蛍光分光測定用光ファイバアセンブリ
サンプル中の対象分析物の存在を検出するシステムであって、細長い透明のサンプル容器と、該サンプルに光学的に接続される励起光源であって、該励起光源からの照射は該サンプルの長さ方向に配向され、かつ、該照射は該サンプルから放射される放射光を誘起する、励起光源と、該サンプルのホルダの周りに配置された少なくとも２つのリニアアレイであって、該リニアアレイがそれぞれ、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成され、該ファイバの該第１の末端は該容器の長さ方向に沿って、その近傍に配置され、各該アレイの該ファイバの該第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成し、該複数の光ファイバは該放射光を受光し、該ファイバの該第１の末端からの放射光を該ファイバの該第２の末端から構成される該末端ポートに送るリニアアレイとを備える、ことを特徴とするシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／２１１，２６４号（本明細書中にその全体が参照により含まれる）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府の権利に関する表明
本願は、米国エネルギー省によって与えられた、契約番号ＤＥ−ＡＣ５２−０６ ＮＡ ２５３９６に基づく政府の援助を用いてなされたものである。米国政府は本発明について所定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
本発明は、概して、サンプル中分析物の分光検出の向上のための、改良型光学構成のための装置および方法に関する。より詳細には、本発明は、プリオンおよび他の低レベル分析物の超高感度検出のための装置および方法に関する。
【０００４】
レーザ誘起蛍光法、ならびに、赤外分光法、紫外・可視分光法、燐光分析法などの他のタイプの分光測定を行う従来の方法では、分析するサンプルを入れるための小さな透明のキュベットが用いられる。標準的なキュベットのサイズは、約１ｃｍ×１ｃｍで高さ約３．５ｃｍであり、底がシールされる。このキュベットは通常石英ガラス製または光学品質のホウケイ酸ガラス製であり、場合により光学的に研磨され、反射防止膜が設けられている。キュベットは上部の開放端から充填され、この開放端には栓が用いられる場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
測定を行うには、キュベットを調査される流体で充填し、キュベットの一面を通して焦点合わせしたレーザで照射する。入射窓から９０度に配置されたキュベットの一面と直列にレンズが配置されてレーザで誘起された蛍光が集められ、これによりレーザ自身または他のノイズに由来する干渉が低減される。実際にはキュベットの少量のみがレーザによって照射されて検出可能な分光放射を生成する。立体角を理由としてレンズが分光放射のおよそ１０％しか拾わないという事実により、検出信号は非常に低いものとなる。この一般的なシステムが少なくとも７５年間用いられてきた。
【０００６】
米国特許出願第１１／６３４，５４６号（２００６年１２月７日出願）に記載の従前の改良によれば、当時の従来技術に対して１０倍程度検出信号の量を増大させることができ、蛍光化合物のマイクロモルでの検出を行うことができた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、この技術をさらに改良し、蛍光化合物のアトモル量の検出を可能とするものである。
【０００８】
以下、本発明のいくつかの非限定的な実施形態を記載する。
【０００９】
本発明の一実施形態によれば、サンプル中の対象分析物の存在を検出するシステムであって、細長い透明のサンプル容器と、該サンプルに光学的に接続される励起光源であって、該励起光源からの照射は該サンプルの長さ方向に配向され、かつ、該照射は該サンプルから放射される放射光を誘起する、励起光源と、該サンプルのホルダの周りに配置された少なくとも２つのリニアアレイであって、該リニアアレイがそれぞれ、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成され、該ファイバの該第１の末端は該容器の長さ方向に沿って、その近傍に配置され、各該アレイの該ファイバの該第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成し、該複数の光ファイバは該放射光を受光し、該ファイバの該第１の末端からの放射光を該ファイバの該第２の末端から構成される該末端ポートに送る、リニアアレイと、ｄ）該１つの末端ポートおよび１つの検出器に光学的に接続された末端ポートアセンブリと、を備えるシステムが提供される。
【００１０】
本発明の他の実施形態によれば、サンプル中の対象分析物の存在を検出するシステムであって、細長い透明のサンプル容器と、該サンプルと光学的に接続される励起光源であって、該励起光源からの照射は該サンプルの長さ方向に配向され、かつ、該照射は該サンプルから放射される蛍光放射光を誘起する、励起光源と、該サンプルのホルダの周りに１つの平面状アレイを構成し、隣接する該リニアアレイが互いに対して９０度に配向されている少なくとも４つのリニアアレイであって、該リニアアレイがそれぞれ、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成され、該ファイバの該第１の末端は該容器の長さ方向に沿ってその近傍に配置され、各該アレイの該ファイバの該第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成し、該複数の光ファイバは該放射光を受光し、該ファイバの該第１の末端からの放射光を該ファイバの該第２の末端から構成される該末端ポートに送る、リニアアレイと、該１つの末端ポートおよび１つの検出器に光学的に接続された末端ポートアセンブリであって、少なくとも１つのレンズを備える末端ポートアセンブリと、を備えるシステムが提供される。
【００１１】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル中の対象分析物の存在を検出する方法であって、細長い透明のサンプル容器を設けるステップと、該サンプルに光学的に接続される励起光源であって、該励起光源からの照射は該サンプルの長さ方向に配向され、かつ、該照射は該サンプルから放射される放射光を誘起する、励起光源を設けるステップと、該サンプルのホルダの周りに配置された少なくとも２つのリニアアレイであって、該リニアアレイがそれぞれ、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成され、該ファイバの該第１の末端は該容器の長さ方向に沿って、その近傍に配置され、各該アレイの該ファイバの該第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成し、該複数の光ファイバは該放射光を受光し、該ファイバの該第１の末端からの放射光を該ファイバの該第２の末端から構成される該末端ポートに送る、リニアアレイを設けるステップと、該１つの末端ポートおよび１つの検出器に光学的に接続された末端ポートアセンブリを設けるステップと、を含む方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態によれば、サンプル中の対象分析物の存在を検出する方法であって、細長い透明のサンプル容器を設けるステップと、該サンプルと光学的に接続される励起光源であって、該励起光源からの照射は該サンプルの長さ方向に配向され、かつ、該照射は該サンプルから放射される蛍光放射光を誘起する、励起光源を設けるステップと、該サンプルのホルダの周りに１つの平面状アレイを構成し、隣接する該リニアアレイが互いに対して９０度に配向されている少なくとも４つのリニアアレイであって、該リニアアレイがそれぞれ、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成され、該ファイバの該第１の末端は該容器の長さ方向に沿ってその近傍に配置され、各該アレイの該ファイバの該第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成し、該複数の光ファイバは該放射光を受光し、該ファイバの該第１の末端からの放射光を該ファイバの該第２の末端から構成される該末端ポートに送る、リニアアレイを設けるステップと、該１つの末端ポートおよび１つの検出器に光学的に接続された末端ポートアセンブリであって、少なくとも１つのレンズを備える末端ポートアセンブリを設けるステップと、を備える方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明にかかるシステムの一実施形態を示す概略図である。
