蛍光画像補正方法および装置ならびにプログラム
【課題】 特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出する際に、蛍光が時間経過とともに蛍光強度が小さくなる蛍光標識検体を検出するときであっても、正確な蛍光の検出を行う。
【解決手段】 画像取得手段５１が、マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を主蛍光画像データＥＤ１として取得する。そして、画像補正手段６０が、画像取得手段５１により取得された主蛍光画像データＥＤ１を蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて補正する。
【解決手段】 画像取得手段５１が、マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を主蛍光画像データＥＤ１として取得する。そして、画像補正手段６０が、画像取得手段５１により取得された主蛍光画像データＥＤ１を蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて補正する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光色素で標識された蛍光標識検体から発生する蛍光を検出し蛍光画像データとして取得したときに、この蛍光画像データを補正する画像補正方法および装置ならびにプログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学分野における技術が急速に発展し、１０万個にも及ぶと考えられているヒトゲノムの塩基配列を解読することを１つの目的とするヒトゲノムプロジェクトが展開されている。一方、各種遺伝子疾患に影響を与えているＤＮＡに関する研究も進んでおり、その１つの方法としてマイクロアレイ技術が注目されている。このマイクロアレイ技術は、既に解読されている多数の異なるｃＤＮＡ（特異的結合物質の一例）を基板となるスライドガラス上の１．８×１．８（ｃｍ）の範囲にドットサイズ５０〜１５０（μｍ）のスポットとして約６４００個並べたマイクロアレイと称するもの、またはｃＤＮＡをナイロンメンブレンフィルタ上の８×１２（ｃｍ）、７×５（ｃｍ）または２２×２２（ｃｍ）の範囲にドットサイズ約０．５〜１（ｍｍ）のスポットとしてそれぞれ５８８個、５０００個、２７０００個並べたマクロアレイと称するもの、あるいは合成オリゴヌクレオチドをシリコン基板上の１．２８×１．２８（ｃｍ）の範囲にドットサイズ５０（μｍ）のスポットとして約６４０００個並べたＤＮＡチップと称するもの等を用いた技術である（上記マイクロアレイ、マクロアレイおよびＤＮＡチップ等を総称して「マイクロプレート」と称することとする。）。
【０００３】
すなわち、蛍光色素ａで標識された健常者の細胞から取り出したＤＮＡの蛍光標識検体Ａをピペット等でこのマイクロプレート上の各ｃＤＮＡに滴下して、蛍光標識検体ＡとｃＤＮＡとをハイブリダイズさせる。このハイブリタイズの処理の後にマイクロプレートは所定の溶液で処理され、ｃＤＮＡとハイブリタイズされなかった蛍光標識検体Ａは各スポットから除去され、ｃＤＮＡとハイブリタイズされた蛍光標識検体Ａは各スポットに残される。そして、上記処理が施されたマイクロプレート上の各検体のスポット（以後スポットと呼ぶ）に、蛍光色素ａを励起する励起光ＦＬを相対的に走査して、この励起光ＦＬの照射により発生した蛍光の検出結果を表す蛍光画像データを得る（たとえば特許文献１、２参照。）。
【０００４】
上記と同様の処理を、蛍光色素ｂで標識された遺伝子疾患を有する者の細胞から取り出したＤＮＡの蛍光標識検体Ｂに関しても行い、励起光の照射により発生した蛍光の検出結果を表す蛍光画像データを得、各スポット毎に蛍光標識検体Ａの各スポットから得られた蛍光画像データと蛍光標識検体Ｂの各スポットから得られた蛍光画像データとの比の値を求める。蛍光画像データの比の値は、異常のあるＤＮＡが滴下されたスポットほど大きくなる（あるいは小さくなる）ことから、各スポットにおける蛍光画像データの比の値が大きい方から順に例えば５０箇所分の蛍光画像データの比の値を、その信号が得られたスポットと対応付ける表として読み取り、この表に基づいて異常のあるＤＮＡが特定される。
【０００５】
なお、マイクロプレート上の各スポットから発せられる蛍光を検出する光学系には空間分解能が高く焦点深度が浅い共焦点光学系が多く用いられているので、共焦点光学系の焦点位置に一致させたマイクロプレート上のスポットへの励起光の照射によりスポットから発せられた蛍光を共焦点光学系の他方の焦点位置に配設されたピンホールを通過させて検出することにより、上記スポット以外の位置で発生した蛍光等のノイズを除去することができる。
【０００６】
ここで、上述した蛍光画像データの分析には、そのデータ自体の信頼性が保証されていることが必要となる。しかし、実際の実験において温度や湿度等の環境変化やマイクロプレートの傷、ハイブリダイゼーションの反応効率、蛍光の読取精度等の実験環境に起因して、たとえば同一種類の特異的結合物質に対し同一の蛍光標識検体をハイブリダイズさせたときであっても得られる蛍光画像データが異なってしまう場合がある。そこで、マイクロプレートから取得した蛍光画像データを用いて、実験工程における不具合を視覚により把握する方法（たとえば特許文献３参照。）や、マイクロプレート上の複数のスポットからそれぞれ取得した蛍光画像データを統計的に解析することにより、取得した蛍光画像データを補正する方法（たとえば特許文献４参照。）等が提案されている。
【特許文献１】特開２００１−７４６５６号公報
【特許文献２】特開２００１−７４６５７号公報
【特許文献３】特開２００２−７１６８８号公報
【特許文献４】特開２００３−２８８６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述した特許文献２、３のような実験環境による信頼性低下を防止するための蛍光画像データの補正においては、励起光が照射された蛍光色素から射出される蛍光は常に一定の強度を有していることが前提となっている。つまり、検体を標識している蛍光色素は、励起光が照射されれば常に所定の蛍光を出力することが前提となっている。
【０００８】
ところが、特定の蛍光色素と特定の検体との組み合わせにおいては、蛍光色素自体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少することが実験において判明した。すなわち、異なるスポットに存在する同一種類の蛍光標識検体に対し同一の時間に励起光をそれぞれ照射し、各スポットから射出される蛍光を同一の時間に検出したとき、蛍光の強度は同一のものとなる。しかし、異なるスポットに存在する同一種類の蛍光標識検体に対し同一の時間に励起光がそれぞれ照射され、各スポットから射出される蛍光を異なる時間に検出したとき、蛍光の強度が異なったものとなってしまうことがわかった。
【０００９】
この蛍光の経時変化により最後に励起光を照射した蛍光標識検体は、最初に検出された蛍光と最後に検出された蛍光とが同じ強度で発光していたときであっても、最初に励起光を照射された蛍光標識検体よりも弱い蛍光を発するものであると認識されてしまい、信頼性の高い分析ができないという問題がある。
【００１０】
そこで、本発明は、蛍光が時間経過とともに蛍光強度が小さくなる蛍光標識検体を分析するときであっても、する蛍光画像補正方法および装置ならびにプログラムを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の蛍光画像補正方法は、マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して取得した主蛍光画像データを補正する蛍光画像補正方法において、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データを補正することを特徴とするものである。
【００１２】
本発明の蛍光画像補正装置は、マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して主蛍光画像データを取得する画像取得手段と、画像取得手段により取得された主蛍光画像データを補正する画像補正手段とを有し、画像補正手段が、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データを補正するものであることを特徴とするものである。
【００１３】
本発明の蛍光画像補正プログラムは、コンピュータに、マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出し取得した蛍光画像データを補正することを実行させるものであり、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、蛍光画像データを補正することを実行させるためのものである。
【００１４】
ここで、「マイクロプレート」とは、複数のスポットを有し、各スポット上に特異的結合物質が固着されているプレート状のものであればなんでもよい。また、「スポット」とは、マイクロプレート状における特異的結合物質が固着されている単位領域をいう。「ハイブリダイズ」とは、核酸が相補的二重鎖形成する性質を利用して、特定の塩基配列にそれと相補的なヌクレオチド鎖を結合させることをいう。「蛍光標識検体」とは蛍光色素により標識されたホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その外の蛋白質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の検体をいい、「特異的結合物質」とはホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ヌクレオチド鎖等であって、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その外の蛋白質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成などが既知の物質をいう。
【００１５】
また、「主蛍光画像データ」とは、蛍光標識検体の分析に用いるための蛍光画像データをいい、「補助蛍光画像データ」とは、主蛍光画像データとは別に励起光の照射が行われることにより取得された、蛍光標識検体の経時変化特性を算出するための蛍光画像データをいう。「時間経過」とは、励起光を照射しているか否かに拘わらず、蛍光標識検体が特異的結合物質とハイブリダイズされてからの時間経過をいう。
【００１６】
なお、画像補正手段は、たとえば主蛍光画像データを取得したときの特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体特有の経時変化特性を有し、この経時変化特性に基づいて主蛍光画像データを補正するようにしてもよいし、主蛍光画像データとは別の補助蛍光画像データを取得したときに、主蛍光画像データから経時変化特性を算出しに基づいて主蛍光画像データを補正するものであればよい。
【００１７】
主蛍光画像データとは別の補助蛍光画像データを取得するとき、画像取得手段は、主蛍光画像データを取得した所定のスポット上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して所定のスポットにおける補助蛍光画像データを取得するものであってもよい。さらに、画像補正手段は、画像取得手段により取得された所定のスポットにおける主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データと、主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データの取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段を有するものであってもよい。
【００１８】
なお、所定のスポットが複数のスポットであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データが、所定のスポットにおける主蛍光画像データを取得する際の励起光のマイクロプレートに対する走査方向とは異なる方向に励起光を走査して取得した蛍光画像データであってもよい。
【００１９】
あるいは、所定のスポットが複数のスポットであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データが、所定のスポットにおける主蛍光画像データを取得する際の励起光のマイクロプレートに対する走査速度とは異なる速度でマイクロプレートを励起光で走査して取得した蛍光画像データであってもよい。
【００２０】
さらに、マイクロプレートが、主蛍光画像データが取得される複数のスポットと、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体が存在する、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットを有するものであってもよい。
【００２１】
なお、検査用スポットに存在する特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体は、主蛍光画像データを取得するスポットの特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体と同一の経時変化特性を有するものであって、この各検査用スポットは、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出するようになっている。
【００２２】
このとき、画像取得手段は、主蛍光画像データを取得するとともに、検査用スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、該蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して複数の検査用蛍光画像データを取得するようにしてもよい。この「検査用蛍光画像データ」とは、主蛍光画像データの取得するための励起光の照射が行われたとき、これと同時に検査用スポットに励起光が照射され取得された、蛍光標識検体の経時変化特性を算出するための蛍光画像データをいう。
【００２３】
