蛍光染料分解剤
【課題】 安全性が高く、蛍光染料の分解力に優れた蛍光染料分解剤および蛍光染料の分解方法。
【解決手段】 マンガンペルオキシターゼを有効成分とし、蛍光染料を分解する蛍光染料分解剤を提供する。また、蛍光染料を含む溶液中でグルコースオキシダーゼおよびグルコースを反応させ、過酸化水素を生成する工程と、上記溶液にマンガンペルオキシターゼおよび２価のマンガンイオンを添加し、溶液中の蛍光染料と反応させて蛍光染料を分解する工程と、を備える蛍光染料の分解方法を提供する。
【解決手段】 マンガンペルオキシターゼを有効成分とし、蛍光染料を分解する蛍光染料分解剤を提供する。また、蛍光染料を含む溶液中でグルコースオキシダーゼおよびグルコースを反応させ、過酸化水素を生成する工程と、上記溶液にマンガンペルオキシターゼおよび２価のマンガンイオンを添加し、溶液中の蛍光染料と反応させて蛍光染料を分解する工程と、を備える蛍光染料の分解方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光染料分解剤に関する。特に、環境、食品環境分野に於いて使用される蛍光染料分解剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生紙から漏出する蛍光染料に対する問題が顕在化しつつある。古紙パルプ（再生パルプ）は、いわゆる白版紙や上質紙、再生紙、新聞用紙などの古紙を原料としており、古紙パルプの多くは再度、白版紙などに再利用される。そのため、古紙パルプから得られる再生紙を白く見せるために再生パルプの製造工程において蛍光染料が使用されている。しかしながら、蛍光染料は有害物質に化学構造が似ており、発ガン性の疑いも持たれているため、蛍光染料を含む再生紙の安全性が疑われている。特に、食品分野では、蛍光染料を含む再生紙を食品用の包装用紙などの用途に用いることは禁じられている。食品衛生法によれば、食品に接触する可能性のある紙からは蛍光染料が検出されてはならないことになっている。
【０００３】
したがって、食品包装用紙などは再生パルプではなくバージンパルプが使われることが多い。しかし、コスト的な問題もあり、菓子箱や宅配ピザの敷き紙、ファーストフード店で使われるフライドポテトを入れる紙箱などには一部古紙パルプが使われているのが実状である。
【０００４】
上述の理由から、古紙パルプ中の蛍光染料を取り除く方法の開発が望まれている。蛍光染料を取り除く方法として、従来では、古紙パルプを直接アルカリや酸で再処理し蛍光染料を分解する方法、蛍光染料の漏出を防ぐために紙の表面に薬剤を塗工する、フィルムを張るなどの方法（特許文献１）などが行われている。また、塩素系の蛍光染料分解剤も用いられている（特許文献２〜５）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１２８０３３号公報
【特許文献２】特開昭６２−９７９９３号公報
【特許文献３】特許第２１１６４４９号公報
【特許文献４】特許第６９８３６５号公報
【特許文献５】特許第３１１８０８７号公報
【特許文献６】特開２００２−２７９７１号公報
【特許文献７】特表平１１−５０８１３６号公報
【特許文献８】特開２００２−６９８８１号公報
【特許文献９】特開２００２−１８４８０号公報
【非特許文献１】リグニン分解酵素系によるパルプ繊維の改質−ＭｎＰ処理がＤＩＰパルプ繊維に及ぼす影響（特種製紙株式会社；土川ら）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、古紙パルプを直接アルカリや酸で処理し蛍光染料を分解する場合、処理の過程で古紙パルプの分解も生じるため、古紙パルプの収率が悪化するという問題点があった。また、紙の表面に薬剤を塗工する、フィルムを張るなどの方法は、いずれもコストが上昇するという問題があった。また、塩素系の蛍光染料分解剤は、蛍光染料の分解能力に優れてはいるが、非常に毒性が強いという問題点があった。この薬品の取り扱いには操業者であっても習熟を要し、取り扱いに厳重な注意が必要である。さらに、塩素系の蛍光染料分解剤は排水処理にも問題が残る。すなわち、未反応の薬品が残っている排水を排水処理設備に供給した場合、活性汚泥処理槽中の微生物が死滅する可能性があり、その結果、排水処理を行うことができなくなる。
【０００７】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、安全性が高く、蛍光染料の分解力に優れた蛍光染料分解剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究した結果、マンガンペルオキシダーゼが蛍光染料を分解できることを見出した。さらに、本発明者は、マンガンペルオキシダーゼが優れた蛍光染料分解効果と高い安全性を有していることを見出した。かかる知見に基づき、本発明者は、安全性が高く、蛍光染料の分解力に優れた蛍光染料分解剤を提供することを可能とし、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、マンガンペルオキシターゼを有効成分とし、蛍光染料を分解する蛍光染料分解剤を提供する。
【００１０】
本発明に用いられているマンガンペルオキシダーゼについては、既にいくつかの機能が報告されている。すなわち、トリクロロエチレンなどの難分解性ハロゲン化炭水化物の化合物を分解する作用（特許文献６）、酵素の活性を増強するための媒介物質と併用することで染料を分解する作用（特許文献７）、パルプ繊維中のリグニンを分解する作用（特許文献８）、排水中のダイオキシン類などの難分解性物質の分解（特許文献９）などである。またリグニン討論会（１９９９）においてはマンガンペルオキシダーゼを用いた古紙パルプの処理法が発表され、脱リグニンに基づく漂白が可能であること等が示されたが、その中では直接的な蛍光染料の分解については考察されていない（非特許文献１）。このように、いくつかの機能が明らかになっているが、マンガンペルオキシダーゼによる直接的な蛍光染料分解作用は今まで報告されておらず、蛍光染料分解作用は今回初めて見出された作用である。
【００１１】
本発明に用いられているマンガンペルオキシダーゼは多くの微生物から分離されており、弱酸性の条件下で２価のマンガンイオンから３価のマンガンイオンを生成する。この３価のマンガンイオンはその酸化力を使って難分解性のフェノール性化合物や色素を分解することができる。酵素が直接フェノール性化合物や色素を分解するのではなく、分子量の小さいマンガンイオンが対象化合物を酸化するため、分子量の大きな酵素が進入しにくい繊維中や多くの化合物がゆるく結合するような比較的大きな粒子中にも３価のマンガンは進入することができる。そのため対象化合物の分解効率は非常に高い。
【００１２】
したがって、本発明の蛍光染料分解剤は、反応溶液中の蛍光染料を効率よく分解することができる。また、マンガンペルオキシダーゼ自体は皮膚に接した場合でも腐食性は非常に低く、水にて洗い流すだけで良い。したがって、本発明の蛍光染料分解剤は、従来、蛍光染料の分解に用いられているアルカリ、酸および塩素系の蛍光分解剤に比べて、非常に安全性が高い。
【００１３】
本発明に用いるマンガンペルオキシターゼは、食用担子菌に由来するマンガンペルオキシターゼであることが好ましい。
食用担子菌に由来するマンガンペルオキシターゼを有効成分とすることによって、より人体などへの安全性を高めることができる。
【００１４】
本発明における蛍光染料は、ウンベリフェロンおよび／またはスチルベン系蛍光増白剤であることが好ましく、さらに、スチルベン系蛍光増白剤であることが好ましい。
本発明の蛍光染料分解剤は、ウンベリフェロンおよび／またはスチルベン系蛍光増白剤を効率的に分解することができる。また、３０分間の反応で、ウンベリフェロンならば５０％以上、スチルベン系蛍光増白剤ならば９０％程度が分解されるため、本発明の蛍光染料分解剤は実用性にも優れている。
【００１５】
また、本発明は、蛍光染料を含む溶液中でグルコースオキシダーゼおよびグルコースを反応させ、過酸化水素を生成する工程と、上記溶液にマンガンペルオキシターゼおよび２価のマンガンイオンを添加し、溶液中の蛍光染料と反応させて蛍光染料を分解する工程と、を備える蛍光染料の分解方法を提供する。本発明に用いるマンガンペルオキシターゼは、食用担子菌に由来するマンガンペルオキシターゼであることが好ましい。本発明における蛍光染料は、ウンベリフェロンおよび／またはスチルベン系蛍光増白剤であることが好ましく、さらに、スチルベン系蛍光増白剤であることが好ましい。
