表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段
【課題】核酸単離のための従来法の欠点を克服し、本質的な技術的消耗(technical expenditure)のない実施又は利用に適した方法及び手段の提供。
【解決手段】表面上での核酸の単離及び精製のための方法及び装置の提供。核酸を含む試料から、単純な方法で、核酸を固定化し、かつ同様に単純な工程によってリリースする。それにより単純な実施が完全に自動化された方法の実施を特に可能にする表面、例えば多孔性膜を使用する方法を提供する。更に、その後の反応段階において、複雑さなしにこの相から核酸を再度リリースでき、かつ、使用できるのであれば、更なる適用、例えば、制限分解、ＲＴ、ＰＣＴ若しくはＲＴ−ＰＣＲのために、又は他のいずれかの上述した分析的-若しくは酵素的反応において核酸を使用することができるような方法で、核酸を、固定相、特に膜と結合させうる。該方法を実施することができる特別な単離容器も提供する。
【解決手段】表面上での核酸の単離及び精製のための方法及び装置の提供。核酸を含む試料から、単純な方法で、核酸を固定化し、かつ同様に単純な工程によってリリースする。それにより単純な実施が完全に自動化された方法の実施を特に可能にする表面、例えば多孔性膜を使用する方法を提供する。更に、その後の反応段階において、複雑さなしにこの相から核酸を再度リリースでき、かつ、使用できるのであれば、更なる適用、例えば、制限分解、ＲＴ、ＰＣＴ若しくはＲＴ−ＰＣＲのために、又は他のいずれかの上述した分析的-若しくは酵素的反応において核酸を使用することができるような方法で、核酸を、固定相、特に膜と結合させうる。該方法を実施することができる特別な単離容器も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面上の核酸の単離及び精製のための新規な方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の遺伝的起源及び機能的活性は、それらの核酸を研究することにより決定及び研究され得ることが長い間知られていた。 核酸の分析は、細胞の活性の原因への直接的なアクセス(access)を可能にする。 従って、それらは、例えば代謝産物の確認(verification of metabolic products)のような間接的な従来の方法より潜在的に優れている。それ故、核酸の分析の大幅な増加が将来的に予想されるであろう。分子生物学的分析は、多くの分野において、例えば、医学的及び臨床的診断、薬剤の開発及び評価を行う製薬業界、食品生産の管理及び食品の調整等を行う食品分析において、植物の栽培及び動物の飼育を行う農畜産業において、並びに環境分析及び他の多くの研究分野において、既に使用されている。父子分析(paternity analysis)の例としては、組織型別、遺伝病の同定、ゲノム分析、分子診断学、例えば、感染症の同定、トランスジェニック(transgenic)研究、生物学及び医学の分野並びに多数の関連する分野における基礎研究を挙げることができる。
【０００３】
遺伝子の活性は、 ＲＮＡ(特に細胞中のｍＲＮＡ)の分析によって直接決定することができる。代謝病、感染又は不完全に発現された (exprimated)遺伝子の認識によるがんの進行は、例えばリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（“リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ”）又は遺伝子発現チップ分析のような現代の分子生物学的方法による細胞中で転写パターン(ｍＲＮＡパターン)の定量分析によって可能になった。例えば、遺伝子欠損の証明又はＨＬＡ型の決定並びに他の遺伝的マーカーは、例えばＰＣＲ、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ又は配列決定のような分子生物学的方法による細胞からのＤＮＡの分析によって可能になった。
【０００４】
ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡの分析も、ウイルスやバクテリアのような伝染性病原体の直接的な確認のために使用される。
【０００５】
ここでは、含有された核酸をそれぞれの分析方法において使用することができるような生物学的及び臨床的試料の調製は、一般に困難である。しかし、正確には、分析を自動的に行うべきである場合は、良好な収率及び高品質、同時に高い再現性を有する核酸の直接的な利用が、多数の試料において重要である。
【０００６】
従来技術(the state of the art)は、ＤＮＡの精製のための多くの方法を既に包含している。例えば、バーンボイム（Birnboim）の方法[酵素学における方法(Methods in Enzymology) 100 (1983) p243]に記載のクローニング及び他の同様の実験方法の目的のためのプラスミドＤＮＡをどのように精製するかが知られている。この方法では、不純物を取り除いたバクテリア起源の溶菌液は、塩化セシウム勾配にかけられ、４〜２４時間の間、遠心分離される。この段階に続いてＤＮＡの抽出及び沈殿が通常行われる。この方法は、一方では非常に高価な装置が必要であり、他方では長時間を要し、多額のコストがかかり、かつ自動化できないという欠点を有する。
【０００７】
不純物を取り除いた溶菌液がＤＮＡの単離のために使用される他の技術は、イオン交換クロマトグラフィー[コルパン(Colpan)ら、J.Chromatog. 296 (1984) p339]及びゲル濾過[モロー(Moreau)ら、Analyt. Biochem. 166 (1987) 188]からなる。これらの方法は、塩化セシウム勾配の代わりとして主に提案されるが、通常高濃度の塩を含む過度に希釈された溶液であるので、溶媒供給並びにそのようにして得られたＤＮＡ画分の沈殿のための精巧な装置を必要とする。
【０００８】
マルコ(Marko)ら[Analyt. Biochem.、121 (1982) p.382]及びボーゲルスタイン(Vogelstein)ら[Proc. Nat. Acad. Sci. 76 (1979) p 615]は、核酸を含む抽出物からのＤＮＡを高濃度のヨウ化ナトリウム又は過塩素酸ナトリウムに通すと、ＤＮＡのみが小型ガラスシンチレーション管、機械的手段によって微粒子化されたガラス繊維シートのガラス繊維膜に付着し、一方ＲＮＡ及び蛋白質は付着しないことを確認した。この方法で結合されたＤＮＡは、例えば水によって溶出することができる。
【０００９】
例えば、WO 87/06621には、ＰＶＤＦ膜上での核酸の固定化が記載されている。しかし、ＰＶＤＦ膜に結合した核酸は、その後溶出されず、その代わりに、全ての結合核酸を含む膜が、ＰＣＲ調製に直接導入される。最終的に、この国際特許出願及びその他の文献により、一般に、ほぼ十分な量の核酸の固定化を可能にするためには、水又はアルコールによって疎水性表面又は膜をあらかじめ湿らせておかなければならないことが明らかにされている。
【００１０】
他方では、例えばＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、サンライズ(SunRise)、ＬＣＲ、分岐ＤＮＡ、ＮＡＳＢＡ、又はタクマン(TaqMan)技術、及びＰＣＲ、ＳＤＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡチップのための同様のリアルタイム定量技術、並びに遺伝子発現のための配列(arrays)、突然変異分析、示差表示分析(differential display analysis)、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ｃＤＮＡ合成、又はサブトラクティブハイブリダイゼーション(subtractive hybridization)のような、多くの現代の適用のためには、直接固相から核酸をリリース(release)できることが絶対的に必要である。これと関連して、WO 87/06621は、この方法において使用される膜から核酸を、確かに回収することはできるとはいえ、この回収は問題を伴い、核酸の定量的な単離には全く適合しないことを教示している。また、この方法で得られた核酸は、それらを濃縮及び単離するためのその後の段階を絶対的に必要とする環境(circumstance)を、やや過剰に希釈する。
【特許文献１】国際公開第87/06621号パンフレット
【非特許文献１】バーンボイム（Birnboim）、Methods in Enzymology、100、（1983)、p243
【非特許文献２】コルパン(Colpan)ら、J.Chromatog.、296、(1984)、p339
【非特許文献３】モロー(Moreau)ら、Analyt. Biochem.、166、(1987)、188
【非特許文献４】マルコ(Marko)ら、Analyt. Biochem.、121、(1982)、p.382
【非特許文献５】ボーゲルスタイン(Vogelstein)ら、Proc. Nat. Acad. Sci.、76、(1979)、p615
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
全ての核酸の水溶液及び他の溶液、並びに生体試料及び材料のような全ての物質及び試料、食料品等は、本発明の意味における核酸試料という語に含まれるであろう。本発明の意味において、核酸含有試料又は物質は、核酸を含む試料又は試料調製によって定義されるであろう。生物学的物質又は生体試料とは、例えば、細胞を含まない試料物質、血漿、血液、唾液、尿、糞便、精液のような体液、細胞、血清、白血球画分、外皮催炎物質(crust phlogistica)、塗抹標本(smears)、あらゆる種類の組織試料、組織部及び器官、遊離又は結合核酸を含む食料試料、又は核酸を含む細胞、植物又は植物粒子、バクテリア、ウイルス、酵母、及び他の真菌(fungi)、その内容がここで参照され、遊離核酸についても同様である欧州特許出願第９５９０９６８４．３に記載されている他の真核生物及び原核生物等を意味する。本発明の意味において、核酸によって、例えば、二本鎖、一本鎖、環状及び直鎖、分岐等のあらゆる長さ及び構造のリボ核酸(RNA)及びデオキシリボ核酸(DNA)のような考えられ得る(possible)全ての種類の核酸、モノマーヌクレオチド、オリゴマー、プラスミド、ウイルス及びバクテリアＤＮＡ並びにＲＮＡ、並びに動物及び植物細胞からのゲノム又は他の非ゲノムＤＮＡ並びにＲＮＡ、真核生物、処理型及び未処理型ｔ−ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎ−ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及びｃＤＮＡ、並びに他の想像できる核酸全てが意味される。
【００１２】
上記の理由のために、従来技術により知られている方法は、特に核酸を得るための方法の自動化に関して、プロセスエンジニアリングに関する限り、できるだけ単純な核酸の定量的単離のための適切な出発点を構成しない。
【００１３】
従って、本発明の方法は、核酸の単離のための従来技術から知られてる方法の欠点を克服すること、及び本質的な技術的消耗(technical expenditure)のない実施又は利用に適した方法及び手段を利用できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明によれば、この目的は、独立項１、９、１４、２１、２９、３０及び７７の方法、独立項９８及び１１３に記載の単離容器又は反応容器、独立項８２、１１０、１１１及び１１５に記載の使用並びに独立項９６に記載の機械、及び独立項１２０に記載のキットによって解決される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の更に有利な態様は、従属項、説明及び添付図から明らかである。
【００１６】
この関連において、本発明は、その上で、核酸を含有する試験試料から、単純な方法で核酸を固定化することができ、かつ、単純な処理(procedural)段階によって再びリリースすることができる表面、例えば多孔性の膜を使用する方法を含む。特に、本発明による単純な処理は、これらの方法を完全に自動的に行うことを可能にする。
【００１７】
本発明の更なる態様は、複雑さなしに以下の反応段階において核酸を固定相から再びリリースすることができ、かつ適用できるのであれば、例えば、制限消化(restriction digestion)、ＲＴ、ＰＣＲ若しくはＲＴ−ＰＣＲ、又は上記の他の分析的若しくは酵素的反応のいずれかにおいて、更に使用することができる方法において、核酸を固定相、特に膜へ結合することを目的とする。
【００１８】
本発明の意味において、表面は、何らかの細孔性分離層と定義される。これは、例えば基板に直接載ることができ、かつそのようにして、片側からのみ近づくことができ、又は結合せずにいる(stand freely)ことができる。両側から近づくことができ、それ故、その全表面では不浸透性(impermeable)基板上に載らないが、全く結合せず、又は数点で支持されるのみである分離層は、本発明による膜と呼ばれるであろう。
【００１９】
本発明の意味において、単離は、その間に核酸の濃度が増加し、及び／又は調製中の、若しくは試料中の非核酸部が減少する核酸の濃縮として定義される。
【００２０】
本発明は、以下の段階によって核酸を単離するための方法を提供する:
- 少なくとも1つの核酸試料を膜に供給すること;
- 膜における核酸の固定化;
- 固定化された核酸の膜からのリリース; 及び
-- ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、アクリレート共重合体、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド(polyvinylidendifluoride)、ポリエチレンテトラフルオロエチレン共重合体塩(polyethylentetrafluorethylene-copolymerisate)、ポリベンズイミダゾール(polybenzimidazole)、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン共重合体塩(polyethylenechlorotrifluorethylene-copolymerisate)、ポリイミド、ポリフェニレンスルフィド(polyphenylenesulfide)、セルロース、セルロース混合エステル(cellulose mixed esters)、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル(polyacrylnitriles)、ポリアクリロニトリル共重合体(polyacrylnitrile-copolymers)、ニトロセルロース、ポリプロピレン及び／又はポリエステルを含む膜を通した輸送(transfer)によるリリースされた核酸の除去。
【００２１】
他の膜、例えばこの説明中で更に記載されたものは、本発明による方法のために使用することができる。
【００２２】
最表面(top)から供給が行われ、下方で除去が行われることが好ましいが、膜における核酸の固定化後に膜を通る液体輸送方法は、水平に配列されたカラムが片側から核酸含有溶液で充填され、カラムの他方の末端においてその後取り除かれることが想像され得る。
【００２３】
膜は、例えば上記の、若しくは別のカラムのような、供給及び除去が行われ、かつ容器の全横断面が被覆される容器内に好ましくは配置され得る。
【００２４】
膜は、コーティングすることができ、コーティングによって疎水性又は親水性にすることができる。
【００２５】
核酸の完全な単離を達成するために、今まで知られていた単離方法は、特にカラム内で、比較的厚い膜又はフリース(fleeces)を用いて行われる。しかし、膜を通した溶液の吸引輸送(suction transfer)中、これにより、比較的大きな、いわゆるデッド・スペース・ボリューム(dead space volume)、即ち、膜の容量が生じ、そのため、核酸は、より多量の溶出バッファーを用いたときにのみ得ることができる。その結果、溶出後に核酸は、多くの適用のためには不適当又は不利な、より希釈された状態で存在する。この理由のため、本発明を行うための好ましい態様は、厚さが好ましくは０．５ｍｍ未満、特に好ましくは０．２ｍｍ未満、例えば０．１ｍｍである膜を使用する。
【００２６】
本発明は、更に次の段階による核酸の単離方法に関する:
- 少なくとも1つの核酸試料の表面への供給;
- 表面における核酸の固定化; 及び
- 溶出媒体(elution medium)による表面からの固定化された核酸のリリース。
【００２７】
この方法は、リリースが、上限が１０℃以下であり、下限が溶出媒体が凍結しないような溶出媒体の凝固点である温度で行われることを特徴とする。従って、Ｔがリリース温度、ＴS,EMが溶出媒体の凝固点を示す不等式１０℃≧Ｔ≧ＴS,EMが成り立つ。これは、核酸のリリースが、溶出媒体の凝固点の近くで明らかに可能であることが、一般的な見解に反して示されたからである。そのような低温における溶出でさえ、核酸がより穏やかに処理され、かつ核酸分解酵素(nucleases)(DNases又はRNases)の存在のサインがまだある場合に、これらが実質上(virtual)凝固点近くにありつづけるようになるという、予期し得ない利点を有し、そのため、核酸の分解は減少し、又は完全に抑制される。
【００２８】
従って、溶出中、温度は好ましくは更に低く、例えば、５℃以下であるべきである。調製物(preparation)が、そのイオン含有量により、その温度においてなお液体である場合、下限は０℃又は−５℃であることもできる。上限は、可能であれば、低温、約５℃であるべきである。
【００２９】
本発明によるこの方法は、溶出バッファーの冷却を要することもあり、更なる溶液の冷却、適用可能であれば、単離容器の冷却も同様に要求することができる。冷却の信頼性が常に保証できるとは限らないので、特に、開発途上国の人々のスクリーニング(screening)のような分野における試験の間、本発明は、外部冷却(external cooling)と無関係に、低温における核酸の単離を可能とする単離容器を更に包含する。
【００３０】
従って、本発明は、１つの上端開口部、１つの底部開口部、及び底部開口部に位置し、上部の全横断面を被覆する１つの膜を有する少なくとも１つの上部；吸収剤材料を含む１つの底部；並びに少なくとも膜の範囲において上部を取り囲む冷却剤を含有するためのジャケット(jacket) を含む核酸の単離のための単離容器を更に包含する。冷却剤を含有するジャケットは、膜、並びに、溶出バッファーの凝固点に近い所望の温度範囲内で、最終的な溶出を信頼性をもって行うことができるために膜上に運ばれる溶菌液、洗浄バッファー及び溶出バッファーのような溶液を低温に冷却することを可能にする。
【００３１】
単離容器の態様の1つでは、ジャケットは、機械的に破壊可能な仕切り(partition)よって分離される２つの区画(compartments)を含み、それにより、溶液が各区画に含有され、仕切りの破壊後に、両溶液の混合によって冷却剤が形成される。
【００３２】
仕切りは、例えば、ジャケットの外壁の所定の部分(provided points)に圧力をかけ、それにより仕切りを破壊する実験具(experimenter)によって破壊され得る。区画内に含有させるのに適当な溶液は、化学的な冷凍技術の分野における専門家に知られている。これらは、所望の温度、及び単離容器の使用中に予想される周囲の温度に調節することができる。
【００３３】
生体試料、例えば上記試料からの核酸の抽出中に、核酸に近づくために、細胞又は分泌物をまず最初に溶解することが必要なこともある。このようにして得られた溶菌液は、核酸に加えて、多量の望ましくない物質、例えば蛋白質又は脂質を含むこともある。溶菌液内の望ましくない物質の量が多すぎて、溶菌液内の核酸の単離の効率が低下し、かつ洗浄又は溶出中の膜の浸透性が低下する場合、膜の妨害(blockage)が、充填によって引き起こされ得る。従って、この望ましくない影響を回避するために、本発明は、膜に達する前に望ましくない物質が除去される方法も目的とする。
【００３４】
本発明による核酸の単離ためのこの方法は、以下の段階:
- 表面において、少なくとも１つの核酸試料に含まれる核酸の固定化を可能にする結合形成条件への、少なくとも１つの核酸試料の標準化;
- 少なくとも１つの核酸試料の表面への供給; 及び
- 表面における核酸の固定化、
を含み、結合条件の調整の前及び／又は後に、予備精製が行われることを特徴とする。
【００３５】
例えば、脱塩により、又は濾過、遠心分離、酵素処理、温度影響、沈殿 及び／若しくは核酸溶液の抽出、並びに／又は核酸溶液の不純物の表面への結合によって予備精製を行うことができる。予備精製は、機械的造粒(mechanical particulation)又は有機試料の溶菌液に関連する核酸溶液の均質化(homogenization)によって行うこともできる。
【００３６】
標準化された結合条件により、RNA及び／又はDNAの固定化を可能にすることができる。
【００３７】
極めて多くの不純物を含む生体試料において単離を行う場合に、予備精製が特に必要であることもある。生体試料は、直接使用されることもあり、又は他の生体試料から次々に(in turn)得られる、考えられ得るいずれの物質をも含むことができる。これらは、例えば、血液、唾液、尿、糞便、精液、細胞、血清、白血球画分、外皮催炎物質(crusta phlogistica)、塗抹標本(smears)、組織試料、植物、バクテリア、真菌(fungi)、ウイルス及び酵母並びに上記の他のタイプの生体試料であることができる。
【００３８】
生体試料が望ましくない物質を高い割合で含んでいる場合、本発明による方法は、そのまま(naturally)特に有利に使用することができる。
【００３９】
予備精製された核酸試料からの核酸の固定化後、通常の単離段階、即ち；
- 固定化された核酸の表面からのリリース;
- リリースされた核酸の表面からの除去
が続けて行われる。
【００４０】
本発明による方法の特別な利点は、これらは、表面において核酸に施される化学反応と組み合わせることができるという事実にある。多数の分析技術は、表面において単離された核酸上でこのように行うことができる。その際、自由なアクセス(access)を達成するために、反応前に、表面から核酸をリリースすることができる。しかし、その代わりに、適切な反応を、表面へ直接結合した核酸上で行なうこともできる。
【００４１】
従って、1つの態様において、本発明は、上記のように予備精製を行う方法であって、リリース段階の後に、好ましくは少なくとも１回、核酸において少なくとも１つの化学反応を行うことを特徴とする方法を目的とする。
【００４２】
本発明の特別な利点は、化学反応の前に、損失を引き起こす単離容器から反応容器へのデカンテーション(decanting)を必要とせず、かつ単離と反応を同じ容器において行うことができるという点である。
【００４３】
更なる態様において、予備精製とは無関係に、本発明は、以下の段階を含む核酸増幅反応を行うための方法に関する；
- 少なくとも1つの核酸試料の表面への供給;
- 表面における核酸の固定化; 及び
- 核酸による増幅反応の実施。
【００４４】
特に、増幅反応において、通常又は必ず使用される少量の物質の場合は、デカンテーションによる損失なしに、核酸の調製物全てを使用することができることが利点である。これはまた、１つの容器において全ての工程を行うことができるような自動化に対して特に有利である。また、消費量が減少し、方法は迅速化され、かつ費用効率が高くなる。
【００４５】
ここで、増幅反応は、等温(isothermal)又は非等温(non-isothermal)反応であることができる。
【００４６】
ここで、増幅反応は、例えば、SDA反応(鎖置換増幅(strand desplacement amplification))、PCR、RT−PCR、LCR若しくはTMA、又はローリングサークル増幅(Rolling circle amplification)であることができる。
【００４７】
NASBA増幅反応は、本発明によるこの方法によっても可能である。
【００４８】
増幅反応の前に、反応バッファーによって、核酸を表面からリリースすることができ、ここで溶出バッファーは、膜上又は膜内に配置される。その代わりに、増幅反応は、表面からの核酸のリリースを引き起こさない反応バッファー内で行うことができる。
【００４９】
この方法は、好ましくはこれらの更なる段階を示す:
- 適用可能であれば、 (これらが反応中になお結合する限り) 表面からの反応 生成物のリリース; 及び
- リリースされた反応生成物の表面からの除去。
【００５０】
更なる態様は、以下の段階を含む核酸上での化学反応の実施のための方法を含む:
- 少なくとも１つの核酸試料の表面への供給;
- 表面における核酸の固定化;
- 固定化された核酸の表面からのリリース;
- 少なくとも1つの核酸における化学反応の実施; 及び
- 事前に固定化を行わない、表面からの核酸の除去。
【００５１】
この方法では、化学反応の後に、核酸が、(固定化された)膜と結合しないが、結合(bond)なしに除去される。そのような追加の(additional)段階を省略することは、調製物の純度を低下させることもあるが、時間に厳しい(time critical)適用における時間節約及び、一定の形態の適用における単純化により、好ましいこともある。本発明による方法は、化学反応の幅広い選択をもたらす。この発明の意味における化学反応は、（表面とのものを除き、この“反応”は、ここで記載した全ての方法によって起こるので）更なる物質との核酸の相互作用、即ち、酵素的変性(enzymatic modification)、プローブによるハイブリダイゼーション、化学的連鎖反応(chemical sequencing reactions)、pH値変化、例えばＲＮＡの塩基性脱プリン(basic depurination)及びＤＮＡの酸性脱プリン(acidic depurination)、並びに抗体結合(bonding anti-bodies)及び蛋白質付加(protein additions)として理解されるべきである。
【００５２】
本発明による方法の利点の１つは、異なる方法が行われる容量空間(volume space)と、核酸が結合し得る膜との永続的な空間統一 (permanent spatial unification)において見られることである。最も単純な方法において、この統一は、直後の膜結合(immediate subsequent membrane bond)によって核酸の取扱いを可能にする。これは特に自動化された方法のための大きな利点である。核酸は、一旦膜に結合すると、更なる処理段階のために、例えば、上記のような、潜在的に純粋な核酸の単離のために、又は核酸による化学反応のために利用することができる。しかし、本発明の更なる態様において、核酸の特性を決定するために、膜に結合した核酸を、別の分析に直ちに付すこともできる。
【００５３】
従って、本発明は、以下の段階を含む、単離容器内での核酸の分析方法を更に目的とする:
- 内部に配置された膜を有する単離容器の設置;
- 核酸の少なくとも1つの試料を備えた単離容器への供給;
- 膜上での核酸の固定化;
- 膜を通した試料の液体成分の輸送; 及び
- 単離容器内に配置された膜上での少なくとも１つの核酸の性質の分析。
【００５４】
更なる方法の態様において、少なくとも1つの化学反応は、上記のように、液体成分の輸送後に核酸上で行うことができる。これは、例えば、核酸のその後の分析を可能にする目的に役立つことができる。この適用の例は、プローブによるハイブリダイゼーション、膜と結合した核酸の放射性マーカー又は特異的な抗体の結合である。例えば、臭化エチジウムのような挿入物質(intercalating substances)による核酸の着色ような補助的な反応もまた、化学反応として理解されるべきである。
【００５５】
核酸の異なる性質は、膜結合分析に利用することができ、組合せた反応容器のない従来の膜について、既に説明されている。分析することができる性質のいくつかは、核酸の放射性又は抗体、核酸結合着色剤分子、又は核酸若しくは蛋白質と結合する着色剤分子であることができる分子との、それらの結合力である。
【００５６】
この方法は、むき出しの(exposed)膜の取扱いがもはや必要とされないような、考えられ得る(considerable)核酸の分析の単純化をもたらす。もっと正確に言えば、それは、単離容器内に配置される。
【００５７】
例えば、その後の分析段階のための、核酸の膜への不可逆的な結合も、本発明の枠内に含まれる。永続的又は不可逆的な結合は、可逆的に結合した核酸に利用することができない方法において、膜及びここに結合した核酸の取扱いを許容する。
【００５８】
更なる態様において、本発明は、核酸の定量的沈殿を目的とする。
【００５９】
あらかじめ知られた方法において、陰イオン交換クロマトグラフィーに基づいた、１００μｇ以上（以下、“大規模”と呼ぶ）のプラスミドDNA の予備精製のために、最後の段階で、高塩濃度バッファーによってプラスミドＤＮＡがカラムから溶出される。プラスミドＤＮＡを、あるものに対して塩から分離し、その他に対して濃縮するために、それはアルコール(例えばイソプロパノール)によって沈殿され、適当な容器中で遠心分離される。残存する微量の塩を除去するために、遠心分離ペレットを70%エタノールで洗浄し、その後再度遠心分離した。２番目の遠心分離のペレットは、少量の低塩濃度バッファーに典型的に溶解され、プラスミドＤＮＡは、この形で更に処理される。
【００６０】
更に、高塩濃度バッファーへのカオトロピック塩の添加によって、ＤＮＡをシリカ膜に結合する状態に変化させる方法が、従来技術において提案されていた。従って、洗浄後、ＤＮＡは低塩濃度バッファーによって膜からリリースされる。
【００６１】
刊行物(ルパート(Ruppert)、A.ら、アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)、(1995), 230: 130−134)では、小規模(100μg未満のプラスミドDNAの単離)で、イソプロパノールで沈殿されたDNAが、0.2μm未満の孔径を有するPVDF膜へ結合し、その後エタノールによって洗浄され、続いてTE(トリスEDTA)によって溶出される、同様の適用が記載されている。 しかしながら、大規模でのそのような方法の記載は存在しない。
【００６２】
その後遠心分離が行われる、記載されたDNAの沈殿は、極めて時間がかかり（約１時間）、また、遠心分離機の使用を必要とする。この工程のために多くの時間が必要とされることに加えて、プラスミド調製における記載の最後の段階は、欠点(faults)に特に弱い。DNAペレットの部分的又は完全な損失が生じることもある。遠心分離容器が決定的な役割を果たすようになる種類（材料）が出現する。
【００６３】
カオトロピック塩及びその後のシリカ膜への核酸の結合の更に記載された適用もまた、カオトロピック塩の調製物への挿入が、最終的に単離されたＤＮＡの汚染の危険性を有するかもしれないという事実により、更に時間がかかる。
【００６４】
記載された小規模でのアルコールの沈澱物の濾過は、一対一の関係をもって(linear fashion)大規模に転換することができないという欠点を有する。従来技術によって使用される膜は、すぐに飽和し、もはや吸収できないので、少量の核酸の単離のみを可能にする。従って、大部分の核酸は、沈殿バッファーの除去の間及び洗浄中に失われる。そのような損失を回避するために、本発明はまた、以下の段階を含む核酸の沈殿方法を目的とする:
- 少なくとも1つの膜が配置された単離容器の設置;
- １つの核酸試料の単離容器への供給;
- 核酸が少なくとも１つの膜と結合するような、試料に含まれる核酸のアルコ ールによる沈殿。この方法は、少なくとも1つの膜の孔径が、０．２μｍ以 上であることを特徴とする。
【００６５】
まず、本発明による方法の実施のために考えられるアルコールは、脂肪族又は非環式の、飽和又は不飽和の炭化水素の全てのヒドロキシル誘導体である。
【００６６】
ヒドロキシル化合物の中で、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、第三ブタノール、ｎ−ペンタノール又はそれらの混合物のようなＣ１−Ｃ５アルカノールが好ましい。本発明による方法の実施のためには、イソプロパノールが特に好ましい。
【００６７】
