色素上皮誘導因子：ＰＥＤＦ遺伝子の特性評価、ゲノム構成および配列
【課題】ＰＥＤＦおよびその機能的断片をコードしている核酸、そのような核酸を含むベクター、そのようなベクターが導入されている宿主細胞、およびＰＥＤＦおよび等価なタンパク質を産生する組換え法を提供すること。
【解決手段】ニューロンを含む細胞集団を有効量の色素上皮誘導因子で処理し；および、該集団のニューロン細胞生存を促進することからなるニューロン細胞生存の促進法。グリア細胞を含む細胞集団を有効量の色素上皮誘導因子で処理し；および、該集団のグリア細胞増殖を阻害することからなるグリア細胞増殖阻害法。
【解決手段】ニューロンを含む細胞集団を有効量の色素上皮誘導因子で処理し；および、該集団のニューロン細胞生存を促進することからなるニューロン細胞生存の促進法。グリア細胞を含む細胞集団を有効量の色素上皮誘導因子で処理し；および、該集団のグリア細胞増殖を阻害することからなるグリア細胞増殖阻害法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は１９９２年９月２４日に出願された特許出願第０７／９５２，７９６号の一部継続出願である１９９４年６月７日に出願された特許出願第０８／２５８，９６３号の一部継続出願である。
【０００２】
（技術分野）
本発明は神経栄養性、神経細胞栄養性およびグリア細胞静止性タンパク質に関する。特に、本発明は色素上皮誘導因子（ＰＥＤＦ）として知られているタンパク質の生物学的特性およびそのタンパク質の組換え形に関している。本発明はまたｒＰＥＤＦと称されるＰＥＤＦの端を切り取ったものにも関している。ＰＥＤＦおよびｒＰＥＤＦおよび機能的に等価なタンパク質に加え、本発明はｒＰＥＤＦおよびその断片をコードしている核酸、そのような核酸を含むベクター、そのようなベクターが導入されている宿主細胞およびそのようなタンパク質を産生するためのこれらの宿主細胞の使用にも関している。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
色素上皮誘導因子（または色素上皮分化因子として知られている）は、培養ヒト網膜芽腫細胞の神経突起成長を誘導できる細胞外神経栄養性作因として培養ヒト胎児網膜色素上皮細胞の馴化培地で同定された（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３０（８），１７００−１７０７）。ＰＥＤＦ源、即ち網膜色素上皮（ＲＰＥ）は網膜神経の正常な分化および機能に決定的なものであろう。増殖因子を含む種々の分子がＲＰＥ細胞により合成および分泌される。ＲＰＥは網膜神経に先だって分化して隣接して存在し、およびそれが血液−網膜障壁の一部として機能しているため（Ｆｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎａ．Ｏｃｕｌａｒ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｈａｒｐｅｒ ＆ Ｒｏｗ，６１−７０）、ＲＰＥは目の血管性、炎症性、消耗性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）および異栄養性（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ）疾患に関係していると考えられる（Ｅｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１３６，７４５−７５０）。増殖因子に加え、栄養および代謝物もまたＲＰＥおよび網膜間で交換されている。例えば、ＲＰＥはよく知られた増殖因子ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、およびＴＧＦ−βを網膜に供給している（Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ ｅｔ
ａｌ．（１９８８）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２９，３０５−３１１；Ｐｌｏｕｅｔ（１９８８）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２９，１０６−１１４；Ｆａｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２９，２４２−２５０；Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２９，３０７−３１３）。ＲＰＥにより供給されたこれらおよび他の未知の因子が網膜の構成、分化および正常な機能発揮に影響していることは非常にありそうなことである。
【０００４】
ＲＰＥにより分泌される推定の分化因子の効果を研究および決定するため、培養細胞に網膜抽出物およびヒト胎児ＲＰＥ細胞の培養で得られた馴化培地が加えられた。例えば、米国特許第４，９９６，１５９（Ｇｌａｓｅｒ）は約５７，０００＋／−３，０００の分子量のＲＰＥから回収された血管新生阻害剤が開示されている。同様に、米国特許第１，７００，６９１（Ｓｔｕａｒｔ）、４，４７７，４３５（Ｃｏｕｒｔｏｉｓら）および４，６７０，２５７（Ｇｕｅｄｏｎ ｂｏｒｎ Ｓａｇｌｉｅｒら）は網膜抽出物および細胞再生および眼疾患処置におけるこれらの抽出物の使用が開示されている。さらに、米国特許第４，７７０，８７７（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）および４，５３４，９６７（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）は、ウシ硝子体液の後方部から精製された細胞増殖阻害剤が開示されている。
【０００５】
ＰＥＤＦは最近ヒトＲＰＥから５０−ｋＤａタンパク質として単離された（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２９，４１４；Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３０，１７００−１７０７；Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，５３，４１１−４１４）。特に、ＰＥＤＦは正常網膜芽細胞に対応する新生物性体であるヒトＹ７９網膜芽腫細胞の分化を誘導することが示されている（Ｃｈａｄｅｒ（１９８７）Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．，２０，２０９−２１６）。ＰＥＤＦにより誘導された分化的変化には神経突起の複雑な網目の拡張、およびニューロン特異的エノラーゼおよび神経フィラメントタンパク質のような神経性マーカーの発現が含まれる。このこと故にＲＰＥによるＰＥＤＦタンパク質の合成および分泌が網膜神経の発達および分化に影響していると信じられている。さらに、ＰＥＤＦは未分化のヒト網膜細胞（Ｙ７９網膜芽腫細胞のような）でのみ多く発現されており、それらが分化するとなくなるかまたはダウンレギュレーションされている。最近、ＰＥＤＦ ｍＲＮＡが静止状態の胎児ヒトＷ１線維芽細胞で多量に発現され、およびそれらが老化すると発現されないことが報告された（Ｐｉｇｎｏｌｏら、（１９９３））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＰＥＤＦのさらなる研究および網膜および中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性、血管性、消耗性および異栄養性疾患の処置におけるその治療的使用の可能性の試験にはＰＥＤＦを多量に入手する必要がある。不幸にして、ヒト胎児の目においてＰＥＤＦは豊富には存在せず、さらにその源となる組織はほとんど入手できないことが（特に、研究および治療応用における胎児組織の使用制限をかんがみると）さらなるＰＥＤＦの研究を最も困難なものにしている。それ故ＰＥＤＦおよび等価なタンパク質が多量に必要とされている。従って、ＰＥＤＦおよび等価なタンパク質をコードしている核酸の多量の入手、およびＰＥＤＦおよび等価なタンパク質を産生する能力はＰＥＤＦ、その構造、生化学的活性および細胞機能の研究ならびにＰＥＤＦの治療的使用の発見および設計に著しく強い影響を与えるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
本発明によって、以下が提供される。
（項目１） ニューロンを含む細胞集団を有効量の色素上皮誘導因子で処理し；および
該集団のニューロン細胞生存を促進することからなるニューロン細胞生存の促進法。
（項目２） グリア細胞を含む細胞集団を有効量の色素上皮誘導因子で処理し；および
該集団のグリア細胞増殖を阻害することからなるグリア細胞増殖阻害法。
（項目３） ニューロン細胞が組織細胞培養にある項目第１項に記載の方法。
（項目４） 以下の工程をさらに含む項目第１項に記載の方法：
細胞培養を設定し；および
該細胞培養を有効量のＰＥＤＦで処理する。
（項目５） 処理される細胞が患者内へ移植される組織の構成要素を含む項目第１項に記載の方法。
（項目６） 細胞が胎児脳細胞である項目第６項に記載の方法。
（項目７） グリア細胞が腫瘍増殖の一部である項目第２項に記載の方法。
（項目８） 阻害されるグリア細胞増殖がグリオシスである項目第２項に記載の方法。
（項目９） 精製された色素上皮誘導因子またはその抗原性断片に対して作製された精製抗体または該抗体の抗原−結合断片。
（項目１０） 前記抗体がポリクローナルである項目第９項に記載の単離抗体または抗体断片。
（項目１１） 前記抗体がモノクローナルである項目第９項に記載の抗体または抗体断片。
（項目１２） 前記抗体が検出可能な標識で標識されている項目第９項に記載の抗体または抗体断片。
（項目１３） 細胞または細胞集団を有効量の項目第９項に記載の抗体または該抗体の抗原結合断片で処理し；および
色素上皮誘導因子生物学的活性を阻害することからなる色素上皮誘導因子の阻害法。
（項目１４） 以下の工程を含んでなる、体液、細胞または組織試料中の色素上皮誘導因子レベルの決定法：
Ａ．該試料と項目第９項に記載の精製抗体または抗原結合断片を該抗体または抗原結合断片と該試料中に存在する色素上皮誘導因子間で免疫複合体が形成される条件下で接触させ；
Ｂ．免疫複合体から過剰の抗体または抗原結合断片を分離し；および
Ｃ．免疫複合体のレベルを決定して色素上皮誘導因子レベルを決定する。
【０００８】
ＰＥＤＦおよびその機能的断片をコードしている核酸、そのような核酸を含むベクター、そのようなベクターが導入されている宿主細胞、およびＰＥＤＦおよび等価なタンパク質を産生する組換え法を提供することが本発明の目的である。本発明の別の目的はＰＥＤＦをコードしているゲノムＤＮＡ配列を得、ヒトゲノム中のイントロンーエクソン連接（ジャンクション）、染色体位置を同定し、ゲノム配列に隣接する該遺伝子の制御領域を提供することである。本発明はそのようなゲノムＰＥＤＦ ＤＮＡに関している。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、ＰＥＤＦの構造的特性を提供し、セリンプロテアーゼ阻害剤のセルピンファミリーへの構造的および機能的類似性を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、そのような組換え法に従って産生されたＰＥＤＦおよび等価なタンパク質を提供することであり、ここでそのように産生されたＰＥＤＦおよび等価なタンパク質は天然に存在する源となる生物体からのＰＥＤＦの単離に付随する危険性を伴っていない。
【００１１】
本発明の別の目的は、ｒＰＥＤＦと称されるＰＥＤＦの端が切断されたものに対する核酸、そのような核酸を含むベクター、そのようなベクターが導入されている宿主細胞、およびｒＰＥＤＦおよび等価なタンパク質を産生する組換え法を提供することである。そのような組換え法に従って産生されるｒＰＥＤＦおよび等価なタンパク質を提供するのも本発明の目的である。
【００１２】
神経細胞栄養性およびグリア細胞静止活性を持つＰＥＤＦタンパク質を提供するのが本発明のさらなる目的である。神経細胞栄養性活性は神経細胞の生存を長くすることで見ることができる。グリア細胞静止活性はＰＥＤＦまたはその活性断片存在下でのグリア細胞の増殖阻害で観察できる。本発明の別の目的はニューロン生存を助長／促進するように、およびグリア細胞の増殖を防止するように神経細胞を処理するための方法を提供することであり、それはそのような細胞集団を有効量のＰＥＤＦまたはその活性断片で処理することを特徴としている。
【００１３】
本発明のさらに別の目的はＰＥＤＦを特異的に認識する抗体を提供することである（モノクローナルまたはポリクローナル、天然のタンパク質、組換え体タンパク質またはその免疫活性断片に対して）。本発明の目的は老化および／または他の消耗性疾患の決定においてそのような抗体調製物を使用するイムノアッセイによりＰＥＤＦを検出する方法を提供することである。本発明の別の目的は特異的にＰＥＤＦ活性を阻害するためにＰＥＤＦ抗体を使用する方法に関している。
【００１４】
本発明のこれらのまたは他の目的および利点、ならびに追加の発明の特色はここに提供された発明の説明から明らかにされるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒトＰＥＤＦ遺伝子構造：ヒトＰＥＤＦ遺伝子の制限地図および構成。エクソン１−８は黒の四角で示されており、１−８の番号が付けてある。イントロンおよび隣接するＤＮＡは水平な線で表されておりＡ−Ｇのラベルが付けられている。いくつかのゲノムクローンは図解した遺伝子の上および下に示されている。制限酵素ＮｏｔＩ（”Ｎ”）、ＢａｍＨＩ（”Ｂ”）およびＥｃｏＲＩ（”Ｅ”）の制限部位は垂直の矢印で示されている。
【図２】ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩエンドヌクレアーゼで制限分解されたヒトゲノムＤＮＡ（Ａ）およびＰ１４７（Ｂ）のサザン分析。パルスフィールド電気泳動を行ったゲルのプロフィールからのサザン分析物は放射性標識ＰＥＤＦ ｃＤＮＡで探査された。Ｐ１４７ＤＮＡのハイブリダイゼーションパターンは全ヒトゲノムＤＮＡと一致した。サイズマーカーが示されている。
【図３】ＰＥＤＦ遺伝子の５’隣接領域。最初のエクソン（大文字）および５プライム隣接領域の最初の１０５０ｂｐが示されている。二つのＡｌｕ反復配列は下線が施されている。ＨＮＦ−１、ＰＥＡ３、オクトマー（Ｏｃｔ）、ｃ／ＥＢＰの可能な結合部位は下線が施されており、ラベルされている。推定ＡＰ−１部位はボールド体で示されており、ＴＲＥｐ／ＲＡＲは二重の下線が付けられている。エクソン１中の下線を付けた配列は５’ＲＡＣＥにより決定された。
【図４】ＰＥＤＦ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析：ヒト成人および胎児組織中のヒトＰＥＤＦ転写体の遺伝子発現分析。ＲＮＡが得られた組織はレーンに対応して上に示されている。膜は各々の試料に対し２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを含んでおり、ヒトＰＥＤＦのための放射性標識ｃＤＮＡで探査された。成人および胎児組織の両方で単一の１．５ｋｂ転写体が観察され、肝臓、精巣、骨格筋および卵巣で最も大きなハイブリダイゼーションがあり、一方、脳、膵臓および胸腺の信号は他の組織のものより著しく弱かった。成人腎臓および脾臓では有意な信号は観察されなかった。ＰＥＤＦ ｍＲＮＡレベルの有意な相違が成人および胎児腎臓で観察された。
【図５】ヒトＰＥＤＦ遺伝子の進化的関連付け：各々のレーンは各々の種をＥｃｏＲＩで消化した総量で８μｇのゲノムＤＮＡを表している。ＰＥＤＦプローブでのサザンブロット分析が示されている。ニワトリ（Ａ）、哺乳類（Ｂ）および霊長類（Ｃ）のハイブリダイゼーション信号が示されている。約２３ｋｂの大きな断片がすべての霊長類および多くの哺乳類で観察される。加えて、試験された異なった哺乳類でいくつかの多形が観察される。
【図６】播種した細胞密度とＭＴＳアッセイにより測定された光学密度の関係。異なった濃度の生後８日の小脳顆粒細胞を９６ウェルプレートに加え、血清含有培地（６Ａ）または化学的に特定される培地（６Ｂ）で培養した。光学密度はインビトロでの日数（ＤＩＶ）１、４または７で測定された。四角、ＤＩＶ１；黒丸、ＤＩＶ４；白丸、ＤＩＶ７。データは細胞密度の関数としてプロットされている（ｎ＝６）。
【図７】化学的に特定される培地におけるＰＥＤＦ刺激細胞生存の時間変化。生後８日の小脳顆粒細胞を９６ウェルプレートで培養した。ＤＩＶ０にＰＥＤＦを加え、ＤＩＶ１、４、７または１０に光学密度を測定した。黒棒、対照；左斜線の棒、ＰＥＤＦ処理（５０ｎｇ／ｍｌ）；右斜線ＰＥＤＦ処理（５００ｎｇ／ｍｌ）。データは光学密度／ウェルで表わされている（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）。統計計算はツーウェイＡＮＯＶＡ ポスト−ｈｏｃ Ｓｃｈｅｆｆｅテストにより行われた。★★対照に対してＰ＜０．０００１。
【図８】化学的に特定される培地におけるＰＥＤＦの用量応答曲線。異なった濃度のＰＥＤＦがＤＩＶ０に加えられ、ＭＴＳアッセイがＤＩＶ７に実施された。データは対照に対する比で表わされている（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）。統計計算はワンウェイＡＮＯＶＡ ポスト−ｈｏｃ ＳｃｈｅｆｆｅＦテストにより統計計算が行われた。★★対照に対してＰ＜０．０００１。
【図９】ＤＩＶ１およびＤＩＶ２での生後５日の小脳顆粒細胞のＭＴＳアッセイ。生後５日の小脳顆粒細胞をＡｒａ−Ｃを含まない血清含有培地（Ａ）またはＦ１２を含まない化学的に特定される培地（Ｂ）を用い、９６ウェルプレートで培養した。ＭＴＳアッセイはＤＩＶ１およびＤＩＶ２に実施された。黒棒、対照；しまを付けた棒、ＰＥＤＦ処理（５００ｎｇ／ｍｌ）。データは光学密度／ウェルで表わされている（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）。統計計算はツーウェイＡＮＯＶＡ ポスト−ｈｏｃ Ｓｃｈｅｆｆｅ Ｆテストにより行われた。★★対照に対してＰ＜０．０００５。
【図１０】生後５日の小脳顆粒細胞内へのＢｒｄＵ取り込み。生後５日の小脳顆粒細胞をＡｒａ−Ｃを含まない血清含有培地（ＳＣＭ）またはＦ１２を含まない化学的に特定される培地（ＣＤＭ）を用い、９６ウェルプレートで培養した。ＰＥＤＦはＤＩＶ０に加えた。ＢｒｄＵはＤＩＶ１に加え、ＤＩＶ２に細胞を固定した。黒棒、対照；しまを付けた棒、ＰＥＤＦ処理（５００ｎｇ／ｍｌ）。標識された核酸の数は全細胞集団のパーセントとして表現されている（平均±ＳＥＤ）。各々の値について少なくとも３０００の細胞が計数された。
【図１１】ＥＬＩＳＡにより測定された細胞密度と神経フィラメントの間の関係。異なった濃度の生後８日の小脳顆粒細胞を９６ウェルプレートに加え、培養した。光学密度はＤＩＶ７に測定された。データは細胞密度の関数としてプロットされている。
【図１２】生後８日の小脳顆粒細胞における神経フィラメントＥＬＩＳＡアッセイ。細胞を血清含有培地（ＳＣＭ）または化学的に特定される培地（ＣＤＭ）を用い、ＰＥＤＦとまたはＰＥＤＦなしで９６ウェルプレートで培養した。ＤＩＶ７に細胞を固定した後、神経フィラメントＥＬＩＳＡが実施され、データは対照に対する比として表現されている（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６から１０）。黒棒、対照；しまを付けた棒、ＰＥＤＦ処理（５００ｎｇ／ｍｌ）。統計計算はツーウェイＡＮＯＶＡ ポスト−ｈｏｃ Ｓｃｈｅｆｆｅ Ｆテストにより行われた。★★対照に対してＰ＜０．０５。
【図１３】培養１０日間のＰＥＤＦ神経細胞栄養性効果の要約。
【図１４】端が切り取られたペプチドＢＰおよびＢＸのＣＧＣ生存率に対する効果。
【図１５】小脳からの大グリア細胞に対するＰＥＤＦの効果。
【図１６】小脳小グリア細胞に対するＰＥＤＦの効果。
【図１７−１】ウシＩＰＭからのＰＥＤＦ−免疫反応性タンパク質の精製。ウシＩＰＭ洗液をＡ）ＴＳＫ−３０００サイズ排除クロマトグラフィー続いてＢ）Ｍｏｎｏ−Ｓクロマトグラフィーにかけた。ウェスタンブロットでＰＥＤＦ含有分画が示される。
【図１７−２】ウシＩＰＭからのＰＥＤＦ−免疫反応性タンパク質の精製。ウシＩＰＭ洗液をＡ）ＴＳＫ−３０００サイズ排除クロマトグラフィー続いてＢ）Ｍｏｎｏ−Ｓクロマトグラフィーにかけた。ウェスタンブロットでＰＥＤＦ含有分画が示される。
【図１８】ウェスタンブロッティングにより示されたＰＥＤＦの酵素的脱グリコシル化。ＰＥＤＦ処理は各々のレーンの上に与えられている。数字は分子量標準の位置を示している。
【図１９】ＰＥＤＦに対する抗体は特異的に天然ＰＥＤＦを高力価で認識する。Ａ）少なくとも１：５０，０００希釈までの抗体の有効性、および過剰のｒＰＥＤＦの添加がバンド可視化を完全に阻止することを示しているウェスタンブロット。Ｂ）スロットブロット分析は天然ウシＰＥＤＦタンパク質の≦１ｎｇを検出する能力を示している。
【図２０】Ｙ−７９細胞における神経突起拡張に対するＰＥＤＦ抗体の逆の効果。上列：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）対照培養。中列：天然ウシＰＥＤＦタンパク質による神経突起誘導に対する抗体効果。下列：光受容体間マトリックス（ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍａｔｒｉｘ：ＩＰＭ）による神経突起誘導に対する抗体効果。
【図２１】ＰＥＤＦ存在または不在下での神経突起成長の位相差顕微鏡分析。
【図２２】組換え体ＰＥＤＦおよび天然の単離ＰＥＤＦの存在下での神経突起成長の位相差顕微鏡分析。
【図２３】ｒＰＥＤＦのＣ−末端欠失の模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は新規で、重要でありようやく解明された特性を持つタンパク質に関する。色素上皮誘導因子（ＰＥＤＦ）は神経栄養性、神経細胞栄養性およびグリア細胞静止特性を持つタンパク質である。本発明はさらに、ＰＥＤＦ遺伝子をコードしているＤＮＡ配列、ＰＥＤＦ遺伝子および生物学的活性を持つＰＥＤＦのタンパク質断片をコードしているＰＥＤＦ遺伝子の断片を含むゲノムＤＮＡに関する。
【００１７】
”神経栄養性”活性とはここでは神経細胞集団の分化を誘導する能力として定義される。例えば、培養網膜芽細胞で分化を誘導できるＰＥＤＦの能力は神経栄養性活性と考えられる。
【００１８】
”神経細胞栄養性”活性とはここでは神経細胞集団の生存を促進する能力として定義される。例えば、神経細胞のニューロン生存因子として働くＰＥＤＦの能力は神経細胞栄養性活性である。
【００１９】
”グリア細胞静止”活性とはここではグリア細胞の成長および増殖を阻害する能力として定義される。例えば、グリア細胞の成長および／または増殖を防止するＰＥＤＦの能力はグリア細胞静止活性である。本発明で評価されたタンパク質アミノ酸配列に基づくと、ＰＥＤＦはセリンプロテアーゼ阻害剤であるセルピン遺伝子ファミリーと高い配列相同性を持っていることが観察された。このファミリーの多くのメンバーは、タンパク質の反応性部位として働くカルボキシル末端の厳密に保存されたドメインを持っている。これらのタンパク質は従って共通の祖先から誘導されていると考えられる。しかしながら、セルピン遺伝子ファミリーのメンバー間で発育制御は異なっており、多くは古典的プロテアーゼ阻害活性から逸脱している（Ｂｏｃｋ（１９９０）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｏｃｋ，Ｓ．Ｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４，１０７−１０８；Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６２，１０３−１０７）。ＰＥＤＦはセルピンと配列相同性を共有しているが、ｃＤＮＡ配列の分析から保存的ドメインを欠いており、従って古典的プロテアーゼ阻害剤としては機能しないであろう。
【００２０】
ＰＥＤＦのゲノム配列決定および分析はイントロンおよびエクソンならびに５’−上流配列の約４ｋｂの配列を提供した。本発明はインサイチュハイブリダイゼーションおよび体性細胞ハイブリッドパネルの分析を用いて、１７ｐ１３．１に対するＰＥＤＦの遺伝子の局在化を示している（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ、ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９：２６６−２７２）。これはｐ５３腫瘍抑制遺伝子ならびにｐ５３遺伝子生成物中の突然変異に相関しない多くの遺伝性癌の染色体局在化に非常に近い。ＰＥＤＦは従ってこれらの癌の第一の候補遺伝子になった。
【００２１】
完全長ゲノムＰＥＤＦ配列は配列ＩＤ番号：４３に示されている。ＰＥＤＦ遺伝子は約１６ｋｂであり、８つのエクソン（そのすべては保存的共通スプライス部位を持っている）を含んでいる。ＰＥＤＦ遺伝子の５’−隣接部位は２つのＡｌｕ反復要素を含んでおり、それは推定プロモーター配列の最初の１０５０ｂｐの約３分の２を占めている。転写因子のいくつかのファミリーのメンバーで認識されるであろういくつかの配列モチーフも存在する。偏在する転写因子のオクタマーファミリーの２つの可能な結合部位の存在は、試験されたほとんどの組織にＰＥＤＦが存在することを説明しているであろう。しかしながら、他のより特異的な要素の存在はＰＥＤＦが厳密な制御下にあることを示唆し、神経分化および線維芽細胞老化のような多様な過程に対する効果が含まれる従来の研究を支持している。
【００２２】
ゲノムＰＥＤＦ配列またはその断片は細胞における遺伝子検出のためのプローブとして有用である。加えて、そのようなプローブはその遺伝子を運んでいる細胞型の同定のためのキットに有用である。遺伝子構成の中の突然変異、欠損または他の変化はＰＥＤＦゲノム配列から誘導されるＤＮＡプローブを使用することにより検出できる。
【００２３】
（組織分布）
ＰＥＤＦはＲＰＥ細胞によって特に高く発現されるが、ほとんどの組織、細胞型、腫瘍などでノーザンおよびウェスタンブロット分析により検出可能である。例えば、硝子体液および眼房液に容易に検出される。ＰＥＤＦの細胞内局在化という重要な問題も追求されている。ＰＥＤＦの大部分は分泌されるようであるが、培養サルＲＰＥ細胞の探査にＰＥＤＦ抗体を用いたところ、核ならびに細胞質の非常に特異的な細胞骨格構造にＰＥＤＦが付随することが観察された。重要なことは、このことが試験された細胞の年齢および特定の細胞周期状態で変化することである。例えば、付着の最初の段階で基層と相互作用する霊長類ＲＰＥ細胞の偽足の先端に本タンパク質は濃縮されるようである。その後、この染色は消失し、特異的細胞骨格構造および核に付随して本タンパク質が出現する。従って、ＰＥＤＦは核および細胞質の両方で重要な細胞内の役割を果たしているようである。
【００２４】
（細胞周期の関与）
本発明は分裂中の未分化Ｙ−７９細胞では発現し、および対応する静止状態の分化細胞ではわずかな発現または無発現であることを示している（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ、ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９：２６６−２７２）。Ｐｉｇｎｏｌｏ
ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２９４９−２９５、はＷＩ−３８線維芽細胞中のＰＥＤＦの合成は若い細胞の細胞周期のＧ０段階に限定されることを示している。さらに、年をとった老化細胞においては、ＰＥＤＦ メッセンジャーＲＮＡは存在しない。
【００２５】
（組換え体ＰＥＤＦの産生）
ＰＥＤＦポリペプチドを分節に区切って研究することは構造−機能の研究では基本的なことである。この目的ために、ＰＥＤＦコード配列の断片を含む発現ベクターがＰＥＤＦポリペプチドの異なった領域の合成および単離のために優れた断片源を提供する。ヒト胎児ＰＥＤＦ配列の発現は大腸菌発現ベクターおよびヒト胎児ＰＥＤＦ ｃＤＮＡにより達成された。組換え体ＰＥＤＦ生成物（ｒＰＥＤＦ）は生物学的に活性な神経栄養性因子であり、湿潤大腸菌グラム当たり１．３ｍｇのオーダーの収量で得られることが示された。端が切断されたペプチドはまた適当な分子生物学的構築物を大腸菌で発現させても作製できる。これらの生成物を用い、ＰＥＤＦ一次構造上の２つの独特な領域が１）タンパク質のＮ−末端近くのアミノ酸残基４４−１２１内に位置し、分子に神経栄養性活性を与える”活性部位”、および２）セルピンの露出ループと相同的であるＣ−末端近くの領域（即ち、”古典的”セルピン活性部位）が区別できた。これらの結果は、１）神経突起成長にはＰＥＤＦの全部の天然コンホメーションは必要とされない、および２）セリンプロテアーゼの阻害ではＰＥＤＦの生物学的活性は説明できないことが示唆される。タンパク質配列を覆う一連の端が切断されたｒＰＥＤＦ構築物が得られ、Ｎ−末端近くの特異的神経栄養性”活性部位”の正確な位置を決めることができた。
【００２６】
（高度に特異的なポリクローナル抗体での特性付け）
精製された組換え体ヒトＰＥＤＦは、ＰＥＤＦ媒介神経栄養性活性を特異的に阻害するポリクローナル抗体（”抗−ｒＰＥＤＦ”）の開発に使用された。さらに、抗−ｒＰＥＤＦは完全にＩＰＭ誘導神経栄養性活性を阻害した。
【００２７】
（ＰＥＤＦの神経栄養性特性）
Ｙ−７９およびＷｅｒｉ腫瘍細胞系において天然ＰＥＤＦおよびｒＰＥＤＦが神経栄養性であることを示すことに加え、本発明はＰＥＤＦが初代培養の正常ニューロンに効果を示すかどうかを決定した。この目的のため、生後８日のラットから調製された正常小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）の培養物を用いて研究が実施された。ｒＰＥＤＦで処理された細胞はより神経的形態的外観を示すことにより処置には応答しなかった。しかしながら、ＰＥＤＦは顆粒細胞生存に大きな効果を示した。これらの細胞は腫瘍性または形質転換細胞ではないので、これらは培養で限られた寿命しかなく、培養培地に依存して約２１日で死んでゆく。しかしながら、ＰＥＤＦ処理培養物は非処理培養物と比較して無血清培地中、培養１０日後に１０倍の細胞を含んでいた（図４）。これらの結果は；１）直接的顕微鏡観察および細胞計数、および２）生きている細胞数を決定するＭＴＳ（テトラゾリウム／ホルマザン）アッセイにより決定された（実施例１１参照）。従って、ＰＥＤＦはＣＮＳニューロン生存に劇的な効果を示し、近年明らかにされつつある”神経細胞栄養性”タンパク質の数少ないリストに加えられるべきである。
【００２８】
一般的な組織培養研究：
ニューロンおよびグリアを用いる組織培養実験で一般的に悩まされる２つの問題は、ニューロンは急速に死にがちであり、グリアは培養皿を乗り越えがちであることである。ＰＥＤＦまたはそのペプチドは両方の点を助けることができる。従って、ＰＥＤＦの商業的使用の一つは、ＣＮＳ細胞が培養される場合の一般的な培養培地添加物としてであろう。
【００２９】
ＣＮＳ移植研究：
ニューロンの移植はある種の病理を治療すると考えられている。例えば、パーキンソン疾患において、特定の胎児脳細胞の患者への移植は疾患に付随する問題を軽減または治療できるであろう。しかしながら、一つの大きな問題は移植された細胞の生存を延ばすこと、およびそれらを分化したまま維持すること（例えば、適当な物質を分泌するように）であろう。細胞をＰＥＤＦで前処理すると、これらの両方の面での助けになる。同様に、移植前にニューロンまたは大グリア細胞をＰＥＤＦでトランスフェクトすると、移植部位で長期間のＰＥＤＦ源であることができる。
【００３０】
盲目治療を助けるため、神経網膜および光受容体細胞の移植の試みが盛んである。現在まで、これらの試みは移植片の非分化および死滅の両方のため実を結んでいない。このような場合にも、ＰＥＤＦは両方の点で助けになるであろう。特に、手術前に移植される光受容体ニューロンはＰＥＤＦまたは細胞内へトランスフェクトされた遺伝子で前処理できる。もしくは、ＰＥＤＦは高レベルで隣接する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞内へトランスフェクトでき、そこでタンパク質の過剰な供給源として働くことができる。幾人かの研究者は、培養ＲＰＥ細胞が試験動物の光受容体空間内への移植後に非常によく生存していることを示している。インビトロでのヒトＲＰＥ細胞のＰＥＤＦ遺伝子によるトランスフェクション、続いてのそれらの網膜移植での使用が容易である。
【００３１】
神経消耗性疾患：
ＣＮＳ（脳および網膜）に対する多くの神経消耗性疾患およびその他の障害はニューロンの死亡およびグリアの過密（グリオシス）により代表される。ＰＥＤＦはこれらの状態において、一次ニューロンの寿命および機能発揮を延長するため、およびグリアの進出をくい止めるために有効に使用できる。例えば、ＰＥＤＦはＣＮＳ障害に応答した小グリア活性化を阻害し、ならびにニューロンの命を延長／助命するのに有効で有り得る。
【００３２】
網膜において、ＰＥＤＦがミュラーグリア細胞を阻害することが予測できる。
【００３３】
ミュラー細胞は大グリア細胞と類似しているので、ＰＥＤＦは同様に網膜剥離、糖尿病、色素性網膜炎などのような病態でのグリオシスの防止ならびに網膜ニューロンの助命に有効であろう。
【００３４】
グリア癌：
ＣＮＳを攻撃する癌の主要な型のほとんどにグリア要素が含まれており、ＰＥＤＦは他の形の療法と組み合わせて使用できるグリア静止因子である。例えば、手術に加えて、ＰＥＤＦは疾患の拡散または再発を有効に阻害できる。
【００３５】
（遺伝的分析）
本発明はヒトＰＥＤＦ遺伝子およびそのプロモーターの構成の決定およびその進化的相関および種々のヒト胎児および成人組織での発現に関している。
【００３６】
本発明は、なかでもＰＥＤＦをコードしている核酸を提供する。特に、ｃＤＮＡ配列が配列ＩＤ番号：１に示したように提供される。このｃＤＮＡは配列ＩＤ番号：２に示したアミノ酸配列を持つＰＥＤＦをコードしている。さらなるゲノム配列は図１のように地図作製がされ、配列ＩＤ番号：４３が提供される。ゲノムＰＥＤＦ配列の追加の断片は配列ＩＤ番号：９から配列ＩＤ番号：１２に提供されている。イントロンーエクソン連結の位置は表１および配列ＩＤ番号：２５から配列ＩＤ番号：４０および配列ＩＤ番号：４３に同定されている。
【００３７】
術語”核酸”とはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のポリマーを称し、それらは任意の源から誘導でき、一本鎖でも二本鎖でもよく、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマー内へ取り込むことができる合成、非天然または改変ヌクレオチドを場合により含むことができる。本発明の核酸は好適にはＤＮＡのセグメントである。
【００３８】
本発明ではさらに、ＰＥＤＦの端が切断されたものが提供される。これらの内最も大きいものはｒＰＥＤＦと称され、ＰＥＤＦのＡｓｐ４４．．．Ｐｒｏ４１８に融合したアミノ酸配列Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅを含んでいる（アミノ末端が欠失している）。ｒＰＥＤＦタンパク質は配列ＩＤ番号：３のアミノ酸配列を含んでいる。本発明はまたｒＰＥＤＦのアミノ酸配列を含むタンパク質（即ち、配列ＩＤ番号：３のアミノ酸配列）をコードしている核酸も提供する。