【００１６】
本発明の蛍光染料の分解方法によれば、溶液中の蛍光染料を効率よく分解することができる。また、本発明の蛍光染料の分解方法は安全性が高い。したがって、本発明の蛍光染料の分解方法はパルプの製造に適用することができ、蛍光染料を含む排水の排水処理に利用することができ、また、環境浄化作用を有する。マンガンペルオキシダーゼ自体は、活性汚泥中の微生物に悪影響を与えることはなく、通常の排水のラインで使用しても何ら問題はない。したがって、本発明の蛍光染料の分解方法はコスト面、設備面においても優れている。
【００１７】
さらに、本発明は、蛍光染料を含有する古紙を原料に用いる再生パルプの製造方法において、上記本発明の蛍光染料の分解方法を行い、パルプ中の蛍光染料を分解する再生パルプの製造方法を提供する。加えて、上記再生パルプの製造方法によって得られる再生パルプを提供する。また、再生パルプは食品用包装紙として用いられることが好ましい。
【００１８】
本発明の再生パルプの製造方法によれば、再生パルプの原料である古紙中に含まれる蛍光染料を分解することができるため、効率的かつ安全に蛍光染料が分解された再生パルプを製造することができる。また、蛍光染料が効率的に低減された再生パルプを提供することができる。蛍光染料が効率的に低減されているため、再生紙からの蛍光染料の漏洩を低減することができ、安全性が高く、食品用包装紙としての用途に適した再生パルプを提供することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、安全性が高く、優れた効果をもつ蛍光染料分解剤および蛍光染料の分解方法が提供される。また、蛍光染料が低減された再生パルプおよびその製造方法を提供することができる。本発明は、環境浄化・排水処理においても有効であり、蛍光増白剤を使用する洗剤工場の排水、その他、蛍光染料を含有する排水であれば、いかなる排水の蛍光染料の分解に使用することができる。コスト面、設備面においても優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の構成および好適な実施形態について詳述するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００２１】
まず、本実施形態における蛍光染料分解剤を説明する。本実施形態における蛍光染料分解剤は、マンガンペルオキシダーゼを有効成分として含有する。
【００２２】
マンガンペルオキシダーゼとは、２価のマンガンイオンを３価のマンガンイオンに酸化する酵素である。本発明で使用するマンガンペルオキシダーゼは活性の発現に過酸化水素を必要とし、酵素は弱酸性領域で最大活性を発揮する。活性の更なる発現のために脂肪酸やＴｗｅｅｎ８０のような界面活性剤を反応系に含んでも良い。マンガンペルオキシダーゼは担子菌に属する白色腐朽菌や褐色腐朽菌などの微生物から得られるものであればどのようなものであっても構わない。中でも、食用担子菌が、安全上の理由から好ましい。また白色腐朽菌や褐色腐朽菌のゲノム中に存在するマンガンペルオキシダーゼ遺伝子を別の宿主に導入し、高発現させ、マンガンペルオキシダーゼを大量に入手することも可能である。具体的には、マンガンペルオキシダーゼをコードするｍＲＮＡよりｃＤＮＡを調製し、そのｃＤＮＡを大量発現プロモーターの下流に接続することで、マンガンペルオキシダーゼの大量発現コンストラクトを調製する。このコンストラクトをピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母に導入し、大量のマンガンペルオキシダーゼを調製する方法がある。上記のようなマンガンペルオキシダーゼを得ることができれば、その製法は特に限定されない。また、本実施形態における蛍光染料分解剤は、マンガンペルオキシダーゼの他に、２価のマンガンイオン、過酸化水素または過酸化水素の供給源、緩衝液などを備えていてもよく、反応開始直前に調製するように、複数の反応剤（好ましくは、反応液）からなっていてもよい。
【００２３】
次に、本実施形態における蛍光染料の分解方法を説明する。本実施形態における蛍光染料の分解方法は、蛍光染料を含む溶液中でグルコースオキシダーゼおよびグルコースを反応させ、過酸化水素を生成する工程（過酸化水素生成工程）と、上記溶液にマンガンペルオキシターゼおよび２価のマンガンイオンを添加し、溶液中の蛍光染料と反応させて蛍光染料を分解する工程（蛍光染料分解工程）と、を備える。本実施形態で使用するマンガンペルオキシダーゼは、上記の蛍光染料分解剤であってよい。
【００２４】
マンガンペルオキシダーゼを使用する際は過酸化水素を必要とするため過酸化水素の添加系についても考慮する必要がある。（１）過酸化水素を直接反応系に添加する場合、（２）グルコースオキシダーゼを用い、グルコースを基質として過酸化水素を発生させる場合、の２通りの方法が挙げられる。特に、本実施形態の過酸化水素生成工程においては、（２）の方法が、継続的に過酸化水素を反応系に供給することができ、マンガンペルオキシダーゼの活性を維持するうえで好ましい。過酸化水素の反応系での濃度は１ｍＭ以下が好ましく、更に好ましくは０．０５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下である。過酸化水素の反応系での濃度が、１ｍＭよりも大きい場合、マンガンペルオキシダーゼの活性が低下したり、活性そのものが失われたりする場合もある。また、過酸化水素の反応系での濃度が、０．０５ｍＭ未満である場合、反応に関与する過酸化水素量が不十分となり、反応が効率的に進まない可能性がある。（１）の添加方法では、過酸化水素の濃度を均一にすることや一定量または一定範囲内に保つことが難しい場合があり、その場合、マンガンペルオキシダーゼの活性が低下したり、活性そのものが失われたりすることもある。
【００２５】
次の蛍光染料分解工程において、マンガンペルオキシダーゼを使用するときの条件は、温度は、３０℃〜７０℃、好ましくは３７℃〜６０℃、更に好ましくは４５℃〜５５℃である。反応ｐＨは、ｐＨ３．０〜６．９、好ましくはｐＨ４．０〜６．０、更に好ましくはｐＨ４．５〜５．５である。蛍光染料分解に際し、使用されるマンガンペルオキシダーゼは適当量の添加であれば全く問題はないが、経済性を考慮した場合、反応系における酵素力価は０．０１Ｕ／ｍｌから１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０５Ｕ／ｍｌから５Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは０．０５Ｕ／ｍｌから２Ｕ／ｍｌの範囲である。
【００２６】
蛍光染料の分解に際して、パルプ繊維中の蛍光染料の分解効率を上げるために、公知のリグニン分解酵素である、リグニンペルオキシダーゼやラッカーゼといった酵素との併用も可能である。また、多糖分解酵素であるキシラナーゼやアミラーゼといった酵素との併用も可能である。
【００２７】
蛍光染料とは、色素が蛍光物質である染料をいい、蛍光剤とも言う。特に、蛍光による増白効果を狙って古紙パルプや衣料用洗剤に添加される蛍光染料を蛍光増白剤と言う。蛍光染料の中には、有害物質に化学構造が似ているものがあり発ガン性の疑いも持たれているため、蛍光染料の安全性が疑われている。また、蛍光染料は一般に極めて分解性が悪く、環境中で完全に分解されるには２ヶ月以上かかるとも言われている。つまり、再生パルプ製造時の排水に混じって河川に放流されて残留し、環境汚染の元凶となっている。
【００２８】
マンガンペルオキシダーゼは蛍光染料の中でも（１）ウンベリフェロンのようなクマリン系蛍光染料、（２）スチルベン系の蛍光増白剤、の２種の分解特性に優れていることを、本発明者は見出した。現在、古紙や洗剤などに使用される蛍光増白剤はスチルベン系の化合物が多く、マンガンペルオキシダーゼはこの蛍光増白剤を効率的に分解することができる。
【００２９】