ここでは、アルコールは、核酸を含む溶液による単離容器の充填前又は後に、この溶液と混合することができる。アルコール、特にイソプロパノールに対する核酸含有溶液の容量比は、 好ましくは２：１〜１：１、特に好ましくは１．６７〜１：１であり、例えば１．４３：１である。
【００６８】
膜の表面領域は、好ましくは、溶液に含有される全ての核酸が、膜と結合するように選択される。
【００６９】
本発明はまた、アルコールによって沈殿された、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡであり得る核酸の結合のために、０．２μｍ以上の孔径を有する膜の使用も目的とする。
【００７０】
０．４５μｍの酢酸セルロース若しくは硝酸セルロースフィルターの使用、又は０．６５μｍの多層酢酸セルロース若しくは硝酸セルロースの使用は、特別な利点であると考えられる。この工程は、真空濾過並びに加圧濾過のために使用することができる。
【００７１】
本発明による方法は、多くの装置を必要とせずに行うことができる高塩濃度バッファー系から低塩濃度バッファー系への核酸の輸送時間の節約を可能にする。典型的には遠心分離段階によって行われる高塩濃度バッファーからの、DNAの古典的なアルコールの沈降反応の代替法として適当である。この方法は、高効率（収率の低損失）であるので、大規模製造に特に適当である。更に、本発明による方法の使用により、既に精製された核酸へ異物(foreign substances)が導入されない。また、古典的な方法と比べて、欠点の影響の受けやすさ(susceptibility of faults)は低下する。
【００７２】
上記の様々な方法の間、供給は好ましくは上から行われる。主に、膜を通した別の方法を、異なる溶液、即ち、核酸を含有する固定化バッファー、洗浄バッファー、溶出液等の輸送に使用することができる。これは、重力(gravity)、遠心分離、真空、（供給側からの）加圧、及び毛管力(capillary forces)であることができる。
【００７３】
固定化及びリリースの段階間で、少なくとも1つの洗浄バッファーによる固定化された核酸の洗浄段階を行うことができる。洗浄は、各洗浄バッファーに対する以下の段階を含む:
- 所定量の洗浄バッファーの表面上への適用; 及び
- 表面を通した洗浄バッファーの輸送。
【００７４】
核酸の供給および固定化は、以下の段階を再び含むことができる:
- 固定化バッファーと核酸試料との混合;
- 固定化バッファー混合した核酸試料の表面上への供給; 及び
- 本質的に供給方向における表面を通した液体成分の輸送。
【００７５】
その工程は、それらを容易に自動化することができるという大きな利点を有するので、前記段階の少なくとも1つは、自動化装置によって完全に自動的に行うことができる。工程の全ての段階は、自動化装置によって制御された一連の段階においても行うことができる。
【００７６】
特にそのような場合は、手動処理中であっても、多数の核酸を同時に単離することが可能である。例えば、８、１２、２４、４８、９６又はそれ以上の単離くぼみ(recesses)を有する市販の“マルチウェル(Multi-well)”容器の形の多数の単離容器を使用することができる。
【００７７】
核酸の除去は２つの基本的に異なる方向で行うことができる。一方に対して、膜によって除去された(溶出された)核酸を輸送し、膜の、核酸含有溶液又は溶菌液が添加される側と反対側へそれらを除去することが可能である。この場合、核酸は添加方向において膜を通して除去される。膜又は表面上の添加する側から核酸を取り除くことも可能である。添加方向と反対の方向において、又は添加する側である、そこから添加が行われる“同じ方向”と反対の方向において、その後除去が行われる。その場合、核酸は膜を通過する必要はない。核酸の除去は、本発明によるいくつかの方法によって、常に添加方向において膜を通して行われる。万一この方法が例えばプラスチック壁のような、液体を通さない基質上に位置する表面を用いて行われるならば、添加方向に向かう方向（反対方向）においてのみ明らかに行うことができる。しかし、いくつかの方法の場合は、両方向における除去が可能である。
【００７８】
核酸が、それらが加えられ固定化された方向と本質的に反対の方向において表面から溶出される（リリースされる）場合、添加方向と比べて、１８０°以下の角度を有する方向はどれも、“同じ方向”と実際に呼ばれるので、どんな場合も、溶出中に核酸が表面、例えば膜を通らないが、表面上への供給方向と反対の方向において、表面から除去される。それ故、この方法の好ましい実施形態において、供給中に核酸が配置されるその他のバッファー、適用可能であれば洗浄バッファーは、吸引又はその他の方法によって膜を通して輸送される。膜の内部に位置する、容器の全横断面を被覆する膜上で単離が行われる場合、供給は好ましくは上から行われる。この場合、除去段階は、再度上方で行われる。例えば、図２は、上から供給され、核酸の除去が上方で行われる漏斗型単離容器示す。
【００７９】
しかし、添加と反対の方向における除去を行うときもまた、他の装置(arrangements)、即ち下方からの核酸の除去を考えることができることが理解されるべきである。例えば、溶菌液バッファーのような核酸含有バッファーは、真空装置によって反応容器から単離装置へ直接取り出すことができるので、核酸を単離装置中の膜の下側と結合させることを考えることができる。そのような場合、下方から取り出され、その後核酸のリリースの後に下方から容器内に排出される溶出バッファーによって、表面からの核酸の除去が行われる。従って、この場合、核酸の除去は、下方において行われる。
【００８０】
更に、例えば、内部に配置された膜を有する水平に置かれたカラムが、フロー・スルー法(flow-through process)において、溶菌液によって充填されるとき、核酸の側面からの除去(lateral removal)が可能であり、水平に置かれたカラムは、核酸が結合する膜の面上で、溶出バッファーによって続いてすすぎ洗いされる。
【００８１】
考えられ得る最大角度１８０°の例は、様々な溶液又はバッファーが下方へ流れる核酸の結合に適当な表面を有する傾斜した表面である。全てのバッファーのように、溶出バッファーもまた、一方の側から来て、他方の側へ流れる。この場合、バッファー流の入る方向と核酸含有バッファー流の出る方向は、１８０°の角度を形成する; しかし、除去は、表面の固定化と同じ面において常に行われる。
【００８２】
本発明による方法では、上記の核酸を含有する試料は、適当な塩類又はアルコール(類)を含み、その後、適当な場合では、調製物を可溶化する溶液へ導入され、遠心分離機の使用による真空によって、加圧によって、毛管力によって、又は核酸が表面上に固定化される、多孔性表面を通す他の適当な方法によって、この方法で得られた混合物に通される。
【００８３】
膜若しくは他の表面上での核酸の固定化に適当な塩類、及び／又は核酸試料の溶菌液類は、鉱酸を有するアルカリ又はアルカリ土類金属類のような金属カチオンの塩類、特にアルカリ若しくはアルカリ土類ハロゲン化物又はリン酸塩を含み、ナトリウム、リチウム若しくはカルシウムのハロゲン化物、特に好ましくは硫酸マグネシウムである。他の金属カチオン、例えばＭｎ、Ｃｕ、Ｃｓ若しくはＡｌ又はアンモニアカチオンを使用することができ、好ましくは鉱酸の塩類である。
【００８４】
一塩基酸若しくは多塩基酸又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属を含む多官能性有機酸もまた、本発明の方法の実施に適当である。これらは、シュウ酸、マロン酸若しくは琥珀酸のような有機ジカルボン酸又はヒドロキシ若しくはポリヒドロキシカルボン酸、例えば、好ましくはクエン酸を含むナトリウム、カリウム若しくはマグネシウムの塩類を特に含む。
【００８５】
ある適用に対して、より適していることが明らかになるならば、表面上での核酸の固定化のための、及び／又は核酸試料を溶解させるための上記に挙げられた物質は、単独で、又は混合して、これとともに使用することができる。
【００８６】
いわゆるカオトロピック剤の使用が特に有効であることが明らかになった。カオトロピック物質は、水素結合の三次元構造を妨害することができる。この方法はまた、生体分子(biological molecules)中で、一次、二次、三次又は四次構造を含む空間構造の形成に関与する分子内結合力を弱める。この種のカオトロピック剤は、従来技術(ロンプ(Roempp)、Lexikon der Biotechnologie、H.デルウェグ（Dellweg）発行、R.D.シュミット(Schmid)及びW.E.フロム(Fromm)、Thieme Verlag, Stuttgart 1992)の記載から、専門家に知られている。
【００８７】
この発明による使用のための好ましいカオトロピック物質は、例えば、トリクロロ酢酸(trichloroacetate)、チオシアネート(thiocyanate)、過塩素酸塩又はヨウ化物群若しくは塩酸グアニジニウムおよび尿素である。
【００８８】
カオトロピック物質は、０．０１〜１０モル濃度の水溶液、好ましくは０．１モル濃度〜７モル濃度の水溶液、最も好ましくは０．２〜０．５モル濃度の水溶液中で使用される。上記のカオトロピック剤は、単独で、又は組合せて使用することができる。特に、過塩素酸ナトリウム、塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、及び／又はヨウ化カリウムの０．０１〜１０モル濃度の水溶液、好ましくは０．１〜７モル濃度の水溶液、特に好ましくは０．２〜０．５モル濃度の水溶液が使用される。
【００８９】
本発明による方法における溶解、結合、洗浄及び／又は溶出のために使用される塩溶液は、好ましくはバッファーで処理される。緩衝物質として適当なものは、以下の緩衝系、例えば、０．００１−３ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０５−１ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．０１−０．５ｍｏｌ／ｌ、とりわけ好ましくは０．０１−０．２ｍｏｌ／ｌの濃度のカルボン酸バッファー、特に、クエン酸塩バッファー、酢酸塩バッファー、琥珀酸塩バッファー、マロン酸塩バッファー、並びにグリシンバッファー、モルホリノプロパンスルホン酸(morpholinopropansulfonic acid)(MOPS)又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）である。
【００９０】
本発明による方法の実施に好ましいアルコール類は、まず第一に、脂肪族又は非環式の飽和若しくは不飽和炭化水素の全てのヒドロキシル誘導体を含む。この化合物が、エチレングリコール、プロピレングリコール又はグリセリンを含む多価Ｃ１−Ｃ５アルカノール類のように、１、２、３又はそれ以上のヒドロキシル基を含むか否かは最初は重要ではない。
【００９１】
また、本発明により使用できるアルコール類は、蔗糖誘導体類、いわゆるアルダイト(Aldite)類、並びにポリフェノールのようなフェノール類を含む。
【００９２】
前述のヒドロキシル化合物の中で、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、第三ブタノール及びペンタノールが特に好ましい。
【００９３】
本発明の意味において、親水性という用語は、それらの化学的性質に基づき、水と容易に混合し、若しくは水を吸収するような材料又は膜に用いる。
【００９４】
本発明の意味において、疎水性という用語は、それらの化学的性質に基づき、水を通さず、若しくはその逆に、その中に残存することができないような材料又は膜に用いる。
【００９５】
本発明の意味において、表面という語により、微小孔構造の分離層(microporous-separating layer)が意味される。膜の場合は、表面はフィルム又はポリマー材料からなる。ポリマーは、好ましくは極性基を有するモノマーからなるであろう。
【００９６】
本発明による方法の別の態様において、幅広い意味での表面の概念は、粒子若しくは粒状層、又はシリカゲルフリースのような繊維層をも含む。
【００９７】
疎水性膜の使用に関連して、本発明の意味において、市販の疎水化ナイロン膜のような、親水性物質からなり、従来技術の記載から周知であるその後の化学処理により疎水性にされ得る膜が好ましい。
【００９８】
疎水化膜は、本発明の目的に対して、そもそも親水性であることもあり、ないこともあり、かつ下記の疎水性コーティング剤によってコーティングされる膜を、一般に含む。この種の疎水性コーティング剤は、ある程度(fairly)長いアルキル鎖又はシロキサン基のような疎水基の薄層によって親水性物質を被覆する。適当な疎水性コーティング剤は、従来技術から多数知られている；これらは、本発明の目的に対して、パラフィン類、ワックス類、金属石鹸類等を、必要であれば、アルミニウム若しくはジルコニウム塩類、第四級有機化合物類、尿素誘導体類、脂質変性メラミン樹脂類、シリコーン類、有機亜鉛化合物類、グルタル酸ジアルデヒド類、及び類似の化合物類を含む。
【００９９】
また、本発明の目的のために使用することができる疎水性膜は、それ自体疎水性である膜及び疎水性になったものであり、かつその基本物質が極性基を含んでいるものである。これらの規準によれば、例えば、以下のグループ--特に疎水化されたもの--が、本発明による使用のために適当である:
ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、硝酸セルロース(cellulose nitrate)、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート及びアクリレート共重合体、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリエチレンテトラフルオロエチレン共重合体塩、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン共重合体塩又はポリフェニレンスルフィド、セルロース及びセルロース混合エステル、酢酸セルロース又は窒素含有セルロース(nitric cellulose)及びポリベンズイミダゾール、ポリイミド、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル共重合体、疎水化ガラス繊維膜、それら中で疎水化ナイロン膜が特に好ましい。
【０１００】
好ましい親水性表面は、親水性材料自体、更に疎水性にされた疎水性材料を含む。例えば、以下の物質を使用することができる: 親水性ナイロン、親水性ポリエーテルスルホン、親水性ポリカーボネート、親水性ポリエステル、ポリプロピレン組織上の親水性ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレンフリース上の親水性ポリテトラフルオロエチレン、親水化(hydrophilized)ポリビニリデンジフルオライド、親水化ポリテトラフルオロエチレン、親水性ポリアミド、窒素含有セルロース、親水性ポリベンズイミダゾール、親水性ポリイミド、親水性ポリアクリロニトリル、親水性ポリアクリロニトリル共重合体、親水性ポリプロピレン、硝酸セルロース、セルロース混合エステル。
【０１０１】
核酸の結合方法に関連する上記の膜は、本発明の文脈にはないが、現在の技術から、一部が知られている。しかし、この方法のための材料の選択は、従来技術からはまだ知られていない。しかし、本発明者らによる徹底的な実験から、核酸の結合に適した更なる膜があることが示された。
【０１０２】
従って、本発明は、核酸の付着(adhesion)及び単離のための材料として、酢酸セルロース、カルボキシル化されていない疎水性ポリビニリデンジフルオライド又は固体の疎水性ポリテトラフルオロエチレンを使用することも包含する。
【０１０３】
ここで、“固体”という用語は、全てが関連する化学物質からなる材料を指し、基板上でコーティングされてもいないし、コーティングとして置かれてもいないものである。
【０１０４】
この材料は、膜状で、細粒(granules)として、繊維状で、又はいずれかの他の形状で使用することができる。例えば繊維は、フリースとして、細粒は、圧縮フリット(compressed frit)として整えることができる。
【０１０５】
上記の本発明による方法において使用される膜（イソプロパノール沈殿を除く）は、例えば、0.001〜50μm、好ましくは、0.01〜20μm、最も好ましくは0.05〜10μmの孔径を有する。上記の方法によるイソプロパノールを用いた核酸の沈殿の場合、孔径は、0.2μm以上でなければならない。
【０１０６】
洗浄バッファーとして、上記の塩類若しくはアルコール類、又はフェノール類若しくはポリフェノール類を考慮することができる。更に、洗浄剤並びにアルブミン及びミルクパウダーのような最も広い意味における天然物質を、洗浄段階のために使用することができる。カオトロピック物質の添加も可能である。洗浄剤及び類似の物質と同様に、ポリマーを添加することができる。いずれの場合も、そこで含まれる洗浄バッファー及び物質は、不純物又はそれらの複混合生成物(decomposite products)が、洗浄バッファーと共に除去されるように、望ましくない不純物と結合し、可溶化し、又はそれと反応することが一般的に可能であるべきである。洗浄段階中の温度は、通常１０〜３０℃の範囲内であり、好ましくは室温であるとしても、より高い温度又はより低い温度であってもうまく使用することができる。そのようなものとして、例えば、低温で、例えば２℃で用いられる溶出用洗浄バッファーを冷却すること、単離容器及び表面又は膜を、所望の温度値に前冷却することが示されることもある。低温のための適用は、その間に細胞核が損害を受けないまま未分化で(initially)残存する細胞質溶解である。一方、より高い温度の洗浄バッファーは、洗い流されるべき不純物のより良好な可溶化を引き起こす。
【０１０７】
本発明の目的のための結合核酸(bound nucleic acids)の溶出に適当な溶出剤は、水又は水性塩溶液である。塩溶液として、０．００１〜０．５モル／リットル、好ましくは０．０１〜０．２モル／リットルの濃度、最も好ましくは０．０１〜０．０５モル濃度の溶液であるモルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、2-[4-(2-ヒドロキシメチル)-1-ピペラジノ(piperazino)]エタンスルホン酸(HEPES) のような現在の技術から知られているバッファー溶液が使用される。更に、使用に好ましいものは、０．００１〜０．５モル濃度、好ましくは０．０１〜０．２モル濃度、最も好ましくは０．０１〜０．０５モル濃度の塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム又はマグネシウムジクロライド(magnesium dichloride)の水溶液を含む、アルカリ又はアルカリ土類金属塩、特にそれらのハロゲン化物の水溶液である。更に、使用に好ましいものは、シュウ酸又は酢酸のようなカルボン酸若しくはジカルボン酸を有するアルカリ又はアルカリ土類金属の塩類の溶液、酢酸ナトリウム溶液、又は、例えば前述の濃度範囲の、例えば０．００１〜０．５モル濃度、好ましくは０．０１〜０．２モル濃度、最も好ましくは０．０１〜０．０５モル濃度のシュウ酸水溶液である。
【０１０８】
さらに、洗浄剤やDMSOのような補助物質の添加も可能である。溶出された核酸を用いて化学反応が行われるべきである場合は、直接膜で行うか、又は別の反応容器において行うと、反応の準備において使用されるべき溶出バッファーに対して、そのような物質又は他の補助物質を添加することもできる。従って、低濃度のDMSOの添加は、多くの反応の準備に対して一般的である。
【０１０９】
化学反応が核酸上で行われた後、それらも反応バッファーによって溶出することができる。SDA又はNASBA反応の後に、核酸は、例えば反応バッファー又は反応マスター混合物(reaction master mix)によって溶出することができる。
【０１１０】
例えば、脱塩され、若しくは二回蒸留された水、又は超高純度ミリポア水(ultrapure Millipore water)のような純水は、溶出手段として特に好ましい。
【０１１１】
０℃以下〜９０℃、例えば１０℃〜３０℃の間の温度において、及び更に高温においても、溶出をうまく行うことができる。水流(stream)による溶出も可能である。溶出温度の下限は、上記のように、溶出媒体の凝固点において見られるべきである。
【０１１２】
本発明による方法は、“現場(field)”において、即ち、実験室の装置ではないため大きな(extensive)電気的製粉装置(electrically powdered equipment)がない場合でさえ、問題なく実施することができるので、それにより、本発明は、本発明の方法を、最少限の追加の部品で実施することができる単離装置の提供も包含する。このために、膜を含む反応容器を使用することができる。これは、使用される様々なバッファーを膜を通して取り出すために、スポンジのような吸収材料と接触させることができる。従って、スポンジは、廃液容器(waste container)とつないだ真空ポンプ又は遠心分離機との組み合わせのように機能する。溶出液を得るために、溶出液は損失されないが、除去され、及び／又は更に念入りに調べられるように、吸収材料と膜との接触が遮断される。
【０１１３】
この態様において、本発明は、上端開口部(top opening)、底部開口部(bottom opening)及び底部開口部に配置され、上部の全横断面を被覆する膜を有する少なくとも１つの円柱状上部(cylindrical upper part)；吸収剤材料を有する下部(lower part)、及び上部と底部を連結するための機構を有する核酸の単離のための単離容器を特に包含する。ここで、連結されると、膜は吸収剤材料と結合し、連結されないと、膜は吸収剤材料と接触しない。
【０１１４】
下部は、上部の直径以上の直径を有する円柱であることが好ましい。この方法では、従来の反応容器のように扱うことができる、本質的に一定の直径を有する単純な管が得られる。この効果は、上部又は上部と下部が、実験室で使用されるような反応容器ホルダー内部に配置され得る管を形成するときに達成される。その機構は、上部と下部との物理的分離を可能にする連結、例えば、銃剣連結装置(bayonet coupling)、プラグ連結装置(plug coupling)又はねじ連結装置(screw coupling)であることができる。ここで、銃剣連結装置は、容易に開閉(lock and unlock)できるという利点を有し、一方、ねじ連結装置は、上部と底部の一層強固な水の結合を可能にする。その代わりに、両部の少なくとも１回の外部分離(once-off separation)を可能にするために、上部と下部の間の所定の破壊点(breaking point)を設けることができ、かつ特に費用効果的に製造することができる。
【０１１５】
しかし、機構は、吸収剤材料と膜との間に挿入することができるスライドであることもできる。この設計は、膜と吸収剤材料との分離を可能にする。
【０１１６】
この方法の生産能力を増加させ、かつ本発明による方法をより一層経済的にするために、上記の単離装置を、いくつかの上部を下部の先端に配置するように修正することも更に可能である。下部は、同時に装置の支持体として働くことができ、かつ、下部内の吸収剤材料の吸収力(drawing capacity)が使い果たされる前に、下部において使用することができる上部のための連結だけではなく、どんな場合であっても多数の単離方法を行うことができるような寸法に作ることができる。
【０１１７】
下部中の吸収剤材料としては、スポンジ及び／又は細粒を示すことができる。例えば、細粒は、吸収技術（例えば、衛生学に関する論文等）の分野における専門家に知られている超吸収剤材料からなることができる。
【０１１８】
本発明は、核酸の性質の分析及び核酸の単離のための本発明による単離容器の使用を同時に包含する。
【０１１９】
個々の段階に関して、本発明による方法は、以下のように実施される：
生体試料由来である場合、それらは適当なバッファーでまず溶解されるべきである。ここで、追加の方法を、溶解、例えば均質化又は超音波のような機械的な影響、酵素の影響、温度の変化又は添加剤のために導入することができる。必要であるか所望される場合、溶菌からいかなる砕片(debris)をも取り除くために、溶解の後に予備精製段階を行うことができる。次いで、まだ実施されていないならば、表面における核酸の固定化が行われる条件が標準化される。結合条件の標準化の後であっても、累積的に(cumulative)又は代わりに予備精製段階を続けることができる。
【０１２０】
核酸又は本来結合していない(free)核酸（類）（もし最初の試料が生物学的でなければ）の回収のために使用される試料の前処理された溶菌液が、例えば--例えば底面に--膜が固定された（プラスチック）カラム内へピペットで移される。機械的支持体として働くフリットに膜を固定すると、より効果的である。その後、溶菌液は、膜を通して輸送される。これは、カラムの出口を真空にすることによって達成することができる。一方、溶菌液側からの加圧により輸送を達成することができる。また--上記のように--溶菌液の輸送は、遠心分離又は毛管力の影響によって行うことができる。後者は、例えば、膜の下方で溶菌液又は濾液(filtrate)と接触させられるスポンジ様材料を用いて生じさせることができる。遠心分離については、底部が開いている単離容器を、輸送された液体用の回収容器内で使用ことができる。
【０１２１】
本発明の好ましい態様において追加された洗浄段階は、表面若しくは膜を通して洗浄バッファーを輸送することによって、又は表面の核酸と同じ側にそれを残存させることにより行うことができる。これは、洗浄バッファーが通される場合、又は取り出される場合、様々な方法において、例えば、膜の反対側に備えられたスポンジによって、真空若しくは加圧装置によって、又は遠心分離若しくは重力によって行うことができる。
【０１２２】
スポンジのような吸収剤材料を使用する装置の利点は、濾過液を処理するための単純で、安全かつ容易な方法にある−−この場合、ここで濾過液によってほぼ(more or less)飽和されるスポンジだけを代える必要がある。カラムを連続的に、又はバッチで操作することができ、かつこれらの両操作方法は、核酸によって膜が完全に飽和されるまで、完全に自動化して実施できることは、この点において明らかであろう。適用可能な場合、最後の段階の間に核酸の溶出が行われる。これは、例えばピペットによって取り出すことができ、若しくは除去することができ、又はなお結合している核酸の原位置(in situ)分析が行われない場合は、何らかの別の方法によって上方で除去することができる。
【０１２３】
所望の核酸は、同時に高濃度でできるだけ少量で使用することが実際は望ましい分子生物学分析の全ての方法に対して大きな利点を有する極少量の弱塩溶液若しくは塩を含有しない溶液中で得られる。できるだけ少量の溶出液を得るために、それらの中に少量の液体のみを回収するので、できるだけ薄い膜を表面として使用する。
【０１２４】
更に、本発明は、装置が垂直位置（同時に、膜は水平位置にある）に配置される場合、膜上の空間を反応領域として使用することができるという利点を有する。従って、例えば、本発明の基礎となる方法によって生成される核酸の単離及びリリースの後、それらを除去しないことだけでなく、単離装置中にそれらを残し、かつそれらを、制限消化、ＲＴ、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、インビトロ転写(in vitro transcription)、ＮＡＳＢＡ、ローリングサークル(rolling circle)、ＬＣＲ（合成酵素連鎖反応(ligase chain reaction)）、ＳＤＡ（鎖置換増幅(strand displacement amplification)）、又望ましくないこともある核酸の完全な除去のためのＲｎａｓｅおよびＤｎａｓｅ消化のような酵素反応のような分子生物学的適用に付すこと、これらの反応によって生成される核酸を、本発明に基づく工程による膜へ再度結合させること、又は上清液中にそれらを保持すること、適用可能であれば、記載のようにそれらを洗浄し、次いで単離若しくは分析のために、例えば、クロマトグラフィー、分光器(spectroscopy)、蛍光計、電気泳動若しくは同様の測定技術によってそれらを溶出することが可能である。
【０１２５】
本発明に従って単離された核酸は、核酸を分解する酵素を含まず、かつ最も多様な方法において直ちに処理及び加工することができるほど高い値の純度を有する。
【０１２６】
本発明によって生成される核酸は、クローニングのために使用することができ、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ポリメラーゼ又はＴ３ポリメラーゼ、ＤＮＡ制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、逆転写酵素及び他のもののような最も多様な酵素用基質として働くことができる。
【０１２７】
本発明における方法によって生成された核酸は、ＰＣＲ、鎖置換増幅、ローリングサークル工程、合成酵素連鎖反応（ＬＣＲ）、サンライズ(SunRise)、ＮＡＳＢＡ及び同様の工程に、特に良好に適合する。
【０１２８】
また、本発明による方法は、診断、例えば食品分析、毒物試験(toxicological tests)において、医学的若しくは臨床的診断、病原診断(pathogene diagnostics)、遺伝子発現分析において、及び環境分析において使用するための核酸の調製に、特に良好に適合する。これらの方法は、本発明による方法によって精製された核酸が、次の段階で増幅されることを特徴とする診断工程に特に適しており、そしてこの方法において増幅された核酸は、その後、続いて、又は直ちに検出される（例えば、ホランド(Holland),P.M.ら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. 88、7276−7280、リバク(Livak)K.J.ら、1995、ＰＣＲ法適用(PCR Methods Applic.) 4、357−362；ケビッツ(Kievits)T.ら、1991、J. Virol. Meth. 35、273−286; イッテンダール(Uyttendaele), M.ら、1994、J. Appl. Bacteriol. 77、694−701）。
【０１２９】
更に、本発明による方法は、次の段階においてハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル増幅段階に付すことができる核酸の調製に特に良好に適合し、本発明による方法によって生成された核酸を、以下の文献（例えば、ブレスターズ(Bresters), D.ら、1994、J. Med. Virol. 43 (3)、262-286；コリンズ(Collins) M.L.ら、1997、Nucl. Acids Res. 25 (15)、2979-2984）に記載されているような、“分岐(branched)”核酸、特に分岐ＤＮＡ及び／若しくは分岐ＲＮＡ並びに／又は樹枝状(dendritic)核酸と接触させることができること、及び発生したシグナルを検出することができることを特徴とする。
【０１３０】
以下に、本発明の自動化の可能性に関する実施例を説明し、かつ様々な表面及び核酸による方法の実施に対する実施例を挙げる。以下について説明する添付図が参照される。
図１は、本発明による方法の実施に適した自動装置の概略図を示す。
図２は、本発明の方法の実施のための単離容器及び回収管の第一の態様を示す。
図３は、本発明による方法の実施のための単離容器及び回収管の第二の態様を示す。
図４は、本発明による方法の実施のための単離容器及び回収管の第三の態様を示す。
図５は、本発明による上部を有する単離容器の態様を示す。
図６は、本発明の方法による様々な試料の、電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
図７は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
図８は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
図９は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の更に別の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
図１０は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを再度示す。