【００３９】
遺伝子コードの縮重およびいわゆる”Ｗｏｂｂｌｅルール”と呼ばれている古典的塩基対生成のコドンの第三位に例外が許されるという観点から、与えられた任意のタンパク質は一つ以上の核酸によりコードされうることを当業者は理解するであろう。従って、本発明は配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：３ならびに等価なタンパク質のアミノ酸配列をコードするすべての核酸を包含している。句”等価な核酸”とはすべてのこれらの核酸を包含することを意図している。
【００４０】
特定のタンパク質の機能に不利に影響することなくアミノ酸配列を変更できることも当業者は理解するであろう。実際、アミノ酸配列のいくつかの変更はタンパク質に改良された特性を与える。どのアミノ酸をタンパク質の機能に不利に影響することなく変更してもよいかの決定は当業者にはよく知られている。さらに、より多くのまたはより少ないアミノ酸を含むタンパク質でも機能的に等価なタンパク質を生じることができる。従って、本発明はＰＥＤＦタンパク質またはその機能的タンパク質断片を生じるすべてのアミノ酸配列を包含することが意図されている。
【００４１】
可能な等価な核酸および等価なタンパク質のいくつかの例には、ｒＰＥＤＦタンパク質およびその等価なタンパク質断片の合成に関する置換、付加または欠失を持つ核酸；ｒＰＥＤＦタンパク質の産生に関する異なった制御配列を持つ核酸；タンパク質のアミノ末端に合同した４つ以外の異なったアミノ酸および／またはアミノ酸の数を持つｒＰＥＤＦの変異体；および活性に不利に影響しないアミノ酸置換、付加、欠失、修飾および／またはグリコシル化のような翻訳後修飾を持つＰＥＤＦおよびｒＰＥＤＦおよびその機能的タンパク質断片が含まれる。神経栄養性活性はＰＥＤＦの特定の部分に関連しているので、これらの残基を含むタンパク質断片は明らかに本発明の範囲内である。
【００４２】
本発明はまた、配列ＩＤ番号：１の核酸、配列ＩＤ番号：２または等価なタンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしている核酸、配列ＩＤ番号：３または保存的に修飾された変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードしている核酸、および保存的に修飾されたそれらの核酸の変異体を含むベクターも提供する。
【００４３】
特に、本発明は配列ＩＤ番号：１の核酸を含むベクターπＦＳ１７、および配列ＩＤ番号：３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている核酸を含むベクターｐＥＶ−ＢＨを提供する。記載されたｃＤＮＡ挿入物は別のベクターにも存在できることを当業者は理解するであろう。例えば、挿入物はファージ、ウイルス、カプシド、プラスミド、コスミド、ファージミド、ＹＡＣまたはファージまたはウイルスカプシドの外側に結合されたような異なった性質を持つベクターに存在できる。ベクターは宿主域、安定性、複製および維持を異にすることができる。さらに、ベクターはクローン化挿入物に及ぼす制御の型を異にすることができる。例えば、ベクターはクローン化挿入物を異なったプロモーター、エンハンサーまたはリボソーム結合部位の制御下に置くことができ、またはそれをトランスポゾンまたは移動性遺伝要素の一部として構成することさえ行う。
【００４４】
本発明は、配列ＩＤ番号：１の核酸、配列ＩＤ番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質または等価なタンパク質をコードしている核酸、配列ＩＤ番号：３のアミノ酸からなるタンパク質または等価なタンパク質をコードしている核酸を含むベクターが導入されている宿主細胞も提供する。特に宿主細胞は配列ＩＤ番号：１の核酸を含むベクターπＦＳ１７、または配列ＩＤ番号：３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている核酸を含むベクターｐＥＶ−ＢＨを持っている。
【００４５】
本発明のベクターは真核生物または原核生物を問わず任意の適した宿主細胞内に導入できる。これらの宿主細胞は増殖のための好適な条件、栄養要求および環境の試薬への感受性が異なっているであろう。宿主細胞内へベクターを導入する任意の適した手段が用いられる。原核生物細胞の場合、ベクター導入は例えばエレクトロポレーション、形質転換、トランスダクション、コンジュゲーションまたはモビリゼーションにより達成される。真核生物細胞の場合、ベクター導入は例えばエレクトロポレーション、トランスフェクション、感染、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルまたは原形質体融合を使用することにより導入されるであろう。
【００４６】
導入された核酸の形は宿主細胞内へのベクターを導入するために使用された方法により変化するであろう。例えば、ベクターが自己複製要素として維持されているか、プロウイルスまたはプロファージとして組み込まれているか、過渡的にトランスフェクトされているか、過渡的に複製不能ウイルスまたはファージと感染されているか、または一重または二重交差組換えにより安定に導入されているかに依存して核酸は閉環状か、ニックされているかまたは直線状であろう。
【００４７】
本発明はまた、ＰＥＤＦ、ｒＰＥＤＦおよび等価なタンパク質を産生する方法を提供し、その方法はタンパク質を宿主細胞で発現することを特徴としている。例えば、配列ＩＤ番号：１の核酸、配列ＩＤ番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質または等価なタンパク質をコードしている核酸、配列ＩＤ番号：３のアミノ酸からなるタンパク質または等価なタンパク質をコードしている核酸またはそれらと等価な核酸を含むベクターが導入されている宿主細胞が所望のタンパク質を産生するのに適した条件下で培養されるであろう。特に、配列ＩＤ番号：１の核酸を含むベクターπＦＳ１７、または配列ＩＤ番号：３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている核酸を含むベクターｐＥＶ−ＢＨは各々配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：３のアミノ酸配列からなるタンパク質を産生するのに適した条件下で培養されるであろう。
【００４８】
本発明はまた、所望のタンパク質を産生するために適当な宿主細胞を培養する前記の本発明に従ってされる組換え的に産生されたＰＥＤＦおよびその機能的タンパク質断片も提供する。組換え的手段によるＰＥＤＦのようなタンパク質の産生は、高度に生成された状態で、天然に存在する供給器官から単離および生成されたタンパク質に付随するであろう疾病原因物質を含まずに多量のタンパク質の入手が可能であり、例えば、そのようなタンパク質源として胎児組織を使用する必要性をなくする。
【００４９】
組換え体ＰＥＤＦおよびその機能的タンパク質断片は、例えば、そのタンパク質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡの様な核酸の導入を含む種々の手段により細胞に対し活性な試薬として供給され、従って、宿主細胞内で転写および／または翻訳されるであろうし、外因性タンパク質の添加および他の適した投与手段は当業者には既知であろう。供給されるのがどのような形であれ、活性試薬は単独で、または投与法に適した活性試薬の医薬組成物および処方を用いて他の活性試薬と組み合わせて使用される。医薬として適した賦形剤（即ち、賦形薬、補助剤、担体または希釈剤）は当業者にはよく知られており、容易に入手可能である。賦形剤の選択は特定の化合物ならびに化合物を投与するのに使用される特定の方法により部分的に決定されるであろう。従って、本発明の範囲内で調製できる多くの種類の適した処方が存在する。しかしながら、組換え体タンパク質の神経栄養性、神経細胞栄養性およびグリア細胞静止活性を変化させない医薬として受容可能な賦形剤が好適である。
【００５０】
以下の実施例は本発明をさらに例示するためのものであり、どうあろうとその範囲を制限していると解釈するべきではない。
【実施例】
【００５１】
（実施例１）
この実施例は、ＰＥＤＦのトリプシン加水分解と生じる断片のアミノ酸配列決定について記載している。
【００５２】
ＰＥＤＦはヒト胎児ＲＰＥ細胞の初代培養培地の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製された。ＨＰＬＣ精製されたＰＥＤＦは還元されアルキル化された。その後、それを乾燥し５０μｌのＣＲＡ緩衝液（８Ｍ尿素、０．４Ｍ炭酸アンモニウム、ｐＨ８．０）に溶解し、５μｌの４５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を加えた。１５分、５０℃で加熱後、溶液を冷却し、５μｌの１００ｍＭヨード酢酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を加えた。１５分後、溶液は２Ｍ尿素の濃度になるように希釈し、１：２５（ｗｔ／ｗｔ）の酵素：基質比を用いて２２時間、３７℃でトリプシン加水分解（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）させた。トリプシン分解ペプチドはＶｙｄａｃ２．１ｍｍｘ１５０ｍｍＣ１８カラムを用い、１０４０ダイオードアレイ検出器を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ１０９０ＨＰＬＣによるナロウボア逆相ＨＰＬＣにより分離した。流速は１５０μｌ／分であり、０分に５％Ｂ、６３分に３３％Ｂ、９５分に６０％Ｂ、１０５分に８０％Ｂのグラディエントを用いた。このグラディエントでは、緩衝液Ａは０．０６％トリフルオロ酢酸水溶液、緩衝液Ｂは０．０５５％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルであった。クロマトグラフィーのデータは２１０ｎｍと２７７ｎｍ（および２０９ｎｍから３２１ｎｍのＵＶスペクトル）でそれぞれのピークを得た。Ｎ末端配列分析のための試料はポリブレン前処理したグラスファイバーフィルターを通し、自動エドマン分解（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｉｃｒｓｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）ＡＢＩ型４７７Ａ気相タンパク質シークエンサー（プログラムＮＯＲＭＡＬ１）にかけた。生じるフェニルヒダントイン化アミノ酸分画はオンラインＡＢＩモデル１２０Ａ ＨＰＬＣとＳｈｉｍａｚｕ ＣＲ４Ａ インテグレーターを用いて手動で同定した。
【００５３】
精製ＰＥＤＦのトリプシン加水分解と得られた断片のアミノ酸分析により
【００５４】
【数１】
【００５５】
を含む非重複ペプチド配列が得られた。
【００５６】
（実施例２）
この実施例は実施例１のペプチド配列に基づいたオリゴヌクレオチドの構築、ＰＥＤＦ
ｃＤＮＡの単離におけるオリゴヌクレオチドの使用、およびＰＥＤＦｃＤＮＡの配列決定について記載している。
【００５７】
実施例１のＪＴ−３とＪＴ−８ペプチド配列およびコドン利用データに基づき、オリゴヌクレオチド、ｏＦＳ５６６５（配列ＩＤ番号：４）：５’−ＡＧＹＡＡＹＴＴＹＴＡＹＧＡＹＣＴＳＴＡ−３’およびｏＦＳ５６６７（配列ＩＤ番号：５）：５’−ＣＴＹＴＣＹＴＣＲＴＣＳＡＧＲＴＡＲＡＡ−３’はＡＢＩ ３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機により構築し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして用いた。
【００５８】
ヒト胎児目Ｃｈａｒｏｎ ＢＳ ｃＤＮＡライブラリー（Ｋｅｌｌｏｇ Ｅｙｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ の Ｄｒ．Ａ．Ｓｗａｒｏｏｐ から提供された）は一度増幅（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９））し、Ｔｅｃｈｎｅ熱サイクラーおよび標準試薬（ＧｅｎｅＡＭＰ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用いた（ただし、３ｍＭでＭｇＳＯ４を使用した）ＰＣＲ（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｒｅｅｉｎｇ ｏｆ λｇｔｌｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｉｎ：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）、ｐｐ．２５３−２６０）でスクリーニングした。約３５０ｂｐのＰＣＲ増幅断片はＮＡ−４５ ＤＥＡＥ−セルロース紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｅｕｌｌ）を用いて３％ＮｕＳｉｅｖｅ３：１ゲル（ＦＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）上に分離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上記文献）。断片はランダムプライミング（ランダムプライミングキット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）によりα３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）で標識し、ヒト胎児目ライブラリーの２００、０００プラーク形成単位（ＰＦＵ）をスクリーンするのに用いた。
【００５９】
８つの陽性なクローンが単離され（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上記文献）、陽性クローンのＤＮＡはＱｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ 製造プロトコール（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）に従って精製された。この陽性クローンの挿入物はＮｏｔＩ（ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で切り出し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で環化し、大腸菌Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｓｕｒｅコンピーテント細胞（Ｓｔａｒｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に形質転換させ、アンピシリンおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクドシド（Ｘ−ｇａｌ）を含んだルリアブロス（ＬＢ）プレートに蒔いた。
【００６０】
白いコロニーが選択され（そのようなコロニーは挿入物を持っていなければならないことに基づいて）、単一コロニー培養からのプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ プラスミド
ミニプレップ プロトコールに従って分離した。精製プラスミドは ＥｃｏＲＩ と ＨｉｎｄＩＩＩ（ＢＲＬ）で消化した。これらの制限部位は挿入物の５’と３’末端にリンカーを連結反応させてライブラリー構築している間に加えられたもので、従ってＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化により単離されたプラスミドに存在する挿入物が切り出される。これらのフラグメントは挿入物の大きさを決定するため０．７％アガロースゲルで電気泳動した。最大の挿入物を持つプラスミド（即ち、πＦＳ１７）が地図作製のため、およびクローンの同一性を確認するため、続いてＳｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０ シークエンシング キット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を用いての配列決定のために選択された。配列分析はＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウェアーパッケージ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）およびＧｅｎＢａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｉｎｔｅｌｌｉｎｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を利用して行った。
【００６１】
πＦＳ１７の配列分析は、配列ＩＤ番号：２の４１８個のアミノ酸をコードする長い読み枠（ＯＲＦ）を持つ配列ＩＤ番号：１、典型的なＡＴＧ開始コドンおよびポリアデニル化信号（配列ＩＤ番号：１には示されていない）からなる塩基配列を明らかにした。クローンのコード配列は前にＰＥＤＦペプチドとして決定された配列と全て正確に同一であった。演繹されるアミノ酸配列はシグナルペプチドとして働く事のできる親水性アミノ酸の広がりを含んでいる。コード配列とペプチド配列をＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａ Ｂａｎｋで比較するとＰＥＤＦはセルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）遺伝子ファミリー（ヒト［α］−１−アンチトリプシンを含んでいる）と有意な相同性を持つ独特のタンパク質である。この遺伝子ファミリーのある群は神経栄養性活性を示すけれど（Ｍｏｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、５８、３５９−３６４；Ｍｏｎａｒｄ（１９８８）ＴＩＮＳ、１１、５４１−５４４）、ＰＥＤＦはセルピンの反応性ドメインの共通配列として提案されている配列を欠いている。
【００６２】
（実施例３）
この実施例は組換え体ＰＥＤＦ生産のための発現ベクターの構築について記載している。
【００６３】
発現ベクターは実施例２で述べたようにヒトＰＥＤＦの完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドπＦＳ１７を用いて構築した。ＰＥＤＦをコードしている配列はベクターｐＥＶＢＨを得るためにプラスミドｐＥＶ−ｖｒｆ２（Ｃｒｏｗｌ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、３８、３１−３８（１９８５））中に存在するバクテリオファージ ラムダ ＰＬプロモーターの制御下におかれた。このことはＰＥＤＦコード領域（即ち、配列ＩＤ番号：１のヌクレオチド２４５番から１４９０番）の部分を含むπＦＳ１７のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩでプラスミドｐＥＶ−ｖｒｆ２を消化し、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）で充填反応して両方の断片を平滑にし、生じた平滑端／適合終結断片を互いに結合させることにより達成された。得られたベクターｐＥＶ−ＢＨはシャインーダルガノ（ＳＤ）配列とＰＥＤＦコード領域との間に８つのヌクレオチドの距離を有した。構築物は配列ＩＤ番号：３に示されているような３７９個のアミノ酸のタンパク質（ｒＰＥＤＦとして知られている）がコードされるようにＭｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｌｅ−Ａｓｐ４４−−−−Ｐｒｏ４１８を特定している。ｒＰＥＤＦタンパク質のアミノ末端のアミノ酸は天然のＰＥＤＦには無く、ｐＥＶ−ＢＨの構築中に核酸が融合することで生ずるものである。
【００６４】
ｐＥＶ−ＢＨによる組換えＰＥＤＦタンパク質の生産を立証するため、このプラスミドを、熱感受性λｃＩＡｔ２リプレッサー（Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８、４８２−４９２）の遺伝子を含む低コピー数適合プラスミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓを有する大腸菌ＲＲＩ株（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）で繁殖させた。タンパク質誘導はＢｅｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０、１１７０７−１１７１９、に記載されているように実施されたが、以下のような変更を行った。ｐＥＶ−ＢＨを含んでいる細菌細胞は３２℃、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含んだＬＢ培地で早期対数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．２）まで増殖させた。培養の温度は６５℃の温浴中でフラスコをインキュベートさせる事で急激に４２℃に上げ、細菌は続いて３４０ｒｐｍエアーフローインキュベーター中で２−３時間、４２℃で増殖させた。一部を取り６００ｎｍで吸収度を読みとった。
【００６５】
タンパク質誘導に続いて合成された初期タンパク質は放射性標識された。培養液が４２℃に達したら、１５０μＣｉのＬ−［３５Ｓ］メチオニン（１０４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を培養液ｍｌ当たりに加え、インキュベートを４２℃で１０分間および３０分間続けた。細胞は遠心分離により回収し、ＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄した。総細菌抽出物からの３５Ｓ−標識されたペプチドを再溶解し、ＳＤＳ−１２％ ＰＡＧＥ続いてフルオログラフィーにより分析した。４２，８２０Ｍｒポリペプチドに対応するバンドが１０分および３０分の後誘導で検出された。ｐＥＶ−ＢＨによって発現した組換え体タンパク質の大きさはｐＥＶ−ＢＨにサブクローンされたコード配列に期待される大きさと一致していた。同様の方法でより小さい断片（ＢＰ＝２８，０００Ｍｒ；ＢＸ＝２４，０００Ｍｒ；ＢＡ＝９，０００Ｍｒ）が合成でき、精製できる。ＢＰペプチドはＰＥＤＦアミノ酸の４４番目から２６９番目を含み、ＢＸペプチドはＰＥＦアミノ酸の４４番目から２２７番目を含み、ＢＡペプチドはＰＥＤＦアミノ酸の４４番目から１２１番目を含んでいる。
【００６６】
（実施例４）
この実施例は完全長ＰＥＤＦ ｃＤＮＡを含んだ発現ベクターの構築について記載している。
【００６７】
ｐＥＶ−ＢＶの構築について実施例３に記載された方法と類似の方法で、プラスミドπＦＳ１７のＰＥＤＦ ＯＲＦがプラスミドｐＲＣ２３とｐＥＶ−ｖｒｆ１（Ｃｒｏｗｌ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ、３８、３１−３８（１９８５））中に存在するバクテリオファージラムダＰＬプロモーターの制御下におかれた。このことはＰＥＤＦ ｃＤＮＡ（即ち、配列ＩＤ番号：１のヌクレオチド１０７から１４９０）の部分を含むπＦＳ１７のＳｆａＮＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩでプラスミドを消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）によるＳｆａＮＩとＥｃｏＲＩ末端の充填反応で平滑端化し、生じた平滑末端化／適合末端化断片をお互いに結合させることにより行った。得られたベクターｐＲＣ−ＳＨおよびｐＥＶ−ＳＨは、ＳＤ配列およびＰＥＤＦコード領域の間に各々１４と８個のヌクレオチドの距離を置いていた。構築物ｐＲＣ−ＳＨは完全長ＰＥＤＦ ＯＲＦ、配列ＩＤ番号：２に示したように天然に存在するアミノ末端を持つ４１８のアミノ酸のＰＥＤＦタンパク質を特定している。構築物ｐＥＶ−ＳＨは、完全長のＰＥＤＦＯＲＦを含み、配列ＩＤ番号：２のＰＥＤＦ配列の前にＭｅｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列ＩＤ番号：８）を持つ４２５個のアミノ酸のＰＥＤＦアミノ末端融合タンパク質を特定する。これらのつけ加えたアミノ末端のアミノ酸は天然のＰＥＤＦでは生ぜず、これらの付加アミノ酸を特定するｐＥＶ−ＳＨのコドンはｐＥＶ−ＳＨの構築中に核酸の融合によって生じる。
【００６８】
２つのベクターによって特定される組換え体タンパク質の生産を確認するため、ベクターを大腸菌株ＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ）に導入し、例３に示した方法と類似の方法で誘導し、その間の３５Ｓ−メチオニンによる代謝標識により、タンパク質誘導が実施され、モニターされた。誘導されたｐＲＣ−ＳＨおよびｐＥＶ−ＳＨによって特定されたタンパク質の発現は、細菌細胞の増殖に負の効果を持っていた。親のプラスミドを含んだ細菌培養と比較すると、ｐＲＣ−ＳＨおよびｐＥＶ−ＳＨを含んだ細菌培養はより遅く増殖し、分割した。この細菌の増殖に対する負の効果は、開始コドンとＳＤの間の距離に関連があり、そのことはそのような距離を短くする事でより効率の良い組換え体タンパク質の翻訳につながることを示唆する。ＰＥＤＦの４６，０００Ｍｒの候補ポリペプチドは、ｐＲＣ−ＳＨとｐＥＶ−ＳＨを含む細菌培養中の培養液や細胞溶解物には検出されなかった。しかしながら、３５，０００Ｍｒタンパク質はｐＲＣ−ＳＨとｐＥＶ−ＳＨを含む培養物の抽出物に見られたが、親プラスミドを含んだ培養物の抽出物には見られなかった。この事はＰＥＤＦのアミノ終末末端はプロテアーゼ感受性であり、組換え体完全長ＰＥＤＦはこの特定の宿主中で代謝されるという事を示唆している。もしくは、期待された大きさの組換え体ＰＥＤＦタンパク質が観察されなかった事は実験上の人為的結果によるものを反映していると思われ、代わりの発現ベクター、宿主、誘導可能プロモーター、サブクローニング部位、組換え体タンパク質の単離または検出の方法あるいはタンパク質誘導の手段を用いることで克服できるであろう。
【００６９】
（実施例５）
この実施例は組換えにより生成されるＰＥＤＦを大量に生成する方法について記載している。
【００７０】
ｒＰＥＤＦを含んでいる総重量が１ｇの大腸菌を５０ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０％ シュークロース、１ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁した。細菌は氷の上に１０分間放置し、４０００ｘｇで遠心分離して沈降させ、５０ｍｌの氷冷した水に１０分間懸濁させた。溶解した外側の細胞壁は８０００ｘｇで遠心分離してスフェロプラストから分離した。
【００７１】
ペレット状のスフェロプラストは５ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌペプスタチンおよび２０μｇ／ｍｌのアプロチニンを含む１０ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再懸濁させた。懸濁液は細胞膜を破壊するためソニケーター（Ｕｌｔｒａｓｏｉｃｓ、Ｉｎｃ．、モデルＷ−２２５）でプローブ音波処理を行った。３０秒の間を置きながら３０秒パルスで三回破壊し、この処理中、試料は氷水中に浸して行った。ＲＮａｓｅ ＴＩ（１３００ユニット、ＢＲＬ）およびＤＮａｓｅ Ｉ（５００μｇ，ＢＲＬ）を音波処理された細胞懸濁液に加え、懸濁液は１０分間室温でインキュベートした。この懸濁液は５ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、２０μｇ／ｍｌアプロチニンを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）４０ｍｌを加えて希釈し、粗封入体は１３，０００ｇ、３０分間遠心分離で沈降させた。封入体を構成している粒子性物質は２５％シュークロース、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ トリトンＸ−１００を含んでいる４０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートし、２４，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。洗浄工程は３回繰り返した。最終的に、封入体は５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、５Ｍグアニジン−Ｃｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる変性緩衝液１０ｍｌに再懸濁させた。懸濁液は氷水中で５秒間、手短にプローブ音波処理した。得られた懸濁液は氷上でさらに１時間インキュベートした。１２，０００ｘｇ、３０分間遠心分離後、上清を５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ ８．０、２０％ グリセロール、１ｍＭ ＤＤＴ、１μｇ／ｍｌのペプスタチンおよび２０μｇ／ｍｌのアプロチニンを含む復元緩衝液１００ｍｌに加え、タンパク質を復元するため４℃で一晩中静かにかき混ぜた。可溶および不溶分画は１３，５００ｘｇで３０分間の遠心分離により分離された。
【００７２】
可溶性分画はそれらをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０微量濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ Ｄｉｖ．、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．、Ｂｅｒｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて１ｍｌに濃縮する事でさらに精製し、それは緩衝液Ａ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ、２０％ グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、１ｍＭベンズアミジン）に対して４℃で３時間透析をした。透析抽出物はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（モデル５４１５Ｃ）で１４，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上清分画は緩衝液Ａで予め平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ−ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｎｅｗ Ｍａｒｋｅｔ、ＮＪ）カラム（１ｍｌベッド容量）に層積した。カラムは２倍のカラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。最終的に、組換え体ｒＰＥＤＦは緩衝液Ａに５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００ｍＭのＮａＣｌを加えて段階的濃度勾配で溶出させた。１ｍｌの分画を重力流出によって回収され、緩衝液Ａに対して透析した。組換え体ｒＰＥＤＦを含む分画３００は−２０℃で保存した。分画３００の回収率は細胞パック１ｇ当たり５０μｇで、それは総タンパク質の２５％に値する。
【００７３】
ｒＰＥＤＦの殆どは６Ｍグアニジウム−Ｃｌを含む１０ｍｌの緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）に分画を溶解することにより不溶性分画から回収された。溶液は１０，０００ｘｇで５分間、遠心分離した。その上清は４Ｍ グアニジウム−Ｃｌを含む緩衝液Ｂで予め平衡化した２つのＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｎｅｗ Ｍａｒｋｅｔ、ＮＪ）カラム（各々２．６ｃｍｘ９５ｃｍ）を縦列につないだ物の上に層積した。流速は３ｍｌ／分であった。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムから得られた組換え体ｒＰＥＤＦを含んでいる分画はプールし、緩衝液Ｃ（４Ｍ尿素、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１ｍＭベンズアミジン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、４ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して透析した。透析分画は０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｒ−ＧＶ、Ｍｉｌｌｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を通過させた。濾液は緩衝液Ｃで予め平衡化したｍｏｎｏ−Ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｎｅｗ Ｍａｒｋｅｔ、ＮＪ）カラム（１ｃｍｘ１０ｃｍ、ｄｘｈ）に層積した。カラムは緩衝液Ｃで洗浄し、組換え体ｒＰＥＤＦは０．５ｍｌ／分で緩衝液Ｃ中の０ｍＭ−５００ｍＭ ＮａＣｌ濃度勾配で溶出させた。２ｍｌずつの分画を回収し、組換え体ｒＰＥＤＦのピーク分画をプールした。プールした分画中の回収率は細胞パック１ｇ当たり０．５ｍｇの組換え体ｒＰＥＤＦであった。
【００７４】
（実施例６）
この実施例は精製組換え体ＰＥＤＦの分化因子としての使用について記載している。
【００７５】
Ｙ７９細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ１８）は１５％ウシ胎児血清と抗生物質（１００００ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）を補給したアール塩を含むイーグル最少必須培地（ＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーターで増殖させた。細胞はＡＴＣＣから受容後、２回継代して繁殖させ、１０％ＤＭＳＯを含む同じ培養液で凍結させた。凍結物の一部を各々の分化の実験に用いた。全ての実験は二回反復で行った。
【００７６】