マンガンペルオキシダーゼを有効成分とする蛍光染料分解剤は、塩素系蛍光染料分解剤と比較して非常に安全である。マンガンペルオキシダーゼ自体は皮膚に接した場合でも腐食性は非常に低く、水にて洗い流すだけで良い。一方の塩素系蛍光染料分解剤は皮膚に接触した場合、炎症、糜爛といった症状を起こし、医師の処置を受ける必要があることもある。
【００３０】
本発明のマンガンペルオキシダーゼを有効成分とする蛍光染料分解剤を用いる場合、マンガンペルオキシダーゼを含む酵素液を直接反応系に添加しても良いが、マンガンペルオキシダーゼを担体に固定化し、過酸化水素と反応させて生成する３価のマンガンイオンのみを分解剤として使っても良い。
【００３１】
本願のマンガンペルオキシダーゼを有効成分とする蛍光染料分解剤は、蛍光染料の存在する古紙パルプ、古紙パルプの排水、蛍光増白剤を使用する洗剤工場の排水、その他、蛍光染料を含有する排水であれば、いかなる排水の蛍光染料の分解に使用することができる。マンガンペルオキシダーゼ自体は、活性汚泥中の微生物に悪影響を与えることはなく、通常の排水のラインで使用しても何ら問題はない。
【００３２】
最後に、本実施形態における再生パルプの製造方法を説明する。本実施形態における再生パルプの製造方法は、蛍光染料を含有する古紙を原料に用いる再生パルプの製造方法において、上記の蛍光染料の分解方法を行い、パルプ中の蛍光染料を分解する再生パルプの製造方法である。
【００３３】
従来の再生パルプの製造方法は、一般的には、古紙を離解してパルプ懸濁液を得る離解工程と、パルプ懸濁液中の異物を分離する粗選・精選工程と、印刷インキを分離する脱墨工程と、再生パルプの色を白くする漂白工程とを経て再生パルプ化が行われている。
【００３４】
本実施形態における再生パルプの製造方法においては、従来の漂白工程の代わりに上述した蛍光染料の分解方法を行う。これによって、再生パルプの原料である古紙中に含まれる蛍光染料を効率的かつ安全に分解することができる。したがって、含有される蛍光染料が低減された再生パルプを得ることができる。蛍光染料が効率的に低減されているため、再生紙からの蛍光染料の漏洩を低減することができ、安全性が高く、食品用包装紙としての用途に適した再生パルプを提供することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００３６】
まず、本実施例のマンガンペルオキシダーゼの調製例、ならびに、酵素活性および蛍光染料分解活性の測定例を示す。次に、本実施例の蛍光染料分解剤を用いた蛍光染料の分解能を検査した実施例を示し、最後に、本実施例の蛍光染料分解剤の安全性を検査した実施例を示す。
【００３７】
＜調製例１：白色腐朽菌の培養＞
使用菌株として、白色腐朽菌Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｏｒｄｉｄａ（ＡＴＣＣ９０８７２）を用いた。白色腐朽菌の培養液から白色腐朽菌由来のマンガンペルオキシダーゼを含む酵素液を調製した。
【００３８】
白色腐朽菌の培養方法は、以下の通りである。まず、白色腐朽菌の種菌をポテトデキストロース寒天培地上で３０℃、３日間前培養した。次に、前培養の後に集菌し、ミキサーでホモジナイズした菌体を本培養の液体培地に接種して本培養を行った。本培養の液体培地は、１０ｇ／ｌ グルコース、０．２２ｇ／ｌ（１．２ｍＭ） 酒石酸アンモニウム、１．６４ｇ／ｌ（２０ｍＭ） 酢酸ナトリウム、１．０ｇ／ｌ Ｔｗｅｅｎ８０、および微量金属塩を含む液体培地（ｐＨ４．５）であり、５００ｍｌ三角フラスコに対し、２００ｍｌの液体培地を用いた。本培養は以下の条件で行った。菌体の接種後、３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。培養３日目に、終濃度が１．２５ｇ／ｌとなるようにベラトリルアルコールを添加した。その後、フラスコのヘッドスペース内を毎日１時間ほど酸素ガスで置換しながら、引き続き、３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養を行った。最終的に７日間培養した。
【００３９】
そして、得られた白色腐朽菌の培養液から、以下の方法で白色腐朽菌由来のマンガンペルオキシダーゼを含む酵素液を調製した。ろ紙にて菌体を除去した後、ポアサイズ０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過したろ液を回収し、これを酵素液１とした。
培養最終日の培養液から得られた酵素液１のマンガンペルオキシダーゼ酵素活性は、２．５Ｕ／ｍｌであった。酵素活性の測定法には、次に述べる方法を用いた。
【００４０】
＜マンガンペルオキシダーゼ酵素活性の測定方法＞
酵素活性の測定に用いる反応液は、以下の組成とした。１．０ｍＭ ２，６−ジメトキシフェノール、１．０ｍＭ 硫酸マンガン（ＩＩ）、５０ｍＭ マロン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）、０．２ｍＭ 過酸化水素水。反応開始前に、セル中に過酸化酸素以外の反応液と酵素液１００μｌとを混合し、３７℃にて５分間保温した。そして、終濃度０．２ｍＭとなるように過酸化水素水を添加して混合液の終量を１ｍｌとし、３７℃にて反応を開始した。生成したＭｎ（ＩＩＩ）−マロン酸錯体による２，６−ジメトキシフェノールの酸化に基づく４６９ｎｍの吸光度変化を測定した。モル吸光係数は４９．６ｍＭ−１ｃｍ−１として酵素活性を算出した。マンガンペルオキシダーゼの酵素活性１ユニット〔Ｕ〕は、１分間に２，６−ジメトキシフェノール酸化物が１μｍｏｌ生成される値として定義した。
【００４１】
＜調製例２：遺伝子組み換えによるマンガンペルオキシダーゼの大量調製＞
（１）マンガンペルオキシダーゼ遺伝子のクローニング
白色腐朽担子菌Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ２４７２５）のマンガンペルオキシダーゼｃＤＮＡを以下の手法によりクローニングした。菌体の培養には、基質としてＣＦ１１（コットン由来セルロースファイバー）を用い、基質濃度は２％、窒素源として尿素を０．０６％、リン酸水素アンモニウムを０．０２６％添加した。前述の本培養の液体培地に植菌後、３７℃、１５０ｒｐｍにて４日間振とう培養し、培養後、グラスフィルターにて菌体を濾別回収した。得られた菌体は液体窒素にて凍結粉砕し、これをｍＲＮＡ抽出のための材料として供した。まず、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（商標）ＦｕｎｇａｌＲＮＡ抽出キット（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ−Ｔｅｋ製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。次に、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（商標）−ｄｔ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてｍＲＮＡを精製した。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応は、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡製）およびｏｌｉｇｏ(ｄＴ)３０プライマーを用いて行った。得られたｃＤＮＡを鋳型として、マンガンペルオキシダーゼ５遺伝子の特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い、マンガンペルオキシダーゼの全長ｃＤＮＡをクローニングした。マンガンペルオキシダーゼ５の遺伝子特異的プライマーは、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍのゲノム情報を元に設計した。特異的プライマーの配列は以下の通りである。Ｆｏｗａｒｄ：５’−ＣＧＡＣＡＧＡＣＡＧ ＧＧＣＴＧＣＣＧＴＧ ＴＧＣＧ−３’（配列番号１）、および、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＡＡＧＣＣＧＧＧ ＣＣＧＴＣＧＡＡ−３’（配列番号２）。
【００４２】
（２）マンガンペルオキシダーゼ発現コンストラクトの構築
得られたｃＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ（タカラバイオ製）を用いて制限酵素処理し、ライゲーションキットとしてＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ（タカラバイオ製）を用い、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現用ベクターであるｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。そしてこの反応液を用い、コンピテントセルＪＭＩ０９（タカラバイオ製）に形質転換してクローニングし、マンガンペルオキシダーゼ発現コンストラクト（ＭｎＰ５／ｐＰＩＣＺαＡ）を得た。
【００４３】
（３）マンガンペルオキシダーゼタンパク質の発現
マンガンペルオキシダーゼ発現コンストラクトをＢｐｕ１１０２Ｉ（タカラバイオ製）で制限酵素処理し、得られた２本鎖直鎖ＤＮＡをエレクトロポレーション法にて、ピヒア・パストリスＫＭ−７１株に導入した。形質転換体の選抜は、抗生物質耐性（Ｚｅｏｃｉｎ耐性）を指標に行った。
【００４４】
上述の形質転換体をＹＰＧ培地（２５ｕｇ／ｍｌ Ｚｅｏｃｉｎ含有）にて培養し、菌体を回収した。次に、Ｈｅｍｉｎ（１０００μモル）および炭素源としてメタノール（１％）を含むＹＰ培地を用いて２７℃、１５０ｒｐｍにて振とう培養を３日間行った後に、菌体外液を５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上清液を回収し、酵素液２とした。この酵素液のマンガンペルオキシダーゼ活性は１Ｕ／ｍｌであった。
【００４５】
＜実施例１：ウンベリフェロンの分解＞
調製例１および調製例２により得られた酵素液１および酵素液２を用いて蛍光染料の分解能を調べるための実験を行った。基質には蛍光染料ウンベリフェロンを用いた。
４−０−メチルウンベリフェロン（Ｓｉｇｍａ社製）を１００μモル／ｌとなるように５０ｍＭ マロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、これを基質溶液とした。酵素ストック溶液には、酵素液１および２を酵素活性１Ｕ／ｍｌに調製したものを用いた。酵素液の酵素力価の希釈調製には５０ｍＭ マロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた。
【００４６】
実施例１の反応系は、最終的に２００μｌとなるように５０ｍＭ マロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を用いて調製した。反応系中には、基質溶液（終濃度０．１ｍＭ）に加え、硫酸マンガンを終濃度０．５ｍＭ、過酸化水素を終濃度０．５ｍＭとなるように添加した。また、酵素液は０．０５Ｕ／ｍｌとなるように反応系に添加した。対照実験用には、熱失活させた酵素液１を使用した。なお、反応は３７℃にて実施した。
【００４７】
蛍光強度の測定には、大日本住友製薬製のフルオロスキャン・アセントを使用し、励起波長３５５ｎｍ、測定波長４５０ｎｍにて測定した。酵素添加後（反応開始後）、０ｍｉｎ、１５ｍｉｎおよび３０ｍｉｎにおける蛍光強度を測定した。
【００４８】
＜結果＞
実施例１の結果を表１に示す。表１は、マンガンペルオキシダーゼによる蛍光染料の分解に伴う蛍光強度の変化を示す。実施例１の結果から、マンガンペルオキシダーゼ酵素活性をもつ酵素液１および２は、４−０−メチルウンベリフェロン分解能を有することが明らかとなった。また、反応開始３０ｍｉｎ後には４７％の４−０−メチルウンベリフェロンが分解されることが分かった。
【００４９】
【表１】
【００５０】
＜実施例２：スチルベン系増白剤の分解＞
基質にもちいる蛍光物質以外は、実施例１と同様にして、実施例２を行った。基質には、スチルベン系増白剤であるＫａｙａｐｈｏｒ ＮＷ（日本化薬製）を用い、反応系での基質濃度を０．００１％とした。
【００５１】
＜結果＞
実施例２の結果を表２に示す。表２は、マンガンペルオキシダーゼによる蛍光染料の分解に伴う蛍光強度の変化を示す。実施例２の結果から、マンガンペルオキシダーゼ酵素活性をもつ酵素液１および２は、Ｋａｙａｐｈｏｒ ＮＷ分解能を有することが明らかとなった。また、反応開始３０ｍｉｎ後には９０％のＫａｙａｐｈｏｒ ＮＷが分解されることが分かった。
【００５２】
【表２】
【００５３】
実施例１および２の結果から、マンガンペルオキシダーゼは、蛍光染料および蛍光増白剤を分解できることが分かった。また本実施例の条件（反応時間３０ｍｉｎ）において、マンガンペルオキシダーゼは、ウンベリフェロンおよびスチルベン系増白剤をそれぞれ半分以下および９０％分解することから、本実施例における酵素液１および酵素液２の反応系は、実用的かつ効率的であることが明らかとなった。特許文献９には、微生物によるダイオキシンの分解が開示されているが、この文献において、ダイオキシンを９０％分解するのに１ヶ月を要している。このことから、マンガンペルオキシダーゼは、クマリン系蛍光染料およびスチルベン系増白剤の分解特性が著しく優れていることが分かる。したがって、マンガンペルオキシダーゼ処理することによって、蛍光染料、蛍光増白剤が存在する古紙パルプやパルプ製造時の排水を効率的かつ実用的に蛍光物質を分解することができる。
【００５４】
＜安全性試験＞
マンガンペルオキシダーゼの安全性を確認するため、以下の方法で「皮膚刺激性試験」および「急性経口毒性試験」を実施した。
【００５５】
＜皮膚刺激性試験＞
調製例１および調製例２により得られた酵素液１および酵素液２（それぞれ１．０Ｕ／ｍｌ、１００ｕｌ）を、各々、除毛後のＣ３Ｈマウス（オス、６週齢、各群１０匹、日本チャールズリバー（株）製）の背中に連続塗布した（１回／日、約１ヶ月間）。塗布期間および塗布終了後の２週間、マウスの背中において、紅斑、浮腫、炎症などの異常は特に観察されなかった。また、対照群（水塗布群）と比較し、体重推移においても有意差（Ｐ＜０．０５）は認められなかった。
【００５６】
酵素液１および酵素液２（それぞれ１．０Ｕ／ｍｌ）を、各々、除毛後のＩＣＲ系マウス（オス、６週齢、各群１０匹、日本チャールズリバー（株）製）に胃ゾンデを用いて経口投与した（投与量５ｇ／マウス体重１ｋｇ）。投与してから２週間後まで、死亡例はなかった。また、体重推移においても対照群（水投与群）と比較して有意差（Ｐ＜０．０５）は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明で得られるマンガンペルオキシダーゼを有効成分として含む蛍光染料分解剤は、安全性が高く、環境浄化、排水処理、パルプの製造分野に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光染料分解剤に関する。特に、環境、食品環境分野に於いて使用される蛍光染料分解剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生紙から漏出する蛍光染料に対する問題が顕在化しつつある。古紙パルプ（再生パルプ）は、いわゆる白版紙や上質紙、再生紙、新聞用紙などの古紙を原料としており、古紙パルプの多くは再度、白版紙などに再利用される。そのため、古紙パルプから得られる再生紙を白く見せるために再生パルプの製造工程において蛍光染料が使用されている。しかしながら、蛍光染料は有害物質に化学構造が似ており、発ガン性の疑いも持たれているため、蛍光染料を含む再生紙の安全性が疑われている。特に、食品分野では、蛍光染料を含む再生紙を食品用の包装用紙などの用途に用いることは禁じられている。食品衛生法によれば、食品に接触する可能性のある紙からは蛍光染料が検出されてはならないことになっている。
【０００３】
したがって、食品包装用紙などは再生パルプではなくバージンパルプが使われることが多い。しかし、コスト的な問題もあり、菓子箱や宅配ピザの敷き紙、ファーストフード店で使われるフライドポテトを入れる紙箱などには一部古紙パルプが使われているのが実状である。
【０００４】
