脂肪細胞分化抑制剤
【課題】 本発明の課題は、脂肪細胞分化抑制作用に優れ安全性の高い脂肪細胞分化抑制剤を提供するものである。
【解決手段】 中性キシロオリゴ糖を有効成分とする脂肪細胞分化抑制剤。前記中性キシロオリゴ糖が、リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖とリグニンの複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理することによって得られたものであることを特徴とする前記発明に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【解決手段】 中性キシロオリゴ糖を有効成分とする脂肪細胞分化抑制剤。前記中性キシロオリゴ糖が、リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖とリグニンの複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理することによって得られたものであることを特徴とする前記発明に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人体に対して安全性の高い脂肪細胞分化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化に伴い、脂肪や糖の過剰摂取が原因となり、糖尿病、高脂血症、動脈硬化などの疾病が増加している。そのメカニズムとしては以下の通りである。即ち、脂肪や糖の過剰摂取により体内に存在する前駆脂肪細胞が脂肪細胞に分化し、脂肪細胞内に脂肪が蓄積される。脂肪細胞への脂肪の蓄積が進行すると脂肪細胞が肥大化し、肥大化脂肪細胞となる。脂肪細胞では脂肪が正常に分解されるが、肥大化脂肪細胞では細胞内に蓄積された脂肪の分解が異常になり、糖尿病、高脂血症、動脈硬化等の疾病を引き起こす。
従って、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制することができれば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化等の予防が可能となると考えられる。
現在、脂肪細胞の分化抑制に関与する成分として、環状ペプチド（特許文献１参照）、イネ科植物抽出成分（特許文献２参照）が報告されているが、一般に充分な効果が期待できる用量を動物やヒトが摂取する場合、アレルギー等の副作用が懸念されたり、臭いや味が原因で摂取が困難等の問題がある。従って、人体に対して安全性が高く、無味・無臭の脂肪細胞分化抑制剤が求められている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５-２２００７４号公報
【特許文献２】特開２００５-２４７６９５号公報
【特許文献３】特開２００３-５５２３１号公報
【特許文献４】特開２００５-１８７３７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、脂肪細胞分化抑制作用に優れ安全性の高い脂肪細胞分化抑制剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するため、以下の構成を採用する。
即ち、本発明の第１は、中性キシロオリゴ糖を有効成分とする脂肪細胞分化抑制剤である。
【０００６】
本発明の第２は、前記中性キシロオリゴ糖が、リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖とリグニンの複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理することによって得られたものである、本発明の第１に記載の脂肪細胞分化抑制剤である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、脂肪細胞分化抑制作用に優れ安全性の高い脂肪細胞分化抑制剤を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、リグノセルロースの酵素分解物である中性キシロオリゴ糖が優れた脂肪細胞分化抑制作用を持つという知見を得て本発明を完成させた。なお、中性キシロオリゴ糖の生理作用について、経腸栄養剤（特許文献３参照）、保湿剤およびそれを含有する皮膚外用剤（特許文献４参照）については過去に報告があるが、脂肪細胞分化抑制作用に関する報告はない。
以下、本発明の構成について詳述する。
キシロオリゴ糖とは、キシロースの２量体であるキシロビオース、３量体であるキシロトリオース、あるいは４量体〜２０量体程度のキシロースの重合体を言う。また、本発明においては、異なる重合度を有する複数のキシロオリゴ糖の混合組成物もキシロオリゴ糖と称する。キシロオリゴ糖は、天然物から製造することが一般的であるため、実際にはこのような混合組成物として得られることが多い。
