脂肪酸エステルの製造方法
【課題】 食用油の製造工程で発生する脱酸廃棄物から効率よく脂肪酸エステルを回収する方法を提供すること
【解決手段】 遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物（例えば、脱酸廃棄物）から脂肪酸エステルを製造する方法であって、（１）酵素の存在下、遊離脂肪酸とアルコールとを反応させて脂肪酸エステルを含む反応混合物を得、この混合物中の水を除去して、混合物中のグリセリドを酵素でアルコリシスし、脂肪酸エステルを回収する方法、あるいは、（２）グリセリドを加水分解して遊離脂肪酸を含有する油分を回収し、酵素の存在下、この油分中の遊離脂肪酸を脂肪酸エステルとし、エステル化により生じた水を除去した後、さらに、油分中の未反応の遊離脂肪酸をグリセロールの存在下でエステル化し、脂肪酸エステルを回収する方法が提供される。
【解決手段】 遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物（例えば、脱酸廃棄物）から脂肪酸エステルを製造する方法であって、（１）酵素の存在下、遊離脂肪酸とアルコールとを反応させて脂肪酸エステルを含む反応混合物を得、この混合物中の水を除去して、混合物中のグリセリドを酵素でアルコリシスし、脂肪酸エステルを回収する方法、あるいは、（２）グリセリドを加水分解して遊離脂肪酸を含有する油分を回収し、酵素の存在下、この油分中の遊離脂肪酸を脂肪酸エステルとし、エステル化により生じた水を除去した後、さらに、油分中の未反応の遊離脂肪酸をグリセロールの存在下でエステル化し、脂肪酸エステルを回収する方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸エステルの製造方法に関する。さらに詳しくは、グリセリドと遊離脂肪酸を含む混合物、特に食用油の製造工程において発生する脱酸廃棄物に由来する油分（以下、ダーク油ということがある）からの脂肪酸エステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油、石炭などの化石燃料を燃焼させると、二酸化炭素、ＮＯｘ、ＳＯｘなどが発生し、地球温暖化、大気汚染などの原因となる。その中でも、ディーゼル自動車に用いられている軽油には窒素化合物、硫黄化合物などが含まれており、ＣＯ２、ＮＯｘ、ＳＯｘなどが大量に発生する。そこで、この軽油の代わりに、天然に存在する植物、動物、魚あるいは微生物が生産する油脂を用いる、いわゆるバイオディーゼル燃料の開発が進められている。
【０００３】
バイオディーゼル燃料（以下、単にバイオ燃料ということがある）は、脂肪酸低級アルコールエステルであり、植物油などの構成成分である脂肪酸と低級アルコールとの反応により得られる。欧米では、特にバイオ燃料への関心が高く、植物油をバイオ燃料に変換し、軽油と混合して利用している。バイオ燃料生産量は年々増加傾向にあり、２００３年には１６６万ｋＬのバイオ燃料が世界中で生産されている。
【０００４】
バイオ燃料を製造する方法には、化学的方法と生物学的方法とがある。現在のバイオ燃料生産の主流である化学的方法ではアルカリ触媒を用いるが、製造過程で発生するアルカリ性廃棄物の処理が問題になっている。そこで、酵素（リパーゼ）を用いる生物学的方法が検討されている。
【０００５】
生物学的方法においては、資源の有効利用の観点から、廃食用油をバイオ燃料に変換する技術が開示されている（例えば、特許文献１、非特許文献１〜３などを参照）。特許文献１においては、廃食用油に含まれるトリグリセリドをアルコリシスして、トリグリセリドを構成する脂肪酸をエステル化し、脂肪酸エステル（すなわち、バイオ燃料）を得る方法を記載している。この方法においては、トリグリセリド１モルから３モルの脂肪酸が遊離することから、理論的に等モルとなるようにトリグリセリドに対して３モルのメタノールを添加すると、酵素が不可逆的に失活することが記載されている。この酵素が失活する問題を解消するため、メタノールを廃食用油に逐次添加し、脂肪酸メチルエステルへの変換率を９６％以上にすることができる。しかも、酵素を連続的に100日以上繰り返し使用することができる。
【０００６】
また、遊離脂肪酸をバイオ燃料に変換する方法も検討されている（例えば、特許文献２、非特許文献４）。この方法では、遊離脂肪酸、メタノール、固定化酵素を含む反応系で反応させると、エステル化に伴って生成する水のため、エステル化率を８３％よりも高めることができない。そこで、エステル化反応後に生成する水を除去し、再びメタノールと固定化酵素を添加して、さらにエステル化を行う２段階酵素法を採用することにより、エステル化率を９５〜９８％にまで高めることができたことが記載されている。
【０００７】
ところで、食用油、特に植物油などは、一般に、搾油、脱ガム、脱酸、脱色、脱臭などの各工程を経て製造される。脱ガム工程で排出される副成物は乳化剤として利用されているレシチンやリゾレシチンを製造する原料として利用される。また、脱色工程からの廃棄物である着色白土の一部はコンクリート助剤や土壌改良剤として利用されている。さらに、脱臭工程からの廃棄物はトコフェロール、ステロール、ステリルエステル生産の原料として活用されている。
【０００８】
一方、脱酸工程で排出される脱酸廃棄物（アルカリ油滓）には約５０％の水、２５％の脂肪酸、２５％の中性脂質（トリグリセリドとジグリセリド）が含まれ、年間約１２万トン排出されている。この脱酸廃棄物からは脂肪酸が抽出され、この脂肪酸は、塗料、潤滑油、石鹸などの原料として使用されている。しかし、脂肪酸の需要の低下から価格の下落を引き起こしている。そのため、脂肪酸エステルとして、再資源化し、バイオ燃料を製造することが望まれている。
【０００９】
この脱酸廃棄物はアルカリ性であるため、このまま酵素を作用させることができない。そこで、酵素を作用させるためには、脱酸廃棄物を硫酸、塩酸、リン酸などの酸で中和した後、水を除去して油分を回収する必要がある。この回収された油分にはグリセリドおよび遊離脂肪酸が含まれているが、この油分に酵素とアルコールとを作用させても、グリセリドと遊離脂肪酸の両方を同時に脂肪酸エステルに変換することはできない。これは、遊離脂肪酸のエステル化に伴って生成する水がグリセリドのアルコリシスを妨害するからである。そこで、グリセリドと遊離脂肪酸との混合物から、効率よく脂肪酸エステルを製造する方法の開発が望まれている。
【特許文献１】国際公開公報 ＷＯ００／１２７４３号公報
【特許文献２】特開２００１−２４５６８６号公報
【非特許文献１】島田ら、J. Am. Oil Chem. Soc., 76巻, 789-793頁 (1999年)
【非特許文献２】渡辺ら、J. Am. Oil Chem. Soc., 78巻, 703-707頁 (1999年)
【非特許文献３】島田ら、J. Mol. Cat. B: Enzyme 17巻, 133-142頁 (2002年)
【非特許文献４】渡辺ら、J. Oleo Sci., 51巻, 655-661頁 (2002年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸アルコールエステルを効率よく製造する方法を提供することを目的とする。特に、例えば、脱酸廃棄物に由来するダーク油から簡単な方法で、脂肪酸低級アルコールエステル（バイオ燃料）を回収する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸エステルを製造する方法であって、（１）エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下、該遊離脂肪酸とアルコールとを反応させて脂肪酸エステルを得る第１反応工程；（２）第１反応工程で生じた水を反応混合物から除去する工程；（３）該水が除去された反応混合物とアルコールとを、グリセリドをアルコリシスし得る酵素の存在下で反応させ、グリセリド中の脂肪酸を脂肪酸エステルに変換する第２反応工程；および（４）得られた脂肪酸エステルを回収する工程；を含む方法を提供する。
【００１２】
一つの実施態様では、前記アルコールが直鎖低級アルコールである。
【００１３】
好ましい実施態様では、直鎖低級アルコールがメタノールまたはエタノールである。
【００１４】
別の実施態様では、前記混合物が脱酸廃棄物に由来する油分（ダーク油）である。
【００１５】
異なる実施態様では、前記第２反応工程において、グリセロールおよび／またはグリセリドを添加してアルコリシスが行われる。
【００１６】
さらに別の実施態様では、前記グリセリドが植物油脂、動物油脂、魚油、および微生物油脂からなる群から選択される少なくとも一つの油脂である。
【００１７】
また、別の実施態様では、前記油分が、植物油脂、動物油脂、魚油、または微生物油脂からの油脂の製造工程において発生する脱酸廃棄物に由来する。
【００１８】
異なる実施態様では、前記第１反応工程において、直鎖低級アルコールは、遊離脂肪酸に対して等モル以上から前記酵素を失活させない量で使用され、第２反応工程において添加する直鎖低級アルコールは、グリセリド中の脂肪酸に対して０．５モル当量以上から前記酵素を失活させない量で使用される。
【００１９】
さらに、本発明は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸エステルを製造する方法であって、（１）該グリセリドを加水分解して脂肪酸を遊離させ、油水分離により遊離脂肪酸を主成分とする油分を得る第１工程；（２）エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下、該第１工程で生じた遊離脂肪酸とアルコールを反応させ、脂肪酸エステルを得る第２工程；（３）該第２工程で生じた水を反応混合物から除去する第３工程；（４）該第３工程で水が除去された反応混合物中の未反応の遊離脂肪酸を、エステル化反応を触媒し得る酵素およびグリセロールの存在下でアルコールと反応させ、遊離脂肪酸を脂肪酸エステルに変換する、第４工程；および（５）得られた脂肪酸エステルを回収する工程；を含む方法を提供する。
【００２０】
一つの実施態様では、前記第１工程の加水分解が、グリセリドを加水分解し得る酵素および水の存在下、行われる。
【００２１】
一つの実施態様では、前記アルコールが、直鎖低級アルコールである。
【００２２】
別の実施態様では、前記直鎖低級アルコールが、メタノールまたはエタノールである。
【００２３】
別の実施態様では、前記混合物が脱酸廃棄物に由来する油分（ダーク油）である。
【００２４】
さらに別の実施態様では、前記油分が、植物油脂、動物油脂、魚油、または微生物油脂からの油脂の製造工程において発生する脱酸廃棄物に由来する。
【００２５】
異なる実施態様では、前記第４工程において、グリセロール量が反応液合計量の１〜５０質量％である。
【００２６】
さらに別の実施態様においては、前記第２および第４工程において、直鎖低級アルコールは、遊離脂肪酸に対して等モル量以上から酵素を失活させない量で使用される。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の方法により、遊離脂肪酸およびグリセリドを含む混合物、例えば、食用油の製造工程で発生する脱酸廃棄物に由来する油分（ダーク油）などから、簡便な方法および装置で、バイオ燃料が製造される。例えば、大豆油製造過程で発生する脱酸廃棄物に由来する油分（例えばダーク油）に含まれるグリセリドと遊離脂肪酸の脂肪酸メチルエステルへの変換率は９８％以上であり、１００日以上連続して、酵素の失活を起こすことなく、脂肪酸エステルが生産される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（Ａ：本発明に用いられる材料）
（Ａ−１：遊離脂肪酸とグリセリドとの混合物）
本発明に用いられる遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物は、種類および起源を問わない。好ましい混合物は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する脱酸廃棄物である。脱酸廃棄物は、植物、動物、魚、微生物などを原料とし、植物油脂、動物油脂、魚油、微生物油脂などを製造する工程の１つである脱酸工程で発生する廃棄物をいう。植物油脂としては、例えば大豆油、菜種油、パーム油、オリーブ油、綿実油、米ぬか油、亜麻仁油、月見草油、胡麻油などが挙げられる。動物油脂としては、牛脂、豚脂、鯨油、アザラシ油などが挙げられる。魚油としては、イワシ油、マグロ油、サケ油などが挙げられる。微生物が生産する油としては、モルティエレラ属(Mortierella)やシゾキトリウム属(Schizochytrium)が生産する油脂などが挙げられる。
【００２９】
通常、脱酸工程後の原油中の遊離脂肪酸の中和には、水酸化ナトリウム水溶液が用いられるため、脱酸廃棄物自体は水を含んだアルカリ性であり、遊離脂肪酸は脂肪酸の金属塩（石鹸）として存在している。そのため、本発明に用いる原料とするためには、塩酸、硫酸、リン酸などの酸による中和、遠心分離や濾過などによる不溶性物質の除去、遠心分離や蒸留などによる水分の除去などの処理が必要となる。あるいは脱酸廃棄物を加圧条件下でケン化分解した後、中和する処理が必要となる。ダーク油は、このような処理を経て得られる油である。ダーク油以外にも、脱ガム油滓、脱臭留出物などが用いられる。以下、脱酸廃棄物由来の油分として、ダーク油を用いる場合について主に説明するが、その他の油分についても同様である。
【００３０】
なお、本発明に用いる混合物中の遊離脂肪酸とグリセリドとの比率（モル比、質量比）は特に制限されない。例えば、遊離脂肪酸とグリセリドとは、質量比で５：９５〜９５：５、あるいは１０：９０〜９０：１０の割合で含まれる混合油が用いられる。
【００３１】
（Ａ−２：グリセリド）
本発明で、グリセリドは中性脂質ともいい、グリセロールと脂肪酸とのエステルをいい、トリグリセリド（ＴＧ）、ジグリセリド（ＤＧ）およびモノグリセリド（ＭＧ）からなる群から選択される少なくとも一つのアシル化グリセロールを含有する。
【００３２】
（Ａ−３：遊離脂肪酸）
遊離脂肪酸は、遊離のカルボキシル基を有する脂肪酸をいい、その種類を問わない。好ましくは、炭素数が６〜２２の遊離脂肪酸である。一価の脂肪酸が好ましく用いられる。遊離脂肪酸は、直鎖の脂肪酸であってもよく、分岐の脂肪酸であってもよい。また、飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。一般には、植物油、動物油、魚油、微生物油などに含まれる遊離脂肪酸またはこれらの油に含まれるグリセリドに由来する遊離脂肪酸が好ましく用いられる。
【００３３】
（Ａ−４：アルコール）
以下に説明する、本発明の第１発明における第１反応工程および第２反応工程、あるいは第２発明における第２工程および第４工程において用いられるアルコールに制限はなく、一価および多価アルコールが用いられる。バイオ燃料に用いるには一価のアルコールが好ましく、炭素数１〜８の直鎖低級アルコールがさらに好ましく用いられる。もっとも好ましくは、メタノールおよびエタノールである。
【００３４】
（Ａ−５：酵素）
本発明には、遊離脂肪酸のエステル化反応を触媒し得る酵素、グリセリドをアルコリシスし得る酵素、および、グリセリドを加水分解し得る酵素が用いられる。リパーゼは、これらの活性を有するので、特に好ましく用いられる。リパーゼ以外にも、エステラーゼ、クチナーゼ、ホスフォリパーゼなども用いることができる。
【００３５】
リパーゼは、トリグリセリドなどの中性脂質に作用して、トリグリセリドをグリセロールまたは部分グリセリドと脂肪酸に分解する能力を有する酵素を指す。このリパーゼは、トリグリセリドの１，３−位に特異的であってもよく、非特異的であってもよい。脂肪酸エステルへの変換という面から、非特異的である方がより好ましい。
【００３６】
リパーゼの起源は問わない。微生物、動物、植物などに由来する酵素が用いられる。例えば、微生物に由来するリパーゼとしては、リゾムコール属、ムコール属、アスペルギルス属、リゾプス属、ペニシリウム属等に属する糸状菌；キャンディダ属、ゲオトリカム属、ピヒア属等に属する酵母；シュードモナス属、セラチア属、アルカリゲネス属、バークホルデリア属、スタッフィロコッカス属、バシラス属（枯草菌）等に属する細菌；などに由来するリパーゼが用いられる。動物に由来するリパーゼとしては、豚膵臓等に由来するリパーゼが挙げられる。
【００３７】
市販の酵素も用いられる。例えば、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）由来のリパーゼ（商品名：リポザイムＩＭ６０、ノボザイムズ社製）、キャンディダ・アンタークティカ（Candida antarctica）のリパーゼ（商品名：ノボザイム４３５、ノボザイムズ社製）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae：旧称Rhizopus delemar）のリパーゼ（商品名：リパーゼＴ、リパーゼＤ、またはリパーゼＦ−ＡＰ１５、天野エンザイム社製）、サーモマイセス・ラヌギノーサ（Thermomyces lanuginosa：旧称Humicola lanuginosa）のリパーゼ（商品名：リポザイムＴＬＩＭ、ノボザイムズ社製)、キャンディダ・ルゴーサ（Candida rugosa：旧称Candida cylindracea）のリパーゼ（商品名：リパーゼＯＦ、名糖産業社製）、シュードモナス（Pseudomonas）属のリパーゼ（商品名：リパーゼＰＳ、リパーゼＡＫ、天野エンザイム社製）、アルカリゲネス（Alcaligenes）属のリパーゼ（商品名：リパーゼＱＬＭ、名糖産業社製）などが挙げられる。
【００３８】
使用する酵素の形状は問わない。粉末でもよいし、固定化されていてもよい。また、リパーゼを産生する微生物、細胞表層にリパーゼを提示している微生物を直接用いてもよいし、これらの微生物を固定化して用いてもよい。これらの中では、酵素の再使用が容易という面から、固定化されたリパーゼを用いるのが最も好ましい。
【００３９】
これらのリパーゼを担体に固定化する方法は公知であり、担体としては、イオン交換樹脂、セラミック樹脂、ガラスビーズ、ケイ藻土、活性炭等が挙げられる。耐久性、リパーゼとの親和性などを考慮すると、イオン交換樹脂、セラミック担体等がより好ましい。固定化方法としては、包括法、架橋法、物理的吸着法、イオン吸着法、疎水結合法などが挙げられるが、架橋法、イオン吸着法、疎水結合法がより好ましい。
【００４０】
本発明は、以下に説明する第１発明および第２発明を含んでいる。いずれの発明も、複数回の酵素反応を行い、その間に脱水処理を施すこと、各反応工程において同じ酵素を用いてもよいことなどから、酵素は固定化されていることが好ましい。固定化酵素としては、市販の固定化リパーゼ、例えば、商品名：ノボザイム４３５、リポザイムＩＭ６０、リポザイムＴＬＩＭ（いずれもノボザイムズ社製）などが用いられる。固定化されたノボザイム４３５が最も好ましく用いられる。あるいは、常法に基づいて、上記微生物あるいは上記微生物に由来する酵素を精製し、固定化して用いてもよい。
【００４１】
（本発明の方法）
本発明は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸エステルを回収する方法であって、（Ａ）この混合物中の遊離脂肪酸をまず脂肪酸エステルとし、ついで、グリセリド中の脂肪酸をアルコリシスによって脂肪酸エステルとし、得られた脂肪酸エステルを回収する第１発明と（Ｂ）この混合物中のグリセリドを加水分解してグリセリド中の脂肪酸を遊離脂肪酸とし、ついで、混合物中の遊離脂肪酸を２段階の反応で脂肪酸エステルとし、得られた脂肪酸エステルを回収する第２発明の２つの発明を含む。以下、それぞれの発明について説明する。
【００４２】
（第１発明）
