｍＲＮＡ発現レベル又は発現産物の測定に基づき、未知のサンプルが再発性である可能性を表わす確率的予測できる（即ち、確率として解釈すべき割合又はパーセントをいずれかを産生できる）。これらの遺伝子特異的な測定値をどのように組み合わせて、分類及び確率的予測を産生するのかについての正確な詳細は、モデルを構築するために使用する予測方法の特定の機構に依存的である。
【００４４】
「増殖」という用語は、増加した細胞のサイズ又は細胞数を導くプロセスを指し、腫瘍又は細胞の成長、血管新生、神経支配、及び転移の１つ又は複数を含むことができる。
【００４５】
「ｑＰＣＲ」又は「ＱＰＣＲ」という用語は、例えば、PCR Technique: Quantitative PCR, J. W. Larrick, ed., Eaton Publishing, 1997、及びA-Z of Quantitative PCR, S. Bustin, ed., IUL Press, 2004に記載する定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。
【００４６】
「腫瘍」という用語は、全ての新生細胞の成長及び増殖（悪性又は良性を問わない）、ならびに全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。
【００４７】
「感度」、「特異性」（又は「選択性」）、及び「分類率」は、予測モデルの有効性の記載に適用される場合、以下を意味する：「感度」は、陽性であると（モデルにより）予測されてもいる真に陽性のサンプルの割合を意味する。癌の再発についてのテストでは、それは、モデルにより再発性であると予測された再発性腫瘍の割合でありうる。「特異性」又は「選択性」は、陰性であると（モデルにより）予測されてもいる真に陰性のサンプルの割合を意味する。ＣＲＣ再発についてのテストでは、モデルにより非再発性であると予測される非再発性腫瘍の割合でありうる。「分類率」は、予測モデルにより（陽性又は陰性として）正確に分類される全てのサンプルの割合である。
【００４８】
「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシーな条件」は、本明細書で定義する通り、典型的に：（１）洗浄のための低イオン強度及び高温、例えば、５０℃の０．０１５M塩化ナトリウム／０．００１５Mクエン酸ナトリウム／０．１%ドデシル硫酸ナトリウムを用いる；（２）ハイブリダイゼーション中に変性剤（例えばホルムアミドなど）、例えば、４２℃の７５０mM塩化ナトリウム、７５mMクエン酸ナトリウムを伴うｐＨ６．５の０．１%ウシ血清アルブミン／０．１% Ｆｉｃｏｌｌ／０．１%ポリビニルピロリドン／５０mMリン酸ナトリウム緩衝液を伴う５０%（ｖ／ｖ）ホルムアミドを用いる；又は（３）４２℃の５０%ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５M ＮａＣｌ、０．０７５Mクエン酸ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１%ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理済みサケ精子ＤＮＡ（５０μg/ml）、０．１% ＳＤＳ、及び１０%硫酸デキストランを用い、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）及び５５℃の５０%ホルムアミド中での洗浄、５５℃のＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣを含む高ストリンジェンシーな洗浄が続く。
【００４９】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989により記載される通りに同定でき、洗浄溶液の使用及び上に記載するものほどストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件（例、温度、イオン強度、及び% ＳＤＳ）を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、以下：２０%ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０%硫酸デキストラン、及び２０mg/ml変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での、３７℃での一晩インキュベーションであり、約３７〜５０℃の１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄が続く。当業者は、プローブ長などの要因を適応させるために必要な、温度、イオン強度などをどのように調整するのかを認識するであろう。
【００５０】
本発明の実施では、特記なき場合、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、及び生化学の従来技術を用い、それらは当技術分野の範囲内である。そのような技術は、文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al., 1989; Oligonucleotide Synthesis, MJ Gait, ed., 1984; Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed., 1987; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 4th edition, D. M. Weir & CC.Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987; Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., 1987; 及びPCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., 1994において十分に説明される。
【００５１】
本発明の実施態様の説明
細胞増殖は、一部の悪性腫瘍における転帰の指標である。結腸直腸癌では、しかし、結果の不一致が報告されている。これらの結果は単一の増殖マーカーに基づくため、本発明は、この限界を克服し、より確定的な結論に達し、そして結腸直腸癌での細胞増殖の予後診断的な役割を決定するためのマイクロアレイの使用を開示する。本明細書で示すマイクロアレイベースの増殖試験は、結腸直腸癌における増殖徴候の低下率が不良転帰と関連することを示す。本発明は、従って、癌からの早期死亡の高リスクにある患者を特定するために使用できる。
【００５２】
本発明は、疾患の予後、例えば、胃腸腫瘍を含む腫瘍の再発の可能性の判断のためのマーカーを提供する。本発明の方法を使用し、多数のマーカーが胃腸癌の進行に関連し、癌の予後の判断に使用できることが見出されている。種々の病期の結腸直腸癌を伴う患者から採取したサンプルでのマイクロアレイは、特定パターンのマーカー発現が癌の予後に関連するとの驚くべき発見を導いている。
【００５３】
特定のＧＣＰＭ、例えば、細胞増殖に関連するマーカーにおける増加は、ポジティブな予後を示している。これは、特に胃腸癌、例えば胃癌又は結腸直腸癌などでの、標準的処置後での癌再発の可能性の減少を含みうる。逆に、これらのマーカーにおける減少はネガティブな予後を示している。これは、特に胃腸癌、例えば胃癌又は結腸直腸癌などでの、疾患進行又は癌再発の可能性の増加を含みうる。発現における減少は、例えば、テストサンプル（例、腫瘍サンプル）のポジティブな予後に関連するサンプルとの比較により判断できる。発現における増加は、例えば、テストサンプル（例、腫瘍サンプル）のネガティブな予後に関連するサンプルとの比較により判断できる。
【００５４】
例えば、予後診断を得るために、患者のサンプル（例、腫瘍サンプル）を、既知の患者の転帰を伴うサンプルと比較できる。患者のサンプルが、良好転帰を伴うサンプルと同程度であり、及び／又は不良転帰を伴うサンプルよりも高いＧＣＰＭの発現増加を示す場合、ポジティブな予後を意味する。患者のサンプルが、不良転帰を伴うサンプルと同程度であり、及び／又は良好転帰を伴うサンプルよりも低いＧＣＰＭの発現減少を示す場合、ネガティブな予後を意味する。あるいは、患者のサンプルを、活発に増殖中／非増殖中の腫瘍細胞のサンプルと比較できる。患者のサンプルが、活発に増殖中の細胞と同程度であり、及び／又は非増殖中の細胞よりも高いＧＣＰＭの発現増加を示す場合、ポジティブな予後を意味する。患者のサンプルが、非増殖中の細胞と同程度であり、及び／又は活発に増殖中の細胞よりも低いＧＣＰＭの発現減少を示す場合、ネガティブな予後を意味する。
【００５５】
本発明は、種々の病期の腫瘍を伴う癌患者から同定され、表Ｃに概説され、結腸直腸癌について予後診断的であることが示されている遺伝子のセットを提供する。これらの遺伝子は全て細胞増殖に関連し、細胞増殖遺伝子と癌予後診断でのそれらの有用性との間の関係を確立する。また、表Ｃに列挙する予後徴候における遺伝子も追加の細胞増殖遺伝子と相関することが見出されている。これらの知見に基づき、本発明は、表Ｄに示し、高増殖群と低増殖群の間で異なって発現される、予後診断マーカーとしての使用のための細胞周期遺伝子のセットも提供する。さらに、予後と細胞増殖関連遺伝子の間の相関に関する驚くべき知見に基づき、本発明は、高増殖状態及び低増殖状態の間で異なって発現される増殖関連遺伝子のセット（表Ａ）ならびに公知の増殖関連遺伝子（表Ｂ）も提供する。表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、及び表Ｄに概説する遺伝子は、胃腸癌予後診断マーカー（ｇＣＰＭｓ）のセットを提供する。
【００５６】
１つのアプローチとして、マーカー（例、ＧＣＰＭ）のパネルの発現を、予後スコアを出すための線形判別分析（ＬＤＡ）を含む技術により分析できる。選択されたマーカーパネル及び予後スコア計算は、広範な実験室テスト及び複数の独立した臨床開発試験に由来しうる。
【００５７】
開示したＧＣＰＭは、従って、癌の予後を判断し、その腫瘍に特有の処置計画を確立するための有用なツールを提供する。特に、ポジティブな予後が、患者により使用され、標準的又はより侵襲性の低い処置選択肢を追及することを決断できる。ネガティブな予後が、患者により使用され、処置を終了する又は高度に侵襲性のもしくは実験的な処置を追及することを決断できる。また、患者は、細胞増殖又は細胞増殖マーカー（例、ＧＣＰＭ）の発現へのその影響に基づき処置を選ぶことができる。本発明に従い、高い増殖性を伴う細胞を特異的に標的にする又は細胞増殖マーカー（例、ＧＣＰＭ）の発現を特異的に減少させる処置が、胃腸癌、例えば結腸直腸癌又は胃癌などを伴う患者には好まれないことがある。
【００５８】
ＧＣＰＭのレベルを、腫瘍組織、腫瘍の近位にある組織、リンパ節サンプル、血液サンプル、血清サンプル、尿サンプル、又は糞便サンプルにおいて、任意の適した技術を使用して検出でき、限定はされないが、オリゴヌクレオチドプローブ、定量的ＰＣＲ、又はマーカーに対して産生された抗体を含みうる。サンプル中での１つのＧＣＰＭの発現レベルは、その被験者における再発の可能性を示しうる。しかし、複数のＧＣＰＭの発現の存在及び量を分析し、増殖徴候を構築することにより、予後診断の感度及び正確性が増加することが理解される。従って、本発明の複数のマーカーを使用し、癌の予後を判断できる。
【００５９】
本発明は、マーカー、特に、ＧＣＰＭのセットに関し、その発現は、具体的には無癌生存に関する、予後値を有する。特定の局面では、癌は、胃腸癌、特に、胃癌又は結腸直腸癌であり、さらなる局面では、結腸直腸癌は腺癌である。
【００６０】
一局面では、本発明は、癌の再発を伴わない癌患者の長期生存の可能性を予測する方法に関し、患者から得られたサンプル中での１つ又は複数の増殖マーカー又はそれらの発現産物の発現レベル（サンプル中での全てのＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物、又はＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている）の決定を含み、ここで増殖マーカーは、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙する１つ又は複数のマーカーの転写物である。特定の局面では、１つ又は複数のＧＣＰＭの発現レベルにおける減少は、癌の再発を伴わない長期生存の可能性の減少を示し、１つ又は複数のＧＣＰＭの発現レベルにおける増加は、癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加を示す。
【００６１】
さらなる局面では、１つ又は複数、例えば少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つ、又は少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、又は少なくとも７５の増殖マーカー又はそれらの発現産物の発現レベルが決定され、例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される；ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７から選択される；又はＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３から選択される。
【００６２】
別の局面では、方法は、全ての増殖マーカー又はそれらの発現産物の発現レベルの決定を含み、例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙される；群ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７について列挙される；又は群ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３について列挙される。
【００６３】
本発明は、セット中の全てのマーカーのアッセイのための保管されたパラフィン包埋生検材料の使用を含み、従って、大半の広く利用可能な型の生検材料に適合する。それは、また、腫瘍組織回収のいくつかの異なる方法、例えば、コア生検又は穿刺吸引に適合する。さらなる局面では、ＲＮＡを患者の固定ワックス包埋癌組織標本から単離する。単離は、当技術分野において公知の任意の技術により、例えば、コア生検組織又は穿刺吸引細胞から実施してよい。
【００６４】
別の局面では、本発明は、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される２つ又はそれ以上のマーカーにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイに関する；ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７から選択される；又はＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３から選択される。
【００６５】
特定の局面では、アレイは、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーの少なくとも３つ、又は少なくとも５つ、又は少なくとも１０、又は少なくとも１５、又は少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、又は少なくとも７５又は全てとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む；群ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７に列挙される；又は群ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３に列挙される。
【００６６】
別の特定の局面では、アレイは、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーの全セットとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む；群ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７について列挙される；又は群ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子（例、ＭＣＭ３、ＭＣＭ６、及びＭＣＭ７の１つ又は複数）、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３に列挙される。