該混合組成物の平均重合度は、正規分布をとる中性キシロオリゴ糖のキシロース鎖長の平均値で示され、２．０〜１５．０が好ましく、３．０〜１０．０がより好ましい。
また、キシロース鎖長の上限と下限との差は２０以下が好ましく、１０以下がより好ましい。
【０００９】
中性キシロオリゴ糖の製造方法としては、（１）木材からキシランを抽出し、それを酵素的に分解する方法（セルラーゼ研究会発行、セルラーゼ研究会報第１６巻、２００１年６月１４日発行、ｐ１７−２６）と、（２）リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖とリグニンの複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、中性キシロオリゴ糖を分離する方法が挙げられる。本発明で使用する中性キシロオリゴ糖の製造方法については、特に限定するものではないが、（２）の方法が、５〜１０量体のように比較的高い重合度のものを大量に安価に製造することが可能である点で特に好ましい。以下にその概要を示す。
【００１０】
中性キシロオリゴ糖は、化学パルプ由来のリグノセルロース材料を原料とし、加水分解工程、濃縮工程、希酸処理工程、精製工程を経て得ることができる。加水分解工程では、希酸処理、高温高圧の水蒸気（蒸煮・爆砕）処理もしくは、ヘミセルラーゼによってリグノセルロース中のキシランを選択的に加水分解し、キシロオリゴ糖とリグニンからなる高分子量の複合体を中間体として得る。濃縮工程では逆浸透膜等により、キシロオリゴ糖−リグニン様物質複合体が濃縮され、低重合度のオリゴ糖や低分子の夾雑物などを除去することができる。濃縮工程は逆浸透膜を用いることが好ましいが、限外濾過膜、塩析、透析などでも可能である。得られた濃縮液の希酸処理工程により、複合体からリグニン様物質が遊離し、中性キシロオリゴ糖と酸性キシロオリゴ糖を含む希酸処理液を得ることができる。この時、複合体から切り離されたリグニン様物質は酸性下で縮合し沈殿するのでセラミックフィルターや濾紙などを用いた濾過等により除去することができる。希酸処理工程では、酸による加水分解を用いることが好ましいが、リグニン分解酵素などを用いた酵素分解などでも可能である。
【００１１】
精製工程は、限外濾過工程、脱色工程、吸着工程からなる。一部のリグニン様物質は可溶性高分子として溶液中に残存するが、限外濾過工程で除去され、着色物質等の夾雑物は活性炭を用いた脱色工程によってそのほとんどが取り除かれる。限外濾過工程は限外濾過膜を用いることが好ましいが、逆浸透膜、塩析、透析などでも可能である。こうして得られた糖液中には中性キシロオリゴ糖と酸性キシロオリゴ糖が溶解している。イオン交換樹脂を用いた吸着工程により、この糖液から中性キシロオリゴ糖のみを取り出すことができる。糖液をまず強陽イオン交換樹脂にて処理し、糖液中の金属イオンを除去する。次いで強陰イオン交換樹脂を用いて糖液中の硫酸イオンなどを除去する。この工程では、硫酸イオンの除去と同時に弱酸である有機酸の一部と着色成分の除去も同時に行っている。強陰イオン交換樹脂で処理された糖液はもう一度強陽イオン交換樹脂で処理し更に金属イオンを除去する。最後に弱陰イオン交換樹脂で処理し、中性キシロオリゴ糖を含む水溶液を回収する。この水溶液を、例えば、スプレードライや凍結乾燥処理により、白色の中性キシロオリゴ糖組成物の粉末を得ることができる。
【００１２】
上記製造方法のメリットは、前述のとおり、経済性と平均重合度の高い中性キシロオリゴ糖が容易に得られる点にある。なお、この方法で得られる中性キシロオリゴ糖の平均重合度は、希酸処理条件を調節するか、再度ヘミセルラーゼで処理する等の方法によって調製可能である。
【００１３】
本発明は、上記の中性キシロオリゴ糖を有効成分とする脂肪細胞分化抑制剤である。脂肪細胞分化抑制剤は、中性キシロオリゴ糖のみを成分とするものでもよく、また、中性キシロオリゴ糖を任意の他成分と組み合わせた組成物であってもよい。
上記脂肪細胞分化抑制剤は、単独で用いることが可能である。単独で用いる場合、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、液剤、カプセル剤等の任意の形態に加工して用いることが可能である。また、加工時には薬学的に許容される製剤用添加剤を更に添加することが可能である。
また、脂肪細胞分化抑制剤は、任意の一般の加工食品、特定保健用食品、栄養機能食品、各種飲料等に添加して用いることが可能である。
さらに、他の医薬品、医薬部外品に使用される成分と混合し、医薬品、医薬部外品として提供することも可能である。
尚、上述した食品、飲料、医薬品等は、ヒトだけではなく、犬や猫などのペットや家畜等の動物を対象として用いることができる。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００１５】