上述の理由から、古紙パルプ中の蛍光染料を取り除く方法の開発が望まれている。蛍光染料を取り除く方法として、従来では、古紙パルプを直接アルカリや酸で再処理し蛍光染料を分解する方法、蛍光染料の漏出を防ぐために紙の表面に薬剤を塗工する、フィルムを張るなどの方法（特許文献１）などが行われている。また、塩素系の蛍光染料分解剤も用いられている（特許文献２〜５）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１２８０３３号公報
【特許文献２】特開昭６２−９７９９３号公報
【特許文献３】特許第２１１６４４９号公報
【特許文献４】特許第６９８３６５号公報
【特許文献５】特許第３１１８０８７号公報
【特許文献６】特開２００２−２７９７１号公報
【特許文献７】特表平１１−５０８１３６号公報
【特許文献８】特開２００２−６９８８１号公報
【特許文献９】特開２００２−１８４８０号公報
【非特許文献１】リグニン分解酵素系によるパルプ繊維の改質−ＭｎＰ処理がＤＩＰパルプ繊維に及ぼす影響（特種製紙株式会社；土川ら）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、古紙パルプを直接アルカリや酸で処理し蛍光染料を分解する場合、処理の過程で古紙パルプの分解も生じるため、古紙パルプの収率が悪化するという問題点があった。また、紙の表面に薬剤を塗工する、フィルムを張るなどの方法は、いずれもコストが上昇するという問題があった。また、塩素系の蛍光染料分解剤は、蛍光染料の分解能力に優れてはいるが、非常に毒性が強いという問題点があった。この薬品の取り扱いには操業者であっても習熟を要し、取り扱いに厳重な注意が必要である。さらに、塩素系の蛍光染料分解剤は排水処理にも問題が残る。すなわち、未反応の薬品が残っている排水を排水処理設備に供給した場合、活性汚泥処理槽中の微生物が死滅する可能性があり、その結果、排水処理を行うことができなくなる。
【０００７】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、安全性が高く、蛍光染料の分解力に優れた蛍光染料分解剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究した結果、マンガンペルオキシダーゼが蛍光染料を分解できることを見出した。さらに、本発明者は、マンガンペルオキシダーゼが優れた蛍光染料分解効果と高い安全性を有していることを見出した。かかる知見に基づき、本発明者は、安全性が高く、蛍光染料の分解力に優れた蛍光染料分解剤を提供することを可能とし、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、マンガンペルオキシターゼを有効成分とし、蛍光染料を分解する蛍光染料分解剤を提供する。
【００１０】
本発明に用いられているマンガンペルオキシダーゼについては、既にいくつかの機能が報告されている。すなわち、トリクロロエチレンなどの難分解性ハロゲン化炭水化物の化合物を分解する作用（特許文献６）、酵素の活性を増強するための媒介物質と併用することで染料を分解する作用（特許文献７）、パルプ繊維中のリグニンを分解する作用（特許文献８）、排水中のダイオキシン類などの難分解性物質の分解（特許文献９）などである。またリグニン討論会（１９９９）においてはマンガンペルオキシダーゼを用いた古紙パルプの処理法が発表され、脱リグニンに基づく漂白が可能であること等が示されたが、その中では直接的な蛍光染料の分解については考察されていない（非特許文献１）。このように、いくつかの機能が明らかになっているが、マンガンペルオキシダーゼによる直接的な蛍光染料分解作用は今まで報告されておらず、蛍光染料分解作用は今回初めて見出された作用である。
【００１１】
本発明に用いられているマンガンペルオキシダーゼは多くの微生物から分離されており、弱酸性の条件下で２価のマンガンイオンから３価のマンガンイオンを生成する。この３価のマンガンイオンはその酸化力を使って難分解性のフェノール性化合物や色素を分解することができる。酵素が直接フェノール性化合物や色素を分解するのではなく、分子量の小さいマンガンイオンが対象化合物を酸化するため、分子量の大きな酵素が進入しにくい繊維中や多くの化合物がゆるく結合するような比較的大きな粒子中にも３価のマンガンは進入することができる。そのため対象化合物の分解効率は非常に高い。
【００１２】
したがって、本発明の蛍光染料分解剤は、反応溶液中の蛍光染料を効率よく分解することができる。また、マンガンペルオキシダーゼ自体は皮膚に接した場合でも腐食性は非常に低く、水にて洗い流すだけで良い。したがって、本発明の蛍光染料分解剤は、従来、蛍光染料の分解に用いられているアルカリ、酸および塩素系の蛍光分解剤に比べて、非常に安全性が高い。
【００１３】
本発明に用いるマンガンペルオキシターゼは、食用担子菌に由来するマンガンペルオキシターゼであることが好ましい。
食用担子菌に由来するマンガンペルオキシターゼを有効成分とすることによって、より人体などへの安全性を高めることができる。
【００１４】
本発明における蛍光染料は、ウンベリフェロンおよび／またはスチルベン系蛍光増白剤であることが好ましく、さらに、スチルベン系蛍光増白剤であることが好ましい。
本発明の蛍光染料分解剤は、ウンベリフェロンおよび／またはスチルベン系蛍光増白剤を効率的に分解することができる。また、３０分間の反応で、ウンベリフェロンならば５０％以上、スチルベン系蛍光増白剤ならば９０％程度が分解されるため、本発明の蛍光染料分解剤は実用性にも優れている。
【００１５】
また、本発明は、蛍光染料を含む溶液中でグルコースオキシダーゼおよびグルコースを反応させ、過酸化水素を生成する工程と、上記溶液にマンガンペルオキシターゼおよび２価のマンガンイオンを添加し、溶液中の蛍光染料と反応させて蛍光染料を分解する工程と、を備える蛍光染料の分解方法を提供する。本発明に用いるマンガンペルオキシターゼは、食用担子菌に由来するマンガンペルオキシターゼであることが好ましい。本発明における蛍光染料は、ウンベリフェロンおよび／またはスチルベン系蛍光増白剤であることが好ましく、さらに、スチルベン系蛍光増白剤であることが好ましい。
【００１６】
本発明の蛍光染料の分解方法によれば、溶液中の蛍光染料を効率よく分解することができる。また、本発明の蛍光染料の分解方法は安全性が高い。したがって、本発明の蛍光染料の分解方法はパルプの製造に適用することができ、蛍光染料を含む排水の排水処理に利用することができ、また、環境浄化作用を有する。マンガンペルオキシダーゼ自体は、活性汚泥中の微生物に悪影響を与えることはなく、通常の排水のラインで使用しても何ら問題はない。したがって、本発明の蛍光染料の分解方法はコスト面、設備面においても優れている。
【００１７】
さらに、本発明は、蛍光染料を含有する古紙を原料に用いる再生パルプの製造方法において、上記本発明の蛍光染料の分解方法を行い、パルプ中の蛍光染料を分解する再生パルプの製造方法を提供する。加えて、上記再生パルプの製造方法によって得られる再生パルプを提供する。また、再生パルプは食品用包装紙として用いられることが好ましい。
【００１８】
本発明の再生パルプの製造方法によれば、再生パルプの原料である古紙中に含まれる蛍光染料を分解することができるため、効率的かつ安全に蛍光染料が分解された再生パルプを製造することができる。また、蛍光染料が効率的に低減された再生パルプを提供することができる。蛍光染料が効率的に低減されているため、再生紙からの蛍光染料の漏洩を低減することができ、安全性が高く、食品用包装紙としての用途に適した再生パルプを提供することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、安全性が高く、優れた効果をもつ蛍光染料分解剤および蛍光染料の分解方法が提供される。また、蛍光染料が低減された再生パルプおよびその製造方法を提供することができる。本発明は、環境浄化・排水処理においても有効であり、蛍光増白剤を使用する洗剤工場の排水、その他、蛍光染料を含有する排水であれば、いかなる排水の蛍光染料の分解に使用することができる。コスト面、設備面においても優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の構成および好適な実施形態について詳述するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００２１】