【図２】本発明にかかる末端ポートアセンブリの一実施形態の側面を示す概略図である。
【図３】本発明にかかるサンプル容器の一実施形態を示す概略図である。
【図４】図３に示すサンプル容器を側面から見た概略図である。
【図５】図３に示すサンプル容器を上から見た概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、サンプル中の対象分析物の存在を検出するシステムに関する。対象分析物は生物学的性質または化学的性質を有するものであってよく、化学的部分（トキシン、代謝産物、薬物、残留薬物）、ペプチド、たんぱく質、細胞成分、ウイルスおよびこれらの組み合わせなどであってよいが、これらのものに限られない。対象分析物は、流体またはゲルなどの担持媒体のいずれに含まれていてもよい。一実施形態では、対象分析物はプリオン、特に細胞性プリオンたんぱく質（ＰｒＰＣ）の立体構造変化形態（ＰｒＰＳｃ）であり、プリオンは、凝集、不溶性、プロテアーゼ分解耐性、βシートリッチな二次構造といった特徴的な物理化学的性質および生化学的性質を有する。本明細書中で「プリオン」とは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）またはプリオン病の発生に関係する、たんぱく質性の感染性病原体の異常なアイソフォーム（たとえば、ＰｒＰＳｃ）を意味し、本明細書中においては、ヒトの疾患であるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、クールー病、ならびに、動物型の疾患であるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ、狂牛病として一般的に知られている）、慢性消耗病（ＣＷＤ）（オオシカおよびシカ）、スクレイピー（ヒツジ）を意味するが、これらのものに限られない。「たんぱく質性」とは、プリオンがたんぱく質および他の生化学的なものから構成されうることを意味し、したがってプリオンがたんぱく質のみから構成されることを示していないことを意味する。
【００１５】
サンプルは、サンプル３０７（図３）と光学的に接続される励起光源によって照射される。励起光源からの照射はたとえばサンプルの長さ方向に方向付けられている。励起光源としては、レーザ、フラッシュランプ、アークランプ、発光ダイオードなどが挙げられるが、これらのものに限られない。好ましくは、励起光源はレーザである。適したレーザの非限定の例としては、５３２ｎｍの共振型Ｎｄ：ＹＡＧレーザが挙げられる。サンプルを照射することによって、サンプルは放射光を発する。この放射光は蛍光、燐光、紫外線、可視光線、赤外線、ラマン散乱光およびこれらの組み合わせからなる群から選択可能である。一実施形態では、この放射光は蛍光である。放射光は、当業者には容易に明らかな方法によって、サンプル中の分析物の濃度と関連づけることができる。
【００１６】
図１は本発明にかかるシステム１００を示す。この実施形態では、細長い透明のサンプル容器３０６を収めるサンプルホルダ１０２から、４つのリニアアレイ１０１が末端ポート１０３へと延びている。末端ポート１０４の一端は末端ポートアセンブリ２００に挿入されている。リニアアレイは、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成されており、これらの複数の光ファイバは任意選択的に保護シースおよび／または絶縁シースで覆われている。ファイバの数は変えることができるが、一実施形態では、約１０乃至約１００、あるいは約２５乃至約７５、あるいは約５０である。リニアアレイの数は変えることができるが、少なくとも２である。光ファイバの第１の末端がサンプル容器を取り囲み、かつ、サンプル容器に（たとえば、約１ｍｍ乃至約１ｃｍで）非常に近接することができる十分な空間を提供できるほどに、サンプルホルダが十分大きくなければならないという点で、リニアアレイの最大数はサンプルホルダの大きさに依存する。一実施形態では、リニアアレイの数は２乃至１０、あるいは約４乃至６、あるいは４である。一実施形態では、リニアアレイは一つの平面状アレイを構成し、このとき隣接するアレイは互いに等距離に配置され、サンプルホルダを取り囲んでいる。リニアアレイの数が４であるとき、隣接するアレイは互いに対して９０度で配向される。リニアアレイの長さは幅広く変えることができるが、光ファイバの数および特性に依存する。その長さは、これらの光ファイバの一体性を損なうことなく各リニアアレイからの光ファイバを束ねることが可能な程度に十分でなければならない。基本的に光ファイバの長さに上限はなく、したがってサンプルの分析に用いられる診断設備から遠くにサンプルを配置することができる。
【００１７】
複数の光ファイバの第１の末端は、たとえば、サンプルを含む容器の長さ方向に実質的に直線状に配列される。複数の光ファイバの第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成する。換言すれば、各リニアアレイからのファイバの第２の末端の所定長さが纏められて１つの束を形成する。好ましくは、各リニアアレイからのファイバの第２の末端は、束の内でランダムに散在している。複数の光ファイバは対象分析物から発せられた放射光を受光し、ファイバの第１の末端からの放射光は、ファイバの第２の末端から構成される末端ポートに送られる。ファイバは高い開口数（ＮＡ）を有し、これはｓｉｎｅθ／２（θは入射光の受光角）に相応する。本発明において、ＮＡは約０．２０乃至約０．２５の範囲であり、受光角は約２０度乃至４５度である。受光角は、放射光の実質的に全てが複数のファイバによって捕捉可能であるように選択される。これにより、希釈分析物（ＰｒＰＳｃなど）の放射光の最適な収集効率が保証される。
【００１８】
一実施形態では、光ファイバは石英ガラスである。ファイバの直径は、たとえば、約５０μｍ乃至約４００μｍである。各リニアアレイからの光ファイバを束にすることにはいくつかの利点がある。各リニアアレイについて個別の検出器は必要とされず、１つの検出器を用いることができる。このことによって、４つのリニアアレイを含むシステムにおいて、検出用の領域は４つの個別の検出器の大きさの１／４となる。したがって、背景雑音は劇的に減少し、これは一方で信号雑音比を高め、検出限界を下げることとなる。一実施形態では、検出器のサイズは約０．５ｍｍ×０．５ｍｍ乃至約１ｍｍ×１ｍｍである。本発明にかかるシステムの検出限界は、分析物の少なくとも１アトモル、あるいは少なくとも２００アトモル、あるいは約０．１アトモル乃至約１．０アトモル、あるいは約０．１アトモル乃至約１ナノモル、あるいは約０．４アトモル乃至約１．０アトモルである。あるいは、システムの検出限界は分析物の少なくとも０．１アトグラム、あるいは、分析物の少なくとも１０アトグラムである。
【００１９】
図２は本発明にかかる末端アセンブリの一実施形態を示す。光ファイバの束から構成される１つの末端ポート１０４の一端は、末端アセンブリ２００の入口２０２に挿入されている。放射光は光ファイバによって末端アセンブリ２００を通って出口２０７へ送られ、その後、一方で検出器に接続されている出力用光ファイバ２０８に送られる。出力用光ファイバ２０８の直径は、たとえば、約３００μｍ乃至約５００μｍ、好ましくは約４００μｍである。したがって、末端ポートアセンブリによって１つの末端ポートが検出器に接続されている。末端ポートアセンブリはたとえば、入射放射光を平行にする第１のレンズ２０３を有する。末端ポートアセンブリはたとえば、出力される放射光を出力用光ファイバ２０８に適したＮＡに焦点合わせする第２のレンズ２０４をさらに有する。末端ポートアセンブリはたとえば、少なくとも１つのノッチフィルタ２０５および少なくとも１つの帯域フィルタ２０６をさらに有する。
【００２０】
適した検出器の非限定の例としては、光ダイオード検出器、光電子増倍管、電荷結合素子、光子計数装置、光学分光計およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００２１】
図３は本発明にかかる、適したサンプルホルダ１０２の一実施形態を示す。細長い透明の容器３０６がサンプルホルダ３００を通されるための空間が形成されるように、スペーサ３０３が配置されている。一実施形態では、サンプルホルダ３００は細管であり、ガラス、石英または他の当業者に知られている適切な材料から構成されている。たとえば、細管は１００μｌの流体を保持することができる。スペーサ３０３は、光ファイバの第１の末端が透明容器を包囲し、そのすぐ近傍にあるように、スロット３０４（または空間）が形成されるように設けられている。スペーサ３０３は、ネジ等の留め具３０１などの手段によってスペーサに取り付けられた上部板３０５と下部板３０２によって固定されている。
