胎盤絨毛膜板膜に由来する間葉系幹細胞を高純度で単離する方法
本発明は、（ａ）剥離した胎盤から絨毛膜板膜を採取する工程と、（ｂ）工程（ａ）で得られた絨毛膜板膜に存在する細胞をスクレイピングによって採取する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞にトリプシン及びエチレンジアミンテトラアセテートを含有する溶液を加えて酵素反応を行い、ウシ胎児血清を加えて酵素反応を停止させる工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた反応液を遠心分離し、得られた細胞をウシ胎児血清及び抗生物質を含有する培地中で培養する工程とを含む胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞の単離方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎盤絨毛膜板膜（placental chorionic plate membrane）由来の間葉系幹細胞を高純度で単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、自己複製能を有し、多様な系統（lineages）に分化できる多能性（multipotent）幹細胞である。間葉系幹細胞はまた、間葉系前駆細胞（mesenchymal progenitor cells）とも呼ばれる。間葉系幹細胞は、条件によって、骨、脂肪、軟骨、神経、筋肉及び骨髄間質細胞などに分化し、多様な治療学的効能を有する。間葉系幹細胞は、成体幹細胞の一種であり、骨髄から造血幹細胞と共に分離されうる。培養皿中に浮遊する造血幹細胞とは異なり、間葉系幹細胞は、培養皿に付着する。間葉系幹細胞は、多様な実験及び／または臨床に使われてきた。しかし、骨髄由来の間葉系幹細胞の分化能は、供与者（donor）の年齢の増加に伴って低下し、また単離される間葉系幹細胞の数は、供与者の状態によって大きく異なる。また、骨髄由来の間葉系幹細胞の採取及び単離の過程で、供与者は、苦痛を受けることがある。従って、間葉系幹細胞の新しい単離方法を開発する必要性が高まっている。
【０００３】
一方、現在胎盤は、出産後に一般的に廃棄される。しかし、胎盤の部位別に、間葉系幹細胞、脱落膜（decidua）細胞、栄養膜（trophoblast）細胞、羊膜（amnion）細胞、上皮細胞（endothelial cells）などの多様な細胞が存在することが明らかになっている。TsujiらのグループとKanhaiらのグループは、胎盤由来の細胞が、間葉系幹細胞や間葉系前駆細胞である可能性が高いと報告し（非特許文献１、非特許文献２）、Surbekらのグループは、神経再生を目的とした胎盤由来の間葉系幹細胞の自家免疫移植の可能性を提示している（非特許文献３）。Takahashiらのグループは、ヒト胎盤由来の間葉系幹細胞の軟骨再生能（potential）について報告している（非特許文献４）。
【０００４】
幹細胞の研究及び活用における共通した制約、すなわち、倫理的問題、単離される細胞数の制限、及び限られた単一組織から単離できる幹細胞の種類などを考慮すると、胎盤由来の幹細胞の単離方法を確立することは、非常に重要である。胎盤由来の多様な幹細胞の活用可能性が、前記の通り報告されているが、胎盤内に存在するさまざまな異なる細胞との混合物から、間葉系幹細胞を高純度で単離することが困難であるという問題がある。
【０００５】
Zhangらは、胎盤からの間葉系前駆細胞の単離方法、及び単離された間葉系前駆細胞の特性について開示している（非特許文献５）。前記方法によれば、胎盤から羊膜嚢（amniotic sac）及び脱落膜を除去した後、リン酸緩衝液で胎盤を洗浄し、灌流液及び培養液（ヘパリン１２．５Ｕ／ｍｌ、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン５０ｍｇ／ｍｌを含むイスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's modified Dulbecco medium））を動脈・静脈循環（arterial-vein circuit）を介して流し、組織から残留血液を除去する。前記組織を、前記培養液中に１２時間ないし２４時間浸し、フィコール（Ficoll）密度勾配を利用して単核細胞を得て、これをウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培地中に再懸濁して間葉系前駆細胞を得る。前記方法は、実験室規模で行われるものの、フィコール密度勾配分離を含んだ複雑な過程を必要とする。さらに、長時間胎盤自体で間葉系幹細胞を培養するので、胎盤内に存在する単核細胞の混在を招くことがある。また、健康な間葉系幹細胞を安定した状態で大量に単離／精製することが困難であるため、間葉系幹細胞を臨床的に適用することが困難になっている。また、羊膜嚢及び脱落膜が除去された胎盤を使用するために、間葉系前駆細胞が胎盤絨毛（placental villi）由来の他の細胞と混ざることがあり、間葉系前駆細胞の純度が低くなる可能性がある。
【０００６】
最近S．J．Kimらは、胎盤の絨毛膜板膜から間葉系幹細胞を単離し、これを胚芽幹細胞から形成された胚状体と共培養することによって、胚芽幹細胞の造血分化（hematopoietic differentiation）を促進させる方法を開示している（非特許文献６）。前記方法によれば、胎盤から絨毛膜板膜を採取し、酵素処理によって絨毛膜板膜から細胞を分離した後、前記細胞を２０％ＦＢＳ及び抗生物質を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）中で培養することによって、絨毛膜板膜から間葉系幹細胞の単離を行う。前記方法は、比較的簡単に間葉系幹細胞を単離／精製できるが、絨毛膜板膜表面全体の酵素処理によって、間葉系幹細胞だけではなく、絨毛膜板膜に接着している羊膜（amnion）細胞も共に分離され、細胞純度が低下する。従って、間葉系幹細胞を何回か継代培養すると、羊膜由来の細胞が混在する。このような羊膜細胞は、間葉系幹細胞より速く増殖するため、間葉系幹細胞の純粋培養が困難になる。また、間葉系幹細胞は、酵素反応の影響を受けやすい。３７℃で酵素処理を行うと、間葉系幹細胞の膜が容易に破損して、細胞の生存率に悪影響を及ぼすことになる。従って、胎盤絨毛膜板膜に由来する間葉系幹細胞の従来の単離方法は、他の細胞との混在という問題点を有している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tsujiら，Stem Cells ２００４；２２（５）：６４９−５８
【非特許文献２】Kanhaiら，Stem Cells ２００４；２２（７）：１３３８−１３４５
【非特許文献３】Surbecら，Am Ｊ Obstet Gynecol ２００６；１９４（３）：６６４−６７３
【非特許文献４】Takahashiら，Biochem Biophys Res Commun ２００６；３４０（３）：９４４−９５２
【非特許文献５】Zhangら，Experimental Hematology ３２（２００４）６５７−６６４
【非特許文献６】S．J．Kimら、Acta Haematol ２００６；１１６；２１９−２２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、幹細胞に関連した倫理性の問題を回避しつつ、胎盤から間葉系幹細胞を高純度で単離する方法を開発しようと研究を行ったところ、物理的なスクレイピング（scraping）方法を利用して胎盤の絨毛膜板膜から細胞を採取し、これを温和な条件で酵素処理し、かつ別途に酵素反応を停止させたとき、間葉系幹細胞を非常に高い純度及び生存率で単離できるということを発見した。