図１１は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを最後に示す。
【０１３１】
本発明による方法は、好ましくは自動的に、部分的に又は完全に、即ち全ての段階において行われる。適当な自動装置の例を、図１に示す。ここで、主部１は、制御電子機器並びに作業台３及び可動アーム２を有する運転モーターを備えている。様々な試料を保持するための領域４のような様々な要素を、作業台上に配置する。真空マニホルド(manifold)５は、上方に位置し、底部で開いている単離装置から液体を取り出すために、また、別の方法では(otherwise)、真空マニホルドに連結した容器と共に働く。例えば、生体試料を溶解に付するために使用され得る攪拌機６も備えられる。使用される単離容器アセンブリー(assemblies)は、例えば、表面が本発明に従って配置される、組み合わせた(integrated)単離容器を有する注入成形部(injection-molded parts)である。典型的には、８、１２、２４、４８、９６、又は１５３６個までの単離容器を、例えば現在のマルチウェルトレイ(multi-well-trays)の形で見られるように使用することができる。対応する標準を使用できるのであれば、より多くの単離容器が一つのアセンブリー上にあることも可能である。しかし、ルアー・アダプター(Luer-adapters)によって、アセンブリーの個々の底部を、使用可能にすること、及びこれらに必要に応じて１つ以上の単離容器を備えることも可能である。ルアー・アダプターなしで別々に使用される単離容器も、本発明に含まれる。
【０１３２】
真空分配機構(vacuum and dispensing mechanisms)８の下では、単離容器アセンブリーは、自動装置中に配置され、これらによって、液体を中に入れ、そして排出することができる。このアセンブリーでは、いくつかの単一真空管を、１つより多い単離又は反応容器の同時処理を可能にするために使用することができる。従って、真空及び分配機構８は、ピペットの役割をする。真空および圧力が、管９を通って真空分配機構８に与えられる。
【０１３３】
核酸を単離するために、分配機構８によって溶解バッファーが導入される、細胞を含む反応容器を、例えば、攪拌機／ホルダー６に配置することもできる。混合後、細胞溶菌液は、単離容器に移される。溶解バッファーは、単離容器中の表面を通ってその後取り出される。次に、細胞溶解液残留物を除去するために、洗浄バッファーによって、表面を洗浄することもでき、ここで、洗浄バッファーも下方へ排出される。最後に、溶出バッファーは、単離装置へ分配され、場合によっては追加の攪拌後、リリースされた核酸は、上方において除去され、回収管へ移される。
【０１３４】
通常、使い捨てチップは、試料の汚染を防ぐために、真空分配機構８上で使用される。
【０１３５】
図２〜４は、本発明において使用されるべき適当な単離容器の異なる概要例を示す。
図２では、漏斗型単離容器１０には、溶解及び洗浄バッファーを吸収するために働くスポンジ様材料１３を含有する回収管１２上に配置される表面１１、例えば膜が備えられる。吸引性能を改善するために、スポンジ様材料１３の下に超吸収性層(superabsorbent layer)１４を配置することもできる。代わりに、層１４は、水を化学的に、例えばアクリレートに変化させることができる材料を含むこともできる。それにより、水も工程から除去される。核酸の溶菌液及び他の調製物を、漏斗に入れる。スポンジ様材料１３は、膜１１を通して適用された液体を取り出す。溶出バッファーの添加の前に、スポンジは、例えば、回収管１２（図示せず）の内部の機構によって、膜から多少間隔を置いて配置される。これは、最後の段階において溶出液バッファーもが、膜１１を通して吸い取られることを防止するであろう。このバッファーは、表面（図１ｂ）で少し(rather)留まり、そして上方で核酸と共に除去することができる。このアセンブリーを使用する場合、自動装置において真空機構５は必要とされない。
【０１３６】
図３は、その底部に配置されたルアー(Luer)接続によって、この場合はスポンジを含まないが、ノズル１８によって真空機構と接続する回収容器１６に、ルアー・アダプター１７によって接続される単離装置の他の例を示す。この場合は、真空の適用により、膜１１を通して溶解及び洗浄バッファーを取り出すこともできる。溶出液バッファーが導入される場合、真空は、止められたままであるので、溶出液を上方で除去することができる。ルアー接続の使用により、個々の単離容器を、単離容器アセンブリーから取り除くことができる。しかし、真空回収容器を、固定された単離装置、例えば８、１２、２４、４８、９６又はそれ以上の個々の容器を有するマルチウェル(multi-well)容器と連結することもできる。
【０１３７】
図４は、重力又は遠心分離によってバッファーが取り出される回収容器を提供する態様を最後に示す。少量で使用される溶出液バッファーは、それ自体が膜１１を通るのに十分なほど重くはなく、上方で再度除去することができる。
【０１３８】
図５は、本発明による単離容器の態様を示す。
図５Ａは、円筒状上部２０を有する単離容器を示す。この上部は、ねじ連結装置２５によって下部２２に接続される。液体の強固な結合(liquid-tight connection)を可能にし、かつ膜１１を支持する限り、ねじ連結装置の代わりに、他の形の連結部を使用することもできる。この例の態様において、膜１１が、上部２０の底部開口部に直接配置される。しかし、それは、内側へ、又は上部の壁に対して９０°ではない角度に配置されることもある。下部は、同様に円筒状の形を示すが、他の態様では、違うように開発されることもある。そのような長方形型として、基板上の上部２０の安定性を改善するものが使用されてもよい。例えば、本発明による方法の所定のオプション(certain options)を用いて使用された溶液を吸収剤材料に完全に含有させるために、下部２２においてより大きな空間が必要とされる場合、上部２０に関連する下部２２の拡大も可能である。
【０１３９】
Ｂ図は、図５Aに示された態様の代わりの態様を示す。ここでは、上部２０及び下部２２が、お互いに永続的に連結され、又は１つの単一成分として作られることもある。吸収剤材料１３と膜１１との間で、膜１１と吸収剤材料１３とを分離するために、スライド２７を、開口部２６を通して単離容器内に挿入することができる。この例において、スライド２７は、スライド２７の収縮を緩和するためのハンドル部２８を更に示す。しかし、スライドは、このハンドル部なしで設計することもできる。図５Bに示すように、吸収剤材料１３は、スライドによって得られた空間を埋めるため、及び膜と接触するために、わずかに広がる。
【０１４０】
図５Ｃは、本発明による単離容器の更なる態様を示す。ここで、下部２３に、いくつかの調製物の同時処理を可能にする上部２０に適合させるために、いくつかのソケット３０を備える。この例において、上部２０は、ねじ連結装置３１によって下部２３に接続される。図５Ａ及びＢにおいて上部２０よりも小さく描かれているが、上部は、これらの態様と同じ大きさ（又はより大きく若しいはより小さい）であることもできる。
【０１４１】
図５Ｄは、冷却液(cooling liquid)を含み、膜１１を外部で取り囲むジャケット３２を有する単離容器を最後に示す。この例において、上部２０及び下部２４は、一緒に差し込まれる。別の形式の接続又は一部の(one-part)態様も可能である。ジャケット３２は、破壊可能な仕切り３５を介して接続することができる２つの区画３３及び３４を含む。両方の区画３３、３４は、仕切り３５の破壊後の混合によって、温度が下がる、例えば溶液のような物質で充填される。
【０１４２】
上記の工程は、以下の実施例によって説明される。これらの工程の異なる様々な使用方法は、先の説明及び例から専門家に明らかであろう。これらの実施例及び対応の記載は、説明のためにのみ示されるものであり、本発明を限定するものではないことを明確に言及する。
【実施例】
【０１４３】
実施例１
ＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡの単離
化学的後処理によって疎水性にされた市販の疎水性ナイロン膜(例えばＭＳＩ製の材料：１．２μｍの孔径を有するマグナＳＨ(Magna SH)、又はパル社(Pall GmbH)製の材料：１．２μｍの孔径を有するヒドロロン(Hydrolon))は、プラスチックカラム中に、単一層で配置される。これらの膜は、機械的支持体として役立つポリプロピレン・フリット上に配置される。これらの膜は、環を有するプラスチックカラム中に固定される。
【０１４４】
この方法で調製されたカラムは、ルアー接続によって真空チャンバーへ接続される。全ての単離段階は、真空の適用によって行われる。
【０１４５】
単離のために、５×１０5個のＨｅＬａ細胞を、遠心分離によってペレットにし、上清液を除去する。１５０μｌの市販のイソチオシアン酸グアニジニウムバッファー、例えば、キアゲン(Qiagen)社製のＲＬＴバッファーの添加によって、現在の技術からよく知られている方法で、細胞を溶解することができる。溶解は、ピペッティング又はボルテックスミキサーでの混合によって、約５秒間粗く混合することによって促進される。次いで、７０％エタノール１５０μｌを添加し、ピペッティング(pipetting)又はボルテックスミキサーでの混合(vortexing)によって、約５秒間混合する。
【０１４６】
その後、溶菌液はピペットでプラスチックカラムへ移され、真空チャンバーを取り除くことにより、膜を通して吸引される。ＲＮＡは、このように作り出された条件の下で、膜に結合したまま保たれる。次に、イソチオシアン酸グアニジニウムを含む市販の一番目の洗浄バッファー、例えば、キアゲンのＲＷ１バッファーによって、及び、その後トリス又はトリスとアルコールを含む二番目の洗浄バッファー、例えばキアゲンのＲＰＥバッファーによって、洗浄が行われる。それぞれの場合、真空チャンバーを取り外すことによって洗浄バッファーを吸引することができる。最後の洗浄段階の後、膜を乾燥するために、約１０分間真空を維持し、その後、真空チャンバーに空気を入れる (airated)。
【０１４７】
溶出のために、精製されたＲＮＡを膜からリリースするために、７０μｌのＲＮａｓｅを含まない水を膜上にピペットで移す。１０〜３０℃の範囲の温度で１分間インキュベートした後、溶出液を膜の最上面からピペットで取り、溶出を完全なものにするために、溶出段階を繰り返す。
【０１４８】
その後、この方法で得られ単離された全ＲＮＡの量を、２６０ｎｍの波長の吸光度測定によって測定する。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度値の間の比の測定によって、このように得られたＲＮＡの品質を測定する。
【０１４９】
疎水性ナイロン膜(番号１及び２)による２つの単離の結果を、下記表１において、一方で疎水性ナイロン（ナイラフロ(Nylaflo)）並びにシリカ膜（番号４）が使用された比較実験と比較する。報告された値は、本発明により使用された材料の印象的な単離収量及び分離効果に対する説得力のある支持を与える。それらは、そのフリース様構造及びそれによる溶出液バッファーの主要部の吸収に恐らく起因して、シリカゲルフリースが明らかな収量の低下を引き起こすことも示す。
【０１５０】
【表１】
【０１５１】
単離されたＲＮＡは、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析することもできる。この目的のために、例えば、１．２％ホルムアルデヒドアガロースゲルを調製する。結果を図６に再現する。
【０１５２】
図６において、1列目は、疎水性ナイロン膜によって単離された、１．２μｍの孔径を有するマグナＳＨからの全ＲＮＡを示す。
２列目は、１．２μmの孔径を有するヒドロロンからの疎水性ナイロン膜によって単離された全RNAを表す。
３列目は、シリカ膜によって単離された全ＲＮＡのクロマトグラムを表す。
それぞれの場合において、５０μｌの全ＲＮＡ単離物が分析された。
【０１５３】
図６は、シリカ膜が使用される場合、測定可能な程度の全ＲＮＡを単離することができないという明らかな証拠を与えるものである。
【０１５４】
実施例２
様々な塩／アルコール混合物によって疎水性膜とＲＮＡを結合させるによる結合していないＲＮＡの単離
この実施例において、溶菌液及び洗浄溶液は、真空の適用により疎水性膜に通される。
疎水性ナイロン膜(例えばパル社(Pall company)製１．２μｍヒドロロン)は、実施例1と同様の方法で、真空チャンバーに連結したプラスチックカラムへ導入される。
【０１５５】
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌをピペッティングによって、市販のイソチオシアン酸グアニジニウム含有溶解バッファー (例えばキアゲン製ＲＬＴバッファー)３５０μｌ、１．２Ｍの酢酸ナトリウム溶液３５０μｌ、２Ｍの塩化ナトリウム溶液３５０μｌ及び４Ｍの塩化リチウム溶液３５０μｌを含んでおり、ピペットで移すことにより混合される市販の溶解バッファーの３５０μｌそれぞれと混合し、それぞれピペッティングによって混合する。
【０１５６】
次に、エタノール２５０μｌを各混合物に添加し、同様にピペッティングによって混合する。その後、ＲＮＡ含有溶液を、ピペットでプラスチックカラムへ移し、真空チャンバーを取り除くことにより膜を通して吸引する。記載した条件の下で、ＲＮＡは、膜へ結合したままである。その後、実施例1に記載のように膜を洗浄する。
【０１５７】
最後に、実施例１にも記載したようなＲＮＡを、上方でピペッティングによって膜から除去する。
【０１５８】
単離された全RNAの容量を、２６０ｎｍでの吸光度測定によって測定した。２６０及び２８０ｎｍでの吸光度の値の間の比の測定によって、このようにして得られたＲＮＡの品質を測定する。
【０１５９】
【表２】
【０１６０】
実施例３
ＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡの単離
実施例1に従って、様々な疎水性膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。この方法で準備されたカラムを、回収管に配置し、遠心分離によって以下の単離段階を行う。
【０１６１】
単離のために、５×１０5個のＨｅＬａ細胞を、遠心分離によってペレットにし、上清物質を除去する。従来技術から原則として(principly)よく知られている方法で、市販のイソチオシアン酸グアニジニウムバッファー(例えばキアゲン製RLTバッファー)１５０μｌを添加することによって、細胞を溶解する。約５秒間、ピペッティング又はボルテックスミキサーで攪拌することによって繰り返し混合することにより溶解が促進される。その後、７０％エタノール１５０μｌを添加し、ピペッティングにより、又は約５秒間、ボルテックスミキサーで攪拌することにより混合する。
【０１６２】
続いて、溶菌液をプラスチックカラムへ移し、1分間１００００×ｇで遠心分離を行い、膜に通す。続いて、イソチオシアン酸グアニジニウムを含む市販の洗浄バッファー、例えば、キアゲンのＲＷ１バッファーによって洗浄を行い、続いて、トリス及びアルコールを含有する洗浄バッファー、例えばキアゲン製ＲＰＥバッファーによって２回目の洗浄を行う。洗浄バッファーは、遠心分離によって膜に通される。膜を乾燥させるために、２分間２００００×ｇで最後の洗浄段階を行う。
【０１６３】
溶出のために、精製されたＲＮＡを膜からリリースするために、７０μｌのＲＮａｓｅを含まない水を、ピペットで膜上に移す。１０〜３０℃の範囲の温度における１〜２分間のインキュベーションの後、溶出液を膜の最上面からピペットで取り除く。完全な溶出を達成するために、溶出段階を一回繰り返す。
【０１６４】
その後、この方法で得られた、単離された全ＲＮＡの容量を、２６０ｎｍの波長における吸光度測定によって測定する。２６０及び２８０ｎｍでの吸光度の値の間の比の測定により、ＲＮＡの品質を測定する。
【０１６５】
異なる疎水性膜を有する単離の結果を、表３に示す。
膜当り３−５つの並行試験を行い、平均値を算出する。シリカ膜の使用によって、溶出液が、それを膜の最上面から除去することにより得られる場合、シリカ膜の使用によって、測定可能な容量の全ＲＮＡは全く単離することができない。
【０１６６】
【表３】
【０１６７】
実施例３ｂ
親水性膜上への結合によるＨｅＬａ細胞からの全RNAの単離
実施例1に従って、様々な親水性膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。この方法で準備されたカラムを、回収管に配置し、以下の単離段階を遠心分離によって行う。
【０１６８】
単離のために、５×１０5個のＨｅＬａ細胞を使用する。実施例３に記載のように、以下の単離段階及び核酸の溶出が行われる。
【０１６９】
その後、この方法で得られた、単離された全ＲＮＡの容量を、２６０ｎｍの波長における吸光度測定によって測定する。２６０及び２８０ｎｍでの吸光度の値の間の比の測定によって、ＲＮＡの品質を測定する。
異なる親水性ナイロン膜による単離の結果を、表３ｂに示す。膜当り２−５つの並行試験を行い、平均値を算出する。シリカ膜の使用によって、溶出液が、それを膜の最上面から除去することにより得られる場合、測定可能な容量の全ＲＮＡを単離することはできない。
【０１７０】
【表４】
【０１７１】
【表５】
【０１７２】
実施例４
水溶液からの結合していないＲＮＡの単離
実施例1に従って、異なる疎水性膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、市販のイソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えばキアゲン製ＲＬＴバッファー３５０μｌと混合する。続いて、エタノール２５０μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、遠心分離（１００００×ｇ；１分）によって膜に通す。続いてバッファー、例えばキアゲン製ＲＰＥによって膜を２回洗浄する。
各バッファーを、遠心分離によって膜に通す。膜を乾燥させるために、最後の洗浄段階を、２００００×ｇで行う。
【０１７３】
続いて、実施例１において既に記載されたようなＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まない水によって溶出し、膜の最上面からピペットによって取り除く。
この方法で得られた、単離された全ＲＮＡの容量を、２６０ｎｍでの吸光度測定によって測定する。２６０及び２８０ｎｍでの吸光度の値の比の測定により、ＲＮＡの品質を測定する。
【０１７４】
様々な疎水性膜による単離の結果を下記表４に記載する。
膜当り３−５つの並行試験を行い、それぞれの場合の平均値を算出する。シリカ膜を使用することによって、溶出液を膜の最上面から取り除くことにより回収する場合、測定可能な容量の全ＲＮＡを単離することはできない。
【０１７５】
【表６】
【０１７６】
実施例４ｂ
親水性膜に結合することによる水溶液からの結合していないＲＮＡの単離
実施例1に従って、異なる親水性膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、市販のイソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えばキアゲン製ＲＬＴバッファー３５０μｌと混合する。続いて、エタノール２５０μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例４に従って膜へ通し、洗浄及び乾燥させる。
続いて、実施例１に既に記載したようなＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まない水によって溶出し、膜の最上面からピペットで取り除く。
その後、この方法で得られた、単離された全ＲＮＡの容量を、２６０ｎｍでの吸光度測定によって測定する。２６０及び２８０ｎｍでの吸光度の値の間の比の測定によって、ＲＮＡの品質を測定する。
【０１７７】
様々な親水性膜による単離の結果を下記表４ｂに記載する。
膜当り２−５の並行試験を行い、それぞれの場合の平均値を算出する。シリカ膜の使用によって、溶出液が膜の最上面から除去されることにより回収される場合、測定可能な容量の全ＲＮＡを単離することはできない。
【０１７８】
【表７】
【０１７９】
実施例５
膜の孔径に依存するＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡの単離
実施例1に従って、異なる孔径を有する疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てた。
実施例３に従って、５×１０5個のＨｅＬａ細胞から細胞溶菌液を調製し、カラムへ移す。続いて、遠心分離を用いて、市販のキアゲンのバッファーＲＷ１及びＲＰＥによって膜を洗浄する。膜を乾燥させるために、２００００×ｇで２分間、最後の遠心分離段階を行う。実施例１に記載のように溶出を行う。
結果を下記表５に記載する。
膜当り３−５つの並行試験を行い、それぞれに対して平均値を算出する。
【０１８０】
【表８】
【０１８１】
実施例６
ＨｅＬａ細胞から単離された全ＲＮＡの安定性及び品質
実施例１に従って、親水性膜（例えばパル社製ヒドロロン、孔径３μｍ）を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
実施例３に従って、５×１０5個のＨｅＬａ細胞から、細胞溶菌液を調製し、カラムへ移す。続いて、遠心分離を用いて、市販のキアゲンのバッファーＲＷ１及びＲＰＥによって膜を洗浄する。膜を乾燥させるために、２００００×ｇで２分間、最後の遠心分離段階を行う。実施例１に記載のように溶出を行う。
単離された全ＲＮＡを、３７℃で１６時間インキュベートし、続いて非変性(non-denaturalizing)アガロースゲルに適用し、分析する。ＲＮＡが何ら変性されなかったことが明らかになる。上記の方法によって単離されたＲＮＡは、核酸分解酵素による汚染を示さないので、高品質である。
【０１８２】
実施例７
９６ウェルトレイ(96-well-tray)内の親水性膜における結合による水溶液からの結合していないＲＮＡの単離
親水性ポリビニリデンジフルオライド膜を有する９６ウェルプレート（ミリポア社(millipore)製デュラポア(Durapore)、０．６５μｍ）を使用する。
全ＲＮＡを含む水溶液５．３ｍｌを、市販のイソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えば、キアゲン社製ＲＬＴバッファー１８．４ｍｌと混合する。続いて、エタノール１３．１ｍｌを添加し、ピペッティングによって混合する。この混合物３５０μｌを、ウェル毎に添加し、真空を適用することによって膜を通して輸送する。続いて、バッファー、例えばキアゲン社のＲＰＥによって膜を２回洗浄する。バッファーは、それぞれの場合において、バッファーを、真空の適用によって膜を通して輸送する。最後の洗浄段階の後に、紙タオルによってトレイを拭き取り、次いで真空を適用することによって５分間乾燥させる。続いて、ＲＮＡを、実施例１に記載のようにＲＮａｓｅを含まない水によって溶出し、膜からピペットで取り除く。
この方法で得られた、単離された全ＲＮＡの容量は、その後２６０ｎｍでの吸光度測定によって測定され、トレイ全体の平均値並びに標準偏差を算出した。平均値は８．４μｇで、標準偏差は０．７μｇである。
【０１８３】
実施例８
毛管力による全ＲＮＡの単離
親水性ポリビニリデン・ジフルオライド膜(ミリポア社製デュラポア、０．６５μｍ)を有する９６ウェルプレートを使用する。
全ＲＮＡを含有する水溶液３３μｌを、市販のイソシアン酸グアニジニウム(guanidinium-iso-cyanate)を含有する溶解バッファー、例えばキアゲン社製ＲＬＴバッファー１１０μｌと混合する。続いて、エタノール７８μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。この混合物４５μｌを、ウェル毎に添加する。 強い吸引性(suction properties)を有する家庭用スポンジを水に浸し、スポンジの表面上の膜の底面に９６ウェルプレートを配置する。ＲＮＡ混合物を、毛管力によって膜を通して輸送する。続いて、バッファー、例えばキアゲン社のＲＰＥによって膜を２回洗浄する。トレイをスポンジの表面に置くことによって、バッファーも膜を通して輸送することができる。最後の洗浄段階の後、トレイを５分間空気にさらして乾燥させる。
続いて、実施例１に記載のように、ＲＮａｓｅを含まない水によってＲＮＡを溶出し、ピペットによって膜から取り除く。
その後、この方法で得られた、単離された全ＲＮＡの容量を、２６０ｎｍ０の波長での吸光度測定によって測定し、トレイ全体の平均値並びに標準偏差を算出する。平均値は５．９μｇで、標準偏差は０．７μｇである。
【０１８４】
実施例９
塩酸グアニジニウムを含有するバッファーによる水溶液からのゲノムＤＮＡの単離
実施例１に従って、疎水性膜(例えばＭＳＩ社製マグナＳＨ、孔径５μｍ)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。市販のキアゲン社製バッファーを用いて精製を行う。
肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを含有する水溶液２００μｌを、ＰＢＳバッファー中で調製する。塩酸グアニジニウムを含有するバッファー、例えば、キアゲン社製ＡＬ２００μｌを添加して混合する。続いて、エタノール２１０μｌを添加し、ボルテックスミキサーによる攪拌によって混合する。実施例３に従って、混合物をカラムへ添加し、遠心分離によって膜を通して輸送する。続いて、アルコール含有バッファー、例えばキアゲン社製ＡＷによって膜を洗浄し、乾燥させる。実施例１に記載のように溶出を行う。３つの並行試験を行い、平均値を算出する。
【０１８５】
その後、単離されたDNAの容量を、２６０ｎｍの波長での吸光度測定によって測定すると、初めの容量の約３０％になる。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度比は、１．８２になる。
【０１８６】
実施例１０
イソチオシアン酸グアニジニウムを含有するバッファーによって疎水性膜に結合させることによる水溶液からのゲノムＤＮＡの単離
実施例１に従って、様々な膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。
全ＤＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー（４ＭのＧＩＴＣ、０．１ＭのＭｇＳＯ４、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４）３５０μｌと混合する。続いて、エタノール２５０μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。混合物をカラムへ添加し、遠心分離（１００００×ｇ；１分）によって膜を通して輸送する。続いて、バッファー、例えばキアゲン社製ＲＰＥによって膜を２回洗浄する。それぞれの場合、遠心分離によって膜を通してバッファーを輸送する。膜を乾燥させるために、２００００×ｇにおいて最後の洗浄段階を行う。実施例１に記載のように溶出を行う。膜当り３つの並行試験を行い、それぞれに対して平均値を算出する。
結果を表６に記載する。
【０１８７】
【表９】
【０１８８】
実施例１１
組織からのゲノムＤＮＡの単離
実施例１に従って、疎水性膜(例えばＭＳＩ製マグナ−ＳＨ、５μｍ)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。市販のキアゲンのバッファーによって精製を行う。
ＡＴＬバッファー１８０μｌを、腎臓組織（マウス）１０ｍｇへ添加し、機械的ホモジナイザー(homogenizer)においてすり潰す。続いて、プロテイナーゼ(proteinase)Ｋ（水２０μｌに約０．４ｍｇ溶出）を添加し、５５℃で１０分間インキュベートする。塩酸グアニジニウム含有バッファー、例えばキアゲン製ＡＬ２００μｌを添加した後、及び７０℃で１０分間インキュベートした後、この溶液へエタノール２００μｌを加えて混合する。この混合物をカラム内へ置き、遠心分離によって膜に通す。アルコール含有バッファー、例えばキアゲン社製ＡＷ１及びＡＷ２によって膜を洗浄し、続いて遠心分離によって乾燥させる。実施例１に記載のように溶出を行う。３つの並行試験を行い、平均値を算出する。
【０１８９】
続いて、単離されたＤＮＡ量を、２６０ｎｍの波長における吸光度測定によって測定すると、平均は９．７７μｇである。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度の比は、１．７４である。
【０１９０】
実施例１２
血液からのゲノムＤＮＡの単離
実施例１に従って、疎水性膜（例えば、ＭＳＩ社製マグナ−ＳＨ、５μｍ）を用いてプラスチックカラムを組み立てる。市販のキアゲン製バッファーによって精製を行う。
【０１９１】
血液２００μｌに対し、ＡＬ２００μｌ及びキアゲンプロテアーゼ(QIAGEN protease)２０μｌを添加し、完全に混合し、５６℃で１０分間インキュベートする。エタノール２００μｌを添加した後、調製物を混合し、カラムへ添加し、そして遠心分離によって膜を通して輸送する。アルコール含有バッファー、例えばキアゲン社製ＡＷ１及びＡＷ２によって膜を洗浄し、遠心分離によって乾燥させる。実施例１に記載のように溶出を行う。
続いて、単離されたＤＮＡ量を、２６０ｎｍの波長における吸光度の測定によって測定すると、１．０３μｇである。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度の比は、１．７である。
【０１９２】
実施例１３
ＲＮＡとＤＮＡとの混合物からの全ＲＮＡの単離
実施例１に従って、疎水性膜(例えばパル社製ヒドロロン、１．２μｍ)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡを含有する水溶液２７５μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えばキアゲン社製ＲＬＴバッファー１７５μｌと混合する。続いて、エタノール２５０μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。この混合物をカラムに加え膜を通して輸送し、実施例４に従って洗浄及び乾燥する。最初の遠心分離段階からの浸透物(penetrant)は、市販のミニスピンカラム(Mini-Spin-Column)（例えば、キアゲン社製ＱＩＡａｍｐミニスピンカラム）へ輸送され、遠心分離によって膜を通して取り出される。実施例４に従い、更なる洗浄段階を行う。続いて、遠心分離（１００００×ｇ、１分）によって、ＲＮａｓｅを含まない水を用いて核酸を溶出し、非変性アガロースゲルにおいて分析する（図７）。ここで記載の方法は、全ＲＮＡとゲノムＤＮＡの良好な分離を可能にする。
【０１９３】
図７は、２つの異なる溶出液の電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
１列目：疎水性ナイロン膜による全ＲＮＡの単離；
２列目：キアゲン社製ＱＩＡａｍｐミニスピンカラムによる浸透物からのゲノムＤＮＡの単離。
【０１９４】
実施例１４
疎水性及び親水性膜との結合によるに水溶液からのプラスミドＤＮＡの単離
実施例１に従って、様々な膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
プラズミドを含有する水溶液（クロンテック社(Clontech company)製ｐＣＭＶ□）１００μｌを、塩酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー（４ＭのＧＩＴＣ、０.１ＭのＭｇＳＯ4、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４）３５０μｌと混合する。続いて、イソプロパノール２５０μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。混合物を、実施例４に従ってカラムに加え、膜を通して輸送し、洗浄及び乾燥する。最後に、プラスミドＤＮＡを、実施例１に既に記載したようなＲＮａｓｅを含有しない水によって溶出し、ピペットで膜から取り除く。
その後、単離されたプラスミドＤＮＡの容量を、２６０ｎｍの波長での吸光度測定によって測定する。
様々な膜をによる単離の結果を、以下の表に記載する。
膜当り３つの並列試験を行い、それぞれに対して平均値を算出する。
