【課題】本発明は、組換えタンパク質又はペプチドの生産レベルを改善する又は宿主細胞において発現される活性組換えタンパク質又はペプチドのレベルを改善するための方法である。
【解決手段】本発明は、組換えタンパク質を発現する細胞の２つの遺伝的プロフィールを比較し、組換えタンパク質発現に応答して上方調節される遺伝子産物の発現を変化させるように前記細胞を修飾する方法である。前記方法は、例えば組換えタンパク質の溶解度を上昇させることによって、タンパク質の生産を改善することができる又はタンパク質の品質を改善することができる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）組換え宿主細胞又は生物において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること；
ｉｉ）前記組換え細胞の遺伝的プロフィールを分析し、前記組換えタンパク質を発現す
るように修飾されていない宿主細胞又は前記組換えタンパク質を発現していない組換え細
胞におけるよりも高いレベルで前記組換え細胞において発現される１又はそれ以上の補償
遺伝子又は遺伝子産物を特定すること；及び
ｉｉｉ）前記組換え細胞における前記特定された補償遺伝子又は遺伝子産物の発現を遺
伝子修飾によって変化させ、組換えタンパク質の発現、活性又は溶解度の上昇を達成する
修飾組換え細胞を提供すること、
を含む、宿主細胞又は生物における組換えタンパク質又はペプチドの発現を改善する方法
。
【請求項２】
前記修飾組換え細胞において前記タンパク質又はペプチドを発現することをさらに含む
、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）前記修飾組換え細胞において前記組換えタンパク質又はペプチドを発現すること
；
（ｂ）前記修飾組換え細胞の遺伝的プロフィールを分析し、前記修飾組換え細胞におい
て区別して発現される少なくとも１つの第二遺伝子又は遺伝子産物を特定すること；
（ｃ）前記修飾組換え細胞における第前記二の特定された遺伝子産物の発現を変化させ
、二重修飾された細胞を提供すること；及び
（ｄ）前記二重修飾組換え細胞において前記タンパク質又はペプチドを発現すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）−ｄ）を反復することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記特定された遺伝子又は遺伝子産物の発現を変化させることによって、細胞生存率が
影響を受けるまで工程ａ）−ｄ）を反復することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えタンパク質又はペプチドの発現が標的エンドポイントに達するまで工程ａ）
−ｄ）を反復することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝的プロフィールが、前記組換え細胞の遺伝的プロフィールを前記宿主細胞の第
二の遺伝的プロフィールと比較することによって分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝的プロフィールがトランスクリプトームプロフィールである、請求項１に記載
の方法。
【請求項９】
前記トランスクリプトームプロフィールがマイクロアレイを通して決定される、請求項
８に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝的プロフィールがプロテオームプロフィールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロテオームプロフィールが二次元ゲル電気泳動、ＩＣＡＴ又はＬＣ／ＭＳを通し
て決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロテオームプロフィールがペプチドアレイを通して決定される、請求項１０に記
載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドアレイが抗体アレイである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記特定される遺伝子産物が、プロテアーゼ、プロテアーゼのサブユニット、プロテア
ーゼの補因子、プロテアーゼの発現に影響を及ぼす細胞又は遺伝子調節剤である、請求項
１に記載の方法。
【請求項１５】
前記特定される遺伝子産物がプロテアーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記特定される遺伝子産物がプロテアーゼのサブユニットである、請求項１４に記載の
方法。
【請求項１７】
前記特定される遺伝子産物がプロテアーゼの補因子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記特定される遺伝子産物が、プロテアーゼの発現に影響を及ぼす細胞又は遺伝子調節
剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記特定される遺伝子産物が、Ｄ−アラニル−メソ−ジアミノピメリン酸エンドペプチ
ダーゼ、亜鉛プロテアーゼ、ミクロソームジペプチダーゼ、細胞外メタロプロテアーゼ前
駆体、細胞分裂タンパク質ｆｔｓＨ及び、遺伝子ｈｓｌＶ、ｈｓｌＵ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐ
Ａ及びｃｌｐＢ由来の遺伝子産物から成る群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記組換えタンパク質又はペプチドが前記宿主細胞において発現されるとき、特定され
る遺伝子産物のｍＲＮＡレベルが上方調節される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記特定された遺伝子産物を宿主細胞ゲノムから除去する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記特定された遺伝子産物を相同的組換えによって除去する、請求項２１に記載の方法
。
【請求項２３】
前記特定される遺伝子産物が、フォールディング調節剤、フォールディング調節剤のサ
ブユニット、フォールディング調節剤の補因子、又はフォールディング調節剤の発現に影
響を及ぼす細胞又は遺伝子調節剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記特定される遺伝子産物がフォールディング調節剤である、請求項２３に記載の方法