第１発明は、（１）遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物とアルコールとを、エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下で反応させ、遊離脂肪酸をエステル化する、第１反応工程と、（２）第１反応工程で生じた水を除去する工程、（３）水が除去された脱水混合物とアルコールとを、グリセリドをアルコリシスし得る酵素の存在下で反応させる第２反応工程；および（４）得られた脂肪酸エステルを回収する工程；を含んでいる。以下、これらの各工程について、説明する。
【００４３】
（Ｂ−１：第１反応工程）
第１反応工程は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物とアルコールとを、エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下で反応させ、遊離脂肪酸をエステル化する工程である。この工程においては、エステル化反応により水が生成する。この生成した水により、グリセリドのアルコリシスが阻害される結果、第１反応においては、遊離脂肪酸のアルコールエステル化が、選択的に進行する。この反応に使用する酵素およびアルコールは上記の通りである。
【００４４】
一般に、アルコール、特にメタノールが過剰に存在する反応系では、反応は進行するものの、酵素が失活しやすく、酵素の繰り返し利用が困難になる。そのため、酵素の繰り返し利用を目的としないときは過剰量のアルコールを添加しても構わないが、酵素の繰り返し利用を目的とする場合、用いる酵素が失活しないアルコール濃度で使用することが必要である。以下、メタノールを使用する場合について説明するが、他のアルコールについても、同様である。
【００４５】
植物油と遊離脂肪酸との混合物をエステル化する場合、例えば、トリグリセリドと遊離脂肪酸が質量比で１：１程度含まれている混合物（ダーク油のモデル混合物）のとき、添加するメタノール量は、遊離脂肪酸に対して等モル以上から、酵素の失活が認められない量とする必要がある。好ましくは、遊離脂肪酸に対して４モル当量以下、さらに好ましくは２モル当量以下とする必要がある。
【００４６】
ダーク油を原料とする反応において使用するメタノール量の決定方法も、基本的には上記ダーク油のモデル混合物の場合と同じである。すなわち、メタノールは遊離脂肪酸に対して等モル量以上から酵素の失活が認められない量にすればよい。好ましくは、遊離脂肪酸に対して１０モル当量以下、さらに好ましくは７．５モル当量以下とすればよい。ただし、ダーク油の場合は、酵素反応を阻害する物質および／または酵素をメタノールによる失活から保護する物質が含まれている可能性がある。酵素のメタノールによる失活を保護する物質が含まれている場合には、ダーク油のモデル混合物を原料としたときより多い量のメタノールを添加することにより、酵素が安定となり、効率的に遊離脂肪酸のエステル化反応を行うことができる。
【００４７】
第１反応工程における酵素、混合物およびアルコールを反応させる方法に特に制限はなく、静置、振盪、攪拌いずれの方法で行ってもよい。振盪または攪拌による方法が、反応を均一に行える点で好ましい。反応装置にも特に制限はなく、例えば、攪拌式リアクター、流動層型リアクターなどのバッチ型反応装置、あるいは、固定化酵素を充填したリアクターなどの連続型反応装置を用いてもよい。
【００４８】
第１反応工程に用いる酵素量は、目的とする反応率を達成し得る量であれば、特に制限はない。好ましくはダーク油の質量に対して０．０５〜４０質量％、より好ましくは０．２〜１０質量％、さらに好ましくは０．５〜５質量％である。
【００４９】
第１反応工程の反応温度も特に制限はない。好ましくは０〜８０℃、より好ましくは１０〜５０℃、さらに好ましくは２０〜４０℃である。耐熱性酵素を使用する場合は、より高い温度が用いられる。
【００５０】
第１反応工程における反応時間に特に制限はない。好ましくは０．５〜１２０時間、より好ましくは２〜９６時間、さらにより好ましくは５〜７２時間である。連続反応の場合は、全体の反応速度を考慮して、決定すればよい。
【００５１】
例えば、第１反応工程でダーク油とメタノールとを質量比で６６:３４（遊離脂肪酸に対して５モル当量のメタノール）の割合で混合し、上記条件で反応させたとき、遊離脂肪酸に対するエステル化率が９６％以上であり、酵素（固定化酵素）を少なくとも１００日以上繰り返し利用できる。
【００５２】
第１反応終了後の反応混合物は水分を含んでいるが、そのまま、第２反応工程に用いることもできる。第２反応工程において、固定化酵素を大過剰量添加する、あるいは反応時間を大きく伸ばすことによりグリセリドのアルコリシスを行ってもよい。しかし、コストの面から現実的ではない。そこで、第１反応終了後の反応混合物から、以下に示すように生成した水と、必要に応じて、未反応のアルコールを除いておくことが好ましい。
【００５３】
（Ｂ−２：水除去工程）
第１反応工程では、遊離脂肪酸のアルコールエステル化にともない、水が発生する。この水は、第２反応工程におけるグリセリドのアルコリシスを阻害するため、除去する必要がある。さらに、第１反応工程終了後の反応混合物にアルコールが存在し、第２反応工程において反応を阻害する場合、アルコールを除去する必要がある場合がある。従って、水および必要に応じて、過剰のアルコールを除去する。水およびアルコールの除去は、好ましくは、まず、濾過などにより不純物を除き、ついで、静置、遠心分離によって分離してくる油層を回収してもよい。さらに回収した油層を蒸留し、水とアルコールを除去してもよい。
【００５４】
ダーク油を用いる場合、通常、酵素反応が終了した反応液を静置または遠心分離するとメタノール層と油層とに分離されるので、油層を回収すればよい。回収後の反応混合物は、そのまま、次の第２工程の反応に用いてもよい。しかし、油層に存在する微量の水を除く方が、第２反応工程における反応の効率が良くなるという観点から、油層を蒸留することにより脱水、あるいは脱アルコールを行う方が好ましい。第２反応工程に使用する反応混合物の水分含量は、好ましくは５０００ｐｐｍ以下であり、より好ましくは１０００ｐｐｍ以下であり、さらに好ましくは３００ｐｐｍ以下である。
【００５５】
（Ｂ−３：第２反応工程）
水分が除去され、必要に応じてアルコールが除去された反応混合物（以下、脱水混合物ということがある）を、ついで、グリセリドのアルコリシス反応を触媒し得る酵素の存在下、アルコールでアルコリシスする。この反応により、グルセリドを構成する脂肪酸は、グリセリドから遊離し、アルコールと反応する。その結果、脂肪酸エステルとグリセロールが生成する。
【００５６】
この第２反応工程に使用するアルコールおよび酵素は、上記の通りである。
【００５７】
第２反応工程で使用するアルコールの量には制限はない。メタノールを例に取ると、使用するメタノール量は、グリセリド中の脂肪酸量に対して０．５モル当量以上で、酵素の失活が認められない量、添加される。好ましくは４モル当量以下、さらに好ましくは２モル当量以下とすればよい。なお、脂肪酸量に対して等モル以下のメタノールを用いるときは、最終的に等モル以上となるように逐次添加するとよい。
【００５８】
ダーク油から脂肪酸エステルを回収する場合、第２反応工程において、グリセロールおよび／またはトリグリセリドを添加してアルコリシスを行うことが、酵素の安定化あるいは反応の効率を上げる上で、好ましい。
【００５９】
グリセロールは、残存する遊離脂肪酸から生成する水を吸収し、酵素を安定化する効果を有すると思われる。グリセロールの添加量は特に制限はない。好ましくはダーク油に由来する脱水混合物の質量を基準にして１〜５０質量％であり、より好ましくは３〜３０質量％であり、さらに好ましくは５〜２０質量％である。グリセロールは、第２反応工程終了後に回収し、繰り返し利用してもよい。
【００６０】
ダーク油には、酵素を不安定にする未知の物質が含まれていることもある。この場合、トリグリセリドの添加は、この未知の物質の濃度を下げる（希釈する）ため、酵素の安定化や、反応の効率化に寄与し得ると考えられる。トリグリセリドとしては、植物、動物、魚、微生物などから調製された油（例えば、食用油）が好ましく用いられる。中でも、入手の容易性という観点から、大豆油、菜種油、パーム油、オリーブ油、綿実油、米ぬか油、亜麻仁油、月見草油、胡麻油などの植物油が好ましく用いられる。また、トリグリセリドおよびグリセロールは、それぞれ、廃食用油など、および廃食用油などを起源として得られるものでもよいが、脱水されていることが好ましい。
【００６１】
トリグリセリドの添加量は特に制限はないが、一般的には、脱水混合物の質量を基準にして、１０〜８０質量％添加される。好ましくは２０〜６０質量％であり、さらに好ましくは３０〜５０質量％である。
【００６２】
第２反応工程における反応方法、反応装置、反応温度、反応時間については、第１反応工程での説明がそのまま、適用される。
【００６３】
第２反応工程の反応に用いる酵素量は特に制限はないが、添加する反応混合液の質量を基準にして０．１〜６０質量％、より好ましくは１〜２０質量％、さらに好ましくは２〜１０質量％である。
【００６４】
第２反応工程において、反応が不十分で、脂肪酸エステルの生成率が低い場合、さらに第１および第２反応工程を繰り返してもよい。
【００６５】
例えば、ダーク油の脱水混合物、植物油、メタノール、グリセロールを質量比で、５２：４２．５：５．５：１０の割合（メタノールはグリセリド中の脂肪酸に対して等モル量）で混合し、上記反応条件で反応させたとき、遊離脂肪酸およびトリグリセリド中の脂肪酸の脂肪酸メチルエステルへの変換率は、第１および第２反応工程を通じて９８％以上に達し、グリセリドおよび遊離脂肪酸の含量がそれぞれ１質量％以下になる。さらに、第２反応工程における酵素（固定化酵素）は、少なくとも１００日以上繰り返し利用できる。
【００６６】
（Ｂ−４：脂肪酸エステルの回収）
第２反応終了後の反応液にはグリセロール、水、および未反応のメタノールが混在している。反応液を静置あるいは遠心分離によってグリセロール層を除去してもよい、水洗等によってグリセロールを除去してもよい。脂肪酸エステルは、溶媒による抽出、蒸留による分離などの常法によって、さらに精製することもできる。
【００６７】
上記のように、脱酸廃棄物に由来するダーク油などのグリセリドと遊離脂肪酸を含有する廃棄物に対して、酵素反応を２段階にわけて行うことにより、廃棄物中に含まれる脂肪酸の９８％以上を脂肪酸エステルとして回収することができる。この方法では用いる酵素が安定に保たれるため、バイオ燃料を低コストで製造することができる。
【００６８】
（第２発明）
第２発明は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸エステルを製造する方法であって、（１）混合物中のグリセリドを加水分解して脂肪酸を遊離させ、油水分離により遊離脂肪酸を主成分とする油分を得る第１工程；（２）エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下、該第１工程で生じた遊離脂肪酸とアルコールを反応させ、脂肪酸エステルを得る第２工程；（３）該第２工程で生じた水を反応混合物から除去する第３工程；（４）該第３工程で水が除去された反応混合物中の未反応の遊離脂肪酸を、エステル化反応を触媒し得る酵素およびグリセロールの存在下でアルコールと反応させ、遊離脂肪酸を脂肪酸エステルに変換する、第４工程；および（５）得られた脂肪酸エステルを回収する工程；を含んでいる。以下、これらの各工程について、説明する。
【００６９】
（Ｃ−１：第１工程）
第１工程は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物中のグリセリドを加水分解し、グリセリド中の脂肪酸を遊離する工程である。このグリセリドの加水分解に特に制限はなく、化学的な加水分解でもよく、酵素による分解でも良い。
【００７０】
化学的な加水分解方法としては、当業者が通常行う方法、例えば、アルカリ加水分解、酸加水分解などの方法が挙げられる。
【００７１】
酵素を用いる場合、グリセリドを加水分解し得る酵素であれば、特に制限はない。トリグリセリドの１，３位に特異的であってもよく、非特異的であってもよい。グリセリドの２位に位置する脂肪酸は、反応中にアシル基転移を起こして１または３位に転移しやすいため、１，３位に特異的な酵素であっても、グリセリドの全ての脂肪酸を加水分解することができる。
【００７２】
このような酵素としては、上記リパーゼが好ましく用いられる。好ましくはキャンディダ・ルゴーサ（Candida rugosa）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、シュードモナス（Pseudomonas）属の微生物、あるいはアルカリゲネス（Alcaligenes）属の微生物のリパーゼが用いられる。より好ましくは、加水分解率が高いという観点から、キャンディダ・ルゴーサのリパーゼである。
【００７３】
リパーゼの形状は、粉末でも固定化されていてもどちらでもよいが、キャンディダ・ルゴーサのリパーゼを用いた加水分解反応では、粉末酵素を水に溶解して用いる方が好ましい。
【００７４】
第１工程における酵素で混合物中のグリセリドを加水分解する方法に特に制限はなく、静置、振盪、攪拌いずれの方法で行ってもよい。振盪または攪拌による方法が、反応を均一に行える点で好ましい。反応装置にも特に制限はなく、例えば、攪拌式リアクター、流動層型リアクターなどのバッチ型反応装置、あるいは、固定化酵素を充填したリアクターなどの連続型反応装置を用いてもよい。
【００７５】
加水分解における水分量は、加水分解が進行するならば、特に制限はない。好ましくは、反応液中に０．１から９５質量％、より好ましくは２〜８０質量％、さらにより好ましくは１０〜５０質量％含まれている。第１工程に用いる酵素量は、目的とする加水分解率を達成する量であれば特に制限はない。好ましくは加水分解したい油と水の質量の合計１ｇに対して０．１〜１００００単位（１単位は、オリーブ油を基質として１分間に１マイクロモルの脂肪酸を遊離する酵素量）、より好ましくは０．５から２０００単位、さらに好ましくは２から５００単位である。
【００７６】
第１工程の反応温度も特に制限はない。好ましくは０〜８０℃、より好ましくは１０〜５０℃、さらに好ましくは２０〜４０℃である。耐熱性酵素を使用する場合は、より高い温度が用いられる。
【００７７】
第１工程における反応時間に特に制限はない。好ましくは０．５〜１２０時間、より好ましくは２〜９６時間、さらにより好ましくは５〜７２時間である。連続反応の場合は、全体の反応速度を考慮して、決定すればよい。
【００７８】
加水分解終了後、反応混合物を油水分離によって得られた油層を回収する。油層の回収方法には特に制限はない。アルカリ加水分解あるいは酸加水分解を行った場合、処理後の反応液を適切なｐＨに調整後、油水分離を行うことが好ましい。例えば、まず、濾過などにより不純物を除き、ついで、静置、遠心分離などによって分離してくる油層を回収してもよい。回収した油層には通常、数％の水が含まれている。この水を蒸留などの手段によって数百ｐｐｍ以下まで減少させてから、次の第２工程（遊離脂肪酸のエステル化）を行ってもよい。しかし、エステル化反応により水が生成するという観点から、第２工程の前には特に蒸留などの脱水操作をおこなう必要はない。
【００７９】
(Ｃ−２:第２工程）
第２工程は、第１工程で回収した油層に含まれる遊離脂肪酸とアルコールとをエステル化反応を触媒し得る酵素の存在下で反応させ、脂肪酸エステルを得る工程である。使用する酵素およびアルコールとしては、前記第１発明で用いられる酵素およびアルコールが用いられる。
【００８０】
この第２工程におけるエステル化は、前記第１発明の第１反応工程で記載したエステル化とほぼ同一の条件で行われる。すなわち、添加するメタノール量は遊離脂肪酸に対して等モル量以上から、酵素の失活が認められない量であり、上記ダーク油のモデル混合物の場合、添加するメタノール量は、好ましくは、遊離脂肪酸に対して４モル当量以下、さらに好ましくは２モル当量以下である。ダーク油を原料とする場合、好ましくは、遊離脂肪酸に対して１０モル当量以下、さらに好ましくは７．５モル当量以下とすればよい。反応温度などの反応条件も上記第１発明の第１反応工程の記載の通りである。
【００８１】
第２工程では、脂肪酸エステルと同時に水が生成するため、遊離脂肪酸と脂肪酸エステルとの間で反応が平衡化する。そのためすべての遊離脂肪酸がエステル化されることはなく、遊離脂肪酸が存在する。そこで、第２工程で生じた水を反応混合物から除去する第３工程を行う。
【００８２】
（Ｃ−３：第３工程）
第３工程は、第２工程で生じた水を反応混合物から除去する工程である。この工程は、上記（Ｂ−２：水除去工程）と同じ方法が適用される。例えば、まず、濾過などにより不純物を除き、ついで、静置、遠心分離によって分離してくる油層を回収してもよい。さらに回収した油層を蒸留し、水とアルコールを除去してもよい。油層に存在する微量の水を除く方が、第４工程における反応の効率が良くなるという観点から、油層を蒸留することにより脱水、あるいは脱アルコールを行う方が好ましい。第４工程に使用する反応混合物の水分含量は、好ましくは５０００ｐｐｍ以下であり、より好ましくは１０００ｐｐｍ以下であり、さらに好ましくは３００ｐｐｍ以下である。
【００８３】
（Ｃ−４：第４工程）
第４工程は、第３工程で水が除去された反応混合物中の未反応の遊離脂肪酸を、エステル化反応を触媒し得る酵素およびグリセロールの存在下でアルコールと反応させ、遊離脂肪酸を脂肪酸エステルに変換する工程である。第４工程において使用する酵素およびアルコールは、前記第２工程と同じであり得る。第４工程において使用するアルコール量には特に制限がないが、メタノールを例にとると、添加するメタノール量は遊離脂肪酸に対して等モル量以上から、酵素の失活が認められない量（未反応の遊離脂肪酸に対して好ましくは５０モル当量以下、より好ましくは２０モル当量以下、さらにより好ましくは１０モル当量以下である。）
【００８４】
この第４工程では、未反応の遊離脂肪酸に対するエステル化率を高めるために、生成する水を除去しながら反応させる方が好ましい。生成する水を除去するためには、例えば、減圧下で反応させる方法や、モレキュラーシーブなどの脱水剤を使う方法などが知られている。しかし、モレキュラーシーブなどの脱水剤はコストが高いという欠点がある。減圧下で反応させる方法の場合、アルコールとしてメタノールやエタノールなどを用いた場合、これらのアルコールの沸点が水よりも低いため、現実的ではない。そこで、第４工程でグリセロールを添加して反応させることにより、生成水がグリセリン層に移行し、エステル化率を向上させることが可能となる。この反応に添加するグリセロールは、反応効率を高める効果があればいずれの量でも構わないが、第３工程終了後の脱水反応液とアルコールの合計に対して、好ましくは１〜５０質量％、より好ましくは２〜３０質量％である。グリセロールは、繰り返し使用しても良いし、毎回新たに添加しても良い。その他の反応温度、反応時間、酵素量、混合方法などの条件については、第２工程と同様の方法でおこなうことができる。
【実施例】
【００８５】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこの実施例に制限されないことはいうまでもない。なお、実施例１および２は第１発明の実施例、実施例３は第２発明の実施例である。
【００８６】
（実施例１：菜種油および遊離脂肪酸を含有する混合物からの脂肪酸エステルの調製）
（１Ａ：第１反応工程）
（１Ａ−１:固定化酵素の安定性に及ぼすメタノール量の影響）
