融合タンパク質の免疫原性の低減
【課題】 免疫原性が低減された融合タンパク質を製造するための方法を開示する。
【解決手段】 本発明の方法は、Ｔ細胞エピトープを識別し、それがＴ細胞レセプターと相互作用する能力を低減させるように、融合タンパク質の接合部の１個または複数のアミノ酸をアッセイし、変更し、修飾することを含む。
【解決手段】 本発明の方法は、Ｔ細胞エピトープを識別し、それがＴ細胞レセプターと相互作用する能力を低減させるように、融合タンパク質の接合部の１個または複数のアミノ酸をアッセイし、変更し、修飾することを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００１年３月３０日に出願された米国仮出願特許出願シリアル番号６０／２８０，６２５号（その全開示内容は言及によって本願に組込まれる）に基づく優先権およびその利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は概括的に言えば、治療剤として免疫原性が低減されているか免疫原性のない修飾された融合タンパク質を製造および使用するための方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、Ｔ−細胞エピトープ候補を識別し、そうしたエピトープを除去するようにアミノ酸配列を修正することにより免疫原性を低減した融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
多くの治療用タンパク質は正常なヒトタンパク質である。例えば、インターロイキン−２、エリスロポエチンおよび成長ホルモンは、すべて、通常これらのタンパク質を既に内成的なレベルで産生しているヒトに与えるヒトタンパク質である。一般に、これらのタンパク質を治療用に用いる場合、完全に正常なヒトタンパク質に対する免疫反応は稀にしか起こらない。
【０００４】
最近では、人工的な活性を有する多くの融合タンパク質が治療用タンパク質として有用であることが明らかになってきている。例えば、Ｅｎｂｒｅｌは、ＴＮＦレセプターの細胞外ドメインとＩｇＧ１ Ｆｃ領域との融合体である。Ｅｎｂｒｅｌは慢性関節リウマチを治療するために使用され、ＴＮＦと反応してＴＮＦの作用を妨げることにより機能すると考えられる。しかし、Ｅｎｂｒｅｌで治療された患者に抗Ｅｎｂｒｅｌ抗体が顕著に発生することがわかった。
【０００５】
治療上有用な融合タンパク質の別の種類の例は、イムノサイトカイン(immunocytokines;免疫サイトカイン)である。これらのタンパク質は抗体部分とサイトカイン部分を含み、癌細胞などの疾病状態の細胞をサイトカインの標的とするのに有用である。しかし、これらの融合タンパク質の多くの治療目的での使用は、哺乳動物、特にヒトにおいてその免疫原性により制限される。
【０００６】
したがって、これらのタンパク質を治療に使用するためには免疫原性の低減された融合タンパク質を生成する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、治療目的で使用される免疫原性の低減された融合タンパク質を産生するのに有用な方法および組成物を特色とする。例えば、本発明はイムノサイトカイン、イムノフュージン(immunofusins;免疫融合体)、イムノリガンド(immunoligands;免疫リガンド)、他の抗体およびＦｃ融合タンパク質、サイトカイン−サイトカイン融合タンパク質および免疫原性の低減されたアルブミン融合タンパク質を特色とする。
【０００８】
本発明は、部分的には、融合タンパク質が「非自己」である配列を含んでいる点への着目に関する。例えば、２個のヒトのタンパク質どうしの融合体であっても、融合接合部周辺の領域は、通常、人体に存在しないペプチド配列を含む。例えば、Ｅｎｂｒｅｌなどのタンパク質薬剤は、２個の正常なヒトのタンパク質：ＴＮＦレセプターとＩｇＧ１に由来する。しかし、ＴＮＦレセプターとＩｇＧ１との間の接合部分は人体内には通常見出されないペプチド配列である。
【０００９】
本発明の好ましい方法は、ＭＨＣ分子に結合する能力(その結合親和性)を減少させることによって、接合部エピトープ(接合部ペプチド)がＴ細胞レセプターと相互作用する能力を低減させ、これにより融合タンパク質の免疫原性を低減することを含む。本発明によれば、接合部のエピトープまたはペプチドは好ましくは「非自己」である。一般に、治療用タンパク質を含めタンパク質が免疫原となるのは、部分的には、タンパク質が抗原提示細胞によってエンドサイトーシスされてタンパク質分解を受け、生じたペプチドが主要組織適合複合体(ＭＨＣ)と呼ばれる分子に結合し、これがペプチドをＴ細胞に提示するためである。抗原提示細胞(ＡＰＣ)表面の抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞を活性化して増殖、分化させ、サイトカインを放出させる。平行してＢ細胞の分化および抗体産生が誘導され、これらによる除去によりさらに治療用タンパク質の有効性が制限される。したがって抗原ペプチドは治療用タンパク質に由来する場合一連の望ましくない免疫反応を誘導し得る。治療用タンパク質の有効性は抗体による反応により制限され、多くの場合Ｔ細胞およびＢ細胞応答の誘導は患者における炎症性のアレルギー反応のために有害である。
【００１０】
本発明は、(１)免疫グロブリン−標的タンパク質接合領域における１個または複数のＴ−細胞エピトープ候補を有する新規なアミノ酸配列の識別；および(２)接合部配列に由来しＴ−細胞エピトープとして機能するペプチドの存在を消失させるか低減させるこれらのアミノ酸配列の修飾を提供する。
【００１１】
本発明は、免疫原性の低減に関係する組成物および方法として２種類の一般的なクラスを提供する。本発明の１つの実施形態によれば、潜在的な非自己Ｔ−細胞エピトープは、融合接合部にわたる配列中に識別される。例えば、潜在的な非自己Ｔ−細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドのモデル化に基づく計算上の方法によって識別される。次いで、接合領域に由来するペプチドのＭＨＣクラスＩＩへの結合能力が低減または除去されるように置換を行う。ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを識別し修飾するこの過程は、「脱−免疫化」と呼ばれ、生じた修飾されたタンパク質分子は「脱−免疫化された」と表現される。
【００１２】
本発明の別の実施形態によれば、融合接合部に１個または複数のグリコシル化部位を導入する。Ｏ−結合グリコシル化部位も使用できるが、Ｎ−結合グリコシル化部位が好適に使用される。好ましい実施形態によれば、野生型の融合接合部を囲む接合領域中のアミノ酸は、Ｎ−末端融合パートナーの最後のアミノ酸をアスパラギンに変異させ、第２の融合パートナーの最初の２個のアミノ酸を、グリシン、これに続いてセリンまたはトレオニンとなるように変異させる。
【００１３】
本発明によれば、バクテリア中で、または酵母や昆虫細胞など、哺乳類のグリコシル化パターンを生成しない有機体中でタンパク質が産生される状況では、ＭＨＣクラスＩＩ結合の除去が好ましい。
【００１４】
タンパク質が、哺乳類の細胞系で、または哺乳動物に無害のグリコシル化パターンを創製する細胞系で産生される場合は、グリコシル化部位の導入が好ましい。
【００１５】
好ましい実施形態では、融合タンパク質の構成成分はサイトカインである。「サイトカイン」という用語は、ここでは、そのサイトカインに対するレセプターを有する細胞の特異的反応を誘導する、天然に存在するまたは遺伝子組換えによるタンパク質、それらのアナログおよびそれらの断片について使用する。好ましくは、サイトカインは細胞によって産生され分泌され得るタンパク質である。好ましくは、サイトカインは、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６およびＩＬ−１８などのインターロイキン、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、Ｇ−ＣＳＦおよびエリスロポエチンなどの造血因子、ＴＮＦαなどの腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、リンホトキシンなどのリンホカイン、レプチンなどの代謝プロセスの制御因子、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγなどのインターフェロン並びにケモカインを含む。好ましくは本発明の抗体-サイトカイン融合タンパク質はサイトカイン特異的生物活性を示す。
【００１６】
別の好ましい実施形態では融合タンパク質の構成成分は抗肥満サイトカインである。例えば構成成分はレプチン、ＣＮＴＦまたはＡｃｒｐ３０の一部である。
【００１７】
さらに別の好ましい実施形態では融合タンパク質の構成成分はホルモンである。例えば、構成成分は、インシュリン、成長ホルモンまたはグルカゴン様ペプチド１(ＧＬＰ−１)でよい。
【００１８】
さらに別の実施形態では融合タンパク質の構成成分は生物活性を有するリガンド結合タンパク質である。好ましい実施形態ではＴＮＦレセプターの細胞外領域が用いられる。
【００１９】
一連の実施形態によれば本発明の融合タンパク質は抗体部分のＣ−末端に非抗体部分のＮ−末端が融合されたものを含む。別の一連の実施形態によれば本発明の融合タンパク質は抗体部分のＮ−末端に非抗体部分のＣ−末端が融合されたものを含む。本発明によれば抗体部分は未処置の免疫グロブリンでもよいし未処置の免疫グロブリンの一部でもよい。免疫グロブリンの一部としては可変領域もしくは定常領域またはその両方を含むことができる。好ましい免疫グロブリンは、Ｆｃ領域またはその一部を含む。本発明の好ましい実施形態としては免疫原性が低減されおよび／またはより長い血中半減期を有するように修飾されたＩｇＧ１免疫グロブリンアイソタイプまたはその一部を含む。例えばＣＨ３−サイトカイン接合部近傍のアミノ酸残基が修飾されたＩｇＧ１が好ましい。場合によってはＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプ由来の抗体部分が好ましい。
【００２０】
イムノサイトカインは腫瘍を標的とする融合タンパク質治療の一例にすぎない。腫瘍特異的抗体への融合によって他の腫瘍有毒分子も腫瘍を標的とすることができる。さらに抗体融合タンパク質はウイルスに感染した細胞など他のタイプの疾病細胞を攻撃することができる。標的化融合タンパク質を造り出す別のアプローチは、Ｆｃ−ＸおよびＸ−Ｆｃ(ここでＸはポリペプチドである)技術の使用である。これらの技術は、対象とするポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に連結する場合、標的タンパク質の産生と収集が改善されるという知見を利用する。Ｆｃ−Ｘ融合タンパク質については、シグナルペプチド(その後に免疫グロブリン遺伝子のＦｃ断片が続く)が標的タンパク質のＮ−末端融合パートナーである。いくつかの例ではＸ−Ｆｃの向きで融合タンパク質を造り出すことが特に有利である。こうした構成体で、標的タンパク質はＮ末端融合タンパク質であり、Ｆｃ断片がこれに続く。リンパ細胞細胞表面糖タンパク質(ＬＨＲ)(米国特許第５，４２８，１３０号)およびグルカゴン様ペプチド(ＧＬＰ−１)が示されているように、いくつかのタンパク質については、このアプローチは有用である。
【００２１】
従って、本発明の方法および組成物は免疫原性が低減されたＦｃＸおよびＸ−Ｆｃ融合タンパク質の形態を提供する。本発明によれば、融合タンパク質の免疫原性は当技術分野で知られた方法またはここに開示する方法によってアッセイすることができる。
【００２２】
本発明の方法および組成物は、さらに免疫原性の低減されたアルブミン融合タンパク質を提供する。ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)は、その半減期が著しく長く、生体内に広く分配され、酵素機能や免疫学機能を有しないことから、治療用ペプチド／タンパク質のためにキャリアーとして使用されてきた(Ｙｅｈら、ＰＮＡＳ ８９：１９０４−１９０８,１９９２)。生体活性ペプチドのＨＳＡへの遺伝的融合は、分泌された治療用ＨＳＡ誘導体の回復に有用である。しかし、本発明によれば、ＨＳＡ−ＣＤ４などのアルブミン融合タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上で提示され得る１個または複数のＴ−細胞エピトープを一般に含む、新規な接合部を有する。本発明は、アルブミン融合タンパク質の免疫原性の低減された形態、およびアルブミン融合タンパク質の免疫原性を低減する一般的な方法を提供する。本発明によれば、有用なアルブミンタンパク質は、アルブミンの種、対立形質および変異された変異体、並びにそれらの断片を含む。好ましいアルブミンタンパク質は、ＨＳＡなどの野生型アルブミンタンパク質の構造と機能的な特性を保持する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、有用な変異を含む正常なまたは変異またはハイブリッド化されたアイソタイプを備えた脱−免疫化抗体融合タンパク質を提供する。これらの変異は、接合部近傍でもよいしまたは接合領域とは別の位置でもよい。
【００２４】
例えば、本発明は、ＩｇＧと非ＩｇＧ部分との間の接合部に点変異を含む、接合部で修飾された脱−免疫イムノサイトカインを提供する。サイトカイン部分はいかなるサイトカインも含むが、好ましくはＩＬ−２またはＩＬ−１２である。１つの実施形態では、アミノ酸変更は、抗体部分のＣ−末端リジンをアラニンまたはロイシンなどの疎水性アミノ酸に変更することを含む。こうした変異を本発明の脱−免疫化修飾と組み合わせることの重要な利点は、変異が、血中半減期の増加と免疫原性の低減にともに作用するということである。ここに記載する、融合接合部の脱免疫を血中半減期を変える変異と組み合わせる方法は、これらの融合タンパク質の臨床での効能を著しく改善するのに有用である。
【００２５】
別の態様では、本発明は、異なるＩｇアイソタイプ(好ましくは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２アイソタイプの両方)に由来するドメインを含むハイブリッド抗体部分と融合接合部での脱−免疫化修飾とを含むイムノサイトカインを提供する。例えば、本発明は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ２ｈ(ヒンジ領域をＩｇＧ１に修飾したＩｇＧ２)ハイブリッドを使用した、脱−免疫化、接合部修飾イムノサイトカインを提供する。好ましい実施形態では、ハイブリッド融合タンパク質は、ＩｇＧ(γ１：ＣＨ１−Ｈ)(γ２：ＣＨ２−ＣＨ３)からなる脱−免疫化免疫グロブリン部分とサイトカイン部分からなる。
【００２６】
別の態様では、本発明は、免疫原性の低減された融合タンパク質をコードするか、免疫原性の低減された融合タンパク質の発現、産生および分泌を促進する新規な核酸配列を提供する。このような核酸は標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成される。
【００２７】
好ましい実施形態において、核酸分子はイムノサイトカイン融合タンパク質をコードする。好ましいイムノサイトカインは、サイトカイン(例えばインターロイキン２)、およびヒト上皮細胞接着分子ＫＳＡ(ＥＰ−ＣＡＭ)(ｈｕＫＳ)に対する抗体などの腫瘍特異的モノクローナル抗体を含む。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、核酸分子は様々な配置においてＦｃ融合タンパク質をコードする。核酸分子は、５'から３'の方向に連続的にコードする、(ｉ)シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域そして標的タンパク質配列、または(ｉｉ)シグナル配列、標的タンパク質そして免疫グロブリンＦｃ領域、または(ｉｉｉ)シグナル配列、第１の標的タンパク質、免疫グロブリンＦｃ領域そして第２の標的タンパク質。生じる核酸分子は、これにより、Ｆｃ−Ｘ、Ｘ−ＦｃまたはＸ−Ｆｃ−Ｙ構造(ここで、ＸとＹは標的タンパク質である)をコードする。別の実施形態では、核酸はシグナル配列を有しないＦｃ−Ｘ、Ｘ−ＦｃまたはＸ−Ｆｃ−Ｙタンパク質をコードする。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、本発明の核酸は変異体またはハイブリッドのアイソタイプとのＩｇ融合タンパク質をコードする。特に、核酸は、ハイブリッドのアイソタイプあるいは変更されたヒンジ領域を備えた抗体部分を提供する。例えば、融合タンパク質は、ヒンジ領域に含まれるジスルフィド結合が少なくなるように修飾されたＩｇＧ２またはヒンジ領域が別の抗体(好ましくは正常もしくは変異体ＩｇＧ１ヒンジ領域)に由来するＩｇＧ２ ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる。
【００３０】
好ましくは、本発明の核酸は、作用可能な結合状態で複製可能な発現ベクター中に組み込み、次いでこの発現ベクターは融合タンパク質を産生するのに能力を有する哺乳類宿主細胞に導入する。生じる融合タンパク質は効率的に産生され、哺乳類の宿主細胞から分泌される。続いて分泌された融合タンパク質を哺乳類の宿主細胞を溶解せずに培養培地から回収する。タンパク質製品は必要に応じて慣用の試薬を使用して、活性アッセイおよび／または精製し、かつ／または、融合パートナーから開裂させる。これらはすべて慣用の技術を使用できる。
【００３１】
したがって、本発明はさらに免疫原性の低減された融合タンパク質を産生する方法を提供する。
【００３２】
さらに、本発明の方法および組成物は、免疫原性の低減された融合タンパク質を使用して、治療処置を提供するのに有用である。本発明の全体的な目的は、有効かつ廉価である方法とともに免疫原性の低減されたタンパク質を提供する。本発明の好ましい治療用組成物は治療上有効な量の脱−免疫化融合タンパク質を含む。好ましくは、脱−免疫化された融合タンパク質は、薬学的に許容できる担体とともに投与される。
【００３３】
これまでに述べてきた、また他の本発明の態様、特徴および利点は、以下に続く詳細な記述、図面および特許請求の範囲からより明白になるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（発明の詳細な説明）
治療用途での使用のために患者に投与される、抗体を含むタンパク質はすべて、レシピエントホストにおいて免疫反応を引き起こす可能性を有する。この免疫反応は、Ｔリンパ球(Ｔ細胞)によって仲介されるが、これは、次いで、Ｂリンパ細胞(Ｂ細胞)を起動して抗体を産生させる。治療剤に対する抗体産生は、治療剤のより多くの迅速な除去に結びつき、アレルギー反応を引き起こすおそれがあるため不利益である。
【００３５】
本発明は、融合タンパク質の免疫原性を低減する方法を提供する。本発明の１つの方法によれば、潜在的なＴ−細胞エピトープは、融合タンパク質の融合接合部の接合領域中で識別される。Ｔ−細胞エピトープは、コンピュータモデリングによる構造に基づく予測やペプチド合成、特異的ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合試験、または免疫原性アッセイを含む、種々の計算的および非計算的(コンピュータを用いたおよび非コンピュータ的な)方法により識別される。
【００３６】
本発明によると、融合接合部は、融合タンパク質において、第１のタンパク質またはペプチドの最後(Ｃ−末端)のアミノ酸と、第２のタンパク質またはペプチドの最初(Ｎ−末端)のアミノ酸との間の位置として定義される。したがって、融合接合部は、１つのタンパク質の最後のアミノ酸と第２のタンパク質の最初の任意のアミノ酸を含む。１つの実施形態では融合接合部はリンカーを含む。
【００３７】
本発明によれば、接合領域は２つのタンパク質間の融合接合部を囲むかその範囲にわたる融合タンパク質の領域である。接合領域は、好ましくは１と約１００個の間のアミノ酸、より好ましくは１と約５０個の間のアミノ酸、または１と約２５個の間のアミノ酸、さらに好ましくは１と約１５個の間のアミノ酸、または１と９個の間のアミノ酸を含む。１つの実施形態では、接合領域は２つのタンパク質間の接合ポイントに挿入されたスペーサーまたはリンカーペプチドを含む。本発明によれば、スペーサーまたはリンカーペプチドを含む接合領域も、スペーサーまたはリンカーを含む融合タンパク質に対する患者の反応を最小限にするために脱−免疫化することができる。
【００３８】
本発明によれば、接合部のＴ−細胞エピトープは、少なくとも２つの異なる融合パートナータンパク質の各々に由来する少なくとも１つのアミノ酸を含む、ＭＨＣクラスＩＩを結合可能なペプチド配列として定義される。例えば、Ｐａｕｌ(Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版[２０００]、ｐ.２７６、８章、表８)は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができる１０個のアミノ酸のセグメントを例として挙げている。接合部のＴ−細胞エピトープにおいて、これらの１０個のアミノ酸ペプチドは異なる融合パートナーに由来する。本発明によれば、融合接合部にわたる潜在的なすなわち候補となるＴ−細胞エピトープ(候補となる接合部Ｔ−細胞エピトープ)は、好ましくは接合部の一方の側から１〜８個のアミノ酸、より好ましくは接合部の一方の側から１〜１０個または１〜１１個のアミノ酸を含む。候補エピトープは好ましくは９個、１１個または１２個のアミノ酸長である。したがって、本発明の接合部Ｔ−細胞エピトープは、接合の各側に由来する少なくとも１個のアミノ酸を含むため、好ましい候補Ｔ−細胞エピトープは、結合の一方の側に由来する１〜８個(または１〜１０個もしくは１１個)のアミノ酸を含んでおり、さらに９〜１２個のアミノ酸(最も好ましくは９個のアミノ酸)を有するエピトープとなるように、これを補足する数のアミノ酸を接合の他方の側から含む接合部エピトープである。
【００３９】
本発明によれば、次いで、接合部のＴ−細胞エピトープ内のアンカー残基を変異させて、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を防ぐ。一般に、追加的な潜在的なＴ−細胞エピトープを導入しないように、かつ各融合パートナーの機能を保存するように注意する。
【００４０】
本発明によれば、野生型の配列の融合は、融合接合部のＮ−末端またはＣ−末端における配列が天然に存在する配列に直接由来する融合である。
【００４１】
本発明によれば、脱−免疫化された融合接合部は、野生型配列の接合に対して１個または複数の置換変異が導入された接合部配列である。最も好ましい実施形態では、融合接合部の脱免疫化は、「免疫原性でない」Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーなどのリンカーの導入を含まず、融合パートナーの空間的関係は脱−免疫化された融合タンパク質において変更されない。本発明によれば、１個または複数のアミノ酸は、接合領域中、融合接合部に対するＮ−末端、融合接合部に対するＣ−末端、融合接合部に対するＮ−末端とＣ−末端の両方のいずれでも置換または変更することができる。
【００４２】
本発明によれば、潜在的なＴ−細胞エピトープは、単離されたペプチドと見なしたとき、ＭＨＣクラスＩＩ分子または非ヒト種における等価物に結合すると予測される配列である。潜在的なＴ−細胞エピトープは、抗原提示細胞にタンパク質が取り込まれる効率、完全なタンパク質中の複数部位で分裂してＭＨＣクラスＩＩに結合可能なペプチドを生成する効率など、抗原処理の他の面を考察することなく定義される。したがって、動物にタンパク質を投与した後、ＭＨＣクラスＩＩ上に現実に提示されるＴ−細胞エピトープの集合は、潜在的なＴ−細胞エピトープの部分集合である。
【００４３】
本発明によれば、Ｔ−細胞エピトープはＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用するタンパク質上のエピトープである。特定の理論に拘束されるものではないが、Ｔ−細胞エピトープはタンパク質または融合タンパク質中のアミノ酸配列であって、Ｔ細胞の成育発展の間に否定的なＴ細胞選別過程を経ることなく、したがってＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示され、Ｔ細胞レセプターによって認識されると予想される配列であると理解される。本発明の好ましい実施形態では、非自己Ｔ−細胞エピトープは、融合タンパク質を形成する２つのタンパク質の融合接合部において接合領域中に存在する。
【００４４】
本発明は、精巧なコンピュータシミュレーションまたはタンパク質三次元構造を必要とせずに、融合タンパク質結合中のＴ−細胞エピトープの数を低減するか除去する非コンピュータ的方法を提供する。１つの実施形態では、本発明の方法は、９個のアミノ酸のコアセグメントが抗原提示の間、Ｔ細胞レセプターともＭＨＣクラスＩＩ分子ともその両方に相互作用するという事実を利用する。Ｎ−末端の多くのアミノ酸は「アンカー」位置残基と呼ばれ、ＭＨＣクラスＩＩ分子内の深いポケットに結合する。ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する上で重要なアンカー位置には、典型的には以下のアミノ酸のうちの１つが存在する：ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。本発明によれば、コアの９個のアミノ酸に隣接するさらに２〜３個のアミノ酸もＭＨＣ分子との相互作用に影響する。さらに、融合タンパク質の第１のタンパク質中のＣ−末端の多くのアミノ酸が一般に置換できる。これは特に、Ｎ−末端融合パートナーまたは第１のタンパク質が、Ｃ−末端融合パートナーまたは第２のタンパク質のＣ−末端に融合されたときに活性であるとわかっている場合、有用である。
