腫瘍増殖阻害化合物及びそれらの使用方法
特定のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、皮下的に与えられる場合、特に粘膜に、例えば鼻腔内、膣内、又は直腸的に、投与される場合、動物実験においてインビボで、及び健常な被験者及びＣＬＬ又はＦＬに苦しむ患者由来の血液から収集されたヒトＰＢＭＣにおいてインビトロで確認されたように、種々のヒトがん形態に対して甚大な効果を有する。本化合物はまた、好ましくは、放射線治療、ホルモン治療、外科的介入、化学療法、免疫学的療法、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、寒冷療法、血管新生阻害、又はそれらのいずれかの組み合わせの中から選択されるがん療法と組み合わせて使用され、最も好ましくは、免疫学的治療であり、患者への抗体の投与を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、医学の分野、特に単独での又は現存する及び将来の療法と組み合わせてのがんの治療に使用するための新規な化合物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん治療は、標的化アプローチの時代に入っている。１つのこのようなアプローチは、悪性細胞を認識する及び排除する免疫系の使用である。合成ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ ＤＮＡ）は、強力な組織化された腫瘍特異的免疫応答を刺激する能力を有する比較的新しいクラスの薬剤である（非特許文献１、２）。
【０００３】
最近の研究は、各々が異なる物理的特性及び生物学的効果を有する、少なくとも３つのクラスのＣｐＧ ＤＮＡ配列が存在することを実証している。いくつかのがん動物モデルにおける予備研究は、ＣｐＧ ＤＮＡががん免疫療法において多くの用途を有し得ることを示唆している。ＣｐＧ ＤＮＡは、先天免疫を活性化させ、抗体依存性細胞傷害性を増強し、特異的な保護的免疫反応を誘発する強力なワクチンアジュバントとして役立つことによって、腫瘍退縮を誘導する能力を有する。初期臨床試験はＣｐＧ ＤＮＡがヒトへ安全に投与され得ることを示しており、どのようにそれらの薬剤ががん免疫療法において役割を果たし得るかを理解するために、研究が行われている（非特許文献３）。
【０００４】
先の特許（特許文献１）は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを示し、インビトロでの腫瘍細胞のアンチセンス阻害、並びに同系Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるインビボでの腫瘍増殖のアンチセンス阻害を示す動物実験を開示した。マウスは、センス及びアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド４０ｍｇ／ｇの腹腔内注射で処置された。組織学的分析は、巣状腫瘍壊死、続いての広範囲の分節状壊死を示した。
【０００５】
Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、西洋社会において最も一般的な白血病である。Ｂ−ＣＬＬは、血球、特にＢリンパ球の制御されない増殖及び／又は減少した細胞死（アポトーシス）を特徴とする、白血球及び骨髄のがんであり、成人白血病の最も一般的な形態である。その罹患率は、７０歳を過ぎると、１００，０００人当たり５０人に近づく。白血病は、通常、数年、さらには数十年もの長期にわたる自然経過を有するが、細胞が連続的な遺伝的欠陥を獲得するので、最終的に加速する。恐らく欠陥Ｂ−ＣＬＬ細胞とそれらの環境との変更された相互作用の結果である、異常に長い寿命に起因して、モノクローナルＢ−ＣＬＬ細胞が容赦なく蓄積する点で、Ｂ−ＣＬＬは、多くの他の悪性疾患とは相違する。サイトカインは、細胞恒常性及び細胞−細胞対話（cell-cell dialogue）において必須の因子であり、この環境において重要であると提案されている（非特許文献４、５）。
【０００６】
Ｂ−ＣＬＬについて共通の初期トランスフォーミング事象は見られていない。主に遺伝子再構成過程の間に生じると考えられ、他のリンパ性悪性疾患においては一般的な、染色体転座は、Ｂ−ＣＬＬにおいては稀である。核型異常は、疾患の経過の間、頻度及び数が増加する傾向にある。転座が見られる場合、それらは、融合遺伝子の形成又はがん遺伝子の過剰発現よりも遺伝子喪失を生じさせる傾向にある。Ｂ−ＣＬＬにおいて最も一般的な遺伝子異常は、１３ｑ欠失（事例の５０％）、１３ｑ４欠失（無痛経過に関連する）、トリソミー１２（１２ｑ１３−１５；ｐ５３を抑制するＭＤＭＱオンコプロテインの過剰発現を伴う）、及び１ｌｑ２２−ｑ２３欠失（事例の２０％）である（非特許文献６、７）。
【０００７】
Ｂ−ＣＬＬ細胞は、ＣＤ２３（ＩｇＥについての低親和性受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ α鎖）、及びＣＤ２７（共刺激分子）などの表面分子を発現し、これらは、他の設定において、活性化の状態を示す。いくつかのタンパク質の発現及び会合は、アポトーシスのプロセスを密接に調節する。これらのタンパク質の相対的バランスが、細胞寿命を制御する。このシステムを担う遺伝子としては、ＢＣＬ−２ファミリー、腫瘍壊死因子受容体、並びにＭｙｃ及びｐ５３などの遺伝子が挙げられる（非特許文献８）。これらの遺伝子によって促進される死経路は全て、プロテアーゼファミリーであるカスパーゼによって代表される、共通の「破壊」カスケードを有するようである。Ｂ−ＣＬＬ細胞は、高レベルのＢＣＬ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバー（ｂａｄ−２、ｂｃｌ−ｎ、ｂａｘ）の生成物を持続的に発現し、同時に、Ｂｃｌ−２機能阻害剤であるＢｃｌ−６は著しく減少される。Ｂｃｌ−２の過剰発現に関与するメカニズムは、現在のところ不明である。Ｂ−ＣＬＬの白血病細胞は、Ｆａｓについて陰性又は弱陽性である。それらは、一般的に、刺激によってＦａｓ発現が誘導された後でさえ、抗Ｆａｓ抗体仲介死に耐性のままである。稀な感受性の症例では、細胞死は、未だキャラクタライズされていないメカニズムによって、Ｂｃｌ−２発現とは無関係に起こる。Ｂｃｌ−２過剰発現及びＦａｓ経路は、Ｂ−ＣＬＬの病態生理学に関与するメカニズムであるが、必ずしも重大な原因事象ではないようである。サイトカインを含むメディエーターは、最初の病因因子とアポトーシスの最終経路とをつなぐ可能性が高い。
【０００８】
大抵のＢ−ＣＬＬ細胞は、細胞周期のＧ０期にあり、正常なリンパ球の増殖を誘導する、コンカナバリンＡ、ホルボールエステル、又は受容体架橋などの従来の方法によっては増殖期へ入るように誘導され得ない。ほんの一部の細胞のみが、未知の促進シグナルに反応してクローン集団を拡大するようである。増殖促進サイトカインは、インビボでこの刺激を提供し得る（非特許文献９）。
【０００９】
Ｂ−ＣＬＬ細胞は、正常なＢ細胞プールを犠牲にして蓄積する。他方で、総Ｔ細胞は、通常、増加される。骨髄Ｔリンパ球は、サルコイドーシス及び関節リウマチなどの自己免疫疾患において見られるように、主にＣＤ４＋細胞である。末梢血中には、しばしばＴｈ２優位サイトカイン表現型が存在する。ＴＣＲレパートリーの異常もまた報告された。報告は、Ｔリンパ球及び間質細胞が、Ｂ−ＣＬＬ細胞の寿命を永続させることができる環境を支えることにおいて重要な役割を有し得ることを示している。悪性細胞及びそれらのＴ細胞環境は両方とも、種々の（a vanity of）表面分子及びそれらの受容体：ＣＤ５並びにそのリガンドＣＤ７２、ＣＤ２７及びＣＤ７０を発現する。これらの知見は、直接的に又は間接的に（サイトカイン）細胞自己保存を生じさせ得る相互作用の種々の可能性を開く。このような長い生存は、次に、遺伝子突然変異及び遺伝子的不安定性の蓄積についての機会を増加させ、このことは、細胞周期チェックポイントの調節不全、及び細胞毒性治療に対する耐性による、疾患の進行に好都合である（非特許文献１０）。
【００１０】
Ｂ−ＣＬＬ細胞とそれらの環境との共生的相互作用は、ほぼ確実に、サイトカインの分泌によって仲介され、接着分子によって調節される。Ｂ−ＣＬＬにおけるサイトカイン関与の研究によって、この白血病における増殖及び長寿命のメディエーターとしての種々のサイトカインを支持又は反証するデータの実体が作製された。サイトカイン産生研究によって、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、１Ｌ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＴＮＦ−β、及びＴＮＦ−αについての逆転写ポリメラーゼ連鎖反応シグナルが実証された（非特許文献１１）。これらの知見は、ＩＬ４、ＩＬ３及びＩＬ６についての陰性結果を示した他の研究によって否定された（非特許文献１２）。対照的に、ＴＧＦ−β、及びＩＬ１０分泌が正常なＢリンパ球中において示された。これらの細胞について構成的であると報告された他のサイトカイン産生はない。
【００１１】
がんの免疫療法は１世紀以上の間探求されているが、種々の抗体ベースの産物ががんの多様な形態を有する患者のマネージメントへ導入されたのは、ほんのここ１０年のことである。現在、これは臨床研究の最も活発な分野の１つであり、８個の治療薬品が腫瘍学において既に認可されている。腫瘍関連マーカーに対する抗体は、数十年間、免疫組織学及びインビトロイムノアッセイにおける医療行為の一部であり、現在、がんの検出及び治療についての重要な生物学的薬剤としてますます認識されるようになっている（非特許文献１３）。分子工学は、このような抗体ベースの治療学についての将来性を改善し、頻繁に投与され得る種々の構築物並びにヒト化又はヒト抗体を生じさせた。
【００１２】
ＣＤ２０は、ＣＬＬ患者のＢ細胞の表面上に不定に発現され、ある患者のＢ細胞は非常に低レベルのＣＤ２０抗原を発現する。ＣＤ２０（ヒトＢリンパ球限定分化抗原）は、プレＢ及び成熟Ｂリンパ球上にある約３５ｋＤの分子量を有する疎水性膜貫通タンパク質である。前記抗原はまた、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）中の９０％超のＢ細胞上において発現されるが、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常な形質細胞又は他の正常な組織上においては見られない。ＣＤ２０は、細胞周期開始及び分化についての活性化プロセスにおける初期段階を調節し、恐らく、カルシウムイオンチャネルとして機能する。ＣＤ２０は、細胞表面から分離されず、抗体結合時にインターナライズしない。遊離ＣＤ２０抗原は、循環中に見られない（非特許文献１４）。
【００１３】
ヒトＣＤ２０に対して指向された遺伝子操作されたキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）又はＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Genentech, Inc., South San Francisco, California, U.S.）は、再発性又は難治性・低悪性度又は濾胞性、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫及びＢ−ＣＬＬを有する患者の治療のために使用される。リツキシマブは、身体の自然防御をリクルートし、ＣＤ２０抗原を介してそれが結合するＢ細胞を攻撃しそして死滅させることによって、働く。インビトロ作用機構研究によって、リツキシマブはヒト補体に結合し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を介してリンパ系Ｂ細胞株を溶解することが実証された（非特許文献１５）。さらに、それは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）についてのアッセイにおいて著しい活性を有する。インビボ前臨床試験によって、リツキシマブは、恐らく補体及び細胞媒介プロセスによって、カニクイザルの末梢血、リンパ節、及び骨髄からＢ細胞を激減させることが示された（非特許文献１６）。リツキシマブはＣＬＬ患者においてある程度成功して使用されてきたが、ＣＬＬ患者の分析は、Ｂ−ＣＬＬ細胞の表面上におけるＣＤ２０の密度はかなり可変であり、ある患者のＢ細胞は非常に低レベルのＣＤ２０抗原を発現することを示している。Ｂ細胞悪性疾患の典型的な治療は、リツキシマブに加えて、放射線療法及び化学療法剤の投与である。ＣＬＬの場合、従来の外部放射線療法が、悪性細胞を破壊するために使用される。しかし、副作用が、この治療における制限因子である。血液学的悪性疾患についての別の広く使用される治療は、化学療法である。併用化学療法は、部分又は完全寛解に達することにおいてある程度成功している。残念ながら、化学療法によって得られるこれらの寛解は、しばしば長持ちしない。
【００１４】
逆に、ＣＤ２３発現は、Ｂ−ＣＬＬにおいてより高いレベルで持続的に存在することがわかった。ＣＤ２３白血球分化抗原は、いくつかの造血系細胞上において発現される４５ｋＤ ＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、これは、ＩｇＥについての低親和性受容体（ＦｃγＲＩＩ）として機能する（非特許文献１７）。それは、Ｃ型レクチンファミリーのメンバーであり、細胞外レクチン結合ドメインと膜貫通領域との間にαヘリカルコイルドコイルストークを含有する。ストーク構造は、そのリガンド（例えば、ＩｇＥ）への結合の間、三量体への膜結合ＣＤ２３のオリゴマー化に寄与すると考えられている。タンパク質分解時、膜結合ＣＤ２３は、いくつかの可溶性ＣＤ２３（ｓＣＤ２３）分子量種（３７ｋＤ、２９ｋＤ及び１６ｋＤ）を生じさせる。ＩｇＥの産生の調節に関与することに加えて、ＣＤ２３はまた、胚中心Ｂ細胞の生存を促進すると推測された。ＣＤ２３の発現は、通常の活性化された濾胞性Ｂ細胞及びＢ−ＣＬＬ細胞において、非常にアップレギュレートされた。
【００１５】
ルミリキシマブは、マカク可変領域及びヒト定常領域（ＩｇＧ１，κ）を有し、活性化ヒト血中Ｂ細胞によるＩｇＥの産生を阻害するために元々は開発された、モノクローナルキメラ抗ＣＤ２３抗体（Biogen Idec製、現在、臨床試験を受けている）である。それは、現在、Ｂ−ＣＬＬ患者における使用についての第ＩＩＩ相試験中である。インビトロ研究によって、ルミリキシマブは、ミトコンドリア死経路を介してＢ−ＣＬＬ細胞においてカスパーゼ依存性アポトーシスを誘導することが示された（非特許文献１８）。従って、それは、リツキシマブとは異なるメカニズムによって腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するようである。
【００１６】
いくつかの他の抗体が、がんの治療について最近認可された。アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）又はＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ilex Pharmaceuticals製の抗ＣＤ５２）（非特許文献１９）は、ＣＬＬの治療について２００１年に認可された。ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Genentech, Inc., South San Francisco, CA）は、結腸直腸がん、小細胞肺がん及び乳がんの治療において使用される血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に対して指向されたヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂである。トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Roche製）は、ＨＥＲ−２標的を過剰発現する転移性乳がん腫瘍に対して有効であるヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂである（非特許文献２０）。
【００１７】
抗体薬物をより効率的にするために、腫瘍細胞の表面上の特異的抗原標的のアップレギュレーションが役立ち得る。このような効果を得るための１つの方法は、免疫調節オリゴヌクレオチドで細胞を刺激することであり得る。免疫刺激効果は、非メチル化ＣｐＧモチーフを含有する合成ＤＮＡベースのオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の使用によって得られ得る。このようなＣｐＧ ＯＤＮは、以下を含む、ヒト及びマウス白血球に対して非常に高い免疫刺激効果を有する：Ｂ細胞増殖、サイトカイン及び免疫グロブリン分泌；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性及びＩＦＮ−γ分泌；並びに、補助刺激分子を発現させ、サイトカイン、特に、Ｔｈ１様Ｔ細胞応答の発達を促進させることにおいて重要であるＴｈ１様サイトカインを分泌させるための、樹状細胞（ＤＣ）及び他の抗原提示細胞の活性化（非特許文献２１）。ＣｐＧ−ＯＤＮによる受容体密度の増加は、細胞に対するオリゴヌクレオチドの直接効果によって、又はサイトカインの誘導によって媒介され得る。抗原密度の増加又は標的受容体を発現する細胞の集団の増加は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のいずれかを増強することによって、抗体が腫瘍細胞をより効率的に死滅させることを可能にする。
【００１８】
ＣｐＧモチーフ単独では、オリゴヌクレオチドの効能の説明ができないという指摘がある。このモチーフは、所望の機能について必要ではないという指摘さえある。
【００１９】
オリゴヌクレオチドに基づくがんへの治療アプローチの開発に費やされた相当な努力、及び今まで報告された時折の成功にかかわらず、改善された効能を示し副作用が最小であるか又は無い、新規な化合物及び投与様式についての必要性が依然としてある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】US 6,498,147 B, THE SCRIPPS INSTITUTE, 2002-12-24
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】KRIEG, A M. Lymphocyte activation by CpG dinucleotide motifs in prokaryotic DNA. Trends Microbiol. 1996, vol.4, no.2, p.73-6
