脂肪組織の肥大を制限するための化粧品用又は医薬用の組成物におけるハロプテリス（Ｈａｌｏｐｔｅｒｉｓ）属に属する褐藻類の抽出物の使用法及びそれに対応する化粧品用又は医薬用の組成物。
【構成】 本発明は、前脂肪細胞の分化への作用によって脂肪組織の肥大を制限するための化粧品用又は医薬用の組成物におけるハロプテリス属（Halopteris）またはスファセラリア属（Sphacelaria）に属する褐藻類の抽出物の使用法に関する。また、藻類ハロプテリス (Halopteris)の抽出物を、脂肪分解を促進する作用剤（例えば、ホスホジエステラーゼの阻害剤又はアドレナリンレセプターをブロックする作用剤など）、及び／又は脂質生成を阻害する作用剤（例えば、脂肪酸合成酵素の阻害剤又はグルコース貫入レセプターをブロックする作用剤など）などのやせることを目的とした美容製剤に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品用又は医薬用の組成物における、脂肪組織の肥大を制限するための藻類の抽出物の使用法に関する。また、本発明は、脂肪組織の肥大を制限するための前記化粧品用又は医薬用の組成物に関する。
【発明の開示】
【０００２】
脂肪組織は結合マトリックスから形成され、基本的に皮下組織の脂肪細胞又はトリグリセリドの形態で豊富な脂質胞を覆う細胞である脂肪細胞から構成されている。これらの脂肪細胞の代謝活性は、第一に脂質生成というトリグリセリド合成ステップと、第二にエネルギー目的のため生物の他の細胞によって使用される血中脂肪酸へ放出される脂肪分解というトリグリセリド加水分解ステップとからなる。
【０００３】
脂肪組織の肥大を制限するため、細胞内のトリグリセリドの脂肪分解又は細胞外への脂肪酸及びグリセロールの再放出のどちらか一方を促進させることによって、又は逆に新しいトリグリセリドの脂質生成を阻害することによって、脂肪部位に作用可能な物質の使用法が知られている。体形を整えるため、この活性型を有する植物の抽出物を化粧品用又は医薬用の組成物に用いることができる。
【０００４】
一例として、単離されたヒト皮下脂肪細胞の脂肪分解を促進する効果を試験管内で示す、褐藻類ラミナリア ディギタータ（Laminaria digitata）の水溶性抽出物が記載されている特許文献ＦＲ−Ａ−２６９３ ９１７が挙げられる。また、脂肪分解の促進活性を有するマンゴスチン（Garcinia mangostana）の種子の脂質抽出物が記載されているＦＲ−Ａ−２７７４ ９０５が挙げられる。
【０００５】
さらに一例として、単離されたヒト皮下脂肪細胞において脂肪酸の新合成を阻害する作用及びそのため脂質生成を阻害する作用を示す、（多価不飽和脂肪酸の高い含有量を有する）微小藻類オドンテラアウリタ（Odontella aurita）の脂質抽出物が記載されている特許文献ＦＲ−Ａ−２ ７９５ ９５８が挙げられる。また、同様な効果を示す（フィトステロールを多く含有する）ポリゴニウムフォゴプリウム(Polygonum fogopyrum)の種子の脂質抽出物が記載されている特許文献ＦＲ−Ａ−２８１７ １５０が挙げられる。
【０００６】
本発明は、より詳細にはハロプテリス(Halopteris)属（スファセラリア(Sphacelaria)目）に属する褐藻類に関する。一例としては、スファセラリア スコパリア（Sphacelaria scoparia）とも称す藻類ハロプテリス スコパリア（Halopteris scoparia）がある。本発明は、脂肪組織の肥大を制限するための化粧品用又は医薬用の組成物におけるハロプテリス(Halopteris)属に属する褐藻類の抽出物の使用法に関する。好ましくは、この藻類は藻類ハロプテリススコパリア（Halopteris scoparia）である。
【０００７】
意外にも、この抽出物は脂質再生の阻害又はトリグリセリドの脂肪分解の促進の何れの有効な作用も有さないことを示す可能性がある。
【０００８】
また、次に示されるように、前脂肪細胞と称され、増殖する唯一の細胞である、脂肪前駆細胞から単独でトリグリセリドを蓄積できる成熟脂肪細胞への形成に、この抽出物が作用することが示されている。前脂肪細胞から成熟脂肪細胞へのこの変化は、細胞分化と呼ばれる。つまり、ハロプテリス(Halopteris)属（又はスファセラリア(Sphacelaria)）に属する褐藻類の抽出物は、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化において阻害する作用を有する。
【０００９】
一般論として、細胞分化は、ホルモン，サイトカイン，成長因子，ビタミン等の細胞が見出される環境下に存在する脂質生成因子によって、通常、正又は負に調節される。それは、一つ以上のこれらの脂質生成の制御因子の濃度の増加又は減少によって生じる。これらの制御因子は、いわゆる自己分泌制御による場合である前脂肪細胞それ自体によって、又は、いわゆる傍分泌制御による場合である周辺細胞によって、或いはまた、いわゆる内分泌制御による場合である離れて存在するが血液により前脂肪細胞へ結合される細胞によって生成される。脂肪細胞の場合、前脂肪細胞は線維芽細胞型の細胞であり、その環境要因に従って、脂肪組織での脂肪細胞へ、又は、骨組織中の骨芽細胞へ分化する。
【００１０】
著者：オオスミ Ｊ，ミヤダイ Ｋ及びイトオ Ｙ、題名：「インターロイキン−１１／脂肪細胞生成の阻害因子による３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でのリポタンパクリパーゼ合成の制御」、Biochem.Mol.In, 1994, 32, ｐ705-712に掲載されている文献から、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）は、脂肪組織の分化を阻害する活性を有し、そのため負の脂肪細胞生成の要素を含むことが知られている。同様に、著者：Guo D，Donner D B、題名：「腫瘍壊死は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、リン酸化、及び、ホスファチジル・イノシトール３−キナーゼへのインスリン受容体基質１の結合を促進する」、J.Biol.Chem., 1996, 271: 615-618に掲載されている文献は、腫瘍壊死（ＴＮＦａ）のα因子のそのような効果を示した。
【００１１】
分化を促進する脂肪細胞化因子の中で、インスリン及びインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ），グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ），ステロールＣｏＡ不飽和化酵素（ＳＣＤ），或いはヒト脂肪細胞の表面に発現するグルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ‐４）及び脂肪酸トランスポーター（ＦＡＢＰ）等の膜タンパクなどの脂肪細胞分化のマーカーの発現を増加させる（著者：Moustaid N、Jones B H及びTaylor J W、題名：「インスリンは、初代培養のヒト脂肪細胞において脂肪合成酵素の活性を上昇させる」、J. Nutr., 1996, 126:865-870に掲載されている文献を参照。）
成熟脂肪細胞は、特にレプチン及びアディポネクチンなどの脂肪細胞に特異的なホルモンに該当すると考えられる分泌因子を生産し、分泌する。また、後者は、J. Bio. Chem, 1995, 270 26746-9に開示されたScherneらによる文献によると、Ａｃｒｐ ３０（３０ｋＤａの脂肪細胞の補体関連タンパク質）であり、又は、J. Bio. Chem, 1996, 271 10697-703に開示されたHuらによる文献によると、マウスで示されたＡｄｉｐｏＱである。NakanoらによるJ. Biochem, 120, ページ803-812で公表された文献によると、ヒト血漿において同様のタンパクが明らかにされ、ＧＢＰ２８（２８ｋＤａのゼラチン結合タンパク）又はＡＰＭ１（Adipose Most Abundant Gene Transcript１、脂肪組織に高発現する遺伝子１）と名付けられた。
【００１２】
藻類ハロプテリス(Halopteris)属、特に藻類ハロプテリス(Halopteris)（又はスファセラリア(Sphacelaria)）スコパリア（scoparia）の抽出物が与える脂肪細胞の分化に基づく阻害作用を研究するために行われた研究結果を以下に示す。
【００１３】