【００４５】
本発明の一般的な方法は、融合タンパク質中のＮ−末端融合パートナーの最もＣ−末端側(C-terminal most)の８アミノ酸に存在するいかなるロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンを変異させることを含む。１つの実施形態では、候補となる接合部のＴ−細胞エピトープアミノ酸中のこれらの１個または複数のアミノ酸を、優先的にトレオニン、アラニンまたはプロリンに変異させる。これは、交換されたアミノ酸の疎水性の性質を幾分か保持する。本発明の別の実施形態では、１個または複数の前述のアミノ酸が、候補となるすなわち潜在的な接合部Ｔ−細胞エピトープから除去するか、または適当なアミノ酸類似体に置換する。本発明によれば、潜在的なＴ−細胞エピトープを破壊するためアミノ酸を除去する場合、除去部近くのアミノ酸を含む新たなＴ−細胞エピトープを生成しないように注意する。
【００４６】
本発明によれば、最後の８個のアミノ酸に１個または複数の疎水性残基の変異を含むＮ末端融合パートナーをコードする配列を含む一般化された発現プラスミド構築中間体を構築することが、多くの場合有用である。一般に、このようなプラスミドは、Ｎ末端融合パートナーのＣ−末端をコードするＤＮＡ部またはその近傍に、１個または複数の便利な制限酵素サイトを有する。
【００４７】
中間プラスミド構築の目的は、融合タンパク質(ここで、１個または複数のＮ−末端融合パートナーは、８個のＣ−末端アミノ酸において、ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの１個または複数を別のアミノ酸とする置換を有する)をコードする発現プラスミドを構築することである。このような最終発現プラスミドの構築は、当業者にはよく知られた他の方法、例えば、ＰＣＲ断片または合成核酸の生成後、断片を適当なベクターにライゲートするか、よく知られたＰＣＲ技術によって他の配列に結合させて行ってもよい。
【００４８】
特に好ましい実施形態は、Ｆｃ−Ｘ融合プラスミド、アルブミン−Ｘ融合プラスミド、ｓｃＦｖ−Ｘ融合プラスミドおよびＦａｂ−Ｘ融合プラスミドを含む。Ｆｃ(ガンマ)−Ｘの場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子のＦｃ領域のＣ−末端の近くにロイシン−セリン−ロイシン−セリンセグメントのアミノ酸置換をもたらすようにコード配列中に変異を導入することが有用である(ここではＩｇＧ１について図解する)。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に由来するヒトＦｃ領域のアミノ酸配列を配列番号：１、２、３および４にそれぞれ示す。
【００４９】
一例として、ＫＳＬＳＬＳＰＧＫ(配列番号：５)をＫＳＡＴＡＴＰＧＫ(配列番号：６)に変更する。この変異は、潜在的な接合部Ｔ−細胞エピトープを除去し、また、上流のフェニルアラニンまたはチロシンが位置１アンカー残基として機能するＴ−細胞エピトープを除去するべく設計されている。
【００５０】
あるいは、候補となる接合部Ｔ−細胞エピトープを除去する変異を血中半減期を延長する変異と組み合わせることが時として有用である。例えば、ＫＳＬＳＬＳＰＧＫ(配列番号：５)をＫＳＡＴＡＴＰＧＡ(配列番号：７)に変更することによる。
【００５１】
他の実施形態は、ＬＳＬＳセグメント中でのグリシンまたはプロリンなど他のアミノ酸への置換を含む。
【００５２】
ＩｇＡ融合タンパク質を作製するために使用する発現ベクターの場合には、Ｃ−末端アミノ酸のうちのいくつかを除去し、その結果、ＩｇＡのオリゴマー化に関係するＣ末端近くのシステインが除去されるようにすることが有用である。例えば、第２のタンパク質に融合される前に、ＩｇＡ重鎖配列がプロリン−トレオニン−ヒスチジンで終わるように１５個のアミノ酸を除去することができる。さらに、ＩｇＡ Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＣ−末端近くに以下の変更を導入することが有用である：
ＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨ(配列番号：８)をＱＫＴＡＤＲＴＡＧＫＰＴＨ(配列番号：９)に変更。
【００５３】
ＩｇＡ−Ｘ融合タンパク質中のさらなる脱−免疫化配列は以下のものである。
【００５４】
【化１】
【００５５】
アルブミン−Ｘ融合の場合には、アルブミン−Ｘ発現プラスミドに次の変化を導入してアルブミンのＣ−末端タンパク質を以下のように修飾することが有用である：
ＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ(配列番号：１３)をＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＴＴＡ(配列番号：１４)に変更。
【００５６】
したがって、本発明は免疫原の低減された融合タンパク質の構築において有用な核酸配列およびタンパク質を提供する。特に、本発明は、最後の８個のアミノ酸中の任意のロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの変異を有するタンパク質を提供する。タンパク質は好ましくは人体中に見出される配列に概ね相当する配列を有するヒトタンパク質である。本発明はこのようなタンパク質をコードする核酸配列も提供する。本発明のこの態様について核酸配列はプラスミド、ＰＣＲ−生成断片、または化学合成によって生成された核酸として存在してもよい。
【００５７】
本発明はまた、１個または複数のＮ−末端融合パートナーが、８個のＣ−末端のアミノ酸中、ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンを別のアミノ酸とする１個または複数の変異を有する融合タンパク質をコードする発現プラスミドを提供する。
【００５８】
例えば、Ｆｃ領域が上記のように変異されているＦｃ−ＩＬ２または全抗体−ＩＬ２融合タンパク質をコードするプラスミドが、本発明によって提供される。さらに、ＷＯ０１／３６４８９に記載されているエリスロポエチンの形態などのエリスロポエチンの正常な形態または変異された形態に上記のように変異されたＦｃ領域を含む融合体が、本発明によって提供される。
【００５９】
本発明は、さらにＮ−結合またはＯ−結合グリコシル化部位を、融合接合部近傍、好ましくは融合接合部に導入することにより、融合タンパク質結合の免疫原性を低減する方法を提供する。例えば、アスパラギン、セリンまたはトレオニンといったアミノ酸、および第３の残基を以下のように導入する。ＸがＮ−末端融合パートナーのアミノ酸を表わす配列であり、ＺがＣ−末端融合パートナーのアミノ酸を表わす配列を考えられたい：
【００６０】
【化２】
【００６１】
この方法によれば、結合ペプチドの接合はグリコシル化部位の導入によって必ずしも阻まれない。しかし、ＭＨＣクラスＩＩ溝内に結合し、Ｎ−末端最端アンカー残基に対してグリコシル化したアスパラギンＣ−末端を有する任意のペプチドは、Ｔ−細胞エピトープとして機能しない。大きなグリコシル化部分の存在は、立体的にＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体の認識を妨害するであろう。好ましいグリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ(ここでＸは好ましくはＧｌｙであるが、任意のアミノ酸であり得る)を含む。
【００６２】
さらに、グリシンおよびセリン残基を導入する変異の導入は新しいＴ−細胞エピトープを生成しない。グリシンもセリンもアンカー残基の役割を果たすことができない。抗原処理において、融合タンパク質は原則としてはグリコシル化したアスパラギンとグリシンの間、またはグリシンとセリンの間で開裂される。いずれの場合も、生じるペプチドはアンカー残基に対し変異体グリシンおよび／またはセリン残基Ｎ−末端を有し、したがって変異体グリシンおよび／またはセリン残基は、Ｔ細胞レセプターによって認識されない。アンカー残基に対する残基Ｎ−末端はＴＣＲによって認識される領域の外部にあるためである。
【００６３】
この方法の変形では、融合接合領域は、グリシン、セリン、アラニンなどのアミノ酸残基が先行するセリンまたはトレオニンを既に含む。接合領域が柔軟で各融合パートナーの疎水性コアから変位する場合、好ましくは第２の方法が使用され、その結果、新規なＮ−結合グリコシル化はいずれの融合パートナーの機能やフォールディングとも干渉しない。
【００６４】
タンパク質工学の技術における当業者にとって、グリコシル化部位の導入がどのような場合に実現可能かを決めるのは単純明快な問題である。例えば、各融合パートナーの三次元構造、または融合パートナーに近似した同族体が知られていることもあろう。タンパク質のＮ−末端またはＣ−末端に少数のアミノ酸がＸ線構造解析で解決されなかったり、ＮＭＲ構造が多くの可能なコンホメーションを示すことはしばしばある。グリコシル化部位のいずれかの側で３個またはそれ以上のアミノ酸が乱される場合、生じる融合タンパク質が正確に折り畳まれ、両方のパートナーが活性になる確信がある。所与の融合タンパク質が機能的であるかどうか決定するのには、ある種の定型的実験が必要である。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態では、融合タンパク質のＮ−末端およびＣ−末端パートナーの両方が、ヒトのタンパク質である。このような融合タンパク質中での潜在的なＴ−細胞エピトープは、Ｃ−末端パートナー(第２のタンパク質)の最初の８個のアミノ酸と結合した、Ｎ−末端パートナー(第１のタンパク質)の最終の８個のアミノ酸から創製される。これは、第１と第２のタンパク質から創製された一連の８個の９−ｍｅｒハイブリッドを提供する。第１のタンパク質の最後の８個のアミノ酸に脂肪族または芳香族性のいずれかの残基(ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシン)が含まれる場合、第１の位置(アンカー位置)にＭＨＣ分子のポケットを結合するアミノ酸を伴うＭＨＣ結合ペプチドを生成する危険が高い。したがって、前述のアミノ酸のうちのいずれかの置換は前述のアミノ酸のうちの１つでないアミノ酸、好ましくはアラニン、プロリンまたはトレオニンで行い、候補Ｔ−細胞エピトープを除去することになろう。
【００６６】
例えば、以下の配列：
【００６７】
【化３】
【００６８】
を含むＦｃ融合タンパク質の場合には、ロイシン残基は２つの潜在的なエピトープを生成する。したがって、配列はＬをＡに、およびＳをＴに変更し
【００６９】
【化４】
【００７０】
として脱−免疫化することができる。これらの変更は、ＭＨＣ結合ポケット中の第１のアミノ酸としてロイシンを、ＭＨＣ結合ポケット中の第１のアミノ酸としてチロシンをそれぞれ有するエピトープを除去する。
【００７１】
これらの置換は、人体においてすべてのＦｃ融合タンパク質を脱−免疫化するため、リンカー配列を伴う場合も伴わない場合も、好ましくは１)融合タンパク質における両方のタンパク質が、ヒトのタンパク質である場合；２)両方のタンパク質の天然配列でのＭＨＣ結合ペプチドは無視される場合；および３)本来の配列と同一の９−ｍｅｒも無視される場合に機能する。
【００７２】
本発明の方法は、一般にすべての脊椎動物において、好ましくは哺乳動物において、また、最も好ましくはヒトにおいて適用可能である。以下の実施例よって本発明をさらに説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７３】
実施例１：ｈｕＫＳ−ＩＬ２イムノサイトカインの免疫原反応性エピトープの除去
ＨｕＫＳ−ＩＬ２は、ヒト化されたＶHおよびＶL領域をヒトのＨおよびＬ鎖定常領域と組み合わせてなる。Ｈ鎖は、前に述べたようにそのカルボキシル末端をヒトＩＬ−２の成熟配列に融合した。このＨ鎖はγ１アイソタイプであり、Ｆｃレセプターに高い親和性がある。この高い親和性のためＨｕＫＳ−ＩＬ２は血液循環からすばやく取り除かれた。特定の理論に拘束されるものではないが、ＨｕＫＳ−ＩＬ２の除去は肝臓(クッパー(Kupffer)細胞)および脾臓(抗原提示細胞)中のＦｃＲ担持細胞を介して生じると推測される。
【００７４】
ある患者がｈｕＫＳ−ＩＬ２分子のある部分に対し免疫反応を示すことが以前に確証されている。しかしこれらの抗体によって認識されたエピトープは知られていない。反応的なエピトープを低減するために、ｈｕＫＳ−ＩＬ２を有する患者の血清の相対的な活性を他の関連するタンパク質と比較した：
(１)Ｈｕ１４．１８−ＩＬ２、完全に異なるヒト化されたＶ領域を備えているが正確に同じＣ領域およびＩＬ−２との融合接合部を有する分子；
(２)ＶＨ１、ヒト残基に張り合わせされた(veneered)、表面露出マウスＢ細胞エピトープを備えたマウスＶ領域に由来する、ＶHおよびＶLの領域中にＴ−細胞エピトープを含まないｈｕＫＳ−ＩＬ２の脱−免疫形；
(３)ＶＨ２、ヒト残基に張り合わせされた(veneered)、表面露出マウスＢ細胞エピトープを備えたマウスＶ領域に由来する、ＣＤＲ３中に１個の残存Ｔ−細胞エピトープを含むｈｕＫＳ−ＩＬ２の脱−免疫形で、このＶHは１個のＴ−細胞エピトープを含む；
(４)ＫＯＬまたはＥＵ Ｃγ１領域(ＫＳではなく)のいずれかで構築された４２５−ＩＬ２(アロタイプの活性と比較するため)；
(５)ｈｕＫＳ−ｍＩＬ２−、マウスＣ領域およびマウスＩＬ−２に融合したｈｕＫＳ Ｖ領域を備えた分子；
(６)ヒトＦｃ−ＩＬ２；
(７)ヒトＦｃのみ；
(８)ヒトＩＬ−２のみ。
【００７５】
免疫グロブリン融合タンパク質および断片をタンパク質Ａセファロースクロマトグラフィーによって精製し、重炭酸ソーダバッファー中９６−ウエルプレートに塗り、次いで、１％ＢＳＡを含有する１％ヤギ血清でブロックした。患者血清の稀釈液をインキュベートし、次いで、結合しない物質をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄して除去した。患者血清から得た結合したヒト抗体を、結合タンパク質に依存する様々なＨＲＰ複合抗体(ＨＲＰ-conjugated antibodies)で検知した。一般に、ヤギ抗ヒトγ鎖ＨＲＰを使用した。プレートに結合されたタンパク質のほとんどがヒトＦｃおよびヒトκ鎖からなっていたためである。
【００７６】
ある患者血清は、同じ患者からの注入前血清においては検知されなかったｈｕＫＳ−ＩＬ２に明瞭な反応を示した。免疫前(preimmune)抗血清はベースライン(基線)となる非免疫対照を確立するために使用した。患者血清で見られた反応は、(１)抗ＩＬ２反応、(２)抗Ｆｃ(アロタイピック)反応、(３)新規な接合配列に対する反応または(４)ＫＳイディオタイプとの抗イディオタイプ、またはこれらの反応の組合せによるものとすることができる。
【００７７】
患者血清は、組換えＩＬ−２やＦｃ領域(上記１および２)とは顕著には反応しなかった。何人かの患者はＫＳ Ｖ領域に抗イディオタイプ反応を示した。患者血清はすべて、Ｆｃ−ＩＬ２とは反応を示した。４人の患者のうちの３人はＦｃ−ＩＬ２と反応を示した。Ｆｃ−ＩＬ２に対するが、ＦｃまたはＩＬ２のいずれかに対するものではない反応の存在は、ＦｃとＩＬ２の間の結合が患者の抗血清によって認識されたことを示唆している。
【００７８】
実施例２：ＭＨＣクラスＩＩの除去によって免疫原性を低減するための抗体−サイトカイン融合タンパク質の接合部におけるアミノ酸残基の修飾
ペプチドスレッディング分析により、強いＭＨＣ可能性を有する２個の重複するペプチドセグメントが、イムノサイトカインのＦｃとＩＬ２部分の間の接合部に識別された。潜在的なＴ−細胞エピトープのペプチドスレッディングおよび識別は、Ｃａｒｒ(ＷＯ００／３４３１７)に開示されるように実行した。アミノ酸の変更は、既存の潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合エピトープを除去するが、新たな潜在的なＭＨＣクラスＩＩエピトープを導入しないように行われた。
【００７９】
接合部配列ＬＳＬＳＰＧＫ−ＡＰ(配列番号：１７)のＡＴＡＴＰＧＡ−ＡＰ(配列番号：１８)への修飾(「ＬＳＬＳからＡＴＡＴへ」)(ここで、ハイフンはイムノサイトカインｈｕＫＳ−ＩＬ２接合部である)は、接合部由来ペプチド配列を、免疫原性にもたらすのに十分に高い親和性をもって任意のヒトのＭＨＣクラスＩＩに結合できないようにする。
【００８０】
実施例３：免疫原性を低減するためのサイトカイン融合タンパク質の接合部におけるアミノ酸残基の修飾
接合部配列ＬＳＬＳＰＧＫ−ＡＰ(配列番号：１７)のＬＮＬＳＰＧＡ−ＡＰ(配列番号：１９)への修飾(「ＬＳＬＳからＬＮＬＳへ」)(ここで、ハイフンはイムノサイトカインｈｕＫＳ−ＩＬ２接合部である)によっても、接合部由来ペプチド配列はある種のヒトのＭＨＣクラスＩＩには結合可能である。しかし、ＫＳ−ＩＬ２タンパク質が哺乳類細胞中で発現され分泌される場合、タンパク質は、ＮＸＳ／Ｔ配列であるため接合部近傍でＮ−グリコシル化される。
【００８１】
生じる接合部由来ペプチドは、接合部由来ペプチドがＭＨＣクラスＩＩによってＴ細胞に提示されたとき、大きなグリコシル化部分がＴ細胞レセプターとＭＨＣクラスＩＩの間の特異的ドッキングを妨げるため、Ｔ−細胞エピトープのように有効ではない。
【００８２】
実施例４：脱−免疫化されたｈｕＫＳ−ＩＬ２イムノサイトカインとの比較におけるイムノサイトカインｈｕＫｓ−ＩＬ２への抗原提示細胞の免疫反応性の同定
反応性エピトープの修飾による免疫原性の低減を、ＬＳＬＳをＡＴＡＴに変化させることにより以下のように直接試験する。この配列を模倣する合成ペプチドは、樹状細胞(ＤＣ)などの古典的抗原提示細胞の免疫反応を変更する。以下の合成ペプチド：
【００８３】
【化５】
【００８４】
(ここで、ハイフンがＫＳ−ＩＬ２結合である)は、自己Ｔ細胞へのＤＣ−仲介抗原提示を刺激するために使用される。続いて行うペプチド抗原による挑戦に対する反応においてこれらのＴ細胞が示す増殖能力は、そうしたペプチドの免疫原性の基準として有用である。
【００８５】
特に、標準の密度勾配技術によりリューコパック(leukopack)から末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を分離する。単核細胞を血清を含まないＡｉｍ Ｖ培養培地中に再懸濁させ、付着させる。３７℃で２時間後、付着していない細胞を除去する。付着細胞は、未成熟樹状細胞(ＤＣ)を誘導するためにヒトＧＭ−ＣＳＦ(５０ｎｇ／ｍｌ)およびＩＬ−４(２０ｎｇ／ｍｌ)を含む培地中で７日間培養する。７日後に細胞を収穫し、適当なＦＩＴＣラベルが付けられたＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ４０に対するＡｂｓを用いてフローサイトメトリーを行って発現型を同定し、未熟なＤＣを確認した。
【００８６】
付着していない細胞は、ＩＬ２およびＩＬ７とともに培養し、後の機能的な研究で用いる自己由来のエフェクター細胞(Ｔ細胞)を得る。機能的な研究では、Ｔ細胞を未熟な樹状細胞に加え(比率１０：１)、ｈｕＫＳ、脱−免疫化ｈｕＫＳ、ペプチド接合部１３ｍｅｒ(ＫＳＬＳＬＳＰＧＫ−ＡＰＴＳ)(配列番号：２０)および修飾され、脱−免疫化された１３ｍｅｒペプチド(ＫＳＡＴＡＴＰＧＫ−ＡＰＴＳ)(配列番号：２１)とともに共培養する。イムノサイトカインまたは免疫原性ペプチドおよび修飾され、脱−免疫化されたペプチドの各々に暴露した後、トリチウムを含むチミジンを組み入れることにより測定した増殖指数を比較して、各分子の免疫原性の程度を示す。すなわち、放射性の組込みの増加は、各ペプチドがＤＣ上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合してＴ細胞に提示される能力にほぼ比例する。
【００８７】
実施例５：アルブミン融合タンパク質中に見出される免疫原性反応性エピトープの除去および免疫原性を低減するための融合接合部におけるアミノ酸残基の修飾
ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)は、その著しい半減期の長さのため、生体内で広く分配されるとともに酵素的または免疫学的機能が欠如していることから、治療用のペプチド／タンパク質用の担体として用いられてきた。遺伝子的に操作されたＨＳＡ−ＣＤ４ハイブリッドは、生体外で可溶性ＣＤ４に似た抗ウイルス性を示すとともにＣＤ４＋細胞中へのヒト免疫不全ウイルスの侵入を阻むことが示されている(Ｙｅｈら、ＰＮＡＳ ８９：１９０４−１９０Ｓ、１９９２年)。したがって、ＨＳＡに生体に影響するペプチドを遺伝的に融合することは、分泌される治療用ＨＳＡ誘導体を設計および回復に有用である。しかし、すべての融合タンパク質と同様に、ＨＳＡ−ＣＤ４は新規な接合部を有し、これは免疫原になり得るとともに、ＭＨＣクラスＩＩ分子上で提示され得るＴ−細胞エピトープを含む。実施例１、２、３および４の方法を使用したＨＳＡとＣＤ４との間の接合部の分析はペプチドを、ＭＨＣと結合する可能性を識別する。潜在的に免疫原性の配列は、潜在的なＴおよびＢ細胞エピトープを減少または除去させて免疫原性を低減するために修飾される。同様に、免疫原性を低減するために新規なグリコシル化部位を接合領域に導入することができる。
【００８８】
【化６】
【００８９】
本発明では、ＨＳＡ−ＩＦＮａｌｐｈａ融合タンパク質接合領域が３つの候補Ｔ−細胞エピトープ：
【００９０】
【化７】
【００９１】
を含むことが想定される。
【００９２】
配列番号１３と２３で描かれるＴ−細胞エピトープは重複し、ＬＶ(太字)をＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＷおよびＹ以外の任意のものに変更することにより脱−免疫化することができる。あるいは、ペプチドスレッディングスコアは、ＬＧをＴＴに変更することにより著しく低減することができる。配列番号：２４中のＴ−細胞エピトープは、２番目のＬ(太字)をＡに変更することにより脱−免疫化することができる。
【００９３】
さらに、ＨＳＡ−Ｘ融合(ここでＸは任意のタンパク質でよい)の場合、融合接合部の脱−免疫化は、アミノ酸配列ＡＡＬＧＬ(配列番号：２５)をＴＡＴＴＡ(配列番号：２６)に変更することにより実現できる。
【００９４】
【化８】
【００９５】
実施例６：Ｘ−Ｆｃ融合タンパク質および免疫原性を低減するための融合接合部のアミノ酸残基の修飾
いくつかの例では、Ｘ−Ｆｃの向きの融合タンパク質を創出するのが有利である。これらの構成体により、標的タンパク質はＮ−末端融合タンパク質であり、Ｆｃ断片が続く。例えば、グルカゴン様ペプチド(ＧＬＰ−１)は、その活性のために遊離Ｎ−末端が必要であり、したがって、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体が有用である。
【００９６】
ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質は、当技術分野の文献に記載された標準的技術によって構築される。この融合タンパク質は、γ１重鎖のヒンジと接合したＧＬＰ−１のＣ−末端を有する。ＣｙｓからＳｅｒ(残基５)への変異体(これは、ＩｇＧ１の軽鎖とのジスルフィド結合を形成するＣｙｓ残基を除去する)を含むγ１ヒンジ配列(Ｌｏら(１９９８)Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５−５００)が使用される。非変異Ｆｃ配列は、
【００９７】
【化９】
【００９８】
であり、下線部がヒンジ領域で、この後にＣＨ２領域配列の開始点が続く。
【００９９】
ＧＬＰ−１（７−３７）と変異体Ｆｃ間の融合接合部は次の通りである：
【０１００】
【化１０】
【０１０１】
ＧＬＰ−１（７−３７）間と正常Ｆｃの融合接合部は次の通りである：
【０１０２】
【化１１】
【０１０３】
３個の潜在的エピトープがＧＬＰ−１−Ｆｃ融合接合部におけるペプチドスレッディングにより識別される。
【０１０４】
【化１２】
【０１０５】
実施例１〜３と同様に行ったＧＬＰ−１(太字テキスト)とＦｃ(通常テキスト)の間の融合接合部の分析により、ＭＨＣ結合性を有するペプチドが識別される。ペプチドスレッディング分析によって潜在的なサイトを識別した後、潜在的に免疫原性の配列をアミノ酸置換により修飾し、潜在的なＴ細胞およびＢ細胞結合エピトープを低減または除去して免疫原性を低減する。
【０１０６】
配列番号：３１、３２および３３で示される前記の潜在的Ｔ−細胞エピトープは単一のアミノ酸置換をなすことにより脱−免疫化される。例えば、配列番号：３１で示されるペプチドはリジン(太字で示す)をトレオニンにおよびアルギニン(太字で示す)をトレオニンに変更することにより脱−免疫化される。配列番号：３２で示されるペプチドは、イソロイシン(太字で示す)をアラニンまたはプロリンに替えることにより脱−免疫化され、配列番号：３３のペプチドは、ロイシンをアラニンまたはプロリンに替えることにより脱−免疫化される。生じる脱−免疫化接合部は次の通りである：
【０１０７】
【化１３】
【０１０８】
融合接合部にグリコシル化部位を導入する典型的な方法によれば、次の変更が導入される：
【０１０９】
【化１４】
【０１１０】
実施例７：Ｅｎｂｒｅｌ、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性反応性エピトープの除去、および免疫原性を低減するための融合接合部のアミノ酸残基の修飾
ＥＮＢＲＥＬまたはエタネルセプト(ＦＤＡによって承認されたＸ−Ｆｃ融合タンパク質)は、慢性関節リウマチを治療するために使用される腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)阻害剤である。ＥＮＢＲＥＬは、ヒトＩｇＧ１のＦｃタンパク質に結合されたＴＮＦレセプターの細胞外のリガンド結合ドメインからなる二量体の融合タンパク質である。ＴＮＦＲ−Ｆｃは、ＴＮＦのそのレセプターへの結合を競争的に阻害し、結合したＴＮＦを生物学的に不活性にし、炎症性の活性を顕著に低減させる。ＧＬＰ−１−Ｆｃについて上述したように、ＴＮＦＲ−Ｆｃは潜在的なＴ−細胞エピトープを含む新規な接合部を有する。
