脳梗塞の予防及び治療用医薬品の製造におけるＬ−ブチルフタリドの使用
【課題】脳梗塞の予防及び治療用医薬品の製造におけるＬ−ブチルフタリドの使用の提供。
【解決手段】本発明は、脳梗塞、特に局所脳虚血により誘導される脳梗塞の予防及び治療用医薬品の製造におけるＬ−ブチルフタリドの使用を開示する。
【解決手段】本発明は、脳梗塞、特に局所脳虚血により誘導される脳梗塞の予防及び治療用医薬品の製造におけるＬ−ブチルフタリドの使用を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳梗塞（特に、局所脳虚血により誘導される脳梗塞）の予防及び治療用医薬品の製造におけるＬ−ｎ−ブチルフタリド及びこれを含む組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
中国において脳血管疾患は主要な死因の一種になりつつあり、また、急性虚血性脳卒中治療用のより有効な治療剤が世界中で求められている。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が１９９６年に承認した血栓溶解剤ｔ−ＰＡは、脳出血の危険性の上昇に関連する副作用が見られるため、上記疾患に対する治療効果については多くの異論がある。様々な脳保護剤についての研究結果から、医薬品の大部分は臨床的治療効果が不十分であるか、又は、比較的重篤な副作用を有することが示されている。まだ臨床試験段階にある医薬品もある。
【０００３】
本発明者らは１０年以上前に、ラセミ型ブチルフタリド（又はブチルフタリド（ＮＢＰ））が、急性虚血性脳卒中に対して顕著な治療効果を有する薬剤であることを見出した。その薬力学的特徴には下記が含まれる：１．虚血性脳のエネルギー代謝の改善；２．ラットにおいて局所脳虚血により誘導される脳梗塞の範囲の顕著な低減、及び、神経機能欠損の緩和；３．局所脳虚血により誘導される脳浮腫の緩和；４．ラットの虚血領域における局所脳血流及び脳軟膜における微小循環の顕著な改善；並びに、５．局所脳虚血により誘導される記憶障害の顕著な緩和。更に、ラセミ型ブチルフタリドは毒性のある副作用をほとんど有さない。本出願人は中国において関連分野の使用特許を二件取得した：特許文献１（発明の名称：脳虚血により誘導される疾患の予防及び治療用医薬品の製造におけるブチルフタリドの使用、１９９９年発行）及び特許文献２（発明の名称：抗血栓症医薬品の製造におけるブチルフタリドの使用、２００２年発行）（これらはいずれも国際特許分類番号Ａ６１Ｋ３１／３４に属する）。
【０００４】
前臨床研究の後、５４２症例について第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相臨床試験が実施され、１９２症例では、複数の医療機関の連携による二重盲検による無作為プラセボ対照が使用された。投与群における総有効率は７０．７％であり、プラセボ群における割合は４１．０％であることが分かった。このように治療効果は良好であった。クラスＩの新薬について、中国国家薬品監督管理局により２００２年に、急性虚血性脳卒中治療用のＮＢＰについて新薬証明書及び製造認可が承認された（国家医薬品認可番号Ｈ２００２０３７４、同Ｈ２００２０３７５、同２００２Ｈ０５５１及び同２００２Ｈ０５５２）。
【０００５】
ラセミ型ブチルフタリド（以降、ｄｌ−ＮＢＰと略す）の化学分割により、左旋性ブチルフタリド（以降、ｌ−ＮＢＰと略す）及び右旋性ブチルフタリド（以降、ｄ−ＮＢＰと略す）がそれぞれ得られる。本出願人は特許文献３（公開番号ＣＮ１２８３６２１Ａ号、発明の名称：光学活性３−ｎ−ブチルフタリドの調製方法）を出願した。なお、Ｌ−ブチルフタリドの機能については上記特許文献１中では言及していない。
【特許文献１】中国特許ＺＬ９３１１７１４８号
【特許文献２】中国特許ＺＬ９８１２５６１８．Ｘ号
【特許文献３】中国特許出願第９９１０９６７３．８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
先行技術における問題点を解決するため、本発明は、脳梗塞の予防用又は治療用医薬品の製造における下式（Ｉ）のＬ−ｎ−ブチルフタリド（以降、ｌ−ＮＢＰと略す）の使用を提供する。
【０００７】
【化１】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明で使用するＬ−ｎ−ブチルフタリドは、まずラセミ型ｎ−ブチルフタリドを化学合成した後に化学的に分割し、ｎ−ブチルフタリドの左旋性光学異性体を製造することにより得られる。核磁気分光分析、質量分析及び赤外スペクトル分析等によって、特にキラルなガスクロマトグラフィーカラム（Ｃｈｉｒａｌｄｅｘ Ｇ−ＴＡ）を使用するＨＰ５８９０ガスクロマトグラフで調べたところ、生成物は光学純度及び化学的純度について単一の光学立体異性体（すなわち、左旋性のｎ−ブチルフタリド）であることが確認された（比旋光性＞−６６．４９°；光学純度＞９８％；化学的純度＞９８％）。分割方法は中国特許出願（発明の名称：「光学活性３−ｎ−ブチルフタリドの調製方法」）（出願番号第９９１０９６７３．８号及び公開番号ＣＮ１２８３６２１号）に開示されている。生成物は、セロリ及びその種子中に含有されるｎ−ブチルフタリドの化学構造と同一の化学構造を有する。
【０００９】
本研究により、光学異性体ｌ−ＢＮＰのラット脳虚血治療効果はｄ−ＢＮＰよりも良好であること、また、同量のｌ−ＢＮＰを含有するｄｌ−ＢＮＰよりも良好であることを示している。
【００１０】
この実験において、中大脳動脈を２時間閉塞した後に２４時間再灌流して作成した虚血性脳卒中モデルラットにより、光学活性ＮＢＰの脳虚血治療効果が認められた。一過性局所脳虚血ラットを各群１０匹ずつの８群に分けた。第一群は植物油１ｍｌ／ｋｇのビヒクルコントロール；第二群及び第三群はｄｌ−ＮＢＰ ４０ｍｇ／ｋｇ及び８０ｍｇ／ｋｇ；第四群及び第五群はｄ−ＮＢＰ ２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ；第六群及び第七群はｌ−ＮＢＰ ２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ；第八群はＭＫ８０１ ０．１ｍｇ／ｋｇ。第一群〜第七群のラットには経口投与し、第八群のラットには腹腔内投与した。ラットを一過性局所脳虚血として１５分後に、コントロールとして溶媒ブチルフタリド及び陽性薬（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｒｕｇ）を投与した。一元配置ＡＮＯＶＡ分析により各群間に有意差があったことから、ｌ−ＢＮＰ群（２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇの両方）において梗塞体積が用量依存的に顕著に減少したことが示された。４０ｍｇ／ｋｇの群における減少効果が最大であり、梗塞体積の減少は上限８０．４％であった（ｐ＜０．００１、対ビヒクル群）。この群における治療効果はＭＫ８０１群の治療効果（梗塞体積の減少８１．８％；ｐ＜０．００１）と類似しており、一方、ｄ−ＮＢＰ群及びｄｌ−ＮＢＰ群では有意な効果が認められなかった（図１及び図２参照）。上記の結果は、ｌ−ＮＢＰの梗塞体積減少効果がｄ−ＮＢＰよりも大きいことを示す。ｄｌ−ＮＢＰ群（８０ｍｇ／ｋｇ）及びｄ−ＮＢＰ群（４０ｍｇ／ｋｇ）における梗塞体積はビヒクルコントロールよりも減少していたが、その間には統計的な差はなかった。ｄｌ−ＮＢＰ（８０ｍｇ／ｋｇ）はｌ−ＮＢＰ（４０ｍｇ／ｋｇ）を含むため、ｄｌ−ＮＢＰ中のｄ−ＮＢＰがｌ−ＮＢＰの効果を相殺しているであろうことが上記結果から示唆される。