【０１９５】
【表１０】
【０１９６】
実施例１５
異なるカオトロピック剤の使用による水溶液からの全ＲＮＡの固定化
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液各１００μｌを、異なる濃度のイソチオシアン酸グアニジニウム(GITC)又は塩酸グアニジニウム(GuHCl)を含む異なる溶解バッファー３５０μｌと混合する。続いて、エタノール２５０μｌを加え、ピペッティングによって混合する。その後、混合物をカラムへ輸送し、遠心分離(１００００×ｇ；１分)によって膜に通す。続いて、アルコール含有バッファー、例えばキアゲン社製ＲＰＥによって膜を２回洗浄する。遠心分離によってバッファーを膜に通す。膜を乾燥させるために、２００００×ｇで最後の洗浄段階を行う。実施例１に記載のように溶出を行う。２つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
結果を表８に記載する。
【０１９７】
【表１１】
【０１９８】
実施例１６
異なるアルコールの使用による水溶液からの全ＲＮＡの固定化
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(濃度４Ｍ)３５０μｌと混合する。続いて、異なる量のエタノール又はイソプロパノールを加え、７００μｌまでのＲＮａｓｅを含有しない水を入れて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例４に従って膜に通し、洗浄する。実施例１のように溶出を行った。
２つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
結果を表９に記載する。
【０１９９】
【表１２】
【０２００】
実施例１７
様々なｐＨ値を有する水溶液からの全ＲＮＡの固定化
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(濃度４Ｍ)３５０μｌと混合する。バッファーは、クエン酸ナトリウム２５ｍＭを含有し、ＨＣｌ又はＮａＯＨによって異なるｐＨ値に調整される。続いて、エタノール２５０μｌを加えて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例４に従って膜に通して洗浄する。実施例１のように溶出も行った。２つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
結果を表１０に記載する。
【０２０１】
【表１３】
【０２０２】
実施例１８
様々な塩類を含む水溶液からの全ＲＮＡの固定化
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡ含有水溶液１００μｌを、塩類(ＮａＣｌ、ＫＣＬ、ＭｇＳＯ4)を含有する溶解バッファー３５０μｌと混合する。 続いて、Ｈ2Ｏ又はエタノール２５０μｌを加えて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例４に従って膜に通し、洗浄する。２つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
結果を表１１に記載する。
【０２０３】
【表１４】
【０２０４】
実施例１９
様々なバッファー条件による水溶液からの全ＲＮＡの固定化
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー（濃度２．５Ｍ）３５０μｌと混合する。溶解バッファーを、様々な濃度のｐＨ７のクエン酸ナトリウム、又はｐＨ７．２のシュウ酸ナトリウムと混合する。 続いて、エタノール２５０μｌを加えて混合する。 その後、この混合物をカラムへ移し、そして、実施例１に従って、膜に通して洗浄し、溶出する。
結果を表１２に記載する。２つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
【０２０５】
【表１５】
【０２０６】
実施例２０
様々なバッファー物質による水溶液からの全ＤＮＡの固定化
実施例１に従って、疎水性膜(例えばパル社製ヒドロロン１．２μｍ)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＤＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(４ＭのＧＩＴＣ、０．１ＭのＭｇＳＯ4)３５０μｌと混合する。溶解バッファーを、様々なバッファー物質(濃度２５ｍＭ)と混合し、様々なｐＨ値に標準化する。続いて、エタノール２５０μｌを加えて混合する。 その後、この混合物をカラムへ移し、実施例４に従って、膜に通し、洗浄し、そして溶出する。
結果を表１３に記載する。３つの試験を行い、それぞれの時点で平均値を決定する。
【０２０７】
【表１６】
【０２０８】
実施例２１
フェノールによる水溶液からの全ＲＮＡの固定化
実施例１のように、疎水性膜(例えばパル社製ヒドロロン、１．２μｍ)を有するプラスチックカラムを構成する。
ＲＮＡ水溶液を、フェノール７００μｌと混合し、遠心分離によって膜を通して分配する。実施例４のように、膜を洗浄し、ＲＮＡを溶出させる。２つの測定を行った。それぞれの場合の平均値を示す。
その後、単離されたＤＮＡの容量を、２６０ｎｍの波長での吸光度測定によって測定すると、約１０．９５μｇになる。２６０ｎｍにおける吸光度と２８０ｎｍにおけるものの比は、０．９７５になる
【０２０９】
実施例２２
異なる塩濃度の下で固定化された全ＲＮＡの洗浄
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー３５０μｌ（濃度４Ｍ）と混合する。続いて、エタノール２５０μｌを加えて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例４に従って膜に通し、洗浄する。その後、様々な濃度のＮａＣｌ及び８０％エタノールを含有するバッファーで、膜を２回洗浄する。各回ごとに、遠心分離によってバッファーを膜に通す。膜を乾燥させるために、２００００×ｇで最後の洗浄段階を行う。実施例１に従って溶出も行われる。２つの試験を行い、それぞれの場合の平均値を示す。
結果を表１４に記載する。
【０２１０】
【表１７】
【０２１１】
実施例２３
異なる塩及びバッファー条件の下での固定化された全ＲＮＡの溶出
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー３５０μｌ（濃度４Ｍ）と混合する。続いて、エタノール２５０μｌを加えて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例１に従って膜へ通し、洗浄する。
溶出のために、精製されたＲＮＡを膜から溶出するために、７０μｌのＮａＣｌ含有溶液、トリス／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７）、又はシュウ酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．２）を、ピペットで膜上へ移す。１〜２分のインキュベーションの後、１０−３０℃の温度において、ピペットで溶出液を膜の表面から取り除く。完全な溶出を達成するために、溶出段階を１回繰り返す。２つの試験を行い、それぞれの場合の平均値を示す。
結果を表１２に要約する。
【０２１２】
【表１８】
【０２１３】
実施例２４
様々な温度における固定化されたＲＮＡの溶出
実施例１に従って、疎水性膜(例えばパル社製ヒドロロン、３μｍ)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
単離のために、５×１０5個のＨｅＬａ細胞を使用する。以後の単離段階は、実施例３に記載のように行われる。
溶出のために、様々な温度のＲＮａｓｅを含まない水７０μｌを、膜からＲＮＡを溶出するために、膜上へピペットで移す。適当な溶出温度における１−２分のインキュベーションの後、溶出液をピペットで膜の上方から取り除く。完全な溶出を達成するために、溶出段階を１回繰り返す。
３つの試験を行い、それぞれの場合の平均値を示す。
結果を表１６に要約する。
【０２１４】
【表１９】
【０２１５】
実施例２５
遠心分離による固定化されたＲＮＡの溶出
実施例1に従って、疎水性膜（例えばパル社製ヒドロロン １．２μｍ）を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＤＮＡを含有する水溶液３５０μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えば キアゲン製ＲＬＴバッファー３５０μｌと混合する。続いて、エタノール２５０μｌを加えてピペッティングによって混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、遠心分離(１００００×ｇ；1分)膜に通す。続いて、バッファー、例えばキアゲン社製ＲＰＥによって膜を２回洗浄する。各回において、バッファーを、遠心分離によって膜を通して輸送する。膜を乾燥させるために、２００００×ｇにおいて最後の洗浄段階を行う。
溶出のために、ＲＮａｓｅを含有しない水７０μｌを、ＲＮＡを膜からリリースするためにピペットで膜上へ移す。１０−３０℃の範囲内の温度で、１分間インキュベートした後、溶出液を、遠心分離（１００００×ｇ、１分）によって膜を通して輸送する。完全な溶出を確実なものにするために、溶出段階を再び繰り返し、それら溶出液を混合する。５つの並行試験を行い、それぞれの場合の平均値を示す。
その後、単離された全ＲＮＡの容量を、２６０ｎｍの波長における吸光度測定によって測定すると、平均で６．４μｇになる。２６０ｎｍにおける吸光度と２８０ｎｍにおけるものの比は、１．９４になる。
【０２１６】
実施例２６
β-アクチン(β-actin)ｍＲＮＡの増幅及び検出のための５´−ヌクレアーゼＰＣＲ検定(5'-nuclease PCR-assays)の使用による“リアルタイム”定量ＲＴ−ＰＣＲ(“Real Time”quantitative RT-PCR)における全ＲＮＡの使用
実施例３に従って、市販の膜（パル、３μｍの孔径を有するヒドロロン）を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
ＲＮＡを単離するために、１×１０5個のＨｅＬａ細胞を使用し、実施例１に記載のように全ＲＮＡの精製を行う。実施例１に記載のように、２×７０μｌのＨ2Ｏによって溶出を行う。残留する微量のＤＮＡの完全な除去のために、分析前にＤＮａｓｅによって試料を処理する。
【０２１７】
“単一容器”‘リアルタイム’定量RT-PCRは、市販のパーキン・エルマー(Perkin-Elmer)の反応系(タクマン(TaqMan)TMPCR試薬キット)を用いて、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を使用することによって行われる。β−アクチンに対して特異的なプライマー及び特異的なタクマンプローブ(TaqMan-probe)(パーキン・エルマー製タクマンβ−アクチン検出キット（TaqManTMβ-Actin Detection Kits）を使用することにより、全ＲＮＡ試料中のβ−アクチンｍＲＮＡ分子が、まず最初にβ−アクチンｃＤＮＡに転写され、続いて、同じ反応容器中で、中断することなく全ての反応が増幅され、直ちに検出される。製造者の指示に従って反応調製物を生成する。３種の異なる容量の単離された全ＲＮＡ（１、２、４μｌの溶出液）を使用し、３つの試験を行う。対照として、ＲＮＡを含まな３種の調製物も試験する。
３７℃で１時間、ｃＤＮＡ合成を行い、その後直ちにＰＣＲを４０サイクル行う。パーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ(Perkin Elmer Applied Biosystems)製ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM７７００配列検出機(ABI PRISMTM Sequence Detector)において、反応及び分析を行う。ＰＣＲサイクル中に生成された全てのアンプリコン(amplicon)は、タクマン−プローブから分割することによって生成される発光分子(light-emitting molecule)を生じさせる。生成された全ての光信号は、生成されるアンプリコン量に正比例し、従って全ＲＮＡ試料中の最初の転写可能容量に正比例する。発光を装置で測定し、コンピュータープログラムによって評価する。光信号を、バックグラウンド上で検出せざるを得ないＰＣＲサイクルは、“しきい値サイクル(Threshold Cycle)”(ct.)と呼ばれるであろう。この値は、試料中で使用することができる特異的に増幅されたＲＮＡの量に対する尺度(measure)である。
【０２１８】
ここで記載の方法によって単離された全ＲＮＡの使用量１μｌに対して、１７．１の平均ｃｔ−値が得られ、全ＲＮＡ２μｌに対して、ｃｔ−値は１６．４であり、全ＲＮＡ４μｌに対してｃｔ−値は１５．３である。この結果、使用された全ＲＮＡとｃｔ−値との間で線形相関(linear correlation)が得られる。このことは、全ＲＮＡが、増幅反応を阻害し得る物質を含まないことを示す。ＲＮＡを含まない対照例は、信号を全く生成しない。
【０２１９】
実施例２７
β−アクチンｍＲＮＡの増幅及び検出のためのＲＴ−ＰＣＲにおける全ＲＮＡの使用
実施例1に従って、市販の膜(パル社、１．２又は３μｍの孔径を有するヒドロロン；サルトリウス社(Sartorius company)、０．４５μｍの孔径を有するサルトロン(Sartolon))を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
ＲＮＡを単離するために、2つの異なる原料を使用する：
１）水溶液中の肝臓(マウス)からの全ＲＮＡ；実施例４に記載のように、精製及び溶出を行う；及び
２）５×１０５個のＨｅＬａ細胞；実施例３に記載のように全ＲＮＡの生成及び溶出を行う。
それぞれの試験に対し、単離された全ＲＮＡ２０ｎｇを使用する。対照として、ＲＮｅａｓｙ−キット(キアゲン)によって精製されたＲＮＡ及びＲＮＡを含まない調製物を使用する。
【０２２０】
標準状態の下で、これらの試料を用いＲＴ−ＰＣＲを行う。増幅のために、２つの異なるプライマー対を、β−アクチン−ｍＲＮＡに対して使用する。１５０Ｂｐの大きさのフラグメントは、感受性を確認するために役立ち、１．７ｋＢｐの大きさのフラグメントは、ＲＮＡの無欠性(integrity)を評価する。 ＲＴ反応から、１μｌが除去され、次のＰＣＲへ導入される。小さなフラグメントに対して２５サイクルを実施し、大きなフラグメントに対して２７サイクルを実施する。付加反応(addition reaction)の温度は５５℃である。続いて、増幅された調製物を、非変性ゲル上に置き、分析する。
【０２２１】
上記の方法で単離された、使用した２０ｎｇ容量の全ＲＮＡに対し、対応するＤＮＡフラグメントをＲＴ−ＰＣＲで確認することができる。ここで使用される条件は、ヒトβ−アクチン−ｍＲＮＡに適応するので、マウスの肝臓からの全ＲＮＡを使用する場合には、転写を確認することはできない。ＲＮＡを含まない対照例はシグナルを全く生成しない。
【０２２２】
図８は、ＲＴ−ＰＣＲ反応生成物の電気泳動分離の臭化エチジウム染色アガロースゲルを示す。
Ａ：１〜８列：１５０Ｂｐ−フラグメントのＲＴ−ＰＣＲ；
１、２列：ヒドロロン１．２μｍ膜によって精製した水溶液からのマウスの肝臓からのＲＮＡ；
３、４列：サルトロン膜によって精製したＨｅＬａ細胞からのＲＮＡ；
５、６列：ヒドロロン３μｍ膜によって精製したＨｅＬａ細胞からのＲＮＡ；
７列：ＲＮｅａｓｙ−ミニキット(RNeasy-Mini-Kit)によって精製したＲＮＡ；
８列：ＲＮＡを含まない対照。
Ｂ：１〜８列：１．７ｋＢｐ−フラグメントのＲＴ−ＰＣＲ
１、２列：ヒドロロン１．２μｍ膜によって精製した水溶液からのマウスの肝臓からのＲＮＡ；
３、４列：サルトロン膜によって精製したＨｅＬａ細胞からのＲＮＡ；
５、６列：ヒドロロン３μｍ膜によって精製したＨｅＬａ細胞からのＲＮＡ；
７列；ＲＮｅａｓｙ−ミニキットによって精製したＲＮＡ；
８列：ＲＮＡを含まない対照。
【０２２３】
実施例２８
β−アクチンｍＲＮＡの増幅及び検出のためのＮＡＳＢＡ反応（核酸配列に基づく増幅(nucleic acid sequence based amplification)）における全ＲＮＡの使用
実施例１に従って、市販の膜（パル社、１．２又は３μｍの孔径を有するヒドロロン；サルトリウス社、０．４５μｍの孔径を有するサルトロン）を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
ＲＮＡを単離するために、２つの異なる原料を使用する：
１）水溶液中の肝臓（マウス）からの全ＲＮＡ；実施例４に記載のように精製及び増幅を行う；及び
２）５×１０5個のＨｅＬａ細胞、実施例３に記載のように全ＲＮＡの精製及び溶出を行う。
【０２２４】
標準条件（ファーイ(Fahy),E.ら、1991、PCR Methods Amplic.1, 25-33））の下で、ＮＡＳＢＡ反応を行う。増幅のために、β−アクチンに特異的なプライマーを使用する。
【０２２５】
単離された全ＲＮＡを、各２０ｎｇ使用する。対照として、ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社）によって精製したＲＮＡ及びＲＮＡを含まない調製物を使用する。まず始めに、インキュベーションを、６５℃で５分間、そして４１℃で５分間行う。この段階に続いて、ＲＮａｓｅＨ、Ｔ７ポリメラーゼ、及びＡＭＶＶ−ＲＴからなる酵素混合物を加え、４１℃で９０分間インキュベートする。続いて、増幅調製物を、非変性ゲル上に置き、分析する。
上記の方法で単離した、使用される２０ｎｇの全ＲＮＡに対し、特異的転写を確認することができる（図９）。
【０２２６】
図９は、ＮＡＳＢＡ反応物の電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
１〜８列：ＮＡＳＢＡ反応物；
１、２列：ヒドロロン１．２μｍ膜によって精製した水溶液からのマウスの肝臓からのＲＮＡ；
３、４列：サルトロン膜によって精製したＨｅＬａ細胞からのＲＮＡ；
５、６列：ヒドロロン３μｍ膜によって精製したＨｅＬａ細胞からのＲＮＡ；
７列：ＲＮｅａｓｙミニキットによって精製したＲＮＡ；
８列：ＲＮＡを含まないＲＮＡ
【０２２７】
実施例２９
疎水性膜上のβ−アクチンｍＲＮＡの増幅及び検出のためのＮＡＳＢＡ反応
実施例１に従って、市販の膜（パル社、３μｍの孔径を有するヒドロロン；０．４５μｍの孔径を有するスポール(Supor)−４５０；ミリポア社(Millipore company)、３μｍの孔径を有するフルオロポア(Fluoropore)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
【０２２８】
ＲＮＡを単離するために、様々な量のＨｅＬａ細胞を使用し、実施例３に記載のように全ＲＮＡの精製を行う。２０μｌのＮＡＳＢＡ反応バッファーの添加によって、溶出を行う。続いて、膜においてＮＡＳＢＡ反応を行う。反応は、標準条件（ファーイ(Fahy),E.ら、1991、PCR Methods Amplic.1, 25-33））において行う。増幅のために、β−アクチンに特異的なプライマーを使用する。
反応容器を、まず最初に湯浴(waterbath)において４１℃で５分間インキュベートする。この反応に続いて、ＲＮａｓｅＨ、Ｔ７ポリメラーゼ及びＡＭＶＶ−ＲＴからなる酵素混合物を加えて４１℃で９０分間インキュベートする。続いて、増幅された調製物を、非変性ゲル上に置き、分析する。
【０２２９】
５×１０5〜３×１０4個のＨｅＬａ細胞から単離された、使用された全ＲＮＡの量に対し、ここで記載の方法によって単離した全ＲＮＡにおいて、特異的な転写を確認することができる（図１０）。
【０２３０】
図１０が、ＮＡＳＢＡ反応物の電気泳動分離の臭化エチジウム染色アガロースゲルを示す。
Ａ：１〜４列：ＨｅＬａ細胞から、ヒドロロン３μｍ膜によって精製したＲＮＡ；
１列：２．５×１０5個の細胞；
２列：１．２５×１０5個の細胞；
３列：６×１０4個の細胞；
４列：３×１０4個の細胞；
Ｂ：１〜３列：ＨｅＬａ細胞から精製したＲＮＡ；
１列：２．５×１０5個のＨｅＬａ細胞からヒドロロン３μｍ膜によって精製したＲＮＡ；
２列：５×１０5個のＨｅＬａ細胞からスポール−４５０ＰＲによって精製したＲＮＡ；
３列：５×１０5個のＨｅＬａ細胞からフルオロポア３μｍ膜によって精製したＲＮＡ。
【０２３１】
実施例３０
酵素ＡｖａＩを有する疎水性膜上でのプラスミドＤＮＡの単離
実施例1に従って、疎水性膜(例えばパル社製スポール−２００ＰＲ)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
プラズミドを含有する水溶液（クロンテック社(Clontech company)製ｐＣＭＶ）１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(４ＭのＧＩＴＣ、０．１ＭのＭｇＳＯ4、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ ４)３５０μｌと混合する。続いて、イソプロパノール２５０μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。この混合物を、実施例４に従ってカラムへ加え、膜を通して輸送し、洗浄及び乾燥する。
制限酵素ＡｖａＩ用バッファー１００μｌを膜へ適用し、そして
１）除去し、新しい反応容器へ移し、続いて制限酵素（例えば、プロメガ社(Promega company)製ＡｖａＩ）を加え；
２）制限酵素（例えば、プロメガ社(Promega company)製ＡｖａＩ）をカラム中の溶出液に加える。
【０２３２】
反応物を、３７℃で１時間インキュベートし、続いて非変性ゲルに適用し、分析する（図１１）。
【０２３３】
図１１は、ＡｖａＩによる制限(restriction)後のプラスミドｐＣＭＶβの電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
１列：切断されていないプラスミド；
２、３列：ＡｖａＩ用反応バッファーによる溶出、新しい容器内での制限；
４、５列：膜上でのＡｖａＩによる制限。
【０２３４】
実施例３１
イソプロパノールによる沈殿のための加圧濾過
標準のプロトコルに従って、アニオン交換クロマトグラフィーによって溶出段階に含まれるプラスミドＤＮＡの単離を行う。高塩濃度バッファーにおいてカラムからＤＮＡを溶出する。続いて、０．７容量のイソプロパノールをこのＤＮＡ溶液に加え、調製物を混合し、室温で１−５分間インキュベートする。使用する濾過装置は、濾過カートリッジ内に５ｃｍ2の表面を有する０．４５μｍの酢酸セルロースフィルターである（滅菌濾過用標準装置、例えば、サルトリウス社製ミニサート(Minisart)）。このフィルターは、プランジャ(plunger)が取り除かれたシリンジ上に差し込まれる。
ここでシリンジをＤＮＡとイソプロパノールとの混合物で充填し、混合物をプランジャによってフィルターを介して加圧する。この形の沈殿物中には、（細孔を通ることができない）ＤＮＡが高い割合でフィルター上に残留する
ここで、シリンジからプランジャを取り除き、再度取り替えて、そしてフィルターを介して空気を加圧する。この段階は、１−２回繰り返され、膜の乾燥に役立つ。
続いて、バッファーがシリンジの本体に充填され、プランジャによって膜を介して加圧されるように溶出するために低塩バッファーを使用する。収量を増加させるために、この最初の溶出液は、シリンジ本体にもう一度充填され、プランジャによって膜を介して加圧される。この試験装置によって得られた収量は、典型的には８０％〜９０％の範囲である（実施例３４参照）。
【０２３５】
実施例３２
イソプロパノールによるＤＮＡの沈殿のための真空濾過
加圧濾過のように、プラスミドＤＮＡをまず最初に単離し、０．７容量(vol)のイソプロパノールを加える。濾過装置は、５ｃｍ2の表面を有する０．４５μｍの酢酸セルロースが供えられた、真空濾過用に構成された装置である。０．４５μｍの硝酸セルロースフィルター又は０．６５μｍの酢酸セルロース若しくは硝酸セルロースの多層フィルターを使用することもできる。
イソプロパノールとＤＮＡとの混合物を１−５分間インキュベートし、次いで濾過装置上に移す。真空をつなぐことにより、フィルターを通して溶液を吸い取る。適量の７０％エタノールをＤＮＡ沈殿を含むフィルターに加え、真空を再度つなぐことによって洗浄する。低塩バッファーを添加することにより、フィルターからのＤＮＡの溶出を行い、短時間のインキュベーションを行い、そしてもう一度真空をつなぐ。２回目の容量の低塩バッファーを用いてフィルターから再度溶出することにより、又は１回目の溶出段階からの溶出液による再開された(renewed)溶出によって、生成物を得ることができる。
ここでも同様に、得られた収量は、典型的には、初めに使用されたＤＮＡの８０％〜９０％の範囲である。
【０２３６】
実施例３３
方法として、実施例３２において示された真空濾過を使用する。真空濾過器サルトリウス(Sartorius)１６３１５を、濾過容器として使用する。ＤＨ５αから単離されたｐＣＭＶβを、プラスミドＤＮＡとして使用する。
【０２３７】
ＱＦバッファー（高塩濃度バッファー）１５ｍｌを、５００μｇのプラスミドに加えて混合する。イソプロパノール１０．５ｍｌを加えて再度混合する。これを、５分間インキュベートする。このように知音伝されたプラスミドＤＮＡを、濾過装置内に固定された膜上へ移す。ここで、真空をつないで濾過を開始する。５ｍｌの７０％エタノールによって膜を洗浄する（真空適用の再開）。その後、１ｍｌのＴＥバッファーをピペットで膜上へ移し、５分間インキュベートし、真空の適用によってＤＮＡを溶出する。続いて、１ｍｌのＴＥバッファーによって後溶出(post-elution)を行う。続いて、浸透物、洗浄画分及び混合溶出液においてそれぞれＤＮＡの総量を測定する（ＯＤ２６０）。以下の結果が得られる。
【０２３８】
【表２０】
【０２３９】
始めの量５００μｇに対して計算した結果、この試験において以下の収量が得られる。
【表２１】
【０２４０】
実施例３４
実施例３４に記載したような加圧濾過を方法として使用する。使用された濾過装置は、市販の０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター(ミニサート、サルトリウス)である。プラスミドＤＮＡとして、ＤＨ５αから単離されたｐＣＭＶβを使用する。
【０２４１】
１５ｍｌのＱＦバッファー(高塩濃度バッファー)を、１００、２００、３００等の９００μｇまでのプラスミドへ加えて混合する。１０.５ｍｌのイソプロパノールを加えて再び混合する。続いて、これを５分間インキュベートする。このように沈殿させたプラスミドＤＮＡを、プランジャを取り除いたシリンジに移す。ここで、シリンジによって加圧濾過を行う。２ｍｌのエタノールでフィルターを洗浄し、記載したように２回乾燥させる。２ｍｌのＴＥバッファーによって溶出を行う。溶出液によって後溶出を行う。続いて、混合溶出液によってそれぞれＤＮＡの総量を測定する（ＯＤ２６０）。以下の結果が得られる。
【０２４２】
【表２２】
【０２４３】
実施例３５
実施例３２に記載したような加圧濾過を方法として使用する。使用した濾過装置は、濾過チャンバー(ＱＩＡｖａｃ)上に差し込まれた市販の０．４５μｍの酢酸セルロースフィルター(ミニサート、サルトリウス)である。貯蔵部として、シリンジの本体を、フィルターの他方の端へ取り付ける。ＤＨ５αから単離したＰＣＭＶβを、プラスミドＤＮＡとして使用する。１５ｍｌのＱＦバッファー（高塩濃度バッファー）を、５００μｇのプラスミドに加えて混合する。１０．５ｍｌのイソプロパノールを加えて再度混合する。これを、５分間インキュベートする。このように沈殿させたプラスミドＤＮＡを、濾過装置に固定した膜へ移す。ここで、真空をつなぎ、濾過を開始する。フィルターは、７０ｍｌエタノール５ｍｌで洗浄しない。むしろ、２ｍｌのバッファーＥＢ（キアゲン）によって直ちに溶出を行う。溶出液によって後溶出を１回行う。ＤＮＡの総量を測定する。以下の結果が得られる：
【０２４４】
【表２３】
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】本発明による方法の実施に適した自動装置の概略図を示す。
【図２】本発明の方法の実施のための単離容器及び回収管の第一の態様を示す。
【図３】本発明による方法の実施のための単離容器及び回収管の第二の態様を示す。
【図４】本発明による方法の実施のための単離容器及び回収管の第三の態様を示す。
【図５】本発明による上部を有する単離容器の態様を示す。
【図６】本発明の方法による様々な試料の、電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
【図７】本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
【図８】本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
【図９】本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の更に別の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
【図１０】本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを再度示す。
【図１１】本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを最後に示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面上の核酸の単離及び精製のための新規な方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の遺伝的起源及び機能的活性は、それらの核酸を研究することにより決定及び研究され得ることが長い間知られていた。 核酸の分析は、細胞の活性の原因への直接的なアクセス(access)を可能にする。 従って、それらは、例えば代謝産物の確認(verification of metabolic products)のような間接的な従来の方法より潜在的に優れている。それ故、核酸の分析の大幅な増加が将来的に予想されるであろう。分子生物学的分析は、多くの分野において、例えば、医学的及び臨床的診断、薬剤の開発及び評価を行う製薬業界、食品生産の管理及び食品の調整等を行う食品分析において、植物の栽培及び動物の飼育を行う農畜産業において、並びに環境分析及び他の多くの研究分野において、既に使用されている。父子分析(paternity analysis)の例としては、組織型別、遺伝病の同定、ゲノム分析、分子診断学、例えば、感染症の同定、トランスジェニック(transgenic)研究、生物学及び医学の分野並びに多数の関連する分野における基礎研究を挙げることができる。
【０００３】
遺伝子の活性は、 ＲＮＡ(特に細胞中のｍＲＮＡ)の分析によって直接決定することができる。代謝病、感染又は不完全に発現された (exprimated)遺伝子の認識によるがんの進行は、例えばリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（“リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ”）又は遺伝子発現チップ分析のような現代の分子生物学的方法による細胞中で転写パターン(ｍＲＮＡパターン)の定量分析によって可能になった。例えば、遺伝子欠損の証明又はＨＬＡ型の決定並びに他の遺伝的マーカーは、例えばＰＣＲ、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ又は配列決定のような分子生物学的方法による細胞からのＤＮＡの分析によって可能になった。
【０００４】
ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡの分析も、ウイルスやバクテリアのような伝染性病原体の直接的な確認のために使用される。
【０００５】
ここでは、含有された核酸をそれぞれの分析方法において使用することができるような生物学的及び臨床的試料の調製は、一般に困難である。しかし、正確には、分析を自動的に行うべきである場合は、良好な収率及び高品質、同時に高い再現性を有する核酸の直接的な利用が、多数の試料において重要である。