【０００９】
従って、本発明は、胎盤の絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞を高純度で単離する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様によって、（ａ）剥離した胎盤から絨毛膜板膜を採取する工程と、（ｂ）工程（ａ）で得られた絨毛膜板膜に存在する細胞をスクレイピングによって採取する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞にトリプシン及びエチレンジアミンテトラアセテートを含有する溶液を加えて酵素反応を行い、ウシ胎児血清を加えて酵素反応を停止させる工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた反応液を遠心分離し、得られた細胞をウシ胎児血清及び抗生物質を含有する培地中で培養する工程とを含む胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞の単離方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の単離方法によれば、物理的なスクレイピング方法によって胎盤絨毛膜板膜の内部部位から細胞を採取する。従って、絨毛膜板膜の内部部位に接着している他の細胞（羊膜細胞を含む）を除外でき、間葉系幹細胞の純度を上昇させることができる。また、酵素反応を温和な条件で行い、酵素反応停止を別途に行うことによって、細胞の生存率を大幅に高めることができる。従って、本発明の単離方法は、間葉系幹細胞の高純度単離及び大量増殖を可能にし、従って、多様な幹細胞治療、例えば、退行性疾患治療などの細胞治療に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の単離方法によって得られた胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞の形態を示す写真である。
【図２】本発明の単離方法によって得られた胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞の核型を示す写真である。
【図３】本発明の単離方法によって得られた胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞の細胞周期を示すグラフである。
【図４】本発明の単離方法によって得られた胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞に対するＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）分析結果を示す。
【図５】本発明の単離方法によって得られた胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞で発現する遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の単離方法によれば、物理的なスクレイピング方法によって胎盤絨毛膜板膜の内部部位から細胞を採取する。従って、絨毛膜板膜の内部部位に接着している他の細胞（羊膜細胞を含む）を除外でき、間葉系幹細胞の純度を上昇させることができる。また、酵素反応を温和な条件で行い、酵素反応停止を別途に行うことによって、細胞の生存率を大幅に高めることができる。従って、本発明の単離方法は、間葉系幹細胞の高純度単離及び大量増殖を可能にし、従って、多様な幹細胞治療、例えば、退行性疾患治療などの細胞治療に利用できる。
【００１４】
本発明の単離方法は、剥離した胎盤から絨毛膜板膜（chorionic plate membrane）を採取する工程［工程（ａ）］を含む。前記剥離した胎盤は、出産後に健康な産婦から分離されて廃棄される胎盤であってもよい。すなわち、前記「剥離した胎盤」とは、出産後に母体から分離された胎盤を意味する。前記剥離した胎盤は、氷浴（ice bath）下の滅菌された容器に速やかに保管することができる。前記剥離した胎盤からの絨毛膜板膜の採取は、一般的な解剖学的方法、例えば、胎盤の胎児面側を覆っている絨毛膜板膜を引き剥がすことによって行うことができる。このようにして得られた絨毛膜板膜を、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：phosphate buffered saline）で２回以上、望ましくは、５回ほど洗浄することによって、組織に存在する夾雑物を除去する。
【００１５】
本発明の単離方法は、前記絨毛膜板膜の内部部分をスクレイピング（scraping）することによって、細胞を採取する工程［工程（ｂ）］を含む。前記スクレイピングは、細胞を掻き取る道具、例えば、滅菌消毒されたスライドガラス（slide glass）、細胞培養用スクレイパー（scraper）などを使用して行うことができる。望ましくは、前記スクレイピングは、滅菌消毒されたスライドガラスを使用して絨毛膜板膜の母体面側を引っ掻くことによって、行うことができる。具体的には、羊膜細胞が下側になるように、絨毛膜板膜をガラス皿の上に広げ、絨毛膜板膜内部側に存在する細胞を滅菌消毒されたスライドガラスで物理的に剥がして採取できる。
【００１６】
採取した細胞を、直接酵素で処理してもよい。または、前記細胞を、適切な緩衝液で洗浄し、遠心分離して濃縮した後、酵素で処理してもよい。前記洗浄は、ＨＢＳＳ（Hank's balanced salt solution）などの緩衝液を使用して２，３回行うことができ、前記遠心分離は、１，０００ないし１，２００ｒｐｍで５ないし１０分間ほど、望ましくは、約１，０００ｒｐｍで約５分間行うことができる。
【００１７】
工程（ｃ）の酵素処理は、トリプシン（trypsin）及びエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）を含有する溶液を使用して行うことができる。前記トリプシン及びＥＤＴＡの濃度は、特に制限されない。例えば、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を使用することができる。また、工程（ｃ）は、酵素反応停止過程を含む。すなわち、本発明の単離方法において、前記酵素反応は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えて停止させることによって、酵素による細胞の損傷を最小化する。
【００１８】
本発明の単離方法において、前記酵素処理及び酵素反応停止過程を２回繰り返すことによって、間葉系幹細胞の収率を上昇させることができる。すなわち、前記酵素処理及び酵素反応停止は、１回または２回行うことができる。前記酵素処理及び酵素反応停止を１回行う場合、前記酵素処理は、約１時間かけて行うことができる。前記酵素処理及び酵素反応停止を２回行う場合、それぞれの酵素処理は約３０分間かけて行うことができる。
【００１９】
本発明の単離方法において、前記酵素処理は、３７℃で行われる一般的な酵素処理とは異なり、比較的低温、例えば、約２０〜３０℃、望ましくは、室温で徐々に行うことができる。このようにすることによって、細胞の損傷を大幅に減らすことができる。
【００２０】
本発明の単離方法は、工程（ｃ）で得られた溶液を遠心分離し、回収した細胞を間葉系幹細胞の培養培地、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を含有する培地中で培養する工程［工程（ｄ）］を含む。前記遠心分離は、約１，０００ｒｐｍで約５分間行うことができる。前記間葉系幹細胞の培養培地としては、比較的少量（例えば、５ないし１０％、望ましくは、約１０％）のＦＢＳを含有する培地、例えば、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌのヘパリン、及び２５ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子（ ＦＧＦ−４：fibroblast growth factor−４）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２が挙げられる。前記培養は、一般的な培養条件、例えば、３７℃、ＣＯ２培養器中で行うことができる。