【００６７】
ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、又はオリゴヌクレオチドにしてよく、それらをディスプレイする固形表面は例えばガラスでよい。ポリヌクレオチドは、本明細書で開示するマーカーの１つ又は複数、例えば、全長配列、任意のコード配列、任意のフラグメント、又はそれらの任意の相補体にハイブリダイズできる。
【００６８】
さらに別の局面では、本発明は、癌の再発を伴わない、癌と診断された患者の長期生存の可能性を予測する方法に関し、以下の工程：（１）患者から得られたサンプル中での、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーの全セット又はサブセットのＲＮＡ転写物又は発現産物の発現レベル（サンプル中での全てのＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物、又はＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている）の決定；（２）工程（１）で得られたデータを統計分析にかけること；及び（３）長期生存の可能性が増加又は減少しているかの判断を含む。
【００６９】
さらに別の局面では、本発明は、患者、例えば、癌患者についての個別化されたゲノミクスプロファイルの作成方法に関し、以下の工程：（ａ）患者から得られたサンプルを発現解析にかけること；（ｂ）表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄのいずれかに列挙するマーカーセットから選択された１つ又は複数のマーカーの発現レベルの決定、ここで発現レベルは対照遺伝子に対して正規化され、場合により参照セット中で見出される量と比較する；及び（ｃ）発現解析により得られたデータをまとめる報告の作成を含む。報告は、例えば、患者の長期生存の可能性の予測及び／又は患者の処置法のための推奨事項を含んでよい。
【００７０】
追加の局面では、本発明は以下：（ａ）患者から得られたサンプルを、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択された少なくとも１つのマーカーのＲＮＡ転写物、又はその産物の発現レベルの定量的分析にかけること；及び（ｂ）癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加を有する可能性が高い患者を特定すること（マーカー、又はそれらの産物の正規化された発現レベルが、上に定めた発現閾値を上回る場合）を含む予後診断方法に関する。代わりの局面では、工程（ｂ）は、癌の再発を伴わない長期生存の可能性の減少を有する可能性の高い患者を特定することを含む（マーカー、又はそれらの産物の正規化された発現レベルが、定めた発現閾値を下回る場合）。
【００７１】
特に、増殖マーカーの比較的低い発現は、不良転帰に関連する。これは、疾患進行、又は、特に胃腸癌、例えば胃癌もしくは結腸直腸癌などでの癌の再発の可能性の増加を含みうる。対照的に、増殖マーカーの比較的高い発現は良好転帰と関連する。これは、特に胃腸癌、例えば胃癌又は結腸直腸癌などでの、標準的処置後での癌再発の可能性の減少を含みうる。低発現は、例えば、テストサンプル（例、腫瘍サンプル）の、ポジティブな予後に関連するサンプルとの比較により判断できる。高発現は、例えば、テストサンプル（例、腫瘍サンプル）の、ネガティブな予後に関連するサンプルとの比較により判断できる。
【００７２】
例えば、予後診断を得るために、患者のサンプル（例、腫瘍サンプル）を、患者の転帰が既知であるサンプルと比較できる。患者のサンプルが、良好転帰を伴うサンプルと同程度であり、及び／又は不良転帰を伴うサンプルよりも高いＧＣＰＭの高発現を示す場合、ポジティブな予後を意味する。患者のサンプルが、不良転帰を伴うサンプルと同程度であり、及び／又は良好転帰を伴うサンプルよりも低いＧＣＰＭの低発現を示す場合、ネガティブな予後を意味する。あるいは、患者のサンプルを、活発に増殖中／非増殖中の腫瘍細胞のサンプルと比較できる。患者のサンプルが、活発に増殖中の細胞と同程度であり、及び／又は非増殖中の細胞よりも高いＧＣＰＭの高発現を示す場合、ポジティブな予後を意味する。患者のサンプルが、非増殖中の細胞と同程度であり、及び／又は活発に増殖中の細胞よりも低いＧＣＰＭの低発現を示す場合、ネガティブな予後を意味する。
【００７３】
さらなる例として、患者のサンプル（例、腫瘍サンプル）からの２つ又はそれ以上のＧＣＰＭを含む予後徴候の発現レベルを、再発性／非再発性癌のサンプルと比較できる。患者のサンプルが、非再発性癌のサンプルとの比較により発現の増加又は減少、及び／又は再発性癌のサンプルと同程度の発現を示す場合、ネガティブな予後を意味する。患者のサンプルが、非再発性癌のサンプルと同程度であるＧＣＰＭの発現、及び／又は再発性癌のサンプルよりも低い又は高い発現を示す場合、ポジティブな予後を意味する。
【００７４】
１つのアプローチとして、予測方法を、予測モデルを生成するために、マーカーのパネル、例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに概説するＧＣＰＭのパネルに適用できる。これは、２つ又はそれ以上のＧＣＰＭを含む予後徴候の生成を含む。
【００７５】
表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄにおける開示したＧＣＰＭは、従って、癌の予後の判断、及びその腫瘍に特有の処置計画、又は処置法の確立のための予後徴候を生成するためのマーカーの有用なセットを提供する。特に、ポジティブな予後が、患者により使用され、標準的又はより侵襲性の低い処置選択肢を追及することを決断できる。ネガティブな予後が、患者により使用され、処置を終了する又は高度に侵襲性のもしくは実験的な処置を追及することを決断できる。また、患者は、予後診断マーカー（例、ＧＣＰＭ）の発現へのその影響に基づき処置を選ぶことができる。
【００７６】
ＧＣＰＭのレベルを、腫瘍組織、腫瘍の近位にある組織、リンパ節サンプル、血液サンプル、血清サンプル、尿サンプル、又は糞便サンプルにおいて、任意の適した技術を使用して検出でき、限定はされないが、オリゴヌクレオチドプローブ、定量的ＰＣＲ、又はマーカーに対して産生された抗体を含みうる。予測徴候の形態での複数のＧＣＰＭの発現の存在及び量を分析し、予後徴候を構築することにより、予後診断の感度及び正確性が増加されることが理解される。従って、本発明の複数のマーカーを使用し、癌の予後を判断できる。
【００７７】
本発明は、セット中のマーカーのアッセイのための保管されたパラフィン包埋生検材料の使用を含み、従って、大半の広く利用可能な型の生検材料に適合する。それは、また、腫瘍組織回収のいくつかの異なる方法、例えば、コア生検又は穿刺吸引に適合する。特定の局面では、ＲＮＡを患者の固定ワックス包埋癌組織標本から単離する。単離は、当技術分野において公知の任意の技術により、例えば、コア生検組織又は穿刺吸引細胞から実施してよい。
【００７８】
一局面では、本発明は、予後、例えば、癌の再発を伴わない癌患者の長期生存の可能性を予測する方法に関し、患者から得られたサンプル中での１つ又は複数の予後診断マーカー又はそれらの発現産物の発現レベル（サンプル中での他のＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物、又はＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている）の決定を含む。特定の局面では、予後診断マーカーは、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙する１つ又は複数のマーカーであり、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーに由来する１つ又は複数の予後徴候として含まれる。
【００７９】
さらなる局面では、予後診断マーカー又はそれらの発現産物の発現レベルを、例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカー、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーに由来する予後徴候について決定する。別の局面では、方法は、予後診断マーカーの全セット又はそれらの発現産物（例、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカー、又は表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、もしくは表Ｄに列挙するマーカーに由来する予後徴候について）の発現レベルの決定を含む。
【００８０】
追加の局面では、本発明は、２つ又はそれ以上のマーカー（例、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、もしくは表Ｄに列挙するマーカー、又は表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、もしくは表Ｄに列挙するマーカーに由来する予後徴候について）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイ（例、マイクロアレイ）に関する。特定の局面では、アレイは、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーに由来する予後徴候、又は例えば、予後徴候についてハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。別の特定の局面では、アレイは、マーカーの全セット（例えば、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに列挙するマーカーについて、又は、例えば、予後徴候について）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【００８１】
これらのアレイでは、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、又はオリゴヌクレオチドにしてよく、それらをディスプレイする固形表面は例えばガラスでよい。ポリヌクレオチドは、本明細書で開示するマーカーの１つ又は複数のマーカー、例えば、全長配列、任意のコード配列、任意のフラグメント、又はそれらの任意の相補体にハイブリダイズできる。特定の局面では、１つ又は複数のＧＣＰＭの発現レベルにおける増加又は減少は、長期生存の可能性の減少（例、癌の再発に起因する）を示し、１つ又は複数のＧＣＰＭの発現レベルにおける増加又は減少の欠如は、癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加を示す。
【００８２】
さらなる局面では、本発明は、以下：（１）抽出緩衝液／試薬及びプロトコール；（２）逆転写緩衝液／試薬及びプロトコール；ならびに（３）定量的ＰＣＲ緩衝液／試薬及びプロトコール（先の方法のいずれかの実施に適する）の１つ又は複数を含むキットに関する。本発明の他の局面及び利点を、本明細書に含まれる説明及び実施例において例示する。
【００８３】
【表２】
表Ａ：高及び低増殖状態にある細胞株間で異なって発現される増殖関連遺伝子
コンフルエント（低増殖）及び半コンフルエント（高増殖）状態にある細胞株間で異なって発現された遺伝子（図１を参照のこと）を、30K MWG Biotechアレイでのマイクロアレイ解析により同定した。表Ａは、細胞増殖関連として遺伝子オントロジー分析により分類されたこれらの遺伝子のサブセットを含む。
【００８４】
【表３】
表Ｂ：公知の細胞増殖関連遺伝子遺伝子
オントロジー分析により細胞増殖関連として分類され、Affymetrix HG-U133プラットフォーム上に存在する全ての遺伝子
【００８５】
予後診断マーカー検出への一般的アプローチ
以下のアプローチ：ＧＣＰＭに選択的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したマイクロアレイアプローチ；ＧＣＰＭ特異的プライマー及びプローブを使用した腫瘍サンプルでのリアルタイムｑＰＣＲ；リンパ節、血液、血清、糞便、又は尿サンプルでの、ＧＣＰＭ特異的プライマー及びプローブを使用したリアルタイムｑＰＣＲ；酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）；抗マーカー抗体を使用した免疫組織化学的検査；及びコンピュータを使用したアレイ又はｑＰＣＲの分析は、ＧＣＰＭファミリーメンバーを含む増殖マーカーを検出するために使用できる非限定的な方法である。
【００８６】
他の有用な方法は、ノーザンブロッティング及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Parker and Barnes, Methods in Molecular Biology 106: 247-283 (1999)）；ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Hod, BioTechniques 13: 852-854 (1992)）；逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ； Weis et al., Trends in Genetics 8: 263-264 (1992)）；遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ； Velculescu et al., Science 270: 484-487 (1995)；及びVelculescu et al., Cell 88: 243-51 (1997)）、MassARRAY技術（Sequenom, San Diego, CA）、及び大規模並列徴候シークエンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による遺伝子発現解析（ＭＰＳＳ； Brenner et al., Nature Biotechnology 18: 630-634 (2000)）を含む。あるいは、特定の複合体（ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖、又はＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む）を認識できる抗体を用いてよい。
【００８７】
一次データを収集し、倍率変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）分析を実施できる（例えば、腫瘍組織及び非腫瘍組織におけるマーカー発現レベルの比較による；マーカー発現レベルと、再発腫瘍及び非再発腫瘍において測定されたレベルとの比較による；マーカー発現レベルと、転移を伴う又は伴わない腫瘍において測定したレベルとの比較による；マーカー発現レベルと、異なって病期分類された腫瘍において測定されたレベルとの比較による；マーカー発現レベルと、異なる増殖レベルを伴う細胞において測定されたレベルとの比較による）。ネガティブ又はポジティブな予後をこの分析に基づいて判断する。腫瘍マーカー発現のさらなる分析は、発現の増加又は減少を示すそれらのマーカーと、公知の胃腸腫瘍の発現プロファイルとのマッチングを含み、予後診断を提供する。
【００８８】
発現が増加していると結論付けるための閾値は、例えば、少なくとも１．５倍又は２倍の増加、そして代わりの実施態様では、少なくとも３倍の増加、４倍の増加、又は５倍の増加として提供する。発現が減少していると結論付けるための閾値は、例えば、少なくとも１．５倍又は２倍の減少、そして代わりの実施態様では、少なくとも３倍の減少、４倍の減少、又は５倍の減少として提供する。発現の増加又は減少が生じたと結論付けるための他の閾値を、本発明の精神から逸脱することなく選択できることが理解できる。
【００８９】