融解後、細胞は継代することなく適当な細胞数になるまで血清含有培地に維持された。細胞は遠心分離で回収し２倍量のＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁して、計数した。その時点で、２．５ｘ１０５の細胞を２ｍｌの無血清培地（ＭＥＭ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｘ非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１％ ＩＴＳ混合物（５μｇ／ｍｌインシュリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレン、Ｃｏｌｉａｂｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）および上記の抗生物質が補給されている）を含む６ウェルプレート（Ｎａｎｃ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の各々のウェルに播種した。
【００７７】
分化エフェクターと対照緩衝液は播種後１２−１６時間後に加え、培養液はインキュベートし７日間静置した。８日目に、細胞はポリＤ−リシン被覆６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移し、細胞が基質に付着したころ古い培養液を２ｍｌの新鮮な無血清培地と入れ替えた。培養液はこの状態に１１日間保った。付着後、培養物は毎日Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＫ２位相差顕微鏡を用いて分化の形態学的証拠を調べ、ならびに神経芽成長を定量した。
【００７８】
非処理の細胞と比較すると、組換え体ｒＰＥＤＦに暴露されたＹ７９培養細胞のみが神経的分化の有意な証拠を示した。いくらかの神経芽成長（５％以下）はｒＰＥＤＦの溶解に用いたものと同一の緩衝液で処理した対照培養で検出されたが、ｒＰＥＤＦまたは緩衝液を加えずに同じ方法で処理した培養では分化の証拠は観察されなかった（図２２Ａ、”対照”）。ｒＰＥＤＦ処理培養細胞の位相差顕微鏡は、細胞凝集体の５０−６５％はポリ−Ｄ−リシンへの付着３日目後に神経芽伸長が観察されたことを示した（図２２Ｂ、”ＰＥＤＦ”）。これらの３日目の神経芽伸長は、細胞凝集端で西洋なし型の細胞からの短い突起として現れた。分化している凝集体の数、凝集体あたりの分化している細胞の数、および神経芽様過程は付着時間とともに増加した。付着５日後、凝集体の約７５−８５％が分化の徴候を示し、それらの周辺細胞のほとんどから神経芽が伸長していた。ｒＰＥＤＦ処理培養物は付着７日後に分化の最大に達し、８５−９０％の細胞が凝集していた。その時点で、２通りの神経性過程が観察された、即ち、３日目に観察された神経芽より２−３倍長い単一の神経芽が互いに離れた凝集体の周辺細胞から伸長しており、より長く且つより薄い突起が隣り合う細胞凝集体間で枝状のネットワークを形成していた。インキュベーションを長くすると、即ち、付着して１０日を超えると、ネットワーク連結の割合に著しい減少があり、単一の神経芽のさらなる成長は無いが、細胞凝集体の生存率には著しい影響はなく、約７５−８０％が別々の実験で残存していた。図２３で見られるように精製天然ＰＥＤＦおよび組換え体ＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）との間に違いは観察されなかった。
【００７９】
ＰＥＤＦおよびｒＰＥＤＦ ｃＤＮＡクローンは大量のＰＥＤＦとｒＰＥＤＦタンパク質生産の手段を供給するだけでなくＰＥＤＦ遺伝子の発現や制御を研究ために使用できる材料としても利用できる。更に、これらの配列は内因性ＰＥＤＦの翻訳を阻害するための翻訳停止のアンチセンス技術に用いる事が出来る。
【００８０】
組換えにより生産されたＰＥＤＦおよびｒＰＥＤＦタンパク質および等価なタンパク質はインビトロおよびインビボにおいて強力な神経栄養性作用物として利用できる。神経栄養性作用物としてのこれらのタンパク質のさらなる生化学的活性は標準インビトロ試験で決定でき、網膜の炎症性、血管性、消耗性、異栄養性疾病の処置におけるこれらのタンパク質の別の治療的使用の開発を可能にする。これらのタンパク質が強力な神経栄養性作用物と仮定すると、これらのタンパク質を、神経栄養性因子に応答する網膜以外の他の組織の処置に治療的有用性がでるように改良できるであろう。これらのタンパク質は非神経性組織およびある種のがんの”分化”因子としてより一般的な有用性を見つける事も出来るであろう。
【００８１】
（実施例７）
分子量３０００の組換え体ＰＥＤＦと共に、より小さな組換え体が合成され、神経栄養性活性を持つかどうか決定された。より小さなペプチドは完全長構築物よりも、高い溶解性、よりよい膜透過性、より低い抗原性、製造の容易さなど様々な利点を与える。
【００８２】
図２３には試験されたうち３つの組換え体のみが示されている。ＢＰ、ＢＸおよびＢＡはそれぞれ２８，０００、２４，０００、９０００の分子量であり、Ｃ末端欠失変異体を表わしている。これら全部が図２１および２２に描かれているものと同様な神経栄養性活性を示す。ここにおける新規の発見は、９０００の分子量のペプチド（天然のタンパク質の全分子量のたったの約２０％）が驚くべき神経栄養性活性を示した事であった。その上、活性な神経栄養性ペプチドはセルピン活性部位を含むことが知られているＣ末端側でなくＮ末端側に配列を示した。従って、活性部位はＮ末端であり、そのような小さな分子で活性が現れる事は驚くべき発見であり、このような事は従来の発見からは予期できない事である。
【００８３】
【表１】
【００８４】
表１：エクソンは大文字およびイントロン配列は小文字である。５’ドナーＧＴおよび３’アクセプターＡＧは下線が施してある。エクソンおよびイントロンサイズは各々ｂｐおよびｋｂで与えられている。
【００８５】
（実施例８）
（ヒトＰＥＤＦ遺伝子のコローニングおよび配列決定）
材料−制限酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴおよびカナマイシンはＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入された。ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭオリゴ ｄＴ（２５）はＤｙｎａｌ Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）から購入された。ＲｅｔｒｏｔｈｅｒｍＴＭ ＲＴはＥｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得られた。ＲＮＡｓｉｎＴＭはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入された。ＴａｑポリメラーゼはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入された。サブクローニングに使用するプラスミドベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入された。神経網膜および網膜色素上皮からの全ＲＮＡは文献に記載されているように（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，１９８７）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から得られたヒト組織から精製された。標識および配列決定に使用された［３２Ｐ］α−ｄＡＴＰおよび［３２Ｐ］γ−ＡＴＰ（３０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｔｓ，ＩＬ）から購入された。Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ（バクトートリプトン
１２ｇ／Ｌ、酵母抽出物 ２４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４１２．５ｇ／Ｌ、ＨＫ２ＰＯ４３．８ｇ／Ｌおよびグリセロール５ｍＬ／Ｌ）、変性溶液（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１．５Ｍ
ＮａＣｌ）、中和溶液（１Ｍトリス−Ｃｌ ｐＨ７．０、１．５Ｍ ＮａＣｌ）、２０Ｘ ＳＳＣ（３．０Ｍ ＮａＣｌ、０．３ｍＭクエン酸ナトリウム）、１０Ｘ ＴＢＥ（１Ｍトリス−ホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）および５０Ｘ ＴＡＥ（２Ｍトリス−酢酸、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０）はＱｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入された。２０Ｘ ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４）はＤｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）から購入された。アンピシリンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入され、水に溶解し、フィルター滅菌された。
【００８６】
（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））
２Ｘ ＰＣＲ混合物は１．６μモル／ｍＬのＧｅｎｅＡｍｐＴＭ ｄＮＴＰｓ（各々４００Ｍ）、２Ｘ ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ ＰＣＲ緩衝液および５０Ｕ／ｍＬのＴａｑポリメラーゼを含むように調製された。これらの試薬はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）から購入された。一般に、鋳型およびオリゴヌクレオチド（各々のオリゴの１００ｎｇ）は２５μＬの容量で混合され、２５μＬの２Ｘ混合物、続いて５０μＬの鉱油が加えられた。鋳型は、最初の変性が９５℃で２分間、３０秒のアニーリング（プライマーに依存して５５から６５℃の間）、および伸長が７２℃にて増幅された生成物に依存して１−５分であった。
【００８７】
（ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ オリゴ ｄＴ（２５）上でのｃＤＮＡ合成）
以前に記載されているように（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ａｎｄ Ｃｈａｄｅｒ １９９２）ｃＤＮＡがＤｙｎａｂｅａｄｓ上で合成された。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（０．５ｍｇ）を１００μＬの１０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＫＣｌで洗浄した。全ＲＮＡ水溶液３０μＬ（３０μｇ、約１μＬ）を３０μＬの上記緩衝液および平衡化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（０．５ｍｇ）と混合し、５５℃で２分間加熱した。ポリ＋Ａ
ＲＮＡを室温で１５分間ビーズにアニール化し、ビーズをＭＰＣ−Ｅ磁気セパレーター（Ｄｙｎａｌ Ｉｎｃ．）へ結合させることにより過剰のＲＮＡを除去した。アニール化されたポリ＋Ａ ｍＲＮＡを持つビーズは次に２．５μＬの緩衝液Ａ（２００ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ８．３、１．０Ｍ ＫＣｌ）、２．５μＬの緩衝液Ｂ（３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ ＭｎＣｌ）、２０μＬの１０ｍＭｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ）１μＬのＲＮＡｓｉｎ、２μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴ、５μＬのＲｅｔｒｏｔｈｅｒｍ ＲＴ（１単位／μＬ）および１６μＬのＨ２Ｏに懸濁し、最終容量を５０μＬとする。反応混合物は４０℃で１０分、続いて６５℃で１時間インキュベートした。ビーズを再びＭＰＣ−Ｅ磁気セパレーターへ結合させ、過剰のＲＴ反応混合物を除去した。ビーズは次に１００μＬの０．２Ｎ ＮａＯＨで１回、１０Ｘ ＳＳＰＥで１回および１Ｘ ＴＥで２回洗浄した。ｃＤＮＡ含有ビーズは最終容量で１００μＬの１Ｘ ＴＥに懸濁した。
【００８８】
（ｃＤＮＡ末端の５’急速増幅（ＲＡＣＥ））
Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入された５’−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥキットに基づく改良法を用いて５’−ＲＡＣＥが実施された（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、１９９４）。最初に、ｃＤＮＡが上記のように（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ａｎｄ Ｃｈａｄｅｒ １９９２）ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ オリゴ ｄＴ（２５）上で合成された。ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲアンカープライマーが５’プライム末端のＰＣＲ増幅のためＰＥＤＦ特異的プライマー＃２７４４と組み合わせて使用された。増幅は上記のように行われ、２μＬのアンカー結合ヒト網膜色素上皮−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｃＤＮＡが鋳型として使用された。増幅は３０サイクル行われた。
【００８９】
（オリゴヌクレオチドの配列）
オリゴヌクレオチドプライマーはＡｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ＤＮＡ合成機モデル３９２により合成された。オリゴヌクレオチドは脱保護され、さらに精製することなく使用された。
【００９０】
（ゲノムライブラリーのスクリーニング）
ヒトゲノムコスミドライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を１５０ｍｇ／ｍＬアンピシリン、２０ｍｇ／ｍＭカナマイシンを含むＬＢプレートにプレート当たり１０，０００コロニーの密度で播種された。コロニーを拾い上げるのにニトロセルロースフィルターが使用され、フィルターはＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されているように処理されハイブリダイズされた。ライブラリーはＴ７／Ｔ３プライマーを用いてＰＥＤＦ ｃＤＮＡクローンから得られた［３２Ｐ］標識ＰＣＲ生成物（Ｓｔｅｅｌｅら、１９９３）で探査した。この結果、ｐ１０Ａコスミドが単離された。λＤＡＳＨＴＭＩＩライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が上記のＰＥＤＦ ｃＤＮＡクローンのインサートを用いてＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によりスクリーンされた。この結果、７ｋｂ ＮｏｔＩ−Ｎｏｔ断片（ＪＴ６Ａ）が単離された。全ＰＥＤＦ遺伝子および隣接する領域を含むＰ−１クローン（ｐ１４７）は、オリゴ１５９０／１５９１を用いてＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により単離された。
【００９１】
（ＰＣＲ生成物のクローニング）
ＰＥＤＦ ｃＤＮＡの内部コード領域から設計された４組のプライマー、６０３：６０４；６０５：６０６；２２３８：３５４および２２１３：２７４４が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）実験のプライマーとして使用するために上記のように合成された。プライマー配列は以下の様である：６０３：５’−ＡＣＡ ＡＧＣ ＴＧＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：１３）、６０４：５’−ＣＡＧ ＡＧＧ ＴＧＣ ＣＡＣ ＡＡＡ ＧＣＴ ＧＧ−３’（配列ＩＤ番号：１４）；６０５：５’−ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＴＧ ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＴＣ ＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：１５）、６０６：５’−ＣＡＴ ＣＡＴ ＧＧＧ ＧＡＣ ＣＣＴ ＣＡＣ ＧＧ−３’（配列ＩＤ番号：１６），２２１３：５’−ＡＧＧ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＣＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＴ−３’（配列ＩＤ番号：１７）、２７４４：５’−ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＣＧ ＣＣＣ ＣＴ−３’（配列ＩＤ番号：１８）；２２３８：５’−ＡＴＧ ＡＴＧ ＴＣＧ ＧＡＣ ＣＣＴ ＡＡＧ ＧＣＴ ＧＴＴ−３’（配列ＩＤ番号：１９），３５４：５’−ＴＧＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＴＧＡ ＧＧＡ ＣＣＧ ＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：２０）。プライマー６０３：６０４および６０５：６０６で生じたＰＣＲ生成物の増幅、サブクローニングおよび配列決定はヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により実施された。６０３：６０４からの生成物は約２ｋｂ（ｊｔ８Ａ）であり、エクソン３からエクソン５へ伸びている。６０５：６０６からの生成物は約３．３ｋｂ（ｊｔ ９）であり、エクソン５からエクソン６へ伸びている。プライマーの組２２１３−２７４４はＰ１クローンｐ１４７からの約２．５Ｋｂ生成物（ｊｔｌ５；ＪＴ１１５とも称される）の増幅に用いられた。この生成物はサブクローニングおよび配列決定のためＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．に送られた。２２３８：３５４プライマーはイントロンＥをまたぐエクソン６からエクソン７の増幅に使用された。この生成物はサブクローン化されなかったが、我々により直接および完全に配列決定された。
【００９２】
（ＤＮＡ配列決定）
Ｐ−１クローン（ｐｌ４７）、このクローンのサブクローンおよびこのクローンのＰＣＲ生成物が配列決定された。ほとんどの配列決定は標準配列決定技術を用いてＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により実施された。すべての重要な領域（例えば、イントロン−エクソン境界）およびクローン間の連結は我々の実験室で配列決定された。ＰＣＲ生成物からのＤＮＡはＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入されたＷｉｚａｒｄＴＭ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製キットを使用して配列決定のために精製された。Ｐ−１クローンおよびプラスミドサブクローンはＱｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）Ｍｉｄｉプラスミド精製キットを使用して精製された。精製ＰＣＲ生成物およびプラスミドはＰＲＩＳＭＴＭ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ａ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用い、使用説明書に従って配列決定された。典型的には、配列決定反応当たり０．５ピコモルの鋳型および３ピコモルのプライマーが使用された。配列決定反応生成物はＳｅｌｅｃｔ−Ｄ Ｇ−５０カラム（５プライム−３プライム；Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を用いて精製され、乾燥された。次に各々の試料を５μＬのホルムアミド、１μＬの５０ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し、モデル３７０Ａ
Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中で加熱し、分析した。すべてのスプライス−部位連接（ジャンクション）、イントロンＦおよびクローンを横切った連接が配列決定された。
【００９３】
（サザンブロット）
種々の種からのＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化ゲノム（８μｇ）ブロットはＢＩＯＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴから購入された。ブロットは標準技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）を使用し、ＰＥＤＦ ｃＤＮＡで探査された。
【００９４】
（ＰＥＤＦの５’ＲＡＣＥ）
５’ＲＡＣＥは上記のようにアンカーオリゴをＤｙｎａｂｅａｄｓ上で前もって合成されたヒト網膜色素上皮ｃＤＮＡへ結合させることにより実施された。５’末端はアンカープライマー（ＡｍｐｌｉＦｉｎｄｅｒのキット）およびＰＥＤＦ−特異的プライマー２７４４を用いて増幅された。増幅は３０サイクル行われた。一つの主要なバンドが約２３０ｂｐに観察された。ＰＣＲ生成物はｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローン化され、配列決定された。これらのクローンの内最も長いものはＰＥＤＦの５’末端から２０ｂｐ伸びていることが観察された。
【００９５】
（ＰＥＤＦ遺伝子の単離）
ＰＥＤＦ遺伝子はプライマー１５９０および１５９１（１５９０：５’−ＧＧＡ ＣＧＣ ＴＧＧ ＡＴＴ ＡＧＡ ＡＧＧ ＣＡＧ ＣＡＡ Ａ−３’（配列ＩＤ番号：２３）；および１５９１：５’−ＣＣＡ ＣＡＣ ＣＣＡ ＧＣＣ ＴＡＧ ＴＣＣ Ｃ−３’（配列ＩＤ番号：２４））を用い、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によりＰ−１クローン（ｐｌ４７）に単離された。このクローンが全ＰＥＤＦを含んでいるかどうかを決定するため、ｐｌ４７およびヒトゲノムＤＮＡの両方がＢａｍＨＩ、ＥｃｏＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化され、続いてパルスフィールド装
置中、アガロースゲル電気泳動により分離された。アガロースゲルはブロットされ、ＰＥＤＦ ｃＤＮＡクローン（Ｓｔｅｅｌｅら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１５２６−１５３０）で探査した。Ｐ−１クローンとゲノムＤＮＡ間のバンドパターンの比較は全ＰＥＤＦ遺伝子がこのクローンに含まれていることを示している。さらに、この結果はＰＥＤＦには一つの遺伝子のみが存在することも示している。
【００９６】
（ＰＥＤＦ遺伝子の配列）
遺伝子のスケール地図が図１に示されている。ＰＥＤＦ遺伝子はその全部が配列決定された（配列ＩＤ番号：４３）。クローンｊｔ１、ｊｔ１４、ｊｔ６Ａおよび関連するＰＣＲ生成物（ｊｔ１５、ｊｔ８Ａおよびｊｔ９）（図１）はＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により配列決定された。遺伝子の残りの部分はｐ１４７クローンを鋳型として用いて遺伝子の異なった部分を増幅することにより配列決定された。すべてのエクソン、イントロン−エクソン連接（ジャンクション）および全イントロンＦはＰ−１クローンｐ１４７より発生するＰＣＲ生成物から上記のように我々の実験室で両方の方向で配列決定された。エクソン１から下流のＮｏｔＩ部位はそれをまたいで増幅し、生成物を配列決定することにより確認された。遺伝子は約１６Ｋｂにわたり、８つのエクソンを持っている。すべてのイントロン−エクソン連接はＡＧ／ＧＴ規則に従っている。イントロン−エクソン連接および隣接する配列は表１に示されている。
【００９７】
ｊｔ１：ヒトゲノムコスミドライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から単離された７．１ｋｂコスミドクローンで、ＰＥＤＦ遺伝子のエクソン７、エクソン８および３’隣接領域を含んでいる。このクローンの５’末端は（約２．１ｋｂの領域）ＰＥＤＦの部分ではない。これは明らかにコスミドの転位（リアレンジメント）により起きたものである。このクローンは全部Ｌａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により配列決定された。
【００９８】
ｊｔ６Ａ：λＤＡＳＨＩＩヒトゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により単離された７．２ｋｂＮｏｔＩ断片である。このクローンはＰＥＤＦ遺伝子の＞６ｋｂの５’隣接領域、エクソン１およびイントロンＡの４２４ｂｐを含んでいる。このクローンは全部Ｌａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により配列決定された。
【００９９】
ｊｔ８Ａ：このクローン化ＰＣＲ生成物ＪＴ８Ａはプライマー６０３：６０４を用いてゲノムＤＮＡから発生させた。このクローンはエクソン４およびイントロンＣおよびＤを含みエクソン３からエクソン５まで伸びている。全部Ｌａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により増幅、クローン化および配列決定された。
【０１００】
ｊｔ９：このクローン化ＰＣＲ生成物ＪＴ８Ａはプライマー６０５：６０６を用いてゲノムＤＮＡから得られた。このクローンは全イントロンＥおよびエクソン５およびエクソン６の一部を含んでいる。全部Ｌａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により増幅、クローン化および配列決定された。
【０１０１】
ｊｔ１５：このクローンはｐ１４７からのプライマー対２２１３：２７４４を用いて増幅されたＰＣＲ生成物から得られた。このクローンはイントロンＢをまたいでエクソン２からエクソン３まで伸びている。ＰＣＲ生成物はサブクローニングおよび配列決定のためにＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．に送られた。
【０１０２】
Ｐ１クローンｐ１４７：このクローンはオリゴヌクレオチド１５９０：１５９１を用いてＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．により単離された。このクローンはイントロンＦの配列（２２３８：３５４）およびサブクローンｊｔ１４を得るために使用された。また、上記のクローンから最初に得られたイントロンーエクソン境界を確認するためにも使用された。イントロン特異的オリゴを用いてすべてのエクソンおよびイントロン境界が増幅され（鋳型としてｐ１４７を用いて）、生成物が配列決定された。すべてのスプライス連接配列ならびにイントロンおよびエクソンの大きさが確認された。
【０１０３】
ｊｔ１４：これはイントロンＡのほとんど、エクソン２およびイントロンＢの一部を含むｐ１４７のサブクローンである。このクローンは我々によって単離され配列決定のためにＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．に送られた。
【０１０４】
従って、上記のクローンおよびＰＣＲ生成物のすべての配列分析によりヒトＰＥＤＦ遺伝子の構造およびエクソンおよびイントロンの大きさが決定された。すべての連接の５’スプライスドナーおよび３’スプライスアクセプター部位はＧＴ／ＡＧコンセンサスに従っている。
【０１０５】
（実施例９）
（ＰＥＤＦプロモーターの分析）
ＰＥＤＦを制御しているであろう可能な転写要素についてのいくらかの理解、ＰＥＤＦ発現についてのさらなる実験のための手引きを得るためにＰＥＤＦ５’隣接領域（図３）の理論的分析を実施した。ＰＥＤＦ遺伝子の５’隣接領域には古典的ＴＡＴＡＡＡ信号またはＴＡＴＡ−ボックスが欠けている。しかしながら、重要な転写因子により認識されるいくつかの興味ある特色および要素が含まれている。−１６４から−５９１および−８２２から−１０５０に２つのＡｌｕ反復要素が存在する。Ａｌｕ領域の外側に、共通のＡＴＧＣＡＡＡＴ（Ｐａｒｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：２６５０−２６５４；Ｆａｌｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：７１−７４；Ｓｔｕｒｍ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌ．２：１５８２−１５９９；Ｆａｉｓｓｔ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３−２６）から１塩基異なった転写因子の偏在するオクタマーファミリー（Ｏｃｔ）のための２つの可能な部位が−２９（ＡＴＣＣＡＡＡＴ）および−１１３（ＧＴＧＣＡＡＡＴ）に存在する。興味を引くもう一つの要素が−６２に位置している。この要素、ＧＴＡＡＡＧＴＴＡＡＣはＨＮＦ−１（肝細胞核因子）に結合している共通ＧＴＡＡＴＮＡＴＴＡＡＣに似ている（Ｆｒａｉｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ ５９：１４５−１４７）。これは多くの有力な肝臓遺伝子をトランス活性化するホームドメイン含有転写因子であるが（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９８３８−９８４２）、内胚葉性分化への関連が示唆されている（Ｂａｕｍｈｕｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４：３７１−３７９）。−２０２の配列ＴＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＡＣＣＴＧＣはＡＰ−１により認識されレチノイン酸によりトランス活性化されるであろう人工的パリンドローム配列（ＴＲＥｐ）ＴＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡ（Ｕｍｅｓｃｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：２６２−２６５；Ｌｉｎｎｅｙ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：３０９−３５０）に非常に類似している。−２２の配列ＴＧＡＧＴＧＣＡおよび−２０７のＴＧＡＴＧＣＡ（ＴＲＥｐ内）はＡＰ−１共通配列ＴＧＡＣＴＣＡ（Ｓｃｈｕｌｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ ６１：４９７−５０４）に類似している。ＴＲＥｐ内に含まれる−２０４の配列ＡＧＧＴＧＡＴＧＣＡＣＣＴもまたその共通配列がＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴである発生的に制御されたＲＡＰ（レチノイン酸受容体）モチーフ（Ｆａｉｓｓｔ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３−２６）に類似している。ＰＥＡ３要素（ポリオーマウイルスエンハンサー活性化因子３）ＡＧＧＡＡＧ／Ａ（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８３９−５８４３；Ｆａｉｓｓｔ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３−２６）が縦列に−１２２および−１２９続いて再び−１４１に存在している。ＰＥＡ３は転写因子ＥＴＳファミリーのメンバーであり（Ｍａｃｌｅｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＴＩＢＳ １７：２５１−２５６）、その活性は非核癌遺伝子により制御されているようである（Ｗａｓｙｌｙｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：３３７１−３３７８）。最も興味深い要素の１つは−６５４に配列ＧＴＧＧＴＴＡＴＧと共に位置する。この要素は転写因子のＣ／ＥＢＰ（ＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質）ファミリーにより認識される共通配列ＧＴＧＧＴ／ＡＴ／ＡＴ／ＡＧ内にある（Ｆａｉｓｓｔ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３−２６）。この因子は成人表現型へ導く最終分化に関与するようである（Ｖｅｌｌａｎｏｗｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ７０：７８４−７９９）。３つの可能なＣＡＣＣＣボックスが存在し、１つは−８４５に、および２つは逆の配向で−８２６および−９０５に存在する。これらはすべてＡｌｕ反復内にある。可能なＳｐｌ部位（ＣＣＣＧＧＣ）がＡｌｕ反復前の−１５３にあり、共通Ｓｐｌ部位ＧＧＣＧＧＧがＡｌｕ反復の内側−１０３０に存在する。
【０１０６】
（実施例１０）
（培養細胞におけるＰＥＤＦ ｍＲＮＡの発現）
（遺伝子発現分析）
レーン当たり２μｇのポリ−（Ａ）ＲＮＡを用い多ヒト組織ｍＲＮＡノーザンブロット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）が放射活性化標識６６７ｂｐＰＣＲ増幅生成物（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９：２６６−２７２）でハイブリダイズされた。ブロットはＱｕｉｃｋＨｙｂ急速ハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中、６８℃で１５分前もってハイブリダイズし、５ｘ１０６ｃｐｍ ＤＮＡ／ｍｌを含む同一の溶液中、６８℃で１時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズされたブロットは２回１００ｍｌの２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて室温で１５分間、さらに１回２００ｍｌの０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて６８℃で３０分間洗浄した。ブロットはＫｏｄａｘ ＸＡＲ−５フィルムおよびＤｕｐｏｎｔ補力スクリーンを用いて、−７０℃で２時間オートラジオグラフィーを行った。
【０１０７】
（遺伝子発現）