【００２２】
本発明にかかるシステムの別の利点は、レーザにパワーを与えるために必要とされる以外に、対象分析物からの放射光を収集し、検出するのに外部電源が必要とされないことである。このことによって、システムは簡素化され、可搬性が向上され、適用範囲は広くなる。さらに、外部電源がないことによって、克服されるべき背景雑音が低減され、これは一方で検出限界を下げることに貢献する。
【００２３】
捕捉される放射光は、光検出器によって電気信号に変換され、分析器（図示せず）に送られる。分析器はこの電気信号を受信し、分析物の存在についてサンプルを分析する。分析器の例は当業者にはよく知られている。分析器の例としては、電気信号の位相感度検出を可能にするロックインアンプ、または、本明細書中に記載の異なる種類の光検出器によって生成される電気信号を分析する当業者に知られた任意の他の手段が挙げられる。
【実施例】
【００２４】
実施例１
固相共振型Ｎｄ：ＹＡＧレーザ（Beam of Light Tech.（オレゴン州クラッカマス）製）からの時間変調光を、典型電力３０ｍＷで波長５３２ｎｍの持続波を用いて、細管の軸に沿って焦点合わせすることにより、サンプルを励起させる。この波長は参照物質であるローダミンの吸収ピークによく一致する。光ファイバアセンブリは、ほぼ細管の１／３の長さにわたって細管の外周の周りに互いに９０度で配置される４つのリニアアレイを含んで設計した。開口数（０．２２、または〜２３度の受光角）が大きいことから、このファイバの配置によってサンプルの視界は完全に覆われる。４つのリニアアレイによって収集された光は纏められ（すなわち、束ねられまたは組み合わされ）、ホログラフィノッチフィルタ（Kaiser Optical Systems（ミネソタ州アンアーバー）製）および帯域フィルタ（Omega Optical, Inc.（バーモント州ブラットルボロ）製）が取り付けられている移動式光学系に集められる。これらはそれぞれ、励起光源からの散乱光を除くため、および、レポーター染料の蛍光検出を帯域制限するために用いられる。光はその後１つのマルチモード４００μｍ光ファイバ（Thorlabs, Inc.（ニュージャージー州ニュートン）製）に戻されて焦点合わせされ、ＢＮＣコネクタに直接取り付けられた検出電子機器のプリアンプの低ノイズ光起電ダイオード検出器（United Detector Technology（カリフォルニア州ホーソーン）製）に出力される。放射光の検出には位相敏感性の「ロックイン」検出スキームが用いられる。励起光源は、検出システムに関する参照周波数を発生する光学チョッパ（Thorlabs, Inc.製）を用いて変調される。ダイオード検出器はトランスコンダクタンスプリアンプ（Stanford Research Systems, Inc.（カリフォルニア州サニーベール）製）の入力に取り付けられ、全体のラインインピーダンスを低減し、これらの低レベル信号のインピーダンスマッチングの難しさをなくす。信号はその後ロックインアンプ（Stanford Research Systems製）で検出され、ＬａｂＶｉｅｗ（登録商標）（National Instruments Inc.（テキサス州オースチン）製）プログラムでデータ取得が行われる。このプログラムは電圧の読み取りに関してロックインアンプを動作させる（pole）電子ストリップチャートから構成され、操作者に測定の時間履歴を周期的に表示し、ＡＳＣＩＩファイルにタイムスタンプとともに値を記録する。ロックインアンプの時定数は数十ヘルツの帯域を与えるように選択される。測定においては時定数として３秒を選択した。安定な読み取りのため、ロックインには持続時間においていくつかの時定数（本例では３乃至３０秒）が必要とされる。新たなサンプルをロードしてから信号が安定化した（２０乃至３０秒）後に、測定値を取得した。励起光源の変調およびロックイン検出器の参照周波数は７５３Ｈｚであり、環境ノイズを最少化するために選択したものである。これに加え、ロックインアンプを用いてライン周波数および２倍ライン周波数での信号のフィルタリングを行い、プリアンプ信号を変調周波数で帯域フィルタリングした。サンプルに対して１ｎＡ／Ｖのプリアンプ感度を選択し、１Ｍオームの入力インピーダンスが得られた。測定を行う際、１セットの開始手順を維持した。この手順とは、全ての電子機器（レーザ、ロックインアンプ、アンプ、プリアンプ）の１５分間のウォームアップ、システムが確実に適切に電気的に接地されているようにする暗信号レベルの視認チェック、安定性と出力レベルに関するチェックのためのレーザパワーの測定、レーザ配置の視認チェック、である。ベースライン信号のコントロール測定は蒸留脱イオン水を入れた細管を用いてチェックした。
【００２５】
濃度を低下させてローダミンレッドの蛍光放射を測定することにより、装置の感度限界をテストした。ローダミンレッドは０．０１アトグラム（ａｇ）［２０アトモル（ａｍ）］の濃度で検出可能であった。特異性および感度を、シカ、ハムスター、マウスおよびヒツジの全長組み替えＰｒＰ（ｒＰｒＰ）を用いたアッセイによって求めた。テストした種にかかわらず、ＰｒＰの検出可能限界は１０ａｇ以上であった。
【００２６】
健常なおよび感染したハムスター、シカおよびヒツジ由来脳ホモジェネートを、本発明にかかる方法における使用に関して調べた。１０％脳ホモジェネートのウェスタンブロットによって、出発材料中のＰｒＰＳｃの存在が確認された。完全なたんぱく質分解の確認として健常なハムスターの脳材料由来のＰｒＰＣの除去と共に行われるＰＫ分解後のＰｒＰＳｃがより低い分子量にシフトするという特徴的バンドを有する、典型的なＰｒＰバンドパターンがＰＫ処理前の１０％脳ホモジェネートにおいて明らかにされた。臨床動物由来の清浄剤抽出脳ホモジェネートの連続希釈から、ＰｒＰＳｃのウェスタンブロットによる検出限界は約１０−３乃至１０−４であり、キャプチャ酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によるＰｒＰＳｃの検出はさらに１０１乃至１０２倍希釈物に感度を有する（データ示さず）ことが示された。これに対し、同一のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）および脳ホモジェネートを用いて、本例で報告されるアッセイの感度は、ウェスタンブロットおよびキャプチャＥＬＩＳＡのそれを少なくとも５桁の大きさで上回った。本発明の方法を用いて、信号ベースライン（Ｓ／Ｂ）比が脳ホモジェネート中のＰｒＰの検出可能性の評価に用いられた。１．１を超えるＳ／Ｂ比がＰｒＰの存在を示すことがわかった。ハムスター、ヒツジおよびシカの健常および感染脳組織由来の、ＰＫ処理およびＰＫ非処理脳ホモジェネートの連続希釈物をＳＯＦＩＡでアッセイした。予想されたように、ＰＫ処理後の健常脳組織由来の全てのサンプルは、試験した濃度にかかわらず、１．１未満のＳ／Ｂ比を有し、ＰｒＰＣが存在しないことを示した。全ての信号出力または１．１を超えるＳ／Ｂ比によって示されるように、ＰＫ処理感染ハムスター脳ホモジェネートの、連続１０倍希釈物由来プロテアーゼ耐性ＰｒＰＳｃは、１０−１１の希釈物で検出可能であり、ヒツジおよびシカ由来のものについては１０−１０の希釈で検出可能であった。さらに、ＰＫ処理脳ホモジェネートからの最大ＰｒＰＳｃ検出は、ハムスターに関して１０−７乃至１０−８倍希釈の範囲であり、ヒツジおよびシカについても同様であった。
【００２７】