【０００６】
従来技術(the state of the art)は、ＤＮＡの精製のための多くの方法を既に包含している。例えば、バーンボイム（Birnboim）の方法[酵素学における方法(Methods in Enzymology) 100 (1983) p243]に記載のクローニング及び他の同様の実験方法の目的のためのプラスミドＤＮＡをどのように精製するかが知られている。この方法では、不純物を取り除いたバクテリア起源の溶菌液は、塩化セシウム勾配にかけられ、４〜２４時間の間、遠心分離される。この段階に続いてＤＮＡの抽出及び沈殿が通常行われる。この方法は、一方では非常に高価な装置が必要であり、他方では長時間を要し、多額のコストがかかり、かつ自動化できないという欠点を有する。
【０００７】
不純物を取り除いた溶菌液がＤＮＡの単離のために使用される他の技術は、イオン交換クロマトグラフィー[コルパン(Colpan)ら、J.Chromatog. 296 (1984) p339]及びゲル濾過[モロー(Moreau)ら、Analyt. Biochem. 166 (1987) 188]からなる。これらの方法は、塩化セシウム勾配の代わりとして主に提案されるが、通常高濃度の塩を含む過度に希釈された溶液であるので、溶媒供給並びにそのようにして得られたＤＮＡ画分の沈殿のための精巧な装置を必要とする。
【０００８】
マルコ(Marko)ら[Analyt. Biochem.、121 (1982) p.382]及びボーゲルスタイン(Vogelstein)ら[Proc. Nat. Acad. Sci. 76 (1979) p 615]は、核酸を含む抽出物からのＤＮＡを高濃度のヨウ化ナトリウム又は過塩素酸ナトリウムに通すと、ＤＮＡのみが小型ガラスシンチレーション管、機械的手段によって微粒子化されたガラス繊維シートのガラス繊維膜に付着し、一方ＲＮＡ及び蛋白質は付着しないことを確認した。この方法で結合されたＤＮＡは、例えば水によって溶出することができる。
【０００９】
例えば、WO 87/06621には、ＰＶＤＦ膜上での核酸の固定化が記載されている。しかし、ＰＶＤＦ膜に結合した核酸は、その後溶出されず、その代わりに、全ての結合核酸を含む膜が、ＰＣＲ調製に直接導入される。最終的に、この国際特許出願及びその他の文献により、一般に、ほぼ十分な量の核酸の固定化を可能にするためには、水又はアルコールによって疎水性表面又は膜をあらかじめ湿らせておかなければならないことが明らかにされている。
【００１０】
他方では、例えばＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、サンライズ(SunRise)、ＬＣＲ、分岐ＤＮＡ、ＮＡＳＢＡ、又はタクマン(TaqMan)技術、及びＰＣＲ、ＳＤＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡチップのための同様のリアルタイム定量技術、並びに遺伝子発現のための配列(arrays)、突然変異分析、示差表示分析(differential display analysis)、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ｃＤＮＡ合成、又はサブトラクティブハイブリダイゼーション(subtractive hybridization)のような、多くの現代の適用のためには、直接固相から核酸をリリース(release)できることが絶対的に必要である。これと関連して、WO 87/06621は、この方法において使用される膜から核酸を、確かに回収することはできるとはいえ、この回収は問題を伴い、核酸の定量的な単離には全く適合しないことを教示している。また、この方法で得られた核酸は、それらを濃縮及び単離するためのその後の段階を絶対的に必要とする環境(circumstance)を、やや過剰に希釈する。
【特許文献１】国際公開第87/06621号パンフレット
【非特許文献１】バーンボイム（Birnboim）、Methods in Enzymology、100、（1983)、p243
【非特許文献２】コルパン(Colpan)ら、J.Chromatog.、296、(1984)、p339
【非特許文献３】モロー(Moreau)ら、Analyt. Biochem.、166、(1987)、188
【非特許文献４】マルコ(Marko)ら、Analyt. Biochem.、121、(1982)、p.382
【非特許文献５】ボーゲルスタイン(Vogelstein)ら、Proc. Nat. Acad. Sci.、76、(1979)、p615
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
全ての核酸の水溶液及び他の溶液、並びに生体試料及び材料のような全ての物質及び試料、食料品等は、本発明の意味における核酸試料という語に含まれるであろう。本発明の意味において、核酸含有試料又は物質は、核酸を含む試料又は試料調製によって定義されるであろう。生物学的物質又は生体試料とは、例えば、細胞を含まない試料物質、血漿、血液、唾液、尿、糞便、精液のような体液、細胞、血清、白血球画分、外皮催炎物質(crust phlogistica)、塗抹標本(smears)、あらゆる種類の組織試料、組織部及び器官、遊離又は結合核酸を含む食料試料、又は核酸を含む細胞、植物又は植物粒子、バクテリア、ウイルス、酵母、及び他の真菌(fungi)、その内容がここで参照され、遊離核酸についても同様である欧州特許出願第９５９０９６８４．３に記載されている他の真核生物及び原核生物等を意味する。本発明の意味において、核酸によって、例えば、二本鎖、一本鎖、環状及び直鎖、分岐等のあらゆる長さ及び構造のリボ核酸(RNA)及びデオキシリボ核酸(DNA)のような考えられ得る(possible)全ての種類の核酸、モノマーヌクレオチド、オリゴマー、プラスミド、ウイルス及びバクテリアＤＮＡ並びにＲＮＡ、並びに動物及び植物細胞からのゲノム又は他の非ゲノムＤＮＡ並びにＲＮＡ、真核生物、処理型及び未処理型ｔ−ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎ−ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及びｃＤＮＡ、並びに他の想像できる核酸全てが意味される。
【００１２】
上記の理由のために、従来技術により知られている方法は、特に核酸を得るための方法の自動化に関して、プロセスエンジニアリングに関する限り、できるだけ単純な核酸の定量的単離のための適切な出発点を構成しない。
【００１３】
従って、本発明の方法は、核酸の単離のための従来技術から知られてる方法の欠点を克服すること、及び本質的な技術的消耗(technical expenditure)のない実施又は利用に適した方法及び手段を利用できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明によれば、この目的は、独立項１、９、１４、２１、２９、３０及び７７の方法、独立項９８及び１１３に記載の単離容器又は反応容器、独立項８２、１１０、１１１及び１１５に記載の使用並びに独立項９６に記載の機械、及び独立項１２０に記載のキットによって解決される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の更に有利な態様は、従属項、説明及び添付図から明らかである。
【００１６】
この関連において、本発明は、その上で、核酸を含有する試験試料から、単純な方法で核酸を固定化することができ、かつ、単純な処理(procedural)段階によって再びリリースすることができる表面、例えば多孔性の膜を使用する方法を含む。特に、本発明による単純な処理は、これらの方法を完全に自動的に行うことを可能にする。
【００１７】
本発明の更なる態様は、複雑さなしに以下の反応段階において核酸を固定相から再びリリースすることができ、かつ適用できるのであれば、例えば、制限消化(restriction digestion)、ＲＴ、ＰＣＲ若しくはＲＴ−ＰＣＲ、又は上記の他の分析的若しくは酵素的反応のいずれかにおいて、更に使用することができる方法において、核酸を固定相、特に膜へ結合することを目的とする。
【００１８】
本発明の意味において、表面は、何らかの細孔性分離層と定義される。これは、例えば基板に直接載ることができ、かつそのようにして、片側からのみ近づくことができ、又は結合せずにいる(stand freely)ことができる。両側から近づくことができ、それ故、その全表面では不浸透性(impermeable)基板上に載らないが、全く結合せず、又は数点で支持されるのみである分離層は、本発明による膜と呼ばれるであろう。
【００１９】
本発明の意味において、単離は、その間に核酸の濃度が増加し、及び／又は調製中の、若しくは試料中の非核酸部が減少する核酸の濃縮として定義される。
【００２０】
本発明は、以下の段階によって核酸を単離するための方法を提供する:
- 少なくとも1つの核酸試料を膜に供給すること;
- 膜における核酸の固定化;
- 固定化された核酸の膜からのリリース; 及び
-- ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、アクリレート共重合体、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド(polyvinylidendifluoride)、ポリエチレンテトラフルオロエチレン共重合体塩(polyethylentetrafluorethylene-copolymerisate)、ポリベンズイミダゾール(polybenzimidazole)、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン共重合体塩(polyethylenechlorotrifluorethylene-copolymerisate)、ポリイミド、ポリフェニレンスルフィド(polyphenylenesulfide)、セルロース、セルロース混合エステル(cellulose mixed esters)、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル(polyacrylnitriles)、ポリアクリロニトリル共重合体(polyacrylnitrile-copolymers)、ニトロセルロース、ポリプロピレン及び／又はポリエステルを含む膜を通した輸送(transfer)によるリリースされた核酸の除去。
【００２１】
他の膜、例えばこの説明中で更に記載されたものは、本発明による方法のために使用することができる。
【００２２】
最表面(top)から供給が行われ、下方で除去が行われることが好ましいが、膜における核酸の固定化後に膜を通る液体輸送方法は、水平に配列されたカラムが片側から核酸含有溶液で充填され、カラムの他方の末端においてその後取り除かれることが想像され得る。
【００２３】
膜は、例えば上記の、若しくは別のカラムのような、供給及び除去が行われ、かつ容器の全横断面が被覆される容器内に好ましくは配置され得る。
【００２４】
膜は、コーティングすることができ、コーティングによって疎水性又は親水性にすることができる。
【００２５】
核酸の完全な単離を達成するために、今まで知られていた単離方法は、特にカラム内で、比較的厚い膜又はフリース(fleeces)を用いて行われる。しかし、膜を通した溶液の吸引輸送(suction transfer)中、これにより、比較的大きな、いわゆるデッド・スペース・ボリューム(dead space volume)、即ち、膜の容量が生じ、そのため、核酸は、より多量の溶出バッファーを用いたときにのみ得ることができる。その結果、溶出後に核酸は、多くの適用のためには不適当又は不利な、より希釈された状態で存在する。この理由のため、本発明を行うための好ましい態様は、厚さが好ましくは０．５ｍｍ未満、特に好ましくは０．２ｍｍ未満、例えば０．１ｍｍである膜を使用する。
【００２６】
本発明は、更に次の段階による核酸の単離方法に関する:
- 少なくとも1つの核酸試料の表面への供給;
- 表面における核酸の固定化; 及び
- 溶出媒体(elution medium)による表面からの固定化された核酸のリリース。
【００２７】
この方法は、リリースが、上限が１０℃以下であり、下限が溶出媒体が凍結しないような溶出媒体の凝固点である温度で行われることを特徴とする。従って、Ｔがリリース温度、ＴS,EMが溶出媒体の凝固点を示す不等式１０℃≧Ｔ≧ＴS,EMが成り立つ。これは、核酸のリリースが、溶出媒体の凝固点の近くで明らかに可能であることが、一般的な見解に反して示されたからである。そのような低温における溶出でさえ、核酸がより穏やかに処理され、かつ核酸分解酵素(nucleases)(DNases又はRNases)の存在のサインがまだある場合に、これらが実質上(virtual)凝固点近くにありつづけるようになるという、予期し得ない利点を有し、そのため、核酸の分解は減少し、又は完全に抑制される。
【００２８】
従って、溶出中、温度は好ましくは更に低く、例えば、５℃以下であるべきである。調製物(preparation)が、そのイオン含有量により、その温度においてなお液体である場合、下限は０℃又は−５℃であることもできる。上限は、可能であれば、低温、約５℃であるべきである。
【００２９】
本発明によるこの方法は、溶出バッファーの冷却を要することもあり、更なる溶液の冷却、適用可能であれば、単離容器の冷却も同様に要求することができる。冷却の信頼性が常に保証できるとは限らないので、特に、開発途上国の人々のスクリーニング(screening)のような分野における試験の間、本発明は、外部冷却(external cooling)と無関係に、低温における核酸の単離を可能とする単離容器を更に包含する。
【００３０】
従って、本発明は、１つの上端開口部、１つの底部開口部、及び底部開口部に位置し、上部の全横断面を被覆する１つの膜を有する少なくとも１つの上部；吸収剤材料を含む１つの底部；並びに少なくとも膜の範囲において上部を取り囲む冷却剤を含有するためのジャケット(jacket) を含む核酸の単離のための単離容器を更に包含する。冷却剤を含有するジャケットは、膜、並びに、溶出バッファーの凝固点に近い所望の温度範囲内で、最終的な溶出を信頼性をもって行うことができるために膜上に運ばれる溶菌液、洗浄バッファー及び溶出バッファーのような溶液を低温に冷却することを可能にする。
【００３１】
単離容器の態様の1つでは、ジャケットは、機械的に破壊可能な仕切り(partition)よって分離される２つの区画(compartments)を含み、それにより、溶液が各区画に含有され、仕切りの破壊後に、両溶液の混合によって冷却剤が形成される。
【００３２】
仕切りは、例えば、ジャケットの外壁の所定の部分(provided points)に圧力をかけ、それにより仕切りを破壊する実験具(experimenter)によって破壊され得る。区画内に含有させるのに適当な溶液は、化学的な冷凍技術の分野における専門家に知られている。これらは、所望の温度、及び単離容器の使用中に予想される周囲の温度に調節することができる。
【００３３】
生体試料、例えば上記試料からの核酸の抽出中に、核酸に近づくために、細胞又は分泌物をまず最初に溶解することが必要なこともある。このようにして得られた溶菌液は、核酸に加えて、多量の望ましくない物質、例えば蛋白質又は脂質を含むこともある。溶菌液内の望ましくない物質の量が多すぎて、溶菌液内の核酸の単離の効率が低下し、かつ洗浄又は溶出中の膜の浸透性が低下する場合、膜の妨害(blockage)が、充填によって引き起こされ得る。従って、この望ましくない影響を回避するために、本発明は、膜に達する前に望ましくない物質が除去される方法も目的とする。
【００３４】
本発明による核酸の単離ためのこの方法は、以下の段階:
- 表面において、少なくとも１つの核酸試料に含まれる核酸の固定化を可能にする結合形成条件への、少なくとも１つの核酸試料の標準化;
- 少なくとも１つの核酸試料の表面への供給; 及び
- 表面における核酸の固定化、
を含み、結合条件の調整の前及び／又は後に、予備精製が行われることを特徴とする。
【００３５】
例えば、脱塩により、又は濾過、遠心分離、酵素処理、温度影響、沈殿 及び／若しくは核酸溶液の抽出、並びに／又は核酸溶液の不純物の表面への結合によって予備精製を行うことができる。予備精製は、機械的造粒(mechanical particulation)又は有機試料の溶菌液に関連する核酸溶液の均質化(homogenization)によって行うこともできる。
【００３６】
標準化された結合条件により、RNA及び／又はDNAの固定化を可能にすることができる。
【００３７】
極めて多くの不純物を含む生体試料において単離を行う場合に、予備精製が特に必要であることもある。生体試料は、直接使用されることもあり、又は他の生体試料から次々に(in turn)得られる、考えられ得るいずれの物質をも含むことができる。これらは、例えば、血液、唾液、尿、糞便、精液、細胞、血清、白血球画分、外皮催炎物質(crusta phlogistica)、塗抹標本(smears)、組織試料、植物、バクテリア、真菌(fungi)、ウイルス及び酵母並びに上記の他のタイプの生体試料であることができる。
【００３８】
生体試料が望ましくない物質を高い割合で含んでいる場合、本発明による方法は、そのまま(naturally)特に有利に使用することができる。
【００３９】
予備精製された核酸試料からの核酸の固定化後、通常の単離段階、即ち；
- 固定化された核酸の表面からのリリース;
- リリースされた核酸の表面からの除去
が続けて行われる。
【００４０】
本発明による方法の特別な利点は、これらは、表面において核酸に施される化学反応と組み合わせることができるという事実にある。多数の分析技術は、表面において単離された核酸上でこのように行うことができる。その際、自由なアクセス(access)を達成するために、反応前に、表面から核酸をリリースすることができる。しかし、その代わりに、適切な反応を、表面へ直接結合した核酸上で行なうこともできる。
【００４１】
従って、1つの態様において、本発明は、上記のように予備精製を行う方法であって、リリース段階の後に、好ましくは少なくとも１回、核酸において少なくとも１つの化学反応を行うことを特徴とする方法を目的とする。
【００４２】
本発明の特別な利点は、化学反応の前に、損失を引き起こす単離容器から反応容器へのデカンテーション(decanting)を必要とせず、かつ単離と反応を同じ容器において行うことができるという点である。
【００４３】
更なる態様において、予備精製とは無関係に、本発明は、以下の段階を含む核酸増幅反応を行うための方法に関する；
- 少なくとも1つの核酸試料の表面への供給;
- 表面における核酸の固定化; 及び
- 核酸による増幅反応の実施。
【００４４】
特に、増幅反応において、通常又は必ず使用される少量の物質の場合は、デカンテーションによる損失なしに、核酸の調製物全てを使用することができることが利点である。これはまた、１つの容器において全ての工程を行うことができるような自動化に対して特に有利である。また、消費量が減少し、方法は迅速化され、かつ費用効率が高くなる。
【００４５】
ここで、増幅反応は、等温(isothermal)又は非等温(non-isothermal)反応であることができる。
【００４６】
ここで、増幅反応は、例えば、SDA反応(鎖置換増幅(strand desplacement amplification))、PCR、RT−PCR、LCR若しくはTMA、又はローリングサークル増幅(Rolling circle amplification)であることができる。
【００４７】
NASBA増幅反応は、本発明によるこの方法によっても可能である。
【００４８】
増幅反応の前に、反応バッファーによって、核酸を表面からリリースすることができ、ここで溶出バッファーは、膜上又は膜内に配置される。その代わりに、増幅反応は、表面からの核酸のリリースを引き起こさない反応バッファー内で行うことができる。
【００４９】
この方法は、好ましくはこれらの更なる段階を示す:
- 適用可能であれば、 (これらが反応中になお結合する限り) 表面からの反応 生成物のリリース; 及び
- リリースされた反応生成物の表面からの除去。
【００５０】
更なる態様は、以下の段階を含む核酸上での化学反応の実施のための方法を含む:
- 少なくとも１つの核酸試料の表面への供給;
- 表面における核酸の固定化;
- 固定化された核酸の表面からのリリース;
- 少なくとも1つの核酸における化学反応の実施; 及び
- 事前に固定化を行わない、表面からの核酸の除去。
【００５１】
この方法では、化学反応の後に、核酸が、(固定化された)膜と結合しないが、結合(bond)なしに除去される。そのような追加の(additional)段階を省略することは、調製物の純度を低下させることもあるが、時間に厳しい(time critical)適用における時間節約及び、一定の形態の適用における単純化により、好ましいこともある。本発明による方法は、化学反応の幅広い選択をもたらす。この発明の意味における化学反応は、（表面とのものを除き、この“反応”は、ここで記載した全ての方法によって起こるので）更なる物質との核酸の相互作用、即ち、酵素的変性(enzymatic modification)、プローブによるハイブリダイゼーション、化学的連鎖反応(chemical sequencing reactions)、pH値変化、例えばＲＮＡの塩基性脱プリン(basic depurination)及びＤＮＡの酸性脱プリン(acidic depurination)、並びに抗体結合(bonding anti-bodies)及び蛋白質付加(protein additions)として理解されるべきである。
【００５２】
本発明による方法の利点の１つは、異なる方法が行われる容量空間(volume space)と、核酸が結合し得る膜との永続的な空間統一 (permanent spatial unification)において見られることである。最も単純な方法において、この統一は、直後の膜結合(immediate subsequent membrane bond)によって核酸の取扱いを可能にする。これは特に自動化された方法のための大きな利点である。核酸は、一旦膜に結合すると、更なる処理段階のために、例えば、上記のような、潜在的に純粋な核酸の単離のために、又は核酸による化学反応のために利用することができる。しかし、本発明の更なる態様において、核酸の特性を決定するために、膜に結合した核酸を、別の分析に直ちに付すこともできる。
【００５３】
従って、本発明は、以下の段階を含む、単離容器内での核酸の分析方法を更に目的とする:
- 内部に配置された膜を有する単離容器の設置;
- 核酸の少なくとも1つの試料を備えた単離容器への供給;
- 膜上での核酸の固定化;
- 膜を通した試料の液体成分の輸送; 及び
- 単離容器内に配置された膜上での少なくとも１つの核酸の性質の分析。
【００５４】
更なる方法の態様において、少なくとも1つの化学反応は、上記のように、液体成分の輸送後に核酸上で行うことができる。これは、例えば、核酸のその後の分析を可能にする目的に役立つことができる。この適用の例は、プローブによるハイブリダイゼーション、膜と結合した核酸の放射性マーカー又は特異的な抗体の結合である。例えば、臭化エチジウムのような挿入物質(intercalating substances)による核酸の着色ような補助的な反応もまた、化学反応として理解されるべきである。
【００５５】
核酸の異なる性質は、膜結合分析に利用することができ、組合せた反応容器のない従来の膜について、既に説明されている。分析することができる性質のいくつかは、核酸の放射性又は抗体、核酸結合着色剤分子、又は核酸若しくは蛋白質と結合する着色剤分子であることができる分子との、それらの結合力である。
【００５６】
この方法は、むき出しの(exposed)膜の取扱いがもはや必要とされないような、考えられ得る(considerable)核酸の分析の単純化をもたらす。もっと正確に言えば、それは、単離容器内に配置される。
【００５７】
例えば、その後の分析段階のための、核酸の膜への不可逆的な結合も、本発明の枠内に含まれる。永続的又は不可逆的な結合は、可逆的に結合した核酸に利用することができない方法において、膜及びここに結合した核酸の取扱いを許容する。
【００５８】
更なる態様において、本発明は、核酸の定量的沈殿を目的とする。
【００５９】
あらかじめ知られた方法において、陰イオン交換クロマトグラフィーに基づいた、１００μｇ以上（以下、“大規模”と呼ぶ）のプラスミドDNA の予備精製のために、最後の段階で、高塩濃度バッファーによってプラスミドＤＮＡがカラムから溶出される。プラスミドＤＮＡを、あるものに対して塩から分離し、その他に対して濃縮するために、それはアルコール(例えばイソプロパノール)によって沈殿され、適当な容器中で遠心分離される。残存する微量の塩を除去するために、遠心分離ペレットを70%エタノールで洗浄し、その後再度遠心分離した。２番目の遠心分離のペレットは、少量の低塩濃度バッファーに典型的に溶解され、プラスミドＤＮＡは、この形で更に処理される。
【００６０】
更に、高塩濃度バッファーへのカオトロピック塩の添加によって、ＤＮＡをシリカ膜に結合する状態に変化させる方法が、従来技術において提案されていた。従って、洗浄後、ＤＮＡは低塩濃度バッファーによって膜からリリースされる。
【００６１】
刊行物(ルパート(Ruppert)、A.ら、アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)、(1995), 230: 130−134)では、小規模(100μg未満のプラスミドDNAの単離)で、イソプロパノールで沈殿されたDNAが、0.2μm未満の孔径を有するPVDF膜へ結合し、その後エタノールによって洗浄され、続いてTE(トリスEDTA)によって溶出される、同様の適用が記載されている。 しかしながら、大規模でのそのような方法の記載は存在しない。
【００６２】
その後遠心分離が行われる、記載されたDNAの沈殿は、極めて時間がかかり（約１時間）、また、遠心分離機の使用を必要とする。この工程のために多くの時間が必要とされることに加えて、プラスミド調製における記載の最後の段階は、欠点(faults)に特に弱い。DNAペレットの部分的又は完全な損失が生じることもある。遠心分離容器が決定的な役割を果たすようになる種類（材料）が出現する。
【００６３】
カオトロピック塩及びその後のシリカ膜への核酸の結合の更に記載された適用もまた、カオトロピック塩の調製物への挿入が、最終的に単離されたＤＮＡの汚染の危険性を有するかもしれないという事実により、更に時間がかかる。
【００６４】
記載された小規模でのアルコールの沈澱物の濾過は、一対一の関係をもって(linear fashion)大規模に転換することができないという欠点を有する。従来技術によって使用される膜は、すぐに飽和し、もはや吸収できないので、少量の核酸の単離のみを可能にする。従って、大部分の核酸は、沈殿バッファーの除去の間及び洗浄中に失われる。そのような損失を回避するために、本発明はまた、以下の段階を含む核酸の沈殿方法を目的とする:
- 少なくとも1つの膜が配置された単離容器の設置;
- １つの核酸試料の単離容器への供給;
- 核酸が少なくとも１つの膜と結合するような、試料に含まれる核酸のアルコ ールによる沈殿。この方法は、少なくとも1つの膜の孔径が、０．２μｍ以 上であることを特徴とする。
【００６５】
まず、本発明による方法の実施のために考えられるアルコールは、脂肪族又は非環式の、飽和又は不飽和の炭化水素の全てのヒドロキシル誘導体である。
【００６６】
ヒドロキシル化合物の中で、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、第三ブタノール、ｎ−ペンタノール又はそれらの混合物のようなＣ１−Ｃ５アルカノールが好ましい。本発明による方法の実施のためには、イソプロパノールが特に好ましい。
【００６７】
ここでは、アルコールは、核酸を含む溶液による単離容器の充填前又は後に、この溶液と混合することができる。アルコール、特にイソプロパノールに対する核酸含有溶液の容量比は、 好ましくは２：１〜１：１、特に好ましくは１．６７〜１：１であり、例えば１．４３：１である。
【００６８】
膜の表面領域は、好ましくは、溶液に含有される全ての核酸が、膜と結合するように選択される。
【００６９】
本発明はまた、アルコールによって沈殿された、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡであり得る核酸の結合のために、０．２μｍ以上の孔径を有する膜の使用も目的とする。
【００７０】
０．４５μｍの酢酸セルロース若しくは硝酸セルロースフィルターの使用、又は０．６５μｍの多層酢酸セルロース若しくは硝酸セルロースの使用は、特別な利点であると考えられる。この工程は、真空濾過並びに加圧濾過のために使用することができる。
【００７１】
本発明による方法は、多くの装置を必要とせずに行うことができる高塩濃度バッファー系から低塩濃度バッファー系への核酸の輸送時間の節約を可能にする。典型的には遠心分離段階によって行われる高塩濃度バッファーからの、DNAの古典的なアルコールの沈降反応の代替法として適当である。この方法は、高効率（収率の低損失）であるので、大規模製造に特に適当である。更に、本発明による方法の使用により、既に精製された核酸へ異物(foreign substances)が導入されない。また、古典的な方法と比べて、欠点の影響の受けやすさ(susceptibility of faults)は低下する。
【００７２】
上記の様々な方法の間、供給は好ましくは上から行われる。主に、膜を通した別の方法を、異なる溶液、即ち、核酸を含有する固定化バッファー、洗浄バッファー、溶出液等の輸送に使用することができる。これは、重力(gravity)、遠心分離、真空、（供給側からの）加圧、及び毛管力(capillary forces)であることができる。
【００７３】
固定化及びリリースの段階間で、少なくとも1つの洗浄バッファーによる固定化された核酸の洗浄段階を行うことができる。洗浄は、各洗浄バッファーに対する以下の段階を含む:
- 所定量の洗浄バッファーの表面上への適用; 及び
- 表面を通した洗浄バッファーの輸送。
【００７４】
核酸の供給および固定化は、以下の段階を再び含むことができる:
- 固定化バッファーと核酸試料との混合;
- 固定化バッファー混合した核酸試料の表面上への供給; 及び
- 本質的に供給方向における表面を通した液体成分の輸送。
【００７５】
その工程は、それらを容易に自動化することができるという大きな利点を有するので、前記段階の少なくとも1つは、自動化装置によって完全に自動的に行うことができる。工程の全ての段階は、自動化装置によって制御された一連の段階においても行うことができる。
【００７６】
特にそのような場合は、手動処理中であっても、多数の核酸を同時に単離することが可能である。例えば、８、１２、２４、４８、９６又はそれ以上の単離くぼみ(recesses)を有する市販の“マルチウェル(Multi-well)”容器の形の多数の単離容器を使用することができる。
【００７７】
核酸の除去は２つの基本的に異なる方向で行うことができる。一方に対して、膜によって除去された(溶出された)核酸を輸送し、膜の、核酸含有溶液又は溶菌液が添加される側と反対側へそれらを除去することが可能である。この場合、核酸は添加方向において膜を通して除去される。膜又は表面上の添加する側から核酸を取り除くことも可能である。添加方向と反対の方向において、又は添加する側である、そこから添加が行われる“同じ方向”と反対の方向において、その後除去が行われる。その場合、核酸は膜を通過する必要はない。核酸の除去は、本発明によるいくつかの方法によって、常に添加方向において膜を通して行われる。万一この方法が例えばプラスチック壁のような、液体を通さない基質上に位置する表面を用いて行われるならば、添加方向に向かう方向（反対方向）においてのみ明らかに行うことができる。しかし、いくつかの方法の場合は、両方向における除去が可能である。
【００７８】
核酸が、それらが加えられ固定化された方向と本質的に反対の方向において表面から溶出される（リリースされる）場合、添加方向と比べて、１８０°以下の角度を有する方向はどれも、“同じ方向”と実際に呼ばれるので、どんな場合も、溶出中に核酸が表面、例えば膜を通らないが、表面上への供給方向と反対の方向において、表面から除去される。それ故、この方法の好ましい実施形態において、供給中に核酸が配置されるその他のバッファー、適用可能であれば洗浄バッファーは、吸引又はその他の方法によって膜を通して輸送される。膜の内部に位置する、容器の全横断面を被覆する膜上で単離が行われる場合、供給は好ましくは上から行われる。この場合、除去段階は、再度上方で行われる。例えば、図２は、上から供給され、核酸の除去が上方で行われる漏斗型単離容器示す。