【０１１１】
ＴＮＦ−ＲのＣ−末端部分(太字テキスト)のｇ１ヒンジＮ−末端(通常テキストで示しヒンジ領域を、下線を付して表す)への直接融合間の接合部は以下の通りである：
【０１１２】
【化１５】
【０１１３】
実施例１〜４と同様に行ったＴＮＦ−ＲとＦｃ間の融合接合部の分析により、ＭＨＣ結合性を有するペプチドが識別される。ペプチドスレッディング分析により潜在的なサイトを識別した後、潜在的に免疫原性の配列をアミノ酸置換により修飾し、潜在的なＴ細胞およびＢ細胞結合エピトープを低減または除去して免疫原性を低減する。
【０１１４】
融合接合部にグリコシル化部位を導入する典型的な方法によって以下の変化を導入した：
【０１１５】
【化１６】
【０１１６】
実施例８：Ｆｃ−ＩＬ１２−ＩＬ２などのＦｃ−Ｘ−Ｙ融合タンパク質の免疫原性反応性エピトープの除去、および免疫原性を低減するための融合接合部のアミノ酸残基の修飾
Ｆｃ−ＩＬ１２−ＩＬ２などのＦｃ−Ｘ−Ｙの配置の融合タンパク質は、潜在的に免疫原性である多数の新規な融合接合部を有する。例えば、Ｆｃ−ＩＬ１２は、他のＦｃ−Ｘ融合タンパク質またはイムノサイトカイン(実施例１)に類似した融合接合部を有するが、サイトカインＩＬ１２の使用のために新規である。融合接合部は免疫原性の結合サイトについて分析され、従って修飾される。第２に、融合タンパク質を構成する２個の異なるサイトカインとともに、実施例５に記載されたそれに匹敵するＸ−Ｙ融合接合部がある。ペプチドスレッディング分析が融合接合部の各々について使用される。
【０１１７】
接合部の分析は、ＦｃのＣ−末端(太字テキスト)とＩＬ１２ｐ３５のＮ−末端(通常テキスト)との間に
【０１１８】
【化１７】
【０１１９】
を、およびＩＬ１２ｐ４０のＣ−末端(太字テキスト)とＩＬ２のＮ−末端(通常テキスト)との間に
【０１２０】
【化１８】
【０１２１】
を、ペプチドスレッディングによりＭＨＣ結合性を有するペプチドを識別する。潜在的に免疫原の配列は、潜在的なＴ−細胞エピトープを低減させるかまたは除去するために修飾される。
【０１２２】
例えば、上記の配列(１)では、次の変更が行われる：
【０１２３】
【化１９】
【０１２４】
これらの変更は、ＦｃとＩＬ１２のｐ３５サブユニットの接合部におけるいくつかのＴ−細胞エピトープのＭＨＣクラスＩＩ結合可能性を低減または除去する。
【０１２５】
別の例では、上記の配列(２)はＩＬ−２内の最初の２つの位置にアスパラギンおよびグリシンを導入することで、グリコシル化部位を導入するように修飾される。この戦略は成熟ＩＬ−２の位置３で天然に存在するトレオニンを使用する。さらに、ｐ４０部分中のジスルフィド結合の形成を開裂させないことが重要である。したがって、少なくとも１個または２個のアミノ酸によってグリコシル化部位をｐ４０の中のシステインから分離することが有用である。
【０１２６】
【化２０】
【０１２７】
ＩＬ１２ｐ４０−ＩＬ２融合の場合には、上に論じたようなグリコシル化部位の導入が以下の潜在的なＴ−細胞エピトープを生成する。
【０１２８】
【化２１】
【０１２９】
しかし、Ｔ−細胞エピトープのグリコシル化は、ＭＨＣクラスＩＩの結合を妨げて低減された免疫原性をもたらす。
【０１３０】
実施例９：Ｘ−Ｆｃ−Ｙ融合タンパク質の接合部における免疫原性反応性エピトープの除去、およびＭＨＣクラスＩＩ結合を低減するための融合接合部のアミノ酸残基の修飾
ＩＬ４−Ｆｃ−ＧＭＣＳＦなどのＸ−Ｆｃ−Ｙ配置の融合タンパク質は、潜在的なＴ−細胞エピトープを含む多数の新規な融合接合部を有する。ＩＬ４−Ｆｃは、他のＸ−Ｆｃ融合タンパク質(実施例６および７)と類似している接合であるが、サイトカインＩＬ４の使用のために新規である。例えば、ヒンジ領域を使用するＦｃ、ＣＨ２およびヒトγ１からのＣＨ３領域を用いる形態が使用される。前述のように、ｐｄＣｓｈｕＦｃγｌ中のγ１ヒンジ配列は、ＩｇＧ１中の軽鎖とのジスルフィド結合を形成するＣｙｓ残基を除去するＣｙｓのＳｅｒへの変異(下線)を含んでもよいし(Ｌｏら(１９９８)Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５−５００)、これにより、分析のための第３の潜在的に免疫原の融合接合部を生成してもよい。融合接合部は潜在的なＴ−細胞エピトープについて分析し、実施例１〜４の方法によって修飾した。
【０１３１】
融合タンパク質を構成する異なるサイトカインＧＭＣＳＦとともに、イムノサイトカインｈｕＫＳ−ＩＬ２について実施例１に記載したそれに匹敵するＦｃＹ融合接合部が存在する。この融合接合部も潜在的なＴ−細胞エピトープのために分析し、実施例１〜４の方法によって修飾した。
【０１３２】
特に、接合部の分析は、ＩＬ４のＣ−末端(太字テキスト)とＦｃのＮ−末端(通常テキスト)との間に
【０１３３】
【化２２】
【０１３４】
を、およびＦｃのＣ−末端(太字テキスト)とＧＭＣＳＦ Ｎ−末端(通常テキスト)との間に
【０１３５】
【化２３】
【０１３６】
を、ペプチドスレッディングにより、ＭＨＣ結合性を有するペプチドを識別する。潜在的なＴ−細胞エピトープは、免疫原性を減少するために潜在的なＴエピトープを除去または低減するために修飾される。
【０１３７】
ＩＬ４−Ｆｃ融合タンパク質の接合部での候補Ｔ−細胞エピトープは以下の通りである：
【０１３８】
【化２４】
【０１３９】
ここで、Ｅ(太字)をＴに変更することでペプチドスレッディングスコアすなわちＭＨＣクラスＩＩ結合可能性を著しく低減する。修飾されたＩＬ４−Ｆｃ融合の配列は以下の通りである：
【０１４０】
【化２５】
【０１４１】
Ｆｃ−ＧＭＣＳＦ融合接合部は、以下に示すように配列ＬＳＬＳをＡＴＡＴに変更することにより脱−免疫化される。
【０１４２】
【化２６】
【０１４３】
実施例１０：ハイブリッドアイソタイプにより調製してイムノサイトカインとイムノフュージンの融合接合部におけるＴ−細胞エピトープを除去するためのアミノ酸残基の修飾
抗体またはハイブリッドアイソタイプとの抗体に基づく融合タンパク質を構築し、その結果、異なるアイソタイプの有用な特徴を単一の分子中に組み合わせることは多くの場合有用である。ハイブリッドアイソタイプとの融合タンパク質は免疫原性を低減するために本発明によって修飾してもよい。
【０１４４】
次の構成成分を備えた抗体融合タンパク質を標準的な組換えＤＮＡ技術によって構築する：軽鎖および重鎖、腫瘍特異的抗原を認識するＶ領域、典型的な軽鎖である軽鎖、およびＩｇＧ２由来のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖、並びにＩｇＧ１由来ヒンジ領域、さらに上記の融合接合部を含む重鎖のＣ−末端に融合されたサイトカイン。
【０１４５】
このタンパク質は、ＣＨｌｇ２とヒンジ−ｇ１との間およびヒンジ−ｇ１とＣＨ２ｇ２との間に新規な接合部を含んでいる。これらの接合部における潜在的なＴ−細胞エピトープの識別および修飾は、以下のように実行される。ＩｇＧ２またはＩｇＧ２ｈアイソタイプのいずれかで調製されたイムノサイトカインおよびＦｃ−Ｘ融合タンパク質については、これらの修飾は、上記実施例１、２、３および８におけるのと同一である。Ｘ−Ｆｃ ＩｇＧ２ｈイムノフュージンについては、ＦｃのＮ−末端が、ＩｇＧ１タイプに修飾されたＩｇＧ２ｈタンパク質のヒンジ領域内にあるので、新規な結合も同一である。しかし、ＩｇＧ２免疫グロブリンに挿入されたＩｇＧ１ヒンジは、ＩｇＧ２ ＣＨ１とＩｇＧ１ヒンジとの間、およびＩｇＧ１ヒンジとＩｇＧ２ ＣＨ２との間に２つの新規な接合部を生成するという点で、２個の新規な融合接合部がある。
【０１４６】
【化２７】
【０１４７】
したがって、接合部の分析は、ＩｇＧ２ ＣＨ１のＣ−末端(太字テキスト)とＩｇＧ１ヒンジのＮ−末端(通常テキスト)間に
【０１４８】
【化２８】
【０１４９】
を、および、ＩｇＧ１ヒンジのＣ−末端(太字テキスト)とＩｇＧ２ ＣＨ２ ＦのＮ−末端(通常テキスト)の間に、
【０１５０】
【化２９】
【０１５１】
を、ペプチドスレッディングにより、ＭＨＣ結合性を有するペプチドを識別するであろう。潜在的な免疫原性配列は、免疫原性を減少するために潜在的なＴおよびＢ細胞エピトープを除去または低減するように修飾される。
【０１５２】
ＩｇＧ２ＣＨ１−ＩｇＧ１ヒンジ融合接合部での２つの潜在的なＴ−細胞エピトープは、以下の通りである：
【０１５３】
【化３０】
【０１５４】
ＩｇＧ２ＣＨｌ−ＩｇＧ１ヒンジ融合接合部は、Ｖ(太字)をＡ、ＴまたはＰに変更することにより脱−免疫化される。修飾された融合接合部の配列は配列番号：５３
【０１５５】
【化３１】
【０１５６】
に示される。
【０１５７】
前述のように、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγｌ中のγ１ヒンジ配列は、ＩｇＧ１中の軽鎖とジスルフィド結合を形成するＣｙｓ残基を除去するＣｙｓのＳｅｒへの変異(下線)を含んでもよいし(Ｌｏら(１９９８)Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５−５００)、これにより、分析および修飾のためのさらに２個の潜在的に免疫原性の以下の融合接合部を生成してもよい。
【０１５８】
【化３２】
【０１５９】
実施例１１：ＩｇＧ１とＩｇＧ４のハイブリッドアイソタイプＦｃ構成成分を使用するＦｃ−ＥＰＯ融合タンパク質の生成
Ｆｃエリスロポエチン融合タンパク質を生成するために、次の発現プラスミドを標準的分子生物学技術を使用して構築した。アミノ酸置換Ｈｉｓ３２Ｇｌｙ、Ｃｙｓ３３Ｐｒｏ、Ｔｒｐ８８ＣｙｓおよびＰｒｏ９０Ａｌａをもたらす変異を備えた配列をコードするヒトエリスロポエチンの形態を含むＸｍａＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片を、ＷＯ０１／３６４８９に示されるように、使用した。対応するタンパク質配列は配列番号：５６
【０１６０】
【化３３】
【０１６１】
に示される。
【０１６２】
ＣＨ３Ｃ−末端の領域のアミノ酸置換をもたらす２セットの変異を施したこと以外、このＸｍａＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片を、ＩｇＧ１からのヒンジ領域およびＩｇＧ２からのＣＨ２とＣＨ３領域をコードするプラスミドベクターに挿入した。ＣＨ３ Ｃ−末端とＥｐｏ Ｎ−末端の接合部の配列を以下の通りである：
【０１６３】
【化３４】
【０１６４】
変異の第１のセット(これは、ＫＳＬＳＬＳＰＧ(配列番号：５８)のＩｇＧ２ ＣＨ３領域の配列をＫＳＡＴＡＴＰＧ(配列番号：５９)に変更する)は、米国特許出願シリアル番号第６０／２８０，６２５号に開示されている。Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ(配列番号：５８の位置３から位置６)をＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ(配列番号：５９の位置３から位置６)に置き換える置換の効果は、ヒトＦｃとヒトエリスロポエチンとの間の結合が非自己ペプチド配列を含むことから発生するかもしれない潜在的なヒト非自己Ｔ−細胞エピトープを除去することである。ＣＨ３領域のＣ−末端アミノ酸においてＫからＡへの単一アミノ酸置換からなる第２のセットは、米国特許出願シリアル番号第０９／７８０，６６８号に開示されている。
【０１６５】
生じるプラスミドはＮＳ／０細胞に感染させ、当技術分野で知られた操作によってＦｃ−Ｅｐｏ融合タンパク質を発現させ精製した。タンパク質Ａへの結合に基づく精製後、ＩｇＧ２ ＣＨ３および上記エリスロポエチン置換を含むｈｕＦｃγ２ｈ−ｈｕＥｐｏタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって同定され、２つの独立した調製物中で９７％のモノマーおよび９０％のモノマーからなることが見出された。ＩｇＧ２ ＣＨ３および上記エリスロポエチン置換を含むｈｕＦｃγ２ｈ−ｈｕＥｐｏタンパク質は、細胞ベースのアッセイ(エリスロポエチンタンパク質がＴＦ−１細胞分裂を刺激するという能力を測定する)においてヒトエリスロポエチンと、モル基準で、ほぼ同様な活性を有することが見出された。アッセイはＷＯ０１／３６４８９に記述されるようにして行われた。
【０１６６】
さらに、ＩｇＧ１(ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３)、ＩｇＧ２(ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３)またはＩｇＧ１(ヒンジ)−ＩｇＧ２(ＣＨ２−ＣＨ３)のいずれかからなるＦｃ領域のＣ−末端に非変異ヒトエリスロポエチンを融合したものを同定した。非変異ヒトＦｃ配列および非変異エリスロポエチン配列を含む発現プラスミドを、上記プラスミドと同様に構築した。ＮＳ／０細胞を、Ｆｃγ１−Ｅｐｏ、Ｆｃγ２−ＥｐｏおよびＦｃγ２ｈ−Ｅｐｏ発現プラスミドに感染させ、各プラスミドのほぼ等しい数のクローンをスクリーニングした後に安定したクローンを分離した。産生性が最良のクローンは、Ｆｃγ１−Ｅｐｏを５０μｇ／ｍｌ、Ｐｃγ２−Ｅｐｏを２０μｇ／ｍｌおよびＦｃγ２ｈ−Ｅｐｏを１２０μｇ／ｍｌ産生した。
【０１６７】
以下の例は、本発明で示される融合タンパク質の配列内に免疫原性の配列領域(Ｔ−細胞エピトープ)の識別するための好ましい方法について詳細に記述する。しかし、既知の他の方法でもこの分子を得ることができる点が指摘されるべきである。
【０１６８】
実施例１２：計算上の方法によるＴ−細胞エピトープの識別
本発明によれば、融合タンパク質の接合領域のエピトープは、その免疫系との相互作用を調整するためにタンパク質中に変異体を導入する方法を使用して修飾することができる。本発明によれば、本発明によって適用することができる当業者には知られた方法は、先行技術（ＷＯ９２／１０７５５およびＷＯ９６／４０７９２(Novo Nordisk)、ＥＰ ０５１９ ５９６(Merck ＆ Co.)、ＥＰ ０６９９ ７５５(Centro de Immunologia Moelcular)、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ９８／５９２４４(Biovation Ltd.)に記載されたもの、さらに関連する方法を含む。
【０１６９】
しかし、前記エピトープの識別がここに詳細に記載する以下の新しい方法によって実現され、本発明による融合タンパク質の接合領域に適用されるのであれば、有利な変異体タンパク質を得ることができる。
【０１７０】
タンパク質、ポリペプチドまたは免疫グロブリンの全体的構造を決定するのに重要な役割を果たす要因は多数存在する。第１に、ペプチド結合、アミノ酸を鎖状に互いに連結するその結合は、共有結合である。この結合は平面構造であり実質的に置換アミドである。「アミド」は−ＣＯＮＨ−基を含む有機化合物の任意の基である。
【０１７１】
隣接アミノ酸のＣαを連結する平面状ペプチド結合は以下に示すように表すことができる：
【０１７２】
【化３５】
【０１７３】
Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子は比較的剛性な平面内にあるので、これらの軸の周りに自由な回転は生じない。このため、破線によって模式的に描いた平面は時として「アミド平面」または「ペプチド平面」と呼ばれ、この平面にはペプチド骨格の酸素(Ｏ)、炭素(Ｃ)、窒素(Ｎ)および水素(Ｈ)原子が載る。このアミド平面の相対する両隅にはＣα原子が位置する。ペプチド平面すなわちアミド平面内では、Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子の周りの回転が実質的にないので、ポリペプチド鎖はＣα原子を連結する一連の平面状ペプチド結合を含む。
【０１７４】
ポリペプチドまたはタンパク質の全体構造または立体構造を規定する上で重要な役割を果たす第２の要因は、共通なＣα連結の周りの各アミド平面の回転角である。「回転角」および「ねじり角」という用語は以下では同義語と見なされる。アミド平面にＯ、Ｃ、ＮおよびＨ原子が載ると仮定すると(立体構造によってはこれらの原子のうちいくつかは平面から若干ずれるかもしれないが、これは通常有効な仮定である)、これらの回転角はＮとＲポリペプチドの骨格の立体構造、つまり隣接残基間に存する構造を定義する。これらの２つの角度はφおよびψとして知られている。したがって、１組の角度、φiおよびψi(ここで添字ｉはポリペプチド鎖の特定の残基を表す)はポリペプチドの２次構造を有効に規定する。角度φおよびψを定義するのに使用される慣用規則、すなわち、所与のポリペプチドについてのアミド平面が角度０を形成する参照ポイント、並びに角度φの定義および角度ψの定義は、文献に定義される。例えば、Ramachandran et al. Adv.Prot.Chem.23：283-437(1968)、特に２８５−９４頁参照(これらのページは言及によって本願に組み込まれる)。
【０１７５】
本発明の方法は任意のタンパク質に適用することができ、ヒトでは、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合溝の主要なポケット１アンカー位置が、特定のアミノ酸側鎖に対してよく設計された特異性を有するという発見に部分的に基づいている。このポケットの特異性は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータ鎖の位置８６でのアミノ酸の同一性によって決定される。このサイトはポケット１の底に位置し、このポケットに収容され得る側鎖の大きさを決定する。Marshall, k.W.、 J.Immunol.、 152：4946-4956 (1994)。この残基がグリシンである場合、すべての疎水性脂肪族および芳香族アミノ酸(疎水性脂肪族は以下のものである:バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニン、また芳香族は以下のものである:フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン)は、ポケット内に収容され得る(芳香族側鎖が優先される)。このポケット残基がバリンである場合、このアミノ酸側鎖はポケット内部に突出するので、収容できるペプチド側鎖のサイズを制限する(例えば疎水性脂肪族側鎖だけが収容可能である)。したがって、アミノ酸残基配列において、疎水性脂肪族および芳香族側鎖を有するアミノ酸が存在する場合にはいつでも、ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープが存在する可能性がある。しかし、側鎖が疎水性脂肪族である場合は、芳香族側鎖の場合と比較して、(全人口において、ポケット１タイプの分布がほぼ均一であると定すれば)Ｔ細胞エピトープに関連する可能性はおよそ２倍である。
【０１７６】
本発明を具体化する計算方法は、以下のようにＴ細胞エピトープを含むペプチド領域の可能性を特徴づける：
(１)予め定義した長さのペプチドセグメントの１次配列を走査し、存在する疎水性脂肪族と芳香族側鎖をすべて識別する。(２)疎水性脂肪族側鎖には芳香族側鎖用のそれより大きな値、好ましくは芳香族側鎖に割り当てる値の約２倍を割り当てる(例えば、疎水性脂肪族側鎖に対しては値２を、芳香族側鎖に対しては値１を割り当てる)。(３)ペプチド内の予め定義した一定の長さの各重複するアミノ酸残基セグメント(ウィンドウ)について存在が決定された値を合計し、特定のセグメント(ウィンドウ)に対する値の合計を、セグメント(ウィンドウ)の中間位置で単一のアミノ酸残基、好ましくは、サンプリングされたセグメント(ウィンドウ)の中間点付近の残基に割り当てる。この手続きを、サンプリングされた各重複するアミノ酸残基セグメント(ウィンドウ)について繰り返す。したがって、ペプチドの各アミノ酸残基は、特定のセグメント(ウィンドウ)内に存在するＴ細胞エピトープの可能性に関係のある値を割り当てられる。(４)上記ステップ３に記載するように計算し割り当てた値は、評価するアミノ酸残基配列全体のアミノ酸座標に対してプロットすることができる。(５)予め定義した値(例えば値１)のスコアを有する配列のすべての部分は、Ｔ細胞エピトープを含むと認められ、必要であれば、修飾することができる。
【０１７７】
本発明のこの特定の実施態様は、Ｔ細胞エピトープを含むであろうペプチド領域を記述できる一般的な方法を提供する。これらの領域内のペプチドに対する修飾は、ＭＨＣクラスＩＩ結合特性を修飾する可能性を有する。
【０１７８】
本発明の別の実施態様によれば、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子モデルによりペプチドの相互作用を考慮に入れたより精巧な計算方法を使用して、Ｔ細胞エピトープをより高精度で予想できる。
【０１７９】
特にこの実施態様によるペプチド内に存在するＴ細胞エピトープの計算上の予想では、すべての公知のＭＨＣクラスＩＩ分子の構造に基づく少なくとも４２個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のモデルの構築が考えられ、Ｔ細胞エピトープの計算による識別におけるこれらのモデルの使用、相対的なペプチド骨格アルファ炭素(Ｃα)位置の知られた変わりやすさを考慮に入れるための各モデルのペプチド骨格のライブラリーの構築、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との間の相互作用において重要な位置での２０個のアミノ酸置換各々のための各モデルを備えた各骨格ドック(dock)のアミノ酸側鎖コンホメーションのライブラリーの構築、および特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容(dock)された特定のペプチドについての最適な骨格および側鎖コンホメーション選択のための、これら骨格および側鎖コンホメーションライブラリーの使用、並びにこの相互作用からの結合スコアの誘導が考えられる。
【０１８０】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のモデルは相同モデリングによって、ブルックヘブン(Brookhaven)タンパク質データバンク(「ＰＤＢ」)で見出された多数の同様の構造から誘導できる。これらは、エネルギー最小化のためのＣＨＡＲＭｍ力場(Molecular Simulations Inc.、San Diego、Ca.から入手可能)と共に、シミュレートされたアニーリング機能を組み込んだ半自動的な相同モデリングソフトウェア(Modeller, Sali A.＆ Blundell TL.、1993.J.Mol.Biol 234：779-815)によって形成できる。別のモデリング方法も同様に利用できる。
【０１８１】
本願の方法は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の小さな集合について結合溝内の各位置での各アミノ酸選択肢の実験により得た結合データのライブラリーを使用する他の計算方法(Marshall,k.W.、 et al.、 Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids、 1(3)：157-162)(1995)や溝内の特定タイプの結合ポケットの結合特性を定義するために実験による同様の結合データを使用し(ここでもまたＭＨＣクラスＩＩ分子の比較的小さな部分集合を使用する)次いでこのポケットライブラリーからポケットタイプを「混合およびマッチング」して人為的に別の「仮想的な」ＭＨＣクラスＩＩ分子を生成するさらに別の計算方法(Sturniolo T.、 et al.、 Nat.Biotech、 17(6)：555-561(1999)と著しく異なる。先行技術は両方とも分析が複雑である点および多数のペプチド変異体を合成する必要がある点の不利益を被り、少数のＭＨＣクラスＩＩ分子しか実験的に走査できない。したがって、第１の先行技術の方法は少数のＭＨＣクラスＩＩ分子の予想しかできない。第２の先行技術の方法は、異なるクラスＩＩ対立遺伝子間においては、１個の分子中で類似したアミノ酸で裏打ちされているポケットは同じ結合特性を持つという仮定も前提としており、ポケットライブラリーに含まれるポケットを含むそうしたＭＨＣクラスＩＩ分子だけが「仮想的に」生成されるという欠点をさらに有する。本明細書に述べるモデリング手法を使用すれば、任意の数およびタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子の構造を推定でき、したがって全集団を代表する対立遺伝子を特異的に選択できる。さらに、走査されるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は、複雑な実験によって追加データを生成する必要以上にさらにモデルを生成することにより増加させることができる。
【０１８２】
骨格ライブラリーの使用により、走査されている様々なペプチドについて、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容された時のＣα原子位置における変化を考慮に入れることができる。この点もまた、上記の先行技術における計算方法(これらは特定のポケット中でアミノ酸結合を走査するため単純化されたペプチド骨格の使用に依存している)と対照的である。これらの単純化された骨格は、「実際の」ペプチドで見つかる骨格構成の代表ではないであろうし、その結果、ペプチド結合の予想が不正確になる。本発明の骨格ライブラリーは、タンパク質データバンク内で見出されるＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するすべてのペプチドの骨格を重ね、結合溝内に位置する１１個のアミノ酸各々のＣα原子間の２乗平均平方根(ＲＭＳ)偏差を記録することにより生成される。このライブラリーは、より大きな変動の可能性までも考慮に入れるために、少数(現在１３個)の適切な利用可能なマウスおよびヒト構造から誘導できる一方、各Ｃ''-αについてのＲＭＳ数値は、５０％増加する。その後、各アミノ酸の平均のＣα位置が決定され、その半径がその位置でのＲＭＳ偏差プラス５０％と等しい球がこの点のまわりに描かれる。この球体は許容されるＣα位置をすべて表す。