【非特許文献２】KRIEG, A M, et al. Mechanisms and therapeutic applications of immune stimulatory CpG DNA. Pharmacol Ther. 1999, vol.84, no.2, p.113-20
【非特許文献３】WOOLDRIDGE, J E , et al. CpG DNA and cancer immunotherapy: orchestrating the antitumour immune response. Curr Opin Oncol. 2003 Nov, vol.15, no.6, p.440-5
【非特許文献４】CALIGARIS-CAPPIO et al., 1999
【非特許文献５】ROZMAN et al., 1995
【非特許文献６】GAIDAN et al., 1991
【非特許文献７】DOHNER et al., 1999
【非特許文献８】OSORIO et al., 1999
【非特許文献９】DANCESCU et al., 1992
【非特許文献１０】KLEIN et al., 2000
【非特許文献１１】PISTOIA et al., 1997
【非特許文献１２】TANGYE et al., 1999
【非特許文献１３】STROME et al., 2007
【非特許文献１４】PESCOVITZ, 2006
【非特許文献１５】REFF et al., 1994
【非特許文献１６】REFF et al., 1994
【非特許文献１７】PATHAN et al., 2008
【非特許文献１８】PATHAN et al., 2008
【非特許文献１９】KEATING et al., 2002
【非特許文献２０】STROME et al., 2007
【非特許文献２１】KRIEG et al, 1995
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者は、驚くべきことに、特定のオリゴヌクレオチド配列が、皮下的に与えられると、又は特に、粘膜に局所的に、例えば経口的、経肺的、鼻腔内、直腸的、又は膣内に投与されると、動物実験においてインビボで、及びＣＬＬ患者及び健常な被験者由来のＰＢＭＣを使用してインビトロで確認されたように、種々のヒトがん形態に対して甚大な効果を有することを見出した。
【００２３】
さらに、新規な配列を開発及び試験しており、これらは単独で又は他の治療と組み合わせて顕著な治療効果を示した。該オリゴヌクレオチドは、アポトーシスを誘導するため、ＮＫ細胞を活性化するため、好中球遊走移動を阻害するため、及び特に細胞表面受容体の発現を増加させるために、使用される。本発明のオリゴヌクレオチドは、がんを治療するための免疫学的アプローチ、例えば特定の受容体に向けられたモノクローナル抗体と組み合わせて使用され得る。本発明の実施態様は、参照により本明細書に組み入れられる、添付の特許請求の範囲において定義される。
【００２４】
本発明を、添付の図面を参照して、以下の説明、非限定的な実施例、及び特許請求の範囲において、より詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】誘発皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについて、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、配列番号６の物質１５０μｇの皮下投与後の時間に対する腫瘍体積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図２】図１と同様のグラフであり、ここで、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、皮下的に（５０μｇボーラス）及び鼻腔内（５０μｇ）に与えられた、配列番号６の物質との比較を示す。
【図３】誘発皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについて、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、配列番号７の物質５０μｇの皮下投与後の時間に対する腫瘍体積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図４】誘発皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについて、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、配列番号１の物質５０μｇの皮下投与後の時間に対する腫瘍体積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図５】誘発皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについて、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、配列番号２の物質５０μｇの皮下投与後の時間に対する腫瘍体積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図６】誘発皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについて、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、配列番号３の物質５０μｇの皮下投与後の時間に対する腫瘍体積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図７】誘発皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについて、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、配列番号４の物質５０μｇの皮下投与後の時間に対する腫瘍体積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図８】配列番号１〜７の化合物を投与後の、インビトロでのヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６に対する増殖減少効果を示す棒グラフであり、ここで、「＋」及び「−」は、それぞれ、ポジティブ及びネガティブコントロールを意味する。
【図９】配列番号１〜７の化合物を投与後の、インビトロでのヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６におけるアポトーシス誘導を示す棒グラフであり、ここで、「＋」及び「−」は、それぞれ、ポジティブ及びネガティブコントロールを意味する。
【図１０ａ】配列番号１〜７に従う化合物の投与後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるＢ細胞増殖マーカーであるＣＤ２０の発現に対する効果を示す棒グラフからなる。
【図１０ｂ】配列番号１〜７に従う化合物の投与後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるＢ細胞増殖マーカーであるＣＤ４０の発現に対する効果を示す棒グラフからなる。
【図１０ｃ】配列番号１〜７に従う化合物の投与後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるＢ細胞増殖マーカーであるＣＤ５４の発現に対する効果を示す棒グラフからなる。
【図１１ａ】配列番号１〜７に従う化合物の投与後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるＢ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９、及びＣＤ８０の発現に対する効果を示す棒グラフからなる。
【図１１ｂ】配列番号１〜７に従う化合物の投与後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるＢ細胞活性化マーカーであるＤ６９、及びＣＤ８６の発現に対する効果を示す棒グラフからなる。
【図１２】配列番号１〜７に従う化合物の投与後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるアポトーシスマーカーであるＣＤ９５の発現に対する効果を示す棒グラフである。
【図１３】実験化合物がＣＬＬ患者由来のＢ細胞上のＣＤ２０ｎのアップレギュレーションをどの程度誘導するかを示すグラフである。試験濃度の１０μＭで、化合物ＩＤＸｓ００２２、００３８及び００７１は全て、有意な効果を示す。これらの化合物は、表１の配列番号３、８、及び９に対応する。
【図１４】同様に、ＣＬＬ患者由来のＢ細胞上のＣＤ８０のアップレギュレーションを示す。ここでまた、表１の配列番号３、８、及び９によって示される化合物は、未処置コントロールと比較した効果を示す。
【図１５】実験化合物がＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣ中においてＮＫ細胞の活性化をどの程度誘導するかを示す。また、表１の配列番号３、８、及び９によって示される化合物は、未処理コントロールと比較した効果を示す。
【図１６】実験化合物がＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣにおいてＴ細胞のアポトーシスを誘導することを示す。試験した化合物は効果を示し、配列番号３に対応する化合物ＩＤＸｓ００２２は、試験濃度の１０μＭで最も強力である。
【図１７】実験化合物がＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣ中においてＢ細胞のアポトーシスも誘導することを示す。試験した化合物は全て効果を示し、配列番号３に対応する化合物ＩＤＸｓ００２２はまた、試験濃度の１０μＭで最も強力である。
【図１８】未処置と比較しての、配列番号３について２５μＭの濃度で３０分、２時間及び６時間曝露後の、健常なコントロール由来のＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＬ−６のアップレギュレーションを示す。
【図１９】未処置と比較しての、配列番号３について２５μＭの濃度で３０分、２時間及び６時間曝露後の、健常なコントロール由来のＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＬ−１０のアップレギュレーションを示す。
【図２０】未処置と比較しての、配列番号３について２５μＭの濃度で３０分、２時間及び６時間曝露後の、健常なコントロール由来のＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＰ−１０のアップレギュレーションを示す。
【図２１】未処置及び７２時間曝露と比較しての、配列番号３について濃度０．１、１、１０及び２５μＭで３０分、２時間及び６時間曝露後の、健常なコントロール由来のＰＢＭＣにおけるＣＤ２０発現のアップレギュレーションを示す。
【図２２】未処置及び７２時間曝露と比較しての、配列番号３を使用して、種々の濃度で３０分、２時間及び６時間曝露後の、健常なコントロール由来のＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞の活性化を示す。
【図２３】１０μＭで配列番号３を投与することによって達成された、３人の健常なコントロール由来のＰＢＭＣにおいて測定されたＣＤ２０の発現を示す。
【図２４】未処置及びポジティブコントロール、配列番号６と比較しての、１０μＭでの配列番号３によって達成された、ＮＫ細胞活性化（ＣＤ６９）の誘導を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
説明
本明細書を詳細に説明する前に、本発明は、このようなデバイス及び方法は変化し得るので、記載されるデバイスの特定の構成部品又は記載される方法のプロセス工程に限定されないと当然ながら理解すべきである。本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を説明する目的のために過ぎず、限定することを意図していないと当然ながら理解すべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ア（a）」、「アン（an）」及び「ザ（the）」はまた、文脈が明確にそうではないように指示しない限り、複数形の概念をも含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「配列（a sequence）」への言及は、２個以上のこのような配列を含むなどである。
【００２７】
さらに、用語「約」は、適用可能な場合、所定の値の＋／−２％、好ましくは＋／−５％、最も好ましくは数値の＋／−１０％の偏差を示すために使用される。
【００２８】
用語「がん」は、任意の悪性新生物性疾患、即ち異常な制御されない細胞分裂によって引き起こされる任意の悪性増殖又は腫瘍を意味するものとする。用語「がん」は、特に本明細書に含まれる動物実験において例示されるような固形限局性腫瘍と、これらに限定されないが、実施例において研究した２つの形態の白血病である慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）などの、非固形がん形態との両方を含むものとする。
【００２９】
本発明者は、以下の少なくとも１つが可能な新規なオリゴヌクレオチド配列を同定した：アポトーシスの誘導、ＮＫ細胞の活性化、好中球の阻害、及び特定の細胞表面マーカーの発現のアップレギュレーション。本発明者はまた、新規な治療方法を利用可能にし、驚くべきことに、用量の減少（１５０μｇから５０μｇへ）が皮下投与における反応を有意に改善したこと、及び粘膜における適用（本明細書において、経鼻投与の形態で試験した）が、投与の等しく有効な方法を提供することを、発見した。
【００３０】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明者は、本明細書において示されるオリゴヌクレオチド配列が、腫瘍部位への、細胞、特に好中球、の遊走を阻害することができ、したがって腫瘍の増殖を阻害することができると考えられる。さらに、インビトロでのヒト細胞株に対する実験は、本発明に従うオリゴヌクレオチドが、増殖を減少させかつアポトーシスを誘導することができることを示している。
【００３１】
好中球遊走の障害ががんの作用であり、このために個体を感染症にかかりやすくするという理論に反して、本発明者は、腫瘍が、状況を有利にするように身体の防御システム、特に炎症反応を使用することができるか、又はある程度、これから恩恵を受けることを意図した。本発明の化合物である、表１に示される配列番号１〜５及び８〜９は、このようなメカニズムを阻害する可能性を提供する。
【００３２】
本発明者はまた、驚くべきことに、本化合物が、本明細書ではＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ６９、ＣＤ８０、及びＣＤ８６によって示される、細胞表面マーカーの発現を誘発する又は増加させることができることを示す。
【００３３】
従って、本発明者は、本発明の１実施態様として、がんの治療のための化合物及び方法を利用可能にし、ここで、表１に示される本発明の化合物は、アポトーシスを増加させるため、ＮＫ細胞を活性化するため、細胞表面マーカーであるＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ６９、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の１つ又はそれ以上の発現をアップレギュレートするため；単独で使用されるか；又は腫瘍の外科的切除、放射線治療、ホルモン治療、外科的介入、化学療法、免疫学的療法、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、寒冷療法、血管新生阻害、又はそれらのいずれかの組み合わせの中から選択される抗腫瘍療法と組み合わせて使用される。最も好ましくは、抗腫瘍治療は、免疫学的治療であり、患者への抗体の投与を含む。
【００３４】
現在入手可能な抗体の例としては、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））、ルミリキシマブ、アレムツズマブ（Alentuzumab）（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、及びトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
抗腫瘍療法と組み合わせて提供される場合、本発明の化合物は、好ましくは、抗腫瘍療法の前に、好ましくは該療法の３０分、１時間、２時間、３時間、６時間又は１２時間前に、投与される。免疫学的療法、特に抗体の投与を含む療法と組み合わせて提供される場合、本発明の化合物は、好ましくは患者への抗体の投与の前に、最も好ましくは特異的抗体を標的化させる細胞表面分子又は細胞表面マーカーのアップレギュレーションを可能にするために十分に前に、投与される。
【００３６】
本発明は、特定のヌクレオチド、即ち、配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列を利用可能にする。表１を参照のこと。
【００３７】
表１．配列情報
【表１】
【００３８】
上記配列、配列番号１〜５及び８〜９は、本発明者によって合成され、本発明者の知る限りでは、以前に知られていない。配列番号６は、US 6,498,147において初めて公開され、配列番号７は、特にSOKOLOSKI , J A, et alによって公開された。ＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニットに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ１１ｂ発現をブロックし、分化ＨＬ−６０顆粒球の接着性を変更させる。Blood. 15 July 1993, vol.82, no.2, p.625-632。
【００３９】
配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従うオリゴヌクレオチド配列は、リン酸骨格修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含み得る。リン酸骨格修飾は、好ましくはホスホロチオエート又はホスホロジチオエート修飾である。
【００４０】
本発明はまた、がんの治療用の、特に腫瘍増殖の阻害を通して、例えば腫瘍部位への好中球遊走の阻害を通してがんを治療する、薬剤を製造するための、配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用を含む。
