血液製剤中の汚染物質を不活性化する方法
【課題】簡単、迅速、低コスト、高再現性で、血液製剤中に存在する汚染物質を不活性化する方法を提供する。
【解決手段】血液製剤にＣタイプ紫外線を１回又は２回以上照射して、前記血液製剤中に存在するウイルス、特にパルボウィルスを不活性化する方法。
【解決手段】血液製剤にＣタイプ紫外線を１回又は２回以上照射して、前記血液製剤中に存在するウイルス、特にパルボウィルスを不活性化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、血液製剤、特に全血、血漿、血液細胞成分から成る液体、生物工学によって得られる非天然製品をも含めて、例えば凝固因子（因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、フォン・ウィルブラント因子など）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、免疫グロブリン、アルブミンなどのような血液製剤、に含まれる汚染物質を不活性化する方法に関わり、前記方法を実施する装置についても言及する。
この発明は、本発明の方法によって処理された血液製剤及び前記血液製剤を含む医薬用及び／または化粧品用組成物にも係わる。
【背景技術】
【０００２】
治療または治療以外の目的で血液製剤を利用できるようにするためには、高純度の、好ましくは、汚染物質、特にウィルス性汚染物質を含まない製剤の実現を可能にする精製技術が必要である。
【０００３】
血液製剤中のウィルス性汚染物質としては、エンベロープのあるウィルス（ＨＩＶ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ及びＧ型肝炎ウィルスなど）やエンベロープのないウィルス（Ａ型肝炎ウィルス、パルボウィルスなど）が挙げられる。
【０００４】
永年にわたって、種々の国際または国内機関が、ウィルス性汚染物質を含んだままで治療または治療以外の目的に使用されるのを防止するため、血液製剤の製造に関して年々きびしい基準を導入している（条令６５／６５ＥＥＣ，７５／３１９／ＥＥＣ及び８９／３８１ＥＥＣ）。
【０００５】
ヨーロッパのレベルでは、エンベロープのあるウィルスまたはエンベロープのないウィルスに対していくつかの処理を施すようにＣＰＭＰ基準（ＣＰＭＰ／ＢＷＴ２６８／９５及び２６９／９５）が要求している。
【０００６】
凝固因子の調製に際して、（乾式または湿式）加熱または低温殺菌による不活性化処理がＡ型肝炎ウィルスに対して有効であることは公知である。しかし、その他のエンベロープのないウィルス、特にパルボウィルスに対しては必ずしも有効ではない。
【０００７】
他方、（溶剤−清浄剤の添加による）化学的不活性化処理がエンベロープのあるウィルスに対して有効であることも公知である。しかし、この処理はエンベロープのないウィルスに対しては無効である。
【０００８】
例えばβ−プロピオラクトンのような化学的物質を利用することも公知である。この方法は、エンベロープのないウィルスの処理には有効であるが、処理されるプロテインを変性させるという欠点がある。
【０００９】
ｐＨを４以下に調整することによる長時間処理、またはプロテアーゼの添加が、例えばパルボウィルスのようなエンベロープのないウィルスの活性化を可能にすることも公知である。しかも、このような処理は、処理されるプロテインの配座（コンフォーメーション）や構造を変化させる。
【００１０】
従って、血液製剤のウィルス不活性化に利用できる公知の物理化学的処理は、ほとんど例外なく、毒性が高いか、処理されるプロテインの配座を著しく変化させるか、あるいは、エンベロープのないウィルス、特にパルボウィルスの処理に効果を発揮できない。
【００１１】
パルボウィルスは、ヒトを含めて多くの動物に感染する小型のエンベロープのないＤＮＡウィルスである（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１−３０，“Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ”，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｅｙｍｏｕｒ Ｓ．Ｂｌｏｃｋ，Ｅｄ．Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ−Ｌｏｎｄｏｎ）。パルボウィルスは風土性であり、多様な疾病の原因となり、病状は宿主の発育状態に応じて異なる。
【００１２】
ヒトに特有の病源として判明しているのは、パルボウィルスＢ１９だけである。マウスのパルボウィルスＨ１もヒトに感染する可能性がある。
【００１３】
健常なヒトがパルボウィルスＢ１９に感染した場合、症候が全く現われないか、または良性腫瘍が発現する（例：幼児の伝染性紅斑（ｃｉｎｑｕｉｅｍｅ ｍａｌａｄｉｅ ｃｈｅｚｌ’ｅｎｆａｎｔ））。
【００１４】
他方、免疫不全患者または血液障害患者の場合には慢性貧血の原因となったり、一過性形成不全に陥り、溶血性貧血の原因となったりする。
【００１５】
胎盤を通過すれば、子宮内死の原因となる。パルボウィルスＢ１９はヒト造血細胞の赤血球系に対して顕著な走性を示す。
【００１６】
最近の疫学的調査によれば、フランスにおいて成人の５０〜６０％と１〜１５才の未成年者の３６％が血清学的に陽性のパルボウィルスを持っている。
【００１７】
複数バッチの精製因子ＶＩＩＩ濃縮液中で遺伝子増幅（ＰＣＲ）を行うことにより、採用するウィルス不活性化方法に関係なく、ウィルスＤＮＡのプロセスが立証された。
【００１８】
このことは、１９８８年以来フランスで使用されている、エンベロープのあるウィルス（ＨＩＶ，ＨＢＶ，ＨＣＶ）で汚染されていない高純度因子ＶＩＩＩ濃縮液（ＦＶＩＩＩ ＴＨＰＳＤ）を誕生以来投与されている未成年の血友病患者の８５％において、臨床的徴候ではなく、Ｂ１９+を血清学的に検出することによって立証された（Ｙ．Ｌａｕｒｉａｕ ｅｔ ａｌ．，１ｅｒｃｏｎｇｒｅｓ ｄｅ ｌａ Ｓｏｃｉｅｔｅ Ｆｒａｎｃａｉｓｅ ｄｅ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ［１ｓｔ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｒｅｎｃｈ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ］（１９９４））。
【００１９】
この観察結果から明らかなように、血液製剤からパルボウィルス、特にパルボウィルスＢ１９を排除する新しいウィルス不活性化方法がない限り、汚染の可能性は高い。
【００２０】
パルボウィルスは高温においても極めて耐性が高い。その赤血球凝集性と感染性は、クロロホルムや各種酸のような化学物質による処理にも影響を受けず、ＲＮａｓｅ，ＤＮａｓｅ，パパインまたはトリプシンを利用した酵素消化にも耐える。
【００２１】
国際特許出願ＷＯ９５／００６３１（特許文献１）はＵＶＡ照射によって光活性化可能で、血液製剤中に存在するウィルスに対して毒性を示す物質を血液製剤に添加してウィルスを不活性化する方法を開示している。この方法は、血液製剤からこの毒性試薬を分離することによって、血液製剤がこの毒性試薬に汚染されるのを防ぐ工程を含む。
【００２２】
毒性試薬としてはプソラレンが代表的である。
【００２３】
しかし、この方法に伴う欠点として、処理された血液製剤からこれらの光活性化可能な物質が完全に除去されるとの保証はなく、もしこれが残留しておれば、処理された血液製剤を変性及び／または不活性化するおそれがあり、たとえ少量ずつでもこれを繰り返し注射すれば、ヒトまたは動物に毒性による身体障害を発生させることになる。
【００２４】
紫外線照射によって一度に多数の製剤を殺菌できることも公知である。特に文献“Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ”（ｃｈａｐｔｅｒ３１，ＩＬ ＳＨＥＣＨＭＥＩＳＴＥＲ）（非特許文献１）から、紫外線照射がウィルス、マイコプラズマ、細菌、かびのような汚染物を破壊できることは公知である。このような照射は、特に気体や液体のような媒質中で利用することができることは公知である。
【００２５】
