腫瘍特性及びマーカーセットの同定のための方法、腫瘍分類、並びに癌のマーカーセット
腫瘍特性を同定するための方法であり、対象とする特性をそれぞれ予測する３つの異なるマーカーセットを得るステップと、腫瘍細胞から試料遺伝子発現シグナルを得るステップと、レポーターを加えて試料の変化に影響を及ぼし、腫瘍中の対象とする遺伝子発現シグナルの評価を可能にするステップと、遺伝子発現シグナルをレポーターと組み合わせるステップと、抽出された遺伝子発現シグナルを、３つの異なるマーカーセットと相関させるステップと、以下のランク付け：３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍が関心対象の特性を有すると予測する場合、腫瘍は、悪性腫瘍と指定される、３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍が関心対象の特性を欠いていると予測する場合、腫瘍は、良性腫瘍と指定される、３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、同じ臨床転帰の予測をもたらさない場合、腫瘍は、「中間」と指定されるに従って、抽出された遺伝子発現シグナルに指定を割り当てるステップと、前記指定を出力するステップとを含む。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、癌バイオマーカー、並びに癌バイオマーカーの同定及び使用のための方法の分野に関する。
【発明の背景】
【０００２】
癌についてより多くを理解するほど、より有効に癌を治療することができる。例えば、ほとんどの癌患者には、手術が行われる。しかし、一部の患者について、追加の治療を用いてさらなる利益が可能となり得る。術後の追加の療法（化学療法など）が有益である癌患者を判定するための満足のゆく手法は、現在のところ存在しない。予後予測のために使用することができる、癌細胞に特異的な遺伝子及びタンパク質の同定は、この点において役立つ。手術とその後の典型的な標準治療によってのみ治療される場合、回復についての予後不良に関連する腫瘍を同定するこれらの遺伝子／タンパク質は、予後不良バイオマーカーと呼ばれる。これらのバイオマーカーは、癌を診断した後の生存率を予測するため、術後の化学療法及び／又は放射線療法を行わずに、又は術後の典型的な標準治療処置のみを用いて、患者の経過が同様、又はより良好であるような、再発のリスクが十分に低い患者を識別するため、並びに最良の転帰を得るのに腫瘍学者が癌を治療するためにとるべき方法を誘導するための有益なツールとして使用することができる。
【０００３】
同様に、薬物反応において役割を果たす、癌において発現される遺伝子が存在する。臨床的な決定をする際、予測された薬物反応に対する情報を有することは有用である。
【０００４】
臨床的に興味を引く、十分な精度を有するスクリーニングツールを提供するために、好ましくは、１つのタイプの癌について複数のマーカーを考慮するべきである。１つの遺伝子マーカーは、十分なレベルの特異性及び感度をもたらさない。例として、２５，０００を超える遺伝子を同時に測定することができるマイクロアレイ技術は、複数のマーカーを見出すために有用なツールを提供する。
【０００５】
本発明の目的は、対象とする腫瘍特性を同定するのに使用するためのマーカーのセット、並びにこれらのマーカーセットの同定及び使用のための方法を提供することである。
【発明の概要】
【０００６】
一実施形態における本発明は、遺伝子のグループに基づいて、「良性」と「悪性」の腫瘍を区別するための、遺伝子発現プロファイルの利用を教示する。本明細書で使用する場合、予測因子及び患者生存率を参照する際、用語「良性腫瘍」は、化学療法又は放射線療法を用いずに（これが典型的な標準治療の一部であっても）、手術及び単に典型的な標準治療によって治癒する見込みのある腫瘍を指す。本明細書で使用する場合、用語「悪性腫瘍」は、手術、及び化学療法又は放射線療法を含む、単に典型的な標準治療によって治癒する見込みのない腫瘍を指す。本明細書で使用する場合、患者が、手術をして５年又は１０年以内に、腫瘍の再発（又は腫瘍の転移）を経験していない場合、腫瘍は「治癒」している。
【０００７】
発現プロファイルが「良性」と「悪性」の腫瘍を区別することができる遺伝子のセットを同定することが可能である。先行技術により、５つのそのような遺伝子発現シグナルセットが開示されており、これらは、乳癌試料についてのバイオマーカーとして開発された。各遺伝子発現シグナルセットは、一連の乳房腫瘍試料から得られた。しかし、これらの５つのバイオマーカーセットは、交差使用（ｃｒｏｓｓ−ｕｓｅｄ）ができない。具体的には、先行技術のいわゆる「乳癌バイオマーカー」は、別のセットの乳房腫瘍試料において使用される場合、予後を一貫して予測するものとして認められていない。他のタイプの癌についてのバイオマーカーも、同じ問題を有する。癌は、非常に不均質である。しばしば、１つのタイプの癌について、いくつかのサブタイプが見出される場合がある。以前に開示されたマーカーセットは、これらのサブタイプについて十分に万能でない。
【０００８】
これらの問題、及びデータセット（試料）利用可能性の制限を克服するために、バイオマーカーのセットを見つけ、使用するための新しい手法が開発された。
【０００９】
本発明の一実施形態では、バイオマーカーの強力なセットを見出すため、患者の遺伝子発現プロファイル及び臨床情報が含まれていた、公開されている癌データセットからランダムトレーニングデータセットが生成された。ランダムトレーニングデータセットの遺伝子発現プロファイルは、患者生存状態及びスクリーニングバイオマーカーと相関させた。
【００１０】
本発明の一実施形態では、バイオマーカーを同定する方法であって、
現在利用可能なデータセット（腫瘍マイクロアレイプロファイリング＋癌患者の臨床情報）からランダムトレーニングデータセットを生成するステップと、
予後についての予測力を有する遺伝子発現シグナルセットを同定するために、ランダムトレーニングデータセットについて遺伝子発現シグナルセットをスクリーニングするステップと、
遺伝子が、良好な予測力を有する遺伝子発現シグナルセットにおいて出現した頻度に基づいて（直前のステップのスクリーニングによって）遺伝子をランク付けし、それによってバイオマーカーセットを構築するステップと、
予測のための、３〜６のバイオマーカーセットの組み合わせ利用（即ち、試料Ａが、３つすべてのバイオマーカーセットによって、「良性腫瘍」として予測される場合、本発明者らは、試料Ａは、「良性腫瘍」（低リスク）であるとし、すべてのバイオマーカーセットが「悪性」とする場合、本発明者らは、試料Ａは、「悪性」（高リスク）であるとし、そうでなければ、本発明者らは、試料Ａは中間リスクのものであるとする）ステップと、
他の独立したデータセットを使用してマーカーを検証するステップと
を含む方法が提供される。
【００１１】
「遺伝子発現シグナル」は、ｍＲＮＡ又はタンパク質などの遺伝子の発現の有形の指標である。
【００１２】
本発明の一実施形態では、腫瘍特性を同定するための方法であって、以下のステップ、 １）対象とする特性をそれぞれ予測する３つの異なるマーカーセットを得るステップと、
２）腫瘍細胞から遺伝子発現シグナルを抽出するステップと、
３）抽出された遺伝子発現シグナルを、３つの異なるマーカーセットと相関させるステップと、
４）以下の、
ａ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍が関心対象の特性を有すると予測する場合、腫瘍は悪性腫瘍と指定される、
ｂ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍が関心対象の特性を欠いていると予測する場合、腫瘍は、良性腫瘍と指定される、
ｃ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、同じ臨床転帰予測をもたらさない場合、腫瘍は、「中間」と指定される
というランク付けに従って、抽出された遺伝子発現シグナルに値を割り当てるステップと
を含む方法が提供される。
【００１３】
いくつかの場合では、関心対象の特性は、転移、炎症、細胞周期、免疫応答遺伝子、薬剤耐性遺伝子、及び多剤耐性遺伝子のうちの１つ又は複数に関係する。いくつかの場合では、腫瘍特性によって、特定の治療又は治療の組合せが決定する。
【００１４】
いくつかの場合では、腫瘍特性は、術後の患者生存率不良をもたらす傾向である。
【００１５】
いくつかの場合では、腫瘍特性は、患者の生存率に関係し、上記方法のステップ４は、以下の、
ａ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍を悪性腫瘍であると予測する場合、腫瘍は、悪性腫瘍と指定され、典型的な標準治療よりも積極的な治療が推奨される、
ｂ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍を良性腫瘍であると予測する場合、標準治療の範囲を超える治療は推奨されず、術後の化学療法も放射線療法も推奨されない、
ｃ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、同じ予後をもたらさない場合、腫瘍は、「中間」と指定され、化学療法及び／又は放射線療法を含む、完全な典型的な標準治療処置が推奨される、
というランク付けに従って、抽出された遺伝子発現シグナルに値を割り当てるステップを含む。
【００１６】
癌が複数のサブタイプを有する場合には、
ａ）検査される腫瘍サブタイプを同定するステップ、
ｂ）その腫瘍サブタイプに特異的なマーカーセットを選択するステップ
という予備ステップを含むことが望ましい場合がある。
【００１７】
いくつかの場合では、対象とする腫瘍特性は、腫瘍が化学療法剤又は放射線などの特定の治療に応答する傾向である。そのような場合では、遺伝子発現シグナルは、トレーニングセットを開発するプロセスにおいて、腫瘍薬物反応と相関する。特定の薬物に対する「良性」の腫瘍の応答は、治療後に、平均未満の腫瘍生存率となり、「悪性」の応答は、治療後に、平均を超える腫瘍生存率となることが理解されるであろう。この手法を使用して、元の腫瘍に関して利用可能な詳細、及びトレーニングセットを開発するのに使用される臨床的データに応じて、個々の薬物又は治療に対する応答についてだけでなく、治療の組合せに対する応答のマーカーを開発することが可能である（これを可能にするのに、元の情報源に十分なデータが存在する場合）。
【００１８】
本発明の一実施形態では、上述した方法において有用なタイプの予測遺伝子発現シグナルセットを決定するための方法であって、以下のステップ、
１）対象とする癌について既知の腫瘍集団に関する対象とする特性についての、遺伝子発現シグナル情報及び患者の臨床情報を得るステップと、
２）遺伝子発現シグナルを、対象とする特性に関する臨床患者情報と相関させて、臨床転帰についての予測力を有する遺伝子を同定するステップと、
３）ステップ１から少なくとも３０のランダムトレーニングデータセットを作るステップと、
４）ステップ３の同定された遺伝子発現シグナルを、癌において活性な既知の遺伝子のリストと比較するステップと、
５）既知の癌遺伝子のリスト上の遺伝子発現シグナルに対応する、同定された遺伝子発現シグナルを選択するステップと、
６）生物学的プロセスにおけるその役割によって、選択された、同定された遺伝子発現シグナルをグループ化するステップと、
７）ステップ６の選択された遺伝子発現シグナルグループから、少なくとも２５遺伝子のランダム遺伝子発現シグナルセットを生成するステップと、
８）ランダム遺伝子発現シグナルセットを、ステップ３のランダムトレーニングデータセットと相関させるステップと、
９）ステップ７の各遺伝子発現シグナルセットについての相関から、生存率スクリーニング（survival screening）についてのＰ値を得るステップと、
１０）遺伝子発現シグナルセットのＰ値が、ランダムトレーニングデータセットの９０％超について０．０５未満である場合、この遺伝子発現シグナルセットを確保するステップと、
１１）セット内の遺伝子出現の頻度に基づいて、ステップ１０において確保されたランダム遺伝子発現シグナルセットをランク付けするステップと、
１２）可能性のある候補マーカーとして、少なくとも上位２６遺伝子を選択するステップと、
１３）ステップ７〜１２を繰り返し、別の独立した、少なくとも２６遺伝子のランクセットを作製するステップと、
１４）ステップ１２及びステップ１３からの上位遺伝子を比較するステップと、
１５）２５を超える遺伝子が同じである場合、この上位遺伝子がマーカーセットとして確保されるステップと、
１６）ステップ７〜１５を２回繰り返して、３つの異なるマーカーセットを得るステップと、
を含む方法が提供される。
【００１９】
本発明の一実施形態では、典型的な標準治療よりも積極的、又は消極的な治療を必要とする患者を識別する方法であって、
「遺伝子発現シグナル」は、ｍＲＮＡなどの遺伝子の発現の有形の指標である（理論上、そうすることが技術的に実現可能である場合、代わりにタンパク質発現を測定することができるか？他に何かあるか？）
１．腫瘍情報及び臨床患者情報を含む情報源が、個々に試験される。どの遺伝子が、その個々の情報源内で予後についての予測力を有するかを識別するために、細胞内のすべての報告された遺伝子発現シグナルが、患者の生存率（５年及び１０年）と相関される。患者の生存率と有意に相関すると見出された遺伝子発現シグナルが、さらなる検査のために同定される。
２．ステップ１において同定された遺伝子発現シグナルは、既知の癌遺伝子のリストと比較され、癌において役割を有することが知られている既知の遺伝子に対応する遺伝子発現シグナルが、さらなる分析のために選択される。（これは、一般には、数百〜数千の遺伝子発現シグナルのリストを生じさせることになる）
３．少なくとも３０（一般に３０〜４０の間）のランダムトレーニングデータセットが、ステップ１の情報源から作製される。同じ個々の遺伝子発現シグナルが、複数のランダムトレーニングデータセット中に出現する場合がある。
４．ステップ２において選択された遺伝子発現シグナルは、生物学的プロセスにおけるその役割に従ってグループ化される（例えば、細胞周期遺伝子、細胞死遺伝子、免疫応答遺伝子、炎症遺伝子などＧＯ解析）。
５．ランダム遺伝子発現シグナルセット（一般に、約百万）が生成され、それぞれは、ステップ３において作製された１つのグループからランダムに選択された約３０の遺伝子を含有する。
６．各ランダムトレーニングデータセットに対する、ステップ４の各ランダム遺伝子発現シグナルセットの生存率スクリーニングについてのＰ値が得られる。もう少しこの相関について記述してもらえないか？
７．Ｐ値が、ランダムデータセットの９０％超について０．０５未満である場合、このランダム遺伝子セットは確保される。
８．ステップ７からの確保されたランダム遺伝子発現シグナルセットは、これらにおいて出現する遺伝子の頻度に基づいてランク付けされる。
９．ステップ８において決定された、最高の予測値を有する上位３０遺伝子（ステップ８でランク付けされた）が、可能性のある候補として選択される。
１０．ステップ５〜９が繰り返され、ステップ３において形成された各グループからランダム遺伝子発現シグナルセットを生成することから開始して、可能性のある候補である上位３０遺伝子の別の、独立したランク付けされたセットを作製する。
１１．ステップ１０において生じた上位３０遺伝子が、ステップ９からの上位３０遺伝子と比較される。３０のうち２５以上が同じである場合、これは、「安定なサイン」と呼ばれ、患者試料のスクリーニングに有用である。２５／３０未満が同じである場合、データは破棄される（両セットの可能性のある候補から）。少なくとも２５が必要であり、したがって、潜在的な候補の第１又は第２のセットを使用することができる。
１２．ステップ５〜１１が、遺伝子発現シグナルの２つの他のグループ（ステップ３の）のために、さらに２回繰り返される。したがって、ステップ３からの異なるグループにそれぞれ関係する、３つのセットの安定なサインが存在することになる。