【００４１】
好ましい実施態様によれば、薬剤は、がんの治療において、細胞表面マーカーのアップレギュレーション、アポトーシスの誘導、ＮＫ細胞の活性化、及び好中球遊走の阻害のうちの少なくとも１つを達成するに有効な用量で経鼻投与される。用量は、好ましくは、がんの治療について約１〜約１００μｇの範囲内にある。
【００４２】
同様に、本発明はまた、がんの治療において、細胞表面マーカーのアップレギュレーション、アポトーシスの誘導、ＮＫ細胞の活性化、及び好中球遊走の阻害のうちの少なくとも１つを達成するに有効な用量での皮下投与用の薬剤を製造するための、配列番号１〜８のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用を含む。用量は、好ましくは、がんの治療について約１〜約１００μｇの範囲内にある。
【００４３】
本発明の１実施態様は、抗腫瘍治療が、オリゴヌクレオチドの投与の前、後、又は本質的に同時に与えられる、上記に定義される使用を含む。この抗腫瘍治療は、放射線治療、ホルモン治療、外科的介入、化学療法、免疫学的療法、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、寒冷療法、血管新生阻害、又はそれらのいずれかの組み合わせの中から選択される。
【００４４】
抗腫瘍治療は、好ましくは患者への抗体の投与を含む免疫学的療法である。
【００４５】
従って、本発明はまた、配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列が、その必要がある患者へ投与される、がんの治療のための方法を含む。
【００４６】
上記で定義されたように、配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つにおける少なくとも１つのヌクレオチドは、リン酸骨格修飾を含み得る。該リン酸骨格修飾は、好ましくはホスホロチオエート又はホスホロジチオエート修飾である。
【００４７】
本発明治療方法の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、経粘膜的に、即ちその必要がある患者の粘膜へ局所的に、投与される。経粘膜投与としては、経口、経肺、経直腸、経膣、および経鼻投与が挙げられる。
【００４８】
別の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、その必要がある患者へ皮下投与される。
【００４９】
本発明の上記実施態様のいずれか１つにおいて、オリゴヌクレオチドは、がんの治療で、例えば細胞表面マーカーのアップレギュレーション、アポトーシスの誘導、ＮＫ細胞の活性化、及びがんの治療の好中球遊走の阻害の少なくとも１つを通して、腫瘍増殖を阻害するに有効な用量で投与される。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約１〜約１００μｇの用量で投与される。
【００５０】
本発明のヌクレオチドは単独で試験しているが、がんの治療への他のアプローチと組み合わせて使用する場合、それらは相加効果又は相乗効果さえ示すことが考えられる。従って、本発明の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、抗腫瘍治療の前、後、又は本質的に同時に投与される。
【００５１】
上記で概説したように、この抗腫瘍治療は、放射線治療、ホルモン治療、外科的介入、化学療法、免疫学的療法、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、寒冷療法、血管新生阻害、又はそれらのいずれかの組み合わせの中から選択される。
【００５２】
抗腫瘍治療は、好ましくは、患者への抗体の投与を含む免疫学的療法である。
【００５３】
本発明の上記実施態様のいずれか１つにおいて、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの細胞表面分子又は細胞表面マーカー、特に、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の中から選択される細胞表面マーカーの発現を誘発するか又は増加させるか又はアップレギュレートさせるに有効な用量で投与される。
【００５４】
当業者は、がんの治療には多数のアプローチが存在するという事実を十分承知している。がんのタイプ、その位置及び進行の状態、並びに患者の状態に依存して、いくつかの療法が使用されることは、がんとの闘いについて特徴的である。いくつかの療法を、続けて、又は組み合わせて使用するのがしばしばそうである。外科的介入、放射線療法及び化学療法などのいくつかの療法が数十年間実施されてきたと同時に、他のものも最近考えられており、多くは依然として実験的使用状態にある。当然ながら、新しいアプローチが絶えず開発されており、本発明に従うオリゴヌクレオチド、それらの使用及び治療方法は、将来の治療と組み合わせても有用であると考えられる。本発明者は、現在、本発明のオリゴヌクレオチド、それらの使用及び治療方法が、以下の抗腫瘍治療と組み合わせて有用であると考えるが、これらに限定されることを望まない；放射線治療、ホルモン治療、外科的介入、化学療法、免疫学的療法、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、寒冷療法、血管新生阻害、又はそれらのいずれかの組み合わせ。
【００５５】
抗腫瘍治療は、好ましくは、患者への抗体の投与を含む免疫学的療法である。
【００５６】
オリゴヌクレオチドは、治療有効量で投与される。「治療有効量」の定義は、疾患及び治療方法の設定に依存し、「治療有効量」は、単独で又は他の治療と組み合わせて、患者の状態の測定可能な改善を生じさせる用量である。
【００５７】
がんを治療するためのオリゴヌクレオチドの有効量は、レシピエント哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、約０．０１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１μｇ〜約１０μｇ、最も好ましくは約１μｇ〜約５μｇの広範囲に及ぶ。オリゴヌクレオチドは、単回用量又は反復用量で投与され得る。現在最も好ましい実施態様は、５０μｇの量で、粘膜投与、例えば鼻腔内、経口的、経直腸的又は膣内に投与される、本発明ヌクレオチドの１単回用量を要する。
【００５８】
本発明のヌクレオチドは、皮下的に又は粘膜に局所的に送達され得る。用語「粘膜に局所的に」は、経口、経肺、直腸、経膣、及び経鼻投与を含む。本発明の１実施態様によれば、ヌクレオチドは、鼻腔内送達される。アクセスのしやすさ及び鼻の脈管構造のため、経鼻薬物送達は、全身的に及び血液脳関門を通過させてＣＮＳへ、小分子薬物及び生物製剤の両方を送達するための魅力的な方法であることがよく知られている。ヌクレオチドは、任意の好適な製剤で、例えば好適な水性緩衝液、例えばしかしこれに限定されないが、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で送達され得る。ヌクレオチドが、粘膜への付着を向上させるように設計された好適な製剤、例えば好適なゲル形成ポリマー、例えばキトサンなど；ヌクレオチドの細胞取り込みを促進する製剤、例えば親油性送達ビヒクル、リポソーム若しくはミセル；又は両方で投与されることが考えられる。
【００５９】
経鼻投与に利用可能ないくつかの方法及びデバイスが存在する；局所的又は全身的作用のいずれかを有する、液体及び粉末の両方の製剤の単回又は反復投与。適切なデバイス又は投与技術を使用して、ＣＮＳへの送達のために嗅球領域を標的化することが可能である。本発明は、鼻粘膜へヌクレオチドを投与するための特定の方法又はデバイスに限定されない。初期動物研究によって、ピペットによる簡単な点滴注入で十分に機能することが示されているが、ヒトに使用するためには、信頼できる単回又は反復用量投与のためのデバイスが好ましい。
【００６０】
本発明の別の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、直腸点滴注入を通して例えば好適な緩衝液に懸濁したオリゴヌクレオチドを含む水性浣腸剤の形態で結腸の粘膜へ投与される。
【００６１】
本発明の別の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、好適な緩衝液に懸濁したオリゴヌクレオチドを含む、エアゾール剤の吸入によって、又はこれもまた好適な緩衝液に懸濁化したオリゴヌクレオチドを含む、洗浄を行うことによって、肺又は気道の粘膜へ投与される。
【００６２】
本発明のなお別の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、好適なビヒクルに懸濁したオリゴヌクレオチドを含む、液剤、緩衝液剤、ゲル剤、軟膏剤、パスタ剤などの適用によって、尿生殖路、例えば、尿道、膣などの粘膜へ投与される。
【００６３】
鼻粘膜への適用からの効果は全身性であることが示されているが、他の部位、例えば尿生殖路、気道又は腸の粘膜への適用が、それらの器官又はそれらの近くに位置する腫瘍の治療にとってより好適であると考えられる。
【００６４】
本発明が、実験のセクションにおいて示されるインビボ及びインビトロデータによってサポートされかつ添付の図において示されるように、がんの治療に有用であることがわかる。
【００６５】
本発明の実施態様は、多くの利点を有する。今までのところ、本発明者によって規定された用量でのオリゴヌクレオチドの投与は、いかなる顕著な副作用をも誘発していない。さらに、経粘膜投与は、容易であり、迅速であり、かつ痛みが無く、驚くべきことに、全身性効果を生じさせる。例えば、腫瘍部位への好中球遊走の阻害を通じての、腫瘍の部位での状態に対する影響が、実験において見られた増殖の減少及びアポトーシスの誘導に関与する、１つの、しかし唯一ではない、要因であると考えられる。この効果は、単独で、又は現存する若しくは将来の抗がん治療と組み合わせて、がん攻撃への将来有望なアプローチを提供するものと考えられる。
【実施例】
【００６６】
実施例
１．動物実験
オリゴヌクレオチドの投与後の、ＲＭＡリンパ腫細胞の皮下増殖の効果を、同系Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスにおいて、インビボで調べた。研究の目的は、皮下腫瘍増殖のマウス実験モデルにおける種々のオリゴヌクレオチドの腫瘍増殖阻害効果を調べることであった。実験用皮下腫瘍は、インビボで維持されたＲＭＡ腫瘍細胞をレシピエントＢ６マウスに接種することによって誘発され得ることが公知である。
研究は、一群Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウス８匹の１０群、合計８０匹のマウスを含んだ。
【００６７】
１．１ テストシステム
腫瘍細胞型及び誘発
マウスにおける皮下腫瘍の誘発は、インビボ増殖されたＲａｕｃｈｅｒウイルス誘発リンパ腫細胞（ＲＭＡ）の細胞懸濁液（１０3）を動物の右側腹部内に接種することによって達成された。
【００６８】
テスト品製剤及び調製
調べる予定のオリゴヌクレオチドは、“レディー・トゥー・ユース”（ready to use）濃度（２．５〜１．２５μｇ／μＬ）で室温にてIndex Pharmaceuticals AB, Stockholm,
Swedenによって供給及び送達され、これを点滴注入の日まで−２０℃で維持した。
【００６９】
１．２ 動物材料及び条件
種、系統及び供給業者
使用したマウスは、MTC, Karolinska Institutet, Stockholm, Swedenでインハウスブリーディングによって得られた近交系のＣ５７ＢＬ／６／Ｂｙマウスであった。
【００７０】
詳細
マウスの体重はおよそ２０グラムであった。１０実験群に分割した８０匹のマウスを、実験において使用した。マウスを、ＭＴＣ動物施設での免疫応答性動物についての通常手順に従って取り扱い、これは、オープンケージに収容し、オープンベンチにおいて手袋で取り扱うことを含んだ。
【００７１】
環境
マウスを、Ｍ３タイプ（ｗ：ｌ：ｈ＝２５：４０：１６ｃｍ）の標準オープンケージ中に維持した。ケージを、プラスチック・カーテンの後ろの連続的な空気流下で、オープンラックに収容した。標準床敷を、Scanbur-BK, Sollentuna, Swedenから購入した。床敷を週１回交換した。動物室の温度を、１８℃〜２２℃の範囲に維持し、実験室の周囲換気システムを介して制御した。明周期は、１２時間暗及び１２時間明とした（０６：００に点灯）。
【００７２】
食餌及び水
マウスに、Scanbur-BK, Sollentuna, Swedenから購入した標準的なマウス食餌を与えた。馴化及び実験の間、必要に応じて、給水ビンを補充した。食餌及び水は自由に与えた。
【００７３】
１．３ 予備実験手順
馴化及び健康手順（health procedure）
適切な馴化を確認するために、実験手順の開始の少なくとも５日前に、マウスを実験室へ移した。
【００７４】
処置群への無作為割付け
検査及びヘルスクリアランスの後、マウスを箱から無作為に選び、耳標によって個々にマークし、そして実験群内に割付けた。
【００７５】
１．４． 実験手順／実験計画
セットアップ
実験手順を、研究ユニットへのマウスの到着の少なくとも５日後に開始した。前記群を無作為に割り当て、実験プロトコルに従って処置した。
【００７６】
実験手順
要約すると、実験は以下の行為を含んだ：ＲＭＡ腫瘍細胞をＢ６マウスの腹水腫瘍として増殖させ、インビボ増殖に適合された腫瘍細胞の供給源を得た。回復後、低用量のＲＭＡ腫瘍細胞を、レシピエントＢ６／Ｂｙマウスの右側腹部内に接種した。１０3細胞の腫瘍細胞用量を、この実験のために使用した。
【００７７】
腫瘍細胞接種後、全てのマウスを、注射の部位での触診によって、週２回モニタリングした。いずれかのマウスにおける腫瘍増殖の最初の兆候で、マウスを群に再分し、３日ごとに試験物質１用量で３用量（１００μｌ）与えた。試験物質を、動物の左側腹部に皮下的に与えた。マウスの１群において、試験物質をまた鼻腔内投与した。この群については、物質５０μｇ（４０μｌ）を投与した。
【００７８】
コントロール動物には、ビヒクルのみ（ＰＢＳ）を３日ごとに１用量で分割して、合計３用量を受容させた。レシピエントマウスの数は、合計１０群について、１実験群当たり８匹、即ち合計８０匹のマウスであった。マウスを継続的にモニタリングし、皮下腫瘍の増殖を測定し、がん塊体積として表した。
【００７９】
皮下ＲＭＡ腫瘍の処置
動物に、左側腹部において、合計３回の皮下注射（１００μＬ）のオリゴヌクレオチドを受容させ、１回の注射は、測定可能な腫瘍増殖の最初の兆候の時点から開始して３日ごとであった。腫瘍サイズを、カリパスを使用して測定し、がん塊体積（ｍｍ3）として表した。
【００８０】
腫瘍増殖速度の評価
各マウスを手触診によって追跡した。腫瘍が出現するとすぐに、そのサイズを、毎日、カリパスを使用して測定した。
【００８１】
最終手順
その増殖中の腫瘍のサイズが１５００ｍｍ3に達したときに、担腫瘍動物を犠牲にした。腫瘍を発症しなかった動物を最長２ヶ月間モニタリングし、その時点でマウスを犠牲にした。
【００８２】
マウス腫瘍全体検体収集
全ての測定を行った後、手袋、滅菌メス及び鉗子を使用して、腫瘍を切除した。腫瘍塊の一部、約４００〜５００ｍｇを切り取り、滅菌メスでスライスし、準備され標識されたエッペンドルフチューブ中の保存溶液中に移した。チューブを固く閉じ、内容物を反転によって５〜６回混合した。収集したサンプルを分析まで４℃で保管した。
【００８３】
１．５ 結果
各試験した化合物は、最長１０日の観察期間の間、腫瘍増殖に対して効果を示した。配列番号７について、驚くべきことに、より低い用量（１５０μｇに対して５０μｇ）が腫瘍増殖を顕著に減少させたことがわかった。非常に驚くべきことに、同一の用量（５０μｇ）が、経鼻投与した場合、等しく大きな増殖減少をもたらした（図１及び２を参照のこと）。
【００８４】
配列番号１、２、３、４及び７（図３〜７）の中で、少なくともこの実験設定において、配列番号１及び７について、効果が最も顕著であった。
【００８５】
２．ヒト細胞株を用いてのインビトロ実験
ヒトがんについての２つの認められているモデル細胞株を使用した。研究の目的は、腫瘍細胞増殖を阻害し、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する、種々のオリゴヌクレオチドの能力を調べることであった。別の目的は、動物実験において得られたデータを、ヒトのがんに対する効果について予測的な別のセットアップと相関させることであった。ポジティブコントロール（市販の免疫刺激オリゴヌクレオチド）、及びネガティブコントロール（逆ＣｐＧ部位を含有する人工配列）を使用した。
【００８６】
２．１ ヒトリンパ腫細胞株
ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉを、組織培養培地中において、４８及び７２時間、本発明のヌクレオチドである配列番号１〜６の各々で刺激した。種々の表面発現マーカーの発現を、ＦＡＣＳアレイ機器（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）を使用して、文献（例えば、GURSEL, et al. Differential and competitive activation of human immune cells by distinct classes of CpG oligodeoxynucleotide. J Leuk Biol. 2002, vol.71, p.813-820.；JAHRSDORFER, et al. CpG DNA increases primary malignant B cell expression of costimulatory molecules and target antigens. J Leuk Biol. 2001, vol.69, p.81-88.；JAHRSDORFER, et al. B-cell lymhomas differ in their responsiveness to CpG oligodeoxynucleotides. Clin Can Res. 2005, vol.11, p.1490-1499.；及びJAHRSDORFER, et al. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides induce apoptosis of B cell chronic lymphocytic leukemia cells. J Leuk Biol. 2005, vol.77, p.378-387を参照のこと）に記載されるようにＦＡＣＳによって分析した。
【００８７】
２．２ ヒト結腸がん細胞株
ヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６を、組織培養培地中において、７２時間、本発明のヌクレオチドである配列番号１〜５及び７の各々で刺激した。細胞増殖及び細胞死を、それぞれ、Ｋｉ−６７及び７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）を使用し、当業者に公知の手順に従って染色し、ＦＡＣＳ分析によって分析した。Ｋｉ−６７は、増殖中の細胞によって発現され、７−ＡＡＤを使用して、アポトーシス細胞を同定することができた。
【００８８】
２．４ 結果
図８において見られるように、配列番号１〜７に従う全ての化合物が、ある程度、腫瘍増殖を減少させることができた。しかし、特に配列番号２〜５及び７が、未処置細胞（ポジティブコントロール）と比較して、腫瘍増殖を著しく減少させた。
【００８９】
図９は、アポトーシスを誘導する同一の化合物の能力を示しており、ここで、該化合物、特に配列番号１、５及び７は、未処置細胞と比較して高い率のアポトーシスを誘導した。
【００９０】
図１０に示されるように、配列番号７を除く全ての配列は、Ｂ細胞増殖マーカーであるＣＤ２０、ＣＤ４０及びＣＤ５４の発現を刺激した。
【００９１】
他方で、図１１は、全ての配列で処置した後のＢ細胞活性化マーカーＣＤ６９、ＣＤ８０及びＣＤ８６のアップレギュレーションを示しており、配列番号７は、Ｂ細胞活性化の最も弱いインデューサであった。
【００９２】
図１２は、全ての配列での処置が、配列番号７を除いて、アポトーシス受容体ＣＤ９５（ＦＡＳ受容体としても公知）を著しい増加をもたらすことを示している。
【００９３】
１年の優先権期間に行われた実験
３．健常な被験者から分離されたＰＢＭＣ中における受容体発現
３．１ 材料及び方法
ヘパリン加末梢血を、健常な被験者（ｎ＝３）から得た。単核球フラクションを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Seromed, Berlin, Germany）勾配遠心分離によって分離した。細胞を、直ちに２×１０6細胞／ｍｌの濃度で、４８ウエルプレート中の、完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有）５００μｌの体積で、３７℃で、インキュベートし、１、１０及び２５μＭの１０個の異なるオリゴヌクレオチド化合物の各々で処置した。細胞のフラクションを、ＦＡＣＳによる表面抗原発現の直接分析のために、４個の抗体の各（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ８０、及びＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ５６ ＣＤ６９）の２つのミックス々で染色した。
【００９４】
４８時間後、細胞２００μｌを、９６ウエルプレート中に遠沈させ、２％ＦＣＳ（ＰＢＳ中）１００μｌに再懸濁し、２セットの抗体ミックス（上記の通り）と共に４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を純粋なＰＢＳで２回洗浄し、続いて表面抗原発現分析のためにＦＡＣＳＡｒｒａｙバイオアナライザーを使用するＦＡＣＳによって分析した。第０日から４日後、細胞の残りをアポトーシス分析のために採取した。細胞を９６ウエルプレート中に遠沈させ、上記の２％ＦＣＳ中に再懸濁し、ＣＤ１９及びＣＤ３の抗体ミックス（BD Pharmingen）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて、初期及び後期アポトーシスそれぞれの分析のために、アネキシンＶ及び７−ＡＡＤでＲＴにて１０分間染色した。細胞を上記のフローサイトメトリーによって分析した。
【００９５】
３．２ 結果
結果は、ＣＤ２０及びＣＤ２３の発現は、１０μＭでの配列番号３の投与によってアップレギュレートされたこと（図２３、データは示さず）、並びにＮＫ細胞活性化（ＣＤ６９）の誘導は、未処置及びポジティブコントロール、配列番号６と比較して、１０μＭでの配列番号３によって達成されたこと（図２４）を示している。オリゴヌクレオチド化合物と共に４日間インキュベートした後、Ｔ及びＢ細胞のアポトーシスは変化されなかった（データは示さず）。
【００９６】
４．ＣＬＬ及びＦＬ患者から分離したＰＢＭＣ中における受容体発現
４．１ 材料及び方法
ヘパリン加末梢血を、有意な循環疾患を有するＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）を有する患者から、インフォームドコンセント後に得た。全ての患者を、ルーチンな免疫表現型、形態学的及び臨床的基準によって診断した。
【００９７】
単核球フラクションを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Seromed, Berlin, Germany）勾配遠心分離によって分離した。細胞を、直ちに、２×１０６細胞／ｍｌの濃度で、４８ウエルプレート中、完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有）５００μｌの体積で、３７℃で、インキュベートし、１、１０及び２５μＭの１０個の異なるオリゴヌクレオチド化合物の各々で処置した。細胞のフラクションを、ＦＡＣＳによる表面抗原発現の直接分析のために、４個の抗体の２つのミックス（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ８０、及びＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ５６ ＣＤ６９）各々で染色した。
【００９８】
４８時間後、細胞２００μｌを、９６ウエルプレート中に遠沈させ、２％ＦＣＳ（ＰＢＳ中）１００μｌ中に再懸濁し、２セットの抗体ミックス（上記の通り）と共に４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を純粋なＰＢＳで２回洗浄し、続いて、表面抗原発現分析のためにＦＡＣＳＡｒｒａｙバイオアナライザーを使用するＦＡＣＳによって分析した。第０日から４日後、細胞の残りをアポトーシス分析のために採取した。細胞を９６ウエルプレート中に遠沈させ、上記のように２％ＦＣＳ中に再懸濁し、ＣＤ１９及びＣＤ３の抗体ミックス（BD Pharmingen）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて、初期及び後期アポトーシスそれぞれの分析のために、アネキシンＶ及び７−ＡＡＤでＲＴにて１０分間染色した。細胞を上記のフローサイトメトリーによって分析した。
【００９９】
４．２ 結果
結果は、配列番号３、８、及び９は、ＣＬＬ−患者由来のＢ細胞上におけるＣＤ２０のアップレギュレーション（図１３）、及びＣＬＬ−患者由来のＢ細胞上におけるＣＤ８０のアップレギュレーション（図１４）を誘導することを示した。ＣＤ２３及びＣＤ２５の発現もまたアップレギュレートされた（データは示さず）。
【０１００】
配列番号３、８、及び９は、ＣＤ６９染色によって測定されるＮＫ細胞の活性化を誘導することも示された（図１５）。
【０１０１】
結果はまた、配列番号３、８、及び９は、ＣＬＬ−患者由来のＰＢＭＣのＴ細胞及びＢ細胞のアポトーシスを誘導することを示した（図１６及び１７）。
【０１０２】
５．パルス実験
５．１ 実験セットアップ
サイトカインプロフィール及び表面マーカーの発現を、健常なコントロール由来のＰＢＭＣを使用して、いわゆるパルス実験において測定した。サイトカインプロフィールを、インビトロでの４８時間培養後に測定し、表面マーカー染色（ＦＡＣＳ）を７２時間後に行った。
【０１０３】
実施例３及び４に記載されるように、ＰＢＭＣを調製及び培養した。次いで、ＰＢＭＣを、所定期間の間、実験化合物にさらし、続いて洗浄した。洗浄を以下のように行った：先ず、プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、上清を捨て、新鮮な培地を添加した。遠心分離を繰り返し、第２の上清を捨て、新鮮な培地を添加した。その後、ＰＢＭＣを、所望の時点である４８時間（サイトカインプロフィール）又は７２時間（表面マーカー染色）までさらに培養した。
【０１０４】
サイトカインプロフィールを、４８時間インビトロ培養の後に測定した。第１バッチにおいて、実験化合物にさらすことなく、ＰＢＭＣを単に４８時間培養した。第２バッチにおいて、ＰＢＭＣを、配列番号３（ＩＤＸｓ００２２）を用いての３０分パルスにさらし、即ち換言すると配列番号３へ３０分間曝露し、上述のように洗浄し、次いで４８時間培養した。第３バッチにおいて、ＰＢＭＣを２時間パルスにさらし、第４バッチにおいて、配列番号３へ６０時間さらした。以下のサイトカインを分析した：Ｉｌ−６、Ｉｌ−１０、及びＩＰ−１０。サイトカイン濃度をｐｇ／ｍｌとして与えた。
【０１０５】
表面マーカー染色をインビトロ培養の７２時間後に行った。第１バッチにおいて、実験化合物にさらすことなく、ＰＢＭＣを単に７２時間培養した。第２バッチにおいて、ＰＢＭＣを、配列番号３（ＩＤＸｓ００２２）を用いての３０分パルスにさらし、即ち換言すると、配列番号３へ３０分間曝露し、上述のように洗浄し、次いで７２時間培養した。第３バッチにおいて、ＰＢＭＣを２時間パルスにさらし、第４バッチにおいて、配列番号３へ６０時間さらした。表面マーカー分析を、ＦＡＣＳによるＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６及びＣＤ６９の表面抗原発現の直接分析によって行った。
【０１０６】
３．２．結果
結果は、オリゴヌクレオチドがわずか３０分後に洗浄によって除去された場合も、顕著な長期効果が存在することを示し、このことは、経鼻投与の、又はオリゴヌクレオチドが約３０分を超えて存在するとは予想されない他の粘膜への投与の実行可能性を支持した。
【０１０７】
結果はまた、２時間後、及び６時間後でさえ、オリゴヌクレオチドが洗浄によって除去された場合、顕著な効果を示し、これは、例えば、より長い滞留時間が期待される直腸投与に対応する。結果を、サイトカイン分析については図１８、１９、及び２０に、表面マーカー染色については図２１及び２２に示す。
【０１０８】
この実験はヒトＰＢＭＣを使用して行なわれ、このことは、別の通常の実験設定である不死化ヒト細胞株を用いて行われる実験よりもより十分な正確さ、その結果をインビボ設定へ振替可能にすることもまた、留意すべきである。特に、患者から得られるＰＢＭＣは、例えばＢ細胞を含有しているであろうし、実験化合物の効果は、その療法のための関連標的に対して直接的に見られる。
【０１０９】
特定の実施態様を本明細書において詳細に開示したが、これは、例示目的のために実施例を用いてなされているだけであり、続いて添付の特許請求の範囲に関して限定することを意図するものではない。特に、種々の置換、変更及び修飾が、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることが、本発明者によって意図されている。
【０１１０】
参考文献
・ US 6,498,147 B (THE SCRIPPS INSTITUTE) 24.12.2002
・ KRIEG, A M. Lymphocyte activation by CpG dinucleotide motifs in prokaryotic DNA. Trends Microbiol. 1996, vol.4, no.2, p.73-6.
・ KRIEG, A M, et al. Mechanisms and therapeutic applications of immune stimulatory cpG DNA. Pharmacol Ther. 1999, vol.84, no.2, p.113-20.
・ WOOLDRIDGE, J E , et al. CpG DNA and cancer immunotherapy: orchestrating the
antitumour immune response. Curr Opin Oncol. 2003 Nov, vol.15, no.6, p.440-5.
・ CALIGARIS-CAPPIO, F., Hamblin, T.J.: Bal1 chronic lymphocytic leukemia: a bird of a different feather. J Clin Oncol. 1999 17:399406.
・ ROZMAN, C., Montserrat, E.: Chronic lymphocytic leukemia. New Engl J Med. 1995 333: 1052-1059.
・ GAIDAN, G.L., Ballerini, P., Gong JZ, et al: p53 mutations in human lymphoid
malignancies: association with Burkitt lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Proc Nat Acad Sci USA. 1991 88:54l 3-541 8.
・ DOHNER, H., Stilgenbauer, S., Doner, K., Bentz, M., Lichter, P.: Chromosome aberration in B-cell chronic lymphocytic leukemia: reassessment based on molecular genetic analysis. J Mol Med. 1999 77:266-270.
・ OSORIO, L.M., Jondal, M.. Aguilar-Santelises, M.; Regulation of BCLL Apoptosis Through Membrane Receptors and Bcl-2 Family Proteins; Leukemia and Lymphoma. 1999 30:247-256.
・ DANCESCU, M., Rubio-Trujillo M, Biron G, Bron D, Delespesse G, Sarfati M. Interleukin 4 protects chronic lymphocytic leukemic B cells from death by apoptosis and upregulates Bcl-2 expression. J Exp Med. 1992 Nov 1;176(5):1319-26.
・ KLEIN, A., Miera, O., Bauer, O., Golfier, S., Schriever. F.; Chemosensitivity of 8 cell chronic lyrnphocytic leukemia and correlated expression of proteins regulating apoptosis, ceIl cycle and DNA repair; Leukemia. 2000 14.40-46.
・ PISTOIA, V.: Production of cytokines by human B cells in health and disease.
lmmunol Today. 1997 18:343-346.
・ TANGYE, S.G., Weston, K.M., Raison, R.L.; Interleukin-10 Inhibits the In vitro Proliferation of Human Activated Leukemic CD5+ B-cells; Leukemia and Lymphoma. 1999 30: 121-130.
・ PESCOVITZ, M.D. Rituximab, an Anti-CD20 Monoclonal Antibody: History and Mechanism of Action. Am J Transpl. 2006 (6): 859-866.
・ REFF M.E., Carner K., Chambers K.S., Chinn P.C., Leonard J.E., Raab R., Newman R.A., Hanna N., Anderson D.R. Depletion of B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Blood. 1994 Jan 15;83(2):435-45.
・ PATHAN, N.I., Chu P., Hariharan K., Cheney C., Molina A., Byrd J. Mediation of apoptosis by and antitumour activity of lumiliximab in chronic lymphocytic leukemia cells and CD23+ lymphoma cell lines. Blood. 2008 Feb 1;111(3):1594-602.
・ SOKOLOSKI , J A, et al. Antisense oligonucleotides to the p65 subunit of NF-kB block CD11b expression and alter adhesion properties of differentiated HL-60 granulocytes. Blood. 15 July 1993, vol.82, no.2, p.625-632.
・ GURSEL, et al. Differential and competitive activation of human immune cells
by distinct classes of CpG oligodeoxynucleotide. J Leuk Biol. 2002, vol.71, p.813-820.
・ JAHRSDORFER, et al. CpG DNA increases primary malignant B cell expression of
costimulatory molecules and target antigens. J Leuk Biol. 2001, vol.69, p.81-88.
・ JAHRSDORFER, et al. B-cell lymhomas differ in their responsiveness to CpG oligodeoxynucleotides. Clin Can Res. 2005, vol.11, p.1490-1499.
・ JAHRSDORFER, et al. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides induce apoptosis
of B cell chronic lymphocytic leukemia cells. J Leuk Biol. 2005, vol.77, p.378-387.
