薬物送達用及び撮像用複合リジン共重合体
生体適合性分子は、グルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基のいずれかとリジンとを含有するポリペプチドを含んでおり、リジン残基の９０％未満が立体障害分子から誘導される基で置換されており、置換ポリペプチドは長さが平均直径の５〜５００倍の立体配座を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍組織の治療用、さらに具体的には腫瘍組織への薬物送達を最適化する改良複合ポリマーに関し、また腫瘍の診断撮像に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの医療処置では、所望の組織型に活性薬剤を蓄積させることが重要である。例えば、化学療法では、薬物が組織と接触するとその組織を破壊するので、正常組織ではなく癌性腫瘍組織にのみ薬物を送達することが重要である。もう一つの例として医用画像が挙げられる。腫瘍組織に特異的な担体分子に造影剤を結合させる。担体分子が腫瘍組織に濃縮されると、造影剤が組織の医用画像を増強する。
【０００３】
ポリ−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＡ）に結合した化学療法薬剤（例えばドキソルビシン）の使用については従前記載されている。用いられる担体分子の多くは、球状又は折り畳み立体配置を有するタンパク質である。
【０００４】
公知の担体分子の一つの類型は、正常組織の血管の孔よりも直径が大きく、腫瘍組織の血管の孔よりも直径の小さいポリペプチドを含むものである。米国特許第５７６２９０９号明細書を参照されたい。こうした担体は、長さが直径よりも数桁大きく、正味電荷は負であり、持続長の長いミミズ状の鎖状立体配座をなす。ランタニド錯体（例えば、ジエチレントリアミン五酢酸ガドリニウム錯体）をこうした担体分子に結合させて錯体分子を形成し、これを被検者の血管内に導入する。
【０００５】
これらの錯体分子はもっぱら腫瘍内皮の孔を通過して、腫瘍間質の線維構造と相互作用する。錯体分子による腫瘍間質への浸透は錯体分子のミミズ状立体配置によって促進され、かかる立体配置によって腫瘍間質の細胞外基質の固定障壁の周囲を錯体分子が「蛇行」できるようになる。
【特許文献１】米国特許第５７６２９０９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
錯体分子のミミズ状立体配置は、ポリペプチド鎖に沿って十分な数のジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）分子を結合させ、鎖内イオン結合を除去又は低減するとともに、ＤＴＰＡ基同士の電荷斥力によってポリマー鎖の折り畳みを解いて伸長させることによって達成される。置換の量（複合度ともいう。）は得られる錯体の立体配置に影響を与え、複合度が高いほど、ばらつきの少ない伸長構造を与え、ターゲティングが良好になる。残念なことに、９０％を上回る複合度を確実に達成するのは困難である。（Ｓｉｅｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， １， ６５ （１９９０）参照。）。置換度が９０％を上回るのは稀であり、無水物／リジン比を高くして反応時間を延ばしたとしても、７回の合成で１回程度である。それでも、単独重合体の場合に妥当なポリマー立体配置を実現するには、このレベルの置換度が必要とされる。
【０００７】
そこで、複合度を極端に高くしなくても、所望の立体配座を与えるポリペプチド−ＤＴＰＡ分子を提供できれば有益である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
グルタミン酸又はアスパラギン酸いずれかとリジンとの置換ランダム共重合体を用いると、直径が正常組織の血管の孔よりも大きく腫瘍組織の血管の孔よりも小さい担体分子の主鎖が得られる。この担体分子は、長さが直径の５〜５００倍であり、好ましくは正味電荷は負である。驚くべきことに、本発明の担体分子は、リジン残基の複合度が９０％未満であるにもかかわらず持続長の長いミミズ状鎖状立体配座を形成する。水性環境下では、負に荷電したグルタミン酸基が電荷斥力相互作用に寄与して鎖を伸ばすと考えられる。一方、水性環境で正に荷電していてポリマーの折り畳みに寄与する遊離リジンは、ポリマー鎖全体では幾分減少する。そこで、例えば、ポリマーにおけるグルタミン酸／リジン比が１：１であれば、２０％の非複合遊離リジンは正電荷の１０％しか表さない。
【０００９】
本発明の担体分子に活性薬剤を結合させて担体／活性薬剤（Ｃ／Ａ）錯体分子を形成し、被検者の血管内に導入する。これらのＣ／Ａ錯体分子はもっぱら腫瘍組織の内皮を通って腫瘍間質の線維構造と相互作用する。これらの分子の取込み及び保持は、コンパクトなペプチドコイルや球状タンパク質のような他の高分子で観察されるものの５倍を超える。Ｃ／Ａ錯体分子による腫瘍間質への浸透は、Ｃ／Ａ分子を、ミミズ状立体配置を有し、腫瘍間質の細胞外基質の固定障壁の周囲を「蛇行」できるように選択、つまり修飾するレプテーションプロセスによって促進することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の新規な特徴は特許請求の範囲に具体的に記載されているが、本発明の構成及び内容は、以下の詳細な説明を図面と共に参照することによって、他の課題及び特徴と併せてさらに十分に理解されよう。
【００１１】
本発明の方法は、担体分子をミミズ状立体配置とするのに必要な置換ポリペプチドの複合度を従来技術の分子よりも少なくするためランダム共重合体を用いる。本発明の方法及び材料は、置換ポリペプチドの造影剤又は薬物送達剤としての有効性を保持するが、従来技術の分子に比べて確実に達成できる低い複合度で有効性を保つ。
【００１２】
本発明の担体分子は、その物理的な大きさによってペプチド結合の回転を物理的に制限する基で置換されたランダム共重合体主鎖を含む。
【００１３】
担体分子の主鎖を形成するランダム共重合体は、グルタミン酸単位及びアスパラギン酸単位のいずれか又は両方とリジン単位とを含む。グルタミン及び／又はアスパラギン酸単位は、共重合体の約２０〜約６０％を構成し得る。好ましくは、共重合体はグルタミン酸−リジン共重合体である。ポリマーの長さは約３５〜約１５００残基又はそれ以上とし得る。特に有用な共重合体は、ｇｌｕ：ｌｙｓ比が約１：４〜約６：４のものである。リジン含有量が大きい方が、共重合体に常磁性イオンを多量に含ませることができるためイメージングに有利であると考えられる。いかなる理論にも束縛されるものではないが、共重合体主鎖におけるグルタミン酸残基の存在で以下に述べる二つの事柄が達成されると考えられる。第一に、グルタミン酸残基は、完全な構築体を合成するための剛性の高い初期共重合体主鎖を与えると考えられる。第二に、共重合体におけるグルタミン酸残基の存在によって、電荷斥力を通じて最終ポリマーの伸張が促進されると考えられる。適当な共重合体は当業者に公知の手法を用いて合成できる。適当な共重合体は様々な供給元から市販されてもいる。
【００１４】
共重合体のリジン基の少なくとも一部には立体障害分子（「ＳＨＭ」）が結合している。ＳＨＭは、その物理的な大きさによって、隣り合った立体障害分子同士に立体障害を与えて伸びた立体配座をもたらす分子である。好ましくは、ＳＨＭは電荷が中性であるか、或いは水性環境中でポリマー鎖に沿って負電荷を呈し、クーロン斥力によってポリマー主鎖をまっすぐに保つのに役立つ。
【００１５】
特に有用な実施形態では、ＳＨＭは画像形成体を含有しているか、或いは画像形成体をキレートしている。適当な画像形成体としては、常磁性体、及び例えばα粒子、γ粒子、β粒子又は陽電子のような粒子を放出する核反応を起こす物質が挙げられる。かかる画像形成体は当業者に公知である。γ放出体としては、例えば１１１Ｉｎ及び１５３Ｇｄが挙げられる。陽電子放出体としては、例えば８９Ｚｒがあり、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）撮像に用いることができる。
【００１６】