１３．患者からの癌細胞を検査して、その遺伝子発現活性、及び３つの安定なサイン中の遺伝子発現シグナルとのその活性の相関を評価する。典型的に、安定なサインは、転移の見込みの暗示となり、したがって、そのサインに整合する高い患者発現は、「悪性」腫瘍を示すことになる。しかし、安定なサインは、アポトーシス遺伝子などの発現されている保護遺伝子を示す場合があることもあり得、この場合、そのサインについて、こうした遺伝子発現サインの高い患者発現量は、「良性」腫瘍を示す。いずれの場合においても、各安定なサインは、患者試料と比較され、「良性」腫瘍又は「悪性」腫瘍の予測は、各安定なサインによって個々に行われる。１つの安定なサインからの「悪性」又は「良性」の暗示についての境界は何か？例えば、サイン中に見出される遺伝子の５０％超が、試料中に発現される場合、「悪性」か？サイン中に見出される遺伝子の５０％超が、対応する非癌組織における正常な基礎レベルを超えて発現される場合、「悪性」か？
１４．患者試料に関する遺伝子発現シグナルの３つのセットのそれぞれの予測を合わせ、以下、
（ａ）３つすべての遺伝子発現シグナルセット（サイン）が、腫瘍を悪性腫瘍であると予測する場合、腫瘍は、悪性腫瘍と指定され、患者は、典型的な標準治療よりも積極的な治療が提供されるべきであり、
（ｂ）３つすべてのデータセットが、腫瘍を良性腫瘍であると予測する場合、患者は、標準治療以外の治療を受けるべきでなく、術後の化学療法も放射線療法も受けるべきでなく、
（ｃ）３つすべてのセットの遺伝子発現産物が、同じ予後をもたらさない場合、腫瘍は、「中間」と指定され、患者は、化学療法及び／又は放射線療法を含む、完全な典型的な標準治療処置を受けるべきであるように腫瘍に値を割り当てるステップ
を含む方法が提供される。
【００２０】
いくつかの場合では、この方法について、生物学的プロセスにおけるその役割によって、遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）分析を使用して、選択された、同定された遺伝子発現シグナルをグループ化することが望ましいであろう。
【００２１】
３０〜５０の間のランダムトレーニングセットが作られることが好ましい。３０〜４０の間のトレーニングセットが作られることがより好ましい。
【００２２】
転移、細胞増殖、腫瘍血管新生、及び薬物反応に関与する遺伝子のグループから、癌において活性であることが知られている遺伝子を選択することが、時には望ましいであろう。
【００２３】
上述した方法を伴う本発明のいくつかの実施形態では、ステップ７において、約７５０，０００〜１，２５０，０００の間、又は約９００，０００〜１，１００，０００の間、又は約１００万のランダム遺伝子発現シグナルセットが生成される。上記方法において記載されたような本発明のいくつかの実施形態では、ステップ７において、生成されたランダム遺伝子発現シグナルセットは、約２５〜５０の間、又は２８〜３２、又は約３０の遺伝子を含有する。
【００２４】
上記方法において記載されたような本発明の一実施形態では、ステップ１２において、上位２６〜５０、又は２８〜３２、又は約３０の遺伝子が選択される。
【００２５】
いくつかの場合では、患者生存率に関係する腫瘍特性を考慮する場合、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、ＮＲＣ−３、ＮＲＣ−４、ＮＲＣ−５、ＮＲＣ−６、ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、及びＮＲＣ−９から本質的になるリストから選択される少なくとも１つの癌バイオマーカーセットを使用することが望ましいであろう。
【００２６】
本発明の一実施形態では、対象とする腫瘍特性を同定するために、上述した方法を実施するための少なくとも３つのマーカーセット及び使用説明書を含むキットが提供される。いくつかの場合では、キットは、表１Ａ又は１Ｂ中に列挙された少なくとも１０の遺伝子発現シグナルを含むことになる。いくつかの場合では、キットは、上述した方法に従って同定された、少なくとも３０の核酸バイオマーカーを含むことになる。
【００２７】
本発明の一実施形態では、対象とする１つ又は複数の腫瘍特性の同定における、表１Ａ又は１Ｂ中の遺伝子発現シグナルのいずれかの使用が提供される。いくつかの場合では、少なくとも３つの異なるマーカーセットが使用され、いくつかの場合では、少なくとも１、２、又は３つのマーカーセットは表１Ａ又は１Ｂ中に見出される遺伝子発現シグナルの少なくとも１、５、１０、２０、又は２５を含む。いくつかの場合では、各マーカーセットは、表１Ａ又は１Ｂ中に見出される遺伝子発現シグナルの少なくとも１、５、１０、２０、又は２５を含有する。
【００２８】
本発明の一実施形態では、癌バイオマーカーは乳癌バイオマーカーであり、第１のサブタイプの試料はＥＲ＋試料である。
【００２９】
本発明の一実施形態では、上述した方法において、ランダムトレーニングセットは、選ばれる方のセットと同じ「良性」腫瘍と「悪性」腫瘍の比を維持しながら、試料をランダムに選ぶことによって生成される。
【００３０】
いくつかの場合では、対象とする腫瘍特性（複数可）は、患者生存率（例えば、手術及び典型的な標準治療後の）に関係することになり、そのような場合では、本方法を典型的な標準治療よりも積極的又は消極的な治療を必要とする患者を識別するためにしようすることができる。（化学療法及び放射線療法は、それ自体では危険である。したがって、これらの療法を必要としない患者に、そのような治療を提供するのを回避することが最良である。）
【００３１】
いくつかの場合では、遺伝子発現シグナル（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質）を抽出し、対象とする遺伝子発現シグナルに特異的なレポーターを使用して、対象とする遺伝子発現シグナルの存在（いくつかの場合では、レベル）をアッセイすることによって、患者の腫瘍組織を試験することが望ましいであろう。これは、複数の遺伝子発現シグナルの検査を本質的に同時に可能にするマイクロアレイ形式で行うことができる。レポーターは、対象とする核酸配列に結合するプローブ、対象とするタンパク質に特異的な抗体、又は任意の他のそのような物質とすることができる（多くのそのようなレポーターは、当技術分野において公知であり、日常的に使用される）。レポーターは、試料の変化を生じさせ、対象とする遺伝子発現シグナルの評価を可能にする。いくつかの場合では、生じる変化は、試料の光学的側面の変化である場合があり、他の場合では、変化は、試料の放射性特性又は蛍光特性などの試料の別のアッセイ可能な側面の変化である場合がある。
【００３２】
特定のタイプの癌が、1つ以上のサブタイプ（例えば、ＥＲ＋及びＥＲ−乳癌）を有する状況では、患者の癌をサブタイプによって最初にグループ化し、次いでグループ化されたサブタイプに関連して作製されたマーカーを使用することが好ましいであろう。
【００３３】
いくつかの場合では、対象とする腫瘍特性（複数可）は、特定の治療（複数可）に対する腫瘍の応答に関係し、そのような場合では、本方法は、腫瘍を有する患者にとって有望な治療手法（１つ若しくは複数の化学療法、又は治療の組合せ）を特定するために使用することできる。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「腫瘍」は、患者において破壊又は中和することが望ましい任意の癌細胞を含む。例えば、腫瘍は、固形腫瘍、骨髄腫、リンパ腫、及び白血病において見出される癌細胞を含むことができる。
【００３５】
腫瘍は一般に、哺乳動物又はトリの腫瘍であり、ヒト、類人猿、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ニワトリ、アヒル、又はガチョウの腫瘍であってもよい。
【００３６】
遺伝子発現シグナルの３つの独立したセットを組み合わせて使用することは、本明細書に記載される手法によって作製される遺伝子発現シグナルに限定されず、商業的に販売され、又は文献に報告されている癌バイオマーカーデータセットに適用することもできることが明らかとなるであろう。（最終的なスクリーニング結果の信頼性は、使用されるセットのロバスト性にある程度依存することになるが、したがって、強力な癌バイオマーカーデータセットを使用することが推奨される）。場合によっては、異なる生物学的プロセスに関与する遺伝子を含む癌バイオマーカーデータセット（例えば、１つのデータセットは、炎症に関係することができ、別のデータセットは、細胞周期に関係してもよく、第３のデータセットは転移に関係してもよい）を選択することが望ましいであろう。
【００３７】
本方法は、一般的であり、任意のタイプの癌に適用することができる。例えば、本方法は、表４に列挙された癌タイプに関して有用である。
【００３８】
本発明の一実施形態では、本方法は、乳癌患者を、手術後にどれぐらい積極的に治療すべきかを判定するのに適用される。
【００３９】
本方法の一実施形態を、実施例１の説明と並行して以下に提供する：
【００４０】
ステップ１：癌細胞遺伝子マイクロアレイデータ、及び腫瘍患者の生存率情報を使用して、自動生存率スクリーニング法を開発するステップ。（非限定例として、公開されている乳癌データセット（２９５試料、Ｃｈａｎｇら、ＰＮＡＳ １０２：３７３８、２００５）をスクリーニングするために、表面タンパク質及び分泌タンパク質が、ＪＭ０１細胞株（マウス乳癌細胞株、インハウス細胞株及びデータ）のマイクロアレイデータから同定された）。用語「生存率スクリーニング」は、Ｃｏｘ−Ｍａｎｔｅｌログランク検定を実行することにより、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を実施することによる、各１つの遺伝子発現値と患者の生存状態（「良い」又は「悪い」）の間の相関の統計的有意性の検査として定義される（Ｃｕｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：１５２、２００７）。このスクリーニングから、それぞれ単独で「良性」腫瘍及び「悪性」腫瘍を区別することができる７つのタンパク質が得られた。例として、実施例１の一部において、元の細胞株において実験的検証するために、タンパク質（ＭＭＰ９）が選択された。ＭＭＰ９抗体を細胞株に適用する場合、癌進行における上皮間葉移行が遮断された。この結果は、本方法は、転移関連遺伝子を見出すのに適していることを示す。
【００４１】
ステップ２：発現値が乳癌患者生存率と相関する遺伝子のゲノム全体での生存率スクリーニングを行うステップが行われた。（実施例１において、データセット１（７８試料、ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２）、及びデータセット２（２８６試料、Ｗａｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ、３６５：６７１、２００５）として定義された２つのトレーニングデータセットが使用された）。得られる遺伝子発現シグナルリストはそれぞれ、Ｓ１、及びＳ２と呼ばれる。これらの２つのリストの全遺伝子は、Ｓｔ遺伝子発現シグナルリスト（Ｓｔ＝Ｓ１＋Ｓ２）と呼ばれる。
【００４２】
ステップ３：対象とする癌が複数のサブタイプを有する場合、第１のサブタイプのマーカーが生成される。（例えば、実施例１において、ＥＲ＋及びＥＲ−マーカーが生成された）。実施例１において、ＥＲ＋腫瘍マーカーは、上記データセットからすべてのＥＲ＋試料を抽出することによって生成され、それぞれ、Ｓ１−ＥＲ＋セット（データセット１から抽出された）及びＳ２−ＥＲ＋セット（データセット２から抽出された）と定義された。Ｓ２−ＥＲ＋セットからＮ個の試料（Ｎ＝６０）をランダムに選ぶことによって、３５個のランダムトレーニングセットが生成される。「良性」腫瘍と「悪性」腫瘍の比は、Ｓ２−ＥＲ＋セットにおける比と本質的に同じに保存される。上述した３５のランダムトレーニングセットにＳ１−ＥＲ＋を加えることによって、３６のトレーニングセットが得られる。
【００４３】
ステップ４：ステップ２の繰り返しを含むが、第１の腫瘍サブタイプについてのサブセット、例えば、実施例１におけるＳ１−ＥＲ＋セット及びＳ２−ＥＲ＋セットのデータセットを使用する、ゲノム全体での生存率スクリーニングによって、遺伝子発現シグナルリスト（実施例１において、Ｓｔ−ＥＲ＋遺伝子発現シグナルリスト）を得るステップ。Ｓｔ−ＥＲ＋遺伝子発現シグナルリストを使用して、遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析（ＧＯアノテーションソフトウェア、Ｄａｖｉｄ、ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／を使用して）が実施され、癌に関連することが知られているＧＯターム、例えば、細胞周期、細胞死などに属する遺伝子のみが、さらなるマーカースクリーニングのために使用される。
【００４４】
ステップ５：１００万の異なるランダム遺伝子セット（各ランダム遺伝子セットは、３０遺伝子を含有する）が、各選択されたＧＯタームでアノテートされた遺伝子（１つのＧＯタームでアノテートされた遺伝子から３０遺伝子をランダムに選ぶことによって、１ＧＯターム当たり通常約６０〜８０遺伝子）から生成される。
【００４５】
ステップ６及び７：好ましくは、すべての第１の腫瘍サブタイプトレーニングセット（例えば、実施例１において、３６のＥＲ＋トレーニングセット）（ステップ３で生成された）に対して１００万のランダム遺伝子セットを使用して、さらなる生存率スクリーニングが行われる。各トレーニングセットについて、各ランダム遺伝子セット（３０遺伝子）の発現値と患者の生存状態（「良い」又は「悪い」）の間の相関の統計的有意性が、例えば、Ｃｏｘ−Ｍａｎｔｅｌログランク検定を実行することにより、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を実施することによって検査される。１つのトレーニングセットに対して１つのランダム遺伝子セットを使用する生存率スクリーニングについて、Ｐ値が０．０５未満である場合、そのランダム遺伝子セットは、そのトレーニングセットに合格したと言われる。
【００４６】
ステップ７：すべての第１のサブタイプ（例えば、３６のＥＲ＋）トレーニングセットが、２，０００超のランダム遺伝子セットを合格させ、又は０．０５超のＰ値が、ランダムトレーニングデータセットの９０％超について得られた場合、これらの合格したランダム遺伝子セットは確保される。
【００４７】
ステップ８：ステップ７に記載の確保されたランダム遺伝子セット中の遺伝子が、合格したランダム遺伝子セット中の出現頻度に基づいてランク付けされる。
【００４８】
ステップ９：上位３０遺伝子（可能性のあるマーカーセットとして定義される）が、可能性のあるマーカーセットとして選ばれる。３０遺伝子が好適であるが、２０〜４０の間、より好ましくは２５〜３５の間、又はより好ましくは２７〜３３の間を使用することができることに留意すべきである。場合によっては、２５〜３０の個々の遺伝子発現シグナルが、スクリーニング目的のために使用される各セットにおいて望まれ、したがって、様々な入力数を、この出力を生じさせるのに使用することができる。
【００４９】
ステップ１０：ステップ５で最初に使用された同じＧＯタームを使用してステップ５が繰り返され、別の１００万の異なるランダム遺伝子セットが生成され、これらは、ステップ６及び７を繰り返すのに使用される。
【００５０】
ステップ１１：上位３０の遺伝子メンバーが、可能性のあるマーカーセット（ステップ９）中のメンバーと実質的に同じである場合、この可能性のあるマーカーセットは安定であり、実際の癌バイオマーカーセットとして使用することができることを意味する。この可能性のあるマーカーセットは、マーカーセットとして指定され（このマーカーセットは、この時点で患者に使用することができる）。２つの可能性のあるマーカーセットについての遺伝子発現シグナルが実質的に同じでない場合、これらのＧＯターム遺伝子は、バイオマーカーセットを見つけるのに不適当であるという暗示であり、この可能性のあるマーカーセットは、さらなる分析から外される。いくつかの場合では、可能性のあるマーカーセットをマーカーセットとして指定する前に、２つの潜在的なマーカー中で、３０の遺伝子発現シグナルのうち少なくとも２５が同じであることが望ましいであろう。いくつかの場合では、２つの可能性のあるマーカーセット中で、遺伝子発現シグナルの２６、２７、２８、２９、又は３０が同じであることが望ましいであろう。