【技術分野】
【０００１】
本出願は、医学の分野、特に単独での又は現存する及び将来の療法と組み合わせてのがんの治療に使用するための新規な化合物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん治療は、標的化アプローチの時代に入っている。１つのこのようなアプローチは、悪性細胞を認識する及び排除する免疫系の使用である。合成ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ ＤＮＡ）は、強力な組織化された腫瘍特異的免疫応答を刺激する能力を有する比較的新しいクラスの薬剤である（非特許文献１、２）。
【０００３】
最近の研究は、各々が異なる物理的特性及び生物学的効果を有する、少なくとも３つのクラスのＣｐＧ ＤＮＡ配列が存在することを実証している。いくつかのがん動物モデルにおける予備研究は、ＣｐＧ ＤＮＡががん免疫療法において多くの用途を有し得ることを示唆している。ＣｐＧ ＤＮＡは、先天免疫を活性化させ、抗体依存性細胞傷害性を増強し、特異的な保護的免疫反応を誘発する強力なワクチンアジュバントとして役立つことによって、腫瘍退縮を誘導する能力を有する。初期臨床試験はＣｐＧ ＤＮＡがヒトへ安全に投与され得ることを示しており、どのようにそれらの薬剤ががん免疫療法において役割を果たし得るかを理解するために、研究が行われている（非特許文献３）。
【０００４】
先の特許（特許文献１）は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを示し、インビトロでの腫瘍細胞のアンチセンス阻害、並びに同系Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるインビボでの腫瘍増殖のアンチセンス阻害を示す動物実験を開示した。マウスは、センス及びアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド４０ｍｇ／ｇの腹腔内注射で処置された。組織学的分析は、巣状腫瘍壊死、続いての広範囲の分節状壊死を示した。
【０００５】
Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、西洋社会において最も一般的な白血病である。Ｂ−ＣＬＬは、血球、特にＢリンパ球の制御されない増殖及び／又は減少した細胞死（アポトーシス）を特徴とする、白血球及び骨髄のがんであり、成人白血病の最も一般的な形態である。その罹患率は、７０歳を過ぎると、１００，０００人当たり５０人に近づく。白血病は、通常、数年、さらには数十年もの長期にわたる自然経過を有するが、細胞が連続的な遺伝的欠陥を獲得するので、最終的に加速する。恐らく欠陥Ｂ−ＣＬＬ細胞とそれらの環境との変更された相互作用の結果である、異常に長い寿命に起因して、モノクローナルＢ−ＣＬＬ細胞が容赦なく蓄積する点で、Ｂ−ＣＬＬは、多くの他の悪性疾患とは相違する。サイトカインは、細胞恒常性及び細胞−細胞対話（cell-cell dialogue）において必須の因子であり、この環境において重要であると提案されている（非特許文献４、５）。
【０００６】
Ｂ−ＣＬＬについて共通の初期トランスフォーミング事象は見られていない。主に遺伝子再構成過程の間に生じると考えられ、他のリンパ性悪性疾患においては一般的な、染色体転座は、Ｂ−ＣＬＬにおいては稀である。核型異常は、疾患の経過の間、頻度及び数が増加する傾向にある。転座が見られる場合、それらは、融合遺伝子の形成又はがん遺伝子の過剰発現よりも遺伝子喪失を生じさせる傾向にある。Ｂ−ＣＬＬにおいて最も一般的な遺伝子異常は、１３ｑ欠失（事例の５０％）、１３ｑ４欠失（無痛経過に関連する）、トリソミー１２（１２ｑ１３−１５；ｐ５３を抑制するＭＤＭＱオンコプロテインの過剰発現を伴う）、及び１ｌｑ２２−ｑ２３欠失（事例の２０％）である（非特許文献６、７）。
【０００７】
Ｂ−ＣＬＬ細胞は、ＣＤ２３（ＩｇＥについての低親和性受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ α鎖）、及びＣＤ２７（共刺激分子）などの表面分子を発現し、これらは、他の設定において、活性化の状態を示す。いくつかのタンパク質の発現及び会合は、アポトーシスのプロセスを密接に調節する。これらのタンパク質の相対的バランスが、細胞寿命を制御する。このシステムを担う遺伝子としては、ＢＣＬ−２ファミリー、腫瘍壊死因子受容体、並びにＭｙｃ及びｐ５３などの遺伝子が挙げられる（非特許文献８）。これらの遺伝子によって促進される死経路は全て、プロテアーゼファミリーであるカスパーゼによって代表される、共通の「破壊」カスケードを有するようである。Ｂ−ＣＬＬ細胞は、高レベルのＢＣＬ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバー（ｂａｄ−２、ｂｃｌ−ｎ、ｂａｘ）の生成物を持続的に発現し、同時に、Ｂｃｌ−２機能阻害剤であるＢｃｌ−６は著しく減少される。Ｂｃｌ−２の過剰発現に関与するメカニズムは、現在のところ不明である。Ｂ−ＣＬＬの白血病細胞は、Ｆａｓについて陰性又は弱陽性である。それらは、一般的に、刺激によってＦａｓ発現が誘導された後でさえ、抗Ｆａｓ抗体仲介死に耐性のままである。稀な感受性の症例では、細胞死は、未だキャラクタライズされていないメカニズムによって、Ｂｃｌ−２発現とは無関係に起こる。Ｂｃｌ−２過剰発現及びＦａｓ経路は、Ｂ−ＣＬＬの病態生理学に関与するメカニズムであるが、必ずしも重大な原因事象ではないようである。サイトカインを含むメディエーターは、最初の病因因子とアポトーシスの最終経路とをつなぐ可能性が高い。
【０００８】
大抵のＢ−ＣＬＬ細胞は、細胞周期のＧ０期にあり、正常なリンパ球の増殖を誘導する、コンカナバリンＡ、ホルボールエステル、又は受容体架橋などの従来の方法によっては増殖期へ入るように誘導され得ない。ほんの一部の細胞のみが、未知の促進シグナルに反応してクローン集団を拡大するようである。増殖促進サイトカインは、インビボでこの刺激を提供し得る（非特許文献９）。
【０００９】
Ｂ−ＣＬＬ細胞は、正常なＢ細胞プールを犠牲にして蓄積する。他方で、総Ｔ細胞は、通常、増加される。骨髄Ｔリンパ球は、サルコイドーシス及び関節リウマチなどの自己免疫疾患において見られるように、主にＣＤ４＋細胞である。末梢血中には、しばしばＴｈ２優位サイトカイン表現型が存在する。ＴＣＲレパートリーの異常もまた報告された。報告は、Ｔリンパ球及び間質細胞が、Ｂ−ＣＬＬ細胞の寿命を永続させることができる環境を支えることにおいて重要な役割を有し得ることを示している。悪性細胞及びそれらのＴ細胞環境は両方とも、種々の（a vanity of）表面分子及びそれらの受容体：ＣＤ５並びにそのリガンドＣＤ７２、ＣＤ２７及びＣＤ７０を発現する。これらの知見は、直接的に又は間接的に（サイトカイン）細胞自己保存を生じさせ得る相互作用の種々の可能性を開く。このような長い生存は、次に、遺伝子突然変異及び遺伝子的不安定性の蓄積についての機会を増加させ、このことは、細胞周期チェックポイントの調節不全、及び細胞毒性治療に対する耐性による、疾患の進行に好都合である（非特許文献１０）。
【００１０】
Ｂ−ＣＬＬ細胞とそれらの環境との共生的相互作用は、ほぼ確実に、サイトカインの分泌によって仲介され、接着分子によって調節される。Ｂ−ＣＬＬにおけるサイトカイン関与の研究によって、この白血病における増殖及び長寿命のメディエーターとしての種々のサイトカインを支持又は反証するデータの実体が作製された。サイトカイン産生研究によって、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、１Ｌ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＴＮＦ−β、及びＴＮＦ−αについての逆転写ポリメラーゼ連鎖反応シグナルが実証された（非特許文献１１）。これらの知見は、ＩＬ４、ＩＬ３及びＩＬ６についての陰性結果を示した他の研究によって否定された（非特許文献１２）。対照的に、ＴＧＦ−β、及びＩＬ１０分泌が正常なＢリンパ球中において示された。これらの細胞について構成的であると報告された他のサイトカイン産生はない。
【００１１】
がんの免疫療法は１世紀以上の間探求されているが、種々の抗体ベースの産物ががんの多様な形態を有する患者のマネージメントへ導入されたのは、ほんのここ１０年のことである。現在、これは臨床研究の最も活発な分野の１つであり、８個の治療薬品が腫瘍学において既に認可されている。腫瘍関連マーカーに対する抗体は、数十年間、免疫組織学及びインビトロイムノアッセイにおける医療行為の一部であり、現在、がんの検出及び治療についての重要な生物学的薬剤としてますます認識されるようになっている（非特許文献１３）。分子工学は、このような抗体ベースの治療学についての将来性を改善し、頻繁に投与され得る種々の構築物並びにヒト化又はヒト抗体を生じさせた。
【００１２】
ＣＤ２０は、ＣＬＬ患者のＢ細胞の表面上に不定に発現され、ある患者のＢ細胞は非常に低レベルのＣＤ２０抗原を発現する。ＣＤ２０（ヒトＢリンパ球限定分化抗原）は、プレＢ及び成熟Ｂリンパ球上にある約３５ｋＤの分子量を有する疎水性膜貫通タンパク質である。前記抗原はまた、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）中の９０％超のＢ細胞上において発現されるが、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常な形質細胞又は他の正常な組織上においては見られない。ＣＤ２０は、細胞周期開始及び分化についての活性化プロセスにおける初期段階を調節し、恐らく、カルシウムイオンチャネルとして機能する。ＣＤ２０は、細胞表面から分離されず、抗体結合時にインターナライズしない。遊離ＣＤ２０抗原は、循環中に見られない（非特許文献１４）。
【００１３】
ヒトＣＤ２０に対して指向された遺伝子操作されたキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）又はＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Genentech, Inc., South San Francisco, California, U.S.）は、再発性又は難治性・低悪性度又は濾胞性、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫及びＢ−ＣＬＬを有する患者の治療のために使用される。リツキシマブは、身体の自然防御をリクルートし、ＣＤ２０抗原を介してそれが結合するＢ細胞を攻撃しそして死滅させることによって、働く。インビトロ作用機構研究によって、リツキシマブはヒト補体に結合し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を介してリンパ系Ｂ細胞株を溶解することが実証された（非特許文献１５）。さらに、それは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）についてのアッセイにおいて著しい活性を有する。インビボ前臨床試験によって、リツキシマブは、恐らく補体及び細胞媒介プロセスによって、カニクイザルの末梢血、リンパ節、及び骨髄からＢ細胞を激減させることが示された（非特許文献１６）。リツキシマブはＣＬＬ患者においてある程度成功して使用されてきたが、ＣＬＬ患者の分析は、Ｂ−ＣＬＬ細胞の表面上におけるＣＤ２０の密度はかなり可変であり、ある患者のＢ細胞は非常に低レベルのＣＤ２０抗原を発現することを示している。Ｂ細胞悪性疾患の典型的な治療は、リツキシマブに加えて、放射線療法及び化学療法剤の投与である。ＣＬＬの場合、従来の外部放射線療法が、悪性細胞を破壊するために使用される。しかし、副作用が、この治療における制限因子である。血液学的悪性疾患についての別の広く使用される治療は、化学療法である。併用化学療法は、部分又は完全寛解に達することにおいてある程度成功している。残念ながら、化学療法によって得られるこれらの寛解は、しばしば長持ちしない。
【００１４】
逆に、ＣＤ２３発現は、Ｂ−ＣＬＬにおいてより高いレベルで持続的に存在することがわかった。ＣＤ２３白血球分化抗原は、いくつかの造血系細胞上において発現される４５ｋＤ ＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、これは、ＩｇＥについての低親和性受容体（ＦｃγＲＩＩ）として機能する（非特許文献１７）。それは、Ｃ型レクチンファミリーのメンバーであり、細胞外レクチン結合ドメインと膜貫通領域との間にαヘリカルコイルドコイルストークを含有する。ストーク構造は、そのリガンド（例えば、ＩｇＥ）への結合の間、三量体への膜結合ＣＤ２３のオリゴマー化に寄与すると考えられている。タンパク質分解時、膜結合ＣＤ２３は、いくつかの可溶性ＣＤ２３（ｓＣＤ２３）分子量種（３７ｋＤ、２９ｋＤ及び１６ｋＤ）を生じさせる。ＩｇＥの産生の調節に関与することに加えて、ＣＤ２３はまた、胚中心Ｂ細胞の生存を促進すると推測された。ＣＤ２３の発現は、通常の活性化された濾胞性Ｂ細胞及びＢ−ＣＬＬ細胞において、非常にアップレギュレートされた。
【００１５】
ルミリキシマブは、マカク可変領域及びヒト定常領域（ＩｇＧ１，κ）を有し、活性化ヒト血中Ｂ細胞によるＩｇＥの産生を阻害するために元々は開発された、モノクローナルキメラ抗ＣＤ２３抗体（Biogen Idec製、現在、臨床試験を受けている）である。それは、現在、Ｂ−ＣＬＬ患者における使用についての第ＩＩＩ相試験中である。インビトロ研究によって、ルミリキシマブは、ミトコンドリア死経路を介してＢ−ＣＬＬ細胞においてカスパーゼ依存性アポトーシスを誘導することが示された（非特許文献１８）。従って、それは、リツキシマブとは異なるメカニズムによって腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するようである。
【００１６】
いくつかの他の抗体が、がんの治療について最近認可された。アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）又はＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ilex Pharmaceuticals製の抗ＣＤ５２）（非特許文献１９）は、ＣＬＬの治療について２００１年に認可された。ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Genentech, Inc., South San Francisco, CA）は、結腸直腸がん、小細胞肺がん及び乳がんの治療において使用される血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に対して指向されたヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂである。トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Roche製）は、ＨＥＲ−２標的を過剰発現する転移性乳がん腫瘍に対して有効であるヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂである（非特許文献２０）。
【００１７】
抗体薬物をより効率的にするために、腫瘍細胞の表面上の特異的抗原標的のアップレギュレーションが役立ち得る。このような効果を得るための１つの方法は、免疫調節オリゴヌクレオチドで細胞を刺激することであり得る。免疫刺激効果は、非メチル化ＣｐＧモチーフを含有する合成ＤＮＡベースのオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の使用によって得られ得る。このようなＣｐＧ ＯＤＮは、以下を含む、ヒト及びマウス白血球に対して非常に高い免疫刺激効果を有する：Ｂ細胞増殖、サイトカイン及び免疫グロブリン分泌；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性及びＩＦＮ−γ分泌；並びに、補助刺激分子を発現させ、サイトカイン、特に、Ｔｈ１様Ｔ細胞応答の発達を促進させることにおいて重要であるＴｈ１様サイトカインを分泌させるための、樹状細胞（ＤＣ）及び他の抗原提示細胞の活性化（非特許文献２１）。ＣｐＧ−ＯＤＮによる受容体密度の増加は、細胞に対するオリゴヌクレオチドの直接効果によって、又はサイトカインの誘導によって媒介され得る。抗原密度の増加又は標的受容体を発現する細胞の集団の増加は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のいずれかを増強することによって、抗体が腫瘍細胞をより効率的に死滅させることを可能にする。
【００１８】
ＣｐＧモチーフ単独では、オリゴヌクレオチドの効能の説明ができないという指摘がある。このモチーフは、所望の機能について必要ではないという指摘さえある。
【００１９】
オリゴヌクレオチドに基づくがんへの治療アプローチの開発に費やされた相当な努力、及び今まで報告された時折の成功にかかわらず、改善された効能を示し副作用が最小であるか又は無い、新規な化合物及び投与様式についての必要性が依然としてある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】US 6,498,147 B, THE SCRIPPS INSTITUTE, 2002-12-24
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】KRIEG, A M. Lymphocyte activation by CpG dinucleotide motifs in prokaryotic DNA. Trends Microbiol. 1996, vol.4, no.2, p.73-6
【非特許文献２】KRIEG, A M, et al. Mechanisms and therapeutic applications of immune stimulatory CpG DNA. Pharmacol Ther. 1999, vol.84, no.2, p.113-20
【非特許文献３】WOOLDRIDGE, J E , et al. CpG DNA and cancer immunotherapy: orchestrating the antitumour immune response. Curr Opin Oncol. 2003 Nov, vol.15, no.6, p.440-5
【非特許文献４】CALIGARIS-CAPPIO et al., 1999
【非特許文献５】ROZMAN et al., 1995
【非特許文献６】GAIDAN et al., 1991
【非特許文献７】DOHNER et al., 1999
【非特許文献８】OSORIO et al., 1999
【非特許文献９】DANCESCU et al., 1992
【非特許文献１０】KLEIN et al., 2000
【非特許文献１１】PISTOIA et al., 1997
【非特許文献１２】TANGYE et al., 1999
【非特許文献１３】STROME et al., 2007
【非特許文献１４】PESCOVITZ, 2006
【非特許文献１５】REFF et al., 1994
【非特許文献１６】REFF et al., 1994
【非特許文献１７】PATHAN et al., 2008
【非特許文献１８】PATHAN et al., 2008
【非特許文献１９】KEATING et al., 2002
【非特許文献２０】STROME et al., 2007
【非特許文献２１】KRIEG et al, 1995
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者は、驚くべきことに、特定のオリゴヌクレオチド配列が、皮下的に与えられると、又は特に、粘膜に局所的に、例えば経口的、経肺的、鼻腔内、直腸的、又は膣内に投与されると、動物実験においてインビボで、及びＣＬＬ患者及び健常な被験者由来のＰＢＭＣを使用してインビトロで確認されたように、種々のヒトがん形態に対して甚大な効果を有することを見出した。
【００２３】
さらに、新規な配列を開発及び試験しており、これらは単独で又は他の治療と組み合わせて顕著な治療効果を示した。該オリゴヌクレオチドは、アポトーシスを誘導するため、ＮＫ細胞を活性化するため、好中球遊走移動を阻害するため、及び特に細胞表面受容体の発現を増加させるために、使用される。本発明のオリゴヌクレオチドは、がんを治療するための免疫学的アプローチ、例えば特定の受容体に向けられたモノクローナル抗体と組み合わせて使用され得る。本発明の実施態様は、参照により本明細書に組み入れられる、添付の特許請求の範囲において定義される。
【００２４】
本発明を、添付の図面を参照して、以下の説明、非限定的な実施例、及び特許請求の範囲において、より詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】誘発皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについて、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、配列番号６の物質１５０μｇの皮下投与後の時間に対する腫瘍体積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図２】図１と同様のグラフであり、ここで、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、皮下的に（５０μｇボーラス）及び鼻腔内（５０μｇ）に与えられた、配列番号６の物質との比較を示す。