まず、本実施形態における蛍光染料分解剤を説明する。本実施形態における蛍光染料分解剤は、マンガンペルオキシダーゼを有効成分として含有する。
【００２２】
マンガンペルオキシダーゼとは、２価のマンガンイオンを３価のマンガンイオンに酸化する酵素である。本発明で使用するマンガンペルオキシダーゼは活性の発現に過酸化水素を必要とし、酵素は弱酸性領域で最大活性を発揮する。活性の更なる発現のために脂肪酸やＴｗｅｅｎ８０のような界面活性剤を反応系に含んでも良い。マンガンペルオキシダーゼは担子菌に属する白色腐朽菌や褐色腐朽菌などの微生物から得られるものであればどのようなものであっても構わない。中でも、食用担子菌が、安全上の理由から好ましい。また白色腐朽菌や褐色腐朽菌のゲノム中に存在するマンガンペルオキシダーゼ遺伝子を別の宿主に導入し、高発現させ、マンガンペルオキシダーゼを大量に入手することも可能である。具体的には、マンガンペルオキシダーゼをコードするｍＲＮＡよりｃＤＮＡを調製し、そのｃＤＮＡを大量発現プロモーターの下流に接続することで、マンガンペルオキシダーゼの大量発現コンストラクトを調製する。このコンストラクトをピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母に導入し、大量のマンガンペルオキシダーゼを調製する方法がある。上記のようなマンガンペルオキシダーゼを得ることができれば、その製法は特に限定されない。また、本実施形態における蛍光染料分解剤は、マンガンペルオキシダーゼの他に、２価のマンガンイオン、過酸化水素または過酸化水素の供給源、緩衝液などを備えていてもよく、反応開始直前に調製するように、複数の反応剤（好ましくは、反応液）からなっていてもよい。
【００２３】
次に、本実施形態における蛍光染料の分解方法を説明する。本実施形態における蛍光染料の分解方法は、蛍光染料を含む溶液中でグルコースオキシダーゼおよびグルコースを反応させ、過酸化水素を生成する工程（過酸化水素生成工程）と、上記溶液にマンガンペルオキシターゼおよび２価のマンガンイオンを添加し、溶液中の蛍光染料と反応させて蛍光染料を分解する工程（蛍光染料分解工程）と、を備える。本実施形態で使用するマンガンペルオキシダーゼは、上記の蛍光染料分解剤であってよい。
【００２４】
マンガンペルオキシダーゼを使用する際は過酸化水素を必要とするため過酸化水素の添加系についても考慮する必要がある。（１）過酸化水素を直接反応系に添加する場合、（２）グルコースオキシダーゼを用い、グルコースを基質として過酸化水素を発生させる場合、の２通りの方法が挙げられる。特に、本実施形態の過酸化水素生成工程においては、（２）の方法が、継続的に過酸化水素を反応系に供給することができ、マンガンペルオキシダーゼの活性を維持するうえで好ましい。過酸化水素の反応系での濃度は１ｍＭ以下が好ましく、更に好ましくは０．０５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下である。過酸化水素の反応系での濃度が、１ｍＭよりも大きい場合、マンガンペルオキシダーゼの活性が低下したり、活性そのものが失われたりする場合もある。また、過酸化水素の反応系での濃度が、０．０５ｍＭ未満である場合、反応に関与する過酸化水素量が不十分となり、反応が効率的に進まない可能性がある。（１）の添加方法では、過酸化水素の濃度を均一にすることや一定量または一定範囲内に保つことが難しい場合があり、その場合、マンガンペルオキシダーゼの活性が低下したり、活性そのものが失われたりすることもある。
【００２５】
次の蛍光染料分解工程において、マンガンペルオキシダーゼを使用するときの条件は、温度は、３０℃〜７０℃、好ましくは３７℃〜６０℃、更に好ましくは４５℃〜５５℃である。反応ｐＨは、ｐＨ３．０〜６．９、好ましくはｐＨ４．０〜６．０、更に好ましくはｐＨ４．５〜５．５である。蛍光染料分解に際し、使用されるマンガンペルオキシダーゼは適当量の添加であれば全く問題はないが、経済性を考慮した場合、反応系における酵素力価は０．０１Ｕ／ｍｌから１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０５Ｕ／ｍｌから５Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは０．０５Ｕ／ｍｌから２Ｕ／ｍｌの範囲である。
【００２６】
蛍光染料の分解に際して、パルプ繊維中の蛍光染料の分解効率を上げるために、公知のリグニン分解酵素である、リグニンペルオキシダーゼやラッカーゼといった酵素との併用も可能である。また、多糖分解酵素であるキシラナーゼやアミラーゼといった酵素との併用も可能である。
【００２７】
蛍光染料とは、色素が蛍光物質である染料をいい、蛍光剤とも言う。特に、蛍光による増白効果を狙って古紙パルプや衣料用洗剤に添加される蛍光染料を蛍光増白剤と言う。蛍光染料の中には、有害物質に化学構造が似ているものがあり発ガン性の疑いも持たれているため、蛍光染料の安全性が疑われている。また、蛍光染料は一般に極めて分解性が悪く、環境中で完全に分解されるには２ヶ月以上かかるとも言われている。つまり、再生パルプ製造時の排水に混じって河川に放流されて残留し、環境汚染の元凶となっている。
【００２８】
マンガンペルオキシダーゼは蛍光染料の中でも（１）ウンベリフェロンのようなクマリン系蛍光染料、（２）スチルベン系の蛍光増白剤、の２種の分解特性に優れていることを、本発明者は見出した。現在、古紙や洗剤などに使用される蛍光増白剤はスチルベン系の化合物が多く、マンガンペルオキシダーゼはこの蛍光増白剤を効率的に分解することができる。
【００２９】
マンガンペルオキシダーゼを有効成分とする蛍光染料分解剤は、塩素系蛍光染料分解剤と比較して非常に安全である。マンガンペルオキシダーゼ自体は皮膚に接した場合でも腐食性は非常に低く、水にて洗い流すだけで良い。一方の塩素系蛍光染料分解剤は皮膚に接触した場合、炎症、糜爛といった症状を起こし、医師の処置を受ける必要があることもある。
【００３０】
本発明のマンガンペルオキシダーゼを有効成分とする蛍光染料分解剤を用いる場合、マンガンペルオキシダーゼを含む酵素液を直接反応系に添加しても良いが、マンガンペルオキシダーゼを担体に固定化し、過酸化水素と反応させて生成する３価のマンガンイオンのみを分解剤として使っても良い。
【００３１】
本願のマンガンペルオキシダーゼを有効成分とする蛍光染料分解剤は、蛍光染料の存在する古紙パルプ、古紙パルプの排水、蛍光増白剤を使用する洗剤工場の排水、その他、蛍光染料を含有する排水であれば、いかなる排水の蛍光染料の分解に使用することができる。マンガンペルオキシダーゼ自体は、活性汚泥中の微生物に悪影響を与えることはなく、通常の排水のラインで使用しても何ら問題はない。
【００３２】
最後に、本実施形態における再生パルプの製造方法を説明する。本実施形態における再生パルプの製造方法は、蛍光染料を含有する古紙を原料に用いる再生パルプの製造方法において、上記の蛍光染料の分解方法を行い、パルプ中の蛍光染料を分解する再生パルプの製造方法である。
【００３３】
従来の再生パルプの製造方法は、一般的には、古紙を離解してパルプ懸濁液を得る離解工程と、パルプ懸濁液中の異物を分離する粗選・精選工程と、印刷インキを分離する脱墨工程と、再生パルプの色を白くする漂白工程とを経て再生パルプ化が行われている。
【００３４】
本実施形態における再生パルプの製造方法においては、従来の漂白工程の代わりに上述した蛍光染料の分解方法を行う。これによって、再生パルプの原料である古紙中に含まれる蛍光染料を効率的かつ安全に分解することができる。したがって、含有される蛍光染料が低減された再生パルプを得ることができる。蛍光染料が効率的に低減されているため、再生紙からの蛍光染料の漏洩を低減することができ、安全性が高く、食品用包装紙としての用途に適した再生パルプを提供することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００３６】
まず、本実施例のマンガンペルオキシダーゼの調製例、ならびに、酵素活性および蛍光染料分解活性の測定例を示す。次に、本実施例の蛍光染料分解剤を用いた蛍光染料の分解能を検査した実施例を示し、最後に、本実施例の蛍光染料分解剤の安全性を検査した実施例を示す。