【００７９】
しかし、添加と反対の方向における除去を行うときもまた、他の装置(arrangements)、即ち下方からの核酸の除去を考えることができることが理解されるべきである。例えば、溶菌液バッファーのような核酸含有バッファーは、真空装置によって反応容器から単離装置へ直接取り出すことができるので、核酸を単離装置中の膜の下側と結合させることを考えることができる。そのような場合、下方から取り出され、その後核酸のリリースの後に下方から容器内に排出される溶出バッファーによって、表面からの核酸の除去が行われる。従って、この場合、核酸の除去は、下方において行われる。
【００８０】
更に、例えば、内部に配置された膜を有する水平に置かれたカラムが、フロー・スルー法(flow-through process)において、溶菌液によって充填されるとき、核酸の側面からの除去(lateral removal)が可能であり、水平に置かれたカラムは、核酸が結合する膜の面上で、溶出バッファーによって続いてすすぎ洗いされる。
【００８１】
考えられ得る最大角度１８０°の例は、様々な溶液又はバッファーが下方へ流れる核酸の結合に適当な表面を有する傾斜した表面である。全てのバッファーのように、溶出バッファーもまた、一方の側から来て、他方の側へ流れる。この場合、バッファー流の入る方向と核酸含有バッファー流の出る方向は、１８０°の角度を形成する; しかし、除去は、表面の固定化と同じ面において常に行われる。
【００８２】
本発明による方法では、上記の核酸を含有する試料は、適当な塩類又はアルコール(類)を含み、その後、適当な場合では、調製物を可溶化する溶液へ導入され、遠心分離機の使用による真空によって、加圧によって、毛管力によって、又は核酸が表面上に固定化される、多孔性表面を通す他の適当な方法によって、この方法で得られた混合物に通される。
【００８３】
膜若しくは他の表面上での核酸の固定化に適当な塩類、及び／又は核酸試料の溶菌液類は、鉱酸を有するアルカリ又はアルカリ土類金属類のような金属カチオンの塩類、特にアルカリ若しくはアルカリ土類ハロゲン化物又はリン酸塩を含み、ナトリウム、リチウム若しくはカルシウムのハロゲン化物、特に好ましくは硫酸マグネシウムである。他の金属カチオン、例えばＭｎ、Ｃｕ、Ｃｓ若しくはＡｌ又はアンモニアカチオンを使用することができ、好ましくは鉱酸の塩類である。
【００８４】
一塩基酸若しくは多塩基酸又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属を含む多官能性有機酸もまた、本発明の方法の実施に適当である。これらは、シュウ酸、マロン酸若しくは琥珀酸のような有機ジカルボン酸又はヒドロキシ若しくはポリヒドロキシカルボン酸、例えば、好ましくはクエン酸を含むナトリウム、カリウム若しくはマグネシウムの塩類を特に含む。
【００８５】
ある適用に対して、より適していることが明らかになるならば、表面上での核酸の固定化のための、及び／又は核酸試料を溶解させるための上記に挙げられた物質は、単独で、又は混合して、これとともに使用することができる。
【００８６】
いわゆるカオトロピック剤の使用が特に有効であることが明らかになった。カオトロピック物質は、水素結合の三次元構造を妨害することができる。この方法はまた、生体分子(biological molecules)中で、一次、二次、三次又は四次構造を含む空間構造の形成に関与する分子内結合力を弱める。この種のカオトロピック剤は、従来技術(ロンプ(Roempp)、Lexikon der Biotechnologie、H.デルウェグ（Dellweg）発行、R.D.シュミット(Schmid)及びW.E.フロム(Fromm)、Thieme Verlag, Stuttgart 1992)の記載から、専門家に知られている。
【００８７】
この発明による使用のための好ましいカオトロピック物質は、例えば、トリクロロ酢酸(trichloroacetate)、チオシアネート(thiocyanate)、過塩素酸塩又はヨウ化物群若しくは塩酸グアニジニウムおよび尿素である。
【００８８】
カオトロピック物質は、０．０１〜１０モル濃度の水溶液、好ましくは０．１モル濃度〜７モル濃度の水溶液、最も好ましくは０．２〜０．５モル濃度の水溶液中で使用される。上記のカオトロピック剤は、単独で、又は組合せて使用することができる。特に、過塩素酸ナトリウム、塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、及び／又はヨウ化カリウムの０．０１〜１０モル濃度の水溶液、好ましくは０．１〜７モル濃度の水溶液、特に好ましくは０．２〜０．５モル濃度の水溶液が使用される。
【００８９】
本発明による方法における溶解、結合、洗浄及び／又は溶出のために使用される塩溶液は、好ましくはバッファーで処理される。緩衝物質として適当なものは、以下の緩衝系、例えば、０．００１−３ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０５−１ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．０１−０．５ｍｏｌ／ｌ、とりわけ好ましくは０．０１−０．２ｍｏｌ／ｌの濃度のカルボン酸バッファー、特に、クエン酸塩バッファー、酢酸塩バッファー、琥珀酸塩バッファー、マロン酸塩バッファー、並びにグリシンバッファー、モルホリノプロパンスルホン酸(morpholinopropansulfonic acid)(MOPS)又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）である。
【００９０】
本発明による方法の実施に好ましいアルコール類は、まず第一に、脂肪族又は非環式の飽和若しくは不飽和炭化水素の全てのヒドロキシル誘導体を含む。この化合物が、エチレングリコール、プロピレングリコール又はグリセリンを含む多価Ｃ１−Ｃ５アルカノール類のように、１、２、３又はそれ以上のヒドロキシル基を含むか否かは最初は重要ではない。
【００９１】
また、本発明により使用できるアルコール類は、蔗糖誘導体類、いわゆるアルダイト(Aldite)類、並びにポリフェノールのようなフェノール類を含む。
【００９２】
前述のヒドロキシル化合物の中で、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、第三ブタノール及びペンタノールが特に好ましい。
【００９３】
本発明の意味において、親水性という用語は、それらの化学的性質に基づき、水と容易に混合し、若しくは水を吸収するような材料又は膜に用いる。
【００９４】
本発明の意味において、疎水性という用語は、それらの化学的性質に基づき、水を通さず、若しくはその逆に、その中に残存することができないような材料又は膜に用いる。
【００９５】
本発明の意味において、表面という語により、微小孔構造の分離層(microporous-separating layer)が意味される。膜の場合は、表面はフィルム又はポリマー材料からなる。ポリマーは、好ましくは極性基を有するモノマーからなるであろう。
【００９６】
本発明による方法の別の態様において、幅広い意味での表面の概念は、粒子若しくは粒状層、又はシリカゲルフリースのような繊維層をも含む。
【００９７】
疎水性膜の使用に関連して、本発明の意味において、市販の疎水化ナイロン膜のような、親水性物質からなり、従来技術の記載から周知であるその後の化学処理により疎水性にされ得る膜が好ましい。
【００９８】
疎水化膜は、本発明の目的に対して、そもそも親水性であることもあり、ないこともあり、かつ下記の疎水性コーティング剤によってコーティングされる膜を、一般に含む。この種の疎水性コーティング剤は、ある程度(fairly)長いアルキル鎖又はシロキサン基のような疎水基の薄層によって親水性物質を被覆する。適当な疎水性コーティング剤は、従来技術から多数知られている；これらは、本発明の目的に対して、パラフィン類、ワックス類、金属石鹸類等を、必要であれば、アルミニウム若しくはジルコニウム塩類、第四級有機化合物類、尿素誘導体類、脂質変性メラミン樹脂類、シリコーン類、有機亜鉛化合物類、グルタル酸ジアルデヒド類、及び類似の化合物類を含む。
【００９９】
また、本発明の目的のために使用することができる疎水性膜は、それ自体疎水性である膜及び疎水性になったものであり、かつその基本物質が極性基を含んでいるものである。これらの規準によれば、例えば、以下のグループ--特に疎水化されたもの--が、本発明による使用のために適当である:
ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、硝酸セルロース(cellulose nitrate)、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート及びアクリレート共重合体、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリエチレンテトラフルオロエチレン共重合体塩、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン共重合体塩又はポリフェニレンスルフィド、セルロース及びセルロース混合エステル、酢酸セルロース又は窒素含有セルロース(nitric cellulose)及びポリベンズイミダゾール、ポリイミド、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル共重合体、疎水化ガラス繊維膜、それら中で疎水化ナイロン膜が特に好ましい。
【０１００】
好ましい親水性表面は、親水性材料自体、更に疎水性にされた疎水性材料を含む。例えば、以下の物質を使用することができる: 親水性ナイロン、親水性ポリエーテルスルホン、親水性ポリカーボネート、親水性ポリエステル、ポリプロピレン組織上の親水性ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレンフリース上の親水性ポリテトラフルオロエチレン、親水化(hydrophilized)ポリビニリデンジフルオライド、親水化ポリテトラフルオロエチレン、親水性ポリアミド、窒素含有セルロース、親水性ポリベンズイミダゾール、親水性ポリイミド、親水性ポリアクリロニトリル、親水性ポリアクリロニトリル共重合体、親水性ポリプロピレン、硝酸セルロース、セルロース混合エステル。
【０１０１】
核酸の結合方法に関連する上記の膜は、本発明の文脈にはないが、現在の技術から、一部が知られている。しかし、この方法のための材料の選択は、従来技術からはまだ知られていない。しかし、本発明者らによる徹底的な実験から、核酸の結合に適した更なる膜があることが示された。
【０１０２】
従って、本発明は、核酸の付着(adhesion)及び単離のための材料として、酢酸セルロース、カルボキシル化されていない疎水性ポリビニリデンジフルオライド又は固体の疎水性ポリテトラフルオロエチレンを使用することも包含する。
【０１０３】
ここで、“固体”という用語は、全てが関連する化学物質からなる材料を指し、基板上でコーティングされてもいないし、コーティングとして置かれてもいないものである。
【０１０４】
この材料は、膜状で、細粒(granules)として、繊維状で、又はいずれかの他の形状で使用することができる。例えば繊維は、フリースとして、細粒は、圧縮フリット(compressed frit)として整えることができる。
【０１０５】
上記の本発明による方法において使用される膜（イソプロパノール沈殿を除く）は、例えば、0.001〜50μm、好ましくは、0.01〜20μm、最も好ましくは0.05〜10μmの孔径を有する。上記の方法によるイソプロパノールを用いた核酸の沈殿の場合、孔径は、0.2μm以上でなければならない。
【０１０６】
洗浄バッファーとして、上記の塩類若しくはアルコール類、又はフェノール類若しくはポリフェノール類を考慮することができる。更に、洗浄剤並びにアルブミン及びミルクパウダーのような最も広い意味における天然物質を、洗浄段階のために使用することができる。カオトロピック物質の添加も可能である。洗浄剤及び類似の物質と同様に、ポリマーを添加することができる。いずれの場合も、そこで含まれる洗浄バッファー及び物質は、不純物又はそれらの複混合生成物(decomposite products)が、洗浄バッファーと共に除去されるように、望ましくない不純物と結合し、可溶化し、又はそれと反応することが一般的に可能であるべきである。洗浄段階中の温度は、通常１０〜３０℃の範囲内であり、好ましくは室温であるとしても、より高い温度又はより低い温度であってもうまく使用することができる。そのようなものとして、例えば、低温で、例えば２℃で用いられる溶出用洗浄バッファーを冷却すること、単離容器及び表面又は膜を、所望の温度値に前冷却することが示されることもある。低温のための適用は、その間に細胞核が損害を受けないまま未分化で(initially)残存する細胞質溶解である。一方、より高い温度の洗浄バッファーは、洗い流されるべき不純物のより良好な可溶化を引き起こす。
【０１０７】
本発明の目的のための結合核酸(bound nucleic acids)の溶出に適当な溶出剤は、水又は水性塩溶液である。塩溶液として、０．００１〜０．５モル／リットル、好ましくは０．０１〜０．２モル／リットルの濃度、最も好ましくは０．０１〜０．０５モル濃度の溶液であるモルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、2-[4-(2-ヒドロキシメチル)-1-ピペラジノ(piperazino)]エタンスルホン酸(HEPES) のような現在の技術から知られているバッファー溶液が使用される。更に、使用に好ましいものは、０．００１〜０．５モル濃度、好ましくは０．０１〜０．２モル濃度、最も好ましくは０．０１〜０．０５モル濃度の塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム又はマグネシウムジクロライド(magnesium dichloride)の水溶液を含む、アルカリ又はアルカリ土類金属塩、特にそれらのハロゲン化物の水溶液である。更に、使用に好ましいものは、シュウ酸又は酢酸のようなカルボン酸若しくはジカルボン酸を有するアルカリ又はアルカリ土類金属の塩類の溶液、酢酸ナトリウム溶液、又は、例えば前述の濃度範囲の、例えば０．００１〜０．５モル濃度、好ましくは０．０１〜０．２モル濃度、最も好ましくは０．０１〜０．０５モル濃度のシュウ酸水溶液である。
【０１０８】
さらに、洗浄剤やDMSOのような補助物質の添加も可能である。溶出された核酸を用いて化学反応が行われるべきである場合は、直接膜で行うか、又は別の反応容器において行うと、反応の準備において使用されるべき溶出バッファーに対して、そのような物質又は他の補助物質を添加することもできる。従って、低濃度のDMSOの添加は、多くの反応の準備に対して一般的である。
【０１０９】
化学反応が核酸上で行われた後、それらも反応バッファーによって溶出することができる。SDA又はNASBA反応の後に、核酸は、例えば反応バッファー又は反応マスター混合物(reaction master mix)によって溶出することができる。
【０１１０】
例えば、脱塩され、若しくは二回蒸留された水、又は超高純度ミリポア水(ultrapure Millipore water)のような純水は、溶出手段として特に好ましい。
【０１１１】
０℃以下〜９０℃、例えば１０℃〜３０℃の間の温度において、及び更に高温においても、溶出をうまく行うことができる。水流(stream)による溶出も可能である。溶出温度の下限は、上記のように、溶出媒体の凝固点において見られるべきである。
【０１１２】
本発明による方法は、“現場(field)”において、即ち、実験室の装置ではないため大きな(extensive)電気的製粉装置(electrically powdered equipment)がない場合でさえ、問題なく実施することができるので、それにより、本発明は、本発明の方法を、最少限の追加の部品で実施することができる単離装置の提供も包含する。このために、膜を含む反応容器を使用することができる。これは、使用される様々なバッファーを膜を通して取り出すために、スポンジのような吸収材料と接触させることができる。従って、スポンジは、廃液容器(waste container)とつないだ真空ポンプ又は遠心分離機との組み合わせのように機能する。溶出液を得るために、溶出液は損失されないが、除去され、及び／又は更に念入りに調べられるように、吸収材料と膜との接触が遮断される。
【０１１３】
この態様において、本発明は、上端開口部(top opening)、底部開口部(bottom opening)及び底部開口部に配置され、上部の全横断面を被覆する膜を有する少なくとも１つの円柱状上部(cylindrical upper part)；吸収剤材料を有する下部(lower part)、及び上部と底部を連結するための機構を有する核酸の単離のための単離容器を特に包含する。ここで、連結されると、膜は吸収剤材料と結合し、連結されないと、膜は吸収剤材料と接触しない。
【０１１４】
下部は、上部の直径以上の直径を有する円柱であることが好ましい。この方法では、従来の反応容器のように扱うことができる、本質的に一定の直径を有する単純な管が得られる。この効果は、上部又は上部と下部が、実験室で使用されるような反応容器ホルダー内部に配置され得る管を形成するときに達成される。その機構は、上部と下部との物理的分離を可能にする連結、例えば、銃剣連結装置(bayonet coupling)、プラグ連結装置(plug coupling)又はねじ連結装置(screw coupling)であることができる。ここで、銃剣連結装置は、容易に開閉(lock and unlock)できるという利点を有し、一方、ねじ連結装置は、上部と底部の一層強固な水の結合を可能にする。その代わりに、両部の少なくとも１回の外部分離(once-off separation)を可能にするために、上部と下部の間の所定の破壊点(breaking point)を設けることができ、かつ特に費用効果的に製造することができる。
【０１１５】
しかし、機構は、吸収剤材料と膜との間に挿入することができるスライドであることもできる。この設計は、膜と吸収剤材料との分離を可能にする。
【０１１６】
この方法の生産能力を増加させ、かつ本発明による方法をより一層経済的にするために、上記の単離装置を、いくつかの上部を下部の先端に配置するように修正することも更に可能である。下部は、同時に装置の支持体として働くことができ、かつ、下部内の吸収剤材料の吸収力(drawing capacity)が使い果たされる前に、下部において使用することができる上部のための連結だけではなく、どんな場合であっても多数の単離方法を行うことができるような寸法に作ることができる。
【０１１７】
下部中の吸収剤材料としては、スポンジ及び／又は細粒を示すことができる。例えば、細粒は、吸収技術（例えば、衛生学に関する論文等）の分野における専門家に知られている超吸収剤材料からなることができる。
【０１１８】
本発明は、核酸の性質の分析及び核酸の単離のための本発明による単離容器の使用を同時に包含する。
【０１１９】
個々の段階に関して、本発明による方法は、以下のように実施される：
生体試料由来である場合、それらは適当なバッファーでまず溶解されるべきである。ここで、追加の方法を、溶解、例えば均質化又は超音波のような機械的な影響、酵素の影響、温度の変化又は添加剤のために導入することができる。必要であるか所望される場合、溶菌からいかなる砕片(debris)をも取り除くために、溶解の後に予備精製段階を行うことができる。次いで、まだ実施されていないならば、表面における核酸の固定化が行われる条件が標準化される。結合条件の標準化の後であっても、累積的に(cumulative)又は代わりに予備精製段階を続けることができる。
【０１２０】
核酸又は本来結合していない(free)核酸（類）（もし最初の試料が生物学的でなければ）の回収のために使用される試料の前処理された溶菌液が、例えば--例えば底面に--膜が固定された（プラスチック）カラム内へピペットで移される。機械的支持体として働くフリットに膜を固定すると、より効果的である。その後、溶菌液は、膜を通して輸送される。これは、カラムの出口を真空にすることによって達成することができる。一方、溶菌液側からの加圧により輸送を達成することができる。また--上記のように--溶菌液の輸送は、遠心分離又は毛管力の影響によって行うことができる。後者は、例えば、膜の下方で溶菌液又は濾液(filtrate)と接触させられるスポンジ様材料を用いて生じさせることができる。遠心分離については、底部が開いている単離容器を、輸送された液体用の回収容器内で使用ことができる。
【０１２１】
本発明の好ましい態様において追加された洗浄段階は、表面若しくは膜を通して洗浄バッファーを輸送することによって、又は表面の核酸と同じ側にそれを残存させることにより行うことができる。これは、洗浄バッファーが通される場合、又は取り出される場合、様々な方法において、例えば、膜の反対側に備えられたスポンジによって、真空若しくは加圧装置によって、又は遠心分離若しくは重力によって行うことができる。
【０１２２】
スポンジのような吸収剤材料を使用する装置の利点は、濾過液を処理するための単純で、安全かつ容易な方法にある−−この場合、ここで濾過液によってほぼ(more or less)飽和されるスポンジだけを代える必要がある。カラムを連続的に、又はバッチで操作することができ、かつこれらの両操作方法は、核酸によって膜が完全に飽和されるまで、完全に自動化して実施できることは、この点において明らかであろう。適用可能な場合、最後の段階の間に核酸の溶出が行われる。これは、例えばピペットによって取り出すことができ、若しくは除去することができ、又はなお結合している核酸の原位置(in situ)分析が行われない場合は、何らかの別の方法によって上方で除去することができる。
【０１２３】
所望の核酸は、同時に高濃度でできるだけ少量で使用することが実際は望ましい分子生物学分析の全ての方法に対して大きな利点を有する極少量の弱塩溶液若しくは塩を含有しない溶液中で得られる。できるだけ少量の溶出液を得るために、それらの中に少量の液体のみを回収するので、できるだけ薄い膜を表面として使用する。
【０１２４】
更に、本発明は、装置が垂直位置（同時に、膜は水平位置にある）に配置される場合、膜上の空間を反応領域として使用することができるという利点を有する。従って、例えば、本発明の基礎となる方法によって生成される核酸の単離及びリリースの後、それらを除去しないことだけでなく、単離装置中にそれらを残し、かつそれらを、制限消化、ＲＴ、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、インビトロ転写(in vitro transcription)、ＮＡＳＢＡ、ローリングサークル(rolling circle)、ＬＣＲ（合成酵素連鎖反応(ligase chain reaction)）、ＳＤＡ（鎖置換増幅(strand displacement amplification)）、又望ましくないこともある核酸の完全な除去のためのＲｎａｓｅおよびＤｎａｓｅ消化のような酵素反応のような分子生物学的適用に付すこと、これらの反応によって生成される核酸を、本発明に基づく工程による膜へ再度結合させること、又は上清液中にそれらを保持すること、適用可能であれば、記載のようにそれらを洗浄し、次いで単離若しくは分析のために、例えば、クロマトグラフィー、分光器(spectroscopy)、蛍光計、電気泳動若しくは同様の測定技術によってそれらを溶出することが可能である。
【０１２５】
本発明に従って単離された核酸は、核酸を分解する酵素を含まず、かつ最も多様な方法において直ちに処理及び加工することができるほど高い値の純度を有する。
【０１２６】
本発明によって生成される核酸は、クローニングのために使用することができ、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ポリメラーゼ又はＴ３ポリメラーゼ、ＤＮＡ制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、逆転写酵素及び他のもののような最も多様な酵素用基質として働くことができる。
【０１２７】
本発明における方法によって生成された核酸は、ＰＣＲ、鎖置換増幅、ローリングサークル工程、合成酵素連鎖反応（ＬＣＲ）、サンライズ(SunRise)、ＮＡＳＢＡ及び同様の工程に、特に良好に適合する。
【０１２８】
また、本発明による方法は、診断、例えば食品分析、毒物試験(toxicological tests)において、医学的若しくは臨床的診断、病原診断(pathogene diagnostics)、遺伝子発現分析において、及び環境分析において使用するための核酸の調製に、特に良好に適合する。これらの方法は、本発明による方法によって精製された核酸が、次の段階で増幅されることを特徴とする診断工程に特に適しており、そしてこの方法において増幅された核酸は、その後、続いて、又は直ちに検出される（例えば、ホランド(Holland),P.M.ら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. 88、7276−7280、リバク(Livak)K.J.ら、1995、ＰＣＲ法適用(PCR Methods Applic.) 4、357−362；ケビッツ(Kievits)T.ら、1991、J. Virol. Meth. 35、273−286; イッテンダール(Uyttendaele), M.ら、1994、J. Appl. Bacteriol. 77、694−701）。
【０１２９】
更に、本発明による方法は、次の段階においてハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル増幅段階に付すことができる核酸の調製に特に良好に適合し、本発明による方法によって生成された核酸を、以下の文献（例えば、ブレスターズ(Bresters), D.ら、1994、J. Med. Virol. 43 (3)、262-286；コリンズ(Collins) M.L.ら、1997、Nucl. Acids Res. 25 (15)、2979-2984）に記載されているような、“分岐(branched)”核酸、特に分岐ＤＮＡ及び／若しくは分岐ＲＮＡ並びに／又は樹枝状(dendritic)核酸と接触させることができること、及び発生したシグナルを検出することができることを特徴とする。
【０１３０】
以下に、本発明の自動化の可能性に関する実施例を説明し、かつ様々な表面及び核酸による方法の実施に対する実施例を挙げる。以下について説明する添付図が参照される。
図１は、本発明による方法の実施に適した自動装置の概略図を示す。
図２は、本発明の方法の実施のための単離容器及び回収管の第一の態様を示す。
図３は、本発明による方法の実施のための単離容器及び回収管の第二の態様を示す。
図４は、本発明による方法の実施のための単離容器及び回収管の第三の態様を示す。
図５は、本発明による上部を有する単離容器の態様を示す。
図６は、本発明の方法による様々な試料の、電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
図７は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
図８は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
図９は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の更に別の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
図１０は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを再度示す。
図１１は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを最後に示す。
【０１３１】
本発明による方法は、好ましくは自動的に、部分的に又は完全に、即ち全ての段階において行われる。適当な自動装置の例を、図１に示す。ここで、主部１は、制御電子機器並びに作業台３及び可動アーム２を有する運転モーターを備えている。様々な試料を保持するための領域４のような様々な要素を、作業台上に配置する。真空マニホルド(manifold)５は、上方に位置し、底部で開いている単離装置から液体を取り出すために、また、別の方法では(otherwise)、真空マニホルドに連結した容器と共に働く。例えば、生体試料を溶解に付するために使用され得る攪拌機６も備えられる。使用される単離容器アセンブリー(assemblies)は、例えば、表面が本発明に従って配置される、組み合わせた(integrated)単離容器を有する注入成形部(injection-molded parts)である。典型的には、８、１２、２４、４８、９６、又は１５３６個までの単離容器を、例えば現在のマルチウェルトレイ(multi-well-trays)の形で見られるように使用することができる。対応する標準を使用できるのであれば、より多くの単離容器が一つのアセンブリー上にあることも可能である。しかし、ルアー・アダプター(Luer-adapters)によって、アセンブリーの個々の底部を、使用可能にすること、及びこれらに必要に応じて１つ以上の単離容器を備えることも可能である。ルアー・アダプターなしで別々に使用される単離容器も、本発明に含まれる。
【０１３２】
真空分配機構(vacuum and dispensing mechanisms)８の下では、単離容器アセンブリーは、自動装置中に配置され、これらによって、液体を中に入れ、そして排出することができる。このアセンブリーでは、いくつかの単一真空管を、１つより多い単離又は反応容器の同時処理を可能にするために使用することができる。従って、真空及び分配機構８は、ピペットの役割をする。真空および圧力が、管９を通って真空分配機構８に与えられる。
【０１３３】
核酸を単離するために、分配機構８によって溶解バッファーが導入される、細胞を含む反応容器を、例えば、攪拌機／ホルダー６に配置することもできる。混合後、細胞溶菌液は、単離容器に移される。溶解バッファーは、単離容器中の表面を通ってその後取り出される。次に、細胞溶解液残留物を除去するために、洗浄バッファーによって、表面を洗浄することもでき、ここで、洗浄バッファーも下方へ排出される。最後に、溶出バッファーは、単離装置へ分配され、場合によっては追加の攪拌後、リリースされた核酸は、上方において除去され、回収管へ移される。
【０１３４】
通常、使い捨てチップは、試料の汚染を防ぐために、真空分配機構８上で使用される。
【０１３５】
図２〜４は、本発明において使用されるべき適当な単離容器の異なる概要例を示す。
図２では、漏斗型単離容器１０には、溶解及び洗浄バッファーを吸収するために働くスポンジ様材料１３を含有する回収管１２上に配置される表面１１、例えば膜が備えられる。吸引性能を改善するために、スポンジ様材料１３の下に超吸収性層(superabsorbent layer)１４を配置することもできる。代わりに、層１４は、水を化学的に、例えばアクリレートに変化させることができる材料を含むこともできる。それにより、水も工程から除去される。核酸の溶菌液及び他の調製物を、漏斗に入れる。スポンジ様材料１３は、膜１１を通して適用された液体を取り出す。溶出バッファーの添加の前に、スポンジは、例えば、回収管１２（図示せず）の内部の機構によって、膜から多少間隔を置いて配置される。これは、最後の段階において溶出液バッファーもが、膜１１を通して吸い取られることを防止するであろう。このバッファーは、表面（図１ｂ）で少し(rather)留まり、そして上方で核酸と共に除去することができる。このアセンブリーを使用する場合、自動装置において真空機構５は必要とされない。
【０１３６】
図３は、その底部に配置されたルアー(Luer)接続によって、この場合はスポンジを含まないが、ノズル１８によって真空機構と接続する回収容器１６に、ルアー・アダプター１７によって接続される単離装置の他の例を示す。この場合は、真空の適用により、膜１１を通して溶解及び洗浄バッファーを取り出すこともできる。溶出液バッファーが導入される場合、真空は、止められたままであるので、溶出液を上方で除去することができる。ルアー接続の使用により、個々の単離容器を、単離容器アセンブリーから取り除くことができる。しかし、真空回収容器を、固定された単離装置、例えば８、１２、２４、４８、９６又はそれ以上の個々の容器を有するマルチウェル(multi-well)容器と連結することもできる。
