胎児異数性の非侵襲性出生前診断の方法および組成物
本発明は、胎児異数性の非侵襲性出生前診断の方法および組成物を提供する。特異的メチル化領域（ＤＭＲ）の大きなパネルが同定された。一定のこれらＤＭＲは、成人女性の血液ＤＮＡにおいては低メチル化され、胎児ＤＮＡにおいては高メチル化されているが、その他は、成人女性の血液ＤＮＡにおいては高メチル化され、胎児ＤＮＡにおいては低メチル化されている。さらに、成人女性ＤＮＡにおいて低メチル化され、胎児ＤＮＡにおいて高メチル化されているＤＭＲは、妊娠中の母体血液試料に存在する胎児ＤＮＡの胎児異数性を正確に予測した。本発明の方法において、高メチル化ＤＮＡは、好ましくはメチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）により、低メチル化ＤＮＡから物理的に分離される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
母体血液の試料を使用した胎児異数性の出生前診断の方法であって、
ａ）高メチル化ＤＮＡ試料を得るために、母体の血液試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡと物理的に分離する工程；
ｂ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を得るために、高メチル化ＤＮＡ試料において、複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルを決定する工程；
ｃ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を前記複数のＤＭＲの標準参照高メチル化値と比較する工程；および
ｄ）前記比較に基づき、胎児異数性を診断する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
母体血液試料が母体の末梢血試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高メチル化ＤＮＡが、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）により低メチル化ＤＮＡから物理的に分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
高メチル化ＤＮＡが低メチル化ＤＮＡから物理的に分離された後、該高メチル化ＤＮＡが増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
高メチル化ＤＮＡがライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）により増幅される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
複数のＤＭＲが、添付Ａ〜Ｅに示されたリストから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
複数のＤＭＲレベルが、少なくとも３個のＤＭＲに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
複数のＤＭＲレベルが、少なくとも５個のＤＭＲに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
複数のＤＭＲレベルが、少なくとも８個のＤＭＲに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
複数のＤＭＲレベルが、少なくとも１０個のＤＭＲに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
複数のＤＭＲが、添付Ａ〜Ｅに示されるリストから選択される、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
高メチル化ＤＮＡ試料における複数のＤＭＲレベルが、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＱＰＣＲ）により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＬＭ−ＰＣＲ効率のコントロールとして、複数のＤＭＲのレベルが未処理の母体血液ＤＮＡ試料全体においても決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を正常な母体血液ＤＮＡ試料の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値が正常な母体血液ＤＮＡ試料の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ、胎児異数性の診断が下される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
２１トリソミー診断のための複数のＤＭＲが２１番染色体上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される３個またはそれ以上の領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される８個またはそれ以上の領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）および塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）のヌクレオチド配列を有する８個の領域から成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
複数のＤＭＲが、１３番染色体、１８番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体から成る群から選択された染色体上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
母体の末梢血試料を使用した２１トリソミーの出生前診断の方法であって、
ａ）高メチル化ＤＮＡ試料を得るために、母体末梢血の試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡと物理的に分離する工程；
ｂ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を得るために、高メチル化ＤＮＡ試料において、２１番染色体上の複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）レベルを決定する工程であって、
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される８個またはそれ以上の領域を含み、および
複数のＤＭＲレベルがリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＱＰＣＲ）により決定される、工程；
ｃ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を２１番染色体上の前記複数のＤＭＲの標準正常参照高メチル化値と比較する工程；ならびに
ｄ）前記比較に基づき２１トリソミーを診断する工程
を含む、前記方法。
【請求項２１】
高メチル化ＤＮＡが、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）により低メチル化ＤＮＡから物理的に分離される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
高メチル化ＤＮＡが低メチル化ＤＮＡから物理的に分離された後、高メチル化ＤＮＡが増幅される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
高メチル化ＤＮＡがライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）により増幅される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＬＭ−ＰＣＲ効率のコントロールとして、複数のＤＭＲレベルが未処理の母体血液ＤＮＡ試料全体においても決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を正常な母体血液ＤＮＡ試料の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値が、正常な母体血液ＤＮＡ試料の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ２１トリソミーの診断が下される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、および塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）のヌクレオチド配列を有する８個の領域から成る、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
胎児異数性の診断に利用するのに適し、関心対象の染色体上にある特異的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定する方法であって、
ａ）以下：
（ｉ）正常の成人女性の末梢血ＤＮＡ試料（ＰＢ試料）；および
（ｉｉ）正常な胎盤ＤＮＡ試料（ＰＬ試料）
を提供する工程；
ｂ）以下：
（ｉ）分離されたＰＢ試料；および
（ｉｉｉ）分離されたＰＬ試料
を得るために、ａ）の各試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する工程；
ｃ）ｂ）の分離された各試料において、関心対象の染色体上の複数の領域のレベルを決定する工程；および
ｄ）分離されたＰＢ試料では低メチル化され、かつ分離されたＰＬ試料では高メチル化されている領域を選択する工程であって、それによって関心対象の染色体上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定する、工程
を含む、前記方法。
【請求項２８】