以下、本発明について、実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明を制限するものではない。
【００２１】
実施例１．間葉系幹細胞の単離
医療、産科及び外科上の問題がなく、妊娠３７週以降で正常な胎児（奇形や多胎児でない）を分娩した健康な産婦から、事前に十分な説明に基づいた同意（informed consent）を得た後、前記産婦から正常胎盤を得て、迅速に氷浴（ice bath）下の滅菌された容器に保管した。胎盤の形態学的及び構造学的特徴を目視にて観察して記録した。胎盤の胎児面側を覆っている絨毛膜板膜を引き剥がし、抗生物質（１％のペニシリン−ストレプトマイシン）を含有するＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、細胞の採取中や移動中に組織で生じる夾雑物を除去した。
【００２２】
羊膜細胞が下側になるように、前記絨毛膜板膜を滅菌消毒された１５０ｍｍ径のガラス皿上に広げ、絨毛膜板膜の内部部位に存在する間葉系幹細胞層の細胞を、滅菌消毒されたスライドガラスで掻き取って回収した。回収した細胞を滅菌ＨＢＳＳ溶液で３回洗浄した後、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去した後、残った細胞に、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液１０ｍｌを加えた。この混合物を室温で３０分間ゆっくり撹拌しつつ、インキュベーションし、１ｍｌのＦＢＳを加えて酵素反応を停止させた。上層（一次酵素反応液）を分離し、５０ｍｌのコニカルチューブ（conical tube）に移した。残った細胞に、再び０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液１０ｍｌを添加し、この混合物を室温で３０分間ゆっくり撹拌しつつ、インキュベーションした。上層を分離し、一次酵素反応液と合わせた。２．５ｍｌのＦＢＳを、得られた酵素反応液に加えて酵素反応を停止させ、得られた溶液を１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を回収した。前記細胞を、培養液（１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌのヘパリン、及び２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−４を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）３ｍｌに加えた。これを十分に撹拌し、Ｔ２５フラスコに移し、３７℃、ＣＯ２培養器中で培養した。
２００６年９月４日に細胞の単離を始め、細胞の成長速度を考慮し、約５日ごとに１回継代して１０継代まで継代培養した。１０継代後に得られた細胞を「ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１」と命名した。
【００２３】
実施例２．形態学的特性の分析
実施例１で得られた細胞（ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１）を位相差（phase contrast）顕微鏡で観察した。その結果を図１に示す。ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１の形態（morphology）は、線維芽細胞（fibroblastoid）の形態を示している。Mycoplasma detection kit（iNtRON Biotechnology，Inc.）を使用したマイコプラズマ試験（mycoplasma test）で、前記細胞は、陰性であることがわかった。前記細胞をコルセミド（colcemid）（Invitrogen）及びＫＣｌ溶液（０．０７５Ｍ ＫＣｌ）で処理し、Trypsin−Giemsaで染色し、CytoVision（Applied Imaging社）を用いて、前記細胞の核型を分析した。その結果、前記細胞の核型は、４６ ＸＸであった（図２）。また、前記細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ：propidium iodide）で染色し、フローサイトメータ（flow cytometer）（ＦＡＣＳ、Beckman社）を用いて、前記細胞の細胞周期を測定した。その結果、前記細胞は、一般的な細胞周期より速い細胞周期を示した（図３参照）。
上記の結果は、実施例１で得られた細胞が、マイコプラズマ陰性で正常核型を有し、速い細胞分裂を示す、新規かつ安全で健康な細胞であることを示している。
【００２４】
実施例３．ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）分析
種々の抗体を用いて、実施例１で得られた細胞の表面に存在する特定抗原を分析するために、ＦＡＣＳ分析を行った。すなわち、細胞が８０％コンフルエントな状態に増殖した時点で、１ｍｌの細胞解離溶液（cell dissociation buffer、ＧＩＢＣＯ社）を前記細胞に加え、培養チューブから細胞を解離させた。前記細胞を、緑色または青色の蛍光物質で標識されたヒト特異的な抗体、すなわち抗ＣＤ１３、抗ＣＤ７１、抗ＣＤ１７８、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ９５、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ３１、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ５１、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗サイトケラチン７と共に、室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで３回洗浄した。フローサイトメータを用いてＦＡＣＳ分析を行った結果を図４に示す。
【００２５】
図４から分かるように、本発明の単離方法によって実施例１で単離された細胞は、ＣＤ１３陽性（≧９９．９８）、ＣＤ７１陽性（≧６８．９２）、ＣＤ１７８陰性（≦４５８）、ＣＤ４４陽性（≧９９．９８）、ＣＤ１０５陽性（≧３５．７５）、ＣＤ９０陽性（≧９９．４６）、ＣＤ９５陽性（≧９９．９８）、ＣＤ３４陰性（≦１．４８）、ＣＤ３１陰性（≦１．３４）、ＣＤ３３陰性（≦１．３７）、ＣＤ５６陽性（≧２０．０４）、ＣＤ５１陰性（≦８．７５）、ＨＬＡ−ＡＢＣ陽性（≧９９．５５）、ＨＬＡ−ＤＲ陰性（≦４１９）、及びサイトケラチン７陰性（≦２．８０）であると確認された。すなわち、実施例１で得られた細胞は、血管内皮細胞、血球細胞、栄養膜細胞ではなく、間葉系幹細胞に特異的な抗原を発現していた。このような結果は、本発明の単離方法によって実施例１で単離された細胞が間葉系幹細胞の特徴を有する細胞であることを示す。
【００２６】
実施例４．幹細胞関連遺伝子のＲＮＡ発現レベル分析