さらに、画像補正手段は、画像取得手段において取得された各検査用スポット毎の複数の検査用蛍光画像データと、該検査用蛍光画像データの取得の際の検査用スポット間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、検査用スポットに存在する蛍光標識検体固有の経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであってもよい。
【００２４】
また、マイクロプレートが、行方向および列方向に沿って格子状に配列された複数のスポットを有するとき、画像取得手段は、各スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し、マイクロプレートを励起光により列方向に走査しながら行方向に移動させることにより、各スポットの蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して複数の主蛍光画像データを取得するものであってもよい。
【００２５】
このとき、画像補正手段は、各スポット列毎の主蛍光画像データの平均値と、各スポット列間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであってもよい。
【００２６】
なお、「スポット列」とは、マイクロプレートの列方向に並んだ複数のスポットをいい、「各スポット列間における励起光照射の時間間隔」とは、たとえば複数のスポット列の中からそれぞれ同一行上に存在するスポット間の時間間隔をいう。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の蛍光画像補正方法および装置ならびにプログラムによれば、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに小さくなるときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データを補正することにより、蛍光が時間経過とともに減少するような特性を有する蛍光標識検体の蛍光を検出するときであっても、この経時変化特性に基づいて補正することができるため、主蛍光画像データを用いて正確な分析を行うことができる。
【００２８】
なお、画像取得手段が、主蛍光画像データの取得とは別に、主蛍光画像データを取得した所定のスポット上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して所定のスポットにおける補助蛍光画像データを取得するものであり、画像補正手段が、画像取得手段により取得された所定のスポットにおける主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データと、主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データの取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段を有する構成にすれば、主蛍光画像データの取得する際に補助蛍光画像データを取得し、主蛍光画像データを補助蛍光画像データとを用いて経時変化特性を算出することにより、効率的に経時変化特性を算出し取得することができる。
【００２９】
また、所定のスポットが複数のスポットであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データが、所定のスポットにおける主蛍光画像データを取得する際の励起光のマイクロプレートに対する走査方向とは異なる方向に励起光を走査して取得した蛍光画像データであれば、主蛍光画像データと補助蛍光画像データとを取得したときの時間間隔が各スポット毎に異なるようにし、所定の複数のスポットから取得した主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データを用いて主蛍光画像データが取得された蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、同一種類の蛍光標識検体がハイブリダイズされたすべてのスポット毎に経時変化特性を算出することが不要となり、効率的に経時変化特性を算出することができる。
【００３０】
さらに、所定のスポットが複数のスポットであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データが、所定のスポットにおける主蛍光画像データを取得する際の励起光のマイクロプレートに対する走査速度とは異なる速度でマイクロプレートを励起光で走査して取得した蛍光画像データであれば、主蛍光画像データと補助蛍光画像データとを取得したときの時間間隔が各スポット毎に異なるようにし、所定の複数のスポットから取得した主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データを用いて主蛍光画像データが取得された蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、同一種類の蛍光標識検体がハイブリダイズされたすべてのスポット毎に経時変化特性を算出することが不要となり、効率的に経時変化特性を算出することができる。
【００３１】
また、マイクロプレートが、主蛍光画像データが取得される複数のスポットと、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体が存在する、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットを有し、画像取得手段が、検査用スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し各検査スポット毎に異なる時刻に励起光を照射することにより、検査用スポットの蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して各検査用スポット毎の検査用蛍光画像データを取得するものであり、画像補正手段が、画像取得手段において取得された各検査用スポット毎の複数の検査用蛍光画像データと、検査用蛍光画像データの取得の際の検査用スポット間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、検査用スポットに存在する蛍光標識検体固有の経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであれば、主蛍光画像データの取得とともに検査用蛍光画像データをも取得し、複数の検査用スポットに対する励起光照射の時間間隔とにより蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、効率的に経時変化特性を算出することができる。
【００３２】
また、マイクロプレートが、行方向および列方向に沿って格子状に配列された複数のスポットを有するときに、画像取得手段が、各スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し、マイクロプレートを励起光により列方向に走査しながら行方向に移動させることにより、各スポット毎の蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して複数の主蛍光画像データを取得するものであり、画像補正手段が、各スポット列毎の主蛍光画像データの平均値と、各スポット列間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有する構成にすれば、主蛍光画像データを用いて経時変化特性を算出することができるため、効率的に主蛍光画像データの補正を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、図面を参照して本発明の蛍光検出システムの実施の形態を詳細に説明する。図１は本発明の画像補正装置を用いて蛍光検出システムの一例を示す構成図である。図１の蛍光検出システム１は、マイクロプレート上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出する蛍光を検出し蛍光画像データとして出力する蛍光検出装置１０と、蛍光検出装置１０から蛍光画像データを取得し、蛍光画像データの補正を行う画像補正装置５０とを有している。
【００３４】
ここで、蛍光検出装置１０は、マイクロプレートを収容するために開閉するプレート収容部１０ａを有しており、このプレート収容部１０ａからマイクロプレートＭＰが装填される。このマイクロプレートＭＰは、図２に示すように、格子状の複数のスポットＷを有し、このスポットＷには特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体が存在している。
【００３５】
図３は蛍光検出装置の一例を示す構成図であり、図１から図３を参照して蛍光検出装置１０について説明する。蛍光検出装置１０は、マイクロプレートＭＰに励起光を走査しながら照射する励起光照射手段２０と、励起光照射手段２０により励起光が蛍光標識検体に照射されたとき、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出する蛍光検出手段３０と、蛍光検出手段３０により検出された蛍光を蛍光画像データとして出力するデータ出力手段４０とを備えている。
【００３６】
ここで、励起光照射手段２０は、励起光ＦＬを射出する励起光源２１と、射出された励起光ＦＬをマイクロプレートＭＰの蛍光標識検体に集光する集光レンズ２４と、励起光ＦＬを矢印Ｙ方向（主走査方向）に走査させるために集光レンズ２４を移動させるレンズ移動手段２５と、励起光を矢印Ｘ方向に走査させるためにマイクロプレートＭＰを矢印Ｘ方向に移動させるプレート移動手段２６とを備えている。
【００３７】
励起光源２１は、蛍光標識検体に用いられる蛍光色素の種類に応じて波長の異なる（たとえば６４０ｎｍ、５３２ｎｍ、４７３ｎｍ）励起光ＦＬを出力する機能を有する。集光レンズ２４は、励起光源２１から射出された励起光ＦＬがミラー２２ａ、２２ｂを介し穴あきミラー２３の穴を貫通して入射されたときに、励起光ＦＬをマイクロプレートＭＰの蛍光標識検体に集光するものである。
【００３８】
このとき、マイクロプレートＭＰには集光レンズ２４により集光された励起光ＦＬが矢印Ｘ方向およびＹ方向に走査しながら照射されるようになっている。具体的には、集光レンズ２４は揺動可能に設けられており、レンズ移動手段２５に接続されている。そして、レンズ移動手段２５は集光位置がマイクロプレートＭＰの矢印Ｙ方向に走査するように集光レンズ２４を揺動させるようになっている。また、マイクロプレートＭＰは、矢印Ｘ方向（副走査方向）に移動可能に設けられており、プレート移動手段２６に接続されている。そして、プレート移動手段２６はマイクロプレートＭＰを矢印Ｘ方向に移動させるようになっている。つまり、励起光ＦＬは、集光レンズ２４の移動により矢印Ｙ方向に走査し、マイクロプレートＭＰの移動により矢印Ｘ方向に走査することになるため、マイクロプレートＭＰ上に格子状に配列された複数の蛍光標識検体に対して励起光ＦＬを走査しながら照射することができる。
【００３９】
蛍光検出手段３０は、たとえばＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｅｉｅｒ Ｔｕｂｅｓ：光電子増倍管）からなっており、蛍光がアナログ信号として検出されるようになっている。なお、蛍光標識検体から射出された蛍光は集光レンズ２４に入射されて平行光になり、穴あきミラー２３のミラー部分により反射されてカラーフィルター３１に入射される。その後カラーフィルター３１から射出した蛍光がミラー３２を介してレンズ３３に入射され、レンズ３３により蛍光検出手段３０に集光されるようになっている。
【００４０】
データ出力手段４０は、蛍光検出手段３０から出力されるアナログ信号をデジタル信号に返還するとともに信号処理を行うことにより、検出された蛍光を蛍光画像データとして出力する機能を有している。ここで、上述のようにマイクロプレートＭＰの各スポットＷには、励起光ＦＬが矢印Ｘ方向および矢印Ｙ方向に対して走査しながら照射されていく。このとき、蛍光検出手段３０が励起光ＦＬが蛍光標識検体に照射されるたびに射出される蛍光を検出し、データ出力手段４０が複数の蛍光標識検体からそれぞれ射出される蛍光を蛍光画像データＥＤとして出力するようになっている。
【００４１】
図３を参照して蛍光検出装置１０の動作例について説明する。まず、励起光照射手段２０から励起光ＦＬがミラー２２ａ、２２ｂおよび集光レンズ２４を介して、マイクロプレートＭＰのスポットＷに照射される。すると、励起光ＦＬが照射されたスポットＷに存在する蛍光標識検体から蛍光が射出する。射出した蛍光が蛍光検出手段３０により検出されてデータ出力手段４０から蛍光画像データとして出力される。このとき、レンズ移動手段２５およびプレート移動手段２６により、励起光ＦＬはマイクロプレートＭＰに対して走査しながら照射されるため、マイクロプレートＭＰに存在する各スポットＷ毎にそれぞれ蛍光画像データＥＤが出力されていく。
【００４２】
図４は本発明の画像補正装置の実施の形態を示すブロック図であり、図１と図４を参照して画像補正装置５０について説明する。画像補正装置５０は、マイクロプレートＭＰのスポットＷに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を主蛍光画像データＥＤ１として取得する画像取得手段５１と、画像取得手段５１により取得された主蛍光画像データＥＤ１を補正する画像補正手段６０とを有している。
【００４３】
ここで、画像取得手段５１は、蛍光標識検体を分析するために用いる主蛍光画像データＥＤ１と、主蛍光画像データＥＤ１の取得とは別に、主蛍光画像データＥＤ１を取得した所定のスポットＷ上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光ＦＬを照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して所定のスポットＷにおける補助蛍光画像データＥＤ２とを取得する機能を有している。
【００４４】