ルチンなどのような抗酸化剤の存在下において、または不存在下において、血液製剤にＣタイプ紫外線を照射し、エンベロープのないウィルス、特にパルボウィルスを不活性化する方法もＣｈｉｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．の文献（Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌｕｍｅ ８６，Ｎｏ．１１，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９５，ｐ．４３３１−４３３６）（非特許文献２）から公知である。
【００２６】
また、公知のウィルス不活性化方法は、血液製剤の完全性及び活性（特に因子ＶＩＩＩのような凝固因子の立体配座）に、従って製剤の活性に影響を及ぼす可能性がある。
【００２７】
さらにまた、公知のウィルス不活性化方法は、再現性またはモニタリングに問題があるため、有効性の確認が困難な場合が多い。即ち、特に乾式加熱によって処理する際に湿度をモニターしなければならない場合、いくつかの処理パラメータは、変更せざるを得ないかまたは容易に維持することができない。しかも、処理の各工程を制御することは困難である。
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ９５／００６３１
【非特許文献１】“Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ”（ｃｈａｐｔｅｒ３１，ＩＬ ＳＨＥＣＨＭＥＩＳＴＥＲ
【非特許文献２】Ｃｈｉｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．の文献（Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌｕｍｅ ８６，Ｎｏ．１１，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９５，ｐ．４３３１−４３３６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
この発明の目的は、公知技術の欠点を残すことなく、簡単、迅速、低コスト、高再現性で、血液製剤中に存在する汚染物質を不活性化する新しい方法及び装置を提供することにある。
【００２９】
この発明の他の目的は、血液製剤、特に因子ＶＩＩＩ，因子ＩＸ，フォン・ウィルブラント因子、フィブロネクチン、フィブリノーゲンなどのような凝固因子の完全性を維持するウィルス不活性化方法を開発することにある。
【００３０】
この発明のさらに他の目的は、容易に実施でき、医薬品製造基準（ＧＭＰ）及びヨーロッパ基準（ＣＰＭＰ）に合致する方法及び装置を提供することにある。
【００３１】
この発明のさらなる目的は、エンベロープのない、好ましくは一本鎖のウィルス、例えばパルボウィルス、特にパルボウィルスＢ１９及びＨ１の不活性化を可能にする、血液製剤のウィルス不活性化方法及び装置を提供することにある。本発明はまた、血液製剤の活性に影響を及ぼすことなく、前記汚染物質、特にエンベロープのないウィルス、例えば、パルボウィルス、特にパルボウィルスＢ１９及びＨ１を含まない血液製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
この発明は、血液製剤中に存在するパルボウィルス、特にパルボウィルスＢ１９及びＨ１を不活性化する方法に係わり、この方法では前記血液製剤にＣタイプ紫外線を１回または２回以上照射する。
【００３３】
“血液製剤”とは、ヒトまたは動物の身体から直接的にまたは合成工程を経て得られる液状または固形のあらゆる血液製剤、例えば、全血、血液細胞成分、血液派生物質、例えば、血清または血漿、及び血中プロテイン成分、即ち凝固因子（因子ＶＩＩＩ，因子ＩＸ，フォン・ウィルブラント因子など）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、免疫グロブリン、アルブミンなどのほか、生物工学によって得られる組換えプロテインまたは合成ペプロチドのようなプロテイン成分を意味するものとする。
【００３４】
インターフェロン、インターロイキン、またはこれらの分子のレセプターのような特異的な血液細胞系によって形成され、天然に、または合成工程を経て得られる因子、例えば、組換えＤＮＡ技術によって得られる組換えペチドまたはプロテインも血液製剤である。この発明の方法は、血液製剤中に存在する可能性がある他の汚染物質、例えば、エンベロープのないウィルス（ＨＡＶ）、エンベロープのあるウィルス（ＨＩＶ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ及びＧ型肝炎ウィルスなど）、細菌類などの不活性化をも可能にする。
【００３５】
この発明の方法は、汚染物質、特にウィルス性汚染物質を不活性化するための、当業者には公知の１つまたは２つ以上の処理方法、特に物理的または化学的ウィルス不活性化処理と組合わせることができる。これらの補足的処理は、１回または２回以上の乾式または湿式加熱処理、化学的成分、特に溶剤−清浄剤または紫外線下で活性化する物質の添加、１回または２回以上の低温殺菌処理、γ線やＸ線などのような特定放射線による１回または２回以上の照射、及びこれらの処理方法の組合わせから成るグループから選択される。血液製剤に添加できる活性物質の例として、遊離基に対して保護機能を果す物質（ビタミンＣなど）やプロテインのアルキル化現象を起こさせるβ−プロピオラクトンを挙げることができる。このような物質は毒性現象を起こしたり、処理される血液製剤を変性させない投与量で使用しなければならない。ただし、エンベロープのないウィルスを不活性化したり、遊離基から保護したりするためには、このような物質を添加しなくても、この発明に従って使用される線量なら照射だけで充分である。
【００３６】
本発明のウィルス不活性化方法は、全血から血液派生物質を単離または分離する一般的な方法と組合わせることができる。
【００３７】
この単離または分離方法としては、全血の各種成分を互いに分離することを可能にする１回または２回以上の濾過、沈澱またはクロマトグラフィー分離処理を利用することができる。
【００３８】
この発明では、ＵＶＣ線の大部分が２５０〜２７０ｎｍ、好ましくは２５４ｎｍの波長で、即ち、核酸の吸収に好ましい波長域で照射され、血液製剤が受ける照射線量は、１０〜２０００ジュール／ｍ２、好ましくは２３０〜４００ジュール／ｍ２である。
【００３９】
この発明の方法においては、処理される血液製剤中に存在するペプチドまたはプロテインの構造を破壊することなく、血液製剤に照射される線量が汚染物質の核酸に対して本質的に作用するように照射線量及び波長を選択する。
【００４０】
予想外のことであるが、従来なら血液製剤の処理は薄層（“単分子層”またはいわゆる積層）の状態でのみ可能であったが、実は薄層の状態でなくても可能であるとの所見を得た。即ち、もはや処理量を制限する要因は全くない。薄層状態にない血液製剤を処理することによって、薄層状態で処理する場合に固相／液相界面に発生する破壊現象を回避できるから、この性質は極めて有益である。しかも、薄層状態で処理しないことで、多量の血液製剤を処理することができ、処理される血液製剤の加熱及びシャリングを回避できる（ＢＡＩＬＥＹ，Ｂｉｏｃｈ．Ｆｏｎｄ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）。
【００４１】
ＵＶＣ線の放射波長及び照射線量は当業者なら、処理すべき血液製剤の量と種類とに応じて調整することができる。処理すべき血液製剤が受ける照射線量が高ければ高いほど、存在する汚染物質の不活性化効果も高くなる。しかし、血液製剤の変性現象を軽減するため、当業者ならＵＶＣ放射波長の照射量を調整することにより、前記血液製剤の変性と活性損を軽減するであろう。この調整は、ヨーロッパＣＰＭＰ基準（ＣＰＭＰ／ＢＷＰ２６８／９５及び２６９／９５）に従って行われる。
【００４２】
照射線量を制限して前記製剤の活性損を１０〜１５％、好ましくは５％以下に抑制しながら、完全なウィルス不活性化を達成することができる（即ち、もはや検出閾値以上のウィルスを検出することはできない）。
【００４３】
この発明では、血液製剤中に存在するパルボウィルス、特にパルボウィルスＢ１９及びＨ１を、この発明の方法を活用することで不活性化する装置についても言及する。