本発明の単離方法によって実施例１で得られた細胞で発現する遺伝子に対してＲＴ−ＰＣＲを行った。すなわち、実施例１で得られた細胞が、Ｔ２５フラスコで約８０％コンフルエントな状態に増殖した時点で、細胞を回収し、次の通りＲＴ−ＰＣＲを行った。すなわち、細胞をトリゾールで溶解（lysis）させ、全ＲＮＡを抽出した。逆転写酵素（reverse transcriptase）を使用し、前記全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡ特異的プライマー及びＴａｇ ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを行った。前記ＰＣＲ産物をアガロースゲルを用いて電気泳動し、増幅された遺伝子を確認した。前記プライマー配列、ＰＣＲ溶液の組成及びＰＣＲの条件は、下記表１ないし３にまとめた。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【表２】
【００２９】
【表３】
【００３０】
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図５に示す。図５から分かるように、幹細胞の自己複製に係わる遺伝子として知られているＮａｎｏｇ及びＳｏｘ２が、実施例１で単離された細胞で発現していた。神経外胚葉性マーカー（neuroectodermal marker）であるＮＦ６８遺伝子の発現も観察された。このような結果は、本発明の単離方法によって実施例１で単離された細胞が、自己複製が可能で、外胚葉中の神経細胞分化に関連した遺伝子を発現する多能性（multipotent）幹細胞の特性を有することを示す。
【００３１】
実施例５．テラトーマ形成能の分析
実施例１で得られた細胞（ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１）をＳＣＩＤマウスの睾丸（testis capsule）に注入し（１ｘ１０６細胞／マウス）、１２週間インキュベーションし、テラトーマ形成が起こるかどうかを確認した。その結果、テラトーマ形成は、観察されなかった。本発明の単離方法によって得られた間葉系幹細胞がテラトーマを形成しないことから、この結果は、前記間葉系幹細胞が良性腫瘍、すなわちテラトーマ、を形成する胚芽幹細胞とは異なり、成体幹細胞であること、従って、多様な細胞治療に安全に使用できることを示す。
【００３２】
実施例６．本発明の単離方法によって単離された間葉系幹細胞に対するヒト胚芽幹細胞培養のためのヒト支持細胞（feeder cell）としての機能確認
ヒト胚芽幹細胞は、多様な細胞に分化可能な分化万能性（pluripotent）幹細胞であり、従って、退行性疾患治療のための細胞治療剤として使われることが期待されている。現在までに構築されたほとんどのヒト胚芽幹細胞は、支持細胞によって大きく影響を受ける。現在、マウス由来のＳＴＯ細胞またはＭＥＦ（mouse embryonic fibroblast）のような支持細胞が使われている。しかし、幹細胞治療法の開発においては、種間（cross−species）汚染の危険性を考慮しなければならないために、ヒト由来の支持細胞を開発する必要性が高まっている。これに関連し、本発明の単離方法によって実施例１で単離された前記細胞（ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１）のヒト支持細胞としての用途を評価した。
【００３３】
ＣＨＡ病院で構築されたＣＨＡ−９ヒト胚芽幹細胞を用いて、ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１細胞の支持細胞能を試験するために、ＣＨＡ−９ヒト胚芽幹細胞の継代培養の前日に、ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１細胞を１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（mitomycin Ｃ）（Sigma）で２時間処理し、細胞周期を、「Ｇ０」と呼ばれる非分裂状態にした後、トリプシン／ＥＤＴＡで処理し、細胞を単離した。単離した細胞を４ウェル培養皿に播種して（０．８ｘ１０５細胞／ウェル）培養した。その翌日、前記ＣＨＡ−９ヒト胚芽幹細胞を単離して、４ウェル培養皿に付着して培養されているＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１上に播き、前記ＣＨＡ−９ヒト胚芽幹細胞及び前記ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１を共培養した。共培養しながら、前記ＣＨＡ−９ヒト胚芽幹細胞の培養状態を、形態学的、胚芽幹細胞特異的マーカーの発現などの観点から観察した。その結果、１０継代（passage）以上に共培養したときも、前記ＣＨＡ−９ヒト胚芽幹細胞の未分化状態及び成長速度、並びに胚芽幹細胞に特異的なマーカーの発現が良好に維持された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎盤絨毛膜板膜（placental chorionic plate membrane）由来の間葉系幹細胞を高純度で単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、自己複製能を有し、多様な系統（lineages）に分化できる多能性（multipotent）幹細胞である。間葉系幹細胞はまた、間葉系前駆細胞（mesenchymal progenitor cells）とも呼ばれる。間葉系幹細胞は、条件によって、骨、脂肪、軟骨、神経、筋肉及び骨髄間質細胞などに分化し、多様な治療学的効能を有する。間葉系幹細胞は、成体幹細胞の一種であり、骨髄から造血幹細胞と共に分離されうる。培養皿中に浮遊する造血幹細胞とは異なり、間葉系幹細胞は、培養皿に付着する。間葉系幹細胞は、多様な実験及び／または臨床に使われてきた。しかし、骨髄由来の間葉系幹細胞の分化能は、供与者（donor）の年齢の増加に伴って低下し、また単離される間葉系幹細胞の数は、供与者の状態によって大きく異なる。また、骨髄由来の間葉系幹細胞の採取及び単離の過程で、供与者は、苦痛を受けることがある。従って、間葉系幹細胞の新しい単離方法を開発する必要性が高まっている。
【０００３】
一方、現在胎盤は、出産後に一般的に廃棄される。しかし、胎盤の部位別に、間葉系幹細胞、脱落膜（decidua）細胞、栄養膜（trophoblast）細胞、羊膜（amnion）細胞、上皮細胞（endothelial cells）などの多様な細胞が存在することが明らかになっている。TsujiらのグループとKanhaiらのグループは、胎盤由来の細胞が、間葉系幹細胞や間葉系前駆細胞である可能性が高いと報告し（非特許文献１、非特許文献２）、Surbekらのグループは、神経再生を目的とした胎盤由来の間葉系幹細胞の自家免疫移植の可能性を提示している（非特許文献３）。Takahashiらのグループは、ヒト胎盤由来の間葉系幹細胞の軟骨再生能（potential）について報告している（非特許文献４）。
【０００４】
幹細胞の研究及び活用における共通した制約、すなわち、倫理的問題、単離される細胞数の制限、及び限られた単一組織から単離できる幹細胞の種類などを考慮すると、胎盤由来の幹細胞の単離方法を確立することは、非常に重要である。胎盤由来の多様な幹細胞の活用可能性が、前記の通り報告されているが、胎盤内に存在するさまざまな異なる細胞との混合物から、間葉系幹細胞を高純度で単離することが困難であるという問題がある。
【０００５】