【００３７】
＜調製例１：白色腐朽菌の培養＞
使用菌株として、白色腐朽菌Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｏｒｄｉｄａ（ＡＴＣＣ９０８７２）を用いた。白色腐朽菌の培養液から白色腐朽菌由来のマンガンペルオキシダーゼを含む酵素液を調製した。
【００３８】
白色腐朽菌の培養方法は、以下の通りである。まず、白色腐朽菌の種菌をポテトデキストロース寒天培地上で３０℃、３日間前培養した。次に、前培養の後に集菌し、ミキサーでホモジナイズした菌体を本培養の液体培地に接種して本培養を行った。本培養の液体培地は、１０ｇ／ｌ グルコース、０．２２ｇ／ｌ（１．２ｍＭ） 酒石酸アンモニウム、１．６４ｇ／ｌ（２０ｍＭ） 酢酸ナトリウム、１．０ｇ／ｌ Ｔｗｅｅｎ８０、および微量金属塩を含む液体培地（ｐＨ４．５）であり、５００ｍｌ三角フラスコに対し、２００ｍｌの液体培地を用いた。本培養は以下の条件で行った。菌体の接種後、３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。培養３日目に、終濃度が１．２５ｇ／ｌとなるようにベラトリルアルコールを添加した。その後、フラスコのヘッドスペース内を毎日１時間ほど酸素ガスで置換しながら、引き続き、３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養を行った。最終的に７日間培養した。
【００３９】
そして、得られた白色腐朽菌の培養液から、以下の方法で白色腐朽菌由来のマンガンペルオキシダーゼを含む酵素液を調製した。ろ紙にて菌体を除去した後、ポアサイズ０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過したろ液を回収し、これを酵素液１とした。
培養最終日の培養液から得られた酵素液１のマンガンペルオキシダーゼ酵素活性は、２．５Ｕ／ｍｌであった。酵素活性の測定法には、次に述べる方法を用いた。
【００４０】
＜マンガンペルオキシダーゼ酵素活性の測定方法＞
酵素活性の測定に用いる反応液は、以下の組成とした。１．０ｍＭ ２，６−ジメトキシフェノール、１．０ｍＭ 硫酸マンガン（ＩＩ）、５０ｍＭ マロン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）、０．２ｍＭ 過酸化水素水。反応開始前に、セル中に過酸化酸素以外の反応液と酵素液１００μｌとを混合し、３７℃にて５分間保温した。そして、終濃度０．２ｍＭとなるように過酸化水素水を添加して混合液の終量を１ｍｌとし、３７℃にて反応を開始した。生成したＭｎ（ＩＩＩ）−マロン酸錯体による２，６−ジメトキシフェノールの酸化に基づく４６９ｎｍの吸光度変化を測定した。モル吸光係数は４９．６ｍＭ−１ｃｍ−１として酵素活性を算出した。マンガンペルオキシダーゼの酵素活性１ユニット〔Ｕ〕は、１分間に２，６−ジメトキシフェノール酸化物が１μｍｏｌ生成される値として定義した。
【００４１】
＜調製例２：遺伝子組み換えによるマンガンペルオキシダーゼの大量調製＞
（１）マンガンペルオキシダーゼ遺伝子のクローニング
白色腐朽担子菌Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ２４７２５）のマンガンペルオキシダーゼｃＤＮＡを以下の手法によりクローニングした。菌体の培養には、基質としてＣＦ１１（コットン由来セルロースファイバー）を用い、基質濃度は２％、窒素源として尿素を０．０６％、リン酸水素アンモニウムを０．０２６％添加した。前述の本培養の液体培地に植菌後、３７℃、１５０ｒｐｍにて４日間振とう培養し、培養後、グラスフィルターにて菌体を濾別回収した。得られた菌体は液体窒素にて凍結粉砕し、これをｍＲＮＡ抽出のための材料として供した。まず、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（商標）ＦｕｎｇａｌＲＮＡ抽出キット（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ−Ｔｅｋ製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。次に、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（商標）−ｄｔ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてｍＲＮＡを精製した。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応は、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡製）およびｏｌｉｇｏ(ｄＴ)３０プライマーを用いて行った。得られたｃＤＮＡを鋳型として、マンガンペルオキシダーゼ５遺伝子の特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い、マンガンペルオキシダーゼの全長ｃＤＮＡをクローニングした。マンガンペルオキシダーゼ５の遺伝子特異的プライマーは、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍのゲノム情報を元に設計した。特異的プライマーの配列は以下の通りである。Ｆｏｗａｒｄ：５’−ＣＧＡＣＡＧＡＣＡＧ ＧＧＣＴＧＣＣＧＴＧ ＴＧＣＧ−３’（配列番号１）、および、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＡＡＧＣＣＧＧＧ ＣＣＧＴＣＧＡＡ−３’（配列番号２）。
【００４２】
（２）マンガンペルオキシダーゼ発現コンストラクトの構築
得られたｃＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ（タカラバイオ製）を用いて制限酵素処理し、ライゲーションキットとしてＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ（タカラバイオ製）を用い、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現用ベクターであるｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。そしてこの反応液を用い、コンピテントセルＪＭＩ０９（タカラバイオ製）に形質転換してクローニングし、マンガンペルオキシダーゼ発現コンストラクト（ＭｎＰ５／ｐＰＩＣＺαＡ）を得た。
【００４３】
（３）マンガンペルオキシダーゼタンパク質の発現
マンガンペルオキシダーゼ発現コンストラクトをＢｐｕ１１０２Ｉ（タカラバイオ製）で制限酵素処理し、得られた２本鎖直鎖ＤＮＡをエレクトロポレーション法にて、ピヒア・パストリスＫＭ−７１株に導入した。形質転換体の選抜は、抗生物質耐性（Ｚｅｏｃｉｎ耐性）を指標に行った。
【００４４】
上述の形質転換体をＹＰＧ培地（２５ｕｇ／ｍｌ Ｚｅｏｃｉｎ含有）にて培養し、菌体を回収した。次に、Ｈｅｍｉｎ（１０００μモル）および炭素源としてメタノール（１％）を含むＹＰ培地を用いて２７℃、１５０ｒｐｍにて振とう培養を３日間行った後に、菌体外液を５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上清液を回収し、酵素液２とした。この酵素液のマンガンペルオキシダーゼ活性は１Ｕ／ｍｌであった。
【００４５】
＜実施例１：ウンベリフェロンの分解＞
調製例１および調製例２により得られた酵素液１および酵素液２を用いて蛍光染料の分解能を調べるための実験を行った。基質には蛍光染料ウンベリフェロンを用いた。
４−０−メチルウンベリフェロン（Ｓｉｇｍａ社製）を１００μモル／ｌとなるように５０ｍＭ マロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、これを基質溶液とした。酵素ストック溶液には、酵素液１および２を酵素活性１Ｕ／ｍｌに調製したものを用いた。酵素液の酵素力価の希釈調製には５０ｍＭ マロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた。
【００４６】