以下、本発明の脂肪細胞分化抑制剤の有効成分である中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）の調製方法、及び得られた中性オリゴ糖について示す。
【００１６】
＜中性キシロオリゴ糖の調製＞
混合広葉樹チップ（国内産広葉樹２０％、ユーカリ８０％）を原料として、クラフト蒸解及び酸素脱リグニン工程により、酸素脱リグニンパルプスラリー（カッパー価９.６、パルプ粘度２５.１ｃｐｓ）を得た。スラリーからパルプを濾別、洗浄した後、パルプ濃度１０％、ｐＨ８に調製したパルプスラリーを用いて以下のキシラナーゼによる酵素処理を行った。
キシラナーゼコンク（アドバンスト・バイオケミカルス社製）を対パルプ５０ユニット／ｇとなるように添加した後、６０℃で１２０分間処理した。その後、濾過によりパルプ残渣を除去し、酵素処理液１０００Ｌを得た。
次に、得られた酵素処理液を濃縮工程、希酸処理工程、精製工程の順に供した。
濃縮工程では、逆浸透膜（日東電工（株）製、ＲＯ ＮＴＲ−７４１０）を用いて濃縮液（４０倍濃縮）を調製した。希酸処理工程では、得られた濃縮液のｐＨを３.５に調整した後、１２１℃で６０分間加熱処理し、リグニンなどの高分子夾雑物の沈殿を形成させた。さらに、この沈殿をセラミックフィルター濾過で取り除くことにより、希酸処理溶液を得た。
精製工程では、限外濾過・脱色工程、吸着工程の順に供した。限外濾過・脱色工程では、希酸処理溶液を限外濾過膜（オスモニクス社製、分画分子量８０００）を通過させた後、活性炭（和光純薬（株）製）７７０ｇの添加及びセラミックフィルター濾過により脱色処理液を得た。吸着工程では、脱色処理液を強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＫ２１８）、強陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＡ４０８）、強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＫ２１８）各１００ｋｇを充填したカラムに順次通過させた後、弱陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＷＡ３０）１００ｋｇを充填したカラムに供した。この弱陰イオン交換樹脂充填カラムを通過した水溶液をスプレードライ処理することによって、中性キシロオリゴ糖の粉末（全糖量１６７０ｇ、回収率４３．２％）を得た。
以下、この中性キシロオリゴ糖を、ＸＮ５とする。
【００１７】
上記で得たＸＮ５は、平均重合度５、キシロース鎖長の上限と下限との差は１０であった。なお、測定方法は以下の通りである。
【００１８】
(１) 全糖量の定量
全糖量は、検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製し、フェノール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(２) 還元糖量の定量
還元糖量は、検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製、ソモジ−ネルソン法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(３) 平均重合度の決定法
サンプル糖液を５０℃に保ち１５，０００ｒｐｍにて１５分遠心分離し不溶物を除去し上清液の全糖量を還元糖量（共にキシロース換算）で割って平均重合度を求めた。
(４) キシロオリゴ糖の分析方法
キシロオリゴ糖の分析にはイオンクロマトグラフィー（ダイオネクス社）を用いた。分析には糖類の分析に適したカラムとしてＣａｒｂｏＰａｃＰＡ−１０（ダイオネクス社）を用いた。
(５) 酵素力価の定義
酵素として用いたキシラナーゼの活性測定にはカバキシラン（シグマ社製）を用いた。酵素力価の定義はキシラナーゼがキシランを分解することで得られる還元糖の還元力をＤＮＳ法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）を用いて測定し、１分間に１マイクロモルのキシロースに相当する還元力を生成させる酵素量を１ユニットとした。
【００１９】
前述で得られた中性キシロオリゴ糖ＸＮ５を含有する水溶液を作成し、これを用いた以下の実験により、本発明の脂肪細胞分化抑制剤の評価試験を行なった。その方法を以下に示す。
【００２０】
＜評価試験＞
継代培養したマウス由来前駆脂肪細胞（3Ｔ3-Ｌ1）をＤＭＥ培地（１０％コウシ血清含有）に懸濁後（細胞密度５ｘ１０４／ｍｌ）、９６ウエルプレートの各ウエルに２００μｌ添加し３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