【０１８３】
最小のＲＭＳ偏差を有するＣα(これは、上記のポケット１中のアミノ酸であり、結合溝中の１１個の残基の位置２と等価である)を動かして、球体は３次元的にグリッド化され、次いでグリッド内の各頂点はそのアミノ酸のＣαのために可能な位置として使用される。結果として得られるアミド平面は、引き続きアミノ酸へのペプチド結合に対応し、これらのＣαの各々にグラフトされ、次のＣαを位置付けるためにφおよびψ角を所定の間隔で回転させる。引き続きＣαがＣαに対して「許容される位置の球」内にある場合にはジペプチドの向きが許容され、それが球の外部になる場合には、ジペプチドは拒絶される。その後、先行するＣαのあらゆる組合せから９個の後続Ｃαがすべて位置付けられるまで、ペプチドがポケット１ Ｃα「種子」から成長するように後続Ｃα位置の各々についてこのプロセスを繰り返す。次いで、ポケット１の前の単一Ｃαについてこのプロセスをもう一度繰り返して結合溝内に位置する骨格Ｃα位置のライブラリーを生成する。
【０１８４】
生成された骨格の数はいくつかの要因に依存する：「許容される位置の球」の大きさ；ポケット１位置の「１次球」のグリッドの精密さ；後続Ｃαを位置付けるために用いるφおよびψの段階的回転角の精密さ。このプロセスを使用すると、大きな骨格ライブラリーを生成できる。骨格ライブラリーが大きい程、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝内の特定のペプチドに対して最もよく適合するものが見つかる可能性は大きくなる。各対立遺伝子について、結合領域のアミノ酸との衝突により、必ずしもすべての骨格がＭＨＣクラスＩＩ分子のすべてのモデルに収容されるのには適さないため、その対立遺伝子によって収容され得る骨格を含むライブラリーの部分集合が生成される。骨格ライブラリーの使用は、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルと共に、各許容される骨格に収容される各ＭＨＣクラスＩＩ分子について結合溝の各位置の各アミノ酸の許容される側鎖コンホメーションからなる徹底的なデータベースを作成する。このデータセットは、単純な立体的重なり関数を用いて生成され、ここで、ＭＨＣクラスＩＩ分子は骨格と結合し、アミノ酸側鎖は所望の位置で骨格上にグラフトされる。各々の側鎖の回転可能な結合を設定した間隔で段階的に回転させ、得られる原子位置は注目する結合に依存する。原子と結合溝の側鎖の原子との相互作用が注目され、位置は次の基準によって許容されるか拒絶される：ここまでに位置付けられたすべての原子の重なりの合計は、予め決めた値を超過してはならない。したがって、コンホメーション探索の厳格性は、結合の段階的回転で用いる間隔と全重なりについて予め決めた限界の関数である。特定のポケットが剛性であると知られている場合、この後者の値は小さくなり得るが、ポケット側鎖の位置に比較的柔軟性があると知られている場合は、比較的緩和である。したがって、許容は結合溝ポケット内の柔軟性における変化を模倣するようになすことができる。次いで、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各々に収容された時、このコンホメーション探索を各骨格のすべての位置にあるすべてのアミノ酸について繰り返し、側鎖コンホメーションの徹底的なデータベースを作成する。
【０１８５】
適切な数式を用いて、上記骨格／側鎖コンホメーションの大きなデータベースの走査により経験的に導き出さなければならないペプチドリガンドコンホメーションと組み合うＭＨＣクラスＩＩ分子モデル間の結合エネルギーを評価する。したがって、９〜２０アミノ酸の範囲で長さが変化する(もっとも、長さは各走査に対しては一定にしておく)可能なペプチドに、以下の計算を施すことにより、タンパク質を潜在的なＴ細胞エピトープについて走査する：ＭＨＣクラスＩＩ分子をその分子に許容されるペプチド骨格とともに選択し、所望のペプチド配列に対応する側鎖をグラフトする。骨格上の特定の位置での原子の識別および特定の側鎖に関する原子間距離データを、そのアミノ酸の許容される各コンホメーションについて集める(上記データベースから得られる)。これを骨格に沿って各側鎖に対して繰り返し、スコアリング関数を用いてペプチドスコアを導く。その骨格のための最良のスコアを保持し、選択されたモデルについて各許容される骨格に対してこのプロセスを繰り返す。すべての許容される骨格から得られたスコアを比較し、最高のスコアをそのＭＨＣクラスＩＩモデル中の所望のペプチドについてのペプチドスコアであると見なす。次いで、このプロセスを、走査されているタンパク質に由来するあらゆる可能なペプチドを備えた各モデルについて繰り返し、ペプチド対モデルのスコアを表示する。
【０１８６】
本発明の状況では、結合親和性計算のために提示される各リガンドは、上に議論されるようなペプチドまたはタンパク質から選択されるアミノ酸断片である。したがって、リガンドは、公知の配列のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から得られ、長さがおよそ９〜２０個のアミノ酸である選択されたアミノ酸伸張物である。「アミノ酸」および「残基」という用語は以下においては同義語と見なされる。リガンドは、骨格ライブラリーから得た骨格上にグラフトされて検査されるペプチドの連続アミノ酸の形をしており、ペプチド骨格のＣ"-α原子の座標を介して、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルライブラリーから得られるＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝中に位置し、各側鎖に対して許容されるコンホメーションは許容されるコンホメーションデータベースから選択される。関連する原子同一性および原子間距離もこのデータベースから検索し、ペプチド結合スコアを計算するために使用する。ＭＨＣクラスＩＩ結合ポケットへの高い結合親和性を備えたリガンドには、部位指図突然変異生成に対する候補としてフラグが立てられる。フラグが立てられたリガンド(したがって対象タンパク質)でアミノ酸置換を行い、これはその後、結合親和性を予め定義した閾値以下に低減する変更を決定するためにスコアリング関数を使用して再試験する。次いで、これらの変更を対象タンパク質に組み入れ、Ｔ細胞エピトープを除去する。
【０１８７】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチドリガンドと結合溝の間は、非共有結合性の相互作用(水素結合、静電気的相互作用、疎水性(親油性)相互作用およびファンデアワールス相互作用を含むが、これらに限定されない)を含む。これらは、以下に詳細に述べるペプチドスコアリング関数に含まれている。水素結合は極性または帯電基間で形成され得るもので、２つの他の原子によって共有された水素原子からなる非共有結合であることが理解されるべきである。水素受容体が部分的に負帯電を有する一方で、水素供与体の水素は正電荷を有する。ペプチド／タンパク質相互作用のために、水素結合供与体は、水素と結合した窒素または酸素もしくは窒素に結合した水素のいずれでもよい。水素結合受容体原子は水素と結合していない酸素、水素が全く結合しておらず１個か２個の結合がある窒素、または１つの結合のみある硫黄でもよい。水素を結合した酸素またはイミン窒素(例えばＣ＝ＮＨ−)などのある種の原子は、水素受容体とも供与体ともなり得る。水素結合エネルギーは3〜7kcal/molの範囲であり、ファンデアワールス結合よりはるかに強いが共有結合よりは弱い。水素結合はまた指向性が強く、供与体原子、水素原子および受容体原子が同一直線上にある場合に最も強い。静電的結合は反対荷電のイオン対間で形成され、相互作用の強さはクーロンの法則による原子間の距離の二乗に反比例する。イオン対間の最適距離は約２．８Åである。タンパク質／ペプチド相互作用では、静電的結合がアルギニン、ヒスチジンまたはリジンとアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩との間で形成され得る。それらは水素結合と強さがほぼ似ているが、結合の強さはイオン化基のｐＫａおよび媒体の誘電率に依存するであろう。
【０１８８】
親油性(脂肪親和性)相互作用は、タンパク質とペプチドリガンド間に生じる良好な疎水性−疎水性接触である。通常、これらは結合溝のポケット内に埋没したペプチドの疎水性アミノ酸側鎖間にそれらが溶媒に露出しないように生じる。疎水性残基の溶媒への露出は、周囲の溶分子が互いに水素結合を強いられ、かご状のクラスレート構造を形成するので非常に不利である。結果として生じるエントロピーの減少は非常に不利である。脂肪親和性の強い原子は、極性でもなく水素受容体でもない硫黄や非極性の炭素原子などである。
【０１８９】
ファンデアワールス結合は３〜４Å離れた原子間で見られる非特異的な結合である。これは水素結合や静電的結合より弱く特異性も低い。原子のまわりの電荷分布は時間とともに変化し、どの瞬間でも、電荷分布は対称ではない。電荷分布におけるこの一時的な非対称性は、近隣の原子にも同様の非対称性を引き起こす。この結果生じる原子間引力は、ファンデアワールス接触距離で最大に達するが、約２Å〜約１Åに至ると非常に急速に低減する。逆に、原子間の隔たりが接触距離未満になるとともに、原子の外殻電子雲が重なるため、強い斥力が支配的になる。引力は静電的結合や水素結合に比べて比較的弱いが(約0.6Kcal/mol)、斥力は特に、ペプチドリガンドがタンパク質に成功裡に結合するかどうか決する上で非常に重要であろう。
【０１９０】
１つの実施形態では、ベーム(Ｂｏｅｈｍ)スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ１手法）が結合定数を評価するために使用される(Boehm, H.J.、 J.Comput Aided Mol.Des.、 8(3):243-256(1994)、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる)。別の実施形態では、スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ２手法）が、Ｔ細胞エピトープを含むリガンドの指標として結合親和力を評価するために使用される(Boehm, H.J.、 J.Comput Aided Mol.Des.、 12(4):309-323(1998)、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる)。しかし、上記の文献に記述されているベームスコアリング関数は、タンパク質へのリガンドの結合親和力を評価するために使用されるが、この場合、リガンドがタンパク質に成功裡に結合することが既に知られており、タンパク質／リガンド複合体はその構造が解明されタンパク質データバンク(「ＰＤＢ」)の中に存在するものである。したがって、スコアリング関数は、陽性であることが知られた結合データを利用して開発されている。陽性および陰性バインダー間の区別を考慮に入れるために、方程式に反発項を加えなければならない。さらに、結合エネルギーのより満足な評価は、上記のベーム関数の領域ベースのエネルギー項を用いるのではなく対同士の方法で脂肪親和性の強い相互作用を計算することで達成される。したがって、好ましい実施形態では、結合エネルギーは修正されたベームスコアリング関数を使用して評価される。修正されたベームスコアリング関数では、タンパク質とリガンド間の結合エネルギー(ΔＧbind)は、以下のパラメーターを考慮して評価される：リガンド(ΔＧo)の並進エントロピーと回転エントロピーの全面的な喪失による結合エネルギーの低減；少なくとも１個のパートナーが中性である、理想的な水素結合からの寄与(ΔＧhb)；摂動のないイオン間相互作用(ΔＧionic)からの寄与；脂肪親和性リガンド原子と脂肪親和性受容体原子の間の脂肪親和性相互作用（ΔＧlipo）；リガンド中の内部自由度の凍結による結合エネルギーの喪失、つまり、各Ｃ−Ｃ結合の周りの回転自由度が低減する(ΔＧrot)；タンパク質とリガンド間の相互作用エネルギー(ＥvdW)。これらの項を考慮すると方程式１が与えられる：
（ΔＧbind）＝（ΔＧo）＋（ΔＧhbｘＮhb）＋（ΔＧionicｘＮionic）＋（ΔＧlipoｘＮlipo）＋（ΔＧrot＋Ｎrot）＋（ＥvdW）
式中、Ｎは特定の項の相互作用を特徴付ける数であり、１つの実施形態では、ΔＧo、ΔＧhb、ΔＧionic、ΔＧlipoおよびΔＧrotは、それぞれ５．４、−４．７、−４．７、−０．１７および１．４の値を与えられる定数である。
【０１９１】
Ｎhbは方程式２：
Ｎhb＝Σh-bondsｆ（ΔＲ，Δα）×ｆ（Ｎneighb）×ｆpcs
によって計算される。
【０１９２】
ｆ（ΔＲ，Δα）は、理想状態からの水素結合の大きな偏差を説明し、方程式３によって計算されるペナルティ関数である：
ｆ（ΔＲ，Δ−α）＝ｆ１（ΔＲ）×ｆ２（Δα）
ここで、ｆ１（ΔＲ）＝１（ΔＲ＜＝ＴＯＬの場合）、
または ＝１−（ΔＲ−ＴＯＬ）／０．４（ΔＲ＜＝０．４＋ＴＯＬの場合）、
または ＝０（ΔＲ＞０．４＋ＴＯＬの場合）。
さらに、ｆ２（Δα）＝１（Δα＜３０°の場合）
または ＝１−（Δα−３０）／５０（Δα＜＝８０°の場合）
または ＝０（Δα＞８０°の場合）。
【０１９３】
ＴＯＬは水素結合長さ（＝０．２５Å）で許容される偏差、
ΔＲはＨ−Ｏ／Ｎ水素結合長さの理想的な値（＝１．９Å）からの偏差、
Δαは水素結合角度∠N/O-H,O/Nの理想的な値（＝１８０°）からの偏差、
ｆ（Ｎneighb）は、タンパク質表面の凹面と凸面の部分を識別し、したがってタンパク質表面で見られるものではなくポケットで見られる極性相互作用に大きな重みを割り当てる。この関数は下記方程式４：
ｆ（Ｎneighb）＝（Ｎneighb／Ｎneighb,0）α（ここで、α＝０．５）
によって計算される。
【０１９４】
Ｎneighbは任意の所与のタンパク質原子に５Åより接近している非水素タンパク質原子の数であり、
Ｎneighb,0＝定数２５である。
【０１９５】
ｆpcsは１つの水素結合当たり極性接触表面積を考慮に入れた関数であり、したがって強い水素結合と弱い水素結合を区別し、その値は次の基準によって決定される：
ｆpcs＝β（Ａpolar／ＮHB＜１０Å2の場合）、
またはｆpcs＝１（Ａpolar／ＮHB＞１０Å2の場合）
Ａpolarはタンパク質リガンド接触表面の大きさであり、
ＮHBは水素結合の数であり、
βは定数＝１．２である。
【０１９６】
修正されたベームスコアリング関数の実行のためには、イオン相互作用からの寄与、ΔＧionicを上記水素結合からの寄与と同様の方法で計算する（同じ幾何学依存性が仮定されるため）。
【０１９７】
Ｎlipo項は方程式５によって計算される：
Ｎlipo＝ΣILｆ（ｒIL）
ｆ（ｒIL）はすべての脂肪親和性リガンド原子について、１また、すべての脂肪親和性タンパク質原子についてＬであり、以下の基準により計算される：
ｆ（ｒIL）＝１（ｒIL＜＝Ｒ１ｆ（ｒIL）＝（ｒIL−Ｒ１）／（Ｒ２−Ｒ１）でＲ２＜ｒIL＞Ｒ１の場合、
ｆ（ｒIL）＝０（ｒIL＞＝Ｒ２の場合）。
【０１９８】
ここで、Ｒ１はｒ１vdw＋ｒLvdw＋０．５および
Ｒ２＝Ｒ１＋３．０であり、
ｒ１vdwは、原子１のファンデアワールスの半径であり、
ｒLvdwは、原子Ｌのファンデアワールスの半径である。
【０１９９】
Ｎrotはアミノ酸側鎖の回転可能な結合の数であり、非環式のｓｐ3−ｓｐ3結合およびｓｐ3−ｓｐ2結合の数である。末端ＣＨ3またはＮＨ3の回転は考慮に入れない。
【０２００】
最後の項Ｅvdwは方程式６によって計算される：
Ｅvdw＝ε1ε2（（ｒ1vdw＋ｒ2vdw）12／ｒ12−（ｒ1vdw＋ｒ2vdw）6／ｒ6）。
【０２０１】
ここでε1とε2は原子同一性に依存する定数であり、
ｒ1vdw＋ｒ2vdwはファンデアワールスの原子半径であり、
ｒは１対の原子間の距離である。
【０２０２】
方程式６に関して、１つの実施形態では、定数ε1とε2はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：０．２４５、Ｎ：０．２８３、Ｏ：０．３１６、Ｓ：０．３１６(つまり、炭素、窒素、酸素および硫黄のそれぞれの原子について)。方程式５および６については、ファンデアワールスの半径はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：１．８５、Ｎ：１．７５、Ｏ：１．６０、Ｓ：２．００Å。
【０２０３】
タンパク質リガンド相互作用についての現時点での理解の制約内ではあるが、上記の方程式に現われるすべての所定の値および定数がすべて決定されることは理解されるべきである(特に本願で試みられている計算のタイプについて)。したがって、このスコアリング関数がさらに精緻化された場合には、これらの値および定数を変更することが可能で、したがって、リガンドへのタンパク質の結合エネルギーを評価する項において所望の結果を与える適当な数値を使用してもよく、したがって、本発明の範囲内である。
【０２０４】
上記のように、スコアリング関数は、側鎖コンホメーション、原子同一性および原子間の距離のデータベースから抽出されたデータに適用される。本発明を説明する目的のために言えば、このデータベースに含まれるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は４２個のモデルと４つの解決された構造である。本発明の計算方法の構築はモジュール化された性質を有するため、新しいモデルを加えペプチド骨格ライブラリーと側鎖コンホメーション関数を用いて走査するだけで、上記のペプチドスコアリング関数によって処理できる追加のデータセットを作成できることは上記の説明から明らかである。これにより、走査されたＭＨＣクラスＩＩ分子のレパートリーを容易に増加させることが可能になり、あるいは、データが入手できる場合には構造および関連データを置き換えて、既存の対立遺伝子のより正確なモデルを作成することができる。
【０２０５】
本発明の予想方法は、様々なＭＨＣクラスＩＩ分子に対する有する親和性が実験的に測定された多数のペプチドを含むデータセットにより較正できる。計算値を実験値と比較することによって、すべての実験的に測定したＴ細胞エピトープが正確に予想されることがわかれば有益性の一端を決定できる。
【０２０６】
利用可能ないくつかの精巧な方法論と比較して、上記のスコアリング関数は比較的単純であるが、計算が非常に急速に実行される、ということが理解されるべきである。また、目的が、選択されたＭＨＣクラスＩＩタンパク質の結合溝に収容される各ペプチドについて真の結合エネルギーそれ自身計算するものではないことも理解されるべきである。根本的な目的は、選択されたタンパク質の１次構造(すなわち、アミノ酸配列)に基づいてＴ細胞エピトープの位置を予想する助けとして相対的な結合エネルギーデータを得ることである。比較的高い結合エネルギー、すなわち選択された閾値以上の結合エネルギーは、リガンド中のＴ細胞エピトープの存在を示唆するだろう。次いで、リガンドに少なくとも１回のアミノ酸置換を施し、結合エネルギーを再計算すればよい。計算が迅速性を有するため、ペプチド配列のこれらの操作はコストに見合う利用可能なコンピューターハードウェアにおいてプログラムのユーザインターフェース内で対話形式に実行できる。したがって、コンピューターハードウェアへの大きな投資は要求されない。
【０２０７】
同じ目的のために他の利用可能なソフトウェアを使用できるかもしれないことは当業者には明白であろう。特に、タンパク質結合サイト内にリガンドをドッキングさせ得るより精巧なソフトウェアを、エネルギー最小化と共に使用してもよい。ドッキングソフトウェアの例は次の通りである：ＤＯＣＫ(Kuntz et al.、 J.Mol.Biol.、 161：269-288(1982))、ＬＵＤＩ(Boehm, H.J.、 J.Comput Aided Mol.Des.、 8：623-632(1994))およびＦＬＥＸＸ(Rarey M.、 et al.、 ISMB、3:300-308(1995))。分子モデリングおよび操作ソフトウェアの例としては：ＡＭＢＥＲ(Tripos)およびＣＨＡＲｍ(Molecular Simulations Inc.)。これらの計算方法の使用は、必要な計算を行うために要求される処理時間の長さにより本発明方法の処理能力を厳しく制限するだろう。しかし、本発明の方法によって「陽性なバインダー」であると判明したペプチドについて結合エネルギーのより正確な計算結果を得るために「第２のスクリーン」として、このような方法を使用し得るというのもあり得ることである。洗練された分子の機械的または分子の動的な計算のための処理時間の制限は、これらの計算を行うソフトウェアの設計およびコンピューターハードウェアの現在の技術制限の両者によって決まる。将来的には、より効率的なコードが書かれ、さらにコンピュータープロセッサー速度の持続的な増加によって、より扱いやすい時間枠内でそのような計算を行うことが実現可能になるかもしれない。巨大分子に適用されるエネルギー関数および折り畳まれたタンパク質構造内で起こる様々な相互作用についての考慮に関するさらに詳しい情報は以下に見られる：Brooks, B.R., et al.、 J.Comput.Chem.、 4:187-217(1983)。一般的なタンパク質−リガンド相互作用に関するさらに詳細な情報は以下に見られる：Dauber-Osguthorpe et al.、 Proteins4(1):31-47(1988)。その内容の全体は言及によって本願に組み入れられる。有用な背景的事項は、例えば以下に見られる：Ｆａｓｍａｎ，Ｇ．Ｄ．、ｅｄ．、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＳＢＮ：０−３０６ ４３１３−９。
【０２０８】
（対応するもの）
本発明は他の具体的なかたちでその精神または基本的な特徴から離れることなく具体化することができる。さらなる具体例として、ここに記載されている発明に限定するというよりは実例として全ての面において、従って考えうる。本発明の範囲内で、従って、先述の明細書によってというよりはさらなる特許請求の範囲によって意図される。さらに、本特許請求の範囲の同等の意味および範囲内に起こる全ての変化は、その中に包括されることを意図している。
【０２０９】
（参考文献による組み込み）
ここで上記に意図する、全ての特許、特許明細書および化学文献は、すべてこの明細書の中に組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００１年３月３０日に出願された米国仮出願特許出願シリアル番号６０／２８０，６２５号（その全開示内容は言及によって本願に組込まれる）に基づく優先権およびその利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は概括的に言えば、治療剤として免疫原性が低減されているか免疫原性のない修飾された融合タンパク質を製造および使用するための方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、Ｔ−細胞エピトープ候補を識別し、そうしたエピトープを除去するようにアミノ酸配列を修正することにより免疫原性を低減した融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
多くの治療用タンパク質は正常なヒトタンパク質である。例えば、インターロイキン−２、エリスロポエチンおよび成長ホルモンは、すべて、通常これらのタンパク質を既に内成的なレベルで産生しているヒトに与えるヒトタンパク質である。一般に、これらのタンパク質を治療用に用いる場合、完全に正常なヒトタンパク質に対する免疫反応は稀にしか起こらない。
【０００４】
最近では、人工的な活性を有する多くの融合タンパク質が治療用タンパク質として有用であることが明らかになってきている。例えば、Ｅｎｂｒｅｌは、ＴＮＦレセプターの細胞外ドメインとＩｇＧ１ Ｆｃ領域との融合体である。Ｅｎｂｒｅｌは慢性関節リウマチを治療するために使用され、ＴＮＦと反応してＴＮＦの作用を妨げることにより機能すると考えられる。しかし、Ｅｎｂｒｅｌで治療された患者に抗Ｅｎｂｒｅｌ抗体が顕著に発生することがわかった。
【０００５】
治療上有用な融合タンパク質の別の種類の例は、イムノサイトカイン(immunocytokines;免疫サイトカイン)である。これらのタンパク質は抗体部分とサイトカイン部分を含み、癌細胞などの疾病状態の細胞をサイトカインの標的とするのに有用である。しかし、これらの融合タンパク質の多くの治療目的での使用は、哺乳動物、特にヒトにおいてその免疫原性により制限される。
【０００６】
したがって、これらのタンパク質を治療に使用するためには免疫原性の低減された融合タンパク質を生成する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、治療目的で使用される免疫原性の低減された融合タンパク質を産生するのに有用な方法および組成物を特色とする。例えば、本発明はイムノサイトカイン、イムノフュージン(immunofusins;免疫融合体)、イムノリガンド(immunoligands;免疫リガンド)、他の抗体およびＦｃ融合タンパク質、サイトカイン−サイトカイン融合タンパク質および免疫原性の低減されたアルブミン融合タンパク質を特色とする。
【０００８】