【図３】誘発皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについて、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、配列番号７の物質５０μｇの皮下投与後の時間に対する腫瘍体積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図４】誘発皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについて、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、配列番号１の物質５０μｇの皮下投与後の時間に対する腫瘍体積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図５】誘発皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについて、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、配列番号２の物質５０μｇの皮下投与後の時間に対する腫瘍体積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図６】誘発皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについて、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、配列番号３の物質５０μｇの皮下投与後の時間に対する腫瘍体積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図７】誘発皮下ＲＭＡリンパ腫を有するマウスについて、コントロール（ＰＢＳ）と比較しての、配列番号４の物質５０μｇの皮下投与後の時間に対する腫瘍体積（ｍｍ3）として測定した腫瘍増殖を示すグラフである。
【図８】配列番号１〜７の化合物を投与後の、インビトロでのヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６に対する増殖減少効果を示す棒グラフであり、ここで、「＋」及び「−」は、それぞれ、ポジティブ及びネガティブコントロールを意味する。
【図９】配列番号１〜７の化合物を投与後の、インビトロでのヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６におけるアポトーシス誘導を示す棒グラフであり、ここで、「＋」及び「−」は、それぞれ、ポジティブ及びネガティブコントロールを意味する。
【図１０ａ】配列番号１〜７に従う化合物の投与後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるＢ細胞増殖マーカーであるＣＤ２０の発現に対する効果を示す棒グラフからなる。
【図１０ｂ】配列番号１〜７に従う化合物の投与後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるＢ細胞増殖マーカーであるＣＤ４０の発現に対する効果を示す棒グラフからなる。
【図１０ｃ】配列番号１〜７に従う化合物の投与後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるＢ細胞増殖マーカーであるＣＤ５４の発現に対する効果を示す棒グラフからなる。
【図１１ａ】配列番号１〜７に従う化合物の投与後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるＢ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９、及びＣＤ８０の発現に対する効果を示す棒グラフからなる。
【図１１ｂ】配列番号１〜７に従う化合物の投与後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるＢ細胞活性化マーカーであるＤ６９、及びＣＤ８６の発現に対する効果を示す棒グラフからなる。
【図１２】配列番号１〜７に従う化合物の投与後の、インビトロでのヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるアポトーシスマーカーであるＣＤ９５の発現に対する効果を示す棒グラフである。
【図１３】実験化合物がＣＬＬ患者由来のＢ細胞上のＣＤ２０ｎのアップレギュレーションをどの程度誘導するかを示すグラフである。試験濃度の１０μＭで、化合物ＩＤＸｓ００２２、００３８及び００７１は全て、有意な効果を示す。これらの化合物は、表１の配列番号３、８、及び９に対応する。
【図１４】同様に、ＣＬＬ患者由来のＢ細胞上のＣＤ８０のアップレギュレーションを示す。ここでまた、表１の配列番号３、８、及び９によって示される化合物は、未処置コントロールと比較した効果を示す。
【図１５】実験化合物がＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣ中においてＮＫ細胞の活性化をどの程度誘導するかを示す。また、表１の配列番号３、８、及び９によって示される化合物は、未処理コントロールと比較した効果を示す。
【図１６】実験化合物がＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣにおいてＴ細胞のアポトーシスを誘導することを示す。試験した化合物は効果を示し、配列番号３に対応する化合物ＩＤＸｓ００２２は、試験濃度の１０μＭで最も強力である。
【図１７】実験化合物がＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣ中においてＢ細胞のアポトーシスも誘導することを示す。試験した化合物は全て効果を示し、配列番号３に対応する化合物ＩＤＸｓ００２２はまた、試験濃度の１０μＭで最も強力である。
【図１８】未処置と比較しての、配列番号３について２５μＭの濃度で３０分、２時間及び６時間曝露後の、健常なコントロール由来のＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＬ−６のアップレギュレーションを示す。
【図１９】未処置と比較しての、配列番号３について２５μＭの濃度で３０分、２時間及び６時間曝露後の、健常なコントロール由来のＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＬ−１０のアップレギュレーションを示す。
【図２０】未処置と比較しての、配列番号３について２５μＭの濃度で３０分、２時間及び６時間曝露後の、健常なコントロール由来のＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＰ−１０のアップレギュレーションを示す。
【図２１】未処置及び７２時間曝露と比較しての、配列番号３について濃度０．１、１、１０及び２５μＭで３０分、２時間及び６時間曝露後の、健常なコントロール由来のＰＢＭＣにおけるＣＤ２０発現のアップレギュレーションを示す。
【図２２】未処置及び７２時間曝露と比較しての、配列番号３を使用して、種々の濃度で３０分、２時間及び６時間曝露後の、健常なコントロール由来のＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞の活性化を示す。
【図２３】１０μＭで配列番号３を投与することによって達成された、３人の健常なコントロール由来のＰＢＭＣにおいて測定されたＣＤ２０の発現を示す。
【図２４】未処置及びポジティブコントロール、配列番号６と比較しての、１０μＭでの配列番号３によって達成された、ＮＫ細胞活性化（ＣＤ６９）の誘導を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
説明
本明細書を詳細に説明する前に、本発明は、このようなデバイス及び方法は変化し得るので、記載されるデバイスの特定の構成部品又は記載される方法のプロセス工程に限定されないと当然ながら理解すべきである。本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を説明する目的のために過ぎず、限定することを意図していないと当然ながら理解すべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ア（a）」、「アン（an）」及び「ザ（the）」はまた、文脈が明確にそうではないように指示しない限り、複数形の概念をも含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「配列（a sequence）」への言及は、２個以上のこのような配列を含むなどである。
【００２７】
さらに、用語「約」は、適用可能な場合、所定の値の＋／−２％、好ましくは＋／−５％、最も好ましくは数値の＋／−１０％の偏差を示すために使用される。
【００２８】
用語「がん」は、任意の悪性新生物性疾患、即ち異常な制御されない細胞分裂によって引き起こされる任意の悪性増殖又は腫瘍を意味するものとする。用語「がん」は、特に本明細書に含まれる動物実験において例示されるような固形限局性腫瘍と、これらに限定されないが、実施例において研究した２つの形態の白血病である慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）などの、非固形がん形態との両方を含むものとする。
【００２９】
本発明者は、以下の少なくとも１つが可能な新規なオリゴヌクレオチド配列を同定した：アポトーシスの誘導、ＮＫ細胞の活性化、好中球の阻害、及び特定の細胞表面マーカーの発現のアップレギュレーション。本発明者はまた、新規な治療方法を利用可能にし、驚くべきことに、用量の減少（１５０μｇから５０μｇへ）が皮下投与における反応を有意に改善したこと、及び粘膜における適用（本明細書において、経鼻投与の形態で試験した）が、投与の等しく有効な方法を提供することを、発見した。
【００３０】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明者は、本明細書において示されるオリゴヌクレオチド配列が、腫瘍部位への、細胞、特に好中球、の遊走を阻害することができ、したがって腫瘍の増殖を阻害することができると考えられる。さらに、インビトロでのヒト細胞株に対する実験は、本発明に従うオリゴヌクレオチドが、増殖を減少させかつアポトーシスを誘導することができることを示している。
【００３１】
好中球遊走の障害ががんの作用であり、このために個体を感染症にかかりやすくするという理論に反して、本発明者は、腫瘍が、状況を有利にするように身体の防御システム、特に炎症反応を使用することができるか、又はある程度、これから恩恵を受けることを意図した。本発明の化合物である、表１に示される配列番号１〜５及び８〜９は、このようなメカニズムを阻害する可能性を提供する。
【００３２】
本発明者はまた、驚くべきことに、本化合物が、本明細書ではＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ６９、ＣＤ８０、及びＣＤ８６によって示される、細胞表面マーカーの発現を誘発する又は増加させることができることを示す。
【００３３】
従って、本発明者は、本発明の１実施態様として、がんの治療のための化合物及び方法を利用可能にし、ここで、表１に示される本発明の化合物は、アポトーシスを増加させるため、ＮＫ細胞を活性化するため、細胞表面マーカーであるＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ６９、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の１つ又はそれ以上の発現をアップレギュレートするため；単独で使用されるか；又は腫瘍の外科的切除、放射線治療、ホルモン治療、外科的介入、化学療法、免疫学的療法、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、寒冷療法、血管新生阻害、又はそれらのいずれかの組み合わせの中から選択される抗腫瘍療法と組み合わせて使用される。最も好ましくは、抗腫瘍治療は、免疫学的治療であり、患者への抗体の投与を含む。
【００３４】
現在入手可能な抗体の例としては、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））、ルミリキシマブ、アレムツズマブ（Alentuzumab）（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、及びトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
抗腫瘍療法と組み合わせて提供される場合、本発明の化合物は、好ましくは、抗腫瘍療法の前に、好ましくは該療法の３０分、１時間、２時間、３時間、６時間又は１２時間前に、投与される。免疫学的療法、特に抗体の投与を含む療法と組み合わせて提供される場合、本発明の化合物は、好ましくは患者への抗体の投与の前に、最も好ましくは特異的抗体を標的化させる細胞表面分子又は細胞表面マーカーのアップレギュレーションを可能にするために十分に前に、投与される。
【００３６】
本発明は、特定のヌクレオチド、即ち、配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列を利用可能にする。表１を参照のこと。
【００３７】
表１．配列情報
【表１】
【００３８】
上記配列、配列番号１〜５及び８〜９は、本発明者によって合成され、本発明者の知る限りでは、以前に知られていない。配列番号６は、US 6,498,147において初めて公開され、配列番号７は、特にSOKOLOSKI , J A, et alによって公開された。ＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニットに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ１１ｂ発現をブロックし、分化ＨＬ−６０顆粒球の接着性を変更させる。Blood. 15 July 1993, vol.82, no.2, p.625-632。
【００３９】
配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従うオリゴヌクレオチド配列は、リン酸骨格修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含み得る。リン酸骨格修飾は、好ましくはホスホロチオエート又はホスホロジチオエート修飾である。
【００４０】
本発明はまた、がんの治療用の、特に腫瘍増殖の阻害を通して、例えば腫瘍部位への好中球遊走の阻害を通してがんを治療する、薬剤を製造するための、配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用を含む。
【００４１】
好ましい実施態様によれば、薬剤は、がんの治療において、細胞表面マーカーのアップレギュレーション、アポトーシスの誘導、ＮＫ細胞の活性化、及び好中球遊走の阻害のうちの少なくとも１つを達成するに有効な用量で経鼻投与される。用量は、好ましくは、がんの治療について約１〜約１００μｇの範囲内にある。
【００４２】
同様に、本発明はまた、がんの治療において、細胞表面マーカーのアップレギュレーション、アポトーシスの誘導、ＮＫ細胞の活性化、及び好中球遊走の阻害のうちの少なくとも１つを達成するに有効な用量での皮下投与用の薬剤を製造するための、配列番号１〜８のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用を含む。用量は、好ましくは、がんの治療について約１〜約１００μｇの範囲内にある。
【００４３】
本発明の１実施態様は、抗腫瘍治療が、オリゴヌクレオチドの投与の前、後、又は本質的に同時に与えられる、上記に定義される使用を含む。この抗腫瘍治療は、放射線治療、ホルモン治療、外科的介入、化学療法、免疫学的療法、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、寒冷療法、血管新生阻害、又はそれらのいずれかの組み合わせの中から選択される。
【００４４】
抗腫瘍治療は、好ましくは患者への抗体の投与を含む免疫学的療法である。
【００４５】
従って、本発明はまた、配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列が、その必要がある患者へ投与される、がんの治療のための方法を含む。
【００４６】
上記で定義されたように、配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つにおける少なくとも１つのヌクレオチドは、リン酸骨格修飾を含み得る。該リン酸骨格修飾は、好ましくはホスホロチオエート又はホスホロジチオエート修飾である。
【００４７】
本発明治療方法の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、経粘膜的に、即ちその必要がある患者の粘膜へ局所的に、投与される。経粘膜投与としては、経口、経肺、経直腸、経膣、および経鼻投与が挙げられる。
【００４８】
別の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、その必要がある患者へ皮下投与される。
【００４９】
本発明の上記実施態様のいずれか１つにおいて、オリゴヌクレオチドは、がんの治療で、例えば細胞表面マーカーのアップレギュレーション、アポトーシスの誘導、ＮＫ細胞の活性化、及びがんの治療の好中球遊走の阻害の少なくとも１つを通して、腫瘍増殖を阻害するに有効な用量で投与される。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約１〜約１００μｇの用量で投与される。
【００５０】
本発明のヌクレオチドは単独で試験しているが、がんの治療への他のアプローチと組み合わせて使用する場合、それらは相加効果又は相乗効果さえ示すことが考えられる。従って、本発明の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、抗腫瘍治療の前、後、又は本質的に同時に投与される。
【００５１】
上記で概説したように、この抗腫瘍治療は、放射線治療、ホルモン治療、外科的介入、化学療法、免疫学的療法、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、寒冷療法、血管新生阻害、又はそれらのいずれかの組み合わせの中から選択される。
【００５２】
抗腫瘍治療は、好ましくは、患者への抗体の投与を含む免疫学的療法である。
【００５３】
本発明の上記実施態様のいずれか１つにおいて、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの細胞表面分子又は細胞表面マーカー、特に、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の中から選択される細胞表面マーカーの発現を誘発するか又は増加させるか又はアップレギュレートさせるに有効な用量で投与される。
【００５４】
当業者は、がんの治療には多数のアプローチが存在するという事実を十分承知している。がんのタイプ、その位置及び進行の状態、並びに患者の状態に依存して、いくつかの療法が使用されることは、がんとの闘いについて特徴的である。いくつかの療法を、続けて、又は組み合わせて使用するのがしばしばそうである。外科的介入、放射線療法及び化学療法などのいくつかの療法が数十年間実施されてきたと同時に、他のものも最近考えられており、多くは依然として実験的使用状態にある。当然ながら、新しいアプローチが絶えず開発されており、本発明に従うオリゴヌクレオチド、それらの使用及び治療方法は、将来の治療と組み合わせても有用であると考えられる。本発明者は、現在、本発明のオリゴヌクレオチド、それらの使用及び治療方法が、以下の抗腫瘍治療と組み合わせて有用であると考えるが、これらに限定されることを望まない；放射線治療、ホルモン治療、外科的介入、化学療法、免疫学的療法、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、寒冷療法、血管新生阻害、又はそれらのいずれかの組み合わせ。
【００５５】
抗腫瘍治療は、好ましくは、患者への抗体の投与を含む免疫学的療法である。
【００５６】
オリゴヌクレオチドは、治療有効量で投与される。「治療有効量」の定義は、疾患及び治療方法の設定に依存し、「治療有効量」は、単独で又は他の治療と組み合わせて、患者の状態の測定可能な改善を生じさせる用量である。
【００５７】
がんを治療するためのオリゴヌクレオチドの有効量は、レシピエント哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、約０．０１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１μｇ〜約１０μｇ、最も好ましくは約１μｇ〜約５μｇの広範囲に及ぶ。オリゴヌクレオチドは、単回用量又は反復用量で投与され得る。現在最も好ましい実施態様は、５０μｇの量で、粘膜投与、例えば鼻腔内、経口的、経直腸的又は膣内に投与される、本発明ヌクレオチドの１単回用量を要する。