これを行うため、脂肪細胞として誘導された３Ｔ３−Ｌ１の前脂肪細胞株における藻類ハロプテリス(Halopteris)（又はスファセラリア(Sphacelaria)）スコパリア（scoparia）の抽出物の作用を研究する。
【００１４】
藻類ハロプテリス スコパリア(Halopterisscoparia)の抽出物は、本研究では、溶媒存在下で乾燥又は凍結乾燥した藻類の浸漬によって得られた水溶性抽出物である。溶媒は、例えばジプロピレングリコール又はグリセロールのような共溶媒と水の混合物である。水と共溶媒の間の割合は、０から８０％の間であり、好ましくは、３０から５０％の間である。溶媒が水のみからなってもよいことは注目すべきことである。
【００１５】
既知の文献、特に、著者：MacDougald O A及びLane M D、題名：「脂肪細胞分化の間の遺伝子発現の転写制御」、Annu. Rev. Biochem., 1995, 64 : 345-373に掲載されている文献に従って、脂肪細胞として誘導される前脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１株における抽出物の作用に関する研究を行う。
【実施例】
【００１６】
以下に簡単にこのプロトコルを述べる。２ｍＭのグルタミン，４．５ｇ／ｌのグルコース，０．１１ｇ／ｌのピルビン酸ナトリウム，１０％のウシ血清（ＳＶＤ）及び抗体（１ｍｌの培地中に５０Ｕペニシリン及び５０μｇのストレプトマイシン）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる培地で、３Ｔ３−Ｌ１株の前脂肪細胞を保持した。以下の方法で、脂肪細胞としての分化が起きた。最初に、２日間でコンフルエンスに達した前脂肪細胞を培養した。以下のＤ０の時において、培地を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含み、０．２５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、０．２５μＭのデキサメタゾン及び１．７４μＭのインスリンを添加したＤＭＥＭから構成される分化誘導培地（ＤＩＭ）と交換した。インキュベーション２日後、つまりＤ２の時において、誘導培地を注意しながら回収し、１０％のＦＣＳ及び０．１７４μＭのインスリンを含む新しい培地と交換した。次に、２日ごとに培地を新しくした。
【００１７】
培養７日後、オイルレッド（Ｏｉｌ Ｒｅｄ）で染色することによって、前脂肪細胞の脂質含有量を評価した。より詳しくは、前脂肪細胞を、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、オイルレッド着色溶媒（イソプロパノール／水の混合液中に０．５％）で１０分間インキュベートした。１０分後、シャーレ一面に増殖した細胞（cellular carpet）を水ですすぎ、純イソプロパノールで前脂肪細胞を溶解させた。培地の吸光度（ＯＤ）を５４０ｎｍで測定した。
【００１８】
０日目（Ｄ０）に開始され、ＤＩＭによる誘導期間中、褐藻類ハロプテリス スコパリア(Halopterisscoparia)の抽出物を３Ｔ３−Ｌ１細胞で検査した。
【００１９】
第１実施例において、分化の開始時（Ｄ０の時）からこの抽出物を添加し、２日ごと（つまり、Ｄ２及びＤ４の時）に新しい培地に交換し、細胞が固定される（Ｄ７の時）まで培地中に保持した。以下の３つの濃度：０．４％，１％及び２．５％で抽出物を試験した。著者：Stone R L及びBerlnohr D A、題名：「レチノイン酸による３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への変換の阻害の分子的基礎」、Differentiation, 1990, 45:119-127に掲載されている文献中で具体的に述べられているように、同様な方法で前脂肪細胞から脂肪細胞への分化を阻害することが知られている１０μＭのレチノイン酸を用いた。
【００２０】
以下の表１に第１実施例の結果を示す。また、対応するグラフを図１に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
それらの濃度のハロプテリス抽出物が細胞毒性を示さないことは注目すべきである。ＭＴＴ中におけるホルマザン結晶への還元を測定する従来の方法により、３Ｔ３−Ｌ１細胞における抽出物の毒性の不在を評価した（具体的には、著者：Mosmann T、題名：「細胞成長及び生存のための簡易な比色分析：増殖と細胞毒性評価への応用」、J .Immunol. Methods, 1983, 65: 55-63に掲載されている文献を参照）。より詳細には、抽出物とのインキュベーション後、細胞をすすぎ、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で０．５ｍｇ／ｍｌに調製されたＭＴＴ溶液中において３時間インキュベートした。インキュベーション後、前脂肪細胞をＰＢＳ中ですすぎ、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）中で溶解した。吸光度（ＯＤ）を５４０ｎｍで測定した。
【００２３】
第２実施例において、開始（Ｄ０）から抽出物を添加したが、第１実施例と異なり、その後新しい培地と交換しなかった。つまり、Ｄ７時で固定されるまで、Ｄ２時又はＤ４時の誘導後においても新しい培地と交換しなかった。同時に、Ｄ２時からＤ７時において、培養液を抽出物で処理し、Ｄ４時に新しい培地と交換した。
【００２４】
以下の表２にこれらの第２実施例の結果を示す。また、対応するグラフを図２に示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】
上記で述べられているように、本実施例において比較対照培養として、１０μＭで試験されたレチノイン酸の不在下又は存在下で、（１０％ＳＶＤを有する培地で培養された）非誘導細胞と、ＤＩＭ培地において誘導された細胞を作成した。実際、後者（レチノイン酸の存在）は、前脂肪細胞から脂肪細胞への分化を阻害することが知られている。
【００２７】
分化誘導培地（ＤＩＭ）の不在下では、大多数の細胞が前脂肪細胞のままであったことが記された。オイルレッドによる脂質の染色後、ごく少数の細胞が顕微鏡下で確認できる脂肪滴を自発的に生産した。
【００２８】
同様に、２日間の誘導培地ＤＩＭの存在下では、オイルレッドによる染色後、大多数の細胞が多数の脂肪滴を含むことがわかった。
【００２９】
これらの実施例の結果を以下に述べる。
【００３０】
０．４％，１％，１．５％（ｖ／ｖ）で試験されたハロプテリス スコパリアの抽出物は、前脂肪細胞から脂肪細胞への分化をそれぞれ２８％，７８％，１２５％阻害した。図１で示されるように、この阻害効果は用量依存的関係に従う。
【００３１】
２．５％の抽出物について１００％を超える阻害が測定されることがわかり、これは、分化誘導培地（ＤＩＭ）の不在下において、少数の細胞で自然に発生した脂肪滴の形成を阻害することを示す。
【００３２】
同じ実験条件下で、１０μＭの量のレチノイン酸の存在は、脂肪滴の発生を非常に強く制限する。すなわち、細胞は前脂肪細胞の形態のままであり、脂肪細胞へ分化しないことがわかる。
【００３３】
ＤＩＭによる誘導のわずか２日間（すなわち、Ｄ０の時からＤ２の時まで）、１％（ｖ／ｖ）で試験されたハロプテリス抽出物の存在は、脂肪細胞への分化を阻害するのに十分である。培養している間（すなわち、Ｄ０の時からＤ７の時まで）、抽出物が存在する場合の７２％に対して４３％を阻害した。分化誘導（すなわち、Ｄ２の時からＤ７の時まで）後、抽出物を細胞と接触させた場合、明らかに低い阻害効果（１５％のみの阻害）を示した（表２を参照）。
【００３４】
これらの結果は、分化の開始から抽出物が存在することの重要性を示している。同様の実験条件で、１０μMのレチノイン酸で試験し、同様の効果を得られる（表２を参照）。Xue J C、Schwarz E J、Chawla A及びLazar M Aによって、「ＰＰＡＲガンマの誘導後、レチノイドの分化の阻害によって、脂肪合成における重要な段階」という題名で、Mol. Cell. Biol., 1996, 16:1567-1575という文献中に、分化を誘導するためレチノイン酸を加える時間の重要性大きく記載されていることは注目すべきことである。
【００３５】
これらの実験の結果から、ハロプテリス スコパリアの抽出物が脂質合成（脂質生成）の阻害剤というよりむしろ真の分化の阻害剤として作用するということをこれで結論付けることができる。
【００３６】
記載された結果を立証するため、分化した脂肪細胞に通常発現するマーカーをコードする遺伝子の発現に関して、３Ｔ３−Ｌ１株の前脂肪細胞におけるハロプテリス スコパリアの抽出物の作用を研究する新たな実験を行った。