【００１１】
行動評価から、ビヒクルコントロール群の大部分のラットの神経学的スコアは２であり、対側性の前肢屈曲という症状が現れ、側方からの押しに対する抵抗性が低下していた。より少ないラットにおいては対側性の旋回運動が生じ、これらをスコア３と評価した。対側性の前肢屈曲のみを発症したラットは更により少なく、これを１と評価し、また、症状が重篤かつ自律運動をしないものは４と評価した。ビヒクルコントロール群のラットの神経学的スコアの平均は２．６±０．３であった。虚血後１５分におけるｌ−ＢＮＰ ２０ｍｇ／ｋｇ又は４０ｍｇ／ｋｇの経口投与により神経学的症状が改善されることが示され（１．４（ｐ＜０．０１）及び１．１（ｐ＜０．００１））、ＭＫ８０１の効力が最も顕著であり（０．８、ｐ＜０．００１）、一方、ｄ−ＢＮＰ群及びｄｌ−ＢＮＰ群では著しい改善が認められなかった。ＭＫ８０１治療群のラットについては、脳虚血により誘導される症状は著しく軽減されたが、四肢が弱くて伸ばすとよろめき、運動失調があり、更に一方向に旋回した。この行動評価から、行動改善程度は薬剤の梗塞体積低減効果に対応することが示唆される。
【００１２】
まとめると、本発明を生化学的、分子生物学的及び動物レベルで実施したところ結果が一致していた。すなわち、ｌ−ＮＢＰの脳保護効果はｄ−ＮＢＰ及びｄｌ−ＮＢＰの脳保護効果よりも大きく、また、ｄｌ−ＮＢＰ中のｄ−ＮＢＰはｌ−ＮＢＰの作用を相殺するため、ｄｌ−ＮＢＰの脳虚血保護効果が低下する。
【００１３】
以前の研究では、血小板凝集及び血栓症に対するｌ−ＮＢＰの効果はアスピリン及びチクロピジンの効果と類似することが示されている。加えて、ｌ−ＮＢＰは、アスピリン及びチクロピジンが有さない脳保護効果及び微小循環改善効果を有する（ｄ−ＮＢＰはこの効果を有さない）。従って、ｌ−ＮＢＰは治療スペクトルが非常に広いため、急性虚血性脳卒中の治療、並びに、脳卒中の二次的予防、心筋梗塞の予防及び末梢血管疾患の治療に使用可能である。
【００１４】
本発明は、ラセミ型薬剤を分割して光学モノマーとし、その個々の特徴を明確にして、効果が強い又は毒性副作用の低い光学異性体からキラルな新薬を開発することにより、治療効果を増大させ、かつ、毒性副作用を低下させる国際的な新薬発見の発展を追求するものである。これに関連して、ラセミ型ブチルフタリド中のｌ−ＮＢＰは脳虚血に対して比較的強力な阻害効果を有する。ｄ−ＮＢＰは効果が弱いだけでなく、ｌ−ＮＢＰの脳虚血阻害効果を相殺する。従って、Ｌ−ブチルフタリドから急性虚血性脳卒中治療用の新規のキラルな薬剤を開発することは妥当である。
【００１５】
本発明はまた、本発明の化合物を有効成分として含み、かつ、従来の医薬品に許容されるビヒクル又は補助剤を含む医薬組成物にも関する。概して、本発明の医薬組成物は本発明の化合物を０．１〜９５重量％含む。
【００１６】
本発明の化合物を含む医薬組成物は、本分野において公知の方法で調製可能である。この場合、本発明の化合物は、所望される場合に、一又は複数の固体又は液体の医薬品に許容されるビヒクル及び／又は補助剤と組み合わせて、人間又は動物における使用に好適な投与形態又は投薬形態に調製可能である。
【００１７】
本発明の化合物及びこれを含む組成物は単位投薬形態で投与可能であり、投与経路は腸管経路又は非経口経路が可能であり、例えば、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、鼻腔投与、口腔粘膜投与、経皮投与、腹腔内投与又は直腸投与等が可能である。
【００１８】
本発明の化合物又はこれを含む医薬組成物の投与経路は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射及び経穴注射等の注射が可能である。
【００１９】
投与調製物は液体調製物又は固体調製物であってよい。例えば、液体調製物としては、溶液、コロイド、微粒子、エマルション及び懸濁物が可能である。例えば錠剤、カプセル、ピル、エアロゾル、ペレット、粉末、溶液、懸濁物、エマルション、粒状物、坐薬及び凍結乾燥粉末等、他の調製物であってもよい。
【００２０】
本発明の化合物は、従来の調製物、並びに、持続放出調製物、制御放出調製物、標的化調製物、及び、様々な微粒子投与系に調製可能である。
【００２１】
単位投薬形態を錠剤として調製する際、この分野で公知の様々な媒介剤（ｖｅｃｔｏｒ）を広範囲に使用可能である。媒介剤の例としては例えば、デンプン、デキストリン、硫酸カルシウム、ラクトース、マンニトール、スクロース、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース及びケイ酸アルミニウム等の希釈剤及び吸収剤；水、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、デンプンスラリー、デキストリン、シロップ、蜜、グルコース溶液、アラビアゴムスラリー、ゼラチンスラリー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、シェラック、メチルセルロース、リン酸カリウム及びポリビニルピロリドン等の湿潤化剤及び結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸塩、寒天粉末、褐藻植物デンプン、重炭酸ナトリウム及びクエン酸、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリルスルホン酸ナトリウム、メチルセルロース及びエチルセルロース等の崩壊剤；スクロース、トリステアリン酸グリセロール、カカオ脂及び硬化油等の崩壊阻害剤；第四級アンモニウム塩及びドデシル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；タルク粉末、二酸化ケイ素、トウモロコシデンプン、ステアリン酸塩、ホウ酸、流動パラフィン及びポリエチレングリコール等の滑剤等が挙げられる。錠剤は更に、コーティング錠剤（例えば、糖衣錠、フィルムコーティング錠剤、腸溶性コーティング錠剤等）、又は、二層錠剤及び多層錠剤として調製可能である。
【００２２】
単位投薬形態をペレット状に調製する際、例えば、この分野で公知の様々な媒介剤を広範囲に使用可能である。媒介剤の例としては例えば、グルコース、ラクトース、デンプン、カカオ脂、水素化植物油、ポリビニルピロリドン、カオリン及びタルク粉末等の希釈剤及び吸収剤；アラビアゴム、トラガカントゴム、ゼラチン、エタノール、蜜、液糖、コメペースト又はパナーダ等の結合剤；寒天粉末、乾燥デンプン、アルギン酸塩、ラウリルスルホン酸ナトリウム、メチルセルロース及びエチルセルロース等の崩壊剤等が挙げられる。
【００２３】
単位投薬形態物をカプセルとして調製する際、有効成分としての本発明の化合物を上記の様々な媒介剤と混合して得る混合物をハードゼラチンカプセル又はソフトカプセル中に入れる。また、有効成分としての本発明の化合物をマイクロカプセル中に配合し、水性媒体と混合して懸濁物とし、ハードカプセル中に充填又は注射物として配合して使用可能である。
【００２４】