Zhangらは、胎盤からの間葉系前駆細胞の単離方法、及び単離された間葉系前駆細胞の特性について開示している（非特許文献５）。前記方法によれば、胎盤から羊膜嚢（amniotic sac）及び脱落膜を除去した後、リン酸緩衝液で胎盤を洗浄し、灌流液及び培養液（ヘパリン１２．５Ｕ／ｍｌ、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン５０ｍｇ／ｍｌを含むイスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's modified Dulbecco medium））を動脈・静脈循環（arterial-vein circuit）を介して流し、組織から残留血液を除去する。前記組織を、前記培養液中に１２時間ないし２４時間浸し、フィコール（Ficoll）密度勾配を利用して単核細胞を得て、これをウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培地中に再懸濁して間葉系前駆細胞を得る。前記方法は、実験室規模で行われるものの、フィコール密度勾配分離を含んだ複雑な過程を必要とする。さらに、長時間胎盤自体で間葉系幹細胞を培養するので、胎盤内に存在する単核細胞の混在を招くことがある。また、健康な間葉系幹細胞を安定した状態で大量に単離／精製することが困難であるため、間葉系幹細胞を臨床的に適用することが困難になっている。また、羊膜嚢及び脱落膜が除去された胎盤を使用するために、間葉系前駆細胞が胎盤絨毛（placental villi）由来の他の細胞と混ざることがあり、間葉系前駆細胞の純度が低くなる可能性がある。
【０００６】
最近S．J．Kimらは、胎盤の絨毛膜板膜から間葉系幹細胞を単離し、これを胚芽幹細胞から形成された胚状体と共培養することによって、胚芽幹細胞の造血分化（hematopoietic differentiation）を促進させる方法を開示している（非特許文献６）。前記方法によれば、胎盤から絨毛膜板膜を採取し、酵素処理によって絨毛膜板膜から細胞を分離した後、前記細胞を２０％ＦＢＳ及び抗生物質を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）中で培養することによって、絨毛膜板膜から間葉系幹細胞の単離を行う。前記方法は、比較的簡単に間葉系幹細胞を単離／精製できるが、絨毛膜板膜表面全体の酵素処理によって、間葉系幹細胞だけではなく、絨毛膜板膜に接着している羊膜（amnion）細胞も共に分離され、細胞純度が低下する。従って、間葉系幹細胞を何回か継代培養すると、羊膜由来の細胞が混在する。このような羊膜細胞は、間葉系幹細胞より速く増殖するため、間葉系幹細胞の純粋培養が困難になる。また、間葉系幹細胞は、酵素反応の影響を受けやすい。３７℃で酵素処理を行うと、間葉系幹細胞の膜が容易に破損して、細胞の生存率に悪影響を及ぼすことになる。従って、胎盤絨毛膜板膜に由来する間葉系幹細胞の従来の単離方法は、他の細胞との混在という問題点を有している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tsujiら，Stem Cells ２００４；２２（５）：６４９−５８
【非特許文献２】Kanhaiら，Stem Cells ２００４；２２（７）：１３３８−１３４５
【非特許文献３】Surbecら，Am Ｊ Obstet Gynecol ２００６；１９４（３）：６６４−６７３
【非特許文献４】Takahashiら，Biochem Biophys Res Commun ２００６；３４０（３）：９４４−９５２
【非特許文献５】Zhangら，Experimental Hematology ３２（２００４）６５７−６６４
【非特許文献６】S．J．Kimら、Acta Haematol ２００６；１１６；２１９−２２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、幹細胞に関連した倫理性の問題を回避しつつ、胎盤から間葉系幹細胞を高純度で単離する方法を開発しようと研究を行ったところ、物理的なスクレイピング（scraping）方法を利用して胎盤の絨毛膜板膜から細胞を採取し、これを温和な条件で酵素処理し、かつ別途に酵素反応を停止させたとき、間葉系幹細胞を非常に高い純度及び生存率で単離できるということを発見した。
【０００９】
従って、本発明は、胎盤の絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞を高純度で単離する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様によって、（ａ）剥離した胎盤から絨毛膜板膜を採取する工程と、（ｂ）工程（ａ）で得られた絨毛膜板膜に存在する細胞をスクレイピングによって採取する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞にトリプシン及びエチレンジアミンテトラアセテートを含有する溶液を加えて酵素反応を行い、ウシ胎児血清を加えて酵素反応を停止させる工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた反応液を遠心分離し、得られた細胞をウシ胎児血清及び抗生物質を含有する培地中で培養する工程とを含む胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞の単離方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の単離方法によれば、物理的なスクレイピング方法によって胎盤絨毛膜板膜の内部部位から細胞を採取する。従って、絨毛膜板膜の内部部位に接着している他の細胞（羊膜細胞を含む）を除外でき、間葉系幹細胞の純度を上昇させることができる。また、酵素反応を温和な条件で行い、酵素反応停止を別途に行うことによって、細胞の生存率を大幅に高めることができる。従って、本発明の単離方法は、間葉系幹細胞の高純度単離及び大量増殖を可能にし、従って、多様な幹細胞治療、例えば、退行性疾患治療などの細胞治療に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の単離方法によって得られた胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞の形態を示す写真である。
【図２】本発明の単離方法によって得られた胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞の核型を示す写真である。
【図３】本発明の単離方法によって得られた胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞の細胞周期を示すグラフである。
【図４】本発明の単離方法によって得られた胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞に対するＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）分析結果を示す。
【図５】本発明の単離方法によって得られた胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞で発現する遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の単離方法によれば、物理的なスクレイピング方法によって胎盤絨毛膜板膜の内部部位から細胞を採取する。従って、絨毛膜板膜の内部部位に接着している他の細胞（羊膜細胞を含む）を除外でき、間葉系幹細胞の純度を上昇させることができる。また、酵素反応を温和な条件で行い、酵素反応停止を別途に行うことによって、細胞の生存率を大幅に高めることができる。従って、本発明の単離方法は、間葉系幹細胞の高純度単離及び大量増殖を可能にし、従って、多様な幹細胞治療、例えば、退行性疾患治療などの細胞治療に利用できる。
【００１４】