ＰＥＤＦメッセンジャーＲＮＡの発現が培養ヒト胎児ＲＰＥ細胞以外のヒト組織で起こっているかどうかを決定するために、試験された各々の組織に対し等量のポリ−（Ａ）ＲＮＡ含んでいる多組織ヒト成人および胎児ＲＮＡブロットを分析した。結果は表４に示されている。ＰＥＤＦプローブは分析された１６の成人組織の１４で種々の強度のハイブリダイゼーションの単一の１．５ｋｂ転写体を同定した。成人腎臓または末梢血白血球では信号が検出されなかった。成人脳、膵臓、脾臓および胸腺で弱い信号が観察できた。ＰＥＤＦメッセンジャーＲＮＡに対する多量のハイブリダイゼーションがヒト成人肝臓、骨格筋、精巣および卵巣で観察された。驚くべきことに、全脳ＲＮＡでは非常に弱い信号しか観察されなかった。試験された胎児組織では、非常に強いＰＥＤＦ信号が肝臓組織で観察され、興味深いことには成人腎臓試料ではＰＥＤＦハイブリダイゼーションがなかったのに比較して胎児腎臓では有意に強度で信号が観察された。
【０１０８】
成人組織で単一の１．５ｋｂ転写体が観察されたのと対照的に、胎児心臓、肺および腎臓で５００ｂｐ未満の追加の副転写体が低強度で種々に標識された。これは、ｍＲＮＡの部分的分解、または選択的スプライスのためと思われる。ＰＥＤＦはまた早期継代のサルＲＰＥ細胞でのみ発現され（１−５の継代数）、後期継代細胞（１０継代）では発現されなかった。これらの結果は老化へのＰＥＤＦの関連を示している。
【０１０９】
（実施例１１）
（種々の系統発生的関連種におけるＰＥＤＦの比較分析）
（進化的保存分析）
多数の哺乳類および霊長類種を含む種々の種のリンパ球からのゲノムＤＮＡ（ＢＩＯＳ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）の８μｇをＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲルで分離した。ゲルはトランスブロットされ、消化されたＤＮＡを含む膜はノーザン分析と同一の方法および条件を用いてハイブリダイズした。
【０１１０】
進化的保存：
若干の系統発生的に関連する種間のＰＥＤＦの進化的保存が試験された。結果は図５に示されている。これらの高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いると、鳥類、哺乳類および霊長類で約２３ｋｂの大きなＥｃｏＲＩ制限断片が観察された。おそらく使用されたヒトＰＥＤＦプローブとの低い相同性のためであろうが、より下等な種ではハイブリダイゼーションは観察されなかった（図５Ａ）。ニワトリおよびマウスのＥｃｏＲＩ断片はヒトのものより幾分小さい。試験されたいくつかの哺乳類種において興味ある制限パターンが現れた（図５Ｂ）。６ｋｂから２ｋｂの間の大きさの範囲にいくつかのより小さな制限断片が観察された。試験されたすべての霊長類種で９ｋｂから２３ｋｂの間の大きさの範囲により大きな断片が観察され、それは約９ｋｂに追加の強くハイブリダイズする多形断片を持っている。
【０１１１】
（実施例１２）
（培養における小脳顆粒細胞に対する色素上皮誘導因子の神経細胞栄養性効果細胞培養）
小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）はＮｏｖｅｌｌｉら（１９８８，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，４５１：２０５−２１２）により記載されているように生後５または８日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット子供から調製された。簡単に記すと、髄膜を含まない組織を１２４ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、３ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２７μＭフェノールレッドおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含む緩衝液中で切り刻み、５５０ｘｇで３分遠心分離した。１０−２０匹の動物からの組織ペレットを再懸濁し、２５０μｇ／ｍｌトリプシンを含む同一の緩衝液３０ｍｌ中でトリプシン分解し（１５分、３７℃）；２６μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ、１６６μｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤および０．５ｍＭの追加のＭｇＳＯ４を含む緩衝液をさらに１５ｍｌ加えて上記のように組織を再び遠心分離した。ペレットを８０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ、０．５２ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤および１．６ｍＭの追加のＭｇＳＯ４を補給した１ｍｌの緩衝液に再懸濁し、パスツールピペットで６０回砕いた。０．１ｍＭのＣａＣｌ２および１．３ｍＭの追加のＭｇＳＯ４を含む緩衝液２ｍｌで懸濁液を希釈し、非分散物は５分間放置して沈澱させた。上清を別のチューブに移し、細胞は軽く遠心分離し、血清含有培地（２５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭグルタミン、１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン、および１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含むイーグル基本培地）または化学的に決められた培地（５μｇ／ｍｌインシュリン、３０ｎＭセレン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、１０００ｎＭプトレシン、２０ｎＭプロジェステロン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１））（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ，１９８５ ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊ．Ｅ．Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｇ．Ｓａｔｏ，ｅｄｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．ｐ．３−４３）に再懸濁して回収した。細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆９６ウェルプレート（ＭＴＳアッセイおよび神経フィラメントＥＬＩＳＡアッセイのため）または８ウェルチャンバースライド（免疫細胞化学およびＢｒｄＵ標識のため）に２．５ｘ１０５細胞／ｍｌで加え、５％ＣＯ２を含む空気からなる雰囲気下、３７℃で増殖させた。培養１日後、血清補給培地中の細胞にのみシトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）を加えた（最終濃度５０μＭ）。
【０１１２】
（ＭＴＳアッセイ）
９６ウェルプレート中の小脳顆粒細胞をＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩）およびＰＭＳ（フェナジンメトスルフェート）（最終濃度；３３３μｇ／ｍｌ ＭＴＳおよび２５μＭ ＰＭＳ）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）と４時間ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。ＰＭＳ存在下、ＭＴＳは代謝的に活性な細胞に観察されるデヒドロゲナーゼ酵素により水可溶性ホルマザンに変換される（Ｃｏｒｙｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍ，３：２０７−２１２）。ホルマザン生成物の量は分光学的に４９０ｎｍで決定した。
【０１１３】
（免疫細胞化学）
インビトロでの日数（ＤＩＶ）で７日後、細胞をカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで１０分間、続いて−２０℃にて９５％エタノール／５％酢酸で１０分間固定した。ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）に対する一次抗体、ＧＡＢＡ、カルビンジン、またはグリア原線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）とのインキュベーションを室温で６０分実施した。２％正常ヤギ血清および０．２％ＢＳＡ存在下、抗体を１：１０００−１：５０００で加えた。抗体はＡＢＣシステム（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびジアミノベンジジンを用いて可視化した。各々の実験で２−３のウェルから少なくとも２０視野を計数した。対照培養中のＮＳＥ陽性細胞と比較した他の抗体により染色された細胞の数の比を決定するために視野当たりの細胞の平均数を計算した。
【０１１４】
（ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識）
ＢｒｄＵ標識は以下の変更を行ったＧａｏら（１９９１ Ｎｅｕｒｏｎ，６：７０５−７１５）の方法により実施された。細胞は８ウェルチャンバースライドに入れ直ちにｒＰＥＤＦを加えた。２４時間後、ＢｒｄＵ（１：１００；Ａｍｅｒｓｈａｍ細胞増殖キット）を培養培地に２４時間加え、その後細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し（１０分）、９５％エタノール／５％酢酸で処理し（１０分）、抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体とインキュベートした（１：２０、２時間）。培養物は次に西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗マウス第二抗体と６０分インキュベートした。ジアミノベンジジンーペルオキシダーゼ後、細胞はＧｅｌ Ｍｏｕｎｔにマウントされた。顕微鏡で標識された細胞のパーセント数を計数することにより、分裂指数が決定された。各々の値に対し、３０００細胞の無作為試料が計数された。
【０１１５】
（神経フィラメントＥＬＩＳＡアッセイ）
わずかな変更を加えたＤｏｈｅｒｔｙら（１９８４ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，４２：１１１６−１１２２）の方法に従って神経フィラメントＥＬＩＳＡが実施された。９６ウェルマイクロタイタープレートで増殖させた培養物は４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳにより、４℃で２時間固定した。固定された細胞は１５分０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで処理して透過性を上げ、続いて非特異的結合を防ぐために６０分１０％ヤギ血清を含むＰＢＳとインキュベーションを行った。培養物は次にモノクローナル抗−神経フィラメント抗体と４℃にて一夜インキュベートした（ＲＭＯ １：１００で；小脳顆粒細胞の培養において神経芽のみを染色する）。１０％ヤギ血清を含むＰＢＳで２回洗浄後、細胞を第二抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗マウス １：１０００で）と１時間インキュベートした。ＰＢＳおよび水で連続的に洗浄した後、培養物は０．２％Ｏ−フェニレンジアミンおよび０．０２％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）と３０分インキュベートした。等量の４．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することにより反応を停止させた。マイクロタイターリーダーを用い、４９０ｎｍで反応生成物の一部の光学密度（Ｏ．Ｄ．）を読みとることにより生成物形成を定量した。
【０１１６】
ＭＴＳアッセイが生きている細胞数の指標になることを確認するため、およびアッセイの結果が直線性を与える細胞数の範囲を決定するために、図６に示した実験を実施した。血清含有培地（ＳＣＭ）においては（図６Ａ）、１−９ｘ１０５細胞／ｃｍ２の範囲に渡って光学密度（Ｏ．Ｄ．）と加えた細胞数が比例した。対照的に、化学的に決められた培地（ＣＤＭ）（図６Ｂ）では、直線範囲は１−５ｘ１０５細胞／ｃｍ２の範囲をカバーするにとどまった。引き続く全ての実験は、どちらの型の培養培地においても直線範囲の中間である２．５ｘ１０５細胞／ｃｍ２で細胞を加えて行った。
【０１１７】
図７は、ＰＥＤＦはＤＩＶ４で細胞数の有意な増加を起こし、ＤＩＶ７および１０では大きな相違を与えることを示す。しかしながら、この２−３倍の増加は対照培養における細胞数の顕著な減少の結果である。化学的に決められた培地における用量応答曲線は（図８）、２０ｎｇ／ｍｌで統計的に有意な効果があることを示している。５０ｎｇ／ｍｌ以上にＰＥＤＦ濃度を増加させてもＣＤＭ中でのさらなる増加を生み出さなかった。
【０１１８】
ＰＥＤＦに応答したＯ．Ｄ．の増加（ＭＴＳアッセイ）が生き残っている細胞の増加を反映しているのか、または増殖の増加を反映しているのかを決定するため、生後５日（Ｐ５）の動物（この時小脳顆粒細胞は動物でまだ分裂している）からの培養物を用いて、ＢｒｄＵ標識研究が実施された。図９はＤＩＶ１および２におけるＰ５ ＣＧＣ培養に対するＰＥＤＦの効果を示している。ＭＴＳアッセイを用いると、ＰＥＤＦはＤＩＶ１では効果がなかったが、血清含有培地または化学的に決められた培地ともＤＩＶ２にＯ．Ｄ．の小さな増加を起こした。従って、ＢｒｄＵを日−１に添加し、日−２に固定した。対照条件下のＢｒｄＵ標識指数はＳＣＭで５％およびＣＤＭで３％であり、ＰＥＤＦはどちらの培養培地でもＢｒｄＵ標識指数を増加させなかった（図１０）。ＰＥＤＦによりＢｒｄＵ標識指数が刺激されないことは、ＰＥＤＦ暴露後のＭＴＳアッセイにより測定されたＯ．Ｄ．の増加は細胞分裂の増加のためではなく、むしろ生き残りの助長に応答していることを示唆している。
【０１１９】
免疫細胞化学を用いてＰＥＤＦ処理前および後の培養液に存在する細胞の同定を行った。ＰＥＤＦと（５００ｎｇ／ｍｌ）またはＰＥＤＦなしで７日間増殖させたＰ８培養細胞を４つの異なった抗体で染色した：すべての小脳ニューロンを認識するニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）に対するポリクローナルウサギ抗体（Ｓｃｈｍｅｃｈｅｌ ｅｔ
ａｌ．（１９７８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９：３１３−３１５）；小脳顆粒細胞を除いたすべての小脳ニューロンで合成されるＧＡＢＡに対するポリクローナル抗体（Ｇｒｕｏｌ ａｎｄ Ｃｒｉｍｉ（１９８８）Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，４１：１３５−１４６）；ニューロン−特異性タンパク質であるカルビンジンおよびＧＦＡＰ（アストログリアにのみ存在する中間フィラメントタンパク質）に対する抗体。結果は表２に要約されている。ＰＥＤＦはＳＣＭ（３０％増加）およびＣＤＭ（６０％増加）の両方でＮＳＥ陽性細胞の数を有意に増加させた。ＧＡＢＡ陽性ニューロンおよびＰｕｒｋｉｎｊｅ細胞（カルビンジン陽性）の数のわずかな（統計的には有意ではない）増加があった。従って、ＰＥＤＦは顆粒ニューロンに対してのみ神経栄養性である。さらに、ＰＥＤＦは培養液中に存在するＧＦＡＰ陽性アストログリア（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）の数を有意に減少させた（ＳＣＭで３０％の減少およびＣＤＭで４０％の減少）。このＰＥＤＦの”グリア静止性”は実施例１４でさらに論議される。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
神経芽成長に対するＰＥＤＦの効果を調べるため、神経フィラメントＥＬＩＳＡ試験が用いられた。免疫細胞化学は、モノクローナル抗体、ＲＭＯ−４２は培養液中の小脳顆粒細胞の神経芽のみ染色することを示したので、この抗体を細胞本体ではなく突起のみに存在する神経フィラメントの直接的測定に使用した（図１１）。ＰＥＤＦはＳＣＭおよびＣＤＭの両方で神経フィラメント含量をわずかに増加させたのみであったが、その増加量は細胞数の増加に直接的に比例していた（図１２）。
【０１２２】
図１３はこの実施例のデータを総括している。培養１０日までに、ほとんどの非処理ＣＧＣ（対照）は死滅したが、ＰＥＤＦ処理細胞は６０％またはそれ以上生き残った。ＰＥＤＦは従って脳ニューロンに対する強力な生存因子である。
【０１２３】
（実施例１３）
（ｒＰＥＤＦペプチド、ＢＰおよびＢＸの神経細胞栄養性特性）
ＰＥＤＦの”神経細胞栄養性”活性について前の節で記載されたことは真実であり、強力な神経栄養性活性を示す組換え体ＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）を比較的多量に製造することが可能である。適当な組換え体分子生物学的技術を用いて、より小さなＰＥＤＦ分子の断片もまた製造でき、それらは神経栄養性かまたは神経細胞栄養性活性が試験される。図１４はＣＧＣ生存率に対するＰＥＤＦのこれらの端が切断された形のうちの２つの効果を示している。ＢＸおよびＢＰは各々ＰＥＤＦ分子のアミノ末端部分からの２４および２８ｋＤａ断片である。両断片は１ｘまたは１０ｘ濃度でニューロン生存因子として作用し、有意にＣＧＣの寿命を延長させる。この実験において、ペプチドは実験の初めに一度に与えられ、細胞数は７日後に決定された。完全ＰＥＤＦ分子とともに、分子のＮ−末端に近いより小さな組換え体ペプチドも”神経細胞栄養性”であると結論付けられる。
【０１２４】
（実施例１４）
（ＰＥＤＦのグリア細胞静止特性）
ラット小脳顆粒細胞の初代培養中にニューロンとともに少数のグリアの異なった型が存在する。グリアはＣＮＳ中におけるニューロンのための”支持”要素であり、建築的骨格、およびニューロンが依存する代謝的支持系を形成する。グリアはまた、脳の腫瘍はほとんどグリアにより形成されおよびグリオシスがいくつかの神経消耗性疾患で問題であるので、臨床的にも重要である。我々の系において、細胞の培養混合集団をニューロンに特異的な抗体およびグリアの異なった型に特異的な他の抗体で免疫細胞化学的に染色した時に、グリアに対するＰＥＤＦの効果について気がついた。この目的のため、ニューロンの存在を示すために標準マーカーニューロン特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）およびその他、大グリア（ａｓｔｒｏｇｌｉａ）の存在を示すためにグリア原線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および小グリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）染色のためにＯＸ−４２を使用した。この実験において（表２）、我々はニューロンがＰＥＤＦ処理によりより長く生きることを知っていたのでＮＳＥ染色で予期される増加を観察したが、ＧＦＡＰ染色での予期されない減少を観察した。このことはＰＥＤＦ処理培養物において大グリア細胞をより少なくする可能性を示している。
【０１２５】
培養皿における大グリア細胞および小グリア細胞の特有の形態およびＧＦＡＰまたはＯＸ−４２に対するそれらの選択的染色のため、異なった実験条件下、顕微鏡下でそれらを個々に計数することが可能である。これは図１５および１６に概説するように行われた。図１５はラット脳から得られた培養液中の大グリア細胞の数に対するＰＥＤＦの効果を培養２週（２ｗ）または１２週（１２ｗ）に示したものである。与えられている時間は、ＰＥＤＦ処理後、４８時間、９６時間または７日である。明らかに、試験されたすべての条件でＰＥＤＦ処理は大グリア細胞の劇的な減少が生じている。図１６は同一の培養での小グリア細胞の平行分析を示している。４８時間または７日間のＰＥＤＦ投与により、２週間（２ｗ）または１２週間（１２ｗ）培養しても細胞の数を減少させていた。従って、ＰＥＤＦは非常に長い期間に渡ってグリア要素を実質的に減少させ、一方、ニューロンには生存因子として働いている。
【０１２６】
（実施例１５）
（天然ウシＰＥＤＦの特性付け）
特異的抗体によって成人ＩＰＭにＰＥＤＦの存在が示されたので、天然ＰＥＤＦの精製源としてウシＩＰＭ洗液を使用した。ＲＰＥおよび網膜細胞はＰＥＤＦ ｍＲＮＡを発現するが、これらの細胞抽出液では抗−ＢＨはウェスタン移行物上のＰＥＤＦバンドを検出できず、このことはＰＥＤＦがＩＰＭ内に迅速に放出されることを示唆している。ウシＩＰＭに存在するＰＥＤＦは全可溶性タンパク質の１％未満であると現在見積もられている（即ち、約２−５ｎｇ／ウシの眼）。生理学的温度では、ＩＰＭ中のＰＥＤＦタンパク質
は長い期間安定に残っており、ＳＤＳに抵抗する非還元複合体は形成しない。従って、その安定な性質のため、培養実験およびインビボでの移植におけるその潜在的有効性は非常に高い。
【０１２７】
ほぼ均質なまでの精製は単純な２工程法により達成される（図１７）。ＩＰＭの成分はサイズ排除カラムクロマトグラフィー（ＴＳＫ−３０００）により分画された。ＰＥＤＦ−免疫反応性分画をプールし、陽イオン交換カラム（Ｍｏｎｏ−Ｓ）に加え、ＮａＣｌ直線濃度勾配により免疫反応性成分を溶出させる。精製プロトコールは材料および方法に詳述されている。各々の溶出プロフィールがパネルＡ（ＴＳＫ−３０００サイズ排除カラムクロマトグラフィー）およびパネルＢ（ｍｏｎｏ−Ｓカラムクロマトグラフィー）に示されている。２８０ｎｍでの吸光度は実線で、およびＮａＣｌ濃度が点線で示されており、ＰＥＤＦ免疫反応性は抗血清Ａｂ−ｒＰＥＤＦで追跡された。挿入図は示された分画のウェスタンブロット分析である。免疫反応はＡｂ−ｒＰＥＤＦの１：１０，０００希釈で実施され、４−クロロ−１−ナフトールで染色された。ＴＳＫ−３０００クロマトグラフィーのための分子サイズ標品はＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、６６，０００）およびＣＡ（ウシカルボニックアンヒドラーゼ、２９，０００）であった。
【０１２８】
可溶性ＩＰＭ成分の洗液で出発し、最初の工程はサイズ排除カラムクロマトグラフィーによるほとんどの豊富にあるタンパク質（ＩＲＢＰ）の除去を含んでいる。ＰＥＤＦは約５０ｋＤａの大きさの単量体ポリペプチドとして溶出する。我々は、ＰＥＤＦの等電点を７．２−７．８であると決定したので、タンパク質を同時に精製および濃縮するための方法の第二の工程にｐＨ６．０でＳ−セファロースカラムクロマトグラフィーを使用した。精製されたタンパク質はおとなのウシの眼当たり約２μｇで回収され、回収率は約４０％であった。天然のＰＥＤＦはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、４９，５００±１，０００のみかけの分子量を持つ単量体糖タンパク質のように振る舞う。
【０１２９】
精製タンパク質はグリコシダーゼＦに感受性があり、Ｎ−結合オリゴサッカライドを示しており、それは天然のタンパク質中の３，０００−Ｍｒまでを占めている（図１８）。アスパラギン−結合オリゴサッカライドを除去するため、精製ＰＥＤＦタンパク質がエンドグリコシダーゼＨおよびＮ−グリコシダーゼＦで処理された。酵素反応は材料と方法に記載されているように実施され、β−メルカプトエタノール存在下または非存在下で全量で２００ｎｇのＰＥＤＦタンパク質が用いられた。反応混合物はＳＤＳ−１２．５％ポリアクリルアミドゲルに適用した。エンドグリコシダーゼＨ（左パネル）およびＮ−グリコシダーゼＦ（右パネル）反応物のウェスタン移行物の写真が示されている。イムノブロットは１：１０，０００希釈抗血清 Ａｂ−ｒＰＥＤＦで処理された。各々の反応の添加成分は上に示されている。各々の写真の右側面の数字はビオチン化ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標品の移動を示している：ウシ血清アルブミン（６６，２００）、オバアルブミン（４５，０００）およびウシカルボニックアンヒドラーゼ（３１，０００）。精製ウシＰＥＤＦはＹ−７９およびＷｅｒｉ網膜芽腫細胞の神経芽成長を促進し、この活性は抗−ｒＰＥＤＦにより遮断されること示した（下記参照）。
【０１３０】
本発明は、ＮＳＥ、ＧＦＡＰ、神経フィラメント（ＮＦ−２００）タンパク質を含むＣＧＣ培養物およびＹ−７９腫瘍細胞でのニューロンおよびグリアマーカーの発現に対する標準ＰＥＤＦの効果を測定するための道具を提供している。
【０１３１】
（実施例１６）
（色素上皮誘導因子：高度に特異的なポリクローナル抗体による特性決定）
ＰＥＤＦに対するポリクローナル抗体を開発するために、大腸菌で産生された精製組換え体ヒトＰＥＤＦを使用した。抗−ｒＰＥＤＦはおとなのウシの眼からのＩＰＭ洗液のウェスタン移行物上の一つのポリペプチドを特異的に認識した（図１９）。ヒト組換え体ＰＥＤＦに対するポリクローナル抗血清は特異的にｒＰＥＤＦを認識する。ヒトｒＰＥＤＦのウェスタン移行物およびスロットブロットはｒＰＥＤＦに対するウサギポリクローナル抗血清、Ａｂ−ｒＰＥＤＦで処理された。４−クロロ−１−ナフトールでの免疫染色の写真が示されている。パネルＡ、ｒＰＥＤＦの０．５μｇのウェスタン移行物が抗血清の希釈の増加をアッセイするために使用された。ｒＰＥＤＦタンパク質は移行前にＳＤＳ−１２．５％ＰＡＧＥで分離された。希釈率は各々のレーンの上に示されている。希釈抗血清は免疫検出に使用する前に５μｇ／ｍｌでｒＰＥＤＦと前もってインキュベートされ、１：１０，０００＋ｒＰＥＤＦと示されている。左の数字はビオチニル化ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標品の分子量を示している。パネルＢ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中ｒＰＥＤＦの量を増量し、マニホールドでニトロセルロース膜へ供給した。膜は抗血清抗−ｒＰＥＤＦおよび１：１０，０００希釈されたウサギ前免疫血清で処理された。右に示されている数字は膜へブロットされたｒＰＥＤＦの量を表している。各々のペーパーに使用された血清は図の上に示されている。
【０１３２】
抗−ＢＨはウェスタン移行物上、１：５０，０００のような高い希釈度でヒトＰＥＤＦを特異的に認識した；重要なことは、それが血清α１−抗トリプシンを認識しなかったことである。本抗体は若年サルＲＰＥ培養細胞の馴化培地の、ならびにおとなのウシの眼からのＩＰＭの、ウェスタン移行物上に一つの主要なバンドを認識した。抗−ｒＰＥＤＦはＩＰＭ促進神経栄養性活性を遮断した（図２０）。血清含有培地中、対数増殖期のヒト網膜芽腫細胞Ｙ−７９をＰＢＳで２回洗浄し、インシュリン、トランスフェリンおよびセレンを補給した無血清ＭＥＭ（ＩＴＳ混合物、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）中に播種した（ｍｌ当たり２．５ｘ１０５細胞）。次にエフェクターが培養液に添加された。５％ＣＯ２、３７℃で７日後、細胞を新鮮な無血清培地を含むポリ−Ｄ−リシン被覆プレートに付着させた。培養物の分化状態を付着後種々の間隔でモニターした。付着９日後の形態的特徴が示されている。エフェクターの添加は各々のパネルに示されており以下の最終濃度であった：１２５μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１％ ＩＰＭおよび１００ｎｇ／ｍｌ 精製ウシＰＥＤＦ。神経芽の成長誘導活性を阻止するため、各々のエフェクターは１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、過剰の抗血清抗−ｒＰＥＤＦ（１μｌ）と少なくとも６時間４℃で前もってインキュベートした。すべての写真は５０倍で示されている。
【０１３３】
抗−ｒＰＥＤＦはまた精製ＰＥＤＦにより促進される神経芽成長活性も阻止した。我々のデータはＩＰＭではＰＥＤＦが唯一の神経栄養性因子であることを示している。これらのデータはまた抗−ｒＰＥＤＦはＰＥＤＦ神経栄養性活性部位ならびにＩＰＭおよび他の組織（例えば、脳）におけるＰＥＤＦの生理学的役割の探査に有用であろうことも示唆している。さらに、これらの結果はＰＥＤＦはＩＰＭを益する成分であり、細胞外マトリックスにおける唯一の神経栄養性成分であることを示している。さらに、本タンパク質は広範囲の組織および細胞外空間に存在している。阻止抗体はＰＥＤＦの生理学的機能を探査する研究に有用である。
【０１３４】
（実施例１７）
（色素上皮誘導因子：神経栄養性活性を持つセルピン）
ヒト胎児ＰＥＤＦ ｃＤＮＡから誘導されるアミノ酸配列は、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）ファミリーとその一次構造の同一性を共有し（約３０％）、セルピンの構造的完全さに必須な残基の９０％を保存している。しかしながら、組換え体ＰＥＤＦはセリンプロテアーゼであるトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼまたはカテプシンＧを阻害しない。ＰＥＤＦの天然の標的はまだ解明されていない。ＰＥＤＦに対して作製した抗体によるウェスタンブロットの免疫検出および蛋白分解性基質としてカゼインを含むゲルのザイモグラフィーにより、網膜色素上皮および網膜間の空間である、光受容体間マトリックス（ＩＰＭ）からのタンパク質を分析した。結果は、ウシＩＰＭは安定でグリコ
シル化されたＰＥＤＦポリペプチド（５０，０００Ｍｒ）を目当たり２−５μｇ含んでいることを示している。トリプシン、サブチリシン、キモトリプシンおよびエラスターゼによるウシＰＥＤＦの制限蛋白分解は４６，０００Ｍｒのポリペプチドを産生し、蛋白分解性切断に感受性を持つヒンジ領域を持つ球状構造が示唆される。一方、カゼインＳＤＳ−ＰＡＧＥザイモグラフィーはＩＰＭ中のプロテアーゼ活性が低いことを明らかにし、それは約８０，０００±５，０００の２倍移動した。カゼイン分解性活性は１μｇ／ｍｌのアプロチニンおよび１０ｍＭ ＰＭＳＦをゲル混合物に加えると１００％阻害されたが、Ｅ６４またはＥＤＴＡには影響を受けなかった。重要なことは、ＩＰＭタンパク質は、約８０，０００Ｍｒのセリンプロテアーゼであるプラスミノーゲンに対する抗体と反応しなかったことである。ｒＰＥＤＦタンパク質が１μｇ／ｍｌで加えられた場合、これらのカゼイン分解性活性ならびに未知の起源のその他のセリンプロテアーゼ活性の信号は約５０％弱められた。これらの結果は新規セリンプロテアーゼおよびセルピンＰＥＤＦのための天然の細胞外部位としてのＩＰＭを示唆しており、両方とも全タンパク質の≦１％で存在している。
【０１３５】
ここに引用したすべての文献は、援用により本明細書に全文包含される。
【０１３６】
本発明はＰＥＤＦの一般的構造特性およびこれらがタンパク質の機能とどのように関係するかについての理解の発端を開示している。ＰＥＤＦはセルピンについて知られている構造特性および一般的三次特性を持っているが、セルピンの抗−プロテアーゼ活性は持っていない。ＰＥＤＦは神経栄養性タンパク質であり、網膜芽腫細胞上の神経芽成長を促進するＩＰＭの唯一の成分であるようである。しかしながら、古典的セルピンのカルボキシ末端近くに観察されるセリンプロテアーゼ阻害剤のための反応中心は、ＰＥＤＦの神経栄養性生物学的活性には必要とされない。特に、分子のアミノ末端部分からのドメインを含むポリペプチド鎖（ＢＡ）は、神経栄養性およびニューロン生存活性にとって十分である。本発明はさらにＣＧＣニューロンがアポトーシスで死ぬかどうかおよびＰＥＤＦはアポトーシスの阻害剤であるかどうかの決定を可能にする。言葉を換えれば、本発明はどのような機構でＰＥＤＦがニューロンを”救い”およびグリアの成長または増殖を”阻害する”かを決定することを可能にする。
【０１３７】
本発明は特異的神経栄養性”活性部位”の決定に有用である。さらに、端が切断されたｒＰＥＤＦペプチドの使用はＰＥＤＦの神経細胞栄養性およびおそらく、グリア細胞静止性に必要な要素決定を可能にする。本発明はさらに、網膜芽腫細胞の分化のための信号の引き金を引くＰＥＤＦの相互作用を研究するために必要な道具を提供する。最近の実験は網膜芽腫細胞により前もって”馴化され”ている培地に加えたときのみ１２５Ｉ−ＢＨは網膜芽腫細胞と競合的様式で結合することが示されている。このことは細胞により産生される一つまたはそれ以上の補因子が結合に必要であろうことを示唆している。本発明はさらにＣＧＣ試験系および網膜芽腫細胞試験系からのＰＥＤＦまたはＰＥＤＦ複合体に対する細胞表面受容体を同定および特性決定するために必要な道具を提供する。
【０１３８】
タンパク質の機能部位のドメインマッピングのための道具として、組換え体変異タンパク質、タンパク質分解生成物および合成ペプチドが使用できる。さらに、本発明の組換え体タンパク質はＰＥＤＦ上の神経栄養性および神経細胞栄養性”活性部位”のマッピング、およびこの興味深いタンパク質が発揮するその劇的な生物学的効果による細胞トランスダクション機構の決定を可能にする。
【０１３９】
本発明は好適な態様を強調して説明したが、ＰＥＤＦ、ｒＰＥＤＦおよび等価なタンパク質、（ＢＰ、ＢＸ、ＢＡ）をコードしている好適な核酸、およびそれらのアミノ酸配列、そのような核酸を利用するベクター、そのようなタンパク質を産生する組換え法、およびそのようなタンパク質の使用法の変形態様が存在し、本発明がここに特別に記載したものと別な方法で実施できるであろうことは当業者には明かであろう。従って、本発明は以下の請求の範囲に定義されるように、本発明の精神および範囲内のすべての改変を包含する。
【０１４０】
（配列表）
【数２】
【０１４１】
【数３】
【０１４２】
【数４】
【０１４３】
【数５】
【０１４４】
【数６】
【０１４５】
【数７】
【０１４６】
【数８】
【０１４７】
【数９】
【０１４８】
【数１０】
【０１４９】
【数１１】
【０１５０】
【数１２】
【０１５１】
【数１３】
【０１５２】
【数１４】
【０１５３】
【数１５】
【０１５４】
【数１６】
【０１５５】
【数１７】
【０１５６】
【数１８】
【０１５７】
【数１９】
【０１５８】
【数２０】
【０１５９】
【数２１】
【０１６０】
【数２２】
【０１６１】
【数２３】
【０１６２】
【数２４】
【０１６３】
【数２５】
【０１６４】
【数２６】
【０１６５】
【数２７】
【０１６６】
【数２８】
【０１６７】
【数２９】
【０１６８】
【数３０】
【０１６９】
【数３１】
【０１７０】
【数３２】
【０１７１】
【数３３】
【０１７２】
【数３４】
【０１７３】
【数３５】
【０１７４】
【数３６】
【０１７５】
【数３７】
【０１７６】
【数３８】
【０１７７】
【数３９】
【０１７８】
【数４０】
【０１７９】
【数４１】
【０１８０】
【数４２】
【０１８１】
【数４３】
【０１８２】
【数４４】
【０１８３】
【数４５】
【０１８４】
【数４６】
【０１８５】
【数４７】
【０１８６】
【数４８】
【０１８７】
【数４９】
【０１８８】
【数５０】
【０１８９】
【数５１】
【０１９０】
【数５２】
【０１９１】
【数５３】
【０１９２】
【数５４】
【０１９３】
【数５５】
【０１９４】
【数５６】
【０１９５】
【数５７】
【０１９６】
【数５８】
【０１９７】
【数５９】
【０１９８】
【数６０】
【０１９９】
【数６１】
【０２００】
【数６２】
【０２０１】
【数６３】
【０２０２】
【数６４】
【０２０３】