具体的には、画像取得手段５１は、図５（ａ）に示すように、マイクロプレートＭＰ上に配列された複数のスポットＷに対して励起光ＦＬを照射しながら走査したときに取得された複数の補助蛍光画像データＥＤ２と、補助蛍光画像データＥＤ２を取得したときの励起光ＦＬの走査方向とは異なる走査方向で励起光ＦＬの照射したときに取得された主蛍光画像データＥＤ１とを取得するようになっている。つまり、図５（ａ）において、励起光ＦＬがまずスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃの順番で照射されるように走査され、補助蛍光画像データＥＤ２ａ、ＥＤ２ｂ、ＥＤ２ｃが取得される。次に、マイクロプレートＭＰが蛍光検出装置１０に対し向きを換えて装着される等することにより、スポットＷｃ、Ｗｂ、Ｗａの順番で励起光ＦＬが照射されるように走査され、補助蛍光画像データＥＤ２ｃ、ＥＤ２ｂ、ＥＤ２ａが取得される。
【００４５】
なお、走査方向の異なる２つの蛍光画像データＥＤ１、ＥＤ２を取得するにあたり、励起光照射手段２０による励起光の走査方向は変えずにマイクロプレートＭＰの向きをかえて２つの蛍光画像データＥＤ１、ＥＤ２を取得するようにしてもよいし、マイクロプレートＭＰの向きを変えずに励起光照射手段２０の励起光の走査方向およびマイクロプレートＭＰの移動方向を逆にすることより、２つの蛍光画像データを取得するようにしてもよい。このような励起光の走査制御は、制御コントローラ７０により行われる。
【００４６】
次に、図４と図５を用いて画像補正手段６０について説明する。図４の画像補正手段６０は、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データＥＤ１を補正するものであって、画像取得手段５１により取得された所定のスポットＷにおける主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２と、主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２の取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段６１と、取得された経時変化特性を用いて主蛍光画像データＥＤ１を補正する補正手段６２とを有する。
【００４７】
具体的には、変化特性取得手段６１は、図５（ａ）に示すように、複数の所定のスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃに存在する蛍光標識検体から取得した３つの補助蛍光画像データＥＤ２ａ、ＥＤ２ｂ、ＥＤ２ｃを取得する。また、変化特性取得手段６１は、複数の所定のスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃに存在する蛍光標識検体から取得した３つの主蛍光画像データＥＤ１ａ、ＥＤ１ｂｖ、ＥＤ１ｃを取得する。そして、スポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃについて、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔に蛍光の強度がどのぐらい減少したかを算出する。具体的には、補助蛍光画像データＥＤ２の蛍光強度を主蛍光画像データＥＤ１の蛍光強度で割り、蛍光強度の減少率を算出する。
【００４８】
このとき、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔は、各スポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃについてそれぞれ異なっている。図５（ａ）に示すような励起光の走査を行ったとき、一回目の励起光の照射から２回目の励起光の照射までの時間間隔はスポットＷｃが最も短く、次いでスポットＷｂ、Ｗａの順に短くなる。
【００４９】
よって、図５（ｂ）に示すように、変化特性取得手段６１は、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔が異なる３つの減少率を取得することができる。そこで、変化特性取得手段６１は、３つの減少率を線で結ぶことにより、蛍光の強度が時間経過とともに小さくなる経時変化特性を算出し取得する。その後、補正手段６２が、主蛍光画像データＥＤ１を取得した時刻から、主蛍光画像データＥＤ１に用いる減少率を図５（ｂ）の経時変化特性から検出し、主蛍光画像データＥＤ１を減少率で除することにより補正する。
【００５０】
これにより、時間経過とともに蛍光の強度が減少したときであっても、その減少分を補正し、精度がよく信頼性の高い蛍光分析を行うことができる。すなわち、上述のような蛍光検出システム１において、蛍光色素は励起光を照射すれば蛍光を射出するものであるため、蛍光が時間経過とともに減衰しないと考えられていた。つまり、図５（ｂ）において、主蛍光画像データＥＤ１と補助蛍光画像データＥＤ２とが等しくなると考えられていた。しかし、実験において、蛍光が時間経過とともに減衰することが認められた。これは、蛍光色素と検査対象である検体とが何らかの化学反応を起こし、蛍光色素による蛍光が時間経過とともに弱くなってしまうことが原因であると考えられる。そこで、蛍光が時間経過とともに減少するような特性を有する蛍光標識検体の蛍光を検出するときであっても、算出した経時変化特性に基づいて補正することができるため、主蛍光画像データＥＤ１を用いて正確な分析を行うことができる。
【００５１】
さらに、１つのマイクロプレートＭＰに対して走査方向を変えて複数回励起光の照射を行い、補助蛍光画像データＥＤ２の取得から主蛍光画像データＥＤ１の取得までの時間間隔が、各スポットのスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃについてそれぞれ異なるようにすることにより、すべてのスポットＷに対して経時変化特性を算出する場合に比べて効率よく経時変化特性を算出することができる。
【００５２】
図６は本発明の画像補正方法の好ましい実施の形態を示すフローチャートであり、図１から図６を参照して画像補正方法について説明する。まず、蛍光検出装置１０においてスポットＷに存在する蛍光標識検体に対し励起光ＦＬが照射される（ステップＳＴ１）。そして、蛍光標識検体から射出される蛍光が補助蛍光画像データＥＤ２として画像取得手段５１に取得される（ステップＳＴ２）。励起光ＦＬはマイクロプレートＭＰの複数のスポットＷに対して走査しながら照射され、画像取得手段５１において複数のスポットに対応した補助蛍光画像データＥＤ２が取得される（ステップＳＴ１〜ステップＳＴ３）。
【００５３】
次に、励起光ＦＬがマイクロプレートＭＰに対し補助蛍光画像データＥＤ２を取得した際の走査方向とは逆向きに走査される（図５（ａ）参照）（ステップＳＴ４）。励起光ＦＬはマイクロプレートＭＰの複数のスポットＷに対して走査しながら照射され、画像取得手段５１において複数のスポットに対応した主蛍光画像データＥＤ１が取得される（ステップＳＴ４〜ステップＳＴ６）。
【００５４】
その後、画像補正装置５０において、主蛍光画像データＥＤ１と補助蛍光画像データＥＤ２とを用いて蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性が算出され（ステップＳＴ７）、この経時変化特性に基づいて主蛍光画像データＥＤ１が補正される（ステップＳＴ８）。具体的には、変化特性取得手段６１において図５（ｂ）に示すような経時変化特性が算出され、補正手段６２において経時変化特性に基づいて主蛍光画像データＥＤ１が補正される。
【００５５】
これにより、時間経過とともに蛍光の強度が減少したときであっても、経時変化特性を算出し、その経時変化特性に基づいて蛍光の強度の減少分を補正することができるため、精度がよく信頼性の高い蛍光分析を行うことができる。
【００５６】
ところで、経時変化特性を算出する方法としては、上述した励起光の走査方向を変える方法の他に、主蛍光画像データとは異なる走査速度で励起光を照射したときの蛍光を示す補助蛍光画像データを用いて経時変化特性を取得する方法、同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットにおいてハイブリダイズされた蛍光標識検体の蛍光検出し、得られた複数の検査用蛍光画像データから経時変化特性を取得する方法、特異的結合物質が存在する複数の格子状に配列されたスポットにおいてハイブリダイズされた蛍光標識検体の蛍光を検出し、得られた蛍光画像データから経時変化特性を取得する方法があげられる。以下に、各方法について説明する。
【００５７】
まず、走査速度の異なる２つの蛍光画像データを用いて経時変化特性を取得する方法について説明する。図７は主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２の取得方法および経時変化特性の一例を示す模式図である。図７（ａ）において、画像取得手段５１は、マイクロプレートＭＰ上の複数の蛍光標識検体に対して励起光ＦＬを照射しながら走査したときに取得された主蛍光画像データＥＤ１と、主蛍光画像データＥＤ１を取得したときの走査速度とは異なる走査速度で励起光ＦＬを照射したときに取得された補助蛍光画像データＥＤ２とを取得するようになっている。
【００５８】
具体的には、複数の主蛍光画像データＥＤ１は、励起光ＦＬの照射時間が蛍光検出を行うのに必要な時間だけ各スポットに励起光が照射されるような主走査速度ＳＶ１で励起光ＦＬを走査しながら照射したときに取得されたものである（本スキャン）。一方、複数の補助蛍光画像データＥＤ２は、主蛍光画像データＥＤ１の取得前に行われる、主走査速度ＳＶ１よりも速い補助走査速度ＳＶ２で励起光ＦＬを走査しながら照射したときに取得されたものである（プレスキャン）。この主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２を用いて上述したように蛍光強度の減少率を算出し、経時変化特性を取得することもできる。このとき、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔は、各スポットＷのスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃについてそれぞれ異なっている。図７（ａ）に示すような励起光の走査を行ったとき、一回目の励起光の照射から２回目の励起光の照射までの時間間隔はスポットＷｃが最も短く、次いでスポットＷｂ、Ｗａの順に短くなる。
【００５９】
よって、図７（ｂ）に示すように、変化特性取得手段６１は、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔が異なる３つの減少率を取得することができる。そこで、変化特性取得手段６１は、３つの減少率を線で結ぶことにより、蛍光の強度が時間経過とともに小さくなる経時変化特性を算出し取得する。その後、補正手段６２が、主蛍光画像データＥＤ１を取得した時刻から、主蛍光画像データＥＤ１に用いる減少率を図７（ｂ）の経時変化特性から検出し、主蛍光画像データＥＤ１を減少率で除することにより補正する。
【００６０】
図７に示すような方法であっても、時間経過とともに蛍光の強度が減少したときに経時変化特性を算出し、その経時変化特性に基づいて蛍光の強度の減少分を補正することができるため、精度がよく信頼性の高い蛍光分析を行うことができる。さらに、蛍光検出装置１０において通常行われるプレスキャンと本スキャンを用いて蛍光標識検体の蛍光強度の減少率を算出し取得することができるため、蛍光検出装置１０に対する特別な制御が不要であり、効率よく蛍光画像データの補正を行うことができる。
【００６１】
次に、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットから取得した検査用蛍光画像データＥＸＤを用いて経時変化特性を取得する方法について説明する。図８は主蛍光画像データＥＤ１を取得するための複数のスポットと、検査用蛍光画像データＥＸＤを取得するための検査用スポットとを有するマイクロプレートＭＰの一例を示す模式図である。具体的には、図８（ａ）において、マイクロプレートＭＰには、それぞれ各検査用スポットＷａ〜Ｗｆに同一の蛍光強度で蛍光を射出するような、ハイブリダイズされた蛍光標識検体がそれぞれ存在している。図８（ａ）においては、マイクロプレートＭＰの各列にそれぞれ１つずつ検査用スポットＷａ〜Ｗｆを配置した場合について例示している。なお、検査用スポットＷａ〜Ｗｆの配置位置は、後述するように、各検査用スポットＷａ〜Ｗｆに異なる時刻に励起光ＦＬが照射されるようなものであればよい。
【００６２】
そして、励起光照射手段２０において、検査用スポットＷａ〜Ｗｆを含むマイクロプレートＭＰの各スポットに励起光ＦＬを走査しながら照射する。すると、各検査用スポットＷａ〜Ｗｆには異なる時刻に励起光ＦＬが照射されることになる。そして、画像取得手段５１は、マイクロプレートＭＰ上の各スポットから主蛍光画像データＥＤ１を取得すると共に、各検査用スポットＷａ〜Ｗｆから検査用蛍光画像データＥＸＤａ〜ＥＸＤｆを取得する。その後、変化特性取得手段６１は、複数の検査用蛍光画像データＥＸＤａ〜ＥＸＤｆが示す蛍光強度と、検査用スポットＷａ〜Ｗｆに励起光ＦＬを照射したときの時刻とにより、図８（ｂ）に示すような経時変化特性を算出する。そして、補正手段６２が、主蛍光画像データＥＤ１を取得した時刻に合わせて、算出した減少率を用いて主蛍光画像データＥＤ１を補正することにより、時間経過とともに減少した蛍光の強度を補正する。
【００６３】
図８に示すような方法であっても、時間経過とともに蛍光の強度が減少したときに経時変化特性を算出し、その経時変化特性に基づいて蛍光の強度の減少分を補正することができるため、精度がよく信頼性の高い蛍光分析を行うことができる。
【００６４】
次に、同一の特異的結合物質とハイブリダイズされた複数の蛍光標識検体から射出された主蛍光画像データを用いて経時変化特性を取得する方法について説明する。図９は同一の特異的結合物質とハイブリダイズされた複数の蛍光標識検体を格子状に配列したマイクロプレートＭＰの一例を示す模式図である。
【００６５】
図９（ａ）において、画像取得手段５１は、マイクロプレートＭＰを励起光により列方向（矢印Ｙ１方向）に走査しながら行方向（矢印Ｘ１方向）に移動させたときの複数の主蛍光画像データＥＤ１を取得するようになっている。そして、変化特性取得手段６１は、図９（ｂ）のように、励起光の走査方向に並んだ複数のスポット列Ｗ３１〜Ｗ３６から射出された複数の主蛍光画像データＥＤ１の平均値と、励起光ＦＬを走査したときの時刻とに基づいて経時変化特性を算出し取得する。そして、補正手段６２は、算出した経時変化特性と、各蛍光標識検体に励起光を照射した時刻とを用いて、取得した主蛍光画像データＥＤ１を補正するようになっている。