本発明の単離方法は、剥離した胎盤から絨毛膜板膜（chorionic plate membrane）を採取する工程［工程（ａ）］を含む。前記剥離した胎盤は、出産後に健康な産婦から分離されて廃棄される胎盤であってもよい。すなわち、前記「剥離した胎盤」とは、出産後に母体から分離された胎盤を意味する。前記剥離した胎盤は、氷浴（ice bath）下の滅菌された容器に速やかに保管することができる。前記剥離した胎盤からの絨毛膜板膜の採取は、一般的な解剖学的方法、例えば、胎盤の胎児面側を覆っている絨毛膜板膜を引き剥がすことによって行うことができる。このようにして得られた絨毛膜板膜を、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：phosphate buffered saline）で２回以上、望ましくは、５回ほど洗浄することによって、組織に存在する夾雑物を除去する。
【００１５】
本発明の単離方法は、前記絨毛膜板膜の内部部分をスクレイピング（scraping）することによって、細胞を採取する工程［工程（ｂ）］を含む。前記スクレイピングは、細胞を掻き取る道具、例えば、滅菌消毒されたスライドガラス（slide glass）、細胞培養用スクレイパー（scraper）などを使用して行うことができる。望ましくは、前記スクレイピングは、滅菌消毒されたスライドガラスを使用して絨毛膜板膜の母体面側を引っ掻くことによって、行うことができる。具体的には、羊膜細胞が下側になるように、絨毛膜板膜をガラス皿の上に広げ、絨毛膜板膜内部側に存在する細胞を滅菌消毒されたスライドガラスで物理的に剥がして採取できる。
【００１６】
採取した細胞を、直接酵素で処理してもよい。または、前記細胞を、適切な緩衝液で洗浄し、遠心分離して濃縮した後、酵素で処理してもよい。前記洗浄は、ＨＢＳＳ（Hank's balanced salt solution）などの緩衝液を使用して２，３回行うことができ、前記遠心分離は、１，０００ないし１，２００ｒｐｍで５ないし１０分間ほど、望ましくは、約１，０００ｒｐｍで約５分間行うことができる。
【００１７】
工程（ｃ）の酵素処理は、トリプシン（trypsin）及びエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）を含有する溶液を使用して行うことができる。前記トリプシン及びＥＤＴＡの濃度は、特に制限されない。例えば、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を使用することができる。また、工程（ｃ）は、酵素反応停止過程を含む。すなわち、本発明の単離方法において、前記酵素反応は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えて停止させることによって、酵素による細胞の損傷を最小化する。
【００１８】
本発明の単離方法において、前記酵素処理及び酵素反応停止過程を２回繰り返すことによって、間葉系幹細胞の収率を上昇させることができる。すなわち、前記酵素処理及び酵素反応停止は、１回または２回行うことができる。前記酵素処理及び酵素反応停止を１回行う場合、前記酵素処理は、約１時間かけて行うことができる。前記酵素処理及び酵素反応停止を２回行う場合、それぞれの酵素処理は約３０分間かけて行うことができる。
【００１９】
本発明の単離方法において、前記酵素処理は、３７℃で行われる一般的な酵素処理とは異なり、比較的低温、例えば、約２０〜３０℃、望ましくは、室温で徐々に行うことができる。このようにすることによって、細胞の損傷を大幅に減らすことができる。
【００２０】
本発明の単離方法は、工程（ｃ）で得られた溶液を遠心分離し、回収した細胞を間葉系幹細胞の培養培地、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を含有する培地中で培養する工程［工程（ｄ）］を含む。前記遠心分離は、約１，０００ｒｐｍで約５分間行うことができる。前記間葉系幹細胞の培養培地としては、比較的少量（例えば、５ないし１０％、望ましくは、約１０％）のＦＢＳを含有する培地、例えば、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌのヘパリン、及び２５ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子（ ＦＧＦ−４：fibroblast growth factor−４）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２が挙げられる。前記培養は、一般的な培養条件、例えば、３７℃、ＣＯ２培養器中で行うことができる。
以下、本発明について、実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明を制限するものではない。
【００２１】
実施例１．間葉系幹細胞の単離
医療、産科及び外科上の問題がなく、妊娠３７週以降で正常な胎児（奇形や多胎児でない）を分娩した健康な産婦から、事前に十分な説明に基づいた同意（informed consent）を得た後、前記産婦から正常胎盤を得て、迅速に氷浴（ice bath）下の滅菌された容器に保管した。胎盤の形態学的及び構造学的特徴を目視にて観察して記録した。胎盤の胎児面側を覆っている絨毛膜板膜を引き剥がし、抗生物質（１％のペニシリン−ストレプトマイシン）を含有するＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、細胞の採取中や移動中に組織で生じる夾雑物を除去した。
【００２２】
羊膜細胞が下側になるように、前記絨毛膜板膜を滅菌消毒された１５０ｍｍ径のガラス皿上に広げ、絨毛膜板膜の内部部位に存在する間葉系幹細胞層の細胞を、滅菌消毒されたスライドガラスで掻き取って回収した。回収した細胞を滅菌ＨＢＳＳ溶液で３回洗浄した後、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去した後、残った細胞に、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液１０ｍｌを加えた。この混合物を室温で３０分間ゆっくり撹拌しつつ、インキュベーションし、１ｍｌのＦＢＳを加えて酵素反応を停止させた。上層（一次酵素反応液）を分離し、５０ｍｌのコニカルチューブ（conical tube）に移した。残った細胞に、再び０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液１０ｍｌを添加し、この混合物を室温で３０分間ゆっくり撹拌しつつ、インキュベーションした。上層を分離し、一次酵素反応液と合わせた。２．５ｍｌのＦＢＳを、得られた酵素反応液に加えて酵素反応を停止させ、得られた溶液を１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を回収した。前記細胞を、培養液（１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌのヘパリン、及び２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−４を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）３ｍｌに加えた。これを十分に撹拌し、Ｔ２５フラスコに移し、３７℃、ＣＯ２培養器中で培養した。
２００６年９月４日に細胞の単離を始め、細胞の成長速度を考慮し、約５日ごとに１回継代して１０継代まで継代培養した。１０継代後に得られた細胞を「ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１」と命名した。
【００２３】
実施例２．形態学的特性の分析