発現が増加していると結論付けるための閾値が、特定のマーカー及び、また、適用すべき特定の予測モデルに依存的であることも理解されうる。閾値は、一般的に、最低誤差率を伴う最高の感度及び選択性を達成するために設定するが、特定の臨床状況では変動が望ましくなりうる。所望の閾値を、任意の予測モデルの統計的変動性を考慮に入れて、十分なサイズの集団を分析することにより決定し、予測モデルを産生するために使用するサンプルのサイズから算出する。同じことを、発現が減少していると結論付けるための閾値の決定に適用する。発現の増加又は減少が生じていると結論付けるための他の閾値、又は閾値を確立するための方法を、本発明の精神から逸脱することなく選択できることが理解できる。
【００９０】
予測モデルが、その出力として、数値、例えば、スコア、可能性値、又は確率を産生しうることも可能である。これらの場合では、閾値を、予測モデルにより産生された結果を適用することが可能であり、そしてこれらの場合では、類似の原理を、発現値について閾値を設定するために使用されるものとして適用する。
【００９１】
ひとたび腫瘍サンプル中の１つ又は複数の増殖マーカーの発現レベルが得られれば、癌再発の可能性を次に判断できる。本発明によると、ネガティブな予後は少なくとも１つの増殖マーカーの発現減少に関連し、ポジティブな予後は少なくとも１つの増殖マーカーの発現増加に関連する。種々の局面では、発現における増加は、本明細書で開示するマーカーの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は７５により示される。他の局面では、発現における減少は、本明細書で開示するマーカーの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は７５により示される。
【００９２】
同定された遺伝子から、１つ又は複数のＧＣＰＭを含む増殖徴候を使用し、１つ又は複数の遺伝子の発現レベルを開示した増殖徴候と比較することにより、癌の予後を決定できる。開示した増殖徴候と腫瘍サンプル中での１つ又は複数のＧＣＰＭの発現を比較することにより、癌再発の可能性を判断できる。予後を確定するための予後徴候の発現レベルの比較を、先に記載した予測モデルを適用することにより行うことができる。
【００９３】
癌再発の可能性を判断することは、医師にとって大きな価値がある。再発の高い可能性は、より長期の又はより高用量の処置を与えるべきであることを意味し、患者は癌の再発の徴候についてより厳密にモニタリングされるべきである。正確な予後診断は、患者にも利益となる。それによって、患者は、患者の配偶者、家族、及び友人と共に、処置に関する決断、ならびに患者の将来及び生活様式の変化に関する決断を下すことも可能になる。従って、本発明は、また、腫瘍サンプル中のマーカーの発現を増殖徴候の差異とマッチングすることにより確立される予後診断に基づき、特定の癌のための処置計画を確立する方法を提供する。
【００９４】
マーカーの選択、又は増殖徴候の構築は、本明細書の表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに開示するＧＣＰＭに制限すべきではなく、しかし、開示した徴候からの１つ又は複数のＧＣＰＭの使用を含みうること、又は、新たな徴候を、開示したマーカーリストから選択されたＧＣＰＭを使用して確立できることが理解される。任意の徴候の必要条件は、それが、医師が処置計画を確立するために十分な正確性で再発の可能性を予測することである。
【００９５】
驚くべきことに、ＧＣＰＭの多くが細胞増殖の増加レベルに関連し、ポジティブな予後にも関連することが発見された。同様に、ＧＣＰＭの発現レベルの減少とネガティブな予後、例えば、胃腸癌再発の可能性増加との間の密接な相関が存在することが見出されている。従って、本発明は、また、細胞増殖に関連するマーカー、例えば、細胞周期成分のＧＣＰＭとしての使用を提供する。
【００９６】
本明細書に記載する通り、癌再発の可能性の判断は、１つ又は複数の増殖特異的マーカーの発現を測定することにより遂行できる。本明細書で提供する方法は、高感度なアッセイも含む。特に、ｑＰＣＲは極めて高感度であり、サンプル中の非常に低コピー数（例、１〜１００）のマーカーを検出するために使用できる。そのような感度により、胃腸癌の予後は、信頼でき、正確になり、テストが簡単になる。
【００９７】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
上に列挙する技術の内、最も高感度で最もフレキシブルな定量方法はＲＴ−ＰＣＲであり、正常組織及び腫瘍組織中で、薬物処置を伴う又は伴わない、異なるサンプル集団においてＲＮＡレベルを比較するために、発現のパターンを特徴付けるために、密接に関連するＲＮＡの間で識別するために、そしてＲＮＡ構造を解析するために使用できる。
【００９８】
ＲＴ−ＰＣＲでは、第１工程は標的サンプルからのＲＮＡの単離である。出発材料は、典型的に、ヒト腫瘍又は腫瘍細胞株、ならびにそれぞれ対応する正常組織又は細胞株から単離される全ＲＮＡである。ＲＮＡは、種々のサンプル、例えば、乳房、肺、大腸（例、大腸又は小腸）、結腸直腸、胃、食道、肛門、直腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾、胸腺、精巣、卵巣、子宮などからの腫瘍サンプル、原発腫瘍からの組織、又は腫瘍細胞株から、及び健康なドナーからのプールサンプルから単離できる。ＲＮＡの供給源が腫瘍である場合、ＲＮＡは、例えば、凍結又は保管されたパラフィン包埋、固定（例、ホルマリン固定）組織サンプルから抽出できる。
【００９９】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングでの第１工程は、ＲＮＡ鋳型のｃＤＮＡへの逆転写であり、ＰＣＲ反応でのその指数関数的増幅が続く。２つの最も一般に使用される逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉｌｏ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）及びモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写工程では、典型的に、発現プロファイリングの状況及び目的に依存して、特定のプライマー、ランダムヘキサマー、又はオリゴｄＴプライマーを使用してプライミングする。例えば、抽出ＲＮＡは、製造業者の説明書に従って、GeneAmp RNA PCR kit（Perkin Elmer, CA, USA）を使用して逆転写できる。派生するｃＤＮＡは、次に、続くＰＣＲ反応において鋳型として使用できる。
【０１００】
ＰＣＲ工程では種々の熱安定性ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを使用できるが、典型的には、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠く）を用いる。このように、ＴａｑＭａｎ（ｇ）ＰＣＲでは、典型的に、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するＴａｑポリメラーゼ又はＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用するが、しかし、等価な５’ヌクレアーゼ活性を伴う任意の酵素を使用できる。
【０１０１】
２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを生成する。第３のオリゴヌクレオチド、又はプローブは、２つのＰＣＲプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。このプローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素により伸長可能ではなく、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素で標識される。レポーター色素からの任意のレーザー誘導性発光は、２つの色素が、それらがプローブ上に存在する際に近接して位置する場合、クエンチング色素によりクエンチされる。増幅反応中、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的な様式でプローブを切断する。結果として生じるプローブフラグメントは、溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルには第２のフルオロフォアのクエンチング効果がない。１分子のレポーター色素が、合成された各々の新分子について遊離され、未クエンチリポーター色素の検出は、データの定量的解釈のための基礎を提供する。
【０１０２】
TaqMan RT-PCRは、市販の機器、例えば、ABI PRISM 7700tam Sequence Detection System(Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)、又はLightcycler(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)などを使用して実施できる。好ましい実施形態では、５’ヌクレアーゼ手順を、リアルタイム定量的ＰＣＲ装置（例えば、ABI PRISM 7700tam Sequence Detection Systemなど）で行なう。システムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、及びコンピュータから成る。このシステムでは、サーモサイクラー上の９６ウェルフォーマット中でサンプルを増幅する。増幅中、レーザー誘導性蛍光シグナルが、ファイバー光ケーブルを通じて、全９６個ウェルについてリアルタイムで収集され、ＣＣＤで検出される。このシステムは、機器を作動させ、データを分析するためのソフトウェアを含む。
【０１０３】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔ、又は閾値サイクルとして表される。上で考察した通り、蛍光値は、サイクル毎に記録され、増幅反応中のその点までに増幅された生成物の量を表す。蛍光シグナルが、統計的に有意であるとして最初に記録される点が、閾値サイクルである。
【０１０４】
誤差及びサンプル間変動の効果を最小化するために、ＲＴ−ＰＣＲは、通常、内部標準を使用して実施される。理想的な内部標準は、異なる組織間で一定レベルで発現され、実験的処理による影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びβ−アクチンのｍＲＮＡである。
【０１０５】
リアルタイム定量的ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲ技術のより最近のバリエーションは、リアルタイム定量的ＰＣＲであり、二重標識蛍光発生プローブ（即ち、TaqMan@プローブ）を通じてＰＣＲ産物の蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、定量的競合ＰＣＲ及び定量的比較ＰＣＲの両方に適合する。前者は各標的配列のための内部コンペティターを正規化のために使用し、後者はサンプル内に含まれる正規化遺伝子、又はＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する。さらなる詳細については、例えば、Held et al., Genome Research 6: 986-994 (1996)を参照のこと。
【０１０６】
発現レベルは、固定パラフィン包埋組織をＲＮＡ供給源として使用して決定できる。本発明の一局面によると、ＰＣＲプライマー及びプローブを、増幅すべき遺伝子中に存在するイントロン配列に基づいて設計する。この実施態様では、プライマー／プローブ設計の第一工程は、遺伝子内のイントロン配列の描写である。これは、例えばKent, W. J., Genome Res.12 (4): 656-64 (2002)により開発されたＤＮＡ ＢＬＡＴソフトウエアなど、公的に利用可能なソフトウエアにより、又はそのバリエーションを含むＢＬＡＳＴソフトウエアにより行うことができる。続く工程は、ＰＣＲプライマー及びプローブ設計の十分に確立された方法に従う。
【０１０７】
非特異的シグナルを回避するために、プライマー及びプローブを設計する際にイントロン内の反復配列をマスクすることが有用である。これは、Baylor College of Medicineを通じてオンラインで利用可能なRepeat Maskerプログラムを使用することにより簡単に遂行でき、反復エレメントのライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復エレメントがマスクされているクエリー配列を戻す。マスクされた配列を次に使用し、任意の市販の、又は、そうでなければ公的に利用可能なプライマー／プローブ設計パッケージ（例えばPrimer Express（Applied Biosystems）；ＭＧＢ ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Applied Biosystems）；一般ユーザー及び生物学者プログラマーのためのＷＷＷ上のＰｒｉｍｅｒ３（Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 (Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)）など）を使用して、プライマー及びプローブの配列を設計できる。
【０１０８】
ＰＣＲプライマー設計において最も重要だと考えられている要素は、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、及びＧ／Ｃ含量、特異性、相補的プライマー配列、及び３’末端配列を含む。一般に、最適なＰＣＲプライマーは一般的に長さ１７〜３０塩基あり、約２０〜８０%、例えば、約５０〜６０%のＧ＋Ｃ塩基を含む。５０と８０℃の間のＴｍ、例えば、約５０〜７０℃が典型的に好ましい。ＰＣＲプライマー及びプローブ設計のためのさらなるガイドラインについては、例えば、Dieffenbach, C. W. et al., General Concepts for PCR Primer Design in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp.133-155;Innis and Gelfand, Optimization of PCRs in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp.5-11;及びPlasterer, T. N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70: 520-527 (1997)を参照のこと。これらの全開示が参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【０１０９】
マイクロアレイ解析
遺伝子発現の差異は、また、マイクロアレイ技術を使用して同定又は確認できる。このように、ＧＣＰＭの発現プロファイルは、新鮮な腫瘍組織又はパラフィン包埋腫瘍組織のいずれかにおいて、マイクロアレイ技術を使用して測定できる。この方法では、目的のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを含む）を、マイクロチップ基材上に配置、又は整列させる。整列させた配列（即ち、捕捉プローブ）を、次に、目的の細胞又は組織からの特異的ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる。ＲＴ−ＰＣＲ方法と同様に、ＲＮＡの供給源は、典型的に、ヒト腫瘍又は腫瘍細胞株、及び対応する正常組織又は正常細胞株から単離された全ＲＮＡである。このように、ＲＮＡは、種々の原発腫瘍又は腫瘍細胞株から単離できる。ＲＮＡの供給源が原発腫瘍である場合、ＲＮＡは、例えば、凍結又は保管されたパラフィン包埋固定（例、ホルマリン固定）組織サンプルから抽出でき、これらは日常的に調製され、日々の診療で保存される。
【０１１０】