【００５８】
本発明のヌクレオチドは、皮下的に又は粘膜に局所的に送達され得る。用語「粘膜に局所的に」は、経口、経肺、直腸、経膣、及び経鼻投与を含む。本発明の１実施態様によれば、ヌクレオチドは、鼻腔内送達される。アクセスのしやすさ及び鼻の脈管構造のため、経鼻薬物送達は、全身的に及び血液脳関門を通過させてＣＮＳへ、小分子薬物及び生物製剤の両方を送達するための魅力的な方法であることがよく知られている。ヌクレオチドは、任意の好適な製剤で、例えば好適な水性緩衝液、例えばしかしこれに限定されないが、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で送達され得る。ヌクレオチドが、粘膜への付着を向上させるように設計された好適な製剤、例えば好適なゲル形成ポリマー、例えばキトサンなど；ヌクレオチドの細胞取り込みを促進する製剤、例えば親油性送達ビヒクル、リポソーム若しくはミセル；又は両方で投与されることが考えられる。
【００５９】
経鼻投与に利用可能ないくつかの方法及びデバイスが存在する；局所的又は全身的作用のいずれかを有する、液体及び粉末の両方の製剤の単回又は反復投与。適切なデバイス又は投与技術を使用して、ＣＮＳへの送達のために嗅球領域を標的化することが可能である。本発明は、鼻粘膜へヌクレオチドを投与するための特定の方法又はデバイスに限定されない。初期動物研究によって、ピペットによる簡単な点滴注入で十分に機能することが示されているが、ヒトに使用するためには、信頼できる単回又は反復用量投与のためのデバイスが好ましい。
【００６０】
本発明の別の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、直腸点滴注入を通して例えば好適な緩衝液に懸濁したオリゴヌクレオチドを含む水性浣腸剤の形態で結腸の粘膜へ投与される。
【００６１】
本発明の別の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、好適な緩衝液に懸濁したオリゴヌクレオチドを含む、エアゾール剤の吸入によって、又はこれもまた好適な緩衝液に懸濁化したオリゴヌクレオチドを含む、洗浄を行うことによって、肺又は気道の粘膜へ投与される。
【００６２】
本発明のなお別の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、好適なビヒクルに懸濁したオリゴヌクレオチドを含む、液剤、緩衝液剤、ゲル剤、軟膏剤、パスタ剤などの適用によって、尿生殖路、例えば、尿道、膣などの粘膜へ投与される。
【００６３】
鼻粘膜への適用からの効果は全身性であることが示されているが、他の部位、例えば尿生殖路、気道又は腸の粘膜への適用が、それらの器官又はそれらの近くに位置する腫瘍の治療にとってより好適であると考えられる。
【００６４】
本発明が、実験のセクションにおいて示されるインビボ及びインビトロデータによってサポートされかつ添付の図において示されるように、がんの治療に有用であることがわかる。
【００６５】
本発明の実施態様は、多くの利点を有する。今までのところ、本発明者によって規定された用量でのオリゴヌクレオチドの投与は、いかなる顕著な副作用をも誘発していない。さらに、経粘膜投与は、容易であり、迅速であり、かつ痛みが無く、驚くべきことに、全身性効果を生じさせる。例えば、腫瘍部位への好中球遊走の阻害を通じての、腫瘍の部位での状態に対する影響が、実験において見られた増殖の減少及びアポトーシスの誘導に関与する、１つの、しかし唯一ではない、要因であると考えられる。この効果は、単独で、又は現存する若しくは将来の抗がん治療と組み合わせて、がん攻撃への将来有望なアプローチを提供するものと考えられる。
【実施例】
【００６６】
実施例
１．動物実験
オリゴヌクレオチドの投与後の、ＲＭＡリンパ腫細胞の皮下増殖の効果を、同系Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスにおいて、インビボで調べた。研究の目的は、皮下腫瘍増殖のマウス実験モデルにおける種々のオリゴヌクレオチドの腫瘍増殖阻害効果を調べることであった。実験用皮下腫瘍は、インビボで維持されたＲＭＡ腫瘍細胞をレシピエントＢ６マウスに接種することによって誘発され得ることが公知である。
研究は、一群Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウス８匹の１０群、合計８０匹のマウスを含んだ。
【００６７】
１．１ テストシステム
腫瘍細胞型及び誘発
マウスにおける皮下腫瘍の誘発は、インビボ増殖されたＲａｕｃｈｅｒウイルス誘発リンパ腫細胞（ＲＭＡ）の細胞懸濁液（１０3）を動物の右側腹部内に接種することによって達成された。
【００６８】
テスト品製剤及び調製
調べる予定のオリゴヌクレオチドは、“レディー・トゥー・ユース”（ready to use）濃度（２．５〜１．２５μｇ／μＬ）で室温にてIndex Pharmaceuticals AB, Stockholm,
Swedenによって供給及び送達され、これを点滴注入の日まで−２０℃で維持した。
【００６９】
１．２ 動物材料及び条件
種、系統及び供給業者
使用したマウスは、MTC, Karolinska Institutet, Stockholm, Swedenでインハウスブリーディングによって得られた近交系のＣ５７ＢＬ／６／Ｂｙマウスであった。
【００７０】
詳細
マウスの体重はおよそ２０グラムであった。１０実験群に分割した８０匹のマウスを、実験において使用した。マウスを、ＭＴＣ動物施設での免疫応答性動物についての通常手順に従って取り扱い、これは、オープンケージに収容し、オープンベンチにおいて手袋で取り扱うことを含んだ。
【００７１】
環境
マウスを、Ｍ３タイプ（ｗ：ｌ：ｈ＝２５：４０：１６ｃｍ）の標準オープンケージ中に維持した。ケージを、プラスチック・カーテンの後ろの連続的な空気流下で、オープンラックに収容した。標準床敷を、Scanbur-BK, Sollentuna, Swedenから購入した。床敷を週１回交換した。動物室の温度を、１８℃〜２２℃の範囲に維持し、実験室の周囲換気システムを介して制御した。明周期は、１２時間暗及び１２時間明とした（０６：００に点灯）。
【００７２】
食餌及び水
マウスに、Scanbur-BK, Sollentuna, Swedenから購入した標準的なマウス食餌を与えた。馴化及び実験の間、必要に応じて、給水ビンを補充した。食餌及び水は自由に与えた。
【００７３】
１．３ 予備実験手順
馴化及び健康手順（health procedure）
適切な馴化を確認するために、実験手順の開始の少なくとも５日前に、マウスを実験室へ移した。
【００７４】
処置群への無作為割付け
検査及びヘルスクリアランスの後、マウスを箱から無作為に選び、耳標によって個々にマークし、そして実験群内に割付けた。
【００７５】
１．４． 実験手順／実験計画
セットアップ
実験手順を、研究ユニットへのマウスの到着の少なくとも５日後に開始した。前記群を無作為に割り当て、実験プロトコルに従って処置した。
【００７６】
実験手順
要約すると、実験は以下の行為を含んだ：ＲＭＡ腫瘍細胞をＢ６マウスの腹水腫瘍として増殖させ、インビボ増殖に適合された腫瘍細胞の供給源を得た。回復後、低用量のＲＭＡ腫瘍細胞を、レシピエントＢ６／Ｂｙマウスの右側腹部内に接種した。１０3細胞の腫瘍細胞用量を、この実験のために使用した。
【００７７】
腫瘍細胞接種後、全てのマウスを、注射の部位での触診によって、週２回モニタリングした。いずれかのマウスにおける腫瘍増殖の最初の兆候で、マウスを群に再分し、３日ごとに試験物質１用量で３用量（１００μｌ）与えた。試験物質を、動物の左側腹部に皮下的に与えた。マウスの１群において、試験物質をまた鼻腔内投与した。この群については、物質５０μｇ（４０μｌ）を投与した。
【００７８】
コントロール動物には、ビヒクルのみ（ＰＢＳ）を３日ごとに１用量で分割して、合計３用量を受容させた。レシピエントマウスの数は、合計１０群について、１実験群当たり８匹、即ち合計８０匹のマウスであった。マウスを継続的にモニタリングし、皮下腫瘍の増殖を測定し、がん塊体積として表した。
【００７９】
皮下ＲＭＡ腫瘍の処置
動物に、左側腹部において、合計３回の皮下注射（１００μＬ）のオリゴヌクレオチドを受容させ、１回の注射は、測定可能な腫瘍増殖の最初の兆候の時点から開始して３日ごとであった。腫瘍サイズを、カリパスを使用して測定し、がん塊体積（ｍｍ3）として表した。
【００８０】
腫瘍増殖速度の評価
各マウスを手触診によって追跡した。腫瘍が出現するとすぐに、そのサイズを、毎日、カリパスを使用して測定した。
【００８１】
最終手順
その増殖中の腫瘍のサイズが１５００ｍｍ3に達したときに、担腫瘍動物を犠牲にした。腫瘍を発症しなかった動物を最長２ヶ月間モニタリングし、その時点でマウスを犠牲にした。
【００８２】
マウス腫瘍全体検体収集
全ての測定を行った後、手袋、滅菌メス及び鉗子を使用して、腫瘍を切除した。腫瘍塊の一部、約４００〜５００ｍｇを切り取り、滅菌メスでスライスし、準備され標識されたエッペンドルフチューブ中の保存溶液中に移した。チューブを固く閉じ、内容物を反転によって５〜６回混合した。収集したサンプルを分析まで４℃で保管した。
【００８３】
１．５ 結果
各試験した化合物は、最長１０日の観察期間の間、腫瘍増殖に対して効果を示した。配列番号７について、驚くべきことに、より低い用量（１５０μｇに対して５０μｇ）が腫瘍増殖を顕著に減少させたことがわかった。非常に驚くべきことに、同一の用量（５０μｇ）が、経鼻投与した場合、等しく大きな増殖減少をもたらした（図１及び２を参照のこと）。
【００８４】
配列番号１、２、３、４及び７（図３〜７）の中で、少なくともこの実験設定において、配列番号１及び７について、効果が最も顕著であった。
【００８５】
２．ヒト細胞株を用いてのインビトロ実験
ヒトがんについての２つの認められているモデル細胞株を使用した。研究の目的は、腫瘍細胞増殖を阻害し、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する、種々のオリゴヌクレオチドの能力を調べることであった。別の目的は、動物実験において得られたデータを、ヒトのがんに対する効果について予測的な別のセットアップと相関させることであった。ポジティブコントロール（市販の免疫刺激オリゴヌクレオチド）、及びネガティブコントロール（逆ＣｐＧ部位を含有する人工配列）を使用した。
【００８６】
２．１ ヒトリンパ腫細胞株
ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉを、組織培養培地中において、４８及び７２時間、本発明のヌクレオチドである配列番号１〜６の各々で刺激した。種々の表面発現マーカーの発現を、ＦＡＣＳアレイ機器（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）を使用して、文献（例えば、GURSEL, et al. Differential and competitive activation of human immune cells by distinct classes of CpG oligodeoxynucleotide. J Leuk Biol. 2002, vol.71, p.813-820.；JAHRSDORFER, et al. CpG DNA increases primary malignant B cell expression of costimulatory molecules and target antigens. J Leuk Biol. 2001, vol.69, p.81-88.；JAHRSDORFER, et al. B-cell lymhomas differ in their responsiveness to CpG oligodeoxynucleotides. Clin Can Res. 2005, vol.11, p.1490-1499.；及びJAHRSDORFER, et al. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides induce apoptosis of B cell chronic lymphocytic leukemia cells. J Leuk Biol. 2005, vol.77, p.378-387を参照のこと）に記載されるようにＦＡＣＳによって分析した。
【００８７】
２．２ ヒト結腸がん細胞株
ヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６を、組織培養培地中において、７２時間、本発明のヌクレオチドである配列番号１〜５及び７の各々で刺激した。細胞増殖及び細胞死を、それぞれ、Ｋｉ−６７及び７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）を使用し、当業者に公知の手順に従って染色し、ＦＡＣＳ分析によって分析した。Ｋｉ−６７は、増殖中の細胞によって発現され、７−ＡＡＤを使用して、アポトーシス細胞を同定することができた。
【００８８】
２．４ 結果
図８において見られるように、配列番号１〜７に従う全ての化合物が、ある程度、腫瘍増殖を減少させることができた。しかし、特に配列番号２〜５及び７が、未処置細胞（ポジティブコントロール）と比較して、腫瘍増殖を著しく減少させた。
【００８９】
図９は、アポトーシスを誘導する同一の化合物の能力を示しており、ここで、該化合物、特に配列番号１、５及び７は、未処置細胞と比較して高い率のアポトーシスを誘導した。
【００９０】
図１０に示されるように、配列番号７を除く全ての配列は、Ｂ細胞増殖マーカーであるＣＤ２０、ＣＤ４０及びＣＤ５４の発現を刺激した。
【００９１】
他方で、図１１は、全ての配列で処置した後のＢ細胞活性化マーカーＣＤ６９、ＣＤ８０及びＣＤ８６のアップレギュレーションを示しており、配列番号７は、Ｂ細胞活性化の最も弱いインデューサであった。
【００９２】
図１２は、全ての配列での処置が、配列番号７を除いて、アポトーシス受容体ＣＤ９５（ＦＡＳ受容体としても公知）を著しい増加をもたらすことを示している。
【００９３】
１年の優先権期間に行われた実験
３．健常な被験者から分離されたＰＢＭＣ中における受容体発現
３．１ 材料及び方法
ヘパリン加末梢血を、健常な被験者（ｎ＝３）から得た。単核球フラクションを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Seromed, Berlin, Germany）勾配遠心分離によって分離した。細胞を、直ちに２×１０6細胞／ｍｌの濃度で、４８ウエルプレート中の、完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有）５００μｌの体積で、３７℃で、インキュベートし、１、１０及び２５μＭの１０個の異なるオリゴヌクレオチド化合物の各々で処置した。細胞のフラクションを、ＦＡＣＳによる表面抗原発現の直接分析のために、４個の抗体の各（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ８０、及びＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ５６ ＣＤ６９）の２つのミックス々で染色した。
【００９４】
４８時間後、細胞２００μｌを、９６ウエルプレート中に遠沈させ、２％ＦＣＳ（ＰＢＳ中）１００μｌに再懸濁し、２セットの抗体ミックス（上記の通り）と共に４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を純粋なＰＢＳで２回洗浄し、続いて表面抗原発現分析のためにＦＡＣＳＡｒｒａｙバイオアナライザーを使用するＦＡＣＳによって分析した。第０日から４日後、細胞の残りをアポトーシス分析のために採取した。細胞を９６ウエルプレート中に遠沈させ、上記の２％ＦＣＳ中に再懸濁し、ＣＤ１９及びＣＤ３の抗体ミックス（BD Pharmingen）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて、初期及び後期アポトーシスそれぞれの分析のために、アネキシンＶ及び７−ＡＡＤでＲＴにて１０分間染色した。細胞を上記のフローサイトメトリーによって分析した。
【００９５】
３．２ 結果
結果は、ＣＤ２０及びＣＤ２３の発現は、１０μＭでの配列番号３の投与によってアップレギュレートされたこと（図２３、データは示さず）、並びにＮＫ細胞活性化（ＣＤ６９）の誘導は、未処置及びポジティブコントロール、配列番号６と比較して、１０μＭでの配列番号３によって達成されたこと（図２４）を示している。オリゴヌクレオチド化合物と共に４日間インキュベートした後、Ｔ及びＢ細胞のアポトーシスは変化されなかった（データは示さず）。
【００９６】
４．ＣＬＬ及びＦＬ患者から分離したＰＢＭＣ中における受容体発現
４．１ 材料及び方法
ヘパリン加末梢血を、有意な循環疾患を有するＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）を有する患者から、インフォームドコンセント後に得た。全ての患者を、ルーチンな免疫表現型、形態学的及び臨床的基準によって診断した。
【００９７】
単核球フラクションを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Seromed, Berlin, Germany）勾配遠心分離によって分離した。細胞を、直ちに、２×１０６細胞／ｍｌの濃度で、４８ウエルプレート中、完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有）５００μｌの体積で、３７℃で、インキュベートし、１、１０及び２５μＭの１０個の異なるオリゴヌクレオチド化合物の各々で処置した。細胞のフラクションを、ＦＡＣＳによる表面抗原発現の直接分析のために、４個の抗体の２つのミックス（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ８０、及びＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ５６ ＣＤ６９）各々で染色した。
【００９８】
４８時間後、細胞２００μｌを、９６ウエルプレート中に遠沈させ、２％ＦＣＳ（ＰＢＳ中）１００μｌ中に再懸濁し、２セットの抗体ミックス（上記の通り）と共に４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を純粋なＰＢＳで２回洗浄し、続いて、表面抗原発現分析のためにＦＡＣＳＡｒｒａｙバイオアナライザーを使用するＦＡＣＳによって分析した。第０日から４日後、細胞の残りをアポトーシス分析のために採取した。細胞を９６ウエルプレート中に遠沈させ、上記のように２％ＦＣＳ中に再懸濁し、ＣＤ１９及びＣＤ３の抗体ミックス（BD Pharmingen）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて、初期及び後期アポトーシスそれぞれの分析のために、アネキシンＶ及び７−ＡＡＤでＲＴにて１０分間染色した。細胞を上記のフローサイトメトリーによって分析した。
【００９９】
４．２ 結果
結果は、配列番号３、８、及び９は、ＣＬＬ−患者由来のＢ細胞上におけるＣＤ２０のアップレギュレーション（図１３）、及びＣＬＬ−患者由来のＢ細胞上におけるＣＤ８０のアップレギュレーション（図１４）を誘導することを示した。ＣＤ２３及びＣＤ２５の発現もまたアップレギュレートされた（データは示さず）。
【０１００】
配列番号３、８、及び９は、ＣＤ６９染色によって測定されるＮＫ細胞の活性化を誘導することも示された（図１５）。
【０１０１】
結果はまた、配列番号３、８、及び９は、ＣＬＬ−患者由来のＰＢＭＣのＴ細胞及びＢ細胞のアポトーシスを誘導することを示した（図１６及び１７）。
【０１０２】
５．パルス実験
５．１ 実験セットアップ
サイトカインプロフィール及び表面マーカーの発現を、健常なコントロール由来のＰＢＭＣを使用して、いわゆるパルス実験において測定した。サイトカインプロフィールを、インビトロでの４８時間培養後に測定し、表面マーカー染色（ＦＡＣＳ）を７２時間後に行った。
【０１０３】
実施例３及び４に記載されるように、ＰＢＭＣを調製及び培養した。次いで、ＰＢＭＣを、所定期間の間、実験化合物にさらし、続いて洗浄した。洗浄を以下のように行った：先ず、プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、上清を捨て、新鮮な培地を添加した。遠心分離を繰り返し、第２の上清を捨て、新鮮な培地を添加した。その後、ＰＢＭＣを、所望の時点である４８時間（サイトカインプロフィール）又は７２時間（表面マーカー染色）までさらに培養した。
【０１０４】
サイトカインプロフィールを、４８時間インビトロ培養の後に測定した。第１バッチにおいて、実験化合物にさらすことなく、ＰＢＭＣを単に４８時間培養した。第２バッチにおいて、ＰＢＭＣを、配列番号３（ＩＤＸｓ００２２）を用いての３０分パルスにさらし、即ち換言すると配列番号３へ３０分間曝露し、上述のように洗浄し、次いで４８時間培養した。第３バッチにおいて、ＰＢＭＣを２時間パルスにさらし、第４バッチにおいて、配列番号３へ６０時間さらした。以下のサイトカインを分析した：Ｉｌ−６、Ｉｌ−１０、及びＩＰ−１０。サイトカイン濃度をｐｇ／ｍｌとして与えた。