【００５１】
ステップ１２：遺伝子発現シグナルの２つの他のグループ（ステップ３の）について、ステップ５〜１１がさらに２回繰り返される。したがって、３つの安定なサインセットが存在することになり、それぞれは、ステップ３からの異なるグループに関係する。
【００５２】
実施例１において、３セットのマーカー（それぞれ、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３と呼ばれ、各セットは３０遺伝子を含有する。表１を参照。）が得られ、ＥＲ＋トレーニングセット（Ｓ１−ＥＲ＋及びＳ２−ＥＲ＋）において試験された。試験プロセスが例示されている。各トレーニングセット中の試料は、３つのグループ、即ち、低リスクグループ、中間リスクグループ及び高リスクグループに分割することができる。
【００５３】
任意選択のステップ１２ｂ：実施例１で実施された任意選択のステップとして、高リスクグループをさらに階層化するためにバイオマーカーセットをさらに分析することが有用となり得る。このステップでは、高リスクグループから試料を採取し（これは、実施例１において、トレーニングセット、Ｓ２−ＥＲ＋のＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３によって階層化された）、ステップ３、４、５、６、７、及び８を繰り返すことを含む。
【００５４】
実施例１において、別の３セットのマーカー（それぞれ、ＮＲＣ−４、ＮＲＣ−５、及びＮＲＣ−６と呼ばれる）が得られた。各セットは、３０遺伝子を含有した（表１を参照）。これらのセットは、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３によって階層化された高リスクグループを対象とした。
【００５５】
ステップ１２ｃ：実験１で行われた任意選択のステップとして、第２のサブタイプの腫瘍（実施例１において、ＥＲ−腫瘍）のバイオマーカーを得るために、データセット１及び２中のすべての第２のサブタイプ試料が抽出される（例えば、それぞれ、データセット１及び２からのＥＲ−試料であり、それぞれ、Ｓ１−ＥＲ−（データセット１から抽出した）セット及びＳ２−ＥＲ−（データセット２から抽出した）セットと定義される）。３５のランダムトレーニングセットは、データセット２、サブタイプ２セット（例えば、Ｓ２−ＥＲ−セット）からＮ試料（Ｎ＝４０）をランダムに選ぶことによって生成される。「良性」腫瘍と「悪性」腫瘍の比は、全体的なデータセット２、サブタイプ２セット（Ｓ２−ＥＲ−セット）における比と同様に維持される。トレーニングセットは、上述した３５のランダムトレーニングセットに、データセット１、タイプ２（例えば、Ｓ１−ＥＲ−）を加えることによって得られる（実施例１において３６）。データセット１、サブタイプ２（例えば、Ｓ１−ＥＲ−）及びデータセット２、サブタイプ２（例えば、Ｓ２−ＥＲ−）セットを使用してステップ４が繰り返されることによって、組み合わされたデータセット、サブタイプ２（例えば、Ｓｔ−ＥＲ−）遺伝子発現シグナルリストが得られ、次いでＧＯ分析が実施される。次いで、ステップ５、６、７、及び８が繰り返される。
【００５６】
実施例１において、別の３セットのマーカー（それぞれ、ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、及びＮＲＣ−９と呼ばれる。各セットは、３０遺伝子を含有する。表１を参照。）が得られた。これらのセットは、ＥＲ−試料のために使用された。
【００５７】
試験プロセス
【００５８】
一般的な概要、実施例１：実施例１において、各マーカーセットについて、ニアレストシュランケンセントロイド（nearest shrunken centroid）分類、及びリーブワンアウト方法を使用した。次いで、本発明者らは、各試料の再発を予測するために、３つのマーカーセットを一緒に組み合わせて使用した。
【００５９】
ｎ試料を含有する所与のデータセットについて、実施例１において使用した試験プロセスは、以下（ステップごとに）のものであった。
【００６０】
ステップ１３：対象とされる試験試料について、本発明者らは、マーカーセットの遺伝子発現プロファイルを抽出した。各遺伝子発現値について、本発明者らは、そのマーカーファクターを乗じ、試験試料の修正された遺伝子発現プロファイルを得る。本発明者らは、ＰＡＭ方法（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら、ＰＮＡＳ、９９：６５６７、２００２）を使用して、マーカーセットについてのｎ−１試料から、「良性」クラス及び「悪性」クラスの両方について標準化されたセントロイドを計算した。各遺伝子のマーカーファクターをクラスセントロイドに乗じ、マーカーセットの修正されたクラスセントロイドを得る。
【００６１】
マーカーセットを使用して対象とされる試験試料の再発を予測するために、本発明者らは、試料の修正された遺伝子発現プロファイルを、これらの修正されたクラスセントロイドのそれぞれと比較する。二乗距離において、セントロイドが最も近いクラスが、その試料について予測されるクラスである。試料が「良性」腫瘍と予測される場合、試料は０と表され、そうでなければ、試料は１と表される。
【００６２】
ステップ１４：ＥＲ＋試料について、試料が、３つすべてのマーカーセットについて０として予測した場合、本発明者らは、この試料を低リスクグループに割り当て、試料が、３つすべてのマーカーセットについて１として予測した場合、本発明者らは、この試料を高リスクグループに割り当て、試料が、低リスクグループにも高リスクグループにも割り当てられない場合、本発明者らは、この試料を中間リスクグループに割り当てる。ＥＲ−試料について、試料が、３つすべてのマーカーセットについて０として予測した場合、本発明者らは、この試料を低リスクグループに割り当て、その他の場合では、本発明者らは、この試料を、高リスクグループに割り当てる。これは、不明瞭な試料を中間グループに割り当てる常套手段の修正である。侵襲性の強い癌のサブタイプの場合では、明らかに低リスクでないすべての癌を高リスクとして分類し、この癌を、通常の標準治療を超えて積極的に治療することが望ましい場合がある。
【００６３】
３つの試験データセットにおけるマーカーセットの検証
【００６４】
マーカーセットのロバスト性及び予測精度を試験するために、本発明者らは、これらの刊行物（Ｋｏｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、２００６；Ｃｈａｎｇら、ＰＮＡＳ １０２：３７３８、２００５、及びＳｏｔｉｒｉｏｕ Ｃら、Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、９８：２６２、２００６）からの３つの独立した乳癌データセットにおいてマーカーセットを試験し、合計で６４４試料を試験した。
【００６５】
ＥＲ＋試料について、各データセットにおいて、試料を、低リスクグループ（ＬＧ）、中間リスクグループ（ＭＧ）、及び高リスクグループ（ＨＧ）に階層化するために、本発明者らはまず、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３マーカーセット（上述した３つの乳癌データセットからの）をした。高リスクグループの試料が１０未満であった場合、本発明者らは、ＭＧグループとＨＧグループを混合し、混合したグループを中間リスクグループと呼んだ。そうでなければ、本発明者らは、ＮＲＣ−４、ＮＲＣ−５、及びＮＲＣ−６マーカーセットを使用して、ＨＧグループを低リスクグループ（ＮＬＧ）、中間リスクグループ（ＮＭＧ）、及び高リスクグループ（ＮＨＧ）の３つの新しいグループに階層化した。本発明者らは、ＮＬＧとＭＧを混合し、これを中間リスクグループと呼び、ＮＭＧとＮＨＧを混合して、これを高リスクグループと呼んだ。ＬＧは、低リスクグループである。本発明者らは、低リスクグループについて高い予測可能性精度（非再発患者について約９０％）を伴う非常に良好な結果を得て、３つすべての試験データセットにおいて３つのグループをうまく分類した（表２を参照）。
【００６６】
ＥＲ−試料について、各データセットにおいて、試料を低い（ＬＧ）、及び高い（ＨＧ）リスクグループに階層化するため、本発明者らは、ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、及びＮＲＣ−９マーカーセットを使用した。本発明者らは、これについても高い予測可能性精度（非再発患者について約９２〜１００％）を伴う非常に良好な結果を得、３つすべての試験データセットにおいて２つのグループをうまく分類した（表２を参照）。
【００６７】
マーカーセットを組み合わせて利用することにより、予測精度が改善される
【００６８】
ＥＲ＋試料について、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３がすべて、試料を「良性」腫瘍として予測することに一致している場合、精度は、１つのマーカーセット、例えば、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、又はＮＲＣ−３などを使用するより有意に改善された（表３）。ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、及びＮＲＣ−９がすべて、ＥＲ−試料について試料を「良性」腫瘍として予測するのに一致している場合、同じ結果が得られた（表３）。一般に、３つのマーカーセットの統合的な利用は、１つのセットを使用することに対して、予測精度が改善されることが見出される。本発明の一実施形態では、精度は、約７０％から約９０％に改善された。本発明の一実施形態では、精度は少なくとも９０％である。別の実施形態では、精度は少なくとも９５％である。
【００６９】
したがって、バイオマーカーの強力なセット、及びその使用が本明細書で提供される。
【００７０】
癌のタイプ、及び患者の状態に応じて、異なる遺伝子プロファイルが「悪性」とみなされる場合があることが理解されるであろう。転移は、癌を有する患者の治療方法を決定する際に重要な要因であると一般に考えられ、例えば、本明細書に開示されるようなバイオマーカーセットのセットは、その目的に有用である。さらに、バイオマーカーセットは、１つ又は複数の特定の薬物に十分に（又は不十分に）反応する見込みのある癌細胞タイプを同定するのに使用することができる。「良性」又は「悪性」とみなされる正確な要因に関わらず、「良性」遺伝子及び「悪性」遺伝子の両方を含有するトレーニングセットＳ１及びＳ２からこの方法を開始することが通常望ましい。高度に発現された標的はしばしば、良好な薬物標的になるため、遺伝子発現のレベルを、良好な薬物標的を同定する場合に考慮することができる。
【００７１】
一般に、低リスクグループ（「良好な予後のサイン」を有する）は、治療に進まないが、高リスクグループ（「不良の予後のサイン」を有する）は、手術に加えて治療を受けるべきである。一般に、中間リスクグループも同様に、手術に加えて治療を受けることになるが、これは、そのタイプの腫瘍についての典型的な標準治療に依存する。
【００７２】
本明細書に開示されるバイオマーカーセットのそれぞれは単独に、追加の治療の必要性を予測するのに有用であるが、全体的な予測精度は、複数のバイオマーカーセットを使用することによって、著しく改善することができる。
【００７３】
例えば、患者試料が、ＮＲＣ＿１、ＮＲＣ＿２、及びＮＲＣ＿３に対してスクリーニングされ、３つすべてのセットが、「良好な」予後を示す場合、患者は低リスクであるとみなされる。すべてが「悪性の」予後を示す場合、試料は高リスクであるとみなされる。１つ又は２つのセットが「悪性」を示し、他のセット（複数可）が「良性」を示す場合、癌は、中間リスクであるとみなされる。
【００７４】
本発明の一実施形態では、患者試料が、任意の１つのバイオマーカーセット（例えば、ＮＲＣ＿１）に関して「良性」又は「悪性」であるかを判定するために、バイオマーカーセットは、多数の患者に由来する試料を代表する２つのバンク（bank）の癌細胞を独立にスクリーニングするのに使用される。第１のバンクは、「良性」癌細胞（転移などの関心対象の挙動又は特性を示さない既知の病歴を持つ）を代表し、第２のバンクは、「悪性」癌細胞（関心対象の挙動又は特性を示す既知の病歴を持つ）を代表す。「良性」バンク及び「悪性」バンクのそれぞれは、各バイオマーカーセットについて、それぞれ、遺伝子発現サイン（「良性」腫瘍及び「悪性」腫瘍について、標準的な「良性」及び「悪性」遺伝子発現サイン）を生じさせる。患者試料について、患者試料のバイオマーカーセットの遺伝子発現サインは、そのバイオマーカーセットの標準的な「良性」及び「悪性」遺伝子発現サインと比較される。そのバイオマーカーセットの標準的な「悪性」サインと最も密接に類似する患者試料は、「悪性」とみなされ、そのバイオマーカーセットの標準的な「良性」サインと最も密接に類似する患者試料は、「良性」とみなされる。
【００７５】
本方法は、いくつかの場合では、以下の癌バイオマーカーセット、即ち、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、ＮＲＣ−３、ＮＲＣ−４、ＮＲＣ−５、ＮＲＣ−６、ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、ＮＲＣ−９のうちの１つ又は複数を組み合わせて使用することを含む。
【００７６】
サブタイプが同定された場合（この例ではＥＲ＋／ＥＲ−）の本方法の使用についての１つの可能な手法の例：
癌細胞の腫瘍試料についてＥＲ状態が判断される。（これは、臨床の場において行われることが多い）
ＥＲ＋試料について、試料が、３つすべてのマーカーセット（ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３）について「良性」と予測された場合、試料は、低リスクグループに割り当てられ、試料が、３つすべてのマーカーセットについて「悪性」と予測された場合、試料は、高リスクグループに割り当てられ、試料が、低リスクグループにも、高リスクグループにも割り当てられない場合、試料は、中間リスクグループに割り当てられる。
マーカーセット（ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３）によって定義されるＥＲ＋高リスクグループについては、マーカーセット（ＮＲＣ−４、ＮＲＣ−５、及びＮＲＣ−６）を使用して再び予測される。試料が、３つすべてのマーカーセットについて「悪性」であると予測された場合、試料は、高リスクグループに割り当てられる。そうでなければ、試料は、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３によって定義される中間リスクグループに割り当てられる。
ＥＲ−試料について、試料は、３つすべてのマーカーセット（ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、及びＮＲＣ−９）について「良性」と予測された場合、低リスクグループに割り当てられ、そうでなければ、試料は、高リスクグループに割り当てられる。
【００７７】
本発明の一実施形態では、手術に加えて追加の癌治療が有益である患者の見込みを評価する方法が提供され、該方法は、
マイクロアレイ遺伝子チップ上にマーカーセットの遺伝子プローブをプリントするステップと、
腫瘍試料からメッセンジャーＲＮＡを抽出するステップと、
マイクロアレイ遺伝子チップ上にこのメッセンジャーＲＮＡをハイブリダイズするステップと、
ハイブリダイズされたマイクロアレイチップを走査することによって、試料のマーカー遺伝子のすべての読み取り値を得るステップと、
読み取り値を正規化するステップと、
試料の各マーカーセットの遺伝子発現プロファイルを構築するステップと、
予測を行うために各マーカーセットの遺伝子発現プロファイルを、標準的な（「良性」及び「悪性」として知られる）腫瘍試料の遺伝子発現プロファイルと相関させるステップと
を含む。
【００７８】