特に好ましい立体障害分子は常磁性体をキレートする分子である。当業者には自明であろうが、常磁性体には数種の遷移金属及びランタニドイオンがある。常磁性体と錯形成することが知られていて、ポリマーの折れ曲がりに抗する立体障害を与えるのに十分な大きさをもつ分子であればどんなものでもＳＨＭとして用いることができる。好ましくは、ＳＨＭから誘導され、ポリマー主鎖に存在する基は、水性環境中で正味の負電荷を呈する。ランタニドイオンをキレートする適当な分子としては、特に限定されないが、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（２−プロピオン酸）（ＤＯＴＭＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス［３−（４−カルボキシル）ブタン酸］、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（酢酸−メチルアミド）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（メチレンホスホン酸）、及びｐ−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＯＴＡ）が挙げられる。他のイオン（例えばＦｅ（III）、Ｍｎ（II）、Ｃｕ（II）等）とのキレートに有用な配位子としては、ビス（チオセミカルバゾン）及びその誘導体、ポルフィリン及びその誘導体、２，３−ビス（２−チオアセトアミド）プロピオネート及びその誘導体、Ｎ，Ｎ′−ビス（メルカプトアセチル）−２，３−ジアミノプロパノエート、並びにビス（アミノエタンチオール）及びその誘導体がある。
【００１７】
典型的には、共重合体主鎖にＳＨＭを結合させるため、ＳＨＭに活性化基を設ける。ＳＨＭに存在する活性化基は、共重合体と反応する任意の基でよい。適当な基としては、特に限定されないが、炭酸−無水炭酸混成基、アミン基、スクシンイミジル基及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）基がある。当業者には、所与のＳＨＭに活性化基を結合させる反応スキームは容易に想到されよう。
【００１８】
特に好ましい方法では、実質的単活性化立体障害分子（「ＳＨＭ」）を提供する。「活性化」という用語は、分子が共重合体鎖に共有結合できる官能基がＳＨＭに設けられていることを意味する。「実質的単活性化」という用語は、立体障害分子の約９０％以上が単一の活性部位のみを有することを意味する。
【００１９】
一実施形態では、ＳＨＭはＤＴＰＡであり、活性化基は炭酸−無水炭酸混成基である。ＤＴＰＡを活性化してポリペプチド主鎖と反応させるための典型的な反応スキームを図１に示す。図に示す通り、まず一無水物ＤＴＰＡを調製する。具体的には、フラスコにアセトニトリルとＤＴＰＡを仕込む。次いで、トリエチルアミンをシリンジを介して添加する。溶液を窒素雰囲気下で６０℃に加熱する。混合物は均一になるまで攪拌する。透明な溶液を次いで窒素雰囲気下で−４５℃に冷却し、イソブチルクロロホルメートをゆっくりと添加してＤＴＰＡの一無水物を得る。当業者には自明であろうが、ＤＴＰＡは無水物への転化に利用可能な酸基を５個有する。しかし、実質的単活性化ＤＴＰＡが望まれるので、これらの酸部位の１個のみを無水物に転化すればよい。意外にも、−４０℃未満に冷却しながらクロロホルメートをゆっくりと添加すると、こうした結果が得られる、つまりＤＴＰＡの約９０％以上がＤＴＰＡの一無水物になることが判明した。
【００２０】
この実質的単活性化ＳＨＭを次いで含リジンポリマーと反応させる。
【００２１】
共重合体を実質的単活性化ＳＨＭと反応させる正確な条件は、選択される共重合体及び用いるＳＨＭを始めとする幾つかの要因によって決まる。当業者には、所望の共重合体−ＳＨＭ複合体を形成する所与の一対の材料のための反応スキームは容易に想到されよう。
【００２２】
特に有用な実施形態では、例えば上述の一無水物ＤＴＰＡを周囲雰囲気条件下でポリ（リジン−コ−グルタミン酸）の水溶液に単に滴下する。
【００２３】
次いで、得られる共重合体−ＳＨＭ生成物を精製する。精製時に、共重合体−ＳＨＭ生成物を揮発性溶媒その他の不純物から分離する。共重合体−ＳＨＭ生成物の精製は公知の手段を用いて行うことができる。
【００２４】
特に有用な実施形態では、共重合体−ＳＨＭ生成物を完全には乾燥させないような精製法が用いられる。過度に乾燥すると、共重合体−ＳＨＭ生成物の立体配置に影響し、複合度の決定に干渉すると考えられる。
【００２５】
好ましい精製法では、まず反応混合物を減圧下に置いて、水よりも揮発性の高い不純物を除去する。このステップで反応混合物から水を完全に除去することがないように注意すべきである。この好ましい精製法の次のステップは、残りの反応混合物を遠心分離することである。可溶性不純物は上清に残る。遠心分離ステップからの保持液を再懸濁して透析に付す。適宜、透析後の共重合体で限外濾過を行う。これらのプロセスにおける技術は当業者の知見の範囲内にある。
【００２６】
次いで、得られる生成物の特性は、例えば高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）のような当業者に公知の技術を用いて決定できる。
【００２７】
複合共重合体を造影剤として用いる実施形態では、複合ポリマーに画像形成体を導入する。例えば、ＭＲ活性剤を得るには、共重合体−ＳＨＭ生成物に常磁性イオンを導入すればよい。例として、共重合体−ＳＨＭ生成物を含有する溶液（１５ｍＭ ＮａＨＣＯ３）にガドリニウム塩（例えばＧｄＣｌ３又はクエン酸ガドリニウムの０．１Ｍ ＨＣｌ溶液（Ｇｄ ５０ｍＭ））を滴下することによって、キレート用ＤＴＰＡ基にガドリニウムを結合させることができる。Ｇｄの滴下は、遊離Ｇｄ（利用可能なＤＴＰＡ基でキレートされていない）の指標が僅かに認められるまで続ける（ポリマー溶液の少量のアリコートを１０μＭのａｒｚｅｎｚｏ IIIIの酢酸緩衝液に添加すると、遊離Ｇｄで染料溶液が青くなる。）。こうしてＧｄを結合させた高複合共重合体は被検者の血管への導入準備が整ったものである。
【００２８】
ある実施形態では、複合ポリマーを薬物送達に用いることができる。例えば、ＳＨＭ自体が治療薬となると思料される。また、置換共重合体鎖の幾つかの部位に治療薬を結合させることもできると思料される。例として、抗腫瘍活性をもつことが判明している化学療法薬（例えばドキソルビシン又はメトトレキセートなど）を複合共重合体に結合させることができる。ここではドキソルビシンとメトトレキセートを具体的な化学療法薬として挙げたが、用いる特定のポリペプチドに結合できる公知の化学療法薬であればどんなものでも使用できる。また、リシンやアブリンのような植物毒素及び細菌毒素を用いてもよい。治療用には、９０Ｙ又は２１１Ａｔのような放射線治療薬を用いることもできる。
【００２９】
治療薬は、当業者に公知の手法を用いて複合共重合体に結合させることができる。また、治療薬を他の種類の活性薬剤と併用して複合共重合体に導入することもできると思料される。例えば、共重合体主鎖を、画像形成体とキレートする非治療型ＳＨＭと高度に結合させて、治療薬が主鎖に沿った少数の部位にのみ存在するようにすることができる。別の例として、共重合体主鎖を非治療型ＳＨＭと高度に結合させて、治療薬が共重合体主鎖に直接結合せず、ＳＨＭに結合させることもできる。
【００３０】
他の実施形態では、複合ポリマーを特定の組織のターゲティングに用いることができる。例えば、ＳＨＭ自体を標的剤とすることができると思料される。また、置換共重合体鎖に沿った幾つかの部位に標的剤を結合させることもできると思料される。標的薬は、当業者に公知の手法を用いて複合共重合体に結合させることができる。また、標的薬を他の種類の活性薬剤と併用して複合共重合体に導入することもできると思料される。例えば、共重合体主鎖を、画像形成体とキレートする非標的型ＳＨＭと高度に結合させて、標的薬が主鎖に沿った少数の部位にのみ存在するようにすることができる。別の例として、共重合体主鎖を非標的型ＳＨＭと高度に結合させて、標的薬が共重合体主鎖に直接結合せず、ＳＨＭに結合させることもできる。
【００３１】
図２に、正常組織から腫瘍組織３を通る血管１を示す。正常組織の血管の孔５は小さく、活性薬剤分子に結合したポリペプチド担体分子である担体／活性薬剤（Ｃ／Ａ）錯体分子１１は血管内に留まる。活性薬剤分子は、公知のコントラスト増強剤、薬剤、毒素、又は腫瘍組織を標的とする他の分子であってよい。腫瘍組織３の内部では、孔７は正常組織の孔５よりも格段に大きい。Ｃ／Ａ錯体分子１３が孔９を通って腫瘍３の間質空間に入るのを示してある。
【００３２】
或いは、孔は単なるチャネルではなく内皮の細胞外基質の線維網で擁していてもよい。レプテーションと呼ばれるプロセスによって、細長いミミズ状分子が障壁の周りをすり抜け、球状分子又はコイル状分子では通過することのできない制限された開口を通り抜けることができる。実験結果によれば、大部分の腫瘍チャネルが実際に内皮の単なる開口ではなくこの種の制限されたチャネルであることを示唆している。
【００３３】
腫瘍３の間質空間には間質１７が豊富に存在する。適切な立体配座、大きさ及び電荷をもつＣ／Ａ錯体分子１５が間質１７と絡み合って、腫瘍３の間質空間に捕捉されるようになるのを示してある。