ＰＬ試料が二つの異なる試料、すなわち、第１トリメスターＰＬ試料および第３トリメスターＰＬ試料を含み、前記工程ｄ）が、第１トリメスターの分離ＰＬ試料および第３トリメスターの分離ＰＬ試料の中で同じメチル化度を有する領域を選択する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
関心対象の染色体が２１番染色体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
関心対象の染色体が、１３番染色体、１８番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体から成る群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
異数性がトリソミーまたはモノソミーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
以下を含む２１トリソミーの出生前診断キット：
ａ）２１番染色体上の複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルを決定するための、１種または複数種の核酸組成物；および
ｂ）２１トリソミーの出生前診断のための核酸組成物の利用ガイド。
【請求項３３】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、添付Ａ〜Ｅに示されたリストから選択される、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される３個またはそれ以上の領域を含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
染色体２１上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される８個またはそれ以上の領域を含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３６】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３）、および塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）のヌクレオチド配列を有する８個の領域から成る、請求項３２に記載のキット。
【請求項３７】
核酸組成物が、
、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１種または複数種のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３８】
血液試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する手段をさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３９】
高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する手段が、メチル化ＤＮＡを免疫沈降させる抗体を含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
高メチル化ＤＮＡを増幅する手段をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
高メチル化ＤＮＡを増幅する手段が、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）を行うためのオリゴヌクレオチドリンカーまたはオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１種または複数種の単離オリゴヌクレオチドプライマーを含む、核酸組成物。
【請求項１】
母体血液の試料を使用した胎児異数性の出生前診断の方法であって、
ａ）高メチル化ＤＮＡ試料を得るために、母体の血液試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡと物理的に分離する工程；
ｂ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を得るために、高メチル化ＤＮＡ試料において、複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルを決定する工程；
ｃ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を前記複数のＤＭＲの標準参照高メチル化値と比較する工程；および
ｄ）前記比較に基づき、胎児異数性を診断する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
母体血液試料が母体の末梢血試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高メチル化ＤＮＡが、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）により低メチル化ＤＮＡから物理的に分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
高メチル化ＤＮＡが低メチル化ＤＮＡから物理的に分離された後、該高メチル化ＤＮＡが増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
高メチル化ＤＮＡがライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）により増幅される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
複数のＤＭＲが、添付Ａ〜Ｅに示されたリストから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
複数のＤＭＲレベルが、少なくとも３個のＤＭＲに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
複数のＤＭＲレベルが、少なくとも５個のＤＭＲに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
複数のＤＭＲレベルが、少なくとも８個のＤＭＲに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
複数のＤＭＲレベルが、少なくとも１０個のＤＭＲに関して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
複数のＤＭＲが、添付Ａ〜Ｅに示されるリストから選択される、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
高メチル化ＤＮＡ試料における複数のＤＭＲレベルが、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＱＰＣＲ）により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＬＭ−ＰＣＲ効率のコントロールとして、複数のＤＭＲのレベルが未処理の母体血液ＤＮＡ試料全体においても決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を正常な母体血液ＤＮＡ試料の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値が正常な母体血液ＤＮＡ試料の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ、胎児異数性の診断が下される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
２１トリソミー診断のための複数のＤＭＲが２１番染色体上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される３個またはそれ以上の領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される８個またはそれ以上の領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）および塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）のヌクレオチド配列を有する８個の領域から成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
複数のＤＭＲが、１３番染色体、１８番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体から成る群から選択された染色体上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
母体の末梢血試料を使用した２１トリソミーの出生前診断の方法であって、
ａ）高メチル化ＤＮＡ試料を得るために、母体末梢血の試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡと物理的に分離する工程；
ｂ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を得るために、高メチル化ＤＮＡ試料において、２１番染色体上の複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）レベルを決定する工程であって、
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される８個またはそれ以上の領域を含み、および
複数のＤＭＲレベルがリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＱＰＣＲ）により決定される、工程；
ｃ）高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を２１番染色体上の前記複数のＤＭＲの標準正常参照高メチル化値と比較する工程；ならびに
ｄ）前記比較に基づき２１トリソミーを診断する工程
を含む、前記方法。