マイクロアレイ技術の特定の実施形態では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅インサートを基材に適用する。基材は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は７５までのヌクレオチド配列を含みうる。他の局面では、基材は少なくとも１０，０００のヌクレオチド配列を含みうる。マイクロアレイ配列は、マイクロチップ上に固定され、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適する。他の実施態様として、マイクロアレイのための標的は、少なくとも５０、１００、２００、４００、５００、１０００、もしくは２０００塩基長；又は５０〜１００、１００〜２００、１００〜５００、１００〜１０００、１００〜２０００、もしくは５００〜５０００塩基長でありうる。さらなる実施態様として、マイクロアレイのための捕捉プローブは、少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、８０、もしくは１００塩基長；又は１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜５０、１０〜７５、１０〜８０、もしくは２０〜８０塩基長でありうる。
【０１１１】
蛍光標識ｃＤＮＡプローブは、目的の組織から抽出したＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの取り込みを介して生成されうる。チップに適用された標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットに特異性を伴ってハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄の後、チップを、共焦点レーザー顕微鏡又は別の検出方法（例えば、ＣＣＤカメラなど）によりスキャンする。整列した各エレメントのハイブリダイゼーションの定量によって、対応するｍＲＮＡ量の判定が可能になる。２色蛍光を用いて、ＲＮＡの２つの供給源から生成した別々に標識されたｃＤＮＡプローブは、対でアレイにハイブリダイズされる。各々の特定遺伝子に対応する２つの供給源からの転写物の相対量は、このように、同時に決定される。
【０１１２】
小型スケールのハイブリダイゼーションは、多数の遺伝子での発現パターンの簡便で迅速な評価を与える。そのような方法は、稀な転写物（１細胞当たり数コピーで発現され、発現レベルにおいて少なくとも約２倍の差異で再現性を持って検出される）を検出するために必要とされる感度を有することが示されている（Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (2): 106-149 (1996)）。マイクロアレイ解析は、例えば、Affymetrix GenChip技術又はIncyteのマイクロアレイ技術を使用することにより、製造業者のプロトコールに従って、市販の機器により実施できる。遺伝子発現の大規模解析のためのマイクロアレイ方法の開発によって、種々の腫瘍型での癌分類及び転帰予測の分子マーカーを体系的に探索することが可能になる。
【０１１３】
ＲＮＡの単離、精製、及び増幅
ｍＲＮＡ抽出のための一般的方法は当技術分野において周知であり、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)を含む、分子生物学の標準的テキストに開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出のための方法は、例えば、Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987)、及びDe Sandres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995)に開示されている。特に、ＲＮＡ単離は、例えばＱｉａｇｅｎなどの製造業者からの精製キット、緩衝液セット、及びプロテアーゼを使用し、製造業者の説明書に従って実施できる。例えば、培養中の細胞からの全ＲＮＡを、Qiagen RNeasyミニカラムを使用して単離できる。他の市販のＲＮＡ単離キットは、MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit（EPICENTRE(D, Madison, WI)）、及びParaffin Block RNA Isolation Kit（Ambion, Inc.）を含む。組織サンプルからの全ＲＮＡをRNA Stat-60（Tel-Test）を使用して単離できる。腫瘍から調製したＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心法により単離できる。
【０１１４】
ＲＮＡ供給源として固定パラフィン包埋組織を使用して遺伝子発現をプロファイリングするための代表的なプロトコールの工程（ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長、及び増幅を含む）が、種々の刊行された学術論文（例えば：T. E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)）に与えられる。簡単に説明すると、代表的なプロセスは、パラフィン包埋腫瘍組織サンプルを厚さ約１０μmの切片に切断することから開始する。ＲＮＡを次に抽出し、そしてタンパク質及びＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の分析後、必要な場合、ＲＮＡ修復及び／又は増幅の工程を含めてよく、ＲＮＡは遺伝子特異的プロモーターを使用して逆転写し、ＲＴ−ＰＣＲが続く。最後に、データを解析し、検証した腫瘍サンプルで同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づき、患者に利用可能な最善の処置選択肢を特定する。
【０１１５】
免疫組織化学及びプロテオミクス
免疫組織化学的方法は、また、本発明の増殖マーカーの発現レベルを検出するのに適する。このように、抗体又は抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、及び最も好ましくは各マーカーに特異的なモノクローナル抗体を使用して、発現を検出する。抗体は、抗体自体を、例えば、放射性標識、蛍光標識、ハプテン標識（例えば、ビオチン）、又は酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）での直接標識により検出できる。あるいは、未標識一次抗体を標識二次抗体（一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清、又はモノクローナル抗体を含む）と共に使用する。免疫組織化学プロトコール及びキットは、当技術分野において周知であり、市販されている。
【０１１６】
プロテオミクスを使用し、特定の時点でサンプル（例、組織、生体、又は細胞培養物）中に存在するポリペプチドを分析できる。特に、プロテオミクス技術を使用し、サンプル中でのタンパク質発現の包括的変化を評価できる（「発現プロテオミクス」とも呼ばれる）。プロテオミクス分析は、典型的に、以下：（１）サンプル中の個々のタンパク質の２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ ＰＡＧＥ）による分離；（２）ゲルから回収された個々のタンパク質の同定（例、質量分析又はＮ末端シークエンシング）、及び（３）バイオインフォマティクスを使用したデータの分析を含む。プロテオミクス方法は、遺伝子発現プロファイリングの他の方法への価値ある補完であり、単独又は他の方法との組み合わせで使用し、本発明の増殖マーカーの産物を検出できる。
【０１１７】
異なって発現される遺伝子の選択
有意と見なされる遺伝子の選択への早期アプローチは、目的の２群間での所定の遺伝子の「倍率変化」を単に見ることを含む。このアプローチでは最も目覚ましく変化すると思われる遺伝子に焦点を合わせ、基礎統計の考察によって、分散（又はノイズレベル）が非常に高い場合（マイクロアレイ実験でしばしば見られる）、外見的に大きな倍率変化が偶然だけにより頻繁に起こりうることを認める。
【０１１８】
マイクロアレイ実験、例えば本明細書に記載するものなどは、典型的に、数千の遺伝子の同時測定を含む。２群間（例えば、再発性腫瘍及び非再発性腫瘍）で特定の遺伝子について発現レベルを比較している場合、有意性についての典型的な検定（例えば、ｔ検定など）は適切ではない。これは、数千の実験のアンサンブルで（この状況では、各遺伝子が「実験」を構成する）、少なくとも１つの実験が有意性についての通常の基準を偶然だけにより合格する確率は本質的に単一であるからである。有意性についての検定では、典型的に、「帰無仮説」が正確である確率を算出する。２群を比較する場合、帰無仮説は、２群間に差異が存在しないことである。統計的検定が、ある閾値（通常、０．０５又は０．０１）を下回る帰無仮説についての確率を産生する場合、本発明者らは帰無仮説を拒絶し、２群が有意に異なるとの仮説を受け入れることが述べられている。明らかに、そのような検定では、偶然だけによる帰無仮説の拒絶が、２０分の１（又は１００分の１）で予測されうる。ｔ検定、又は有意性についての他の類似の統計的検定の使用は、マイクロアレイとの関連で失敗し、ずっと多くの偽陽性（又は第一種過誤）を産生する。
【０１１９】
この型の状況では、複数の仮説を同時に検定し、典型的な複数の比較手順、例えばボンフェローニの方法（４３）などを適用する。しかし、そのような検定は、大半のマイクロアレイ実験で保存的すぎ、多くの偽陰性（第二種）過誤をもたらす。
【０１２０】
より最近のアプローチは、所定の検定が有意である確率を適用する試みを使用せず、実験のサブセットを選択する手段を確立し、第一種過誤の予測される割合（又は偽発見率；４７）が制御されるようにする。それは、この研究で使用されてきたこのアプローチであり、種々の実行、即ち、BRB Array Tools（４８）、及びBioconductor（Ｒ統計的環境を使用する；１０、３９）のlimma（１１、４２）パッケージを用いて提供される方法を介する。
【０１２１】
データマイニングのための一般的方法論：予後徴候の生成
データマイニングは、「知識」の抽出、換言すると、「ノウハウ」、又は（通常）大量のデータ（データセット）からの予測能を記載するために使用する用語である。これは、予後徴候を生成するためにこの試験で使用するアプローチである。この試験の場合、「ノウハウ」は、所定のセットの遺伝子発現測定値からの予後、又は「徴候」を的確に予測するための能力である（一般的にこのセクションにおいて、及び、実施例のセクションにおいて詳細に記載される）。
【０１２２】
この試験で使用される方法で使用される特定の詳細を、実施例１７〜２０に記載する。しかし、データマイニング方法（実施例に記載の方法、及び本明細書に記載の方法の両方）のいずれの適用も、この一般的プロトコールに従う。
【０１２３】
データマイニング（４９）、及び関連するトピック機械学習（４０）は複雑で反復的な数学的課題であり、１つ又は複数の適切なコンピューターソフトウェアパッケージ（以下を参照のこと）の使用を含む。ソフトウェアの使用は他方で有利である（仮に正確な方法論に固執する場合、データマイニング技術の使用に成功するために、各技術の背後にある理論の複雑さに完全に精通する必要はない）。不利点は、データマイニングの適用がしばしば「ブラックボックス」と見なされうることである：データを挿入し、回答を受け取る。これをどのように達成するかは、エンドユーザーからしばしばマスクされている（これは、記載の技術の多くの場合であり、データマイニングのための選ばれた統計的方法にしばしば影響を与えうる）。例えば、ニューラルネットワーク及びサポートベクターマシンは、特に複雑な実行を有し、エンドユーザーが決断を産生するために使用する「規則」を抽出することを非常に困難にする。他方で、ｋ−最近隣法及び線形判別分析は、ユーザーから隠されていない意思決定のための非常に透明なプロセスを有する。
【０１２４】
データマイニングで使用する２つの型のアプローチが存在する：教師あり（supervised）アプローチ及び教師なし（unsupervised）アプローチ。教師ありアプローチでは、データと関連付けれらる情報は公知である（例えば、カテゴリーデータ（例、再発性腫瘍対非再発性腫瘍））。必要とされるものは、観察された応答（例、再発性対非再発性）と入力変数を関連付ける能力である。教師なしアプローチでは、データセット内のクラスは事前に公知ではなく、データマイニング方法論を用いて、データセット内のクラス又は構造を見出すことを試みる。
【０１２５】
本実施例では教師ありアプローチが使用されたが、本明細書で詳細に考察され、他の技術のいずれかが使用されうると理解される。
【０１２６】
全プロトコールは以下の工程を含む：
【０１２７】
● データ表示。これは、選ばれたデータマイニング技術で作業を成功する可能性が最も高い形態へのデータ変換を含む。データが数値である、例えば研究中のデータが遺伝子発現の相対レベルを表わすこの試験などの場合では、これはかなり単純である。データが大きなダイナミックレンジ（即ち、多くの桁）を対象とする場合、しばしばデータの対数を取る。データが、別々の日での別々の研究者による別々のサンプルでの多くの測定値を対象とする場合、特別な注意を払い、系統誤差が最小化されることを保証しなければならない。系統誤差（即ち、プロトコールの差異、マシンの差異、操作者の差異、及び他の定量可能因子に起因する誤差）の最小化は、本明細書で「正規化」と呼ばれるプロセスである。
【０１２８】
● 特性選択。典型的に、データセットは、日常的に測定するために実際的でありうるより多くのデータエレメント、及び、追加で、予測モデルを産生するために必要とされる情報を提供しない多くのエレメントを含む。予測モデルがデータセットを記載する実際の能力は、データセットの全次元の特定のサブセットに由来する。これらの次元は、データセットの最も重要な成分（又は特性）である。マイクロアレイデータに関連し、データセットの次元は個々の遺伝子であることに注意すること。特性選択は、本明細書の記載に関連し、最も「異なって発現」されるそれらの遺伝子を見出すことを含む。より一般的な意味で、それは有意性についての特定の統計的検定に合格するそれらの群を含み、即ち、研究中の１つ又は他の群において一貫してより高い又はより低い特定の変数のレベルである。時折、特性は、最も大きな分散を示すそれらの変数（又は次元）である。
【０１２９】
特性選択の適用は、予測モデルを作るために使用される方法に完全に非依存的であり、所望の結果を達成するための多大の実験を含む。本発明内で、有意な遺伝子、及びより早期の成功モデル（ＮＺ分類子）と相関する遺伝子の選択は、特性選択を伴った。また、データ整理の方法（例えば主成分分析など）をデータセットに適用できる。
【０１３０】
● 訓練。ひとたびクラス（例、再発／非再発）及びデータセットの特性が確立されており、データがデータマイニングのための入力として容認できる形態で表わされた場合、低下したデータセット（特性により記載される）を選択肢の予測モデルに適用する。このモデルのための入力は、通常、多次元数値入力の形態であり（ベクターとして公知）、出力情報（クラスラベル又は応答）と関連する。訓練プロセスにおいて、選択されたデータを、連続的（ニューラルネットワークなどの技術において）又は全体として（特定の形態の回帰を適用する技術、例えば線形モデル、線形判別分析、サポートベクターマシンにおいて）のいずれかで予測モデル中に入力する。特定の例（例、ｋ−最近隣法）では、データセット（又は特性選択後に得られるデータセットのサブセット）はそれ自体がモデルである。考察した通り、効果的モデルを、詳細な数学の最小限の理解により、種々のソフトウェアパッケージの使用を通じて確立でき、ここでモデルのパラメータは、成功の結果を導く可能性が最も高いように専門分析者により事前に決定されている。
【０１３１】
● バリデーション。これは、データマイニングプロトコールの重要な構成要素であり、この不正確な適用は頻繁に誤差を招く。データセットの部分は別に、特性選択及び訓練とは別に設定すべきであり、予測モデルの成功をテストする。さらに、バリデーションの結果を使用して、特性選択及びモデルの訓練をもたらす場合、それを現実の状況に適用する前にモデルをテストするためのさらなるバリデーションセットを得る。このプロセスがモデルに厳密に従わない場合、現実世界の状況において失敗する可能性が高い。バリデーションの方法を、以下により詳細に記載する。
【０１３２】
● 適用。ひとたにモデルが構築され、バリデーションされれば、それはエンドユーザーに利用可能な特定の方法でパッケージしなければならない。これは、しばしば、特定の形態のスプレッドシートアプリケーション（その中にモデルを包埋している）、統計ソフトウェアパッケージのスクリプト記述、又は情報技術スタッフによるハードコードされたアプリケーション中へのモデルのリファクタリングの実行を含む。
【０１３３】
頻繁に使用されるソフトウェアパッケージの例：