例えば、本発明の化合物を注射用製剤、例えば、注射用の溶液、懸濁物、エマルション、凍結乾燥粉末等に配合可能であり、これらは水性又は非水性のいずれであってもよく、また、一及び／又は複数の医薬品に許容される媒介剤、希釈剤、結合剤、滑剤、保存剤、界面活性剤又は分散剤を含んでよい。希釈剤は、例えば、水、エタノール、ポリエチレングリコール、１，３−プロピレングリコール、エトキシル化イソステアリルアルコール、多オキシル化イソステアリルアルコール及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等から選択可能である。更に、適量の塩化ナトリウム、グルコース又はグリセロールを注射用調製物に添加して、等張性注射物を調製可能である。また、従来の溶解剤、バッファー、ｐＨ調節剤も添加可能である。これらの補助剤はこの分野では一般に使用される。
【００２５】
更に、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、矯味矯臭剤又は甘味剤等を医薬調製物に添加可能である。
【００２６】
投与目的の達成及び治療効果の増大のため、この分野で公知の任意の投与方法により医薬品又は医薬組成物を投与可能である。
【００２７】
本発明の化合物を含む医薬組成物の投与用量は、予防又は治療する疾患の性質又は重篤度、患者又は動物の性別、年齢、体重、特質及び個々の応答、投与経路、投与頻度及び治療目的等の多くの要因に応じて変わる。従って、本発明における治療用量は広範囲で変化する可能性がある。一般的に、本発明における医薬成分の用量は、当業者に公知であり、また、本発明の化合物を含む組成物の最終調製物に含有される薬剤の正確な量により好適に調節し、治療有効量を達成することにより、本発明の予防又は治療目的を達成可能である。好適な１日用量は好ましくは０．１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／日／人である。投薬は、投与者の臨床経験に応じて、単位投薬形態で、又は、投与のために２つ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）の投薬形態に分割して実施可能であり、また、他の治療手段による他の投薬法を含む。
【００２８】
各治療に必要な総用量を２回以上に分けて、又は、１回で投与可能である。本発明の化合物又は組成物は、単独投与、又は、容量調節した他の治療剤又は効果の異なる薬剤との組み合わせでも使用可能である。
【００２９】
用語：
ｄｌ−ＮＢＰ：ラセミ型ブチルフタリド
ｄ−ＮＢＰ：右旋性ブチルフタリド
ｌ−ＮＢＰ：左旋性ｎ−ブチルフタリド
ｔＭＣＡＯ：一過性局所脳虚血モデル
【００３０】
図面の説明
図１は、一過性の中大脳動脈閉塞の１５分後に胃管法によりＮＢＰを投与したラットの脳梗塞体積に対する効果を示すデジタル写真である。
【００３１】
図２は、一過性の中大脳動脈閉塞の１５分後に胃管法によりＮＢＰを投与したラットの脳梗塞体積に対する効果を示す。データは、梗塞部分を反対側の（正常な）半球の部分により除することによって得られる体積百分率として表され、平均±標準誤差として表される。
＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（対ビヒクル群）。
【００３２】
図３は、一過性の中大脳動脈閉塞の１５分後に胃管法によりＮＢＰを投与したラットの行動スコアに対する効果を示す。データは平均±標準誤差として表される。
＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（対ビヒクル群）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
[実施例１]
ｔＭＣＡＯラットの脳梗塞体積に対する光学ブチルフタリドの効果
実験材料及び方法
試薬及び薬剤
ｌ−ＮＢＰ、ｄ−ＮＢＰ及びｄｌ−ＮＢＰはいずれも当研究所の合成製薬化学部門より入手。これらの光学純度及び化学的純度は共に＞９９％であり、旋光性はそれぞれ−６６．４９°、＋６６．８８°及び０°である。これらを植物油と配合した。ＭＫ８０１はシグマ社製であり、生理的ブラインと配合した。塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｌａｎｔ社製造）を蒸留水を配合して４％溶液として使用した。
【００３４】
一過性局所脳虚血モデル（ｔＭＣＡＯ）の調製
体重２８０ｇ〜３２０ｇのオスＷｉｓｔｅｒ系ラットを使用し、１つのケージにラット５匹の割合で飼育した。室温を２３℃に制御し、ラットには食物及び水を自由に摂取させた。ラットをペントバルビタールナトリウム４０ｍｇ／ｋｇで麻酔した。手術用顕微鏡下、正中頸部皮膚切開により右総頸動脈を露出させた後、内頸動脈（ＩＣＡ）及び外頸動脈（ＥＣＡ）を周囲の神経及び筋膜から分離し、吻合分岐を結紮した。ＥＣＡを結紮して切断し、引っ張ってまっすぐにしてＩＣＡと一直線とした。先端が丸く直径０．２８ｍｍのナイロン縫合糸（ポリ−Ｌ−リシンで被覆）をＥＣＡからＩＣＡの内腔に約２０ｍｍにわたって頭蓋内を中大脳動脈の開始点の方向に導入した。２時間虚血させた後、ナイロン縫合糸を慎重に引き抜き、ＥＣＡを開口部位で結紮した。その後、ラットを縫合してケージに戻し、２４時間再灌流した。手術中、室温を２４℃〜２５℃で維持した。ラットを３７℃の加熱プレート上に置き、手術中体温を維持した。虚血して１５分後に投与した。
【００３５】
グループ分け及び薬剤投与
ラットを各群１０匹ずつの８群に分けた。第一群は植物油１ｍｌ／ｋｇのビヒクルコントロール；第二群及び第三群はｄｌ−ＮＢＰ ４０ｍｇ／ｋｇ及び８０ｍｇ／ｋｇ；第四群及び第五群はｄ−ＮＢＰ ２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ；第六群及び第七群はｌ−ＮＢＰ ２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ；第八群はＭＫ８０１ ０．１ｍｇ／ｋｇ。第一群〜第七群のラットには経口投与し、第八群のラットには腹腔内投与した。
【００３６】
神経学的行動評価
虚血して２４時間後に神経学的行動を観察した。ラットを尾を持って地面から１インチ持ち上げ、両前肢の状態を観察した。両肩を押して、左右の抵抗性に差異があるかを観察した。ラットを地面に下ろして歩行状態を観察した。下記基準に従ってスコアをつけた。
０：強い前肢、地面に向かって対称的に伸びる；両肩の抵抗性は同一、及び、正常な歩行。
１：対側性の肩の屈曲、前肢の屈曲；両肩の抵抗性は同一、及び、正常な歩行。
２：対側性の肩の屈曲、前肢の屈曲；押しに対する肩の抵抗性の対側性の低下、及び、正常な歩行。
３：対側性の肩の屈曲、前肢の屈曲；押しに対する肩の抵抗性の対側性の低下、及び、歩行時に旋回。
４：対側性の肩の屈曲、前肢の屈曲；自律的に動くことができない。
スコアが大きいほど、ラットの行動障害は重篤である。
【００３７】
脳梗塞体積の測定
手術して２４時間後にラットをペントバルビタールナトリウム１００ｍｇ／ｋｇで麻酔し、断頭した。その後、脳を迅速に取り出し、冠状縫合に沿って切片６つに切断し（第一〜第五の切片は厚さ２ｍｍ、第六の切片は厚さ４ｍｍ）、その後迅速に、１４％ＴＴＣ１．５ｍｌ及び１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１ｍｌを含む溶液５ｍｌ中に入れて遮光した。３７℃で３０分間インキュベートし、その間、７〜８分毎に上下を反転させた。ＴＴＣにより染色後、正常な脳組織は赤色、梗塞組織は白色となり、境界が明確であった。インキュベート後、脳切片の各群を順に並べ、保存用にデジタルカメラで撮影した。それぞれの切片をコンピューター画像分析装置システム（ＳＰＯＴ ３．５ ソフトウエア）で調べ、梗塞面積の積分により梗塞体積を計算した。脳浮腫の影響を避けるため、梗塞体積を脳半球の百分率で表した。計算式は次の通りである：脳梗塞体積（％）＝（非手術半球の体積−手術半球の非梗塞部分の体積）／（非手術半球の体積）。