【数６５】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は１９９２年９月２４日に出願された特許出願第０７／９５２，７９６号の一部継続出願である１９９４年６月７日に出願された特許出願第０８／２５８，９６３号の一部継続出願である。
【０００２】
（技術分野）
本発明は神経栄養性、神経細胞栄養性およびグリア細胞静止性タンパク質に関する。特に、本発明は色素上皮誘導因子（ＰＥＤＦ）として知られているタンパク質の生物学的特性およびそのタンパク質の組換え形に関している。本発明はまたｒＰＥＤＦと称されるＰＥＤＦの端を切り取ったものにも関している。ＰＥＤＦおよびｒＰＥＤＦおよび機能的に等価なタンパク質に加え、本発明はｒＰＥＤＦおよびその断片をコードしている核酸、そのような核酸を含むベクター、そのようなベクターが導入されている宿主細胞およびそのようなタンパク質を産生するためのこれらの宿主細胞の使用にも関している。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
色素上皮誘導因子（または色素上皮分化因子として知られている）は、培養ヒト網膜芽腫細胞の神経突起成長を誘導できる細胞外神経栄養性作因として培養ヒト胎児網膜色素上皮細胞の馴化培地で同定された（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３０（８），１７００−１７０７）。ＰＥＤＦ源、即ち網膜色素上皮（ＲＰＥ）は網膜神経の正常な分化および機能に決定的なものであろう。増殖因子を含む種々の分子がＲＰＥ細胞により合成および分泌される。ＲＰＥは網膜神経に先だって分化して隣接して存在し、およびそれが血液−網膜障壁の一部として機能しているため（Ｆｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎａ．Ｏｃｕｌａｒ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｈａｒｐｅｒ ＆ Ｒｏｗ，６１−７０）、ＲＰＥは目の血管性、炎症性、消耗性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）および異栄養性（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ）疾患に関係していると考えられる（Ｅｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１３６，７４５−７５０）。増殖因子に加え、栄養および代謝物もまたＲＰＥおよび網膜間で交換されている。例えば、ＲＰＥはよく知られた増殖因子ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、およびＴＧＦ−βを網膜に供給している（Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ ｅｔ
ａｌ．（１９８８）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２９，３０５−３１１；Ｐｌｏｕｅｔ（１９８８）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２９，１０６−１１４；Ｆａｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２９，２４２−２５０；Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２９，３０７−３１３）。ＲＰＥにより供給されたこれらおよび他の未知の因子が網膜の構成、分化および正常な機能発揮に影響していることは非常にありそうなことである。
【０００４】
ＲＰＥにより分泌される推定の分化因子の効果を研究および決定するため、培養細胞に網膜抽出物およびヒト胎児ＲＰＥ細胞の培養で得られた馴化培地が加えられた。例えば、米国特許第４，９９６，１５９（Ｇｌａｓｅｒ）は約５７，０００＋／−３，０００の分子量のＲＰＥから回収された血管新生阻害剤が開示されている。同様に、米国特許第１，７００，６９１（Ｓｔｕａｒｔ）、４，４７７，４３５（Ｃｏｕｒｔｏｉｓら）および４，６７０，２５７（Ｇｕｅｄｏｎ ｂｏｒｎ Ｓａｇｌｉｅｒら）は網膜抽出物および細胞再生および眼疾患処置におけるこれらの抽出物の使用が開示されている。さらに、米国特許第４，７７０，８７７（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）および４，５３４，９６７（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）は、ウシ硝子体液の後方部から精製された細胞増殖阻害剤が開示されている。
【０００５】
ＰＥＤＦは最近ヒトＲＰＥから５０−ｋＤａタンパク質として単離された（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２９，４１４；Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３０，１７００−１７０７；Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，５３，４１１−４１４）。特に、ＰＥＤＦは正常網膜芽細胞に対応する新生物性体であるヒトＹ７９網膜芽腫細胞の分化を誘導することが示されている（Ｃｈａｄｅｒ（１９８７）Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．，２０，２０９−２１６）。ＰＥＤＦにより誘導された分化的変化には神経突起の複雑な網目の拡張、およびニューロン特異的エノラーゼおよび神経フィラメントタンパク質のような神経性マーカーの発現が含まれる。このこと故にＲＰＥによるＰＥＤＦタンパク質の合成および分泌が網膜神経の発達および分化に影響していると信じられている。さらに、ＰＥＤＦは未分化のヒト網膜細胞（Ｙ７９網膜芽腫細胞のような）でのみ多く発現されており、それらが分化するとなくなるかまたはダウンレギュレーションされている。最近、ＰＥＤＦ ｍＲＮＡが静止状態の胎児ヒトＷ１線維芽細胞で多量に発現され、およびそれらが老化すると発現されないことが報告された（Ｐｉｇｎｏｌｏら、（１９９３））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＰＥＤＦのさらなる研究および網膜および中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性、血管性、消耗性および異栄養性疾患の処置におけるその治療的使用の可能性の試験にはＰＥＤＦを多量に入手する必要がある。不幸にして、ヒト胎児の目においてＰＥＤＦは豊富には存在せず、さらにその源となる組織はほとんど入手できないことが（特に、研究および治療応用における胎児組織の使用制限をかんがみると）さらなるＰＥＤＦの研究を最も困難なものにしている。それ故ＰＥＤＦおよび等価なタンパク質が多量に必要とされている。従って、ＰＥＤＦおよび等価なタンパク質をコードしている核酸の多量の入手、およびＰＥＤＦおよび等価なタンパク質を産生する能力はＰＥＤＦ、その構造、生化学的活性および細胞機能の研究ならびにＰＥＤＦの治療的使用の発見および設計に著しく強い影響を与えるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
本発明によって、以下が提供される。
（項目１） ニューロンを含む細胞集団を有効量の色素上皮誘導因子で処理し；および
該集団のニューロン細胞生存を促進することからなるニューロン細胞生存の促進法。
（項目２） グリア細胞を含む細胞集団を有効量の色素上皮誘導因子で処理し；および
該集団のグリア細胞増殖を阻害することからなるグリア細胞増殖阻害法。
（項目３） ニューロン細胞が組織細胞培養にある項目第１項に記載の方法。
（項目４） 以下の工程をさらに含む項目第１項に記載の方法：
細胞培養を設定し；および
該細胞培養を有効量のＰＥＤＦで処理する。
（項目５） 処理される細胞が患者内へ移植される組織の構成要素を含む項目第１項に記載の方法。
（項目６） 細胞が胎児脳細胞である項目第６項に記載の方法。
（項目７） グリア細胞が腫瘍増殖の一部である項目第２項に記載の方法。
（項目８） 阻害されるグリア細胞増殖がグリオシスである項目第２項に記載の方法。
（項目９） 精製された色素上皮誘導因子またはその抗原性断片に対して作製された精製抗体または該抗体の抗原−結合断片。
（項目１０） 前記抗体がポリクローナルである項目第９項に記載の単離抗体または抗体断片。
（項目１１） 前記抗体がモノクローナルである項目第９項に記載の抗体または抗体断片。
（項目１２） 前記抗体が検出可能な標識で標識されている項目第９項に記載の抗体または抗体断片。
（項目１３） 細胞または細胞集団を有効量の項目第９項に記載の抗体または該抗体の抗原結合断片で処理し；および
色素上皮誘導因子生物学的活性を阻害することからなる色素上皮誘導因子の阻害法。
（項目１４） 以下の工程を含んでなる、体液、細胞または組織試料中の色素上皮誘導因子レベルの決定法：
Ａ．該試料と項目第９項に記載の精製抗体または抗原結合断片を該抗体または抗原結合断片と該試料中に存在する色素上皮誘導因子間で免疫複合体が形成される条件下で接触させ；
Ｂ．免疫複合体から過剰の抗体または抗原結合断片を分離し；および
Ｃ．免疫複合体のレベルを決定して色素上皮誘導因子レベルを決定する。
【０００８】
ＰＥＤＦおよびその機能的断片をコードしている核酸、そのような核酸を含むベクター、そのようなベクターが導入されている宿主細胞、およびＰＥＤＦおよび等価なタンパク質を産生する組換え法を提供することが本発明の目的である。本発明の別の目的はＰＥＤＦをコードしているゲノムＤＮＡ配列を得、ヒトゲノム中のイントロンーエクソン連接（ジャンクション）、染色体位置を同定し、ゲノム配列に隣接する該遺伝子の制御領域を提供することである。本発明はそのようなゲノムＰＥＤＦ ＤＮＡに関している。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、ＰＥＤＦの構造的特性を提供し、セリンプロテアーゼ阻害剤のセルピンファミリーへの構造的および機能的類似性を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、そのような組換え法に従って産生されたＰＥＤＦおよび等価なタンパク質を提供することであり、ここでそのように産生されたＰＥＤＦおよび等価なタンパク質は天然に存在する源となる生物体からのＰＥＤＦの単離に付随する危険性を伴っていない。
【００１１】
本発明の別の目的は、ｒＰＥＤＦと称されるＰＥＤＦの端が切断されたものに対する核酸、そのような核酸を含むベクター、そのようなベクターが導入されている宿主細胞、およびｒＰＥＤＦおよび等価なタンパク質を産生する組換え法を提供することである。そのような組換え法に従って産生されるｒＰＥＤＦおよび等価なタンパク質を提供するのも本発明の目的である。
【００１２】
神経細胞栄養性およびグリア細胞静止活性を持つＰＥＤＦタンパク質を提供するのが本発明のさらなる目的である。神経細胞栄養性活性は神経細胞の生存を長くすることで見ることができる。グリア細胞静止活性はＰＥＤＦまたはその活性断片存在下でのグリア細胞の増殖阻害で観察できる。本発明の別の目的はニューロン生存を助長／促進するように、およびグリア細胞の増殖を防止するように神経細胞を処理するための方法を提供することであり、それはそのような細胞集団を有効量のＰＥＤＦまたはその活性断片で処理することを特徴としている。
【００１３】
本発明のさらに別の目的はＰＥＤＦを特異的に認識する抗体を提供することである（モノクローナルまたはポリクローナル、天然のタンパク質、組換え体タンパク質またはその免疫活性断片に対して）。本発明の目的は老化および／または他の消耗性疾患の決定においてそのような抗体調製物を使用するイムノアッセイによりＰＥＤＦを検出する方法を提供することである。本発明の別の目的は特異的にＰＥＤＦ活性を阻害するためにＰＥＤＦ抗体を使用する方法に関している。
【００１４】
本発明のこれらのまたは他の目的および利点、ならびに追加の発明の特色はここに提供された発明の説明から明らかにされるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒトＰＥＤＦ遺伝子構造：ヒトＰＥＤＦ遺伝子の制限地図および構成。エクソン１−８は黒の四角で示されており、１−８の番号が付けてある。イントロンおよび隣接するＤＮＡは水平な線で表されておりＡ−Ｇのラベルが付けられている。いくつかのゲノムクローンは図解した遺伝子の上および下に示されている。制限酵素ＮｏｔＩ（”Ｎ”）、ＢａｍＨＩ（”Ｂ”）およびＥｃｏＲＩ（”Ｅ”）の制限部位は垂直の矢印で示されている。
【図２】ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩエンドヌクレアーゼで制限分解されたヒトゲノムＤＮＡ（Ａ）およびＰ１４７（Ｂ）のサザン分析。パルスフィールド電気泳動を行ったゲルのプロフィールからのサザン分析物は放射性標識ＰＥＤＦ ｃＤＮＡで探査された。Ｐ１４７ＤＮＡのハイブリダイゼーションパターンは全ヒトゲノムＤＮＡと一致した。サイズマーカーが示されている。
【図３】ＰＥＤＦ遺伝子の５’隣接領域。最初のエクソン（大文字）および５プライム隣接領域の最初の１０５０ｂｐが示されている。二つのＡｌｕ反復配列は下線が施されている。ＨＮＦ−１、ＰＥＡ３、オクトマー（Ｏｃｔ）、ｃ／ＥＢＰの可能な結合部位は下線が施されており、ラベルされている。推定ＡＰ−１部位はボールド体で示されており、ＴＲＥｐ／ＲＡＲは二重の下線が付けられている。エクソン１中の下線を付けた配列は５’ＲＡＣＥにより決定された。
【図４】ＰＥＤＦ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析：ヒト成人および胎児組織中のヒトＰＥＤＦ転写体の遺伝子発現分析。ＲＮＡが得られた組織はレーンに対応して上に示されている。膜は各々の試料に対し２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを含んでおり、ヒトＰＥＤＦのための放射性標識ｃＤＮＡで探査された。成人および胎児組織の両方で単一の１．５ｋｂ転写体が観察され、肝臓、精巣、骨格筋および卵巣で最も大きなハイブリダイゼーションがあり、一方、脳、膵臓および胸腺の信号は他の組織のものより著しく弱かった。成人腎臓および脾臓では有意な信号は観察されなかった。ＰＥＤＦ ｍＲＮＡレベルの有意な相違が成人および胎児腎臓で観察された。
【図５】ヒトＰＥＤＦ遺伝子の進化的関連付け：各々のレーンは各々の種をＥｃｏＲＩで消化した総量で８μｇのゲノムＤＮＡを表している。ＰＥＤＦプローブでのサザンブロット分析が示されている。ニワトリ（Ａ）、哺乳類（Ｂ）および霊長類（Ｃ）のハイブリダイゼーション信号が示されている。約２３ｋｂの大きな断片がすべての霊長類および多くの哺乳類で観察される。加えて、試験された異なった哺乳類でいくつかの多形が観察される。
【図６】播種した細胞密度とＭＴＳアッセイにより測定された光学密度の関係。異なった濃度の生後８日の小脳顆粒細胞を９６ウェルプレートに加え、血清含有培地（６Ａ）または化学的に特定される培地（６Ｂ）で培養した。光学密度はインビトロでの日数（ＤＩＶ）１、４または７で測定された。四角、ＤＩＶ１；黒丸、ＤＩＶ４；白丸、ＤＩＶ７。データは細胞密度の関数としてプロットされている（ｎ＝６）。
【図７】化学的に特定される培地におけるＰＥＤＦ刺激細胞生存の時間変化。生後８日の小脳顆粒細胞を９６ウェルプレートで培養した。ＤＩＶ０にＰＥＤＦを加え、ＤＩＶ１、４、７または１０に光学密度を測定した。黒棒、対照；左斜線の棒、ＰＥＤＦ処理（５０ｎｇ／ｍｌ）；右斜線ＰＥＤＦ処理（５００ｎｇ／ｍｌ）。データは光学密度／ウェルで表わされている（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）。統計計算はツーウェイＡＮＯＶＡ ポスト−ｈｏｃ Ｓｃｈｅｆｆｅテストにより行われた。★★対照に対してＰ＜０．０００１。
【図８】化学的に特定される培地におけるＰＥＤＦの用量応答曲線。異なった濃度のＰＥＤＦがＤＩＶ０に加えられ、ＭＴＳアッセイがＤＩＶ７に実施された。データは対照に対する比で表わされている（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）。統計計算はワンウェイＡＮＯＶＡ ポスト−ｈｏｃ ＳｃｈｅｆｆｅＦテストにより統計計算が行われた。★★対照に対してＰ＜０．０００１。
【図９】ＤＩＶ１およびＤＩＶ２での生後５日の小脳顆粒細胞のＭＴＳアッセイ。生後５日の小脳顆粒細胞をＡｒａ−Ｃを含まない血清含有培地（Ａ）またはＦ１２を含まない化学的に特定される培地（Ｂ）を用い、９６ウェルプレートで培養した。ＭＴＳアッセイはＤＩＶ１およびＤＩＶ２に実施された。黒棒、対照；しまを付けた棒、ＰＥＤＦ処理（５００ｎｇ／ｍｌ）。データは光学密度／ウェルで表わされている（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）。統計計算はツーウェイＡＮＯＶＡ ポスト−ｈｏｃ Ｓｃｈｅｆｆｅ Ｆテストにより行われた。★★対照に対してＰ＜０．０００５。
【図１０】生後５日の小脳顆粒細胞内へのＢｒｄＵ取り込み。生後５日の小脳顆粒細胞をＡｒａ−Ｃを含まない血清含有培地（ＳＣＭ）またはＦ１２を含まない化学的に特定される培地（ＣＤＭ）を用い、９６ウェルプレートで培養した。ＰＥＤＦはＤＩＶ０に加えた。ＢｒｄＵはＤＩＶ１に加え、ＤＩＶ２に細胞を固定した。黒棒、対照；しまを付けた棒、ＰＥＤＦ処理（５００ｎｇ／ｍｌ）。標識された核酸の数は全細胞集団のパーセントとして表現されている（平均±ＳＥＤ）。各々の値について少なくとも３０００の細胞が計数された。
【図１１】ＥＬＩＳＡにより測定された細胞密度と神経フィラメントの間の関係。異なった濃度の生後８日の小脳顆粒細胞を９６ウェルプレートに加え、培養した。光学密度はＤＩＶ７に測定された。データは細胞密度の関数としてプロットされている。
【図１２】生後８日の小脳顆粒細胞における神経フィラメントＥＬＩＳＡアッセイ。細胞を血清含有培地（ＳＣＭ）または化学的に特定される培地（ＣＤＭ）を用い、ＰＥＤＦとまたはＰＥＤＦなしで９６ウェルプレートで培養した。ＤＩＶ７に細胞を固定した後、神経フィラメントＥＬＩＳＡが実施され、データは対照に対する比として表現されている（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６から１０）。黒棒、対照；しまを付けた棒、ＰＥＤＦ処理（５００ｎｇ／ｍｌ）。統計計算はツーウェイＡＮＯＶＡ ポスト−ｈｏｃ Ｓｃｈｅｆｆｅ Ｆテストにより行われた。★★対照に対してＰ＜０．０５。
【図１３】培養１０日間のＰＥＤＦ神経細胞栄養性効果の要約。
【図１４】端が切り取られたペプチドＢＰおよびＢＸのＣＧＣ生存率に対する効果。
【図１５】小脳からの大グリア細胞に対するＰＥＤＦの効果。
【図１６】小脳小グリア細胞に対するＰＥＤＦの効果。
【図１７−１】ウシＩＰＭからのＰＥＤＦ−免疫反応性タンパク質の精製。ウシＩＰＭ洗液をＡ）ＴＳＫ−３０００サイズ排除クロマトグラフィー続いてＢ）Ｍｏｎｏ−Ｓクロマトグラフィーにかけた。ウェスタンブロットでＰＥＤＦ含有分画が示される。
【図１７−２】ウシＩＰＭからのＰＥＤＦ−免疫反応性タンパク質の精製。ウシＩＰＭ洗液をＡ）ＴＳＫ−３０００サイズ排除クロマトグラフィー続いてＢ）Ｍｏｎｏ−Ｓクロマトグラフィーにかけた。ウェスタンブロットでＰＥＤＦ含有分画が示される。
【図１８】ウェスタンブロッティングにより示されたＰＥＤＦの酵素的脱グリコシル化。ＰＥＤＦ処理は各々のレーンの上に与えられている。数字は分子量標準の位置を示している。
【図１９】ＰＥＤＦに対する抗体は特異的に天然ＰＥＤＦを高力価で認識する。Ａ）少なくとも１：５０，０００希釈までの抗体の有効性、および過剰のｒＰＥＤＦの添加がバンド可視化を完全に阻止することを示しているウェスタンブロット。Ｂ）スロットブロット分析は天然ウシＰＥＤＦタンパク質の≦１ｎｇを検出する能力を示している。
【図２０】Ｙ−７９細胞における神経突起拡張に対するＰＥＤＦ抗体の逆の効果。上列：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）対照培養。中列：天然ウシＰＥＤＦタンパク質による神経突起誘導に対する抗体効果。下列：光受容体間マトリックス（ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍａｔｒｉｘ：ＩＰＭ）による神経突起誘導に対する抗体効果。
【図２１】ＰＥＤＦ存在または不在下での神経突起成長の位相差顕微鏡分析。
【図２２】組換え体ＰＥＤＦおよび天然の単離ＰＥＤＦの存在下での神経突起成長の位相差顕微鏡分析。
【図２３】ｒＰＥＤＦのＣ−末端欠失の模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は新規で、重要でありようやく解明された特性を持つタンパク質に関する。色素上皮誘導因子（ＰＥＤＦ）は神経栄養性、神経細胞栄養性およびグリア細胞静止特性を持つタンパク質である。本発明はさらに、ＰＥＤＦ遺伝子をコードしているＤＮＡ配列、ＰＥＤＦ遺伝子および生物学的活性を持つＰＥＤＦのタンパク質断片をコードしているＰＥＤＦ遺伝子の断片を含むゲノムＤＮＡに関する。
【００１７】
”神経栄養性”活性とはここでは神経細胞集団の分化を誘導する能力として定義される。例えば、培養網膜芽細胞で分化を誘導できるＰＥＤＦの能力は神経栄養性活性と考えられる。
【００１８】
”神経細胞栄養性”活性とはここでは神経細胞集団の生存を促進する能力として定義される。例えば、神経細胞のニューロン生存因子として働くＰＥＤＦの能力は神経細胞栄養性活性である。
【００１９】
”グリア細胞静止”活性とはここではグリア細胞の成長および増殖を阻害する能力として定義される。例えば、グリア細胞の成長および／または増殖を防止するＰＥＤＦの能力はグリア細胞静止活性である。本発明で評価されたタンパク質アミノ酸配列に基づくと、ＰＥＤＦはセリンプロテアーゼ阻害剤であるセルピン遺伝子ファミリーと高い配列相同性を持っていることが観察された。このファミリーの多くのメンバーは、タンパク質の反応性部位として働くカルボキシル末端の厳密に保存されたドメインを持っている。これらのタンパク質は従って共通の祖先から誘導されていると考えられる。しかしながら、セルピン遺伝子ファミリーのメンバー間で発育制御は異なっており、多くは古典的プロテアーゼ阻害活性から逸脱している（Ｂｏｃｋ（１９９０）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｏｃｋ，Ｓ．Ｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４，１０７−１０８；Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６２，１０３−１０７）。ＰＥＤＦはセルピンと配列相同性を共有しているが、ｃＤＮＡ配列の分析から保存的ドメインを欠いており、従って古典的プロテアーゼ阻害剤としては機能しないであろう。
【００２０】
ＰＥＤＦのゲノム配列決定および分析はイントロンおよびエクソンならびに５’−上流配列の約４ｋｂの配列を提供した。本発明はインサイチュハイブリダイゼーションおよび体性細胞ハイブリッドパネルの分析を用いて、１７ｐ１３．１に対するＰＥＤＦの遺伝子の局在化を示している（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ、ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９：２６６−２７２）。これはｐ５３腫瘍抑制遺伝子ならびにｐ５３遺伝子生成物中の突然変異に相関しない多くの遺伝性癌の染色体局在化に非常に近い。ＰＥＤＦは従ってこれらの癌の第一の候補遺伝子になった。
【００２１】
完全長ゲノムＰＥＤＦ配列は配列ＩＤ番号：４３に示されている。ＰＥＤＦ遺伝子は約１６ｋｂであり、８つのエクソン（そのすべては保存的共通スプライス部位を持っている）を含んでいる。ＰＥＤＦ遺伝子の５’−隣接部位は２つのＡｌｕ反復要素を含んでおり、それは推定プロモーター配列の最初の１０５０ｂｐの約３分の２を占めている。転写因子のいくつかのファミリーのメンバーで認識されるであろういくつかの配列モチーフも存在する。偏在する転写因子のオクタマーファミリーの２つの可能な結合部位の存在は、試験されたほとんどの組織にＰＥＤＦが存在することを説明しているであろう。しかしながら、他のより特異的な要素の存在はＰＥＤＦが厳密な制御下にあることを示唆し、神経分化および線維芽細胞老化のような多様な過程に対する効果が含まれる従来の研究を支持している。
【００２２】
ゲノムＰＥＤＦ配列またはその断片は細胞における遺伝子検出のためのプローブとして有用である。加えて、そのようなプローブはその遺伝子を運んでいる細胞型の同定のためのキットに有用である。遺伝子構成の中の突然変異、欠損または他の変化はＰＥＤＦゲノム配列から誘導されるＤＮＡプローブを使用することにより検出できる。
【００２３】
（組織分布）
ＰＥＤＦはＲＰＥ細胞によって特に高く発現されるが、ほとんどの組織、細胞型、腫瘍などでノーザンおよびウェスタンブロット分析により検出可能である。例えば、硝子体液および眼房液に容易に検出される。ＰＥＤＦの細胞内局在化という重要な問題も追求されている。ＰＥＤＦの大部分は分泌されるようであるが、培養サルＲＰＥ細胞の探査にＰＥＤＦ抗体を用いたところ、核ならびに細胞質の非常に特異的な細胞骨格構造にＰＥＤＦが付随することが観察された。重要なことは、このことが試験された細胞の年齢および特定の細胞周期状態で変化することである。例えば、付着の最初の段階で基層と相互作用する霊長類ＲＰＥ細胞の偽足の先端に本タンパク質は濃縮されるようである。その後、この染色は消失し、特異的細胞骨格構造および核に付随して本タンパク質が出現する。従って、ＰＥＤＦは核および細胞質の両方で重要な細胞内の役割を果たしているようである。
【００２４】
（細胞周期の関与）
本発明は分裂中の未分化Ｙ−７９細胞では発現し、および対応する静止状態の分化細胞ではわずかな発現または無発現であることを示している（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ、ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９：２６６−２７２）。Ｐｉｇｎｏｌｏ
ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２９４９−２９５、はＷＩ−３８線維芽細胞中のＰＥＤＦの合成は若い細胞の細胞周期のＧ０段階に限定されることを示している。さらに、年をとった老化細胞においては、ＰＥＤＦ メッセンジャーＲＮＡは存在しない。
【００２５】
（組換え体ＰＥＤＦの産生）
ＰＥＤＦポリペプチドを分節に区切って研究することは構造−機能の研究では基本的なことである。この目的ために、ＰＥＤＦコード配列の断片を含む発現ベクターがＰＥＤＦポリペプチドの異なった領域の合成および単離のために優れた断片源を提供する。ヒト胎児ＰＥＤＦ配列の発現は大腸菌発現ベクターおよびヒト胎児ＰＥＤＦ ｃＤＮＡにより達成された。組換え体ＰＥＤＦ生成物（ｒＰＥＤＦ）は生物学的に活性な神経栄養性因子であり、湿潤大腸菌グラム当たり１．３ｍｇのオーダーの収量で得られることが示された。端が切断されたペプチドはまた適当な分子生物学的構築物を大腸菌で発現させても作製できる。これらの生成物を用い、ＰＥＤＦ一次構造上の２つの独特な領域が１）タンパク質のＮ−末端近くのアミノ酸残基４４−１２１内に位置し、分子に神経栄養性活性を与える”活性部位”、および２）セルピンの露出ループと相同的であるＣ−末端近くの領域（即ち、”古典的”セルピン活性部位）が区別できた。これらの結果は、１）神経突起成長にはＰＥＤＦの全部の天然コンホメーションは必要とされない、および２）セリンプロテアーゼの阻害ではＰＥＤＦの生物学的活性は説明できないことが示唆される。タンパク質配列を覆う一連の端が切断されたｒＰＥＤＦ構築物が得られ、Ｎ−末端近くの特異的神経栄養性”活性部位”の正確な位置を決めることができた。
【００２６】
（高度に特異的なポリクローナル抗体での特性付け）
精製された組換え体ヒトＰＥＤＦは、ＰＥＤＦ媒介神経栄養性活性を特異的に阻害するポリクローナル抗体（”抗−ｒＰＥＤＦ”）の開発に使用された。さらに、抗−ｒＰＥＤＦは完全にＩＰＭ誘導神経栄養性活性を阻害した。
【００２７】
（ＰＥＤＦの神経栄養性特性）
Ｙ−７９およびＷｅｒｉ腫瘍細胞系において天然ＰＥＤＦおよびｒＰＥＤＦが神経栄養性であることを示すことに加え、本発明はＰＥＤＦが初代培養の正常ニューロンに効果を示すかどうかを決定した。この目的のため、生後８日のラットから調製された正常小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）の培養物を用いて研究が実施された。ｒＰＥＤＦで処理された細胞はより神経的形態的外観を示すことにより処置には応答しなかった。しかしながら、ＰＥＤＦは顆粒細胞生存に大きな効果を示した。これらの細胞は腫瘍性または形質転換細胞ではないので、これらは培養で限られた寿命しかなく、培養培地に依存して約２１日で死んでゆく。しかしながら、ＰＥＤＦ処理培養物は非処理培養物と比較して無血清培地中、培養１０日後に１０倍の細胞を含んでいた（図４）。これらの結果は；１）直接的顕微鏡観察および細胞計数、および２）生きている細胞数を決定するＭＴＳ（テトラゾリウム／ホルマザン）アッセイにより決定された（実施例１１参照）。従って、ＰＥＤＦはＣＮＳニューロン生存に劇的な効果を示し、近年明らかにされつつある”神経細胞栄養性”タンパク質の数少ないリストに加えられるべきである。
【００２８】
一般的な組織培養研究：
ニューロンおよびグリアを用いる組織培養実験で一般的に悩まされる２つの問題は、ニューロンは急速に死にがちであり、グリアは培養皿を乗り越えがちであることである。ＰＥＤＦまたはそのペプチドは両方の点を助けることができる。従って、ＰＥＤＦの商業的使用の一つは、ＣＮＳ細胞が培養される場合の一般的な培養培地添加物としてであろう。
【００２９】
ＣＮＳ移植研究：
ニューロンの移植はある種の病理を治療すると考えられている。例えば、パーキンソン疾患において、特定の胎児脳細胞の患者への移植は疾患に付随する問題を軽減または治療できるであろう。しかしながら、一つの大きな問題は移植された細胞の生存を延ばすこと、およびそれらを分化したまま維持すること（例えば、適当な物質を分泌するように）であろう。細胞をＰＥＤＦで前処理すると、これらの両方の面での助けになる。同様に、移植前にニューロンまたは大グリア細胞をＰＥＤＦでトランスフェクトすると、移植部位で長期間のＰＥＤＦ源であることができる。
【００３０】
盲目治療を助けるため、神経網膜および光受容体細胞の移植の試みが盛んである。現在まで、これらの試みは移植片の非分化および死滅の両方のため実を結んでいない。このような場合にも、ＰＥＤＦは両方の点で助けになるであろう。特に、手術前に移植される光受容体ニューロンはＰＥＤＦまたは細胞内へトランスフェクトされた遺伝子で前処理できる。もしくは、ＰＥＤＦは高レベルで隣接する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞内へトランスフェクトでき、そこでタンパク質の過剰な供給源として働くことができる。幾人かの研究者は、培養ＲＰＥ細胞が試験動物の光受容体空間内への移植後に非常によく生存していることを示している。インビトロでのヒトＲＰＥ細胞のＰＥＤＦ遺伝子によるトランスフェクション、続いてのそれらの網膜移植での使用が容易である。
【００３１】
神経消耗性疾患：
ＣＮＳ（脳および網膜）に対する多くの神経消耗性疾患およびその他の障害はニューロンの死亡およびグリアの過密（グリオシス）により代表される。ＰＥＤＦはこれらの状態において、一次ニューロンの寿命および機能発揮を延長するため、およびグリアの進出をくい止めるために有効に使用できる。例えば、ＰＥＤＦはＣＮＳ障害に応答した小グリア活性化を阻害し、ならびにニューロンの命を延長／助命するのに有効で有り得る。
【００３２】
網膜において、ＰＥＤＦがミュラーグリア細胞を阻害することが予測できる。
【００３３】
ミュラー細胞は大グリア細胞と類似しているので、ＰＥＤＦは同様に網膜剥離、糖尿病、色素性網膜炎などのような病態でのグリオシスの防止ならびに網膜ニューロンの助命に有効であろう。
【００３４】
グリア癌：
ＣＮＳを攻撃する癌の主要な型のほとんどにグリア要素が含まれており、ＰＥＤＦは他の形の療法と組み合わせて使用できるグリア静止因子である。例えば、手術に加えて、ＰＥＤＦは疾患の拡散または再発を有効に阻害できる。
【００３５】
（遺伝的分析）
本発明はヒトＰＥＤＦ遺伝子およびそのプロモーターの構成の決定およびその進化的相関および種々のヒト胎児および成人組織での発現に関している。
【００３６】
本発明は、なかでもＰＥＤＦをコードしている核酸を提供する。特に、ｃＤＮＡ配列が配列ＩＤ番号：１に示したように提供される。このｃＤＮＡは配列ＩＤ番号：２に示したアミノ酸配列を持つＰＥＤＦをコードしている。さらなるゲノム配列は図１のように地図作製がされ、配列ＩＤ番号：４３が提供される。ゲノムＰＥＤＦ配列の追加の断片は配列ＩＤ番号：９から配列ＩＤ番号：１２に提供されている。イントロンーエクソン連結の位置は表１および配列ＩＤ番号：２５から配列ＩＤ番号：４０および配列ＩＤ番号：４３に同定されている。
【００３７】
術語”核酸”とはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のポリマーを称し、それらは任意の源から誘導でき、一本鎖でも二本鎖でもよく、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマー内へ取り込むことができる合成、非天然または改変ヌクレオチドを場合により含むことができる。本発明の核酸は好適にはＤＮＡのセグメントである。
【００３８】
本発明ではさらに、ＰＥＤＦの端が切断されたものが提供される。これらの内最も大きいものはｒＰＥＤＦと称され、ＰＥＤＦのＡｓｐ４４．．．Ｐｒｏ４１８に融合したアミノ酸配列Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅを含んでいる（アミノ末端が欠失している）。ｒＰＥＤＦタンパク質は配列ＩＤ番号：３のアミノ酸配列を含んでいる。本発明はまたｒＰＥＤＦのアミノ酸配列を含むタンパク質（即ち、配列ＩＤ番号：３のアミノ酸配列）をコードしている核酸も提供する。
【００３９】
遺伝子コードの縮重およびいわゆる”Ｗｏｂｂｌｅルール”と呼ばれている古典的塩基対生成のコドンの第三位に例外が許されるという観点から、与えられた任意のタンパク質は一つ以上の核酸によりコードされうることを当業者は理解するであろう。従って、本発明は配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：３ならびに等価なタンパク質のアミノ酸配列をコードするすべての核酸を包含している。句”等価な核酸”とはすべてのこれらの核酸を包含することを意図している。
【００４０】