− スプレッドシートプラグイン（複数の業者から得られる）
− Ｒ統計環境
− 市販パッケージMatLab、S-plus、SAS、SPSS、STATA
− フリーのオープンソースソフトウェア、例えばOctave（MatLab clone）など
− 多くの多様なＣ＋＋ライブラリー、市販のクローズソース設定における予測モデルの実行のために使用できる。
【０１３４】
データマイニング方法の例
方法は、最初にデータマイニングプロセスの工程（上記）を実施し、次に適切な公知のソフトウェアパッケージを適用することによることができる。データマイニングのプロセスのさらなる説明が、多くの極めて良く書かれたテキストに詳細に記載される（４９）。
【０１３５】
● 線形モデル（４９、５０）：データを線形回帰モデルの入力として処理し、その中ではクラスラベル又は応答変数が出力である。クラスラベル、又は他のカテゴリーデータを、数値（通常は整数）に変換しなければならない。一般化された線形モデルでは、クラスラベル又は応答変数は、それ自体が入力データに直線的に関連せず、しかし、「リンク関数」の使用を通じて変換される。ロジスティック回帰は一般化された線形モデルの最も共通の形態である。
【０１３６】
● 線形判別分析（４９、５１、５２）：データを直線的に分離可能である場合（即ち、データの群又はクラスを超平面（閾値のｎ次元延長である）により分離できる）、この技術を適用できる。変数の組み合わせを使用してクラスを分離し、群間分散を最大化し、そして群内分散を最小化する。この副産物は、分類規則の形成である。この規則の未知クラスのサンプルへの適用によって、そのサンプルのために作るべきクラスメンバーシップの予測又は分類が可能になる。線形判別分析、例えばマイクロアレイ解析のために共通に使用される最短収縮重心法（ｎｅａｒｅｓｔ ｓｈｒｕｎｋｅｎ ｃｅｎｔｒｏｉｄ）の変動が存在する。
【０１３７】
● サポートベクターマシン（５３）：変数のコレクションを、加重のコレクションと併用し、それらの加重変数に関するクラス間の分離を最大化するモデルを決定する。このモデルのサンプルへの適用によって、次に、そのサンプルでのクラスメンバーシップの分類又は予測が産生される。
【０１３８】
● ニューラルネットワーク（５２）：データをノードのネットワーク（生物学的ニューロンと表面的に似ている）中への入力として処理し、それらが連結されている全てのノードからの入力を適用し、そして入力が出力に変換される。通常、ニューラルネットワークでは「乗加算（ｍｕｌｔｉｐｌｙ ａｎｄ ｓｕｍ）」アルゴリズムを使用し、複数の連結入力ノードからの入力を単一出力に変換する。ノードは、そのノードへの入力が特定の閾値を超えない場合、必ずしも出力を産生しないであろう。各ノードは、その入力として、いくつかの他のノードからの出力を有しており、通常、最終出力ノードはカテゴリー変数に関連付けられている。ノードの数、及びノードのトポロジーは、ほとんど無限の方法で変動でき、他の方法ではカテゴリー化することが可能ではないであろう、極めてのノイズのあるデータを分類する能力を提供する。ニューラルネットワークの最も共通の実行は、多層パーセプトロンである。
【０１３９】
● 分類ツリー及び回帰ツリー（５４）：これらでは、変数を使用し、サンプルのクラスを決定するために段階的方法で従うことができる規則の階層を定義する。典型的プロセスでは、特定クラス出力、又は判別能力の具体的記載を導く一連の規則が作られる。例の分類ツリーは、例えば以下：
if gene A> x and gene Y > x and gene Z = z
then
class A
else if geneA = q
then
class B
のアルゴリズムの実行である。
【０１４０】
● 最短距離法（５１、５２）
予測又は分類は、サンプル（未知のクラス）をその周囲のもの（公知のクラス）と比較することにより行い、近似を距離関数により定義する。多くの異なる距離関数を定義することが可能である。通常使用される距離関数は、ユークリッド距離（ピタゴラス距離の（三角測量と同様の）ｎ次元への延長）、種々の形態の相関（ピアソン相関係数を含む）である。また、通常は、意味のある距離メトリックにより相互に連結されないであろうデータポイントをユーグリッド空間に変換する変換関数が存在し、ユーグリッド距離を次に適用できる（例、マハラノビス距離）。距離メトリックは非常に複雑でありうるが、ｋ−最近接法の基本となる前提は非常に単純であり、本質的に「未知の入力と最も類似のｋ−データベクターを見出し、それらがいずれのクラスに対応するかを見出し、そして未知の入力がいずれのクラスであるのかに関して投票する」との再記載である。
【０１４１】
● 他の方法：
− ベイジアン・ネットワーク
有向非巡回グラフを使用し、それらの同時確率分布との併用で変数のコレクションを表わし、それを次に使用し、サンプルについてのクラスメンバーシップの確率を決定する。
− 独立成分分析、ここでは独立シグナル（例、クラスメンバーシップ）を変数のコレクションから（成分中に）単離する。これらの成分を次に使用し、サンプルについてのクラスメンバーシップの分類又は予測を産生できる。
集合学習法は、予測方法のコレクションを合わせ、サンプルについてのクラスメンバーシップの同時分類又は予測を産生する。
【０１４２】
探索できるこれらの方法論の多くのバリエーションが存在し、多くの新たな方法論が常に定義され、開発されている。容認できる結果を得るために、これらの方法論のいずれかを適用できることが理解される。全ての結果が包括的バリデーション計画を介してテストされることを保証することにより、注意し、過剰適合を回避しなければならない。
【０１４３】
バリデーション
記載の予測モデルのいずれかの適用は、方法を新たなデータセット（例えば臨床試験からのデータなど）に適用できる前に、訓練及びクロスバリデーション（４３、５５）の両方を含む。訓練は、目的のデータセットのサブセット（この場合では、結腸直腸癌からの遺伝子発現測定）を取ることを含み、テスト中のクラス（この場合では、再発性腫瘍及び非再発性腫瘍）にわたり層別化する。この訓練セットを使用し、予測モデル（上で定義する）を生成し、それをデータの残り（テストセット）についてテストする。
【０１４４】
テストセットにおいてより良好な成績を得るために予測モデルのパラメータを変更することが可能であるが、しかし、これは過剰適合として公知の状況を導き、ここでは予測モデルが訓練データセットに作用するが、しかし、任意の外部データセットには作用しない。これを回避するために、バリデーションのプロセスに従う。典型的に適用される２つの主な型のバリデーションが存在し、第１（ホールドアウトバリデーション）はデータセットを３群に分割することを含む：テスト、訓練、及びバリデーション。バリデーションセットは、訓練プロセス中へのいかなる入力も有さず、パラメータの任意の調整又は他の改良が、テストセット（バリデーションセットではない）への適用中に起こらなければならない。第２の主な型はクロスバリデーションであり、それは、以下に記載するいくつかの異なる方法で適用できる。
【０１４５】
２つの主な亜型のクロスバリデーションが存在する：Ｋ倍クロスバリデーション及び１個抜き（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ）クロスバリデーション。
【０１４６】
Ｋ倍クロスバリデーション：データセットをＫサブサンプルに分け、各サブサンプルがオリジナルとほとんど同じ割合のクラスグループを含む。各回のバリデーション中に、Ｋサブサンプルの１つを取っておき、そして訓練はデータセットの残りを使用して達成する。その回での訓練の有効性は、１個抜き群の分類がどの程度正確であるかにより測る。この手順はＫ回繰り返し、そして全有効性が、公知のクラスを伴う予測クラスの比較により確認される。
【０１４７】
１個抜きクロスバリデーション：通常使用されるＫ倍クロスバリデーションの変動（Ｋ＝ｎ；ｎはサンプル数である）。
【０１４８】
ＣＣＰＭＳの組み合わせは、例えば表１及び２に上に記載するものなどであり、予後診断のための予測モデルを構築するために使用できる。
【０１４９】
予後徴候
予後徴候は、１つ又は複数のこれらのマーカーを含み、徴候に由来する１つ又は複数の予測モデルの適用を通じて患者の転帰を判断するために使用できる。特に、臨床医又は研究者は、徴候における１つ又は複数の発現差異（例、発現の増加又は減少）を判断し、予測モデルを適用し、それによりネガティブな予後（患者の疾患再発の可能性）又は、代わりにポジティブな予後（寛解の継続）の可能性を予測できる。
【０１５０】
さらなる局面では、本発明は、癌の処置計画の決定方法を含み、以下：（ａ）癌サンプルの提供；（ｂ）サンプル中のＧｇＣＰＭファミリーメンバーの発現レベルの検出；（ｃ）ＣＣＰＭファミリーメンバーの発現レベルに基づく癌の予後の判断；及び（ｄ）予後診断に従った処置計画の決定を含む。
【０１５１】
さらなる局面では、本発明は、ＧＣＰＭを検出するための装置を含み、以下：その上にＧＣＰＭ捕捉試薬を有する基材；及び基材に関連する検出器を含む、検出器は捕捉試薬に関連するＧＣＰＭを検出可能である。追加の局面は、癌を検出するためのキットを含み、以下：基材；ＧＣＰＭ捕捉試薬；及び使用説明書を含む。本発明のさらなる局面は、ｑＰＣＲを使用してａＧＣＰＭを検出するための方法を含み、以下：ＣＣＰＭに特異的なフォワードプライマー；ＧＣＰＭに特異的なリバースプライマー；ＰＣＲ試薬；反応バイアル；及び使用説明書を含む。
【０１５２】
本発明の追加の局面は、ＧＣＰＭポリペプチド又はペプチドの存在を検出するためのキットを含み、以下：ＧＣＰＭポリペプチド又はペプチドのための捕捉試薬を有する基材；ＧＣＰＭポリペプチド又はペプチドに特異的な抗体；ＧＣＰＭポリペプチド又はペプチドのための結合抗体を標識可能な試薬；及び使用説明書を含む。
【０１５３】
さらなる局面では、本発明は、結腸直腸癌の予後を判断するための方法を含み、以下の工程：結腸直腸癌を有することが疑われる患者からの腫瘍サンプルの提供；ＥＬＩＳＡ方法を使用したＧＣＰＭポリペプチドの存在の測定を含む。本発明の特定の局面では、本発明のＧＣＰＭは、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄに示すマーカーから選択される。さらなる局面では、ＧＣＰＭは予後徴候に含まれる。
【０１５４】
胃腸癌、例、胃癌及び結腸直腸癌について本明細書で例示され、本発明のＧＣＰＭでは、他の癌（例、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌（例えば腺癌及び、特に、小細胞肺癌など）、リンパ腫、神経膠腫、芽細胞腫（例、髄芽細胞腫）、及び中皮腫）の予後診断のための使用も見出され、減少した又は低い発現はポジティブな予後に関連し、増加した又は高い発現はネガティブな予後に関連する。
【０１５５】
実施例
本明細書に記載する実施例は、本発明の実施態様を例証する目的のためである。分析の他の実施態様、方法、及び型は、分子診断技術における当業者の範囲内であり、本明細書では詳細に記載する必要はない。当技術分野の範囲内の他の実施態様は、本発明の一部と見なされる。
【０１５６】
実施例１：細胞培養
実験計画を図１に示す。１０の結腸直腸細胞株を培養し、半コンフルエンス及び完全コンフルエンスで回収した。２つの成長段階の遺伝子発現プロファイルを３０，０００オリゴヌクレオチドアレイで解析し、遺伝子増幅徴候（ＧＰＳ；表Ｃ）を、異なって発現される遺伝子の遺伝子オントロジー分析により同定した。教師なしクラスタリングを次に使用し、ＧＰＳ発現の類似性に基づき、臨床の結腸直腸サンプルの２つのコホート（コホートＡ：７３オリゴアレイ上の病期Ｉ−ＩＶ、コホートＢ：５５ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ上の病期ＩＩ）を独立的に二分した。Ｋｉ−６７免疫染色は、コホートＡ腫瘍からの組織切片でも実施した。これに従い、増殖活性と臨床病理学的パラメータの間の相関を研究した。
【０１５７】
異なる病期に由来する１０の結腸直腸癌細胞株が、本試験に含まれた：ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−８、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、Ｌｓ１７４Ｔ、ＳＫ−ＣＯ−１、ＳＷ４８、ＳＷ４８０、及びＳＷ６２０（ATCC, Manassas, VA）。細胞を、３７℃の５% ＣＯ２加湿空気中で、１０%ウシ胎児血清、１００IU/mlペニシリン及び１００μg/mlストレプトマイシン（GIBCO-Invitrogen, CA）を添加したアルファ最小必須培地中で培養した。２つの細胞培養物を、各細胞株について確立した。第１の培養物を、半コンフルエント（５０〜６０%）に達した時に回収した。第２の培養物中の細胞が完全コンフルエントに達した際（顕微鏡的及び肉眼的の両方で判断した）、培地を交換し、そして細胞を２４時間後に回収し、成長阻止細胞からＲＮＡを調製した。アレイ実験を、各細胞培養物から抽出したＲＮＡで行った。また、第２の培養実験を同じ手順に従って行い、抽出ＲＮＡを色素逆転（ｄｙｅ−ｒｅｖｅｒｓｅｄ）ハイブリダイゼーションのために使用した。
【０１５８】
実施例２：患者
２つのコホートの患者を解析した。コホートＡは、ダニディン及びオークランドの病院で１９９５〜２０００年の間に外科手術を受けた７３人のニュージーランドの結腸直腸癌患者を含んだ。これらの患者は前向きコホート試験の一部であり、全ての病期を含んだ。腫瘍サンプルを手術現場から新たに収集し、液体窒素中で急速凍結し、そして−８０℃で保存した。標本は１人の病理学者（Ｈ−Ｓ Ｙ）により精査され、ＴＮＭシステム（３４）に従って病期分類された。７３人の患者の内、３２人が疾患再発を発生し、４１人が最低５年間の追跡調査後に無再発のままであった。全生存期間の中央値は、再発性患者及び無再発患者でそれぞれ２９．５ヶ月間及び６６ヶ月間であった。２０人の患者が５−ＦＵベースの術後アジュバント化学療法を受け、１２人の患者が放射線療法を受けた（術前７人及び術後５人）。
【０１５９】
コホートＢは、Technical University of Munichで１９９５〜２００１年に外科手術を受けた５５人のドイツ人結腸直腸癌患者の群を含み、新鮮凍結サンプルを組織バンクに保存した。５５人全てが病期ＩＩ疾患を有し、２６人が疾患再発を発生し（生存期間の中央値４７ヶ月）及び２９人が無再発のままであった（生存期間の中央値８２ヶ月）。患者のいずれも化学療法又は放射線療法を受けなかった。両コホートの臨床病理学的変数を、表２の一部としてまとめる。
【０１６０】
【表４】
【０１６１】
実施例３：アレイの調製及び遺伝子発現解析
コホートＡの腫瘍及び細胞株：組織サンプル及び細胞株をホモジナイズし、そしてＲＮＡをTri-Reagent（Progenz, Auckland, NZ）を使用して抽出した。ＲＮＡを次に、RNeasy mini column（Qiagen, Victoria, Australia）を使用し、製造業者のプロトコールに従って精製した。各培養物又は腫瘍サンプルから抽出した１０マイクログラムの全ＲＮＡを、オリゴｄＴプライミングし、そしてｃＤＮＡ合成をａａ−ｄＵＴＰ及びSuperscript II RNase H-Reverse Transcriptase（Invitrogen）の存在下で行った。Ｃｙ色素を、間接的アミノ−アリルｃＤＮＡ標識方法を使用してｃＤＮＡ中に取り込ませた。１２の異なる細胞株のプールに由来するｃＤＮＡを、全てのハイブリダイゼーションのための参照として使用した。個々の結腸直腸癌の細胞株又は組織サンプルからのＣｙ５−ｄＵＴＰタグ付きｃＤＮＡを、参照サンプルからのＣｙ３−ｄＵＴＰタグ付きｃＤＮＡと合わせた。混合物を次にQiaQuick PCR purification Kit（Qiagen, Victoria, Australia）を使用して精製し、MWG 30K Oligo Set（MWG Biotech, NC）でスポットしたマイクロアレイに同時ハイブリダイズした。第２の培養実験からのｃＤＮＡサンプルを、追加で、リバース標識を使用してマイクロアレイで分析した。
【０１６２】
アレイをGenePix 4000B Microarray Scannerでスキャンし、データをGenePix Pro 4.1 Microarray Acquisition and Analysis Software（Axon, CA）を使用して解析した。各チャネルからの前景強度をｌｏｇ２変換し、ＳＮＯＭＡＤソフトウェア（３５）を使用して正規化した。正規化値を照合し、BRB-Array Tools Version 3.2（Dr. Richard Simon and Amy Peng Lam, Biometric Research Branch, National Cancer Instituteにより開発）を使用して選別した。低強度遺伝子、及び組織サンプル又は細胞株にわたる測定値の２０%超が失われている遺伝子は、さらなる解析から除外した。