菜種油（トリグリセリド）／菜種油由来の遊離脂肪酸の混合液（５０：５０， ｗｔ／ｗｔ）とメタノールとを、質量比で９：１（メタノール１０質量％；遊離脂肪酸に対して２モル当量）、８：２（メタノール２０質量％；遊離脂肪酸に対して４．４モル当量）、７：３（メタノール３０質量％；遊離脂肪酸に対して７．６モル当量）、５：５（メタノール５０質量％；遊離脂肪酸に対して１７．６モル当量）で混合した混合物１０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．０５ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１および２４時間後にそれぞれ０．２ｇをサンプリングし、生じた脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）含量をＴＬＣ−ＦＩＤ（イアトロスキャンＭＫ−５，ヤトロン社製）を用いて測定した。なお、ＴＬＣ−ＦＩＤ分析では、一次展開溶媒としてベンゼン：クロロホルム：酢酸＝５０：２０：０．５（容量比）を、二次展開溶媒としてヘキサン：ジエチルエーテル＝６５：５（容量比）を用いて行った。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新しい混合物を添加して反応を行った。このサイクルを８回繰り返した。なお、以降、トリグリセリドをＴＧと、遊離脂肪酸をＦＦＡと、そして脂肪酸メチルエステルをＦＡＭＥと省略して記載することがある。結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
反応初期である１時間後のＦＡＭＥ含量より、メタノール添加量が多いほどエステル化の速度が遅いことが分かる。メタノール含量が１０質量％（以下、ｗｔ％と記載する）および２０ｗｔ％の時の２４時間後のＦＡＭＥ含量は、ほぼ同じレベル（５０ｗｔ％）に達しており、かつ８サイクル繰り返してもＦＡＭＥ含量の低下が見られなかった。しかし、メタノール含量が３０ｗｔ％以上になると２４時間後のＦＡＭＥ含量は５０ｗｔ％に達せず、かつ反応の繰り返しと共にＦＡＭＥ含量が低下した。これは固定化酵素の不可逆的失活のためである。以上の結果から、第１反応工程（ＦＦＡのエステル化）に最適なメタノール含量は１０ｗｔ％（ＦＦＡに対して２倍モル当量）であることが分かった。
【００８９】
（１Ａ−２：固定化酵素量の影響）
菜種油／菜種油由来の遊離脂肪酸の混合液（５０：５０、ｗｔ／ｗｔ）９ｇにメタノールを１ｇ添加し、これに、種々の量（０．０２５ｇ、０．０５ｇ、０．１ｇ、０．２ｇ、および０．４ｇ）の固定化酵素（ノボザイム４３５）を加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１および２４時間後にそれぞれ０．２ｇをサンプリングし、生じたＦＡＭＥ、ＦＦＡ、ＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。結果を表２に示す。
【００９０】
【表２】
【００９１】
この結果から、酵素量の増加と共に反応速度が増加することがわかった。以下の実験では酵素量を０．５ｗｔ％とすることにした。なお、表２から、反応が進んでもＴＧ含量はあまり減少していなかったことが分かる。これは、ＦＦＡのエステル化によって生成する水がＴＧのメタノリシス反応を妨害しているためである。
【００９２】
（１Ａ−３：ＦＦＡのエステル化：連続反応による酵素の安定性）
菜種油／菜種油由来の遊離脂肪酸の混合物（５０：５０，ｗｔ／ｗｔ）を９ｇ、メタノールを１ｇ、および固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．０５ｇ混合して、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１、３、６、および２４時間後に０．２ｇサンプリングし、ＦＡＭＥ、ＦＦＡの含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新しい混合物を添加して反応を行った。これを１００日間繰り返した。結果を表３に示す。
【００９３】
【表３】
【００９４】
反応初期である１、３、および６時間後のＦＡＭＥ含量は、反応の繰り返しと共に少しずつ低下していったが（酵素活性の半減期１５０日以上）、１サイクルを２４時間としたとき、２４時間後のＦＡＭＥ含量は５０ｗｔ％以上、未反応のＦＦＡ含量は２％前後を維持していた。したがって、第１反応工程におけるＦＦＡのエステル化には、同じ固定化酵素を１００日以上繰り返して使用できることが分かった。なお、１００日目における２４時間後のＦＦＡ含量は２．７ｗｔ％であったが、反応時間を４８時間まで延長するとＦＦＡ含量は１．５ｗｔ％まで低下した。このことから、酵素活性が低下した時は反応時間を延長すれば良い（１サイクルの時間を長くすればよい）と言える。
【００９５】
以上の予備的検討後、菜種油／菜種油由来の遊離脂肪酸の混合液（５０：５０、ｗｔ／ｗｔ）１４４０ｇ、メタノールを１６０ｇ（ＦＦＡに対して２モル当量）、および８ｇのノボザイム４３５を２Ｌの撹拌翼付反応器にいれ、３０℃、１２０回転／分で撹拌しながら、２４時間反応させ、第１反応工程の反応液を得た。
【００９６】
（１Ｂ：脱水工程）
第１反応工程で得られた反応液から、水およびメタノールを４ｍｍＨｇ、８０℃、３０分の条件下で除去し、脱水混合物を得た。
【００９７】
（１Ｃ：第２反応工程）
（１Ｃ−１：メタノール量の影響）
１Ｂで得られた脱水混合物とメタノールとを質量比で９５：５（メタノール５ｗｔ％；グリセリド中の脂肪酸に対して等モル量）、９０：１０（メタノール１０ｗｔ％；グリセリド中の脂肪酸に対して２モル当量）、８０：２０（メタノール２０ｗｔ％；グリセリド中の脂肪酸に対して４モル当量）で混合した混合物１０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．４ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１、３、６、および２４時間後に０．２ｇサンプリングし、残存するＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。さらに２４時間を１サイクルとし、２４時間後に反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に、新しい脱水混合物を追加した。このサイクルを４回行った。各反応液について、反応初期におけるＴＧの減少速度を求めた。メタノール５ｗｔ％、１サイクル目のＴＧの減少速度を１００としたときの相対速度を表４に示す。
【００９８】
【表４】
【００９９】
第２反応工程では、１サイクル目ではメタノールが１０ｗｔ％の時、最も反応速度が速かった。メタノールが１０ｗｔ％より多くなると、反応の繰り返しと共に固定化酵素が失活していくことが分かった。これに対しメタノール５ｗｔ％の時は酵素の失活が見られなかった。
【０１００】
（１Ｃ−２：酵素量の影響）
脱水混合物とメタノールとを質量比９５：５で混合した混合物１０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．２〜１．０ｇ（脱水混合物に対して２〜１０ｗｔ％）加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。４、９、および２４時間後に０．２ｇサンプリングし、ＦＡＭＥ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。結果を表５に示す。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
表５からわかるように、添加した酵素量が２〜８ｗｔ％の場合は、酵素量の増加と共にＦＡＭＥ含量が増加した。酵素量１０ｗｔ％の時、ＦＡＭＥ含量がやや低下した。これは、反応速度の低下に起因すると思われる。以下の実験では、脱水混合物に対して、酵素量を６ｗｔ％に設定することにした。
【０１０３】
（１Ｃ−３：連続１００日間の運転）
脱水混合物とメタノールとを質量比９５：５で混合した混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．６ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。２時間後および２４時間後に０．２ｇサンプリングし、ＦＡＭＥ、ＦＦＡ、およびＴＧの各含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に、上記脱水混合物とメタノールとの混合物を添加して反応を行った。これを１００日間繰り返した。結果を表６に示す。
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
反応を繰り返すに従って、２時間後のＦＡＭＥ含量が増加し、ＴＧ含量が減少した。これは、反応の繰り返しと共に固定化酵素が活性化され、酵素の反応速度が増加したためである。反応開始から３０日目をすぎる頃から、酵素の反応速度が大きくなった。６０日を経過するころから、酵素活性が徐々に低下し始めた。なお、酵素活性の半減期は３００日程度と推定される。運転開始から５サイクル目までは１サイクル４８時間、６サイクル目以降は１サイクルを２４時間に設定すると、固定化酵素を１００日間連続使用してもＴＧ、およびＦＦＡ含量は、共に１ｗｔ％以下であり、ＦＡＭＥ含量が９８ｗｔ％以上を保っていた。このことから、第１反応工程〜第２反応工程を通じたＦＦＡおよびトリグリセリド中の脂肪酸のＦＡＭＥへの変換率は９８％以上であったことがわかる。
【０１０６】
以上の結果から、脱水混合物とメタノールとを質量比９５：５（グリセリド中の脂肪酸に対して等モル量のメタノール）で混合した混合物１０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．６ｇ（混合物に対して６ｗｔ％）加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させ、２４時間反応させた。脱水混合物中のＦＡＭＥへの変換率は９８％以上であり、酵素は１００日以上使用できた。
【０１０７】
（実施例２：ダーク油からの脂肪酸エステルの製造）
（２Ａ：ダーク油の前処理）
大豆および菜種油製造工程で発生した脱酸廃棄物を遠心分離し、水および不溶物を除去することにより、ダーク油を調製した。ダーク油の脱酸廃棄物からの回収率は約９０％であった。このダーク油の組成は、ロットにより異なるが、水分が約１ｗｔ％、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が約７５〜８０ｗｔ％、トリグリセリド（ＴＧ）が約５〜１０ｗｔ％、ジグリセリド（ＤＧ）が約３ｗｔ％、植物ステロールが約１ｗｔ％、ステリルエステルが約２ｗｔ％、残りがその他の炭化水素である。
【０１０８】
なお、この実験に用いたダーク油の脂肪酸組成は、パルミチン酸が５．６ｗｔ％、ステアリン酸が２ｗｔ％、オレイン酸が３９．３％、リノール酸が４４．９％、リノレン酸が７．６％であった。
【０１０９】
（２Ｂ：第１反応工程）
（２Ｂ−１:固定化酵素の安定性に及ぼすメタノール量の影響）
ダーク油とメタノールとを質量比９０．７：９．３（メタノール量はＦＦＡに対して等モル量）で混合した混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．３ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１、６、および２４時間後にそれぞれ０．５ｇサンプリングし、０．５Ｍ ＫＯＨ溶液を用いて酸価（試料１ｇを中和するのに要するＫＯＨのｍｇ数）を測定した。反応前と反応後の酸価の減少量から、ＦＦＡに対するエステル化率を求めた。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新しいダーク油混合物を添加して反応を行った。反応を１０回繰り返した。結果を表７に示す。
【０１１０】
【表７】
【０１１１】
菜種油および菜種油由来の遊離脂肪酸を用いた実施例１においては、メタノールを１０ｗｔ％添加したとき、表３のデータから固定化酵素の半減期を推定すると、１５０日以上であった。これに対して、ダーク油にメタノールを９．３ｗｔ％添加（ＦＦＡに対して等モル量）したとき、酵素の失活が非常に早くなり、酵素の半減期（１時間後のエステル化率より推定）は約３日であった。このように、実施例１の第１反応工程（ＦＦＡのエステル化）と同じ反応条件をダーク油の第１反応工程に当てはめることができないことが分かった。
【０１１２】
そこで、ダーク油を用いる場合の最適なメタノール濃度を検討した。ダーク油とメタノールとを、質量比で９０．７：９．３（ＦＦＡに対して等モル量のメタノール）、８３．０：１７．０（ＦＦＡに対して２モル当量のメタノール）、７６．５：２３．５（ＦＦＡに対して３モル当量のメタノール）、７１．０：２９．０（ＦＦＡに対して４モル当量のメタノール）、６６．２：３３．８（ＦＦＡに対して５モル当量のメタノール）、６２．０：３８．０（ＦＦＡに対して６モル当量のメタノール）、５６．６：４３．４（ＦＦＡに対して７．５モル当量のメタノール）、および４９．５：５０．５（ＦＦＡに対して１０モル当量のメタノール）の割合で混合した混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．３ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１時間後にそれぞれ０．５ｇをサンプリングし、０．５Ｍ ＫＯＨ溶液を用いて酸価を測定した。反応前と反応後の酸価の減少量から、ＦＦＡに対するエステル化率を求めた。２４時間後に反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たなダーク油混合物を添加して反応を行った。この１サイクルを２４時間として、このサイクルを５回繰り返し、以下の式：｛（５サイクル目に入って１時間目のエステル化率）／（１サイクル目の１時間目のエステル化率）｝×１００（％）の値を求め、固定化酵素の安定性を評価した。その結果を表８に示す。
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
実施例１でも記載したように、菜種油および菜種油由来の遊離脂肪酸を含む混合物では、メタノールが１０ｗｔ％の時、酵素は非常に安定であったが、メタノールを３０ｗｔ％以上含む場合、固定化酵素の失活がみられた。これとは逆に、ダーク油の第１反応工程では、メタノール量が９．３ｗｔ％の時、酵素は極めて不安定であった。そして、メタノール量が増加すると共に酵素が安定になり、メタノール量が２９．０から４３．４ｗｔ％のとき、固定化酵素は高い安定性を示すことがわかった。これは、ダーク油中に酵素反応を阻害する物質が含まれているために、メタノールによる希釈で酵素の安定性が高まったため、および／または酵素のメタノールによる失活を保護する物質がダーク油中に含まれているためと推定される。メタノール量３３．８ｗｔ％のとき、酵素の安定性が最も高かったので、今後の実験ではメタノール量を３３．８ｗｔ％（ＦＦＡに対して５モル当量）で行うことにした。
【０１１５】
（２Ｂ−２:酵素量の影響）
ダーク油とメタノールとを質量比で６６：３４の割合で混合したダーク油混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．０７５ｇ（０．２５ｗｔ％）、０．１５ｇ（０．５ｗｔ％）、０．３ｇ（１ｗｔ％）、０．６ｇ（２ｗｔ％）、または１．２ｇ（４ｗｔ％）加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１、３、６、および２４時間後にそれぞれ０．５ｇサンプリングし、０．５Ｍ ＫＯＨ溶液を用いて酸価を測定した。反応前と反応後の酸価の減少量から、ＦＦＡに対するエステル化率を求めた。結果を表９に示す。
【０１１６】
【表９】
【０１１７】
酵素量の増加と共に、エステル化反応の速度が大きくなることが分かる。以下の実験では、酵素量をダーク油とメタノールとの混合物に対して、１ｗｔ％使用することにした。
【０１１８】
（２Ｂ−３：ダーク油中のＦＦＡのエステル化：連続１００日間の運転）
ダーク油とメタノールとを質量比６６：３４の割合で混合したダーク油混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．３ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１、６、および２４時間後にそれぞれ０．５ｇをサンプリングし、０．５Ｍ ＫＯＨ溶液を用いて酸価を測定した。反応前と反応後の酸価の減少量から、ＦＦＡに対するエステル化率を求めた。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たなダーク油混合物を添加して反応を行った。反応を１００日間繰り返した。結果を表１０に示す。また、１サイクル目と１００サイクル目の反応の経時変化を表１１に示す。
【０１１９】
【表１０】
【０１２０】
【表１１】
【０１２１】
反応を繰り返すに従って、徐々に固定化酵素の活性が低下し、ＦＦＡに対するエステル化率が低下した。この時、固定化酵素の半減期は約１２０日と推定された。１サイクルを２４時間とすると、９０サイクル目までは９２％以上のエステル化率を保っていた。１００サイクル目、２４時間後のエステル化率は８８％であったが、反応時間を４８時間まで延長すると、エステル化率は９６％にまで上昇した。したがって、１００サイクル目以降は反応時間を伸ばせば、固定化酵素をさらに長期間使用できることが分かった。なおこの反応では、ＴＧ含量は殆ど変化しなかった。
【０１２２】
（２Ｂ−４：ダーク油中のＦＦＡのエステル化：スケールアップした連続１００日間の運転）
ダーク油とメタノールとを質量比６６：３４の割合で混合したダーク油混合物２０００ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を２０ｇ加えて、３０℃、１２０回転／分で攪拌しながら、５Ｌの反応槽内で反応させた。１、６、および２４時間後にそれぞれ０．５ｇサンプリングし、０．５Ｍ ＫＯＨ溶液を用いて酸価を測定した。反応前と反応後の酸価の減少量から、ＦＦＡに対するエステル化率を求めた。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たなダーク油混合物を添加して反応を行った。反応を１００日間繰り返した。結果を表１２に示す。
【０１２３】
【表１２】
【０１２４】
反応を繰り返すに従って、徐々に固定化酵素の活性が低下し、エステル化率が低下した。１サイクルを２４時間とすると、１００サイクル目までは９２％以上のエステル化率を保っていた。このように２Ｂ−３で記載した３０ｇスケールでの反応は、２Ｌスケールの反応へスケールアップしても完全に再現されることが分かった。
【０１２５】
以上の予備的検討後、ダーク油とメタノールとを質量比６６：３４（ＦＦＡに対して５モル当量のメタノール）の割合で混合した混合物１６００ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を１６ｇ加えて、３０℃、１２０回転／分で攪拌しながら２４時間反応させた。反応液を静置すると２層に分離したので、１１５５ｇの油層と、４３５ｇのメタノール層をそれぞれ回収した。
【０１２６】
（２Ｂ：脱水工程）
第１反応工程で得られた反応液から、水およびメタノールを、４ｍｍＨｇ、８０℃、３０分間の条件下で除去し、１１００ｇの油層（以下、ダーク油脱水画分という）を回収した。このダーク油脱水画分中のＦＦＡ含量は２．８ｗｔ％、ＴＧ含量は９．５ｗｔ％、水分含量は０．０３％であった（この値はロットによって異なる）。
【０１２７】
（２Ｃ：第２反応工程）
（２Ｃ−１：酵素の安定性の検討）
ダーク油脱水画分とメタノールとを質量比９４．５：５．５（グリセリド中の脂肪酸に対して５モル当量のメタノール）の割合で混合したダーク油脱水混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を１．８ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。２４時間後に０．２ｇをサンプリングし、残存ＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。さらに２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たなダーク油脱水混合物を添加し、反応を行った。これを５日間繰り返した。結果を表１３に示す。
