血管形成抑制剤
【課題】血管形成を抑制する治療剤、固形癌に対する治療剤、及び血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤、ＣＸＣＲ４の作用を増強する物質を有効成分として含有する組織を修復する治療剤を提供する。
【解決手段】ＣＸＣＲ４ノックアウトマウスにおいて血管の形成が抑制されるという知見に基づき、ＣＸＣＲ４の作用を阻害する物質を有効成分として含有する血管形成を抑制する治療剤、固形癌に対する治療剤、及び血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤。
【解決手段】ＣＸＣＲ４ノックアウトマウスにおいて血管の形成が抑制されるという知見に基づき、ＣＸＣＲ４の作用を阻害する物質を有効成分として含有する血管形成を抑制する治療剤、固形癌に対する治療剤、及び血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＸＣＲ４阻害剤を有効成分として含有する、新規血管形成抑制剤、抗固形癌剤、また、血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤に関する。さらに本発明はＣＸＣＲ４増強剤を有効成分として含有する組織修復剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、腫瘍細胞が血管外に浸潤する際に、血管内皮細胞が開裂することが知られている。また、癌の増殖や転移には血管新生が深くかかわっており、腫瘍細胞が種々の血管新生因子を産生、放出することも知られている。特に、固形腫瘍の増殖には血管の新生が必須とされている。
【０００３】
このため血管新生を阻害する物質は新しい作用機序を有する制癌剤になる可能性があるため、ステロイド剤や微生物代謝産物などいくつかのタイプの血管新生阻害物質がすでに試みられている（「がんの浸潤・転移研究マニュアル」がん転移研究会編、金芳堂発行、１９９４年、１５９〜１８２ページ）が、癌の増殖、転移をより効果的に抑制する作用を有する新規な血管新生阻害物質の発見が切望されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、癌の増殖、浸潤、転移をより効果的に抑制する作用を有するケモカインレセプター阻害剤を含む血管形成抑制剤、抗固形癌剤、また、血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤を提供する。さらに本発明は、ケモカインレセプター増強剤を有効成分として含有する組織修復剤を提供することを目的とする。
【０００５】
すなわち、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進めた結果、ＣＸＣケモカインであるプレ−Ｂ細胞成長刺激因子／基質細胞誘導因子（以下ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１またはＳＤＦ−１とする）およびケモカインレセプターであるＣＸＣＲ４のノックアウトマウスを作製し、該マウスの血管の形成が抑制されること、すなわち、ＣＸＣＲ４を抑制することにより血管形成が抑制されることを見出した。係る知見は、ケモカインレセプターＣＸＣＲ４が血管新生にとって必須であることを意味する。
【０００６】
生体組織の血管新生は、一般的に成長過程において特異的な機能を実現するため、すでに存在する血管系の再構成により起こる。初期の血管系において必須の分子は、そのほとんどがレセプターチロンシンキナーゼとそのリガンドであることが変異マウスの分析から決められてきた（Ｒｉｓａｕ，Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ３８６，６７１−６７４（１９９７）、Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．＆Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｐ．Ａ．Ｃｅｌｌ ８７，Ｉ１５８−ｌｌ５５（１９９６）、Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７，２４２−２４５（１９９７））。しかしながら係るマウスの多くは、組織発達前の初期妊娠時に死亡することから、器官形時期の血管形成に必要な物質はいまだ不明であった。
【０００７】
本発明に係るケモカインレセプターＣＸＣＲ４の構造は既に知られている（Ｂｌｅｕｌ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，８２９−８８３（１９９６）、Ｏｂｅｒｌｉｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，８８８−８３５（１９９６）、Ｎａｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，１４７２６−１４７２９（１９９６））。ＣＸＣＲ４は、７回膜貫通Ｇタンパク共役タンパク質であり、ＣＸＣケモカインであるＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１のレセプターである。また、上記因子はＢリンパ球産生、骨髄造血と心室壁形成に必要とされているものである（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，６８５−６８８（１９９６））。また、ＣＸＣＲ４は、Ｔ細胞系親和性のＨＩＶ−１のコレセプターとして機能するものでもある（Ｆｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２，８７２−８７７（１９９６））。ＣＸＣＲ４は、培養内皮細胞に発現していることも報告されている（Ｖｏｌｉｎ，Ｍ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４２，４６−５３（１９９８））。
【０００８】
また、本発明者らは、上記ＣＸＣＲ４が、発生途上の血管内皮細胞に発現すること、ＣＸＣＲ４またはそのリガンドであるＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１を欠くマウスにおいては、消化器系に供給される大型の血管の形成欠陥を示すことを見出した。係る知見は、ＣＸＣＲ４及びＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１シグナル系が消化管を栄養する中動静脈の形成に必須であることを意味する。さらに、本発明者らは、ＣＸＣＲ４を欠くマウスは、胎生致死性であり、ＰＧＳＦ／ＳＤＦ−１を欠くマウスで見られるのと同様であることを見出した。係る知見は、ＣＸＣＲ４がＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の生理的に最も主要なレセプターであることを示唆するものである。
【０００９】
本発明者らによる以上の知見に基づき、癌組織の維持、拡大において血管形成は必須であることから、ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質は血管形成を阻害し、従って、有効な抗癌剤となることが考えられる。
【００１０】
また、同様にＣＸＣＲ４を阻害する物質が、血管新生が関与する疾患の治療剤となることが考えられる。
【００１１】
さらに、ＣＸＣＲ４に基づく作用を促進することで、血管形成を促進し、血管形成が望まれる疾患の治療剤となることが考えられる。
【００１２】
より詳しくは、本発明は、以下にまとめたように、ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を有効成分とする血管形成抑制剤、抗固形癌剤、血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤を提供する。また、本発明はＣＸＣＲ４に基づく作用を増強する物質を有効成分として含有する組織修復剤等を提供する。
【００１３】
すなわち、本発明は、ＣＸＣＲ４阻害剤を有効成分として含有する血管形成抑制剤を提供する。
【００１４】
本発明はまた、ＣＸＣＲ４阻害剤を有効成分として含有する抗固形癌剤を提供する。
【００１５】
本発明はまた、ＣＸＣＲ４阻害剤を有効成分として含有する血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＣＸＣＲ４増強剤を有効成分として含有する組織修復剤を提供する。
【００１７】
ある大きさを超えた癌組織の維持、拡大においてこの中等大動静脈の形成は必須であるため、本発明に係る血管形成抑制剤は、ＣＸＣＲ４またはＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１シグナル系をブロックし、癌組織の維持、拡大を抑制するものである。
【００１８】
また、本発明により得られた知見は、ＣＸＣＲ４及びＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１シグナル系が普遍的な血管形成に働いている可能性を示唆している。従って癌の種類や血管新生を重要な病態形成要因とする疾患によっては、ＣＸＣＲ４及びＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１が病態形成に深く関与している可能性があり、この場合ＣＸＣＲ４またはＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１を単独または他の分子と同時にブロックすることにより、これらの疾患を抑制できる可能性がある。
【００１９】
なお、本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などに対する略号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用に墓づく略号である。それらの例を以下に示す。またアミノ酸の場合は、光学異性体があり得るときは特に明示しない限りＬ体を示す。
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ：アデニン
Ｔ：チミン
Ｇ：グアニン
Ｃ：シトシン
ＲＮＡ：リボ核酸
ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸
ＧあるいはＧｌｙ：グリシン
ＡあるいはＡｌａ：アラニン
ＶあるいはＶａｌ：バリン
ＬあるいはＬｅｕ：ロイシン
ＩあるいはＩｌｅ：イソロイシン
ＳあるいはＳｅｒ：セリン
ＴあるいはＴｈｒ：スレオニン
ＣあるいはＣｙｓ：システイン
ＭあるいはＭｅｔ：メチオニン
ＥあるいはＧｌｕ：グルタミン酸
ＤあるいはＡｓｐ：アスパラキン酸
ＫあるいはＬｙｓ：リシン
ＲあるいはＡｒｇ：アルギニン
ＨあるいはＨｉｓ：ヒスチジン
ＦあるいはＰｈｅ：フェニルアラニン
ＹあるいはＴｙｒ：チロシン
ＷあるいはＴｒｐ：トリプトファン
ＰあるいはＰｒｏ：プロリン
ＮあるいはＡｓｎ；アスパラギン
ＱあるいはＧｌｎ：グルタミン
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＣＸＣＲ４遺伝子の標的戦略を示す図である。ここで、上は野生型ＣＸＣＲ４対立遺伝子を、中は、標的ベクターを、および下は、予想変異対立遺伝子を示す。また、遺伝子の翻訳領域は黒四角で示される。白四角は５’および３’非翻訳領域を示す。点線は、標的ベクターに使用された相同な断片を示す。プローブＡは、サザンハイブリダイゼーション用の外部プローブである。制限酵素位置はそれぞれ、Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｓｈ、ＳｐｈＩ；Ｘ、ＸｈｏＩである。
【図２Ａ】野生型（＋／＋）およびヘテロ変異（＋／−）マウスのテールＤＮＡのサザンブロット分析を示す写真である。プローブＡにより同定された、１１．８ｋｂ野生型および８．２ｋｂ標的対立遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片が示されている。
【図２Ｂ】ＣＸＣＲ４発現のＲＴ−ＰＣＲ増幅分析を示す写真である。全ＲＮＡはＥ１８．５の野生型およびホモ変異胚から調製し、さらにＣＸＣＲ４特異的プライマーで増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅はまた、増幅可能なＲＮＡの存在のコントロールとして、普遍的に発現しているＧ３ＰＤＨ ｍＲＮＡを用いた。
【図３】野生型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１３．５での腸間膜と中腸ループ領域での胃腸系血管欠損を示すものであり、腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。矢印は、野生型腸間膜の小腸に供給する上腸間膜動脈又は静脈よりの大分枝を示す。ｄｕは十二指腸、ｐは中間腸ループの近位を、ｄｍは中間腸ループの末梢部を示す。
【図４】野生型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１３．５での腸間膜の断面での胃腸系血管欠損を示すものであり、腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。ａは動脈、ｖは静脈を示す。
【図５】野生型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１７．５での空腸での胃腸系血管欠損を示すものであり、腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。矢印は、野生型腸間膜の小腸に供給する上腸間膜動脈又は静脈よりの大分枝を示す。
【図６】野生型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１７．５でのより遠位の空腸での胃腸系血管欠損を示すものであり、腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。矢印は、野生型腸間膜の小腸に供給する上腸間膜動脈又は静脈よりの大分枝を示す。
【図７】変異型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１３．５での腸間膜と中腸ループ領域での胃腸系血管欠損を示すものであり、変異型の腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。ｐは中間腸ループの近位を、ｄｍは中間腸ループの末梢部を示す。
【図８】変異型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１３．５での染色した腸間膜の断面での胃腸系血管欠損を示すものであり、変異型の腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。
【図９】異型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１７．５での空腸での胃腸系血管欠損を示すものであり、変異型の腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。
【図１０】変異型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１７．５でのより遠位の空腸での胃腸系血管欠損を示すものであり、変異型の腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。
【図１１】変異型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１６．５での変異マウスの未染色の腸出血様病変の胃腸系血管欠損を示すものであり、変異型の腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。
【図１２Ａ】野生型、Ｅ１３．５での抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による胃の免疫染色の結果を示す写真である。矢印は野生型にのみ観察される大型の血管を示す。
【図１２Ｂ】変異型、Ｅ１３．５での抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による胃の免疫染色の結果を示す写真である。
【図１２Ｃ】野生型、Ｅ１５．５での抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による胃の免疫染色の結果を示す写真である。写真内に挿入された写真は、Ｅ１５．５での染色した胃の壁内の大型の血管のヘマトキシリン−エオジン染色された断面を示す。矢印は野生型にのみ観察される大型の血管を示す。
【図１２Ｄ】変異型、Ｅ１５．５での抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による胃の免疫染色の結果を示す写真である。
【図１３Ａ】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。野生型の中腸ループにつながる腸間膜の連続切片において、ヘマトキシリン-エオジンで染色した。ｍは、腸間膜、ｉは、小腸、ａは上腸間膜動脈、ｖは上腸間静脈を示す。
【図１３Ｂ】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。ＣＸＣＲ４特異的プローブとハイブリダイズした。矢印矢頭は、腸間膜血管の染色された内皮細胞を示す。
【図１３Ｃ】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１特異的プローブとハイブリダイズした。腸間膜内の内皮細胞を取り巻く間葉細胞にＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１が発現している。
【図１３Ｄ】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。野生型の中腸ループにつながる腸間膜の連続切片において、ヘマトキシリン−エオジンで染色した。図１３Ｄは、図１３Ａの上腸間膜動脈から生じる血管の拡大図であり、血管内皮細胞にＣＸＣＲ４の強い発現を認めた。
【図１３Ｅ】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。ＣＸＣＲ４特異的プローブとハイブリダイズした。図１３Ｅは、図１３Ｂの上腸間膜動脈から生じる血管の拡大図であり、血管内皮細胞にＣＸＣＲ４の強い発現を認めた。矢印矢頭は、腸間膜血管の染色された内皮細胞を示す。
【図１３Ｆ】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。野生型Ｅ１８．５胚の骨髄の断面であり、造血細胞にＣＸＣＲ４が発現し、紡錘型のストローマ細胞には発現していない。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明に係る血管形成抑制剤、抗固形癌剤、又は血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤は、ケモカインレセプターであるＣＸＣＲ４の作用を阻害する物質を有効成分として含む。また、本発明に係る組織修復剤は、該ＣＸＣＲ４の作用を増強する物質を有効成分として含有する。
【００２２】
ＣＸＣＲ４のアミノ酸配列については、すでに知られている。具体的にはヒトＣＸＣＲ４及びマウスＣＸＣＲ４のアミノ酸配列は、各々配列番号１及び３に示される。また、ヒトＣＸＣＲ４及びマウスＣＸＣＲ４の塩基配列は、各々配列番号２（塩基位置１〜１０５６）及び４（塩基位置１〜１０７７）に示される。
【００２３】
ＣＸＣＲ４に結合するリガンドであるＳＤＦ−１についても既にそのアミノ酸配列が知られている。ＳＤＦ−１にはアミノ酸配列の長さが異なる２種類、すなわちＳＤＦ−１−α及びＳＤＦ−１−βが存在する。具体的にはヒトＳＤＦ−１−αのアミノ酸配列は配列番号５に、塩基配列は配列番号：６（塩基位置４７４〜７４０）に示される。ヒトＳＤＦ−１−βは、ヒトＳＤＦ−１−αのＣ末端側にさらに４つのアミノ酸残基Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ（配列番号：９）が付加されている。
【００２４】
マウスＳＤＦ−１−αのアミノ酸配列は配列番号：７に、塩基配列は配列番号：８（塩基位置８２〜３４８）に示される。マウスＳＤＦ−１−βは、マウスＳＤＦ−１−αのＣ末端側にさらに４つのアミノ酸残基Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ（配列番号：１０）が付加されている。ヒト及びマウスＳＤＦ−１はアミノ酸１位のＭｅｔから２１位のＧｌｙまでがシグナル配列である。
【００２５】