培養開始から２日目にデキサメタゾン（０．５ｍＭ）、メチルイソブチルキサンチン（１μＭ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥ培地（１０％コウシ血清含有）に置き換え、上記と同様の条件で培養した。
培養開始から４日目にインシュリン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥ培地（１０％コウシ血清含有）に置き換え、上記と同様の条件で２日毎に培地交換を行い培養した。
培養開始から１３日目に培地を取り除き、細胞にオイルレッドを添加し、中性脂肪を染色した。染色された色素を細胞より抽出し、吸光度（５２０ｎｍ）を測定した。また、細胞内のＧＰＤＨ(グリセロール３リン酸脱水素酵素)活性を測定した。
なお、培養開始から２日目から培養終了日まで、中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）を、最終濃度が各々１％、０．１％、０．０１％となるように添加した３種類の培地を用いて培養を行なった。コントロールとして蒸留水を添加した培地を用いて培養を行なった。
また、中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）が上記濃度範囲においてマウス由来前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）に対して細胞毒性のないことをＭＴＴアッセイキット（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭ社）を用いてあらかじめ確認した。
細胞内の脂肪蓄積抑制率の結果を表１に示す。また、細胞内のＧＰＤＨ活性抑制率（コントロールを１００とした場合の相対値）を表２に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
表１、及び表２より、中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）を添加した試験区では、コントロールと比較し、細胞内の脂肪含量が低く、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化により誘導されるＧＰＤＨ活性が低いことが示されている。
即ち、本発明の中性キシロオリゴ糖は、脂肪細胞分化抑制効果を有することは明らかである。
【００２４】
なお、前述の調製例により得られた中性キシロオリゴ糖の安全性試験（皮膚刺激性試験、急性経口毒性試験）、及び、安定性試験を以下の方法により実施した。
（１）皮膚刺激性試験
２質量％の中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）水溶液１００μｌを、各々、除毛後のＣ３Ｈマウス（雄、６週齢、日本チャールズリバー（株）製）の背皮に、約１ヶ月間、連続塗布した（１回／日、各群１０匹）。
塗布期間及び塗布終了後の２週間、マウス背皮において、紅斑、浮腫、炎症等の異常は特に観察されなかった。また、ブランク（水塗布群）と比較し、体重推移においても有意差（Ｐ＜０.０５）が認められなかった。
【００２５】
（２）急性経口毒性試験
中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）水溶液を、ＩＣＲ系マウス（雄、６週齢、日本チャールズリバー（株）製）に胃ゾンデを用いて、経口投与した（投与量：２ｇ／マウス体重１ｋｇ、各群１０匹）。
投与してから２週間後まで、死亡例はなかった。又、体重推移においてもブランク（水投与群）と比較し、有意差（Ｐ＜０.０５）が認められなかった。
【００２６】
（３）安定性試験
中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）水溶液（１％濃度）を調製後、室温で保存した。調製直後、及び、１ヶ月保存後の中性キシロオリゴ糖水溶液をイオンクロマトグラムで分析した。
１ケ月保存後のサンプルのクロマトグラムのパターンは、調製直後のサンプルと比較して変化はなかった。又、クロマトグラムの各ピークの面積の差は、１ケ月保存後のサンプルと調製直後のサンプルの間で、５％未満であった。
【００２７】
上記（１）〜（３）の試験により、本発明の中性キシロオリゴ糖の安全性及び安定性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明により、脂肪細胞分化抑制作用に優れ安全性の高い脂肪細胞分化抑制剤が提供される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人体に対して安全性の高い脂肪細胞分化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化に伴い、脂肪や糖の過剰摂取が原因となり、糖尿病、高脂血症、動脈硬化などの疾病が増加している。そのメカニズムとしては以下の通りである。即ち、脂肪や糖の過剰摂取により体内に存在する前駆脂肪細胞が脂肪細胞に分化し、脂肪細胞内に脂肪が蓄積される。脂肪細胞への脂肪の蓄積が進行すると脂肪細胞が肥大化し、肥大化脂肪細胞となる。脂肪細胞では脂肪が正常に分解されるが、肥大化脂肪細胞では細胞内に蓄積された脂肪の分解が異常になり、糖尿病、高脂血症、動脈硬化等の疾病を引き起こす。