【００３８】
統計学的分析
結果を平均±標準誤差で表した。一元配置ＡＮＯＶＡにより神経学的行動スコア及び脳梗塞体積を統計学的に分析し、また、ｐｏｓｔｈｏｃ ＬＳＤ検定により群間の差を分析した。ｐ＜０．０５の場合に結果は有意差を示すと考えた。
【００３９】
結果
ｔＭＣＡＯラットの脳梗塞体積に対する光学ブチルフタリドの効果
一元配置ＡＮＯＶＡ分析により各群間に有意差があったことから、ｌ−ＮＢＰ群（２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇの両方）において梗塞体積が非常に顕著かつ用量依存的に減少していることが示される。ｌ−ＮＢＰ ４０ｍｇ／ｋｇの群における減少効果が最も良く、梗塞体積が上限８０．４％減少した（ｐ＜０．００１、対ビヒクル群）。この群における治療効果はＭＫ８０１群の治療効果（梗塞体積減少８１．８％下；ｐ＜０．００１）と類似しており、その一方で、ｄ−ＮＢＰ群及びｄｌ−ＮＢＰ群には著しい効果が認められなかった（図１及び図２参照）。上記結果は、ｌ−ＮＢＰの梗塞体積減少効果がｄ−ＮＢＰよりも良好であることを示している。ｄｌ−ＮＢＰ群（８０ｍｇ／ｋｇ）及びｄ−ＮＢＰ群（４０ｍｇ／ｋｇ）における梗塞体積はビヒクルコントロールよりも低かったが、その間には統計学的な差はなかったことから、ｄｌ−ＮＢＰ中のｄ−ＮＢＰがｌ−ＮＢＰの効果を相殺しているであろうことが示唆される。
【００４０】
行動評価
ビヒクルコントロール群の大部分のラットの神経学的スコアは２であり、対側性の前肢屈曲という症状が現れ、側方からの押しに対する抵抗性が低下していた。より少ないラットにおいては対側性の旋回運動が生じ、これらをスコア３と評価した。対側性の前肢屈曲のみを発症したラットは更により少なく、これを１と評価し、また、症状が重篤かつ自律運動不可能なものは４と評価した。神経学的スコアの平均は２．６±０．３であった。虚血後１５分におけるｌ−ＢＮＰ ２０ｍｇ／ｋｇ又は４０ｍｇ／ｋｇの経口投与により神経学的症状が改善されることが示され（１．４（ｐ＜０．０１）及び１．１（ｐ＜０．００１））、ＭＫ８０１の効力が最も顕著であり（０．８、ｐ＜０．００１）、一方、ｄ−ＢＮＰ群及びｄｌ−ＢＮＰ群では著しい改善が認められなかった。ＭＫ８０１治療群のラットについては、脳虚血により誘導される症状は著しく軽減されたが、四肢が弱くて伸ばすとよろめき、運動失調があり、更に一方向に旋回した。この行動評価から、薬剤の行動改善程度は薬剤の梗塞体積低減効果に対応することが示唆される（図３参照）。
【００４１】
考察
本発明者らが以前に使用したモデルは永続的な局所虚血（中大脳動脈の焼灼による）であり、一方、この実験では一過性の局所脳虚血モデル（虚血２時間＋再灌流２４時間）を使用している。後者は脳梗塞体積が前者よりも大きい。ｄｌ−ＭＢＰ用量は前回の用量と同じにしたが、ｄｌ−ＮＢＰは、使用した用量（４０ｍｇ／ｋｇ及び８０ｍｇ／ｋｇ）では脳梗塞体積減少効果を有さない。この結果の差はこの二種のモデルの差に起因する。
【００４２】
本発明を生化学的、分子生物学的及び動物レベルで実施したところ結果が一致していた、すなわち、ｌ−ＮＢＰの脳保護効果はｄ−ＮＢＰ及びｄｌ−ＮＢＰよりも大きく、また、ｄｌ−ＮＢＰ中のｄ−ＮＢＰはｌ−ＮＢＰの作用を相殺するため、ｄｌ−ＮＢＰの脳虚血保護効果が低下する。
【００４３】
文献中に記載されるように、また、新薬発見に対する要求により、治療効果の増大及び毒性副作用の軽減を目的として、ラセミ型薬剤を分割して光学モノマーとし、その個々の特徴を明確にして、効果が強い又は毒性副作用の低い光学異性体からキラルな新薬を開発することが望ましい。これに関連して、ラセミ型ブチルフタリド中のｌ−ＮＢＰは比較的強力な脳虚血保護効果を有する。ｄ−ＮＢＰは効果が弱いだけでなく、ｌ−ＮＢＰの脳虚血保護効果を相殺する。従って、Ｌ−ブチルフタリドから急性虚血性脳卒中治療用の新規のキラルな薬剤を開発することは妥当である。
【００４４】
以前の研究では、血小板凝集及び血栓症に対するｌ−ＮＢＰの阻害効果はアスピリン及びチクロピジンの効果と類似することが示されている。加えて、ｌ−ＮＢＰは、アスピリン及びチクロピジンが有さない脳保護効果及び微小循環改善効果を有する（ｄ−ＮＢＰはこの効果を有さない）。従って、ｌ−ＮＢＰは治療スペクトルが非常に広いため、急性虚血性脳卒中の治療、並びに、脳卒中の二次的予防、心筋梗塞の予防及び末梢血管疾患の治療に使用可能である。重要な社会的利益及び経済的利益をもたらすことが期待されるので、ｌ−ＮＢＰから脳卒中治療用薬剤を開発することは有望である。左旋性ブチルフタリドの局所脳虚血治療効果は中国及び他の国でも報告されていない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】一過性の中大脳動脈閉塞の１５分後に胃管法によりＮＢＰを投与したラットの脳梗塞体積に対する効果を示すデジタル写真である。
【図２】一過性の中大脳動脈閉塞の１５分後に胃管法によりＮＢＰを投与したラットの脳梗塞体積に対する効果を示す。データは、梗塞部分を反対側の（正常な）半球の部分により除することによって得られる体積百分率として表され、平均±標準誤差として表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（対ビヒクル群）。
【図３】一過性の中大脳動脈閉塞の１５分後に胃管法によりＮＢＰを投与したラットの行動スコアに対する効果を示す。データは平均±標準誤差として表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（対ビヒクル群）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳梗塞（特に、局所脳虚血により誘導される脳梗塞）の予防及び治療用医薬品の製造におけるＬ−ｎ−ブチルフタリド及びこれを含む組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
中国において脳血管疾患は主要な死因の一種になりつつあり、また、急性虚血性脳卒中治療用のより有効な治療剤が世界中で求められている。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が１９９６年に承認した血栓溶解剤ｔ−ＰＡは、脳出血の危険性の上昇に関連する副作用が見られるため、上記疾患に対する治療効果については多くの異論がある。様々な脳保護剤についての研究結果から、医薬品の大部分は臨床的治療効果が不十分であるか、又は、比較的重篤な副作用を有することが示されている。まだ臨床試験段階にある医薬品もある。
【０００３】
本発明者らは１０年以上前に、ラセミ型ブチルフタリド（又はブチルフタリド（ＮＢＰ））が、急性虚血性脳卒中に対して顕著な治療効果を有する薬剤であることを見出した。その薬力学的特徴には下記が含まれる：１．虚血性脳のエネルギー代謝の改善；２．ラットにおいて局所脳虚血により誘導される脳梗塞の範囲の顕著な低減、及び、神経機能欠損の緩和；３．局所脳虚血により誘導される脳浮腫の緩和；４．ラットの虚血領域における局所脳血流及び脳軟膜における微小循環の顕著な改善；並びに、５．局所脳虚血により誘導される記憶障害の顕著な緩和。更に、ラセミ型ブチルフタリドは毒性のある副作用をほとんど有さない。本出願人は中国において関連分野の使用特許を二件取得した：特許文献１（発明の名称：脳虚血により誘導される疾患の予防及び治療用医薬品の製造におけるブチルフタリドの使用、１９９９年発行）及び特許文献２（発明の名称：抗血栓症医薬品の製造におけるブチルフタリドの使用、２００２年発行）（これらはいずれも国際特許分類番号Ａ６１Ｋ３１／３４に属する）。