これまでに知られているＣＸＣケモカインとしては、前記ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の他，ＩＬ−８（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ．，Ｔ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，９２３３−９２３７（１９８７））、ＮＡＰ−２（Ｗａｌｚ．Ａ，ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎ．，１５９，９６９−９７５（１９８９））、ＮＡＰ−４，ＧＲＯα（Ｒｉｃｈｍｏｎｄｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６，１８５−１９８（１９８８））、ＧＲＯβ（Ｈａｓｋｉｌｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，７７７３２−７７３６（１９９０））、ＧＲＯγ（Ｈａｓｋｉｌｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、（１９９０）前出）、ＧＣＰ−２（Ｐｒｏｏｓｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０，１０００−１０１０（１９９３）、ＥＮＡ−７８（Ｗａｙｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４，１３５５−１３６２（１９９１））、ＰＦ−４（Ｄｅｕｅｌ，Ｔ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４，２２５６−２２５８（１９７７））、及びＩＰ−１０（Ｄｅｗａｌｄ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，３２，８１−８４（１９９２）が挙げられる。
【００２６】
本発明において使用可能なＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質については特に限定はされず、ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害し、結果として血管新生を阻害する物質であればよい。
【００２７】
具体的には、（ｉ）リガンド（ＳＤＦ−１）とレセプター（ＣＸＣＲ４）との結合自体を阻害することに基づく物質、（ｉｉ）ＣＸＣＲ４から核へのシグナル伝達を阻害することに基づく物質、（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４自体の発現を阻害する物質、（ｉｖ）ＳＤＦ−１自体の発現を阻害する物質、が挙げられる。
【００２８】
（ｉ）ＳＤＦ−１とＣＸＣＲ４との結合自体を阻害する物質として、ＳＤＦ−１を阻害する物質とＣＸＣＲ４を阻害する物質がある。
【００２９】
ＳＤＦ−１を阻害する物質は、より具体的にはＣＸＣＲ４に対しＳＤＦ−１と拮抗的に競合し阻害する物質とＳＤＦ−１に結合してＣＸＣＲ４へのＳＤＦ−１の結合を阻害する物質がある。ＣＸＣＲ４に対しＳＤＦ−１と拮抗的に競合し阻害する物質として、具体的にはＳＤＦ−１と類似の構造を有する蛋白質、その蛋白質と他のペプチド又はポリペプチドとの融合蛋白質、ＳＤＦ−１の部分ペプチド及びＳＤＦ−１の結合部位と類似の構造を有する低分子化合物等が挙げられる。
【００３０】
ＳＤＦ−１に結合してＣＸＣＲ４へのＳＤＦ−１の結合を阻害する物質として、具体的には抗ＳＤＦ−１抗体、その結合活性を有する抗体断片、ＳＤＦ−１に対する結合活性を有する融合タンパク質、ＳＤＦ−１の構造変化を誘導する物質、及びＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４との結合部位に結合する低分子化合物等が挙げられる。
【００３１】
ＣＸＣＲ４を阻害する物質は、より具体的にはＳＤＦ−１との結合においてＣＸＣＲ４と拮抗的に競合して阻害する物質とＣＸＣＲ４に結合してＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害する物質がある。ＳＤＦ−１との結合においてＣＸＣＲ４と拮抗的に競合して阻害する物質として、具体的にはＣＸＣＲ４と拮抗的に阻害する可溶性ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ４と類似の構造を有するタンパク質、そのタンパク質と他のペプチド又はポリペプチドとの融合タンパク質、又はＣＸＣＲ４部分ペプチド及びＣＸＣＲ４の結合部位と類似の構造を有する低分子化合物等が挙げられる。
【００３２】
ＣＸＣＲ４に結合してＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害する物質として、具体的には抗ＣＸＣＲ４抗体、その結合活性を有する抗体断片、ＣＸＣＲ４に対する結合活性を有する融合タンパク質、ＳＤＦ−１の構造変化を誘導する物質及びＣＸＣＲ４のＳＤＦ−１結合部位に結合する低分子化合物等が挙げられる。ＳＤＦ−１とＣＸＣＲ４との結合自体を阻害する物質の具体例は、Ｔ２２（Ｔ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３８９−１３９３（１９９７）、ＡＬＸ４０−４Ｃ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３９５−１４００（１９９７）、ＡＭＤ３１００（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３８３−１３８８（１９９７），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，４，７２−７７（１９９８））等である。これらの物質の作成方法については、例えばＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１１８９−１１９１（１９９７）に記載の方法に準じて可能である。
【００３３】
（ｉｉ）ＣＸＣＲ４から核へのシグナル伝達を阻害することに基づく物質としては、係る作用を有する物質であれば特に制限はない。ＣＸＣＲ４から核へのシグナル伝達を阻害することに基づく物質としては、Ｇタンパク共役タンパク質の下流に存在するシグナル伝達系の阻害剤、例えばＭＡＰＫカスケード阻害剤、ホスホライペースＣ（ＰＬＣ）の阻害剤、ＰＩ３キナーゼ基ナーゼ阻害剤等が挙げられる。
【００３４】
（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４自体の発現を阻害する物質として、細胞上からみかけ上ＣＸＣＲ４を消失させる物質及びＣＸＣＲ４自体の発現を阻害する物質が挙げられる。細胞上からみかけ上ＣＸＣＲ４を消失させる物質とは、具体的にはＣＸＣＲ４のダウンレギュレーションを誘導する物質である。ＣＸＣＲ４のダウンレギュレーションの誘導とは、具体的には細胞膜に作用して細胞膜の流動性を変化させ、細胞膜上からＣＸＣＲ４を消失させる作用を意味する。このような作用を有する物質として、例えばデキサメタゾン等が挙げられる。
【００３５】
ＣＸＣＲ４自体の発現を阻害する物質として、具体的にはアンチジーン、アンチセンス（アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスベクターにより発現されるアンチセンスＲＮＡ）、リボザイム及びＣＸＣＲ４の発現調節部位、例えばプロモーターやエンハンサー等に対し阻害する物質が挙げられる。
【００３６】
後述の実施例において、ＣＸＣＲ４遺伝子の一部を含むベクターを用いてＣＸＣＲ４を欠損させたことにより、血管形成が抑制されたことが明らかとなった。従って、ＣＸＣＲ４のアンチジーン、アンチセンス又はリボザイム等によりＣＸＣＲ４を阻害すれば、血管形成が抑制される。
【００３７】
本発明で好ましく使用可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＣＸＣＲ４に対するＳＤＦ−１の遺伝子、又はＣＸＣＲ４に基づくシグナル系に関わる物質の遺伝子と選択的にハイブリダイズし得るヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はヌクレオチド誘導体、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド等が含まれる。本発明は例えば、配列番号：２に示されるヒトＣＸＣＲ４遺伝子の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００３８】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：２に示される塩基配列中の連続する少なくとも２０個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、前記連続する少なくとも２０個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含む、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３９】
ここでいう「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補的であるもののみならず、ＤＮＡ又はｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号：２に示される塩基配列に選択的に安定にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在していてもよい。選択的に安定にハイブリダイズするとは、少なくとも２０個、好ましくは３０個の連続したヌクレオチド配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有するものを示す。尚、本明細書において相同性とは同等性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す。
【００４０】
本発明において便用されるオリゴヌクレオチド誘導体がデオキシリボヌクレオチドの場合、各々の構造は化１に示したとおりである。
【００４１】
【化１】
【００４２】
ここで、Ｘは独立して酸素（Ｏ）、イオウ（Ｓ）、低級アルキル基あるいは一級アミン又は二級アミンのいずれであってもよい。Ｙは独立して酸素（Ｏ）あるいはイオウ（Ｓ）のいずれでもよい、Ｂはアデニン、グアニン、チミン、あるいはシトシンのいずれかから選ばれ、主としてヒトＣＸＣＲ４遺伝子のＤＮＡ又はｍＲＮＡの相補的オリゴヌクレオチドである。Ｒは独立して水素（Ｈ）又はジメトキシトリチル基あるいは低級アルキル基である。ｎは７−２８である。
【００４３】
好ましいオリゴヌクレオチド誘導体としては、修飾されていないオリゴヌクレオチドだけではなく、下に示すごとく、修飾されたオリゴヌクレオチドでもよい。このような修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
【００４４】
【化２】
【００４５】
これらのオリゴヌクレオチド修飾体は、次の通り常法により得ることができる。化１のＸ及びＹがＯであるオリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成装置、例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製によって容易に合成される、合成方法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等で得ることができる。
【００４６】
Ｘが低級アルコキシ基であるリン酸トリエステル修飾体は、常法、例えば化学合成で得られたオリゴヌクレオチドをトシルクロリドのＤＭＦ／メタノール／２，６−ルチジン溶液で処理することにより得ることができる。Ｘがアルキル基であるアルキルホスホネート修飾体は、常法、例えばホスホアミダイトを用いて得ることができる。ＸがＳであるホスホロチオエート修飾体は、常法、例えばイオウを用いた固相合成法あるいはテトラエチルチウラムジスルフィドを用いて、固相合成法により得ることができる。Ｘ、Ｙが共にＳであるホスホロジチオエート修飾体は、例えばヒスアミダイトをチオアミダイトに変換し、イオウを作用させることにより固相合成法により得ることができる。Ｘが一級アミンあるいは二級アミンであるホスホロアミデート修飾体は、例えばハイドロジェンホスホネートを一級あるいは二級アミンで処理することにより固相合成法により得ることができる。あるいは、アミダイトをｔｅｒｔ−ブチルハイドロパーオキサイドで酸化しても得ることができる。
【００４７】
精製及び純度確認は、高速液体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で行うことができる。分子量の確認は、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ又はＦａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙで行うことができる。
【００４８】
本発明で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、ＣＸＣＲ４レセプター又はそのリガンド、さらにＣＸＣＲ４に基づくシグナル伝達物質の産生細胞に作用して、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、該ポリペプチドの発現を抑制することにより、結果的にＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する効果を有する。
【００４９】
本発明で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは結果として血管の新生を阻害することにおいて有用である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合有する血管新生阻害剤は、癌、特には固形癌の治療剤として有用である。
【００５０】
ＣＸＣＲ４アンチセンスベクターを作製するには、通常用いられる方法に従えばよい。すなわち、ＣＸＣＲ４をコードするｃＤＮＡをＡＡＶベクター（アデノ随伴ベクター）、ＭＬＶベクター（マウス白血病ウィルスベクター）、又はＨＩＶベクター等にアンチセンス方向に連結する。アンチセンス方向とは、プロモーターの下流に導入するｃＤＮＡの３’側から連結することを意味する。これらのベクターに含まれるｃＤＮＡから合成されたアンチセンスＲＮＡは、宿主のＣＸＣＲ４の発現を構成的に抑制する。
【００５１】
アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡは、例えばリポソーム法、ＨＶＪリポソーム法、正電荷リポソーム法等の手段を用いて細胞に導入することができる。ＣＸＣＲ４アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを導入することにより、構成的にＣＸＣＲ４の発現を阻害する事が可能である。
【００５２】
（ｉｖ）ＣＸＣＲ４に対するＳＤＦ−１自体の発現を阻害する物質として、ＳＤＦ−１の発現阻害のためのアンチセンス及びＳＤＦ−１の発現調節部位、例えばプロモーター等に対し阻害する物質が挙げられる。
【００５３】
上述した本発明で使用可能な抗体、例えば抗ＳＤＦ−１抗体又は抗ＣＸＣＲ４抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体は上述の性質を有する抗体である。
【００５４】
抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をクローニングする。
【００５５】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ菌類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。
【００５６】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株が適宜使用される。前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。
【００５７】
得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。このように得られたハイブリドーマから通常用いられる方法に従い抗体を取得すればよい。
【００５８】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原蛋白質または抗原発現細胞で感作し、感作Ｂリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、所望の抗原または抗原発現細胞への結合活性を育する所望のヒト抗体を得ることもできる。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを育するトランスジェニック動物に抗原または抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい。
【００５９】
本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｎｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ １９９０参照）。
【００６０】
また、本発明には、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３）、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３）を使用できる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００６１】
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域（Ｃ領域）からなり、ヒト型化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）およびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明における有効成分として有用である。
【００６２】
本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、抗体の断片やその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる。
【００６３】
発明に使用される抗体を取得するために、ファージライブラリー法を用いることができる。（Ｍａｒｋｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３３５，７３０−７３３）例えばヒトＢ細胞よりヒト抗体Ｖ領域、例えばｓｃＦｖをコードする遺伝子からなるｃＤＮＡライブラリーを得、このｃＤＮＡライブラリーをファージベクターに、例えばＭ１３ファージ表面提示ベクターに導入し、これを大腸菌に感染させる。大腸菌でｃＤＮＡライブラリーは発現され、細胞表面に抗体Ｖ領域が産生される。所望の抗原をコートしたプレートに上で、抗原結合活性に基づいて選択することにより、所望の抗体をコードする遺伝子を得ることができる。
【００６４】
ファージライブラリー法を応用してチェインシャッフリング法を用い、抗原に対しより強い結合活性を有する抗体を得ることができる。（Ａｋａｍａｔｓｕ，Ｙ．＆ Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ，Ｎ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７，２７３−２８６（１９９４））。すなわち、いったん分離した抗体遺伝子のＶ領域の一方（例えばＶＨ）を固定し、Ｂ細胞から調製したもう一方（例えばＶＬ）混合体との間で新たにライブラリーを作製し、抗原により強く結合するクローンを分離すればよい。
【００６５】
また、抗体のアミノ酸配列に人為的突然変異を導入することによっても、抗原に対しより強い結合活性を有する抗体を得ることができる。（Ａｋａｍａｔｓｕ，Ｙ．＆ Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ，Ｎ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２７，２７３−２８６（１９９４））。すなわち、クローニングした抗体Ｖ領域をコードする遺伝子に突然変異を導入し、この遺伝子を上記ファージライブラリー法で発現させることにより、抗原に対しより強い結合活性を有する抗体をコードする遺伝子を得ることができる。
【００６６】
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本明細書でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
【００６７】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本明細書でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００６８】