【００４４】
この装置は、本質的にはＣタイプ紫外線放射源、即ち、その波長が処理すべきウィルスの核酸による紫外線吸収に最適な２３０〜２７０ｎｍ、好ましくは約２５４ｎｍである紫外線放射源に係わる。この装置において、放射線が処理すべき血液製剤に向けられる。
【００４５】
この装置では、処理すべき血液製剤に１０〜２０００ジュール／ｍ２の線量、好ましくは２３０〜４００ジュール／ｍ２の線量を照射することができる。
【００４６】
この発明では、上記不活性化装置を含む製造設備についても言及する。
【００４７】
この製造設備は、全血から血液派生物質の単離または分離を可能にする装置をも含む。
【００４８】
製造設備に含まれるこれらの装置としては、処理すべき血液製剤を沈澱、遠心分離／デカンテーション、濾過、濃縮または透析する手段等が考えられ、これらの装置は、当業者ならば血液製剤の種類に応じて調整することができる。
【００４９】
Ｃタイプ紫外線の照射を受ける血液製剤は、Ｃタイプ紫外線の放射波長域をほとんど吸収しない石英管またはポリマー材からなる管に収容するのが好ましい。
【００５０】
製造設備は、紫外線の作用下に発生する可能性がある遊離基から保護する物質を血液製剤に添加するための装置をも含むことができる。このような保護剤としては、アスコルビン酸ナトリウム、グルタチオンのようなビタミンのほか、当業者にとって公知のその他の物質（ＳＯＤ）を挙げることができる。製造設備はさらに、処理すべき血液製剤中に存在する汚染物質を不活性化できる種々の化学物質を血液製剤に添加するための装置をも含むことができる。添加される物質は、紫外線の作用下で活性化し、この発明の方法と組合わせることで前記血液製剤中に存在する他の汚染物質に対する相乗効果を発揮できる物質であればよい。ただし、特に薄層状態の血液製剤に応用される不透過ＵＶ線の場合とは異なり、この発明では、薄層を利用したり、ウィルス不活性化のために有毒添加物を添加しなくても血液製剤を処理することができる。
【００５１】
この発明は、この発明の方法によって得られる、ウィルス性汚染物質を含まない、特にエンベロープのない一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡウィルス、具体的にはパルボウィルスＢ１９及び／またはＨ１を含まない血液製剤にも係わり、特に、その活性の８５％以上、好ましくは９５％以上を維持できることを特徴とする凝固因子のような血液派生物質にも係わる。効果損の測定は、当業者に公知の方法で行われる。
【００５２】
この発明は、前記血液製剤を含む医薬品用及び／または化粧品用組成物（例えば生物接着剤）にも係わる。この発明の実施形態を添付の図面に沿って以下に詳述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
図１〜３には、この発明で使用する血液製剤製造設備を示した。
【００５４】
この設備１は、因子ＶＩＩＩまたはフィブリノーゲンのような血液製剤の沈澱、遠心分離／デカンテーション、濾過及び透析に使用され、処理すべき血液製剤に応じて当業者が適応させることができる装置（２，３）を含む。
【００５５】
製造設備は、物理的処理によって前記血液製剤のウィルス不活性化を行うこの発明を実施するための装置４をも含む。
【００５６】
この発明で使用する血液製剤は、ポンプによって装置４と対向する石英管６に送入される。
【００５７】
装置４は、放射の９０％以上が２３０〜２７０ｎｍで、好ましくは約２５４ｎｍの波長で行われるＵＶランプ７、好ましくは消毒用ＵＶ管形ランプを含む。このランプは、円筒形などの反射チェンバ８内に設けられ、反射チェンバ８はその焦点に配置された石英管６に向かってＵＶ線を送る。
【００５８】
この発明で使用する装置では、石英管６内を循環する血液製剤とＵＶランプ７との接触はあり得ない。
【００５９】
バッフルまたは窒素添加などのような乱流システムを利用することによって、石英管６内の流れを均質化することができる。
【００６０】
製造設備は、ポンプ５、及び処理すべき血液製剤の流量を制御し、ＵＶランプ７の前を通過する血液製剤の通過時間を変化させることを可能にする流量計１１をも含む。
【００６１】
さらに、石英管６とＵＶランプ７との間に１つまたは２つ以上のスクリーン９を設けることができる。スクリーンを適当に選択することにより、処理すべき血液製剤への照射線量を変え、特定の放射波長を選択することができる。使用するＵＶランプの選択（出力の異なるランプを使用できる）、使用するスクリーンの選択、及びランプの前を通過する血液製剤の速度の調整によって、処理すべき血液製剤への照射線量を変えることもできる。これらの調整は、当業者なら、処理すべき血液製剤の量及び種類に応じて行うことができる。
【００６２】
ＵＶランプとは反対の側に、石英管６を照射するＣタイプ紫外線量を（従って、血液製剤が受ける照射線量を）制御するシステム１０を配置する。
【００６３】
この制御システム１０は、図示のように、好ましくは石英管６の両側に、必要ならスクリーン９の両側に配置されて、処理すべき血液製剤の種類及びＵＶランプ７からの照射線量に応じて当業者が血液製剤の流量を調整できるようにする１つまたは２つ以上のセンサー１２から成る。
【００６４】
血液製剤の滞留時間を調整することにより、照射線量を一定に維持することができる。管の直径は、処理量と消毒ランプの出力及び長さとに応じて選択すればよい。装置内の温度と流体（液体製剤）内の温度は、いずれも制御され、記録される。
【００６５】
この発明で使用する装置及び設備は、血液製剤温度の制御手段、例えば冷凍装置やファンのような冷却手段をも含むことができる。
【００６６】
これらの設備及び装置に使用される種々の材料は、医薬製造基準（ＧＭＰ）を満たし、現場で衛生的に処理できる本質的に使い捨ての物質、例えばステンレススチール３１６Ｌやテフロン（登録商標）などであることが好ましい。
【００６７】
Ｃタイプ紫外線によるウィルス不活性化装置は、血液製剤の処理及び分離工程の下流、例えば、血液製剤の殺菌濾過工程の手前、または限外濾過工程の後方に配置することが好ましい。この発明で使用する装置は、簡単かつ小型の携帯可能な装置であるから、血液製剤の製造、精製または分離設備に大がかりな変更を加えることなく、あらゆる種類の血液製剤のウィルス不活性化に使用できる。
【００６８】
この発明で使用する装置及び設備は、単一ブロックとして、または直列または並列に配置されたポータブル・モジュールとして構成することができる。処理すべき血液製剤が受ける照射線量は極めて低く、１０〜２０００ジュール／ｍ２、好ましくは２３０〜４００ジュール／ｍ２程度である。意外にも、このような照射線量で所要のウィルス不活性化を達成できる。
【００６９】
紫外線ランプの出力は、処理される血液製剤の完全性を保持できるように、４〜１３２ワット、好ましくは８〜６０ワットの範囲に設定する。なお、この発明の方法を利用すれば、血液製剤（特に凝固因子、フィブリノーゲンまたは免疫グロブリン）の活性が著しい影響を受けることはない（活性の低下は、平均して５％以下）。
【００７０】
この発明で使用する設備のＵＶランプは、商品名ＳＰＡのタイプ、特にＡＱＵＡＦＩＮ ＶＡＬＥＮＣＩＡ社（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）の製品であることが好ましい。
【００７１】
下記の例では、パルボウィルス及びその他のエンベロープのないウィルスに感染している血液製剤サンプルから得られた種々のウィルス不活性化測定値を示す。
【実施例】
【００７２】
１．材料及び方法
ヒトのパルボウィルスを使用することによって起こる問題及びこれらのパルボウィルス、特にパルボウィルスＢ１９をインビトロ培養することに伴う問題を考慮して、形状及びサイズが極めて似ているマウスのパルボウィルスＭＶＭｐを、パルボウィルスＢ１９の不活性化方法開発のモデルとして使用する。マウスのパルボウィルスＭＶＭｐを選択した理由は、このタイプのパルボウィルスが紫外線照射または温度変更による不活性化に対してパルボウィルスＢ１９よりも感度が低いことにある。
【００７３】
試験は、エンベロープのないＲＮＡウィルスの不活性化との比較において行う。
【００７４】