【００３４】
本発明のＣ／Ａ錯体分子は好ましくは、断面直径が健常な内皮の孔よりも大きく正常組織の血管内に留まるが、腫瘍組織の血管の孔よりは小さくその孔から容易に出て間質空間に入り込むことができる。直径約２０〜５０Åの錯体分子は一般に腫瘍組織の孔構造を通るが、正常組織の孔構造は通らない。
【００３５】
腫瘍内部での濃縮に効果的なものとするため、Ｃ／Ａ錯体分子は好適には長さが血液内での循環時間を増すのに十分な長さをもつが、腫瘍間質に取り込まれるのに十分な短さのものである。いったん腫瘍間質に入ると、長い分子の方が、おそらく間質空間の間質と絡み合うことで、腫瘍間質に留まる傾向にある。
【００３６】
腫瘍組織におけるＣ／Ａ分子の濃縮は、鎖長に依存する次の二つのプロセスの所産である。
【００３７】
１．レプテーションによる腫瘍組織内への取込みが第一のプロセスであり、このプロセスではペプチド鎖の長さが増すほど取込みの有効性は低くなる。レプテーションによって障壁及び孔を通過することができても、分子が長いほど腫瘍間質への通過は遅くなる。このプロセスは周知であり、ゲル電気泳動でのＤＮＡ分子又は変性タンパク質の分離を起こす。
【００３８】
２．第二のプロセスは、腎臓の糸球体濾過で行われる血液循環からのＣ／Ａ錯体分子のクリアランスに関する。クリアランスは短い分子の方が速く、血漿寿命が短くなる。血漿寿命はペプチドの長さが増すと急激に増大するが、分子長が５００残基程度でプラトーに達し、寿命はそれ以上ほとんど変化しない。
【００３９】
高分子の立体配座が細長いミミズ状であると、折り畳み立体配座又は球状立体配座のような他の立体配座よりも取込みが増大する。立体配座は分子の持続長によって測定することができる。これは光散乱法で決定し得る。
【００４０】
立体配座は、鎖内電荷相互作用と分子の剛直性の結果である。Ｃ／Ａ担体分子はポリペプチドとして選択される。しかし、ポリペプチドの多くは、各ペプチド結合での回転が比較的自由なため折り畳まれて密なランダムコイルになる傾向がある。また、各ポリペプチドが反対電荷のアミノ酸からなる場合には、図３の結合２１で示すような鎖内電荷相互作用が生ずる。また、図３の結合２３で示すように鎖同士の間で鎖間電荷相互作用が起こることもある。鎖内電荷相互作用が有意に存在すると、Ｃ／Ａ錯体分子は球状又は折り畳み状の立体配座を取る可能性がある。
【００４１】
本発明のランダム共重合体担体分子で達成される立体配座は、基本的に伸び拡がった伸長鎖で折り畳みのほとんどないミミズ状の形態である。分子の「直線性」の尺度は持続長（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ）である。持続長は、光散乱実験で測定される回転半径に関係する。ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）のように置換基がほとんど又は全くない折り畳みポリペプチドは持続長が約１０オングストローム（Å）と短く、腫瘍組織のターゲティングには適さない。従って、本発明のランダム共重合体系Ｃ／Ａ錯体分子は好ましくは１００〜６００Åの持続長を有し、ＰＬＬのＣ／Ａ錯体分子よりもはるかに容易に腫瘍組織に濃縮する。適切な持続長の担体分子と活性薬剤との錯体を形成するため、ランダム共重合体出発原料は鎖内イオン結合が実質的にないか或いは低減している。
【００４２】
試験溶液内の夾雑粒子の影響で、分子によっては立体配座を決定するための光散乱法による持続長の測定が困難な場合もある。しかし、担体に結合した常磁性体の磁気共鳴（ＭＲ）Ｔ１緩和を測定することによって、分子の立体配座を推量できることが判明した。これは、ポリマー鎖に沿ったキレート剤にガドリニウムのような常磁性イオンを結合させることによって実施される。
【００４３】
担体分子が細長い立体配座を有する場合、キレート剤／ＭＲ活性体は主鎖への結合点で自由に回転し、ＭＲ信号の発生源である周囲の水プロトンのＴ１緩和時間が長くなる。
【００４４】
担体分子が球状又は高度に折り畳まれた立体配座を有する場合、立体障害及び分子の混み合いによってキレート剤／ＭＲ活性体との相互作用が起こり、主鎖との結合での回転が制約される。そのため、キレート剤／ＭＲ活性体は担体分子の全体的に緩慢な運動と共にしか運動しない。こうしてＴ１緩和時間が短くなる。
【００４５】
高い緩和度は、約１５ｓ−１・ｍＭ−１の卵白のように折り畳まって球状立体配座となる分子に付随する。低い緩和度は、高度置換Ｇｄ−ＤＴＰＡ ＰＬＬ．ｓｕｐ．ｈのような細長い分子に付随し、この分子ではＧｄが速く回転でき、約８ｓ−１・ｍＭ−１の緩和度を有する。本発明の最適な立体配座は７〜８ｓ−１・ｍＭ−１の緩和度に関連する。ペプチド剤の緩和度が高いときは、その取込み係数は一貫して低かったが、これがレプテーション機構が存在しないためであることは明らかである。
【００４６】
生体内の化学物質の多くは負電荷を有するので、被検者の体内に導入された分子が正味負電荷を有していると、凝集を低減し、血漿中での安定な長期循環を図るのに有利である。負に荷電したデキストラン分子は、正電荷又は中性電荷の同等のデキストラン分子よりも糸球体濾過される速度が格段に遅いことが知られている。
【００４７】
正味の負電荷が大きいと、Ｃ／Ａ錯体分子がその細長いミミズ状立体配座を保つのに役立つという点でも望ましい。
【００４８】
図４に、複数の側鎖で水素原子を置換した共重合体担体を示す。共重合体は複数のアミノ酸３１からなり、各アミノ酸３１は末端がポリペプチド結合で連結している。複数の側鎖残基３３が結合して、立体障害及び斥力を及ぼして共重合体鎖をまっすぐにしている。
【００４９】
図４には、共重合体の長さをその直径の約５〜５００倍とかなり長くすべきであることも示す。こうすることで、上述の通り、共重合体及び結合化学物質が腫瘍組織の孔を通って腫瘍間質に捕捉されるようになる。
【００５０】
多くの生体内分子が負電荷を有する傾向にあるため、血漿タンパク質との凝集を回避するためにもＣ／Ａ錯体分子が正味の負電荷を有していると有利である。また、正に荷電した分子は細胞表面（概して負に荷電している）に付着することも知られている。
【００５１】
本発明の組成物の一つの好ましい使用方法を実施するには、まず被検者を撮像し、次いで、本発明に係る共重合体系造影剤を静脈注射して被検者の体内に導入する。ポリマー系造影剤の投与量は約０．０１〜約０．１ミリモルＧｄ／ｋｇの範囲内であればよい。次いで、１以上の所定の組織部位で被検者を撮像する。被検者は、好ましくは注射直後から開始して所定の時間間隔で撮像する。好ましくは、この時間間隔は注射後短時間（１０分間以内）から注射後１時間までとする。２４時間後の画像も取得し得る。
【実施例】
【００５２】
実施例１
フラスコにアセトニトリルとＤＴＰＡを仕込む。次いで、トリエチルアミンをシリンジを介して添加する。溶液を窒素雰囲気下で６０℃に加熱する。混合物を均一になるまで攪拌する。透明な溶液を次いで窒素雰囲気下で−２８℃に冷却し、イソブチルクロロホルメートをゆっくりと添加してＤＴＰＡの無水物を得る。ＤＴＰＡの無水物をグルタミン酸−リジン共重合体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手、ｇｌｕ：ｌｙｓ＝６：４、重合数１４０）と７：１のＤＴＰＡ／リジン比で１２時間反応させた。生成物を５０℃で２０分間ロータリーエバポレーター処理した後、分画分子量３００００のメンブランフィルターでダイアフィルトレーションした。
【００５３】
収率は２２％であった。全有効リジンに対する非結合遊離リジンの分率は２０％であり、リジン／全残基数の当量をＴＮＢＳ法（Ｆｉｅｌｄｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２５：４６４−４６８ （１９７２）に記載）で求めたところ８％であった。Ｒ１すなわち２３℃でのＴ１緩和度は８．５ｍＭｓｅｃであった。リジン複合度は低い（２０％）ものの、グルタミン酸残基によるリジン正電荷の希釈による有効複合度は８％と極めて良好である。
【００５４】
ラット腫瘍モデルで撮像を行った。具体的には、ラット乳腺癌細胞（ＡＴＣＣ１３７６２、Ｍａｔ Ｂ細胞）をＦｉｓｈｅｒ ３４４メスラット（０．５ｍｌリン酸緩衝食塩水中細胞１０６個）に移植した。７〜９日後に腫瘍は直径約１０ｍｍとなり、この時点で撮像を行った。撮像は２Ｔで３３ｃｍボアのＧＥ ＣＳＩスキャナを用いて実施した。送受信にはバードケージ型直角コイルを用いた。Ｔ１強調画像を得た（ＴＲ＝２５０ｍｓ、ＴＥ＝１８ＭＳ、ＮＥＸ＝１６）。造影剤の注射前にラットを撮像した。造影剤は、０．０２５ミリモルＧｄ／ｋｇの投与量で尾静脈から注入した。注射後直ちにラットを撮像し、次いで２４時間後に撮像した。撮像効率は６７％の腫瘍強調であったのに対して、同じ投与量の球状薬剤（アルブミン（Ｇｄ）ＤＴＰＡ）又はコイル状薬剤（遊離リジン含有量２５〜３５％）では１５％であった。