従って、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制することができれば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化等の予防が可能となると考えられる。
現在、脂肪細胞の分化抑制に関与する成分として、環状ペプチド（特許文献１参照）、イネ科植物抽出成分（特許文献２参照）が報告されているが、一般に充分な効果が期待できる用量を動物やヒトが摂取する場合、アレルギー等の副作用が懸念されたり、臭いや味が原因で摂取が困難等の問題がある。従って、人体に対して安全性が高く、無味・無臭の脂肪細胞分化抑制剤が求められている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５-２２００７４号公報
【特許文献２】特開２００５-２４７６９５号公報
【特許文献３】特開２００３-５５２３１号公報
【特許文献４】特開２００５-１８７３７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、脂肪細胞分化抑制作用に優れ安全性の高い脂肪細胞分化抑制剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するため、以下の構成を採用する。
即ち、本発明の第１は、中性キシロオリゴ糖を有効成分とする脂肪細胞分化抑制剤である。
【０００６】
本発明の第２は、前記中性キシロオリゴ糖が、リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖とリグニンの複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理することによって得られたものである、本発明の第１に記載の脂肪細胞分化抑制剤である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、脂肪細胞分化抑制作用に優れ安全性の高い脂肪細胞分化抑制剤を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、リグノセルロースの酵素分解物である中性キシロオリゴ糖が優れた脂肪細胞分化抑制作用を持つという知見を得て本発明を完成させた。なお、中性キシロオリゴ糖の生理作用について、経腸栄養剤（特許文献３参照）、保湿剤およびそれを含有する皮膚外用剤（特許文献４参照）については過去に報告があるが、脂肪細胞分化抑制作用に関する報告はない。
以下、本発明の構成について詳述する。
キシロオリゴ糖とは、キシロースの２量体であるキシロビオース、３量体であるキシロトリオース、あるいは４量体〜２０量体程度のキシロースの重合体を言う。また、本発明においては、異なる重合度を有する複数のキシロオリゴ糖の混合組成物もキシロオリゴ糖と称する。キシロオリゴ糖は、天然物から製造することが一般的であるため、実際にはこのような混合組成物として得られることが多い。
該混合組成物の平均重合度は、正規分布をとる中性キシロオリゴ糖のキシロース鎖長の平均値で示され、２．０〜１５．０が好ましく、３．０〜１０．０がより好ましい。
また、キシロース鎖長の上限と下限との差は２０以下が好ましく、１０以下がより好ましい。
【０００９】
中性キシロオリゴ糖の製造方法としては、（１）木材からキシランを抽出し、それを酵素的に分解する方法（セルラーゼ研究会発行、セルラーゼ研究会報第１６巻、２００１年６月１４日発行、ｐ１７−２６）と、（２）リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖とリグニンの複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、中性キシロオリゴ糖を分離する方法が挙げられる。本発明で使用する中性キシロオリゴ糖の製造方法については、特に限定するものではないが、（２）の方法が、５〜１０量体のように比較的高い重合度のものを大量に安価に製造することが可能である点で特に好ましい。以下にその概要を示す。
【００１０】