前記のように発現・産生された抗体は、通常用いられる方法に従い、宿主細胞内外から分離し均一にまで精製することができる。また、濃度測定は吸光度の測定またはＥＬＩＳＡ等により行うことができる。
【００６９】
本発明で使用されるＣＸＣＲ４阻害物質として、ＳＤＦ−１又はＣＸＣＲ４と類似の構造を有するタンパク質（類似構造タンパク質）が挙げられる。この物質は、ＳＤＦ−１又はＣＸＣＲ４との結合活性を有し、且つその生物学的活性を伝達しない物質である。即ちＣＸＣＲ４に対しＳＤＦ−１と競合的に結合するが、ＳＤＦ−１の生物学的活性を伝達しないため、ＳＤＦ−１によるシグナル伝達を遮断する。
【００７０】
ＳＤＦ−１類似構造タンパク質は、ＳＤＦ−１のアミノ酸配列のアミノ酸残基を置換することにより変異を導入して作製される。ＳＤＦ−１類似構造タンパク質のもととなるＳＤＦ−１はその由来を問わないが、抗原性等を考慮すれば、好ましくはヒトＳＤＦ−１である。具体的には、ＳＤＦ−１のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、ＷＨＡＴＩＦ（Ｖｒｉｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ（１９９０）８，５２−５６）を用いてその二次構造を予測し、さらに置換されるアミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。
【００７１】
適切な置換アミノ酸残基を決定した後、ヒトＳＤＦ−１遺伝子をコードする塩基配列を含むベクターを鋳型として、通常行われるＰＣＲ（ポリメレースチェインリアクション）法によりアミノ酸が置換されるように変異を導入することにより、ＳＤＦ−１類似構造タンパク質をコードする遺伝子が得られる。これを必要に応じて適当な発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じてＳＤＦ−１類似構造タンパク質を得ることができる。ＳＤＦ−１類似構造タンパク質として、Ｎ末端を欠失させたＳＤＦ−１が知られている（ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９７）１６，６９９６−７００７）。
【００７２】
本発明で使用されるＳＤＦ−１部分ペプチド又はＣＸＣＲ４部分ペプチドは、各々ＣＸＣＲ４あるいはＳＤＦ−１との結合活性を有し、且つＳＤＦ−１の生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、ＳＤＦ−１部分ペプチド又はＣＸＣＲ４部分ペプチドはＣＸＣＲ４又はＳＤＦ−１に結合し、これらを捕捉することによりＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を特異的に阻害する。
【００７３】
その結果、ＳＤＦ−１の生物学的活性を伝達しないため、ＳＤＦ−１によるシグナル伝達を遮断する。
【００７４】
ＳＤＦ−１部分ペプチド又はＣＸＣＲ４部分ペプチドは、ＳＤＦ−１又はＣＸＣＲ４のアミノ酸配列においてＳＤＦ−１とＣＸＣＲ４との結合に係わる領域の一部又は全部のアミノ酸配列からなるペプチドである。このようなペプチドは、通常１０〜８０、好ましくは２０〜５０、より好ましくは２０〜４０個のアミノ酸残基からなる。
【００７５】
ＳＤＦ−１部分ペプチド又はＣＸＣＲ４部分ペプチドは、ＳＤＦ−１又はＣＸＣＲ４のアミノ酸配列において、ＳＤＦ−１とＣＸＣＲ４との結合に係わる領域を特定し、その一部又は全部のアミノ酸配列を通常知られる方法、例えば遺伝子工学的手法又はペプチド合成法により作製することができる。
【００７６】
ＳＤＦ−１部分ペプチド又はＣＸＣＲ４部分ペプチドを遺伝子工学的手法により作製するには、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じて得ることができる。
【００７７】
ＳＤＦ−１部分ペプチド又はＣＸＣＲ４部分ペプチドをペプチド合成法により作製するには、ペプチド合成において通常用いられている方法、例えば固相合成法又は液相合成法を用いることができる。具体的には、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合成 監修矢島治明廣川書店１９９１年に記載の方法に準じて行えばよい。固相合成法としては、例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しようとするペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を結合させ、α−アミノ基及び側鎖官能基を適切な保護基で保護したアミノ酸をＣ末端からＮ末端方向の順番に１アミノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したアミノ酸又はペプチドのα−アミノ基の該保護基を脱離させる反応を交互に繰り返すことにより、ペプチド鎖を伸長させる方法が用いられる。固相ペプチド合成法は、用いられる保護基の種類によりＢｏｃ法とＦｍｏｃ法に大別される。
【００７８】
このようにして目的とするペプチドを合成した後、脱保護反応及びペプチド鎖の支持体から切断する。ペプチド鎖との切断反応には、Ｂｏｃ法ではフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸を、又Ｆｍｏｃ法ではＴＦＡを通常用いることができる。Ｂｏｃ法では、例えばフッ化水素中で上記保護ペプチド樹脂をアニソール存在下で処理する。次いで、保護基の脱離と支持体から切断しペプチドを回収する。
【００７９】
これを凍結乾燥することにより、粗ペプチドが得られる。一方、Ｆｍｏｃ法では、例えばＴＦＡ中で上記と同様の操作で脱保護反応及びペプチド鎖の支持体から切断反応を行うことができる。
【００８０】
得られた粗ペプチドは、ＨＰＬＣに適用することにより分離、精製することができる。その溶出にあたり、蛋白質の精製に通常用いられる水−アセトニトリル系溶媒を使用して最適条件下で行えばよい。得られたクロマトグラフィーのプロファイルのピークに該当する画分を分取し、これを凍結乾燥する。このようにして精製したペプチド画分について、マススペクトル分析による分子量解析、アミノ酸組成分析、又はアミノ酸配列解析等により同定する。
【００８１】
本発明で使用されるＳＤＦ−１の部分ペプチドあるいはＣＸＣＲ４の部分ペプチドは、各々ＣＸＣＲ４あるいはＳＤＦ−１に結合し、シグナルの伝達活性がないものであれば、その配列を問わない。ＳＤＦ−１の部分ペプチドおよびＣＸＣＲ４のペプチドについては、既に知られたアミノ酸配列を使用できる。例えば、リガンドとしてＳＤＦ−１の場合、配列表の配列番号５（ヒト）、および７（マウス）に記載されたアミノ酸配列が使用可能である。
【００８２】
本発明において使用可能なＣＸＣＲ４に基づく作用を増強する物質については特に限定されないが、ＳＤＦ−１を増強する物質として、ＳＤＦ−１自体、ＳＤＦ−１のアゴニスト、又はＳＤＦ−１の発現増強剤が挙げられる。さらに、レセプターＣＸＣＲ４を増強する物質としては、ＣＸＣＲ４自体、そのアゴニスト、又はＣＸＣＲ４の発現増強剤が挙げられる。
【００８３】
上記説明したように、本発明に係るＣＸＣＲ４阻害剤を有効成分として含む血管形成抑制剤を用いることにより、血管形成（Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を抑制可能となることから、固形癌に対する抗腫瘍効果（血管新生の抑制）血管肉腫（血管自体の癌）カポシ肉腫に対して抗腫瘍効果が発揮される。また、血管新生を病態形成要因とする疾患、具体的には慢性関節リウマチ、乾せん（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、糖尿病性網膜症に対して治療効果が発揮される。
【００８４】
ＣＸＣＲ４の作用を増強する物質を含む血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤を用いることにより、血管新生を促進させることが可能となり、心筋梗塞、術後の血管新生を伴う疾患、具体的には創傷治癒、骨の修復及びリモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）、軟骨の修復、毛髪の成長、心筋梗塞、脳梗塞および脳における外傷に対する治療効果が発揮される。
【００８５】
本発明において使用可能な血管新生阻害及び促進試験法は血管新生試験法を用い行える。このアッセイ方法についても特に制限はなく、通常公知の方法が好ましく使用できる（「がんの浸潤・転移研究マニュアル」がん転移研究会編、金芳堂発行、１９９４年、１５９〜１８２ページ）。具体的には、（ｉ）血管内皮細胞への影響を、腫瘍細胞が血管外に浸潤する際、血管内皮細胞が開裂するという知見に基づく血管内皮細胞間隔の開裂を測定する方法（ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの透過性から）、（ｉｉ）血管新生誘導因子としてその役割を生体内で発揮する候補因子を同定するためのｉｎｖｉｖｏ測定法として知られている角膜法、及び（ｉｖ）ＣＡＭ法（ｃｈｉｃｋｅｍｂｒｙｏｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ）、（ｖ）肉眼で誘導血管の量を測定する背部皮下法、（ｖｉ）血管内皮細胞の管腔形成の測定方法等が挙げられる。
【００８６】
抗腫瘍効果の確認には、移植モデルや移植転移モデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験又は癌細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験が挙げられる。具体的には、「がんの浸潤・転移研究マニュアル」がん転移研究会編、金芳堂発行、１９９４年、７〜１５８ページに記載の方法を使用することができる。
【００８７】
本発明に係る血管形成抑制剤、抗固形癌剤、治療剤、組織修復剤等は、経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。
【００８８】
有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０９ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。
【００８９】
本発明に係る血管形成抑制剤、抗固形癌剤、治療剤、組織修復剤等は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルキン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトニル、ラクトー
ス、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。
【００９０】
使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００９１】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって何等限定されるものではない。
【実施例】
【００９２】
ＣＸＣＲ４完全欠損マウスの作製および分析
ＣＸＣＲ４遺伝子座を含むゲノムＤＮＡを、マウス株１２９ＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）から単離した。
【００９３】
エクソン２の５’翻訳領域を含む１．１ｋｂゲノム断片をネオマイシン耐性遺伝子で置き換え、ヘルペスシンプレックスチミジンキナーゼ遺伝子を５’末端に連結した。
【００９４】
胚形成の１４．１日（以下、Ｅ１４．１とする）の細胞内に標的ベクターをエレクトロポレーションにより導入し、Ｇ４１８とガンシクロビルにより相同性組換えを選択し、ＰＣＲで同定した。
【００９５】
変異座の構造とＥＳ細胞コロニーでの単一の挿入物の存在をサザンハイブリダイゼーションで確認した。Ｎａｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．．Ｎａｔｕｒｅ３８２，６８５−６８８（１９９６）に記載の方法にしたがい、未分化胚芽細胞の注入により変異マウスを作製するために変異ＥＳ細胞コロニーを用いた。
【００９６】
サザンハイブリダイゼーション分析のため、テールＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ナイロンメンブレンに移し、５’側相同領域の５５０ｂｐのプローブＡとハイブリダイズさせた。
【００９７】
Ｅ１８．５の胚の胎仔肝臓から単離した３μｇの全ＲＮＡを出発材料として標準の方法に従いＲＴ−ＰＣＲを４０サイクル行った。６３０ｂｐのＰＣＲ産物をＣＸＣＲ４特異的プライマー，すなわち前方プライマー（配列番号：１１）及び後方プライマー（配列番号：１２）を用いて増幅した。組織学的分析及びフローサイトメトリー分析はＮａｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，６８５−６８８（１９９６）に記載の方法に準じて行った。
【００９８】
免疫組織学的染色は、Ａｄａｃｈｉ，Ｓ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．，Ｋａｔａｏｋａ，Ｈ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．−Ｉ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，５０７−５１４の方法に準じた。胚及び器官の切片を４％パラホルムアルデヒドで固定し、メタノールで脱水し、メタノール中３０％過酸化水素で脱色し、再度水和した。
【００９９】
ＰＢＳＭＴ（１％スキムミルク粉および０．３％ｖ／ｖ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ）でインキュベートした後、試料をＰＢＳＭＴ中、１：２５０希釈した抗−ＰＥＣＡＭ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と４℃一晩インキュベートした後、ＰＢＳＭＴで洗浄し、１：５００希釈ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ製）とＰＢＳＭＴ中４℃一晩インキュベートした。
【０１００】
その後、試料をよく洗浄し、胚を２５０μｇ／ｍｌジアミノベンジジン（同仁化学製）、０．０８％ＮｉＣｌ２を含むＰＢＳ中で３０分インキュベートした。過酸化水素を加えて、最終濃度０．０１％としてパーオキシダーゼ染色を行った。反応は約３０分後に止めた。
【０１０１】
Ｎａｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，６８５−６８８（１９９６）に記載の方法により、マウスＣＸＣＲ４又はＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１ｃＤＮＡの断片をプローブとしてアンチセンス転写を用いて行った。
【０１０２】
ＣＸＣＲ４の生理的機能を決定するため、ＣＸＣＲ４欠損マウスを作製した。すなわち、ＣＸＣＲ４遺伝子のうち、レセプター機能に重要なすべての膜貫通領域を含むエクソン２の大部分を削除し、その部分をネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）で置換できるようにしたターゲットベクターを構築した。この結果、相同組換え後、実質的にＣＸＣＲ４遺伝子が完全に削除されることとなる。
【０１０３】
図１は、ＣＸＣＲ４遺伝子の標的戦略を示す図（上、中、下とする）である。上には、野生型ＣＸＣＲ４対立遺伝子、中には標的ベクター、および下には予想変異対立遺伝子を示す。遺伝子の翻訳領域は黒四角で示される。白四角は５’および３’非翻訳領域を示す。点線は、標的ベクターに使用された相同な断片を示す。プローブＡは、サザンハイブリダイゼーション用の外部プローブである。ここで制限酵素位置をそれぞれ、Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｓｈ、ＳｐｈＩ；Ｘ、ＸｈｏＩとした。
【０１０４】
図２Ａは、野生型（＋／＋）およびヘテロ変異（＋／−）マウスのテールＤＮＡのサザンブロット分析を示す写真である。プローブＡにより同定された、１１．８ｋｂ野生型および８．２ｋｂ標的対立遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片が示されている。また、図２Ｂは、ＣＸＣＲ４発現のＲＴ−ＰＣＲ増幅分析を示す写真である。全ＲＮＡはＥ１８．５の野生型およびホモ変異胚から調製し、さらにＣＸＣＲ４特異的プライマーで増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅はまた、増幅可能なＲＮＡの存在のコントロールとして、普遍的に発現しているＧ３ＰＤＨ ｍＲＮＡを用いた。
【０１０５】
ＣＸＣＲ４ヘテロ（＋／−）変異を有するマウスを作製した。該マウスは健康でかつ妊娠可能であった。ＣＸＣＲ４ホモ（−／−）変異胚は胚形成のＥ１５．５まで予想された比で存在した。しかし、既に報告しているＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１欠損マウスと同様に（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，６８５−６８８（１９９６））、約半分のＣＸＣＲ４−／−胚はＥ１８．５で死亡し、ＣＸＣＲ４−／−新生仔は１時間以内に死亡した。
【０１０６】
胚形成時において、ＣＸＣＲ４の機能を明らかにするために、ＣＸＣＲ４の成育中の胚における発現をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより調べた。ＣＸＣＲ４転写物が、胚形成時において血管形成時の内皮に高いレベルで検出された。
【０１０７】
この知見に基づき、血管形成におけるＣＸＣＲ４遺伝子欠損の効果を調べた。卵黄および臍帯の血管は視覚的には正常であった。Ｅ１８．５のＣＸＣＲ４−／−胚の組織学的検査では、主な血管である大動脈、大静脈、頚動脈、頚静脈、腹腔動脈、腸間膜動脈および腸間膜静脈の存在が認められた。その後、器官の血管系を可視化するため、野生型及び変異胚の全組織調製物について、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体で免疫染色した。ＰＥＣＡＭ−１は胎生期を通じて、すべての内皮細胞において特異的かつ安定に発現することが知られている（Ｖｅｃｃｈｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６３，２４７−２５５（１９９４）、Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０，２５３９−２５５８（１９９４））。
【０１０８】
その結果、Ｅ１１．５までは胃、小腸、および腸間膜を含む胃腸組織において、高度に分岐した均一な血管系が野生型と変異型ともに認められた。Ｅ１２．５付近では、中腸ループに結合している腸間膜において大小の血管が再構成により形成されていることが認められた。Ｅ１３．５での野生型胚では図３に示されるように、腸管へ栄養する腸間膜動脈や腸間膜静脈から分岐する多くの大分枝が形成されていた。一方、Ｅ１３．５でのＣＸＣＲ４−／−胚の腸間膜では、これらの大分枝が存在せず、その代わりより小さな血管のみが生じていた。顕微鏡を用いた組織学的分析によれば、Ｅ１３．５での野生型胚の腸間膜には腸間膜動脈や腸間膜静脈が認められ、これより分岐した血管は動脈、静脈が対となっていた（図４）。これとは対照的に、ＣＸＣＲ４−／−胚の大部分の血管は図８に見られ
るように対ではなく一本であった。ただし、変異胚の腸間膜内の腸間膜動脈や腸間膜静脈は正常であった。Ｅ１７．５での野生型胚では、腸間膜の大型の血管は多くの分枝を出し腸管に達していた（図５と図６）。しかしながら、ＣＸＣＲ４−／−胚ではこのような腸間膜の大型の血管に相当する血管は実質的に欠損していた（図９と図６）。また、変異腸間膜では異常な分岐を示す大型の血管が認められた（図９と図６）。このような血管系の欠損により、大部分のＥ１６．５の変異胚の小腸には多数の出血様病変が見られた。この病変は腸を支配する循環系の異常によるものと考えられる（図１１）。
【０１０９】
以上の結果から、ＣＸＣＲ４は、小腸の正常な血管形成に必須であることが示された。その作用機序としてはＣＸＣＲ４は、腸間膜の血管の分岐及び／又は再構成に関与していると考えられる。
【０１１０】
胃の場合、野生型胚では、Ｅ１３．５までに、小弯側の間葉から分岐する大型の血管が形成され、腹側および背側表面全体に分布している（図１２Ａ、１２Ｃ）。組織学的解析によると、この血管はＥ１５．５の野生型マウスにおいて、図１２Ｃ内に挿入した写真で示されるように、静脈と動脈が対をなしていた。しかしながら、これに相当する血管は変異胚には認められなかった（図１２Ｂ、１２Ｄ）。胃を取り巻く小血管ネットワークの形成は、変異胚でも正常に見えた（図１２Ｄ）。
【０１１１】