【００５５】
実施例２
共重合体としてＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手した重合数１０１３の１：４ ｇｌｕ−ｌｙｓ共重合体を用いた点を除けば、実施例１の合成法に従った。収率は３０％であった。全有効リジンに対する非結合遊離リジンの分率は１２％であり、リジン／全残基数の当量は１０％であった。Ｒ１すなわち２３℃でのＴ１緩和度は７．９ｍＭｓｅｃであり、伸長共重合体と一致した極めて良好な値であった。２４時間後の腫瘍信号強調は３０％であった。この場合にも、球状ポリマー又はコイル状ポリマーで得られた信号強調は１０〜１５％にすぎなかった。
【００５６】
用途によっては、血液循環時間が長いのは望ましくない場合がある。本発明の方法／材料は、血液循環時間をある目標レベルに設定することができる所望のミミズ状立体配座の短鎖ポリマーを確実に製造する能力を提供する。血液循環時間はポリマー鎖長に直接依存する。短鎖ポリマーでは理論的予測によれば腫瘍強調は小さくなるが、応答は迅速で（１時間未満）、血液循環からのクリアランスは迅速であり、いずれもある臨床スクリーニング法では望ましい場合がある。いずれにせよ、本明細書書に記載した幾つかの実施形態に従って製造した短鎖ポリマーでは、腫瘍強調は現在ＦＤＡで認可されている造影剤Ｇｄ−ＤＴＰＡで得られる応答よりも２倍以上大きい。しかし、本発明の短鎖ランダム共重合体薬剤は、Ｇｄ−ＤＴＰＡほど迅速には腫瘍から洗い流されない。従って、臨床スクリーニング法は、現在用いられている低分子量薬剤よりも格段に単純化される。
【００５７】
従来技術の主鎖の短いポリマー材料の場合、標準的な合成スキームでは適切な立体配座を達成するのが通例困難である。おそらくは末端同士の相互作用のため、高いプロトン緩和度及び低い腫瘍強調効率で実証されるように伸長立体配座が達成されない。しかし、１４０残基しかないランダム共重合体を出発原料として同じ標準的な合成法を用いると、プロトン緩和度が小さく、生成物が伸長形態を取ることが示された。ラット腫瘍モデルでの腫瘍強調は標準的投与量の０．１ミリモルＧｄ／ｋｇで１６０％であるのに対して、９０残基の鎖長のＧｄ−ＤＴＰＡ−ポリリジンのコイル状薬剤では５％未満であり、低分子量造影剤のＧｄ−ＤＴＰＡでは７０％である。さらに、１４０残基の鎖長でのこの強調レベルは、伸長単独重合体について４７６残基の鎖長で観測される強調に鑑みてレプテーションプロセスから予測されるものと厳密に同じである。
【００５８】
腫瘍の視覚化に加えて、本発明に係る比較的短いランダム共重合体薬剤は他の用途にも好適に使用できる。血液クリアランス特性が比較的良好であるため、本発明の血管内ポリマー薬剤は血管造影法に有用であろう。また、筋肉、腎臓又は肝臓のような他の器官には蓄積しないようである。従って、本発明の薬剤は、動物モデルの肝臓及び腎臓に蓄積する傾向がみられる球状タンパク質やコイル状単独重合体をベースとした他の薬剤よりも薬物送達／撮像に好ましい。
【００５９】
本明細書では本発明の特定の実施形態について説明してきたたが、当業者が改変及び変更をなし得ることは明らかである。従って、特許請求の範囲は、本発明の要旨及び技術的範囲に属するあらゆる改変及び変形を包含することを意図したものである。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＳＨＭ（ＤＴＰＡ）を活性化して共重合体主鎖と反応させる反応スキームを示す図。
【図２】被検者における本発明に係る複合共重合体の作用を示す図。
【図３】ポリペプチドの鎖間架橋及び鎖内架橋を示す図。
【図４】本発明に係る高置換ポリペプチドを示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍組織の治療用、さらに具体的には腫瘍組織への薬物送達を最適化する改良複合ポリマーに関し、また腫瘍の診断撮像に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの医療処置では、所望の組織型に活性薬剤を蓄積させることが重要である。例えば、化学療法では、薬物が組織と接触するとその組織を破壊するので、正常組織ではなく癌性腫瘍組織にのみ薬物を送達することが重要である。もう一つの例として医用画像が挙げられる。腫瘍組織に特異的な担体分子に造影剤を結合させる。担体分子が腫瘍組織に濃縮されると、造影剤が組織の医用画像を増強する。
【０００３】
ポリ−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＡ）に結合した化学療法薬剤（例えばドキソルビシン）の使用については従前記載されている。用いられる担体分子の多くは、球状又は折り畳み立体配置を有するタンパク質である。
【０００４】
公知の担体分子の一つの類型は、正常組織の血管の孔よりも直径が大きく、腫瘍組織の血管の孔よりも直径の小さいポリペプチドを含むものである。米国特許第５７６２９０９号明細書を参照されたい。こうした担体は、長さが直径よりも数桁大きく、正味電荷は負であり、持続長の長いミミズ状の鎖状立体配座をなす。ランタニド錯体（例えば、ジエチレントリアミン五酢酸ガドリニウム錯体）をこうした担体分子に結合させて錯体分子を形成し、これを被検者の血管内に導入する。
【０００５】
これらの錯体分子はもっぱら腫瘍内皮の孔を通過して、腫瘍間質の線維構造と相互作用する。錯体分子による腫瘍間質への浸透は錯体分子のミミズ状立体配置によって促進され、かかる立体配置によって腫瘍間質の細胞外基質の固定障壁の周囲を錯体分子が「蛇行」できるようになる。
【特許文献１】米国特許第５７６２９０９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
錯体分子のミミズ状立体配置は、ポリペプチド鎖に沿って十分な数のジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）分子を結合させ、鎖内イオン結合を除去又は低減するとともに、ＤＴＰＡ基同士の電荷斥力によってポリマー鎖の折り畳みを解いて伸長させることによって達成される。置換の量（複合度ともいう。）は得られる錯体の立体配置に影響を与え、複合度が高いほど、ばらつきの少ない伸長構造を与え、ターゲティングが良好になる。残念なことに、９０％を上回る複合度を確実に達成するのは困難である。（Ｓｉｅｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， １， ６５ （１９９０）参照。）。置換度が９０％を上回るのは稀であり、無水物／リジン比を高くして反応時間を延ばしたとしても、７回の合成で１回程度である。それでも、単独重合体の場合に妥当なポリマー立体配置を実現するには、このレベルの置換度が必要とされる。
【０００７】
そこで、複合度を極端に高くしなくても、所望の立体配座を与えるポリペプチド−ＤＴＰＡ分子を提供できれば有益である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
グルタミン酸又はアスパラギン酸いずれかとリジンとの置換ランダム共重合体を用いると、直径が正常組織の血管の孔よりも大きく腫瘍組織の血管の孔よりも小さい担体分子の主鎖が得られる。この担体分子は、長さが直径の５〜５００倍であり、好ましくは正味電荷は負である。驚くべきことに、本発明の担体分子は、リジン残基の複合度が９０％未満であるにもかかわらず持続長の長いミミズ状鎖状立体配座を形成する。水性環境下では、負に荷電したグルタミン酸基が電荷斥力相互作用に寄与して鎖を伸ばすと考えられる。一方、水性環境で正に荷電していてポリマーの折り畳みに寄与する遊離リジンは、ポリマー鎖全体では幾分減少する。そこで、例えば、ポリマーにおけるグルタミン酸／リジン比が１：１であれば、２０％の非複合遊離リジンは正電荷の１０％しか表さない。
【０００９】
本発明の担体分子に活性薬剤を結合させて担体／活性薬剤（Ｃ／Ａ）錯体分子を形成し、被検者の血管内に導入する。これらのＣ／Ａ錯体分子はもっぱら腫瘍組織の内皮を通って腫瘍間質の線維構造と相互作用する。これらの分子の取込み及び保持は、コンパクトなペプチドコイルや球状タンパク質のような他の高分子で観察されるものの５倍を超える。Ｃ／Ａ錯体分子による腫瘍間質への浸透は、Ｃ／Ａ分子を、ミミズ状立体配置を有し、腫瘍間質の細胞外基質の固定障壁の周囲を「蛇行」できるように選択、つまり修飾するレプテーションプロセスによって促進することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の新規な特徴は特許請求の範囲に具体的に記載されているが、本発明の構成及び内容は、以下の詳細な説明を図面と共に参照することによって、他の課題及び特徴と併せてさらに十分に理解されよう。