【０１２８】
【表１３】
【０１２９】
１Ｃ−３で記載したように、菜種油および菜種油由来の遊離脂肪酸を用いた反応系における第２反応工程では、固定化酵素の半減期は３００日以上であった。これに対して、ダーク油脱水画分を用いた反応では、固定化酵素の失活のため、反応を繰り返すに従ってＴＧ残存量が増加し、５サイクル目で殆ど酵素活性を失っていることが分かった。このように、菜種油および菜種油由来の遊離脂肪酸を用いた反応系における第２反応工程と同じ反応条件を、ダーク油脱水画分を用いる第２反応工程に当てはめることができないことが分かった。
【０１３０】
（２Ｃ−２：酵素の安定化の検討−その１）
ダーク油脱水画分とメタノールとを質量比９４．５：５．５（グリセリド中の脂肪酸に対して５モル当量のメタノール）で混合したダーク油脱水画分混合物３０ｇに、グリセロール３．０ｇと固定化酵素（ノボザイム４３５）を１．８ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。２４時間後に０．２ｇをサンプリングし、残存するＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たなダーク油脱水画分とメタノールとの混合物を添加して反応を行った。２４時間を１サイクルとし、このサイクルを５回繰り返した。結果を表１４に示す。
【０１３１】
【表１４】
【０１３２】
ダーク油脱水画分中に含まれるグリセリドのアルコリシス反応において、グリセロールを添加することにより、酵素が安定化され、グリセロールを添加しない場合に比べてＴＧの残存量が減少した。しかし、５サイクル目でもＴＧが４．３ｗｔ％残っており、固定化酵素が長期間の連続反応に耐えないであろうと推測された。
【０１３３】
（２Ｃ−３：酵素の安定化の検討−その２）
２Ｃ−１と同様にして、ダーク油脱水画分を調製した。このダーク油脱水画分中のＴＧ含量は８．２ｗｔ％であった。このダーク油脱水画分を用いて、以下の検討を行った。
【０１３４】
（検討１）
ダーク油脱水画分とメタノールとを質量比９４．５：５．５（グリセリド中の脂肪酸に対して５モル当量のメタノール）の割合で混合した混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を１．８ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。２、４、および２４時間後にそれぞれ０．２ｇをサンプリングし、残存するＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たな混合物を添加して、反応を行った。反応を１０日間繰り返した。結果を表１５に示す。
【０１３５】
【表１５】
【０１３６】
ダーク油脱水画分に酵素とメタノール以外は何も添加しなかったとき、反応を繰り返すと、ＴＧ残存量が増加することから、固定化酵素が速やかに失活していることが分かる。この時、酵素活性の半減期は１０日以下であった。
【０１３７】
（検討２）
菜種油の添加効果を検討した。ダーク油脱水画分、菜種油、およびメタノールを質量比５２．０：４２．５：５．５（グリセリド中の脂肪酸に対して等モル量のメタノール）の割合で混合した混合物３０ｇ（この時のＦＡＭＥ含量は４９ｗｔ％、ＴＧ含量は４９ｗｔ％であった）に、固定化酵素（ノボザイム４３５）を１．８ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。２、４、および２４時間後にそれぞれ０．２ｇをサンプリングし、残存するＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たな混合物を添加して、反応を行った。反応を４１日間繰り返した。結果を表１６に示す。
【０１３８】
【表１６】
【０１３９】
菜種油を添加することにより、何も添加しないとき（検討１）に比較して、固定化酵素の安定性が増加し、酵素活性の半減期は、約２５日であった。したがって、ダーク油のアルコリシス反応において、植物油を添加することにより酵素の安定性が増加することが分かった。
【０１４０】
（検討３）
グリセロールと菜種油の添加効果を検討した。ダーク油脱水画分、菜種油、およびメタノールを質量比５２．０：４２．５：５．５（グリセリド中の脂肪酸に対して等モル量のメタノール）の割合で混合した混合物３０ｇ（この時のＦＡＭＥ含量は４９ｗｔ％、ＴＧ含量は４９ｗｔ％であった）に、グリセロールを３．０ｇおよび固定化酵素（ノボザイム４３５）を１．８ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。２、４、および２４時間後にそれぞれ０．２ｇをサンプリングし、残存するＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たな混合物を添加して、反応を行った。反応を１００日間繰り返した。結果を表１７に示す。
【０１４１】
【表１７】
【０１４２】
この表からわかるように、ダーク油のアルコリシス反応時に、グリセロールおよび菜種油を添加することにより、グリセロールの単独添加（２Ｃ−２）、あるいは菜種油の単独添加時（検討２）の時よりもさらに固定化酵素の安定性が増加した。酵素活性の半減期は１２０日程度まで伸びた。
【０１４３】
なお、反応開始から４サイクル目まで、および１００サイクル目以降では２４時間後の残存ＴＧ含量が１．５ｗｔ％よりも大きくなった。しかし、反応時間を４８時間まで伸ばすことにより、残存ＴＧ含量を検出限界以下まで下げることができた（データ示さず）。また、残存ＴＧ含量が検出限界以下まで下がったとき、第１反応工程〜第２反応工程を通したＦＦＡとグリセリド中の脂肪酸のＦＡＭＥへの変換率は９８〜９９％、酸価は１．２であった。
【０１４４】
これらの結果から、ダーク油を用いる第２反応工程では、ダーク油脱水画分のみを反応に使用すると、酵素の耐久性が悪いことがわかった。一方、ダーク油脱水画分にトリグリセリド（植物油）およびグリセロールを添加することによって、酵素の安定性が格段に向上することが分かった。このトリグリセリド（植物油）およびグリセロールを含む第２反応工程を、１サイクルを２４時間、ＴＧ残存量１．５ｗｔ％以下に目標を設定した場合、固定化酵素は少なくとも１００サイクル連続使用可能で、１００サイクル目以降は反応時間を４８時間に伸ばせばさらに長期間連続使用可能となる。
【０１４５】
（２Ｃ−４：酵素の安定化の検討（スケールアップ）−その３）
ダーク油脱水画分、菜種油、およびメタノールを質量比５２．０：４２．５：５．５で混合した混合物２０００ｇ（この時のＦＡＭＥ含量は４９ｗｔ％、ＴＧ含量は４９ｗｔ％であった）に、グリセロール２００ｇと固定化酵素（ノボザイム４３５）を１２０ｇ加えて、３０℃、１４０回転／分で攪拌しながら反応させた。２、４、および２４時間後にそれぞれ０．２ｇをサンプリングし、ＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たな混合物を添加して、反応を行った。反応を１００日間繰り返した。結果を表１８に示す。
【０１４６】
【表１８】
【０１４７】
ダーク油脱水画分混合物を２０００ｇにスケールアップして反応させたとき、小スケールでの反応（表１７）の時に比べて反応速度が速かった。これは、小スケールの場合、５０ｍｌのバイアル瓶内で３０ｇの混合物の往復振盪であったことと、反応系に添加したグリセロールの粘度が高いことなどの理由で、酵素と反応液との混合効率があまり良くなかったからと思われる。これに対し、２Ｌスケールでの反応では、攪拌翼を用いて攪拌したため、酵素と反応液との混合効率が向上し、反応速度が向上したと考えられる。また、２Ｌスケールでの反応における酵素の安定性は、３０ｇスケールでの安定性と同じであった。このように、ダーク油からの脂肪酸エステルの製造を２Ｌにスケールアップしても、十分な反応効率と安定性が得られることが分かった。なお、２Ｌスケールでの反応における第１反応工程〜第２反応工程を通したＦＦＡおよびグリセリド中の脂肪酸のＦＡＭＥへの変換率は９８〜９９％、酸価は１．２であった。
【０１４８】
（実施例３：ダーク油からの脂肪酸エステルの製造）
（３Ａ：ダーク油の前処理）
大豆および菜種油製造工程で発生した脱酸廃棄物を遠心分離し、水および不溶物を除去することにより、ダーク油を調製した。実施例３に用いたダーク油の組成は、水分が約１ｗｔ％、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が７７．９ｗｔ％、トリグリセリド（ＴＧ）が１２ｗｔ％、ジグリセリド（ＤＧ）が４．８ｗｔ％、植物ステロールが０．９ｗｔ％、ステリルエステルが２．２ｗｔ％、残りがその他の炭化水素である。酸価は１５１ｍｇ ＫＯＨ／ｇであった。
【０１４９】
（３Ｂ：第１工程）
ダーク油１．７ｋｇに、水１．１３ｋｇおよび５６，６００単位のキャンディダ・ルゴーサのリパーゼを添加し、１２０ｒｐｍで攪拌しながら、３０℃で反応させた。反応は１０時間でほぼ定常に達した。攪拌を停止後、反応液を６０℃まで上昇させて静置することにより水層と油層を分離させ、上層の油分を回収した。この油分（以下、ダーク油加水分解油分と略する）の組成を調べたところ、ＦＦＡ；９１．５ｗｔ％、ＴＧ；０．８ｗｔ％、ＤＧ；０．２ｗｔ％、ステロール；０．４ｗｔ％、ステリルエステル；２．５ｗｔ％、その他の炭化水素；４．６ｗｔ％をそれぞれ含んでおり、酸価は１８３ｍｇ ＫＯＨ／ｇであった。このダーク油加水分解油分には水分量が１．５ｗｔ％含まれていたが、蒸留などによる脱水をせずに、次の工程をおこなった。
【０１５０】
（３Ｃ：第２工程）
（３Ｃ−１：ダーク油加水分解油分のエステル化；メタノール量の影響）
ダーク油加水分解油分とメタノール（ＦＦＡに対して等モル量、２モル当量、５モル当量、７モル当量、および１０モル当量のメタノール）の混合液１０ｇ、および固定化酵素（ノボザイム４３５）０．１ｇを３０℃で振とうしながら反応させた。１サイクル目（反応開始から１または２４時間後）にそれぞれ０．５ｇサンプリングし、０．５Ｍ ＫＯＨ溶液を用いて酸価を測定した。反応前後の酸価の減少量から、ＦＦＡに対するエステル化率を求めた。反応液を回収・除去し、残った固定化酵素に上記と同様に新たな混合物を添加して、さらに２４時間反応を行った（２サイクル目の反応）。１サイクルを２４時間として、このサイクルを５回繰り返し、以下の式：｛（５サイクル目に入って１時間目のエステル化率）／（１サイクル目の１時間目のエステル化率）｝×１００（％）の値を求め、固定化酵素の安定性を評価した。結果を表１９に示す。
【０１５１】
【表１９】
【０１５２】
１サイクル目（２４時間後）のエステル化率は、２モル当量以上のメタノール添加で９４%以上に達した。しかし、５モル当量以上添加してもエステル化率は９６%を越えなかった。１サイクル目と５サイクル目のエステル化率から、固定化酵素の安定性を測定した結果、固定化酵素は理論量よりも５から７モル当量のメタノール存在下で高い安定性を示すことがわかった。この結果は、表８の結果とよく似ている。
【０１５３】
（３Ｃ−２：ダーク油加水分解油分のエステル化；経時変化および連続反応）
ダーク油加水分解油分６６ｇ、メタノール３４ｇ（ＦＦＡに対して５モル当量）と固定化酵素（ノボザイム４３５）１ｇを３０℃で振とうしながら反応させた。適宜サンプリングして反応液の酸価を測定し、反応前後の酸価の減少量からＦＦＡに対するエステル化率の経時変化を求めた。結果を表２０に示す。
【０１５４】
【表２０】
【０１５５】
反応はおよそ１０時間で定常に達し、２４時間後のＦＦＡに対するエステル化率は９６％であった。さらに、本反応を２４時間毎に基質を交換して繰り返した。その結果、１００日間以上同様の反応率が維持されており、１００サイクル目、２４時間後のＦＦＡに対するエステル化率は、１サイクル目のそれと全く同じであった。
【０１５６】
（３Ｄ：第３工程）
第４工程のための試料を調製した。第１工程で得られたダーク油加水分解油分６６０ｇ、メタノール３４０ｇと固定化酵素（ノボザイム４３５）１０ｇを３０℃、１５０回転／分で攪拌しながら２４時間反応させた。静置後、分離したメタノール層を除去した。油層を回収し、残存するメタノールおよび水を４ｍｍＨｇ、８０℃、３０分の条件下で除去すると、ＦＦＡを３．５ｗｔ％および水を０．０３ｗｔ％含む油分６７３ｇが得られた。この油分を、以下、第３工程脱水油分といい、残存するＦＦＡをさらにエステル化するために、次の第４工程に供した。
【０１５７】
（３Ｅ：第４工程）
（３Ｅ−１：未反応ＦＦＡのエステル化：グリセロールの添加効果）
第３工程脱水油分とメタノール（残存するＦＦＡに対して等モル、５モル当量、および１０モル当量のメタノール）の混液１０ｇに固定化酵素（ノボザイム４３５）０．１ｇを加え、３０℃で振とうしながら２４時間反応させた。２４時間後、反応液の酸価を測定し、反応前後の酸価の減少量からＦＦＡに対するエステル化率を求めた。
【０１５８】
他方で、エステル化反応に伴って生成する水の除去を目的として、反応系にグリセロールを添加した。第３工程脱水油分とメタノール（残存するＦＦＡに対して等モル、５モル当量、および１０モル当量のメタノール）の混液１０ｇに、グリセロール１ｇと固定化酵素（ノボザイム４３５）０．１ｇを加え、３０℃で振とうしながら２４時間反応させた。２４時間後、反応液の酸価を測定し、反応前後の酸価の減少量からＦＦＡに対するエステル化率を求めた。その結果を表２１に示す。
【０１５９】
【表２１】
【０１６０】
残存ＦＦＡに対して等モル量(０．４ｗｔ％)のメタノールを添加したとき、残存ＦＦＡに対する反応率は８％に過ぎなかった。そこで、この反応率を向上させるために、メタノール量を５モル当量（２．２ｗｔ％）および１０モル当量（４．４ｗｔ％）に増加させたとき、エステル化率は各々４３％、５２％に上昇し、２回のエステル化反応を合わせた総反応率は９８％に達した。したがって、第４工程において、効率の良いエステル化のためには、メタノールを過剰量添加しなければならないことがわかった。
【０１６１】
他方、グリセロールを添加したとき、残存ＦＦＡに対するエステル化率は、等モル量のメタノール添加でも６７％、５モル当量の添加で７１％にまで上昇し、２回のエステル化反応を合わせた総反応率は９９％に到達した。したがって、グリセロールの添加によって生成水がグリセロール層へ移行し、エステル化率が格段に向上すること、また、メタノールを過剰量添加しなくても高いエステル化率が得られることがわかった。
【０１６２】
（３Ｅ−２：未反応ＦＦＡのエステル化、連続反応）
第３工程脱水油分とメタノール（残存するＦＦＡに対して５倍モル当量）の混液１０ｇに、グリセロール１ｇと固定化酵素（ノボザイム４３５）０．１ｇを加え、３０℃で振とうしながら２４時間反応させた。２４時間後、反応液を回収・除去し、残った固定化酵素に上記と同様に新たな混合物を添加して、反応を１００日間繰り返した。その結果、２回のエステル化反応を合わせた総反応率は１００日間高いレベルを維持し、３０日目までは９９%、３１から１００日目までは９８．５%以上であった。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明の方法により、食用油などの製造工程で発生する脱酸廃棄物に含まれる遊離脂肪酸およびグリセリドから効率よく脂肪酸エステルが製造される。そのため、廃棄物の利用が可能となるとともに、生じた脂肪酸エステルは、バイオディーゼル燃料として利用されるため、二酸化炭素、窒素酸化物、硫黄化合物などの地球温暖化物質あるいは大気汚染物質の環境への放出を減少できるので、産業上有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸エステルの製造方法に関する。さらに詳しくは、グリセリドと遊離脂肪酸を含む混合物、特に食用油の製造工程において発生する脱酸廃棄物に由来する油分（以下、ダーク油ということがある）からの脂肪酸エステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油、石炭などの化石燃料を燃焼させると、二酸化炭素、ＮＯｘ、ＳＯｘなどが発生し、地球温暖化、大気汚染などの原因となる。その中でも、ディーゼル自動車に用いられている軽油には窒素化合物、硫黄化合物などが含まれており、ＣＯ２、ＮＯｘ、ＳＯｘなどが大量に発生する。そこで、この軽油の代わりに、天然に存在する植物、動物、魚あるいは微生物が生産する油脂を用いる、いわゆるバイオディーゼル燃料の開発が進められている。
【０００３】
バイオディーゼル燃料（以下、単にバイオ燃料ということがある）は、脂肪酸低級アルコールエステルであり、植物油などの構成成分である脂肪酸と低級アルコールとの反応により得られる。欧米では、特にバイオ燃料への関心が高く、植物油をバイオ燃料に変換し、軽油と混合して利用している。バイオ燃料生産量は年々増加傾向にあり、２００３年には１６６万ｋＬのバイオ燃料が世界中で生産されている。
【０００４】
バイオ燃料を製造する方法には、化学的方法と生物学的方法とがある。現在のバイオ燃料生産の主流である化学的方法ではアルカリ触媒を用いるが、製造過程で発生するアルカリ性廃棄物の処理が問題になっている。そこで、酵素（リパーゼ）を用いる生物学的方法が検討されている。
【０００５】
生物学的方法においては、資源の有効利用の観点から、廃食用油をバイオ燃料に変換する技術が開示されている（例えば、特許文献１、非特許文献１〜３などを参照）。特許文献１においては、廃食用油に含まれるトリグリセリドをアルコリシスして、トリグリセリドを構成する脂肪酸をエステル化し、脂肪酸エステル（すなわち、バイオ燃料）を得る方法を記載している。この方法においては、トリグリセリド１モルから３モルの脂肪酸が遊離することから、理論的に等モルとなるようにトリグリセリドに対して３モルのメタノールを添加すると、酵素が不可逆的に失活することが記載されている。この酵素が失活する問題を解消するため、メタノールを廃食用油に逐次添加し、脂肪酸メチルエステルへの変換率を９６％以上にすることができる。しかも、酵素を連続的に100日以上繰り返し使用することができる。
【０００６】
また、遊離脂肪酸をバイオ燃料に変換する方法も検討されている（例えば、特許文献２、非特許文献４）。この方法では、遊離脂肪酸、メタノール、固定化酵素を含む反応系で反応させると、エステル化に伴って生成する水のため、エステル化率を８３％よりも高めることができない。そこで、エステル化反応後に生成する水を除去し、再びメタノールと固定化酵素を添加して、さらにエステル化を行う２段階酵素法を採用することにより、エステル化率を９５〜９８％にまで高めることができたことが記載されている。
【０００７】
ところで、食用油、特に植物油などは、一般に、搾油、脱ガム、脱酸、脱色、脱臭などの各工程を経て製造される。脱ガム工程で排出される副成物は乳化剤として利用されているレシチンやリゾレシチンを製造する原料として利用される。また、脱色工程からの廃棄物である着色白土の一部はコンクリート助剤や土壌改良剤として利用されている。さらに、脱臭工程からの廃棄物はトコフェロール、ステロール、ステリルエステル生産の原料として活用されている。
【０００８】
一方、脱酸工程で排出される脱酸廃棄物（アルカリ油滓）には約５０％の水、２５％の脂肪酸、２５％の中性脂質（トリグリセリドとジグリセリド）が含まれ、年間約１２万トン排出されている。この脱酸廃棄物からは脂肪酸が抽出され、この脂肪酸は、塗料、潤滑油、石鹸などの原料として使用されている。しかし、脂肪酸の需要の低下から価格の下落を引き起こしている。そのため、脂肪酸エステルとして、再資源化し、バイオ燃料を製造することが望まれている。
【０００９】