【０１３７】
図４は、重力又は遠心分離によってバッファーが取り出される回収容器を提供する態様を最後に示す。少量で使用される溶出液バッファーは、それ自体が膜１１を通るのに十分なほど重くはなく、上方で再度除去することができる。
【０１３８】
図５は、本発明による単離容器の態様を示す。
図５Ａは、円筒状上部２０を有する単離容器を示す。この上部は、ねじ連結装置２５によって下部２２に接続される。液体の強固な結合(liquid-tight connection)を可能にし、かつ膜１１を支持する限り、ねじ連結装置の代わりに、他の形の連結部を使用することもできる。この例の態様において、膜１１が、上部２０の底部開口部に直接配置される。しかし、それは、内側へ、又は上部の壁に対して９０°ではない角度に配置されることもある。下部は、同様に円筒状の形を示すが、他の態様では、違うように開発されることもある。そのような長方形型として、基板上の上部２０の安定性を改善するものが使用されてもよい。例えば、本発明による方法の所定のオプション(certain options)を用いて使用された溶液を吸収剤材料に完全に含有させるために、下部２２においてより大きな空間が必要とされる場合、上部２０に関連する下部２２の拡大も可能である。
【０１３９】
Ｂ図は、図５Aに示された態様の代わりの態様を示す。ここでは、上部２０及び下部２２が、お互いに永続的に連結され、又は１つの単一成分として作られることもある。吸収剤材料１３と膜１１との間で、膜１１と吸収剤材料１３とを分離するために、スライド２７を、開口部２６を通して単離容器内に挿入することができる。この例において、スライド２７は、スライド２７の収縮を緩和するためのハンドル部２８を更に示す。しかし、スライドは、このハンドル部なしで設計することもできる。図５Bに示すように、吸収剤材料１３は、スライドによって得られた空間を埋めるため、及び膜と接触するために、わずかに広がる。
【０１４０】
図５Ｃは、本発明による単離容器の更なる態様を示す。ここで、下部２３に、いくつかの調製物の同時処理を可能にする上部２０に適合させるために、いくつかのソケット３０を備える。この例において、上部２０は、ねじ連結装置３１によって下部２３に接続される。図５Ａ及びＢにおいて上部２０よりも小さく描かれているが、上部は、これらの態様と同じ大きさ（又はより大きく若しいはより小さい）であることもできる。
【０１４１】
図５Ｄは、冷却液(cooling liquid)を含み、膜１１を外部で取り囲むジャケット３２を有する単離容器を最後に示す。この例において、上部２０及び下部２４は、一緒に差し込まれる。別の形式の接続又は一部の(one-part)態様も可能である。ジャケット３２は、破壊可能な仕切り３５を介して接続することができる２つの区画３３及び３４を含む。両方の区画３３、３４は、仕切り３５の破壊後の混合によって、温度が下がる、例えば溶液のような物質で充填される。
【０１４２】
上記の工程は、以下の実施例によって説明される。これらの工程の異なる様々な使用方法は、先の説明及び例から専門家に明らかであろう。これらの実施例及び対応の記載は、説明のためにのみ示されるものであり、本発明を限定するものではないことを明確に言及する。
【実施例】
【０１４３】
実施例１
ＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡの単離
化学的後処理によって疎水性にされた市販の疎水性ナイロン膜(例えばＭＳＩ製の材料：１．２μｍの孔径を有するマグナＳＨ(Magna SH)、又はパル社(Pall GmbH)製の材料：１．２μｍの孔径を有するヒドロロン(Hydrolon))は、プラスチックカラム中に、単一層で配置される。これらの膜は、機械的支持体として役立つポリプロピレン・フリット上に配置される。これらの膜は、環を有するプラスチックカラム中に固定される。
【０１４４】
この方法で調製されたカラムは、ルアー接続によって真空チャンバーへ接続される。全ての単離段階は、真空の適用によって行われる。
【０１４５】
単離のために、５×１０5個のＨｅＬａ細胞を、遠心分離によってペレットにし、上清液を除去する。１５０μｌの市販のイソチオシアン酸グアニジニウムバッファー、例えば、キアゲン(Qiagen)社製のＲＬＴバッファーの添加によって、現在の技術からよく知られている方法で、細胞を溶解することができる。溶解は、ピペッティング又はボルテックスミキサーでの混合によって、約５秒間粗く混合することによって促進される。次いで、７０％エタノール１５０μｌを添加し、ピペッティング(pipetting)又はボルテックスミキサーでの混合(vortexing)によって、約５秒間混合する。
【０１４６】
その後、溶菌液はピペットでプラスチックカラムへ移され、真空チャンバーを取り除くことにより、膜を通して吸引される。ＲＮＡは、このように作り出された条件の下で、膜に結合したまま保たれる。次に、イソチオシアン酸グアニジニウムを含む市販の一番目の洗浄バッファー、例えば、キアゲンのＲＷ１バッファーによって、及び、その後トリス又はトリスとアルコールを含む二番目の洗浄バッファー、例えばキアゲンのＲＰＥバッファーによって、洗浄が行われる。それぞれの場合、真空チャンバーを取り外すことによって洗浄バッファーを吸引することができる。最後の洗浄段階の後、膜を乾燥するために、約１０分間真空を維持し、その後、真空チャンバーに空気を入れる (airated)。
【０１４７】
溶出のために、精製されたＲＮＡを膜からリリースするために、７０μｌのＲＮａｓｅを含まない水を膜上にピペットで移す。１０〜３０℃の範囲の温度で１分間インキュベートした後、溶出液を膜の最上面からピペットで取り、溶出を完全なものにするために、溶出段階を繰り返す。
【０１４８】
その後、この方法で得られ単離された全ＲＮＡの量を、２６０ｎｍの波長の吸光度測定によって測定する。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度値の間の比の測定によって、このように得られたＲＮＡの品質を測定する。
【０１４９】
疎水性ナイロン膜(番号１及び２)による２つの単離の結果を、下記表１において、一方で疎水性ナイロン（ナイラフロ(Nylaflo)）並びにシリカ膜（番号４）が使用された比較実験と比較する。報告された値は、本発明により使用された材料の印象的な単離収量及び分離効果に対する説得力のある支持を与える。それらは、そのフリース様構造及びそれによる溶出液バッファーの主要部の吸収に恐らく起因して、シリカゲルフリースが明らかな収量の低下を引き起こすことも示す。
【０１５０】
【表１】
【０１５１】
単離されたＲＮＡは、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析することもできる。この目的のために、例えば、１．２％ホルムアルデヒドアガロースゲルを調製する。結果を図６に再現する。
【０１５２】
図６において、1列目は、疎水性ナイロン膜によって単離された、１．２μｍの孔径を有するマグナＳＨからの全ＲＮＡを示す。
２列目は、１．２μmの孔径を有するヒドロロンからの疎水性ナイロン膜によって単離された全RNAを表す。
３列目は、シリカ膜によって単離された全ＲＮＡのクロマトグラムを表す。
それぞれの場合において、５０μｌの全ＲＮＡ単離物が分析された。
【０１５３】
図６は、シリカ膜が使用される場合、測定可能な程度の全ＲＮＡを単離することができないという明らかな証拠を与えるものである。
【０１５４】
実施例２
様々な塩／アルコール混合物によって疎水性膜とＲＮＡを結合させるによる結合していないＲＮＡの単離
この実施例において、溶菌液及び洗浄溶液は、真空の適用により疎水性膜に通される。
疎水性ナイロン膜(例えばパル社(Pall company)製１．２μｍヒドロロン)は、実施例1と同様の方法で、真空チャンバーに連結したプラスチックカラムへ導入される。
【０１５５】
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌをピペッティングによって、市販のイソチオシアン酸グアニジニウム含有溶解バッファー (例えばキアゲン製ＲＬＴバッファー)３５０μｌ、１．２Ｍの酢酸ナトリウム溶液３５０μｌ、２Ｍの塩化ナトリウム溶液３５０μｌ及び４Ｍの塩化リチウム溶液３５０μｌを含んでおり、ピペットで移すことにより混合される市販の溶解バッファーの３５０μｌそれぞれと混合し、それぞれピペッティングによって混合する。
【０１５６】
次に、エタノール２５０μｌを各混合物に添加し、同様にピペッティングによって混合する。その後、ＲＮＡ含有溶液を、ピペットでプラスチックカラムへ移し、真空チャンバーを取り除くことにより膜を通して吸引する。記載した条件の下で、ＲＮＡは、膜へ結合したままである。その後、実施例1に記載のように膜を洗浄する。
【０１５７】
最後に、実施例１にも記載したようなＲＮＡを、上方でピペッティングによって膜から除去する。
【０１５８】
単離された全RNAの容量を、２６０ｎｍでの吸光度測定によって測定した。２６０及び２８０ｎｍでの吸光度の値の間の比の測定によって、このようにして得られたＲＮＡの品質を測定する。
【０１５９】
【表２】
【０１６０】
実施例３
ＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡの単離
実施例1に従って、様々な疎水性膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。この方法で準備されたカラムを、回収管に配置し、遠心分離によって以下の単離段階を行う。
【０１６１】
単離のために、５×１０5個のＨｅＬａ細胞を、遠心分離によってペレットにし、上清物質を除去する。従来技術から原則として(principly)よく知られている方法で、市販のイソチオシアン酸グアニジニウムバッファー(例えばキアゲン製RLTバッファー)１５０μｌを添加することによって、細胞を溶解する。約５秒間、ピペッティング又はボルテックスミキサーで攪拌することによって繰り返し混合することにより溶解が促進される。その後、７０％エタノール１５０μｌを添加し、ピペッティングにより、又は約５秒間、ボルテックスミキサーで攪拌することにより混合する。
【０１６２】
続いて、溶菌液をプラスチックカラムへ移し、1分間１００００×ｇで遠心分離を行い、膜に通す。続いて、イソチオシアン酸グアニジニウムを含む市販の洗浄バッファー、例えば、キアゲンのＲＷ１バッファーによって洗浄を行い、続いて、トリス及びアルコールを含有する洗浄バッファー、例えばキアゲン製ＲＰＥバッファーによって２回目の洗浄を行う。洗浄バッファーは、遠心分離によって膜に通される。膜を乾燥させるために、２分間２００００×ｇで最後の洗浄段階を行う。
【０１６３】
溶出のために、精製されたＲＮＡを膜からリリースするために、７０μｌのＲＮａｓｅを含まない水を、ピペットで膜上に移す。１０〜３０℃の範囲の温度における１〜２分間のインキュベーションの後、溶出液を膜の最上面からピペットで取り除く。完全な溶出を達成するために、溶出段階を一回繰り返す。
【０１６４】
その後、この方法で得られた、単離された全ＲＮＡの容量を、２６０ｎｍの波長における吸光度測定によって測定する。２６０及び２８０ｎｍでの吸光度の値の間の比の測定により、ＲＮＡの品質を測定する。
【０１６５】
異なる疎水性膜を有する単離の結果を、表３に示す。
膜当り３−５つの並行試験を行い、平均値を算出する。シリカ膜の使用によって、溶出液が、それを膜の最上面から除去することにより得られる場合、シリカ膜の使用によって、測定可能な容量の全ＲＮＡは全く単離することができない。
【０１６６】
【表３】
【０１６７】
実施例３ｂ
親水性膜上への結合によるＨｅＬａ細胞からの全RNAの単離
実施例1に従って、様々な親水性膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。この方法で準備されたカラムを、回収管に配置し、以下の単離段階を遠心分離によって行う。
【０１６８】
単離のために、５×１０5個のＨｅＬａ細胞を使用する。実施例３に記載のように、以下の単離段階及び核酸の溶出が行われる。
【０１６９】
その後、この方法で得られた、単離された全ＲＮＡの容量を、２６０ｎｍの波長における吸光度測定によって測定する。２６０及び２８０ｎｍでの吸光度の値の間の比の測定によって、ＲＮＡの品質を測定する。
異なる親水性ナイロン膜による単離の結果を、表３ｂに示す。膜当り２−５つの並行試験を行い、平均値を算出する。シリカ膜の使用によって、溶出液が、それを膜の最上面から除去することにより得られる場合、測定可能な容量の全ＲＮＡを単離することはできない。
【０１７０】
【表４】
【０１７１】
【表５】
【０１７２】
実施例４
水溶液からの結合していないＲＮＡの単離
実施例1に従って、異なる疎水性膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、市販のイソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えばキアゲン製ＲＬＴバッファー３５０μｌと混合する。続いて、エタノール２５０μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、遠心分離（１００００×ｇ；１分）によって膜に通す。続いてバッファー、例えばキアゲン製ＲＰＥによって膜を２回洗浄する。
各バッファーを、遠心分離によって膜に通す。膜を乾燥させるために、最後の洗浄段階を、２００００×ｇで行う。
【０１７３】
続いて、実施例１において既に記載されたようなＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まない水によって溶出し、膜の最上面からピペットによって取り除く。
この方法で得られた、単離された全ＲＮＡの容量を、２６０ｎｍでの吸光度測定によって測定する。２６０及び２８０ｎｍでの吸光度の値の比の測定により、ＲＮＡの品質を測定する。
【０１７４】
様々な疎水性膜による単離の結果を下記表４に記載する。
膜当り３−５つの並行試験を行い、それぞれの場合の平均値を算出する。シリカ膜を使用することによって、溶出液を膜の最上面から取り除くことにより回収する場合、測定可能な容量の全ＲＮＡを単離することはできない。
【０１７５】
【表６】
【０１７６】
実施例４ｂ
親水性膜に結合することによる水溶液からの結合していないＲＮＡの単離
実施例1に従って、異なる親水性膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、市販のイソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えばキアゲン製ＲＬＴバッファー３５０μｌと混合する。続いて、エタノール２５０μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例４に従って膜へ通し、洗浄及び乾燥させる。
続いて、実施例１に既に記載したようなＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まない水によって溶出し、膜の最上面からピペットで取り除く。
その後、この方法で得られた、単離された全ＲＮＡの容量を、２６０ｎｍでの吸光度測定によって測定する。２６０及び２８０ｎｍでの吸光度の値の間の比の測定によって、ＲＮＡの品質を測定する。
【０１７７】
様々な親水性膜による単離の結果を下記表４ｂに記載する。
膜当り２−５の並行試験を行い、それぞれの場合の平均値を算出する。シリカ膜の使用によって、溶出液が膜の最上面から除去されることにより回収される場合、測定可能な容量の全ＲＮＡを単離することはできない。
【０１７８】
【表７】
【０１７９】
実施例５
膜の孔径に依存するＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡの単離
実施例1に従って、異なる孔径を有する疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てた。
実施例３に従って、５×１０5個のＨｅＬａ細胞から細胞溶菌液を調製し、カラムへ移す。続いて、遠心分離を用いて、市販のキアゲンのバッファーＲＷ１及びＲＰＥによって膜を洗浄する。膜を乾燥させるために、２００００×ｇで２分間、最後の遠心分離段階を行う。実施例１に記載のように溶出を行う。
結果を下記表５に記載する。
膜当り３−５つの並行試験を行い、それぞれに対して平均値を算出する。
【０１８０】
【表８】
【０１８１】
実施例６
ＨｅＬａ細胞から単離された全ＲＮＡの安定性及び品質
実施例１に従って、親水性膜（例えばパル社製ヒドロロン、孔径３μｍ）を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
実施例３に従って、５×１０5個のＨｅＬａ細胞から、細胞溶菌液を調製し、カラムへ移す。続いて、遠心分離を用いて、市販のキアゲンのバッファーＲＷ１及びＲＰＥによって膜を洗浄する。膜を乾燥させるために、２００００×ｇで２分間、最後の遠心分離段階を行う。実施例１に記載のように溶出を行う。
単離された全ＲＮＡを、３７℃で１６時間インキュベートし、続いて非変性(non-denaturalizing)アガロースゲルに適用し、分析する。ＲＮＡが何ら変性されなかったことが明らかになる。上記の方法によって単離されたＲＮＡは、核酸分解酵素による汚染を示さないので、高品質である。
【０１８２】
実施例７
９６ウェルトレイ(96-well-tray)内の親水性膜における結合による水溶液からの結合していないＲＮＡの単離
親水性ポリビニリデンジフルオライド膜を有する９６ウェルプレート（ミリポア社(millipore)製デュラポア(Durapore)、０．６５μｍ）を使用する。
全ＲＮＡを含む水溶液５．３ｍｌを、市販のイソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えば、キアゲン社製ＲＬＴバッファー１８．４ｍｌと混合する。続いて、エタノール１３．１ｍｌを添加し、ピペッティングによって混合する。この混合物３５０μｌを、ウェル毎に添加し、真空を適用することによって膜を通して輸送する。続いて、バッファー、例えばキアゲン社のＲＰＥによって膜を２回洗浄する。バッファーは、それぞれの場合において、バッファーを、真空の適用によって膜を通して輸送する。最後の洗浄段階の後に、紙タオルによってトレイを拭き取り、次いで真空を適用することによって５分間乾燥させる。続いて、ＲＮＡを、実施例１に記載のようにＲＮａｓｅを含まない水によって溶出し、膜からピペットで取り除く。
この方法で得られた、単離された全ＲＮＡの容量は、その後２６０ｎｍでの吸光度測定によって測定され、トレイ全体の平均値並びに標準偏差を算出した。平均値は８．４μｇで、標準偏差は０．７μｇである。
【０１８３】
実施例８
毛管力による全ＲＮＡの単離
親水性ポリビニリデン・ジフルオライド膜(ミリポア社製デュラポア、０．６５μｍ)を有する９６ウェルプレートを使用する。
全ＲＮＡを含有する水溶液３３μｌを、市販のイソシアン酸グアニジニウム(guanidinium-iso-cyanate)を含有する溶解バッファー、例えばキアゲン社製ＲＬＴバッファー１１０μｌと混合する。続いて、エタノール７８μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。この混合物４５μｌを、ウェル毎に添加する。 強い吸引性(suction properties)を有する家庭用スポンジを水に浸し、スポンジの表面上の膜の底面に９６ウェルプレートを配置する。ＲＮＡ混合物を、毛管力によって膜を通して輸送する。続いて、バッファー、例えばキアゲン社のＲＰＥによって膜を２回洗浄する。トレイをスポンジの表面に置くことによって、バッファーも膜を通して輸送することができる。最後の洗浄段階の後、トレイを５分間空気にさらして乾燥させる。
続いて、実施例１に記載のように、ＲＮａｓｅを含まない水によってＲＮＡを溶出し、ピペットによって膜から取り除く。
その後、この方法で得られた、単離された全ＲＮＡの容量を、２６０ｎｍ０の波長での吸光度測定によって測定し、トレイ全体の平均値並びに標準偏差を算出する。平均値は５．９μｇで、標準偏差は０．７μｇである。
【０１８４】
実施例９
塩酸グアニジニウムを含有するバッファーによる水溶液からのゲノムＤＮＡの単離
実施例１に従って、疎水性膜(例えばＭＳＩ社製マグナＳＨ、孔径５μｍ)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。市販のキアゲン社製バッファーを用いて精製を行う。
肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを含有する水溶液２００μｌを、ＰＢＳバッファー中で調製する。塩酸グアニジニウムを含有するバッファー、例えば、キアゲン社製ＡＬ２００μｌを添加して混合する。続いて、エタノール２１０μｌを添加し、ボルテックスミキサーによる攪拌によって混合する。実施例３に従って、混合物をカラムへ添加し、遠心分離によって膜を通して輸送する。続いて、アルコール含有バッファー、例えばキアゲン社製ＡＷによって膜を洗浄し、乾燥させる。実施例１に記載のように溶出を行う。３つの並行試験を行い、平均値を算出する。
【０１８５】
その後、単離されたDNAの容量を、２６０ｎｍの波長での吸光度測定によって測定すると、初めの容量の約３０％になる。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度比は、１．８２になる。
【０１８６】
実施例１０
イソチオシアン酸グアニジニウムを含有するバッファーによって疎水性膜に結合させることによる水溶液からのゲノムＤＮＡの単離
実施例１に従って、様々な膜を有するプラスチックカラムを組み立てる。
全ＤＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー（４ＭのＧＩＴＣ、０．１ＭのＭｇＳＯ４、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４）３５０μｌと混合する。続いて、エタノール２５０μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。混合物をカラムへ添加し、遠心分離（１００００×ｇ；１分）によって膜を通して輸送する。続いて、バッファー、例えばキアゲン社製ＲＰＥによって膜を２回洗浄する。それぞれの場合、遠心分離によって膜を通してバッファーを輸送する。膜を乾燥させるために、２００００×ｇにおいて最後の洗浄段階を行う。実施例１に記載のように溶出を行う。膜当り３つの並行試験を行い、それぞれに対して平均値を算出する。
結果を表６に記載する。
【０１８７】
【表９】
【０１８８】
実施例１１
組織からのゲノムＤＮＡの単離
実施例１に従って、疎水性膜(例えばＭＳＩ製マグナ−ＳＨ、５μｍ)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。市販のキアゲンのバッファーによって精製を行う。
ＡＴＬバッファー１８０μｌを、腎臓組織（マウス）１０ｍｇへ添加し、機械的ホモジナイザー(homogenizer)においてすり潰す。続いて、プロテイナーゼ(proteinase)Ｋ（水２０μｌに約０．４ｍｇ溶出）を添加し、５５℃で１０分間インキュベートする。塩酸グアニジニウム含有バッファー、例えばキアゲン製ＡＬ２００μｌを添加した後、及び７０℃で１０分間インキュベートした後、この溶液へエタノール２００μｌを加えて混合する。この混合物をカラム内へ置き、遠心分離によって膜に通す。アルコール含有バッファー、例えばキアゲン社製ＡＷ１及びＡＷ２によって膜を洗浄し、続いて遠心分離によって乾燥させる。実施例１に記載のように溶出を行う。３つの並行試験を行い、平均値を算出する。
【０１８９】
続いて、単離されたＤＮＡ量を、２６０ｎｍの波長における吸光度測定によって測定すると、平均は９．７７μｇである。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度の比は、１．７４である。
【０１９０】
実施例１２
血液からのゲノムＤＮＡの単離
実施例１に従って、疎水性膜（例えば、ＭＳＩ社製マグナ−ＳＨ、５μｍ）を用いてプラスチックカラムを組み立てる。市販のキアゲン製バッファーによって精製を行う。
【０１９１】
血液２００μｌに対し、ＡＬ２００μｌ及びキアゲンプロテアーゼ(QIAGEN protease)２０μｌを添加し、完全に混合し、５６℃で１０分間インキュベートする。エタノール２００μｌを添加した後、調製物を混合し、カラムへ添加し、そして遠心分離によって膜を通して輸送する。アルコール含有バッファー、例えばキアゲン社製ＡＷ１及びＡＷ２によって膜を洗浄し、遠心分離によって乾燥させる。実施例１に記載のように溶出を行う。
続いて、単離されたＤＮＡ量を、２６０ｎｍの波長における吸光度の測定によって測定すると、１．０３μｇである。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度の比は、１．７である。
【０１９２】
実施例１３
ＲＮＡとＤＮＡとの混合物からの全ＲＮＡの単離
実施例１に従って、疎水性膜(例えばパル社製ヒドロロン、１．２μｍ)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡを含有する水溶液２７５μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えばキアゲン社製ＲＬＴバッファー１７５μｌと混合する。続いて、エタノール２５０μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。この混合物をカラムに加え膜を通して輸送し、実施例４に従って洗浄及び乾燥する。最初の遠心分離段階からの浸透物(penetrant)は、市販のミニスピンカラム(Mini-Spin-Column)（例えば、キアゲン社製ＱＩＡａｍｐミニスピンカラム）へ輸送され、遠心分離によって膜を通して取り出される。実施例４に従い、更なる洗浄段階を行う。続いて、遠心分離（１００００×ｇ、１分）によって、ＲＮａｓｅを含まない水を用いて核酸を溶出し、非変性アガロースゲルにおいて分析する（図７）。ここで記載の方法は、全ＲＮＡとゲノムＤＮＡの良好な分離を可能にする。
【０１９３】
図７は、２つの異なる溶出液の電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
１列目：疎水性ナイロン膜による全ＲＮＡの単離；
２列目：キアゲン社製ＱＩＡａｍｐミニスピンカラムによる浸透物からのゲノムＤＮＡの単離。
【０１９４】
実施例１４
疎水性及び親水性膜との結合によるに水溶液からのプラスミドＤＮＡの単離
実施例１に従って、様々な膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
プラズミドを含有する水溶液（クロンテック社(Clontech company)製ｐＣＭＶ□）１００μｌを、塩酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー（４ＭのＧＩＴＣ、０.１ＭのＭｇＳＯ4、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４）３５０μｌと混合する。続いて、イソプロパノール２５０μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。混合物を、実施例４に従ってカラムに加え、膜を通して輸送し、洗浄及び乾燥する。最後に、プラスミドＤＮＡを、実施例１に既に記載したようなＲＮａｓｅを含有しない水によって溶出し、ピペットで膜から取り除く。
その後、単離されたプラスミドＤＮＡの容量を、２６０ｎｍの波長での吸光度測定によって測定する。
様々な膜をによる単離の結果を、以下の表に記載する。
膜当り３つの並列試験を行い、それぞれに対して平均値を算出する。
【０１９５】
【表１０】
【０１９６】
実施例１５
異なるカオトロピック剤の使用による水溶液からの全ＲＮＡの固定化
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液各１００μｌを、異なる濃度のイソチオシアン酸グアニジニウム(GITC)又は塩酸グアニジニウム(GuHCl)を含む異なる溶解バッファー３５０μｌと混合する。続いて、エタノール２５０μｌを加え、ピペッティングによって混合する。その後、混合物をカラムへ輸送し、遠心分離(１００００×ｇ；１分)によって膜に通す。続いて、アルコール含有バッファー、例えばキアゲン社製ＲＰＥによって膜を２回洗浄する。遠心分離によってバッファーを膜に通す。膜を乾燥させるために、２００００×ｇで最後の洗浄段階を行う。実施例１に記載のように溶出を行う。２つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
結果を表８に記載する。
【０１９７】
【表１１】
【０１９８】
実施例１６
異なるアルコールの使用による水溶液からの全ＲＮＡの固定化
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(濃度４Ｍ)３５０μｌと混合する。続いて、異なる量のエタノール又はイソプロパノールを加え、７００μｌまでのＲＮａｓｅを含有しない水を入れて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例４に従って膜に通し、洗浄する。実施例１のように溶出を行った。
２つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
結果を表９に記載する。
【０１９９】
【表１２】
【０２００】
実施例１７
様々なｐＨ値を有する水溶液からの全ＲＮＡの固定化
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(濃度４Ｍ)３５０μｌと混合する。バッファーは、クエン酸ナトリウム２５ｍＭを含有し、ＨＣｌ又はＮａＯＨによって異なるｐＨ値に調整される。続いて、エタノール２５０μｌを加えて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例４に従って膜に通して洗浄する。実施例１のように溶出も行った。２つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
結果を表１０に記載する。
【０２０１】
【表１３】
【０２０２】
実施例１８
様々な塩類を含む水溶液からの全ＲＮＡの固定化
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡ含有水溶液１００μｌを、塩類(ＮａＣｌ、ＫＣＬ、ＭｇＳＯ4)を含有する溶解バッファー３５０μｌと混合する。 続いて、Ｈ2Ｏ又はエタノール２５０μｌを加えて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例４に従って膜に通し、洗浄する。２つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
結果を表１１に記載する。
【０２０３】
【表１４】
【０２０４】
実施例１９
様々なバッファー条件による水溶液からの全ＲＮＡの固定化
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー（濃度２．５Ｍ）３５０μｌと混合する。溶解バッファーを、様々な濃度のｐＨ７のクエン酸ナトリウム、又はｐＨ７．２のシュウ酸ナトリウムと混合する。 続いて、エタノール２５０μｌを加えて混合する。 その後、この混合物をカラムへ移し、そして、実施例１に従って、膜に通して洗浄し、溶出する。
結果を表１２に記載する。２つの試験を行い、それぞれの平均値を示す。
【０２０５】
【表１５】
【０２０６】
実施例２０
様々なバッファー物質による水溶液からの全ＤＮＡの固定化
実施例１に従って、疎水性膜(例えばパル社製ヒドロロン１．２μｍ)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＤＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(４ＭのＧＩＴＣ、０．１ＭのＭｇＳＯ4)３５０μｌと混合する。溶解バッファーを、様々なバッファー物質(濃度２５ｍＭ)と混合し、様々なｐＨ値に標準化する。続いて、エタノール２５０μｌを加えて混合する。 その後、この混合物をカラムへ移し、実施例４に従って、膜に通し、洗浄し、そして溶出する。