【請求項２１】
高メチル化ＤＮＡが、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤｉＰ）により低メチル化ＤＮＡから物理的に分離される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
高メチル化ＤＮＡが低メチル化ＤＮＡから物理的に分離された後、高メチル化ＤＮＡが増幅される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
高メチル化ＤＮＡがライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）により増幅される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＬＭ−ＰＣＲ効率のコントロールとして、複数のＤＭＲレベルが未処理の母体血液ＤＮＡ試料全体においても決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値を正常な母体血液ＤＮＡ試料の標準正常参照高メチル化値と比較し、高メチル化ＤＮＡ試料の高メチル化値が、正常な母体血液ＤＮＡ試料の標準正常参照高メチル化値よりも高ければ２１トリソミーの診断が下される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、および塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）のヌクレオチド配列を有する８個の領域から成る、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
胎児異数性の診断に利用するのに適し、関心対象の染色体上にある特異的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定する方法であって、
ａ）以下：
（ｉ）正常の成人女性の末梢血ＤＮＡ試料（ＰＢ試料）；および
（ｉｉ）正常な胎盤ＤＮＡ試料（ＰＬ試料）
を提供する工程；
ｂ）以下：
（ｉ）分離されたＰＢ試料；および
（ｉｉｉ）分離されたＰＬ試料
を得るために、ａ）の各試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する工程；
ｃ）ｂ）の分離された各試料において、関心対象の染色体上の複数の領域のレベルを決定する工程；および
ｄ）分離されたＰＢ試料では低メチル化され、かつ分離されたＰＬ試料では高メチル化されている領域を選択する工程であって、それによって関心対象の染色体上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定する、工程
を含む、前記方法。
【請求項２８】
ＰＬ試料が二つの異なる試料、すなわち、第１トリメスターＰＬ試料および第３トリメスターＰＬ試料を含み、前記工程ｄ）が、第１トリメスターの分離ＰＬ試料および第３トリメスターの分離ＰＬ試料の中で同じメチル化度を有する領域を選択する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
関心対象の染色体が２１番染色体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
関心対象の染色体が、１３番染色体、１８番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体から成る群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
異数性がトリソミーまたはモノソミーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
以下を含む２１トリソミーの出生前診断キット：
ａ）２１番染色体上の複数の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）のレベルを決定するための、１種または複数種の核酸組成物；および
ｂ）２１トリソミーの出生前診断のための核酸組成物の利用ガイド。
【請求項３３】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、添付Ａ〜Ｅに示されたリストから選択される、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される３個またはそれ以上の領域を含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
染色体２１上の複数のＤＭＲが、塩基対３９２７９８５６−３９２８０００４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、塩基対４４１６１１７８−４４１６１３２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、塩基対４４１６１２３９−４４１６１３７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対２９１３６７３５−２９１３６８４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される８個またはそれ以上の領域を含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３６】
２１番染色体上の複数のＤＭＲが、塩基対３３３２０７３５−３３３２０８２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、塩基対４２１８９５５７−４２１８９６８３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、塩基対４２３５５７１２−４２３５５８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、塩基対４２３５７２１５−４２３５７３４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、塩基対２２４０３６４９−２２４０３７９２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、塩基対３２２６８８４３−３２２６８９４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、塩基対４４０７９２３５−４４０７９３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３）、および塩基対３７８４１２８４−３７８４１４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）のヌクレオチド配列を有する８個の領域から成る、請求項３２に記載のキット。
【請求項３７】
核酸組成物が、
、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１種または複数種のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３８】
血液試料において、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡを化学的に変性させることなく、または酵素的に消化させることなく、高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する手段をさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３９】
高メチル化ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡから物理的に分離する手段が、メチル化ＤＮＡを免疫沈降させる抗体を含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
高メチル化ＤＮＡを増幅する手段をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
高メチル化ＤＮＡを増幅する手段が、ライゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭ−ＰＣＲ）を行うためのオリゴヌクレオチドリンカーまたはオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１種または複数種の単離オリゴヌクレオチドプライマーを含む、核酸組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１３−５１７７８９（Ｐ２０１３−５１７７８９Ａ）
【公表日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５０５２９（Ｐ２０１２−５５０５２９）
【出願日】平成２３年１月２６日（２０１１．１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０００２１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９２５９２
【国際公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【出願人】（５１２１９４３６３）ニプド ジェネティクス リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２６日（２０１１．１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０００２１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９２５９２
【国際公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【出願人】（５１２１９４３６３）ニプド ジェネティクス リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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