【０００４】
前臨床研究の後、５４２症例について第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相臨床試験が実施され、１９２症例では、複数の医療機関の連携による二重盲検による無作為プラセボ対照が使用された。投与群における総有効率は７０．７％であり、プラセボ群における割合は４１．０％であることが分かった。このように治療効果は良好であった。クラスＩの新薬について、中国国家薬品監督管理局により２００２年に、急性虚血性脳卒中治療用のＮＢＰについて新薬証明書及び製造認可が承認された（国家医薬品認可番号Ｈ２００２０３７４、同Ｈ２００２０３７５、同２００２Ｈ０５５１及び同２００２Ｈ０５５２）。
【０００５】
ラセミ型ブチルフタリド（以降、ｄｌ−ＮＢＰと略す）の化学分割により、左旋性ブチルフタリド（以降、ｌ−ＮＢＰと略す）及び右旋性ブチルフタリド（以降、ｄ−ＮＢＰと略す）がそれぞれ得られる。本出願人は特許文献３（公開番号ＣＮ１２８３６２１Ａ号、発明の名称：光学活性３−ｎ−ブチルフタリドの調製方法）を出願した。なお、Ｌ−ブチルフタリドの機能については上記特許文献１中では言及していない。
【特許文献１】中国特許ＺＬ９３１１７１４８号
【特許文献２】中国特許ＺＬ９８１２５６１８．Ｘ号
【特許文献３】中国特許出願第９９１０９６７３．８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
先行技術における問題点を解決するため、本発明は、脳梗塞の予防用又は治療用医薬品の製造における下式（Ｉ）のＬ−ｎ−ブチルフタリド（以降、ｌ−ＮＢＰと略す）の使用を提供する。
【０００７】
【化１】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明で使用するＬ−ｎ−ブチルフタリドは、まずラセミ型ｎ−ブチルフタリドを化学合成した後に化学的に分割し、ｎ−ブチルフタリドの左旋性光学異性体を製造することにより得られる。核磁気分光分析、質量分析及び赤外スペクトル分析等によって、特にキラルなガスクロマトグラフィーカラム（Ｃｈｉｒａｌｄｅｘ Ｇ−ＴＡ）を使用するＨＰ５８９０ガスクロマトグラフで調べたところ、生成物は光学純度及び化学的純度について単一の光学立体異性体（すなわち、左旋性のｎ−ブチルフタリド）であることが確認された（比旋光性＞−６６．４９°；光学純度＞９８％；化学的純度＞９８％）。分割方法は中国特許出願（発明の名称：「光学活性３−ｎ−ブチルフタリドの調製方法」）（出願番号第９９１０９６７３．８号及び公開番号ＣＮ１２８３６２１号）に開示されている。生成物は、セロリ及びその種子中に含有されるｎ−ブチルフタリドの化学構造と同一の化学構造を有する。
【０００９】
本研究により、光学異性体ｌ−ＢＮＰのラット脳虚血治療効果はｄ−ＢＮＰよりも良好であること、また、同量のｌ−ＢＮＰを含有するｄｌ−ＢＮＰよりも良好であることを示している。
【００１０】
この実験において、中大脳動脈を２時間閉塞した後に２４時間再灌流して作成した虚血性脳卒中モデルラットにより、光学活性ＮＢＰの脳虚血治療効果が認められた。一過性局所脳虚血ラットを各群１０匹ずつの８群に分けた。第一群は植物油１ｍｌ／ｋｇのビヒクルコントロール；第二群及び第三群はｄｌ−ＮＢＰ ４０ｍｇ／ｋｇ及び８０ｍｇ／ｋｇ；第四群及び第五群はｄ−ＮＢＰ ２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ；第六群及び第七群はｌ−ＮＢＰ ２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ；第八群はＭＫ８０１ ０．１ｍｇ／ｋｇ。第一群〜第七群のラットには経口投与し、第八群のラットには腹腔内投与した。ラットを一過性局所脳虚血として１５分後に、コントロールとして溶媒ブチルフタリド及び陽性薬（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｒｕｇ）を投与した。一元配置ＡＮＯＶＡ分析により各群間に有意差があったことから、ｌ−ＢＮＰ群（２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇの両方）において梗塞体積が用量依存的に顕著に減少したことが示された。４０ｍｇ／ｋｇの群における減少効果が最大であり、梗塞体積の減少は上限８０．４％であった（ｐ＜０．００１、対ビヒクル群）。この群における治療効果はＭＫ８０１群の治療効果（梗塞体積の減少８１．８％；ｐ＜０．００１）と類似しており、一方、ｄ−ＮＢＰ群及びｄｌ−ＮＢＰ群では有意な効果が認められなかった（図１及び図２参照）。上記の結果は、ｌ−ＮＢＰの梗塞体積減少効果がｄ−ＮＢＰよりも大きいことを示す。ｄｌ−ＮＢＰ群（８０ｍｇ／ｋｇ）及びｄ−ＮＢＰ群（４０ｍｇ／ｋｇ）における梗塞体積はビヒクルコントロールよりも減少していたが、その間には統計的な差はなかった。ｄｌ−ＮＢＰ（８０ｍｇ／ｋｇ）はｌ−ＮＢＰ（４０ｍｇ／ｋｇ）を含むため、ｄｌ−ＮＢＰ中のｄ−ＮＢＰがｌ−ＮＢＰの効果を相殺しているであろうことが上記結果から示唆される。
【００１１】
行動評価から、ビヒクルコントロール群の大部分のラットの神経学的スコアは２であり、対側性の前肢屈曲という症状が現れ、側方からの押しに対する抵抗性が低下していた。より少ないラットにおいては対側性の旋回運動が生じ、これらをスコア３と評価した。対側性の前肢屈曲のみを発症したラットは更により少なく、これを１と評価し、また、症状が重篤かつ自律運動をしないものは４と評価した。ビヒクルコントロール群のラットの神経学的スコアの平均は２．６±０．３であった。虚血後１５分におけるｌ−ＢＮＰ ２０ｍｇ／ｋｇ又は４０ｍｇ／ｋｇの経口投与により神経学的症状が改善されることが示され（１．４（ｐ＜０．０１）及び１．１（ｐ＜０．００１））、ＭＫ８０１の効力が最も顕著であり（０．８、ｐ＜０．００１）、一方、ｄ−ＢＮＰ群及びｄｌ−ＢＮＰ群では著しい改善が認められなかった。ＭＫ８０１治療群のラットについては、脳虚血により誘導される症状は著しく軽減されたが、四肢が弱くて伸ばすとよろめき、運動失調があり、更に一方向に旋回した。この行動評価から、行動改善程度は薬剤の梗塞体積低減効果に対応することが示唆される。
【００１２】
まとめると、本発明を生化学的、分子生物学的及び動物レベルで実施したところ結果が一致していた。すなわち、ｌ−ＮＢＰの脳保護効果はｄ−ＮＢＰ及びｄｌ−ＮＢＰの脳保護効果よりも大きく、また、ｄｌ−ＮＢＰ中のｄ−ＮＢＰはｌ−ＮＢＰの作用を相殺するため、ｄｌ−ＮＢＰの脳虚血保護効果が低下する。
【００１３】
以前の研究では、血小板凝集及び血栓症に対するｌ−ＮＢＰの効果はアスピリン及びチクロピジンの効果と類似することが示されている。加えて、ｌ−ＮＢＰは、アスピリン及びチクロピジンが有さない脳保護効果及び微小循環改善効果を有する（ｄ−ＮＢＰはこの効果を有さない）。従って、ｌ−ＮＢＰは治療スペクトルが非常に広いため、急性虚血性脳卒中の治療、並びに、脳卒中の二次的予防、心筋梗塞の予防及び末梢血管疾患の治療に使用可能である。
【００１４】