ＥＭＣウィルス（脳心筋炎ウィルス）はピコルナウィルス群に属し、その不活性化はエンベロープのないＲＮＡウィルスのモデルとして検討されている。ＥＭＣウィルスは、ヒトにおけるＡ型肝炎ウィルスによる汚染のモデルとして利用できるマウスのウィルスである。１０６ｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍｌのＥＭＣと１０１０ｐｆｕ／ｍｌのＭＶＭｐとを種々の血液製剤サンプル（低温沈澱物、因子ＶＩＩＩまたは免疫グロブリン）に接種する。
【００７５】
２．活性ウィルスのタイター
ヨーロッパ共同体の勧告（ＥＥＣ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ｎｏｔ ｆｏｒ ｇｕｉｄａｎｃｅ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ １９９１，１９，ｐ．２５１）に従ってウィルス減少指数を測定し、対数減少の形で表わした。タイターの測定は、Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ Ｐ．が記述している方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１０，ｐｐ．５８６−５９０（１９７２））及びＲｕｓｓｅｌｌ Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．が記述している方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，ｐｐ．２８２１−２８２８（１９９２））に従って行うことができる。
【００７６】
パルボウィルスに感染した細胞系として、ＮＢ３２４／ｋヒト細胞系（Ｔｏｔｔｅｒｓａｌｌ ｅｔ ａｌ．，によって記述）及びＬ９２９系（Ａ９ ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．４系のクローン９２９）を選択した。
【００７７】
滴定は、放射性標識プローブを利用して感染中心のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法によって行うことができる。検出は、ニトロセルロース・フィルターで行われる。ウィルスタイターの測定は、溶菌プラークまたは限界希釈法（ＴＣＩＤ５０−ｓｐｅｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法）によって行われる。
【００７８】
この発明の方法で処理される血液製剤は、血漿の低温沈澱物、あらかじめ溶剤／清浄剤で処理されているか、あるいは処理されていない因子ＶＩＩＩ，フィブリノーゲン及び免疫グロブリンである。
【００７９】
３．結果
この発明の方法（各工程）及びそれを実施するための装置は、ヨーロッパの関係機関が要求する実施条件（ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６８／９５及びＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６９／９５−それぞれ１９９６年８月１４日及び９月１３日から発効（参考のためこの明細書中に引用））に合致する。これらの機関の勧告（§５．２．１（１）ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６９／９５）通り、この発明の方法及びそれを実施するための装置は、エンベロープのないウィルス、特にパルボウィルスに対する有効処理工程を少なくとも１つ含んでいる（§５．２．２(ｉｉｉ)）。この発明は、特に不活性化条件、即ち、５〜９対数減少（Ａｎｎｅｘ Ｉ ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６８／９５参照）を満たしている。即ち、接種されたウィルスを残らず排除することができる。事実、発明者は、処理後、検出閾値以上のウィルス増殖を観察できなかった。
【００８０】
図４に示すように、紫外線照射量を増大させると、因子ＶＩＩＩのような血液派生物質の不活性化が促進される。しかし、意外な所見として、Ｃタイプ紫外線を照射することにより、因子ＶＩＩＩを含む溶液に接種されたパルボウィルスを、血液派生物質の活性をほとんど損なうことなく低い照射線量で不活性化できる（図５参照）。
【００８１】
下に掲げる表１には、免疫グロブリンを含む組成物に接種されたウィルスの対数減少（ｌｏｇ１０）を示す。この対数減少値は、前記免疫グロブリンが受けるＣタイプ紫外線照射量の増加に対応させて示してある。
【００８２】
【表１】
【００８３】
溶液中の免疫グロブリン濃度は、２ｍｇ／ｍｌである。
他の処理ずみ血液製剤でも同様の結果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】この発明に係る方法を実施するための装置の例を略示する斜視図である。
【図２】この発明に係る方法を実施するための装置の例を略示する斜視図である。
【図３】その装置の細部を略示する斜視図である。
【図４】因子ＶＩＩＩが受ける紫外線照射線量を増加させながら、発色性媒質中で測定した因子ＶＩＩＩ活性の保持％を示すグラフである。
【図５】紫外線照射線量を増加させながら、処理される因子ＶＩＩＩ溶液に接種されたパルボウィルスＭＶＭｐを滴定した結果を示すグラフである。照射線量は、照射された線量であり、この測定結果を対数値で表わしてある。
【符号の説明】
【００８５】
６ 石英管
【技術分野】
【０００１】
この発明は、血液製剤、特に全血、血漿、血液細胞成分から成る液体、生物工学によって得られる非天然製品をも含めて、例えば凝固因子（因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、フォン・ウィルブラント因子など）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、免疫グロブリン、アルブミンなどのような血液製剤、に含まれる汚染物質を不活性化する方法に関わり、前記方法を実施する装置についても言及する。
この発明は、本発明の方法によって処理された血液製剤及び前記血液製剤を含む医薬用及び／または化粧品用組成物にも係わる。
【背景技術】
【０００２】
治療または治療以外の目的で血液製剤を利用できるようにするためには、高純度の、好ましくは、汚染物質、特にウィルス性汚染物質を含まない製剤の実現を可能にする精製技術が必要である。
【０００３】
血液製剤中のウィルス性汚染物質としては、エンベロープのあるウィルス（ＨＩＶ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ及びＧ型肝炎ウィルスなど）やエンベロープのないウィルス（Ａ型肝炎ウィルス、パルボウィルスなど）が挙げられる。
【０００４】
永年にわたって、種々の国際または国内機関が、ウィルス性汚染物質を含んだままで治療または治療以外の目的に使用されるのを防止するため、血液製剤の製造に関して年々きびしい基準を導入している（条令６５／６５ＥＥＣ，７５／３１９／ＥＥＣ及び８９／３８１ＥＥＣ）。
【０００５】
ヨーロッパのレベルでは、エンベロープのあるウィルスまたはエンベロープのないウィルスに対していくつかの処理を施すようにＣＰＭＰ基準（ＣＰＭＰ／ＢＷＴ２６８／９５及び２６９／９５）が要求している。
【０００６】
凝固因子の調製に際して、（乾式または湿式）加熱または低温殺菌による不活性化処理がＡ型肝炎ウィルスに対して有効であることは公知である。しかし、その他のエンベロープのないウィルス、特にパルボウィルスに対しては必ずしも有効ではない。
【０００７】
他方、（溶剤−清浄剤の添加による）化学的不活性化処理がエンベロープのあるウィルスに対して有効であることも公知である。しかし、この処理はエンベロープのないウィルスに対しては無効である。
【０００８】
例えばβ−プロピオラクトンのような化学的物質を利用することも公知である。この方法は、エンベロープのないウィルスの処理には有効であるが、処理されるプロテインを変性させるという欠点がある。
【０００９】
ｐＨを４以下に調整することによる長時間処理、またはプロテアーゼの添加が、例えばパルボウィルスのようなエンベロープのないウィルスの活性化を可能にすることも公知である。しかも、このような処理は、処理されるプロテインの配座（コンフォーメーション）や構造を変化させる。
【００１０】