Ｅ１８．５での変異胚の胃腸の組織学的分析では、器官形成に何等異常は認められなかった。例えば、変異マウスの胃、腸管の平滑筋層は、外層および内層それぞれ、縦方向および垂直方向に正常に認められた。
【０１１２】
図３〜６は、ＣＸＣＲ４−／−胚における胃腸系血管欠損を示す写真であり、野生型の腸間膜および腸の、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。図３はＥ１３．５での腸間膜と中腸ループ領域を示す。図５はＥ１７．５での空腸を示す。図６はＥ１７．５での空腸を示す。図７はＥ１３．５での染色した腸間膜の断面を示す。図３，５，６での矢印は、野生型腸間膜の小腸を栄養する上腸間膜動脈又は静脈よりの大型の分枝を示す。
【０１１３】
また、図７〜１１は、同様にＣＸＣＲ４−／−胚における胃腸系血管欠損を示す写真であり、変異型の腸間膜および腸の、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。図７はＥ１３．５での腸間膜と中腸ループ領域を示す。図９はＥ１７．５での空腸を示す。図１０はＥ１７．５での空腸を示す。図８はＥ１３．５での染色した腸間膜の断面を示す。図１１はＥ１６．５での変異マウスの未染色の腸出血様病変を示す。図９，１０での矢印は、変異マウスの走行、分岐が異常な大型の血管を示す。
【０１１４】
また、図１２Ａから１２Ｄは、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による胃の免疫染色の結果を示す写真である。図１２Ａと１２ＢがＥ１３．５、図１２Ｃと１２ＤはＥ１５．５、図１２Ａと１２Ｇは野生型、図１２Ｂと１２Ｄは変異型を示す。図１２Ｃの写真内に挿入された写真は、Ｅ１５．５での染色した胃の壁内の大型の血管のヘマトキシリン−エオジン染色された断面を示す。図１２Ａと１２Ｃの矢印は野生型にのみ観察される大型の血管を示す。ｄｕは十二指腸、ｐは中間腸ループの近位を、ｄｍは中間腸ループの末梢部、ａは動脈、ｖは静脈を示す。
【０１１５】
これらの知見は、ＣＸＣＲ４−／−マウスにおける血管形成の異常は、消化管そのものの異常による二次的なものではないことを示している。このような血管形成の異常と同様の異常がＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１欠損マウスでも認められた。
【０１１６】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析によれば、Ｅ１２．５の野生型胚の腸間膜、腸壁及び胃壁の血管内皮細胞にＣＸＣＲ４転写物が発現していることが示された（図１３Ｂと１３Ｅ）。特に、腸間膜動脈の分枝の内皮細胞に強い発現が観察された（図１３Ｂ、１３Ｅ）。これとは対照的に、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１は腸間膜の内皮細胞をとりまく間葉細胞において高いレベルで発現していたが、腸と胃の壁や内皮細胞には発現していなかった（図１３Ｃ）。
【０１１７】
図１３Ａから１３Ｆはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。野生型の中腸ループにつながる腸間膜の連続切片を用いて、１枚はヘマトキシリン−エオジンで染色し（図１３Ａと１３Ｄ）、もう１枚はＣＸＣＲ４特異的プローブとハイブリダイズし（図１３Ｂと１３Ｅ）、更にもう１枚はＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１特異的プローブとハイブリダイズした（図１３Ｅ）。図１３Ｄと１３Ｅは、図１３Ａと１３Ｂの上腸間膜動脈から生じた分岐血管の拡大図であり、血管内皮細胞にＣＸＣＲ４の強い発現があることが示された。図１３Ｂと１３Ｅの矢印矢頭は、腸間膜血管のＣＸＣＲ４の発現が認められる内皮細胞を示す。腸間膜内の内皮細胞を取り巻く間葉細胞でＰＲＳＦ／ＳＤＦ−１が発現している（図１３Ｅ）。野生型Ｅ１８．５胚の骨髄の断面であり、造血細胞内でＣＸＣＲ４が発現し、紡錘型のストローマ細胞で発現していない（図１３Ｆ）。ｍは、腸間膜、ｉは、小腸、ａは上腸間膜動脈、ｖは上腸間静脈を示す。
【０１１８】
得られた発現パターンは、間葉細胞により産生されたＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１が内皮細胞上のＣＸＣＲ４に作用することを示し、これより腸間膜の間葉において極めて重要な役割を果たすサイトカインによるパラクラインシグナルの存在が強く示唆される。このことからＣＸＣＲ４−／−およびＰＲＳＦ／ＳＤＦ−１−／−の胃で大血管を欠損する表現型も、胃の小弯に沿う間葉での血管の分岐または再構成の異常による結果である可能性がある。
【０１１９】
他の器官で血管系を調べるため、卵黄嚢、脳、心臓を抗ＰＥＣＡＭ−１モノクローナル抗体で染色した。卵黄嚢（Ｅ１２．５，Ｅ１４．５）、頭領域（Ｅ１１．５）、心臓（Ｅ１２．５−Ｅ１４．５）の大および小血管の形成は、ＣＸＣＲ４−／−、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１−／−と、野生型の間で明らかな差はなかった。
【０１２０】
以上の実験結果をまとめると、ＣＸＣＲ４とＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１は血管内皮細胞に作用して血管分岐又は再構成を制御することにより、胃腸組織へ供給する成熟血管系の形成に必須であることが示された。
【０１２１】
フローサイトメトリー分析によると、ＣＸＣＲ４−／−マウスの胎仔肝臓のＢ細胞前駆細胞が極めて減少していることが明らかとなった。組織学的分析では、骨髄腔の骨髄球系細胞およびその前駆細胞が認められなかった。さらに、Ｅ１８．５の変異マウスの心臓では心室中隔の膜性部の欠損が見いだされた。これらの異常はＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１欠損マウスで観察された表現型と非常に似ており、ＣＸＣＲ４が、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の主要な生理的受容体であるという考えを支持する。
【０１２２】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＥ１８．５での野生型マウスの骨髄においては、造血細胞においてＣＸＣＲ４転写物が発現していたがＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１転写物の発現が認められた紡錘型ストローマ細胞にはＣＸＣＲ４転写物が発現されなかった（図（Ｆｉｇ３ｄ））。これらの発現パターンの結果は、骨髄においてパラクラインシグナルの存在を意味するものである。
【０１２３】
今まで報告されたＦｌｋ−１、Ｔｉｅ−２などの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）と、ＶＥＧＦ、アンジオポイエチン−１、ＰＤＧＦ−Ｂのようなそのリガンドの変異マウスを用いた解析によれば、それらは血管系の発育に重要な役割を果たし、それらの多くは、発生における血管形成のごく初期過程及び体のいたるところでの血管形成（卵黄嚢、必要、胚外の脈管構造を含む）に必要であることが知られている（Ｓｈａｌａｂｙ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３７６，６２−６６（１９９５）、Ｆｏｎｇ，Ｇ．−Ｈ．，Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．＆ Ｂｒｅｉｔｍａｎ，Ｍ．Ｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３７６，６６−７０（１９９５）、Ｄｕｍｏｎｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ．８，１８９７−１９０９（１９９４）、Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３７６，７０−７４（１９９５）、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ８８０，４３５−４３９（１９９６）、Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８０，４３９−４４２（１９９６）、Ｓｕｒｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ８７，Ｉ１７１−１１８０（１９９６））。
【０１２４】
これとは対照的に、ＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の作用は発生においてより後期であり、器官特異的である。Ｔｉｅ−２およびそのリガンドであるアンジオポイエチン−１は、初期の血管系で分岐および／または再構成に必要と考えられている（Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３７６，７０−７４（１９９５）、Ｓｕｒｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ８７，Ｉ１７１−１１８０（１９９６））。消化管での成熟血管系形成における役割は明らかでない。また、Ｔｉｅ−２又はアンジオポイエチン−／−マウスで観察される卵黄嚢血管系における明確な異常は、ＣＸＣＲ４またはＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１−／−マウスでは認められなかった。一方、ＰＦ４（Ｍａｉｏｎｅ，Ｔ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，７７−７９（１９９０））、ＩＬ−８（Ｋｏｃｈ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８，１７９８−１８０１（１９９２））、ＩＰ−１０（Ｌｕｓｔｅｒ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２，２１９−２３１（１９９５））、およびＧｒｏβ（Ｃａｏ，Ｙ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２，２０６９−２０７７（１９９５））といったＣＸＣケモカインも血管新生制御因子であることが報告されている。しかし、内皮細胞でのレセプターの発現や生理学的役割はいまだ解明されていない。凝固因子Ｖ（Ｃｕｉ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８４，６６−６８（１９９６））及び組織因子（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ８８３，７８−７５（１９９６））は、卵黄嚢血管系に必須であることが示されているが、これらの因子がいかなる受容体を介して作用するかは明らかでない。
【０１２５】
以上の背景から、本発明はケモカインと７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体という血管形成に必須の新規なシグナル系の存在を示したと言える。
【０１２６】
最近、ヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質Ｇα１３のαサブユニットを欠損するマウスでは、卵黄嚢の血管系が形成されないこと及び胚体の小血管が拡大するなどの異常があることが示された。その表現型はＣＸＣＲ４欠損マウスとは異なるが、ＣＸＣＲ４がＧα１３と共役する可能性について検討する必要はある。
【０１２７】
ＣＸＣＲ４とＣＣＲ５は、それぞれＴ細胞系親和性およびマクロファージ親和性のＨＩＶ−１株が宿主細胞に感染するのに必須のコレセプターであることが知られている（Ｆｅｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２，８７２−８７７（１９９６）、Ｆａｕｃｉ，Ａ．Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ ８８４，５２９−５８４（１９９６））。このうちＣＣＲ５を欠損したホモ変異体の人々が見出されており、これらの人々は、ＨＩＶ−１感染に抵抗性であり何ら健康に問題はない（Ｌｉｕ，Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ８６，３６７−３７７（１９９６）、Ｓａｍｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，７２２−７２５（１９９６）、Ｄｅａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３，１８５６−１８６１）。
【０１２８】
しかし、もう一方のＣＸＣＲ４に関しては、ＣＸＣＲ４欠損マウスが胚時期に致死性であることから、ヒトでのＣＸＣＲ４ホモ欠損はありえないことが強く示唆された。ただし、Ｔ細胞系親和性ＨＩＶ−１抵抗性の長期生存者においては他の遺伝的要因または生存可能なＣＸＣＲ４ホモ変異が存在する可能性は残されている。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
ＣＸＣＲ４ノックアウトマウスおいては血管の形成が抑制されたという本発明による知見に基づき、ＣＸＣＲ４の作用を阻害する物質を有効成分として含有する血管形成抑制剤、また癌組織の維持、拡大において血管形成は必須であることから、抗固形癌剤の作成、及びＣＸＣＲ４の作用を阻害する物質を有効成分として含有する血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤の作成、さらには、ＣＸＣＲ４の作用を増強する物質を有効成分として含有する組織修復剤の作成に用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＸＣＲ４阻害剤を有効成分として含有する、新規血管形成抑制剤、抗固形癌剤、また、血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤に関する。さらに本発明はＣＸＣＲ４増強剤を有効成分として含有する組織修復剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、腫瘍細胞が血管外に浸潤する際に、血管内皮細胞が開裂することが知られている。また、癌の増殖や転移には血管新生が深くかかわっており、腫瘍細胞が種々の血管新生因子を産生、放出することも知られている。特に、固形腫瘍の増殖には血管の新生が必須とされている。
【０００３】
このため血管新生を阻害する物質は新しい作用機序を有する制癌剤になる可能性があるため、ステロイド剤や微生物代謝産物などいくつかのタイプの血管新生阻害物質がすでに試みられている（「がんの浸潤・転移研究マニュアル」がん転移研究会編、金芳堂発行、１９９４年、１５９〜１８２ページ）が、癌の増殖、転移をより効果的に抑制する作用を有する新規な血管新生阻害物質の発見が切望されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、癌の増殖、浸潤、転移をより効果的に抑制する作用を有するケモカインレセプター阻害剤を含む血管形成抑制剤、抗固形癌剤、また、血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤を提供する。さらに本発明は、ケモカインレセプター増強剤を有効成分として含有する組織修復剤を提供することを目的とする。
【０００５】
すなわち、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進めた結果、ＣＸＣケモカインであるプレ−Ｂ細胞成長刺激因子／基質細胞誘導因子（以下ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１またはＳＤＦ−１とする）およびケモカインレセプターであるＣＸＣＲ４のノックアウトマウスを作製し、該マウスの血管の形成が抑制されること、すなわち、ＣＸＣＲ４を抑制することにより血管形成が抑制されることを見出した。係る知見は、ケモカインレセプターＣＸＣＲ４が血管新生にとって必須であることを意味する。
【０００６】
生体組織の血管新生は、一般的に成長過程において特異的な機能を実現するため、すでに存在する血管系の再構成により起こる。初期の血管系において必須の分子は、そのほとんどがレセプターチロンシンキナーゼとそのリガンドであることが変異マウスの分析から決められてきた（Ｒｉｓａｕ，Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ３８６，６７１−６７４（１９９７）、Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．＆Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｐ．Ａ．Ｃｅｌｌ ８７，Ｉ１５８−ｌｌ５５（１９９６）、Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７，２４２−２４５（１９９７））。しかしながら係るマウスの多くは、組織発達前の初期妊娠時に死亡することから、器官形時期の血管形成に必要な物質はいまだ不明であった。
【０００７】
本発明に係るケモカインレセプターＣＸＣＲ４の構造は既に知られている（Ｂｌｅｕｌ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，８２９−８８３（１９９６）、Ｏｂｅｒｌｉｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，８８８−８３５（１９９６）、Ｎａｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，１４７２６−１４７２９（１９９６））。ＣＸＣＲ４は、７回膜貫通Ｇタンパク共役タンパク質であり、ＣＸＣケモカインであるＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１のレセプターである。また、上記因子はＢリンパ球産生、骨髄造血と心室壁形成に必要とされているものである（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，６８５−６８８（１９９６））。また、ＣＸＣＲ４は、Ｔ細胞系親和性のＨＩＶ−１のコレセプターとして機能するものでもある（Ｆｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２，８７２−８７７（１９９６））。ＣＸＣＲ４は、培養内皮細胞に発現していることも報告されている（Ｖｏｌｉｎ，Ｍ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４２，４６−５３（１９９８））。
【０００８】
また、本発明者らは、上記ＣＸＣＲ４が、発生途上の血管内皮細胞に発現すること、ＣＸＣＲ４またはそのリガンドであるＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１を欠くマウスにおいては、消化器系に供給される大型の血管の形成欠陥を示すことを見出した。係る知見は、ＣＸＣＲ４及びＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１シグナル系が消化管を栄養する中動静脈の形成に必須であることを意味する。さらに、本発明者らは、ＣＸＣＲ４を欠くマウスは、胎生致死性であり、ＰＧＳＦ／ＳＤＦ−１を欠くマウスで見られるのと同様であることを見出した。係る知見は、ＣＸＣＲ４がＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の生理的に最も主要なレセプターであることを示唆するものである。
【０００９】
本発明者らによる以上の知見に基づき、癌組織の維持、拡大において血管形成は必須であることから、ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質は血管形成を阻害し、従って、有効な抗癌剤となることが考えられる。
【００１０】
また、同様にＣＸＣＲ４を阻害する物質が、血管新生が関与する疾患の治療剤となることが考えられる。
【００１１】
さらに、ＣＸＣＲ４に基づく作用を促進することで、血管形成を促進し、血管形成が望まれる疾患の治療剤となることが考えられる。
【００１２】
より詳しくは、本発明は、以下にまとめたように、ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を有効成分とする血管形成抑制剤、抗固形癌剤、血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤を提供する。また、本発明はＣＸＣＲ４に基づく作用を増強する物質を有効成分として含有する組織修復剤等を提供する。
【００１３】
すなわち、本発明は、ＣＸＣＲ４阻害剤を有効成分として含有する血管形成抑制剤を提供する。
【００１４】