１０倍連続希釈ＰＫ非処理健常脳ホモジェネートの場合、ＳＯＦＩＡによって、ＰｒＰＣは、ハムスターに関しては１０−１１の希釈物で、シカおよびヒツジに関しては１０−１０の希釈物で検出可能であり（１０−６乃至１０−７の希釈物でピーク検出）、その後のＳ／Ｂ比は全て１．１未満に落ちた。２６３Ｋ感染ハムスター、スクレイピー感染ヒツジおよびＣＷＤ感染シカのＰＫ非処理脳組織由来のもののＳ／Ｂ比は、ＰｒＰの存在を示し続けた。関連組織由来の連続希釈脳ホモジェネートは全て、ヒツジおよびシカに関しては１０−１１の希釈物で（１０−７の希釈物でピーク検出）、ハムスターに関しては１０−１３の希釈物で（１０−８の希釈物でピーク検出）、１．１を超えるＳ／Ｂ値を示した。これらの結果は、プロテアーゼ非処理感染脳組織由来のＰｒＰが、ＰｒＰＣ検出可能なレベルを超えて希釈可能でありながらも、全てのＰｒＰＳｃを検出する能力が保持されていることを示す。これらの結果は、臨床疾患にある感染脳中のＰｒＰＣよりも、少なくともさらに１ｌｏｇ多い全ＰｒＰＳｃが存在することをさらに示唆する。このことを支持するものとして、ＰｒＰＳｃがスクレイピー感染中に脳内に蓄積され、ＰｒＰＣのそれよりも１０倍大きい濃度に達するということが先に報告されている。２６３Ｋ感染ハムスターに関する先に公開されたデータ（R. Atarashi et al. "Ultrasensitive detection of scrapie prion protein using seeded conversion of recombinant prion protein," Nature Meth. vol. 4 (2007) pp. 645-650）を用いると、ＳＯＦＩＡは、ＰＫ非処理ハムスター脳由来のＰｒＰＳｃについて約１０ａｇの検出限界を有する。ハムスターのデータの直接外挿によれば、１フェムトグラムのＰｒＰＳｃがヒツジおよびシカの脳材料から検出可能であることが示唆される。しかし、等しい抗体反応性を仮定すると、希釈サンプルのウェスタンブロットは、１グラム等量をベースとして、ハムスターの脳内には、ヒツジおよびシカの脳材料よりも少なくとも１０乃至１００倍多いＰｒＰＳｃが存在することが示唆され、これは、ヒツジおよびシカにおけるたんぱく質の検出が１０乃至１００ａｇまたはこれよりも良い範囲にあることを示唆した。
【００２８】
本発明の全ての実施形態において、他に特に言及しない限り、パーセントはすべて組成物全体の重量割合である。割合（ratio）はすべて、他に特に言及しない限り、重量割合である。範囲はすべて包括的でありかつ化合可能である。数値量はすべて、他に特に言及しない限り、「約」の語により修正されるものと理解される。
【００２９】
発明の詳細な説明において引用した全ての文献は、関連部分において、本明細書中にその全体が参照により含まれる。任意の文献の引用は、本発明に関する従来技術であることを認めるものであるとして理解されるべきではない。用語の任意の意味または定義が参照により含まれる文献の同一の用語の任意の意味または定義に反する場合、本願の書類において当該用語に与えられている意味または定義が優先される。
【００３０】
本発明の特定の実施形態について例示し、記載したが、種々の他の変更および修正が本発明の概念および範囲を逸脱すること無く行うことができることは当業者には明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲において、本発明の範囲内にあるかかる全ての変更および修正が含まれるものと理解される。
【符号の説明】
【００３１】
１００ システム、 １０１ リニアアレイ、 １０２ サンプルホルダ、 １０３ 末端ポート、 １０４ 末端ポート、 ２００ ポートアセンブリ、 ２０２ 出口、 ２０３ 第１のレンズ、 ２０４ 第２のレンズ、 ２０５ ノッチフィルタ、 ２０６ 帯域フィルタ、 ２０８ 光ファイバ、 ３００ サンプルホルダ、 ３０１ 留め具、 ３０２ 下部板、 ３０３ スペーサ、 ３０４ スロット、 ３０５ 上部板、 ３０６ 容器、 サンプルホルダ、 ３０７ サンプル
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／２１１，２６４号（本明細書中にその全体が参照により含まれる）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府の権利に関する表明
本願は、米国エネルギー省によって与えられた、契約番号ＤＥ−ＡＣ５２−０６ ＮＡ ２５３９６に基づく政府の援助を用いてなされたものである。米国政府は本発明について所定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
本発明は、概して、サンプル中分析物の分光検出の向上のための、改良型光学構成のための装置および方法に関する。より詳細には、本発明は、プリオンおよび他の低レベル分析物の超高感度検出のための装置および方法に関する。
【０００４】
レーザ誘起蛍光法、ならびに、赤外分光法、紫外・可視分光法、燐光分析法などの他のタイプの分光測定を行う従来の方法では、分析するサンプルを入れるための小さな透明のキュベットが用いられる。標準的なキュベットのサイズは、約１ｃｍ×１ｃｍで高さ約３．５ｃｍであり、底がシールされる。このキュベットは通常石英ガラス製または光学品質のホウケイ酸ガラス製であり、場合により光学的に研磨され、反射防止膜が設けられている。キュベットは上部の開放端から充填され、この開放端には栓が用いられる場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
測定を行うには、キュベットを調査される流体で充填し、キュベットの一面を通して焦点合わせしたレーザで照射する。入射窓から９０度に配置されたキュベットの一面と直列にレンズが配置されてレーザで誘起された蛍光が集められ、これによりレーザ自身または他のノイズに由来する干渉が低減される。実際にはキュベットの少量のみがレーザによって照射されて検出可能な分光放射を生成する。立体角を理由としてレンズが分光放射のおよそ１０％しか拾わないという事実により、検出信号は非常に低いものとなる。この一般的なシステムが少なくとも７５年間用いられてきた。
【０００６】
米国特許出願第１１／６３４，５４６号（２００６年１２月７日出願）に記載の従前の改良によれば、当時の従来技術に対して１０倍程度検出信号の量を増大させることができ、蛍光化合物のマイクロモルでの検出を行うことができた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、この技術をさらに改良し、蛍光化合物のアトモル量の検出を可能とするものである。
【０００８】
以下、本発明のいくつかの非限定的な実施形態を記載する。
【０００９】
本発明の一実施形態によれば、サンプル中の対象分析物の存在を検出するシステムであって、細長い透明のサンプル容器と、該サンプルに光学的に接続される励起光源であって、該励起光源からの照射は該サンプルの長さ方向に配向され、かつ、該照射は該サンプルから放射される放射光を誘起する、励起光源と、該サンプルのホルダの周りに配置された少なくとも２つのリニアアレイであって、該リニアアレイがそれぞれ、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成され、該ファイバの該第１の末端は該容器の長さ方向に沿って、その近傍に配置され、各該アレイの該ファイバの該第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成し、該複数の光ファイバは該放射光を受光し、該ファイバの該第１の末端からの放射光を該ファイバの該第２の末端から構成される該末端ポートに送る、リニアアレイと、ｄ）該１つの末端ポートおよび１つの検出器に光学的に接続された末端ポートアセンブリと、を備えるシステムが提供される。
【００１０】
本発明の他の実施形態によれば、サンプル中の対象分析物の存在を検出するシステムであって、細長い透明のサンプル容器と、該サンプルと光学的に接続される励起光源であって、該励起光源からの照射は該サンプルの長さ方向に配向され、かつ、該照射は該サンプルから放射される蛍光放射光を誘起する、励起光源と、該サンプルのホルダの周りに１つの平面状アレイを構成し、隣接する該リニアアレイが互いに対して９０度に配向されている少なくとも４つのリニアアレイであって、該リニアアレイがそれぞれ、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成され、該ファイバの該第１の末端は該容器の長さ方向に沿ってその近傍に配置され、各該アレイの該ファイバの該第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成し、該複数の光ファイバは該放射光を受光し、該ファイバの該第１の末端からの放射光を該ファイバの該第２の末端から構成される該末端ポートに送る、リニアアレイと、該１つの末端ポートおよび１つの検出器に光学的に接続された末端ポートアセンブリであって、少なくとも１つのレンズを備える末端ポートアセンブリと、を備えるシステムが提供される。
【００１１】