【００６６】
このように、経時変化特性を算出する際に、実際の画像取得対象である主蛍光画像データＥＤ１を用いることにより、効率よく経時変化特性を算出し画像の補正を行うことができる。
【００６７】
なお、図９の方法においては、測定対象から得られた主蛍光画像データＥＤ１を用いて経時変化特性を求めるようにしている。つまり、経時変化特性を考慮しなければスポット列の主蛍光画像データＥＤ１の平均値は各スポット列同士において略同一となる、という前提の下で経時変化特性を算出している。
【００６８】
つまり、一般的にマイクロプレート（ＤＮＡチップ）には各スポットにＤＮＡはランダムに配置されている。一方、マイクロプレート（ＤＮＡチップ）には数万ものスポットが設けられており、１つの列のスポット数は１００個以上存在することになる。なお、蛍光検出装置１０の検出レベルも０ｄｉｇｉｔ〜６５５３５ｄｉｇｉｔという有限な整数である。ランダムにＤＮＡが配列された数万ものスポットという有限母集団から、数百個のスポットを含むスポット列毎に標本化しその平均値を取った場合、各スポット列同士の平均は統計学的に略同一になる。したがって、主蛍光画像データＥＤ１を用いて経時変化特性を効率的に算出することができる。
【００６９】
上記各実施の形態によれば、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに小さくなるときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データＥＤ１を補正することにより、蛍光が時間経過とともに減少するような特性を有する蛍光標識検体の蛍光を検出するときであっても、この経時変化特性に基づいて補正することができるため、主蛍光画像データＥＤ１を用いて正確な分析を行うことができる。
【００７０】
なお、画像取得手段５１が、主蛍光画像データＥＤ１の取得とは別に、主蛍光画像データＥＤ１を取得した所定のスポット上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光ＦＬを照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して所定のスポットにおける補助蛍光画像データＥＤ２を取得するものであり、画像補正手段６０が、画像取得手段５１により取得された所定のスポットにおける主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２と、主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２の取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段６１を有する構成にすれば、主蛍光画像データＥＤ１の取得する際に補助蛍光画像データＥＤ２を取得し、主蛍光画像データＥＤ１を補助蛍光画像データＥＤ２とを用いて経時変化特性を算出することにより、効率的に経時変化特性を算出し取得することができる。
【００７１】
また、図５に示すように、所定のスポットが複数のスポットＷａ〜Ｗｃであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データＥＤ２が、所定のスポットにおける主蛍光画像データＥＤ１を取得する際の励起光のマイクロプレートＭＰに対する走査方向とは異なる方向に励起光を走査して取得した蛍光画像データであれば、主蛍光画像データＥＤ１と補助蛍光画像データＥＤ２とを取得したときの時間間隔が各スポット毎に異なるようにし、所定の複数のスポットＷａ〜Ｗｃから取得した主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２を用いて主蛍光画像データＥＤ１が取得された蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、同一種類の蛍光標識検体がハイブリダイズされたすべてのスポット毎に経時変化特性を算出することが不要となり、効率的に経時変化特性を算出することができる。
【００７２】
さらに、図７に示すように、所定のスポットが複数のスポットＷａ〜Ｗｃであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データＥＤ２が、所定のスポットＷａ〜Ｗｃにおける主蛍光画像データＥＤ１を取得する際の励起光のマイクロプレートＭＰに対する走査速度とは異なる速度でマイクロプレートＭＰを励起光ＦＬで走査して取得した蛍光画像データであれば、主蛍光画像データＥＤ１と補助蛍光画像データＥＤ２とを取得したときの時間間隔が各スポットＷａ〜Ｗｃ毎に異なるようにし、所定の複数のスポットＷａ〜Ｗｃから取得した主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２を用いて主蛍光画像データＥＤ１が取得された蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、同一種類の蛍光標識検体がハイブリダイズされたすべてのスポット毎に経時変化特性を算出することが不要となり、効率的に経時変化特性を算出することができる。
【００７３】
また、図８に示すように、画像取得手段５１が、複数の検査用スポットＷａ〜Ｗｆにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し各検査スポット毎Ｗａ〜Ｗｆに異なる時刻に励起光を照射することにより、検査用スポットＷａ〜Ｗｆの蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して各検査用スポットＷａ〜Ｗｆ毎の検査用蛍光画像データＥＸＤを取得するものであり、画像補正手段６０が、画像取得手段５１において取得された各検査用スポットＷａ〜Ｗｆ毎の複数の検査用蛍光画像データＥＸＤａ〜ＥＸＤｆと、検査用蛍光画像データＥＸＤの取得の際の検査用スポットＷａ〜Ｗｆ間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、検査用スポットＷａ〜Ｗｆに存在する蛍光標識検体固有の経時変化特性を取得する変化特性取得手段６１を有することにより、主蛍光画像データＥＤ１の取得とともに検査用蛍光画像データＥＸＤを取得して経時変化特性を算出するため、効率的に経時変化特性を算出することができる。
【００７４】
さらに、図９に示すように、マイクロプレートＭＰが、行方向および列方向に沿って格子状に配列された複数のスポットを有するときに、画像取得手段５１が、同数の特異的結合物質が存在する複数のスポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し、マイクロプレートＭＰを励起光ＦＬにより列方向に走査しながら行方向に移動させることにより、各スポット毎の蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して複数の主蛍光画像データＥＤ１を取得するものであり、画像補正手段６０が、各スポット列Ｗ３１〜Ｗ３６毎の蛍光画像データＥＤ１の平均値と、各スポット列間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有する構成にすれば、主蛍光画像データＥＤ１を用いて経時変化特性を算出することができるため、効率的に蛍光画像データの補正を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の画像補正装置の好ましい実施の形態を示す外観図
【図２】本発明の画像補正装置において補正される蛍光画像データを取得する際に使用するマイクロプレートの一例を示す模式図
【図３】本発明の画像補正装置において補正される蛍光画像データを取得するための蛍光検出装置の一例を示す構成図
【図４】本発明の画像補正装置の好ましい実施の形態を示すブロック図
【図５】図４の画像補正装置において、画像取得手段が２つの蛍光画像データを取得する際の励起光の走査方法の一例を示す模式図
【図６】本発明の画像補正方法の好ましい実施の形態を示すフローチャート
【図７】本発明の画像補正装置において、画像取得手段が２つの蛍光画像データを取得する際の励起光の走査方法の別の一例を示す模式図
【図８】本発明の画像補正装置において、画像取得手段が経時変化特性を取得するのに用いられる蛍光画像データを取得する際のマイクロプレートの一例を示す模式図
【図９】本発明の画像補正装置において、画像取得手段が経時変化特性を取得するのに用いられる蛍光画像データを取得する際のマイクロプレートの一例を示す模式図
【符号の説明】
【００７６】
１ 蛍光検出システム
１０ 蛍光検出装置
２０ 励起光照射手段
２１ 励起光源
３０ 蛍光検出手段
５０ 画像補正装置
５１ 画像取得手段
６０ 画像補正手段
６１ 変化特性取得手段
６２ 補正手段
ＥＤ１ 主蛍光画像データ
ＥＤ２ 補助蛍光画像データ
ＥＸＤ 検査用蛍光画像データ
ＦＬ 励起光
ＭＰ マイクロプレート
Ｗ スポット
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光色素で標識された蛍光標識検体から発生する蛍光を検出し蛍光画像データとして取得したときに、この蛍光画像データを補正する画像補正方法および装置ならびにプログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学分野における技術が急速に発展し、１０万個にも及ぶと考えられているヒトゲノムの塩基配列を解読することを１つの目的とするヒトゲノムプロジェクトが展開されている。一方、各種遺伝子疾患に影響を与えているＤＮＡに関する研究も進んでおり、その１つの方法としてマイクロアレイ技術が注目されている。このマイクロアレイ技術は、既に解読されている多数の異なるｃＤＮＡ（特異的結合物質の一例）を基板となるスライドガラス上の１．８×１．８（ｃｍ）の範囲にドットサイズ５０〜１５０（μｍ）のスポットとして約６４００個並べたマイクロアレイと称するもの、またはｃＤＮＡをナイロンメンブレンフィルタ上の８×１２（ｃｍ）、７×５（ｃｍ）または２２×２２（ｃｍ）の範囲にドットサイズ約０．５〜１（ｍｍ）のスポットとしてそれぞれ５８８個、５０００個、２７０００個並べたマクロアレイと称するもの、あるいは合成オリゴヌクレオチドをシリコン基板上の１．２８×１．２８（ｃｍ）の範囲にドットサイズ５０（μｍ）のスポットとして約６４０００個並べたＤＮＡチップと称するもの等を用いた技術である（上記マイクロアレイ、マクロアレイおよびＤＮＡチップ等を総称して「マイクロプレート」と称することとする。）。
【０００３】
すなわち、蛍光色素ａで標識された健常者の細胞から取り出したＤＮＡの蛍光標識検体Ａをピペット等でこのマイクロプレート上の各ｃＤＮＡに滴下して、蛍光標識検体ＡとｃＤＮＡとをハイブリダイズさせる。このハイブリタイズの処理の後にマイクロプレートは所定の溶液で処理され、ｃＤＮＡとハイブリタイズされなかった蛍光標識検体Ａは各スポットから除去され、ｃＤＮＡとハイブリタイズされた蛍光標識検体Ａは各スポットに残される。そして、上記処理が施されたマイクロプレート上の各検体のスポット（以後スポットと呼ぶ）に、蛍光色素ａを励起する励起光ＦＬを相対的に走査して、この励起光ＦＬの照射により発生した蛍光の検出結果を表す蛍光画像データを得る（たとえば特許文献１、２参照。）。
【０００４】
上記と同様の処理を、蛍光色素ｂで標識された遺伝子疾患を有する者の細胞から取り出したＤＮＡの蛍光標識検体Ｂに関しても行い、励起光の照射により発生した蛍光の検出結果を表す蛍光画像データを得、各スポット毎に蛍光標識検体Ａの各スポットから得られた蛍光画像データと蛍光標識検体Ｂの各スポットから得られた蛍光画像データとの比の値を求める。蛍光画像データの比の値は、異常のあるＤＮＡが滴下されたスポットほど大きくなる（あるいは小さくなる）ことから、各スポットにおける蛍光画像データの比の値が大きい方から順に例えば５０箇所分の蛍光画像データの比の値を、その信号が得られたスポットと対応付ける表として読み取り、この表に基づいて異常のあるＤＮＡが特定される。
【０００５】
なお、マイクロプレート上の各スポットから発せられる蛍光を検出する光学系には空間分解能が高く焦点深度が浅い共焦点光学系が多く用いられているので、共焦点光学系の焦点位置に一致させたマイクロプレート上のスポットへの励起光の照射によりスポットから発せられた蛍光を共焦点光学系の他方の焦点位置に配設されたピンホールを通過させて検出することにより、上記スポット以外の位置で発生した蛍光等のノイズを除去することができる。
【０００６】
ここで、上述した蛍光画像データの分析には、そのデータ自体の信頼性が保証されていることが必要となる。しかし、実際の実験において温度や湿度等の環境変化やマイクロプレートの傷、ハイブリダイゼーションの反応効率、蛍光の読取精度等の実験環境に起因して、たとえば同一種類の特異的結合物質に対し同一の蛍光標識検体をハイブリダイズさせたときであっても得られる蛍光画像データが異なってしまう場合がある。そこで、マイクロプレートから取得した蛍光画像データを用いて、実験工程における不具合を視覚により把握する方法（たとえば特許文献３参照。）や、マイクロプレート上の複数のスポットからそれぞれ取得した蛍光画像データを統計的に解析することにより、取得した蛍光画像データを補正する方法（たとえば特許文献４参照。）等が提案されている。
【特許文献１】特開２００１−７４６５６号公報
【特許文献２】特開２００１−７４６５７号公報
【特許文献３】特開２００２−７１６８８号公報
【特許文献４】特開２００３−２８８６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述した特許文献２、３のような実験環境による信頼性低下を防止するための蛍光画像データの補正においては、励起光が照射された蛍光色素から射出される蛍光は常に一定の強度を有していることが前提となっている。つまり、検体を標識している蛍光色素は、励起光が照射されれば常に所定の蛍光を出力することが前提となっている。
【０００８】