実施例１で得られた細胞（ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１）を位相差（phase contrast）顕微鏡で観察した。その結果を図１に示す。ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１の形態（morphology）は、線維芽細胞（fibroblastoid）の形態を示している。Mycoplasma detection kit（iNtRON Biotechnology，Inc.）を使用したマイコプラズマ試験（mycoplasma test）で、前記細胞は、陰性であることがわかった。前記細胞をコルセミド（colcemid）（Invitrogen）及びＫＣｌ溶液（０．０７５Ｍ ＫＣｌ）で処理し、Trypsin−Giemsaで染色し、CytoVision（Applied Imaging社）を用いて、前記細胞の核型を分析した。その結果、前記細胞の核型は、４６ ＸＸであった（図２）。また、前記細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ：propidium iodide）で染色し、フローサイトメータ（flow cytometer）（ＦＡＣＳ、Beckman社）を用いて、前記細胞の細胞周期を測定した。その結果、前記細胞は、一般的な細胞周期より速い細胞周期を示した（図３参照）。
上記の結果は、実施例１で得られた細胞が、マイコプラズマ陰性で正常核型を有し、速い細胞分裂を示す、新規かつ安全で健康な細胞であることを示している。
【００２４】
実施例３．ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）分析
種々の抗体を用いて、実施例１で得られた細胞の表面に存在する特定抗原を分析するために、ＦＡＣＳ分析を行った。すなわち、細胞が８０％コンフルエントな状態に増殖した時点で、１ｍｌの細胞解離溶液（cell dissociation buffer、ＧＩＢＣＯ社）を前記細胞に加え、培養チューブから細胞を解離させた。前記細胞を、緑色または青色の蛍光物質で標識されたヒト特異的な抗体、すなわち抗ＣＤ１３、抗ＣＤ７１、抗ＣＤ１７８、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ９５、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ３１、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ５１、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗サイトケラチン７と共に、室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで３回洗浄した。フローサイトメータを用いてＦＡＣＳ分析を行った結果を図４に示す。
【００２５】
図４から分かるように、本発明の単離方法によって実施例１で単離された細胞は、ＣＤ１３陽性（≧９９．９８）、ＣＤ７１陽性（≧６８．９２）、ＣＤ１７８陰性（≦４５８）、ＣＤ４４陽性（≧９９．９８）、ＣＤ１０５陽性（≧３５．７５）、ＣＤ９０陽性（≧９９．４６）、ＣＤ９５陽性（≧９９．９８）、ＣＤ３４陰性（≦１．４８）、ＣＤ３１陰性（≦１．３４）、ＣＤ３３陰性（≦１．３７）、ＣＤ５６陽性（≧２０．０４）、ＣＤ５１陰性（≦８．７５）、ＨＬＡ−ＡＢＣ陽性（≧９９．５５）、ＨＬＡ−ＤＲ陰性（≦４１９）、及びサイトケラチン７陰性（≦２．８０）であると確認された。すなわち、実施例１で得られた細胞は、血管内皮細胞、血球細胞、栄養膜細胞ではなく、間葉系幹細胞に特異的な抗原を発現していた。このような結果は、本発明の単離方法によって実施例１で単離された細胞が間葉系幹細胞の特徴を有する細胞であることを示す。
【００２６】
実施例４．幹細胞関連遺伝子のＲＮＡ発現レベル分析
本発明の単離方法によって実施例１で得られた細胞で発現する遺伝子に対してＲＴ−ＰＣＲを行った。すなわち、実施例１で得られた細胞が、Ｔ２５フラスコで約８０％コンフルエントな状態に増殖した時点で、細胞を回収し、次の通りＲＴ−ＰＣＲを行った。すなわち、細胞をトリゾールで溶解（lysis）させ、全ＲＮＡを抽出した。逆転写酵素（reverse transcriptase）を使用し、前記全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡ特異的プライマー及びＴａｇ ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを行った。前記ＰＣＲ産物をアガロースゲルを用いて電気泳動し、増幅された遺伝子を確認した。前記プライマー配列、ＰＣＲ溶液の組成及びＰＣＲの条件は、下記表１ないし３にまとめた。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【表２】
【００２９】
【表３】
【００３０】
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図５に示す。図５から分かるように、幹細胞の自己複製に係わる遺伝子として知られているＮａｎｏｇ及びＳｏｘ２が、実施例１で単離された細胞で発現していた。神経外胚葉性マーカー（neuroectodermal marker）であるＮＦ６８遺伝子の発現も観察された。このような結果は、本発明の単離方法によって実施例１で単離された細胞が、自己複製が可能で、外胚葉中の神経細胞分化に関連した遺伝子を発現する多能性（multipotent）幹細胞の特性を有することを示す。
【００３１】
実施例５．テラトーマ形成能の分析
実施例１で得られた細胞（ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１）をＳＣＩＤマウスの睾丸（testis capsule）に注入し（１ｘ１０６細胞／マウス）、１２週間インキュベーションし、テラトーマ形成が起こるかどうかを確認した。その結果、テラトーマ形成は、観察されなかった。本発明の単離方法によって得られた間葉系幹細胞がテラトーマを形成しないことから、この結果は、前記間葉系幹細胞が良性腫瘍、すなわちテラトーマ、を形成する胚芽幹細胞とは異なり、成体幹細胞であること、従って、多様な細胞治療に安全に使用できることを示す。
【００３２】
実施例６．本発明の単離方法によって単離された間葉系幹細胞に対するヒト胚芽幹細胞培養のためのヒト支持細胞（feeder cell）としての機能確認
ヒト胚芽幹細胞は、多様な細胞に分化可能な分化万能性（pluripotent）幹細胞であり、従って、退行性疾患治療のための細胞治療剤として使われることが期待されている。現在までに構築されたほとんどのヒト胚芽幹細胞は、支持細胞によって大きく影響を受ける。現在、マウス由来のＳＴＯ細胞またはＭＥＦ（mouse embryonic fibroblast）のような支持細胞が使われている。しかし、幹細胞治療法の開発においては、種間（cross−species）汚染の危険性を考慮しなければならないために、ヒト由来の支持細胞を開発する必要性が高まっている。これに関連し、本発明の単離方法によって実施例１で単離された前記細胞（ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１）のヒト支持細胞としての用途を評価した。
【００３３】