本発明は、ラセミ型薬剤を分割して光学モノマーとし、その個々の特徴を明確にして、効果が強い又は毒性副作用の低い光学異性体からキラルな新薬を開発することにより、治療効果を増大させ、かつ、毒性副作用を低下させる国際的な新薬発見の発展を追求するものである。これに関連して、ラセミ型ブチルフタリド中のｌ−ＮＢＰは脳虚血に対して比較的強力な阻害効果を有する。ｄ−ＮＢＰは効果が弱いだけでなく、ｌ−ＮＢＰの脳虚血阻害効果を相殺する。従って、Ｌ−ブチルフタリドから急性虚血性脳卒中治療用の新規のキラルな薬剤を開発することは妥当である。
【００１５】
本発明はまた、本発明の化合物を有効成分として含み、かつ、従来の医薬品に許容されるビヒクル又は補助剤を含む医薬組成物にも関する。概して、本発明の医薬組成物は本発明の化合物を０．１〜９５重量％含む。
【００１６】
本発明の化合物を含む医薬組成物は、本分野において公知の方法で調製可能である。この場合、本発明の化合物は、所望される場合に、一又は複数の固体又は液体の医薬品に許容されるビヒクル及び／又は補助剤と組み合わせて、人間又は動物における使用に好適な投与形態又は投薬形態に調製可能である。
【００１７】
本発明の化合物及びこれを含む組成物は単位投薬形態で投与可能であり、投与経路は腸管経路又は非経口経路が可能であり、例えば、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、鼻腔投与、口腔粘膜投与、経皮投与、腹腔内投与又は直腸投与等が可能である。
【００１８】
本発明の化合物又はこれを含む医薬組成物の投与経路は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射及び経穴注射等の注射が可能である。
【００１９】
投与調製物は液体調製物又は固体調製物であってよい。例えば、液体調製物としては、溶液、コロイド、微粒子、エマルション及び懸濁物が可能である。例えば錠剤、カプセル、ピル、エアロゾル、ペレット、粉末、溶液、懸濁物、エマルション、粒状物、坐薬及び凍結乾燥粉末等、他の調製物であってもよい。
【００２０】
本発明の化合物は、従来の調製物、並びに、持続放出調製物、制御放出調製物、標的化調製物、及び、様々な微粒子投与系に調製可能である。
【００２１】
単位投薬形態を錠剤として調製する際、この分野で公知の様々な媒介剤（ｖｅｃｔｏｒ）を広範囲に使用可能である。媒介剤の例としては例えば、デンプン、デキストリン、硫酸カルシウム、ラクトース、マンニトール、スクロース、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース及びケイ酸アルミニウム等の希釈剤及び吸収剤；水、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、デンプンスラリー、デキストリン、シロップ、蜜、グルコース溶液、アラビアゴムスラリー、ゼラチンスラリー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、シェラック、メチルセルロース、リン酸カリウム及びポリビニルピロリドン等の湿潤化剤及び結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸塩、寒天粉末、褐藻植物デンプン、重炭酸ナトリウム及びクエン酸、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリルスルホン酸ナトリウム、メチルセルロース及びエチルセルロース等の崩壊剤；スクロース、トリステアリン酸グリセロール、カカオ脂及び硬化油等の崩壊阻害剤；第四級アンモニウム塩及びドデシル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；タルク粉末、二酸化ケイ素、トウモロコシデンプン、ステアリン酸塩、ホウ酸、流動パラフィン及びポリエチレングリコール等の滑剤等が挙げられる。錠剤は更に、コーティング錠剤（例えば、糖衣錠、フィルムコーティング錠剤、腸溶性コーティング錠剤等）、又は、二層錠剤及び多層錠剤として調製可能である。
【００２２】
単位投薬形態をペレット状に調製する際、例えば、この分野で公知の様々な媒介剤を広範囲に使用可能である。媒介剤の例としては例えば、グルコース、ラクトース、デンプン、カカオ脂、水素化植物油、ポリビニルピロリドン、カオリン及びタルク粉末等の希釈剤及び吸収剤；アラビアゴム、トラガカントゴム、ゼラチン、エタノール、蜜、液糖、コメペースト又はパナーダ等の結合剤；寒天粉末、乾燥デンプン、アルギン酸塩、ラウリルスルホン酸ナトリウム、メチルセルロース及びエチルセルロース等の崩壊剤等が挙げられる。
【００２３】
単位投薬形態物をカプセルとして調製する際、有効成分としての本発明の化合物を上記の様々な媒介剤と混合して得る混合物をハードゼラチンカプセル又はソフトカプセル中に入れる。また、有効成分としての本発明の化合物をマイクロカプセル中に配合し、水性媒体と混合して懸濁物とし、ハードカプセル中に充填又は注射物として配合して使用可能である。
【００２４】
例えば、本発明の化合物を注射用製剤、例えば、注射用の溶液、懸濁物、エマルション、凍結乾燥粉末等に配合可能であり、これらは水性又は非水性のいずれであってもよく、また、一及び／又は複数の医薬品に許容される媒介剤、希釈剤、結合剤、滑剤、保存剤、界面活性剤又は分散剤を含んでよい。希釈剤は、例えば、水、エタノール、ポリエチレングリコール、１，３−プロピレングリコール、エトキシル化イソステアリルアルコール、多オキシル化イソステアリルアルコール及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等から選択可能である。更に、適量の塩化ナトリウム、グルコース又はグリセロールを注射用調製物に添加して、等張性注射物を調製可能である。また、従来の溶解剤、バッファー、ｐＨ調節剤も添加可能である。これらの補助剤はこの分野では一般に使用される。
【００２５】
更に、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、矯味矯臭剤又は甘味剤等を医薬調製物に添加可能である。
【００２６】
投与目的の達成及び治療効果の増大のため、この分野で公知の任意の投与方法により医薬品又は医薬組成物を投与可能である。
【００２７】
本発明の化合物を含む医薬組成物の投与用量は、予防又は治療する疾患の性質又は重篤度、患者又は動物の性別、年齢、体重、特質及び個々の応答、投与経路、投与頻度及び治療目的等の多くの要因に応じて変わる。従って、本発明における治療用量は広範囲で変化する可能性がある。一般的に、本発明における医薬成分の用量は、当業者に公知であり、また、本発明の化合物を含む組成物の最終調製物に含有される薬剤の正確な量により好適に調節し、治療有効量を達成することにより、本発明の予防又は治療目的を達成可能である。好適な１日用量は好ましくは０．１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／日／人である。投薬は、投与者の臨床経験に応じて、単位投薬形態で、又は、投与のために２つ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）の投薬形態に分割して実施可能であり、また、他の治療手段による他の投薬法を含む。
【００２８】
各治療に必要な総用量を２回以上に分けて、又は、１回で投与可能である。本発明の化合物又は組成物は、単独投与、又は、容量調節した他の治療剤又は効果の異なる薬剤との組み合わせでも使用可能である。
【００２９】