本発明は、部分的には、融合タンパク質が「非自己」である配列を含んでいる点への着目に関する。例えば、２個のヒトのタンパク質どうしの融合体であっても、融合接合部周辺の領域は、通常、人体に存在しないペプチド配列を含む。例えば、Ｅｎｂｒｅｌなどのタンパク質薬剤は、２個の正常なヒトのタンパク質：ＴＮＦレセプターとＩｇＧ１に由来する。しかし、ＴＮＦレセプターとＩｇＧ１との間の接合部分は人体内には通常見出されないペプチド配列である。
【０００９】
本発明の好ましい方法は、ＭＨＣ分子に結合する能力(その結合親和性)を減少させることによって、接合部エピトープ(接合部ペプチド)がＴ細胞レセプターと相互作用する能力を低減させ、これにより融合タンパク質の免疫原性を低減することを含む。本発明によれば、接合部のエピトープまたはペプチドは好ましくは「非自己」である。一般に、治療用タンパク質を含めタンパク質が免疫原となるのは、部分的には、タンパク質が抗原提示細胞によってエンドサイトーシスされてタンパク質分解を受け、生じたペプチドが主要組織適合複合体(ＭＨＣ)と呼ばれる分子に結合し、これがペプチドをＴ細胞に提示するためである。抗原提示細胞(ＡＰＣ)表面の抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞を活性化して増殖、分化させ、サイトカインを放出させる。平行してＢ細胞の分化および抗体産生が誘導され、これらによる除去によりさらに治療用タンパク質の有効性が制限される。したがって抗原ペプチドは治療用タンパク質に由来する場合一連の望ましくない免疫反応を誘導し得る。治療用タンパク質の有効性は抗体による反応により制限され、多くの場合Ｔ細胞およびＢ細胞応答の誘導は患者における炎症性のアレルギー反応のために有害である。
【００１０】
本発明は、(１)免疫グロブリン−標的タンパク質接合領域における１個または複数のＴ−細胞エピトープ候補を有する新規なアミノ酸配列の識別；および(２)接合部配列に由来しＴ−細胞エピトープとして機能するペプチドの存在を消失させるか低減させるこれらのアミノ酸配列の修飾を提供する。
【００１１】
本発明は、免疫原性の低減に関係する組成物および方法として２種類の一般的なクラスを提供する。本発明の１つの実施形態によれば、潜在的な非自己Ｔ−細胞エピトープは、融合接合部にわたる配列中に識別される。例えば、潜在的な非自己Ｔ−細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドのモデル化に基づく計算上の方法によって識別される。次いで、接合領域に由来するペプチドのＭＨＣクラスＩＩへの結合能力が低減または除去されるように置換を行う。ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを識別し修飾するこの過程は、「脱−免疫化」と呼ばれ、生じた修飾されたタンパク質分子は「脱−免疫化された」と表現される。
【００１２】
本発明の別の実施形態によれば、融合接合部に１個または複数のグリコシル化部位を導入する。Ｏ−結合グリコシル化部位も使用できるが、Ｎ−結合グリコシル化部位が好適に使用される。好ましい実施形態によれば、野生型の融合接合部を囲む接合領域中のアミノ酸は、Ｎ−末端融合パートナーの最後のアミノ酸をアスパラギンに変異させ、第２の融合パートナーの最初の２個のアミノ酸を、グリシン、これに続いてセリンまたはトレオニンとなるように変異させる。
【００１３】
本発明によれば、バクテリア中で、または酵母や昆虫細胞など、哺乳類のグリコシル化パターンを生成しない有機体中でタンパク質が産生される状況では、ＭＨＣクラスＩＩ結合の除去が好ましい。
【００１４】
タンパク質が、哺乳類の細胞系で、または哺乳動物に無害のグリコシル化パターンを創製する細胞系で産生される場合は、グリコシル化部位の導入が好ましい。
【００１５】
好ましい実施形態では、融合タンパク質の構成成分はサイトカインである。「サイトカイン」という用語は、ここでは、そのサイトカインに対するレセプターを有する細胞の特異的反応を誘導する、天然に存在するまたは遺伝子組換えによるタンパク質、それらのアナログおよびそれらの断片について使用する。好ましくは、サイトカインは細胞によって産生され分泌され得るタンパク質である。好ましくは、サイトカインは、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６およびＩＬ−１８などのインターロイキン、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、Ｇ−ＣＳＦおよびエリスロポエチンなどの造血因子、ＴＮＦαなどの腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、リンホトキシンなどのリンホカイン、レプチンなどの代謝プロセスの制御因子、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγなどのインターフェロン並びにケモカインを含む。好ましくは本発明の抗体-サイトカイン融合タンパク質はサイトカイン特異的生物活性を示す。
【００１６】
別の好ましい実施形態では融合タンパク質の構成成分は抗肥満サイトカインである。例えば構成成分はレプチン、ＣＮＴＦまたはＡｃｒｐ３０の一部である。
【００１７】
さらに別の好ましい実施形態では融合タンパク質の構成成分はホルモンである。例えば、構成成分は、インシュリン、成長ホルモンまたはグルカゴン様ペプチド１(ＧＬＰ−１)でよい。
【００１８】
さらに別の実施形態では融合タンパク質の構成成分は生物活性を有するリガンド結合タンパク質である。好ましい実施形態ではＴＮＦレセプターの細胞外領域が用いられる。
【００１９】
一連の実施形態によれば本発明の融合タンパク質は抗体部分のＣ−末端に非抗体部分のＮ−末端が融合されたものを含む。別の一連の実施形態によれば本発明の融合タンパク質は抗体部分のＮ−末端に非抗体部分のＣ−末端が融合されたものを含む。本発明によれば抗体部分は未処置の免疫グロブリンでもよいし未処置の免疫グロブリンの一部でもよい。免疫グロブリンの一部としては可変領域もしくは定常領域またはその両方を含むことができる。好ましい免疫グロブリンは、Ｆｃ領域またはその一部を含む。本発明の好ましい実施形態としては免疫原性が低減されおよび／またはより長い血中半減期を有するように修飾されたＩｇＧ１免疫グロブリンアイソタイプまたはその一部を含む。例えばＣＨ３−サイトカイン接合部近傍のアミノ酸残基が修飾されたＩｇＧ１が好ましい。場合によってはＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプ由来の抗体部分が好ましい。
【００２０】
イムノサイトカインは腫瘍を標的とする融合タンパク質治療の一例にすぎない。腫瘍特異的抗体への融合によって他の腫瘍有毒分子も腫瘍を標的とすることができる。さらに抗体融合タンパク質はウイルスに感染した細胞など他のタイプの疾病細胞を攻撃することができる。標的化融合タンパク質を造り出す別のアプローチは、Ｆｃ−ＸおよびＸ−Ｆｃ(ここでＸはポリペプチドである)技術の使用である。これらの技術は、対象とするポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ部分に連結する場合、標的タンパク質の産生と収集が改善されるという知見を利用する。Ｆｃ−Ｘ融合タンパク質については、シグナルペプチド(その後に免疫グロブリン遺伝子のＦｃ断片が続く)が標的タンパク質のＮ−末端融合パートナーである。いくつかの例ではＸ−Ｆｃの向きで融合タンパク質を造り出すことが特に有利である。こうした構成体で、標的タンパク質はＮ末端融合タンパク質であり、Ｆｃ断片がこれに続く。リンパ細胞細胞表面糖タンパク質(ＬＨＲ)(米国特許第５，４２８，１３０号)およびグルカゴン様ペプチド(ＧＬＰ−１)が示されているように、いくつかのタンパク質については、このアプローチは有用である。
【００２１】
従って、本発明の方法および組成物は免疫原性が低減されたＦｃＸおよびＸ−Ｆｃ融合タンパク質の形態を提供する。本発明によれば、融合タンパク質の免疫原性は当技術分野で知られた方法またはここに開示する方法によってアッセイすることができる。
【００２２】
本発明の方法および組成物は、さらに免疫原性の低減されたアルブミン融合タンパク質を提供する。ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)は、その半減期が著しく長く、生体内に広く分配され、酵素機能や免疫学機能を有しないことから、治療用ペプチド／タンパク質のためにキャリアーとして使用されてきた(Ｙｅｈら、ＰＮＡＳ ８９：１９０４−１９０８,１９９２)。生体活性ペプチドのＨＳＡへの遺伝的融合は、分泌された治療用ＨＳＡ誘導体の回復に有用である。しかし、本発明によれば、ＨＳＡ−ＣＤ４などのアルブミン融合タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上で提示され得る１個または複数のＴ−細胞エピトープを一般に含む、新規な接合部を有する。本発明は、アルブミン融合タンパク質の免疫原性の低減された形態、およびアルブミン融合タンパク質の免疫原性を低減する一般的な方法を提供する。本発明によれば、有用なアルブミンタンパク質は、アルブミンの種、対立形質および変異された変異体、並びにそれらの断片を含む。好ましいアルブミンタンパク質は、ＨＳＡなどの野生型アルブミンタンパク質の構造と機能的な特性を保持する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、有用な変異を含む正常なまたは変異またはハイブリッド化されたアイソタイプを備えた脱−免疫化抗体融合タンパク質を提供する。これらの変異は、接合部近傍でもよいしまたは接合領域とは別の位置でもよい。
【００２４】
例えば、本発明は、ＩｇＧと非ＩｇＧ部分との間の接合部に点変異を含む、接合部で修飾された脱−免疫イムノサイトカインを提供する。サイトカイン部分はいかなるサイトカインも含むが、好ましくはＩＬ−２またはＩＬ−１２である。１つの実施形態では、アミノ酸変更は、抗体部分のＣ−末端リジンをアラニンまたはロイシンなどの疎水性アミノ酸に変更することを含む。こうした変異を本発明の脱−免疫化修飾と組み合わせることの重要な利点は、変異が、血中半減期の増加と免疫原性の低減にともに作用するということである。ここに記載する、融合接合部の脱免疫を血中半減期を変える変異と組み合わせる方法は、これらの融合タンパク質の臨床での効能を著しく改善するのに有用である。
【００２５】
別の態様では、本発明は、異なるＩｇアイソタイプ(好ましくは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２アイソタイプの両方)に由来するドメインを含むハイブリッド抗体部分と融合接合部での脱−免疫化修飾とを含むイムノサイトカインを提供する。例えば、本発明は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ２ｈ(ヒンジ領域をＩｇＧ１に修飾したＩｇＧ２)ハイブリッドを使用した、脱−免疫化、接合部修飾イムノサイトカインを提供する。好ましい実施形態では、ハイブリッド融合タンパク質は、ＩｇＧ(γ１：ＣＨ１−Ｈ)(γ２：ＣＨ２−ＣＨ３)からなる脱−免疫化免疫グロブリン部分とサイトカイン部分からなる。
【００２６】
別の態様では、本発明は、免疫原性の低減された融合タンパク質をコードするか、免疫原性の低減された融合タンパク質の発現、産生および分泌を促進する新規な核酸配列を提供する。このような核酸は標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成される。
【００２７】
好ましい実施形態において、核酸分子はイムノサイトカイン融合タンパク質をコードする。好ましいイムノサイトカインは、サイトカイン(例えばインターロイキン２)、およびヒト上皮細胞接着分子ＫＳＡ(ＥＰ−ＣＡＭ)(ｈｕＫＳ)に対する抗体などの腫瘍特異的モノクローナル抗体を含む。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、核酸分子は様々な配置においてＦｃ融合タンパク質をコードする。核酸分子は、５'から３'の方向に連続的にコードする、(ｉ)シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域そして標的タンパク質配列、または(ｉｉ)シグナル配列、標的タンパク質そして免疫グロブリンＦｃ領域、または(ｉｉｉ)シグナル配列、第１の標的タンパク質、免疫グロブリンＦｃ領域そして第２の標的タンパク質。生じる核酸分子は、これにより、Ｆｃ−Ｘ、Ｘ−ＦｃまたはＸ−Ｆｃ−Ｙ構造(ここで、ＸとＹは標的タンパク質である)をコードする。別の実施形態では、核酸はシグナル配列を有しないＦｃ−Ｘ、Ｘ−ＦｃまたはＸ−Ｆｃ−Ｙタンパク質をコードする。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、本発明の核酸は変異体またはハイブリッドのアイソタイプとのＩｇ融合タンパク質をコードする。特に、核酸は、ハイブリッドのアイソタイプあるいは変更されたヒンジ領域を備えた抗体部分を提供する。例えば、融合タンパク質は、ヒンジ領域に含まれるジスルフィド結合が少なくなるように修飾されたＩｇＧ２またはヒンジ領域が別の抗体(好ましくは正常もしくは変異体ＩｇＧ１ヒンジ領域)に由来するＩｇＧ２ ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる。
【００３０】
好ましくは、本発明の核酸は、作用可能な結合状態で複製可能な発現ベクター中に組み込み、次いでこの発現ベクターは融合タンパク質を産生するのに能力を有する哺乳類宿主細胞に導入する。生じる融合タンパク質は効率的に産生され、哺乳類の宿主細胞から分泌される。続いて分泌された融合タンパク質を哺乳類の宿主細胞を溶解せずに培養培地から回収する。タンパク質製品は必要に応じて慣用の試薬を使用して、活性アッセイおよび／または精製し、かつ／または、融合パートナーから開裂させる。これらはすべて慣用の技術を使用できる。
【００３１】
したがって、本発明はさらに免疫原性の低減された融合タンパク質を産生する方法を提供する。
【００３２】
さらに、本発明の方法および組成物は、免疫原性の低減された融合タンパク質を使用して、治療処置を提供するのに有用である。本発明の全体的な目的は、有効かつ廉価である方法とともに免疫原性の低減されたタンパク質を提供する。本発明の好ましい治療用組成物は治療上有効な量の脱−免疫化融合タンパク質を含む。好ましくは、脱−免疫化された融合タンパク質は、薬学的に許容できる担体とともに投与される。
【００３３】
これまでに述べてきた、また他の本発明の態様、特徴および利点は、以下に続く詳細な記述、図面および特許請求の範囲からより明白になるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（発明の詳細な説明）
治療用途での使用のために患者に投与される、抗体を含むタンパク質はすべて、レシピエントホストにおいて免疫反応を引き起こす可能性を有する。この免疫反応は、Ｔリンパ球(Ｔ細胞)によって仲介されるが、これは、次いで、Ｂリンパ細胞(Ｂ細胞)を起動して抗体を産生させる。治療剤に対する抗体産生は、治療剤のより多くの迅速な除去に結びつき、アレルギー反応を引き起こすおそれがあるため不利益である。
【００３５】
本発明は、融合タンパク質の免疫原性を低減する方法を提供する。本発明の１つの方法によれば、潜在的なＴ−細胞エピトープは、融合タンパク質の融合接合部の接合領域中で識別される。Ｔ−細胞エピトープは、コンピュータモデリングによる構造に基づく予測やペプチド合成、特異的ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合試験、または免疫原性アッセイを含む、種々の計算的および非計算的(コンピュータを用いたおよび非コンピュータ的な)方法により識別される。
【００３６】
本発明によると、融合接合部は、融合タンパク質において、第１のタンパク質またはペプチドの最後(Ｃ−末端)のアミノ酸と、第２のタンパク質またはペプチドの最初(Ｎ−末端)のアミノ酸との間の位置として定義される。したがって、融合接合部は、１つのタンパク質の最後のアミノ酸と第２のタンパク質の最初の任意のアミノ酸を含む。１つの実施形態では融合接合部はリンカーを含む。
【００３７】
本発明によれば、接合領域は２つのタンパク質間の融合接合部を囲むかその範囲にわたる融合タンパク質の領域である。接合領域は、好ましくは１と約１００個の間のアミノ酸、より好ましくは１と約５０個の間のアミノ酸、または１と約２５個の間のアミノ酸、さらに好ましくは１と約１５個の間のアミノ酸、または１と９個の間のアミノ酸を含む。１つの実施形態では、接合領域は２つのタンパク質間の接合ポイントに挿入されたスペーサーまたはリンカーペプチドを含む。本発明によれば、スペーサーまたはリンカーペプチドを含む接合領域も、スペーサーまたはリンカーを含む融合タンパク質に対する患者の反応を最小限にするために脱−免疫化することができる。
【００３８】
本発明によれば、接合部のＴ−細胞エピトープは、少なくとも２つの異なる融合パートナータンパク質の各々に由来する少なくとも１つのアミノ酸を含む、ＭＨＣクラスＩＩを結合可能なペプチド配列として定義される。例えば、Ｐａｕｌ(Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版[２０００]、ｐ.２７６、８章、表８)は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができる１０個のアミノ酸のセグメントを例として挙げている。接合部のＴ−細胞エピトープにおいて、これらの１０個のアミノ酸ペプチドは異なる融合パートナーに由来する。本発明によれば、融合接合部にわたる潜在的なすなわち候補となるＴ−細胞エピトープ(候補となる接合部Ｔ−細胞エピトープ)は、好ましくは接合部の一方の側から１〜８個のアミノ酸、より好ましくは接合部の一方の側から１〜１０個または１〜１１個のアミノ酸を含む。候補エピトープは好ましくは９個、１１個または１２個のアミノ酸長である。したがって、本発明の接合部Ｔ−細胞エピトープは、接合の各側に由来する少なくとも１個のアミノ酸を含むため、好ましい候補Ｔ−細胞エピトープは、結合の一方の側に由来する１〜８個(または１〜１０個もしくは１１個)のアミノ酸を含んでおり、さらに９〜１２個のアミノ酸(最も好ましくは９個のアミノ酸)を有するエピトープとなるように、これを補足する数のアミノ酸を接合の他方の側から含む接合部エピトープである。
【００３９】
本発明によれば、次いで、接合部のＴ−細胞エピトープ内のアンカー残基を変異させて、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を防ぐ。一般に、追加的な潜在的なＴ−細胞エピトープを導入しないように、かつ各融合パートナーの機能を保存するように注意する。
【００４０】
本発明によれば、野生型の配列の融合は、融合接合部のＮ−末端またはＣ−末端における配列が天然に存在する配列に直接由来する融合である。
【００４１】
本発明によれば、脱−免疫化された融合接合部は、野生型配列の接合に対して１個または複数の置換変異が導入された接合部配列である。最も好ましい実施形態では、融合接合部の脱免疫化は、「免疫原性でない」Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーなどのリンカーの導入を含まず、融合パートナーの空間的関係は脱−免疫化された融合タンパク質において変更されない。本発明によれば、１個または複数のアミノ酸は、接合領域中、融合接合部に対するＮ−末端、融合接合部に対するＣ−末端、融合接合部に対するＮ−末端とＣ−末端の両方のいずれでも置換または変更することができる。
【００４２】
本発明によれば、潜在的なＴ−細胞エピトープは、単離されたペプチドと見なしたとき、ＭＨＣクラスＩＩ分子または非ヒト種における等価物に結合すると予測される配列である。潜在的なＴ−細胞エピトープは、抗原提示細胞にタンパク質が取り込まれる効率、完全なタンパク質中の複数部位で分裂してＭＨＣクラスＩＩに結合可能なペプチドを生成する効率など、抗原処理の他の面を考察することなく定義される。したがって、動物にタンパク質を投与した後、ＭＨＣクラスＩＩ上に現実に提示されるＴ−細胞エピトープの集合は、潜在的なＴ−細胞エピトープの部分集合である。
【００４３】
本発明によれば、Ｔ−細胞エピトープはＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用するタンパク質上のエピトープである。特定の理論に拘束されるものではないが、Ｔ−細胞エピトープはタンパク質または融合タンパク質中のアミノ酸配列であって、Ｔ細胞の成育発展の間に否定的なＴ細胞選別過程を経ることなく、したがってＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示され、Ｔ細胞レセプターによって認識されると予想される配列であると理解される。本発明の好ましい実施形態では、非自己Ｔ−細胞エピトープは、融合タンパク質を形成する２つのタンパク質の融合接合部において接合領域中に存在する。
【００４４】
本発明は、精巧なコンピュータシミュレーションまたはタンパク質三次元構造を必要とせずに、融合タンパク質結合中のＴ−細胞エピトープの数を低減するか除去する非コンピュータ的方法を提供する。１つの実施形態では、本発明の方法は、９個のアミノ酸のコアセグメントが抗原提示の間、Ｔ細胞レセプターともＭＨＣクラスＩＩ分子ともその両方に相互作用するという事実を利用する。Ｎ−末端の多くのアミノ酸は「アンカー」位置残基と呼ばれ、ＭＨＣクラスＩＩ分子内の深いポケットに結合する。ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する上で重要なアンカー位置には、典型的には以下のアミノ酸のうちの１つが存在する：ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。本発明によれば、コアの９個のアミノ酸に隣接するさらに２〜３個のアミノ酸もＭＨＣ分子との相互作用に影響する。さらに、融合タンパク質の第１のタンパク質中のＣ−末端の多くのアミノ酸が一般に置換できる。これは特に、Ｎ−末端融合パートナーまたは第１のタンパク質が、Ｃ−末端融合パートナーまたは第２のタンパク質のＣ−末端に融合されたときに活性であるとわかっている場合、有用である。
【００４５】
本発明の一般的な方法は、融合タンパク質中のＮ−末端融合パートナーの最もＣ−末端側(C-terminal most)の８アミノ酸に存在するいかなるロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンを変異させることを含む。１つの実施形態では、候補となる接合部のＴ−細胞エピトープアミノ酸中のこれらの１個または複数のアミノ酸を、優先的にトレオニン、アラニンまたはプロリンに変異させる。これは、交換されたアミノ酸の疎水性の性質を幾分か保持する。本発明の別の実施形態では、１個または複数の前述のアミノ酸が、候補となるすなわち潜在的な接合部Ｔ−細胞エピトープから除去するか、または適当なアミノ酸類似体に置換する。本発明によれば、潜在的なＴ−細胞エピトープを破壊するためアミノ酸を除去する場合、除去部近くのアミノ酸を含む新たなＴ−細胞エピトープを生成しないように注意する。
【００４６】
本発明によれば、最後の８個のアミノ酸に１個または複数の疎水性残基の変異を含むＮ末端融合パートナーをコードする配列を含む一般化された発現プラスミド構築中間体を構築することが、多くの場合有用である。一般に、このようなプラスミドは、Ｎ末端融合パートナーのＣ−末端をコードするＤＮＡ部またはその近傍に、１個または複数の便利な制限酵素サイトを有する。
【００４７】
中間プラスミド構築の目的は、融合タンパク質(ここで、１個または複数のＮ−末端融合パートナーは、８個のＣ−末端アミノ酸において、ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの１個または複数を別のアミノ酸とする置換を有する)をコードする発現プラスミドを構築することである。このような最終発現プラスミドの構築は、当業者にはよく知られた他の方法、例えば、ＰＣＲ断片または合成核酸の生成後、断片を適当なベクターにライゲートするか、よく知られたＰＣＲ技術によって他の配列に結合させて行ってもよい。
【００４８】
特に好ましい実施形態は、Ｆｃ−Ｘ融合プラスミド、アルブミン−Ｘ融合プラスミド、ｓｃＦｖ−Ｘ融合プラスミドおよびＦａｂ−Ｘ融合プラスミドを含む。Ｆｃ(ガンマ)−Ｘの場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子のＦｃ領域のＣ−末端の近くにロイシン−セリン−ロイシン−セリンセグメントのアミノ酸置換をもたらすようにコード配列中に変異を導入することが有用である(ここではＩｇＧ１について図解する)。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に由来するヒトＦｃ領域のアミノ酸配列を配列番号：１、２、３および４にそれぞれ示す。
【００４９】
一例として、ＫＳＬＳＬＳＰＧＫ(配列番号：５)をＫＳＡＴＡＴＰＧＫ(配列番号：６)に変更する。この変異は、潜在的な接合部Ｔ−細胞エピトープを除去し、また、上流のフェニルアラニンまたはチロシンが位置１アンカー残基として機能するＴ−細胞エピトープを除去するべく設計されている。
【００５０】
あるいは、候補となる接合部Ｔ−細胞エピトープを除去する変異を血中半減期を延長する変異と組み合わせることが時として有用である。例えば、ＫＳＬＳＬＳＰＧＫ(配列番号：５)をＫＳＡＴＡＴＰＧＡ(配列番号：７)に変更することによる。
【００５１】
他の実施形態は、ＬＳＬＳセグメント中でのグリシンまたはプロリンなど他のアミノ酸への置換を含む。