本発明の別の実施形態によれば、サンプル中の対象分析物の存在を検出する方法であって、細長い透明のサンプル容器を設けるステップと、該サンプルに光学的に接続される励起光源であって、該励起光源からの照射は該サンプルの長さ方向に配向され、かつ、該照射は該サンプルから放射される放射光を誘起する、励起光源を設けるステップと、該サンプルのホルダの周りに配置された少なくとも２つのリニアアレイであって、該リニアアレイがそれぞれ、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成され、該ファイバの該第１の末端は該容器の長さ方向に沿って、その近傍に配置され、各該アレイの該ファイバの該第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成し、該複数の光ファイバは該放射光を受光し、該ファイバの該第１の末端からの放射光を該ファイバの該第２の末端から構成される該末端ポートに送る、リニアアレイを設けるステップと、該１つの末端ポートおよび１つの検出器に光学的に接続された末端ポートアセンブリを設けるステップと、を含む方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態によれば、サンプル中の対象分析物の存在を検出する方法であって、細長い透明のサンプル容器を設けるステップと、該サンプルと光学的に接続される励起光源であって、該励起光源からの照射は該サンプルの長さ方向に配向され、かつ、該照射は該サンプルから放射される蛍光放射光を誘起する、励起光源を設けるステップと、該サンプルのホルダの周りに１つの平面状アレイを構成し、隣接する該リニアアレイが互いに対して９０度に配向されている少なくとも４つのリニアアレイであって、該リニアアレイがそれぞれ、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成され、該ファイバの該第１の末端は該容器の長さ方向に沿ってその近傍に配置され、各該アレイの該ファイバの該第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成し、該複数の光ファイバは該放射光を受光し、該ファイバの該第１の末端からの放射光を該ファイバの該第２の末端から構成される該末端ポートに送る、リニアアレイを設けるステップと、該１つの末端ポートおよび１つの検出器に光学的に接続された末端ポートアセンブリであって、少なくとも１つのレンズを備える末端ポートアセンブリを設けるステップと、を備える方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明にかかるシステムの一実施形態を示す概略図である。
【図２】本発明にかかる末端ポートアセンブリの一実施形態の側面を示す概略図である。
【図３】本発明にかかるサンプル容器の一実施形態を示す概略図である。
【図４】図３に示すサンプル容器を側面から見た概略図である。
【図５】図３に示すサンプル容器を上から見た概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、サンプル中の対象分析物の存在を検出するシステムに関する。対象分析物は生物学的性質または化学的性質を有するものであってよく、化学的部分（トキシン、代謝産物、薬物、残留薬物）、ペプチド、たんぱく質、細胞成分、ウイルスおよびこれらの組み合わせなどであってよいが、これらのものに限られない。対象分析物は、流体またはゲルなどの担持媒体のいずれに含まれていてもよい。一実施形態では、対象分析物はプリオン、特に細胞性プリオンたんぱく質（ＰｒＰＣ）の立体構造変化形態（ＰｒＰＳｃ）であり、プリオンは、凝集、不溶性、プロテアーゼ分解耐性、βシートリッチな二次構造といった特徴的な物理化学的性質および生化学的性質を有する。本明細書中で「プリオン」とは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）またはプリオン病の発生に関係する、たんぱく質性の感染性病原体の異常なアイソフォーム（たとえば、ＰｒＰＳｃ）を意味し、本明細書中においては、ヒトの疾患であるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、クールー病、ならびに、動物型の疾患であるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ、狂牛病として一般的に知られている）、慢性消耗病（ＣＷＤ）（オオシカおよびシカ）、スクレイピー（ヒツジ）を意味するが、これらのものに限られない。「たんぱく質性」とは、プリオンがたんぱく質および他の生化学的なものから構成されうることを意味し、したがってプリオンがたんぱく質のみから構成されることを示していないことを意味する。
【００１５】
サンプルは、サンプル３０７（図３）と光学的に接続される励起光源によって照射される。励起光源からの照射はたとえばサンプルの長さ方向に方向付けられている。励起光源としては、レーザ、フラッシュランプ、アークランプ、発光ダイオードなどが挙げられるが、これらのものに限られない。好ましくは、励起光源はレーザである。適したレーザの非限定の例としては、５３２ｎｍの共振型Ｎｄ：ＹＡＧレーザが挙げられる。サンプルを照射することによって、サンプルは放射光を発する。この放射光は蛍光、燐光、紫外線、可視光線、赤外線、ラマン散乱光およびこれらの組み合わせからなる群から選択可能である。一実施形態では、この放射光は蛍光である。放射光は、当業者には容易に明らかな方法によって、サンプル中の分析物の濃度と関連づけることができる。
【００１６】
図１は本発明にかかるシステム１００を示す。この実施形態では、細長い透明のサンプル容器３０６を収めるサンプルホルダ１０２から、４つのリニアアレイ１０１が末端ポート１０３へと延びている。末端ポート１０４の一端は末端ポートアセンブリ２００に挿入されている。リニアアレイは、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成されており、これらの複数の光ファイバは任意選択的に保護シースおよび／または絶縁シースで覆われている。ファイバの数は変えることができるが、一実施形態では、約１０乃至約１００、あるいは約２５乃至約７５、あるいは約５０である。リニアアレイの数は変えることができるが、少なくとも２である。光ファイバの第１の末端がサンプル容器を取り囲み、かつ、サンプル容器に（たとえば、約１ｍｍ乃至約１ｃｍで）非常に近接することができる十分な空間を提供できるほどに、サンプルホルダが十分大きくなければならないという点で、リニアアレイの最大数はサンプルホルダの大きさに依存する。一実施形態では、リニアアレイの数は２乃至１０、あるいは約４乃至６、あるいは４である。一実施形態では、リニアアレイは一つの平面状アレイを構成し、このとき隣接するアレイは互いに等距離に配置され、サンプルホルダを取り囲んでいる。リニアアレイの数が４であるとき、隣接するアレイは互いに対して９０度で配向される。リニアアレイの長さは幅広く変えることができるが、光ファイバの数および特性に依存する。その長さは、これらの光ファイバの一体性を損なうことなく各リニアアレイからの光ファイバを束ねることが可能な程度に十分でなければならない。基本的に光ファイバの長さに上限はなく、したがってサンプルの分析に用いられる診断設備から遠くにサンプルを配置することができる。
【００１７】
複数の光ファイバの第１の末端は、たとえば、サンプルを含む容器の長さ方向に実質的に直線状に配列される。複数の光ファイバの第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成する。換言すれば、各リニアアレイからのファイバの第２の末端の所定長さが纏められて１つの束を形成する。好ましくは、各リニアアレイからのファイバの第２の末端は、束の内でランダムに散在している。複数の光ファイバは対象分析物から発せられた放射光を受光し、ファイバの第１の末端からの放射光は、ファイバの第２の末端から構成される末端ポートに送られる。ファイバは高い開口数（ＮＡ）を有し、これはｓｉｎｅθ／２（θは入射光の受光角）に相応する。本発明において、ＮＡは約０．２０乃至約０．２５の範囲であり、受光角は約２０度乃至４５度である。受光角は、放射光の実質的に全てが複数のファイバによって捕捉可能であるように選択される。これにより、希釈分析物（ＰｒＰＳｃなど）の放射光の最適な収集効率が保証される。
【００１８】
一実施形態では、光ファイバは石英ガラスである。ファイバの直径は、たとえば、約５０μｍ乃至約４００μｍである。各リニアアレイからの光ファイバを束にすることにはいくつかの利点がある。各リニアアレイについて個別の検出器は必要とされず、１つの検出器を用いることができる。このことによって、４つのリニアアレイを含むシステムにおいて、検出用の領域は４つの個別の検出器の大きさの１／４となる。したがって、背景雑音は劇的に減少し、これは一方で信号雑音比を高め、検出限界を下げることとなる。一実施形態では、検出器のサイズは約０．５ｍｍ×０．５ｍｍ乃至約１ｍｍ×１ｍｍである。本発明にかかるシステムの検出限界は、分析物の少なくとも１アトモル、あるいは少なくとも２００アトモル、あるいは約０．１アトモル乃至約１．０アトモル、あるいは約０．１アトモル乃至約１ナノモル、あるいは約０．４アトモル乃至約１．０アトモルである。あるいは、システムの検出限界は分析物の少なくとも０．１アトグラム、あるいは、分析物の少なくとも１０アトグラムである。