特定のタンパク質の機能に不利に影響することなくアミノ酸配列を変更できることも当業者は理解するであろう。実際、アミノ酸配列のいくつかの変更はタンパク質に改良された特性を与える。どのアミノ酸をタンパク質の機能に不利に影響することなく変更してもよいかの決定は当業者にはよく知られている。さらに、より多くのまたはより少ないアミノ酸を含むタンパク質でも機能的に等価なタンパク質を生じることができる。従って、本発明はＰＥＤＦタンパク質またはその機能的タンパク質断片を生じるすべてのアミノ酸配列を包含することが意図されている。
【００４１】
可能な等価な核酸および等価なタンパク質のいくつかの例には、ｒＰＥＤＦタンパク質およびその等価なタンパク質断片の合成に関する置換、付加または欠失を持つ核酸；ｒＰＥＤＦタンパク質の産生に関する異なった制御配列を持つ核酸；タンパク質のアミノ末端に合同した４つ以外の異なったアミノ酸および／またはアミノ酸の数を持つｒＰＥＤＦの変異体；および活性に不利に影響しないアミノ酸置換、付加、欠失、修飾および／またはグリコシル化のような翻訳後修飾を持つＰＥＤＦおよびｒＰＥＤＦおよびその機能的タンパク質断片が含まれる。神経栄養性活性はＰＥＤＦの特定の部分に関連しているので、これらの残基を含むタンパク質断片は明らかに本発明の範囲内である。
【００４２】
本発明はまた、配列ＩＤ番号：１の核酸、配列ＩＤ番号：２または等価なタンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしている核酸、配列ＩＤ番号：３または保存的に修飾された変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードしている核酸、および保存的に修飾されたそれらの核酸の変異体を含むベクターも提供する。
【００４３】
特に、本発明は配列ＩＤ番号：１の核酸を含むベクターπＦＳ１７、および配列ＩＤ番号：３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている核酸を含むベクターｐＥＶ−ＢＨを提供する。記載されたｃＤＮＡ挿入物は別のベクターにも存在できることを当業者は理解するであろう。例えば、挿入物はファージ、ウイルス、カプシド、プラスミド、コスミド、ファージミド、ＹＡＣまたはファージまたはウイルスカプシドの外側に結合されたような異なった性質を持つベクターに存在できる。ベクターは宿主域、安定性、複製および維持を異にすることができる。さらに、ベクターはクローン化挿入物に及ぼす制御の型を異にすることができる。例えば、ベクターはクローン化挿入物を異なったプロモーター、エンハンサーまたはリボソーム結合部位の制御下に置くことができ、またはそれをトランスポゾンまたは移動性遺伝要素の一部として構成することさえ行う。
【００４４】
本発明は、配列ＩＤ番号：１の核酸、配列ＩＤ番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質または等価なタンパク質をコードしている核酸、配列ＩＤ番号：３のアミノ酸からなるタンパク質または等価なタンパク質をコードしている核酸を含むベクターが導入されている宿主細胞も提供する。特に宿主細胞は配列ＩＤ番号：１の核酸を含むベクターπＦＳ１７、または配列ＩＤ番号：３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている核酸を含むベクターｐＥＶ−ＢＨを持っている。
【００４５】
本発明のベクターは真核生物または原核生物を問わず任意の適した宿主細胞内に導入できる。これらの宿主細胞は増殖のための好適な条件、栄養要求および環境の試薬への感受性が異なっているであろう。宿主細胞内へベクターを導入する任意の適した手段が用いられる。原核生物細胞の場合、ベクター導入は例えばエレクトロポレーション、形質転換、トランスダクション、コンジュゲーションまたはモビリゼーションにより達成される。真核生物細胞の場合、ベクター導入は例えばエレクトロポレーション、トランスフェクション、感染、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルまたは原形質体融合を使用することにより導入されるであろう。
【００４６】
導入された核酸の形は宿主細胞内へのベクターを導入するために使用された方法により変化するであろう。例えば、ベクターが自己複製要素として維持されているか、プロウイルスまたはプロファージとして組み込まれているか、過渡的にトランスフェクトされているか、過渡的に複製不能ウイルスまたはファージと感染されているか、または一重または二重交差組換えにより安定に導入されているかに依存して核酸は閉環状か、ニックされているかまたは直線状であろう。
【００４７】
本発明はまた、ＰＥＤＦ、ｒＰＥＤＦおよび等価なタンパク質を産生する方法を提供し、その方法はタンパク質を宿主細胞で発現することを特徴としている。例えば、配列ＩＤ番号：１の核酸、配列ＩＤ番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質または等価なタンパク質をコードしている核酸、配列ＩＤ番号：３のアミノ酸からなるタンパク質または等価なタンパク質をコードしている核酸またはそれらと等価な核酸を含むベクターが導入されている宿主細胞が所望のタンパク質を産生するのに適した条件下で培養されるであろう。特に、配列ＩＤ番号：１の核酸を含むベクターπＦＳ１７、または配列ＩＤ番号：３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている核酸を含むベクターｐＥＶ−ＢＨは各々配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：３のアミノ酸配列からなるタンパク質を産生するのに適した条件下で培養されるであろう。
【００４８】
本発明はまた、所望のタンパク質を産生するために適当な宿主細胞を培養する前記の本発明に従ってされる組換え的に産生されたＰＥＤＦおよびその機能的タンパク質断片も提供する。組換え的手段によるＰＥＤＦのようなタンパク質の産生は、高度に生成された状態で、天然に存在する供給器官から単離および生成されたタンパク質に付随するであろう疾病原因物質を含まずに多量のタンパク質の入手が可能であり、例えば、そのようなタンパク質源として胎児組織を使用する必要性をなくする。
【００４９】
組換え体ＰＥＤＦおよびその機能的タンパク質断片は、例えば、そのタンパク質をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡの様な核酸の導入を含む種々の手段により細胞に対し活性な試薬として供給され、従って、宿主細胞内で転写および／または翻訳されるであろうし、外因性タンパク質の添加および他の適した投与手段は当業者には既知であろう。供給されるのがどのような形であれ、活性試薬は単独で、または投与法に適した活性試薬の医薬組成物および処方を用いて他の活性試薬と組み合わせて使用される。医薬として適した賦形剤（即ち、賦形薬、補助剤、担体または希釈剤）は当業者にはよく知られており、容易に入手可能である。賦形剤の選択は特定の化合物ならびに化合物を投与するのに使用される特定の方法により部分的に決定されるであろう。従って、本発明の範囲内で調製できる多くの種類の適した処方が存在する。しかしながら、組換え体タンパク質の神経栄養性、神経細胞栄養性およびグリア細胞静止活性を変化させない医薬として受容可能な賦形剤が好適である。
【００５０】
以下の実施例は本発明をさらに例示するためのものであり、どうあろうとその範囲を制限していると解釈するべきではない。
【実施例】
【００５１】
（実施例１）
この実施例は、ＰＥＤＦのトリプシン加水分解と生じる断片のアミノ酸配列決定について記載している。
【００５２】
ＰＥＤＦはヒト胎児ＲＰＥ細胞の初代培養培地の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製された。ＨＰＬＣ精製されたＰＥＤＦは還元されアルキル化された。その後、それを乾燥し５０μｌのＣＲＡ緩衝液（８Ｍ尿素、０．４Ｍ炭酸アンモニウム、ｐＨ８．０）に溶解し、５μｌの４５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を加えた。１５分、５０℃で加熱後、溶液を冷却し、５μｌの１００ｍＭヨード酢酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を加えた。１５分後、溶液は２Ｍ尿素の濃度になるように希釈し、１：２５（ｗｔ／ｗｔ）の酵素：基質比を用いて２２時間、３７℃でトリプシン加水分解（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）させた。トリプシン分解ペプチドはＶｙｄａｃ２．１ｍｍｘ１５０ｍｍＣ１８カラムを用い、１０４０ダイオードアレイ検出器を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ１０９０ＨＰＬＣによるナロウボア逆相ＨＰＬＣにより分離した。流速は１５０μｌ／分であり、０分に５％Ｂ、６３分に３３％Ｂ、９５分に６０％Ｂ、１０５分に８０％Ｂのグラディエントを用いた。このグラディエントでは、緩衝液Ａは０．０６％トリフルオロ酢酸水溶液、緩衝液Ｂは０．０５５％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルであった。クロマトグラフィーのデータは２１０ｎｍと２７７ｎｍ（および２０９ｎｍから３２１ｎｍのＵＶスペクトル）でそれぞれのピークを得た。Ｎ末端配列分析のための試料はポリブレン前処理したグラスファイバーフィルターを通し、自動エドマン分解（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｉｃｒｓｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）ＡＢＩ型４７７Ａ気相タンパク質シークエンサー（プログラムＮＯＲＭＡＬ１）にかけた。生じるフェニルヒダントイン化アミノ酸分画はオンラインＡＢＩモデル１２０Ａ ＨＰＬＣとＳｈｉｍａｚｕ ＣＲ４Ａ インテグレーターを用いて手動で同定した。
【００５３】
精製ＰＥＤＦのトリプシン加水分解と得られた断片のアミノ酸分析により
【００５４】
【数１】
【００５５】
を含む非重複ペプチド配列が得られた。
【００５６】
（実施例２）
この実施例は実施例１のペプチド配列に基づいたオリゴヌクレオチドの構築、ＰＥＤＦ
ｃＤＮＡの単離におけるオリゴヌクレオチドの使用、およびＰＥＤＦｃＤＮＡの配列決定について記載している。
【００５７】
実施例１のＪＴ−３とＪＴ−８ペプチド配列およびコドン利用データに基づき、オリゴヌクレオチド、ｏＦＳ５６６５（配列ＩＤ番号：４）：５’−ＡＧＹＡＡＹＴＴＹＴＡＹＧＡＹＣＴＳＴＡ−３’およびｏＦＳ５６６７（配列ＩＤ番号：５）：５’−ＣＴＹＴＣＹＴＣＲＴＣＳＡＧＲＴＡＲＡＡ−３’はＡＢＩ ３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機により構築し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして用いた。
【００５８】
ヒト胎児目Ｃｈａｒｏｎ ＢＳ ｃＤＮＡライブラリー（Ｋｅｌｌｏｇ Ｅｙｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ の Ｄｒ．Ａ．Ｓｗａｒｏｏｐ から提供された）は一度増幅（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９））し、Ｔｅｃｈｎｅ熱サイクラーおよび標準試薬（ＧｅｎｅＡＭＰ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用いた（ただし、３ｍＭでＭｇＳＯ４を使用した）ＰＣＲ（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｒｅｅｉｎｇ ｏｆ λｇｔｌｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｉｎ：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）、ｐｐ．２５３−２６０）でスクリーニングした。約３５０ｂｐのＰＣＲ増幅断片はＮＡ−４５ ＤＥＡＥ−セルロース紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｅｕｌｌ）を用いて３％ＮｕＳｉｅｖｅ３：１ゲル（ＦＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）上に分離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上記文献）。断片はランダムプライミング（ランダムプライミングキット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）によりα３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）で標識し、ヒト胎児目ライブラリーの２００、０００プラーク形成単位（ＰＦＵ）をスクリーンするのに用いた。
【００５９】
８つの陽性なクローンが単離され（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上記文献）、陽性クローンのＤＮＡはＱｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ 製造プロトコール（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）に従って精製された。この陽性クローンの挿入物はＮｏｔＩ（ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で切り出し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で環化し、大腸菌Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｓｕｒｅコンピーテント細胞（Ｓｔａｒｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に形質転換させ、アンピシリンおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクドシド（Ｘ−ｇａｌ）を含んだルリアブロス（ＬＢ）プレートに蒔いた。
【００６０】
白いコロニーが選択され（そのようなコロニーは挿入物を持っていなければならないことに基づいて）、単一コロニー培養からのプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ プラスミド
ミニプレップ プロトコールに従って分離した。精製プラスミドは ＥｃｏＲＩ と ＨｉｎｄＩＩＩ（ＢＲＬ）で消化した。これらの制限部位は挿入物の５’と３’末端にリンカーを連結反応させてライブラリー構築している間に加えられたもので、従ってＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化により単離されたプラスミドに存在する挿入物が切り出される。これらのフラグメントは挿入物の大きさを決定するため０．７％アガロースゲルで電気泳動した。最大の挿入物を持つプラスミド（即ち、πＦＳ１７）が地図作製のため、およびクローンの同一性を確認するため、続いてＳｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０ シークエンシング キット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を用いての配列決定のために選択された。配列分析はＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウェアーパッケージ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）およびＧｅｎＢａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｉｎｔｅｌｌｉｎｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を利用して行った。
【００６１】
πＦＳ１７の配列分析は、配列ＩＤ番号：２の４１８個のアミノ酸をコードする長い読み枠（ＯＲＦ）を持つ配列ＩＤ番号：１、典型的なＡＴＧ開始コドンおよびポリアデニル化信号（配列ＩＤ番号：１には示されていない）からなる塩基配列を明らかにした。クローンのコード配列は前にＰＥＤＦペプチドとして決定された配列と全て正確に同一であった。演繹されるアミノ酸配列はシグナルペプチドとして働く事のできる親水性アミノ酸の広がりを含んでいる。コード配列とペプチド配列をＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａ Ｂａｎｋで比較するとＰＥＤＦはセルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）遺伝子ファミリー（ヒト［α］−１−アンチトリプシンを含んでいる）と有意な相同性を持つ独特のタンパク質である。この遺伝子ファミリーのある群は神経栄養性活性を示すけれど（Ｍｏｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、５８、３５９−３６４；Ｍｏｎａｒｄ（１９８８）ＴＩＮＳ、１１、５４１−５４４）、ＰＥＤＦはセルピンの反応性ドメインの共通配列として提案されている配列を欠いている。
【００６２】
（実施例３）
この実施例は組換え体ＰＥＤＦ生産のための発現ベクターの構築について記載している。
【００６３】
発現ベクターは実施例２で述べたようにヒトＰＥＤＦの完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドπＦＳ１７を用いて構築した。ＰＥＤＦをコードしている配列はベクターｐＥＶＢＨを得るためにプラスミドｐＥＶ−ｖｒｆ２（Ｃｒｏｗｌ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、３８、３１−３８（１９８５））中に存在するバクテリオファージ ラムダ ＰＬプロモーターの制御下におかれた。このことはＰＥＤＦコード領域（即ち、配列ＩＤ番号：１のヌクレオチド２４５番から１４９０番）の部分を含むπＦＳ１７のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩでプラスミドｐＥＶ−ｖｒｆ２を消化し、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）で充填反応して両方の断片を平滑にし、生じた平滑端／適合終結断片を互いに結合させることにより達成された。得られたベクターｐＥＶ−ＢＨはシャインーダルガノ（ＳＤ）配列とＰＥＤＦコード領域との間に８つのヌクレオチドの距離を有した。構築物は配列ＩＤ番号：３に示されているような３７９個のアミノ酸のタンパク質（ｒＰＥＤＦとして知られている）がコードされるようにＭｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｌｅ−Ａｓｐ４４−−−−Ｐｒｏ４１８を特定している。ｒＰＥＤＦタンパク質のアミノ末端のアミノ酸は天然のＰＥＤＦには無く、ｐＥＶ−ＢＨの構築中に核酸が融合することで生ずるものである。
【００６４】
ｐＥＶ−ＢＨによる組換えＰＥＤＦタンパク質の生産を立証するため、このプラスミドを、熱感受性λｃＩＡｔ２リプレッサー（Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８、４８２−４９２）の遺伝子を含む低コピー数適合プラスミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓを有する大腸菌ＲＲＩ株（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）で繁殖させた。タンパク質誘導はＢｅｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０、１１７０７−１１７１９、に記載されているように実施されたが、以下のような変更を行った。ｐＥＶ−ＢＨを含んでいる細菌細胞は３２℃、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含んだＬＢ培地で早期対数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．２）まで増殖させた。培養の温度は６５℃の温浴中でフラスコをインキュベートさせる事で急激に４２℃に上げ、細菌は続いて３４０ｒｐｍエアーフローインキュベーター中で２−３時間、４２℃で増殖させた。一部を取り６００ｎｍで吸収度を読みとった。
【００６５】
タンパク質誘導に続いて合成された初期タンパク質は放射性標識された。培養液が４２℃に達したら、１５０μＣｉのＬ−［３５Ｓ］メチオニン（１０４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を培養液ｍｌ当たりに加え、インキュベートを４２℃で１０分間および３０分間続けた。細胞は遠心分離により回収し、ＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄した。総細菌抽出物からの３５Ｓ−標識されたペプチドを再溶解し、ＳＤＳ−１２％ ＰＡＧＥ続いてフルオログラフィーにより分析した。４２，８２０Ｍｒポリペプチドに対応するバンドが１０分および３０分の後誘導で検出された。ｐＥＶ−ＢＨによって発現した組換え体タンパク質の大きさはｐＥＶ−ＢＨにサブクローンされたコード配列に期待される大きさと一致していた。同様の方法でより小さい断片（ＢＰ＝２８，０００Ｍｒ；ＢＸ＝２４，０００Ｍｒ；ＢＡ＝９，０００Ｍｒ）が合成でき、精製できる。ＢＰペプチドはＰＥＤＦアミノ酸の４４番目から２６９番目を含み、ＢＸペプチドはＰＥＦアミノ酸の４４番目から２２７番目を含み、ＢＡペプチドはＰＥＤＦアミノ酸の４４番目から１２１番目を含んでいる。
【００６６】
（実施例４）
この実施例は完全長ＰＥＤＦ ｃＤＮＡを含んだ発現ベクターの構築について記載している。
【００６７】
ｐＥＶ−ＢＶの構築について実施例３に記載された方法と類似の方法で、プラスミドπＦＳ１７のＰＥＤＦ ＯＲＦがプラスミドｐＲＣ２３とｐＥＶ−ｖｒｆ１（Ｃｒｏｗｌ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ、３８、３１−３８（１９８５））中に存在するバクテリオファージラムダＰＬプロモーターの制御下におかれた。このことはＰＥＤＦ ｃＤＮＡ（即ち、配列ＩＤ番号：１のヌクレオチド１０７から１４９０）の部分を含むπＦＳ１７のＳｆａＮＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩでプラスミドを消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）によるＳｆａＮＩとＥｃｏＲＩ末端の充填反応で平滑端化し、生じた平滑末端化／適合末端化断片をお互いに結合させることにより行った。得られたベクターｐＲＣ−ＳＨおよびｐＥＶ−ＳＨは、ＳＤ配列およびＰＥＤＦコード領域の間に各々１４と８個のヌクレオチドの距離を置いていた。構築物ｐＲＣ−ＳＨは完全長ＰＥＤＦ ＯＲＦ、配列ＩＤ番号：２に示したように天然に存在するアミノ末端を持つ４１８のアミノ酸のＰＥＤＦタンパク質を特定している。構築物ｐＥＶ−ＳＨは、完全長のＰＥＤＦＯＲＦを含み、配列ＩＤ番号：２のＰＥＤＦ配列の前にＭｅｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列ＩＤ番号：８）を持つ４２５個のアミノ酸のＰＥＤＦアミノ末端融合タンパク質を特定する。これらのつけ加えたアミノ末端のアミノ酸は天然のＰＥＤＦでは生ぜず、これらの付加アミノ酸を特定するｐＥＶ−ＳＨのコドンはｐＥＶ−ＳＨの構築中に核酸の融合によって生じる。
【００６８】
２つのベクターによって特定される組換え体タンパク質の生産を確認するため、ベクターを大腸菌株ＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ）に導入し、例３に示した方法と類似の方法で誘導し、その間の３５Ｓ−メチオニンによる代謝標識により、タンパク質誘導が実施され、モニターされた。誘導されたｐＲＣ−ＳＨおよびｐＥＶ−ＳＨによって特定されたタンパク質の発現は、細菌細胞の増殖に負の効果を持っていた。親のプラスミドを含んだ細菌培養と比較すると、ｐＲＣ−ＳＨおよびｐＥＶ−ＳＨを含んだ細菌培養はより遅く増殖し、分割した。この細菌の増殖に対する負の効果は、開始コドンとＳＤの間の距離に関連があり、そのことはそのような距離を短くする事でより効率の良い組換え体タンパク質の翻訳につながることを示唆する。ＰＥＤＦの４６，０００Ｍｒの候補ポリペプチドは、ｐＲＣ−ＳＨとｐＥＶ−ＳＨを含む細菌培養中の培養液や細胞溶解物には検出されなかった。しかしながら、３５，０００Ｍｒタンパク質はｐＲＣ−ＳＨとｐＥＶ−ＳＨを含む培養物の抽出物に見られたが、親プラスミドを含んだ培養物の抽出物には見られなかった。この事はＰＥＤＦのアミノ終末末端はプロテアーゼ感受性であり、組換え体完全長ＰＥＤＦはこの特定の宿主中で代謝されるという事を示唆している。もしくは、期待された大きさの組換え体ＰＥＤＦタンパク質が観察されなかった事は実験上の人為的結果によるものを反映していると思われ、代わりの発現ベクター、宿主、誘導可能プロモーター、サブクローニング部位、組換え体タンパク質の単離または検出の方法あるいはタンパク質誘導の手段を用いることで克服できるであろう。
【００６９】
（実施例５）
この実施例は組換えにより生成されるＰＥＤＦを大量に生成する方法について記載している。
【００７０】
ｒＰＥＤＦを含んでいる総重量が１ｇの大腸菌を５０ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０％ シュークロース、１ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁した。細菌は氷の上に１０分間放置し、４０００ｘｇで遠心分離して沈降させ、５０ｍｌの氷冷した水に１０分間懸濁させた。溶解した外側の細胞壁は８０００ｘｇで遠心分離してスフェロプラストから分離した。
【００７１】
ペレット状のスフェロプラストは５ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌペプスタチンおよび２０μｇ／ｍｌのアプロチニンを含む１０ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再懸濁させた。懸濁液は細胞膜を破壊するためソニケーター（Ｕｌｔｒａｓｏｉｃｓ、Ｉｎｃ．、モデルＷ−２２５）でプローブ音波処理を行った。３０秒の間を置きながら３０秒パルスで三回破壊し、この処理中、試料は氷水中に浸して行った。ＲＮａｓｅ ＴＩ（１３００ユニット、ＢＲＬ）およびＤＮａｓｅ Ｉ（５００μｇ，ＢＲＬ）を音波処理された細胞懸濁液に加え、懸濁液は１０分間室温でインキュベートした。この懸濁液は５ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、２０μｇ／ｍｌアプロチニンを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）４０ｍｌを加えて希釈し、粗封入体は１３，０００ｇ、３０分間遠心分離で沈降させた。封入体を構成している粒子性物質は２５％シュークロース、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ トリトンＸ−１００を含んでいる４０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートし、２４，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。洗浄工程は３回繰り返した。最終的に、封入体は５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、５Ｍグアニジン−Ｃｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる変性緩衝液１０ｍｌに再懸濁させた。懸濁液は氷水中で５秒間、手短にプローブ音波処理した。得られた懸濁液は氷上でさらに１時間インキュベートした。１２，０００ｘｇ、３０分間遠心分離後、上清を５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ ８．０、２０％ グリセロール、１ｍＭ ＤＤＴ、１μｇ／ｍｌのペプスタチンおよび２０μｇ／ｍｌのアプロチニンを含む復元緩衝液１００ｍｌに加え、タンパク質を復元するため４℃で一晩中静かにかき混ぜた。可溶および不溶分画は１３，５００ｘｇで３０分間の遠心分離により分離された。
【００７２】
可溶性分画はそれらをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０微量濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ Ｄｉｖ．、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．、Ｂｅｒｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて１ｍｌに濃縮する事でさらに精製し、それは緩衝液Ａ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ、２０％ グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、１ｍＭベンズアミジン）に対して４℃で３時間透析をした。透析抽出物はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（モデル５４１５Ｃ）で１４，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上清分画は緩衝液Ａで予め平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ−ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｎｅｗ Ｍａｒｋｅｔ、ＮＪ）カラム（１ｍｌベッド容量）に層積した。カラムは２倍のカラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。最終的に、組換え体ｒＰＥＤＦは緩衝液Ａに５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００ｍＭのＮａＣｌを加えて段階的濃度勾配で溶出させた。１ｍｌの分画を重力流出によって回収され、緩衝液Ａに対して透析した。組換え体ｒＰＥＤＦを含む分画３００は−２０℃で保存した。分画３００の回収率は細胞パック１ｇ当たり５０μｇで、それは総タンパク質の２５％に値する。
【００７３】
ｒＰＥＤＦの殆どは６Ｍグアニジウム−Ｃｌを含む１０ｍｌの緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）に分画を溶解することにより不溶性分画から回収された。溶液は１０，０００ｘｇで５分間、遠心分離した。その上清は４Ｍ グアニジウム−Ｃｌを含む緩衝液Ｂで予め平衡化した２つのＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｎｅｗ Ｍａｒｋｅｔ、ＮＪ）カラム（各々２．６ｃｍｘ９５ｃｍ）を縦列につないだ物の上に層積した。流速は３ｍｌ／分であった。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムから得られた組換え体ｒＰＥＤＦを含んでいる分画はプールし、緩衝液Ｃ（４Ｍ尿素、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１ｍＭベンズアミジン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、４ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して透析した。透析分画は０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｒ−ＧＶ、Ｍｉｌｌｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を通過させた。濾液は緩衝液Ｃで予め平衡化したｍｏｎｏ−Ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｎｅｗ Ｍａｒｋｅｔ、ＮＪ）カラム（１ｃｍｘ１０ｃｍ、ｄｘｈ）に層積した。カラムは緩衝液Ｃで洗浄し、組換え体ｒＰＥＤＦは０．５ｍｌ／分で緩衝液Ｃ中の０ｍＭ−５００ｍＭ ＮａＣｌ濃度勾配で溶出させた。２ｍｌずつの分画を回収し、組換え体ｒＰＥＤＦのピーク分画をプールした。プールした分画中の回収率は細胞パック１ｇ当たり０．５ｍｇの組換え体ｒＰＥＤＦであった。
【００７４】
（実施例６）
この実施例は精製組換え体ＰＥＤＦの分化因子としての使用について記載している。
【００７５】
Ｙ７９細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ１８）は１５％ウシ胎児血清と抗生物質（１００００ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）を補給したアール塩を含むイーグル最少必須培地（ＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーターで増殖させた。細胞はＡＴＣＣから受容後、２回継代して繁殖させ、１０％ＤＭＳＯを含む同じ培養液で凍結させた。凍結物の一部を各々の分化の実験に用いた。全ての実験は二回反復で行った。
【００７６】
融解後、細胞は継代することなく適当な細胞数になるまで血清含有培地に維持された。細胞は遠心分離で回収し２倍量のＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁して、計数した。その時点で、２．５ｘ１０５の細胞を２ｍｌの無血清培地（ＭＥＭ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｘ非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１％ ＩＴＳ混合物（５μｇ／ｍｌインシュリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレン、Ｃｏｌｉａｂｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）および上記の抗生物質が補給されている）を含む６ウェルプレート（Ｎａｎｃ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の各々のウェルに播種した。
【００７７】
分化エフェクターと対照緩衝液は播種後１２−１６時間後に加え、培養液はインキュベートし７日間静置した。８日目に、細胞はポリＤ−リシン被覆６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移し、細胞が基質に付着したころ古い培養液を２ｍｌの新鮮な無血清培地と入れ替えた。培養液はこの状態に１１日間保った。付着後、培養物は毎日Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＫ２位相差顕微鏡を用いて分化の形態学的証拠を調べ、ならびに神経芽成長を定量した。