【００３７】
そのため、培養期間の前に、Ｄ０と称される時までの２日間でコンフルエンスに達した前脂肪細胞を使用した。その後、比較対照として利用可能な培地を配置する。Ｄ０の時に、ハロプテリス抽出物の存在下又は不在下において、培地を分化誘導培地ＤＩＭと交換する。
【００３８】
Ｄ４とＤ７の時（それぞれ、Ｄ０+４日とＤ０+７日）に、提供者に推奨されたプロトコルに従い適切な試薬（この場合Ｔｒｉ−試薬）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＤＮＡを取り除いた（ＤＮＡフリーシステム、Ambion社）。アガロースゲルでＤＮＡの特性を確認した。開始因子であるオリゴ（ｄＴ）と酵素スパースクリプト（Superscript）ＩＩ（Gibco社）の存在下で、ｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）反応を行った。蛍光によってｃＤＮＡ合成を定量化し、２０ｎｇ／ｍｌの濃度に調製した。ロシュモレキュラー システム社の「ライトサイクラー」システムで、提供者に推奨されたプロトコルに従い、定量的ＰＣＲによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。複製されたＤＮＡの中に組み込まれた蛍光性物質をＰＣＲサイクルの間、継続的に測定し、各々実験されるマーカーに対する相対発現量を得ることを可能とする。
【００３９】
脂肪酸（ＦＡＢＰ４）を結合する細胞質のタンパクをコードする遺伝子４２２／ａＰ２の発現を調節する転写因子ＰＰＡＲｇ（Peroxisome proliferator activated receptor gamma、ペルオキシゾーム誘導剤活性化受容体ガンマ）の発現、ｃ／ＥＢＰａ，ｃ／ＥＢＰｂ，ｃ／ＥＢＰｇ（ＣＡＡＴ−エンハンサー−結合タンパク質アルファ，ベータ，ガンマ）といったタンパクと同様に、酵素ＦＡＳ（脂肪酸合成酵素）をコードする遺伝子の発現をコントロールする転写因子ＳＲＥＢＰ１（Sterol Response Element Binding Protein、ステロール反応成分結合タンパク質）の発現に関する研究を行った。ｃ／ＥＢＰａ因子は、ステアリン酸ＣｏＡ不飽和化酵素タイプ１（ＳＣＤ１）及びグルコース受容体（ＧＬＵＴ−４）の遺伝子の発現を調節する。また、脂肪酸トランスポーター（脂肪酸転移酵素又はＦＡＴ）の発現を研究した。
【００４０】
４日目と７日目の第２の培地の誘導期間に関して、３種の培地（対照培地，誘導培地のみが存在する培地，誘導培地と抽出物が存在する培地）で得られた結果を下記に示す。
【００４１】
誘導の４日後、ｃ／ＥＢＰａの発現は、誘導されていない対照と比較して、１０．４倍増加した。抽出物の存在下では、ｃ／ＥＢＰａの発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、３３％減少した。誘導の７日後、ｃ／ＥＢＰａの発現は、誘導されていない対照と比較して、２７．７倍増加した。抽出物の存在下では、ｃ／ＥＢＰａの発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、３７％減少した。
【００４２】
誘導の４日後、ＳＲＥＢＰ１の発現は、誘導されていない対照と比較して、１．９倍（＋８８％）増加した。抽出物の存在下では、ＳＲＥＢＰ１の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、２１％減少した。誘導の７日後、ＳＲＥＢＰ１の発現は、誘導されていない対照と比較して、２．７倍（＋１６６％）増加した。抽出物の存在下では、ＳＲＥＢＰ１の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、３１％減少した。
【００４３】
誘導の４日後、酵素ＦＡＳの発現は、誘導されていない対照と比較して、有意に増加しなかった。しかし、抽出物の存在下では、酵素ＦＡＳの発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、４７％減少した。誘導の７日後、酵素ＦＡＳの発現は、誘導されていない対照と比較して、８．３倍増加した。抽出物の存在下では、酵素ＦＡＳの発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、５８％減少した。
【００４４】
誘導の４日後、ＳＣＤ１転写因子の発現は、誘導されていない対照と比較して、１４倍増加した。抽出物の存在下では、ＳＣＤ１の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、２５％減少した。誘導の７日後、ＳＣＤ１の発現は、誘導されていない対照と比較して、５６７倍増加した。抽出物の存在下では、ＳＣＤ１の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、２７％減少した。
【００４５】
誘導の４日後、ＦＡＴの発現は、誘導されていない対照と比較して、１３２９倍増加した。抽出物の存在下では、ＦＡＴの発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、ＦＡＴの発現を４４％減少させた。誘導の７日後、ＦＡＴの発現は、誘導されていない対照と比較して、１５２８倍増加した。抽出物の存在下では、ＦＡＴの発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、５６％減少した。
【００４６】
誘導の４日後、ＧＬＵＴ−４の発現は、誘導されていない対照と比較して、２８１倍増加した。抽出物の存在下では、ＧＬＵＴ−４の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、３７％減少した。誘導の７日後、ＧＬＵＴ−４の発現は、誘導されていない対照と比較して、３０７９倍増加した。抽出物の存在下では、ＧＬＵＴ−４の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、２３％減少した。
【００４７】
予想される結果と一致して、ハロプテリス抽出物の不在下でのＤＩＭ誘導培地による分化は、対照である培地と比較して、程度の差はあるものの前脂肪細胞の脂肪細胞への分化のマーカーを全て増加した。
【００４８】
上記で与えられた結果は、ハロプテリス スコパリアの抽出物が、多くの脂肪細胞の分化マーカーの発現を改変することを示すことができる。具体的には、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、ｃ／ＥＢＰａ転写因子の発現を（誘導の４日後に３３％、誘導の７日後に３７％）減少させ、また、ＳＲＥＢＰ１の発現を（誘導の４日後に２１％、誘導の７日後に３１％）減少させ、酵素ＦＡＳの発現を（誘導の４日後に４７％、誘導の７日後に５８％）減少させ、酵素ＳＣＤ１の発現を（誘導の４日後に２５％、誘導の７日後に２７％）減少させ、脂肪酸トランスポーターＦＡＴの発現を（誘導の４日後に４４％、誘導の７日後に５６％）減少させ、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ−４の発現を（誘導の４日後に３７％、誘導の７日後に２３％）減少させ、脂肪細胞タンパク質結合脂肪酸ＦＡＢＰ４（誘導の４日後に１８％）減少させた。一方、ハロプテリス抽出物は、ＰＰＡＲｇ因子において任意の有意な効果を示さなかった。しかしながら、ハロプテリス抽出物は、ＰＰＡＲｇ因子の調節下にある２つの遺伝子の発現を改変する。つまり、ＦＡＢＰ４の発現を（少なくとも一時的に）減少させる。
【００４９】
また、マイクロタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）の発現を減少させた。誘導の７日後、誘導培地によって誘導されたＬＰＬの発現は、抽出物の存在下で６６％減少した。
【００５０】
また、誘導の４日後、ＣＯＬ１の発現が、誘導されていない対照と比較して、７０％減少したことを示した。抽出物の存在下で、この発現は、誘導されていない対照と比較して、わずか４６％減少し、抽出物の不在下で誘導した脂肪細胞と比較して、７９％増加したことを意味する。誘導の７日後、ＣＯＬ１の発現は、誘導されていない対照と比較して、８０％減少した。抽出物の存在下で、その発現は、誘導されていない対照と比較して、５９％減少し、抽出物の不在下で誘導した脂肪細胞と比較して、２倍増加したことを意味する。
【００５１】