この脱酸廃棄物はアルカリ性であるため、このまま酵素を作用させることができない。そこで、酵素を作用させるためには、脱酸廃棄物を硫酸、塩酸、リン酸などの酸で中和した後、水を除去して油分を回収する必要がある。この回収された油分にはグリセリドおよび遊離脂肪酸が含まれているが、この油分に酵素とアルコールとを作用させても、グリセリドと遊離脂肪酸の両方を同時に脂肪酸エステルに変換することはできない。これは、遊離脂肪酸のエステル化に伴って生成する水がグリセリドのアルコリシスを妨害するからである。そこで、グリセリドと遊離脂肪酸との混合物から、効率よく脂肪酸エステルを製造する方法の開発が望まれている。
【特許文献１】国際公開公報 ＷＯ００／１２７４３号公報
【特許文献２】特開２００１−２４５６８６号公報
【非特許文献１】島田ら、J. Am. Oil Chem. Soc., 76巻, 789-793頁 (1999年)
【非特許文献２】渡辺ら、J. Am. Oil Chem. Soc., 78巻, 703-707頁 (1999年)
【非特許文献３】島田ら、J. Mol. Cat. B: Enzyme 17巻, 133-142頁 (2002年)
【非特許文献４】渡辺ら、J. Oleo Sci., 51巻, 655-661頁 (2002年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸アルコールエステルを効率よく製造する方法を提供することを目的とする。特に、例えば、脱酸廃棄物に由来するダーク油から簡単な方法で、脂肪酸低級アルコールエステル（バイオ燃料）を回収する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸エステルを製造する方法であって、（１）エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下、該遊離脂肪酸とアルコールとを反応させて脂肪酸エステルを得る第１反応工程；（２）第１反応工程で生じた水を反応混合物から除去する工程；（３）該水が除去された反応混合物とアルコールとを、グリセリドをアルコリシスし得る酵素の存在下で反応させ、グリセリド中の脂肪酸を脂肪酸エステルに変換する第２反応工程；および（４）得られた脂肪酸エステルを回収する工程；を含む方法を提供する。
【００１２】
一つの実施態様では、前記アルコールが直鎖低級アルコールである。
【００１３】
好ましい実施態様では、直鎖低級アルコールがメタノールまたはエタノールである。
【００１４】
別の実施態様では、前記混合物が脱酸廃棄物に由来する油分（ダーク油）である。
【００１５】
異なる実施態様では、前記第２反応工程において、グリセロールおよび／またはグリセリドを添加してアルコリシスが行われる。
【００１６】
さらに別の実施態様では、前記グリセリドが植物油脂、動物油脂、魚油、および微生物油脂からなる群から選択される少なくとも一つの油脂である。
【００１７】
また、別の実施態様では、前記油分が、植物油脂、動物油脂、魚油、または微生物油脂からの油脂の製造工程において発生する脱酸廃棄物に由来する。
【００１８】
異なる実施態様では、前記第１反応工程において、直鎖低級アルコールは、遊離脂肪酸に対して等モル以上から前記酵素を失活させない量で使用され、第２反応工程において添加する直鎖低級アルコールは、グリセリド中の脂肪酸に対して０．５モル当量以上から前記酵素を失活させない量で使用される。
【００１９】
さらに、本発明は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸エステルを製造する方法であって、（１）該グリセリドを加水分解して脂肪酸を遊離させ、油水分離により遊離脂肪酸を主成分とする油分を得る第１工程；（２）エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下、該第１工程で生じた遊離脂肪酸とアルコールを反応させ、脂肪酸エステルを得る第２工程；（３）該第２工程で生じた水を反応混合物から除去する第３工程；（４）該第３工程で水が除去された反応混合物中の未反応の遊離脂肪酸を、エステル化反応を触媒し得る酵素およびグリセロールの存在下でアルコールと反応させ、遊離脂肪酸を脂肪酸エステルに変換する、第４工程；および（５）得られた脂肪酸エステルを回収する工程；を含む方法を提供する。
【００２０】
一つの実施態様では、前記第１工程の加水分解が、グリセリドを加水分解し得る酵素および水の存在下、行われる。
【００２１】
一つの実施態様では、前記アルコールが、直鎖低級アルコールである。
【００２２】
別の実施態様では、前記直鎖低級アルコールが、メタノールまたはエタノールである。
【００２３】
別の実施態様では、前記混合物が脱酸廃棄物に由来する油分（ダーク油）である。
【００２４】
さらに別の実施態様では、前記油分が、植物油脂、動物油脂、魚油、または微生物油脂からの油脂の製造工程において発生する脱酸廃棄物に由来する。
【００２５】
異なる実施態様では、前記第４工程において、グリセロール量が反応液合計量の１〜５０質量％である。
【００２６】
さらに別の実施態様においては、前記第２および第４工程において、直鎖低級アルコールは、遊離脂肪酸に対して等モル量以上から酵素を失活させない量で使用される。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の方法により、遊離脂肪酸およびグリセリドを含む混合物、例えば、食用油の製造工程で発生する脱酸廃棄物に由来する油分（ダーク油）などから、簡便な方法および装置で、バイオ燃料が製造される。例えば、大豆油製造過程で発生する脱酸廃棄物に由来する油分（例えばダーク油）に含まれるグリセリドと遊離脂肪酸の脂肪酸メチルエステルへの変換率は９８％以上であり、１００日以上連続して、酵素の失活を起こすことなく、脂肪酸エステルが生産される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（Ａ：本発明に用いられる材料）
（Ａ−１：遊離脂肪酸とグリセリドとの混合物）
本発明に用いられる遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物は、種類および起源を問わない。好ましい混合物は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する脱酸廃棄物である。脱酸廃棄物は、植物、動物、魚、微生物などを原料とし、植物油脂、動物油脂、魚油、微生物油脂などを製造する工程の１つである脱酸工程で発生する廃棄物をいう。植物油脂としては、例えば大豆油、菜種油、パーム油、オリーブ油、綿実油、米ぬか油、亜麻仁油、月見草油、胡麻油などが挙げられる。動物油脂としては、牛脂、豚脂、鯨油、アザラシ油などが挙げられる。魚油としては、イワシ油、マグロ油、サケ油などが挙げられる。微生物が生産する油としては、モルティエレラ属(Mortierella)やシゾキトリウム属(Schizochytrium)が生産する油脂などが挙げられる。
【００２９】
通常、脱酸工程後の原油中の遊離脂肪酸の中和には、水酸化ナトリウム水溶液が用いられるため、脱酸廃棄物自体は水を含んだアルカリ性であり、遊離脂肪酸は脂肪酸の金属塩（石鹸）として存在している。そのため、本発明に用いる原料とするためには、塩酸、硫酸、リン酸などの酸による中和、遠心分離や濾過などによる不溶性物質の除去、遠心分離や蒸留などによる水分の除去などの処理が必要となる。あるいは脱酸廃棄物を加圧条件下でケン化分解した後、中和する処理が必要となる。ダーク油は、このような処理を経て得られる油である。ダーク油以外にも、脱ガム油滓、脱臭留出物などが用いられる。以下、脱酸廃棄物由来の油分として、ダーク油を用いる場合について主に説明するが、その他の油分についても同様である。
【００３０】
なお、本発明に用いる混合物中の遊離脂肪酸とグリセリドとの比率（モル比、質量比）は特に制限されない。例えば、遊離脂肪酸とグリセリドとは、質量比で５：９５〜９５：５、あるいは１０：９０〜９０：１０の割合で含まれる混合油が用いられる。
【００３１】
（Ａ−２：グリセリド）
本発明で、グリセリドは中性脂質ともいい、グリセロールと脂肪酸とのエステルをいい、トリグリセリド（ＴＧ）、ジグリセリド（ＤＧ）およびモノグリセリド（ＭＧ）からなる群から選択される少なくとも一つのアシル化グリセロールを含有する。
【００３２】
（Ａ−３：遊離脂肪酸）
遊離脂肪酸は、遊離のカルボキシル基を有する脂肪酸をいい、その種類を問わない。好ましくは、炭素数が６〜２２の遊離脂肪酸である。一価の脂肪酸が好ましく用いられる。遊離脂肪酸は、直鎖の脂肪酸であってもよく、分岐の脂肪酸であってもよい。また、飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。一般には、植物油、動物油、魚油、微生物油などに含まれる遊離脂肪酸またはこれらの油に含まれるグリセリドに由来する遊離脂肪酸が好ましく用いられる。
【００３３】
（Ａ−４：アルコール）
以下に説明する、本発明の第１発明における第１反応工程および第２反応工程、あるいは第２発明における第２工程および第４工程において用いられるアルコールに制限はなく、一価および多価アルコールが用いられる。バイオ燃料に用いるには一価のアルコールが好ましく、炭素数１〜８の直鎖低級アルコールがさらに好ましく用いられる。もっとも好ましくは、メタノールおよびエタノールである。
【００３４】
（Ａ−５：酵素）
本発明には、遊離脂肪酸のエステル化反応を触媒し得る酵素、グリセリドをアルコリシスし得る酵素、および、グリセリドを加水分解し得る酵素が用いられる。リパーゼは、これらの活性を有するので、特に好ましく用いられる。リパーゼ以外にも、エステラーゼ、クチナーゼ、ホスフォリパーゼなども用いることができる。
【００３５】
リパーゼは、トリグリセリドなどの中性脂質に作用して、トリグリセリドをグリセロールまたは部分グリセリドと脂肪酸に分解する能力を有する酵素を指す。このリパーゼは、トリグリセリドの１，３−位に特異的であってもよく、非特異的であってもよい。脂肪酸エステルへの変換という面から、非特異的である方がより好ましい。
【００３６】
リパーゼの起源は問わない。微生物、動物、植物などに由来する酵素が用いられる。例えば、微生物に由来するリパーゼとしては、リゾムコール属、ムコール属、アスペルギルス属、リゾプス属、ペニシリウム属等に属する糸状菌；キャンディダ属、ゲオトリカム属、ピヒア属等に属する酵母；シュードモナス属、セラチア属、アルカリゲネス属、バークホルデリア属、スタッフィロコッカス属、バシラス属（枯草菌）等に属する細菌；などに由来するリパーゼが用いられる。動物に由来するリパーゼとしては、豚膵臓等に由来するリパーゼが挙げられる。
【００３７】
市販の酵素も用いられる。例えば、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）由来のリパーゼ（商品名：リポザイムＩＭ６０、ノボザイムズ社製）、キャンディダ・アンタークティカ（Candida antarctica）のリパーゼ（商品名：ノボザイム４３５、ノボザイムズ社製）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae：旧称Rhizopus delemar）のリパーゼ（商品名：リパーゼＴ、リパーゼＤ、またはリパーゼＦ−ＡＰ１５、天野エンザイム社製）、サーモマイセス・ラヌギノーサ（Thermomyces lanuginosa：旧称Humicola lanuginosa）のリパーゼ（商品名：リポザイムＴＬＩＭ、ノボザイムズ社製)、キャンディダ・ルゴーサ（Candida rugosa：旧称Candida cylindracea）のリパーゼ（商品名：リパーゼＯＦ、名糖産業社製）、シュードモナス（Pseudomonas）属のリパーゼ（商品名：リパーゼＰＳ、リパーゼＡＫ、天野エンザイム社製）、アルカリゲネス（Alcaligenes）属のリパーゼ（商品名：リパーゼＱＬＭ、名糖産業社製）などが挙げられる。
【００３８】
使用する酵素の形状は問わない。粉末でもよいし、固定化されていてもよい。また、リパーゼを産生する微生物、細胞表層にリパーゼを提示している微生物を直接用いてもよいし、これらの微生物を固定化して用いてもよい。これらの中では、酵素の再使用が容易という面から、固定化されたリパーゼを用いるのが最も好ましい。
【００３９】
これらのリパーゼを担体に固定化する方法は公知であり、担体としては、イオン交換樹脂、セラミック樹脂、ガラスビーズ、ケイ藻土、活性炭等が挙げられる。耐久性、リパーゼとの親和性などを考慮すると、イオン交換樹脂、セラミック担体等がより好ましい。固定化方法としては、包括法、架橋法、物理的吸着法、イオン吸着法、疎水結合法などが挙げられるが、架橋法、イオン吸着法、疎水結合法がより好ましい。
【００４０】
本発明は、以下に説明する第１発明および第２発明を含んでいる。いずれの発明も、複数回の酵素反応を行い、その間に脱水処理を施すこと、各反応工程において同じ酵素を用いてもよいことなどから、酵素は固定化されていることが好ましい。固定化酵素としては、市販の固定化リパーゼ、例えば、商品名：ノボザイム４３５、リポザイムＩＭ６０、リポザイムＴＬＩＭ（いずれもノボザイムズ社製）などが用いられる。固定化されたノボザイム４３５が最も好ましく用いられる。あるいは、常法に基づいて、上記微生物あるいは上記微生物に由来する酵素を精製し、固定化して用いてもよい。
【００４１】
（本発明の方法）
本発明は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸エステルを回収する方法であって、（Ａ）この混合物中の遊離脂肪酸をまず脂肪酸エステルとし、ついで、グリセリド中の脂肪酸をアルコリシスによって脂肪酸エステルとし、得られた脂肪酸エステルを回収する第１発明と（Ｂ）この混合物中のグリセリドを加水分解してグリセリド中の脂肪酸を遊離脂肪酸とし、ついで、混合物中の遊離脂肪酸を２段階の反応で脂肪酸エステルとし、得られた脂肪酸エステルを回収する第２発明の２つの発明を含む。以下、それぞれの発明について説明する。
【００４２】
（第１発明）
第１発明は、（１）遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物とアルコールとを、エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下で反応させ、遊離脂肪酸をエステル化する、第１反応工程と、（２）第１反応工程で生じた水を除去する工程、（３）水が除去された脱水混合物とアルコールとを、グリセリドをアルコリシスし得る酵素の存在下で反応させる第２反応工程；および（４）得られた脂肪酸エステルを回収する工程；を含んでいる。以下、これらの各工程について、説明する。
【００４３】
（Ｂ−１：第１反応工程）
第１反応工程は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物とアルコールとを、エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下で反応させ、遊離脂肪酸をエステル化する工程である。この工程においては、エステル化反応により水が生成する。この生成した水により、グリセリドのアルコリシスが阻害される結果、第１反応においては、遊離脂肪酸のアルコールエステル化が、選択的に進行する。この反応に使用する酵素およびアルコールは上記の通りである。
【００４４】
一般に、アルコール、特にメタノールが過剰に存在する反応系では、反応は進行するものの、酵素が失活しやすく、酵素の繰り返し利用が困難になる。そのため、酵素の繰り返し利用を目的としないときは過剰量のアルコールを添加しても構わないが、酵素の繰り返し利用を目的とする場合、用いる酵素が失活しないアルコール濃度で使用することが必要である。以下、メタノールを使用する場合について説明するが、他のアルコールについても、同様である。
【００４５】
植物油と遊離脂肪酸との混合物をエステル化する場合、例えば、トリグリセリドと遊離脂肪酸が質量比で１：１程度含まれている混合物（ダーク油のモデル混合物）のとき、添加するメタノール量は、遊離脂肪酸に対して等モル以上から、酵素の失活が認められない量とする必要がある。好ましくは、遊離脂肪酸に対して４モル当量以下、さらに好ましくは２モル当量以下とする必要がある。
【００４６】
ダーク油を原料とする反応において使用するメタノール量の決定方法も、基本的には上記ダーク油のモデル混合物の場合と同じである。すなわち、メタノールは遊離脂肪酸に対して等モル量以上から酵素の失活が認められない量にすればよい。好ましくは、遊離脂肪酸に対して１０モル当量以下、さらに好ましくは７．５モル当量以下とすればよい。ただし、ダーク油の場合は、酵素反応を阻害する物質および／または酵素をメタノールによる失活から保護する物質が含まれている可能性がある。酵素のメタノールによる失活を保護する物質が含まれている場合には、ダーク油のモデル混合物を原料としたときより多い量のメタノールを添加することにより、酵素が安定となり、効率的に遊離脂肪酸のエステル化反応を行うことができる。
【００４７】
第１反応工程における酵素、混合物およびアルコールを反応させる方法に特に制限はなく、静置、振盪、攪拌いずれの方法で行ってもよい。振盪または攪拌による方法が、反応を均一に行える点で好ましい。反応装置にも特に制限はなく、例えば、攪拌式リアクター、流動層型リアクターなどのバッチ型反応装置、あるいは、固定化酵素を充填したリアクターなどの連続型反応装置を用いてもよい。
【００４８】
第１反応工程に用いる酵素量は、目的とする反応率を達成し得る量であれば、特に制限はない。好ましくはダーク油の質量に対して０．０５〜４０質量％、より好ましくは０．２〜１０質量％、さらに好ましくは０．５〜５質量％である。
【００４９】
第１反応工程の反応温度も特に制限はない。好ましくは０〜８０℃、より好ましくは１０〜５０℃、さらに好ましくは２０〜４０℃である。耐熱性酵素を使用する場合は、より高い温度が用いられる。
【００５０】
第１反応工程における反応時間に特に制限はない。好ましくは０．５〜１２０時間、より好ましくは２〜９６時間、さらにより好ましくは５〜７２時間である。連続反応の場合は、全体の反応速度を考慮して、決定すればよい。
【００５１】
例えば、第１反応工程でダーク油とメタノールとを質量比で６６:３４（遊離脂肪酸に対して５モル当量のメタノール）の割合で混合し、上記条件で反応させたとき、遊離脂肪酸に対するエステル化率が９６％以上であり、酵素（固定化酵素）を少なくとも１００日以上繰り返し利用できる。
【００５２】
第１反応終了後の反応混合物は水分を含んでいるが、そのまま、第２反応工程に用いることもできる。第２反応工程において、固定化酵素を大過剰量添加する、あるいは反応時間を大きく伸ばすことによりグリセリドのアルコリシスを行ってもよい。しかし、コストの面から現実的ではない。そこで、第１反応終了後の反応混合物から、以下に示すように生成した水と、必要に応じて、未反応のアルコールを除いておくことが好ましい。
【００５３】
（Ｂ−２：水除去工程）
第１反応工程では、遊離脂肪酸のアルコールエステル化にともない、水が発生する。この水は、第２反応工程におけるグリセリドのアルコリシスを阻害するため、除去する必要がある。さらに、第１反応工程終了後の反応混合物にアルコールが存在し、第２反応工程において反応を阻害する場合、アルコールを除去する必要がある場合がある。従って、水および必要に応じて、過剰のアルコールを除去する。水およびアルコールの除去は、好ましくは、まず、濾過などにより不純物を除き、ついで、静置、遠心分離によって分離してくる油層を回収してもよい。さらに回収した油層を蒸留し、水とアルコールを除去してもよい。
【００５４】
ダーク油を用いる場合、通常、酵素反応が終了した反応液を静置または遠心分離するとメタノール層と油層とに分離されるので、油層を回収すればよい。回収後の反応混合物は、そのまま、次の第２工程の反応に用いてもよい。しかし、油層に存在する微量の水を除く方が、第２反応工程における反応の効率が良くなるという観点から、油層を蒸留することにより脱水、あるいは脱アルコールを行う方が好ましい。第２反応工程に使用する反応混合物の水分含量は、好ましくは５０００ｐｐｍ以下であり、より好ましくは１０００ｐｐｍ以下であり、さらに好ましくは３００ｐｐｍ以下である。