従って、血液製剤のウィルス不活性化に利用できる公知の物理化学的処理は、ほとんど例外なく、毒性が高いか、処理されるプロテインの配座を著しく変化させるか、あるいは、エンベロープのないウィルス、特にパルボウィルスの処理に効果を発揮できない。
【００１１】
パルボウィルスは、ヒトを含めて多くの動物に感染する小型のエンベロープのないＤＮＡウィルスである（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１−３０，“Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ”，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｅｙｍｏｕｒ Ｓ．Ｂｌｏｃｋ，Ｅｄ．Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ−Ｌｏｎｄｏｎ）。パルボウィルスは風土性であり、多様な疾病の原因となり、病状は宿主の発育状態に応じて異なる。
【００１２】
ヒトに特有の病源として判明しているのは、パルボウィルスＢ１９だけである。マウスのパルボウィルスＨ１もヒトに感染する可能性がある。
【００１３】
健常なヒトがパルボウィルスＢ１９に感染した場合、症候が全く現われないか、または良性腫瘍が発現する（例：幼児の伝染性紅斑（ｃｉｎｑｕｉｅｍｅ ｍａｌａｄｉｅ ｃｈｅｚｌ’ｅｎｆａｎｔ））。
【００１４】
他方、免疫不全患者または血液障害患者の場合には慢性貧血の原因となったり、一過性形成不全に陥り、溶血性貧血の原因となったりする。
【００１５】
胎盤を通過すれば、子宮内死の原因となる。パルボウィルスＢ１９はヒト造血細胞の赤血球系に対して顕著な走性を示す。
【００１６】
最近の疫学的調査によれば、フランスにおいて成人の５０〜６０％と１〜１５才の未成年者の３６％が血清学的に陽性のパルボウィルスを持っている。
【００１７】
複数バッチの精製因子ＶＩＩＩ濃縮液中で遺伝子増幅（ＰＣＲ）を行うことにより、採用するウィルス不活性化方法に関係なく、ウィルスＤＮＡのプロセスが立証された。
【００１８】
このことは、１９８８年以来フランスで使用されている、エンベロープのあるウィルス（ＨＩＶ，ＨＢＶ，ＨＣＶ）で汚染されていない高純度因子ＶＩＩＩ濃縮液（ＦＶＩＩＩ ＴＨＰＳＤ）を誕生以来投与されている未成年の血友病患者の８５％において、臨床的徴候ではなく、Ｂ１９+を血清学的に検出することによって立証された（Ｙ．Ｌａｕｒｉａｕ ｅｔ ａｌ．，１ｅｒｃｏｎｇｒｅｓ ｄｅ ｌａ Ｓｏｃｉｅｔｅ Ｆｒａｎｃａｉｓｅ ｄｅ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ［１ｓｔ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｒｅｎｃｈ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ］（１９９４））。
【００１９】
この観察結果から明らかなように、血液製剤からパルボウィルス、特にパルボウィルスＢ１９を排除する新しいウィルス不活性化方法がない限り、汚染の可能性は高い。
【００２０】
パルボウィルスは高温においても極めて耐性が高い。その赤血球凝集性と感染性は、クロロホルムや各種酸のような化学物質による処理にも影響を受けず、ＲＮａｓｅ，ＤＮａｓｅ，パパインまたはトリプシンを利用した酵素消化にも耐える。
【００２１】
国際特許出願ＷＯ９５／００６３１（特許文献１）はＵＶＡ照射によって光活性化可能で、血液製剤中に存在するウィルスに対して毒性を示す物質を血液製剤に添加してウィルスを不活性化する方法を開示している。この方法は、血液製剤からこの毒性試薬を分離することによって、血液製剤がこの毒性試薬に汚染されるのを防ぐ工程を含む。
【００２２】
毒性試薬としてはプソラレンが代表的である。
【００２３】
しかし、この方法に伴う欠点として、処理された血液製剤からこれらの光活性化可能な物質が完全に除去されるとの保証はなく、もしこれが残留しておれば、処理された血液製剤を変性及び／または不活性化するおそれがあり、たとえ少量ずつでもこれを繰り返し注射すれば、ヒトまたは動物に毒性による身体障害を発生させることになる。
【００２４】
紫外線照射によって一度に多数の製剤を殺菌できることも公知である。特に文献“Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ”（ｃｈａｐｔｅｒ３１，ＩＬ ＳＨＥＣＨＭＥＩＳＴＥＲ）（非特許文献１）から、紫外線照射がウィルス、マイコプラズマ、細菌、かびのような汚染物を破壊できることは公知である。このような照射は、特に気体や液体のような媒質中で利用することができることは公知である。
【００２５】
ルチンなどのような抗酸化剤の存在下において、または不存在下において、血液製剤にＣタイプ紫外線を照射し、エンベロープのないウィルス、特にパルボウィルスを不活性化する方法もＣｈｉｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．の文献（Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌｕｍｅ ８６，Ｎｏ．１１，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９５，ｐ．４３３１−４３３６）（非特許文献２）から公知である。
【００２６】
また、公知のウィルス不活性化方法は、血液製剤の完全性及び活性（特に因子ＶＩＩＩのような凝固因子の立体配座）に、従って製剤の活性に影響を及ぼす可能性がある。
【００２７】
さらにまた、公知のウィルス不活性化方法は、再現性またはモニタリングに問題があるため、有効性の確認が困難な場合が多い。即ち、特に乾式加熱によって処理する際に湿度をモニターしなければならない場合、いくつかの処理パラメータは、変更せざるを得ないかまたは容易に維持することができない。しかも、処理の各工程を制御することは困難である。
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ９５／００６３１
【非特許文献１】“Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ”（ｃｈａｐｔｅｒ３１，ＩＬ ＳＨＥＣＨＭＥＩＳＴＥＲ
【非特許文献２】Ｃｈｉｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．の文献（Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌｕｍｅ ８６，Ｎｏ．１１，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９５，ｐ．４３３１−４３３６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
この発明の目的は、公知技術の欠点を残すことなく、簡単、迅速、低コスト、高再現性で、血液製剤中に存在する汚染物質を不活性化する新しい方法及び装置を提供することにある。
【００２９】
この発明の他の目的は、血液製剤、特に因子ＶＩＩＩ，因子ＩＸ，フォン・ウィルブラント因子、フィブロネクチン、フィブリノーゲンなどのような凝固因子の完全性を維持するウィルス不活性化方法を開発することにある。
【００３０】
この発明のさらに他の目的は、容易に実施でき、医薬品製造基準（ＧＭＰ）及びヨーロッパ基準（ＣＰＭＰ）に合致する方法及び装置を提供することにある。
【００３１】
この発明のさらなる目的は、エンベロープのない、好ましくは一本鎖のウィルス、例えばパルボウィルス、特にパルボウィルスＢ１９及びＨ１の不活性化を可能にする、血液製剤のウィルス不活性化方法及び装置を提供することにある。本発明はまた、血液製剤の活性に影響を及ぼすことなく、前記汚染物質、特にエンベロープのないウィルス、例えば、パルボウィルス、特にパルボウィルスＢ１９及びＨ１を含まない血液製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
この発明は、血液製剤中に存在するパルボウィルス、特にパルボウィルスＢ１９及びＨ１を不活性化する方法に係わり、この方法では前記血液製剤にＣタイプ紫外線を１回または２回以上照射する。