誘導の４日後、ＣＯＬ４の発現は、誘導されていない対照と比較して、３．１倍増加した。抽出物の存在下では、ＣＯＬ４の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、１６％増加した。誘導の７日後、ＣＯＬ４の発現は、誘導されていない対照と比較して、２．６倍増加した。抽出物の存在下では、ＣＯＬ４の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、１７％増加した。
【００５２】
このため、誘導培地ＤＩＭの添加により、コラーゲンタイプ１（ＣＯＬ１）の発現は減少した。このコラーゲンは、真皮中に最も豊富に存在する。それは、主な性質が引張強度である厚い線維を形成する。このコラーゲンは、線維芽細胞，また軟骨細胞，骨芽細胞によって主に生産される。これらの細胞は、脂肪細胞のような線維芽細胞から得る。このコラーゲンは、お互いに結合した脂肪細胞を保つことを可能とする。それゆえ分化の間、前脂肪細胞がコラーゲンタイプ１を生成するための能力を失う。一方、成熟脂肪細胞はコラーゲンタイプ４（ＣＯＬ４）を生産する。これは繊維を形成せず、基底層、特に真皮表皮基底膜で非組織化形状の形態にある。ＣＯＬ４は、支持組織（真皮）と上皮組織（表皮）との間の中間に位置し、ろ過支持体として機能する。ＣＯＬ４は、上皮細胞（ケラチノサイト）と内皮細胞によって作られ、また、脂肪細胞によっても生産される。
【００５３】
抽出物は、コラーゲンの発現を改変するとみてもよく、通常分化の間に観察されるコラーゲンタイプ１（ＣＯＬ１）の喪失を低減させる。ＣＯＬ１の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して（誘導の４日後に７９％、誘導の７日後に５９％）増加する。さらに、抽出物は、脂肪細胞への分化中に通常増加するコラーゲンタイプ４（ＣＯＬ４）の発現を抑制しない。抽出物は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、ＣＯＬ４の発現を（誘導の４日後に１６％、誘導の７日後に１７％）増加させる。
【００５４】
従って、ＲＴＰＣＲ法による脂肪細胞への分化の発現遺伝子の分析によって、前脂肪細胞の成熟細胞への分化におけるハロプテリス スコパリア抽出物の阻害作用を確認した。また、この作用が、分化のある特定のマーカーに限定されることを示す。さらに、それは、コラーゲンタイプ１（ＣＯＬ１）の高レベルを保持し、コラーゲンタイプ４（ＣＯＬ４）の発現を誘発する。この作用は興味深く、脂肪分解剤による脂肪組織の攻撃の後、皮膚組織を制限するための必要性に関する。
【００５５】
また、ハロプテリス スコパリア抽出物（１％）は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、アディポネクチンの発現を７０％減少させる。
【００５６】
従って、本発明は、前脂肪細胞の分化への作用によって脂肪組織の肥大を制限するための化粧品用又は医薬用の組成物におけるハロプテリス属（Halopteris）に属する褐藻類の抽出物の使用法に関する。前記藻類は、好ましくは藻類ハロプテリス スコパリア（Halopteris scoparia）である。
【００５７】
さらに、好適な一実施形態によれば、前記抽出物は、乾燥又は凍結乾燥された藻類を、水又は共溶媒と水の混合液などの溶媒の存在下に浸漬することによって得られる。前記共溶媒は、ジプロピレングリコール又はグリセロールであってもよく、前記水と共溶媒の比率は、０〜８０％、好ましくは３０〜５０％である。
【００５８】
また、本発明は、作用物質として、脂肪細胞の分化を阻害するように作用するハロプテリス（Halopteris）属に属する褐藻類の抽出物を少なくとも一つ含むことを特徴とする脂肪組織の肥大を制限するための化粧品用又は医薬用の組成物に関する。前記藻類は、好ましくは藻類ハロプテリス スコパリア(Halopterisscoparia)又はスファセラリア スコパリア（Sphacelaria scoparia）である。
【００５９】
前記抽出物は、好ましくは乾燥又は凍結乾燥された藻類を、水又は共溶媒と水の混合液などの溶媒の存在下に浸漬することによって得られる。前記共溶媒は、ジプロピレングリコール又はグリセロールであってもよく、前記水と共溶媒の比率は、０〜８０％、好ましくは３０〜５０％である。
【００６０】
本発明の別の特徴によれば、藻類ハロプテリス (Halopteris)の抽出物を、脂肪分解を促進する作用剤（例えば、ホスホジエステラーゼの阻害剤又はアドレナリンレセプターをブロックする作用剤など）、及び／又は脂質生成を阻害する作用剤（例えば、脂肪酸合成酵素の阻害剤又はグルコース貫入レセプターをブロックする作用剤など）などのやせることを目的とした美容製剤に関する。
【００６１】
また、本発明は、前脂肪細胞の分化を阻害することによって、脂肪組織の肥大を制限することを目的とした上述の美容製剤の使用法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、第１実施例の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、第２実施例の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品用又は医薬用の組成物における、脂肪組織の肥大を制限するための藻類の抽出物の使用法に関する。また、本発明は、脂肪組織の肥大を制限するための前記化粧品用又は医薬用の組成物に関する。
【発明の開示】
【０００２】
脂肪組織は結合マトリックスから形成され、基本的に皮下組織の脂肪細胞又はトリグリセリドの形態で豊富な脂質胞を覆う細胞である脂肪細胞から構成されている。これらの脂肪細胞の代謝活性は、第一に脂質生成というトリグリセリド合成ステップと、第二にエネルギー目的のため生物の他の細胞によって使用される血中脂肪酸へ放出される脂肪分解というトリグリセリド加水分解ステップとからなる。
【０００３】
脂肪組織の肥大を制限するため、細胞内のトリグリセリドの脂肪分解又は細胞外への脂肪酸及びグリセロールの再放出のどちらか一方を促進させることによって、又は逆に新しいトリグリセリドの脂質生成を阻害することによって、脂肪部位に作用可能な物質の使用法が知られている。体形を整えるため、この活性型を有する植物の抽出物を化粧品用又は医薬用の組成物に用いることができる。
【０００４】
一例として、単離されたヒト皮下脂肪細胞の脂肪分解を促進する効果を試験管内で示す、褐藻類ラミナリア ディギタータ（Laminaria digitata）の水溶性抽出物が記載されている特許文献ＦＲ−Ａ−２６９３ ９１７が挙げられる。また、脂肪分解の促進活性を有するマンゴスチン（Garcinia mangostana）の種子の脂質抽出物が記載されているＦＲ−Ａ−２７７４ ９０５が挙げられる。
【０００５】
さらに一例として、単離されたヒト皮下脂肪細胞において脂肪酸の新合成を阻害する作用及びそのため脂質生成を阻害する作用を示す、（多価不飽和脂肪酸の高い含有量を有する）微小藻類オドンテラアウリタ（Odontella aurita）の脂質抽出物が記載されている特許文献ＦＲ−Ａ−２ ７９５ ９５８が挙げられる。また、同様な効果を示す（フィトステロールを多く含有する）ポリゴニウムフォゴプリウム(Polygonum fogopyrum)の種子の脂質抽出物が記載されている特許文献ＦＲ−Ａ−２８１７ １５０が挙げられる。
【０００６】
本発明は、より詳細にはハロプテリス(Halopteris)属（スファセラリア(Sphacelaria)目）に属する褐藻類に関する。一例としては、スファセラリア スコパリア（Sphacelaria scoparia）とも称す藻類ハロプテリス スコパリア（Halopteris scoparia）がある。本発明は、脂肪組織の肥大を制限するための化粧品用又は医薬用の組成物におけるハロプテリス(Halopteris)属に属する褐藻類の抽出物の使用法に関する。好ましくは、この藻類は藻類ハロプテリススコパリア（Halopteris scoparia）である。
【０００７】
意外にも、この抽出物は脂質再生の阻害又はトリグリセリドの脂肪分解の促進の何れの有効な作用も有さないことを示す可能性がある。
【０００８】
また、次に示されるように、前脂肪細胞と称され、増殖する唯一の細胞である、脂肪前駆細胞から単独でトリグリセリドを蓄積できる成熟脂肪細胞への形成に、この抽出物が作用することが示されている。前脂肪細胞から成熟脂肪細胞へのこの変化は、細胞分化と呼ばれる。つまり、ハロプテリス(Halopteris)属（又はスファセラリア(Sphacelaria)）に属する褐藻類の抽出物は、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化において阻害する作用を有する。