ところが、特定の蛍光色素と特定の検体との組み合わせにおいては、蛍光色素自体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少することが実験において判明した。すなわち、異なるスポットに存在する同一種類の蛍光標識検体に対し同一の時間に励起光をそれぞれ照射し、各スポットから射出される蛍光を同一の時間に検出したとき、蛍光の強度は同一のものとなる。しかし、異なるスポットに存在する同一種類の蛍光標識検体に対し同一の時間に励起光がそれぞれ照射され、各スポットから射出される蛍光を異なる時間に検出したとき、蛍光の強度が異なったものとなってしまうことがわかった。
【０００９】
この蛍光の経時変化により最後に励起光を照射した蛍光標識検体は、最初に検出された蛍光と最後に検出された蛍光とが同じ強度で発光していたときであっても、最初に励起光を照射された蛍光標識検体よりも弱い蛍光を発するものであると認識されてしまい、信頼性の高い分析ができないという問題がある。
【００１０】
そこで、本発明は、蛍光が時間経過とともに蛍光強度が小さくなる蛍光標識検体を分析するときであっても、する蛍光画像補正方法および装置ならびにプログラムを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の蛍光画像補正方法は、マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して取得した主蛍光画像データを補正する蛍光画像補正方法において、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データを補正することを特徴とするものである。
【００１２】
本発明の蛍光画像補正装置は、マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して主蛍光画像データを取得する画像取得手段と、画像取得手段により取得された主蛍光画像データを補正する画像補正手段とを有し、画像補正手段が、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データを補正するものであることを特徴とするものである。
【００１３】
本発明の蛍光画像補正プログラムは、コンピュータに、マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出し取得した蛍光画像データを補正することを実行させるものであり、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、蛍光画像データを補正することを実行させるためのものである。
【００１４】
ここで、「マイクロプレート」とは、複数のスポットを有し、各スポット上に特異的結合物質が固着されているプレート状のものであればなんでもよい。また、「スポット」とは、マイクロプレート状における特異的結合物質が固着されている単位領域をいう。「ハイブリダイズ」とは、核酸が相補的二重鎖形成する性質を利用して、特定の塩基配列にそれと相補的なヌクレオチド鎖を結合させることをいう。「蛍光標識検体」とは蛍光色素により標識されたホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その外の蛋白質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の検体をいい、「特異的結合物質」とはホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ヌクレオチド鎖等であって、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その外の蛋白質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成などが既知の物質をいう。
【００１５】
また、「主蛍光画像データ」とは、蛍光標識検体の分析に用いるための蛍光画像データをいい、「補助蛍光画像データ」とは、主蛍光画像データとは別に励起光の照射が行われることにより取得された、蛍光標識検体の経時変化特性を算出するための蛍光画像データをいう。「時間経過」とは、励起光を照射しているか否かに拘わらず、蛍光標識検体が特異的結合物質とハイブリダイズされてからの時間経過をいう。
【００１６】
なお、画像補正手段は、たとえば主蛍光画像データを取得したときの特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体特有の経時変化特性を有し、この経時変化特性に基づいて主蛍光画像データを補正するようにしてもよいし、主蛍光画像データとは別の補助蛍光画像データを取得したときに、主蛍光画像データから経時変化特性を算出しに基づいて主蛍光画像データを補正するものであればよい。
【００１７】
主蛍光画像データとは別の補助蛍光画像データを取得するとき、画像取得手段は、主蛍光画像データを取得した所定のスポット上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して所定のスポットにおける補助蛍光画像データを取得するものであってもよい。さらに、画像補正手段は、画像取得手段により取得された所定のスポットにおける主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データと、主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データの取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段を有するものであってもよい。
【００１８】
なお、所定のスポットが複数のスポットであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データが、所定のスポットにおける主蛍光画像データを取得する際の励起光のマイクロプレートに対する走査方向とは異なる方向に励起光を走査して取得した蛍光画像データであってもよい。
【００１９】
あるいは、所定のスポットが複数のスポットであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データが、所定のスポットにおける主蛍光画像データを取得する際の励起光のマイクロプレートに対する走査速度とは異なる速度でマイクロプレートを励起光で走査して取得した蛍光画像データであってもよい。
【００２０】
さらに、マイクロプレートが、主蛍光画像データが取得される複数のスポットと、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体が存在する、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットを有するものであってもよい。
【００２１】
なお、検査用スポットに存在する特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体は、主蛍光画像データを取得するスポットの特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体と同一の経時変化特性を有するものであって、この各検査用スポットは、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出するようになっている。
【００２２】
このとき、画像取得手段は、主蛍光画像データを取得するとともに、検査用スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、該蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して複数の検査用蛍光画像データを取得するようにしてもよい。この「検査用蛍光画像データ」とは、主蛍光画像データの取得するための励起光の照射が行われたとき、これと同時に検査用スポットに励起光が照射され取得された、蛍光標識検体の経時変化特性を算出するための蛍光画像データをいう。
【００２３】
さらに、画像補正手段は、画像取得手段において取得された各検査用スポット毎の複数の検査用蛍光画像データと、該検査用蛍光画像データの取得の際の検査用スポット間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、検査用スポットに存在する蛍光標識検体固有の経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであってもよい。
【００２４】
また、マイクロプレートが、行方向および列方向に沿って格子状に配列された複数のスポットを有するとき、画像取得手段は、各スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し、マイクロプレートを励起光により列方向に走査しながら行方向に移動させることにより、各スポットの蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して複数の主蛍光画像データを取得するものであってもよい。
【００２５】
このとき、画像補正手段は、各スポット列毎の主蛍光画像データの平均値と、各スポット列間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであってもよい。
【００２６】
なお、「スポット列」とは、マイクロプレートの列方向に並んだ複数のスポットをいい、「各スポット列間における励起光照射の時間間隔」とは、たとえば複数のスポット列の中からそれぞれ同一行上に存在するスポット間の時間間隔をいう。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の蛍光画像補正方法および装置ならびにプログラムによれば、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに小さくなるときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データを補正することにより、蛍光が時間経過とともに減少するような特性を有する蛍光標識検体の蛍光を検出するときであっても、この経時変化特性に基づいて補正することができるため、主蛍光画像データを用いて正確な分析を行うことができる。
【００２８】
なお、画像取得手段が、主蛍光画像データの取得とは別に、主蛍光画像データを取得した所定のスポット上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して所定のスポットにおける補助蛍光画像データを取得するものであり、画像補正手段が、画像取得手段により取得された所定のスポットにおける主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データと、主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データの取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段を有する構成にすれば、主蛍光画像データの取得する際に補助蛍光画像データを取得し、主蛍光画像データを補助蛍光画像データとを用いて経時変化特性を算出することにより、効率的に経時変化特性を算出し取得することができる。
【００２９】
また、所定のスポットが複数のスポットであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データが、所定のスポットにおける主蛍光画像データを取得する際の励起光のマイクロプレートに対する走査方向とは異なる方向に励起光を走査して取得した蛍光画像データであれば、主蛍光画像データと補助蛍光画像データとを取得したときの時間間隔が各スポット毎に異なるようにし、所定の複数のスポットから取得した主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データを用いて主蛍光画像データが取得された蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、同一種類の蛍光標識検体がハイブリダイズされたすべてのスポット毎に経時変化特性を算出することが不要となり、効率的に経時変化特性を算出することができる。
【００３０】
さらに、所定のスポットが複数のスポットであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データが、所定のスポットにおける主蛍光画像データを取得する際の励起光のマイクロプレートに対する走査速度とは異なる速度でマイクロプレートを励起光で走査して取得した蛍光画像データであれば、主蛍光画像データと補助蛍光画像データとを取得したときの時間間隔が各スポット毎に異なるようにし、所定の複数のスポットから取得した主蛍光画像データおよび補助蛍光画像データを用いて主蛍光画像データが取得された蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、同一種類の蛍光標識検体がハイブリダイズされたすべてのスポット毎に経時変化特性を算出することが不要となり、効率的に経時変化特性を算出することができる。
【００３１】
また、マイクロプレートが、主蛍光画像データが取得される複数のスポットと、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体が存在する、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットを有し、画像取得手段が、検査用スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し各検査スポット毎に異なる時刻に励起光を照射することにより、検査用スポットの蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して各検査用スポット毎の検査用蛍光画像データを取得するものであり、画像補正手段が、画像取得手段において取得された各検査用スポット毎の複数の検査用蛍光画像データと、検査用蛍光画像データの取得の際の検査用スポット間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、検査用スポットに存在する蛍光標識検体固有の経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであれば、主蛍光画像データの取得とともに検査用蛍光画像データをも取得し、複数の検査用スポットに対する励起光照射の時間間隔とにより蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、効率的に経時変化特性を算出することができる。
