表面プラズモン放射光検出方法および装置、表面プラズモン放射光検出用試料セルおよびキット
【課題】表面プラズモン放射光検出を、極めて高感度に行う。
【解決手段】誘電体プレート11と該プレート11の一面の所定領域に設けられた金属膜12を備えたセンサチップ10を用意し、誘電体プレート11と金属膜12との界面に、全反射条件で励起光L0を入射させて金属膜12に表面プラズモンを誘起し、この表面プラズモンに起因して金属膜12上に生じる電場増強場内において、試料に含まれる蛍光標識が付与された被検出物質から生じる蛍光Lfが、金属膜12に新たな表面プラズモンを誘起し、この表面プラズモンからの放射光Leを誘電体プレート11の励起光を入射させた面側から検出する表面プラズモン放射光検出方法において、蛍光標識として、蛍光色素分子15を、蛍光色素分子15から生じる蛍光を透過すると共に、蛍光色素分子15が金属膜12に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料16により包含してなる消光防止性蛍光物質Ｆを用いる。
【解決手段】誘電体プレート11と該プレート11の一面の所定領域に設けられた金属膜12を備えたセンサチップ10を用意し、誘電体プレート11と金属膜12との界面に、全反射条件で励起光L0を入射させて金属膜12に表面プラズモンを誘起し、この表面プラズモンに起因して金属膜12上に生じる電場増強場内において、試料に含まれる蛍光標識が付与された被検出物質から生じる蛍光Lfが、金属膜12に新たな表面プラズモンを誘起し、この表面プラズモンからの放射光Leを誘電体プレート11の励起光を入射させた面側から検出する表面プラズモン放射光検出方法において、蛍光標識として、蛍光色素分子15を、蛍光色素分子15から生じる蛍光を透過すると共に、蛍光色素分子15が金属膜12に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料16により包含してなる消光防止性蛍光物質Ｆを用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の特定物質を検出する表面プラズモン放射光検出方法および装置、表面プラズモン放射光検出用試料セルおよびキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって検出対象物質の存在を確認する方法である。また、検出対象物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素分子で標識されて検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００３】
また、このような蛍光検出法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献１などに提案されている。これは、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属膜を設けたセンサチップを備え、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属膜形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射させ、この励起光の照射により金属膜に表面プラズモンが生じ、その電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりＳ／Ｎを向上させるものである。
【０００４】
しかしながら、蛍光信号を発する反応部と光検出器との間には一般に数百μｍ程度の距離があり、医療診断に応用される場合、一般にサンプルは血液や血清あるいは血漿のような体液中に存在する状態で供給されるため、その数百μｍ間に体液等の溶媒が存在することになる。サンプルが血清や血漿であれば、比較的透明で光吸収が少ないため信号の減衰は無視できるが、サンプルとして血液をそのまま使う場合は血液による光吸収のための信号の減衰が大きく検出が十分にできない。
【０００５】
そのため、通常の蛍光測定においては、血液を遠心分離し赤血球などの着色成分を除去したり、血球フィルタを通して血清あるいは血漿状態にしたりするという前処理が行われている。しかしながら、この前処理を行うため手間が掛かると共に、血球フィルタなどの高価な分離フィルタを要するためコスト高となっていた。
【０００６】
一方、特許文献２および非特許文献１には蛍光色素からの蛍光を検出するのではなく、該蛍光が金属膜に新たに表面プラズモンを誘起して生じる放射光をプリズム側から取り出す方法が提案されている。このような、蛍光が新たな表面プラズモンを誘起し、この新たな表面プラズモンから生じる放射光（SPCE: Surface Plasmon-Coupled Emission)を利用する検出方法を医療診断に応用すれば、蛍光が溶媒を通過する距離は数十ｎｍ程度とすることができるため、血液における光吸収をほぼ無視することができ、血液に前述の前処理を行うことなく測定が可能となる。
【０００７】
ところが、表面プラズモン増強蛍光検出装置においては、非特許文献１に示されているように、試料中の蛍光色素と金属膜とが接近し過ぎていると、蛍光色素内で励起されたエネルギーが蛍光を発生させる前に金属膜へ遷移してしまい、蛍光が生じないという現象（いわゆる金属消光）が起こり得る。
【０００８】
そこで、非特許文献２では、金属膜上にカルボキシメチルデキストラン(ＣＭＤ)膜を作製して距離を離す方法が提案されている。
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００５３９７４号明細書
【非特許文献１】Thorsten Liebermann Wolfgang Knoll, "Surface-plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy" Colloids and Surfaces A 171(2000)115-130
【非特許文献２】W.Knoll他、Analytical Chemistry（Anal.Chem.）76(2004) p.6765
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、金属膜上にＣＭＤ膜を形成する場合、金膜上にＳＡＭ（自己組織化膜）を付けてからさらにＣＭＤ膜を作製する必要があることから、金属消光を防止するための手立てに時間がかかり、またセンサ部の製造工程が複雑なものとなり実用的でないという問題がある。