マイクロアレイ遺伝子チップの作製、走査及びアレイデータの正規化に関する詳細な情報は、Ａｇｉｌｅｎｔ社のウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｅｎ−ＵＳ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／ｄｎａｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ／ｐａｇｅｓ／ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘ．、及び公的に利用可能な文献に見出すことができる。
【００７９】
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
【表１−６】
【表１−７】
【表１−８】
【００８０】
注：この表に列挙された各遺伝子についてのメッセンジャーＲＮＡ配列は、この文書の最後に添付されている。表１中の各遺伝子についてのすべてのメッセンジャーＲＮＡ配列は、公開データベースであるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から抽出される。
【００８１】
配列の形式は、ＦＡＳＴＡ形式である。ＦＡＳＴＡ形式における配列は、１行の説明から始まり、その後に配列データの行が続く。説明行は、第１列の超（「＞」）記号によって、配列データと区別される。
【００８２】
ＦＡＳＴＡにおける配列の例：
【００８３】
【化１】
【００８４】
説明の行において、第１の項目である６０１９は、ＮＣＢＩ ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ ＩＤであり、これは、表１の第１列中のＩＤであり、記号（「｜」）の後の別の項目は、ＮＣＢＩ参照メッセンジャーＲＮＡ配列ＩＤである。１つのＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ ＩＤは、いくつかの参照メッセンジャーＲＮＡ配列を有することができることに留意すべきである。この場合、１つのＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ ＩＤに対するすべてのメッセンジャーＲＮＡ配列が列挙される。各配列は、１つの参照メッセンジャーＲＮＡ配列を表す。
【００８５】
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【表２−４】
【表２−５】
【表２−６】
【表２−７】
【００８６】
【表３】
【００８７】
注：＊元の試験セット１中に２９５試料が存在する。しかし、このセットは、ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ ら、Ｎａｔｕｒｅ、４１５：５３０、２００２からのものである７６試料を含む。本発明者らは、トレーニングセットとしてｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒのデータセット（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４１５：５３０、２００２）を使用したので、次いで、２９５試料からこれらの７６試料を除いた。したがって、試験セット１は、２１９試料を含有する。
【００８８】
１．Ｎは、試料数を表す
２．Ｒは、グループ中の試料数と試験セットの合計試料数との比を表す
３．Ｒ１は、非再発を有する試料の百分率（精度）を表す
４．Ｒ２は、再発を有する試料の百分率（精度）を表す
５．試験セット１は、Ｃｈａｎｇら、ＰＮＡＳ、２００５からのものである
６．試験セット２は、Ｋｏｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、２００６からのものである
７．試験セット３は、Ｓｏｔｉｒｉｏｕら、Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、９８：２６２、２００６からのものである
【００８９】
【表４】
【００９０】
注：使用したデータセットは、表２中のデータセットと同じである。
【００９１】
【表５−１】
【表５−２】
【表５−３】
【表５−４】
【表５−５】
【表５−６】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、癌バイオマーカー、並びに癌バイオマーカーの同定及び使用のための方法の分野に関する。
【発明の背景】
【０００２】
癌についてより多くを理解するほど、より有効に癌を治療することができる。例えば、ほとんどの癌患者には、手術が行われる。しかし、一部の患者について、追加の治療を用いてさらなる利益が可能となり得る。術後の追加の療法（化学療法など）が有益である癌患者を判定するための満足のゆく手法は、現在のところ存在しない。予後予測のために使用することができる、癌細胞に特異的な遺伝子及びタンパク質の同定は、この点において役立つ。手術とその後の典型的な標準治療によってのみ治療される場合、回復についての予後不良に関連する腫瘍を同定するこれらの遺伝子／タンパク質は、予後不良バイオマーカーと呼ばれる。これらのバイオマーカーは、癌を診断した後の生存率を予測するため、術後の化学療法及び／又は放射線療法を行わずに、又は術後の典型的な標準治療処置のみを用いて、患者の経過が同様、又はより良好であるような、再発のリスクが十分に低い患者を識別するため、並びに最良の転帰を得るのに腫瘍学者が癌を治療するためにとるべき方法を誘導するための有益なツールとして使用することができる。
【０００３】
同様に、薬物反応において役割を果たす、癌において発現される遺伝子が存在する。臨床的な決定をする際、予測された薬物反応に対する情報を有することは有用である。
【０００４】
臨床的に興味を引く、十分な精度を有するスクリーニングツールを提供するために、好ましくは、１つのタイプの癌について複数のマーカーを考慮するべきである。１つの遺伝子マーカーは、十分なレベルの特異性及び感度をもたらさない。例として、２５，０００を超える遺伝子を同時に測定することができるマイクロアレイ技術は、複数のマーカーを見出すために有用なツールを提供する。
【０００５】
本発明の目的は、対象とする腫瘍特性を同定するのに使用するためのマーカーのセット、並びにこれらのマーカーセットの同定及び使用のための方法を提供することである。
【発明の概要】
【０００６】
一実施形態における本発明は、遺伝子のグループに基づいて、「良性」と「悪性」の腫瘍を区別するための、遺伝子発現プロファイルの利用を教示する。本明細書で使用する場合、予測因子及び患者生存率を参照する際、用語「良性腫瘍」は、化学療法又は放射線療法を用いずに（これが典型的な標準治療の一部であっても）、手術及び単に典型的な標準治療によって治癒する見込みのある腫瘍を指す。本明細書で使用する場合、用語「悪性腫瘍」は、手術、及び化学療法又は放射線療法を含む、単に典型的な標準治療によって治癒する見込みのない腫瘍を指す。本明細書で使用する場合、患者が、手術をして５年又は１０年以内に、腫瘍の再発（又は腫瘍の転移）を経験していない場合、腫瘍は「治癒」している。
【０００７】
発現プロファイルが「良性」と「悪性」の腫瘍を区別することができる遺伝子のセットを同定することが可能である。先行技術により、５つのそのような遺伝子発現シグナルセットが開示されており、これらは、乳癌試料についてのバイオマーカーとして開発された。各遺伝子発現シグナルセットは、一連の乳房腫瘍試料から得られた。しかし、これらの５つのバイオマーカーセットは、交差使用（ｃｒｏｓｓ−ｕｓｅｄ）ができない。具体的には、先行技術のいわゆる「乳癌バイオマーカー」は、別のセットの乳房腫瘍試料において使用される場合、予後を一貫して予測するものとして認められていない。他のタイプの癌についてのバイオマーカーも、同じ問題を有する。癌は、非常に不均質である。しばしば、１つのタイプの癌について、いくつかのサブタイプが見出される場合がある。以前に開示されたマーカーセットは、これらのサブタイプについて十分に万能でない。
【０００８】
これらの問題、及びデータセット（試料）利用可能性の制限を克服するために、バイオマーカーのセットを見つけ、使用するための新しい手法が開発された。
【０００９】
本発明の一実施形態では、バイオマーカーの強力なセットを見出すため、患者の遺伝子発現プロファイル及び臨床情報が含まれていた、公開されている癌データセットからランダムトレーニングデータセットが生成された。ランダムトレーニングデータセットの遺伝子発現プロファイルは、患者生存状態及びスクリーニングバイオマーカーと相関させた。
【００１０】
本発明の一実施形態では、バイオマーカーを同定する方法であって、
現在利用可能なデータセット（腫瘍マイクロアレイプロファイリング＋癌患者の臨床情報）からランダムトレーニングデータセットを生成するステップと、
予後についての予測力を有する遺伝子発現シグナルセットを同定するために、ランダムトレーニングデータセットについて遺伝子発現シグナルセットをスクリーニングするステップと、
遺伝子が、良好な予測力を有する遺伝子発現シグナルセットにおいて出現した頻度に基づいて（直前のステップのスクリーニングによって）遺伝子をランク付けし、それによってバイオマーカーセットを構築するステップと、
予測のための、３〜６のバイオマーカーセットの組み合わせ利用（即ち、試料Ａが、３つすべてのバイオマーカーセットによって、「良性腫瘍」として予測される場合、本発明者らは、試料Ａは、「良性腫瘍」（低リスク）であるとし、すべてのバイオマーカーセットが「悪性」とする場合、本発明者らは、試料Ａは、「悪性」（高リスク）であるとし、そうでなければ、本発明者らは、試料Ａは中間リスクのものであるとする）ステップと、
他の独立したデータセットを使用してマーカーを検証するステップと
を含む方法が提供される。
【００１１】
「遺伝子発現シグナル」は、ｍＲＮＡ又はタンパク質などの遺伝子の発現の有形の指標である。
【００１２】
本発明の一実施形態では、腫瘍特性を同定するための方法であって、以下のステップ、 １）対象とする特性をそれぞれ予測する３つの異なるマーカーセットを得るステップと、
２）腫瘍細胞から遺伝子発現シグナルを抽出するステップと、
３）抽出された遺伝子発現シグナルを、３つの異なるマーカーセットと相関させるステップと、
４）以下の、
ａ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍が関心対象の特性を有すると予測する場合、腫瘍は悪性腫瘍と指定される、
ｂ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍が関心対象の特性を欠いていると予測する場合、腫瘍は、良性腫瘍と指定される、
ｃ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、同じ臨床転帰予測をもたらさない場合、腫瘍は、「中間」と指定される
というランク付けに従って、抽出された遺伝子発現シグナルに値を割り当てるステップと
を含む方法が提供される。
【００１３】
いくつかの場合では、関心対象の特性は、転移、炎症、細胞周期、免疫応答遺伝子、薬剤耐性遺伝子、及び多剤耐性遺伝子のうちの１つ又は複数に関係する。いくつかの場合では、腫瘍特性によって、特定の治療又は治療の組合せが決定する。
【００１４】
いくつかの場合では、腫瘍特性は、術後の患者生存率不良をもたらす傾向である。
【００１５】
いくつかの場合では、腫瘍特性は、患者の生存率に関係し、上記方法のステップ４は、以下の、
ａ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍を悪性腫瘍であると予測する場合、腫瘍は、悪性腫瘍と指定され、典型的な標準治療よりも積極的な治療が推奨される、
ｂ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍を良性腫瘍であると予測する場合、標準治療の範囲を超える治療は推奨されず、術後の化学療法も放射線療法も推奨されない、
ｃ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、同じ予後をもたらさない場合、腫瘍は、「中間」と指定され、化学療法及び／又は放射線療法を含む、完全な典型的な標準治療処置が推奨される、
というランク付けに従って、抽出された遺伝子発現シグナルに値を割り当てるステップを含む。
【００１６】
癌が複数のサブタイプを有する場合には、
ａ）検査される腫瘍サブタイプを同定するステップ、
ｂ）その腫瘍サブタイプに特異的なマーカーセットを選択するステップ
という予備ステップを含むことが望ましい場合がある。
【００１７】
いくつかの場合では、対象とする腫瘍特性は、腫瘍が化学療法剤又は放射線などの特定の治療に応答する傾向である。そのような場合では、遺伝子発現シグナルは、トレーニングセットを開発するプロセスにおいて、腫瘍薬物反応と相関する。特定の薬物に対する「良性」の腫瘍の応答は、治療後に、平均未満の腫瘍生存率となり、「悪性」の応答は、治療後に、平均を超える腫瘍生存率となることが理解されるであろう。この手法を使用して、元の腫瘍に関して利用可能な詳細、及びトレーニングセットを開発するのに使用される臨床的データに応じて、個々の薬物又は治療に対する応答についてだけでなく、治療の組合せに対する応答のマーカーを開発することが可能である（これを可能にするのに、元の情報源に十分なデータが存在する場合）。
【００１８】
本発明の一実施形態では、上述した方法において有用なタイプの予測遺伝子発現シグナルセットを決定するための方法であって、以下のステップ、
１）対象とする癌について既知の腫瘍集団に関する対象とする特性についての、遺伝子発現シグナル情報及び患者の臨床情報を得るステップと、
２）遺伝子発現シグナルを、対象とする特性に関する臨床患者情報と相関させて、臨床転帰についての予測力を有する遺伝子を同定するステップと、
３）ステップ１から少なくとも３０のランダムトレーニングデータセットを作るステップと、
４）ステップ３の同定された遺伝子発現シグナルを、癌において活性な既知の遺伝子のリストと比較するステップと、
５）既知の癌遺伝子のリスト上の遺伝子発現シグナルに対応する、同定された遺伝子発現シグナルを選択するステップと、
６）生物学的プロセスにおけるその役割によって、選択された、同定された遺伝子発現シグナルをグループ化するステップと、
７）ステップ６の選択された遺伝子発現シグナルグループから、少なくとも２５遺伝子のランダム遺伝子発現シグナルセットを生成するステップと、
８）ランダム遺伝子発現シグナルセットを、ステップ３のランダムトレーニングデータセットと相関させるステップと、
９）ステップ７の各遺伝子発現シグナルセットについての相関から、生存率スクリーニング（survival screening）についてのＰ値を得るステップと、
１０）遺伝子発現シグナルセットのＰ値が、ランダムトレーニングデータセットの９０％超について０．０５未満である場合、この遺伝子発現シグナルセットを確保するステップと、
１１）セット内の遺伝子出現の頻度に基づいて、ステップ１０において確保されたランダム遺伝子発現シグナルセットをランク付けするステップと、
１２）可能性のある候補マーカーとして、少なくとも上位２６遺伝子を選択するステップと、
１３）ステップ７〜１２を繰り返し、別の独立した、少なくとも２６遺伝子のランクセットを作製するステップと、
１４）ステップ１２及びステップ１３からの上位遺伝子を比較するステップと、
１５）２５を超える遺伝子が同じである場合、この上位遺伝子がマーカーセットとして確保されるステップと、
１６）ステップ７〜１５を２回繰り返して、３つの異なるマーカーセットを得るステップと、
を含む方法が提供される。
【００１９】
本発明の一実施形態では、典型的な標準治療よりも積極的、又は消極的な治療を必要とする患者を識別する方法であって、
「遺伝子発現シグナル」は、ｍＲＮＡなどの遺伝子の発現の有形の指標である（理論上、そうすることが技術的に実現可能である場合、代わりにタンパク質発現を測定することができるか？他に何かあるか？）