【０００９】
一般論として、細胞分化は、ホルモン，サイトカイン，成長因子，ビタミン等の細胞が見出される環境下に存在する脂質生成因子によって、通常、正又は負に調節される。それは、一つ以上のこれらの脂質生成の制御因子の濃度の増加又は減少によって生じる。これらの制御因子は、いわゆる自己分泌制御による場合である前脂肪細胞それ自体によって、又は、いわゆる傍分泌制御による場合である周辺細胞によって、或いはまた、いわゆる内分泌制御による場合である離れて存在するが血液により前脂肪細胞へ結合される細胞によって生成される。脂肪細胞の場合、前脂肪細胞は線維芽細胞型の細胞であり、その環境要因に従って、脂肪組織での脂肪細胞へ、又は、骨組織中の骨芽細胞へ分化する。
【００１０】
著者：オオスミ Ｊ，ミヤダイ Ｋ及びイトオ Ｙ、題名：「インターロイキン−１１／脂肪細胞生成の阻害因子による３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でのリポタンパクリパーゼ合成の制御」、Biochem.Mol.In, 1994, 32, ｐ705-712に掲載されている文献から、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）は、脂肪組織の分化を阻害する活性を有し、そのため負の脂肪細胞生成の要素を含むことが知られている。同様に、著者：Guo D，Donner D B、題名：「腫瘍壊死は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、リン酸化、及び、ホスファチジル・イノシトール３−キナーゼへのインスリン受容体基質１の結合を促進する」、J.Biol.Chem., 1996, 271: 615-618に掲載されている文献は、腫瘍壊死（ＴＮＦａ）のα因子のそのような効果を示した。
【００１１】
分化を促進する脂肪細胞化因子の中で、インスリン及びインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ），グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ），ステロールＣｏＡ不飽和化酵素（ＳＣＤ），或いはヒト脂肪細胞の表面に発現するグルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ‐４）及び脂肪酸トランスポーター（ＦＡＢＰ）等の膜タンパクなどの脂肪細胞分化のマーカーの発現を増加させる（著者：Moustaid N、Jones B H及びTaylor J W、題名：「インスリンは、初代培養のヒト脂肪細胞において脂肪合成酵素の活性を上昇させる」、J. Nutr., 1996, 126:865-870に掲載されている文献を参照。）
成熟脂肪細胞は、特にレプチン及びアディポネクチンなどの脂肪細胞に特異的なホルモンに該当すると考えられる分泌因子を生産し、分泌する。また、後者は、J. Bio. Chem, 1995, 270 26746-9に開示されたScherneらによる文献によると、Ａｃｒｐ ３０（３０ｋＤａの脂肪細胞の補体関連タンパク質）であり、又は、J. Bio. Chem, 1996, 271 10697-703に開示されたHuらによる文献によると、マウスで示されたＡｄｉｐｏＱである。NakanoらによるJ. Biochem, 120, ページ803-812で公表された文献によると、ヒト血漿において同様のタンパクが明らかにされ、ＧＢＰ２８（２８ｋＤａのゼラチン結合タンパク）又はＡＰＭ１（Adipose Most Abundant Gene Transcript１、脂肪組織に高発現する遺伝子１）と名付けられた。
【００１２】
藻類ハロプテリス(Halopteris)属、特に藻類ハロプテリス(Halopteris)（又はスファセラリア(Sphacelaria)）スコパリア（scoparia）の抽出物が与える脂肪細胞の分化に基づく阻害作用を研究するために行われた研究結果を以下に示す。
【００１３】
これを行うため、脂肪細胞として誘導された３Ｔ３−Ｌ１の前脂肪細胞株における藻類ハロプテリス(Halopteris)（又はスファセラリア(Sphacelaria)）スコパリア（scoparia）の抽出物の作用を研究する。
【００１４】
藻類ハロプテリス スコパリア(Halopterisscoparia)の抽出物は、本研究では、溶媒存在下で乾燥又は凍結乾燥した藻類の浸漬によって得られた水溶性抽出物である。溶媒は、例えばジプロピレングリコール又はグリセロールのような共溶媒と水の混合物である。水と共溶媒の間の割合は、０から８０％の間であり、好ましくは、３０から５０％の間である。溶媒が水のみからなってもよいことは注目すべきことである。
【００１５】
既知の文献、特に、著者：MacDougald O A及びLane M D、題名：「脂肪細胞分化の間の遺伝子発現の転写制御」、Annu. Rev. Biochem., 1995, 64 : 345-373に掲載されている文献に従って、脂肪細胞として誘導される前脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１株における抽出物の作用に関する研究を行う。
【実施例】
【００１６】
以下に簡単にこのプロトコルを述べる。２ｍＭのグルタミン，４．５ｇ／ｌのグルコース，０．１１ｇ／ｌのピルビン酸ナトリウム，１０％のウシ血清（ＳＶＤ）及び抗体（１ｍｌの培地中に５０Ｕペニシリン及び５０μｇのストレプトマイシン）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる培地で、３Ｔ３−Ｌ１株の前脂肪細胞を保持した。以下の方法で、脂肪細胞としての分化が起きた。最初に、２日間でコンフルエンスに達した前脂肪細胞を培養した。以下のＤ０の時において、培地を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含み、０．２５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、０．２５μＭのデキサメタゾン及び１．７４μＭのインスリンを添加したＤＭＥＭから構成される分化誘導培地（ＤＩＭ）と交換した。インキュベーション２日後、つまりＤ２の時において、誘導培地を注意しながら回収し、１０％のＦＣＳ及び０．１７４μＭのインスリンを含む新しい培地と交換した。次に、２日ごとに培地を新しくした。
【００１７】
培養７日後、オイルレッド（Ｏｉｌ Ｒｅｄ）で染色することによって、前脂肪細胞の脂質含有量を評価した。より詳しくは、前脂肪細胞を、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、オイルレッド着色溶媒（イソプロパノール／水の混合液中に０．５％）で１０分間インキュベートした。１０分後、シャーレ一面に増殖した細胞（cellular carpet）を水ですすぎ、純イソプロパノールで前脂肪細胞を溶解させた。培地の吸光度（ＯＤ）を５４０ｎｍで測定した。
【００１８】
０日目（Ｄ０）に開始され、ＤＩＭによる誘導期間中、褐藻類ハロプテリス スコパリア(Halopterisscoparia)の抽出物を３Ｔ３−Ｌ１細胞で検査した。
【００１９】
第１実施例において、分化の開始時（Ｄ０の時）からこの抽出物を添加し、２日ごと（つまり、Ｄ２及びＤ４の時）に新しい培地に交換し、細胞が固定される（Ｄ７の時）まで培地中に保持した。以下の３つの濃度：０．４％，１％及び２．５％で抽出物を試験した。著者：Stone R L及びBerlnohr D A、題名：「レチノイン酸による３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への変換の阻害の分子的基礎」、Differentiation, 1990, 45:119-127に掲載されている文献中で具体的に述べられているように、同様な方法で前脂肪細胞から脂肪細胞への分化を阻害することが知られている１０μＭのレチノイン酸を用いた。
【００２０】
以下の表１に第１実施例の結果を示す。また、対応するグラフを図１に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