用語：
ｄｌ−ＮＢＰ：ラセミ型ブチルフタリド
ｄ−ＮＢＰ：右旋性ブチルフタリド
ｌ−ＮＢＰ：左旋性ｎ−ブチルフタリド
ｔＭＣＡＯ：一過性局所脳虚血モデル
【００３０】
図面の説明
図１は、一過性の中大脳動脈閉塞の１５分後に胃管法によりＮＢＰを投与したラットの脳梗塞体積に対する効果を示すデジタル写真である。
【００３１】
図２は、一過性の中大脳動脈閉塞の１５分後に胃管法によりＮＢＰを投与したラットの脳梗塞体積に対する効果を示す。データは、梗塞部分を反対側の（正常な）半球の部分により除することによって得られる体積百分率として表され、平均±標準誤差として表される。
＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（対ビヒクル群）。
【００３２】
図３は、一過性の中大脳動脈閉塞の１５分後に胃管法によりＮＢＰを投与したラットの行動スコアに対する効果を示す。データは平均±標準誤差として表される。
＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（対ビヒクル群）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
[実施例１]
ｔＭＣＡＯラットの脳梗塞体積に対する光学ブチルフタリドの効果
実験材料及び方法
試薬及び薬剤
ｌ−ＮＢＰ、ｄ−ＮＢＰ及びｄｌ−ＮＢＰはいずれも当研究所の合成製薬化学部門より入手。これらの光学純度及び化学的純度は共に＞９９％であり、旋光性はそれぞれ−６６．４９°、＋６６．８８°及び０°である。これらを植物油と配合した。ＭＫ８０１はシグマ社製であり、生理的ブラインと配合した。塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｌａｎｔ社製造）を蒸留水を配合して４％溶液として使用した。
【００３４】
一過性局所脳虚血モデル（ｔＭＣＡＯ）の調製
体重２８０ｇ〜３２０ｇのオスＷｉｓｔｅｒ系ラットを使用し、１つのケージにラット５匹の割合で飼育した。室温を２３℃に制御し、ラットには食物及び水を自由に摂取させた。ラットをペントバルビタールナトリウム４０ｍｇ／ｋｇで麻酔した。手術用顕微鏡下、正中頸部皮膚切開により右総頸動脈を露出させた後、内頸動脈（ＩＣＡ）及び外頸動脈（ＥＣＡ）を周囲の神経及び筋膜から分離し、吻合分岐を結紮した。ＥＣＡを結紮して切断し、引っ張ってまっすぐにしてＩＣＡと一直線とした。先端が丸く直径０．２８ｍｍのナイロン縫合糸（ポリ−Ｌ−リシンで被覆）をＥＣＡからＩＣＡの内腔に約２０ｍｍにわたって頭蓋内を中大脳動脈の開始点の方向に導入した。２時間虚血させた後、ナイロン縫合糸を慎重に引き抜き、ＥＣＡを開口部位で結紮した。その後、ラットを縫合してケージに戻し、２４時間再灌流した。手術中、室温を２４℃〜２５℃で維持した。ラットを３７℃の加熱プレート上に置き、手術中体温を維持した。虚血して１５分後に投与した。
【００３５】
グループ分け及び薬剤投与
ラットを各群１０匹ずつの８群に分けた。第一群は植物油１ｍｌ／ｋｇのビヒクルコントロール；第二群及び第三群はｄｌ−ＮＢＰ ４０ｍｇ／ｋｇ及び８０ｍｇ／ｋｇ；第四群及び第五群はｄ−ＮＢＰ ２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ；第六群及び第七群はｌ−ＮＢＰ ２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ；第八群はＭＫ８０１ ０．１ｍｇ／ｋｇ。第一群〜第七群のラットには経口投与し、第八群のラットには腹腔内投与した。
【００３６】
神経学的行動評価
虚血して２４時間後に神経学的行動を観察した。ラットを尾を持って地面から１インチ持ち上げ、両前肢の状態を観察した。両肩を押して、左右の抵抗性に差異があるかを観察した。ラットを地面に下ろして歩行状態を観察した。下記基準に従ってスコアをつけた。
０：強い前肢、地面に向かって対称的に伸びる；両肩の抵抗性は同一、及び、正常な歩行。
１：対側性の肩の屈曲、前肢の屈曲；両肩の抵抗性は同一、及び、正常な歩行。
２：対側性の肩の屈曲、前肢の屈曲；押しに対する肩の抵抗性の対側性の低下、及び、正常な歩行。
３：対側性の肩の屈曲、前肢の屈曲；押しに対する肩の抵抗性の対側性の低下、及び、歩行時に旋回。
４：対側性の肩の屈曲、前肢の屈曲；自律的に動くことができない。
スコアが大きいほど、ラットの行動障害は重篤である。
【００３７】
脳梗塞体積の測定
手術して２４時間後にラットをペントバルビタールナトリウム１００ｍｇ／ｋｇで麻酔し、断頭した。その後、脳を迅速に取り出し、冠状縫合に沿って切片６つに切断し（第一〜第五の切片は厚さ２ｍｍ、第六の切片は厚さ４ｍｍ）、その後迅速に、１４％ＴＴＣ１．５ｍｌ及び１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１ｍｌを含む溶液５ｍｌ中に入れて遮光した。３７℃で３０分間インキュベートし、その間、７〜８分毎に上下を反転させた。ＴＴＣにより染色後、正常な脳組織は赤色、梗塞組織は白色となり、境界が明確であった。インキュベート後、脳切片の各群を順に並べ、保存用にデジタルカメラで撮影した。それぞれの切片をコンピューター画像分析装置システム（ＳＰＯＴ ３．５ ソフトウエア）で調べ、梗塞面積の積分により梗塞体積を計算した。脳浮腫の影響を避けるため、梗塞体積を脳半球の百分率で表した。計算式は次の通りである：脳梗塞体積（％）＝（非手術半球の体積−手術半球の非梗塞部分の体積）／（非手術半球の体積）。
【００３８】
統計学的分析
結果を平均±標準誤差で表した。一元配置ＡＮＯＶＡにより神経学的行動スコア及び脳梗塞体積を統計学的に分析し、また、ｐｏｓｔｈｏｃ ＬＳＤ検定により群間の差を分析した。ｐ＜０．０５の場合に結果は有意差を示すと考えた。
【００３９】
結果
ｔＭＣＡＯラットの脳梗塞体積に対する光学ブチルフタリドの効果
一元配置ＡＮＯＶＡ分析により各群間に有意差があったことから、ｌ−ＮＢＰ群（２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇの両方）において梗塞体積が非常に顕著かつ用量依存的に減少していることが示される。ｌ−ＮＢＰ ４０ｍｇ／ｋｇの群における減少効果が最も良く、梗塞体積が上限８０．４％減少した（ｐ＜０．００１、対ビヒクル群）。この群における治療効果はＭＫ８０１群の治療効果（梗塞体積減少８１．８％下；ｐ＜０．００１）と類似しており、その一方で、ｄ−ＮＢＰ群及びｄｌ−ＮＢＰ群には著しい効果が認められなかった（図１及び図２参照）。上記結果は、ｌ−ＮＢＰの梗塞体積減少効果がｄ−ＮＢＰよりも良好であることを示している。ｄｌ−ＮＢＰ群（８０ｍｇ／ｋｇ）及びｄ−ＮＢＰ群（４０ｍｇ／ｋｇ）における梗塞体積はビヒクルコントロールよりも低かったが、その間には統計学的な差はなかったことから、ｄｌ−ＮＢＰ中のｄ−ＮＢＰがｌ−ＮＢＰの効果を相殺しているであろうことが示唆される。
【００４０】
行動評価
ビヒクルコントロール群の大部分のラットの神経学的スコアは２であり、対側性の前肢屈曲という症状が現れ、側方からの押しに対する抵抗性が低下していた。より少ないラットにおいては対側性の旋回運動が生じ、これらをスコア３と評価した。対側性の前肢屈曲のみを発症したラットは更により少なく、これを１と評価し、また、症状が重篤かつ自律運動不可能なものは４と評価した。神経学的スコアの平均は２．６±０．３であった。虚血後１５分におけるｌ−ＢＮＰ ２０ｍｇ／ｋｇ又は４０ｍｇ／ｋｇの経口投与により神経学的症状が改善されることが示され（１．４（ｐ＜０．０１）及び１．１（ｐ＜０．００１））、ＭＫ８０１の効力が最も顕著であり（０．８、ｐ＜０．００１）、一方、ｄ−ＢＮＰ群及びｄｌ−ＢＮＰ群では著しい改善が認められなかった。ＭＫ８０１治療群のラットについては、脳虚血により誘導される症状は著しく軽減されたが、四肢が弱くて伸ばすとよろめき、運動失調があり、更に一方向に旋回した。この行動評価から、薬剤の行動改善程度は薬剤の梗塞体積低減効果に対応することが示唆される（図３参照）。