【０１０５】
表面マーカー染色をインビトロ培養の７２時間後に行った。第１バッチにおいて、実験化合物にさらすことなく、ＰＢＭＣを単に７２時間培養した。第２バッチにおいて、ＰＢＭＣを、配列番号３（ＩＤＸｓ００２２）を用いての３０分パルスにさらし、即ち換言すると、配列番号３へ３０分間曝露し、上述のように洗浄し、次いで７２時間培養した。第３バッチにおいて、ＰＢＭＣを２時間パルスにさらし、第４バッチにおいて、配列番号３へ６０時間さらした。表面マーカー分析を、ＦＡＣＳによるＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６及びＣＤ６９の表面抗原発現の直接分析によって行った。
【０１０６】
３．２．結果
結果は、オリゴヌクレオチドがわずか３０分後に洗浄によって除去された場合も、顕著な長期効果が存在することを示し、このことは、経鼻投与の、又はオリゴヌクレオチドが約３０分を超えて存在するとは予想されない他の粘膜への投与の実行可能性を支持した。
【０１０７】
結果はまた、２時間後、及び６時間後でさえ、オリゴヌクレオチドが洗浄によって除去された場合、顕著な効果を示し、これは、例えば、より長い滞留時間が期待される直腸投与に対応する。結果を、サイトカイン分析については図１８、１９、及び２０に、表面マーカー染色については図２１及び２２に示す。
【０１０８】
この実験はヒトＰＢＭＣを使用して行なわれ、このことは、別の通常の実験設定である不死化ヒト細胞株を用いて行われる実験よりもより十分な正確さ、その結果をインビボ設定へ振替可能にすることもまた、留意すべきである。特に、患者から得られるＰＢＭＣは、例えばＢ細胞を含有しているであろうし、実験化合物の効果は、その療法のための関連標的に対して直接的に見られる。
【０１０９】
特定の実施態様を本明細書において詳細に開示したが、これは、例示目的のために実施例を用いてなされているだけであり、続いて添付の特許請求の範囲に関して限定することを意図するものではない。特に、種々の置換、変更及び修飾が、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることが、本発明者によって意図されている。
【０１１０】
参考文献
・ US 6,498,147 B (THE SCRIPPS INSTITUTE) 24.12.2002
・ KRIEG, A M. Lymphocyte activation by CpG dinucleotide motifs in prokaryotic DNA. Trends Microbiol. 1996, vol.4, no.2, p.73-6.
・ KRIEG, A M, et al. Mechanisms and therapeutic applications of immune stimulatory cpG DNA. Pharmacol Ther. 1999, vol.84, no.2, p.113-20.
・ WOOLDRIDGE, J E , et al. CpG DNA and cancer immunotherapy: orchestrating the
antitumour immune response. Curr Opin Oncol. 2003 Nov, vol.15, no.6, p.440-5.
・ CALIGARIS-CAPPIO, F., Hamblin, T.J.: Bal1 chronic lymphocytic leukemia: a bird of a different feather. J Clin Oncol. 1999 17:399406.
・ ROZMAN, C., Montserrat, E.: Chronic lymphocytic leukemia. New Engl J Med. 1995 333: 1052-1059.
・ GAIDAN, G.L., Ballerini, P., Gong JZ, et al: p53 mutations in human lymphoid
malignancies: association with Burkitt lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Proc Nat Acad Sci USA. 1991 88:54l 3-541 8.
・ DOHNER, H., Stilgenbauer, S., Doner, K., Bentz, M., Lichter, P.: Chromosome aberration in B-cell chronic lymphocytic leukemia: reassessment based on molecular genetic analysis. J Mol Med. 1999 77:266-270.
・ OSORIO, L.M., Jondal, M.. Aguilar-Santelises, M.; Regulation of BCLL Apoptosis Through Membrane Receptors and Bcl-2 Family Proteins; Leukemia and Lymphoma. 1999 30:247-256.
・ DANCESCU, M., Rubio-Trujillo M, Biron G, Bron D, Delespesse G, Sarfati M. Interleukin 4 protects chronic lymphocytic leukemic B cells from death by apoptosis and upregulates Bcl-2 expression. J Exp Med. 1992 Nov 1;176(5):1319-26.
・ KLEIN, A., Miera, O., Bauer, O., Golfier, S., Schriever. F.; Chemosensitivity of 8 cell chronic lyrnphocytic leukemia and correlated expression of proteins regulating apoptosis, ceIl cycle and DNA repair; Leukemia. 2000 14.40-46.
・ PISTOIA, V.: Production of cytokines by human B cells in health and disease.
lmmunol Today. 1997 18:343-346.
・ TANGYE, S.G., Weston, K.M., Raison, R.L.; Interleukin-10 Inhibits the In vitro Proliferation of Human Activated Leukemic CD5+ B-cells; Leukemia and Lymphoma. 1999 30: 121-130.
・ PESCOVITZ, M.D. Rituximab, an Anti-CD20 Monoclonal Antibody: History and Mechanism of Action. Am J Transpl. 2006 (6): 859-866.
・ REFF M.E., Carner K., Chambers K.S., Chinn P.C., Leonard J.E., Raab R., Newman R.A., Hanna N., Anderson D.R. Depletion of B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Blood. 1994 Jan 15;83(2):435-45.
・ PATHAN, N.I., Chu P., Hariharan K., Cheney C., Molina A., Byrd J. Mediation of apoptosis by and antitumour activity of lumiliximab in chronic lymphocytic leukemia cells and CD23+ lymphoma cell lines. Blood. 2008 Feb 1;111(3):1594-602.
・ SOKOLOSKI , J A, et al. Antisense oligonucleotides to the p65 subunit of NF-kB block CD11b expression and alter adhesion properties of differentiated HL-60 granulocytes. Blood. 15 July 1993, vol.82, no.2, p.625-632.
・ GURSEL, et al. Differential and competitive activation of human immune cells
by distinct classes of CpG oligodeoxynucleotide. J Leuk Biol. 2002, vol.71, p.813-820.
・ JAHRSDORFER, et al. CpG DNA increases primary malignant B cell expression of
costimulatory molecules and target antigens. J Leuk Biol. 2001, vol.69, p.81-88.
・ JAHRSDORFER, et al. B-cell lymhomas differ in their responsiveness to CpG oligodeoxynucleotides. Clin Can Res. 2005, vol.11, p.1490-1499.
・ JAHRSDORFER, et al. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides induce apoptosis
of B cell chronic lymphocytic leukemia cells. J Leuk Biol. 2005, vol.77, p.378-387.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列。
【請求項２】
少なくとも１つのヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有する、配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列。
【請求項３】
がんの治療用の薬剤を製造するための、配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用。
【請求項４】
薬剤が、細胞表面マーカーであるＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の少なくとも１つの発現をアップレギュレートするのに有効な用量で、粘膜へ局所的に又は皮下的に投与される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
薬剤が、がんの治療において腫瘍部位への好中球遊走の阻害を通じて腫瘍増殖を阻害するのに有効な用量で、粘膜へ局所的に又は皮下的に投与される、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
薬剤が、アポトーシスを誘導するに有効な用量で、粘膜へ局所的に又は皮下的に投与される、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
薬剤が、ＮＫ細胞を活性化するのに有効な用量で、粘膜へ局所的に又は皮下的に投与される、請求項３に記載の使用。
【請求項８】
用量が、がんの治療について約１〜約１００μｇの範囲内にある、請求項４〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
抗腫瘍治療が、オリゴヌクレオチドの投与の前、後、又は本質的に同時に行なわれる、請求項４〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
抗腫瘍治療が、放射線治療、ホルモン治療、外科的介入、化学療法、免疫学的療法、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、寒冷療法、血管新生阻害、又はそれらのいずれかの組み合わせの中から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
抗腫瘍治療が、免疫学的療法であり、患者への抗体の投与を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列がその必要のある患者へ投与される、がんの治療のための方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが、その必要のある患者の粘膜へ局所的に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが、その必要のある患者へ皮下投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが、細胞表面マーカーであるＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の少なくとも１つの発現を誘発するに有効な用量で投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドが、がんの治療において腫瘍部位への好中球遊走の阻害を通じて腫瘍増殖を阻害するのに有効な用量で投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
薬剤が、アポトーシスを誘導するのに有効な用量で投与される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１９】
薬剤が、ＮＫ細胞を活性化するのに有効な用量で投与される、請求項１２に記載の使用。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドが、約１〜約１００μｇの用量で投与される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、抗腫瘍治療の前、後、又は本質的に同時に投与される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
抗腫瘍治療が、放射線治療、ホルモン治療、外科的介入、化学療法、免疫学的療法、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、寒冷療法、血管新生阻害、又はそれらのいずれかの組み合わせの中から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗腫瘍治療が、免疫学的治療であり、患者への抗体の投与を含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項１】
配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列。
【請求項２】
少なくとも１つのヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有する、配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列。
【請求項３】
がんの治療用の薬剤を製造するための、配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列の使用。
【請求項４】
薬剤が、細胞表面マーカーであるＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の少なくとも１つの発現をアップレギュレートするのに有効な用量で、粘膜へ局所的に又は皮下的に投与される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
薬剤が、がんの治療において腫瘍部位への好中球遊走の阻害を通じて腫瘍増殖を阻害するのに有効な用量で、粘膜へ局所的に又は皮下的に投与される、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
薬剤が、アポトーシスを誘導するに有効な用量で、粘膜へ局所的に又は皮下的に投与される、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
薬剤が、ＮＫ細胞を活性化するのに有効な用量で、粘膜へ局所的に又は皮下的に投与される、請求項３に記載の使用。
【請求項８】
用量が、がんの治療について約１〜約１００μｇの範囲内にある、請求項４〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
抗腫瘍治療が、オリゴヌクレオチドの投与の前、後、又は本質的に同時に行なわれる、請求項４〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
抗腫瘍治療が、放射線治療、ホルモン治療、外科的介入、化学療法、免疫学的療法、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、寒冷療法、血管新生阻害、又はそれらのいずれかの組み合わせの中から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
抗腫瘍治療が、免疫学的療法であり、患者への抗体の投与を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
配列番号１〜５及び８〜９のいずれか１つに従う単離されたオリゴヌクレオチド配列がその必要のある患者へ投与される、がんの治療のための方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが、その必要のある患者の粘膜へ局所的に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが、その必要のある患者へ皮下投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが、細胞表面マーカーであるＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の少なくとも１つの発現を誘発するに有効な用量で投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドが、がんの治療において腫瘍部位への好中球遊走の阻害を通じて腫瘍増殖を阻害するのに有効な用量で投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
薬剤が、アポトーシスを誘導するのに有効な用量で投与される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１９】
薬剤が、ＮＫ細胞を活性化するのに有効な用量で投与される、請求項１２に記載の使用。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドが、約１〜約１００μｇの用量で投与される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、抗腫瘍治療の前、後、又は本質的に同時に投与される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
抗腫瘍治療が、放射線治療、ホルモン治療、外科的介入、化学療法、免疫学的療法、光線力学療法、レーザー療法、温熱療法、寒冷療法、血管新生阻害、又はそれらのいずれかの組み合わせの中から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗腫瘍治療が、免疫学的治療であり、患者への抗体の投与を含む、請求項２１に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公表番号】特表２０１０−５２５８１１（Ｐ２０１０−５２５８１１Ａ）
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０６１４０（Ｐ２０１０−５０６１４０）
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０５０５０１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３６７４８
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５０８００３０１１）インデックス・ファーマシューティカルズ・アクチエボラーグ (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０５０５０１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３６７４８
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５０８００３０１１）インデックス・ファーマシューティカルズ・アクチエボラーグ (12)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]