【００１１】
本発明の方法は、担体分子をミミズ状立体配置とするのに必要な置換ポリペプチドの複合度を従来技術の分子よりも少なくするためランダム共重合体を用いる。本発明の方法及び材料は、置換ポリペプチドの造影剤又は薬物送達剤としての有効性を保持するが、従来技術の分子に比べて確実に達成できる低い複合度で有効性を保つ。
【００１２】
本発明の担体分子は、その物理的な大きさによってペプチド結合の回転を物理的に制限する基で置換されたランダム共重合体主鎖を含む。
【００１３】
担体分子の主鎖を形成するランダム共重合体は、グルタミン酸単位及びアスパラギン酸単位のいずれか又は両方とリジン単位とを含む。グルタミン及び／又はアスパラギン酸単位は、共重合体の約２０〜約６０％を構成し得る。好ましくは、共重合体はグルタミン酸−リジン共重合体である。ポリマーの長さは約３５〜約１５００残基又はそれ以上とし得る。特に有用な共重合体は、ｇｌｕ：ｌｙｓ比が約１：４〜約６：４のものである。リジン含有量が大きい方が、共重合体に常磁性イオンを多量に含ませることができるためイメージングに有利であると考えられる。いかなる理論にも束縛されるものではないが、共重合体主鎖におけるグルタミン酸残基の存在で以下に述べる二つの事柄が達成されると考えられる。第一に、グルタミン酸残基は、完全な構築体を合成するための剛性の高い初期共重合体主鎖を与えると考えられる。第二に、共重合体におけるグルタミン酸残基の存在によって、電荷斥力を通じて最終ポリマーの伸張が促進されると考えられる。適当な共重合体は当業者に公知の手法を用いて合成できる。適当な共重合体は様々な供給元から市販されてもいる。
【００１４】
共重合体のリジン基の少なくとも一部には立体障害分子（「ＳＨＭ」）が結合している。ＳＨＭは、その物理的な大きさによって、隣り合った立体障害分子同士に立体障害を与えて伸びた立体配座をもたらす分子である。好ましくは、ＳＨＭは電荷が中性であるか、或いは水性環境中でポリマー鎖に沿って負電荷を呈し、クーロン斥力によってポリマー主鎖をまっすぐに保つのに役立つ。
【００１５】
特に有用な実施形態では、ＳＨＭは画像形成体を含有しているか、或いは画像形成体をキレートしている。適当な画像形成体としては、常磁性体、及び例えばα粒子、γ粒子、β粒子又は陽電子のような粒子を放出する核反応を起こす物質が挙げられる。かかる画像形成体は当業者に公知である。γ放出体としては、例えば１１１Ｉｎ及び１５３Ｇｄが挙げられる。陽電子放出体としては、例えば８９Ｚｒがあり、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）撮像に用いることができる。
【００１６】
特に好ましい立体障害分子は常磁性体をキレートする分子である。当業者には自明であろうが、常磁性体には数種の遷移金属及びランタニドイオンがある。常磁性体と錯形成することが知られていて、ポリマーの折れ曲がりに抗する立体障害を与えるのに十分な大きさをもつ分子であればどんなものでもＳＨＭとして用いることができる。好ましくは、ＳＨＭから誘導され、ポリマー主鎖に存在する基は、水性環境中で正味の負電荷を呈する。ランタニドイオンをキレートする適当な分子としては、特に限定されないが、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（２−プロピオン酸）（ＤＯＴＭＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス［３−（４−カルボキシル）ブタン酸］、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（酢酸−メチルアミド）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（メチレンホスホン酸）、及びｐ−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＯＴＡ）が挙げられる。他のイオン（例えばＦｅ（III）、Ｍｎ（II）、Ｃｕ（II）等）とのキレートに有用な配位子としては、ビス（チオセミカルバゾン）及びその誘導体、ポルフィリン及びその誘導体、２，３−ビス（２−チオアセトアミド）プロピオネート及びその誘導体、Ｎ，Ｎ′−ビス（メルカプトアセチル）−２，３−ジアミノプロパノエート、並びにビス（アミノエタンチオール）及びその誘導体がある。
【００１７】
典型的には、共重合体主鎖にＳＨＭを結合させるため、ＳＨＭに活性化基を設ける。ＳＨＭに存在する活性化基は、共重合体と反応する任意の基でよい。適当な基としては、特に限定されないが、炭酸−無水炭酸混成基、アミン基、スクシンイミジル基及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）基がある。当業者には、所与のＳＨＭに活性化基を結合させる反応スキームは容易に想到されよう。
【００１８】
特に好ましい方法では、実質的単活性化立体障害分子（「ＳＨＭ」）を提供する。「活性化」という用語は、分子が共重合体鎖に共有結合できる官能基がＳＨＭに設けられていることを意味する。「実質的単活性化」という用語は、立体障害分子の約９０％以上が単一の活性部位のみを有することを意味する。
【００１９】
一実施形態では、ＳＨＭはＤＴＰＡであり、活性化基は炭酸−無水炭酸混成基である。ＤＴＰＡを活性化してポリペプチド主鎖と反応させるための典型的な反応スキームを図１に示す。図に示す通り、まず一無水物ＤＴＰＡを調製する。具体的には、フラスコにアセトニトリルとＤＴＰＡを仕込む。次いで、トリエチルアミンをシリンジを介して添加する。溶液を窒素雰囲気下で６０℃に加熱する。混合物は均一になるまで攪拌する。透明な溶液を次いで窒素雰囲気下で−４５℃に冷却し、イソブチルクロロホルメートをゆっくりと添加してＤＴＰＡの一無水物を得る。当業者には自明であろうが、ＤＴＰＡは無水物への転化に利用可能な酸基を５個有する。しかし、実質的単活性化ＤＴＰＡが望まれるので、これらの酸部位の１個のみを無水物に転化すればよい。意外にも、−４０℃未満に冷却しながらクロロホルメートをゆっくりと添加すると、こうした結果が得られる、つまりＤＴＰＡの約９０％以上がＤＴＰＡの一無水物になることが判明した。
【００２０】
この実質的単活性化ＳＨＭを次いで含リジンポリマーと反応させる。
【００２１】
共重合体を実質的単活性化ＳＨＭと反応させる正確な条件は、選択される共重合体及び用いるＳＨＭを始めとする幾つかの要因によって決まる。当業者には、所望の共重合体−ＳＨＭ複合体を形成する所与の一対の材料のための反応スキームは容易に想到されよう。
【００２２】
特に有用な実施形態では、例えば上述の一無水物ＤＴＰＡを周囲雰囲気条件下でポリ（リジン−コ−グルタミン酸）の水溶液に単に滴下する。
【００２３】
次いで、得られる共重合体−ＳＨＭ生成物を精製する。精製時に、共重合体−ＳＨＭ生成物を揮発性溶媒その他の不純物から分離する。共重合体−ＳＨＭ生成物の精製は公知の手段を用いて行うことができる。
【００２４】
特に有用な実施形態では、共重合体−ＳＨＭ生成物を完全には乾燥させないような精製法が用いられる。過度に乾燥すると、共重合体−ＳＨＭ生成物の立体配置に影響し、複合度の決定に干渉すると考えられる。
【００２５】
好ましい精製法では、まず反応混合物を減圧下に置いて、水よりも揮発性の高い不純物を除去する。このステップで反応混合物から水を完全に除去することがないように注意すべきである。この好ましい精製法の次のステップは、残りの反応混合物を遠心分離することである。可溶性不純物は上清に残る。遠心分離ステップからの保持液を再懸濁して透析に付す。適宜、透析後の共重合体で限外濾過を行う。これらのプロセスにおける技術は当業者の知見の範囲内にある。
【００２６】
次いで、得られる生成物の特性は、例えば高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）のような当業者に公知の技術を用いて決定できる。
【００２７】
複合共重合体を造影剤として用いる実施形態では、複合ポリマーに画像形成体を導入する。例えば、ＭＲ活性剤を得るには、共重合体−ＳＨＭ生成物に常磁性イオンを導入すればよい。例として、共重合体−ＳＨＭ生成物を含有する溶液（１５ｍＭ ＮａＨＣＯ３）にガドリニウム塩（例えばＧｄＣｌ３又はクエン酸ガドリニウムの０．１Ｍ ＨＣｌ溶液（Ｇｄ ５０ｍＭ））を滴下することによって、キレート用ＤＴＰＡ基にガドリニウムを結合させることができる。Ｇｄの滴下は、遊離Ｇｄ（利用可能なＤＴＰＡ基でキレートされていない）の指標が僅かに認められるまで続ける（ポリマー溶液の少量のアリコートを１０μＭのａｒｚｅｎｚｏ IIIIの酢酸緩衝液に添加すると、遊離Ｇｄで染料溶液が青くなる。）。こうしてＧｄを結合させた高複合共重合体は被検者の血管への導入準備が整ったものである。