【００１９】
図２は本発明にかかる末端アセンブリの一実施形態を示す。光ファイバの束から構成される１つの末端ポート１０４の一端は、末端アセンブリ２００の入口２０２に挿入されている。放射光は光ファイバによって末端アセンブリ２００を通って出口２０７へ送られ、その後、一方で検出器に接続されている出力用光ファイバ２０８に送られる。出力用光ファイバ２０８の直径は、たとえば、約３００μｍ乃至約５００μｍ、好ましくは約４００μｍである。したがって、末端ポートアセンブリによって１つの末端ポートが検出器に接続されている。末端ポートアセンブリはたとえば、入射放射光を平行にする第１のレンズ２０３を有する。末端ポートアセンブリはたとえば、出力される放射光を出力用光ファイバ２０８に適したＮＡに焦点合わせする第２のレンズ２０４をさらに有する。末端ポートアセンブリはたとえば、少なくとも１つのノッチフィルタ２０５および少なくとも１つの帯域フィルタ２０６をさらに有する。
【００２０】
適した検出器の非限定の例としては、光ダイオード検出器、光電子増倍管、電荷結合素子、光子計数装置、光学分光計およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００２１】
図３は本発明にかかる、適したサンプルホルダ１０２の一実施形態を示す。細長い透明の容器３０６がサンプルホルダ３００を通されるための空間が形成されるように、スペーサ３０３が配置されている。一実施形態では、サンプルホルダ３００は細管であり、ガラス、石英または他の当業者に知られている適切な材料から構成されている。たとえば、細管は１００μｌの流体を保持することができる。スペーサ３０３は、光ファイバの第１の末端が透明容器を包囲し、そのすぐ近傍にあるように、スロット３０４（または空間）が形成されるように設けられている。スペーサ３０３は、ネジ等の留め具３０１などの手段によってスペーサに取り付けられた上部板３０５と下部板３０２によって固定されている。
【００２２】
本発明にかかるシステムの別の利点は、レーザにパワーを与えるために必要とされる以外に、対象分析物からの放射光を収集し、検出するのに外部電源が必要とされないことである。このことによって、システムは簡素化され、可搬性が向上され、適用範囲は広くなる。さらに、外部電源がないことによって、克服されるべき背景雑音が低減され、これは一方で検出限界を下げることに貢献する。
【００２３】
捕捉される放射光は、光検出器によって電気信号に変換され、分析器（図示せず）に送られる。分析器はこの電気信号を受信し、分析物の存在についてサンプルを分析する。分析器の例は当業者にはよく知られている。分析器の例としては、電気信号の位相感度検出を可能にするロックインアンプ、または、本明細書中に記載の異なる種類の光検出器によって生成される電気信号を分析する当業者に知られた任意の他の手段が挙げられる。
【実施例】
【００２４】
実施例１
固相共振型Ｎｄ：ＹＡＧレーザ（Beam of Light Tech.（オレゴン州クラッカマス）製）からの時間変調光を、典型電力３０ｍＷで波長５３２ｎｍの持続波を用いて、細管の軸に沿って焦点合わせすることにより、サンプルを励起させる。この波長は参照物質であるローダミンの吸収ピークによく一致する。光ファイバアセンブリは、ほぼ細管の１／３の長さにわたって細管の外周の周りに互いに９０度で配置される４つのリニアアレイを含んで設計した。開口数（０．２２、または〜２３度の受光角）が大きいことから、このファイバの配置によってサンプルの視界は完全に覆われる。４つのリニアアレイによって収集された光は纏められ（すなわち、束ねられまたは組み合わされ）、ホログラフィノッチフィルタ（Kaiser Optical Systems（ミネソタ州アンアーバー）製）および帯域フィルタ（Omega Optical, Inc.（バーモント州ブラットルボロ）製）が取り付けられている移動式光学系に集められる。これらはそれぞれ、励起光源からの散乱光を除くため、および、レポーター染料の蛍光検出を帯域制限するために用いられる。光はその後１つのマルチモード４００μｍ光ファイバ（Thorlabs, Inc.（ニュージャージー州ニュートン）製）に戻されて焦点合わせされ、ＢＮＣコネクタに直接取り付けられた検出電子機器のプリアンプの低ノイズ光起電ダイオード検出器（United Detector Technology（カリフォルニア州ホーソーン）製）に出力される。放射光の検出には位相敏感性の「ロックイン」検出スキームが用いられる。励起光源は、検出システムに関する参照周波数を発生する光学チョッパ（Thorlabs, Inc.製）を用いて変調される。ダイオード検出器はトランスコンダクタンスプリアンプ（Stanford Research Systems, Inc.（カリフォルニア州サニーベール）製）の入力に取り付けられ、全体のラインインピーダンスを低減し、これらの低レベル信号のインピーダンスマッチングの難しさをなくす。信号はその後ロックインアンプ（Stanford Research Systems製）で検出され、ＬａｂＶｉｅｗ（登録商標）（National Instruments Inc.（テキサス州オースチン）製）プログラムでデータ取得が行われる。このプログラムは電圧の読み取りに関してロックインアンプを動作させる（pole）電子ストリップチャートから構成され、操作者に測定の時間履歴を周期的に表示し、ＡＳＣＩＩファイルにタイムスタンプとともに値を記録する。ロックインアンプの時定数は数十ヘルツの帯域を与えるように選択される。測定においては時定数として３秒を選択した。安定な読み取りのため、ロックインには持続時間においていくつかの時定数（本例では３乃至３０秒）が必要とされる。新たなサンプルをロードしてから信号が安定化した（２０乃至３０秒）後に、測定値を取得した。励起光源の変調およびロックイン検出器の参照周波数は７５３Ｈｚであり、環境ノイズを最少化するために選択したものである。これに加え、ロックインアンプを用いてライン周波数および２倍ライン周波数での信号のフィルタリングを行い、プリアンプ信号を変調周波数で帯域フィルタリングした。サンプルに対して１ｎＡ／Ｖのプリアンプ感度を選択し、１Ｍオームの入力インピーダンスが得られた。測定を行う際、１セットの開始手順を維持した。この手順とは、全ての電子機器（レーザ、ロックインアンプ、アンプ、プリアンプ）の１５分間のウォームアップ、システムが確実に適切に電気的に接地されているようにする暗信号レベルの視認チェック、安定性と出力レベルに関するチェックのためのレーザパワーの測定、レーザ配置の視認チェック、である。ベースライン信号のコントロール測定は蒸留脱イオン水を入れた細管を用いてチェックした。
【００２５】
濃度を低下させてローダミンレッドの蛍光放射を測定することにより、装置の感度限界をテストした。ローダミンレッドは０．０１アトグラム（ａｇ）［２０アトモル（ａｍ）］の濃度で検出可能であった。特異性および感度を、シカ、ハムスター、マウスおよびヒツジの全長組み替えＰｒＰ（ｒＰｒＰ）を用いたアッセイによって求めた。テストした種にかかわらず、ＰｒＰの検出可能限界は１０ａｇ以上であった。
【００２６】
健常なおよび感染したハムスター、シカおよびヒツジ由来脳ホモジェネートを、本発明にかかる方法における使用に関して調べた。１０％脳ホモジェネートのウェスタンブロットによって、出発材料中のＰｒＰＳｃの存在が確認された。完全なたんぱく質分解の確認として健常なハムスターの脳材料由来のＰｒＰＣの除去と共に行われるＰＫ分解後のＰｒＰＳｃがより低い分子量にシフトするという特徴的バンドを有する、典型的なＰｒＰバンドパターンがＰＫ処理前の１０％脳ホモジェネートにおいて明らかにされた。臨床動物由来の清浄剤抽出脳ホモジェネートの連続希釈から、ＰｒＰＳｃのウェスタンブロットによる検出限界は約１０−３乃至１０−４であり、キャプチャ酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によるＰｒＰＳｃの検出はさらに１０１乃至１０２倍希釈物に感度を有する（データ示さず）ことが示された。これに対し、同一のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）および脳ホモジェネートを用いて、本例で報告されるアッセイの感度は、ウェスタンブロットおよびキャプチャＥＬＩＳＡのそれを少なくとも５桁の大きさで上回った。本発明の方法を用いて、信号ベースライン（Ｓ／Ｂ）比が脳ホモジェネート中のＰｒＰの検出可能性の評価に用いられた。１．１を超えるＳ／Ｂ比がＰｒＰの存在を示すことがわかった。ハムスター、ヒツジおよびシカの健常および感染脳組織由来の、ＰＫ処理およびＰＫ非処理脳ホモジェネートの連続希釈物をＳＯＦＩＡでアッセイした。予想されたように、ＰＫ処理後の健常脳組織由来の全てのサンプルは、試験した濃度にかかわらず、１．１未満のＳ／Ｂ比を有し、ＰｒＰＣが存在しないことを示した。全ての信号出力または１．１を超えるＳ／Ｂ比によって示されるように、ＰＫ処理感染ハムスター脳ホモジェネートの、連続１０倍希釈物由来プロテアーゼ耐性ＰｒＰＳｃは、１０−１１の希釈物で検出可能であり、ヒツジおよびシカ由来のものについては１０−１０の希釈で検出可能であった。さらに、ＰＫ処理脳ホモジェネートからの最大ＰｒＰＳｃ検出は、ハムスターに関して１０−７乃至１０−８倍希釈の範囲であり、ヒツジおよびシカについても同様であった。