【０１６３】
コホートＢ腫瘍：全ＲＮＡを各腫瘍からRNeasy Mini Kitを使用して抽出し、RNeasy Columns（Qiagen, Hilden, Germany）で精製した。１０マイクログラムの全ＲＮＡを使用し、SuperScript II reverse transcriptase（GIBCO-Invitrogen, NY）及びオリゴｄＴ−Ｔ７プライマー（Eurogentec, Koeln, Germany）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ビオチン化ｃＲＮＡを、二本鎖ｃＤＮＡからPromega RiboMax T7-kit（Promega, Madison, WI）及びBiotin-NTP labelling mix（Loxo, Dossenheim, Germany）を使用して合成した。次に、ビオチン化ｃＲＮＡを精製し、断片化した。断片化ｃＲＮＡをAffymetrix HGU133A GeneChips（Affymetrix, Santa Clara, CA）にハイブリダイズし、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで染色した。アレイを次にＨＰアルゴンイオンレーザー共焦点顕微鏡を用いてスキャンし、デジタル画像データをAffymetrix（登録商標）Microarray Suite 5.0 Softwareを使用して処理した。全てのAffymetrix U133A GeneChipが、異常な特徴を伴うスキャンを除去するための品質管理に合格した。バックグラウンド補正及び正規化を、Ｒコンピュータ環境中で、Bioconductor package affy中で実行されたロバストマルチアレイアベレージ関数を使用して実施した。
【０１６４】
実施例４：定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
１１の遺伝子（ＭＡＤ２Ｌ１、ＰＯＬＥ２、ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＲＡＮＳＥＨ２Ａ、ＴＯＰＫ、ＫＰＮＡ２、Ｇ２２Ｐ１、ＰＣＮＡ、及びＧＭＮＮ）の発現を、細胞培養物からのｃＤＮＡを使用してバリデーションした。全ＲＮＡ（２μg）をSuperscript II RNase H-Reverse Transcriptase kit（Invitrogen）及びオリゴｄＴプラマー（Invitrogen）を使用して逆転写した。ＱＰＣＲを、ABI Prism 7900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems）で、Taqman Gene Expression Assays（Applied Biosystems）を使用して実施した。相対的倍率変化を、内部コントロールとしてTopoisomerase 3Aを伴う２−ΔΔＣＴ方法３６を使用して算出した。参照ＲＮＡを、異なる実験間の比較を可能にするための検量用試料として使用した。
【０１６５】
実施例５：免疫組織化学的分析
Ｋｉ−６７抗原（MIB-1; DakoCytomation, Denmark）の免疫組織化学的発現を、コホートＡからの７３のパラフィン包埋した原発結腸直腸腫瘍の４μm切片上で研究した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノール中の０．３%過酸化水素でブロックし、抗原を沸騰中のクエン酸緩衝液（ｐＨ６）中に回収した。非特異的結合部位を、１% ＢＳＡを含む５%通常ヤギ血清でブロックした。一次抗体（１：５０希釈）をEnVision system（Dako EnVision, CA）及びDAB substrate kit（Vector laboratories, CA）を使用して検出した。５つの高倍率視野を１０×１０顕微鏡グリッドを使用して選択し、細胞計数を手動で、盲検様式で、臨床病理学的データの知識なしに実施した。Ｋｉ−６７増殖指数（ＰＩ）を、各腫瘍での陽性染色された核のパーセントで提示した。
【０１６６】
実施例６：統計分析
統計分析をSPSS（登録商標）version 14.0.0（SPSS Inc., Chicago, IL）を使用して実施した。Ｋｉ−６７増殖指数を平均値±ＳＤで提示した。フィッシャー直接検定又はクラスカル・ワリス検定を使用し、分類された群間での差異を、ＧＰＳ又はＫｉ−６７ ＰＩの発現対臨床病理学的パラメータに基づいて評価した。Ｐ値≦０．０５を有意と見なした。全生存期間（ＯＳ）及び無再発生存期間（ＲＦＳ）を、カプラン・マイヤー法（３７）を使用してプロットした。ログランク検定を使用し、分類された群間での生存時間における差異を検定した。相対リスク及び関連する信頼区間も、各変数について、Ｃｏｘ単変量モデルを使用して推定し、そして多変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルを、単変量解析において有意であった予測変数を伴う前向き段階的回帰を使用して開発した。Ｋ−平均クラスタリング方法を使用し、ＧＰＳの発現レベルに基づいて臨床サンプルを分類した。
【０１６７】
実施例７：結腸直腸細胞株モデルを使用した遺伝子増幅徴候（ＧＰＳ）の同定
遺伝子増幅徴候（ＧＰＳ）を引き出し、適用するために使用するアプローチの概観を図１にまとめる。ＧＰＳは、３８の有糸分裂の細胞周期遺伝子（表Ｃ）を含め、半コンフルエント培養中での周期中の細胞において比較的過剰発現されていた。低増殖は、低ＧＰＳ発現により定義され、好ましくない臨床病理学的変数、より短い全生存、及び無再発生存と関連した（ｐ＜０．０５）。関連は、Ｋｉ−６７増殖指数と臨床病理学的変数又は臨床転帰の間に見出されなかった。
【０１６８】
【表５】
【０１６９】
ＧＰＳは、その発現がＣＲＣ細胞増殖速度と相関する遺伝子のサブセットとして同定された。マイクロアレイの統計分析（ＳＡＭ；参考文献３８）を使用し、指数関数的に成長する（半コンフルエント）ＣＲＣ細胞株と非周期中（完全コンフルエント）のＣＲＣ細胞株の間で異なって発現される（ＤＥ）遺伝子を同定した（図１、段階１）。遺伝子特異的色素バイアス及び変動の他の源について調整するために、各培養セットを独立的に分析した。分析は５０２のＤＥ遺伝子に限定され、それらでは有意な発現差異が両方の培養セットにおいて２つの成長期の間で観察された（偽発見率＜１%）。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を、ＥＡＳＥ３９を使用して行い、ＤＥ遺伝子において有意に反映される生物学的プロセスカテゴリーを特定した。細胞増殖関連カテゴリーは、指数関数的に成長する細胞において上方調節される遺伝子に主に起因して過剰提示された。有糸分裂の細胞周期カテゴリー（ＧＯ：００００２７８）をＧＰＳと定義した。なぜなら、（ｉ）この生物学的プロセスは最も過剰提示されるＧＯ期間であり（ＥＡＳＥスコア＝５．５２１１）；及び（ｉｉ）３８の有糸分裂の細胞周期遺伝子の全て（表Ｃ）が、成長阻止細胞と比較し、急速成長中により高いレベルで発現されたからである。ＧＰＳからの１１の遺伝子の発現をＱＰＣＲにより判定し、アレイデータから得られる換算値と相関した。従って、ＱＰＣＲによって、増殖徴候遺伝子の発現上昇がＣＲＣ細胞株における増殖増加と相関することが確認された（図５）。
【０１７０】
実施例８：遺伝子増幅徴候の発現レベルに従ったＣＲＣサンプルの分類
ＣＲＣ腫瘍の相対的増殖状態及び臨床適用のためのＧＰＳの有用性を検証するために、２つのコホートからのＣＲＣ腫瘍をＧＰＳ発現に基づき２つのクラスターに層別化した（図１、段階２）。ＧＰＳを定義する３８の遺伝子の発現値を、腫瘍のマイクロアレイ生成発現プロファイルから最初に得た。各コホートからの腫瘍を、次に、それらのＧＰＳ発現レベルの類似性に基づき、Ｋ平均教師なしクラスタリングを使用し、２つのクラスター（Ｋ＝２）に別々に分類した。全ての選別された遺伝子を使用した、２つの定義されたクラスター間でのＤＥ遺伝子の分析によって、ＧＰＳが、両方のコホートにおいて、クラスター２（下パネル）と比較し、クラスター１（図２Ａ、上パネル）において上方制御された遺伝子のリスト内に含まれることが明らかになった。このように、クラスター１の腫瘍は高ＧＰＳ発現により特徴付けられ、クラスター２の腫瘍は低ＧＰＳ発現により特徴付けられる。
【０１７１】
実施例９：低い遺伝子増幅徴候は、好ましくない臨床病理学的変数と関連する。
表２には、ＧＰＳ発現レベルと臨床病理学的変数の間の関連をまとめている。関連は、両方のコホートにおける、低い増殖活性（低ＧＰＳ発現により定義される）と再発の増加リスクの間に観察された（コホートＡ及びＢについてそれぞれＰ＝０．０３及び＜０．００１）。コホートＡでは、低ＧＰＳ発現が、より高い病期及びリンパ節転移とも関連した（それぞれＰ＝０．００６及び０．０３）。また、コホートＡからのリンパ侵襲を伴う腫瘍は、統計的有意性に達することはないにもかかわらず（Ｐ＝０．０６）、リンパ侵襲を伴わない腫瘍よりも増殖性が低い傾向にあった。関連は、ＧＰＳ発現レベルと、腫瘍部位、年齢、性別、分化の程度、Ｔ病期、血管侵襲、リンパ球浸潤、及び腫瘍辺縁の間に見出されなかった。
【０１７２】
実施例１０：遺伝子増幅徴候によって臨床転帰が予測される。
患者の転帰を予測する際のＧＰＳの性能を検証するために、カプラン・マイヤー生存分析を使用し、低ＧＰＳ腫瘍と高ＧＰＳ腫瘍の間でＲＦＳ及びＯＳを比較した（図３）。全ての患者を術後６０ヶ月目に打ち切った。結腸直腸癌コホートＡでは、ＯＳ及びＲＦＳは、低ＧＰＳ発現を伴う患者においてより短かった（それぞれログランク検定Ｐ＝０．０４及び０．０１）。結腸直腸癌コホートＢでは、低ＧＰＳ発現も減少したＯＳ（Ｐ＝０．０００４）及びＲＦＳ（Ｐ＝０．０００２）と関連した。単変量解析においてＯＳ及びＲＦＳを予測するパラメータを多変量モデルにおいて研究した場合、病期は５年ＯＳの独立した予測因子だけであり、病期及びＴ病期はコホートＡにおけるＲＦＳの独立した予測因子であった。コホートＢでは、低ＧＰＳ発現及びリンパ侵襲が、ＯＳ及びＲＦＳの両方への独立した寄与を示した。生存分析がリンパ侵襲を伴わないコホートＢ患者に限定された場合、低ＧＰＳは依然としてより短いＯＳ及びＲＦＳに関連し、予測因子としてのＧＰＳの独立性が確認された。生存と単変数及び多変数関連の分析を表３にまとめる。
【０１７３】
低ＧＰＳ発現は、また、胃癌を伴う患者における減少した５年全生存率と関連した（ｐ＝０．００８）。低ＧＰＳ及び高ＧＰＳの胃腫瘍の全生存期間を比較したカプラン・マイヤー生存プロットを図４に示す。
【０１７４】
【表６】
【０１７５】
実施例１１：Ｋｉ−６７は、臨床病理学的変数又は生存に関連しない。
Ｋｉ−６７免疫染色は、コホートＡ腫瘍だけからの組織切片で実施した。なぜなら、パラフィン包埋サンプルがコホートＢについて利用不可能であったからである（図１、段階３）。核染色は７３すべてのＣＲＣ腫瘍で検出された。Ｋｉ−６７ ＰＩは２５%から９６%に及び、平均値は７６．３±１７．５であった。平均Ｋｉ−６７値をカットオフポイントとして使用し、腫瘍を、低ＰＩ又は高ＰＩを伴う２群に割り当てた。Ｋｉ−６７ ＰＩは、臨床病理学的変数（表２）又は生存のいずれとも関連しなかった（図３）。生存分析が最高Ｋｉ−６７値及び最低Ｋｉ−６７値を伴う患者に限定される場合、統計的差異は観察されなかった（データ示さず）。これらの結果の要約は、成長関連遺伝子の低発現が結腸直腸癌における不良転帰と関連することを示し、Ｋｉ−６７は関連を検出するために十分に高感度ではなかった。これらの知見は、癌からの早期死亡の高リスクにある患者を特定するための追加基準として使用できる。
【０１７６】
実施例１２：相関する細胞増殖遺伝子の選択
コホートＢ（５５人のドイツ人ＣＲＣ患者；表２）を、最初に、３８の遺伝子細胞増殖徴候（表Ｃ）及びＫ平均クラスタリング方法（ピアソン非中央、１０００順列、同じクラスターで発生する閾値を８０%に設定）を使用し、低増殖群と高増殖群に分類した。マイクロアレイの統計分析（ＳＡＭ）を次に適用し、全ての選別された遺伝子（１６０４１の遺伝子）が分析のために含まれた場合に低増殖群と高増殖群の間で異なって発現される（ＦＤＲ＝０）遺伝子を同定した。７５４の遺伝子が、高増殖群で過剰発現されることが見出された。ＧＡＴＨＥＲ遺伝子オントロジープログラムを次に使用し、異なって発現される遺伝子のリスト内で最も過剰提示される遺伝子オントロジーカテゴリーを同定した。細胞周期カテゴリーは、異なって発現される遺伝子のリスト内で最も過剰提示されるカテゴリーであった。低増殖群と高増殖群の間で異なって発現される１０２の細胞周期遺伝子を（元の３８の遺伝子徴候に加えて）表Ｄに示す。
【０１７７】
【表７】
【０１７８】
結論
本発明は、遺伝子増幅徴候と主要な臨床病理学的変数ならびに結腸直腸癌での転帰の間の関連を報告した最初のものである。開示した試験では、インビトロ由来の複数遺伝子増幅徴候を使用し、Ｋｉ−６７免疫染色により増殖状態を研究した。本明細書の結果によると、腫瘍でのＧＰＳの低発現は、２つの独立した患者のコホートにおける再発のより高いリスク及びより短い生存期間と関連した。対照的に、Ｋｉ−６７増殖指数は、臨床的に関連するエンドポイントのいずれとも関連しなかった。
【０１７９】
結腸直腸ＧＰＳは３８の有糸分裂の細胞周期遺伝子を包含し、遺伝子の中心セット（ＣＤＣ２、ＲＦＣ４、ＰＣＮＡ、ＣＣＮＥ１、ＣＤＫ７、ＭＣＭ遺伝子、ＦＥＮ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２、及びＢＵＢ３）を含み、それらは、乳房（４０）、（４１）、卵巣（４２）、肝臓（４３）、急性リンパ芽球白血病（４４）、神経芽細胞腫（４５）、肺偏平上皮細胞癌（４６）、頭頚部（４７）、前立腺（４８）、及び胃（４９）の腫瘍について定義された増殖徴候の一部である。これは保存された発現パターンを表わす。なぜなら、これらの遺伝子の大半が、速く成長する腫瘍において高度に過剰発現され、高い割合の迅速な周期中の細胞を反映することが見出されているからである（５０）。従って、結腸直腸ＧＰＳの発現レベルは、腫瘍の増殖状態のための測定を提供する。
【０１８０】
この試験では、不良転帰に関連するいくつかの臨床病理学的変数（病期、リンパ節転移、及びリンパ侵襲）が、コホートＡ患者での低ＧＰＳ発現と関連した。コホートＢ（病期ＩＩ腫瘍から完全になる）では、試験ではＧＰＳとリンパ侵襲の間の関連を判定した。この関連は、このコホートにおけるリンパ侵襲を伴う少数の腫瘍のため、統計的有意性に達することはできなかった（５／５５）。理論により束縛されることなく、より進行性の腫瘍での低ＧＰＳ発現は、ＣＲＣ進行が増殖亢進により促進されないことを示しうる。増殖加速は依然として腫瘍形成の初期段階中での重要な促進力でありうるが、より進行性の疾患が遺伝子不安定性などのプロセスにより依存的であり、連続的選択を可能にすることが可能である。本発明者らの知見と一致して、２つの大規模試験では、ＣＤＫ２、サイクリンＥ及びＡの発現減少と進行段階の深部浸潤及びリンパ節転移の間の関連が報告された（５１）、（５２）。
【０１８１】
低ＧＰＳと好ましくない臨床病理学的変数の間の関係によって、ＧＰＳも患者の転帰を予測することが示唆された。実際に、コホートＡ及びＢの両方において、低ＧＰＳ発現が、再発のより高いリスク及びより短い無再発全生存と関連した。コホートＢでは、全ての患者が病期ＩＩの腫瘍を有したが、関連は多変量解析中のままであった。しかし、コホートＡにおいて、患者は病期Ｉ−ＩＶの疾患を有したが、関連は腫瘍の病期に非依存的ではなかった。再発を伴う及び伴わない患者数は、コホートＡにおける疾患の各病期内にあり、恐らくは、ＧＰＳと生存の間の非依存的な関連を実証するために不十分であった。コホートＢにおいて、低ＧＰＳ発現及びリンパ侵襲は、多変量解析中の独立した予測因子のままであり、ＧＰＳが同じ病期内のＣＲＣ患者の転帰の予測を改善しうることを示唆した。驚くべきことではないが、リンパ節の存在及び遠隔臓器の関与は、転帰の最も強力な予測因子であった。なぜなら、これらは腫瘍転移の直接的な顕在化であるからである。
【０１８２】