【００４１】
考察
本発明者らが以前に使用したモデルは永続的な局所虚血（中大脳動脈の焼灼による）であり、一方、この実験では一過性の局所脳虚血モデル（虚血２時間＋再灌流２４時間）を使用している。後者は脳梗塞体積が前者よりも大きい。ｄｌ−ＭＢＰ用量は前回の用量と同じにしたが、ｄｌ−ＮＢＰは、使用した用量（４０ｍｇ／ｋｇ及び８０ｍｇ／ｋｇ）では脳梗塞体積減少効果を有さない。この結果の差はこの二種のモデルの差に起因する。
【００４２】
本発明を生化学的、分子生物学的及び動物レベルで実施したところ結果が一致していた、すなわち、ｌ−ＮＢＰの脳保護効果はｄ−ＮＢＰ及びｄｌ−ＮＢＰよりも大きく、また、ｄｌ−ＮＢＰ中のｄ−ＮＢＰはｌ−ＮＢＰの作用を相殺するため、ｄｌ−ＮＢＰの脳虚血保護効果が低下する。
【００４３】
文献中に記載されるように、また、新薬発見に対する要求により、治療効果の増大及び毒性副作用の軽減を目的として、ラセミ型薬剤を分割して光学モノマーとし、その個々の特徴を明確にして、効果が強い又は毒性副作用の低い光学異性体からキラルな新薬を開発することが望ましい。これに関連して、ラセミ型ブチルフタリド中のｌ−ＮＢＰは比較的強力な脳虚血保護効果を有する。ｄ−ＮＢＰは効果が弱いだけでなく、ｌ−ＮＢＰの脳虚血保護効果を相殺する。従って、Ｌ−ブチルフタリドから急性虚血性脳卒中治療用の新規のキラルな薬剤を開発することは妥当である。
【００４４】
以前の研究では、血小板凝集及び血栓症に対するｌ−ＮＢＰの阻害効果はアスピリン及びチクロピジンの効果と類似することが示されている。加えて、ｌ−ＮＢＰは、アスピリン及びチクロピジンが有さない脳保護効果及び微小循環改善効果を有する（ｄ−ＮＢＰはこの効果を有さない）。従って、ｌ−ＮＢＰは治療スペクトルが非常に広いため、急性虚血性脳卒中の治療、並びに、脳卒中の二次的予防、心筋梗塞の予防及び末梢血管疾患の治療に使用可能である。重要な社会的利益及び経済的利益をもたらすことが期待されるので、ｌ−ＮＢＰから脳卒中治療用薬剤を開発することは有望である。左旋性ブチルフタリドの局所脳虚血治療効果は中国及び他の国でも報告されていない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】一過性の中大脳動脈閉塞の１５分後に胃管法によりＮＢＰを投与したラットの脳梗塞体積に対する効果を示すデジタル写真である。
【図２】一過性の中大脳動脈閉塞の１５分後に胃管法によりＮＢＰを投与したラットの脳梗塞体積に対する効果を示す。データは、梗塞部分を反対側の（正常な）半球の部分により除することによって得られる体積百分率として表され、平均±標準誤差として表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（対ビヒクル群）。
【図３】一過性の中大脳動脈閉塞の１５分後に胃管法によりＮＢＰを投与したラットの行動スコアに対する効果を示す。データは平均±標準誤差として表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（対ビヒクル群）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳梗塞の予防用又は治療用医薬品の製造における式（Ｉ）のＬ−ブチルフタリドの使用。
【化１】
【請求項２】
前記脳梗塞は局所脳虚血により誘導される
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記化合物の治療上有効量は０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日である
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
治療上有効量の式（Ｉ）のＬ−ブチルフタリド及び医薬品に許容される担体を含む
ことを特徴とする医薬組成物。
【化２】
【請求項５】
錠剤、カプセル、ピル、注射、持続放出調製物、制御放出調製物、及び、様々な微粒子輸送系を含む
ことを特徴とする請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１】
脳梗塞の予防用又は治療用医薬品の製造における式（Ｉ）のＬ−ブチルフタリドの使用。
【化１】
【請求項２】
前記脳梗塞は局所脳虚血により誘導される
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記化合物の治療上有効量は０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日である
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
治療上有効量の式（Ｉ）のＬ−ブチルフタリド及び医薬品に許容される担体を含む
ことを特徴とする医薬組成物。
【化２】
【請求項５】
錠剤、カプセル、ピル、注射、持続放出調製物、制御放出調製物、及び、様々な微粒子輸送系を含む
ことを特徴とする請求項５に記載の医薬組成物。
【図２】
【図３】
【図１】
【図３】
【図１】
【公表番号】特表２００７−５０７４３６（Ｐ２００７−５０７４３６Ａ）
【公表日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２９５６２（Ｐ２００６−５２９５６２）
【出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００４／００１１２３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３４９３６
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（５０５０５９２２６）シジャージョアン ファーマ． グループ ジョオンチ ファーマシューティカル テクノロジー（シジャージョアン）カンパニー リミテッド (7)
【出願人】（５０６１１８４９０）インスティテュート オブ マテリア メディカ， チャイニーズ アカデミー オブ メディカル サイエンスィズ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００４／００１１２３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３４９３６
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（５０５０５９２２６）シジャージョアン ファーマ． グループ ジョオンチ ファーマシューティカル テクノロジー（シジャージョアン）カンパニー リミテッド (7)
【出願人】（５０６１１８４９０）インスティテュート オブ マテリア メディカ， チャイニーズ アカデミー オブ メディカル サイエンスィズ (3)
【Ｆターム（参考）】
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