中性キシロオリゴ糖は、化学パルプ由来のリグノセルロース材料を原料とし、加水分解工程、濃縮工程、希酸処理工程、精製工程を経て得ることができる。加水分解工程では、希酸処理、高温高圧の水蒸気（蒸煮・爆砕）処理もしくは、ヘミセルラーゼによってリグノセルロース中のキシランを選択的に加水分解し、キシロオリゴ糖とリグニンからなる高分子量の複合体を中間体として得る。濃縮工程では逆浸透膜等により、キシロオリゴ糖−リグニン様物質複合体が濃縮され、低重合度のオリゴ糖や低分子の夾雑物などを除去することができる。濃縮工程は逆浸透膜を用いることが好ましいが、限外濾過膜、塩析、透析などでも可能である。得られた濃縮液の希酸処理工程により、複合体からリグニン様物質が遊離し、中性キシロオリゴ糖と酸性キシロオリゴ糖を含む希酸処理液を得ることができる。この時、複合体から切り離されたリグニン様物質は酸性下で縮合し沈殿するのでセラミックフィルターや濾紙などを用いた濾過等により除去することができる。希酸処理工程では、酸による加水分解を用いることが好ましいが、リグニン分解酵素などを用いた酵素分解などでも可能である。
【００１１】
精製工程は、限外濾過工程、脱色工程、吸着工程からなる。一部のリグニン様物質は可溶性高分子として溶液中に残存するが、限外濾過工程で除去され、着色物質等の夾雑物は活性炭を用いた脱色工程によってそのほとんどが取り除かれる。限外濾過工程は限外濾過膜を用いることが好ましいが、逆浸透膜、塩析、透析などでも可能である。こうして得られた糖液中には中性キシロオリゴ糖と酸性キシロオリゴ糖が溶解している。イオン交換樹脂を用いた吸着工程により、この糖液から中性キシロオリゴ糖のみを取り出すことができる。糖液をまず強陽イオン交換樹脂にて処理し、糖液中の金属イオンを除去する。次いで強陰イオン交換樹脂を用いて糖液中の硫酸イオンなどを除去する。この工程では、硫酸イオンの除去と同時に弱酸である有機酸の一部と着色成分の除去も同時に行っている。強陰イオン交換樹脂で処理された糖液はもう一度強陽イオン交換樹脂で処理し更に金属イオンを除去する。最後に弱陰イオン交換樹脂で処理し、中性キシロオリゴ糖を含む水溶液を回収する。この水溶液を、例えば、スプレードライや凍結乾燥処理により、白色の中性キシロオリゴ糖組成物の粉末を得ることができる。
【００１２】
上記製造方法のメリットは、前述のとおり、経済性と平均重合度の高い中性キシロオリゴ糖が容易に得られる点にある。なお、この方法で得られる中性キシロオリゴ糖の平均重合度は、希酸処理条件を調節するか、再度ヘミセルラーゼで処理する等の方法によって調製可能である。
【００１３】
本発明は、上記の中性キシロオリゴ糖を有効成分とする脂肪細胞分化抑制剤である。脂肪細胞分化抑制剤は、中性キシロオリゴ糖のみを成分とするものでもよく、また、中性キシロオリゴ糖を任意の他成分と組み合わせた組成物であってもよい。
上記脂肪細胞分化抑制剤は、単独で用いることが可能である。単独で用いる場合、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、液剤、カプセル剤等の任意の形態に加工して用いることが可能である。また、加工時には薬学的に許容される製剤用添加剤を更に添加することが可能である。
また、脂肪細胞分化抑制剤は、任意の一般の加工食品、特定保健用食品、栄養機能食品、各種飲料等に添加して用いることが可能である。
さらに、他の医薬品、医薬部外品に使用される成分と混合し、医薬品、医薬部外品として提供することも可能である。
尚、上述した食品、飲料、医薬品等は、ヒトだけではなく、犬や猫などのペットや家畜等の動物を対象として用いることができる。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００１５】
以下、本発明の脂肪細胞分化抑制剤の有効成分である中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）の調製方法、及び得られた中性オリゴ糖について示す。
【００１６】
＜中性キシロオリゴ糖の調製＞
混合広葉樹チップ（国内産広葉樹２０％、ユーカリ８０％）を原料として、クラフト蒸解及び酸素脱リグニン工程により、酸素脱リグニンパルプスラリー（カッパー価９.６、パルプ粘度２５.１ｃｐｓ）を得た。スラリーからパルプを濾別、洗浄した後、パルプ濃度１０％、ｐＨ８に調製したパルプスラリーを用いて以下のキシラナーゼによる酵素処理を行った。
キシラナーゼコンク（アドバンスト・バイオケミカルス社製）を対パルプ５０ユニット／ｇとなるように添加した後、６０℃で１２０分間処理した。その後、濾過によりパルプ残渣を除去し、酵素処理液１０００Ｌを得た。
次に、得られた酵素処理液を濃縮工程、希酸処理工程、精製工程の順に供した。
濃縮工程では、逆浸透膜（日東電工（株）製、ＲＯ ＮＴＲ−７４１０）を用いて濃縮液（４０倍濃縮）を調製した。希酸処理工程では、得られた濃縮液のｐＨを３.５に調整した後、１２１℃で６０分間加熱処理し、リグニンなどの高分子夾雑物の沈殿を形成させた。さらに、この沈殿をセラミックフィルター濾過で取り除くことにより、希酸処理溶液を得た。