それらの濃度のハロプテリス抽出物が細胞毒性を示さないことは注目すべきである。ＭＴＴ中におけるホルマザン結晶への還元を測定する従来の方法により、３Ｔ３−Ｌ１細胞における抽出物の毒性の不在を評価した（具体的には、著者：Mosmann T、題名：「細胞成長及び生存のための簡易な比色分析：増殖と細胞毒性評価への応用」、J .Immunol. Methods, 1983, 65: 55-63に掲載されている文献を参照）。より詳細には、抽出物とのインキュベーション後、細胞をすすぎ、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で０．５ｍｇ／ｍｌに調製されたＭＴＴ溶液中において３時間インキュベートした。インキュベーション後、前脂肪細胞をＰＢＳ中ですすぎ、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）中で溶解した。吸光度（ＯＤ）を５４０ｎｍで測定した。
【００２３】
第２実施例において、開始（Ｄ０）から抽出物を添加したが、第１実施例と異なり、その後新しい培地と交換しなかった。つまり、Ｄ７時で固定されるまで、Ｄ２時又はＤ４時の誘導後においても新しい培地と交換しなかった。同時に、Ｄ２時からＤ７時において、培養液を抽出物で処理し、Ｄ４時に新しい培地と交換した。
【００２４】
以下の表２にこれらの第２実施例の結果を示す。また、対応するグラフを図２に示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】
上記で述べられているように、本実施例において比較対照培養として、１０μＭで試験されたレチノイン酸の不在下又は存在下で、（１０％ＳＶＤを有する培地で培養された）非誘導細胞と、ＤＩＭ培地において誘導された細胞を作成した。実際、後者（レチノイン酸の存在）は、前脂肪細胞から脂肪細胞への分化を阻害することが知られている。
【００２７】
分化誘導培地（ＤＩＭ）の不在下では、大多数の細胞が前脂肪細胞のままであったことが記された。オイルレッドによる脂質の染色後、ごく少数の細胞が顕微鏡下で確認できる脂肪滴を自発的に生産した。
【００２８】
同様に、２日間の誘導培地ＤＩＭの存在下では、オイルレッドによる染色後、大多数の細胞が多数の脂肪滴を含むことがわかった。
【００２９】
これらの実施例の結果を以下に述べる。
【００３０】
０．４％，１％，１．５％（ｖ／ｖ）で試験されたハロプテリス スコパリアの抽出物は、前脂肪細胞から脂肪細胞への分化をそれぞれ２８％，７８％，１２５％阻害した。図１で示されるように、この阻害効果は用量依存的関係に従う。
【００３１】
２．５％の抽出物について１００％を超える阻害が測定されることがわかり、これは、分化誘導培地（ＤＩＭ）の不在下において、少数の細胞で自然に発生した脂肪滴の形成を阻害することを示す。
【００３２】
同じ実験条件下で、１０μＭの量のレチノイン酸の存在は、脂肪滴の発生を非常に強く制限する。すなわち、細胞は前脂肪細胞の形態のままであり、脂肪細胞へ分化しないことがわかる。
【００３３】
ＤＩＭによる誘導のわずか２日間（すなわち、Ｄ０の時からＤ２の時まで）、１％（ｖ／ｖ）で試験されたハロプテリス抽出物の存在は、脂肪細胞への分化を阻害するのに十分である。培養している間（すなわち、Ｄ０の時からＤ７の時まで）、抽出物が存在する場合の７２％に対して４３％を阻害した。分化誘導（すなわち、Ｄ２の時からＤ７の時まで）後、抽出物を細胞と接触させた場合、明らかに低い阻害効果（１５％のみの阻害）を示した（表２を参照）。
【００３４】
これらの結果は、分化の開始から抽出物が存在することの重要性を示している。同様の実験条件で、１０μMのレチノイン酸で試験し、同様の効果を得られる（表２を参照）。Xue J C、Schwarz E J、Chawla A及びLazar M Aによって、「ＰＰＡＲガンマの誘導後、レチノイドの分化の阻害によって、脂肪合成における重要な段階」という題名で、Mol. Cell. Biol., 1996, 16:1567-1575という文献中に、分化を誘導するためレチノイン酸を加える時間の重要性大きく記載されていることは注目すべきことである。
【００３５】
これらの実験の結果から、ハロプテリス スコパリアの抽出物が脂質合成（脂質生成）の阻害剤というよりむしろ真の分化の阻害剤として作用するということをこれで結論付けることができる。
【００３６】
記載された結果を立証するため、分化した脂肪細胞に通常発現するマーカーをコードする遺伝子の発現に関して、３Ｔ３−Ｌ１株の前脂肪細胞におけるハロプテリス スコパリアの抽出物の作用を研究する新たな実験を行った。
【００３７】
そのため、培養期間の前に、Ｄ０と称される時までの２日間でコンフルエンスに達した前脂肪細胞を使用した。その後、比較対照として利用可能な培地を配置する。Ｄ０の時に、ハロプテリス抽出物の存在下又は不在下において、培地を分化誘導培地ＤＩＭと交換する。
【００３８】
Ｄ４とＤ７の時（それぞれ、Ｄ０+４日とＤ０+７日）に、提供者に推奨されたプロトコルに従い適切な試薬（この場合Ｔｒｉ−試薬）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＤＮＡを取り除いた（ＤＮＡフリーシステム、Ambion社）。アガロースゲルでＤＮＡの特性を確認した。開始因子であるオリゴ（ｄＴ）と酵素スパースクリプト（Superscript）ＩＩ（Gibco社）の存在下で、ｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）反応を行った。蛍光によってｃＤＮＡ合成を定量化し、２０ｎｇ／ｍｌの濃度に調製した。ロシュモレキュラー システム社の「ライトサイクラー」システムで、提供者に推奨されたプロトコルに従い、定量的ＰＣＲによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。複製されたＤＮＡの中に組み込まれた蛍光性物質をＰＣＲサイクルの間、継続的に測定し、各々実験されるマーカーに対する相対発現量を得ることを可能とする。
【００３９】
脂肪酸（ＦＡＢＰ４）を結合する細胞質のタンパクをコードする遺伝子４２２／ａＰ２の発現を調節する転写因子ＰＰＡＲｇ（Peroxisome proliferator activated receptor gamma、ペルオキシゾーム誘導剤活性化受容体ガンマ）の発現、ｃ／ＥＢＰａ，ｃ／ＥＢＰｂ，ｃ／ＥＢＰｇ（ＣＡＡＴ−エンハンサー−結合タンパク質アルファ，ベータ，ガンマ）といったタンパクと同様に、酵素ＦＡＳ（脂肪酸合成酵素）をコードする遺伝子の発現をコントロールする転写因子ＳＲＥＢＰ１（Sterol Response Element Binding Protein、ステロール反応成分結合タンパク質）の発現に関する研究を行った。ｃ／ＥＢＰａ因子は、ステアリン酸ＣｏＡ不飽和化酵素タイプ１（ＳＣＤ１）及びグルコース受容体（ＧＬＵＴ−４）の遺伝子の発現を調節する。また、脂肪酸トランスポーター（脂肪酸転移酵素又はＦＡＴ）の発現を研究した。
【００４０】
４日目と７日目の第２の培地の誘導期間に関して、３種の培地（対照培地，誘導培地のみが存在する培地，誘導培地と抽出物が存在する培地）で得られた結果を下記に示す。
【００４１】
誘導の４日後、ｃ／ＥＢＰａの発現は、誘導されていない対照と比較して、１０．４倍増加した。抽出物の存在下では、ｃ／ＥＢＰａの発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、３３％減少した。誘導の７日後、ｃ／ＥＢＰａの発現は、誘導されていない対照と比較して、２７．７倍増加した。抽出物の存在下では、ｃ／ＥＢＰａの発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、３７％減少した。
【００４２】
誘導の４日後、ＳＲＥＢＰ１の発現は、誘導されていない対照と比較して、１．９倍（＋８８％）増加した。抽出物の存在下では、ＳＲＥＢＰ１の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、２１％減少した。誘導の７日後、ＳＲＥＢＰ１の発現は、誘導されていない対照と比較して、２．７倍（＋１６６％）増加した。抽出物の存在下では、ＳＲＥＢＰ１の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、３１％減少した。
【００４３】
誘導の４日後、酵素ＦＡＳの発現は、誘導されていない対照と比較して、有意に増加しなかった。しかし、抽出物の存在下では、酵素ＦＡＳの発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、４７％減少した。誘導の７日後、酵素ＦＡＳの発現は、誘導されていない対照と比較して、８．３倍増加した。抽出物の存在下では、酵素ＦＡＳの発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、５８％減少した。