本発明はまた、ＣＸＣＲ４阻害剤を有効成分として含有する抗固形癌剤を提供する。
【００１５】
本発明はまた、ＣＸＣＲ４阻害剤を有効成分として含有する血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＣＸＣＲ４増強剤を有効成分として含有する組織修復剤を提供する。
【００１７】
ある大きさを超えた癌組織の維持、拡大においてこの中等大動静脈の形成は必須であるため、本発明に係る血管形成抑制剤は、ＣＸＣＲ４またはＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１シグナル系をブロックし、癌組織の維持、拡大を抑制するものである。
【００１８】
また、本発明により得られた知見は、ＣＸＣＲ４及びＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１シグナル系が普遍的な血管形成に働いている可能性を示唆している。従って癌の種類や血管新生を重要な病態形成要因とする疾患によっては、ＣＸＣＲ４及びＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１が病態形成に深く関与している可能性があり、この場合ＣＸＣＲ４またはＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１を単独または他の分子と同時にブロックすることにより、これらの疾患を抑制できる可能性がある。
【００１９】
なお、本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などに対する略号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用に墓づく略号である。それらの例を以下に示す。またアミノ酸の場合は、光学異性体があり得るときは特に明示しない限りＬ体を示す。
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ：アデニン
Ｔ：チミン
Ｇ：グアニン
Ｃ：シトシン
ＲＮＡ：リボ核酸
ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸
ＧあるいはＧｌｙ：グリシン
ＡあるいはＡｌａ：アラニン
ＶあるいはＶａｌ：バリン
ＬあるいはＬｅｕ：ロイシン
ＩあるいはＩｌｅ：イソロイシン
ＳあるいはＳｅｒ：セリン
ＴあるいはＴｈｒ：スレオニン
ＣあるいはＣｙｓ：システイン
ＭあるいはＭｅｔ：メチオニン
ＥあるいはＧｌｕ：グルタミン酸
ＤあるいはＡｓｐ：アスパラキン酸
ＫあるいはＬｙｓ：リシン
ＲあるいはＡｒｇ：アルギニン
ＨあるいはＨｉｓ：ヒスチジン
ＦあるいはＰｈｅ：フェニルアラニン
ＹあるいはＴｙｒ：チロシン
ＷあるいはＴｒｐ：トリプトファン
ＰあるいはＰｒｏ：プロリン
ＮあるいはＡｓｎ；アスパラギン
ＱあるいはＧｌｎ：グルタミン
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＣＸＣＲ４遺伝子の標的戦略を示す図である。ここで、上は野生型ＣＸＣＲ４対立遺伝子を、中は、標的ベクターを、および下は、予想変異対立遺伝子を示す。また、遺伝子の翻訳領域は黒四角で示される。白四角は５’および３’非翻訳領域を示す。点線は、標的ベクターに使用された相同な断片を示す。プローブＡは、サザンハイブリダイゼーション用の外部プローブである。制限酵素位置はそれぞれ、Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｓｈ、ＳｐｈＩ；Ｘ、ＸｈｏＩである。
【図２Ａ】野生型（＋／＋）およびヘテロ変異（＋／−）マウスのテールＤＮＡのサザンブロット分析を示す写真である。プローブＡにより同定された、１１．８ｋｂ野生型および８．２ｋｂ標的対立遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片が示されている。
【図２Ｂ】ＣＸＣＲ４発現のＲＴ−ＰＣＲ増幅分析を示す写真である。全ＲＮＡはＥ１８．５の野生型およびホモ変異胚から調製し、さらにＣＸＣＲ４特異的プライマーで増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅はまた、増幅可能なＲＮＡの存在のコントロールとして、普遍的に発現しているＧ３ＰＤＨ ｍＲＮＡを用いた。
【図３】野生型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１３．５での腸間膜と中腸ループ領域での胃腸系血管欠損を示すものであり、腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。矢印は、野生型腸間膜の小腸に供給する上腸間膜動脈又は静脈よりの大分枝を示す。ｄｕは十二指腸、ｐは中間腸ループの近位を、ｄｍは中間腸ループの末梢部を示す。
【図４】野生型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１３．５での腸間膜の断面での胃腸系血管欠損を示すものであり、腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。ａは動脈、ｖは静脈を示す。
【図５】野生型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１７．５での空腸での胃腸系血管欠損を示すものであり、腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。矢印は、野生型腸間膜の小腸に供給する上腸間膜動脈又は静脈よりの大分枝を示す。
【図６】野生型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１７．５でのより遠位の空腸での胃腸系血管欠損を示すものであり、腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。矢印は、野生型腸間膜の小腸に供給する上腸間膜動脈又は静脈よりの大分枝を示す。
【図７】変異型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１３．５での腸間膜と中腸ループ領域での胃腸系血管欠損を示すものであり、変異型の腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。ｐは中間腸ループの近位を、ｄｍは中間腸ループの末梢部を示す。
【図８】変異型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１３．５での染色した腸間膜の断面での胃腸系血管欠損を示すものであり、変異型の腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。
【図９】異型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１７．５での空腸での胃腸系血管欠損を示すものであり、変異型の腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。
【図１０】変異型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１７．５でのより遠位の空腸での胃腸系血管欠損を示すものであり、変異型の腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。
【図１１】変異型のＣＸＣＲ４−／−胚におけるＥ１６．５での変異マウスの未染色の腸出血様病変の胃腸系血管欠損を示すものであり、変異型の腸間膜および腸の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。
【図１２Ａ】野生型、Ｅ１３．５での抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による胃の免疫染色の結果を示す写真である。矢印は野生型にのみ観察される大型の血管を示す。
【図１２Ｂ】変異型、Ｅ１３．５での抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による胃の免疫染色の結果を示す写真である。
【図１２Ｃ】野生型、Ｅ１５．５での抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による胃の免疫染色の結果を示す写真である。写真内に挿入された写真は、Ｅ１５．５での染色した胃の壁内の大型の血管のヘマトキシリン−エオジン染色された断面を示す。矢印は野生型にのみ観察される大型の血管を示す。
【図１２Ｄ】変異型、Ｅ１５．５での抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による胃の免疫染色の結果を示す写真である。
【図１３Ａ】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。野生型の中腸ループにつながる腸間膜の連続切片において、ヘマトキシリン-エオジンで染色した。ｍは、腸間膜、ｉは、小腸、ａは上腸間膜動脈、ｖは上腸間静脈を示す。
【図１３Ｂ】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。ＣＸＣＲ４特異的プローブとハイブリダイズした。矢印矢頭は、腸間膜血管の染色された内皮細胞を示す。
【図１３Ｃ】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１特異的プローブとハイブリダイズした。腸間膜内の内皮細胞を取り巻く間葉細胞にＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１が発現している。
【図１３Ｄ】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。野生型の中腸ループにつながる腸間膜の連続切片において、ヘマトキシリン−エオジンで染色した。図１３Ｄは、図１３Ａの上腸間膜動脈から生じる血管の拡大図であり、血管内皮細胞にＣＸＣＲ４の強い発現を認めた。
【図１３Ｅ】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。ＣＸＣＲ４特異的プローブとハイブリダイズした。図１３Ｅは、図１３Ｂの上腸間膜動脈から生じる血管の拡大図であり、血管内皮細胞にＣＸＣＲ４の強い発現を認めた。矢印矢頭は、腸間膜血管の染色された内皮細胞を示す。
【図１３Ｆ】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。野生型Ｅ１８．５胚の骨髄の断面であり、造血細胞にＣＸＣＲ４が発現し、紡錘型のストローマ細胞には発現していない。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明に係る血管形成抑制剤、抗固形癌剤、又は血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤は、ケモカインレセプターであるＣＸＣＲ４の作用を阻害する物質を有効成分として含む。また、本発明に係る組織修復剤は、該ＣＸＣＲ４の作用を増強する物質を有効成分として含有する。
【００２２】
ＣＸＣＲ４のアミノ酸配列については、すでに知られている。具体的にはヒトＣＸＣＲ４及びマウスＣＸＣＲ４のアミノ酸配列は、各々配列番号１及び３に示される。また、ヒトＣＸＣＲ４及びマウスＣＸＣＲ４の塩基配列は、各々配列番号２（塩基位置１〜１０５６）及び４（塩基位置１〜１０７７）に示される。
【００２３】
ＣＸＣＲ４に結合するリガンドであるＳＤＦ−１についても既にそのアミノ酸配列が知られている。ＳＤＦ−１にはアミノ酸配列の長さが異なる２種類、すなわちＳＤＦ−１−α及びＳＤＦ−１−βが存在する。具体的にはヒトＳＤＦ−１−αのアミノ酸配列は配列番号５に、塩基配列は配列番号：６（塩基位置４７４〜７４０）に示される。ヒトＳＤＦ−１−βは、ヒトＳＤＦ−１−αのＣ末端側にさらに４つのアミノ酸残基Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ（配列番号：９）が付加されている。
【００２４】
マウスＳＤＦ−１−αのアミノ酸配列は配列番号：７に、塩基配列は配列番号：８（塩基位置８２〜３４８）に示される。マウスＳＤＦ−１−βは、マウスＳＤＦ−１−αのＣ末端側にさらに４つのアミノ酸残基Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ（配列番号：１０）が付加されている。ヒト及びマウスＳＤＦ−１はアミノ酸１位のＭｅｔから２１位のＧｌｙまでがシグナル配列である。
【００２５】
これまでに知られているＣＸＣケモカインとしては、前記ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の他，ＩＬ−８（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ．，Ｔ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，９２３３−９２３７（１９８７））、ＮＡＰ−２（Ｗａｌｚ．Ａ，ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎ．，１５９，９６９−９７５（１９８９））、ＮＡＰ−４，ＧＲＯα（Ｒｉｃｈｍｏｎｄｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６，１８５−１９８（１９８８））、ＧＲＯβ（Ｈａｓｋｉｌｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，７７７３２−７７３６（１９９０））、ＧＲＯγ（Ｈａｓｋｉｌｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、（１９９０）前出）、ＧＣＰ−２（Ｐｒｏｏｓｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０，１０００−１０１０（１９９３）、ＥＮＡ−７８（Ｗａｙｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４，１３５５−１３６２（１９９１））、ＰＦ−４（Ｄｅｕｅｌ，Ｔ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４，２２５６−２２５８（１９７７））、及びＩＰ−１０（Ｄｅｗａｌｄ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，３２，８１−８４（１９９２）が挙げられる。
【００２６】
本発明において使用可能なＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質については特に限定はされず、ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害し、結果として血管新生を阻害する物質であればよい。
【００２７】
具体的には、（ｉ）リガンド（ＳＤＦ−１）とレセプター（ＣＸＣＲ４）との結合自体を阻害することに基づく物質、（ｉｉ）ＣＸＣＲ４から核へのシグナル伝達を阻害することに基づく物質、（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４自体の発現を阻害する物質、（ｉｖ）ＳＤＦ−１自体の発現を阻害する物質、が挙げられる。
【００２８】
（ｉ）ＳＤＦ−１とＣＸＣＲ４との結合自体を阻害する物質として、ＳＤＦ−１を阻害する物質とＣＸＣＲ４を阻害する物質がある。
【００２９】
ＳＤＦ−１を阻害する物質は、より具体的にはＣＸＣＲ４に対しＳＤＦ−１と拮抗的に競合し阻害する物質とＳＤＦ−１に結合してＣＸＣＲ４へのＳＤＦ−１の結合を阻害する物質がある。ＣＸＣＲ４に対しＳＤＦ−１と拮抗的に競合し阻害する物質として、具体的にはＳＤＦ−１と類似の構造を有する蛋白質、その蛋白質と他のペプチド又はポリペプチドとの融合蛋白質、ＳＤＦ−１の部分ペプチド及びＳＤＦ−１の結合部位と類似の構造を有する低分子化合物等が挙げられる。
【００３０】
ＳＤＦ−１に結合してＣＸＣＲ４へのＳＤＦ−１の結合を阻害する物質として、具体的には抗ＳＤＦ−１抗体、その結合活性を有する抗体断片、ＳＤＦ−１に対する結合活性を有する融合タンパク質、ＳＤＦ−１の構造変化を誘導する物質、及びＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４との結合部位に結合する低分子化合物等が挙げられる。
【００３１】
ＣＸＣＲ４を阻害する物質は、より具体的にはＳＤＦ−１との結合においてＣＸＣＲ４と拮抗的に競合して阻害する物質とＣＸＣＲ４に結合してＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害する物質がある。ＳＤＦ−１との結合においてＣＸＣＲ４と拮抗的に競合して阻害する物質として、具体的にはＣＸＣＲ４と拮抗的に阻害する可溶性ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ４と類似の構造を有するタンパク質、そのタンパク質と他のペプチド又はポリペプチドとの融合タンパク質、又はＣＸＣＲ４部分ペプチド及びＣＸＣＲ４の結合部位と類似の構造を有する低分子化合物等が挙げられる。
【００３２】
ＣＸＣＲ４に結合してＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害する物質として、具体的には抗ＣＸＣＲ４抗体、その結合活性を有する抗体断片、ＣＸＣＲ４に対する結合活性を有する融合タンパク質、ＳＤＦ−１の構造変化を誘導する物質及びＣＸＣＲ４のＳＤＦ−１結合部位に結合する低分子化合物等が挙げられる。ＳＤＦ−１とＣＸＣＲ４との結合自体を阻害する物質の具体例は、Ｔ２２（Ｔ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３８９−１３９３（１９９７）、ＡＬＸ４０−４Ｃ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３９５−１４００（１９９７）、ＡＭＤ３１００（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３８３−１３８８（１９９７），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，４，７２−７７（１９９８））等である。これらの物質の作成方法については、例えばＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１１８９−１１９１（１９９７）に記載の方法に準じて可能である。
【００３３】
（ｉｉ）ＣＸＣＲ４から核へのシグナル伝達を阻害することに基づく物質としては、係る作用を有する物質であれば特に制限はない。ＣＸＣＲ４から核へのシグナル伝達を阻害することに基づく物質としては、Ｇタンパク共役タンパク質の下流に存在するシグナル伝達系の阻害剤、例えばＭＡＰＫカスケード阻害剤、ホスホライペースＣ（ＰＬＣ）の阻害剤、ＰＩ３キナーゼ基ナーゼ阻害剤等が挙げられる。
【００３４】
（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４自体の発現を阻害する物質として、細胞上からみかけ上ＣＸＣＲ４を消失させる物質及びＣＸＣＲ４自体の発現を阻害する物質が挙げられる。細胞上からみかけ上ＣＸＣＲ４を消失させる物質とは、具体的にはＣＸＣＲ４のダウンレギュレーションを誘導する物質である。ＣＸＣＲ４のダウンレギュレーションの誘導とは、具体的には細胞膜に作用して細胞膜の流動性を変化させ、細胞膜上からＣＸＣＲ４を消失させる作用を意味する。このような作用を有する物質として、例えばデキサメタゾン等が挙げられる。
【００３５】
ＣＸＣＲ４自体の発現を阻害する物質として、具体的にはアンチジーン、アンチセンス（アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスベクターにより発現されるアンチセンスＲＮＡ）、リボザイム及びＣＸＣＲ４の発現調節部位、例えばプロモーターやエンハンサー等に対し阻害する物質が挙げられる。
【００３６】
後述の実施例において、ＣＸＣＲ４遺伝子の一部を含むベクターを用いてＣＸＣＲ４を欠損させたことにより、血管形成が抑制されたことが明らかとなった。従って、ＣＸＣＲ４のアンチジーン、アンチセンス又はリボザイム等によりＣＸＣＲ４を阻害すれば、血管形成が抑制される。
【００３７】