放射線療法又は化学療法での処置は、コホートＡ患者のそれぞれ１８%及び２７%で使用され、この試験での起こりうる交絡因子であった。理論的には、ＧＰＳ発現上昇に関連する生存の改善は、癌処置に対する速く増殖する腫瘍のより良好な応答を反映しうる（５３）、（５４）。しかし、相関は処置とＧＰＳ発現の間に見出されなかった。さらに、コホートＢの患者はアジュバント療法を受けておらず、ＧＰＳと生存の間の関連が処置に非依存的であることを示す。この試験は、腫瘍増殖と化学療法又は放射線療法への反応の間の関係を研究するように計画されていなかったことを指摘すべきである。
【０１８３】
症例数も、本試験における臨床病理学的変数とＫｉ−６７ ＰＩを用いた生存の間の関連の欠如を説明しうる。上記の通り、Ｋｉ−６７及びＣＲＣ転帰に関する他の試験では、一貫性のない知見が報告されている。しかし、最大の症例数を伴う３つの他のＣＲＣ試験では、低いＫｉ−６７ ＰＩが不良予後に関連した（２７）、（２９）、（３０）。本発明者らは、ＧＰＳを適用して同じ結論に達したが、しかし、ずっと小さな症例数に基づいていた。複数遺伝子発現解析は、従って、Ｋｉ−６７ ＰＩよりも、増殖と予後の間の関係を判定するためのより高感度なツールであった。
【０１８４】
低ＧＰＳを伴う腫瘍における好ましくない予後の背後にある生物学的根拠は、さらなる研究を含みうる。低ＧＰＳ腫瘍における不良臨床転帰に潜在的に寄与しうる機構は、以下を含む：（ｉ）迅速に増殖する腫瘍へのより効果的な免疫応答；（ｉｉ）癌細胞をアポトーシスに対してより抵抗性にし、侵襲性を増加させうるが、しかし、また、円滑な複製機構を乱すより高レベルの遺伝子損傷；（ｉｉｉ）徐々に分裂し、正常幹細胞と類似であるが、しかし、高い転移能を有する癌幹細胞数の増加；及び（ｉｖ）高い増殖速度を有するが、しかし、比較的良好な予後を有する高い割合のマイクロサテライト不安定腫瘍。
【０１８５】
要約すると、本発明は、結腸直腸癌における細胞増殖の予後診断的な役割に関連する先の矛盾する結果を明らかにしている。ＧＰＳはＣＲＣ細胞株を使用して開発されており、２つの独立した患者コホートに適用されてきた。ＣＲＣにおける成長関連遺伝子の低発現は、より進行性の腫瘍病期（コホートＡ）及び同じ病期内の不良臨床転帰（コホートＢ）と関連することが見出された。複数遺伝子発現解析は、転帰を予測するための、長期確立された増殖マーカーＫｉ−６７よりもより強力な指標として示された。今後の試験のために、ＣＲＣが、他の通常の上皮癌、例えば乳癌及び肺癌（例、Ｋｉ−６７を参照のこと）とは異なるという根拠を決定することが有用でありうる。これは、重要な基礎をなす生物学的機構への洞察を提供する可能性が高い。実際的観点から、所定の病理学的段階内での再発リスクを層別化する能力によって、アジュバント療法をより正確に標的とすることが可能になりうる。このように、ＧＰＳ発現を、結腸直腸癌からの再発及び死亡の高リスクにある患者を特定するための従来の病期分類への補助として使用できる。
【０１８６】
上の明細書中で言及する全ての刊行物及び特許は、本明細書において参照により組み入れられる。
【０１８７】
先の記載において、公知の等価物を有する整数又は成分を参照し、そのような等価物は本明細書において個々に示されるかのように組み入れられる。
【０１８８】
本発明は、実施例により、及び、その可能な実施態様を参照し、記載されているが、その範囲又は精神から逸脱することなく改善及び／又は改変してよいことを理解すべきである。
【０１８９】
【表８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される１つ又は複数の遺伝子を含む、患者において胃腸癌の進行を判断するための予後徴候。
【請求項２】
徴候が、ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７のいずれかから選択される１つ又は複数の遺伝子を含む、請求項１記載の徴候。
【請求項３】
胃腸癌の再発を伴わない胃腸癌患者の長期生存の可能性を予測する方法であって、患者から得られた胃腸サンプル中で１つ又は複数の予後診断用ＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物の発現レベル、ここで、胃腸癌組織サンプル中での全てのＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物、又はＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、を決定すること；ここで予後診断用ＲＮＡ転写物は、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される１つ又は複数の遺伝子の転写物であり；及び
胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性を確立すること
を含む方法。
【請求項４】
少なくとも１つの予後診断用ＲＮＡ転写物又はその発現産物が、ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７のいずれか１つから選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、又は少なくとも１５の予後診断用ＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む、請求項３又は請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１つ又は複数の予後診断用ＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物の発現増加が、胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性増加を示す、請求項３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
予測モデルを適用し、予測方法を再発性腫瘍サンプル及び非再発性腫瘍サンプル中での予測徴候の発現レベルに適用することで確立し、胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性を確立する、請求項３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
予測方法が、線形モデル、サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、分類ツリー及び回帰ツリー、アンサンブル学習法、判別分析、最短距離法、ベイジアン・ネットワーク、独立成分分析からなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
胃腸癌が胃癌又は結腸直腸癌である、請求項３〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
１つ又は複数の予後診断用ＲＮＡ転写物の発現レベルが決定される、請求項３〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
ＲＮＡを患者の固定ワックス包埋胃腸癌組織標本から単離する、請求項３〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡをコア生検組織又は細針吸引細胞から単離する、請求項３〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される２つ又はそれ以上の遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイ。
【請求項１４】
遺伝子：ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７の２つ又はそれ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項１３記載のアレイ。
【請求項１５】
少なくとも３つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、又は少なくとも１５の遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項１３又は請求項１４に記載のアレイ。
【請求項１６】
遺伝子：ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項１３記載のアレイ。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項１３〜１６のいずれか一項記載のアレイ。
【請求項１８】
ｃＤＮＡが約５００〜５０００塩基長である、請求項１７記載のアレイ。
【請求項１９】
ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドである、請求項１３〜１６のいずれか一項記載のアレイ。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドが約２０〜８０塩基長である、請求項１９記載のアレイ。
【請求項２１】
固体表面がガラスである、請求項１３〜２０のいずれか一項記載のアレイ。
【請求項２２】
胃腸癌の再発を伴わない、胃腸癌と診断された患者の長期生存の可能性を予測する方法であって：
（１）患者から得られた胃腸癌組織サンプル中で、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される遺伝子のＲＮＡ転写物又は発現産物の発現レベル、ここで、胃腸癌組織サンプル中での全てのＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物、又はＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、を決定すること；
（２）工程（１）で得られたデータを統計分析にかけること；及び
（３）長期生存の可能性が増加又は減少しているかを決定すること；
の工程、
及び胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性を確立すること
を含む方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの予後診断用ＲＮＡ転写物又はその発現産物が、ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７のいずれか１つから選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
統計分析を、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを使用することにより実施する、請求項２２又は請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
癌患者についての個別化されたゲノミクスプロファイルを作成する方法であって：（ａ）患者から得られた胃腸組織から抽出されたＲＮＡを遺伝子発現解析にかけること；（ｂ）表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄのいずれか１つに列挙する胃腸癌遺伝子セットから選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベル、ここで、発現レベルは対照遺伝子に対して正規化され、場合により胃腸癌参照組織セットで見出される量と比較される、を決定すること；及び（ｃ）遺伝子発現解析により得られたデータをまとめる報告を作成すること、の工程を含む方法。
【請求項２５】
胃腸組織が胃腸癌細胞を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
胃腸組織が固定パラフィン包埋生検サンプルから得られる、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
ＲＮＡが断片化されている、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
報告が患者の長期生存の可能性の予測を含む、請求項２２〜２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
報告が患者の処置法のための推奨事項を含む、請求項２２〜２９のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）患者から得られた胃腸癌細胞を含むサンプルを、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄのいずれか１つから選択される少なくとも１つの遺伝子のＲＮＡ転写物、又はその産物のレベルの定量的分析にかけること；及び（ｂ）遺伝子、又はそれらの産物の正規化された発現レベルが、定めた発現閾値を上回る場合、胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加を有する可能性が高い患者を特定すること
を含む予後診断方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの予後診断用ＲＮＡ転写物又はその発現産物が、ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７のいずれか１つから選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルが、２つ又はそれ以上のハウスキーピング遺伝子のＲＮＡ転写物又は産物の平均レベルに対して正規化される、請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ハウスキーピング遺伝子が、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、Ｃｙｐｌ、アルブミン、アクチン、チューブリン、シクロフィリンヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＲＰＴ）、Ｌ３２、２８Ｓ、及び１８５からなる群より選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
サンプルを、検出限界を上回り存在する全ての遺伝子の包括的遺伝子発現解析にかける、請求項３０〜３３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルが、アッセイされた全ての遺伝子又はそのサブセットのＲＮＡ転写物又は産物の平均シグナルに対して正規化される、請求項３０〜３４のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
ＲＮＡ転写物のレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定し、そしてシグナルがＣｔ値である、請求項３０〜３５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
アッセイされた遺伝子が少なくとも５０又は少なくとも１００の癌関連遺伝子を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
患者がヒトである、請求項３０〜３７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
サンプルが固定パラフィン包埋組織（ＦＰＥＴ）サンプル、又は新鮮もしくは凍結組織サンプルである、請求項３０〜３８のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
サンプルが、細針、コア、又は他のタイプの生検からの組織サンプルである、請求項３０〜３８のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
定量分析が定量的ＲＴ−ＰＣＲにより実施される、請求項３０〜４０のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
定量分析が遺伝子の産物を定量することにより実施される、請求項３０〜４０のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
産物が免疫組織化学により又はプロテオミクス技術により定量される、請求項３０〜４０のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
患者が、胃腸癌の再発を伴わず、長期生存の可能性増加を有することを示す報告を作成する工程をさらに含む、請求項３０〜４３のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