精製工程では、限外濾過・脱色工程、吸着工程の順に供した。限外濾過・脱色工程では、希酸処理溶液を限外濾過膜（オスモニクス社製、分画分子量８０００）を通過させた後、活性炭（和光純薬（株）製）７７０ｇの添加及びセラミックフィルター濾過により脱色処理液を得た。吸着工程では、脱色処理液を強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＫ２１８）、強陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＡ４０８）、強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＰＫ２１８）各１００ｋｇを充填したカラムに順次通過させた後、弱陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＷＡ３０）１００ｋｇを充填したカラムに供した。この弱陰イオン交換樹脂充填カラムを通過した水溶液をスプレードライ処理することによって、中性キシロオリゴ糖の粉末（全糖量１６７０ｇ、回収率４３．２％）を得た。
以下、この中性キシロオリゴ糖を、ＸＮ５とする。
【００１７】
上記で得たＸＮ５は、平均重合度５、キシロース鎖長の上限と下限との差は１０であった。なお、測定方法は以下の通りである。
【００１８】
(１) 全糖量の定量
全糖量は、検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製し、フェノール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(２) 還元糖量の定量
還元糖量は、検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製、ソモジ−ネルソン法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(３) 平均重合度の決定法
サンプル糖液を５０℃に保ち１５，０００ｒｐｍにて１５分遠心分離し不溶物を除去し上清液の全糖量を還元糖量（共にキシロース換算）で割って平均重合度を求めた。
(４) キシロオリゴ糖の分析方法
キシロオリゴ糖の分析にはイオンクロマトグラフィー（ダイオネクス社）を用いた。分析には糖類の分析に適したカラムとしてＣａｒｂｏＰａｃＰＡ−１０（ダイオネクス社）を用いた。
(５) 酵素力価の定義
酵素として用いたキシラナーゼの活性測定にはカバキシラン（シグマ社製）を用いた。酵素力価の定義はキシラナーゼがキシランを分解することで得られる還元糖の還元力をＤＮＳ法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）を用いて測定し、１分間に１マイクロモルのキシロースに相当する還元力を生成させる酵素量を１ユニットとした。
【００１９】
前述で得られた中性キシロオリゴ糖ＸＮ５を含有する水溶液を作成し、これを用いた以下の実験により、本発明の脂肪細胞分化抑制剤の評価試験を行なった。その方法を以下に示す。
【００２０】
＜評価試験＞
継代培養したマウス由来前駆脂肪細胞（3Ｔ3-Ｌ1）をＤＭＥ培地（１０％コウシ血清含有）に懸濁後（細胞密度５ｘ１０４／ｍｌ）、９６ウエルプレートの各ウエルに２００μｌ添加し３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
培養開始から２日目にデキサメタゾン（０．５ｍＭ）、メチルイソブチルキサンチン（１μＭ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥ培地（１０％コウシ血清含有）に置き換え、上記と同様の条件で培養した。
培養開始から４日目にインシュリン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥ培地（１０％コウシ血清含有）に置き換え、上記と同様の条件で２日毎に培地交換を行い培養した。
培養開始から１３日目に培地を取り除き、細胞にオイルレッドを添加し、中性脂肪を染色した。染色された色素を細胞より抽出し、吸光度（５２０ｎｍ）を測定した。また、細胞内のＧＰＤＨ(グリセロール３リン酸脱水素酵素)活性を測定した。
なお、培養開始から２日目から培養終了日まで、中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）を、最終濃度が各々１％、０．１％、０．０１％となるように添加した３種類の培地を用いて培養を行なった。コントロールとして蒸留水を添加した培地を用いて培養を行なった。
また、中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）が上記濃度範囲においてマウス由来前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）に対して細胞毒性のないことをＭＴＴアッセイキット（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭ社）を用いてあらかじめ確認した。