【００３３】
“血液製剤”とは、ヒトまたは動物の身体から直接的にまたは合成工程を経て得られる液状または固形のあらゆる血液製剤、例えば、全血、血液細胞成分、血液派生物質、例えば、血清または血漿、及び血中プロテイン成分、即ち凝固因子（因子ＶＩＩＩ，因子ＩＸ，フォン・ウィルブラント因子など）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、免疫グロブリン、アルブミンなどのほか、生物工学によって得られる組換えプロテインまたは合成ペプロチドのようなプロテイン成分を意味するものとする。
【００３４】
インターフェロン、インターロイキン、またはこれらの分子のレセプターのような特異的な血液細胞系によって形成され、天然に、または合成工程を経て得られる因子、例えば、組換えＤＮＡ技術によって得られる組換えペチドまたはプロテインも血液製剤である。この発明の方法は、血液製剤中に存在する可能性がある他の汚染物質、例えば、エンベロープのないウィルス（ＨＡＶ）、エンベロープのあるウィルス（ＨＩＶ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ及びＧ型肝炎ウィルスなど）、細菌類などの不活性化をも可能にする。
【００３５】
この発明の方法は、汚染物質、特にウィルス性汚染物質を不活性化するための、当業者には公知の１つまたは２つ以上の処理方法、特に物理的または化学的ウィルス不活性化処理と組合わせることができる。これらの補足的処理は、１回または２回以上の乾式または湿式加熱処理、化学的成分、特に溶剤−清浄剤または紫外線下で活性化する物質の添加、１回または２回以上の低温殺菌処理、γ線やＸ線などのような特定放射線による１回または２回以上の照射、及びこれらの処理方法の組合わせから成るグループから選択される。血液製剤に添加できる活性物質の例として、遊離基に対して保護機能を果す物質（ビタミンＣなど）やプロテインのアルキル化現象を起こさせるβ−プロピオラクトンを挙げることができる。このような物質は毒性現象を起こしたり、処理される血液製剤を変性させない投与量で使用しなければならない。ただし、エンベロープのないウィルスを不活性化したり、遊離基から保護したりするためには、このような物質を添加しなくても、この発明に従って使用される線量なら照射だけで充分である。
【００３６】
本発明のウィルス不活性化方法は、全血から血液派生物質を単離または分離する一般的な方法と組合わせることができる。
【００３７】
この単離または分離方法としては、全血の各種成分を互いに分離することを可能にする１回または２回以上の濾過、沈澱またはクロマトグラフィー分離処理を利用することができる。
【００３８】
この発明では、ＵＶＣ線の大部分が２５０〜２７０ｎｍ、好ましくは２５４ｎｍの波長で、即ち、核酸の吸収に好ましい波長域で照射され、血液製剤が受ける照射線量は、１０〜２０００ジュール／ｍ２、好ましくは２３０〜４００ジュール／ｍ２である。
【００３９】
この発明の方法においては、処理される血液製剤中に存在するペプチドまたはプロテインの構造を破壊することなく、血液製剤に照射される線量が汚染物質の核酸に対して本質的に作用するように照射線量及び波長を選択する。
【００４０】
予想外のことであるが、従来なら血液製剤の処理は薄層（“単分子層”またはいわゆる積層）の状態でのみ可能であったが、実は薄層の状態でなくても可能であるとの所見を得た。即ち、もはや処理量を制限する要因は全くない。薄層状態にない血液製剤を処理することによって、薄層状態で処理する場合に固相／液相界面に発生する破壊現象を回避できるから、この性質は極めて有益である。しかも、薄層状態で処理しないことで、多量の血液製剤を処理することができ、処理される血液製剤の加熱及びシャリングを回避できる（ＢＡＩＬＥＹ，Ｂｉｏｃｈ．Ｆｏｎｄ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）。
【００４１】
ＵＶＣ線の放射波長及び照射線量は当業者なら、処理すべき血液製剤の量と種類とに応じて調整することができる。処理すべき血液製剤が受ける照射線量が高ければ高いほど、存在する汚染物質の不活性化効果も高くなる。しかし、血液製剤の変性現象を軽減するため、当業者ならＵＶＣ放射波長の照射量を調整することにより、前記血液製剤の変性と活性損を軽減するであろう。この調整は、ヨーロッパＣＰＭＰ基準（ＣＰＭＰ／ＢＷＰ２６８／９５及び２６９／９５）に従って行われる。
【００４２】
照射線量を制限して前記製剤の活性損を１０〜１５％、好ましくは５％以下に抑制しながら、完全なウィルス不活性化を達成することができる（即ち、もはや検出閾値以上のウィルスを検出することはできない）。
【００４３】
この発明では、血液製剤中に存在するパルボウィルス、特にパルボウィルスＢ１９及びＨ１を、この発明の方法を活用することで不活性化する装置についても言及する。
【００４４】
この装置は、本質的にはＣタイプ紫外線放射源、即ち、その波長が処理すべきウィルスの核酸による紫外線吸収に最適な２３０〜２７０ｎｍ、好ましくは約２５４ｎｍである紫外線放射源に係わる。この装置において、放射線が処理すべき血液製剤に向けられる。
【００４５】
この装置では、処理すべき血液製剤に１０〜２０００ジュール／ｍ２の線量、好ましくは２３０〜４００ジュール／ｍ２の線量を照射することができる。
【００４６】
この発明では、上記不活性化装置を含む製造設備についても言及する。
【００４７】
この製造設備は、全血から血液派生物質の単離または分離を可能にする装置をも含む。
【００４８】
製造設備に含まれるこれらの装置としては、処理すべき血液製剤を沈澱、遠心分離／デカンテーション、濾過、濃縮または透析する手段等が考えられ、これらの装置は、当業者ならば血液製剤の種類に応じて調整することができる。
【００４９】
Ｃタイプ紫外線の照射を受ける血液製剤は、Ｃタイプ紫外線の放射波長域をほとんど吸収しない石英管またはポリマー材からなる管に収容するのが好ましい。
【００５０】
製造設備は、紫外線の作用下に発生する可能性がある遊離基から保護する物質を血液製剤に添加するための装置をも含むことができる。このような保護剤としては、アスコルビン酸ナトリウム、グルタチオンのようなビタミンのほか、当業者にとって公知のその他の物質（ＳＯＤ）を挙げることができる。製造設備はさらに、処理すべき血液製剤中に存在する汚染物質を不活性化できる種々の化学物質を血液製剤に添加するための装置をも含むことができる。添加される物質は、紫外線の作用下で活性化し、この発明の方法と組合わせることで前記血液製剤中に存在する他の汚染物質に対する相乗効果を発揮できる物質であればよい。ただし、特に薄層状態の血液製剤に応用される不透過ＵＶ線の場合とは異なり、この発明では、薄層を利用したり、ウィルス不活性化のために有毒添加物を添加しなくても血液製剤を処理することができる。
【００５１】
この発明は、この発明の方法によって得られる、ウィルス性汚染物質を含まない、特にエンベロープのない一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡウィルス、具体的にはパルボウィルスＢ１９及び／またはＨ１を含まない血液製剤にも係わり、特に、その活性の８５％以上、好ましくは９５％以上を維持できることを特徴とする凝固因子のような血液派生物質にも係わる。効果損の測定は、当業者に公知の方法で行われる。
【００５２】
この発明は、前記血液製剤を含む医薬品用及び／または化粧品用組成物（例えば生物接着剤）にも係わる。この発明の実施形態を添付の図面に沿って以下に詳述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
図１〜３には、この発明で使用する血液製剤製造設備を示した。
【００５４】
この設備１は、因子ＶＩＩＩまたはフィブリノーゲンのような血液製剤の沈澱、遠心分離／デカンテーション、濾過及び透析に使用され、処理すべき血液製剤に応じて当業者が適応させることができる装置（２，３）を含む。
【００５５】
製造設備は、物理的処理によって前記血液製剤のウィルス不活性化を行うこの発明を実施するための装置４をも含む。
【００５６】
この発明で使用する血液製剤は、ポンプによって装置４と対向する石英管６に送入される。
【００５７】