実施例１の反応系は、最終的に２００μｌとなるように５０ｍＭ マロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を用いて調製した。反応系中には、基質溶液（終濃度０．１ｍＭ）に加え、硫酸マンガンを終濃度０．５ｍＭ、過酸化水素を終濃度０．５ｍＭとなるように添加した。また、酵素液は０．０５Ｕ／ｍｌとなるように反応系に添加した。対照実験用には、熱失活させた酵素液１を使用した。なお、反応は３７℃にて実施した。
【００４７】
蛍光強度の測定には、大日本住友製薬製のフルオロスキャン・アセントを使用し、励起波長３５５ｎｍ、測定波長４５０ｎｍにて測定した。酵素添加後（反応開始後）、０ｍｉｎ、１５ｍｉｎおよび３０ｍｉｎにおける蛍光強度を測定した。
【００４８】
＜結果＞
実施例１の結果を表１に示す。表１は、マンガンペルオキシダーゼによる蛍光染料の分解に伴う蛍光強度の変化を示す。実施例１の結果から、マンガンペルオキシダーゼ酵素活性をもつ酵素液１および２は、４−０−メチルウンベリフェロン分解能を有することが明らかとなった。また、反応開始３０ｍｉｎ後には４７％の４−０−メチルウンベリフェロンが分解されることが分かった。
【００４９】
【表１】
【００５０】
＜実施例２：スチルベン系増白剤の分解＞
基質にもちいる蛍光物質以外は、実施例１と同様にして、実施例２を行った。基質には、スチルベン系増白剤であるＫａｙａｐｈｏｒ ＮＷ（日本化薬製）を用い、反応系での基質濃度を０．００１％とした。
【００５１】
＜結果＞
実施例２の結果を表２に示す。表２は、マンガンペルオキシダーゼによる蛍光染料の分解に伴う蛍光強度の変化を示す。実施例２の結果から、マンガンペルオキシダーゼ酵素活性をもつ酵素液１および２は、Ｋａｙａｐｈｏｒ ＮＷ分解能を有することが明らかとなった。また、反応開始３０ｍｉｎ後には９０％のＫａｙａｐｈｏｒ ＮＷが分解されることが分かった。
【００５２】
【表２】
【００５３】
実施例１および２の結果から、マンガンペルオキシダーゼは、蛍光染料および蛍光増白剤を分解できることが分かった。また本実施例の条件（反応時間３０ｍｉｎ）において、マンガンペルオキシダーゼは、ウンベリフェロンおよびスチルベン系増白剤をそれぞれ半分以下および９０％分解することから、本実施例における酵素液１および酵素液２の反応系は、実用的かつ効率的であることが明らかとなった。特許文献９には、微生物によるダイオキシンの分解が開示されているが、この文献において、ダイオキシンを９０％分解するのに１ヶ月を要している。このことから、マンガンペルオキシダーゼは、クマリン系蛍光染料およびスチルベン系増白剤の分解特性が著しく優れていることが分かる。したがって、マンガンペルオキシダーゼ処理することによって、蛍光染料、蛍光増白剤が存在する古紙パルプやパルプ製造時の排水を効率的かつ実用的に蛍光物質を分解することができる。
【００５４】
＜安全性試験＞
マンガンペルオキシダーゼの安全性を確認するため、以下の方法で「皮膚刺激性試験」および「急性経口毒性試験」を実施した。
【００５５】
＜皮膚刺激性試験＞
調製例１および調製例２により得られた酵素液１および酵素液２（それぞれ１．０Ｕ／ｍｌ、１００ｕｌ）を、各々、除毛後のＣ３Ｈマウス（オス、６週齢、各群１０匹、日本チャールズリバー（株）製）の背中に連続塗布した（１回／日、約１ヶ月間）。塗布期間および塗布終了後の２週間、マウスの背中において、紅斑、浮腫、炎症などの異常は特に観察されなかった。また、対照群（水塗布群）と比較し、体重推移においても有意差（Ｐ＜０．０５）は認められなかった。
【００５６】
酵素液１および酵素液２（それぞれ１．０Ｕ／ｍｌ）を、各々、除毛後のＩＣＲ系マウス（オス、６週齢、各群１０匹、日本チャールズリバー（株）製）に胃ゾンデを用いて経口投与した（投与量５ｇ／マウス体重１ｋｇ）。投与してから２週間後まで、死亡例はなかった。また、体重推移においても対照群（水投与群）と比較して有意差（Ｐ＜０．０５）は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明で得られるマンガンペルオキシダーゼを有効成分として含む蛍光染料分解剤は、安全性が高く、環境浄化、排水処理、パルプの製造分野に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンガンペルオキシターゼを有効成分とし、蛍光染料を分解する蛍光染料分解剤。
【請求項２】
前記マンガンペルオキシターゼは食用担子菌に由来するマンガンペルオキシターゼである、請求項１に記載の蛍光染料分解剤。
【請求項３】
前記蛍光染料はスチルベン系蛍光増白剤である、請求項１または２に記載の蛍光染料分解剤。
【請求項４】
蛍光染料を含む溶液中でグルコースオキシダーゼおよびグルコースを反応させ、過酸化水素を生成する工程と、
前記溶液にマンガンペルオキシターゼおよび２価のマンガンイオンを添加し、溶液中の蛍光染料と反応させて蛍光染料を分解する工程と、
を備える蛍光染料の分解方法。
【請求項５】
前記マンガンペルオキシターゼは食用担子菌に由来するマンガンペルオキシターゼである、請求項４に記載の蛍光染料の分解方法。
【請求項６】
前記蛍光染料はスチルベン系蛍光増白剤である、請求項４または５に記載の蛍光染料の分解方法。
【請求項７】
蛍光染料を含有する古紙を原料に用いる再生パルプの製造方法において、
請求項４〜６のいずれか一項に記載の蛍光染料の分解方法を行い、パルプ中の蛍光染料を分解する再生パルプの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の製造方法によって得られる再生パルプ。
【請求項９】
前記再生パルプは食品用包装紙として用いられる、請求項８に記載の再生パルプ。
【請求項１】
マンガンペルオキシターゼを有効成分とし、蛍光染料を分解する蛍光染料分解剤。
【請求項２】
前記マンガンペルオキシターゼは食用担子菌に由来するマンガンペルオキシターゼである、請求項１に記載の蛍光染料分解剤。
【請求項３】
前記蛍光染料はスチルベン系蛍光増白剤である、請求項１または２に記載の蛍光染料分解剤。
【請求項４】
蛍光染料を含む溶液中でグルコースオキシダーゼおよびグルコースを反応させ、過酸化水素を生成する工程と、
前記溶液にマンガンペルオキシターゼおよび２価のマンガンイオンを添加し、溶液中の蛍光染料と反応させて蛍光染料を分解する工程と、
を備える蛍光染料の分解方法。
【請求項５】
前記マンガンペルオキシターゼは食用担子菌に由来するマンガンペルオキシターゼである、請求項４に記載の蛍光染料の分解方法。
【請求項６】
前記蛍光染料はスチルベン系蛍光増白剤である、請求項４または５に記載の蛍光染料の分解方法。
【請求項７】
蛍光染料を含有する古紙を原料に用いる再生パルプの製造方法において、
請求項４〜６のいずれか一項に記載の蛍光染料の分解方法を行い、パルプ中の蛍光染料を分解する再生パルプの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の製造方法によって得られる再生パルプ。
【請求項９】
前記再生パルプは食品用包装紙として用いられる、請求項８に記載の再生パルプ。
【公開番号】特開２００９−１２４９７６（Ｐ２００９−１２４９７６Ａ）
【公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３０２１４５（Ｐ２００７−３０２１４５）
【出願日】平成１９年１１月２１日（２００７．１１．２１）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【出願人】（０００２１４２５０）ナガセケムテックス株式会社 (173)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２１日（２００７．１１．２１）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【出願人】（０００２１４２５０）ナガセケムテックス株式会社 (173)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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