１．腫瘍情報及び臨床患者情報を含む情報源が、個々に試験される。どの遺伝子が、その個々の情報源内で予後についての予測力を有するかを識別するために、細胞内のすべての報告された遺伝子発現シグナルが、患者の生存率（５年及び１０年）と相関される。患者の生存率と有意に相関すると見出された遺伝子発現シグナルが、さらなる検査のために同定される。
２．ステップ１において同定された遺伝子発現シグナルは、既知の癌遺伝子のリストと比較され、癌において役割を有することが知られている既知の遺伝子に対応する遺伝子発現シグナルが、さらなる分析のために選択される。（これは、一般には、数百〜数千の遺伝子発現シグナルのリストを生じさせることになる）
３．少なくとも３０（一般に３０〜４０の間）のランダムトレーニングデータセットが、ステップ１の情報源から作製される。同じ個々の遺伝子発現シグナルが、複数のランダムトレーニングデータセット中に出現する場合がある。
４．ステップ２において選択された遺伝子発現シグナルは、生物学的プロセスにおけるその役割に従ってグループ化される（例えば、細胞周期遺伝子、細胞死遺伝子、免疫応答遺伝子、炎症遺伝子などＧＯ解析）。
５．ランダム遺伝子発現シグナルセット（一般に、約百万）が生成され、それぞれは、ステップ３において作製された１つのグループからランダムに選択された約３０の遺伝子を含有する。
６．各ランダムトレーニングデータセットに対する、ステップ４の各ランダム遺伝子発現シグナルセットの生存率スクリーニングについてのＰ値が得られる。もう少しこの相関について記述してもらえないか？
７．Ｐ値が、ランダムデータセットの９０％超について０．０５未満である場合、このランダム遺伝子セットは確保される。
８．ステップ７からの確保されたランダム遺伝子発現シグナルセットは、これらにおいて出現する遺伝子の頻度に基づいてランク付けされる。
９．ステップ８において決定された、最高の予測値を有する上位３０遺伝子（ステップ８でランク付けされた）が、可能性のある候補として選択される。
１０．ステップ５〜９が繰り返され、ステップ３において形成された各グループからランダム遺伝子発現シグナルセットを生成することから開始して、可能性のある候補である上位３０遺伝子の別の、独立したランク付けされたセットを作製する。
１１．ステップ１０において生じた上位３０遺伝子が、ステップ９からの上位３０遺伝子と比較される。３０のうち２５以上が同じである場合、これは、「安定なサイン」と呼ばれ、患者試料のスクリーニングに有用である。２５／３０未満が同じである場合、データは破棄される（両セットの可能性のある候補から）。少なくとも２５が必要であり、したがって、潜在的な候補の第１又は第２のセットを使用することができる。
１２．ステップ５〜１１が、遺伝子発現シグナルの２つの他のグループ（ステップ３の）のために、さらに２回繰り返される。したがって、ステップ３からの異なるグループにそれぞれ関係する、３つのセットの安定なサインが存在することになる。
１３．患者からの癌細胞を検査して、その遺伝子発現活性、及び３つの安定なサイン中の遺伝子発現シグナルとのその活性の相関を評価する。典型的に、安定なサインは、転移の見込みの暗示となり、したがって、そのサインに整合する高い患者発現は、「悪性」腫瘍を示すことになる。しかし、安定なサインは、アポトーシス遺伝子などの発現されている保護遺伝子を示す場合があることもあり得、この場合、そのサインについて、こうした遺伝子発現サインの高い患者発現量は、「良性」腫瘍を示す。いずれの場合においても、各安定なサインは、患者試料と比較され、「良性」腫瘍又は「悪性」腫瘍の予測は、各安定なサインによって個々に行われる。１つの安定なサインからの「悪性」又は「良性」の暗示についての境界は何か？例えば、サイン中に見出される遺伝子の５０％超が、試料中に発現される場合、「悪性」か？サイン中に見出される遺伝子の５０％超が、対応する非癌組織における正常な基礎レベルを超えて発現される場合、「悪性」か？
１４．患者試料に関する遺伝子発現シグナルの３つのセットのそれぞれの予測を合わせ、以下、
（ａ）３つすべての遺伝子発現シグナルセット（サイン）が、腫瘍を悪性腫瘍であると予測する場合、腫瘍は、悪性腫瘍と指定され、患者は、典型的な標準治療よりも積極的な治療が提供されるべきであり、
（ｂ）３つすべてのデータセットが、腫瘍を良性腫瘍であると予測する場合、患者は、標準治療以外の治療を受けるべきでなく、術後の化学療法も放射線療法も受けるべきでなく、
（ｃ）３つすべてのセットの遺伝子発現産物が、同じ予後をもたらさない場合、腫瘍は、「中間」と指定され、患者は、化学療法及び／又は放射線療法を含む、完全な典型的な標準治療処置を受けるべきであるように腫瘍に値を割り当てるステップ
を含む方法が提供される。
【００２０】
いくつかの場合では、この方法について、生物学的プロセスにおけるその役割によって、遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）分析を使用して、選択された、同定された遺伝子発現シグナルをグループ化することが望ましいであろう。
【００２１】
３０〜５０の間のランダムトレーニングセットが作られることが好ましい。３０〜４０の間のトレーニングセットが作られることがより好ましい。
【００２２】
転移、細胞増殖、腫瘍血管新生、及び薬物反応に関与する遺伝子のグループから、癌において活性であることが知られている遺伝子を選択することが、時には望ましいであろう。
【００２３】
上述した方法を伴う本発明のいくつかの実施形態では、ステップ７において、約７５０，０００〜１，２５０，０００の間、又は約９００，０００〜１，１００，０００の間、又は約１００万のランダム遺伝子発現シグナルセットが生成される。上記方法において記載されたような本発明のいくつかの実施形態では、ステップ７において、生成されたランダム遺伝子発現シグナルセットは、約２５〜５０の間、又は２８〜３２、又は約３０の遺伝子を含有する。
【００２４】
上記方法において記載されたような本発明の一実施形態では、ステップ１２において、上位２６〜５０、又は２８〜３２、又は約３０の遺伝子が選択される。
【００２５】
いくつかの場合では、患者生存率に関係する腫瘍特性を考慮する場合、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、ＮＲＣ−３、ＮＲＣ−４、ＮＲＣ−５、ＮＲＣ−６、ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、及びＮＲＣ−９から本質的になるリストから選択される少なくとも１つの癌バイオマーカーセットを使用することが望ましいであろう。
【００２６】
本発明の一実施形態では、対象とする腫瘍特性を同定するために、上述した方法を実施するための少なくとも３つのマーカーセット及び使用説明書を含むキットが提供される。いくつかの場合では、キットは、表１Ａ又は１Ｂ中に列挙された少なくとも１０の遺伝子発現シグナルを含むことになる。いくつかの場合では、キットは、上述した方法に従って同定された、少なくとも３０の核酸バイオマーカーを含むことになる。
【００２７】
本発明の一実施形態では、対象とする１つ又は複数の腫瘍特性の同定における、表１Ａ又は１Ｂ中の遺伝子発現シグナルのいずれかの使用が提供される。いくつかの場合では、少なくとも３つの異なるマーカーセットが使用され、いくつかの場合では、少なくとも１、２、又は３つのマーカーセットは表１Ａ又は１Ｂ中に見出される遺伝子発現シグナルの少なくとも１、５、１０、２０、又は２５を含む。いくつかの場合では、各マーカーセットは、表１Ａ又は１Ｂ中に見出される遺伝子発現シグナルの少なくとも１、５、１０、２０、又は２５を含有する。
【００２８】
本発明の一実施形態では、癌バイオマーカーは乳癌バイオマーカーであり、第１のサブタイプの試料はＥＲ＋試料である。
【００２９】
本発明の一実施形態では、上述した方法において、ランダムトレーニングセットは、選ばれる方のセットと同じ「良性」腫瘍と「悪性」腫瘍の比を維持しながら、試料をランダムに選ぶことによって生成される。
【００３０】
いくつかの場合では、対象とする腫瘍特性（複数可）は、患者生存率（例えば、手術及び典型的な標準治療後の）に関係することになり、そのような場合では、本方法を典型的な標準治療よりも積極的又は消極的な治療を必要とする患者を識別するためにしようすることができる。（化学療法及び放射線療法は、それ自体では危険である。したがって、これらの療法を必要としない患者に、そのような治療を提供するのを回避することが最良である。）
【００３１】
いくつかの場合では、遺伝子発現シグナル（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質）を抽出し、対象とする遺伝子発現シグナルに特異的なレポーターを使用して、対象とする遺伝子発現シグナルの存在（いくつかの場合では、レベル）をアッセイすることによって、患者の腫瘍組織を試験することが望ましいであろう。これは、複数の遺伝子発現シグナルの検査を本質的に同時に可能にするマイクロアレイ形式で行うことができる。レポーターは、対象とする核酸配列に結合するプローブ、対象とするタンパク質に特異的な抗体、又は任意の他のそのような物質とすることができる（多くのそのようなレポーターは、当技術分野において公知であり、日常的に使用される）。レポーターは、試料の変化を生じさせ、対象とする遺伝子発現シグナルの評価を可能にする。いくつかの場合では、生じる変化は、試料の光学的側面の変化である場合があり、他の場合では、変化は、試料の放射性特性又は蛍光特性などの試料の別のアッセイ可能な側面の変化である場合がある。
【００３２】
特定のタイプの癌が、1つ以上のサブタイプ（例えば、ＥＲ＋及びＥＲ−乳癌）を有する状況では、患者の癌をサブタイプによって最初にグループ化し、次いでグループ化されたサブタイプに関連して作製されたマーカーを使用することが好ましいであろう。
【００３３】
いくつかの場合では、対象とする腫瘍特性（複数可）は、特定の治療（複数可）に対する腫瘍の応答に関係し、そのような場合では、本方法は、腫瘍を有する患者にとって有望な治療手法（１つ若しくは複数の化学療法、又は治療の組合せ）を特定するために使用することできる。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「腫瘍」は、患者において破壊又は中和することが望ましい任意の癌細胞を含む。例えば、腫瘍は、固形腫瘍、骨髄腫、リンパ腫、及び白血病において見出される癌細胞を含むことができる。
【００３５】
腫瘍は一般に、哺乳動物又はトリの腫瘍であり、ヒト、類人猿、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ニワトリ、アヒル、又はガチョウの腫瘍であってもよい。
【００３６】
遺伝子発現シグナルの３つの独立したセットを組み合わせて使用することは、本明細書に記載される手法によって作製される遺伝子発現シグナルに限定されず、商業的に販売され、又は文献に報告されている癌バイオマーカーデータセットに適用することもできることが明らかとなるであろう。（最終的なスクリーニング結果の信頼性は、使用されるセットのロバスト性にある程度依存することになるが、したがって、強力な癌バイオマーカーデータセットを使用することが推奨される）。場合によっては、異なる生物学的プロセスに関与する遺伝子を含む癌バイオマーカーデータセット（例えば、１つのデータセットは、炎症に関係することができ、別のデータセットは、細胞周期に関係してもよく、第３のデータセットは転移に関係してもよい）を選択することが望ましいであろう。
【００３７】
本方法は、一般的であり、任意のタイプの癌に適用することができる。例えば、本方法は、表４に列挙された癌タイプに関して有用である。
【００３８】
本発明の一実施形態では、本方法は、乳癌患者を、手術後にどれぐらい積極的に治療すべきかを判定するのに適用される。
【００３９】
本方法の一実施形態を、実施例１の説明と並行して以下に提供する：
【００４０】
ステップ１：癌細胞遺伝子マイクロアレイデータ、及び腫瘍患者の生存率情報を使用して、自動生存率スクリーニング法を開発するステップ。（非限定例として、公開されている乳癌データセット（２９５試料、Ｃｈａｎｇら、ＰＮＡＳ １０２：３７３８、２００５）をスクリーニングするために、表面タンパク質及び分泌タンパク質が、ＪＭ０１細胞株（マウス乳癌細胞株、インハウス細胞株及びデータ）のマイクロアレイデータから同定された）。用語「生存率スクリーニング」は、Ｃｏｘ−Ｍａｎｔｅｌログランク検定を実行することにより、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を実施することによる、各１つの遺伝子発現値と患者の生存状態（「良い」又は「悪い」）の間の相関の統計的有意性の検査として定義される（Ｃｕｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：１５２、２００７）。このスクリーニングから、それぞれ単独で「良性」腫瘍及び「悪性」腫瘍を区別することができる７つのタンパク質が得られた。例として、実施例１の一部において、元の細胞株において実験的検証するために、タンパク質（ＭＭＰ９）が選択された。ＭＭＰ９抗体を細胞株に適用する場合、癌進行における上皮間葉移行が遮断された。この結果は、本方法は、転移関連遺伝子を見出すのに適していることを示す。
【００４１】
ステップ２：発現値が乳癌患者生存率と相関する遺伝子のゲノム全体での生存率スクリーニングを行うステップが行われた。（実施例１において、データセット１（７８試料、ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２）、及びデータセット２（２８６試料、Ｗａｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ、３６５：６７１、２００５）として定義された２つのトレーニングデータセットが使用された）。得られる遺伝子発現シグナルリストはそれぞれ、Ｓ１、及びＳ２と呼ばれる。これらの２つのリストの全遺伝子は、Ｓｔ遺伝子発現シグナルリスト（Ｓｔ＝Ｓ１＋Ｓ２）と呼ばれる。
【００４２】
ステップ３：対象とする癌が複数のサブタイプを有する場合、第１のサブタイプのマーカーが生成される。（例えば、実施例１において、ＥＲ＋及びＥＲ−マーカーが生成された）。実施例１において、ＥＲ＋腫瘍マーカーは、上記データセットからすべてのＥＲ＋試料を抽出することによって生成され、それぞれ、Ｓ１−ＥＲ＋セット（データセット１から抽出された）及びＳ２−ＥＲ＋セット（データセット２から抽出された）と定義された。Ｓ２−ＥＲ＋セットからＮ個の試料（Ｎ＝６０）をランダムに選ぶことによって、３５個のランダムトレーニングセットが生成される。「良性」腫瘍と「悪性」腫瘍の比は、Ｓ２−ＥＲ＋セットにおける比と本質的に同じに保存される。上述した３５のランダムトレーニングセットにＳ１−ＥＲ＋を加えることによって、３６のトレーニングセットが得られる。
【００４３】
ステップ４：ステップ２の繰り返しを含むが、第１の腫瘍サブタイプについてのサブセット、例えば、実施例１におけるＳ１−ＥＲ＋セット及びＳ２−ＥＲ＋セットのデータセットを使用する、ゲノム全体での生存率スクリーニングによって、遺伝子発現シグナルリスト（実施例１において、Ｓｔ−ＥＲ＋遺伝子発現シグナルリスト）を得るステップ。Ｓｔ−ＥＲ＋遺伝子発現シグナルリストを使用して、遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析（ＧＯアノテーションソフトウェア、Ｄａｖｉｄ、ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／を使用して）が実施され、癌に関連することが知られているＧＯターム、例えば、細胞周期、細胞死などに属する遺伝子のみが、さらなるマーカースクリーニングのために使用される。
【００４４】
ステップ５：１００万の異なるランダム遺伝子セット（各ランダム遺伝子セットは、３０遺伝子を含有する）が、各選択されたＧＯタームでアノテートされた遺伝子（１つのＧＯタームでアノテートされた遺伝子から３０遺伝子をランダムに選ぶことによって、１ＧＯターム当たり通常約６０〜８０遺伝子）から生成される。
【００４５】