細胞内の脂肪蓄積抑制率の結果を表１に示す。また、細胞内のＧＰＤＨ活性抑制率（コントロールを１００とした場合の相対値）を表２に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
表１、及び表２より、中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）を添加した試験区では、コントロールと比較し、細胞内の脂肪含量が低く、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化により誘導されるＧＰＤＨ活性が低いことが示されている。
即ち、本発明の中性キシロオリゴ糖は、脂肪細胞分化抑制効果を有することは明らかである。
【００２４】
なお、前述の調製例により得られた中性キシロオリゴ糖の安全性試験（皮膚刺激性試験、急性経口毒性試験）、及び、安定性試験を以下の方法により実施した。
（１）皮膚刺激性試験
２質量％の中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）水溶液１００μｌを、各々、除毛後のＣ３Ｈマウス（雄、６週齢、日本チャールズリバー（株）製）の背皮に、約１ヶ月間、連続塗布した（１回／日、各群１０匹）。
塗布期間及び塗布終了後の２週間、マウス背皮において、紅斑、浮腫、炎症等の異常は特に観察されなかった。また、ブランク（水塗布群）と比較し、体重推移においても有意差（Ｐ＜０.０５）が認められなかった。
【００２５】
（２）急性経口毒性試験
中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）水溶液を、ＩＣＲ系マウス（雄、６週齢、日本チャールズリバー（株）製）に胃ゾンデを用いて、経口投与した（投与量：２ｇ／マウス体重１ｋｇ、各群１０匹）。
投与してから２週間後まで、死亡例はなかった。又、体重推移においてもブランク（水投与群）と比較し、有意差（Ｐ＜０.０５）が認められなかった。
【００２６】
（３）安定性試験
中性キシロオリゴ糖（ＸＮ５）水溶液（１％濃度）を調製後、室温で保存した。調製直後、及び、１ヶ月保存後の中性キシロオリゴ糖水溶液をイオンクロマトグラムで分析した。
１ケ月保存後のサンプルのクロマトグラムのパターンは、調製直後のサンプルと比較して変化はなかった。又、クロマトグラムの各ピークの面積の差は、１ケ月保存後のサンプルと調製直後のサンプルの間で、５％未満であった。
【００２７】
上記（１）〜（３）の試験により、本発明の中性キシロオリゴ糖の安全性及び安定性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明により、脂肪細胞分化抑制作用に優れ安全性の高い脂肪細胞分化抑制剤が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中性キシロオリゴ糖を有効成分とする脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項２】
前記中性キシロオリゴ糖が、リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖とリグニンの複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理することによって得られたものであることを特徴とする請求項１に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項１】
中性キシロオリゴ糖を有効成分とする脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項２】
前記中性キシロオリゴ糖が、リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖とリグニンの複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理することによって得られたものであることを特徴とする請求項１に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【公開番号】特開２００９−１３０８８（Ｐ２００９−１３０８８Ａ）
【公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１７４８０９（Ｐ２００７−１７４８０９）
【出願日】平成１９年７月３日（２００７．７．３）
【出願人】（０００１２２２９８）王子製紙株式会社 (2,055)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月３日（２００７．７．３）
【出願人】（０００１２２２９８）王子製紙株式会社 (2,055)
【Ｆターム（参考）】
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