本発明で好ましく使用可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＣＸＣＲ４に対するＳＤＦ−１の遺伝子、又はＣＸＣＲ４に基づくシグナル系に関わる物質の遺伝子と選択的にハイブリダイズし得るヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はヌクレオチド誘導体、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド等が含まれる。本発明は例えば、配列番号：２に示されるヒトＣＸＣＲ４遺伝子の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００３８】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：２に示される塩基配列中の連続する少なくとも２０個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、前記連続する少なくとも２０個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含む、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３９】
ここでいう「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補的であるもののみならず、ＤＮＡ又はｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号：２に示される塩基配列に選択的に安定にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在していてもよい。選択的に安定にハイブリダイズするとは、少なくとも２０個、好ましくは３０個の連続したヌクレオチド配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有するものを示す。尚、本明細書において相同性とは同等性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す。
【００４０】
本発明において便用されるオリゴヌクレオチド誘導体がデオキシリボヌクレオチドの場合、各々の構造は化１に示したとおりである。
【００４１】
【化１】
【００４２】
ここで、Ｘは独立して酸素（Ｏ）、イオウ（Ｓ）、低級アルキル基あるいは一級アミン又は二級アミンのいずれであってもよい。Ｙは独立して酸素（Ｏ）あるいはイオウ（Ｓ）のいずれでもよい、Ｂはアデニン、グアニン、チミン、あるいはシトシンのいずれかから選ばれ、主としてヒトＣＸＣＲ４遺伝子のＤＮＡ又はｍＲＮＡの相補的オリゴヌクレオチドである。Ｒは独立して水素（Ｈ）又はジメトキシトリチル基あるいは低級アルキル基である。ｎは７−２８である。
【００４３】
好ましいオリゴヌクレオチド誘導体としては、修飾されていないオリゴヌクレオチドだけではなく、下に示すごとく、修飾されたオリゴヌクレオチドでもよい。このような修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
【００４４】
【化２】
【００４５】
これらのオリゴヌクレオチド修飾体は、次の通り常法により得ることができる。化１のＸ及びＹがＯであるオリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成装置、例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製によって容易に合成される、合成方法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等で得ることができる。
【００４６】
Ｘが低級アルコキシ基であるリン酸トリエステル修飾体は、常法、例えば化学合成で得られたオリゴヌクレオチドをトシルクロリドのＤＭＦ／メタノール／２，６−ルチジン溶液で処理することにより得ることができる。Ｘがアルキル基であるアルキルホスホネート修飾体は、常法、例えばホスホアミダイトを用いて得ることができる。ＸがＳであるホスホロチオエート修飾体は、常法、例えばイオウを用いた固相合成法あるいはテトラエチルチウラムジスルフィドを用いて、固相合成法により得ることができる。Ｘ、Ｙが共にＳであるホスホロジチオエート修飾体は、例えばヒスアミダイトをチオアミダイトに変換し、イオウを作用させることにより固相合成法により得ることができる。Ｘが一級アミンあるいは二級アミンであるホスホロアミデート修飾体は、例えばハイドロジェンホスホネートを一級あるいは二級アミンで処理することにより固相合成法により得ることができる。あるいは、アミダイトをｔｅｒｔ−ブチルハイドロパーオキサイドで酸化しても得ることができる。
【００４７】
精製及び純度確認は、高速液体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で行うことができる。分子量の確認は、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ又はＦａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙで行うことができる。
【００４８】
本発明で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、ＣＸＣＲ４レセプター又はそのリガンド、さらにＣＸＣＲ４に基づくシグナル伝達物質の産生細胞に作用して、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、該ポリペプチドの発現を抑制することにより、結果的にＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する効果を有する。
【００４９】
本発明で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは結果として血管の新生を阻害することにおいて有用である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合有する血管新生阻害剤は、癌、特には固形癌の治療剤として有用である。
【００５０】
ＣＸＣＲ４アンチセンスベクターを作製するには、通常用いられる方法に従えばよい。すなわち、ＣＸＣＲ４をコードするｃＤＮＡをＡＡＶベクター（アデノ随伴ベクター）、ＭＬＶベクター（マウス白血病ウィルスベクター）、又はＨＩＶベクター等にアンチセンス方向に連結する。アンチセンス方向とは、プロモーターの下流に導入するｃＤＮＡの３’側から連結することを意味する。これらのベクターに含まれるｃＤＮＡから合成されたアンチセンスＲＮＡは、宿主のＣＸＣＲ４の発現を構成的に抑制する。
【００５１】
アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡは、例えばリポソーム法、ＨＶＪリポソーム法、正電荷リポソーム法等の手段を用いて細胞に導入することができる。ＣＸＣＲ４アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを導入することにより、構成的にＣＸＣＲ４の発現を阻害する事が可能である。
【００５２】
（ｉｖ）ＣＸＣＲ４に対するＳＤＦ−１自体の発現を阻害する物質として、ＳＤＦ−１の発現阻害のためのアンチセンス及びＳＤＦ−１の発現調節部位、例えばプロモーター等に対し阻害する物質が挙げられる。
【００５３】
上述した本発明で使用可能な抗体、例えば抗ＳＤＦ−１抗体又は抗ＣＸＣＲ４抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体は上述の性質を有する抗体である。
【００５４】
抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をクローニングする。
【００５５】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ菌類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。
【００５６】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株が適宜使用される。前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。
【００５７】
得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。このように得られたハイブリドーマから通常用いられる方法に従い抗体を取得すればよい。
【００５８】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原蛋白質または抗原発現細胞で感作し、感作Ｂリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、所望の抗原または抗原発現細胞への結合活性を育する所望のヒト抗体を得ることもできる。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを育するトランスジェニック動物に抗原または抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい。
【００５９】
本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｎｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ １９９０参照）。
【００６０】
また、本発明には、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３）、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３）を使用できる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００６１】
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域（Ｃ領域）からなり、ヒト型化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）およびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明における有効成分として有用である。
【００６２】
本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、抗体の断片やその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる。
【００６３】
発明に使用される抗体を取得するために、ファージライブラリー法を用いることができる。（Ｍａｒｋｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３３５，７３０−７３３）例えばヒトＢ細胞よりヒト抗体Ｖ領域、例えばｓｃＦｖをコードする遺伝子からなるｃＤＮＡライブラリーを得、このｃＤＮＡライブラリーをファージベクターに、例えばＭ１３ファージ表面提示ベクターに導入し、これを大腸菌に感染させる。大腸菌でｃＤＮＡライブラリーは発現され、細胞表面に抗体Ｖ領域が産生される。所望の抗原をコートしたプレートに上で、抗原結合活性に基づいて選択することにより、所望の抗体をコードする遺伝子を得ることができる。
【００６４】
ファージライブラリー法を応用してチェインシャッフリング法を用い、抗原に対しより強い結合活性を有する抗体を得ることができる。（Ａｋａｍａｔｓｕ，Ｙ．＆ Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ，Ｎ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７，２７３−２８６（１９９４））。すなわち、いったん分離した抗体遺伝子のＶ領域の一方（例えばＶＨ）を固定し、Ｂ細胞から調製したもう一方（例えばＶＬ）混合体との間で新たにライブラリーを作製し、抗原により強く結合するクローンを分離すればよい。
【００６５】
また、抗体のアミノ酸配列に人為的突然変異を導入することによっても、抗原に対しより強い結合活性を有する抗体を得ることができる。（Ａｋａｍａｔｓｕ，Ｙ．＆ Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ，Ｎ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２７，２７３−２８６（１９９４））。すなわち、クローニングした抗体Ｖ領域をコードする遺伝子に突然変異を導入し、この遺伝子を上記ファージライブラリー法で発現させることにより、抗原に対しより強い結合活性を有する抗体をコードする遺伝子を得ることができる。
【００６６】
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本明細書でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
【００６７】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本明細書でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００６８】
前記のように発現・産生された抗体は、通常用いられる方法に従い、宿主細胞内外から分離し均一にまで精製することができる。また、濃度測定は吸光度の測定またはＥＬＩＳＡ等により行うことができる。
【００６９】
本発明で使用されるＣＸＣＲ４阻害物質として、ＳＤＦ−１又はＣＸＣＲ４と類似の構造を有するタンパク質（類似構造タンパク質）が挙げられる。この物質は、ＳＤＦ−１又はＣＸＣＲ４との結合活性を有し、且つその生物学的活性を伝達しない物質である。即ちＣＸＣＲ４に対しＳＤＦ−１と競合的に結合するが、ＳＤＦ−１の生物学的活性を伝達しないため、ＳＤＦ−１によるシグナル伝達を遮断する。
【００７０】
ＳＤＦ−１類似構造タンパク質は、ＳＤＦ−１のアミノ酸配列のアミノ酸残基を置換することにより変異を導入して作製される。ＳＤＦ−１類似構造タンパク質のもととなるＳＤＦ−１はその由来を問わないが、抗原性等を考慮すれば、好ましくはヒトＳＤＦ−１である。具体的には、ＳＤＦ−１のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、ＷＨＡＴＩＦ（Ｖｒｉｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ（１９９０）８，５２−５６）を用いてその二次構造を予測し、さらに置換されるアミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。
【００７１】
適切な置換アミノ酸残基を決定した後、ヒトＳＤＦ−１遺伝子をコードする塩基配列を含むベクターを鋳型として、通常行われるＰＣＲ（ポリメレースチェインリアクション）法によりアミノ酸が置換されるように変異を導入することにより、ＳＤＦ−１類似構造タンパク質をコードする遺伝子が得られる。これを必要に応じて適当な発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じてＳＤＦ−１類似構造タンパク質を得ることができる。ＳＤＦ−１類似構造タンパク質として、Ｎ末端を欠失させたＳＤＦ−１が知られている（ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９７）１６，６９９６−７００７）。
【００７２】
本発明で使用されるＳＤＦ−１部分ペプチド又はＣＸＣＲ４部分ペプチドは、各々ＣＸＣＲ４あるいはＳＤＦ−１との結合活性を有し、且つＳＤＦ−１の生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、ＳＤＦ−１部分ペプチド又はＣＸＣＲ４部分ペプチドはＣＸＣＲ４又はＳＤＦ−１に結合し、これらを捕捉することによりＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を特異的に阻害する。
【００７３】
その結果、ＳＤＦ−１の生物学的活性を伝達しないため、ＳＤＦ−１によるシグナル伝達を遮断する。
【００７４】
ＳＤＦ−１部分ペプチド又はＣＸＣＲ４部分ペプチドは、ＳＤＦ−１又はＣＸＣＲ４のアミノ酸配列においてＳＤＦ−１とＣＸＣＲ４との結合に係わる領域の一部又は全部のアミノ酸配列からなるペプチドである。このようなペプチドは、通常１０〜８０、好ましくは２０〜５０、より好ましくは２０〜４０個のアミノ酸残基からなる。
【００７５】
ＳＤＦ−１部分ペプチド又はＣＸＣＲ４部分ペプチドは、ＳＤＦ−１又はＣＸＣＲ４のアミノ酸配列において、ＳＤＦ−１とＣＸＣＲ４との結合に係わる領域を特定し、その一部又は全部のアミノ酸配列を通常知られる方法、例えば遺伝子工学的手法又はペプチド合成法により作製することができる。
【００７６】
ＳＤＦ−１部分ペプチド又はＣＸＣＲ４部分ペプチドを遺伝子工学的手法により作製するには、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じて得ることができる。
【００７７】
ＳＤＦ−１部分ペプチド又はＣＸＣＲ４部分ペプチドをペプチド合成法により作製するには、ペプチド合成において通常用いられている方法、例えば固相合成法又は液相合成法を用いることができる。具体的には、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合成 監修矢島治明廣川書店１９９１年に記載の方法に準じて行えばよい。固相合成法としては、例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しようとするペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を結合させ、α−アミノ基及び側鎖官能基を適切な保護基で保護したアミノ酸をＣ末端からＮ末端方向の順番に１アミノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したアミノ酸又はペプチドのα−アミノ基の該保護基を脱離させる反応を交互に繰り返すことにより、ペプチド鎖を伸長させる方法が用いられる。固相ペプチド合成法は、用いられる保護基の種類によりＢｏｃ法とＦｍｏｃ法に大別される。
【００７８】
このようにして目的とするペプチドを合成した後、脱保護反応及びペプチド鎖の支持体から切断する。ペプチド鎖との切断反応には、Ｂｏｃ法ではフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸を、又Ｆｍｏｃ法ではＴＦＡを通常用いることができる。Ｂｏｃ法では、例えばフッ化水素中で上記保護ペプチド樹脂をアニソール存在下で処理する。次いで、保護基の脱離と支持体から切断しペプチドを回収する。
【００７９】
これを凍結乾燥することにより、粗ペプチドが得られる。一方、Ｆｍｏｃ法では、例えばＴＦＡ中で上記と同様の操作で脱保護反応及びペプチド鎖の支持体から切断反応を行うことができる。
【００８０】
得られた粗ペプチドは、ＨＰＬＣに適用することにより分離、精製することができる。その溶出にあたり、蛋白質の精製に通常用いられる水−アセトニトリル系溶媒を使用して最適条件下で行えばよい。得られたクロマトグラフィーのプロファイルのピークに該当する画分を分取し、これを凍結乾燥する。このようにして精製したペプチド画分について、マススペクトル分析による分子量解析、アミノ酸組成分析、又はアミノ酸配列解析等により同定する。
【００８１】
本発明で使用されるＳＤＦ−１の部分ペプチドあるいはＣＸＣＲ４の部分ペプチドは、各々ＣＸＣＲ４あるいはＳＤＦ−１に結合し、シグナルの伝達活性がないものであれば、その配列を問わない。ＳＤＦ−１の部分ペプチドおよびＣＸＣＲ４のペプチドについては、既に知られたアミノ酸配列を使用できる。例えば、リガンドとしてＳＤＦ−１の場合、配列表の配列番号５（ヒト）、および７（マウス）に記載されたアミノ酸配列が使用可能である。
【００８２】
本発明において使用可能なＣＸＣＲ４に基づく作用を増強する物質については特に限定されないが、ＳＤＦ−１を増強する物質として、ＳＤＦ−１自体、ＳＤＦ−１のアゴニスト、又はＳＤＦ−１の発現増強剤が挙げられる。さらに、レセプターＣＸＣＲ４を増強する物質としては、ＣＸＣＲ４自体、そのアゴニスト、又はＣＸＣＲ４の発現増強剤が挙げられる。
【００８３】
上記説明したように、本発明に係るＣＸＣＲ４阻害剤を有効成分として含む血管形成抑制剤を用いることにより、血管形成（Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を抑制可能となることから、固形癌に対する抗腫瘍効果（血管新生の抑制）血管肉腫（血管自体の癌）カポシ肉腫に対して抗腫瘍効果が発揮される。また、血管新生を病態形成要因とする疾患、具体的には慢性関節リウマチ、乾せん（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、糖尿病性網膜症に対して治療効果が発揮される。
【００８４】
ＣＸＣＲ４の作用を増強する物質を含む血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤を用いることにより、血管新生を促進させることが可能となり、心筋梗塞、術後の血管新生を伴う疾患、具体的には創傷治癒、骨の修復及びリモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）、軟骨の修復、毛髪の成長、心筋梗塞、脳梗塞および脳における外傷に対する治療効果が発揮される。