装置４は、放射の９０％以上が２３０〜２７０ｎｍで、好ましくは約２５４ｎｍの波長で行われるＵＶランプ７、好ましくは消毒用ＵＶ管形ランプを含む。このランプは、円筒形などの反射チェンバ８内に設けられ、反射チェンバ８はその焦点に配置された石英管６に向かってＵＶ線を送る。
【００５８】
この発明で使用する装置では、石英管６内を循環する血液製剤とＵＶランプ７との接触はあり得ない。
【００５９】
バッフルまたは窒素添加などのような乱流システムを利用することによって、石英管６内の流れを均質化することができる。
【００６０】
製造設備は、ポンプ５、及び処理すべき血液製剤の流量を制御し、ＵＶランプ７の前を通過する血液製剤の通過時間を変化させることを可能にする流量計１１をも含む。
【００６１】
さらに、石英管６とＵＶランプ７との間に１つまたは２つ以上のスクリーン９を設けることができる。スクリーンを適当に選択することにより、処理すべき血液製剤への照射線量を変え、特定の放射波長を選択することができる。使用するＵＶランプの選択（出力の異なるランプを使用できる）、使用するスクリーンの選択、及びランプの前を通過する血液製剤の速度の調整によって、処理すべき血液製剤への照射線量を変えることもできる。これらの調整は、当業者なら、処理すべき血液製剤の量及び種類に応じて行うことができる。
【００６２】
ＵＶランプとは反対の側に、石英管６を照射するＣタイプ紫外線量を（従って、血液製剤が受ける照射線量を）制御するシステム１０を配置する。
【００６３】
この制御システム１０は、図示のように、好ましくは石英管６の両側に、必要ならスクリーン９の両側に配置されて、処理すべき血液製剤の種類及びＵＶランプ７からの照射線量に応じて当業者が血液製剤の流量を調整できるようにする１つまたは２つ以上のセンサー１２から成る。
【００６４】
血液製剤の滞留時間を調整することにより、照射線量を一定に維持することができる。管の直径は、処理量と消毒ランプの出力及び長さとに応じて選択すればよい。装置内の温度と流体（液体製剤）内の温度は、いずれも制御され、記録される。
【００６５】
この発明で使用する装置及び設備は、血液製剤温度の制御手段、例えば冷凍装置やファンのような冷却手段をも含むことができる。
【００６６】
これらの設備及び装置に使用される種々の材料は、医薬製造基準（ＧＭＰ）を満たし、現場で衛生的に処理できる本質的に使い捨ての物質、例えばステンレススチール３１６Ｌやテフロン（登録商標）などであることが好ましい。
【００６７】
Ｃタイプ紫外線によるウィルス不活性化装置は、血液製剤の処理及び分離工程の下流、例えば、血液製剤の殺菌濾過工程の手前、または限外濾過工程の後方に配置することが好ましい。この発明で使用する装置は、簡単かつ小型の携帯可能な装置であるから、血液製剤の製造、精製または分離設備に大がかりな変更を加えることなく、あらゆる種類の血液製剤のウィルス不活性化に使用できる。
【００６８】
この発明で使用する装置及び設備は、単一ブロックとして、または直列または並列に配置されたポータブル・モジュールとして構成することができる。処理すべき血液製剤が受ける照射線量は極めて低く、１０〜２０００ジュール／ｍ２、好ましくは２３０〜４００ジュール／ｍ２程度である。意外にも、このような照射線量で所要のウィルス不活性化を達成できる。
【００６９】
紫外線ランプの出力は、処理される血液製剤の完全性を保持できるように、４〜１３２ワット、好ましくは８〜６０ワットの範囲に設定する。なお、この発明の方法を利用すれば、血液製剤（特に凝固因子、フィブリノーゲンまたは免疫グロブリン）の活性が著しい影響を受けることはない（活性の低下は、平均して５％以下）。
【００７０】
この発明で使用する設備のＵＶランプは、商品名ＳＰＡのタイプ、特にＡＱＵＡＦＩＮ ＶＡＬＥＮＣＩＡ社（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）の製品であることが好ましい。
【００７１】
下記の例では、パルボウィルス及びその他のエンベロープのないウィルスに感染している血液製剤サンプルから得られた種々のウィルス不活性化測定値を示す。
【実施例】
【００７２】
１．材料及び方法
ヒトのパルボウィルスを使用することによって起こる問題及びこれらのパルボウィルス、特にパルボウィルスＢ１９をインビトロ培養することに伴う問題を考慮して、形状及びサイズが極めて似ているマウスのパルボウィルスＭＶＭｐを、パルボウィルスＢ１９の不活性化方法開発のモデルとして使用する。マウスのパルボウィルスＭＶＭｐを選択した理由は、このタイプのパルボウィルスが紫外線照射または温度変更による不活性化に対してパルボウィルスＢ１９よりも感度が低いことにある。
【００７３】
試験は、エンベロープのないＲＮＡウィルスの不活性化との比較において行う。
【００７４】
ＥＭＣウィルス（脳心筋炎ウィルス）はピコルナウィルス群に属し、その不活性化はエンベロープのないＲＮＡウィルスのモデルとして検討されている。ＥＭＣウィルスは、ヒトにおけるＡ型肝炎ウィルスによる汚染のモデルとして利用できるマウスのウィルスである。１０６ｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍｌのＥＭＣと１０１０ｐｆｕ／ｍｌのＭＶＭｐとを種々の血液製剤サンプル（低温沈澱物、因子ＶＩＩＩまたは免疫グロブリン）に接種する。
【００７５】
２．活性ウィルスのタイター
ヨーロッパ共同体の勧告（ＥＥＣ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ｎｏｔ ｆｏｒ ｇｕｉｄａｎｃｅ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ １９９１，１９，ｐ．２５１）に従ってウィルス減少指数を測定し、対数減少の形で表わした。タイターの測定は、Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ Ｐ．が記述している方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１０，ｐｐ．５８６−５９０（１９７２））及びＲｕｓｓｅｌｌ Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．が記述している方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，ｐｐ．２８２１−２８２８（１９９２））に従って行うことができる。
【００７６】
パルボウィルスに感染した細胞系として、ＮＢ３２４／ｋヒト細胞系（Ｔｏｔｔｅｒｓａｌｌ ｅｔ ａｌ．，によって記述）及びＬ９２９系（Ａ９ ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．４系のクローン９２９）を選択した。
【００７７】
滴定は、放射性標識プローブを利用して感染中心のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法によって行うことができる。検出は、ニトロセルロース・フィルターで行われる。ウィルスタイターの測定は、溶菌プラークまたは限界希釈法（ＴＣＩＤ５０−ｓｐｅｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法）によって行われる。
【００７８】
この発明の方法で処理される血液製剤は、血漿の低温沈澱物、あらかじめ溶剤／清浄剤で処理されているか、あるいは処理されていない因子ＶＩＩＩ，フィブリノーゲン及び免疫グロブリンである。
【００７９】
３．結果
この発明の方法（各工程）及びそれを実施するための装置は、ヨーロッパの関係機関が要求する実施条件（ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６８／９５及びＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６９／９５−それぞれ１９９６年８月１４日及び９月１３日から発効（参考のためこの明細書中に引用））に合致する。これらの機関の勧告（§５．２．１（１）ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６９／９５）通り、この発明の方法及びそれを実施するための装置は、エンベロープのないウィルス、特にパルボウィルスに対する有効処理工程を少なくとも１つ含んでいる（§５．２．２(ｉｉｉ)）。この発明は、特に不活性化条件、即ち、５〜９対数減少（Ａｎｎｅｘ Ｉ ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６８／９５参照）を満たしている。即ち、接種されたウィルスを残らず排除することができる。事実、発明者は、処理後、検出閾値以上のウィルス増殖を観察できなかった。