【００２８】
ある実施形態では、複合ポリマーを薬物送達に用いることができる。例えば、ＳＨＭ自体が治療薬となると思料される。また、置換共重合体鎖の幾つかの部位に治療薬を結合させることもできると思料される。例として、抗腫瘍活性をもつことが判明している化学療法薬（例えばドキソルビシン又はメトトレキセートなど）を複合共重合体に結合させることができる。ここではドキソルビシンとメトトレキセートを具体的な化学療法薬として挙げたが、用いる特定のポリペプチドに結合できる公知の化学療法薬であればどんなものでも使用できる。また、リシンやアブリンのような植物毒素及び細菌毒素を用いてもよい。治療用には、９０Ｙ又は２１１Ａｔのような放射線治療薬を用いることもできる。
【００２９】
治療薬は、当業者に公知の手法を用いて複合共重合体に結合させることができる。また、治療薬を他の種類の活性薬剤と併用して複合共重合体に導入することもできると思料される。例えば、共重合体主鎖を、画像形成体とキレートする非治療型ＳＨＭと高度に結合させて、治療薬が主鎖に沿った少数の部位にのみ存在するようにすることができる。別の例として、共重合体主鎖を非治療型ＳＨＭと高度に結合させて、治療薬が共重合体主鎖に直接結合せず、ＳＨＭに結合させることもできる。
【００３０】
他の実施形態では、複合ポリマーを特定の組織のターゲティングに用いることができる。例えば、ＳＨＭ自体を標的剤とすることができると思料される。また、置換共重合体鎖に沿った幾つかの部位に標的剤を結合させることもできると思料される。標的薬は、当業者に公知の手法を用いて複合共重合体に結合させることができる。また、標的薬を他の種類の活性薬剤と併用して複合共重合体に導入することもできると思料される。例えば、共重合体主鎖を、画像形成体とキレートする非標的型ＳＨＭと高度に結合させて、標的薬が主鎖に沿った少数の部位にのみ存在するようにすることができる。別の例として、共重合体主鎖を非標的型ＳＨＭと高度に結合させて、標的薬が共重合体主鎖に直接結合せず、ＳＨＭに結合させることもできる。
【００３１】
図２に、正常組織から腫瘍組織３を通る血管１を示す。正常組織の血管の孔５は小さく、活性薬剤分子に結合したポリペプチド担体分子である担体／活性薬剤（Ｃ／Ａ）錯体分子１１は血管内に留まる。活性薬剤分子は、公知のコントラスト増強剤、薬剤、毒素、又は腫瘍組織を標的とする他の分子であってよい。腫瘍組織３の内部では、孔７は正常組織の孔５よりも格段に大きい。Ｃ／Ａ錯体分子１３が孔９を通って腫瘍３の間質空間に入るのを示してある。
【００３２】
或いは、孔は単なるチャネルではなく内皮の細胞外基質の線維網で擁していてもよい。レプテーションと呼ばれるプロセスによって、細長いミミズ状分子が障壁の周りをすり抜け、球状分子又はコイル状分子では通過することのできない制限された開口を通り抜けることができる。実験結果によれば、大部分の腫瘍チャネルが実際に内皮の単なる開口ではなくこの種の制限されたチャネルであることを示唆している。
【００３３】
腫瘍３の間質空間には間質１７が豊富に存在する。適切な立体配座、大きさ及び電荷をもつＣ／Ａ錯体分子１５が間質１７と絡み合って、腫瘍３の間質空間に捕捉されるようになるのを示してある。
【００３４】
本発明のＣ／Ａ錯体分子は好ましくは、断面直径が健常な内皮の孔よりも大きく正常組織の血管内に留まるが、腫瘍組織の血管の孔よりは小さくその孔から容易に出て間質空間に入り込むことができる。直径約２０〜５０Åの錯体分子は一般に腫瘍組織の孔構造を通るが、正常組織の孔構造は通らない。
【００３５】
腫瘍内部での濃縮に効果的なものとするため、Ｃ／Ａ錯体分子は好適には長さが血液内での循環時間を増すのに十分な長さをもつが、腫瘍間質に取り込まれるのに十分な短さのものである。いったん腫瘍間質に入ると、長い分子の方が、おそらく間質空間の間質と絡み合うことで、腫瘍間質に留まる傾向にある。
【００３６】
腫瘍組織におけるＣ／Ａ分子の濃縮は、鎖長に依存する次の二つのプロセスの所産である。
【００３７】
１．レプテーションによる腫瘍組織内への取込みが第一のプロセスであり、このプロセスではペプチド鎖の長さが増すほど取込みの有効性は低くなる。レプテーションによって障壁及び孔を通過することができても、分子が長いほど腫瘍間質への通過は遅くなる。このプロセスは周知であり、ゲル電気泳動でのＤＮＡ分子又は変性タンパク質の分離を起こす。
【００３８】
２．第二のプロセスは、腎臓の糸球体濾過で行われる血液循環からのＣ／Ａ錯体分子のクリアランスに関する。クリアランスは短い分子の方が速く、血漿寿命が短くなる。血漿寿命はペプチドの長さが増すと急激に増大するが、分子長が５００残基程度でプラトーに達し、寿命はそれ以上ほとんど変化しない。
【００３９】
高分子の立体配座が細長いミミズ状であると、折り畳み立体配座又は球状立体配座のような他の立体配座よりも取込みが増大する。立体配座は分子の持続長によって測定することができる。これは光散乱法で決定し得る。
【００４０】
立体配座は、鎖内電荷相互作用と分子の剛直性の結果である。Ｃ／Ａ担体分子はポリペプチドとして選択される。しかし、ポリペプチドの多くは、各ペプチド結合での回転が比較的自由なため折り畳まれて密なランダムコイルになる傾向がある。また、各ポリペプチドが反対電荷のアミノ酸からなる場合には、図３の結合２１で示すような鎖内電荷相互作用が生ずる。また、図３の結合２３で示すように鎖同士の間で鎖間電荷相互作用が起こることもある。鎖内電荷相互作用が有意に存在すると、Ｃ／Ａ錯体分子は球状又は折り畳み状の立体配座を取る可能性がある。
【００４１】
本発明のランダム共重合体担体分子で達成される立体配座は、基本的に伸び拡がった伸長鎖で折り畳みのほとんどないミミズ状の形態である。分子の「直線性」の尺度は持続長（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ）である。持続長は、光散乱実験で測定される回転半径に関係する。ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）のように置換基がほとんど又は全くない折り畳みポリペプチドは持続長が約１０オングストローム（Å）と短く、腫瘍組織のターゲティングには適さない。従って、本発明のランダム共重合体系Ｃ／Ａ錯体分子は好ましくは１００〜６００Åの持続長を有し、ＰＬＬのＣ／Ａ錯体分子よりもはるかに容易に腫瘍組織に濃縮する。適切な持続長の担体分子と活性薬剤との錯体を形成するため、ランダム共重合体出発原料は鎖内イオン結合が実質的にないか或いは低減している。
【００４２】
試験溶液内の夾雑粒子の影響で、分子によっては立体配座を決定するための光散乱法による持続長の測定が困難な場合もある。しかし、担体に結合した常磁性体の磁気共鳴（ＭＲ）Ｔ１緩和を測定することによって、分子の立体配座を推量できることが判明した。これは、ポリマー鎖に沿ったキレート剤にガドリニウムのような常磁性イオンを結合させることによって実施される。
【００４３】
担体分子が細長い立体配座を有する場合、キレート剤／ＭＲ活性体は主鎖への結合点で自由に回転し、ＭＲ信号の発生源である周囲の水プロトンのＴ１緩和時間が長くなる。
【００４４】
担体分子が球状又は高度に折り畳まれた立体配座を有する場合、立体障害及び分子の混み合いによってキレート剤／ＭＲ活性体との相互作用が起こり、主鎖との結合での回転が制約される。そのため、キレート剤／ＭＲ活性体は担体分子の全体的に緩慢な運動と共にしか運動しない。こうしてＴ１緩和時間が短くなる。
【００４５】
高い緩和度は、約１５ｓ−１・ｍＭ−１の卵白のように折り畳まって球状立体配座となる分子に付随する。低い緩和度は、高度置換Ｇｄ−ＤＴＰＡ ＰＬＬ．ｓｕｐ．ｈのような細長い分子に付随し、この分子ではＧｄが速く回転でき、約８ｓ−１・ｍＭ−１の緩和度を有する。本発明の最適な立体配座は７〜８ｓ−１・ｍＭ−１の緩和度に関連する。ペプチド剤の緩和度が高いときは、その取込み係数は一貫して低かったが、これがレプテーション機構が存在しないためであることは明らかである。
【００４６】
生体内の化学物質の多くは負電荷を有するので、被検者の体内に導入された分子が正味負電荷を有していると、凝集を低減し、血漿中での安定な長期循環を図るのに有利である。負に荷電したデキストラン分子は、正電荷又は中性電荷の同等のデキストラン分子よりも糸球体濾過される速度が格段に遅いことが知られている。