【００５５】
（Ｂ−３：第２反応工程）
水分が除去され、必要に応じてアルコールが除去された反応混合物（以下、脱水混合物ということがある）を、ついで、グリセリドのアルコリシス反応を触媒し得る酵素の存在下、アルコールでアルコリシスする。この反応により、グルセリドを構成する脂肪酸は、グリセリドから遊離し、アルコールと反応する。その結果、脂肪酸エステルとグリセロールが生成する。
【００５６】
この第２反応工程に使用するアルコールおよび酵素は、上記の通りである。
【００５７】
第２反応工程で使用するアルコールの量には制限はない。メタノールを例に取ると、使用するメタノール量は、グリセリド中の脂肪酸量に対して０．５モル当量以上で、酵素の失活が認められない量、添加される。好ましくは４モル当量以下、さらに好ましくは２モル当量以下とすればよい。なお、脂肪酸量に対して等モル以下のメタノールを用いるときは、最終的に等モル以上となるように逐次添加するとよい。
【００５８】
ダーク油から脂肪酸エステルを回収する場合、第２反応工程において、グリセロールおよび／またはトリグリセリドを添加してアルコリシスを行うことが、酵素の安定化あるいは反応の効率を上げる上で、好ましい。
【００５９】
グリセロールは、残存する遊離脂肪酸から生成する水を吸収し、酵素を安定化する効果を有すると思われる。グリセロールの添加量は特に制限はない。好ましくはダーク油に由来する脱水混合物の質量を基準にして１〜５０質量％であり、より好ましくは３〜３０質量％であり、さらに好ましくは５〜２０質量％である。グリセロールは、第２反応工程終了後に回収し、繰り返し利用してもよい。
【００６０】
ダーク油には、酵素を不安定にする未知の物質が含まれていることもある。この場合、トリグリセリドの添加は、この未知の物質の濃度を下げる（希釈する）ため、酵素の安定化や、反応の効率化に寄与し得ると考えられる。トリグリセリドとしては、植物、動物、魚、微生物などから調製された油（例えば、食用油）が好ましく用いられる。中でも、入手の容易性という観点から、大豆油、菜種油、パーム油、オリーブ油、綿実油、米ぬか油、亜麻仁油、月見草油、胡麻油などの植物油が好ましく用いられる。また、トリグリセリドおよびグリセロールは、それぞれ、廃食用油など、および廃食用油などを起源として得られるものでもよいが、脱水されていることが好ましい。
【００６１】
トリグリセリドの添加量は特に制限はないが、一般的には、脱水混合物の質量を基準にして、１０〜８０質量％添加される。好ましくは２０〜６０質量％であり、さらに好ましくは３０〜５０質量％である。
【００６２】
第２反応工程における反応方法、反応装置、反応温度、反応時間については、第１反応工程での説明がそのまま、適用される。
【００６３】
第２反応工程の反応に用いる酵素量は特に制限はないが、添加する反応混合液の質量を基準にして０．１〜６０質量％、より好ましくは１〜２０質量％、さらに好ましくは２〜１０質量％である。
【００６４】
第２反応工程において、反応が不十分で、脂肪酸エステルの生成率が低い場合、さらに第１および第２反応工程を繰り返してもよい。
【００６５】
例えば、ダーク油の脱水混合物、植物油、メタノール、グリセロールを質量比で、５２：４２．５：５．５：１０の割合（メタノールはグリセリド中の脂肪酸に対して等モル量）で混合し、上記反応条件で反応させたとき、遊離脂肪酸およびトリグリセリド中の脂肪酸の脂肪酸メチルエステルへの変換率は、第１および第２反応工程を通じて９８％以上に達し、グリセリドおよび遊離脂肪酸の含量がそれぞれ１質量％以下になる。さらに、第２反応工程における酵素（固定化酵素）は、少なくとも１００日以上繰り返し利用できる。
【００６６】
（Ｂ−４：脂肪酸エステルの回収）
第２反応終了後の反応液にはグリセロール、水、および未反応のメタノールが混在している。反応液を静置あるいは遠心分離によってグリセロール層を除去してもよい、水洗等によってグリセロールを除去してもよい。脂肪酸エステルは、溶媒による抽出、蒸留による分離などの常法によって、さらに精製することもできる。
【００６７】
上記のように、脱酸廃棄物に由来するダーク油などのグリセリドと遊離脂肪酸を含有する廃棄物に対して、酵素反応を２段階にわけて行うことにより、廃棄物中に含まれる脂肪酸の９８％以上を脂肪酸エステルとして回収することができる。この方法では用いる酵素が安定に保たれるため、バイオ燃料を低コストで製造することができる。
【００６８】
（第２発明）
第２発明は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸エステルを製造する方法であって、（１）混合物中のグリセリドを加水分解して脂肪酸を遊離させ、油水分離により遊離脂肪酸を主成分とする油分を得る第１工程；（２）エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下、該第１工程で生じた遊離脂肪酸とアルコールを反応させ、脂肪酸エステルを得る第２工程；（３）該第２工程で生じた水を反応混合物から除去する第３工程；（４）該第３工程で水が除去された反応混合物中の未反応の遊離脂肪酸を、エステル化反応を触媒し得る酵素およびグリセロールの存在下でアルコールと反応させ、遊離脂肪酸を脂肪酸エステルに変換する、第４工程；および（５）得られた脂肪酸エステルを回収する工程；を含んでいる。以下、これらの各工程について、説明する。
【００６９】
（Ｃ−１：第１工程）
第１工程は、遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物中のグリセリドを加水分解し、グリセリド中の脂肪酸を遊離する工程である。このグリセリドの加水分解に特に制限はなく、化学的な加水分解でもよく、酵素による分解でも良い。
【００７０】
化学的な加水分解方法としては、当業者が通常行う方法、例えば、アルカリ加水分解、酸加水分解などの方法が挙げられる。
【００７１】
酵素を用いる場合、グリセリドを加水分解し得る酵素であれば、特に制限はない。トリグリセリドの１，３位に特異的であってもよく、非特異的であってもよい。グリセリドの２位に位置する脂肪酸は、反応中にアシル基転移を起こして１または３位に転移しやすいため、１，３位に特異的な酵素であっても、グリセリドの全ての脂肪酸を加水分解することができる。
【００７２】
このような酵素としては、上記リパーゼが好ましく用いられる。好ましくはキャンディダ・ルゴーサ（Candida rugosa）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、シュードモナス（Pseudomonas）属の微生物、あるいはアルカリゲネス（Alcaligenes）属の微生物のリパーゼが用いられる。より好ましくは、加水分解率が高いという観点から、キャンディダ・ルゴーサのリパーゼである。
【００７３】
リパーゼの形状は、粉末でも固定化されていてもどちらでもよいが、キャンディダ・ルゴーサのリパーゼを用いた加水分解反応では、粉末酵素を水に溶解して用いる方が好ましい。
【００７４】
第１工程における酵素で混合物中のグリセリドを加水分解する方法に特に制限はなく、静置、振盪、攪拌いずれの方法で行ってもよい。振盪または攪拌による方法が、反応を均一に行える点で好ましい。反応装置にも特に制限はなく、例えば、攪拌式リアクター、流動層型リアクターなどのバッチ型反応装置、あるいは、固定化酵素を充填したリアクターなどの連続型反応装置を用いてもよい。
【００７５】
加水分解における水分量は、加水分解が進行するならば、特に制限はない。好ましくは、反応液中に０．１から９５質量％、より好ましくは２〜８０質量％、さらにより好ましくは１０〜５０質量％含まれている。第１工程に用いる酵素量は、目的とする加水分解率を達成する量であれば特に制限はない。好ましくは加水分解したい油と水の質量の合計１ｇに対して０．１〜１００００単位（１単位は、オリーブ油を基質として１分間に１マイクロモルの脂肪酸を遊離する酵素量）、より好ましくは０．５から２０００単位、さらに好ましくは２から５００単位である。
【００７６】
第１工程の反応温度も特に制限はない。好ましくは０〜８０℃、より好ましくは１０〜５０℃、さらに好ましくは２０〜４０℃である。耐熱性酵素を使用する場合は、より高い温度が用いられる。
【００７７】
第１工程における反応時間に特に制限はない。好ましくは０．５〜１２０時間、より好ましくは２〜９６時間、さらにより好ましくは５〜７２時間である。連続反応の場合は、全体の反応速度を考慮して、決定すればよい。
【００７８】
加水分解終了後、反応混合物を油水分離によって得られた油層を回収する。油層の回収方法には特に制限はない。アルカリ加水分解あるいは酸加水分解を行った場合、処理後の反応液を適切なｐＨに調整後、油水分離を行うことが好ましい。例えば、まず、濾過などにより不純物を除き、ついで、静置、遠心分離などによって分離してくる油層を回収してもよい。回収した油層には通常、数％の水が含まれている。この水を蒸留などの手段によって数百ｐｐｍ以下まで減少させてから、次の第２工程（遊離脂肪酸のエステル化）を行ってもよい。しかし、エステル化反応により水が生成するという観点から、第２工程の前には特に蒸留などの脱水操作をおこなう必要はない。
【００７９】
(Ｃ−２:第２工程）
第２工程は、第１工程で回収した油層に含まれる遊離脂肪酸とアルコールとをエステル化反応を触媒し得る酵素の存在下で反応させ、脂肪酸エステルを得る工程である。使用する酵素およびアルコールとしては、前記第１発明で用いられる酵素およびアルコールが用いられる。
【００８０】
この第２工程におけるエステル化は、前記第１発明の第１反応工程で記載したエステル化とほぼ同一の条件で行われる。すなわち、添加するメタノール量は遊離脂肪酸に対して等モル量以上から、酵素の失活が認められない量であり、上記ダーク油のモデル混合物の場合、添加するメタノール量は、好ましくは、遊離脂肪酸に対して４モル当量以下、さらに好ましくは２モル当量以下である。ダーク油を原料とする場合、好ましくは、遊離脂肪酸に対して１０モル当量以下、さらに好ましくは７．５モル当量以下とすればよい。反応温度などの反応条件も上記第１発明の第１反応工程の記載の通りである。
【００８１】
第２工程では、脂肪酸エステルと同時に水が生成するため、遊離脂肪酸と脂肪酸エステルとの間で反応が平衡化する。そのためすべての遊離脂肪酸がエステル化されることはなく、遊離脂肪酸が存在する。そこで、第２工程で生じた水を反応混合物から除去する第３工程を行う。
【００８２】
（Ｃ−３：第３工程）
第３工程は、第２工程で生じた水を反応混合物から除去する工程である。この工程は、上記（Ｂ−２：水除去工程）と同じ方法が適用される。例えば、まず、濾過などにより不純物を除き、ついで、静置、遠心分離によって分離してくる油層を回収してもよい。さらに回収した油層を蒸留し、水とアルコールを除去してもよい。油層に存在する微量の水を除く方が、第４工程における反応の効率が良くなるという観点から、油層を蒸留することにより脱水、あるいは脱アルコールを行う方が好ましい。第４工程に使用する反応混合物の水分含量は、好ましくは５０００ｐｐｍ以下であり、より好ましくは１０００ｐｐｍ以下であり、さらに好ましくは３００ｐｐｍ以下である。
【００８３】
（Ｃ−４：第４工程）
第４工程は、第３工程で水が除去された反応混合物中の未反応の遊離脂肪酸を、エステル化反応を触媒し得る酵素およびグリセロールの存在下でアルコールと反応させ、遊離脂肪酸を脂肪酸エステルに変換する工程である。第４工程において使用する酵素およびアルコールは、前記第２工程と同じであり得る。第４工程において使用するアルコール量には特に制限がないが、メタノールを例にとると、添加するメタノール量は遊離脂肪酸に対して等モル量以上から、酵素の失活が認められない量（未反応の遊離脂肪酸に対して好ましくは５０モル当量以下、より好ましくは２０モル当量以下、さらにより好ましくは１０モル当量以下である。）
【００８４】
この第４工程では、未反応の遊離脂肪酸に対するエステル化率を高めるために、生成する水を除去しながら反応させる方が好ましい。生成する水を除去するためには、例えば、減圧下で反応させる方法や、モレキュラーシーブなどの脱水剤を使う方法などが知られている。しかし、モレキュラーシーブなどの脱水剤はコストが高いという欠点がある。減圧下で反応させる方法の場合、アルコールとしてメタノールやエタノールなどを用いた場合、これらのアルコールの沸点が水よりも低いため、現実的ではない。そこで、第４工程でグリセロールを添加して反応させることにより、生成水がグリセリン層に移行し、エステル化率を向上させることが可能となる。この反応に添加するグリセロールは、反応効率を高める効果があればいずれの量でも構わないが、第３工程終了後の脱水反応液とアルコールの合計に対して、好ましくは１〜５０質量％、より好ましくは２〜３０質量％である。グリセロールは、繰り返し使用しても良いし、毎回新たに添加しても良い。その他の反応温度、反応時間、酵素量、混合方法などの条件については、第２工程と同様の方法でおこなうことができる。
【実施例】
【００８５】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこの実施例に制限されないことはいうまでもない。なお、実施例１および２は第１発明の実施例、実施例３は第２発明の実施例である。
【００８６】
（実施例１：菜種油および遊離脂肪酸を含有する混合物からの脂肪酸エステルの調製）
（１Ａ：第１反応工程）
（１Ａ−１:固定化酵素の安定性に及ぼすメタノール量の影響）
菜種油（トリグリセリド）／菜種油由来の遊離脂肪酸の混合液（５０：５０， ｗｔ／ｗｔ）とメタノールとを、質量比で９：１（メタノール１０質量％；遊離脂肪酸に対して２モル当量）、８：２（メタノール２０質量％；遊離脂肪酸に対して４．４モル当量）、７：３（メタノール３０質量％；遊離脂肪酸に対して７．６モル当量）、５：５（メタノール５０質量％；遊離脂肪酸に対して１７．６モル当量）で混合した混合物１０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．０５ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１および２４時間後にそれぞれ０．２ｇをサンプリングし、生じた脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）含量をＴＬＣ−ＦＩＤ（イアトロスキャンＭＫ−５，ヤトロン社製）を用いて測定した。なお、ＴＬＣ−ＦＩＤ分析では、一次展開溶媒としてベンゼン：クロロホルム：酢酸＝５０：２０：０．５（容量比）を、二次展開溶媒としてヘキサン：ジエチルエーテル＝６５：５（容量比）を用いて行った。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新しい混合物を添加して反応を行った。このサイクルを８回繰り返した。なお、以降、トリグリセリドをＴＧと、遊離脂肪酸をＦＦＡと、そして脂肪酸メチルエステルをＦＡＭＥと省略して記載することがある。結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
反応初期である１時間後のＦＡＭＥ含量より、メタノール添加量が多いほどエステル化の速度が遅いことが分かる。メタノール含量が１０質量％（以下、ｗｔ％と記載する）および２０ｗｔ％の時の２４時間後のＦＡＭＥ含量は、ほぼ同じレベル（５０ｗｔ％）に達しており、かつ８サイクル繰り返してもＦＡＭＥ含量の低下が見られなかった。しかし、メタノール含量が３０ｗｔ％以上になると２４時間後のＦＡＭＥ含量は５０ｗｔ％に達せず、かつ反応の繰り返しと共にＦＡＭＥ含量が低下した。これは固定化酵素の不可逆的失活のためである。以上の結果から、第１反応工程（ＦＦＡのエステル化）に最適なメタノール含量は１０ｗｔ％（ＦＦＡに対して２倍モル当量）であることが分かった。
【００８９】
（１Ａ−２：固定化酵素量の影響）
菜種油／菜種油由来の遊離脂肪酸の混合液（５０：５０、ｗｔ／ｗｔ）９ｇにメタノールを１ｇ添加し、これに、種々の量（０．０２５ｇ、０．０５ｇ、０．１ｇ、０．２ｇ、および０．４ｇ）の固定化酵素（ノボザイム４３５）を加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１および２４時間後にそれぞれ０．２ｇをサンプリングし、生じたＦＡＭＥ、ＦＦＡ、ＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。結果を表２に示す。
【００９０】
【表２】
【００９１】
この結果から、酵素量の増加と共に反応速度が増加することがわかった。以下の実験では酵素量を０．５ｗｔ％とすることにした。なお、表２から、反応が進んでもＴＧ含量はあまり減少していなかったことが分かる。これは、ＦＦＡのエステル化によって生成する水がＴＧのメタノリシス反応を妨害しているためである。
【００９２】
（１Ａ−３：ＦＦＡのエステル化：連続反応による酵素の安定性）
菜種油／菜種油由来の遊離脂肪酸の混合物（５０：５０，ｗｔ／ｗｔ）を９ｇ、メタノールを１ｇ、および固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．０５ｇ混合して、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１、３、６、および２４時間後に０．２ｇサンプリングし、ＦＡＭＥ、ＦＦＡの含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新しい混合物を添加して反応を行った。これを１００日間繰り返した。結果を表３に示す。
【００９３】
【表３】
【００９４】
反応初期である１、３、および６時間後のＦＡＭＥ含量は、反応の繰り返しと共に少しずつ低下していったが（酵素活性の半減期１５０日以上）、１サイクルを２４時間としたとき、２４時間後のＦＡＭＥ含量は５０ｗｔ％以上、未反応のＦＦＡ含量は２％前後を維持していた。したがって、第１反応工程におけるＦＦＡのエステル化には、同じ固定化酵素を１００日以上繰り返して使用できることが分かった。なお、１００日目における２４時間後のＦＦＡ含量は２．７ｗｔ％であったが、反応時間を４８時間まで延長するとＦＦＡ含量は１．５ｗｔ％まで低下した。このことから、酵素活性が低下した時は反応時間を延長すれば良い（１サイクルの時間を長くすればよい）と言える。
【００９５】
以上の予備的検討後、菜種油／菜種油由来の遊離脂肪酸の混合液（５０：５０、ｗｔ／ｗｔ）１４４０ｇ、メタノールを１６０ｇ（ＦＦＡに対して２モル当量）、および８ｇのノボザイム４３５を２Ｌの撹拌翼付反応器にいれ、３０℃、１２０回転／分で撹拌しながら、２４時間反応させ、第１反応工程の反応液を得た。
【００９６】
（１Ｂ：脱水工程）
第１反応工程で得られた反応液から、水およびメタノールを４ｍｍＨｇ、８０℃、３０分の条件下で除去し、脱水混合物を得た。
【００９７】
（１Ｃ：第２反応工程）
（１Ｃ−１：メタノール量の影響）
１Ｂで得られた脱水混合物とメタノールとを質量比で９５：５（メタノール５ｗｔ％；グリセリド中の脂肪酸に対して等モル量）、９０：１０（メタノール１０ｗｔ％；グリセリド中の脂肪酸に対して２モル当量）、８０：２０（メタノール２０ｗｔ％；グリセリド中の脂肪酸に対して４モル当量）で混合した混合物１０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．４ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１、３、６、および２４時間後に０．２ｇサンプリングし、残存するＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。さらに２４時間を１サイクルとし、２４時間後に反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に、新しい脱水混合物を追加した。このサイクルを４回行った。各反応液について、反応初期におけるＴＧの減少速度を求めた。メタノール５ｗｔ％、１サイクル目のＴＧの減少速度を１００としたときの相対速度を表４に示す。