【００５２】
ＩｇＡ融合タンパク質を作製するために使用する発現ベクターの場合には、Ｃ−末端アミノ酸のうちのいくつかを除去し、その結果、ＩｇＡのオリゴマー化に関係するＣ末端近くのシステインが除去されるようにすることが有用である。例えば、第２のタンパク質に融合される前に、ＩｇＡ重鎖配列がプロリン−トレオニン−ヒスチジンで終わるように１５個のアミノ酸を除去することができる。さらに、ＩｇＡ Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインのＣ−末端近くに以下の変更を導入することが有用である：
ＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨ(配列番号：８)をＱＫＴＡＤＲＴＡＧＫＰＴＨ(配列番号：９)に変更。
【００５３】
ＩｇＡ−Ｘ融合タンパク質中のさらなる脱−免疫化配列は以下のものである。
【００５４】
【化１】
【００５５】
アルブミン−Ｘ融合の場合には、アルブミン−Ｘ発現プラスミドに次の変化を導入してアルブミンのＣ−末端タンパク質を以下のように修飾することが有用である：
ＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ(配列番号：１３)をＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＴＴＡ(配列番号：１４)に変更。
【００５６】
したがって、本発明は免疫原の低減された融合タンパク質の構築において有用な核酸配列およびタンパク質を提供する。特に、本発明は、最後の８個のアミノ酸中の任意のロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの変異を有するタンパク質を提供する。タンパク質は好ましくは人体中に見出される配列に概ね相当する配列を有するヒトタンパク質である。本発明はこのようなタンパク質をコードする核酸配列も提供する。本発明のこの態様について核酸配列はプラスミド、ＰＣＲ−生成断片、または化学合成によって生成された核酸として存在してもよい。
【００５７】
本発明はまた、１個または複数のＮ−末端融合パートナーが、８個のＣ−末端のアミノ酸中、ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンを別のアミノ酸とする１個または複数の変異を有する融合タンパク質をコードする発現プラスミドを提供する。
【００５８】
例えば、Ｆｃ領域が上記のように変異されているＦｃ−ＩＬ２または全抗体−ＩＬ２融合タンパク質をコードするプラスミドが、本発明によって提供される。さらに、ＷＯ０１／３６４８９に記載されているエリスロポエチンの形態などのエリスロポエチンの正常な形態または変異された形態に上記のように変異されたＦｃ領域を含む融合体が、本発明によって提供される。
【００５９】
本発明は、さらにＮ−結合またはＯ−結合グリコシル化部位を、融合接合部近傍、好ましくは融合接合部に導入することにより、融合タンパク質結合の免疫原性を低減する方法を提供する。例えば、アスパラギン、セリンまたはトレオニンといったアミノ酸、および第３の残基を以下のように導入する。ＸがＮ−末端融合パートナーのアミノ酸を表わす配列であり、ＺがＣ−末端融合パートナーのアミノ酸を表わす配列を考えられたい：
【００６０】
【化２】
【００６１】
この方法によれば、結合ペプチドの接合はグリコシル化部位の導入によって必ずしも阻まれない。しかし、ＭＨＣクラスＩＩ溝内に結合し、Ｎ−末端最端アンカー残基に対してグリコシル化したアスパラギンＣ−末端を有する任意のペプチドは、Ｔ−細胞エピトープとして機能しない。大きなグリコシル化部分の存在は、立体的にＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体の認識を妨害するであろう。好ましいグリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ(ここでＸは好ましくはＧｌｙであるが、任意のアミノ酸であり得る)を含む。
【００６２】
さらに、グリシンおよびセリン残基を導入する変異の導入は新しいＴ−細胞エピトープを生成しない。グリシンもセリンもアンカー残基の役割を果たすことができない。抗原処理において、融合タンパク質は原則としてはグリコシル化したアスパラギンとグリシンの間、またはグリシンとセリンの間で開裂される。いずれの場合も、生じるペプチドはアンカー残基に対し変異体グリシンおよび／またはセリン残基Ｎ−末端を有し、したがって変異体グリシンおよび／またはセリン残基は、Ｔ細胞レセプターによって認識されない。アンカー残基に対する残基Ｎ−末端はＴＣＲによって認識される領域の外部にあるためである。
【００６３】
この方法の変形では、融合接合領域は、グリシン、セリン、アラニンなどのアミノ酸残基が先行するセリンまたはトレオニンを既に含む。接合領域が柔軟で各融合パートナーの疎水性コアから変位する場合、好ましくは第２の方法が使用され、その結果、新規なＮ−結合グリコシル化はいずれの融合パートナーの機能やフォールディングとも干渉しない。
【００６４】
タンパク質工学の技術における当業者にとって、グリコシル化部位の導入がどのような場合に実現可能かを決めるのは単純明快な問題である。例えば、各融合パートナーの三次元構造、または融合パートナーに近似した同族体が知られていることもあろう。タンパク質のＮ−末端またはＣ−末端に少数のアミノ酸がＸ線構造解析で解決されなかったり、ＮＭＲ構造が多くの可能なコンホメーションを示すことはしばしばある。グリコシル化部位のいずれかの側で３個またはそれ以上のアミノ酸が乱される場合、生じる融合タンパク質が正確に折り畳まれ、両方のパートナーが活性になる確信がある。所与の融合タンパク質が機能的であるかどうか決定するのには、ある種の定型的実験が必要である。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態では、融合タンパク質のＮ−末端およびＣ−末端パートナーの両方が、ヒトのタンパク質である。このような融合タンパク質中での潜在的なＴ−細胞エピトープは、Ｃ−末端パートナー(第２のタンパク質)の最初の８個のアミノ酸と結合した、Ｎ−末端パートナー(第１のタンパク質)の最終の８個のアミノ酸から創製される。これは、第１と第２のタンパク質から創製された一連の８個の９−ｍｅｒハイブリッドを提供する。第１のタンパク質の最後の８個のアミノ酸に脂肪族または芳香族性のいずれかの残基(ロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシン)が含まれる場合、第１の位置(アンカー位置)にＭＨＣ分子のポケットを結合するアミノ酸を伴うＭＨＣ結合ペプチドを生成する危険が高い。したがって、前述のアミノ酸のうちのいずれかの置換は前述のアミノ酸のうちの１つでないアミノ酸、好ましくはアラニン、プロリンまたはトレオニンで行い、候補Ｔ−細胞エピトープを除去することになろう。
【００６６】
例えば、以下の配列：
【００６７】
【化３】
【００６８】
を含むＦｃ融合タンパク質の場合には、ロイシン残基は２つの潜在的なエピトープを生成する。したがって、配列はＬをＡに、およびＳをＴに変更し
【００６９】
【化４】
【００７０】
として脱−免疫化することができる。これらの変更は、ＭＨＣ結合ポケット中の第１のアミノ酸としてロイシンを、ＭＨＣ結合ポケット中の第１のアミノ酸としてチロシンをそれぞれ有するエピトープを除去する。
【００７１】
これらの置換は、人体においてすべてのＦｃ融合タンパク質を脱−免疫化するため、リンカー配列を伴う場合も伴わない場合も、好ましくは１)融合タンパク質における両方のタンパク質が、ヒトのタンパク質である場合；２)両方のタンパク質の天然配列でのＭＨＣ結合ペプチドは無視される場合；および３)本来の配列と同一の９−ｍｅｒも無視される場合に機能する。
【００７２】
本発明の方法は、一般にすべての脊椎動物において、好ましくは哺乳動物において、また、最も好ましくはヒトにおいて適用可能である。以下の実施例よって本発明をさらに説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７３】
実施例１：ｈｕＫＳ−ＩＬ２イムノサイトカインの免疫原反応性エピトープの除去
ＨｕＫＳ−ＩＬ２は、ヒト化されたＶHおよびＶL領域をヒトのＨおよびＬ鎖定常領域と組み合わせてなる。Ｈ鎖は、前に述べたようにそのカルボキシル末端をヒトＩＬ−２の成熟配列に融合した。このＨ鎖はγ１アイソタイプであり、Ｆｃレセプターに高い親和性がある。この高い親和性のためＨｕＫＳ−ＩＬ２は血液循環からすばやく取り除かれた。特定の理論に拘束されるものではないが、ＨｕＫＳ−ＩＬ２の除去は肝臓(クッパー(Kupffer)細胞)および脾臓(抗原提示細胞)中のＦｃＲ担持細胞を介して生じると推測される。
【００７４】
ある患者がｈｕＫＳ−ＩＬ２分子のある部分に対し免疫反応を示すことが以前に確証されている。しかしこれらの抗体によって認識されたエピトープは知られていない。反応的なエピトープを低減するために、ｈｕＫＳ−ＩＬ２を有する患者の血清の相対的な活性を他の関連するタンパク質と比較した：
(１)Ｈｕ１４．１８−ＩＬ２、完全に異なるヒト化されたＶ領域を備えているが正確に同じＣ領域およびＩＬ−２との融合接合部を有する分子；
(２)ＶＨ１、ヒト残基に張り合わせされた(veneered)、表面露出マウスＢ細胞エピトープを備えたマウスＶ領域に由来する、ＶHおよびＶLの領域中にＴ−細胞エピトープを含まないｈｕＫＳ−ＩＬ２の脱−免疫形；
(３)ＶＨ２、ヒト残基に張り合わせされた(veneered)、表面露出マウスＢ細胞エピトープを備えたマウスＶ領域に由来する、ＣＤＲ３中に１個の残存Ｔ−細胞エピトープを含むｈｕＫＳ−ＩＬ２の脱−免疫形で、このＶHは１個のＴ−細胞エピトープを含む；
(４)ＫＯＬまたはＥＵ Ｃγ１領域(ＫＳではなく)のいずれかで構築された４２５−ＩＬ２(アロタイプの活性と比較するため)；
(５)ｈｕＫＳ−ｍＩＬ２−、マウスＣ領域およびマウスＩＬ−２に融合したｈｕＫＳ Ｖ領域を備えた分子；
(６)ヒトＦｃ−ＩＬ２；
(７)ヒトＦｃのみ；
(８)ヒトＩＬ−２のみ。
【００７５】
免疫グロブリン融合タンパク質および断片をタンパク質Ａセファロースクロマトグラフィーによって精製し、重炭酸ソーダバッファー中９６−ウエルプレートに塗り、次いで、１％ＢＳＡを含有する１％ヤギ血清でブロックした。患者血清の稀釈液をインキュベートし、次いで、結合しない物質をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄して除去した。患者血清から得た結合したヒト抗体を、結合タンパク質に依存する様々なＨＲＰ複合抗体(ＨＲＰ-conjugated antibodies)で検知した。一般に、ヤギ抗ヒトγ鎖ＨＲＰを使用した。プレートに結合されたタンパク質のほとんどがヒトＦｃおよびヒトκ鎖からなっていたためである。
【００７６】
ある患者血清は、同じ患者からの注入前血清においては検知されなかったｈｕＫＳ−ＩＬ２に明瞭な反応を示した。免疫前(preimmune)抗血清はベースライン(基線)となる非免疫対照を確立するために使用した。患者血清で見られた反応は、(１)抗ＩＬ２反応、(２)抗Ｆｃ(アロタイピック)反応、(３)新規な接合配列に対する反応または(４)ＫＳイディオタイプとの抗イディオタイプ、またはこれらの反応の組合せによるものとすることができる。
【００７７】
患者血清は、組換えＩＬ−２やＦｃ領域(上記１および２)とは顕著には反応しなかった。何人かの患者はＫＳ Ｖ領域に抗イディオタイプ反応を示した。患者血清はすべて、Ｆｃ−ＩＬ２とは反応を示した。４人の患者のうちの３人はＦｃ−ＩＬ２と反応を示した。Ｆｃ−ＩＬ２に対するが、ＦｃまたはＩＬ２のいずれかに対するものではない反応の存在は、ＦｃとＩＬ２の間の結合が患者の抗血清によって認識されたことを示唆している。
【００７８】
実施例２：ＭＨＣクラスＩＩの除去によって免疫原性を低減するための抗体−サイトカイン融合タンパク質の接合部におけるアミノ酸残基の修飾
ペプチドスレッディング分析により、強いＭＨＣ可能性を有する２個の重複するペプチドセグメントが、イムノサイトカインのＦｃとＩＬ２部分の間の接合部に識別された。潜在的なＴ−細胞エピトープのペプチドスレッディングおよび識別は、Ｃａｒｒ(ＷＯ００／３４３１７)に開示されるように実行した。アミノ酸の変更は、既存の潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合エピトープを除去するが、新たな潜在的なＭＨＣクラスＩＩエピトープを導入しないように行われた。
【００７９】
接合部配列ＬＳＬＳＰＧＫ−ＡＰ(配列番号：１７)のＡＴＡＴＰＧＡ−ＡＰ(配列番号：１８)への修飾(「ＬＳＬＳからＡＴＡＴへ」)(ここで、ハイフンはイムノサイトカインｈｕＫＳ−ＩＬ２接合部である)は、接合部由来ペプチド配列を、免疫原性にもたらすのに十分に高い親和性をもって任意のヒトのＭＨＣクラスＩＩに結合できないようにする。
【００８０】
実施例３：免疫原性を低減するためのサイトカイン融合タンパク質の接合部におけるアミノ酸残基の修飾
接合部配列ＬＳＬＳＰＧＫ−ＡＰ(配列番号：１７)のＬＮＬＳＰＧＡ−ＡＰ(配列番号：１９)への修飾(「ＬＳＬＳからＬＮＬＳへ」)(ここで、ハイフンはイムノサイトカインｈｕＫＳ−ＩＬ２接合部である)によっても、接合部由来ペプチド配列はある種のヒトのＭＨＣクラスＩＩには結合可能である。しかし、ＫＳ−ＩＬ２タンパク質が哺乳類細胞中で発現され分泌される場合、タンパク質は、ＮＸＳ／Ｔ配列であるため接合部近傍でＮ−グリコシル化される。
【００８１】
生じる接合部由来ペプチドは、接合部由来ペプチドがＭＨＣクラスＩＩによってＴ細胞に提示されたとき、大きなグリコシル化部分がＴ細胞レセプターとＭＨＣクラスＩＩの間の特異的ドッキングを妨げるため、Ｔ−細胞エピトープのように有効ではない。
【００８２】
実施例４：脱−免疫化されたｈｕＫＳ−ＩＬ２イムノサイトカインとの比較におけるイムノサイトカインｈｕＫｓ−ＩＬ２への抗原提示細胞の免疫反応性の同定
反応性エピトープの修飾による免疫原性の低減を、ＬＳＬＳをＡＴＡＴに変化させることにより以下のように直接試験する。この配列を模倣する合成ペプチドは、樹状細胞(ＤＣ)などの古典的抗原提示細胞の免疫反応を変更する。以下の合成ペプチド：
【００８３】
【化５】
【００８４】
(ここで、ハイフンがＫＳ−ＩＬ２結合である)は、自己Ｔ細胞へのＤＣ−仲介抗原提示を刺激するために使用される。続いて行うペプチド抗原による挑戦に対する反応においてこれらのＴ細胞が示す増殖能力は、そうしたペプチドの免疫原性の基準として有用である。
【００８５】
特に、標準の密度勾配技術によりリューコパック(leukopack)から末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を分離する。単核細胞を血清を含まないＡｉｍ Ｖ培養培地中に再懸濁させ、付着させる。３７℃で２時間後、付着していない細胞を除去する。付着細胞は、未成熟樹状細胞(ＤＣ)を誘導するためにヒトＧＭ−ＣＳＦ(５０ｎｇ／ｍｌ)およびＩＬ−４(２０ｎｇ／ｍｌ)を含む培地中で７日間培養する。７日後に細胞を収穫し、適当なＦＩＴＣラベルが付けられたＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ４０に対するＡｂｓを用いてフローサイトメトリーを行って発現型を同定し、未熟なＤＣを確認した。
【００８６】
付着していない細胞は、ＩＬ２およびＩＬ７とともに培養し、後の機能的な研究で用いる自己由来のエフェクター細胞(Ｔ細胞)を得る。機能的な研究では、Ｔ細胞を未熟な樹状細胞に加え(比率１０：１)、ｈｕＫＳ、脱−免疫化ｈｕＫＳ、ペプチド接合部１３ｍｅｒ(ＫＳＬＳＬＳＰＧＫ−ＡＰＴＳ)(配列番号：２０)および修飾され、脱−免疫化された１３ｍｅｒペプチド(ＫＳＡＴＡＴＰＧＫ−ＡＰＴＳ)(配列番号：２１)とともに共培養する。イムノサイトカインまたは免疫原性ペプチドおよび修飾され、脱−免疫化されたペプチドの各々に暴露した後、トリチウムを含むチミジンを組み入れることにより測定した増殖指数を比較して、各分子の免疫原性の程度を示す。すなわち、放射性の組込みの増加は、各ペプチドがＤＣ上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合してＴ細胞に提示される能力にほぼ比例する。
【００８７】
実施例５：アルブミン融合タンパク質中に見出される免疫原性反応性エピトープの除去および免疫原性を低減するための融合接合部におけるアミノ酸残基の修飾
ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)は、その著しい半減期の長さのため、生体内で広く分配されるとともに酵素的または免疫学的機能が欠如していることから、治療用のペプチド／タンパク質用の担体として用いられてきた。遺伝子的に操作されたＨＳＡ−ＣＤ４ハイブリッドは、生体外で可溶性ＣＤ４に似た抗ウイルス性を示すとともにＣＤ４＋細胞中へのヒト免疫不全ウイルスの侵入を阻むことが示されている(Ｙｅｈら、ＰＮＡＳ ８９：１９０４−１９０Ｓ、１９９２年)。したがって、ＨＳＡに生体に影響するペプチドを遺伝的に融合することは、分泌される治療用ＨＳＡ誘導体を設計および回復に有用である。しかし、すべての融合タンパク質と同様に、ＨＳＡ−ＣＤ４は新規な接合部を有し、これは免疫原になり得るとともに、ＭＨＣクラスＩＩ分子上で提示され得るＴ−細胞エピトープを含む。実施例１、２、３および４の方法を使用したＨＳＡとＣＤ４との間の接合部の分析はペプチドを、ＭＨＣと結合する可能性を識別する。潜在的に免疫原性の配列は、潜在的なＴおよびＢ細胞エピトープを減少または除去させて免疫原性を低減するために修飾される。同様に、免疫原性を低減するために新規なグリコシル化部位を接合領域に導入することができる。
【００８８】
【化６】
【００８９】
本発明では、ＨＳＡ−ＩＦＮａｌｐｈａ融合タンパク質接合領域が３つの候補Ｔ−細胞エピトープ：
【００９０】
【化７】
【００９１】
を含むことが想定される。
【００９２】
配列番号１３と２３で描かれるＴ−細胞エピトープは重複し、ＬＶ(太字)をＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＷおよびＹ以外の任意のものに変更することにより脱−免疫化することができる。あるいは、ペプチドスレッディングスコアは、ＬＧをＴＴに変更することにより著しく低減することができる。配列番号：２４中のＴ−細胞エピトープは、２番目のＬ(太字)をＡに変更することにより脱−免疫化することができる。
【００９３】
さらに、ＨＳＡ−Ｘ融合(ここでＸは任意のタンパク質でよい)の場合、融合接合部の脱−免疫化は、アミノ酸配列ＡＡＬＧＬ(配列番号：２５)をＴＡＴＴＡ(配列番号：２６)に変更することにより実現できる。
【００９４】
【化８】
【００９５】
実施例６：Ｘ−Ｆｃ融合タンパク質および免疫原性を低減するための融合接合部のアミノ酸残基の修飾
いくつかの例では、Ｘ−Ｆｃの向きの融合タンパク質を創出するのが有利である。これらの構成体により、標的タンパク質はＮ−末端融合タンパク質であり、Ｆｃ断片が続く。例えば、グルカゴン様ペプチド(ＧＬＰ−１)は、その活性のために遊離Ｎ−末端が必要であり、したがって、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合体が有用である。
【００９６】
ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質は、当技術分野の文献に記載された標準的技術によって構築される。この融合タンパク質は、γ１重鎖のヒンジと接合したＧＬＰ−１のＣ−末端を有する。ＣｙｓからＳｅｒ(残基５)への変異体(これは、ＩｇＧ１の軽鎖とのジスルフィド結合を形成するＣｙｓ残基を除去する)を含むγ１ヒンジ配列(Ｌｏら(１９９８)Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５−５００)が使用される。非変異Ｆｃ配列は、
【００９７】
【化９】
【００９８】
であり、下線部がヒンジ領域で、この後にＣＨ２領域配列の開始点が続く。
【００９９】
ＧＬＰ−１（７−３７）と変異体Ｆｃ間の融合接合部は次の通りである：
【０１００】
【化１０】
【０１０１】
ＧＬＰ−１（７−３７）間と正常Ｆｃの融合接合部は次の通りである：
【０１０２】
【化１１】
【０１０３】
３個の潜在的エピトープがＧＬＰ−１−Ｆｃ融合接合部におけるペプチドスレッディングにより識別される。
【０１０４】
【化１２】
【０１０５】
実施例１〜３と同様に行ったＧＬＰ−１(太字テキスト)とＦｃ(通常テキスト)の間の融合接合部の分析により、ＭＨＣ結合性を有するペプチドが識別される。ペプチドスレッディング分析によって潜在的なサイトを識別した後、潜在的に免疫原性の配列をアミノ酸置換により修飾し、潜在的なＴ細胞およびＢ細胞結合エピトープを低減または除去して免疫原性を低減する。
【０１０６】
配列番号：３１、３２および３３で示される前記の潜在的Ｔ−細胞エピトープは単一のアミノ酸置換をなすことにより脱−免疫化される。例えば、配列番号：３１で示されるペプチドはリジン(太字で示す)をトレオニンにおよびアルギニン(太字で示す)をトレオニンに変更することにより脱−免疫化される。配列番号：３２で示されるペプチドは、イソロイシン(太字で示す)をアラニンまたはプロリンに替えることにより脱−免疫化され、配列番号：３３のペプチドは、ロイシンをアラニンまたはプロリンに替えることにより脱−免疫化される。生じる脱−免疫化接合部は次の通りである：
【０１０７】
【化１３】
【０１０８】
融合接合部にグリコシル化部位を導入する典型的な方法によれば、次の変更が導入される：
【０１０９】
【化１４】
【０１１０】
実施例７：Ｅｎｂｒｅｌ、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性反応性エピトープの除去、および免疫原性を低減するための融合接合部のアミノ酸残基の修飾
ＥＮＢＲＥＬまたはエタネルセプト(ＦＤＡによって承認されたＸ−Ｆｃ融合タンパク質)は、慢性関節リウマチを治療するために使用される腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)阻害剤である。ＥＮＢＲＥＬは、ヒトＩｇＧ１のＦｃタンパク質に結合されたＴＮＦレセプターの細胞外のリガンド結合ドメインからなる二量体の融合タンパク質である。ＴＮＦＲ−Ｆｃは、ＴＮＦのそのレセプターへの結合を競争的に阻害し、結合したＴＮＦを生物学的に不活性にし、炎症性の活性を顕著に低減させる。ＧＬＰ−１−Ｆｃについて上述したように、ＴＮＦＲ−Ｆｃは潜在的なＴ−細胞エピトープを含む新規な接合部を有する。
【０１１１】
ＴＮＦ−ＲのＣ−末端部分(太字テキスト)のｇ１ヒンジＮ−末端(通常テキストで示しヒンジ領域を、下線を付して表す)への直接融合間の接合部は以下の通りである：
【０１１２】
【化１５】
【０１１３】
実施例１〜４と同様に行ったＴＮＦ−ＲとＦｃ間の融合接合部の分析により、ＭＨＣ結合性を有するペプチドが識別される。ペプチドスレッディング分析により潜在的なサイトを識別した後、潜在的に免疫原性の配列をアミノ酸置換により修飾し、潜在的なＴ細胞およびＢ細胞結合エピトープを低減または除去して免疫原性を低減する。
【０１１４】
融合接合部にグリコシル化部位を導入する典型的な方法によって以下の変化を導入した：
【０１１５】
【化１６】
【０１１６】
実施例８：Ｆｃ−ＩＬ１２−ＩＬ２などのＦｃ−Ｘ−Ｙ融合タンパク質の免疫原性反応性エピトープの除去、および免疫原性を低減するための融合接合部のアミノ酸残基の修飾
Ｆｃ−ＩＬ１２−ＩＬ２などのＦｃ−Ｘ−Ｙの配置の融合タンパク質は、潜在的に免疫原性である多数の新規な融合接合部を有する。例えば、Ｆｃ−ＩＬ１２は、他のＦｃ−Ｘ融合タンパク質またはイムノサイトカイン(実施例１)に類似した融合接合部を有するが、サイトカインＩＬ１２の使用のために新規である。融合接合部は免疫原性の結合サイトについて分析され、従って修飾される。第２に、融合タンパク質を構成する２個の異なるサイトカインとともに、実施例５に記載されたそれに匹敵するＸ−Ｙ融合接合部がある。ペプチドスレッディング分析が融合接合部の各々について使用される。
【０１１７】
接合部の分析は、ＦｃのＣ−末端(太字テキスト)とＩＬ１２ｐ３５のＮ−末端(通常テキスト)との間に
【０１１８】
【化１７】
【０１１９】
を、およびＩＬ１２ｐ４０のＣ−末端(太字テキスト)とＩＬ２のＮ−末端(通常テキスト)との間に
【０１２０】
【化１８】
【０１２１】
を、ペプチドスレッディングによりＭＨＣ結合性を有するペプチドを識別する。潜在的に免疫原の配列は、潜在的なＴ−細胞エピトープを低減させるかまたは除去するために修飾される。
【０１２２】
例えば、上記の配列(１)では、次の変更が行われる：
【０１２３】
【化１９】
【０１２４】
これらの変更は、ＦｃとＩＬ１２のｐ３５サブユニットの接合部におけるいくつかのＴ−細胞エピトープのＭＨＣクラスＩＩ結合可能性を低減または除去する。
【０１２５】
別の例では、上記の配列(２)はＩＬ−２内の最初の２つの位置にアスパラギンおよびグリシンを導入することで、グリコシル化部位を導入するように修飾される。この戦略は成熟ＩＬ−２の位置３で天然に存在するトレオニンを使用する。さらに、ｐ４０部分中のジスルフィド結合の形成を開裂させないことが重要である。したがって、少なくとも１個または２個のアミノ酸によってグリコシル化部位をｐ４０の中のシステインから分離することが有用である。
【０１２６】
【化２０】
【０１２７】
ＩＬ１２ｐ４０−ＩＬ２融合の場合には、上に論じたようなグリコシル化部位の導入が以下の潜在的なＴ−細胞エピトープを生成する。
【０１２８】
【化２１】
【０１２９】
しかし、Ｔ−細胞エピトープのグリコシル化は、ＭＨＣクラスＩＩの結合を妨げて低減された免疫原性をもたらす。
【０１３０】