ステップ６及び７：好ましくは、すべての第１の腫瘍サブタイプトレーニングセット（例えば、実施例１において、３６のＥＲ＋トレーニングセット）（ステップ３で生成された）に対して１００万のランダム遺伝子セットを使用して、さらなる生存率スクリーニングが行われる。各トレーニングセットについて、各ランダム遺伝子セット（３０遺伝子）の発現値と患者の生存状態（「良い」又は「悪い」）の間の相関の統計的有意性が、例えば、Ｃｏｘ−Ｍａｎｔｅｌログランク検定を実行することにより、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を実施することによって検査される。１つのトレーニングセットに対して１つのランダム遺伝子セットを使用する生存率スクリーニングについて、Ｐ値が０．０５未満である場合、そのランダム遺伝子セットは、そのトレーニングセットに合格したと言われる。
【００４６】
ステップ７：すべての第１のサブタイプ（例えば、３６のＥＲ＋）トレーニングセットが、２，０００超のランダム遺伝子セットを合格させ、又は０．０５超のＰ値が、ランダムトレーニングデータセットの９０％超について得られた場合、これらの合格したランダム遺伝子セットは確保される。
【００４７】
ステップ８：ステップ７に記載の確保されたランダム遺伝子セット中の遺伝子が、合格したランダム遺伝子セット中の出現頻度に基づいてランク付けされる。
【００４８】
ステップ９：上位３０遺伝子（可能性のあるマーカーセットとして定義される）が、可能性のあるマーカーセットとして選ばれる。３０遺伝子が好適であるが、２０〜４０の間、より好ましくは２５〜３５の間、又はより好ましくは２７〜３３の間を使用することができることに留意すべきである。場合によっては、２５〜３０の個々の遺伝子発現シグナルが、スクリーニング目的のために使用される各セットにおいて望まれ、したがって、様々な入力数を、この出力を生じさせるのに使用することができる。
【００４９】
ステップ１０：ステップ５で最初に使用された同じＧＯタームを使用してステップ５が繰り返され、別の１００万の異なるランダム遺伝子セットが生成され、これらは、ステップ６及び７を繰り返すのに使用される。
【００５０】
ステップ１１：上位３０の遺伝子メンバーが、可能性のあるマーカーセット（ステップ９）中のメンバーと実質的に同じである場合、この可能性のあるマーカーセットは安定であり、実際の癌バイオマーカーセットとして使用することができることを意味する。この可能性のあるマーカーセットは、マーカーセットとして指定され（このマーカーセットは、この時点で患者に使用することができる）。２つの可能性のあるマーカーセットについての遺伝子発現シグナルが実質的に同じでない場合、これらのＧＯターム遺伝子は、バイオマーカーセットを見つけるのに不適当であるという暗示であり、この可能性のあるマーカーセットは、さらなる分析から外される。いくつかの場合では、可能性のあるマーカーセットをマーカーセットとして指定する前に、２つの潜在的なマーカー中で、３０の遺伝子発現シグナルのうち少なくとも２５が同じであることが望ましいであろう。いくつかの場合では、２つの可能性のあるマーカーセット中で、遺伝子発現シグナルの２６、２７、２８、２９、又は３０が同じであることが望ましいであろう。
【００５１】
ステップ１２：遺伝子発現シグナルの２つの他のグループ（ステップ３の）について、ステップ５〜１１がさらに２回繰り返される。したがって、３つの安定なサインセットが存在することになり、それぞれは、ステップ３からの異なるグループに関係する。
【００５２】
実施例１において、３セットのマーカー（それぞれ、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３と呼ばれ、各セットは３０遺伝子を含有する。表１を参照。）が得られ、ＥＲ＋トレーニングセット（Ｓ１−ＥＲ＋及びＳ２−ＥＲ＋）において試験された。試験プロセスが例示されている。各トレーニングセット中の試料は、３つのグループ、即ち、低リスクグループ、中間リスクグループ及び高リスクグループに分割することができる。
【００５３】
任意選択のステップ１２ｂ：実施例１で実施された任意選択のステップとして、高リスクグループをさらに階層化するためにバイオマーカーセットをさらに分析することが有用となり得る。このステップでは、高リスクグループから試料を採取し（これは、実施例１において、トレーニングセット、Ｓ２−ＥＲ＋のＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３によって階層化された）、ステップ３、４、５、６、７、及び８を繰り返すことを含む。
【００５４】
実施例１において、別の３セットのマーカー（それぞれ、ＮＲＣ−４、ＮＲＣ−５、及びＮＲＣ−６と呼ばれる）が得られた。各セットは、３０遺伝子を含有した（表１を参照）。これらのセットは、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３によって階層化された高リスクグループを対象とした。
【００５５】
ステップ１２ｃ：実験１で行われた任意選択のステップとして、第２のサブタイプの腫瘍（実施例１において、ＥＲ−腫瘍）のバイオマーカーを得るために、データセット１及び２中のすべての第２のサブタイプ試料が抽出される（例えば、それぞれ、データセット１及び２からのＥＲ−試料であり、それぞれ、Ｓ１−ＥＲ−（データセット１から抽出した）セット及びＳ２−ＥＲ−（データセット２から抽出した）セットと定義される）。３５のランダムトレーニングセットは、データセット２、サブタイプ２セット（例えば、Ｓ２−ＥＲ−セット）からＮ試料（Ｎ＝４０）をランダムに選ぶことによって生成される。「良性」腫瘍と「悪性」腫瘍の比は、全体的なデータセット２、サブタイプ２セット（Ｓ２−ＥＲ−セット）における比と同様に維持される。トレーニングセットは、上述した３５のランダムトレーニングセットに、データセット１、タイプ２（例えば、Ｓ１−ＥＲ−）を加えることによって得られる（実施例１において３６）。データセット１、サブタイプ２（例えば、Ｓ１−ＥＲ−）及びデータセット２、サブタイプ２（例えば、Ｓ２−ＥＲ−）セットを使用してステップ４が繰り返されることによって、組み合わされたデータセット、サブタイプ２（例えば、Ｓｔ−ＥＲ−）遺伝子発現シグナルリストが得られ、次いでＧＯ分析が実施される。次いで、ステップ５、６、７、及び８が繰り返される。
【００５６】
実施例１において、別の３セットのマーカー（それぞれ、ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、及びＮＲＣ−９と呼ばれる。各セットは、３０遺伝子を含有する。表１を参照。）が得られた。これらのセットは、ＥＲ−試料のために使用された。
【００５７】
試験プロセス
【００５８】
一般的な概要、実施例１：実施例１において、各マーカーセットについて、ニアレストシュランケンセントロイド（nearest shrunken centroid）分類、及びリーブワンアウト方法を使用した。次いで、本発明者らは、各試料の再発を予測するために、３つのマーカーセットを一緒に組み合わせて使用した。
【００５９】
ｎ試料を含有する所与のデータセットについて、実施例１において使用した試験プロセスは、以下（ステップごとに）のものであった。
【００６０】
ステップ１３：対象とされる試験試料について、本発明者らは、マーカーセットの遺伝子発現プロファイルを抽出した。各遺伝子発現値について、本発明者らは、そのマーカーファクターを乗じ、試験試料の修正された遺伝子発現プロファイルを得る。本発明者らは、ＰＡＭ方法（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら、ＰＮＡＳ、９９：６５６７、２００２）を使用して、マーカーセットについてのｎ−１試料から、「良性」クラス及び「悪性」クラスの両方について標準化されたセントロイドを計算した。各遺伝子のマーカーファクターをクラスセントロイドに乗じ、マーカーセットの修正されたクラスセントロイドを得る。
【００６１】
マーカーセットを使用して対象とされる試験試料の再発を予測するために、本発明者らは、試料の修正された遺伝子発現プロファイルを、これらの修正されたクラスセントロイドのそれぞれと比較する。二乗距離において、セントロイドが最も近いクラスが、その試料について予測されるクラスである。試料が「良性」腫瘍と予測される場合、試料は０と表され、そうでなければ、試料は１と表される。
【００６２】
ステップ１４：ＥＲ＋試料について、試料が、３つすべてのマーカーセットについて０として予測した場合、本発明者らは、この試料を低リスクグループに割り当て、試料が、３つすべてのマーカーセットについて１として予測した場合、本発明者らは、この試料を高リスクグループに割り当て、試料が、低リスクグループにも高リスクグループにも割り当てられない場合、本発明者らは、この試料を中間リスクグループに割り当てる。ＥＲ−試料について、試料が、３つすべてのマーカーセットについて０として予測した場合、本発明者らは、この試料を低リスクグループに割り当て、その他の場合では、本発明者らは、この試料を、高リスクグループに割り当てる。これは、不明瞭な試料を中間グループに割り当てる常套手段の修正である。侵襲性の強い癌のサブタイプの場合では、明らかに低リスクでないすべての癌を高リスクとして分類し、この癌を、通常の標準治療を超えて積極的に治療することが望ましい場合がある。
【００６３】
３つの試験データセットにおけるマーカーセットの検証
【００６４】
マーカーセットのロバスト性及び予測精度を試験するために、本発明者らは、これらの刊行物（Ｋｏｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、２００６；Ｃｈａｎｇら、ＰＮＡＳ １０２：３７３８、２００５、及びＳｏｔｉｒｉｏｕ Ｃら、Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、９８：２６２、２００６）からの３つの独立した乳癌データセットにおいてマーカーセットを試験し、合計で６４４試料を試験した。
【００６５】
ＥＲ＋試料について、各データセットにおいて、試料を、低リスクグループ（ＬＧ）、中間リスクグループ（ＭＧ）、及び高リスクグループ（ＨＧ）に階層化するために、本発明者らはまず、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３マーカーセット（上述した３つの乳癌データセットからの）をした。高リスクグループの試料が１０未満であった場合、本発明者らは、ＭＧグループとＨＧグループを混合し、混合したグループを中間リスクグループと呼んだ。そうでなければ、本発明者らは、ＮＲＣ−４、ＮＲＣ−５、及びＮＲＣ−６マーカーセットを使用して、ＨＧグループを低リスクグループ（ＮＬＧ）、中間リスクグループ（ＮＭＧ）、及び高リスクグループ（ＮＨＧ）の３つの新しいグループに階層化した。本発明者らは、ＮＬＧとＭＧを混合し、これを中間リスクグループと呼び、ＮＭＧとＮＨＧを混合して、これを高リスクグループと呼んだ。ＬＧは、低リスクグループである。本発明者らは、低リスクグループについて高い予測可能性精度（非再発患者について約９０％）を伴う非常に良好な結果を得て、３つすべての試験データセットにおいて３つのグループをうまく分類した（表２を参照）。
【００６６】
ＥＲ−試料について、各データセットにおいて、試料を低い（ＬＧ）、及び高い（ＨＧ）リスクグループに階層化するため、本発明者らは、ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、及びＮＲＣ−９マーカーセットを使用した。本発明者らは、これについても高い予測可能性精度（非再発患者について約９２〜１００％）を伴う非常に良好な結果を得、３つすべての試験データセットにおいて２つのグループをうまく分類した（表２を参照）。
【００６７】
マーカーセットを組み合わせて利用することにより、予測精度が改善される
【００６８】
ＥＲ＋試料について、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３がすべて、試料を「良性」腫瘍として予測することに一致している場合、精度は、１つのマーカーセット、例えば、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、又はＮＲＣ−３などを使用するより有意に改善された（表３）。ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、及びＮＲＣ−９がすべて、ＥＲ−試料について試料を「良性」腫瘍として予測するのに一致している場合、同じ結果が得られた（表３）。一般に、３つのマーカーセットの統合的な利用は、１つのセットを使用することに対して、予測精度が改善されることが見出される。本発明の一実施形態では、精度は、約７０％から約９０％に改善された。本発明の一実施形態では、精度は少なくとも９０％である。別の実施形態では、精度は少なくとも９５％である。
【００６９】
したがって、バイオマーカーの強力なセット、及びその使用が本明細書で提供される。
【００７０】
癌のタイプ、及び患者の状態に応じて、異なる遺伝子プロファイルが「悪性」とみなされる場合があることが理解されるであろう。転移は、癌を有する患者の治療方法を決定する際に重要な要因であると一般に考えられ、例えば、本明細書に開示されるようなバイオマーカーセットのセットは、その目的に有用である。さらに、バイオマーカーセットは、１つ又は複数の特定の薬物に十分に（又は不十分に）反応する見込みのある癌細胞タイプを同定するのに使用することができる。「良性」又は「悪性」とみなされる正確な要因に関わらず、「良性」遺伝子及び「悪性」遺伝子の両方を含有するトレーニングセットＳ１及びＳ２からこの方法を開始することが通常望ましい。高度に発現された標的はしばしば、良好な薬物標的になるため、遺伝子発現のレベルを、良好な薬物標的を同定する場合に考慮することができる。
【００７１】
一般に、低リスクグループ（「良好な予後のサイン」を有する）は、治療に進まないが、高リスクグループ（「不良の予後のサイン」を有する）は、手術に加えて治療を受けるべきである。一般に、中間リスクグループも同様に、手術に加えて治療を受けることになるが、これは、そのタイプの腫瘍についての典型的な標準治療に依存する。
【００７２】
本明細書に開示されるバイオマーカーセットのそれぞれは単独に、追加の治療の必要性を予測するのに有用であるが、全体的な予測精度は、複数のバイオマーカーセットを使用することによって、著しく改善することができる。
【００７３】
例えば、患者試料が、ＮＲＣ＿１、ＮＲＣ＿２、及びＮＲＣ＿３に対してスクリーニングされ、３つすべてのセットが、「良好な」予後を示す場合、患者は低リスクであるとみなされる。すべてが「悪性の」予後を示す場合、試料は高リスクであるとみなされる。１つ又は２つのセットが「悪性」を示し、他のセット（複数可）が「良性」を示す場合、癌は、中間リスクであるとみなされる。
【００７４】
本発明の一実施形態では、患者試料が、任意の１つのバイオマーカーセット（例えば、ＮＲＣ＿１）に関して「良性」又は「悪性」であるかを判定するために、バイオマーカーセットは、多数の患者に由来する試料を代表する２つのバンク（bank）の癌細胞を独立にスクリーニングするのに使用される。第１のバンクは、「良性」癌細胞（転移などの関心対象の挙動又は特性を示さない既知の病歴を持つ）を代表し、第２のバンクは、「悪性」癌細胞（関心対象の挙動又は特性を示す既知の病歴を持つ）を代表す。「良性」バンク及び「悪性」バンクのそれぞれは、各バイオマーカーセットについて、それぞれ、遺伝子発現サイン（「良性」腫瘍及び「悪性」腫瘍について、標準的な「良性」及び「悪性」遺伝子発現サイン）を生じさせる。患者試料について、患者試料のバイオマーカーセットの遺伝子発現サインは、そのバイオマーカーセットの標準的な「良性」及び「悪性」遺伝子発現サインと比較される。そのバイオマーカーセットの標準的な「悪性」サインと最も密接に類似する患者試料は、「悪性」とみなされ、そのバイオマーカーセットの標準的な「良性」サインと最も密接に類似する患者試料は、「良性」とみなされる。
【００７５】