。
【請求項２５】
前記特定される遺伝子産物がフォールディング調節剤のサブユニットである、請求項２
３に記載の方法。
【請求項２６】
前記特定される遺伝子産物がフォールディング調節剤の補因子である、請求項２３に記
載の方法。
【請求項２７】
前記特定される遺伝子産物が、フォールディング調節剤の発現に影響を及ぼす細胞又は
遺伝子調節剤である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記フォールディング調節剤がシャペロンタンパク質である、請求項２３に記載の方法
。
【請求項２９】
前記フォールディング調節剤が、遺伝子ｃｂｐＡ、ｈｔｐＧ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｆ
ｋｂＰ２、ｇｒｏＥＳ及びｇｒｏＥＬの遺伝子産物から成る群より選択される、請求項２
３に記載の方法。
【請求項３０】
前記特定される遺伝子産物の発現が、前記特定遺伝子、特定遺伝子の補因子、又は特定
遺伝子の細胞又は遺伝子調節剤の発現を上昇させることによって変化する、請求項２３に
記載の方法。
【請求項３１】
前記発現上昇が、前記特定遺伝子産物をコードするＤＮＡの組込みによる、請求項３０
に記載の方法。
【請求項３２】
前記発現上昇が、宿主細胞ゲノムへのプロモーターの挿入による、請求項３０に記載の
方法。
【請求項３３】
前記発現上昇が、前記宿主細胞への外来性ベクターの組込みによる、請求項３０に記載
の方法。
【請求項３４】
前記宿主細胞が微生物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記宿主細胞がシュードモナス菌（Pseudomonad）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主細胞がＰ．フルオレセンス（P. fluorescence）細胞である、請求項１に記載
の方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記宿主細胞が、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞及び植物細胞から成る
群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記マイクロアレイが、前記宿主細胞のゲノムの少なくとも５０％に対する結合パート
ナーの試料を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項４０】
前記マイクロアレイ手法が、前記宿主細胞のゲノムの少なくとも８０％に対する結合パ
ートナーの試料を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項４１】
前記マイクロアレイが、前記宿主細胞のゲノムの少なくとも９０％に対する結合パート
ナーの試料を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項４２】
前記マイクロアレイが、前記宿主細胞のゲノムの少なくとも９５％に対する結合パート
ナーの試料を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項４３】
前記改善された発現が、組換えタンパク質又はペプチドの量の上昇である、請求項１に
記載の方法。
【請求項４４】
前記改善された発現が、前記組換えタンパク質又はペプチドの溶解度の上昇である、請
求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記改善された発現が、前記組換えタンパク質又はペプチドの活性の上昇である、請求
項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記遺伝的プロフィールが、遺伝子ファミリーにおける遺伝子のプロフィールである、
請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記プロフィールが、プロテアーゼ及びフォールディング調節剤を含む、請求項１に記
載の方法。
【請求項４８】
前記プロフィールが本質的にプロテアーゼから成る、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも２つのプロテアーゼの発現を低下させるように遺伝的に修飾された組換えタ
ンパク質を発現する宿主細胞又は生物。
【請求項５０】
Ｄ−アラニル−メソ−ジアミノピメリン酸エンドペプチダーゼ、亜鉛プロテアーゼ、ミ
クロソームジペプチダーゼ、細胞外メタロプロテアーゼ前駆体、細胞分裂タンパク質ｆｔ
ｓＨ、及び遺伝子ｈｓｌＶ、ｈｓｌＵ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐＡ及びｃｌｐＢ由来の遺伝子産
物から成る群より選択される少なくとも１つのプロテアーゼの発現を低下させるように遺
伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物。
【請求項５１】
少なくとも１つのプロテアーゼの発現を低下させるように遺伝的に修飾された哺乳動物
由来の組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物。
【請求項５２】
前記組換えタンパク質がヒト成長ホルモンである、請求項５２に記載の宿主細胞又は生
物。
【請求項５３】
フォールディング調節剤サブユニットではない少なくとも２つのフォールディング調節
剤の発現を上昇させるように遺伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主細胞又
は生物。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【公開番号】特開２０１２−５５３１８（Ｐ２０１２−５５３１８Ａ）
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５１６１０（Ｐ２０１１−２５１６１０）
【出願日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【分割の表示】特願２００７−５２３７０７（Ｐ２００７−５２３７０７）の分割
【原出願日】平成１７年７月２６日（２００５．７．２６）
【出願人】（５０２１４１０５０）ダウ　グローバル　テクノロジーズ　エルエルシー (1,383)
【Ｆターム（参考）】