結果を表１３に記載する。３つの試験を行い、それぞれの時点で平均値を決定する。
【０２０７】
【表１６】
【０２０８】
実施例２１
フェノールによる水溶液からの全ＲＮＡの固定化
実施例１のように、疎水性膜(例えばパル社製ヒドロロン、１．２μｍ)を有するプラスチックカラムを構成する。
ＲＮＡ水溶液を、フェノール７００μｌと混合し、遠心分離によって膜を通して分配する。実施例４のように、膜を洗浄し、ＲＮＡを溶出させる。２つの測定を行った。それぞれの場合の平均値を示す。
その後、単離されたＤＮＡの容量を、２６０ｎｍの波長での吸光度測定によって測定すると、約１０．９５μｇになる。２６０ｎｍにおける吸光度と２８０ｎｍにおけるものの比は、０．９７５になる
【０２０９】
実施例２２
異なる塩濃度の下で固定化された全ＲＮＡの洗浄
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー３５０μｌ（濃度４Ｍ）と混合する。続いて、エタノール２５０μｌを加えて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例４に従って膜に通し、洗浄する。その後、様々な濃度のＮａＣｌ及び８０％エタノールを含有するバッファーで、膜を２回洗浄する。各回ごとに、遠心分離によってバッファーを膜に通す。膜を乾燥させるために、２００００×ｇで最後の洗浄段階を行う。実施例１に従って溶出も行われる。２つの試験を行い、それぞれの場合の平均値を示す。
結果を表１４に記載する。
【０２１０】
【表１７】
【０２１１】
実施例２３
異なる塩及びバッファー条件の下での固定化された全ＲＮＡの溶出
実施例１に従って、疎水性膜を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＲＮＡを含有する水溶液１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー３５０μｌ（濃度４Ｍ）と混合する。続いて、エタノール２５０μｌを加えて混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、実施例１に従って膜へ通し、洗浄する。
溶出のために、精製されたＲＮＡを膜から溶出するために、７０μｌのＮａＣｌ含有溶液、トリス／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７）、又はシュウ酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．２）を、ピペットで膜上へ移す。１〜２分のインキュベーションの後、１０−３０℃の温度において、ピペットで溶出液を膜の表面から取り除く。完全な溶出を達成するために、溶出段階を１回繰り返す。２つの試験を行い、それぞれの場合の平均値を示す。
結果を表１２に要約する。
【０２１２】
【表１８】
【０２１３】
実施例２４
様々な温度における固定化されたＲＮＡの溶出
実施例１に従って、疎水性膜(例えばパル社製ヒドロロン、３μｍ)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
単離のために、５×１０5個のＨｅＬａ細胞を使用する。以後の単離段階は、実施例３に記載のように行われる。
溶出のために、様々な温度のＲＮａｓｅを含まない水７０μｌを、膜からＲＮＡを溶出するために、膜上へピペットで移す。適当な溶出温度における１−２分のインキュベーションの後、溶出液をピペットで膜の上方から取り除く。完全な溶出を達成するために、溶出段階を１回繰り返す。
３つの試験を行い、それぞれの場合の平均値を示す。
結果を表１６に要約する。
【０２１４】
【表１９】
【０２１５】
実施例２５
遠心分離による固定化されたＲＮＡの溶出
実施例1に従って、疎水性膜（例えばパル社製ヒドロロン １．２μｍ）を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
全ＤＮＡを含有する水溶液３５０μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー、例えば キアゲン製ＲＬＴバッファー３５０μｌと混合する。続いて、エタノール２５０μｌを加えてピペッティングによって混合する。その後、この混合物をカラムへ移し、遠心分離(１００００×ｇ；1分)膜に通す。続いて、バッファー、例えばキアゲン社製ＲＰＥによって膜を２回洗浄する。各回において、バッファーを、遠心分離によって膜を通して輸送する。膜を乾燥させるために、２００００×ｇにおいて最後の洗浄段階を行う。
溶出のために、ＲＮａｓｅを含有しない水７０μｌを、ＲＮＡを膜からリリースするためにピペットで膜上へ移す。１０−３０℃の範囲内の温度で、１分間インキュベートした後、溶出液を、遠心分離（１００００×ｇ、１分）によって膜を通して輸送する。完全な溶出を確実なものにするために、溶出段階を再び繰り返し、それら溶出液を混合する。５つの並行試験を行い、それぞれの場合の平均値を示す。
その後、単離された全ＲＮＡの容量を、２６０ｎｍの波長における吸光度測定によって測定すると、平均で６．４μｇになる。２６０ｎｍにおける吸光度と２８０ｎｍにおけるものの比は、１．９４になる。
【０２１６】
実施例２６
β-アクチン(β-actin)ｍＲＮＡの増幅及び検出のための５´−ヌクレアーゼＰＣＲ検定(5'-nuclease PCR-assays)の使用による“リアルタイム”定量ＲＴ−ＰＣＲ(“Real Time”quantitative RT-PCR)における全ＲＮＡの使用
実施例３に従って、市販の膜（パル、３μｍの孔径を有するヒドロロン）を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
ＲＮＡを単離するために、１×１０5個のＨｅＬａ細胞を使用し、実施例１に記載のように全ＲＮＡの精製を行う。実施例１に記載のように、２×７０μｌのＨ2Ｏによって溶出を行う。残留する微量のＤＮＡの完全な除去のために、分析前にＤＮａｓｅによって試料を処理する。
【０２１７】
“単一容器”‘リアルタイム’定量RT-PCRは、市販のパーキン・エルマー(Perkin-Elmer)の反応系(タクマン(TaqMan)TMPCR試薬キット)を用いて、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を使用することによって行われる。β−アクチンに対して特異的なプライマー及び特異的なタクマンプローブ(TaqMan-probe)(パーキン・エルマー製タクマンβ−アクチン検出キット（TaqManTMβ-Actin Detection Kits）を使用することにより、全ＲＮＡ試料中のβ−アクチンｍＲＮＡ分子が、まず最初にβ−アクチンｃＤＮＡに転写され、続いて、同じ反応容器中で、中断することなく全ての反応が増幅され、直ちに検出される。製造者の指示に従って反応調製物を生成する。３種の異なる容量の単離された全ＲＮＡ（１、２、４μｌの溶出液）を使用し、３つの試験を行う。対照として、ＲＮＡを含まな３種の調製物も試験する。
３７℃で１時間、ｃＤＮＡ合成を行い、その後直ちにＰＣＲを４０サイクル行う。パーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ(Perkin Elmer Applied Biosystems)製ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM７７００配列検出機(ABI PRISMTM Sequence Detector)において、反応及び分析を行う。ＰＣＲサイクル中に生成された全てのアンプリコン(amplicon)は、タクマン−プローブから分割することによって生成される発光分子(light-emitting molecule)を生じさせる。生成された全ての光信号は、生成されるアンプリコン量に正比例し、従って全ＲＮＡ試料中の最初の転写可能容量に正比例する。発光を装置で測定し、コンピュータープログラムによって評価する。光信号を、バックグラウンド上で検出せざるを得ないＰＣＲサイクルは、“しきい値サイクル(Threshold Cycle)”(ct.)と呼ばれるであろう。この値は、試料中で使用することができる特異的に増幅されたＲＮＡの量に対する尺度(measure)である。
【０２１８】
ここで記載の方法によって単離された全ＲＮＡの使用量１μｌに対して、１７．１の平均ｃｔ−値が得られ、全ＲＮＡ２μｌに対して、ｃｔ−値は１６．４であり、全ＲＮＡ４μｌに対してｃｔ−値は１５．３である。この結果、使用された全ＲＮＡとｃｔ−値との間で線形相関(linear correlation)が得られる。このことは、全ＲＮＡが、増幅反応を阻害し得る物質を含まないことを示す。ＲＮＡを含まない対照例は、信号を全く生成しない。
【０２１９】
実施例２７
β−アクチンｍＲＮＡの増幅及び検出のためのＲＴ−ＰＣＲにおける全ＲＮＡの使用
実施例1に従って、市販の膜(パル社、１．２又は３μｍの孔径を有するヒドロロン；サルトリウス社(Sartorius company)、０．４５μｍの孔径を有するサルトロン(Sartolon))を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
ＲＮＡを単離するために、2つの異なる原料を使用する：
１）水溶液中の肝臓(マウス)からの全ＲＮＡ；実施例４に記載のように、精製及び溶出を行う；及び
２）５×１０５個のＨｅＬａ細胞；実施例３に記載のように全ＲＮＡの生成及び溶出を行う。
それぞれの試験に対し、単離された全ＲＮＡ２０ｎｇを使用する。対照として、ＲＮｅａｓｙ−キット(キアゲン)によって精製されたＲＮＡ及びＲＮＡを含まない調製物を使用する。
【０２２０】
標準状態の下で、これらの試料を用いＲＴ−ＰＣＲを行う。増幅のために、２つの異なるプライマー対を、β−アクチン−ｍＲＮＡに対して使用する。１５０Ｂｐの大きさのフラグメントは、感受性を確認するために役立ち、１．７ｋＢｐの大きさのフラグメントは、ＲＮＡの無欠性(integrity)を評価する。 ＲＴ反応から、１μｌが除去され、次のＰＣＲへ導入される。小さなフラグメントに対して２５サイクルを実施し、大きなフラグメントに対して２７サイクルを実施する。付加反応(addition reaction)の温度は５５℃である。続いて、増幅された調製物を、非変性ゲル上に置き、分析する。
【０２２１】
上記の方法で単離された、使用した２０ｎｇ容量の全ＲＮＡに対し、対応するＤＮＡフラグメントをＲＴ−ＰＣＲで確認することができる。ここで使用される条件は、ヒトβ−アクチン−ｍＲＮＡに適応するので、マウスの肝臓からの全ＲＮＡを使用する場合には、転写を確認することはできない。ＲＮＡを含まない対照例はシグナルを全く生成しない。
【０２２２】
図８は、ＲＴ−ＰＣＲ反応生成物の電気泳動分離の臭化エチジウム染色アガロースゲルを示す。
Ａ：１〜８列：１５０Ｂｐ−フラグメントのＲＴ−ＰＣＲ；
１、２列：ヒドロロン１．２μｍ膜によって精製した水溶液からのマウスの肝臓からのＲＮＡ；
３、４列：サルトロン膜によって精製したＨｅＬａ細胞からのＲＮＡ；
５、６列：ヒドロロン３μｍ膜によって精製したＨｅＬａ細胞からのＲＮＡ；
７列：ＲＮｅａｓｙ−ミニキット(RNeasy-Mini-Kit)によって精製したＲＮＡ；
８列：ＲＮＡを含まない対照。
Ｂ：１〜８列：１．７ｋＢｐ−フラグメントのＲＴ−ＰＣＲ
１、２列：ヒドロロン１．２μｍ膜によって精製した水溶液からのマウスの肝臓からのＲＮＡ；
３、４列：サルトロン膜によって精製したＨｅＬａ細胞からのＲＮＡ；
５、６列：ヒドロロン３μｍ膜によって精製したＨｅＬａ細胞からのＲＮＡ；
７列；ＲＮｅａｓｙ−ミニキットによって精製したＲＮＡ；
８列：ＲＮＡを含まない対照。
【０２２３】
実施例２８
β−アクチンｍＲＮＡの増幅及び検出のためのＮＡＳＢＡ反応（核酸配列に基づく増幅(nucleic acid sequence based amplification)）における全ＲＮＡの使用
実施例１に従って、市販の膜（パル社、１．２又は３μｍの孔径を有するヒドロロン；サルトリウス社、０．４５μｍの孔径を有するサルトロン）を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
ＲＮＡを単離するために、２つの異なる原料を使用する：
１）水溶液中の肝臓（マウス）からの全ＲＮＡ；実施例４に記載のように精製及び増幅を行う；及び
２）５×１０5個のＨｅＬａ細胞、実施例３に記載のように全ＲＮＡの精製及び溶出を行う。
【０２２４】
標準条件（ファーイ(Fahy),E.ら、1991、PCR Methods Amplic.1, 25-33））の下で、ＮＡＳＢＡ反応を行う。増幅のために、β−アクチンに特異的なプライマーを使用する。
【０２２５】
単離された全ＲＮＡを、各２０ｎｇ使用する。対照として、ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社）によって精製したＲＮＡ及びＲＮＡを含まない調製物を使用する。まず始めに、インキュベーションを、６５℃で５分間、そして４１℃で５分間行う。この段階に続いて、ＲＮａｓｅＨ、Ｔ７ポリメラーゼ、及びＡＭＶＶ−ＲＴからなる酵素混合物を加え、４１℃で９０分間インキュベートする。続いて、増幅調製物を、非変性ゲル上に置き、分析する。
上記の方法で単離した、使用される２０ｎｇの全ＲＮＡに対し、特異的転写を確認することができる（図９）。
【０２２６】
図９は、ＮＡＳＢＡ反応物の電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
１〜８列：ＮＡＳＢＡ反応物；
１、２列：ヒドロロン１．２μｍ膜によって精製した水溶液からのマウスの肝臓からのＲＮＡ；
３、４列：サルトロン膜によって精製したＨｅＬａ細胞からのＲＮＡ；
５、６列：ヒドロロン３μｍ膜によって精製したＨｅＬａ細胞からのＲＮＡ；
７列：ＲＮｅａｓｙミニキットによって精製したＲＮＡ；
８列：ＲＮＡを含まないＲＮＡ
【０２２７】
実施例２９
疎水性膜上のβ−アクチンｍＲＮＡの増幅及び検出のためのＮＡＳＢＡ反応
実施例１に従って、市販の膜（パル社、３μｍの孔径を有するヒドロロン；０．４５μｍの孔径を有するスポール(Supor)−４５０；ミリポア社(Millipore company)、３μｍの孔径を有するフルオロポア(Fluoropore)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
【０２２８】
ＲＮＡを単離するために、様々な量のＨｅＬａ細胞を使用し、実施例３に記載のように全ＲＮＡの精製を行う。２０μｌのＮＡＳＢＡ反応バッファーの添加によって、溶出を行う。続いて、膜においてＮＡＳＢＡ反応を行う。反応は、標準条件（ファーイ(Fahy),E.ら、1991、PCR Methods Amplic.1, 25-33））において行う。増幅のために、β−アクチンに特異的なプライマーを使用する。
反応容器を、まず最初に湯浴(waterbath)において４１℃で５分間インキュベートする。この反応に続いて、ＲＮａｓｅＨ、Ｔ７ポリメラーゼ及びＡＭＶＶ−ＲＴからなる酵素混合物を加えて４１℃で９０分間インキュベートする。続いて、増幅された調製物を、非変性ゲル上に置き、分析する。
【０２２９】
５×１０5〜３×１０4個のＨｅＬａ細胞から単離された、使用された全ＲＮＡの量に対し、ここで記載の方法によって単離した全ＲＮＡにおいて、特異的な転写を確認することができる（図１０）。
【０２３０】
図１０が、ＮＡＳＢＡ反応物の電気泳動分離の臭化エチジウム染色アガロースゲルを示す。
Ａ：１〜４列：ＨｅＬａ細胞から、ヒドロロン３μｍ膜によって精製したＲＮＡ；
１列：２．５×１０5個の細胞；
２列：１．２５×１０5個の細胞；
３列：６×１０4個の細胞；
４列：３×１０4個の細胞；
Ｂ：１〜３列：ＨｅＬａ細胞から精製したＲＮＡ；
１列：２．５×１０5個のＨｅＬａ細胞からヒドロロン３μｍ膜によって精製したＲＮＡ；
２列：５×１０5個のＨｅＬａ細胞からスポール−４５０ＰＲによって精製したＲＮＡ；
３列：５×１０5個のＨｅＬａ細胞からフルオロポア３μｍ膜によって精製したＲＮＡ。
【０２３１】
実施例３０
酵素ＡｖａＩを有する疎水性膜上でのプラスミドＤＮＡの単離
実施例1に従って、疎水性膜(例えばパル社製スポール−２００ＰＲ)を用いてプラスチックカラムを組み立てる。
プラズミドを含有する水溶液（クロンテック社(Clontech company)製ｐＣＭＶ）１００μｌを、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解バッファー(４ＭのＧＩＴＣ、０．１ＭのＭｇＳＯ4、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ ４)３５０μｌと混合する。続いて、イソプロパノール２５０μｌを添加し、ピペッティングによって混合する。この混合物を、実施例４に従ってカラムへ加え、膜を通して輸送し、洗浄及び乾燥する。
制限酵素ＡｖａＩ用バッファー１００μｌを膜へ適用し、そして
１）除去し、新しい反応容器へ移し、続いて制限酵素（例えば、プロメガ社(Promega company)製ＡｖａＩ）を加え；
２）制限酵素（例えば、プロメガ社(Promega company)製ＡｖａＩ）をカラム中の溶出液に加える。
【０２３２】
反応物を、３７℃で１時間インキュベートし、続いて非変性ゲルに適用し、分析する（図１１）。
【０２３３】
図１１は、ＡｖａＩによる制限(restriction)後のプラスミドｐＣＭＶβの電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
１列：切断されていないプラスミド；
２、３列：ＡｖａＩ用反応バッファーによる溶出、新しい容器内での制限；
４、５列：膜上でのＡｖａＩによる制限。
【０２３４】
実施例３１
イソプロパノールによる沈殿のための加圧濾過
標準のプロトコルに従って、アニオン交換クロマトグラフィーによって溶出段階に含まれるプラスミドＤＮＡの単離を行う。高塩濃度バッファーにおいてカラムからＤＮＡを溶出する。続いて、０．７容量のイソプロパノールをこのＤＮＡ溶液に加え、調製物を混合し、室温で１−５分間インキュベートする。使用する濾過装置は、濾過カートリッジ内に５ｃｍ2の表面を有する０．４５μｍの酢酸セルロースフィルターである（滅菌濾過用標準装置、例えば、サルトリウス社製ミニサート(Minisart)）。このフィルターは、プランジャ(plunger)が取り除かれたシリンジ上に差し込まれる。
ここでシリンジをＤＮＡとイソプロパノールとの混合物で充填し、混合物をプランジャによってフィルターを介して加圧する。この形の沈殿物中には、（細孔を通ることができない）ＤＮＡが高い割合でフィルター上に残留する
ここで、シリンジからプランジャを取り除き、再度取り替えて、そしてフィルターを介して空気を加圧する。この段階は、１−２回繰り返され、膜の乾燥に役立つ。
続いて、バッファーがシリンジの本体に充填され、プランジャによって膜を介して加圧されるように溶出するために低塩バッファーを使用する。収量を増加させるために、この最初の溶出液は、シリンジ本体にもう一度充填され、プランジャによって膜を介して加圧される。この試験装置によって得られた収量は、典型的には８０％〜９０％の範囲である（実施例３４参照）。
【０２３５】
実施例３２
イソプロパノールによるＤＮＡの沈殿のための真空濾過
加圧濾過のように、プラスミドＤＮＡをまず最初に単離し、０．７容量(vol)のイソプロパノールを加える。濾過装置は、５ｃｍ2の表面を有する０．４５μｍの酢酸セルロースが供えられた、真空濾過用に構成された装置である。０．４５μｍの硝酸セルロースフィルター又は０．６５μｍの酢酸セルロース若しくは硝酸セルロースの多層フィルターを使用することもできる。
イソプロパノールとＤＮＡとの混合物を１−５分間インキュベートし、次いで濾過装置上に移す。真空をつなぐことにより、フィルターを通して溶液を吸い取る。適量の７０％エタノールをＤＮＡ沈殿を含むフィルターに加え、真空を再度つなぐことによって洗浄する。低塩バッファーを添加することにより、フィルターからのＤＮＡの溶出を行い、短時間のインキュベーションを行い、そしてもう一度真空をつなぐ。２回目の容量の低塩バッファーを用いてフィルターから再度溶出することにより、又は１回目の溶出段階からの溶出液による再開された(renewed)溶出によって、生成物を得ることができる。
ここでも同様に、得られた収量は、典型的には、初めに使用されたＤＮＡの８０％〜９０％の範囲である。
【０２３６】
実施例３３
方法として、実施例３２において示された真空濾過を使用する。真空濾過器サルトリウス(Sartorius)１６３１５を、濾過容器として使用する。ＤＨ５αから単離されたｐＣＭＶβを、プラスミドＤＮＡとして使用する。
【０２３７】
ＱＦバッファー（高塩濃度バッファー）１５ｍｌを、５００μｇのプラスミドに加えて混合する。イソプロパノール１０．５ｍｌを加えて再度混合する。これを、５分間インキュベートする。このように知音伝されたプラスミドＤＮＡを、濾過装置内に固定された膜上へ移す。ここで、真空をつないで濾過を開始する。５ｍｌの７０％エタノールによって膜を洗浄する（真空適用の再開）。その後、１ｍｌのＴＥバッファーをピペットで膜上へ移し、５分間インキュベートし、真空の適用によってＤＮＡを溶出する。続いて、１ｍｌのＴＥバッファーによって後溶出(post-elution)を行う。続いて、浸透物、洗浄画分及び混合溶出液においてそれぞれＤＮＡの総量を測定する（ＯＤ２６０）。以下の結果が得られる。
【０２３８】
【表２０】
【０２３９】
始めの量５００μｇに対して計算した結果、この試験において以下の収量が得られる。
【表２１】
【０２４０】
実施例３４
実施例３４に記載したような加圧濾過を方法として使用する。使用された濾過装置は、市販の０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター(ミニサート、サルトリウス)である。プラスミドＤＮＡとして、ＤＨ５αから単離されたｐＣＭＶβを使用する。
【０２４１】
１５ｍｌのＱＦバッファー(高塩濃度バッファー)を、１００、２００、３００等の９００μｇまでのプラスミドへ加えて混合する。１０.５ｍｌのイソプロパノールを加えて再び混合する。続いて、これを５分間インキュベートする。このように沈殿させたプラスミドＤＮＡを、プランジャを取り除いたシリンジに移す。ここで、シリンジによって加圧濾過を行う。２ｍｌのエタノールでフィルターを洗浄し、記載したように２回乾燥させる。２ｍｌのＴＥバッファーによって溶出を行う。溶出液によって後溶出を行う。続いて、混合溶出液によってそれぞれＤＮＡの総量を測定する（ＯＤ２６０）。以下の結果が得られる。
【０２４２】
【表２２】
【０２４３】
実施例３５
実施例３２に記載したような加圧濾過を方法として使用する。使用した濾過装置は、濾過チャンバー(ＱＩＡｖａｃ)上に差し込まれた市販の０．４５μｍの酢酸セルロースフィルター(ミニサート、サルトリウス)である。貯蔵部として、シリンジの本体を、フィルターの他方の端へ取り付ける。ＤＨ５αから単離したＰＣＭＶβを、プラスミドＤＮＡとして使用する。１５ｍｌのＱＦバッファー（高塩濃度バッファー）を、５００μｇのプラスミドに加えて混合する。１０．５ｍｌのイソプロパノールを加えて再度混合する。これを、５分間インキュベートする。このように沈殿させたプラスミドＤＮＡを、濾過装置に固定した膜へ移す。ここで、真空をつなぎ、濾過を開始する。フィルターは、７０ｍｌエタノール５ｍｌで洗浄しない。むしろ、２ｍｌのバッファーＥＢ（キアゲン）によって直ちに溶出を行う。溶出液によって後溶出を１回行う。ＤＮＡの総量を測定する。以下の結果が得られる：
【０２４４】
【表２３】
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】本発明による方法の実施に適した自動装置の概略図を示す。
【図２】本発明の方法の実施のための単離容器及び回収管の第一の態様を示す。
【図３】本発明による方法の実施のための単離容器及び回収管の第二の態様を示す。
【図４】本発明による方法の実施のための単離容器及び回収管の第三の態様を示す。
【図５】本発明による上部を有する単離容器の態様を示す。
【図６】本発明の方法による様々な試料の、電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
【図７】本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
【図８】本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
【図９】本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の更に別の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
【図１０】本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを再度示す。
【図１１】本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを最後に示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む単離容器内での核酸の分析方法；
- 膜を備えた単離容器の設置；
- 少なくとも１つの核酸試料の単離容器への供給；
- 該膜における核酸の固定化；
- 該膜を通した試料の液体部の輸送；及び
- 単離容器内に含まれる該膜上の核酸の少なくとも１つの性質の分析。
【請求項２】
液体部の輸送後に、少なくとも１つの化学反応が核酸において行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分析される性質が、核酸の放射性であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分析される性質が、核酸の分子に対する結合力であることを特徴とする請求項１又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記分子が抗体であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分子が核酸結合蛋白質であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記分子が染料分子であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
供給が上方で行われることを特徴とする請求項１〜７の１項に記載の方法。
【請求項９】
以下の段階をさらに含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 固定化された核酸の該膜からのリリース；
- 核酸における少なくとも１つの化学反応の実施；及び
- 更なる固定化を伴わない該膜からの核酸の除去。
【請求項１０】
化学反応が核酸増幅反応である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
増幅反応が等温ではないことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
増幅反応が等温であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
増幅反応が、ＳＤＡ反応（“鎖置換増幅”）、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲであることを特徴とする請求項１０〜１２の１項に記載の方法。
【請求項１４】
増幅反応の実施前に、核酸が適当な反応バッファーによって膜からリリースされ、かつ溶出液が膜上又は膜内に置かれることを特徴とする請求項１０〜１３の１項に記載の方法。
【請求項１５】
リリースされた増幅反応生成物の膜からの除去を更に含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
膜からの核酸のリリースを引き起こさない反応バッファー中で増幅反応が行われることを特徴とする請求項１０〜１３の１項に記載の方法。
【請求項１７】
以下の段階を更に含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法；
- 膜からの増幅反応生成物のリリース；及び
- リリースされた増幅反応生成物の該膜からの除去。
【請求項１】
以下の段階を含む単離容器内での核酸の分析方法；
- 膜を備えた単離容器の設置；
- 少なくとも１つの核酸試料の単離容器への供給；
- 該膜における核酸の固定化；
- 該膜を通した試料の液体部の輸送；及び
- 単離容器内に含まれる該膜上の核酸の少なくとも１つの性質の分析。
【請求項２】
液体部の輸送後に、少なくとも１つの化学反応が核酸において行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分析される性質が、核酸の放射性であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分析される性質が、核酸の分子に対する結合力であることを特徴とする請求項１又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記分子が抗体であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分子が核酸結合蛋白質であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記分子が染料分子であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
供給が上方で行われることを特徴とする請求項１〜７の１項に記載の方法。
【請求項９】
以下の段階をさらに含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 固定化された核酸の該膜からのリリース；
- 核酸における少なくとも１つの化学反応の実施；及び
- 更なる固定化を伴わない該膜からの核酸の除去。
【請求項１０】
化学反応が核酸増幅反応である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
増幅反応が等温ではないことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
増幅反応が等温であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
増幅反応が、ＳＤＡ反応（“鎖置換増幅”）、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲであることを特徴とする請求項１０〜１２の１項に記載の方法。
【請求項１４】
増幅反応の実施前に、核酸が適当な反応バッファーによって膜からリリースされ、かつ溶出液が膜上又は膜内に置かれることを特徴とする請求項１０〜１３の１項に記載の方法。
【請求項１５】
リリースされた増幅反応生成物の膜からの除去を更に含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
膜からの核酸のリリースを引き起こさない反応バッファー中で増幅反応が行われることを特徴とする請求項１０〜１３の１項に記載の方法。
【請求項１７】
以下の段階を更に含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法；
- 膜からの増幅反応生成物のリリース；及び
- リリースされた増幅反応生成物の該膜からの除去。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００８−２６３９７８（Ｐ２００８−２６３９７８Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１０１０５０（Ｐ２００８−１０１０５０）
【出願日】平成２０年４月９日（２００８．４．９）
【分割の表示】特願２０００−５７８４７９（Ｐ２０００−５７８４７９）の分割
【原出願日】平成１１年４月２０日（１９９９．４．２０）
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月９日（２００８．４．９）
【分割の表示】特願２０００−５７８４７９（Ｐ２０００−５７８４７９）の分割
【原出願日】平成１１年４月２０日（１９９９．４．２０）
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
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