本方法は、いくつかの場合では、以下の癌バイオマーカーセット、即ち、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、ＮＲＣ−３、ＮＲＣ−４、ＮＲＣ−５、ＮＲＣ−６、ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、ＮＲＣ−９のうちの１つ又は複数を組み合わせて使用することを含む。
【００７６】
サブタイプが同定された場合（この例ではＥＲ＋／ＥＲ−）の本方法の使用についての１つの可能な手法の例：
癌細胞の腫瘍試料についてＥＲ状態が判断される。（これは、臨床の場において行われることが多い）
ＥＲ＋試料について、試料が、３つすべてのマーカーセット（ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３）について「良性」と予測された場合、試料は、低リスクグループに割り当てられ、試料が、３つすべてのマーカーセットについて「悪性」と予測された場合、試料は、高リスクグループに割り当てられ、試料が、低リスクグループにも、高リスクグループにも割り当てられない場合、試料は、中間リスクグループに割り当てられる。
マーカーセット（ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３）によって定義されるＥＲ＋高リスクグループについては、マーカーセット（ＮＲＣ−４、ＮＲＣ−５、及びＮＲＣ−６）を使用して再び予測される。試料が、３つすべてのマーカーセットについて「悪性」であると予測された場合、試料は、高リスクグループに割り当てられる。そうでなければ、試料は、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、及びＮＲＣ−３によって定義される中間リスクグループに割り当てられる。
ＥＲ−試料について、試料は、３つすべてのマーカーセット（ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、及びＮＲＣ−９）について「良性」と予測された場合、低リスクグループに割り当てられ、そうでなければ、試料は、高リスクグループに割り当てられる。
【００７７】
本発明の一実施形態では、手術に加えて追加の癌治療が有益である患者の見込みを評価する方法が提供され、該方法は、
マイクロアレイ遺伝子チップ上にマーカーセットの遺伝子プローブをプリントするステップと、
腫瘍試料からメッセンジャーＲＮＡを抽出するステップと、
マイクロアレイ遺伝子チップ上にこのメッセンジャーＲＮＡをハイブリダイズするステップと、
ハイブリダイズされたマイクロアレイチップを走査することによって、試料のマーカー遺伝子のすべての読み取り値を得るステップと、
読み取り値を正規化するステップと、
試料の各マーカーセットの遺伝子発現プロファイルを構築するステップと、
予測を行うために各マーカーセットの遺伝子発現プロファイルを、標準的な（「良性」及び「悪性」として知られる）腫瘍試料の遺伝子発現プロファイルと相関させるステップと
を含む。
【００７８】
マイクロアレイ遺伝子チップの作製、走査及びアレイデータの正規化に関する詳細な情報は、Ａｇｉｌｅｎｔ社のウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｅｎ−ＵＳ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／ｄｎａｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ／ｐａｇｅｓ／ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘ．、及び公的に利用可能な文献に見出すことができる。
【００７９】
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
【表１−６】
【表１−７】
【表１−８】
【００８０】
注：この表に列挙された各遺伝子についてのメッセンジャーＲＮＡ配列は、この文書の最後に添付されている。表１中の各遺伝子についてのすべてのメッセンジャーＲＮＡ配列は、公開データベースであるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から抽出される。
【００８１】
配列の形式は、ＦＡＳＴＡ形式である。ＦＡＳＴＡ形式における配列は、１行の説明から始まり、その後に配列データの行が続く。説明行は、第１列の超（「＞」）記号によって、配列データと区別される。
【００８２】
ＦＡＳＴＡにおける配列の例：
【００８３】
【化１】
【００８４】
説明の行において、第１の項目である６０１９は、ＮＣＢＩ ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ ＩＤであり、これは、表１の第１列中のＩＤであり、記号（「｜」）の後の別の項目は、ＮＣＢＩ参照メッセンジャーＲＮＡ配列ＩＤである。１つのＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ ＩＤは、いくつかの参照メッセンジャーＲＮＡ配列を有することができることに留意すべきである。この場合、１つのＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ ＩＤに対するすべてのメッセンジャーＲＮＡ配列が列挙される。各配列は、１つの参照メッセンジャーＲＮＡ配列を表す。
【００８５】
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【表２−４】
【表２−５】
【表２−６】
【表２−７】
【００８６】
【表３】
【００８７】
注：＊元の試験セット１中に２９５試料が存在する。しかし、このセットは、ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ ら、Ｎａｔｕｒｅ、４１５：５３０、２００２からのものである７６試料を含む。本発明者らは、トレーニングセットとしてｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒのデータセット（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４１５：５３０、２００２）を使用したので、次いで、２９５試料からこれらの７６試料を除いた。したがって、試験セット１は、２１９試料を含有する。
【００８８】
１．Ｎは、試料数を表す
２．Ｒは、グループ中の試料数と試験セットの合計試料数との比を表す
３．Ｒ１は、非再発を有する試料の百分率（精度）を表す
４．Ｒ２は、再発を有する試料の百分率（精度）を表す
５．試験セット１は、Ｃｈａｎｇら、ＰＮＡＳ、２００５からのものである
６．試験セット２は、Ｋｏｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、２００６からのものである
７．試験セット３は、Ｓｏｔｉｒｉｏｕら、Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、９８：２６２、２００６からのものである
【００８９】
【表４】
【００９０】
注：使用したデータセットは、表２中のデータセットと同じである。
【００９１】
【表５−１】
【表５−２】
【表５−３】
【表５−４】
【表５−５】
【表５−６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍特性を同定するための方法であって、以下のステップ、
１）対象とする特性をそれぞれ予測する３つの異なるマーカーセットを得るステップと、
２）腫瘍細胞から試料遺伝子発現シグナルを得るステップと、
３）レポーターを加えて試料の変化に影響を及ぼし、腫瘍中の対象とする遺伝子発現シグナルの評価を可能にするステップと、
４）前記遺伝子発現シグナルを前記レポーターと組み合わせるステップと、
５）抽出された遺伝子発現シグナルを、前記３つの異なるマーカーセットと相関させるステップと、
６）以下の、
ａ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍が関心対象の特性を有すると予測する場合、腫瘍は、悪性腫瘍と指定される、
ｂ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍が関心対象の特性を欠いていると予測する場合、腫瘍は、良性腫瘍と指定される、
ｃ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、同じ臨床転帰の予測をもたらさない場合、腫瘍は、「中間」と指定される
というランク付けに従って、抽出された遺伝子発現シグナルに指定を割り当てるステップと、
７）前記指定を出力するステップと
を含む方法。
【請求項２】
関心対象の特性が、転移、炎症、細胞周期、免疫応答遺伝子、薬剤耐性遺伝子、及び多剤耐性遺伝子の１つ又は複数に関係する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍特性が、術後の患者生存率不良をもたらす傾向である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ４が、以下の、
ａ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍を悪性腫瘍であると予測する場合、腫瘍は、悪性腫瘍と指定され、典型的な標準治療よりも積極的な治療が推奨される、
ｂ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍を良性腫瘍であると予測する場合、標準治療の範囲を超える治療は推奨されず、術後の化学療法も放射線療法も推奨されない、
ｃ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、同じ予後をもたらさない場合、腫瘍は、「中間」と指定され、化学療法及び／又は放射線療法を含む、完全な典型的な標準治療処置が推奨される、
というランク付けに従って、抽出された遺伝子発現シグナルに値を割り当てるステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ１の前に、
ａ）検査される腫瘍サブタイプを同定するステップ、
ｂ）その腫瘍サブタイプに特異的なマーカーセットを選択するステップ
という予備ステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１において使用されるタイプの予測遺伝子発現シグナルセットを決定するための方法であって、以下のステップ、
１）対象とする癌について既知の腫瘍集団に関する対象とする特性についての、遺伝子発現シグナル情報及び患者の臨床情報を得るステップと、
２）遺伝子発現シグナルを、対象とする特性に関する臨床患者情報と相関させて、臨床転帰についての予測力を有する遺伝子を同定するステップと、
３）同定された遺伝子発現シグナルから少なくとも３０のランダムトレーニングデータセットを作るステップと、
４）ステップ１の同定された遺伝子発現シグナルを、癌において活性な既知の遺伝子のリストと比較するステップと、
５）既知の癌遺伝子のリスト上の遺伝子発現シグナルに対応する、同定された遺伝子発現シグナルを選択するステップと、
６）生物学的プロセスにおけるその役割によって、選択された、同定された遺伝子発現シグナルをグループ化するステップと、
７）ステップ６の選択された遺伝子発現シグナルグループから少なくとも２５遺伝子のランダム遺伝子発現シグナルセットを生成するステップと、
８）ランダム遺伝子発現シグナルセットを、ステップ３で得られたランダムトレーニングデータセットと相関させるステップと、
９）ステップ７の各遺伝子発現シグナルセットについての相関から、生存率スクリーニングについてのＰ値を得るステップと、
１０）遺伝子発現シグナルセットのＰ値が、ランダムトレーニングデータセットの９０％超について０．０５未満である場合、該遺伝子発現シグナルセットを確保するステップと、
１１）セット内の遺伝子出現の頻度に基づいて、ステップ１０において確保されたランダム遺伝子発現シグナルセットをランク付けするステップと、
１２）可能性のある候補マーカーとして、少なくとも上位２６遺伝子を選択するステップと、
１３）ステップ７〜１２を繰り返し、別の独立した、少なくとも２６遺伝子のランクセットを作製するステップと、
１４）ステップ１２及びステップ１３の上位遺伝子を比較するステップと、
１５）２５を超える遺伝子が同じである場合、上位遺伝子がマーカーセットとして確保されるステップと、
１６）ステップ７〜１５を２回繰り返して、３つの異なるマーカーセットを得るステップと
１７）前記３つの異なるマーカーセットを出力するステップと
を含む方法。
【請求項７】
生物学的プロセスにおけるその役割によって、選択された、同定された遺伝子発現シグナルをグループ化するステップが、遺伝子オントロジー分析を使用して行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ３において、３０〜５０の間のランダムトレーニングセットが作られる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
３０〜４０の間のトレーニングセットが作られる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ４において、癌において活性であると知られている遺伝子が、転移、細胞増殖、腫瘍血管新生、及び薬物反応に関与する遺伝子のグループから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ７において、約７５０，０００〜１，２５０，０００の間のランダム遺伝子発現シグナルセットが生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ７において、約９００，０００〜１，１００，０００の間のランダム遺伝子発現シグナルセットが生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ７において、約１，０００，０００のランダム遺伝子発現シグナルセットが生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ７において、生成されるランダム遺伝子発現シグナルセットが、約２５〜５０の間の遺伝子を含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ７において、生成されるランダム遺伝子発現シグナルセットが、約２８〜３２の間の遺伝子を含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ１２において、上位２６〜５０遺伝子が選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ１２において、上位２８〜３２遺伝子が選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍が哺乳動物の腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍が、ヒト、類人猿、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又はアレチネズミのうちの１つの腫瘍である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの癌バイオマーカーセットが、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、ＮＲＣ−３、ＮＲＣ−４、ＮＲＣ−５、ＮＲＣ−６、ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、及びＮＲＣ−９から本質的になるリストから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法を実施するための、少なくとも３つのマーカーセット及び使用説明書を含むキット。
【請求項２２】
表１Ａ又は１Ｂに列挙された少なくとも１０の遺伝子発現シグナルを含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