【００３２】
また、マイクロプレートが、行方向および列方向に沿って格子状に配列された複数のスポットを有するときに、画像取得手段が、各スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し、マイクロプレートを励起光により列方向に走査しながら行方向に移動させることにより、各スポット毎の蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して複数の主蛍光画像データを取得するものであり、画像補正手段が、各スポット列毎の主蛍光画像データの平均値と、各スポット列間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有する構成にすれば、主蛍光画像データを用いて経時変化特性を算出することができるため、効率的に主蛍光画像データの補正を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、図面を参照して本発明の蛍光検出システムの実施の形態を詳細に説明する。図１は本発明の画像補正装置を用いて蛍光検出システムの一例を示す構成図である。図１の蛍光検出システム１は、マイクロプレート上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出する蛍光を検出し蛍光画像データとして出力する蛍光検出装置１０と、蛍光検出装置１０から蛍光画像データを取得し、蛍光画像データの補正を行う画像補正装置５０とを有している。
【００３４】
ここで、蛍光検出装置１０は、マイクロプレートを収容するために開閉するプレート収容部１０ａを有しており、このプレート収容部１０ａからマイクロプレートＭＰが装填される。このマイクロプレートＭＰは、図２に示すように、格子状の複数のスポットＷを有し、このスポットＷには特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体が存在している。
【００３５】
図３は蛍光検出装置の一例を示す構成図であり、図１から図３を参照して蛍光検出装置１０について説明する。蛍光検出装置１０は、マイクロプレートＭＰに励起光を走査しながら照射する励起光照射手段２０と、励起光照射手段２０により励起光が蛍光標識検体に照射されたとき、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出する蛍光検出手段３０と、蛍光検出手段３０により検出された蛍光を蛍光画像データとして出力するデータ出力手段４０とを備えている。
【００３６】
ここで、励起光照射手段２０は、励起光ＦＬを射出する励起光源２１と、射出された励起光ＦＬをマイクロプレートＭＰの蛍光標識検体に集光する集光レンズ２４と、励起光ＦＬを矢印Ｙ方向（主走査方向）に走査させるために集光レンズ２４を移動させるレンズ移動手段２５と、励起光を矢印Ｘ方向に走査させるためにマイクロプレートＭＰを矢印Ｘ方向に移動させるプレート移動手段２６とを備えている。
【００３７】
励起光源２１は、蛍光標識検体に用いられる蛍光色素の種類に応じて波長の異なる（たとえば６４０ｎｍ、５３２ｎｍ、４７３ｎｍ）励起光ＦＬを出力する機能を有する。集光レンズ２４は、励起光源２１から射出された励起光ＦＬがミラー２２ａ、２２ｂを介し穴あきミラー２３の穴を貫通して入射されたときに、励起光ＦＬをマイクロプレートＭＰの蛍光標識検体に集光するものである。
【００３８】
このとき、マイクロプレートＭＰには集光レンズ２４により集光された励起光ＦＬが矢印Ｘ方向およびＹ方向に走査しながら照射されるようになっている。具体的には、集光レンズ２４は揺動可能に設けられており、レンズ移動手段２５に接続されている。そして、レンズ移動手段２５は集光位置がマイクロプレートＭＰの矢印Ｙ方向に走査するように集光レンズ２４を揺動させるようになっている。また、マイクロプレートＭＰは、矢印Ｘ方向（副走査方向）に移動可能に設けられており、プレート移動手段２６に接続されている。そして、プレート移動手段２６はマイクロプレートＭＰを矢印Ｘ方向に移動させるようになっている。つまり、励起光ＦＬは、集光レンズ２４の移動により矢印Ｙ方向に走査し、マイクロプレートＭＰの移動により矢印Ｘ方向に走査することになるため、マイクロプレートＭＰ上に格子状に配列された複数の蛍光標識検体に対して励起光ＦＬを走査しながら照射することができる。
【００３９】
蛍光検出手段３０は、たとえばＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｅｉｅｒ Ｔｕｂｅｓ：光電子増倍管）からなっており、蛍光がアナログ信号として検出されるようになっている。なお、蛍光標識検体から射出された蛍光は集光レンズ２４に入射されて平行光になり、穴あきミラー２３のミラー部分により反射されてカラーフィルター３１に入射される。その後カラーフィルター３１から射出した蛍光がミラー３２を介してレンズ３３に入射され、レンズ３３により蛍光検出手段３０に集光されるようになっている。
【００４０】
データ出力手段４０は、蛍光検出手段３０から出力されるアナログ信号をデジタル信号に返還するとともに信号処理を行うことにより、検出された蛍光を蛍光画像データとして出力する機能を有している。ここで、上述のようにマイクロプレートＭＰの各スポットＷには、励起光ＦＬが矢印Ｘ方向および矢印Ｙ方向に対して走査しながら照射されていく。このとき、蛍光検出手段３０が励起光ＦＬが蛍光標識検体に照射されるたびに射出される蛍光を検出し、データ出力手段４０が複数の蛍光標識検体からそれぞれ射出される蛍光を蛍光画像データＥＤとして出力するようになっている。
【００４１】
図３を参照して蛍光検出装置１０の動作例について説明する。まず、励起光照射手段２０から励起光ＦＬがミラー２２ａ、２２ｂおよび集光レンズ２４を介して、マイクロプレートＭＰのスポットＷに照射される。すると、励起光ＦＬが照射されたスポットＷに存在する蛍光標識検体から蛍光が射出する。射出した蛍光が蛍光検出手段３０により検出されてデータ出力手段４０から蛍光画像データとして出力される。このとき、レンズ移動手段２５およびプレート移動手段２６により、励起光ＦＬはマイクロプレートＭＰに対して走査しながら照射されるため、マイクロプレートＭＰに存在する各スポットＷ毎にそれぞれ蛍光画像データＥＤが出力されていく。
【００４２】
図４は本発明の画像補正装置の実施の形態を示すブロック図であり、図１と図４を参照して画像補正装置５０について説明する。画像補正装置５０は、マイクロプレートＭＰのスポットＷに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を主蛍光画像データＥＤ１として取得する画像取得手段５１と、画像取得手段５１により取得された主蛍光画像データＥＤ１を補正する画像補正手段６０とを有している。
【００４３】
ここで、画像取得手段５１は、蛍光標識検体を分析するために用いる主蛍光画像データＥＤ１と、主蛍光画像データＥＤ１の取得とは別に、主蛍光画像データＥＤ１を取得した所定のスポットＷ上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光ＦＬを照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して所定のスポットＷにおける補助蛍光画像データＥＤ２とを取得する機能を有している。
【００４４】
具体的には、画像取得手段５１は、図５（ａ）に示すように、マイクロプレートＭＰ上に配列された複数のスポットＷに対して励起光ＦＬを照射しながら走査したときに取得された複数の補助蛍光画像データＥＤ２と、補助蛍光画像データＥＤ２を取得したときの励起光ＦＬの走査方向とは異なる走査方向で励起光ＦＬの照射したときに取得された主蛍光画像データＥＤ１とを取得するようになっている。つまり、図５（ａ）において、励起光ＦＬがまずスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃの順番で照射されるように走査され、補助蛍光画像データＥＤ２ａ、ＥＤ２ｂ、ＥＤ２ｃが取得される。次に、マイクロプレートＭＰが蛍光検出装置１０に対し向きを換えて装着される等することにより、スポットＷｃ、Ｗｂ、Ｗａの順番で励起光ＦＬが照射されるように走査され、補助蛍光画像データＥＤ２ｃ、ＥＤ２ｂ、ＥＤ２ａが取得される。
【００４５】
なお、走査方向の異なる２つの蛍光画像データＥＤ１、ＥＤ２を取得するにあたり、励起光照射手段２０による励起光の走査方向は変えずにマイクロプレートＭＰの向きをかえて２つの蛍光画像データＥＤ１、ＥＤ２を取得するようにしてもよいし、マイクロプレートＭＰの向きを変えずに励起光照射手段２０の励起光の走査方向およびマイクロプレートＭＰの移動方向を逆にすることより、２つの蛍光画像データを取得するようにしてもよい。このような励起光の走査制御は、制御コントローラ７０により行われる。
【００４６】
次に、図４と図５を用いて画像補正手段６０について説明する。図４の画像補正手段６０は、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データＥＤ１を補正するものであって、画像取得手段５１により取得された所定のスポットＷにおける主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２と、主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２の取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段６１と、取得された経時変化特性を用いて主蛍光画像データＥＤ１を補正する補正手段６２とを有する。
【００４７】
具体的には、変化特性取得手段６１は、図５（ａ）に示すように、複数の所定のスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃに存在する蛍光標識検体から取得した３つの補助蛍光画像データＥＤ２ａ、ＥＤ２ｂ、ＥＤ２ｃを取得する。また、変化特性取得手段６１は、複数の所定のスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃに存在する蛍光標識検体から取得した３つの主蛍光画像データＥＤ１ａ、ＥＤ１ｂｖ、ＥＤ１ｃを取得する。そして、スポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃについて、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔に蛍光の強度がどのぐらい減少したかを算出する。具体的には、補助蛍光画像データＥＤ２の蛍光強度を主蛍光画像データＥＤ１の蛍光強度で割り、蛍光強度の減少率を算出する。
【００４８】
このとき、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔は、各スポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃについてそれぞれ異なっている。図５（ａ）に示すような励起光の走査を行ったとき、一回目の励起光の照射から２回目の励起光の照射までの時間間隔はスポットＷｃが最も短く、次いでスポットＷｂ、Ｗａの順に短くなる。
【００４９】
よって、図５（ｂ）に示すように、変化特性取得手段６１は、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔が異なる３つの減少率を取得することができる。そこで、変化特性取得手段６１は、３つの減少率を線で結ぶことにより、蛍光の強度が時間経過とともに小さくなる経時変化特性を算出し取得する。その後、補正手段６２が、主蛍光画像データＥＤ１を取得した時刻から、主蛍光画像データＥＤ１に用いる減少率を図５（ｂ）の経時変化特性から検出し、主蛍光画像データＥＤ１を減少率で除することにより補正する。
【００５０】
これにより、時間経過とともに蛍光の強度が減少したときであっても、その減少分を補正し、精度がよく信頼性の高い蛍光分析を行うことができる。すなわち、上述のような蛍光検出システム１において、蛍光色素は励起光を照射すれば蛍光を射出するものであるため、蛍光が時間経過とともに減衰しないと考えられていた。つまり、図５（ｂ）において、主蛍光画像データＥＤ１と補助蛍光画像データＥＤ２とが等しくなると考えられていた。しかし、実験において、蛍光が時間経過とともに減衰することが認められた。これは、蛍光色素と検査対象である検体とが何らかの化学反応を起こし、蛍光色素による蛍光が時間経過とともに弱くなってしまうことが原因であると考えられる。そこで、蛍光が時間経過とともに減少するような特性を有する蛍光標識検体の蛍光を検出するときであっても、算出した経時変化特性に基づいて補正することができるため、主蛍光画像データＥＤ１を用いて正確な分析を行うことができる。
【００５１】
さらに、１つのマイクロプレートＭＰに対して走査方向を変えて複数回励起光の照射を行い、補助蛍光画像データＥＤ２の取得から主蛍光画像データＥＤ１の取得までの時間間隔が、各スポットのスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃについてそれぞれ異なるようにすることにより、すべてのスポットＷに対して経時変化特性を算出する場合に比べて効率よく経時変化特性を算出することができる。
【００５２】
図６は本発明の画像補正方法の好ましい実施の形態を示すフローチャートであり、図１から図６を参照して画像補正方法について説明する。まず、蛍光検出装置１０においてスポットＷに存在する蛍光標識検体に対し励起光ＦＬが照射される（ステップＳＴ１）。そして、蛍光標識検体から射出される蛍光が補助蛍光画像データＥＤ２として画像取得手段５１に取得される（ステップＳＴ２）。励起光ＦＬはマイクロプレートＭＰの複数のスポットＷに対して走査しながら照射され、画像取得手段５１において複数のスポットに対応した補助蛍光画像データＥＤ２が取得される（ステップＳＴ１〜ステップＳＴ３）。
【００５３】
次に、励起光ＦＬがマイクロプレートＭＰに対し補助蛍光画像データＥＤ２を取得した際の走査方向とは逆向きに走査される（図５（ａ）参照）（ステップＳＴ４）。励起光ＦＬはマイクロプレートＭＰの複数のスポットＷに対して走査しながら照射され、画像取得手段５１において複数のスポットに対応した主蛍光画像データＥＤ１が取得される（ステップＳＴ４〜ステップＳＴ６）。