【００８５】
本発明において使用可能な血管新生阻害及び促進試験法は血管新生試験法を用い行える。このアッセイ方法についても特に制限はなく、通常公知の方法が好ましく使用できる（「がんの浸潤・転移研究マニュアル」がん転移研究会編、金芳堂発行、１９９４年、１５９〜１８２ページ）。具体的には、（ｉ）血管内皮細胞への影響を、腫瘍細胞が血管外に浸潤する際、血管内皮細胞が開裂するという知見に基づく血管内皮細胞間隔の開裂を測定する方法（ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの透過性から）、（ｉｉ）血管新生誘導因子としてその役割を生体内で発揮する候補因子を同定するためのｉｎｖｉｖｏ測定法として知られている角膜法、及び（ｉｖ）ＣＡＭ法（ｃｈｉｃｋｅｍｂｒｙｏｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ）、（ｖ）肉眼で誘導血管の量を測定する背部皮下法、（ｖｉ）血管内皮細胞の管腔形成の測定方法等が挙げられる。
【００８６】
抗腫瘍効果の確認には、移植モデルや移植転移モデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験又は癌細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験が挙げられる。具体的には、「がんの浸潤・転移研究マニュアル」がん転移研究会編、金芳堂発行、１９９４年、７〜１５８ページに記載の方法を使用することができる。
【００８７】
本発明に係る血管形成抑制剤、抗固形癌剤、治療剤、組織修復剤等は、経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。
【００８８】
有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０９ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。
【００８９】
本発明に係る血管形成抑制剤、抗固形癌剤、治療剤、組織修復剤等は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルキン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトニル、ラクトー
ス、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。
【００９０】
使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００９１】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって何等限定されるものではない。
【実施例】
【００９２】
ＣＸＣＲ４完全欠損マウスの作製および分析
ＣＸＣＲ４遺伝子座を含むゲノムＤＮＡを、マウス株１２９ＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）から単離した。
【００９３】
エクソン２の５’翻訳領域を含む１．１ｋｂゲノム断片をネオマイシン耐性遺伝子で置き換え、ヘルペスシンプレックスチミジンキナーゼ遺伝子を５’末端に連結した。
【００９４】
胚形成の１４．１日（以下、Ｅ１４．１とする）の細胞内に標的ベクターをエレクトロポレーションにより導入し、Ｇ４１８とガンシクロビルにより相同性組換えを選択し、ＰＣＲで同定した。
【００９５】
変異座の構造とＥＳ細胞コロニーでの単一の挿入物の存在をサザンハイブリダイゼーションで確認した。Ｎａｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．．Ｎａｔｕｒｅ３８２，６８５−６８８（１９９６）に記載の方法にしたがい、未分化胚芽細胞の注入により変異マウスを作製するために変異ＥＳ細胞コロニーを用いた。
【００９６】
サザンハイブリダイゼーション分析のため、テールＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ナイロンメンブレンに移し、５’側相同領域の５５０ｂｐのプローブＡとハイブリダイズさせた。
【００９７】
Ｅ１８．５の胚の胎仔肝臓から単離した３μｇの全ＲＮＡを出発材料として標準の方法に従いＲＴ−ＰＣＲを４０サイクル行った。６３０ｂｐのＰＣＲ産物をＣＸＣＲ４特異的プライマー，すなわち前方プライマー（配列番号：１１）及び後方プライマー（配列番号：１２）を用いて増幅した。組織学的分析及びフローサイトメトリー分析はＮａｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，６８５−６８８（１９９６）に記載の方法に準じて行った。
【００９８】
免疫組織学的染色は、Ａｄａｃｈｉ，Ｓ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．，Ｋａｔａｏｋａ，Ｈ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．−Ｉ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，５０７−５１４の方法に準じた。胚及び器官の切片を４％パラホルムアルデヒドで固定し、メタノールで脱水し、メタノール中３０％過酸化水素で脱色し、再度水和した。
【００９９】
ＰＢＳＭＴ（１％スキムミルク粉および０．３％ｖ／ｖ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ）でインキュベートした後、試料をＰＢＳＭＴ中、１：２５０希釈した抗−ＰＥＣＡＭ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と４℃一晩インキュベートした後、ＰＢＳＭＴで洗浄し、１：５００希釈ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ製）とＰＢＳＭＴ中４℃一晩インキュベートした。
【０１００】
その後、試料をよく洗浄し、胚を２５０μｇ／ｍｌジアミノベンジジン（同仁化学製）、０．０８％ＮｉＣｌ２を含むＰＢＳ中で３０分インキュベートした。過酸化水素を加えて、最終濃度０．０１％としてパーオキシダーゼ染色を行った。反応は約３０分後に止めた。
【０１０１】
Ｎａｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，６８５−６８８（１９９６）に記載の方法により、マウスＣＸＣＲ４又はＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１ｃＤＮＡの断片をプローブとしてアンチセンス転写を用いて行った。
【０１０２】
ＣＸＣＲ４の生理的機能を決定するため、ＣＸＣＲ４欠損マウスを作製した。すなわち、ＣＸＣＲ４遺伝子のうち、レセプター機能に重要なすべての膜貫通領域を含むエクソン２の大部分を削除し、その部分をネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）で置換できるようにしたターゲットベクターを構築した。この結果、相同組換え後、実質的にＣＸＣＲ４遺伝子が完全に削除されることとなる。
【０１０３】
図１は、ＣＸＣＲ４遺伝子の標的戦略を示す図（上、中、下とする）である。上には、野生型ＣＸＣＲ４対立遺伝子、中には標的ベクター、および下には予想変異対立遺伝子を示す。遺伝子の翻訳領域は黒四角で示される。白四角は５’および３’非翻訳領域を示す。点線は、標的ベクターに使用された相同な断片を示す。プローブＡは、サザンハイブリダイゼーション用の外部プローブである。ここで制限酵素位置をそれぞれ、Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｓｈ、ＳｐｈＩ；Ｘ、ＸｈｏＩとした。
【０１０４】
図２Ａは、野生型（＋／＋）およびヘテロ変異（＋／−）マウスのテールＤＮＡのサザンブロット分析を示す写真である。プローブＡにより同定された、１１．８ｋｂ野生型および８．２ｋｂ標的対立遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片が示されている。また、図２Ｂは、ＣＸＣＲ４発現のＲＴ−ＰＣＲ増幅分析を示す写真である。全ＲＮＡはＥ１８．５の野生型およびホモ変異胚から調製し、さらにＣＸＣＲ４特異的プライマーで増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅はまた、増幅可能なＲＮＡの存在のコントロールとして、普遍的に発現しているＧ３ＰＤＨ ｍＲＮＡを用いた。
【０１０５】
ＣＸＣＲ４ヘテロ（＋／−）変異を有するマウスを作製した。該マウスは健康でかつ妊娠可能であった。ＣＸＣＲ４ホモ（−／−）変異胚は胚形成のＥ１５．５まで予想された比で存在した。しかし、既に報告しているＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１欠損マウスと同様に（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，６８５−６８８（１９９６））、約半分のＣＸＣＲ４−／−胚はＥ１８．５で死亡し、ＣＸＣＲ４−／−新生仔は１時間以内に死亡した。
【０１０６】
胚形成時において、ＣＸＣＲ４の機能を明らかにするために、ＣＸＣＲ４の成育中の胚における発現をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより調べた。ＣＸＣＲ４転写物が、胚形成時において血管形成時の内皮に高いレベルで検出された。
【０１０７】
この知見に基づき、血管形成におけるＣＸＣＲ４遺伝子欠損の効果を調べた。卵黄および臍帯の血管は視覚的には正常であった。Ｅ１８．５のＣＸＣＲ４−／−胚の組織学的検査では、主な血管である大動脈、大静脈、頚動脈、頚静脈、腹腔動脈、腸間膜動脈および腸間膜静脈の存在が認められた。その後、器官の血管系を可視化するため、野生型及び変異胚の全組織調製物について、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体で免疫染色した。ＰＥＣＡＭ−１は胎生期を通じて、すべての内皮細胞において特異的かつ安定に発現することが知られている（Ｖｅｃｃｈｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６３，２４７−２５５（１９９４）、Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０，２５３９−２５５８（１９９４））。
【０１０８】
その結果、Ｅ１１．５までは胃、小腸、および腸間膜を含む胃腸組織において、高度に分岐した均一な血管系が野生型と変異型ともに認められた。Ｅ１２．５付近では、中腸ループに結合している腸間膜において大小の血管が再構成により形成されていることが認められた。Ｅ１３．５での野生型胚では図３に示されるように、腸管へ栄養する腸間膜動脈や腸間膜静脈から分岐する多くの大分枝が形成されていた。一方、Ｅ１３．５でのＣＸＣＲ４−／−胚の腸間膜では、これらの大分枝が存在せず、その代わりより小さな血管のみが生じていた。顕微鏡を用いた組織学的分析によれば、Ｅ１３．５での野生型胚の腸間膜には腸間膜動脈や腸間膜静脈が認められ、これより分岐した血管は動脈、静脈が対となっていた（図４）。これとは対照的に、ＣＸＣＲ４−／−胚の大部分の血管は図８に見られ
るように対ではなく一本であった。ただし、変異胚の腸間膜内の腸間膜動脈や腸間膜静脈は正常であった。Ｅ１７．５での野生型胚では、腸間膜の大型の血管は多くの分枝を出し腸管に達していた（図５と図６）。しかしながら、ＣＸＣＲ４−／−胚ではこのような腸間膜の大型の血管に相当する血管は実質的に欠損していた（図９と図６）。また、変異腸間膜では異常な分岐を示す大型の血管が認められた（図９と図６）。このような血管系の欠損により、大部分のＥ１６．５の変異胚の小腸には多数の出血様病変が見られた。この病変は腸を支配する循環系の異常によるものと考えられる（図１１）。
【０１０９】
以上の結果から、ＣＸＣＲ４は、小腸の正常な血管形成に必須であることが示された。その作用機序としてはＣＸＣＲ４は、腸間膜の血管の分岐及び／又は再構成に関与していると考えられる。
【０１１０】
胃の場合、野生型胚では、Ｅ１３．５までに、小弯側の間葉から分岐する大型の血管が形成され、腹側および背側表面全体に分布している（図１２Ａ、１２Ｃ）。組織学的解析によると、この血管はＥ１５．５の野生型マウスにおいて、図１２Ｃ内に挿入した写真で示されるように、静脈と動脈が対をなしていた。しかしながら、これに相当する血管は変異胚には認められなかった（図１２Ｂ、１２Ｄ）。胃を取り巻く小血管ネットワークの形成は、変異胚でも正常に見えた（図１２Ｄ）。
【０１１１】
Ｅ１８．５での変異胚の胃腸の組織学的分析では、器官形成に何等異常は認められなかった。例えば、変異マウスの胃、腸管の平滑筋層は、外層および内層それぞれ、縦方向および垂直方向に正常に認められた。
【０１１２】
図３〜６は、ＣＸＣＲ４−／−胚における胃腸系血管欠損を示す写真であり、野生型の腸間膜および腸の、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。図３はＥ１３．５での腸間膜と中腸ループ領域を示す。図５はＥ１７．５での空腸を示す。図６はＥ１７．５での空腸を示す。図７はＥ１３．５での染色した腸間膜の断面を示す。図３，５，６での矢印は、野生型腸間膜の小腸を栄養する上腸間膜動脈又は静脈よりの大型の分枝を示す。
【０１１３】
また、図７〜１１は、同様にＣＸＣＲ４−／−胚における胃腸系血管欠損を示す写真であり、変異型の腸間膜および腸の、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による免疫染色を示す写真である。図７はＥ１３．５での腸間膜と中腸ループ領域を示す。図９はＥ１７．５での空腸を示す。図１０はＥ１７．５での空腸を示す。図８はＥ１３．５での染色した腸間膜の断面を示す。図１１はＥ１６．５での変異マウスの未染色の腸出血様病変を示す。図９，１０での矢印は、変異マウスの走行、分岐が異常な大型の血管を示す。
【０１１４】
また、図１２Ａから１２Ｄは、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体による胃の免疫染色の結果を示す写真である。図１２Ａと１２ＢがＥ１３．５、図１２Ｃと１２ＤはＥ１５．５、図１２Ａと１２Ｇは野生型、図１２Ｂと１２Ｄは変異型を示す。図１２Ｃの写真内に挿入された写真は、Ｅ１５．５での染色した胃の壁内の大型の血管のヘマトキシリン−エオジン染色された断面を示す。図１２Ａと１２Ｃの矢印は野生型にのみ観察される大型の血管を示す。ｄｕは十二指腸、ｐは中間腸ループの近位を、ｄｍは中間腸ループの末梢部、ａは動脈、ｖは静脈を示す。
【０１１５】
これらの知見は、ＣＸＣＲ４−／−マウスにおける血管形成の異常は、消化管そのものの異常による二次的なものではないことを示している。このような血管形成の異常と同様の異常がＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１欠損マウスでも認められた。
【０１１６】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析によれば、Ｅ１２．５の野生型胚の腸間膜、腸壁及び胃壁の血管内皮細胞にＣＸＣＲ４転写物が発現していることが示された（図１３Ｂと１３Ｅ）。特に、腸間膜動脈の分枝の内皮細胞に強い発現が観察された（図１３Ｂ、１３Ｅ）。これとは対照的に、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１は腸間膜の内皮細胞をとりまく間葉細胞において高いレベルで発現していたが、腸と胃の壁や内皮細胞には発現していなかった（図１３Ｃ）。
【０１１７】
図１３Ａから１３Ｆはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる胃腸組織でのＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の発現の解析を示す写真である。野生型の中腸ループにつながる腸間膜の連続切片を用いて、１枚はヘマトキシリン−エオジンで染色し（図１３Ａと１３Ｄ）、もう１枚はＣＸＣＲ４特異的プローブとハイブリダイズし（図１３Ｂと１３Ｅ）、更にもう１枚はＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１特異的プローブとハイブリダイズした（図１３Ｅ）。図１３Ｄと１３Ｅは、図１３Ａと１３Ｂの上腸間膜動脈から生じた分岐血管の拡大図であり、血管内皮細胞にＣＸＣＲ４の強い発現があることが示された。図１３Ｂと１３Ｅの矢印矢頭は、腸間膜血管のＣＸＣＲ４の発現が認められる内皮細胞を示す。腸間膜内の内皮細胞を取り巻く間葉細胞でＰＲＳＦ／ＳＤＦ−１が発現している（図１３Ｅ）。野生型Ｅ１８．５胚の骨髄の断面であり、造血細胞内でＣＸＣＲ４が発現し、紡錘型のストローマ細胞で発現していない（図１３Ｆ）。ｍは、腸間膜、ｉは、小腸、ａは上腸間膜動脈、ｖは上腸間静脈を示す。
【０１１８】
得られた発現パターンは、間葉細胞により産生されたＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１が内皮細胞上のＣＸＣＲ４に作用することを示し、これより腸間膜の間葉において極めて重要な役割を果たすサイトカインによるパラクラインシグナルの存在が強く示唆される。このことからＣＸＣＲ４−／−およびＰＲＳＦ／ＳＤＦ−１−／−の胃で大血管を欠損する表現型も、胃の小弯に沿う間葉での血管の分岐または再構成の異常による結果である可能性がある。
【０１１９】
他の器官で血管系を調べるため、卵黄嚢、脳、心臓を抗ＰＥＣＡＭ−１モノクローナル抗体で染色した。卵黄嚢（Ｅ１２．５，Ｅ１４．５）、頭領域（Ｅ１１．５）、心臓（Ｅ１２．５−Ｅ１４．５）の大および小血管の形成は、ＣＸＣＲ４−／−、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１−／−と、野生型の間で明らかな差はなかった。
【０１２０】
以上の実験結果をまとめると、ＣＸＣＲ４とＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１は血管内皮細胞に作用して血管分岐又は再構成を制御することにより、胃腸組織へ供給する成熟血管系の形成に必須であることが示された。
【０１２１】
フローサイトメトリー分析によると、ＣＸＣＲ４−／−マウスの胎仔肝臓のＢ細胞前駆細胞が極めて減少していることが明らかとなった。組織学的分析では、骨髄腔の骨髄球系細胞およびその前駆細胞が認められなかった。さらに、Ｅ１８．５の変異マウスの心臓では心室中隔の膜性部の欠損が見いだされた。これらの異常はＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１欠損マウスで観察された表現型と非常に似ており、ＣＸＣＲ４が、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の主要な生理的受容体であるという考えを支持する。
【０１２２】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＥ１８．５での野生型マウスの骨髄においては、造血細胞においてＣＸＣＲ４転写物が発現していたがＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１転写物の発現が認められた紡錘型ストローマ細胞にはＣＸＣＲ４転写物が発現されなかった（図（Ｆｉｇ３ｄ））。これらの発現パターンの結果は、骨髄においてパラクラインシグナルの存在を意味するものである。
【０１２３】
今まで報告されたＦｌｋ−１、Ｔｉｅ−２などの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）と、ＶＥＧＦ、アンジオポイエチン−１、ＰＤＧＦ−Ｂのようなそのリガンドの変異マウスを用いた解析によれば、それらは血管系の発育に重要な役割を果たし、それらの多くは、発生における血管形成のごく初期過程及び体のいたるところでの血管形成（卵黄嚢、必要、胚外の脈管構造を含む）に必要であることが知られている（Ｓｈａｌａｂｙ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３７６，６２−６６（１９９５）、Ｆｏｎｇ，Ｇ．−Ｈ．，Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．＆ Ｂｒｅｉｔｍａｎ，Ｍ．Ｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３７６，６６−７０（１９９５）、Ｄｕｍｏｎｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ．８，１８９７−１９０９（１９９４）、Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３７６，７０−７４（１９９５）、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ８８０，４３５−４３９（１９９６）、Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８０，４３９−４４２（１９９６）、Ｓｕｒｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ８７，Ｉ１７１−１１８０（１９９６））。