【００４４】
誘導の４日後、ＳＣＤ１転写因子の発現は、誘導されていない対照と比較して、１４倍増加した。抽出物の存在下では、ＳＣＤ１の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、２５％減少した。誘導の７日後、ＳＣＤ１の発現は、誘導されていない対照と比較して、５６７倍増加した。抽出物の存在下では、ＳＣＤ１の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、２７％減少した。
【００４５】
誘導の４日後、ＦＡＴの発現は、誘導されていない対照と比較して、１３２９倍増加した。抽出物の存在下では、ＦＡＴの発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、ＦＡＴの発現を４４％減少させた。誘導の７日後、ＦＡＴの発現は、誘導されていない対照と比較して、１５２８倍増加した。抽出物の存在下では、ＦＡＴの発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、５６％減少した。
【００４６】
誘導の４日後、ＧＬＵＴ−４の発現は、誘導されていない対照と比較して、２８１倍増加した。抽出物の存在下では、ＧＬＵＴ−４の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、３７％減少した。誘導の７日後、ＧＬＵＴ−４の発現は、誘導されていない対照と比較して、３０７９倍増加した。抽出物の存在下では、ＧＬＵＴ−４の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、２３％減少した。
【００４７】
予想される結果と一致して、ハロプテリス抽出物の不在下でのＤＩＭ誘導培地による分化は、対照である培地と比較して、程度の差はあるものの前脂肪細胞の脂肪細胞への分化のマーカーを全て増加した。
【００４８】
上記で与えられた結果は、ハロプテリス スコパリアの抽出物が、多くの脂肪細胞の分化マーカーの発現を改変することを示すことができる。具体的には、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、ｃ／ＥＢＰａ転写因子の発現を（誘導の４日後に３３％、誘導の７日後に３７％）減少させ、また、ＳＲＥＢＰ１の発現を（誘導の４日後に２１％、誘導の７日後に３１％）減少させ、酵素ＦＡＳの発現を（誘導の４日後に４７％、誘導の７日後に５８％）減少させ、酵素ＳＣＤ１の発現を（誘導の４日後に２５％、誘導の７日後に２７％）減少させ、脂肪酸トランスポーターＦＡＴの発現を（誘導の４日後に４４％、誘導の７日後に５６％）減少させ、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ−４の発現を（誘導の４日後に３７％、誘導の７日後に２３％）減少させ、脂肪細胞タンパク質結合脂肪酸ＦＡＢＰ４（誘導の４日後に１８％）減少させた。一方、ハロプテリス抽出物は、ＰＰＡＲｇ因子において任意の有意な効果を示さなかった。しかしながら、ハロプテリス抽出物は、ＰＰＡＲｇ因子の調節下にある２つの遺伝子の発現を改変する。つまり、ＦＡＢＰ４の発現を（少なくとも一時的に）減少させる。
【００４９】
また、マイクロタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）の発現を減少させた。誘導の７日後、誘導培地によって誘導されたＬＰＬの発現は、抽出物の存在下で６６％減少した。
【００５０】
また、誘導の４日後、ＣＯＬ１の発現が、誘導されていない対照と比較して、７０％減少したことを示した。抽出物の存在下で、この発現は、誘導されていない対照と比較して、わずか４６％減少し、抽出物の不在下で誘導した脂肪細胞と比較して、７９％増加したことを意味する。誘導の７日後、ＣＯＬ１の発現は、誘導されていない対照と比較して、８０％減少した。抽出物の存在下で、その発現は、誘導されていない対照と比較して、５９％減少し、抽出物の不在下で誘導した脂肪細胞と比較して、２倍増加したことを意味する。
【００５１】
誘導の４日後、ＣＯＬ４の発現は、誘導されていない対照と比較して、３．１倍増加した。抽出物の存在下では、ＣＯＬ４の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、１６％増加した。誘導の７日後、ＣＯＬ４の発現は、誘導されていない対照と比較して、２．６倍増加した。抽出物の存在下では、ＣＯＬ４の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、１７％増加した。
【００５２】
このため、誘導培地ＤＩＭの添加により、コラーゲンタイプ１（ＣＯＬ１）の発現は減少した。このコラーゲンは、真皮中に最も豊富に存在する。それは、主な性質が引張強度である厚い線維を形成する。このコラーゲンは、線維芽細胞，また軟骨細胞，骨芽細胞によって主に生産される。これらの細胞は、脂肪細胞のような線維芽細胞から得る。このコラーゲンは、お互いに結合した脂肪細胞を保つことを可能とする。それゆえ分化の間、前脂肪細胞がコラーゲンタイプ１を生成するための能力を失う。一方、成熟脂肪細胞はコラーゲンタイプ４（ＣＯＬ４）を生産する。これは繊維を形成せず、基底層、特に真皮表皮基底膜で非組織化形状の形態にある。ＣＯＬ４は、支持組織（真皮）と上皮組織（表皮）との間の中間に位置し、ろ過支持体として機能する。ＣＯＬ４は、上皮細胞（ケラチノサイト）と内皮細胞によって作られ、また、脂肪細胞によっても生産される。
【００５３】
抽出物は、コラーゲンの発現を改変するとみてもよく、通常分化の間に観察されるコラーゲンタイプ１（ＣＯＬ１）の喪失を低減させる。ＣＯＬ１の発現は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して（誘導の４日後に７９％、誘導の７日後に５９％）増加する。さらに、抽出物は、脂肪細胞への分化中に通常増加するコラーゲンタイプ４（ＣＯＬ４）の発現を抑制しない。抽出物は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、ＣＯＬ４の発現を（誘導の４日後に１６％、誘導の７日後に１７％）増加させる。
【００５４】
従って、ＲＴＰＣＲ法による脂肪細胞への分化の発現遺伝子の分析によって、前脂肪細胞の成熟細胞への分化におけるハロプテリス スコパリア抽出物の阻害作用を確認した。また、この作用が、分化のある特定のマーカーに限定されることを示す。さらに、それは、コラーゲンタイプ１（ＣＯＬ１）の高レベルを保持し、コラーゲンタイプ４（ＣＯＬ４）の発現を誘発する。この作用は興味深く、脂肪分解剤による脂肪組織の攻撃の後、皮膚組織を制限するための必要性に関する。
【００５５】
また、ハロプテリス スコパリア抽出物（１％）は、抽出物なしで誘導された脂肪細胞と比較して、アディポネクチンの発現を７０％減少させる。
【００５６】
従って、本発明は、前脂肪細胞の分化への作用によって脂肪組織の肥大を制限するための化粧品用又は医薬用の組成物におけるハロプテリス属（Halopteris）に属する褐藻類の抽出物の使用法に関する。前記藻類は、好ましくは藻類ハロプテリス スコパリア（Halopteris scoparia）である。
【００５７】
さらに、好適な一実施形態によれば、前記抽出物は、乾燥又は凍結乾燥された藻類を、水又は共溶媒と水の混合液などの溶媒の存在下に浸漬することによって得られる。前記共溶媒は、ジプロピレングリコール又はグリセロールであってもよく、前記水と共溶媒の比率は、０〜８０％、好ましくは３０〜５０％である。
【００５８】
また、本発明は、作用物質として、脂肪細胞の分化を阻害するように作用するハロプテリス（Halopteris）属に属する褐藻類の抽出物を少なくとも一つ含むことを特徴とする脂肪組織の肥大を制限するための化粧品用又は医薬用の組成物に関する。前記藻類は、好ましくは藻類ハロプテリス スコパリア(Halopterisscoparia)又はスファセラリア スコパリア（Sphacelaria scoparia）である。
【００５９】
前記抽出物は、好ましくは乾燥又は凍結乾燥された藻類を、水又は共溶媒と水の混合液などの溶媒の存在下に浸漬することによって得られる。前記共溶媒は、ジプロピレングリコール又はグリセロールであってもよく、前記水と共溶媒の比率は、０〜８０％、好ましくは３０〜５０％である。
【００６０】