【００７８】
非処理の細胞と比較すると、組換え体ｒＰＥＤＦに暴露されたＹ７９培養細胞のみが神経的分化の有意な証拠を示した。いくらかの神経芽成長（５％以下）はｒＰＥＤＦの溶解に用いたものと同一の緩衝液で処理した対照培養で検出されたが、ｒＰＥＤＦまたは緩衝液を加えずに同じ方法で処理した培養では分化の証拠は観察されなかった（図２２Ａ、”対照”）。ｒＰＥＤＦ処理培養細胞の位相差顕微鏡は、細胞凝集体の５０−６５％はポリ−Ｄ−リシンへの付着３日目後に神経芽伸長が観察されたことを示した（図２２Ｂ、”ＰＥＤＦ”）。これらの３日目の神経芽伸長は、細胞凝集端で西洋なし型の細胞からの短い突起として現れた。分化している凝集体の数、凝集体あたりの分化している細胞の数、および神経芽様過程は付着時間とともに増加した。付着５日後、凝集体の約７５−８５％が分化の徴候を示し、それらの周辺細胞のほとんどから神経芽が伸長していた。ｒＰＥＤＦ処理培養物は付着７日後に分化の最大に達し、８５−９０％の細胞が凝集していた。その時点で、２通りの神経性過程が観察された、即ち、３日目に観察された神経芽より２−３倍長い単一の神経芽が互いに離れた凝集体の周辺細胞から伸長しており、より長く且つより薄い突起が隣り合う細胞凝集体間で枝状のネットワークを形成していた。インキュベーションを長くすると、即ち、付着して１０日を超えると、ネットワーク連結の割合に著しい減少があり、単一の神経芽のさらなる成長は無いが、細胞凝集体の生存率には著しい影響はなく、約７５−８０％が別々の実験で残存していた。図２３で見られるように精製天然ＰＥＤＦおよび組換え体ＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）との間に違いは観察されなかった。
【００７９】
ＰＥＤＦおよびｒＰＥＤＦ ｃＤＮＡクローンは大量のＰＥＤＦとｒＰＥＤＦタンパク質生産の手段を供給するだけでなくＰＥＤＦ遺伝子の発現や制御を研究ために使用できる材料としても利用できる。更に、これらの配列は内因性ＰＥＤＦの翻訳を阻害するための翻訳停止のアンチセンス技術に用いる事が出来る。
【００８０】
組換えにより生産されたＰＥＤＦおよびｒＰＥＤＦタンパク質および等価なタンパク質はインビトロおよびインビボにおいて強力な神経栄養性作用物として利用できる。神経栄養性作用物としてのこれらのタンパク質のさらなる生化学的活性は標準インビトロ試験で決定でき、網膜の炎症性、血管性、消耗性、異栄養性疾病の処置におけるこれらのタンパク質の別の治療的使用の開発を可能にする。これらのタンパク質が強力な神経栄養性作用物と仮定すると、これらのタンパク質を、神経栄養性因子に応答する網膜以外の他の組織の処置に治療的有用性がでるように改良できるであろう。これらのタンパク質は非神経性組織およびある種のがんの”分化”因子としてより一般的な有用性を見つける事も出来るであろう。
【００８１】
（実施例７）
分子量３０００の組換え体ＰＥＤＦと共に、より小さな組換え体が合成され、神経栄養性活性を持つかどうか決定された。より小さなペプチドは完全長構築物よりも、高い溶解性、よりよい膜透過性、より低い抗原性、製造の容易さなど様々な利点を与える。
【００８２】
図２３には試験されたうち３つの組換え体のみが示されている。ＢＰ、ＢＸおよびＢＡはそれぞれ２８，０００、２４，０００、９０００の分子量であり、Ｃ末端欠失変異体を表わしている。これら全部が図２１および２２に描かれているものと同様な神経栄養性活性を示す。ここにおける新規の発見は、９０００の分子量のペプチド（天然のタンパク質の全分子量のたったの約２０％）が驚くべき神経栄養性活性を示した事であった。その上、活性な神経栄養性ペプチドはセルピン活性部位を含むことが知られているＣ末端側でなくＮ末端側に配列を示した。従って、活性部位はＮ末端であり、そのような小さな分子で活性が現れる事は驚くべき発見であり、このような事は従来の発見からは予期できない事である。
【００８３】
【表１】
【００８４】
表１：エクソンは大文字およびイントロン配列は小文字である。５’ドナーＧＴおよび３’アクセプターＡＧは下線が施してある。エクソンおよびイントロンサイズは各々ｂｐおよびｋｂで与えられている。
【００８５】
（実施例８）
（ヒトＰＥＤＦ遺伝子のコローニングおよび配列決定）
材料−制限酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴおよびカナマイシンはＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入された。ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭオリゴ ｄＴ（２５）はＤｙｎａｌ Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）から購入された。ＲｅｔｒｏｔｈｅｒｍＴＭ ＲＴはＥｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得られた。ＲＮＡｓｉｎＴＭはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入された。ＴａｑポリメラーゼはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入された。サブクローニングに使用するプラスミドベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入された。神経網膜および網膜色素上皮からの全ＲＮＡは文献に記載されているように（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，１９８７）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から得られたヒト組織から精製された。標識および配列決定に使用された［３２Ｐ］α−ｄＡＴＰおよび［３２Ｐ］γ−ＡＴＰ（３０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｔｓ，ＩＬ）から購入された。Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ（バクトートリプトン
１２ｇ／Ｌ、酵母抽出物 ２４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４１２．５ｇ／Ｌ、ＨＫ２ＰＯ４３．８ｇ／Ｌおよびグリセロール５ｍＬ／Ｌ）、変性溶液（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１．５Ｍ
ＮａＣｌ）、中和溶液（１Ｍトリス−Ｃｌ ｐＨ７．０、１．５Ｍ ＮａＣｌ）、２０Ｘ ＳＳＣ（３．０Ｍ ＮａＣｌ、０．３ｍＭクエン酸ナトリウム）、１０Ｘ ＴＢＥ（１Ｍトリス−ホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）および５０Ｘ ＴＡＥ（２Ｍトリス−酢酸、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０）はＱｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入された。２０Ｘ ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４）はＤｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）から購入された。アンピシリンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入され、水に溶解し、フィルター滅菌された。
【００８６】
（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））
２Ｘ ＰＣＲ混合物は１．６μモル／ｍＬのＧｅｎｅＡｍｐＴＭ ｄＮＴＰｓ（各々４００Ｍ）、２Ｘ ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ ＰＣＲ緩衝液および５０Ｕ／ｍＬのＴａｑポリメラーゼを含むように調製された。これらの試薬はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）から購入された。一般に、鋳型およびオリゴヌクレオチド（各々のオリゴの１００ｎｇ）は２５μＬの容量で混合され、２５μＬの２Ｘ混合物、続いて５０μＬの鉱油が加えられた。鋳型は、最初の変性が９５℃で２分間、３０秒のアニーリング（プライマーに依存して５５から６５℃の間）、および伸長が７２℃にて増幅された生成物に依存して１−５分であった。
【００８７】
（ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ オリゴ ｄＴ（２５）上でのｃＤＮＡ合成）
以前に記載されているように（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ａｎｄ Ｃｈａｄｅｒ １９９２）ｃＤＮＡがＤｙｎａｂｅａｄｓ上で合成された。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（０．５ｍｇ）を１００μＬの１０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＫＣｌで洗浄した。全ＲＮＡ水溶液３０μＬ（３０μｇ、約１μＬ）を３０μＬの上記緩衝液および平衡化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（０．５ｍｇ）と混合し、５５℃で２分間加熱した。ポリ＋Ａ
ＲＮＡを室温で１５分間ビーズにアニール化し、ビーズをＭＰＣ−Ｅ磁気セパレーター（Ｄｙｎａｌ Ｉｎｃ．）へ結合させることにより過剰のＲＮＡを除去した。アニール化されたポリ＋Ａ ｍＲＮＡを持つビーズは次に２．５μＬの緩衝液Ａ（２００ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ８．３、１．０Ｍ ＫＣｌ）、２．５μＬの緩衝液Ｂ（３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ ＭｎＣｌ）、２０μＬの１０ｍＭｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ）１μＬのＲＮＡｓｉｎ、２μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴ、５μＬのＲｅｔｒｏｔｈｅｒｍ ＲＴ（１単位／μＬ）および１６μＬのＨ２Ｏに懸濁し、最終容量を５０μＬとする。反応混合物は４０℃で１０分、続いて６５℃で１時間インキュベートした。ビーズを再びＭＰＣ−Ｅ磁気セパレーターへ結合させ、過剰のＲＴ反応混合物を除去した。ビーズは次に１００μＬの０．２Ｎ ＮａＯＨで１回、１０Ｘ ＳＳＰＥで１回および１Ｘ ＴＥで２回洗浄した。ｃＤＮＡ含有ビーズは最終容量で１００μＬの１Ｘ ＴＥに懸濁した。
【００８８】
（ｃＤＮＡ末端の５’急速増幅（ＲＡＣＥ））
Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入された５’−ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥキットに基づく改良法を用いて５’−ＲＡＣＥが実施された（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、１９９４）。最初に、ｃＤＮＡが上記のように（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ａｎｄ Ｃｈａｄｅｒ １９９２）ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ オリゴ ｄＴ（２５）上で合成された。ＡｍｐｌｉＦＩＮＤＥＲアンカープライマーが５’プライム末端のＰＣＲ増幅のためＰＥＤＦ特異的プライマー＃２７４４と組み合わせて使用された。増幅は上記のように行われ、２μＬのアンカー結合ヒト網膜色素上皮−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｃＤＮＡが鋳型として使用された。増幅は３０サイクル行われた。
【００８９】
（オリゴヌクレオチドの配列）
オリゴヌクレオチドプライマーはＡｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ＤＮＡ合成機モデル３９２により合成された。オリゴヌクレオチドは脱保護され、さらに精製することなく使用された。
【００９０】
（ゲノムライブラリーのスクリーニング）
ヒトゲノムコスミドライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を１５０ｍｇ／ｍＬアンピシリン、２０ｍｇ／ｍＭカナマイシンを含むＬＢプレートにプレート当たり１０，０００コロニーの密度で播種された。コロニーを拾い上げるのにニトロセルロースフィルターが使用され、フィルターはＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されているように処理されハイブリダイズされた。ライブラリーはＴ７／Ｔ３プライマーを用いてＰＥＤＦ ｃＤＮＡクローンから得られた［３２Ｐ］標識ＰＣＲ生成物（Ｓｔｅｅｌｅら、１９９３）で探査した。この結果、ｐ１０Ａコスミドが単離された。λＤＡＳＨＴＭＩＩライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が上記のＰＥＤＦ ｃＤＮＡクローンのインサートを用いてＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によりスクリーンされた。この結果、７ｋｂ ＮｏｔＩ−Ｎｏｔ断片（ＪＴ６Ａ）が単離された。全ＰＥＤＦ遺伝子および隣接する領域を含むＰ−１クローン（ｐ１４７）は、オリゴ１５９０／１５９１を用いてＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により単離された。
【００９１】
（ＰＣＲ生成物のクローニング）
ＰＥＤＦ ｃＤＮＡの内部コード領域から設計された４組のプライマー、６０３：６０４；６０５：６０６；２２３８：３５４および２２１３：２７４４が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）実験のプライマーとして使用するために上記のように合成された。プライマー配列は以下の様である：６０３：５’−ＡＣＡ ＡＧＣ ＴＧＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：１３）、６０４：５’−ＣＡＧ ＡＧＧ ＴＧＣ ＣＡＣ ＡＡＡ ＧＣＴ ＧＧ−３’（配列ＩＤ番号：１４）；６０５：５’−ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＴＧ ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＴＣ ＴＧ−３’（配列ＩＤ番号：１５）、６０６：５’−ＣＡＴ ＣＡＴ ＧＧＧ ＧＡＣ ＣＣＴ ＣＡＣ ＧＧ−３’（配列ＩＤ番号：１６），２２１３：５’−ＡＧＧ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＣＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＴ−３’（配列ＩＤ番号：１７）、２７４４：５’−ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＣＧ ＣＣＣ ＣＴ−３’（配列ＩＤ番号：１８）；２２３８：５’−ＡＴＧ ＡＴＧ ＴＣＧ ＧＡＣ ＣＣＴ ＡＡＧ ＧＣＴ ＧＴＴ−３’（配列ＩＤ番号：１９），３５４：５’−ＴＧＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＴＧＡ ＧＧＡ ＣＣＧ ＣＣ−３’（配列ＩＤ番号：２０）。プライマー６０３：６０４および６０５：６０６で生じたＰＣＲ生成物の増幅、サブクローニングおよび配列決定はヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により実施された。６０３：６０４からの生成物は約２ｋｂ（ｊｔ８Ａ）であり、エクソン３からエクソン５へ伸びている。６０５：６０６からの生成物は約３．３ｋｂ（ｊｔ ９）であり、エクソン５からエクソン６へ伸びている。プライマーの組２２１３−２７４４はＰ１クローンｐ１４７からの約２．５Ｋｂ生成物（ｊｔｌ５；ＪＴ１１５とも称される）の増幅に用いられた。この生成物はサブクローニングおよび配列決定のためＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．に送られた。２２３８：３５４プライマーはイントロンＥをまたぐエクソン６からエクソン７の増幅に使用された。この生成物はサブクローン化されなかったが、我々により直接および完全に配列決定された。
【００９２】
（ＤＮＡ配列決定）
Ｐ−１クローン（ｐｌ４７）、このクローンのサブクローンおよびこのクローンのＰＣＲ生成物が配列決定された。ほとんどの配列決定は標準配列決定技術を用いてＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により実施された。すべての重要な領域（例えば、イントロン−エクソン境界）およびクローン間の連結は我々の実験室で配列決定された。ＰＣＲ生成物からのＤＮＡはＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入されたＷｉｚａｒｄＴＭ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製キットを使用して配列決定のために精製された。Ｐ−１クローンおよびプラスミドサブクローンはＱｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）Ｍｉｄｉプラスミド精製キットを使用して精製された。精製ＰＣＲ生成物およびプラスミドはＰＲＩＳＭＴＭ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ａ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用い、使用説明書に従って配列決定された。典型的には、配列決定反応当たり０．５ピコモルの鋳型および３ピコモルのプライマーが使用された。配列決定反応生成物はＳｅｌｅｃｔ−Ｄ Ｇ−５０カラム（５プライム−３プライム；Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を用いて精製され、乾燥された。次に各々の試料を５μＬのホルムアミド、１μＬの５０ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し、モデル３７０Ａ
Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中で加熱し、分析した。すべてのスプライス−部位連接（ジャンクション）、イントロンＦおよびクローンを横切った連接が配列決定された。
【００９３】
（サザンブロット）
種々の種からのＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化ゲノム（８μｇ）ブロットはＢＩＯＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴから購入された。ブロットは標準技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）を使用し、ＰＥＤＦ ｃＤＮＡで探査された。
【００９４】
（ＰＥＤＦの５’ＲＡＣＥ）
５’ＲＡＣＥは上記のようにアンカーオリゴをＤｙｎａｂｅａｄｓ上で前もって合成されたヒト網膜色素上皮ｃＤＮＡへ結合させることにより実施された。５’末端はアンカープライマー（ＡｍｐｌｉＦｉｎｄｅｒのキット）およびＰＥＤＦ−特異的プライマー２７４４を用いて増幅された。増幅は３０サイクル行われた。一つの主要なバンドが約２３０ｂｐに観察された。ＰＣＲ生成物はｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローン化され、配列決定された。これらのクローンの内最も長いものはＰＥＤＦの５’末端から２０ｂｐ伸びていることが観察された。
【００９５】
（ＰＥＤＦ遺伝子の単離）
ＰＥＤＦ遺伝子はプライマー１５９０および１５９１（１５９０：５’−ＧＧＡ ＣＧＣ ＴＧＧ ＡＴＴ ＡＧＡ ＡＧＧ ＣＡＧ ＣＡＡ Ａ−３’（配列ＩＤ番号：２３）；および１５９１：５’−ＣＣＡ ＣＡＣ ＣＣＡ ＧＣＣ ＴＡＧ ＴＣＣ Ｃ−３’（配列ＩＤ番号：２４））を用い、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によりＰ−１クローン（ｐｌ４７）に単離された。このクローンが全ＰＥＤＦを含んでいるかどうかを決定するため、ｐｌ４７およびヒトゲノムＤＮＡの両方がＢａｍＨＩ、ＥｃｏＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化され、続いてパルスフィールド装
置中、アガロースゲル電気泳動により分離された。アガロースゲルはブロットされ、ＰＥＤＦ ｃＤＮＡクローン（Ｓｔｅｅｌｅら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１５２６−１５３０）で探査した。Ｐ−１クローンとゲノムＤＮＡ間のバンドパターンの比較は全ＰＥＤＦ遺伝子がこのクローンに含まれていることを示している。さらに、この結果はＰＥＤＦには一つの遺伝子のみが存在することも示している。
【００９６】
（ＰＥＤＦ遺伝子の配列）
遺伝子のスケール地図が図１に示されている。ＰＥＤＦ遺伝子はその全部が配列決定された（配列ＩＤ番号：４３）。クローンｊｔ１、ｊｔ１４、ｊｔ６Ａおよび関連するＰＣＲ生成物（ｊｔ１５、ｊｔ８Ａおよびｊｔ９）（図１）はＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により配列決定された。遺伝子の残りの部分はｐ１４７クローンを鋳型として用いて遺伝子の異なった部分を増幅することにより配列決定された。すべてのエクソン、イントロン−エクソン連接（ジャンクション）および全イントロンＦはＰ−１クローンｐ１４７より発生するＰＣＲ生成物から上記のように我々の実験室で両方の方向で配列決定された。エクソン１から下流のＮｏｔＩ部位はそれをまたいで増幅し、生成物を配列決定することにより確認された。遺伝子は約１６Ｋｂにわたり、８つのエクソンを持っている。すべてのイントロン−エクソン連接はＡＧ／ＧＴ規則に従っている。イントロン−エクソン連接および隣接する配列は表１に示されている。
【００９７】
ｊｔ１：ヒトゲノムコスミドライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から単離された７．１ｋｂコスミドクローンで、ＰＥＤＦ遺伝子のエクソン７、エクソン８および３’隣接領域を含んでいる。このクローンの５’末端は（約２．１ｋｂの領域）ＰＥＤＦの部分ではない。これは明らかにコスミドの転位（リアレンジメント）により起きたものである。このクローンは全部Ｌａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により配列決定された。
【００９８】
ｊｔ６Ａ：λＤＡＳＨＩＩヒトゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により単離された７．２ｋｂＮｏｔＩ断片である。このクローンはＰＥＤＦ遺伝子の＞６ｋｂの５’隣接領域、エクソン１およびイントロンＡの４２４ｂｐを含んでいる。このクローンは全部Ｌａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により配列決定された。
【００９９】
ｊｔ８Ａ：このクローン化ＰＣＲ生成物ＪＴ８Ａはプライマー６０３：６０４を用いてゲノムＤＮＡから発生させた。このクローンはエクソン４およびイントロンＣおよびＤを含みエクソン３からエクソン５まで伸びている。全部Ｌａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により増幅、クローン化および配列決定された。
【０１００】
ｊｔ９：このクローン化ＰＣＲ生成物ＪＴ８Ａはプライマー６０５：６０６を用いてゲノムＤＮＡから得られた。このクローンは全イントロンＥおよびエクソン５およびエクソン６の一部を含んでいる。全部Ｌａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．により増幅、クローン化および配列決定された。
【０１０１】
ｊｔ１５：このクローンはｐ１４７からのプライマー対２２１３：２７４４を用いて増幅されたＰＣＲ生成物から得られた。このクローンはイントロンＢをまたいでエクソン２からエクソン３まで伸びている。ＰＣＲ生成物はサブクローニングおよび配列決定のためにＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．に送られた。
【０１０２】
Ｐ１クローンｐ１４７：このクローンはオリゴヌクレオチド１５９０：１５９１を用いてＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．により単離された。このクローンはイントロンＦの配列（２２３８：３５４）およびサブクローンｊｔ１４を得るために使用された。また、上記のクローンから最初に得られたイントロンーエクソン境界を確認するためにも使用された。イントロン特異的オリゴを用いてすべてのエクソンおよびイントロン境界が増幅され（鋳型としてｐ１４７を用いて）、生成物が配列決定された。すべてのスプライス連接配列ならびにイントロンおよびエクソンの大きさが確認された。
【０１０３】
ｊｔ１４：これはイントロンＡのほとんど、エクソン２およびイントロンＢの一部を含むｐ１４７のサブクローンである。このクローンは我々によって単離され配列決定のためにＬａｒｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．に送られた。
【０１０４】
従って、上記のクローンおよびＰＣＲ生成物のすべての配列分析によりヒトＰＥＤＦ遺伝子の構造およびエクソンおよびイントロンの大きさが決定された。すべての連接の５’スプライスドナーおよび３’スプライスアクセプター部位はＧＴ／ＡＧコンセンサスに従っている。
【０１０５】
（実施例９）
（ＰＥＤＦプロモーターの分析）
ＰＥＤＦを制御しているであろう可能な転写要素についてのいくらかの理解、ＰＥＤＦ発現についてのさらなる実験のための手引きを得るためにＰＥＤＦ５’隣接領域（図３）の理論的分析を実施した。ＰＥＤＦ遺伝子の５’隣接領域には古典的ＴＡＴＡＡＡ信号またはＴＡＴＡ−ボックスが欠けている。しかしながら、重要な転写因子により認識されるいくつかの興味ある特色および要素が含まれている。−１６４から−５９１および−８２２から−１０５０に２つのＡｌｕ反復要素が存在する。Ａｌｕ領域の外側に、共通のＡＴＧＣＡＡＡＴ（Ｐａｒｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：２６５０−２６５４；Ｆａｌｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：７１−７４；Ｓｔｕｒｍ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌ．２：１５８２−１５９９；Ｆａｉｓｓｔ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３−２６）から１塩基異なった転写因子の偏在するオクタマーファミリー（Ｏｃｔ）のための２つの可能な部位が−２９（ＡＴＣＣＡＡＡＴ）および−１１３（ＧＴＧＣＡＡＡＴ）に存在する。興味を引くもう一つの要素が−６２に位置している。この要素、ＧＴＡＡＡＧＴＴＡＡＣはＨＮＦ−１（肝細胞核因子）に結合している共通ＧＴＡＡＴＮＡＴＴＡＡＣに似ている（Ｆｒａｉｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ ５９：１４５−１４７）。これは多くの有力な肝臓遺伝子をトランス活性化するホームドメイン含有転写因子であるが（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９８３８−９８４２）、内胚葉性分化への関連が示唆されている（Ｂａｕｍｈｕｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４：３７１−３７９）。−２０２の配列ＴＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＡＣＣＴＧＣはＡＰ−１により認識されレチノイン酸によりトランス活性化されるであろう人工的パリンドローム配列（ＴＲＥｐ）ＴＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡ（Ｕｍｅｓｃｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：２６２−２６５；Ｌｉｎｎｅｙ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：３０９−３５０）に非常に類似している。−２２の配列ＴＧＡＧＴＧＣＡおよび−２０７のＴＧＡＴＧＣＡ（ＴＲＥｐ内）はＡＰ−１共通配列ＴＧＡＣＴＣＡ（Ｓｃｈｕｌｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ ６１：４９７−５０４）に類似している。ＴＲＥｐ内に含まれる−２０４の配列ＡＧＧＴＧＡＴＧＣＡＣＣＴもまたその共通配列がＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴである発生的に制御されたＲＡＰ（レチノイン酸受容体）モチーフ（Ｆａｉｓｓｔ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３−２６）に類似している。ＰＥＡ３要素（ポリオーマウイルスエンハンサー活性化因子３）ＡＧＧＡＡＧ／Ａ（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８３９−５８４３；Ｆａｉｓｓｔ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３−２６）が縦列に−１２２および−１２９続いて再び−１４１に存在している。ＰＥＡ３は転写因子ＥＴＳファミリーのメンバーであり（Ｍａｃｌｅｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＴＩＢＳ １７：２５１−２５６）、その活性は非核癌遺伝子により制御されているようである（Ｗａｓｙｌｙｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：３３７１−３３７８）。最も興味深い要素の１つは−６５４に配列ＧＴＧＧＴＴＡＴＧと共に位置する。この要素は転写因子のＣ／ＥＢＰ（ＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質）ファミリーにより認識される共通配列ＧＴＧＧＴ／ＡＴ／ＡＴ／ＡＧ内にある（Ｆａｉｓｓｔ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３−２６）。この因子は成人表現型へ導く最終分化に関与するようである（Ｖｅｌｌａｎｏｗｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ７０：７８４−７９９）。３つの可能なＣＡＣＣＣボックスが存在し、１つは−８４５に、および２つは逆の配向で−８２６および−９０５に存在する。これらはすべてＡｌｕ反復内にある。可能なＳｐｌ部位（ＣＣＣＧＧＣ）がＡｌｕ反復前の−１５３にあり、共通Ｓｐｌ部位ＧＧＣＧＧＧがＡｌｕ反復の内側−１０３０に存在する。
【０１０６】
（実施例１０）
（培養細胞におけるＰＥＤＦ ｍＲＮＡの発現）
（遺伝子発現分析）
レーン当たり２μｇのポリ−（Ａ）ＲＮＡを用い多ヒト組織ｍＲＮＡノーザンブロット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）が放射活性化標識６６７ｂｐＰＣＲ増幅生成物（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９：２６６−２７２）でハイブリダイズされた。ブロットはＱｕｉｃｋＨｙｂ急速ハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中、６８℃で１５分前もってハイブリダイズし、５ｘ１０６ｃｐｍ ＤＮＡ／ｍｌを含む同一の溶液中、６８℃で１時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズされたブロットは２回１００ｍｌの２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて室温で１５分間、さらに１回２００ｍｌの０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて６８℃で３０分間洗浄した。ブロットはＫｏｄａｘ ＸＡＲ−５フィルムおよびＤｕｐｏｎｔ補力スクリーンを用いて、−７０℃で２時間オートラジオグラフィーを行った。
【０１０７】
（遺伝子発現）
ＰＥＤＦメッセンジャーＲＮＡの発現が培養ヒト胎児ＲＰＥ細胞以外のヒト組織で起こっているかどうかを決定するために、試験された各々の組織に対し等量のポリ−（Ａ）ＲＮＡ含んでいる多組織ヒト成人および胎児ＲＮＡブロットを分析した。結果は表４に示されている。ＰＥＤＦプローブは分析された１６の成人組織の１４で種々の強度のハイブリダイゼーションの単一の１．５ｋｂ転写体を同定した。成人腎臓または末梢血白血球では信号が検出されなかった。成人脳、膵臓、脾臓および胸腺で弱い信号が観察できた。ＰＥＤＦメッセンジャーＲＮＡに対する多量のハイブリダイゼーションがヒト成人肝臓、骨格筋、精巣および卵巣で観察された。驚くべきことに、全脳ＲＮＡでは非常に弱い信号しか観察されなかった。試験された胎児組織では、非常に強いＰＥＤＦ信号が肝臓組織で観察され、興味深いことには成人腎臓試料ではＰＥＤＦハイブリダイゼーションがなかったのに比較して胎児腎臓では有意に強度で信号が観察された。
【０１０８】
成人組織で単一の１．５ｋｂ転写体が観察されたのと対照的に、胎児心臓、肺および腎臓で５００ｂｐ未満の追加の副転写体が低強度で種々に標識された。これは、ｍＲＮＡの部分的分解、または選択的スプライスのためと思われる。ＰＥＤＦはまた早期継代のサルＲＰＥ細胞でのみ発現され（１−５の継代数）、後期継代細胞（１０継代）では発現されなかった。これらの結果は老化へのＰＥＤＦの関連を示している。
【０１０９】
（実施例１１）
（種々の系統発生的関連種におけるＰＥＤＦの比較分析）
（進化的保存分析）