ＣＨＡ病院で構築されたＣＨＡ−９ヒト胚芽幹細胞を用いて、ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１細胞の支持細胞能を試験するために、ＣＨＡ−９ヒト胚芽幹細胞の継代培養の前日に、ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１細胞を１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（mitomycin Ｃ）（Sigma）で２時間処理し、細胞周期を、「Ｇ０」と呼ばれる非分裂状態にした後、トリプシン／ＥＤＴＡで処理し、細胞を単離した。単離した細胞を４ウェル培養皿に播種して（０．８ｘ１０５細胞／ウェル）培養した。その翌日、前記ＣＨＡ−９ヒト胚芽幹細胞を単離して、４ウェル培養皿に付着して培養されているＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１上に播き、前記ＣＨＡ−９ヒト胚芽幹細胞及び前記ＣＨＡ−ＰＤＭＳＣ−１を共培養した。共培養しながら、前記ＣＨＡ−９ヒト胚芽幹細胞の培養状態を、形態学的、胚芽幹細胞特異的マーカーの発現などの観点から観察した。その結果、１０継代（passage）以上に共培養したときも、前記ＣＨＡ−９ヒト胚芽幹細胞の未分化状態及び成長速度、並びに胚芽幹細胞に特異的なマーカーの発現が良好に維持された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）剥離した胎盤から絨毛膜板膜を採取する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた絨毛膜板膜に存在する細胞をスクレイピングによって採取する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞にトリプシン及びエチレンジアミンテトラアセテートを含有する溶液を加えて酵素反応を行い、ウシ胎児血清を加えて酵素反応を停止させる工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた反応液を遠心分離し、得られた細胞をウシ胎児血清及び抗生物質を含有する培地中で培養する工程とを含む胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞の単離方法。
【請求項２】
工程（ｂ）が、滅菌されたスライドガラスで、絨毛膜板膜の母体面側をスクレイピングすることによって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）及び工程（ｃ）の間に、前記細胞を洗浄し、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して濃縮することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）が２回繰り返されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）で、それぞれの酵素反応が３０分間ずつ行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）で、前記酵素反応が２０℃ないし３０℃で行われることを特徴とする請求項１ないし請求項５のうち、いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）で、前記酵素反応が室温で行われることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｄ）で、前記培地が１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌのヘパリン、及び２５ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−４）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）剥離した胎盤から絨毛膜板膜を採取する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた絨毛膜板膜に存在する細胞をスクレイピングによって採取する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞にトリプシン及びエチレンジアミンテトラアセテートを含有する溶液を加えて酵素反応を行い、ウシ胎児血清を加えて酵素反応を停止させる工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた反応液を遠心分離し、得られた細胞をウシ胎児血清及び抗生物質を含有する培地中で培養する工程とを含む胎盤絨毛膜板膜由来の間葉系幹細胞の単離方法。
【請求項２】
工程（ｂ）が、滅菌されたスライドガラスで、絨毛膜板膜の母体面側をスクレイピングすることによって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）及び工程（ｃ）の間に、前記細胞を洗浄し、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して濃縮することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）が２回繰り返されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）で、それぞれの酵素反応が３０分間ずつ行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）で、前記酵素反応が２０℃ないし３０℃で行われることを特徴とする請求項１ないし請求項５のうち、いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）で、前記酵素反応が室温で行われることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｄ）で、前記培地が１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌのヘパリン、及び２５ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−４）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５２７６２９（Ｐ２０１０−５２７６２９Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１０１８５（Ｐ２０１０−５１０１８５）
【出願日】平成１９年１０月２４日（２００７．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００５２３５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４６９９２
【国際公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（５０８３２１６６１）シーエイチエーバイオテック カンパニー，リミテッド (3)
【出願人】（５０７２９８２５６）カレッジ オブ メディスン ポーチョン シーエイチエー ユニバーシティ インダストリー−アカデミック コーポレーション ファウンデーション (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２４日（２００７．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００５２３５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４６９９２
【国際公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（５０８３２１６６１）シーエイチエーバイオテック カンパニー，リミテッド (3)
【出願人】（５０７２９８２５６）カレッジ オブ メディスン ポーチョン シーエイチエー ユニバーシティ インダストリー−アカデミック コーポレーション ファウンデーション (5)
【Ｆターム（参考）】
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