【０１２４】
これとは対照的に、ＣＸＣＲ４およびＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１の作用は発生においてより後期であり、器官特異的である。Ｔｉｅ−２およびそのリガンドであるアンジオポイエチン−１は、初期の血管系で分岐および／または再構成に必要と考えられている（Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３７６，７０−７４（１９９５）、Ｓｕｒｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ８７，Ｉ１７１−１１８０（１９９６））。消化管での成熟血管系形成における役割は明らかでない。また、Ｔｉｅ−２又はアンジオポイエチン−／−マウスで観察される卵黄嚢血管系における明確な異常は、ＣＸＣＲ４またはＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１−／−マウスでは認められなかった。一方、ＰＦ４（Ｍａｉｏｎｅ，Ｔ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，７７−７９（１９９０））、ＩＬ−８（Ｋｏｃｈ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８，１７９８−１８０１（１９９２））、ＩＰ−１０（Ｌｕｓｔｅｒ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２，２１９−２３１（１９９５））、およびＧｒｏβ（Ｃａｏ，Ｙ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２，２０６９−２０７７（１９９５））といったＣＸＣケモカインも血管新生制御因子であることが報告されている。しかし、内皮細胞でのレセプターの発現や生理学的役割はいまだ解明されていない。凝固因子Ｖ（Ｃｕｉ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８４，６６−６８（１９９６））及び組織因子（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ８８３，７８−７５（１９９６））は、卵黄嚢血管系に必須であることが示されているが、これらの因子がいかなる受容体を介して作用するかは明らかでない。
【０１２５】
以上の背景から、本発明はケモカインと７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体という血管形成に必須の新規なシグナル系の存在を示したと言える。
【０１２６】
最近、ヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質Ｇα１３のαサブユニットを欠損するマウスでは、卵黄嚢の血管系が形成されないこと及び胚体の小血管が拡大するなどの異常があることが示された。その表現型はＣＸＣＲ４欠損マウスとは異なるが、ＣＸＣＲ４がＧα１３と共役する可能性について検討する必要はある。
【０１２７】
ＣＸＣＲ４とＣＣＲ５は、それぞれＴ細胞系親和性およびマクロファージ親和性のＨＩＶ−１株が宿主細胞に感染するのに必須のコレセプターであることが知られている（Ｆｅｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２，８７２−８７７（１９９６）、Ｆａｕｃｉ，Ａ．Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ ８８４，５２９−５８４（１９９６））。このうちＣＣＲ５を欠損したホモ変異体の人々が見出されており、これらの人々は、ＨＩＶ−１感染に抵抗性であり何ら健康に問題はない（Ｌｉｕ，Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ８６，３６７−３７７（１９９６）、Ｓａｍｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３８２，７２２−７２５（１９９６）、Ｄｅａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３，１８５６−１８６１）。
【０１２８】
しかし、もう一方のＣＸＣＲ４に関しては、ＣＸＣＲ４欠損マウスが胚時期に致死性であることから、ヒトでのＣＸＣＲ４ホモ欠損はありえないことが強く示唆された。ただし、Ｔ細胞系親和性ＨＩＶ−１抵抗性の長期生存者においては他の遺伝的要因または生存可能なＣＸＣＲ４ホモ変異が存在する可能性は残されている。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
ＣＸＣＲ４ノックアウトマウスおいては血管の形成が抑制されたという本発明による知見に基づき、ＣＸＣＲ４の作用を阻害する物質を有効成分として含有する血管形成抑制剤、また癌組織の維持、拡大において血管形成は必須であることから、抗固形癌剤の作成、及びＣＸＣＲ４の作用を阻害する物質を有効成分として含有する血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤の作成、さらには、ＣＸＣＲ４の作用を増強する物質を有効成分として含有する組織修復剤の作成に用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を有効成分として含有してなる血管形成を抑制する治療剤。
【請求項２】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を有効成分として含有してなる固形癌に対する治療剤。
【請求項３】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を有効成分として含有してなる血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤。
【請求項４】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を有効成分として含有してなる組織を修復する治療剤。
【請求項５】
前記物質が、ＳＤＦ−１とＣＸＣＲ４との結合自体を阻害することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の治療剤。
【請求項６】
前記物質がＣＸＣＲ４から核へのシグナル伝達を阻害することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の治療剤。
【請求項７】
前記物質がＣＸＣＲ４自体の発現を阻害することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の治療剤。
【請求項８】
前記物質がＳＤＦ−１自体の発現を阻害することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の治療剤。
【請求項９】
請求項５においてさらに、前記物質が、ＳＤＦ−１を阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項１０】
請求項５においてさらに、前記物質が、ＣＸＣＲ４を阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項１１】
請求項９においてさらに、前記物質が、ＣＸＣＲ４に対しＳＤＦ−１と拮抗的に競合し阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項１２】
請求項９においてさらに、前記物質が、ＳＤＦ−１に結合してＣＸＣＲ４へのＳＤＦ−１の結合を阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項１３】
請求項１１においてさらに、前記物質が、ＳＤＦ−１類似蛋白質、前記蛋白質と他のペプチド又はポリペプチドとの融合蛋白質、ＳＤＦ−１の部分ペプチド、又はＳＤＦ−１の結合部位と類似の構造を有する低分子化合物からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする治療剤。
【請求項１４】
請求項１２においてさらに、前記物質が、抗ＳＤＦ−１抗体、抗ＳＤＦ−１抗体活性を有する前記抗体断片、ＳＤＦ−１に対する結合活性を有する融合タンパク質、ＳＤＦ−１の構造変化を誘導する物質、及びＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４との結合部位に結合可能な低分子化合物からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする治療剤。
【請求項１５】
請求項１０においてさらに、前記物質が、ＳＤＦ−１との結合においてＣＸＣＲ４と拮抗的に競合して阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項１６】
請求項１０においてさらに、前記物質が、ＣＸＣＲ４に結合してＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項１７】
請求項１５においてさらに、前記物質が、ＣＸＣＲ４と拮抗的に阻害する可溶性ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ４と類似の構造を有するタンパク質、前記タンパク質と他のペプチド又はポリペプチドとの融合タンパク質、及びＣＸＣＲ４部分ペプチド及びＣＸＣＲ４の結合部位と類似の構造を有する低分子化合物からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする治療剤。
【請求項１８】
請求項１６においてさらに、前記物質が、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体活性を有する抗体断片、ＣＸＣＲ４に対する結合活性を有する融合タンパク質、ＳＤＦ−１の構造変化を誘導する物質およびＣＸＣＲ４のＳＤＦ−１結合部位に結合する低分子化合物からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする治療剤。
【請求項１９】
請求項６においてさらに、前記物質がＧタンパク共役タンパク質の下流に存在するシグナル伝達系の阻害剤であって、ＭＡＰＫカスケード阻害剤、ホスホライペースＣ（ＰＬＣ）の阻害剤、及びＰＩ３キナーゼ基ナーゼ阻害剤からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする治療剤。
【請求項２０】
請求項７においてさらに、前記物質が、細胞上からみかけ上ＣＸＣＲ４を消失させる物質であって、細胞膜に作用して細胞膜の流動性を変化させ、細胞膜上からＣＸＣＲ４を消失させることを特徴とする治療剤。
【請求項２１】
請求項７においてさらに、前記物質が、ＣＸＣＲ４自体の発現を阻害する物質であって、アンチジーン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスベクターにより発現されるアンチセンスＲＮＡ、リボザイム及びＣＸＣＲ４発現調節部位に対する阻害性物質からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする治療剤。
【請求項２２】
請求項８においてさらに、前記物質がＳＤＦ−１の発現阻害のためのアンチセンスであることを特徴とする治療剤。
【請求項２３】
請求項８においてさらに、前記物質がＳＤＦ−１の発現調節部位に対し阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項２４】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を用いる血管形成抑制方法。
【請求項２５】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を用いる固形癌治療方法。
【請求項２６】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を用いる血管新生を病態形成要因とする疾患の治療方法。
【請求項２７】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を用いる組織修復方法。
【請求項１】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を有効成分として含有してなる血管形成を抑制する治療剤。
【請求項２】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を有効成分として含有してなる固形癌に対する治療剤。
【請求項３】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を有効成分として含有してなる血管新生を病態形成要因とする疾患の治療剤。
【請求項４】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を有効成分として含有してなる組織を修復する治療剤。
【請求項５】
前記物質が、ＳＤＦ−１とＣＸＣＲ４との結合自体を阻害することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の治療剤。
【請求項６】
前記物質がＣＸＣＲ４から核へのシグナル伝達を阻害することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の治療剤。
【請求項７】
前記物質がＣＸＣＲ４自体の発現を阻害することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の治療剤。
【請求項８】
前記物質がＳＤＦ−１自体の発現を阻害することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の治療剤。
【請求項９】
請求項５においてさらに、前記物質が、ＳＤＦ−１を阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項１０】
請求項５においてさらに、前記物質が、ＣＸＣＲ４を阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項１１】
請求項９においてさらに、前記物質が、ＣＸＣＲ４に対しＳＤＦ−１と拮抗的に競合し阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項１２】
請求項９においてさらに、前記物質が、ＳＤＦ−１に結合してＣＸＣＲ４へのＳＤＦ−１の結合を阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項１３】
請求項１１においてさらに、前記物質が、ＳＤＦ−１類似蛋白質、前記蛋白質と他のペプチド又はポリペプチドとの融合蛋白質、ＳＤＦ−１の部分ペプチド、又はＳＤＦ−１の結合部位と類似の構造を有する低分子化合物からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする治療剤。
【請求項１４】
請求項１２においてさらに、前記物質が、抗ＳＤＦ−１抗体、抗ＳＤＦ−１抗体活性を有する前記抗体断片、ＳＤＦ−１に対する結合活性を有する融合タンパク質、ＳＤＦ−１の構造変化を誘導する物質、及びＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４との結合部位に結合可能な低分子化合物からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする治療剤。
【請求項１５】
請求項１０においてさらに、前記物質が、ＳＤＦ−１との結合においてＣＸＣＲ４と拮抗的に競合して阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項１６】
請求項１０においてさらに、前記物質が、ＣＸＣＲ４に結合してＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項１７】
請求項１５においてさらに、前記物質が、ＣＸＣＲ４と拮抗的に阻害する可溶性ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ４と類似の構造を有するタンパク質、前記タンパク質と他のペプチド又はポリペプチドとの融合タンパク質、及びＣＸＣＲ４部分ペプチド及びＣＸＣＲ４の結合部位と類似の構造を有する低分子化合物からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする治療剤。
【請求項１８】
請求項１６においてさらに、前記物質が、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体活性を有する抗体断片、ＣＸＣＲ４に対する結合活性を有する融合タンパク質、ＳＤＦ−１の構造変化を誘導する物質およびＣＸＣＲ４のＳＤＦ−１結合部位に結合する低分子化合物からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする治療剤。
【請求項１９】
請求項６においてさらに、前記物質がＧタンパク共役タンパク質の下流に存在するシグナル伝達系の阻害剤であって、ＭＡＰＫカスケード阻害剤、ホスホライペースＣ（ＰＬＣ）の阻害剤、及びＰＩ３キナーゼ基ナーゼ阻害剤からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする治療剤。
【請求項２０】
請求項７においてさらに、前記物質が、細胞上からみかけ上ＣＸＣＲ４を消失させる物質であって、細胞膜に作用して細胞膜の流動性を変化させ、細胞膜上からＣＸＣＲ４を消失させることを特徴とする治療剤。
【請求項２１】
請求項７においてさらに、前記物質が、ＣＸＣＲ４自体の発現を阻害する物質であって、アンチジーン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスベクターにより発現されるアンチセンスＲＮＡ、リボザイム及びＣＸＣＲ４発現調節部位に対する阻害性物質からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする治療剤。
【請求項２２】
請求項８においてさらに、前記物質がＳＤＦ−１の発現阻害のためのアンチセンスであることを特徴とする治療剤。
【請求項２３】
請求項８においてさらに、前記物質がＳＤＦ−１の発現調節部位に対し阻害することを特徴とする治療剤。
【請求項２４】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を用いる血管形成抑制方法。
【請求項２５】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を用いる固形癌治療方法。
【請求項２６】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を用いる血管新生を病態形成要因とする疾患の治療方法。
【請求項２７】
ＣＸＣＲ４に基づく作用を阻害する物質を用いる組織修復方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１３Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１３Ｆ】
【公開番号】特開２００９−２５６３５９（Ｐ２００９−２５６３５９Ａ）
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４７６３３（Ｐ２００９−１４７６３３）
【出願日】平成２１年６月２２日（２００９．６．２２）
【分割の表示】特願２０００−５３７５７５（Ｐ２０００−５３７５７５）の分割
【原出願日】平成１１年３月２３日（１９９９．３．２３）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【出願人】（０００１５７８６５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２２日（２００９．６．２２）
【分割の表示】特願２０００−５３７５７５（Ｐ２０００−５３７５７５）の分割
【原出願日】平成１１年３月２３日（１９９９．３．２３）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【出願人】（０００１５７８６５）
【Ｆターム（参考）】
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