本発明の別の特徴によれば、藻類ハロプテリス (Halopteris)の抽出物を、脂肪分解を促進する作用剤（例えば、ホスホジエステラーゼの阻害剤又はアドレナリンレセプターをブロックする作用剤など）、及び／又は脂質生成を阻害する作用剤（例えば、脂肪酸合成酵素の阻害剤又はグルコース貫入レセプターをブロックする作用剤など）などのやせることを目的とした美容製剤に関する。
【００６１】
また、本発明は、前脂肪細胞の分化を阻害することによって、脂肪組織の肥大を制限することを目的とした上述の美容製剤の使用法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、第１実施例の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、第２実施例の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前脂肪細胞の分化への作用により脂肪組織の肥大を制限するための化粧品用又は医薬用の組成物におけるハロプテリス（Halopteris）属に属する褐藻類の抽出物の使用法。
【請求項２】
前記藻類が、藻類ハロプテリス スコパリア(Halopteris scoparia)であることを特徴とする請求項１記載の使用法。
【請求項３】
前記抽出物は、乾燥又は凍結乾燥された藻類を、水又は共溶媒と水の混合液などの溶媒の存在下に浸漬することによって得られることを特徴とする請求項１又は２記載の使用法。
【請求項４】
前記共溶媒が、ジプロピレングリコール又はグリセロールであることを特徴とする請求項３記載の使用法。
【請求項５】
前記水と共溶媒の比率が、０〜８０％であることを特徴とする請求項４記載の使用法。
【請求項６】
前記水と共溶媒の比率が、３０〜５０％であることを特徴とする請求項５記載の使用法。
【請求項７】
脂肪組織の肥大を制限するための化粧品用又は医薬用の組成物であって、作用物質として、脂肪細胞の分化を阻害するように作用するハロプテリス（Halopteris）属に属する褐藻類の抽出物を少なくとも一つ含むことを特徴とする化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項８】
前記藻類が、藻類ハロプテリス スコパリア(Halopteris scoparia)であることを特徴とする請求項７記載の化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項９】
前記抽出物は、乾燥又は凍結乾燥された藻類を、水又は共溶媒と水の混合液などの溶媒の存在下に浸漬することによって得られることを特徴とする請求項７又は８記載の化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項１０】
前記共溶媒が、ジプロピレングリコール又はグリセロールであることを特徴とする請求項９記載の化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項１１】
前記水と共溶媒の比率が、０〜８０％であることを特徴とする請求項９又は１０記載の化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項１２】
前記水と共溶媒の比率が、３０〜５０％であることを特徴とする請求項９又は１０記載の化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項１３】
脂肪分解を促進する作用物質及び／又は脂質生成を阻害する作用物質を含むことを特徴とする請求項７〜１２のいずれか１項に記載の化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項１４】
前脂肪細胞の分化を阻害することによって、脂肪組織の肥大を制限する目的のための請求項７〜１３のいずれか１項に記載の化粧品用又は医薬用の組成物の使用法。
【請求項１】
前脂肪細胞の分化への作用により脂肪組織の肥大を制限するための化粧品用又は医薬用の組成物におけるハロプテリス（Halopteris）属に属する褐藻類の抽出物の使用法。
【請求項２】
前記藻類が、藻類ハロプテリス スコパリア(Halopteris scoparia)であることを特徴とする請求項１記載の使用法。
【請求項３】
前記抽出物は、乾燥又は凍結乾燥された藻類を、水又は共溶媒と水の混合液などの溶媒の存在下に浸漬することによって得られることを特徴とする請求項１又は２記載の使用法。
【請求項４】
前記共溶媒が、ジプロピレングリコール又はグリセロールであることを特徴とする請求項３記載の使用法。
【請求項５】
前記水と共溶媒の比率が、０〜８０％であることを特徴とする請求項４記載の使用法。
【請求項６】
前記水と共溶媒の比率が、３０〜５０％であることを特徴とする請求項５記載の使用法。
【請求項７】
脂肪組織の肥大を制限するための化粧品用又は医薬用の組成物であって、作用物質として、脂肪細胞の分化を阻害するように作用するハロプテリス（Halopteris）属に属する褐藻類の抽出物を少なくとも一つ含むことを特徴とする化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項８】
前記藻類が、藻類ハロプテリス スコパリア(Halopteris scoparia)であることを特徴とする請求項７記載の化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項９】
前記抽出物は、乾燥又は凍結乾燥された藻類を、水又は共溶媒と水の混合液などの溶媒の存在下に浸漬することによって得られることを特徴とする請求項７又は８記載の化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項１０】
前記共溶媒が、ジプロピレングリコール又はグリセロールであることを特徴とする請求項９記載の化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項１１】
前記水と共溶媒の比率が、０〜８０％であることを特徴とする請求項９又は１０記載の化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項１２】
前記水と共溶媒の比率が、３０〜５０％であることを特徴とする請求項９又は１０記載の化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項１３】
脂肪分解を促進する作用物質及び／又は脂質生成を阻害する作用物質を含むことを特徴とする請求項７〜１２のいずれか１項に記載の化粧品用又は医薬用の組成物。
【請求項１４】
前脂肪細胞の分化を阻害することによって、脂肪組織の肥大を制限する目的のための請求項７〜１３のいずれか１項に記載の化粧品用又は医薬用の組成物の使用法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５０１２６６（Ｐ２００６−５０１２６６Ａ）
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３５５９７（Ｐ２００４−５３５５９７）
【出願日】平成１５年９月１０日（２００３．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／００２６９１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２４１０２
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【出願人】（３０３０４７３４４）ソシエテ ドゥ クルタージュ エ ドゥ ディフュジョン−コディフ アンテルナショナル エス．アー．エス (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月１０日（２００３．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／００２６９１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２４１０２
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【出願人】（３０３０４７３４４）ソシエテ ドゥ クルタージュ エ ドゥ ディフュジョン−コディフ アンテルナショナル エス．アー．エス (1)
【Ｆターム（参考）】
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