【００４７】
正味の負電荷が大きいと、Ｃ／Ａ錯体分子がその細長いミミズ状立体配座を保つのに役立つという点でも望ましい。
【００４８】
図４に、複数の側鎖で水素原子を置換した共重合体担体を示す。共重合体は複数のアミノ酸３１からなり、各アミノ酸３１は末端がポリペプチド結合で連結している。複数の側鎖残基３３が結合して、立体障害及び斥力を及ぼして共重合体鎖をまっすぐにしている。
【００４９】
図４には、共重合体の長さをその直径の約５〜５００倍とかなり長くすべきであることも示す。こうすることで、上述の通り、共重合体及び結合化学物質が腫瘍組織の孔を通って腫瘍間質に捕捉されるようになる。
【００５０】
多くの生体内分子が負電荷を有する傾向にあるため、血漿タンパク質との凝集を回避するためにもＣ／Ａ錯体分子が正味の負電荷を有していると有利である。また、正に荷電した分子は細胞表面（概して負に荷電している）に付着することも知られている。
【００５１】
本発明の組成物の一つの好ましい使用方法を実施するには、まず被検者を撮像し、次いで、本発明に係る共重合体系造影剤を静脈注射して被検者の体内に導入する。ポリマー系造影剤の投与量は約０．０１〜約０．１ミリモルＧｄ／ｋｇの範囲内であればよい。次いで、１以上の所定の組織部位で被検者を撮像する。被検者は、好ましくは注射直後から開始して所定の時間間隔で撮像する。好ましくは、この時間間隔は注射後短時間（１０分間以内）から注射後１時間までとする。２４時間後の画像も取得し得る。
【実施例】
【００５２】
実施例１
フラスコにアセトニトリルとＤＴＰＡを仕込む。次いで、トリエチルアミンをシリンジを介して添加する。溶液を窒素雰囲気下で６０℃に加熱する。混合物を均一になるまで攪拌する。透明な溶液を次いで窒素雰囲気下で−２８℃に冷却し、イソブチルクロロホルメートをゆっくりと添加してＤＴＰＡの無水物を得る。ＤＴＰＡの無水物をグルタミン酸−リジン共重合体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手、ｇｌｕ：ｌｙｓ＝６：４、重合数１４０）と７：１のＤＴＰＡ／リジン比で１２時間反応させた。生成物を５０℃で２０分間ロータリーエバポレーター処理した後、分画分子量３００００のメンブランフィルターでダイアフィルトレーションした。
【００５３】
収率は２２％であった。全有効リジンに対する非結合遊離リジンの分率は２０％であり、リジン／全残基数の当量をＴＮＢＳ法（Ｆｉｅｌｄｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２５：４６４−４６８ （１９７２）に記載）で求めたところ８％であった。Ｒ１すなわち２３℃でのＴ１緩和度は８．５ｍＭｓｅｃであった。リジン複合度は低い（２０％）ものの、グルタミン酸残基によるリジン正電荷の希釈による有効複合度は８％と極めて良好である。
【００５４】
ラット腫瘍モデルで撮像を行った。具体的には、ラット乳腺癌細胞（ＡＴＣＣ１３７６２、Ｍａｔ Ｂ細胞）をＦｉｓｈｅｒ ３４４メスラット（０．５ｍｌリン酸緩衝食塩水中細胞１０６個）に移植した。７〜９日後に腫瘍は直径約１０ｍｍとなり、この時点で撮像を行った。撮像は２Ｔで３３ｃｍボアのＧＥ ＣＳＩスキャナを用いて実施した。送受信にはバードケージ型直角コイルを用いた。Ｔ１強調画像を得た（ＴＲ＝２５０ｍｓ、ＴＥ＝１８ＭＳ、ＮＥＸ＝１６）。造影剤の注射前にラットを撮像した。造影剤は、０．０２５ミリモルＧｄ／ｋｇの投与量で尾静脈から注入した。注射後直ちにラットを撮像し、次いで２４時間後に撮像した。撮像効率は６７％の腫瘍強調であったのに対して、同じ投与量の球状薬剤（アルブミン（Ｇｄ）ＤＴＰＡ）又はコイル状薬剤（遊離リジン含有量２５〜３５％）では１５％であった。
【００５５】
実施例２
共重合体としてＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手した重合数１０１３の１：４ ｇｌｕ−ｌｙｓ共重合体を用いた点を除けば、実施例１の合成法に従った。収率は３０％であった。全有効リジンに対する非結合遊離リジンの分率は１２％であり、リジン／全残基数の当量は１０％であった。Ｒ１すなわち２３℃でのＴ１緩和度は７．９ｍＭｓｅｃであり、伸長共重合体と一致した極めて良好な値であった。２４時間後の腫瘍信号強調は３０％であった。この場合にも、球状ポリマー又はコイル状ポリマーで得られた信号強調は１０〜１５％にすぎなかった。
【００５６】
用途によっては、血液循環時間が長いのは望ましくない場合がある。本発明の方法／材料は、血液循環時間をある目標レベルに設定することができる所望のミミズ状立体配座の短鎖ポリマーを確実に製造する能力を提供する。血液循環時間はポリマー鎖長に直接依存する。短鎖ポリマーでは理論的予測によれば腫瘍強調は小さくなるが、応答は迅速で（１時間未満）、血液循環からのクリアランスは迅速であり、いずれもある臨床スクリーニング法では望ましい場合がある。いずれにせよ、本明細書書に記載した幾つかの実施形態に従って製造した短鎖ポリマーでは、腫瘍強調は現在ＦＤＡで認可されている造影剤Ｇｄ−ＤＴＰＡで得られる応答よりも２倍以上大きい。しかし、本発明の短鎖ランダム共重合体薬剤は、Ｇｄ−ＤＴＰＡほど迅速には腫瘍から洗い流されない。従って、臨床スクリーニング法は、現在用いられている低分子量薬剤よりも格段に単純化される。
【００５７】
従来技術の主鎖の短いポリマー材料の場合、標準的な合成スキームでは適切な立体配座を達成するのが通例困難である。おそらくは末端同士の相互作用のため、高いプロトン緩和度及び低い腫瘍強調効率で実証されるように伸長立体配座が達成されない。しかし、１４０残基しかないランダム共重合体を出発原料として同じ標準的な合成法を用いると、プロトン緩和度が小さく、生成物が伸長形態を取ることが示された。ラット腫瘍モデルでの腫瘍強調は標準的投与量の０．１ミリモルＧｄ／ｋｇで１６０％であるのに対して、９０残基の鎖長のＧｄ−ＤＴＰＡ−ポリリジンのコイル状薬剤では５％未満であり、低分子量造影剤のＧｄ−ＤＴＰＡでは７０％である。さらに、１４０残基の鎖長でのこの強調レベルは、伸長単独重合体について４７６残基の鎖長で観測される強調に鑑みてレプテーションプロセスから予測されるものと厳密に同じである。
【００５８】
腫瘍の視覚化に加えて、本発明に係る比較的短いランダム共重合体薬剤は他の用途にも好適に使用できる。血液クリアランス特性が比較的良好であるため、本発明の血管内ポリマー薬剤は血管造影法に有用であろう。また、筋肉、腎臓又は肝臓のような他の器官には蓄積しないようである。従って、本発明の薬剤は、動物モデルの肝臓及び腎臓に蓄積する傾向がみられる球状タンパク質やコイル状単独重合体をベースとした他の薬剤よりも薬物送達／撮像に好ましい。
【００５９】
本明細書では本発明の特定の実施形態について説明してきたたが、当業者が改変及び変更をなし得ることは明らかである。従って、特許請求の範囲は、本発明の要旨及び技術的範囲に属するあらゆる改変及び変形を包含することを意図したものである。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＳＨＭ（ＤＴＰＡ）を活性化して共重合体主鎖と反応させる反応スキームを示す図。
【図２】被検者における本発明に係る複合共重合体の作用を示す図。
【図３】ポリペプチドの鎖間架橋及び鎖内架橋を示す図。
【図４】本発明に係る高置換ポリペプチドを示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基からなる群から選択される１種以上のアミノ酸残基とリジン残基とを含有するポリペプチドを含んでなる分子であって、リジン残基の９０％未満が立体障害分子から誘導される基で置換されており、置換ポリペプチドがその平均直径の５〜５００倍の長さの立体配座を有している、分子。
【請求項２】
前記立体障害分子から誘導される基が、画像形成体をキレートできるものである、請求項１記載の分子。
【請求項３】
前記立体障害分子から誘導される基が常磁性体をキレートできるものである、請求項１記載の分子。
【請求項４】
前記立体障害分子が、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（２−プロピオン酸）（ＤＯＴＭＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス［３−（４−カルボキシル）ブタン酸］、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（酢酸メチルアミド）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（メチレンホスホン酸）、及びｐ−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＯＴＡ）、並びにビス（チオセミカルバゾン）、ビス（チオセミカルバゾン）誘導体、ポルフィリン、ポルフィリン誘導体、２，３−ビス（２−チオアセトアミド）プロピオネート、２，３−ビス（２−チオアセトアミド）プロピオネート誘導体、Ｎ，Ｎ′−ビス（メルカプトアセチル）−２，３−ジアミノプロパノエート、ビス（アミノエタンチオール）、及びビス（アミノエタンチオール）の誘導体からなる群から選択される、請求項１記載の分子。