実施例９：Ｘ−Ｆｃ−Ｙ融合タンパク質の接合部における免疫原性反応性エピトープの除去、およびＭＨＣクラスＩＩ結合を低減するための融合接合部のアミノ酸残基の修飾
ＩＬ４−Ｆｃ−ＧＭＣＳＦなどのＸ−Ｆｃ−Ｙ配置の融合タンパク質は、潜在的なＴ−細胞エピトープを含む多数の新規な融合接合部を有する。ＩＬ４−Ｆｃは、他のＸ−Ｆｃ融合タンパク質(実施例６および７)と類似している接合であるが、サイトカインＩＬ４の使用のために新規である。例えば、ヒンジ領域を使用するＦｃ、ＣＨ２およびヒトγ１からのＣＨ３領域を用いる形態が使用される。前述のように、ｐｄＣｓｈｕＦｃγｌ中のγ１ヒンジ配列は、ＩｇＧ１中の軽鎖とのジスルフィド結合を形成するＣｙｓ残基を除去するＣｙｓのＳｅｒへの変異(下線)を含んでもよいし(Ｌｏら(１９９８)Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５−５００)、これにより、分析のための第３の潜在的に免疫原の融合接合部を生成してもよい。融合接合部は潜在的なＴ−細胞エピトープについて分析し、実施例１〜４の方法によって修飾した。
【０１３１】
融合タンパク質を構成する異なるサイトカインＧＭＣＳＦとともに、イムノサイトカインｈｕＫＳ−ＩＬ２について実施例１に記載したそれに匹敵するＦｃＹ融合接合部が存在する。この融合接合部も潜在的なＴ−細胞エピトープのために分析し、実施例１〜４の方法によって修飾した。
【０１３２】
特に、接合部の分析は、ＩＬ４のＣ−末端(太字テキスト)とＦｃのＮ−末端(通常テキスト)との間に
【０１３３】
【化２２】
【０１３４】
を、およびＦｃのＣ−末端(太字テキスト)とＧＭＣＳＦ Ｎ−末端(通常テキスト)との間に
【０１３５】
【化２３】
【０１３６】
を、ペプチドスレッディングにより、ＭＨＣ結合性を有するペプチドを識別する。潜在的なＴ−細胞エピトープは、免疫原性を減少するために潜在的なＴエピトープを除去または低減するために修飾される。
【０１３７】
ＩＬ４−Ｆｃ融合タンパク質の接合部での候補Ｔ−細胞エピトープは以下の通りである：
【０１３８】
【化２４】
【０１３９】
ここで、Ｅ(太字)をＴに変更することでペプチドスレッディングスコアすなわちＭＨＣクラスＩＩ結合可能性を著しく低減する。修飾されたＩＬ４−Ｆｃ融合の配列は以下の通りである：
【０１４０】
【化２５】
【０１４１】
Ｆｃ−ＧＭＣＳＦ融合接合部は、以下に示すように配列ＬＳＬＳをＡＴＡＴに変更することにより脱−免疫化される。
【０１４２】
【化２６】
【０１４３】
実施例１０：ハイブリッドアイソタイプにより調製してイムノサイトカインとイムノフュージンの融合接合部におけるＴ−細胞エピトープを除去するためのアミノ酸残基の修飾
抗体またはハイブリッドアイソタイプとの抗体に基づく融合タンパク質を構築し、その結果、異なるアイソタイプの有用な特徴を単一の分子中に組み合わせることは多くの場合有用である。ハイブリッドアイソタイプとの融合タンパク質は免疫原性を低減するために本発明によって修飾してもよい。
【０１４４】
次の構成成分を備えた抗体融合タンパク質を標準的な組換えＤＮＡ技術によって構築する：軽鎖および重鎖、腫瘍特異的抗原を認識するＶ領域、典型的な軽鎖である軽鎖、およびＩｇＧ２由来のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖、並びにＩｇＧ１由来ヒンジ領域、さらに上記の融合接合部を含む重鎖のＣ−末端に融合されたサイトカイン。
【０１４５】
このタンパク質は、ＣＨｌｇ２とヒンジ−ｇ１との間およびヒンジ−ｇ１とＣＨ２ｇ２との間に新規な接合部を含んでいる。これらの接合部における潜在的なＴ−細胞エピトープの識別および修飾は、以下のように実行される。ＩｇＧ２またはＩｇＧ２ｈアイソタイプのいずれかで調製されたイムノサイトカインおよびＦｃ−Ｘ融合タンパク質については、これらの修飾は、上記実施例１、２、３および８におけるのと同一である。Ｘ−Ｆｃ ＩｇＧ２ｈイムノフュージンについては、ＦｃのＮ−末端が、ＩｇＧ１タイプに修飾されたＩｇＧ２ｈタンパク質のヒンジ領域内にあるので、新規な結合も同一である。しかし、ＩｇＧ２免疫グロブリンに挿入されたＩｇＧ１ヒンジは、ＩｇＧ２ ＣＨ１とＩｇＧ１ヒンジとの間、およびＩｇＧ１ヒンジとＩｇＧ２ ＣＨ２との間に２つの新規な接合部を生成するという点で、２個の新規な融合接合部がある。
【０１４６】
【化２７】
【０１４７】
したがって、接合部の分析は、ＩｇＧ２ ＣＨ１のＣ−末端(太字テキスト)とＩｇＧ１ヒンジのＮ−末端(通常テキスト)間に
【０１４８】
【化２８】
【０１４９】
を、および、ＩｇＧ１ヒンジのＣ−末端(太字テキスト)とＩｇＧ２ ＣＨ２ ＦのＮ−末端(通常テキスト)の間に、
【０１５０】
【化２９】
【０１５１】
を、ペプチドスレッディングにより、ＭＨＣ結合性を有するペプチドを識別するであろう。潜在的な免疫原性配列は、免疫原性を減少するために潜在的なＴおよびＢ細胞エピトープを除去または低減するように修飾される。
【０１５２】
ＩｇＧ２ＣＨ１−ＩｇＧ１ヒンジ融合接合部での２つの潜在的なＴ−細胞エピトープは、以下の通りである：
【０１５３】
【化３０】
【０１５４】
ＩｇＧ２ＣＨｌ−ＩｇＧ１ヒンジ融合接合部は、Ｖ(太字)をＡ、ＴまたはＰに変更することにより脱−免疫化される。修飾された融合接合部の配列は配列番号：５３
【０１５５】
【化３１】
【０１５６】
に示される。
【０１５７】
前述のように、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγｌ中のγ１ヒンジ配列は、ＩｇＧ１中の軽鎖とジスルフィド結合を形成するＣｙｓ残基を除去するＣｙｓのＳｅｒへの変異(下線)を含んでもよいし(Ｌｏら(１９９８)Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５−５００)、これにより、分析および修飾のためのさらに２個の潜在的に免疫原性の以下の融合接合部を生成してもよい。
【０１５８】
【化３２】
【０１５９】
実施例１１：ＩｇＧ１とＩｇＧ４のハイブリッドアイソタイプＦｃ構成成分を使用するＦｃ−ＥＰＯ融合タンパク質の生成
Ｆｃエリスロポエチン融合タンパク質を生成するために、次の発現プラスミドを標準的分子生物学技術を使用して構築した。アミノ酸置換Ｈｉｓ３２Ｇｌｙ、Ｃｙｓ３３Ｐｒｏ、Ｔｒｐ８８ＣｙｓおよびＰｒｏ９０Ａｌａをもたらす変異を備えた配列をコードするヒトエリスロポエチンの形態を含むＸｍａＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片を、ＷＯ０１／３６４８９に示されるように、使用した。対応するタンパク質配列は配列番号：５６
【０１６０】
【化３３】
【０１６１】
に示される。
【０１６２】
ＣＨ３Ｃ−末端の領域のアミノ酸置換をもたらす２セットの変異を施したこと以外、このＸｍａＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片を、ＩｇＧ１からのヒンジ領域およびＩｇＧ２からのＣＨ２とＣＨ３領域をコードするプラスミドベクターに挿入した。ＣＨ３ Ｃ−末端とＥｐｏ Ｎ−末端の接合部の配列を以下の通りである：
【０１６３】
【化３４】
【０１６４】
変異の第１のセット(これは、ＫＳＬＳＬＳＰＧ(配列番号：５８)のＩｇＧ２ ＣＨ３領域の配列をＫＳＡＴＡＴＰＧ(配列番号：５９)に変更する)は、米国特許出願シリアル番号第６０／２８０，６２５号に開示されている。Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ(配列番号：５８の位置３から位置６)をＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ(配列番号：５９の位置３から位置６)に置き換える置換の効果は、ヒトＦｃとヒトエリスロポエチンとの間の結合が非自己ペプチド配列を含むことから発生するかもしれない潜在的なヒト非自己Ｔ−細胞エピトープを除去することである。ＣＨ３領域のＣ−末端アミノ酸においてＫからＡへの単一アミノ酸置換からなる第２のセットは、米国特許出願シリアル番号第０９／７８０，６６８号に開示されている。
【０１６５】
生じるプラスミドはＮＳ／０細胞に感染させ、当技術分野で知られた操作によってＦｃ−Ｅｐｏ融合タンパク質を発現させ精製した。タンパク質Ａへの結合に基づく精製後、ＩｇＧ２ ＣＨ３および上記エリスロポエチン置換を含むｈｕＦｃγ２ｈ−ｈｕＥｐｏタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって同定され、２つの独立した調製物中で９７％のモノマーおよび９０％のモノマーからなることが見出された。ＩｇＧ２ ＣＨ３および上記エリスロポエチン置換を含むｈｕＦｃγ２ｈ−ｈｕＥｐｏタンパク質は、細胞ベースのアッセイ(エリスロポエチンタンパク質がＴＦ−１細胞分裂を刺激するという能力を測定する)においてヒトエリスロポエチンと、モル基準で、ほぼ同様な活性を有することが見出された。アッセイはＷＯ０１／３６４８９に記述されるようにして行われた。
【０１６６】
さらに、ＩｇＧ１(ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３)、ＩｇＧ２(ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３)またはＩｇＧ１(ヒンジ)−ＩｇＧ２(ＣＨ２−ＣＨ３)のいずれかからなるＦｃ領域のＣ−末端に非変異ヒトエリスロポエチンを融合したものを同定した。非変異ヒトＦｃ配列および非変異エリスロポエチン配列を含む発現プラスミドを、上記プラスミドと同様に構築した。ＮＳ／０細胞を、Ｆｃγ１−Ｅｐｏ、Ｆｃγ２−ＥｐｏおよびＦｃγ２ｈ−Ｅｐｏ発現プラスミドに感染させ、各プラスミドのほぼ等しい数のクローンをスクリーニングした後に安定したクローンを分離した。産生性が最良のクローンは、Ｆｃγ１−Ｅｐｏを５０μｇ／ｍｌ、Ｐｃγ２−Ｅｐｏを２０μｇ／ｍｌおよびＦｃγ２ｈ−Ｅｐｏを１２０μｇ／ｍｌ産生した。
【０１６７】
以下の例は、本発明で示される融合タンパク質の配列内に免疫原性の配列領域(Ｔ−細胞エピトープ)の識別するための好ましい方法について詳細に記述する。しかし、既知の他の方法でもこの分子を得ることができる点が指摘されるべきである。
【０１６８】
実施例１２：計算上の方法によるＴ−細胞エピトープの識別
本発明によれば、融合タンパク質の接合領域のエピトープは、その免疫系との相互作用を調整するためにタンパク質中に変異体を導入する方法を使用して修飾することができる。本発明によれば、本発明によって適用することができる当業者には知られた方法は、先行技術（ＷＯ９２／１０７５５およびＷＯ９６／４０７９２(Novo Nordisk)、ＥＰ ０５１９ ５９６(Merck ＆ Co.)、ＥＰ ０６９９ ７５５(Centro de Immunologia Moelcular)、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ９８／５９２４４(Biovation Ltd.)に記載されたもの、さらに関連する方法を含む。
【０１６９】
しかし、前記エピトープの識別がここに詳細に記載する以下の新しい方法によって実現され、本発明による融合タンパク質の接合領域に適用されるのであれば、有利な変異体タンパク質を得ることができる。
【０１７０】
タンパク質、ポリペプチドまたは免疫グロブリンの全体的構造を決定するのに重要な役割を果たす要因は多数存在する。第１に、ペプチド結合、アミノ酸を鎖状に互いに連結するその結合は、共有結合である。この結合は平面構造であり実質的に置換アミドである。「アミド」は−ＣＯＮＨ−基を含む有機化合物の任意の基である。
【０１７１】
隣接アミノ酸のＣαを連結する平面状ペプチド結合は以下に示すように表すことができる：
【０１７２】
【化３５】
【０１７３】
Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子は比較的剛性な平面内にあるので、これらの軸の周りに自由な回転は生じない。このため、破線によって模式的に描いた平面は時として「アミド平面」または「ペプチド平面」と呼ばれ、この平面にはペプチド骨格の酸素(Ｏ)、炭素(Ｃ)、窒素(Ｎ)および水素(Ｈ)原子が載る。このアミド平面の相対する両隅にはＣα原子が位置する。ペプチド平面すなわちアミド平面内では、Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子の周りの回転が実質的にないので、ポリペプチド鎖はＣα原子を連結する一連の平面状ペプチド結合を含む。
【０１７４】
ポリペプチドまたはタンパク質の全体構造または立体構造を規定する上で重要な役割を果たす第２の要因は、共通なＣα連結の周りの各アミド平面の回転角である。「回転角」および「ねじり角」という用語は以下では同義語と見なされる。アミド平面にＯ、Ｃ、ＮおよびＨ原子が載ると仮定すると(立体構造によってはこれらの原子のうちいくつかは平面から若干ずれるかもしれないが、これは通常有効な仮定である)、これらの回転角はＮとＲポリペプチドの骨格の立体構造、つまり隣接残基間に存する構造を定義する。これらの２つの角度はφおよびψとして知られている。したがって、１組の角度、φiおよびψi(ここで添字ｉはポリペプチド鎖の特定の残基を表す)はポリペプチドの２次構造を有効に規定する。角度φおよびψを定義するのに使用される慣用規則、すなわち、所与のポリペプチドについてのアミド平面が角度０を形成する参照ポイント、並びに角度φの定義および角度ψの定義は、文献に定義される。例えば、Ramachandran et al. Adv.Prot.Chem.23：283-437(1968)、特に２８５−９４頁参照(これらのページは言及によって本願に組み込まれる)。
【０１７５】
本発明の方法は任意のタンパク質に適用することができ、ヒトでは、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合溝の主要なポケット１アンカー位置が、特定のアミノ酸側鎖に対してよく設計された特異性を有するという発見に部分的に基づいている。このポケットの特異性は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータ鎖の位置８６でのアミノ酸の同一性によって決定される。このサイトはポケット１の底に位置し、このポケットに収容され得る側鎖の大きさを決定する。Marshall, k.W.、 J.Immunol.、 152：4946-4956 (1994)。この残基がグリシンである場合、すべての疎水性脂肪族および芳香族アミノ酸(疎水性脂肪族は以下のものである:バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニン、また芳香族は以下のものである:フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン)は、ポケット内に収容され得る(芳香族側鎖が優先される)。このポケット残基がバリンである場合、このアミノ酸側鎖はポケット内部に突出するので、収容できるペプチド側鎖のサイズを制限する(例えば疎水性脂肪族側鎖だけが収容可能である)。したがって、アミノ酸残基配列において、疎水性脂肪族および芳香族側鎖を有するアミノ酸が存在する場合にはいつでも、ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープが存在する可能性がある。しかし、側鎖が疎水性脂肪族である場合は、芳香族側鎖の場合と比較して、(全人口において、ポケット１タイプの分布がほぼ均一であると定すれば)Ｔ細胞エピトープに関連する可能性はおよそ２倍である。
【０１７６】
本発明を具体化する計算方法は、以下のようにＴ細胞エピトープを含むペプチド領域の可能性を特徴づける：
(１)予め定義した長さのペプチドセグメントの１次配列を走査し、存在する疎水性脂肪族と芳香族側鎖をすべて識別する。(２)疎水性脂肪族側鎖には芳香族側鎖用のそれより大きな値、好ましくは芳香族側鎖に割り当てる値の約２倍を割り当てる(例えば、疎水性脂肪族側鎖に対しては値２を、芳香族側鎖に対しては値１を割り当てる)。(３)ペプチド内の予め定義した一定の長さの各重複するアミノ酸残基セグメント(ウィンドウ)について存在が決定された値を合計し、特定のセグメント(ウィンドウ)に対する値の合計を、セグメント(ウィンドウ)の中間位置で単一のアミノ酸残基、好ましくは、サンプリングされたセグメント(ウィンドウ)の中間点付近の残基に割り当てる。この手続きを、サンプリングされた各重複するアミノ酸残基セグメント(ウィンドウ)について繰り返す。したがって、ペプチドの各アミノ酸残基は、特定のセグメント(ウィンドウ)内に存在するＴ細胞エピトープの可能性に関係のある値を割り当てられる。(４)上記ステップ３に記載するように計算し割り当てた値は、評価するアミノ酸残基配列全体のアミノ酸座標に対してプロットすることができる。(５)予め定義した値(例えば値１)のスコアを有する配列のすべての部分は、Ｔ細胞エピトープを含むと認められ、必要であれば、修飾することができる。
【０１７７】
本発明のこの特定の実施態様は、Ｔ細胞エピトープを含むであろうペプチド領域を記述できる一般的な方法を提供する。これらの領域内のペプチドに対する修飾は、ＭＨＣクラスＩＩ結合特性を修飾する可能性を有する。
【０１７８】
本発明の別の実施態様によれば、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子モデルによりペプチドの相互作用を考慮に入れたより精巧な計算方法を使用して、Ｔ細胞エピトープをより高精度で予想できる。
【０１７９】
特にこの実施態様によるペプチド内に存在するＴ細胞エピトープの計算上の予想では、すべての公知のＭＨＣクラスＩＩ分子の構造に基づく少なくとも４２個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のモデルの構築が考えられ、Ｔ細胞エピトープの計算による識別におけるこれらのモデルの使用、相対的なペプチド骨格アルファ炭素(Ｃα)位置の知られた変わりやすさを考慮に入れるための各モデルのペプチド骨格のライブラリーの構築、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との間の相互作用において重要な位置での２０個のアミノ酸置換各々のための各モデルを備えた各骨格ドック(dock)のアミノ酸側鎖コンホメーションのライブラリーの構築、および特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容(dock)された特定のペプチドについての最適な骨格および側鎖コンホメーション選択のための、これら骨格および側鎖コンホメーションライブラリーの使用、並びにこの相互作用からの結合スコアの誘導が考えられる。
【０１８０】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のモデルは相同モデリングによって、ブルックヘブン(Brookhaven)タンパク質データバンク(「ＰＤＢ」)で見出された多数の同様の構造から誘導できる。これらは、エネルギー最小化のためのＣＨＡＲＭｍ力場(Molecular Simulations Inc.、San Diego、Ca.から入手可能)と共に、シミュレートされたアニーリング機能を組み込んだ半自動的な相同モデリングソフトウェア(Modeller, Sali A.＆ Blundell TL.、1993.J.Mol.Biol 234：779-815)によって形成できる。別のモデリング方法も同様に利用できる。
【０１８１】
本願の方法は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の小さな集合について結合溝内の各位置での各アミノ酸選択肢の実験により得た結合データのライブラリーを使用する他の計算方法(Marshall,k.W.、 et al.、 Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids、 1(3)：157-162)(1995)や溝内の特定タイプの結合ポケットの結合特性を定義するために実験による同様の結合データを使用し(ここでもまたＭＨＣクラスＩＩ分子の比較的小さな部分集合を使用する)次いでこのポケットライブラリーからポケットタイプを「混合およびマッチング」して人為的に別の「仮想的な」ＭＨＣクラスＩＩ分子を生成するさらに別の計算方法(Sturniolo T.、 et al.、 Nat.Biotech、 17(6)：555-561(1999)と著しく異なる。先行技術は両方とも分析が複雑である点および多数のペプチド変異体を合成する必要がある点の不利益を被り、少数のＭＨＣクラスＩＩ分子しか実験的に走査できない。したがって、第１の先行技術の方法は少数のＭＨＣクラスＩＩ分子の予想しかできない。第２の先行技術の方法は、異なるクラスＩＩ対立遺伝子間においては、１個の分子中で類似したアミノ酸で裏打ちされているポケットは同じ結合特性を持つという仮定も前提としており、ポケットライブラリーに含まれるポケットを含むそうしたＭＨＣクラスＩＩ分子だけが「仮想的に」生成されるという欠点をさらに有する。本明細書に述べるモデリング手法を使用すれば、任意の数およびタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子の構造を推定でき、したがって全集団を代表する対立遺伝子を特異的に選択できる。さらに、走査されるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は、複雑な実験によって追加データを生成する必要以上にさらにモデルを生成することにより増加させることができる。
【０１８２】
骨格ライブラリーの使用により、走査されている様々なペプチドについて、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容された時のＣα原子位置における変化を考慮に入れることができる。この点もまた、上記の先行技術における計算方法(これらは特定のポケット中でアミノ酸結合を走査するため単純化されたペプチド骨格の使用に依存している)と対照的である。これらの単純化された骨格は、「実際の」ペプチドで見つかる骨格構成の代表ではないであろうし、その結果、ペプチド結合の予想が不正確になる。本発明の骨格ライブラリーは、タンパク質データバンク内で見出されるＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するすべてのペプチドの骨格を重ね、結合溝内に位置する１１個のアミノ酸各々のＣα原子間の２乗平均平方根(ＲＭＳ)偏差を記録することにより生成される。このライブラリーは、より大きな変動の可能性までも考慮に入れるために、少数(現在１３個)の適切な利用可能なマウスおよびヒト構造から誘導できる一方、各Ｃ''-αについてのＲＭＳ数値は、５０％増加する。その後、各アミノ酸の平均のＣα位置が決定され、その半径がその位置でのＲＭＳ偏差プラス５０％と等しい球がこの点のまわりに描かれる。この球体は許容されるＣα位置をすべて表す。
【０１８３】
最小のＲＭＳ偏差を有するＣα(これは、上記のポケット１中のアミノ酸であり、結合溝中の１１個の残基の位置２と等価である)を動かして、球体は３次元的にグリッド化され、次いでグリッド内の各頂点はそのアミノ酸のＣαのために可能な位置として使用される。結果として得られるアミド平面は、引き続きアミノ酸へのペプチド結合に対応し、これらのＣαの各々にグラフトされ、次のＣαを位置付けるためにφおよびψ角を所定の間隔で回転させる。引き続きＣαがＣαに対して「許容される位置の球」内にある場合にはジペプチドの向きが許容され、それが球の外部になる場合には、ジペプチドは拒絶される。その後、先行するＣαのあらゆる組合せから９個の後続Ｃαがすべて位置付けられるまで、ペプチドがポケット１ Ｃα「種子」から成長するように後続Ｃα位置の各々についてこのプロセスを繰り返す。次いで、ポケット１の前の単一Ｃαについてこのプロセスをもう一度繰り返して結合溝内に位置する骨格Ｃα位置のライブラリーを生成する。
【０１８４】
生成された骨格の数はいくつかの要因に依存する：「許容される位置の球」の大きさ；ポケット１位置の「１次球」のグリッドの精密さ；後続Ｃαを位置付けるために用いるφおよびψの段階的回転角の精密さ。このプロセスを使用すると、大きな骨格ライブラリーを生成できる。骨格ライブラリーが大きい程、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝内の特定のペプチドに対して最もよく適合するものが見つかる可能性は大きくなる。各対立遺伝子について、結合領域のアミノ酸との衝突により、必ずしもすべての骨格がＭＨＣクラスＩＩ分子のすべてのモデルに収容されるのには適さないため、その対立遺伝子によって収容され得る骨格を含むライブラリーの部分集合が生成される。骨格ライブラリーの使用は、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルと共に、各許容される骨格に収容される各ＭＨＣクラスＩＩ分子について結合溝の各位置の各アミノ酸の許容される側鎖コンホメーションからなる徹底的なデータベースを作成する。このデータセットは、単純な立体的重なり関数を用いて生成され、ここで、ＭＨＣクラスＩＩ分子は骨格と結合し、アミノ酸側鎖は所望の位置で骨格上にグラフトされる。各々の側鎖の回転可能な結合を設定した間隔で段階的に回転させ、得られる原子位置は注目する結合に依存する。原子と結合溝の側鎖の原子との相互作用が注目され、位置は次の基準によって許容されるか拒絶される：ここまでに位置付けられたすべての原子の重なりの合計は、予め決めた値を超過してはならない。したがって、コンホメーション探索の厳格性は、結合の段階的回転で用いる間隔と全重なりについて予め決めた限界の関数である。特定のポケットが剛性であると知られている場合、この後者の値は小さくなり得るが、ポケット側鎖の位置に比較的柔軟性があると知られている場合は、比較的緩和である。したがって、許容は結合溝ポケット内の柔軟性における変化を模倣するようになすことができる。次いで、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各々に収容された時、このコンホメーション探索を各骨格のすべての位置にあるすべてのアミノ酸について繰り返し、側鎖コンホメーションの徹底的なデータベースを作成する。