請求項３、２５、及び３０のいずれか一項記載の方法の実施に適する、（１）抽出緩衝液／試薬及びプロトコール；（２）逆転写緩衝液／試薬及びプロトコール；ならびに（３）定量的ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液／試薬及びプロトコールの１つ又は複数を含むキット。
【請求項１】
表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される１つ又は複数の遺伝子を含む、患者において胃腸癌の進行を判断するための予後徴候。
【請求項２】
徴候が、ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７のいずれかから選択される１つ又は複数の遺伝子を含む、請求項１記載の徴候。
【請求項３】
胃腸癌の再発を伴わない胃腸癌患者の長期生存の可能性を予測する方法であって、患者から得られた胃腸サンプル中で１つ又は複数の予後診断用ＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物の発現レベル、ここで、胃腸癌組織サンプル中での全てのＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物、又はＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、を決定すること；ここで予後診断用ＲＮＡ転写物は、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される１つ又は複数の遺伝子の転写物であり；及び
胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性を確立すること
を含む方法。
【請求項４】
少なくとも１つの予後診断用ＲＮＡ転写物又はその発現産物が、ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７のいずれか１つから選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、又は少なくとも１５の予後診断用ＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物の発現レベルを決定することを含む、請求項３又は請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１つ又は複数の予後診断用ＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物の発現増加が、胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性増加を示す、請求項３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
予測モデルを適用し、予測方法を再発性腫瘍サンプル及び非再発性腫瘍サンプル中での予測徴候の発現レベルに適用することで確立し、胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性を確立する、請求項３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
予測方法が、線形モデル、サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、分類ツリー及び回帰ツリー、アンサンブル学習法、判別分析、最短距離法、ベイジアン・ネットワーク、独立成分分析からなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
胃腸癌が胃癌又は結腸直腸癌である、請求項３〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
１つ又は複数の予後診断用ＲＮＡ転写物の発現レベルが決定される、請求項３〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
ＲＮＡを患者の固定ワックス包埋胃腸癌組織標本から単離する、請求項３〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡをコア生検組織又は細針吸引細胞から単離する、請求項３〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される２つ又はそれ以上の遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイ。
【請求項１４】
遺伝子：ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７の２つ又はそれ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項１３記載のアレイ。
【請求項１５】
少なくとも３つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、又は少なくとも１５の遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項１３又は請求項１４に記載のアレイ。
【請求項１６】
遺伝子：ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、請求項１３記載のアレイ。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項１３〜１６のいずれか一項記載のアレイ。
【請求項１８】
ｃＤＮＡが約５００〜５０００塩基長である、請求項１７記載のアレイ。
【請求項１９】
ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドである、請求項１３〜１６のいずれか一項記載のアレイ。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドが約２０〜８０塩基長である、請求項１９記載のアレイ。
【請求項２１】
固体表面がガラスである、請求項１３〜２０のいずれか一項記載のアレイ。
【請求項２２】
胃腸癌の再発を伴わない、胃腸癌と診断された患者の長期生存の可能性を予測する方法であって：
（１）患者から得られた胃腸癌組織サンプル中で、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄから選択される遺伝子のＲＮＡ転写物又は発現産物の発現レベル、ここで、胃腸癌組織サンプル中での全てのＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物、又はＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の参照セットの発現レベルに対して正規化されている、を決定すること；
（２）工程（１）で得られたデータを統計分析にかけること；及び
（３）長期生存の可能性が増加又は減少しているかを決定すること；
の工程、
及び胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性を確立すること
を含む方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの予後診断用ＲＮＡ転写物又はその発現産物が、ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７のいずれか１つから選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
統計分析を、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを使用することにより実施する、請求項２２又は請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
癌患者についての個別化されたゲノミクスプロファイルを作成する方法であって：（ａ）患者から得られた胃腸組織から抽出されたＲＮＡを遺伝子発現解析にかけること；（ｂ）表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄのいずれか１つに列挙する胃腸癌遺伝子セットから選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベル、ここで、発現レベルは対照遺伝子に対して正規化され、場合により胃腸癌参照組織セットで見出される量と比較される、を決定すること；及び（ｃ）遺伝子発現解析により得られたデータをまとめる報告を作成すること、の工程を含む方法。
【請求項２５】
胃腸組織が胃腸癌細胞を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
胃腸組織が固定パラフィン包埋生検サンプルから得られる、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
ＲＮＡが断片化されている、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
報告が患者の長期生存の可能性の予測を含む、請求項２２〜２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
報告が患者の処置法のための推奨事項を含む、請求項２２〜２９のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）患者から得られた胃腸癌細胞を含むサンプルを、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、又は表Ｄのいずれか１つから選択される少なくとも１つの遺伝子のＲＮＡ転写物、又はその産物のレベルの定量的分析にかけること；及び（ｂ）遺伝子、又はそれらの産物の正規化された発現レベルが、定めた発現閾値を上回る場合、胃腸癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加を有する可能性が高い患者を特定すること
を含む予後診断方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの予後診断用ＲＮＡ転写物又はその発現産物が、ＣＤＣ２、ＭＣＭ６、ＲＰＡ３、ＭＣＭ７、ＰＣＮＡ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＰＮＡ２、ＡＮＬＮ、ＡＰＧ７Ｌ、ＴＯＰＫ、ＧＭＮＮ、ＲＲＭ１、ＣＤＣ４５Ｌ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＲＡＮ、ＤＵＴ、ＲＲＭ２、ＣＤＫ７、ＭＬＨ３、ＳＭＣ４Ｌ１、ＣＳＰＧ６、ＰＯＬＤ２、ＰＯＬＥ２、ＢＣＣＩＰ、Ｐｆｓ２、ＴＲＥＸ１、ＢＵＢ３、ＦＥＮ１、ＤＲＦ１、ＰＲＥＩ３、ＣＣＮＥ１、ＲＰＡ１、ＰＯＬＥ３、ＲＦＣ４、ＭＣＭ３、ＣＨＥＫ１、ＣＣＮＤ１、及びＣＤＣ３７のいずれか１つから選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルが、２つ又はそれ以上のハウスキーピング遺伝子のＲＮＡ転写物又は産物の平均レベルに対して正規化される、請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ハウスキーピング遺伝子が、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、Ｃｙｐｌ、アルブミン、アクチン、チューブリン、シクロフィリンヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＲＰＴ）、Ｌ３２、２８Ｓ、及び１８５からなる群より選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
サンプルを、検出限界を上回り存在する全ての遺伝子の包括的遺伝子発現解析にかける、請求項３０〜３３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルが、アッセイされた全ての遺伝子又はそのサブセットのＲＮＡ転写物又は産物の平均シグナルに対して正規化される、請求項３０〜３４のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
ＲＮＡ転写物のレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定し、そしてシグナルがＣｔ値である、請求項３０〜３５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
アッセイされた遺伝子が少なくとも５０又は少なくとも１００の癌関連遺伝子を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
患者がヒトである、請求項３０〜３７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
サンプルが固定パラフィン包埋組織（ＦＰＥＴ）サンプル、又は新鮮もしくは凍結組織サンプルである、請求項３０〜３８のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
サンプルが、細針、コア、又は他のタイプの生検からの組織サンプルである、請求項３０〜３８のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
定量分析が定量的ＲＴ−ＰＣＲにより実施される、請求項３０〜４０のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
定量分析が遺伝子の産物を定量することにより実施される、請求項３０〜４０のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
産物が免疫組織化学により又はプロテオミクス技術により定量される、請求項３０〜４０のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
患者が、胃腸癌の再発を伴わず、長期生存の可能性増加を有することを示す報告を作成する工程をさらに含む、請求項３０〜４３のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
請求項３、２５、及び３０のいずれか一項記載の方法の実施に適する、（１）抽出緩衝液／試薬及びプロトコール；（２）逆転写緩衝液／試薬及びプロトコール；ならびに（３）定量的ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液／試薬及びプロトコールの１つ又は複数を含むキット。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【公表番号】特表２０１０−５３９９７３（Ｐ２０１０−５３９９７３Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２７９０１（Ｐ２０１０−５２７９０１）
【出願日】平成２０年１０月６日（２００８．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００８／０００２６０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４５１１５
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５０４３５０１２０）パシフィック エッジ バイオテクノロジー リミティド (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月６日（２００８．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００８／０００２６０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４５１１５
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５０４３５０１２０）パシフィック エッジ バイオテクノロジー リミティド (9)
【Ｆターム（参考）】
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