【００２７】
１０倍連続希釈ＰＫ非処理健常脳ホモジェネートの場合、ＳＯＦＩＡによって、ＰｒＰＣは、ハムスターに関しては１０−１１の希釈物で、シカおよびヒツジに関しては１０−１０の希釈物で検出可能であり（１０−６乃至１０−７の希釈物でピーク検出）、その後のＳ／Ｂ比は全て１．１未満に落ちた。２６３Ｋ感染ハムスター、スクレイピー感染ヒツジおよびＣＷＤ感染シカのＰＫ非処理脳組織由来のもののＳ／Ｂ比は、ＰｒＰの存在を示し続けた。関連組織由来の連続希釈脳ホモジェネートは全て、ヒツジおよびシカに関しては１０−１１の希釈物で（１０−７の希釈物でピーク検出）、ハムスターに関しては１０−１３の希釈物で（１０−８の希釈物でピーク検出）、１．１を超えるＳ／Ｂ値を示した。これらの結果は、プロテアーゼ非処理感染脳組織由来のＰｒＰが、ＰｒＰＣ検出可能なレベルを超えて希釈可能でありながらも、全てのＰｒＰＳｃを検出する能力が保持されていることを示す。これらの結果は、臨床疾患にある感染脳中のＰｒＰＣよりも、少なくともさらに１ｌｏｇ多い全ＰｒＰＳｃが存在することをさらに示唆する。このことを支持するものとして、ＰｒＰＳｃがスクレイピー感染中に脳内に蓄積され、ＰｒＰＣのそれよりも１０倍大きい濃度に達するということが先に報告されている。２６３Ｋ感染ハムスターに関する先に公開されたデータ（R. Atarashi et al. "Ultrasensitive detection of scrapie prion protein using seeded conversion of recombinant prion protein," Nature Meth. vol. 4 (2007) pp. 645-650）を用いると、ＳＯＦＩＡは、ＰＫ非処理ハムスター脳由来のＰｒＰＳｃについて約１０ａｇの検出限界を有する。ハムスターのデータの直接外挿によれば、１フェムトグラムのＰｒＰＳｃがヒツジおよびシカの脳材料から検出可能であることが示唆される。しかし、等しい抗体反応性を仮定すると、希釈サンプルのウェスタンブロットは、１グラム等量をベースとして、ハムスターの脳内には、ヒツジおよびシカの脳材料よりも少なくとも１０乃至１００倍多いＰｒＰＳｃが存在することが示唆され、これは、ヒツジおよびシカにおけるたんぱく質の検出が１０乃至１００ａｇまたはこれよりも良い範囲にあることを示唆した。
【００２８】
本発明の全ての実施形態において、他に特に言及しない限り、パーセントはすべて組成物全体の重量割合である。割合（ratio）はすべて、他に特に言及しない限り、重量割合である。範囲はすべて包括的でありかつ化合可能である。数値量はすべて、他に特に言及しない限り、「約」の語により修正されるものと理解される。
【００２９】
発明の詳細な説明において引用した全ての文献は、関連部分において、本明細書中にその全体が参照により含まれる。任意の文献の引用は、本発明に関する従来技術であることを認めるものであるとして理解されるべきではない。用語の任意の意味または定義が参照により含まれる文献の同一の用語の任意の意味または定義に反する場合、本願の書類において当該用語に与えられている意味または定義が優先される。
【００３０】
本発明の特定の実施形態について例示し、記載したが、種々の他の変更および修正が本発明の概念および範囲を逸脱すること無く行うことができることは当業者には明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲において、本発明の範囲内にあるかかる全ての変更および修正が含まれるものと理解される。
【符号の説明】
【００３１】
１００ システム、 １０１ リニアアレイ、 １０２ サンプルホルダ、 １０３ 末端ポート、 １０４ 末端ポート、 ２００ ポートアセンブリ、 ２０２ 出口、 ２０３ 第１のレンズ、 ２０４ 第２のレンズ、 ２０５ ノッチフィルタ、 ２０６ 帯域フィルタ、 ２０８ 光ファイバ、 ３００ サンプルホルダ、 ３０１ 留め具、 ３０２ 下部板、 ３０３ スペーサ、 ３０４ スロット、 ３０５ 上部板、 ３０６ 容器、 サンプルホルダ、 ３０７ サンプル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の対象分析物の存在を検出するシステムであって、
ａ）細長い透明のサンプル容器と、
ｂ）該サンプルに光学的に接続される励起光源であって、該励起光源からの照射は該サンプルの長さ方向に配向され、かつ、該照射は該サンプルから放射される放射光を誘起する、励起光源と、
ｃ）該サンプルのホルダの周りに配置された少なくとも２つのリニアアレイであって、該リニアアレイがそれぞれ、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成され、
ｉ）該ファイバの該第１の末端は該容器の長さ方向に沿って、その近傍に配置され、
ｉｉ）各該アレイの該ファイバの該第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成し、
ｉｉｉ）該複数の光ファイバは該放射光を受光し、該ファイバの該第１の末端からの放射光を該ファイバの該第２の末端から構成される該末端ポートに送る、
リニアアレイと、
ｄ）該１つの末端ポートおよび１つの検出器に光学的に接続された末端ポートアセンブリと、
を備える、ことを特徴とするシステム。
【請求項２】
前記末端ポートアセンブリは、少なくとも１つのレンズをさらに備える、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
前記末端ポートアセンブリは、ノッチフィルタをさらに備える、請求項１記載のシステム。
【請求項４】
前記末端ポートアセンブリは、帯域フィルタをさらに備える、請求項１記載のシステム。
【請求項５】
４つの前記リニアアレイを備える、請求項１記載のシステム。
【請求項６】
前記複数のリニアアレイは１つの平面状アレイを構成し、隣接する前記リニアアレイは互いに対して９０度に配向されている、請求項４記載のシステム。
【請求項７】
前記励起光源はレーザである、請求項１記載のシステム。
【請求項８】
前記放射光は、蛍光、燐光、紫外線、可視光線、赤外線、ラマン散乱光およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１記載のシステム。
【請求項９】
各前記アレイの前記ファイバの前記第２の末端は、ランダムな順で束ねられている、請求項１記載のシステム。
【請求項１０】
電源に接続されていない、請求項１記載のシステム。
【請求項１１】
前記検出器は約０．５ｍｍ×０．５ｍｍ乃至約１ｍｍ×１ｍｍのサイズを有する、請求項１記載のシステム。
【請求項１２】
各前記リニアアレイは、約１０乃至約１００の前記ファイバから構成される、請求項１記載のシステム。
【請求項１３】
前記光ファイバは、約２０度乃至約４５度の受光角を有する、請求項１記載のシステム。
【請求項１４】
サンプル中の対象分析物の存在を検出するシステムであって、
ａ）細長い透明のサンプル容器と、
ｂ）該サンプルと光学的に接続される励起光源であって、該励起光源からの照射は該サンプルの長さ方向に配向され、かつ、該照射は該サンプルから放射される蛍光放射光を誘起する、励起光源と、
ｃ）該サンプルのホルダの周りに１つの平面状アレイを構成し、隣接する該リニアアレイが互いに対して９０度に配向されている少なくとも４つのリニアアレイであって、該リニアアレイがそれぞれ、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成され、
ｉ）該ファイバの該第１の末端は該容器の長さ方向に沿ってその近傍に配置され、
ｉｉ）各該アレイの該ファイバの該第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成し、
ｉｉｉ）該複数の光ファイバは該放射光を受光し、該ファイバの該第１の末端からの放射光を該ファイバの該第２の末端から構成される該末端ポートに送る、
リニアアレイと、