【００５４】
その後、画像補正装置５０において、主蛍光画像データＥＤ１と補助蛍光画像データＥＤ２とを用いて蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性が算出され（ステップＳＴ７）、この経時変化特性に基づいて主蛍光画像データＥＤ１が補正される（ステップＳＴ８）。具体的には、変化特性取得手段６１において図５（ｂ）に示すような経時変化特性が算出され、補正手段６２において経時変化特性に基づいて主蛍光画像データＥＤ１が補正される。
【００５５】
これにより、時間経過とともに蛍光の強度が減少したときであっても、経時変化特性を算出し、その経時変化特性に基づいて蛍光の強度の減少分を補正することができるため、精度がよく信頼性の高い蛍光分析を行うことができる。
【００５６】
ところで、経時変化特性を算出する方法としては、上述した励起光の走査方向を変える方法の他に、主蛍光画像データとは異なる走査速度で励起光を照射したときの蛍光を示す補助蛍光画像データを用いて経時変化特性を取得する方法、同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットにおいてハイブリダイズされた蛍光標識検体の蛍光検出し、得られた複数の検査用蛍光画像データから経時変化特性を取得する方法、特異的結合物質が存在する複数の格子状に配列されたスポットにおいてハイブリダイズされた蛍光標識検体の蛍光を検出し、得られた蛍光画像データから経時変化特性を取得する方法があげられる。以下に、各方法について説明する。
【００５７】
まず、走査速度の異なる２つの蛍光画像データを用いて経時変化特性を取得する方法について説明する。図７は主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２の取得方法および経時変化特性の一例を示す模式図である。図７（ａ）において、画像取得手段５１は、マイクロプレートＭＰ上の複数の蛍光標識検体に対して励起光ＦＬを照射しながら走査したときに取得された主蛍光画像データＥＤ１と、主蛍光画像データＥＤ１を取得したときの走査速度とは異なる走査速度で励起光ＦＬを照射したときに取得された補助蛍光画像データＥＤ２とを取得するようになっている。
【００５８】
具体的には、複数の主蛍光画像データＥＤ１は、励起光ＦＬの照射時間が蛍光検出を行うのに必要な時間だけ各スポットに励起光が照射されるような主走査速度ＳＶ１で励起光ＦＬを走査しながら照射したときに取得されたものである（本スキャン）。一方、複数の補助蛍光画像データＥＤ２は、主蛍光画像データＥＤ１の取得前に行われる、主走査速度ＳＶ１よりも速い補助走査速度ＳＶ２で励起光ＦＬを走査しながら照射したときに取得されたものである（プレスキャン）。この主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２を用いて上述したように蛍光強度の減少率を算出し、経時変化特性を取得することもできる。このとき、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔は、各スポットＷのスポットＷａ、Ｗｂ、Ｗｃについてそれぞれ異なっている。図７（ａ）に示すような励起光の走査を行ったとき、一回目の励起光の照射から２回目の励起光の照射までの時間間隔はスポットＷｃが最も短く、次いでスポットＷｂ、Ｗａの順に短くなる。
【００５９】
よって、図７（ｂ）に示すように、変化特性取得手段６１は、主蛍光画像データＥＤ１を取得してから補助蛍光画像データＥＤ２を取得するまでの時間間隔が異なる３つの減少率を取得することができる。そこで、変化特性取得手段６１は、３つの減少率を線で結ぶことにより、蛍光の強度が時間経過とともに小さくなる経時変化特性を算出し取得する。その後、補正手段６２が、主蛍光画像データＥＤ１を取得した時刻から、主蛍光画像データＥＤ１に用いる減少率を図７（ｂ）の経時変化特性から検出し、主蛍光画像データＥＤ１を減少率で除することにより補正する。
【００６０】
図７に示すような方法であっても、時間経過とともに蛍光の強度が減少したときに経時変化特性を算出し、その経時変化特性に基づいて蛍光の強度の減少分を補正することができるため、精度がよく信頼性の高い蛍光分析を行うことができる。さらに、蛍光検出装置１０において通常行われるプレスキャンと本スキャンを用いて蛍光標識検体の蛍光強度の減少率を算出し取得することができるため、蛍光検出装置１０に対する特別な制御が不要であり、効率よく蛍光画像データの補正を行うことができる。
【００６１】
次に、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットから取得した検査用蛍光画像データＥＸＤを用いて経時変化特性を取得する方法について説明する。図８は主蛍光画像データＥＤ１を取得するための複数のスポットと、検査用蛍光画像データＥＸＤを取得するための検査用スポットとを有するマイクロプレートＭＰの一例を示す模式図である。具体的には、図８（ａ）において、マイクロプレートＭＰには、それぞれ各検査用スポットＷａ〜Ｗｆに同一の蛍光強度で蛍光を射出するような、ハイブリダイズされた蛍光標識検体がそれぞれ存在している。図８（ａ）においては、マイクロプレートＭＰの各列にそれぞれ１つずつ検査用スポットＷａ〜Ｗｆを配置した場合について例示している。なお、検査用スポットＷａ〜Ｗｆの配置位置は、後述するように、各検査用スポットＷａ〜Ｗｆに異なる時刻に励起光ＦＬが照射されるようなものであればよい。
【００６２】
そして、励起光照射手段２０において、検査用スポットＷａ〜Ｗｆを含むマイクロプレートＭＰの各スポットに励起光ＦＬを走査しながら照射する。すると、各検査用スポットＷａ〜Ｗｆには異なる時刻に励起光ＦＬが照射されることになる。そして、画像取得手段５１は、マイクロプレートＭＰ上の各スポットから主蛍光画像データＥＤ１を取得すると共に、各検査用スポットＷａ〜Ｗｆから検査用蛍光画像データＥＸＤａ〜ＥＸＤｆを取得する。その後、変化特性取得手段６１は、複数の検査用蛍光画像データＥＸＤａ〜ＥＸＤｆが示す蛍光強度と、検査用スポットＷａ〜Ｗｆに励起光ＦＬを照射したときの時刻とにより、図８（ｂ）に示すような経時変化特性を算出する。そして、補正手段６２が、主蛍光画像データＥＤ１を取得した時刻に合わせて、算出した減少率を用いて主蛍光画像データＥＤ１を補正することにより、時間経過とともに減少した蛍光の強度を補正する。
【００６３】
図８に示すような方法であっても、時間経過とともに蛍光の強度が減少したときに経時変化特性を算出し、その経時変化特性に基づいて蛍光の強度の減少分を補正することができるため、精度がよく信頼性の高い蛍光分析を行うことができる。
【００６４】
次に、同一の特異的結合物質とハイブリダイズされた複数の蛍光標識検体から射出された主蛍光画像データを用いて経時変化特性を取得する方法について説明する。図９は同一の特異的結合物質とハイブリダイズされた複数の蛍光標識検体を格子状に配列したマイクロプレートＭＰの一例を示す模式図である。
【００６５】
図９（ａ）において、画像取得手段５１は、マイクロプレートＭＰを励起光により列方向（矢印Ｙ１方向）に走査しながら行方向（矢印Ｘ１方向）に移動させたときの複数の主蛍光画像データＥＤ１を取得するようになっている。そして、変化特性取得手段６１は、図９（ｂ）のように、励起光の走査方向に並んだ複数のスポット列Ｗ３１〜Ｗ３６から射出された複数の主蛍光画像データＥＤ１の平均値と、励起光ＦＬを走査したときの時刻とに基づいて経時変化特性を算出し取得する。そして、補正手段６２は、算出した経時変化特性と、各蛍光標識検体に励起光を照射した時刻とを用いて、取得した主蛍光画像データＥＤ１を補正するようになっている。
【００６６】
このように、経時変化特性を算出する際に、実際の画像取得対象である主蛍光画像データＥＤ１を用いることにより、効率よく経時変化特性を算出し画像の補正を行うことができる。
【００６７】
なお、図９の方法においては、測定対象から得られた主蛍光画像データＥＤ１を用いて経時変化特性を求めるようにしている。つまり、経時変化特性を考慮しなければスポット列の主蛍光画像データＥＤ１の平均値は各スポット列同士において略同一となる、という前提の下で経時変化特性を算出している。
【００６８】
つまり、一般的にマイクロプレート（ＤＮＡチップ）には各スポットにＤＮＡはランダムに配置されている。一方、マイクロプレート（ＤＮＡチップ）には数万ものスポットが設けられており、１つの列のスポット数は１００個以上存在することになる。なお、蛍光検出装置１０の検出レベルも０ｄｉｇｉｔ〜６５５３５ｄｉｇｉｔという有限な整数である。ランダムにＤＮＡが配列された数万ものスポットという有限母集団から、数百個のスポットを含むスポット列毎に標本化しその平均値を取った場合、各スポット列同士の平均は統計学的に略同一になる。したがって、主蛍光画像データＥＤ１を用いて経時変化特性を効率的に算出することができる。
【００６９】
上記各実施の形態によれば、蛍光標識検体から射出される蛍光の強度が時間経過とともに小さくなるときの経時変化特性に基づいて、主蛍光画像データＥＤ１を補正することにより、蛍光が時間経過とともに減少するような特性を有する蛍光標識検体の蛍光を検出するときであっても、この経時変化特性に基づいて補正することができるため、主蛍光画像データＥＤ１を用いて正確な分析を行うことができる。
【００７０】
なお、画像取得手段５１が、主蛍光画像データＥＤ１の取得とは別に、主蛍光画像データＥＤ１を取得した所定のスポット上に存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光ＦＬを照射することにより、蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して所定のスポットにおける補助蛍光画像データＥＤ２を取得するものであり、画像補正手段６０が、画像取得手段５１により取得された所定のスポットにおける主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２と、主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２の取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段６１を有する構成にすれば、主蛍光画像データＥＤ１の取得する際に補助蛍光画像データＥＤ２を取得し、主蛍光画像データＥＤ１を補助蛍光画像データＥＤ２とを用いて経時変化特性を算出することにより、効率的に経時変化特性を算出し取得することができる。
【００７１】
また、図５に示すように、所定のスポットが複数のスポットＷａ〜Ｗｃであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データＥＤ２が、所定のスポットにおける主蛍光画像データＥＤ１を取得する際の励起光のマイクロプレートＭＰに対する走査方向とは異なる方向に励起光を走査して取得した蛍光画像データであれば、主蛍光画像データＥＤ１と補助蛍光画像データＥＤ２とを取得したときの時間間隔が各スポット毎に異なるようにし、所定の複数のスポットＷａ〜Ｗｃから取得した主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２を用いて主蛍光画像データＥＤ１が取得された蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、同一種類の蛍光標識検体がハイブリダイズされたすべてのスポット毎に経時変化特性を算出することが不要となり、効率的に経時変化特性を算出することができる。
【００７２】
さらに、図７に示すように、所定のスポットが複数のスポットＷａ〜Ｗｃであり、所定のスポットにおける補助蛍光画像データＥＤ２が、所定のスポットＷａ〜Ｗｃにおける主蛍光画像データＥＤ１を取得する際の励起光のマイクロプレートＭＰに対する走査速度とは異なる速度でマイクロプレートＭＰを励起光ＦＬで走査して取得した蛍光画像データであれば、主蛍光画像データＥＤ１と補助蛍光画像データＥＤ２とを取得したときの時間間隔が各スポットＷａ〜Ｗｃ毎に異なるようにし、所定の複数のスポットＷａ〜Ｗｃから取得した主蛍光画像データＥＤ１および補助蛍光画像データＥＤ２を用いて主蛍光画像データＥＤ１が取得された蛍光標識検体特有の経時変化特性を算出するため、同一種類の蛍光標識検体がハイブリダイズされたすべてのスポット毎に経時変化特性を算出することが不要となり、効率的に経時変化特性を算出することができる。
【００７３】
また、図８に示すように、画像取得手段５１が、複数の検査用スポットＷａ〜Ｗｆにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し各検査スポット毎Ｗａ〜Ｗｆに異なる時刻に励起光を照射することにより、検査用スポットＷａ〜Ｗｆの蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して各検査用スポットＷａ〜Ｗｆ毎の検査用蛍光画像データＥＸＤを取得するものであり、画像補正手段６０が、画像取得手段５１において取得された各検査用スポットＷａ〜Ｗｆ毎の複数の検査用蛍光画像データＥＸＤａ〜ＥＸＤｆと、検査用蛍光画像データＥＸＤの取得の際の検査用スポットＷａ〜Ｗｆ間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、検査用スポットＷａ〜Ｗｆに存在する蛍光標識検体固有の経時変化特性を取得する変化特性取得手段６１を有することにより、主蛍光画像データＥＤ１の取得とともに検査用蛍光画像データＥＸＤを取得して経時変化特性を算出するため、効率的に経時変化特性を算出することができる。
【００７４】
さらに、図９に示すように、マイクロプレートＭＰが、行方向および列方向に沿って格子状に配列された複数のスポットを有するときに、画像取得手段５１が、同数の特異的結合物質が存在する複数のスポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し、マイクロプレートＭＰを励起光ＦＬにより列方向に走査しながら行方向に移動させることにより、各スポット毎の蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して複数の主蛍光画像データＥＤ１を取得するものであり、画像補正手段６０が、各スポット列Ｗ３１〜Ｗ３６毎の蛍光画像データＥＤ１の平均値と、各スポット列間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有する構成にすれば、主蛍光画像データＥＤ１を用いて経時変化特性を算出することができるため、効率的に蛍光画像データの補正を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の画像補正装置の好ましい実施の形態を示す外観図