多数の哺乳類および霊長類種を含む種々の種のリンパ球からのゲノムＤＮＡ（ＢＩＯＳ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）の８μｇをＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲルで分離した。ゲルはトランスブロットされ、消化されたＤＮＡを含む膜はノーザン分析と同一の方法および条件を用いてハイブリダイズした。
【０１１０】
進化的保存：
若干の系統発生的に関連する種間のＰＥＤＦの進化的保存が試験された。結果は図５に示されている。これらの高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いると、鳥類、哺乳類および霊長類で約２３ｋｂの大きなＥｃｏＲＩ制限断片が観察された。おそらく使用されたヒトＰＥＤＦプローブとの低い相同性のためであろうが、より下等な種ではハイブリダイゼーションは観察されなかった（図５Ａ）。ニワトリおよびマウスのＥｃｏＲＩ断片はヒトのものより幾分小さい。試験されたいくつかの哺乳類種において興味ある制限パターンが現れた（図５Ｂ）。６ｋｂから２ｋｂの間の大きさの範囲にいくつかのより小さな制限断片が観察された。試験されたすべての霊長類種で９ｋｂから２３ｋｂの間の大きさの範囲により大きな断片が観察され、それは約９ｋｂに追加の強くハイブリダイズする多形断片を持っている。
【０１１１】
（実施例１２）
（培養における小脳顆粒細胞に対する色素上皮誘導因子の神経細胞栄養性効果細胞培養）
小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）はＮｏｖｅｌｌｉら（１９８８，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，４５１：２０５−２１２）により記載されているように生後５または８日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット子供から調製された。簡単に記すと、髄膜を含まない組織を１２４ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、３ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２７μＭフェノールレッドおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含む緩衝液中で切り刻み、５５０ｘｇで３分遠心分離した。１０−２０匹の動物からの組織ペレットを再懸濁し、２５０μｇ／ｍｌトリプシンを含む同一の緩衝液３０ｍｌ中でトリプシン分解し（１５分、３７℃）；２６μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ、１６６μｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤および０．５ｍＭの追加のＭｇＳＯ４を含む緩衝液をさらに１５ｍｌ加えて上記のように組織を再び遠心分離した。ペレットを８０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ、０．５２ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤および１．６ｍＭの追加のＭｇＳＯ４を補給した１ｍｌの緩衝液に再懸濁し、パスツールピペットで６０回砕いた。０．１ｍＭのＣａＣｌ２および１．３ｍＭの追加のＭｇＳＯ４を含む緩衝液２ｍｌで懸濁液を希釈し、非分散物は５分間放置して沈澱させた。上清を別のチューブに移し、細胞は軽く遠心分離し、血清含有培地（２５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭグルタミン、１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン、および１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含むイーグル基本培地）または化学的に決められた培地（５μｇ／ｍｌインシュリン、３０ｎＭセレン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、１０００ｎＭプトレシン、２０ｎＭプロジェステロン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１））（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ，１９８５ ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊ．Ｅ．Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｇ．Ｓａｔｏ，ｅｄｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．ｐ．３−４３）に再懸濁して回収した。細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆９６ウェルプレート（ＭＴＳアッセイおよび神経フィラメントＥＬＩＳＡアッセイのため）または８ウェルチャンバースライド（免疫細胞化学およびＢｒｄＵ標識のため）に２．５ｘ１０５細胞／ｍｌで加え、５％ＣＯ２を含む空気からなる雰囲気下、３７℃で増殖させた。培養１日後、血清補給培地中の細胞にのみシトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）を加えた（最終濃度５０μＭ）。
【０１１２】
（ＭＴＳアッセイ）
９６ウェルプレート中の小脳顆粒細胞をＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩）およびＰＭＳ（フェナジンメトスルフェート）（最終濃度；３３３μｇ／ｍｌ ＭＴＳおよび２５μＭ ＰＭＳ）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）と４時間ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。ＰＭＳ存在下、ＭＴＳは代謝的に活性な細胞に観察されるデヒドロゲナーゼ酵素により水可溶性ホルマザンに変換される（Ｃｏｒｙｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍ，３：２０７−２１２）。ホルマザン生成物の量は分光学的に４９０ｎｍで決定した。
【０１１３】
（免疫細胞化学）
インビトロでの日数（ＤＩＶ）で７日後、細胞をカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで１０分間、続いて−２０℃にて９５％エタノール／５％酢酸で１０分間固定した。ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）に対する一次抗体、ＧＡＢＡ、カルビンジン、またはグリア原線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）とのインキュベーションを室温で６０分実施した。２％正常ヤギ血清および０．２％ＢＳＡ存在下、抗体を１：１０００−１：５０００で加えた。抗体はＡＢＣシステム（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびジアミノベンジジンを用いて可視化した。各々の実験で２−３のウェルから少なくとも２０視野を計数した。対照培養中のＮＳＥ陽性細胞と比較した他の抗体により染色された細胞の数の比を決定するために視野当たりの細胞の平均数を計算した。
【０１１４】
（ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識）
ＢｒｄＵ標識は以下の変更を行ったＧａｏら（１９９１ Ｎｅｕｒｏｎ，６：７０５−７１５）の方法により実施された。細胞は８ウェルチャンバースライドに入れ直ちにｒＰＥＤＦを加えた。２４時間後、ＢｒｄＵ（１：１００；Ａｍｅｒｓｈａｍ細胞増殖キット）を培養培地に２４時間加え、その後細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し（１０分）、９５％エタノール／５％酢酸で処理し（１０分）、抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体とインキュベートした（１：２０、２時間）。培養物は次に西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗マウス第二抗体と６０分インキュベートした。ジアミノベンジジンーペルオキシダーゼ後、細胞はＧｅｌ Ｍｏｕｎｔにマウントされた。顕微鏡で標識された細胞のパーセント数を計数することにより、分裂指数が決定された。各々の値に対し、３０００細胞の無作為試料が計数された。
【０１１５】
（神経フィラメントＥＬＩＳＡアッセイ）
わずかな変更を加えたＤｏｈｅｒｔｙら（１９８４ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，４２：１１１６−１１２２）の方法に従って神経フィラメントＥＬＩＳＡが実施された。９６ウェルマイクロタイタープレートで増殖させた培養物は４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳにより、４℃で２時間固定した。固定された細胞は１５分０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで処理して透過性を上げ、続いて非特異的結合を防ぐために６０分１０％ヤギ血清を含むＰＢＳとインキュベーションを行った。培養物は次にモノクローナル抗−神経フィラメント抗体と４℃にて一夜インキュベートした（ＲＭＯ １：１００で；小脳顆粒細胞の培養において神経芽のみを染色する）。１０％ヤギ血清を含むＰＢＳで２回洗浄後、細胞を第二抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗マウス １：１０００で）と１時間インキュベートした。ＰＢＳおよび水で連続的に洗浄した後、培養物は０．２％Ｏ−フェニレンジアミンおよび０．０２％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）と３０分インキュベートした。等量の４．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することにより反応を停止させた。マイクロタイターリーダーを用い、４９０ｎｍで反応生成物の一部の光学密度（Ｏ．Ｄ．）を読みとることにより生成物形成を定量した。
【０１１６】
ＭＴＳアッセイが生きている細胞数の指標になることを確認するため、およびアッセイの結果が直線性を与える細胞数の範囲を決定するために、図６に示した実験を実施した。血清含有培地（ＳＣＭ）においては（図６Ａ）、１−９ｘ１０５細胞／ｃｍ２の範囲に渡って光学密度（Ｏ．Ｄ．）と加えた細胞数が比例した。対照的に、化学的に決められた培地（ＣＤＭ）（図６Ｂ）では、直線範囲は１−５ｘ１０５細胞／ｃｍ２の範囲をカバーするにとどまった。引き続く全ての実験は、どちらの型の培養培地においても直線範囲の中間である２．５ｘ１０５細胞／ｃｍ２で細胞を加えて行った。
【０１１７】
図７は、ＰＥＤＦはＤＩＶ４で細胞数の有意な増加を起こし、ＤＩＶ７および１０では大きな相違を与えることを示す。しかしながら、この２−３倍の増加は対照培養における細胞数の顕著な減少の結果である。化学的に決められた培地における用量応答曲線は（図８）、２０ｎｇ／ｍｌで統計的に有意な効果があることを示している。５０ｎｇ／ｍｌ以上にＰＥＤＦ濃度を増加させてもＣＤＭ中でのさらなる増加を生み出さなかった。
【０１１８】
ＰＥＤＦに応答したＯ．Ｄ．の増加（ＭＴＳアッセイ）が生き残っている細胞の増加を反映しているのか、または増殖の増加を反映しているのかを決定するため、生後５日（Ｐ５）の動物（この時小脳顆粒細胞は動物でまだ分裂している）からの培養物を用いて、ＢｒｄＵ標識研究が実施された。図９はＤＩＶ１および２におけるＰ５ ＣＧＣ培養に対するＰＥＤＦの効果を示している。ＭＴＳアッセイを用いると、ＰＥＤＦはＤＩＶ１では効果がなかったが、血清含有培地または化学的に決められた培地ともＤＩＶ２にＯ．Ｄ．の小さな増加を起こした。従って、ＢｒｄＵを日−１に添加し、日−２に固定した。対照条件下のＢｒｄＵ標識指数はＳＣＭで５％およびＣＤＭで３％であり、ＰＥＤＦはどちらの培養培地でもＢｒｄＵ標識指数を増加させなかった（図１０）。ＰＥＤＦによりＢｒｄＵ標識指数が刺激されないことは、ＰＥＤＦ暴露後のＭＴＳアッセイにより測定されたＯ．Ｄ．の増加は細胞分裂の増加のためではなく、むしろ生き残りの助長に応答していることを示唆している。
【０１１９】
免疫細胞化学を用いてＰＥＤＦ処理前および後の培養液に存在する細胞の同定を行った。ＰＥＤＦと（５００ｎｇ／ｍｌ）またはＰＥＤＦなしで７日間増殖させたＰ８培養細胞を４つの異なった抗体で染色した：すべての小脳ニューロンを認識するニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）に対するポリクローナルウサギ抗体（Ｓｃｈｍｅｃｈｅｌ ｅｔ
ａｌ．（１９７８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９：３１３−３１５）；小脳顆粒細胞を除いたすべての小脳ニューロンで合成されるＧＡＢＡに対するポリクローナル抗体（Ｇｒｕｏｌ ａｎｄ Ｃｒｉｍｉ（１９８８）Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，４１：１３５−１４６）；ニューロン−特異性タンパク質であるカルビンジンおよびＧＦＡＰ（アストログリアにのみ存在する中間フィラメントタンパク質）に対する抗体。結果は表２に要約されている。ＰＥＤＦはＳＣＭ（３０％増加）およびＣＤＭ（６０％増加）の両方でＮＳＥ陽性細胞の数を有意に増加させた。ＧＡＢＡ陽性ニューロンおよびＰｕｒｋｉｎｊｅ細胞（カルビンジン陽性）の数のわずかな（統計的には有意ではない）増加があった。従って、ＰＥＤＦは顆粒ニューロンに対してのみ神経栄養性である。さらに、ＰＥＤＦは培養液中に存在するＧＦＡＰ陽性アストログリア（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）の数を有意に減少させた（ＳＣＭで３０％の減少およびＣＤＭで４０％の減少）。このＰＥＤＦの”グリア静止性”は実施例１４でさらに論議される。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
神経芽成長に対するＰＥＤＦの効果を調べるため、神経フィラメントＥＬＩＳＡ試験が用いられた。免疫細胞化学は、モノクローナル抗体、ＲＭＯ−４２は培養液中の小脳顆粒細胞の神経芽のみ染色することを示したので、この抗体を細胞本体ではなく突起のみに存在する神経フィラメントの直接的測定に使用した（図１１）。ＰＥＤＦはＳＣＭおよびＣＤＭの両方で神経フィラメント含量をわずかに増加させたのみであったが、その増加量は細胞数の増加に直接的に比例していた（図１２）。
【０１２２】
図１３はこの実施例のデータを総括している。培養１０日までに、ほとんどの非処理ＣＧＣ（対照）は死滅したが、ＰＥＤＦ処理細胞は６０％またはそれ以上生き残った。ＰＥＤＦは従って脳ニューロンに対する強力な生存因子である。
【０１２３】
（実施例１３）
（ｒＰＥＤＦペプチド、ＢＰおよびＢＸの神経細胞栄養性特性）
ＰＥＤＦの”神経細胞栄養性”活性について前の節で記載されたことは真実であり、強力な神経栄養性活性を示す組換え体ＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）を比較的多量に製造することが可能である。適当な組換え体分子生物学的技術を用いて、より小さなＰＥＤＦ分子の断片もまた製造でき、それらは神経栄養性かまたは神経細胞栄養性活性が試験される。図１４はＣＧＣ生存率に対するＰＥＤＦのこれらの端が切断された形のうちの２つの効果を示している。ＢＸおよびＢＰは各々ＰＥＤＦ分子のアミノ末端部分からの２４および２８ｋＤａ断片である。両断片は１ｘまたは１０ｘ濃度でニューロン生存因子として作用し、有意にＣＧＣの寿命を延長させる。この実験において、ペプチドは実験の初めに一度に与えられ、細胞数は７日後に決定された。完全ＰＥＤＦ分子とともに、分子のＮ−末端に近いより小さな組換え体ペプチドも”神経細胞栄養性”であると結論付けられる。
【０１２４】
（実施例１４）
（ＰＥＤＦのグリア細胞静止特性）
ラット小脳顆粒細胞の初代培養中にニューロンとともに少数のグリアの異なった型が存在する。グリアはＣＮＳ中におけるニューロンのための”支持”要素であり、建築的骨格、およびニューロンが依存する代謝的支持系を形成する。グリアはまた、脳の腫瘍はほとんどグリアにより形成されおよびグリオシスがいくつかの神経消耗性疾患で問題であるので、臨床的にも重要である。我々の系において、細胞の培養混合集団をニューロンに特異的な抗体およびグリアの異なった型に特異的な他の抗体で免疫細胞化学的に染色した時に、グリアに対するＰＥＤＦの効果について気がついた。この目的のため、ニューロンの存在を示すために標準マーカーニューロン特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）およびその他、大グリア（ａｓｔｒｏｇｌｉａ）の存在を示すためにグリア原線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および小グリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）染色のためにＯＸ−４２を使用した。この実験において（表２）、我々はニューロンがＰＥＤＦ処理によりより長く生きることを知っていたのでＮＳＥ染色で予期される増加を観察したが、ＧＦＡＰ染色での予期されない減少を観察した。このことはＰＥＤＦ処理培養物において大グリア細胞をより少なくする可能性を示している。
【０１２５】
培養皿における大グリア細胞および小グリア細胞の特有の形態およびＧＦＡＰまたはＯＸ−４２に対するそれらの選択的染色のため、異なった実験条件下、顕微鏡下でそれらを個々に計数することが可能である。これは図１５および１６に概説するように行われた。図１５はラット脳から得られた培養液中の大グリア細胞の数に対するＰＥＤＦの効果を培養２週（２ｗ）または１２週（１２ｗ）に示したものである。与えられている時間は、ＰＥＤＦ処理後、４８時間、９６時間または７日である。明らかに、試験されたすべての条件でＰＥＤＦ処理は大グリア細胞の劇的な減少が生じている。図１６は同一の培養での小グリア細胞の平行分析を示している。４８時間または７日間のＰＥＤＦ投与により、２週間（２ｗ）または１２週間（１２ｗ）培養しても細胞の数を減少させていた。従って、ＰＥＤＦは非常に長い期間に渡ってグリア要素を実質的に減少させ、一方、ニューロンには生存因子として働いている。
【０１２６】
（実施例１５）
（天然ウシＰＥＤＦの特性付け）
特異的抗体によって成人ＩＰＭにＰＥＤＦの存在が示されたので、天然ＰＥＤＦの精製源としてウシＩＰＭ洗液を使用した。ＲＰＥおよび網膜細胞はＰＥＤＦ ｍＲＮＡを発現するが、これらの細胞抽出液では抗−ＢＨはウェスタン移行物上のＰＥＤＦバンドを検出できず、このことはＰＥＤＦがＩＰＭ内に迅速に放出されることを示唆している。ウシＩＰＭに存在するＰＥＤＦは全可溶性タンパク質の１％未満であると現在見積もられている（即ち、約２−５ｎｇ／ウシの眼）。生理学的温度では、ＩＰＭ中のＰＥＤＦタンパク質
は長い期間安定に残っており、ＳＤＳに抵抗する非還元複合体は形成しない。従って、その安定な性質のため、培養実験およびインビボでの移植におけるその潜在的有効性は非常に高い。
【０１２７】
ほぼ均質なまでの精製は単純な２工程法により達成される（図１７）。ＩＰＭの成分はサイズ排除カラムクロマトグラフィー（ＴＳＫ−３０００）により分画された。ＰＥＤＦ−免疫反応性分画をプールし、陽イオン交換カラム（Ｍｏｎｏ−Ｓ）に加え、ＮａＣｌ直線濃度勾配により免疫反応性成分を溶出させる。精製プロトコールは材料および方法に詳述されている。各々の溶出プロフィールがパネルＡ（ＴＳＫ−３０００サイズ排除カラムクロマトグラフィー）およびパネルＢ（ｍｏｎｏ−Ｓカラムクロマトグラフィー）に示されている。２８０ｎｍでの吸光度は実線で、およびＮａＣｌ濃度が点線で示されており、ＰＥＤＦ免疫反応性は抗血清Ａｂ−ｒＰＥＤＦで追跡された。挿入図は示された分画のウェスタンブロット分析である。免疫反応はＡｂ−ｒＰＥＤＦの１：１０，０００希釈で実施され、４−クロロ−１−ナフトールで染色された。ＴＳＫ−３０００クロマトグラフィーのための分子サイズ標品はＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、６６，０００）およびＣＡ（ウシカルボニックアンヒドラーゼ、２９，０００）であった。
【０１２８】
可溶性ＩＰＭ成分の洗液で出発し、最初の工程はサイズ排除カラムクロマトグラフィーによるほとんどの豊富にあるタンパク質（ＩＲＢＰ）の除去を含んでいる。ＰＥＤＦは約５０ｋＤａの大きさの単量体ポリペプチドとして溶出する。我々は、ＰＥＤＦの等電点を７．２−７．８であると決定したので、タンパク質を同時に精製および濃縮するための方法の第二の工程にｐＨ６．０でＳ−セファロースカラムクロマトグラフィーを使用した。精製されたタンパク質はおとなのウシの眼当たり約２μｇで回収され、回収率は約４０％であった。天然のＰＥＤＦはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、４９，５００±１，０００のみかけの分子量を持つ単量体糖タンパク質のように振る舞う。
【０１２９】
精製タンパク質はグリコシダーゼＦに感受性があり、Ｎ−結合オリゴサッカライドを示しており、それは天然のタンパク質中の３，０００−Ｍｒまでを占めている（図１８）。アスパラギン−結合オリゴサッカライドを除去するため、精製ＰＥＤＦタンパク質がエンドグリコシダーゼＨおよびＮ−グリコシダーゼＦで処理された。酵素反応は材料と方法に記載されているように実施され、β−メルカプトエタノール存在下または非存在下で全量で２００ｎｇのＰＥＤＦタンパク質が用いられた。反応混合物はＳＤＳ−１２．５％ポリアクリルアミドゲルに適用した。エンドグリコシダーゼＨ（左パネル）およびＮ−グリコシダーゼＦ（右パネル）反応物のウェスタン移行物の写真が示されている。イムノブロットは１：１０，０００希釈抗血清 Ａｂ−ｒＰＥＤＦで処理された。各々の反応の添加成分は上に示されている。各々の写真の右側面の数字はビオチン化ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標品の移動を示している：ウシ血清アルブミン（６６，２００）、オバアルブミン（４５，０００）およびウシカルボニックアンヒドラーゼ（３１，０００）。精製ウシＰＥＤＦはＹ−７９およびＷｅｒｉ網膜芽腫細胞の神経芽成長を促進し、この活性は抗−ｒＰＥＤＦにより遮断されること示した（下記参照）。
【０１３０】
本発明は、ＮＳＥ、ＧＦＡＰ、神経フィラメント（ＮＦ−２００）タンパク質を含むＣＧＣ培養物およびＹ−７９腫瘍細胞でのニューロンおよびグリアマーカーの発現に対する標準ＰＥＤＦの効果を測定するための道具を提供している。
【０１３１】
（実施例１６）
（色素上皮誘導因子：高度に特異的なポリクローナル抗体による特性決定）
ＰＥＤＦに対するポリクローナル抗体を開発するために、大腸菌で産生された精製組換え体ヒトＰＥＤＦを使用した。抗−ｒＰＥＤＦはおとなのウシの眼からのＩＰＭ洗液のウェスタン移行物上の一つのポリペプチドを特異的に認識した（図１９）。ヒト組換え体ＰＥＤＦに対するポリクローナル抗血清は特異的にｒＰＥＤＦを認識する。ヒトｒＰＥＤＦのウェスタン移行物およびスロットブロットはｒＰＥＤＦに対するウサギポリクローナル抗血清、Ａｂ−ｒＰＥＤＦで処理された。４−クロロ−１−ナフトールでの免疫染色の写真が示されている。パネルＡ、ｒＰＥＤＦの０．５μｇのウェスタン移行物が抗血清の希釈の増加をアッセイするために使用された。ｒＰＥＤＦタンパク質は移行前にＳＤＳ−１２．５％ＰＡＧＥで分離された。希釈率は各々のレーンの上に示されている。希釈抗血清は免疫検出に使用する前に５μｇ／ｍｌでｒＰＥＤＦと前もってインキュベートされ、１：１０，０００＋ｒＰＥＤＦと示されている。左の数字はビオチニル化ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標品の分子量を示している。パネルＢ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中ｒＰＥＤＦの量を増量し、マニホールドでニトロセルロース膜へ供給した。膜は抗血清抗−ｒＰＥＤＦおよび１：１０，０００希釈されたウサギ前免疫血清で処理された。右に示されている数字は膜へブロットされたｒＰＥＤＦの量を表している。各々のペーパーに使用された血清は図の上に示されている。
【０１３２】
抗−ＢＨはウェスタン移行物上、１：５０，０００のような高い希釈度でヒトＰＥＤＦを特異的に認識した；重要なことは、それが血清α１−抗トリプシンを認識しなかったことである。本抗体は若年サルＲＰＥ培養細胞の馴化培地の、ならびにおとなのウシの眼からのＩＰＭの、ウェスタン移行物上に一つの主要なバンドを認識した。抗−ｒＰＥＤＦはＩＰＭ促進神経栄養性活性を遮断した（図２０）。血清含有培地中、対数増殖期のヒト網膜芽腫細胞Ｙ−７９をＰＢＳで２回洗浄し、インシュリン、トランスフェリンおよびセレンを補給した無血清ＭＥＭ（ＩＴＳ混合物、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）中に播種した（ｍｌ当たり２．５ｘ１０５細胞）。次にエフェクターが培養液に添加された。５％ＣＯ２、３７℃で７日後、細胞を新鮮な無血清培地を含むポリ−Ｄ−リシン被覆プレートに付着させた。培養物の分化状態を付着後種々の間隔でモニターした。付着９日後の形態的特徴が示されている。エフェクターの添加は各々のパネルに示されており以下の最終濃度であった：１２５μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１％ ＩＰＭおよび１００ｎｇ／ｍｌ 精製ウシＰＥＤＦ。神経芽の成長誘導活性を阻止するため、各々のエフェクターは１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、過剰の抗血清抗−ｒＰＥＤＦ（１μｌ）と少なくとも６時間４℃で前もってインキュベートした。すべての写真は５０倍で示されている。
【０１３３】
抗−ｒＰＥＤＦはまた精製ＰＥＤＦにより促進される神経芽成長活性も阻止した。我々のデータはＩＰＭではＰＥＤＦが唯一の神経栄養性因子であることを示している。これらのデータはまた抗−ｒＰＥＤＦはＰＥＤＦ神経栄養性活性部位ならびにＩＰＭおよび他の組織（例えば、脳）におけるＰＥＤＦの生理学的役割の探査に有用であろうことも示唆している。さらに、これらの結果はＰＥＤＦはＩＰＭを益する成分であり、細胞外マトリックスにおける唯一の神経栄養性成分であることを示している。さらに、本タンパク質は広範囲の組織および細胞外空間に存在している。阻止抗体はＰＥＤＦの生理学的機能を探査する研究に有用である。
【０１３４】
（実施例１７）
（色素上皮誘導因子：神経栄養性活性を持つセルピン）
ヒト胎児ＰＥＤＦ ｃＤＮＡから誘導されるアミノ酸配列は、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）ファミリーとその一次構造の同一性を共有し（約３０％）、セルピンの構造的完全さに必須な残基の９０％を保存している。しかしながら、組換え体ＰＥＤＦはセリンプロテアーゼであるトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼまたはカテプシンＧを阻害しない。ＰＥＤＦの天然の標的はまだ解明されていない。ＰＥＤＦに対して作製した抗体によるウェスタンブロットの免疫検出および蛋白分解性基質としてカゼインを含むゲルのザイモグラフィーにより、網膜色素上皮および網膜間の空間である、光受容体間マトリックス（ＩＰＭ）からのタンパク質を分析した。結果は、ウシＩＰＭは安定でグリコ
シル化されたＰＥＤＦポリペプチド（５０，０００Ｍｒ）を目当たり２−５μｇ含んでいることを示している。トリプシン、サブチリシン、キモトリプシンおよびエラスターゼによるウシＰＥＤＦの制限蛋白分解は４６，０００Ｍｒのポリペプチドを産生し、蛋白分解性切断に感受性を持つヒンジ領域を持つ球状構造が示唆される。一方、カゼインＳＤＳ−ＰＡＧＥザイモグラフィーはＩＰＭ中のプロテアーゼ活性が低いことを明らかにし、それは約８０，０００±５，０００の２倍移動した。カゼイン分解性活性は１μｇ／ｍｌのアプロチニンおよび１０ｍＭ ＰＭＳＦをゲル混合物に加えると１００％阻害されたが、Ｅ６４またはＥＤＴＡには影響を受けなかった。重要なことは、ＩＰＭタンパク質は、約８０，０００Ｍｒのセリンプロテアーゼであるプラスミノーゲンに対する抗体と反応しなかったことである。ｒＰＥＤＦタンパク質が１μｇ／ｍｌで加えられた場合、これらのカゼイン分解性活性ならびに未知の起源のその他のセリンプロテアーゼ活性の信号は約５０％弱められた。これらの結果は新規セリンプロテアーゼおよびセルピンＰＥＤＦのための天然の細胞外部位としてのＩＰＭを示唆しており、両方とも全タンパク質の≦１％で存在している。
【０１３５】
ここに引用したすべての文献は、援用により本明細書に全文包含される。
【０１３６】
本発明はＰＥＤＦの一般的構造特性およびこれらがタンパク質の機能とどのように関係するかについての理解の発端を開示している。ＰＥＤＦはセルピンについて知られている構造特性および一般的三次特性を持っているが、セルピンの抗−プロテアーゼ活性は持っていない。ＰＥＤＦは神経栄養性タンパク質であり、網膜芽腫細胞上の神経芽成長を促進するＩＰＭの唯一の成分であるようである。しかしながら、古典的セルピンのカルボキシ末端近くに観察されるセリンプロテアーゼ阻害剤のための反応中心は、ＰＥＤＦの神経栄養性生物学的活性には必要とされない。特に、分子のアミノ末端部分からのドメインを含むポリペプチド鎖（ＢＡ）は、神経栄養性およびニューロン生存活性にとって十分である。本発明はさらにＣＧＣニューロンがアポトーシスで死ぬかどうかおよびＰＥＤＦはアポトーシスの阻害剤であるかどうかの決定を可能にする。言葉を換えれば、本発明はどのような機構でＰＥＤＦがニューロンを”救い”およびグリアの成長または増殖を”阻害する”かを決定することを可能にする。
【０１３７】
本発明は特異的神経栄養性”活性部位”の決定に有用である。さらに、端が切断されたｒＰＥＤＦペプチドの使用はＰＥＤＦの神経細胞栄養性およびおそらく、グリア細胞静止性に必要な要素決定を可能にする。本発明はさらに、網膜芽腫細胞の分化のための信号の引き金を引くＰＥＤＦの相互作用を研究するために必要な道具を提供する。最近の実験は網膜芽腫細胞により前もって”馴化され”ている培地に加えたときのみ１２５Ｉ−ＢＨは網膜芽腫細胞と競合的様式で結合することが示されている。このことは細胞により産生される一つまたはそれ以上の補因子が結合に必要であろうことを示唆している。本発明はさらにＣＧＣ試験系および網膜芽腫細胞試験系からのＰＥＤＦまたはＰＥＤＦ複合体に対する細胞表面受容体を同定および特性決定するために必要な道具を提供する。
【０１３８】
タンパク質の機能部位のドメインマッピングのための道具として、組換え体変異タンパク質、タンパク質分解生成物および合成ペプチドが使用できる。さらに、本発明の組換え体タンパク質はＰＥＤＦ上の神経栄養性および神経細胞栄養性”活性部位”のマッピング、およびこの興味深いタンパク質が発揮するその劇的な生物学的効果による細胞トランスダクション機構の決定を可能にする。
【０１３９】
本発明は好適な態様を強調して説明したが、ＰＥＤＦ、ｒＰＥＤＦおよび等価なタンパク質、（ＢＰ、ＢＸ、ＢＡ）をコードしている好適な核酸、およびそれらのアミノ酸配列、そのような核酸を利用するベクター、そのようなタンパク質を産生する組換え法、およびそのようなタンパク質の使用法の変形態様が存在し、本発明がここに特別に記載したものと別な方法で実施できるであろうことは当業者には明かであろう。従って、本発明は以下の請求の範囲に定義されるように、本発明の精神および範囲内のすべての改変を包含する。
【０１４０】
（配列表）
【数２】
【０１４１】
【数３】
【０１４２】
【数４】
【０１４３】
【数５】
【０１４４】
【数６】
【０１４５】
【数７】
【０１４６】
【数８】
【０１４７】
【数９】
【０１４８】
【数１０】
【０１４９】
【数１１】
【０１５０】
【数１２】
【０１５１】
【数１３】
【０１５２】
【数１４】
【０１５３】
【数１５】
【０１５４】
【数１６】
【０１５５】
【数１７】
【０１５６】
【数１８】
【０１５７】
【数１９】
【０１５８】
【数２０】
【０１５９】
【数２１】
【０１６０】
【数２２】
【０１６１】
【数２３】
【０１６２】
【数２４】
【０１６３】
【数２５】
【０１６４】
【数２６】
【０１６５】
【数２７】
【０１６６】
【数２８】
【０１６７】
【数２９】
【０１６８】
【数３０】
【０１６９】
【数３１】
【０１７０】
【数３２】
【０１７１】
【数３３】
【０１７２】
【数３４】
【０１７３】
【数３５】
【０１７４】
【数３６】
【０１７５】
【数３７】
【０１７６】
【数３８】
【０１７７】
【数３９】
【０１７８】
【数４０】
【０１７９】
【数４１】
【０１８０】
【数４２】
【０１８１】
【数４３】
【０１８２】
【数４４】
【０１８３】
【数４５】
【０１８４】
【数４６】
【０１８５】
【数４７】
【０１８６】
【数４８】
【０１８７】
【数４９】
【０１８８】
【数５０】
【０１８９】
【数５１】
【０１９０】
【数５２】
【０１９１】
【数５３】
【０１９２】
【数５４】
【０１９３】
【数５５】
【０１９４】
【数５６】
【０１９５】
【数５７】
【０１９６】
【数５８】
【０１９７】
【数５９】
【０１９８】
【数６０】
【０１９９】
【数６１】
【０２００】
【数６２】
【０２０１】
【数６３】
【０２０２】
【数６４】
【０２０３】
【数６５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の方法。
【請求項１】
明細書に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公開番号】特開２００９−１５３５１７（Ｐ２００９−１５３５１７Ａ）
【公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１４５２（Ｐ２００９−１１４５２）
【出願日】平成２１年１月２１日（２００９．１．２１）
【分割の表示】特願２００６−３３１２９（Ｐ２００６−３３１２９）の分割
【原出願日】平成７年６月６日（１９９５．６．６）
【出願人】（５０４３６９８２３）アメリカ合衆国 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２１日（２００９．１．２１）
【分割の表示】特願２００６−３３１２９（Ｐ２００６−３３１２９）の分割
【原出願日】平成７年６月６日（１９９５．６．６）
【出願人】（５０４３６９８２３）アメリカ合衆国 (2)
【Ｆターム（参考）】
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