【００９８】
【表４】
【００９９】
第２反応工程では、１サイクル目ではメタノールが１０ｗｔ％の時、最も反応速度が速かった。メタノールが１０ｗｔ％より多くなると、反応の繰り返しと共に固定化酵素が失活していくことが分かった。これに対しメタノール５ｗｔ％の時は酵素の失活が見られなかった。
【０１００】
（１Ｃ−２：酵素量の影響）
脱水混合物とメタノールとを質量比９５：５で混合した混合物１０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．２〜１．０ｇ（脱水混合物に対して２〜１０ｗｔ％）加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。４、９、および２４時間後に０．２ｇサンプリングし、ＦＡＭＥ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。結果を表５に示す。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
表５からわかるように、添加した酵素量が２〜８ｗｔ％の場合は、酵素量の増加と共にＦＡＭＥ含量が増加した。酵素量１０ｗｔ％の時、ＦＡＭＥ含量がやや低下した。これは、反応速度の低下に起因すると思われる。以下の実験では、脱水混合物に対して、酵素量を６ｗｔ％に設定することにした。
【０１０３】
（１Ｃ−３：連続１００日間の運転）
脱水混合物とメタノールとを質量比９５：５で混合した混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．６ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。２時間後および２４時間後に０．２ｇサンプリングし、ＦＡＭＥ、ＦＦＡ、およびＴＧの各含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に、上記脱水混合物とメタノールとの混合物を添加して反応を行った。これを１００日間繰り返した。結果を表６に示す。
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
反応を繰り返すに従って、２時間後のＦＡＭＥ含量が増加し、ＴＧ含量が減少した。これは、反応の繰り返しと共に固定化酵素が活性化され、酵素の反応速度が増加したためである。反応開始から３０日目をすぎる頃から、酵素の反応速度が大きくなった。６０日を経過するころから、酵素活性が徐々に低下し始めた。なお、酵素活性の半減期は３００日程度と推定される。運転開始から５サイクル目までは１サイクル４８時間、６サイクル目以降は１サイクルを２４時間に設定すると、固定化酵素を１００日間連続使用してもＴＧ、およびＦＦＡ含量は、共に１ｗｔ％以下であり、ＦＡＭＥ含量が９８ｗｔ％以上を保っていた。このことから、第１反応工程〜第２反応工程を通じたＦＦＡおよびトリグリセリド中の脂肪酸のＦＡＭＥへの変換率は９８％以上であったことがわかる。
【０１０６】
以上の結果から、脱水混合物とメタノールとを質量比９５：５（グリセリド中の脂肪酸に対して等モル量のメタノール）で混合した混合物１０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．６ｇ（混合物に対して６ｗｔ％）加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させ、２４時間反応させた。脱水混合物中のＦＡＭＥへの変換率は９８％以上であり、酵素は１００日以上使用できた。
【０１０７】
（実施例２：ダーク油からの脂肪酸エステルの製造）
（２Ａ：ダーク油の前処理）
大豆および菜種油製造工程で発生した脱酸廃棄物を遠心分離し、水および不溶物を除去することにより、ダーク油を調製した。ダーク油の脱酸廃棄物からの回収率は約９０％であった。このダーク油の組成は、ロットにより異なるが、水分が約１ｗｔ％、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が約７５〜８０ｗｔ％、トリグリセリド（ＴＧ）が約５〜１０ｗｔ％、ジグリセリド（ＤＧ）が約３ｗｔ％、植物ステロールが約１ｗｔ％、ステリルエステルが約２ｗｔ％、残りがその他の炭化水素である。
【０１０８】
なお、この実験に用いたダーク油の脂肪酸組成は、パルミチン酸が５．６ｗｔ％、ステアリン酸が２ｗｔ％、オレイン酸が３９．３％、リノール酸が４４．９％、リノレン酸が７．６％であった。
【０１０９】
（２Ｂ：第１反応工程）
（２Ｂ−１:固定化酵素の安定性に及ぼすメタノール量の影響）
ダーク油とメタノールとを質量比９０．７：９．３（メタノール量はＦＦＡに対して等モル量）で混合した混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．３ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１、６、および２４時間後にそれぞれ０．５ｇサンプリングし、０．５Ｍ ＫＯＨ溶液を用いて酸価（試料１ｇを中和するのに要するＫＯＨのｍｇ数）を測定した。反応前と反応後の酸価の減少量から、ＦＦＡに対するエステル化率を求めた。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新しいダーク油混合物を添加して反応を行った。反応を１０回繰り返した。結果を表７に示す。
【０１１０】
【表７】
【０１１１】
菜種油および菜種油由来の遊離脂肪酸を用いた実施例１においては、メタノールを１０ｗｔ％添加したとき、表３のデータから固定化酵素の半減期を推定すると、１５０日以上であった。これに対して、ダーク油にメタノールを９．３ｗｔ％添加（ＦＦＡに対して等モル量）したとき、酵素の失活が非常に早くなり、酵素の半減期（１時間後のエステル化率より推定）は約３日であった。このように、実施例１の第１反応工程（ＦＦＡのエステル化）と同じ反応条件をダーク油の第１反応工程に当てはめることができないことが分かった。
【０１１２】
そこで、ダーク油を用いる場合の最適なメタノール濃度を検討した。ダーク油とメタノールとを、質量比で９０．７：９．３（ＦＦＡに対して等モル量のメタノール）、８３．０：１７．０（ＦＦＡに対して２モル当量のメタノール）、７６．５：２３．５（ＦＦＡに対して３モル当量のメタノール）、７１．０：２９．０（ＦＦＡに対して４モル当量のメタノール）、６６．２：３３．８（ＦＦＡに対して５モル当量のメタノール）、６２．０：３８．０（ＦＦＡに対して６モル当量のメタノール）、５６．６：４３．４（ＦＦＡに対して７．５モル当量のメタノール）、および４９．５：５０．５（ＦＦＡに対して１０モル当量のメタノール）の割合で混合した混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．３ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１時間後にそれぞれ０．５ｇをサンプリングし、０．５Ｍ ＫＯＨ溶液を用いて酸価を測定した。反応前と反応後の酸価の減少量から、ＦＦＡに対するエステル化率を求めた。２４時間後に反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たなダーク油混合物を添加して反応を行った。この１サイクルを２４時間として、このサイクルを５回繰り返し、以下の式：｛（５サイクル目に入って１時間目のエステル化率）／（１サイクル目の１時間目のエステル化率）｝×１００（％）の値を求め、固定化酵素の安定性を評価した。その結果を表８に示す。
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
実施例１でも記載したように、菜種油および菜種油由来の遊離脂肪酸を含む混合物では、メタノールが１０ｗｔ％の時、酵素は非常に安定であったが、メタノールを３０ｗｔ％以上含む場合、固定化酵素の失活がみられた。これとは逆に、ダーク油の第１反応工程では、メタノール量が９．３ｗｔ％の時、酵素は極めて不安定であった。そして、メタノール量が増加すると共に酵素が安定になり、メタノール量が２９．０から４３．４ｗｔ％のとき、固定化酵素は高い安定性を示すことがわかった。これは、ダーク油中に酵素反応を阻害する物質が含まれているために、メタノールによる希釈で酵素の安定性が高まったため、および／または酵素のメタノールによる失活を保護する物質がダーク油中に含まれているためと推定される。メタノール量３３．８ｗｔ％のとき、酵素の安定性が最も高かったので、今後の実験ではメタノール量を３３．８ｗｔ％（ＦＦＡに対して５モル当量）で行うことにした。
【０１１５】
（２Ｂ−２:酵素量の影響）
ダーク油とメタノールとを質量比で６６：３４の割合で混合したダーク油混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．０７５ｇ（０．２５ｗｔ％）、０．１５ｇ（０．５ｗｔ％）、０．３ｇ（１ｗｔ％）、０．６ｇ（２ｗｔ％）、または１．２ｇ（４ｗｔ％）加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１、３、６、および２４時間後にそれぞれ０．５ｇサンプリングし、０．５Ｍ ＫＯＨ溶液を用いて酸価を測定した。反応前と反応後の酸価の減少量から、ＦＦＡに対するエステル化率を求めた。結果を表９に示す。
【０１１６】
【表９】
【０１１７】
酵素量の増加と共に、エステル化反応の速度が大きくなることが分かる。以下の実験では、酵素量をダーク油とメタノールとの混合物に対して、１ｗｔ％使用することにした。
【０１１８】
（２Ｂ−３：ダーク油中のＦＦＡのエステル化：連続１００日間の運転）
ダーク油とメタノールとを質量比６６：３４の割合で混合したダーク油混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を０．３ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。１、６、および２４時間後にそれぞれ０．５ｇをサンプリングし、０．５Ｍ ＫＯＨ溶液を用いて酸価を測定した。反応前と反応後の酸価の減少量から、ＦＦＡに対するエステル化率を求めた。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たなダーク油混合物を添加して反応を行った。反応を１００日間繰り返した。結果を表１０に示す。また、１サイクル目と１００サイクル目の反応の経時変化を表１１に示す。
【０１１９】
【表１０】
【０１２０】
【表１１】
【０１２１】
反応を繰り返すに従って、徐々に固定化酵素の活性が低下し、ＦＦＡに対するエステル化率が低下した。この時、固定化酵素の半減期は約１２０日と推定された。１サイクルを２４時間とすると、９０サイクル目までは９２％以上のエステル化率を保っていた。１００サイクル目、２４時間後のエステル化率は８８％であったが、反応時間を４８時間まで延長すると、エステル化率は９６％にまで上昇した。したがって、１００サイクル目以降は反応時間を伸ばせば、固定化酵素をさらに長期間使用できることが分かった。なおこの反応では、ＴＧ含量は殆ど変化しなかった。
【０１２２】
（２Ｂ−４：ダーク油中のＦＦＡのエステル化：スケールアップした連続１００日間の運転）
ダーク油とメタノールとを質量比６６：３４の割合で混合したダーク油混合物２０００ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を２０ｇ加えて、３０℃、１２０回転／分で攪拌しながら、５Ｌの反応槽内で反応させた。１、６、および２４時間後にそれぞれ０．５ｇサンプリングし、０．５Ｍ ＫＯＨ溶液を用いて酸価を測定した。反応前と反応後の酸価の減少量から、ＦＦＡに対するエステル化率を求めた。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たなダーク油混合物を添加して反応を行った。反応を１００日間繰り返した。結果を表１２に示す。
【０１２３】
【表１２】
【０１２４】
反応を繰り返すに従って、徐々に固定化酵素の活性が低下し、エステル化率が低下した。１サイクルを２４時間とすると、１００サイクル目までは９２％以上のエステル化率を保っていた。このように２Ｂ−３で記載した３０ｇスケールでの反応は、２Ｌスケールの反応へスケールアップしても完全に再現されることが分かった。
【０１２５】
以上の予備的検討後、ダーク油とメタノールとを質量比６６：３４（ＦＦＡに対して５モル当量のメタノール）の割合で混合した混合物１６００ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を１６ｇ加えて、３０℃、１２０回転／分で攪拌しながら２４時間反応させた。反応液を静置すると２層に分離したので、１１５５ｇの油層と、４３５ｇのメタノール層をそれぞれ回収した。
【０１２６】
（２Ｂ：脱水工程）
第１反応工程で得られた反応液から、水およびメタノールを、４ｍｍＨｇ、８０℃、３０分間の条件下で除去し、１１００ｇの油層（以下、ダーク油脱水画分という）を回収した。このダーク油脱水画分中のＦＦＡ含量は２．８ｗｔ％、ＴＧ含量は９．５ｗｔ％、水分含量は０．０３％であった（この値はロットによって異なる）。
【０１２７】
（２Ｃ：第２反応工程）
（２Ｃ−１：酵素の安定性の検討）
ダーク油脱水画分とメタノールとを質量比９４．５：５．５（グリセリド中の脂肪酸に対して５モル当量のメタノール）の割合で混合したダーク油脱水混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を１．８ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。２４時間後に０．２ｇをサンプリングし、残存ＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。さらに２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たなダーク油脱水混合物を添加し、反応を行った。これを５日間繰り返した。結果を表１３に示す。
【０１２８】
【表１３】
【０１２９】
１Ｃ−３で記載したように、菜種油および菜種油由来の遊離脂肪酸を用いた反応系における第２反応工程では、固定化酵素の半減期は３００日以上であった。これに対して、ダーク油脱水画分を用いた反応では、固定化酵素の失活のため、反応を繰り返すに従ってＴＧ残存量が増加し、５サイクル目で殆ど酵素活性を失っていることが分かった。このように、菜種油および菜種油由来の遊離脂肪酸を用いた反応系における第２反応工程と同じ反応条件を、ダーク油脱水画分を用いる第２反応工程に当てはめることができないことが分かった。
【０１３０】
（２Ｃ−２：酵素の安定化の検討−その１）
ダーク油脱水画分とメタノールとを質量比９４．５：５．５（グリセリド中の脂肪酸に対して５モル当量のメタノール）で混合したダーク油脱水画分混合物３０ｇに、グリセロール３．０ｇと固定化酵素（ノボザイム４３５）を１．８ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。２４時間後に０．２ｇをサンプリングし、残存するＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たなダーク油脱水画分とメタノールとの混合物を添加して反応を行った。２４時間を１サイクルとし、このサイクルを５回繰り返した。結果を表１４に示す。
【０１３１】
【表１４】
【０１３２】
ダーク油脱水画分中に含まれるグリセリドのアルコリシス反応において、グリセロールを添加することにより、酵素が安定化され、グリセロールを添加しない場合に比べてＴＧの残存量が減少した。しかし、５サイクル目でもＴＧが４．３ｗｔ％残っており、固定化酵素が長期間の連続反応に耐えないであろうと推測された。
【０１３３】
（２Ｃ−３：酵素の安定化の検討−その２）
２Ｃ−１と同様にして、ダーク油脱水画分を調製した。このダーク油脱水画分中のＴＧ含量は８．２ｗｔ％であった。このダーク油脱水画分を用いて、以下の検討を行った。
【０１３４】
（検討１）
ダーク油脱水画分とメタノールとを質量比９４．５：５．５（グリセリド中の脂肪酸に対して５モル当量のメタノール）の割合で混合した混合物３０ｇに、固定化酵素（ノボザイム４３５）を１．８ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。２、４、および２４時間後にそれぞれ０．２ｇをサンプリングし、残存するＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たな混合物を添加して、反応を行った。反応を１０日間繰り返した。結果を表１５に示す。
【０１３５】
【表１５】
【０１３６】
ダーク油脱水画分に酵素とメタノール以外は何も添加しなかったとき、反応を繰り返すと、ＴＧ残存量が増加することから、固定化酵素が速やかに失活していることが分かる。この時、酵素活性の半減期は１０日以下であった。
【０１３７】
（検討２）
菜種油の添加効果を検討した。ダーク油脱水画分、菜種油、およびメタノールを質量比５２．０：４２．５：５．５（グリセリド中の脂肪酸に対して等モル量のメタノール）の割合で混合した混合物３０ｇ（この時のＦＡＭＥ含量は４９ｗｔ％、ＴＧ含量は４９ｗｔ％であった）に、固定化酵素（ノボザイム４３５）を１．８ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。２、４、および２４時間後にそれぞれ０．２ｇをサンプリングし、残存するＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たな混合物を添加して、反応を行った。反応を４１日間繰り返した。結果を表１６に示す。
【０１３８】
【表１６】
【０１３９】
菜種油を添加することにより、何も添加しないとき（検討１）に比較して、固定化酵素の安定性が増加し、酵素活性の半減期は、約２５日であった。したがって、ダーク油のアルコリシス反応において、植物油を添加することにより酵素の安定性が増加することが分かった。
【０１４０】
（検討３）
グリセロールと菜種油の添加効果を検討した。ダーク油脱水画分、菜種油、およびメタノールを質量比５２．０：４２．５：５．５（グリセリド中の脂肪酸に対して等モル量のメタノール）の割合で混合した混合物３０ｇ（この時のＦＡＭＥ含量は４９ｗｔ％、ＴＧ含量は４９ｗｔ％であった）に、グリセロールを３．０ｇおよび固定化酵素（ノボザイム４３５）を１．８ｇ加えて、３０℃、１３０振盪／分で振盪しながら反応させた。２、４、および２４時間後にそれぞれ０．２ｇをサンプリングし、残存するＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たな混合物を添加して、反応を行った。反応を１００日間繰り返した。結果を表１７に示す。
【０１４１】
【表１７】
【０１４２】
この表からわかるように、ダーク油のアルコリシス反応時に、グリセロールおよび菜種油を添加することにより、グリセロールの単独添加（２Ｃ−２）、あるいは菜種油の単独添加時（検討２）の時よりもさらに固定化酵素の安定性が増加した。酵素活性の半減期は１２０日程度まで伸びた。
【０１４３】
なお、反応開始から４サイクル目まで、および１００サイクル目以降では２４時間後の残存ＴＧ含量が１．５ｗｔ％よりも大きくなった。しかし、反応時間を４８時間まで伸ばすことにより、残存ＴＧ含量を検出限界以下まで下げることができた（データ示さず）。また、残存ＴＧ含量が検出限界以下まで下がったとき、第１反応工程〜第２反応工程を通したＦＦＡとグリセリド中の脂肪酸のＦＡＭＥへの変換率は９８〜９９％、酸価は１．２であった。
【０１４４】