【図２】本発明の画像補正装置において補正される蛍光画像データを取得する際に使用するマイクロプレートの一例を示す模式図
【図３】本発明の画像補正装置において補正される蛍光画像データを取得するための蛍光検出装置の一例を示す構成図
【図４】本発明の画像補正装置の好ましい実施の形態を示すブロック図
【図５】図４の画像補正装置において、画像取得手段が２つの蛍光画像データを取得する際の励起光の走査方法の一例を示す模式図
【図６】本発明の画像補正方法の好ましい実施の形態を示すフローチャート
【図７】本発明の画像補正装置において、画像取得手段が２つの蛍光画像データを取得する際の励起光の走査方法の別の一例を示す模式図
【図８】本発明の画像補正装置において、画像取得手段が経時変化特性を取得するのに用いられる蛍光画像データを取得する際のマイクロプレートの一例を示す模式図
【図９】本発明の画像補正装置において、画像取得手段が経時変化特性を取得するのに用いられる蛍光画像データを取得する際のマイクロプレートの一例を示す模式図
【符号の説明】
【００７６】
１ 蛍光検出システム
１０ 蛍光検出装置
２０ 励起光照射手段
２１ 励起光源
３０ 蛍光検出手段
５０ 画像補正装置
５１ 画像取得手段
６０ 画像補正手段
６１ 変化特性取得手段
６２ 補正手段
ＥＤ１ 主蛍光画像データ
ＥＤ２ 補助蛍光画像データ
ＥＸＤ 検査用蛍光画像データ
ＦＬ 励起光
ＭＰ マイクロプレート
Ｗ スポット
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、前記蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して取得した主蛍光画像データを補正する蛍光画像補正方法において、
前記蛍光標識検体から射出される前記蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、前記主蛍光画像データを補正することを特徴とする蛍光画像補正方法。
【請求項２】
マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、前記蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して主蛍光画像データを取得する画像取得手段と、
該画像取得手段により取得された前記主蛍光画像データを補正する画像補正手段とを有し、
該画像補正手段が、前記蛍光標識検体から射出される前記蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、前記主蛍光画像データを補正するものであることを特徴とする蛍光画像補正装置。
【請求項３】
前記画像取得手段が、前記主蛍光画像データの取得とは別に、該主蛍光画像データを取得した所定のスポット上に存在する、前記特異的結合物質とハイブリダイズされた前記蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、該蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して前記所定のスポットにおける補助蛍光画像データを取得するものであり、
前記画像補正手段が、前記画像取得手段により取得された前記所定のスポットにおける前記主蛍光画像データおよび前記補助蛍光画像データと、該主蛍光画像データおよび該補助蛍光画像データの取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて前記経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の蛍光画像補正装置。
【請求項４】
前記所定のスポットが複数のスポットであり、
該所定のスポットにおける前記補助蛍光画像データが、該所定のスポットにおける前記主蛍光画像データを取得する際の前記励起光の前記マイクロプレートに対する走査方向とは異なる方向に前記励起光を走査して取得した前記蛍光画像データであることを特徴とする請求項３に記載の蛍光画像補正装置。
【請求項５】
前記所定のスポットが複数のスポットであり、
該所定のスポットにおける前記補助蛍光画像データが、該所定のスポットにおける前記主蛍光画像データを取得する際の前記励起光の前記マイクロプレートに対する走査速度とは異なる速度で前記マイクロプレートを前記励起光で走査して取得した前記蛍光画像データであることを特徴とする請求項３に記載の蛍光画像補正装置。
【請求項６】
前記マイクロプレートが、前記主蛍光画像データが取得される複数のスポットと、前記特異的結合物質とハイブリダイズされた前記蛍光標識検体が存在する、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットを有し、
前記画像取得手段が、前記主蛍光画像データを取得するとともに、前記検査用スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた前記蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、該蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して複数の検査用蛍光画像データを取得するものであり、
前記画像補正手段が、前記画像取得手段において取得された各検査用スポット毎の前記複数の検査用蛍光画像データと、該検査用蛍光画像データの取得の際の前記検査用スポット間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、前記検査用スポットに存在する前記蛍光標識検体固有の前記経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の蛍光画像補正装置。
【請求項７】
前記マイクロプレートが、行方向および列方向に沿って格子状に配列された前記複数のスポットを有するものであり、
前記画像取得手段が、前記各スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた前記蛍光標識検体に対し、前記マイクロプレートを前記励起光により前記列方向に走査しながら前記行方向に移動させることにより、前記各スポットの蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して複数の前記主蛍光画像データを取得するものであり、
前記画像補正手段が、前記各スポット列毎の前記主蛍光画像データの平均値と、前記各スポット列間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、前記経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の蛍光画像補正装置。
【請求項８】
コンピュータに、
マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、前記蛍光標識検体から射出された蛍光を検出し取得した蛍光画像データを補正することを実行させるための蛍光画像補正プログラムであって、
前記蛍光標識検体から射出される前記蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、前記蛍光画像データを補正することを実行させるための蛍光画像補正プログラム。
【請求項１】
マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、前記蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して取得した主蛍光画像データを補正する蛍光画像補正方法において、
前記蛍光標識検体から射出される前記蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、前記主蛍光画像データを補正することを特徴とする蛍光画像補正方法。
【請求項２】
マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、前記蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して主蛍光画像データを取得する画像取得手段と、
該画像取得手段により取得された前記主蛍光画像データを補正する画像補正手段とを有し、
該画像補正手段が、前記蛍光標識検体から射出される前記蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、前記主蛍光画像データを補正するものであることを特徴とする蛍光画像補正装置。
【請求項３】
前記画像取得手段が、前記主蛍光画像データの取得とは別に、該主蛍光画像データを取得した所定のスポット上に存在する、前記特異的結合物質とハイブリダイズされた前記蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、該蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して前記所定のスポットにおける補助蛍光画像データを取得するものであり、
前記画像補正手段が、前記画像取得手段により取得された前記所定のスポットにおける前記主蛍光画像データおよび前記補助蛍光画像データと、該主蛍光画像データおよび該補助蛍光画像データの取得の際の励起光照射の時間間隔とに基づいて前記経時変化特性を算出し取得する変化特性取得手段を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の蛍光画像補正装置。
【請求項４】
前記所定のスポットが複数のスポットであり、
該所定のスポットにおける前記補助蛍光画像データが、該所定のスポットにおける前記主蛍光画像データを取得する際の前記励起光の前記マイクロプレートに対する走査方向とは異なる方向に前記励起光を走査して取得した前記蛍光画像データであることを特徴とする請求項３に記載の蛍光画像補正装置。
【請求項５】
前記所定のスポットが複数のスポットであり、
該所定のスポットにおける前記補助蛍光画像データが、該所定のスポットにおける前記主蛍光画像データを取得する際の前記励起光の前記マイクロプレートに対する走査速度とは異なる速度で前記マイクロプレートを前記励起光で走査して取得した前記蛍光画像データであることを特徴とする請求項３に記載の蛍光画像補正装置。
【請求項６】
前記マイクロプレートが、前記主蛍光画像データが取得される複数のスポットと、前記特異的結合物質とハイブリダイズされた前記蛍光標識検体が存在する、それぞれ同一の蛍光強度で蛍光を射出する複数の検査用スポットを有し、
前記画像取得手段が、前記主蛍光画像データを取得するとともに、前記検査用スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた前記蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、該蛍光標識検体から射出された蛍光を検出して複数の検査用蛍光画像データを取得するものであり、
前記画像補正手段が、前記画像取得手段において取得された各検査用スポット毎の前記複数の検査用蛍光画像データと、該検査用蛍光画像データの取得の際の前記検査用スポット間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、前記検査用スポットに存在する前記蛍光標識検体固有の前記経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の蛍光画像補正装置。
【請求項７】
前記マイクロプレートが、行方向および列方向に沿って格子状に配列された前記複数のスポットを有するものであり、
前記画像取得手段が、前記各スポットにおいてそれぞれハイブリダイズされた前記蛍光標識検体に対し、前記マイクロプレートを前記励起光により前記列方向に走査しながら前記行方向に移動させることにより、前記各スポットの蛍光標識検体からそれぞれ射出された蛍光を検出して複数の前記主蛍光画像データを取得するものであり、
前記画像補正手段が、前記各スポット列毎の前記主蛍光画像データの平均値と、前記各スポット列間における励起光照射の時間間隔とに基づいて、前記経時変化特性を取得する変化特性取得手段を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の蛍光画像補正装置。
【請求項８】
コンピュータに、
マイクロプレートのスポットに存在する、特異的結合物質とハイブリダイズされた蛍光標識検体に対し励起光を照射することにより、前記蛍光標識検体から射出された蛍光を検出し取得した蛍光画像データを補正することを実行させるための蛍光画像補正プログラムであって、
前記蛍光標識検体から射出される前記蛍光の強度が時間経過とともに減少するときの経時変化特性に基づいて、前記蛍光画像データを補正することを実行させるための蛍光画像補正プログラム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−９８２０２（Ｐ２００６−９８２０２Ａ）
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２８４４０７（Ｐ２００４−２８４４０７）
【出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【出願人】（０００００５２０１）富士写真フイルム株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【出願人】（０００００５２０１）富士写真フイルム株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
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