【０１８５】
適切な数式を用いて、上記骨格／側鎖コンホメーションの大きなデータベースの走査により経験的に導き出さなければならないペプチドリガンドコンホメーションと組み合うＭＨＣクラスＩＩ分子モデル間の結合エネルギーを評価する。したがって、９〜２０アミノ酸の範囲で長さが変化する(もっとも、長さは各走査に対しては一定にしておく)可能なペプチドに、以下の計算を施すことにより、タンパク質を潜在的なＴ細胞エピトープについて走査する：ＭＨＣクラスＩＩ分子をその分子に許容されるペプチド骨格とともに選択し、所望のペプチド配列に対応する側鎖をグラフトする。骨格上の特定の位置での原子の識別および特定の側鎖に関する原子間距離データを、そのアミノ酸の許容される各コンホメーションについて集める(上記データベースから得られる)。これを骨格に沿って各側鎖に対して繰り返し、スコアリング関数を用いてペプチドスコアを導く。その骨格のための最良のスコアを保持し、選択されたモデルについて各許容される骨格に対してこのプロセスを繰り返す。すべての許容される骨格から得られたスコアを比較し、最高のスコアをそのＭＨＣクラスＩＩモデル中の所望のペプチドについてのペプチドスコアであると見なす。次いで、このプロセスを、走査されているタンパク質に由来するあらゆる可能なペプチドを備えた各モデルについて繰り返し、ペプチド対モデルのスコアを表示する。
【０１８６】
本発明の状況では、結合親和性計算のために提示される各リガンドは、上に議論されるようなペプチドまたはタンパク質から選択されるアミノ酸断片である。したがって、リガンドは、公知の配列のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から得られ、長さがおよそ９〜２０個のアミノ酸である選択されたアミノ酸伸張物である。「アミノ酸」および「残基」という用語は以下においては同義語と見なされる。リガンドは、骨格ライブラリーから得た骨格上にグラフトされて検査されるペプチドの連続アミノ酸の形をしており、ペプチド骨格のＣ"-α原子の座標を介して、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルライブラリーから得られるＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝中に位置し、各側鎖に対して許容されるコンホメーションは許容されるコンホメーションデータベースから選択される。関連する原子同一性および原子間距離もこのデータベースから検索し、ペプチド結合スコアを計算するために使用する。ＭＨＣクラスＩＩ結合ポケットへの高い結合親和性を備えたリガンドには、部位指図突然変異生成に対する候補としてフラグが立てられる。フラグが立てられたリガンド(したがって対象タンパク質)でアミノ酸置換を行い、これはその後、結合親和性を予め定義した閾値以下に低減する変更を決定するためにスコアリング関数を使用して再試験する。次いで、これらの変更を対象タンパク質に組み入れ、Ｔ細胞エピトープを除去する。
【０１８７】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチドリガンドと結合溝の間は、非共有結合性の相互作用(水素結合、静電気的相互作用、疎水性(親油性)相互作用およびファンデアワールス相互作用を含むが、これらに限定されない)を含む。これらは、以下に詳細に述べるペプチドスコアリング関数に含まれている。水素結合は極性または帯電基間で形成され得るもので、２つの他の原子によって共有された水素原子からなる非共有結合であることが理解されるべきである。水素受容体が部分的に負帯電を有する一方で、水素供与体の水素は正電荷を有する。ペプチド／タンパク質相互作用のために、水素結合供与体は、水素と結合した窒素または酸素もしくは窒素に結合した水素のいずれでもよい。水素結合受容体原子は水素と結合していない酸素、水素が全く結合しておらず１個か２個の結合がある窒素、または１つの結合のみある硫黄でもよい。水素を結合した酸素またはイミン窒素(例えばＣ＝ＮＨ−)などのある種の原子は、水素受容体とも供与体ともなり得る。水素結合エネルギーは3〜7kcal/molの範囲であり、ファンデアワールス結合よりはるかに強いが共有結合よりは弱い。水素結合はまた指向性が強く、供与体原子、水素原子および受容体原子が同一直線上にある場合に最も強い。静電的結合は反対荷電のイオン対間で形成され、相互作用の強さはクーロンの法則による原子間の距離の二乗に反比例する。イオン対間の最適距離は約２．８Åである。タンパク質／ペプチド相互作用では、静電的結合がアルギニン、ヒスチジンまたはリジンとアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩との間で形成され得る。それらは水素結合と強さがほぼ似ているが、結合の強さはイオン化基のｐＫａおよび媒体の誘電率に依存するであろう。
【０１８８】
親油性(脂肪親和性)相互作用は、タンパク質とペプチドリガンド間に生じる良好な疎水性−疎水性接触である。通常、これらは結合溝のポケット内に埋没したペプチドの疎水性アミノ酸側鎖間にそれらが溶媒に露出しないように生じる。疎水性残基の溶媒への露出は、周囲の溶分子が互いに水素結合を強いられ、かご状のクラスレート構造を形成するので非常に不利である。結果として生じるエントロピーの減少は非常に不利である。脂肪親和性の強い原子は、極性でもなく水素受容体でもない硫黄や非極性の炭素原子などである。
【０１８９】
ファンデアワールス結合は３〜４Å離れた原子間で見られる非特異的な結合である。これは水素結合や静電的結合より弱く特異性も低い。原子のまわりの電荷分布は時間とともに変化し、どの瞬間でも、電荷分布は対称ではない。電荷分布におけるこの一時的な非対称性は、近隣の原子にも同様の非対称性を引き起こす。この結果生じる原子間引力は、ファンデアワールス接触距離で最大に達するが、約２Å〜約１Åに至ると非常に急速に低減する。逆に、原子間の隔たりが接触距離未満になるとともに、原子の外殻電子雲が重なるため、強い斥力が支配的になる。引力は静電的結合や水素結合に比べて比較的弱いが(約0.6Kcal/mol)、斥力は特に、ペプチドリガンドがタンパク質に成功裡に結合するかどうか決する上で非常に重要であろう。
【０１９０】
１つの実施形態では、ベーム(Ｂｏｅｈｍ)スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ１手法）が結合定数を評価するために使用される(Boehm, H.J.、 J.Comput Aided Mol.Des.、 8(3):243-256(1994)、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる)。別の実施形態では、スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ２手法）が、Ｔ細胞エピトープを含むリガンドの指標として結合親和力を評価するために使用される(Boehm, H.J.、 J.Comput Aided Mol.Des.、 12(4):309-323(1998)、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる)。しかし、上記の文献に記述されているベームスコアリング関数は、タンパク質へのリガンドの結合親和力を評価するために使用されるが、この場合、リガンドがタンパク質に成功裡に結合することが既に知られており、タンパク質／リガンド複合体はその構造が解明されタンパク質データバンク(「ＰＤＢ」)の中に存在するものである。したがって、スコアリング関数は、陽性であることが知られた結合データを利用して開発されている。陽性および陰性バインダー間の区別を考慮に入れるために、方程式に反発項を加えなければならない。さらに、結合エネルギーのより満足な評価は、上記のベーム関数の領域ベースのエネルギー項を用いるのではなく対同士の方法で脂肪親和性の強い相互作用を計算することで達成される。したがって、好ましい実施形態では、結合エネルギーは修正されたベームスコアリング関数を使用して評価される。修正されたベームスコアリング関数では、タンパク質とリガンド間の結合エネルギー(ΔＧbind)は、以下のパラメーターを考慮して評価される：リガンド(ΔＧo)の並進エントロピーと回転エントロピーの全面的な喪失による結合エネルギーの低減；少なくとも１個のパートナーが中性である、理想的な水素結合からの寄与(ΔＧhb)；摂動のないイオン間相互作用(ΔＧionic)からの寄与；脂肪親和性リガンド原子と脂肪親和性受容体原子の間の脂肪親和性相互作用（ΔＧlipo）；リガンド中の内部自由度の凍結による結合エネルギーの喪失、つまり、各Ｃ−Ｃ結合の周りの回転自由度が低減する(ΔＧrot)；タンパク質とリガンド間の相互作用エネルギー(ＥvdW)。これらの項を考慮すると方程式１が与えられる：
（ΔＧbind）＝（ΔＧo）＋（ΔＧhbｘＮhb）＋（ΔＧionicｘＮionic）＋（ΔＧlipoｘＮlipo）＋（ΔＧrot＋Ｎrot）＋（ＥvdW）
式中、Ｎは特定の項の相互作用を特徴付ける数であり、１つの実施形態では、ΔＧo、ΔＧhb、ΔＧionic、ΔＧlipoおよびΔＧrotは、それぞれ５．４、−４．７、−４．７、−０．１７および１．４の値を与えられる定数である。
【０１９１】
Ｎhbは方程式２：
Ｎhb＝Σh-bondsｆ（ΔＲ，Δα）×ｆ（Ｎneighb）×ｆpcs
によって計算される。
【０１９２】
ｆ（ΔＲ，Δα）は、理想状態からの水素結合の大きな偏差を説明し、方程式３によって計算されるペナルティ関数である：
ｆ（ΔＲ，Δ−α）＝ｆ１（ΔＲ）×ｆ２（Δα）
ここで、ｆ１（ΔＲ）＝１（ΔＲ＜＝ＴＯＬの場合）、
または ＝１−（ΔＲ−ＴＯＬ）／０．４（ΔＲ＜＝０．４＋ＴＯＬの場合）、
または ＝０（ΔＲ＞０．４＋ＴＯＬの場合）。
さらに、ｆ２（Δα）＝１（Δα＜３０°の場合）
または ＝１−（Δα−３０）／５０（Δα＜＝８０°の場合）
または ＝０（Δα＞８０°の場合）。
【０１９３】
ＴＯＬは水素結合長さ（＝０．２５Å）で許容される偏差、
ΔＲはＨ−Ｏ／Ｎ水素結合長さの理想的な値（＝１．９Å）からの偏差、
Δαは水素結合角度∠N/O-H,O/Nの理想的な値（＝１８０°）からの偏差、
ｆ（Ｎneighb）は、タンパク質表面の凹面と凸面の部分を識別し、したがってタンパク質表面で見られるものではなくポケットで見られる極性相互作用に大きな重みを割り当てる。この関数は下記方程式４：
ｆ（Ｎneighb）＝（Ｎneighb／Ｎneighb,0）α（ここで、α＝０．５）
によって計算される。
【０１９４】
Ｎneighbは任意の所与のタンパク質原子に５Åより接近している非水素タンパク質原子の数であり、
Ｎneighb,0＝定数２５である。
【０１９５】
ｆpcsは１つの水素結合当たり極性接触表面積を考慮に入れた関数であり、したがって強い水素結合と弱い水素結合を区別し、その値は次の基準によって決定される：
ｆpcs＝β（Ａpolar／ＮHB＜１０Å2の場合）、
またはｆpcs＝１（Ａpolar／ＮHB＞１０Å2の場合）
Ａpolarはタンパク質リガンド接触表面の大きさであり、
ＮHBは水素結合の数であり、
βは定数＝１．２である。
【０１９６】
修正されたベームスコアリング関数の実行のためには、イオン相互作用からの寄与、ΔＧionicを上記水素結合からの寄与と同様の方法で計算する（同じ幾何学依存性が仮定されるため）。
【０１９７】
Ｎlipo項は方程式５によって計算される：
Ｎlipo＝ΣILｆ（ｒIL）
ｆ（ｒIL）はすべての脂肪親和性リガンド原子について、１また、すべての脂肪親和性タンパク質原子についてＬであり、以下の基準により計算される：
ｆ（ｒIL）＝１（ｒIL＜＝Ｒ１ｆ（ｒIL）＝（ｒIL−Ｒ１）／（Ｒ２−Ｒ１）でＲ２＜ｒIL＞Ｒ１の場合、
ｆ（ｒIL）＝０（ｒIL＞＝Ｒ２の場合）。
【０１９８】
ここで、Ｒ１はｒ１vdw＋ｒLvdw＋０．５および
Ｒ２＝Ｒ１＋３．０であり、
ｒ１vdwは、原子１のファンデアワールスの半径であり、
ｒLvdwは、原子Ｌのファンデアワールスの半径である。
【０１９９】
Ｎrotはアミノ酸側鎖の回転可能な結合の数であり、非環式のｓｐ3−ｓｐ3結合およびｓｐ3−ｓｐ2結合の数である。末端ＣＨ3またはＮＨ3の回転は考慮に入れない。
【０２００】
最後の項Ｅvdwは方程式６によって計算される：
Ｅvdw＝ε1ε2（（ｒ1vdw＋ｒ2vdw）12／ｒ12−（ｒ1vdw＋ｒ2vdw）6／ｒ6）。
【０２０１】
ここでε1とε2は原子同一性に依存する定数であり、
ｒ1vdw＋ｒ2vdwはファンデアワールスの原子半径であり、
ｒは１対の原子間の距離である。
【０２０２】
方程式６に関して、１つの実施形態では、定数ε1とε2はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：０．２４５、Ｎ：０．２８３、Ｏ：０．３１６、Ｓ：０．３１６(つまり、炭素、窒素、酸素および硫黄のそれぞれの原子について)。方程式５および６については、ファンデアワールスの半径はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：１．８５、Ｎ：１．７５、Ｏ：１．６０、Ｓ：２．００Å。
【０２０３】
タンパク質リガンド相互作用についての現時点での理解の制約内ではあるが、上記の方程式に現われるすべての所定の値および定数がすべて決定されることは理解されるべきである(特に本願で試みられている計算のタイプについて)。したがって、このスコアリング関数がさらに精緻化された場合には、これらの値および定数を変更することが可能で、したがって、リガンドへのタンパク質の結合エネルギーを評価する項において所望の結果を与える適当な数値を使用してもよく、したがって、本発明の範囲内である。
【０２０４】
上記のように、スコアリング関数は、側鎖コンホメーション、原子同一性および原子間の距離のデータベースから抽出されたデータに適用される。本発明を説明する目的のために言えば、このデータベースに含まれるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は４２個のモデルと４つの解決された構造である。本発明の計算方法の構築はモジュール化された性質を有するため、新しいモデルを加えペプチド骨格ライブラリーと側鎖コンホメーション関数を用いて走査するだけで、上記のペプチドスコアリング関数によって処理できる追加のデータセットを作成できることは上記の説明から明らかである。これにより、走査されたＭＨＣクラスＩＩ分子のレパートリーを容易に増加させることが可能になり、あるいは、データが入手できる場合には構造および関連データを置き換えて、既存の対立遺伝子のより正確なモデルを作成することができる。
【０２０５】
本発明の予想方法は、様々なＭＨＣクラスＩＩ分子に対する有する親和性が実験的に測定された多数のペプチドを含むデータセットにより較正できる。計算値を実験値と比較することによって、すべての実験的に測定したＴ細胞エピトープが正確に予想されることがわかれば有益性の一端を決定できる。
【０２０６】
利用可能ないくつかの精巧な方法論と比較して、上記のスコアリング関数は比較的単純であるが、計算が非常に急速に実行される、ということが理解されるべきである。また、目的が、選択されたＭＨＣクラスＩＩタンパク質の結合溝に収容される各ペプチドについて真の結合エネルギーそれ自身計算するものではないことも理解されるべきである。根本的な目的は、選択されたタンパク質の１次構造(すなわち、アミノ酸配列)に基づいてＴ細胞エピトープの位置を予想する助けとして相対的な結合エネルギーデータを得ることである。比較的高い結合エネルギー、すなわち選択された閾値以上の結合エネルギーは、リガンド中のＴ細胞エピトープの存在を示唆するだろう。次いで、リガンドに少なくとも１回のアミノ酸置換を施し、結合エネルギーを再計算すればよい。計算が迅速性を有するため、ペプチド配列のこれらの操作はコストに見合う利用可能なコンピューターハードウェアにおいてプログラムのユーザインターフェース内で対話形式に実行できる。したがって、コンピューターハードウェアへの大きな投資は要求されない。
【０２０７】
同じ目的のために他の利用可能なソフトウェアを使用できるかもしれないことは当業者には明白であろう。特に、タンパク質結合サイト内にリガンドをドッキングさせ得るより精巧なソフトウェアを、エネルギー最小化と共に使用してもよい。ドッキングソフトウェアの例は次の通りである：ＤＯＣＫ(Kuntz et al.、 J.Mol.Biol.、 161：269-288(1982))、ＬＵＤＩ(Boehm, H.J.、 J.Comput Aided Mol.Des.、 8：623-632(1994))およびＦＬＥＸＸ(Rarey M.、 et al.、 ISMB、3:300-308(1995))。分子モデリングおよび操作ソフトウェアの例としては：ＡＭＢＥＲ(Tripos)およびＣＨＡＲｍ(Molecular Simulations Inc.)。これらの計算方法の使用は、必要な計算を行うために要求される処理時間の長さにより本発明方法の処理能力を厳しく制限するだろう。しかし、本発明の方法によって「陽性なバインダー」であると判明したペプチドについて結合エネルギーのより正確な計算結果を得るために「第２のスクリーン」として、このような方法を使用し得るというのもあり得ることである。洗練された分子の機械的または分子の動的な計算のための処理時間の制限は、これらの計算を行うソフトウェアの設計およびコンピューターハードウェアの現在の技術制限の両者によって決まる。将来的には、より効率的なコードが書かれ、さらにコンピュータープロセッサー速度の持続的な増加によって、より扱いやすい時間枠内でそのような計算を行うことが実現可能になるかもしれない。巨大分子に適用されるエネルギー関数および折り畳まれたタンパク質構造内で起こる様々な相互作用についての考慮に関するさらに詳しい情報は以下に見られる：Brooks, B.R., et al.、 J.Comput.Chem.、 4:187-217(1983)。一般的なタンパク質−リガンド相互作用に関するさらに詳細な情報は以下に見られる：Dauber-Osguthorpe et al.、 Proteins4(1):31-47(1988)。その内容の全体は言及によって本願に組み入れられる。有用な背景的事項は、例えば以下に見られる：Ｆａｓｍａｎ，Ｇ．Ｄ．、ｅｄ．、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＳＢＮ：０−３０６ ４３１３−９。
【０２０８】
（対応するもの）
本発明は他の具体的なかたちでその精神または基本的な特徴から離れることなく具体化することができる。さらなる具体例として、ここに記載されている発明に限定するというよりは実例として全ての面において、従って考えうる。本発明の範囲内で、従って、先述の明細書によってというよりはさらなる特許請求の範囲によって意図される。さらに、本特許請求の範囲の同等の意味および範囲内に起こる全ての変化は、その中に包括されることを意図している。
【０２０９】
（参考文献による組み込み）
ここで上記に意図する、全ての特許、特許明細書および化学文献は、すべてこの明細書の中に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のタンパク質がＣ−末端側のアミノ酸を介して第２のタンパク質のＮ−末端側のアミノ酸と連結して融合接合部を形成する、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを含む融合タンパク質の非自己Ｔ細胞エピトープを除去することにより免疫原性を低減する方法であって、該方法は、該融合接合部を取り囲む接合領域の１から１５のアミノ酸が変更され、該変更が、以下のステップ：
（ｉ）Ｎ−結合グリコシル化部位またはＯ−結合グリコシル化部位を導入する、
（ｉｉ）融合タンパク質中のＮ−末端融合パートナーの最もＣ−末端側の８アミノ酸に存在するロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンをトレオニン、アラニンまたはプロリンに変更する、
（ｉｉｉ）前記第1のタンパク質がＩｇＧ分子またはその断片である場合に、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＳｅｒをＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒに変更する、
の１つにより行われる方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｉ）が、前記融合接合部の１０、５または２個のアミノ酸内にグリコシル化部位を導入することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｉ）が、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒアミノ酸配列（Ｘは任意のアミノ酸である）を導入することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のタンパク質がＩｇ分子またはその断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のタンパク質がＩｇ分子またはその断片であり、前記第２のタンパク質がサイトカインである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
血中半減期を増大するために、さらなる変更がＣ末端のリジンをアラニンまたはロイシンに変更することにより、融合タンパク質のＩｇＧとサイトカインの部分の間で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記接合領域が１から９個のアミノ酸を含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
第１のタンパク質がＣ−末端側のアミノ酸を介して第２のタンパク質のＮ−末端側のアミノ酸と連結して融合接合部を形成する、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを含む融合タンパク質の非自己Ｔ細胞エピトープを除去することにより免疫原性を低減する方法であって、該方法は、該融合接合部を取り囲む接合領域の１から１５のアミノ酸が変更され、該変更が、以下のステップ：
（ｉ）Ｎ−結合グリコシル化部位またはＯ−結合グリコシル化部位を導入する、
（ｉｉ）融合タンパク質中のＮ−末端融合パートナーの最もＣ−末端側の８アミノ酸に存在するロイシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンをトレオニン、アラニンまたはプロリンに変更する、
（ｉｉｉ）前記第1のタンパク質がＩｇＧ分子またはその断片である場合に、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＳｅｒをＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒに変更する、
の１つにより行われる方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｉ）が、前記融合接合部の１０、５または２個のアミノ酸内にグリコシル化部位を導入することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｉ）が、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒアミノ酸配列（Ｘは任意のアミノ酸である）を導入することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のタンパク質がＩｇ分子またはその断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のタンパク質がＩｇ分子またはその断片であり、前記第２のタンパク質がサイトカインである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
血中半減期を増大するために、さらなる変更がＣ末端のリジンをアラニンまたはロイシンに変更することにより、融合タンパク質のＩｇＧとサイトカインの部分の間で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記接合領域が１から９個のアミノ酸を含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【公開番号】特開２０１０−２２２３８０（Ｐ２０１０−２２２３８０Ａ）
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５１７４３（Ｐ２０１０−１５１７４３）
【出願日】平成２２年７月２日（２０１０．７．２）
【分割の表示】特願２００２−５７７８５６（Ｐ２００２−５７７８５６）の分割
【原出願日】平成１４年３月３０日（２００２．３．３０）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２日（２０１０．７．２）
【分割の表示】特願２００２−５７７８５６（Ｐ２００２−５７７８５６）の分割
【原出願日】平成１４年３月３０日（２００２．３．３０）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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