【請求項５】
前記ポリペプチドがリジンとグルタミン酸とのランダム共重合体である、請求項１記載の分子。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、リジン残基とグルタミン酸残基を１：４〜６：４の比で含有している、請求項１記載の分子。
【請求項７】
前記ポリペプチドがグルタミン酸残基を２０〜６０％含有するランダム共重合体であって、当該ポリペプチドの残部がリジン残基である、請求項１記載の分子。
【請求項８】
前記ポリペプチドが３５〜１５００個のアミノ酸残基を含んでなる、請求項１記載の分子。
【請求項９】
前記置換ポリペプチドの平均直径が２０〜５０Åである、請求項１記載の分子。
【請求項１０】
前記ポリペプチドがリジンとグルタミン酸とのランダム共重合体であり、立体障害分子がジエチレントリアミン五酢酸である、請求項１記載の分子。
【請求項１１】
画像形成体をさらに含んでなる、請求項１記載の分子。
【請求項１２】
前記画像形成体が常磁性体である、請求項１１記載の分子。
【請求項１３】
前記画像形成体がランタニドイオンである、請求項１１記載の分子。
【請求項１４】
前記画像形成体がガドリニウムである、請求項１１記載の分子。
【請求項１５】
治療薬をさらに含んでなる、請求項１記載の分子。
【請求項１６】
標的薬をさらに含んでなる、請求項１記載の分子。
【請求項１７】
リジンとグルタミン酸とのランダム共重合体を含んでなる分子であって、リジン残基の９０％未満がジエチレントリアミン五酢酸から誘導される基で置換されており、置換共重合体がその平均直径の５〜５０倍の長さの立体配座を有していて、ジエチレントリアミン五酢酸から誘導される基の少なくとも一部がガドリニウムイオンと会合している、分子。
【請求項１８】
請求項１１記載の化合物を被検者に投与するステップ、及び
被検者を撮像するステップ
を含んでなる方法。
【請求項１９】
前記化合物が、ジエチレントリアミン五酢酸から誘導される基で置換されたリジンとグルタミン酸とのランダム共重合体であり、ジエチレントリアミン五酢酸から誘導される基の少なくとも一部がガドリニウムイオンと会合している、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物が０．０１〜約０．１ミリモルＧｄ／ｋｇの投与量で投与される、請求項１９記載の方法。
【請求項１】
グルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基からなる群から選択される１種以上のアミノ酸残基とリジン残基とを含有するポリペプチドを含んでなる分子であって、リジン残基の９０％未満が立体障害分子から誘導される基で置換されており、置換ポリペプチドがその平均直径の５〜５００倍の長さの立体配座を有している、分子。
【請求項２】
前記立体障害分子から誘導される基が、画像形成体をキレートできるものである、請求項１記載の分子。
【請求項３】
前記立体障害分子から誘導される基が常磁性体をキレートできるものである、請求項１記載の分子。
【請求項４】
前記立体障害分子が、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（２−プロピオン酸）（ＤＯＴＭＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス［３−（４−カルボキシル）ブタン酸］、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（酢酸メチルアミド）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（メチレンホスホン酸）、及びｐ−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＯＴＡ）、並びにビス（チオセミカルバゾン）、ビス（チオセミカルバゾン）誘導体、ポルフィリン、ポルフィリン誘導体、２，３−ビス（２−チオアセトアミド）プロピオネート、２，３−ビス（２−チオアセトアミド）プロピオネート誘導体、Ｎ，Ｎ′−ビス（メルカプトアセチル）−２，３−ジアミノプロパノエート、ビス（アミノエタンチオール）、及びビス（アミノエタンチオール）の誘導体からなる群から選択される、請求項１記載の分子。
【請求項５】
前記ポリペプチドがリジンとグルタミン酸とのランダム共重合体である、請求項１記載の分子。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、リジン残基とグルタミン酸残基を１：４〜６：４の比で含有している、請求項１記載の分子。
【請求項７】
前記ポリペプチドがグルタミン酸残基を２０〜６０％含有するランダム共重合体であって、当該ポリペプチドの残部がリジン残基である、請求項１記載の分子。
【請求項８】
前記ポリペプチドが３５〜１５００個のアミノ酸残基を含んでなる、請求項１記載の分子。
【請求項９】
前記置換ポリペプチドの平均直径が２０〜５０Åである、請求項１記載の分子。
【請求項１０】
前記ポリペプチドがリジンとグルタミン酸とのランダム共重合体であり、立体障害分子がジエチレントリアミン五酢酸である、請求項１記載の分子。
【請求項１１】
画像形成体をさらに含んでなる、請求項１記載の分子。
【請求項１２】
前記画像形成体が常磁性体である、請求項１１記載の分子。
【請求項１３】
前記画像形成体がランタニドイオンである、請求項１１記載の分子。
【請求項１４】
前記画像形成体がガドリニウムである、請求項１１記載の分子。
【請求項１５】
治療薬をさらに含んでなる、請求項１記載の分子。
【請求項１６】
標的薬をさらに含んでなる、請求項１記載の分子。
【請求項１７】
リジンとグルタミン酸とのランダム共重合体を含んでなる分子であって、リジン残基の９０％未満がジエチレントリアミン五酢酸から誘導される基で置換されており、置換共重合体がその平均直径の５〜５０倍の長さの立体配座を有していて、ジエチレントリアミン五酢酸から誘導される基の少なくとも一部がガドリニウムイオンと会合している、分子。
【請求項１８】
請求項１１記載の化合物を被検者に投与するステップ、及び
被検者を撮像するステップ
を含んでなる方法。
【請求項１９】
前記化合物が、ジエチレントリアミン五酢酸から誘導される基で置換されたリジンとグルタミン酸とのランダム共重合体であり、ジエチレントリアミン五酢酸から誘導される基の少なくとも一部がガドリニウムイオンと会合している、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物が０．０１〜約０．１ミリモルＧｄ／ｋｇの投与量で投与される、請求項１９記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００６−５０１２０４（Ｐ２００６−５０１２０４Ａ）
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５２４６９７（Ｐ２００４−５２４６９７）
【出願日】平成１５年７月２３日（２００３．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２２９１３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１１０３４
【国際公開日】平成１６年２月５日（２００４．２．５）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年７月２３日（２００３．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２２９１３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１１０３４
【国際公開日】平成１６年２月５日（２００４．２．５）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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