請求項６に記載の方法によって同定された少なくとも３０の核酸バイオマーカーを含有する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
対象とする１つ又は複数の腫瘍特性の同定における、表１Ａ又は１Ｂ中の配列のいずれかの使用。
【請求項２５】
少なくとも３つの異なるマーカーセットが使用される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
癌バイオマーカーが乳癌バイオマーカーであり、第１のサブタイプの試料が、ＥＲ＋試料である、請求項５に記載の方法。
【請求項２７】
ランダムトレーニングセットが、選ばれる方のセットと同じ「良性」腫瘍と「悪性」腫瘍の比を維持しながら、試料をランダムに選ぶことによって生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項２８】
悪性腫瘍と指定されるすべての遺伝子発現値がグループ化され、以下のステップ、
１）同定された遺伝子発現シグナルから、少なくとも３０のランダムトレーニングデータセットを作るステップと、
２）新しいグループの同定された遺伝子発現シグナルを、癌において活性な既知の遺伝子のリストと比較するステップと、
３）既知の癌遺伝子のリスト上の遺伝子発現シグナルに対応する、同定された遺伝子発現シグナルを選択するステップと
４）生物学的プロセスにおけるその役割によって、選択された、同定された遺伝子発現シグナルをグループ化するステップと、
５）ステップ４の選択された遺伝子発現シグナルグループから少なくとも２５遺伝子のランダム遺伝子発現シグナルセットを生成するステップと、
６）ランダム遺伝子発現シグナルセットを、ステップ１で得られたランダムトレーニングデータセットと相関させるステップと、
７）ステップ６の各遺伝子発現シグナルセットについての相関から、生存率スクリーニングについてのＰ値を得るステップと、
８）遺伝子発現シグナルセットのＰ値が、ランダムトレーニングデータセットの９０％超について０．０５未満である場合、該遺伝子発現シグナルセットを確保するステップと、
９）セット内の遺伝子出現の頻度に基づいて、ステップ８において確保されたランダム遺伝子発現シグナルセットをランク付けするステップと
１０）可能性のある候補マーカーとして、少なくとも上位２６遺伝子を選択するステップと、
１１）ステップ５〜１０を繰り返し、別の独立した、少なくとも２６遺伝子のランクセットを作製するステップと、
１２）ステップ１０及びステップ１１の上位遺伝子を比較するステップと、
１３）２５を超える遺伝子が同じである場合、上位遺伝子がマーカーセットとして確保されるステップと
１４）ステップ５〜１３を２回繰り返して、３つの新しい異なるマーカーセットを得るステップと
１５）前記３つの異なる新しいマーカーセットを出力するステップと
が実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
腫瘍特性を同定するための方法であって、以下のステップ、
１）対象とする特性をそれぞれ予測する３つの異なるマーカーセットを得るステップと、
２）腫瘍細胞から試料遺伝子発現シグナルを得るステップと、
３）レポーターを加えて試料の変化に影響を及ぼし、腫瘍中の対象とする遺伝子発現シグナルの評価を可能にするステップと、
４）前記遺伝子発現シグナルを前記レポーターと組み合わせるステップと、
５）抽出された遺伝子発現シグナルを、前記３つの異なるマーカーセットと相関させるステップと、
６）以下の、
ａ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍が関心対象の特性を有すると予測する場合、腫瘍は、悪性腫瘍と指定される、
ｂ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍が関心対象の特性を欠いていると予測する場合、腫瘍は、良性腫瘍と指定される、
ｃ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、同じ臨床転帰の予測をもたらさない場合、腫瘍は、「中間」と指定される
というランク付けに従って、抽出された遺伝子発現シグナルに指定を割り当てるステップと、
７）前記指定を出力するステップと
を含む方法。
【請求項２】
関心対象の特性が、転移、炎症、細胞周期、免疫応答遺伝子、薬剤耐性遺伝子、及び多剤耐性遺伝子の１つ又は複数に関係する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍特性が、術後の患者生存率不良をもたらす傾向である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ４が、以下の、
ａ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍を悪性腫瘍であると予測する場合、腫瘍は、悪性腫瘍と指定され、典型的な標準治療よりも積極的な治療が推奨される、
ｂ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、腫瘍を良性腫瘍であると予測する場合、標準治療の範囲を超える治療は推奨されず、術後の化学療法も放射線療法も推奨されない、
ｃ．３つすべての予測遺伝子発現シグナルセットの相関が、同じ予後をもたらさない場合、腫瘍は、「中間」と指定され、化学療法及び／又は放射線療法を含む、完全な典型的な標準治療処置が推奨される、
というランク付けに従って、抽出された遺伝子発現シグナルに値を割り当てるステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ１の前に、
ａ）検査される腫瘍サブタイプを同定するステップ、
ｂ）その腫瘍サブタイプに特異的なマーカーセットを選択するステップ
という予備ステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１において使用されるタイプの予測遺伝子発現シグナルセットを決定するための方法であって、以下のステップ、
１）対象とする癌について既知の腫瘍集団に関する対象とする特性についての、遺伝子発現シグナル情報及び患者の臨床情報を得るステップと、
２）遺伝子発現シグナルを、対象とする特性に関する臨床患者情報と相関させて、臨床転帰についての予測力を有する遺伝子を同定するステップと、
３）同定された遺伝子発現シグナルから少なくとも３０のランダムトレーニングデータセットを作るステップと、
４）ステップ１の同定された遺伝子発現シグナルを、癌において活性な既知の遺伝子のリストと比較するステップと、
５）既知の癌遺伝子のリスト上の遺伝子発現シグナルに対応する、同定された遺伝子発現シグナルを選択するステップと、
６）生物学的プロセスにおけるその役割によって、選択された、同定された遺伝子発現シグナルをグループ化するステップと、
７）ステップ６の選択された遺伝子発現シグナルグループから少なくとも２５遺伝子のランダム遺伝子発現シグナルセットを生成するステップと、
８）ランダム遺伝子発現シグナルセットを、ステップ３で得られたランダムトレーニングデータセットと相関させるステップと、
９）ステップ７の各遺伝子発現シグナルセットについての相関から、生存率スクリーニングについてのＰ値を得るステップと、
１０）遺伝子発現シグナルセットのＰ値が、ランダムトレーニングデータセットの９０％超について０．０５未満である場合、該遺伝子発現シグナルセットを確保するステップと、
１１）セット内の遺伝子出現の頻度に基づいて、ステップ１０において確保されたランダム遺伝子発現シグナルセットをランク付けするステップと、
１２）可能性のある候補マーカーとして、少なくとも上位２６遺伝子を選択するステップと、
１３）ステップ７〜１２を繰り返し、別の独立した、少なくとも２６遺伝子のランクセットを作製するステップと、
１４）ステップ１２及びステップ１３の上位遺伝子を比較するステップと、
１５）２５を超える遺伝子が同じである場合、上位遺伝子がマーカーセットとして確保されるステップと、
１６）ステップ７〜１５を２回繰り返して、３つの異なるマーカーセットを得るステップと
１７）前記３つの異なるマーカーセットを出力するステップと
を含む方法。
【請求項７】
生物学的プロセスにおけるその役割によって、選択された、同定された遺伝子発現シグナルをグループ化するステップが、遺伝子オントロジー分析を使用して行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ３において、３０〜５０の間のランダムトレーニングセットが作られる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
３０〜４０の間のトレーニングセットが作られる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ４において、癌において活性であると知られている遺伝子が、転移、細胞増殖、腫瘍血管新生、及び薬物反応に関与する遺伝子のグループから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ７において、約７５０，０００〜１，２５０，０００の間のランダム遺伝子発現シグナルセットが生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ７において、約９００，０００〜１，１００，０００の間のランダム遺伝子発現シグナルセットが生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ７において、約１，０００，０００のランダム遺伝子発現シグナルセットが生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ７において、生成されるランダム遺伝子発現シグナルセットが、約２５〜５０の間の遺伝子を含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ７において、生成されるランダム遺伝子発現シグナルセットが、約２８〜３２の間の遺伝子を含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ１２において、上位２６〜５０遺伝子が選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ１２において、上位２８〜３２遺伝子が選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍が哺乳動物の腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍が、ヒト、類人猿、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又はアレチネズミのうちの１つの腫瘍である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの癌バイオマーカーセットが、ＮＲＣ−１、ＮＲＣ−２、ＮＲＣ−３、ＮＲＣ−４、ＮＲＣ−５、ＮＲＣ−６、ＮＲＣ−７、ＮＲＣ−８、及びＮＲＣ−９から本質的になるリストから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法を実施するための、少なくとも３つのマーカーセット及び使用説明書を含むキット。
【請求項２２】
表１Ａ又は１Ｂに列挙された少なくとも１０の遺伝子発現シグナルを含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
請求項６に記載の方法によって同定された少なくとも３０の核酸バイオマーカーを含有する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
対象とする１つ又は複数の腫瘍特性の同定における、表１Ａ又は１Ｂ中の配列のいずれかの使用。
【請求項２５】
少なくとも３つの異なるマーカーセットが使用される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
癌バイオマーカーが乳癌バイオマーカーであり、第１のサブタイプの試料が、ＥＲ＋試料である、請求項５に記載の方法。
【請求項２７】
ランダムトレーニングセットが、選ばれる方のセットと同じ「良性」腫瘍と「悪性」腫瘍の比を維持しながら、試料をランダムに選ぶことによって生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項２８】
悪性腫瘍と指定されるすべての遺伝子発現値がグループ化され、以下のステップ、
１）同定された遺伝子発現シグナルから、少なくとも３０のランダムトレーニングデータセットを作るステップと、
２）新しいグループの同定された遺伝子発現シグナルを、癌において活性な既知の遺伝子のリストと比較するステップと、
３）既知の癌遺伝子のリスト上の遺伝子発現シグナルに対応する、同定された遺伝子発現シグナルを選択するステップと
４）生物学的プロセスにおけるその役割によって、選択された、同定された遺伝子発現シグナルをグループ化するステップと、
５）ステップ４の選択された遺伝子発現シグナルグループから少なくとも２５遺伝子のランダム遺伝子発現シグナルセットを生成するステップと、
６）ランダム遺伝子発現シグナルセットを、ステップ１で得られたランダムトレーニングデータセットと相関させるステップと、
７）ステップ６の各遺伝子発現シグナルセットについての相関から、生存率スクリーニングについてのＰ値を得るステップと、
８）遺伝子発現シグナルセットのＰ値が、ランダムトレーニングデータセットの９０％超について０．０５未満である場合、該遺伝子発現シグナルセットを確保するステップと、
９）セット内の遺伝子出現の頻度に基づいて、ステップ８において確保されたランダム遺伝子発現シグナルセットをランク付けするステップと
１０）可能性のある候補マーカーとして、少なくとも上位２６遺伝子を選択するステップと、
１１）ステップ５〜１０を繰り返し、別の独立した、少なくとも２６遺伝子のランクセットを作製するステップと、
１２）ステップ１０及びステップ１１の上位遺伝子を比較するステップと、
１３）２５を超える遺伝子が同じである場合、上位遺伝子がマーカーセットとして確保されるステップと
１４）ステップ５〜１３を２回繰り返して、３つの新しい異なるマーカーセットを得るステップと
１５）前記３つの異なる新しいマーカーセットを出力するステップと
が実施される、請求項１に記載の方法。
【公表番号】特表２０１２−５２５８１８（Ｐ２０１２−５２５８１８Ａ）
【公表日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０５００７（Ｐ２０１２−５０５００７）
【出願日】平成２２年４月１６日（２０１０．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００５６５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１８５２０
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５９５００６２２３）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (25)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１６日（２０１０．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００５６５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１８５２０
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５９５００６２２３）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (25)
【Ｆターム（参考）】
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