これらの結果から、ダーク油を用いる第２反応工程では、ダーク油脱水画分のみを反応に使用すると、酵素の耐久性が悪いことがわかった。一方、ダーク油脱水画分にトリグリセリド（植物油）およびグリセロールを添加することによって、酵素の安定性が格段に向上することが分かった。このトリグリセリド（植物油）およびグリセロールを含む第２反応工程を、１サイクルを２４時間、ＴＧ残存量１．５ｗｔ％以下に目標を設定した場合、固定化酵素は少なくとも１００サイクル連続使用可能で、１００サイクル目以降は反応時間を４８時間に伸ばせばさらに長期間連続使用可能となる。
【０１４５】
（２Ｃ−４：酵素の安定化の検討（スケールアップ）−その３）
ダーク油脱水画分、菜種油、およびメタノールを質量比５２．０：４２．５：５．５で混合した混合物２０００ｇ（この時のＦＡＭＥ含量は４９ｗｔ％、ＴＧ含量は４９ｗｔ％であった）に、グリセロール２００ｇと固定化酵素（ノボザイム４３５）を１２０ｇ加えて、３０℃、１４０回転／分で攪拌しながら反応させた。２、４、および２４時間後にそれぞれ０．２ｇをサンプリングし、ＴＧ含量をＴＬＣ−ＦＩＤを用いて測定した。２４時間後、反応液を回収・除去して、残った固定化酵素に上記と同様の新たな混合物を添加して、反応を行った。反応を１００日間繰り返した。結果を表１８に示す。
【０１４６】
【表１８】
【０１４７】
ダーク油脱水画分混合物を２０００ｇにスケールアップして反応させたとき、小スケールでの反応（表１７）の時に比べて反応速度が速かった。これは、小スケールの場合、５０ｍｌのバイアル瓶内で３０ｇの混合物の往復振盪であったことと、反応系に添加したグリセロールの粘度が高いことなどの理由で、酵素と反応液との混合効率があまり良くなかったからと思われる。これに対し、２Ｌスケールでの反応では、攪拌翼を用いて攪拌したため、酵素と反応液との混合効率が向上し、反応速度が向上したと考えられる。また、２Ｌスケールでの反応における酵素の安定性は、３０ｇスケールでの安定性と同じであった。このように、ダーク油からの脂肪酸エステルの製造を２Ｌにスケールアップしても、十分な反応効率と安定性が得られることが分かった。なお、２Ｌスケールでの反応における第１反応工程〜第２反応工程を通したＦＦＡおよびグリセリド中の脂肪酸のＦＡＭＥへの変換率は９８〜９９％、酸価は１．２であった。
【０１４８】
（実施例３：ダーク油からの脂肪酸エステルの製造）
（３Ａ：ダーク油の前処理）
大豆および菜種油製造工程で発生した脱酸廃棄物を遠心分離し、水および不溶物を除去することにより、ダーク油を調製した。実施例３に用いたダーク油の組成は、水分が約１ｗｔ％、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が７７．９ｗｔ％、トリグリセリド（ＴＧ）が１２ｗｔ％、ジグリセリド（ＤＧ）が４．８ｗｔ％、植物ステロールが０．９ｗｔ％、ステリルエステルが２．２ｗｔ％、残りがその他の炭化水素である。酸価は１５１ｍｇ ＫＯＨ／ｇであった。
【０１４９】
（３Ｂ：第１工程）
ダーク油１．７ｋｇに、水１．１３ｋｇおよび５６，６００単位のキャンディダ・ルゴーサのリパーゼを添加し、１２０ｒｐｍで攪拌しながら、３０℃で反応させた。反応は１０時間でほぼ定常に達した。攪拌を停止後、反応液を６０℃まで上昇させて静置することにより水層と油層を分離させ、上層の油分を回収した。この油分（以下、ダーク油加水分解油分と略する）の組成を調べたところ、ＦＦＡ；９１．５ｗｔ％、ＴＧ；０．８ｗｔ％、ＤＧ；０．２ｗｔ％、ステロール；０．４ｗｔ％、ステリルエステル；２．５ｗｔ％、その他の炭化水素；４．６ｗｔ％をそれぞれ含んでおり、酸価は１８３ｍｇ ＫＯＨ／ｇであった。このダーク油加水分解油分には水分量が１．５ｗｔ％含まれていたが、蒸留などによる脱水をせずに、次の工程をおこなった。
【０１５０】
（３Ｃ：第２工程）
（３Ｃ−１：ダーク油加水分解油分のエステル化；メタノール量の影響）
ダーク油加水分解油分とメタノール（ＦＦＡに対して等モル量、２モル当量、５モル当量、７モル当量、および１０モル当量のメタノール）の混合液１０ｇ、および固定化酵素（ノボザイム４３５）０．１ｇを３０℃で振とうしながら反応させた。１サイクル目（反応開始から１または２４時間後）にそれぞれ０．５ｇサンプリングし、０．５Ｍ ＫＯＨ溶液を用いて酸価を測定した。反応前後の酸価の減少量から、ＦＦＡに対するエステル化率を求めた。反応液を回収・除去し、残った固定化酵素に上記と同様に新たな混合物を添加して、さらに２４時間反応を行った（２サイクル目の反応）。１サイクルを２４時間として、このサイクルを５回繰り返し、以下の式：｛（５サイクル目に入って１時間目のエステル化率）／（１サイクル目の１時間目のエステル化率）｝×１００（％）の値を求め、固定化酵素の安定性を評価した。結果を表１９に示す。
【０１５１】
【表１９】
【０１５２】
１サイクル目（２４時間後）のエステル化率は、２モル当量以上のメタノール添加で９４%以上に達した。しかし、５モル当量以上添加してもエステル化率は９６%を越えなかった。１サイクル目と５サイクル目のエステル化率から、固定化酵素の安定性を測定した結果、固定化酵素は理論量よりも５から７モル当量のメタノール存在下で高い安定性を示すことがわかった。この結果は、表８の結果とよく似ている。
【０１５３】
（３Ｃ−２：ダーク油加水分解油分のエステル化；経時変化および連続反応）
ダーク油加水分解油分６６ｇ、メタノール３４ｇ（ＦＦＡに対して５モル当量）と固定化酵素（ノボザイム４３５）１ｇを３０℃で振とうしながら反応させた。適宜サンプリングして反応液の酸価を測定し、反応前後の酸価の減少量からＦＦＡに対するエステル化率の経時変化を求めた。結果を表２０に示す。
【０１５４】
【表２０】
【０１５５】
反応はおよそ１０時間で定常に達し、２４時間後のＦＦＡに対するエステル化率は９６％であった。さらに、本反応を２４時間毎に基質を交換して繰り返した。その結果、１００日間以上同様の反応率が維持されており、１００サイクル目、２４時間後のＦＦＡに対するエステル化率は、１サイクル目のそれと全く同じであった。
【０１５６】
（３Ｄ：第３工程）
第４工程のための試料を調製した。第１工程で得られたダーク油加水分解油分６６０ｇ、メタノール３４０ｇと固定化酵素（ノボザイム４３５）１０ｇを３０℃、１５０回転／分で攪拌しながら２４時間反応させた。静置後、分離したメタノール層を除去した。油層を回収し、残存するメタノールおよび水を４ｍｍＨｇ、８０℃、３０分の条件下で除去すると、ＦＦＡを３．５ｗｔ％および水を０．０３ｗｔ％含む油分６７３ｇが得られた。この油分を、以下、第３工程脱水油分といい、残存するＦＦＡをさらにエステル化するために、次の第４工程に供した。
【０１５７】
（３Ｅ：第４工程）
（３Ｅ−１：未反応ＦＦＡのエステル化：グリセロールの添加効果）
第３工程脱水油分とメタノール（残存するＦＦＡに対して等モル、５モル当量、および１０モル当量のメタノール）の混液１０ｇに固定化酵素（ノボザイム４３５）０．１ｇを加え、３０℃で振とうしながら２４時間反応させた。２４時間後、反応液の酸価を測定し、反応前後の酸価の減少量からＦＦＡに対するエステル化率を求めた。
【０１５８】
他方で、エステル化反応に伴って生成する水の除去を目的として、反応系にグリセロールを添加した。第３工程脱水油分とメタノール（残存するＦＦＡに対して等モル、５モル当量、および１０モル当量のメタノール）の混液１０ｇに、グリセロール１ｇと固定化酵素（ノボザイム４３５）０．１ｇを加え、３０℃で振とうしながら２４時間反応させた。２４時間後、反応液の酸価を測定し、反応前後の酸価の減少量からＦＦＡに対するエステル化率を求めた。その結果を表２１に示す。
【０１５９】
【表２１】
【０１６０】
残存ＦＦＡに対して等モル量(０．４ｗｔ％)のメタノールを添加したとき、残存ＦＦＡに対する反応率は８％に過ぎなかった。そこで、この反応率を向上させるために、メタノール量を５モル当量（２．２ｗｔ％）および１０モル当量（４．４ｗｔ％）に増加させたとき、エステル化率は各々４３％、５２％に上昇し、２回のエステル化反応を合わせた総反応率は９８％に達した。したがって、第４工程において、効率の良いエステル化のためには、メタノールを過剰量添加しなければならないことがわかった。
【０１６１】
他方、グリセロールを添加したとき、残存ＦＦＡに対するエステル化率は、等モル量のメタノール添加でも６７％、５モル当量の添加で７１％にまで上昇し、２回のエステル化反応を合わせた総反応率は９９％に到達した。したがって、グリセロールの添加によって生成水がグリセロール層へ移行し、エステル化率が格段に向上すること、また、メタノールを過剰量添加しなくても高いエステル化率が得られることがわかった。
【０１６２】
（３Ｅ−２：未反応ＦＦＡのエステル化、連続反応）
第３工程脱水油分とメタノール（残存するＦＦＡに対して５倍モル当量）の混液１０ｇに、グリセロール１ｇと固定化酵素（ノボザイム４３５）０．１ｇを加え、３０℃で振とうしながら２４時間反応させた。２４時間後、反応液を回収・除去し、残った固定化酵素に上記と同様に新たな混合物を添加して、反応を１００日間繰り返した。その結果、２回のエステル化反応を合わせた総反応率は１００日間高いレベルを維持し、３０日目までは９９%、３１から１００日目までは９８．５%以上であった。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明の方法により、食用油などの製造工程で発生する脱酸廃棄物に含まれる遊離脂肪酸およびグリセリドから効率よく脂肪酸エステルが製造される。そのため、廃棄物の利用が可能となるとともに、生じた脂肪酸エステルは、バイオディーゼル燃料として利用されるため、二酸化炭素、窒素酸化物、硫黄化合物などの地球温暖化物質あるいは大気汚染物質の環境への放出を減少できるので、産業上有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸エステルを製造する方法であって、
（１）エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下、該遊離脂肪酸とアルコールとを反応させて脂肪酸エステルを得る第１反応工程；
（２）第１反応工程で生じた水を反応混合物から除去する工程；
（３）該水が除去された反応混合物とアルコールとを、グリセリドをアルコリシスし得る酵素の存在下で反応させ、グリセリド中の脂肪酸を脂肪酸エステルに変換する第２反応工程；および
（４）得られた脂肪酸エステルを回収する工程；を含む、方法。
【請求項２】
前記アルコールが、直鎖低級アルコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記直鎖低級アルコールが、メタノールまたはエタノールである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記混合物が、脱酸廃棄物に由来する油分である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２反応工程において、グリセロールおよび／またはグリセリドを添加してアルコリシスを行う、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記グリセリドが植物油脂、動物油脂、魚油、および微生物油脂からなる群から選択される少なくとも一つの油脂である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記油分が、植物油脂、動物油脂、魚油、または微生物油脂からの油脂の製造工程において発生する脱酸廃棄物に由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記第１反応工程において、直鎖低級アルコールは、遊離脂肪酸に対して等モル以上から前記酵素を失活させない量で使用され、第２反応工程において添加する直鎖低級アルコールは、グリセリド中の脂肪酸に対して０．５モル当量以上から前記酵素を失活させない量で使用される、請求項１から７のいずれかの項に記載の方法。
【請求項９】
遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸エステルを製造する方法であって、
（１）該グリセリドを加水分解して脂肪酸を遊離させ、油水分離により遊離脂肪酸を主成分とする油分を得る第１工程；
（２）エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下、該第１工程で生じた遊離脂肪酸とアルコールを反応させ、脂肪酸エステルを得る第２工程；
（３）該第２工程で生じた水を反応混合物から除去する第３工程；
（４）該第３工程で水が除去された反応混合物中の未反応の遊離脂肪酸を、エステル化反応を触媒し得る酵素およびグリセロールの存在下でアルコールと反応させ、遊離脂肪酸を脂肪酸エステルに変換する、第４工程；および
（５）得られた脂肪酸エステルを回収する工程；を含む、方法。
【請求項１０】
前記第１工程の加水分解が、グリセリドを加水分解し得る酵素および水の存在下、行われる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルコールが、直鎖低級アルコールである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記直鎖低級アルコールが、メタノールまたはエタノールである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記混合物が、脱酸廃棄物に由来する油分である、請求項９から１２のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１４】
前記油分が、植物油脂、動物油脂、魚油、または微生物油脂からの油脂の製造工程において発生する脱酸廃棄物に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第４工程において、グリセロール量が反応液合計量の１〜５０質量％である、請求項９から１４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２および第４工程において、直鎖低級アルコールは、遊離脂肪酸に対して等モル量以上から酵素を失活させない量で使用される、請求項９から１５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１】
遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸エステルを製造する方法であって、
（１）エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下、該遊離脂肪酸とアルコールとを反応させて脂肪酸エステルを得る第１反応工程；
（２）第１反応工程で生じた水を反応混合物から除去する工程；
（３）該水が除去された反応混合物とアルコールとを、グリセリドをアルコリシスし得る酵素の存在下で反応させ、グリセリド中の脂肪酸を脂肪酸エステルに変換する第２反応工程；および
（４）得られた脂肪酸エステルを回収する工程；を含む、方法。
【請求項２】
前記アルコールが、直鎖低級アルコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記直鎖低級アルコールが、メタノールまたはエタノールである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記混合物が、脱酸廃棄物に由来する油分である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２反応工程において、グリセロールおよび／またはグリセリドを添加してアルコリシスを行う、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記グリセリドが植物油脂、動物油脂、魚油、および微生物油脂からなる群から選択される少なくとも一つの油脂である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記油分が、植物油脂、動物油脂、魚油、または微生物油脂からの油脂の製造工程において発生する脱酸廃棄物に由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記第１反応工程において、直鎖低級アルコールは、遊離脂肪酸に対して等モル以上から前記酵素を失活させない量で使用され、第２反応工程において添加する直鎖低級アルコールは、グリセリド中の脂肪酸に対して０．５モル当量以上から前記酵素を失活させない量で使用される、請求項１から７のいずれかの項に記載の方法。
【請求項９】
遊離脂肪酸およびグリセリドを含有する混合物から脂肪酸エステルを製造する方法であって、
（１）該グリセリドを加水分解して脂肪酸を遊離させ、油水分離により遊離脂肪酸を主成分とする油分を得る第１工程；
（２）エステル化反応を触媒し得る酵素の存在下、該第１工程で生じた遊離脂肪酸とアルコールを反応させ、脂肪酸エステルを得る第２工程；
（３）該第２工程で生じた水を反応混合物から除去する第３工程；
（４）該第３工程で水が除去された反応混合物中の未反応の遊離脂肪酸を、エステル化反応を触媒し得る酵素およびグリセロールの存在下でアルコールと反応させ、遊離脂肪酸を脂肪酸エステルに変換する、第４工程；および
（５）得られた脂肪酸エステルを回収する工程；を含む、方法。
【請求項１０】
前記第１工程の加水分解が、グリセリドを加水分解し得る酵素および水の存在下、行われる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルコールが、直鎖低級アルコールである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記直鎖低級アルコールが、メタノールまたはエタノールである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記混合物が、脱酸廃棄物に由来する油分である、請求項９から１２のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１４】
前記油分が、植物油脂、動物油脂、魚油、または微生物油脂からの油脂の製造工程において発生する脱酸廃棄物に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第４工程において、グリセロール量が反応液合計量の１〜５０質量％である、請求項９から１４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２および第４工程において、直鎖低級アルコールは、遊離脂肪酸に対して等モル量以上から酵素を失活させない量で使用される、請求項９から１５のいずれかの項に記載の方法。
【公開番号】特開２００６−２８８２２８（Ｐ２００６−２８８２２８Ａ）
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１１０６６０（Ｐ２００５−１１０６６０）
【出願日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１５および１６年度、経済産業省 地域新生コンソーシアム研究開発事業、「植物油製造過程で発生する脱酸廃棄物からのバイオ燃料の実用化生産」で得られた成果に基づくものであり、産業再生法第３０条の適用をうけるもの）
【出願人】（５９１０３０４９９）大阪市 (64)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１５および１６年度、経済産業省 地域新生コンソーシアム研究開発事業、「植物油製造過程で発生する脱酸廃棄物からのバイオ燃料の実用化生産」で得られた成果に基づくものであり、産業再生法第３０条の適用をうけるもの）
【出願人】（５９１０３０４９９）大阪市 (64)
【Ｆターム（参考）】
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