ｄ）該１つの末端ポートおよび１つの検出器に光学的に接続された末端ポートアセンブリであって、少なくとも１つのレンズを備える末端ポートアセンブリと、
を備える、ことを特徴とするシステム。
【請求項１５】
前記サンプルは約０．１アトモル乃至約１ナノモルの対象分析物を含む、請求項１４記載のシステム。
【請求項１６】
前記末端ポートアセンブリは、ノッチフィルタおよび帯域フィルタをさらに備える、請求項１４記載のシステム。
【請求項１７】
前記励起光源はレーザである、請求項１４記載のシステム。
【請求項１８】
前記検出器は、約０．５ｍｍ×０．５ｍｍ乃至約１ｍｍ×１ｍｍのサイズを有する、請求項１４記載のシステム。
【請求項１９】
各前記リニアアレイは、約１０乃至約１００の前記ファイバを備える、請求項１４記載のシステム。
【請求項２０】
前記光ファイバは、約２０度乃至約４５度の受光角を有する、請求項１４記載のシステム。
【請求項１】
サンプル中の対象分析物の存在を検出するシステムであって、
ａ）細長い透明のサンプル容器と、
ｂ）該サンプルに光学的に接続される励起光源であって、該励起光源からの照射は該サンプルの長さ方向に配向され、かつ、該照射は該サンプルから放射される放射光を誘起する、励起光源と、
ｃ）該サンプルのホルダの周りに配置された少なくとも２つのリニアアレイであって、該リニアアレイがそれぞれ、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成され、
ｉ）該ファイバの該第１の末端は該容器の長さ方向に沿って、その近傍に配置され、
ｉｉ）各該アレイの該ファイバの該第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成し、
ｉｉｉ）該複数の光ファイバは該放射光を受光し、該ファイバの該第１の末端からの放射光を該ファイバの該第２の末端から構成される該末端ポートに送る、
リニアアレイと、
ｄ）該１つの末端ポートおよび１つの検出器に光学的に接続された末端ポートアセンブリと、
を備える、ことを特徴とするシステム。
【請求項２】
前記末端ポートアセンブリは、少なくとも１つのレンズをさらに備える、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
前記末端ポートアセンブリは、ノッチフィルタをさらに備える、請求項１記載のシステム。
【請求項４】
前記末端ポートアセンブリは、帯域フィルタをさらに備える、請求項１記載のシステム。
【請求項５】
４つの前記リニアアレイを備える、請求項１記載のシステム。
【請求項６】
前記複数のリニアアレイは１つの平面状アレイを構成し、隣接する前記リニアアレイは互いに対して９０度に配向されている、請求項４記載のシステム。
【請求項７】
前記励起光源はレーザである、請求項１記載のシステム。
【請求項８】
前記放射光は、蛍光、燐光、紫外線、可視光線、赤外線、ラマン散乱光およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１記載のシステム。
【請求項９】
各前記アレイの前記ファイバの前記第２の末端は、ランダムな順で束ねられている、請求項１記載のシステム。
【請求項１０】
電源に接続されていない、請求項１記載のシステム。
【請求項１１】
前記検出器は約０．５ｍｍ×０．５ｍｍ乃至約１ｍｍ×１ｍｍのサイズを有する、請求項１記載のシステム。
【請求項１２】
各前記リニアアレイは、約１０乃至約１００の前記ファイバから構成される、請求項１記載のシステム。
【請求項１３】
前記光ファイバは、約２０度乃至約４５度の受光角を有する、請求項１記載のシステム。
【請求項１４】
サンプル中の対象分析物の存在を検出するシステムであって、
ａ）細長い透明のサンプル容器と、
ｂ）該サンプルと光学的に接続される励起光源であって、該励起光源からの照射は該サンプルの長さ方向に配向され、かつ、該照射は該サンプルから放射される蛍光放射光を誘起する、励起光源と、
ｃ）該サンプルのホルダの周りに１つの平面状アレイを構成し、隣接する該リニアアレイが互いに対して９０度に配向されている少なくとも４つのリニアアレイであって、該リニアアレイがそれぞれ、第１および第２の末端を有する複数の光ファイバから構成され、
ｉ）該ファイバの該第１の末端は該容器の長さ方向に沿ってその近傍に配置され、
ｉｉ）各該アレイの該ファイバの該第２の末端は束ねられて１つの末端ポートを形成し、
ｉｉｉ）該複数の光ファイバは該放射光を受光し、該ファイバの該第１の末端からの放射光を該ファイバの該第２の末端から構成される該末端ポートに送る、
リニアアレイと、
ｄ）該１つの末端ポートおよび１つの検出器に光学的に接続された末端ポートアセンブリであって、少なくとも１つのレンズを備える末端ポートアセンブリと、
を備える、ことを特徴とするシステム。
【請求項１５】
前記サンプルは約０．１アトモル乃至約１ナノモルの対象分析物を含む、請求項１４記載のシステム。
【請求項１６】
前記末端ポートアセンブリは、ノッチフィルタおよび帯域フィルタをさらに備える、請求項１４記載のシステム。
【請求項１７】
前記励起光源はレーザである、請求項１４記載のシステム。
【請求項１８】
前記検出器は、約０．５ｍｍ×０．５ｍｍ乃至約１ｍｍ×１ｍｍのサイズを有する、請求項１４記載のシステム。
【請求項１９】
各前記リニアアレイは、約１０乃至約１００の前記ファイバを備える、請求項１４記載のシステム。
【請求項２０】
前記光ファイバは、約２０度乃至約４５度の受光角を有する、請求項１４記載のシステム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５２２２２１（Ｐ２０１２−５２２２２１Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２２５７（Ｐ２０１２−５０２２５７）
【出願日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８６９２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１５０８
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５０８１１５０２６）ロス アラモス ナショナル セキュリティー，エルエルシー (9)
【氏名又は名称原語表記】ＬＯＳ ＡＬＡＭＯＳ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＳＥＣＵＲＩＴＹ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】ＬＯＳ ＡＬＡＭＯＳ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ，ＬＣ／ＩＰ，ＭＳ Ａ１８７，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，ＮＭ ８７５４５，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【出願人】（５１０１５０９２７）ザ リサーチ ファンデーション オブ ステート ユニバーシティ オブ ニューヨーク (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８６９２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１５０８
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５０８１１５０２６）ロス アラモス ナショナル セキュリティー，エルエルシー (9)
【氏名又は名称原語表記】ＬＯＳ ＡＬＡＭＯＳ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＳＥＣＵＲＩＴＹ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】ＬＯＳ ＡＬＡＭＯＳ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ，ＬＣ／ＩＰ，ＭＳ Ａ１８７，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，ＮＭ ８７５４５，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【出願人】（５１０１５０９２７）ザ リサーチ ファンデーション オブ ステート ユニバーシティ オブ ニューヨーク (3)
【Ｆターム（参考）】
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