【００８０】
図４に示すように、紫外線照射量を増大させると、因子ＶＩＩＩのような血液派生物質の不活性化が促進される。しかし、意外な所見として、Ｃタイプ紫外線を照射することにより、因子ＶＩＩＩを含む溶液に接種されたパルボウィルスを、血液派生物質の活性をほとんど損なうことなく低い照射線量で不活性化できる（図５参照）。
【００８１】
下に掲げる表１には、免疫グロブリンを含む組成物に接種されたウィルスの対数減少（ｌｏｇ１０）を示す。この対数減少値は、前記免疫グロブリンが受けるＣタイプ紫外線照射量の増加に対応させて示してある。
【００８２】
【表１】
【００８３】
溶液中の免疫グロブリン濃度は、２ｍｇ／ｍｌである。
他の処理ずみ血液製剤でも同様の結果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】この発明に係る方法を実施するための装置の例を略示する斜視図である。
【図２】この発明に係る方法を実施するための装置の例を略示する斜視図である。
【図３】その装置の細部を略示する斜視図である。
【図４】因子ＶＩＩＩが受ける紫外線照射線量を増加させながら、発色性媒質中で測定した因子ＶＩＩＩ活性の保持％を示すグラフである。
【図５】紫外線照射線量を増加させながら、処理される因子ＶＩＩＩ溶液に接種されたパルボウィルスＭＶＭｐを滴定した結果を示すグラフである。照射線量は、照射された線量であり、この測定結果を対数値で表わしてある。
【符号の説明】
【００８５】
６ 石英管
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液製剤にＣタイプ紫外線を１回以上照射して前記血液製剤中に存在するウィルスを不活性化する方法において、
前記血液製剤に前記Ｃタイプ紫外線を照射するために石英管または前記Ｃタイプ紫外線を吸収しないポリマー材から成る管の中で前記血液製剤を循環させることと、
乱流システムにより前記管内を循環する前記血液製剤の流れを均質化することによって、前記管では、薄層状態にない前記血液製剤を処理し、前記血液製剤が薄層状態である場合に前記管の固相／液相界面に発生する破壊現象を回避することとを特徴とする前記ウィルスを不活性化する方法。
【請求項２】
前記乱流システムが、バッフルおよび窒素添加のいずれかである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液製剤が血清、血漿及び血中プロテイン成分から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記血中プロテイン成分が凝固因子であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記凝固因子が、因子ＶＩＩＩ，因子ＩＸ，フォン・ウィルブラント因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチンから成るグループから選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記血中プロテイン成分が免疫グロブリン、アルブミンから成るグループから選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｃタイプ紫外線の照射が２５０〜２７０ｎｍで行われることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃタイプ紫外線の照射が２５４ｎｍを含む波長で行われることを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
１つ以上の物理的および化学的いずれかのウィルス不活性化処理と組合わせることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記物理的ウィルス不活性化処理に１回以上の加熱工程が含まれることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
全血から前記血液製剤を単離または分離する方法と組合わせることを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
血液製剤にＣタイプ紫外線を１回以上照射して前記血液製剤中に存在するウィルスを不活性化する方法において、
前記血液製剤に前記Ｃタイプ紫外線を照射するために石英管または前記Ｃタイプ紫外線を吸収しないポリマー材から成る管の中で前記血液製剤を循環させることと、
乱流システムにより前記管内を循環する前記血液製剤の流れを均質化することによって、前記管では、薄層状態にない前記血液製剤を処理し、前記血液製剤が薄層状態である場合に前記管の固相／液相界面に発生する破壊現象を回避することとを特徴とする前記ウィルスを不活性化する方法。
【請求項２】
前記乱流システムが、バッフルおよび窒素添加のいずれかである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液製剤が血清、血漿及び血中プロテイン成分から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記血中プロテイン成分が凝固因子であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記凝固因子が、因子ＶＩＩＩ，因子ＩＸ，フォン・ウィルブラント因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチンから成るグループから選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記血中プロテイン成分が免疫グロブリン、アルブミンから成るグループから選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｃタイプ紫外線の照射が２５０〜２７０ｎｍで行われることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃタイプ紫外線の照射が２５４ｎｍを含む波長で行われることを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
１つ以上の物理的および化学的いずれかのウィルス不活性化処理と組合わせることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記物理的ウィルス不活性化処理に１回以上の加熱工程が含まれることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
全血から前記血液製剤を単離または分離する方法と組合わせることを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−７７７０７（Ｐ２００９−７７７０７Ａ）
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０７６０８（Ｐ２００８−２０７６０８）
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【分割の表示】特願平９−５０６１００の分割
【原出願日】平成８年７月１５日（１９９６．７．１５）
【出願人】（５０９０１７３３２）サルトリアス ステディム バイオテック ジーエムビーエイチ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【分割の表示】特願平９−５０６１００の分割
【原出願日】平成８年７月１５日（１９９６．７．１５）
【出願人】（５０９０１７３３２）サルトリアス ステディム バイオテック ジーエムビーエイチ (1)
【Ｆターム（参考）】
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