【００１０】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、センサ部の製造工程を複雑化させることなく、高い感度で表面プラズモン放射光を検出することができる検出方法および装置を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、表面プラズモン放射光検出方法に用いられる試料セルおよびキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の表面プラズモン放射光検出方法は、誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属膜を備えたセンサチップを用意し、
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に、前記誘電体プレートの前記一面とは反対の面から全反射条件で励起光を照射して前記金属膜に表面プラズモンを誘起し、
前記表面プラズモンに起因して前記金属膜上に生じる電場増強場内において、前記試料に含まれる被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識から生じる蛍光が、前記金属膜に新たに表面プラズモンを誘起し、前記誘電体プレートの前記反対の面から出射される、前記新たに誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法において、
前記蛍光標識として、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質を用いたことを特徴とする。
【００１３】
なお、ここで「蛍光標識物質」は蛍光標識が付与された被検出物質であってもよいし、被検出物質と競合する、蛍光標識が付与された競合物質であってもよい。一般に、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には被検出物質に蛍光標識が付与され、競合法によるアッセイを行う場合には被検出物質と競合する競合物質に蛍光標識が付与される。本発明の蛍光検出方法は、サンドイッチ法、競合法のいずれの方法によるアッセイにも対応可能である。
【００１４】
また、消光防止性蛍光物質の消光防止材料に含まれる蛍光色素分子の数は１個でもよいが、複数であることがより好ましい。なお、消光防止性蛍光物質が複数の蛍光色素分子を備えるものである場合には、少なくとも１つの蛍光色素分子が金属消光を防止する材料に包まれていればよく、他の蛍光色素分子の一部が消光防止材料の外部に露出していてもよい。
【００１５】
本発明の表面プラズモン放射光検出装置は、誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属膜を備えたセンサチップと、
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に、前記誘電体プレートの前記試料保持面とは反対の面から、前記金属膜において表面プラズモン共鳴を生じる全反射条件で励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記金属膜に試料を接触させた状態の前記センサチップへの、前記励起光の照射により生じた電場増強場内において、前記試料に含まれる被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識から生じる蛍光が、前記金属膜に新たに表面プラズモンを誘起し、前記誘電体プレートの前記反対の面から出射される、前記新たに誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出手段とを備え、
前記蛍光標識が、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質であることを特徴とする。
【００１６】
本発明の表面プラズモン放射光検出用試料セルは、被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識からの蛍光により誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法に使用される試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記流路の前記注入口と前記空気孔との間の壁面の少なくとも一部に設けられた、所定の光を透過する誘電体プレート、および該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属膜からなるセンサチップ部と、
前記金属膜上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質と、
前記流路内の前記センサチップ部より上流側に固定されてなる、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質とを備えてなることを特徴とする。
【００１７】
なお、本発明の試料セルは第２の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を備えている場合には、サンドイッチ法によるアッセイ、第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を備えている場合には競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００１８】
本発明の表面プラズモン放射光検出用キットは、被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識からの蛍光により誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法に使用される表面プラズモン放射光検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記流路の前記注入口と前記空気孔との間の壁面の少なくとも一部に設けられた、所定の光を透過する誘電体プレート、および該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属膜からなるセンサチップ部と、前記金属膜上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質とを備えた試料セル、および
表面プラズモン放射光検出測定を行うにあたり、前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下するための、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を含む標識用溶液を備えたことを特徴とする。
【００１９】
なお、本発明の蛍光検出用キットは、標識用溶液に第２の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を備えている場合には、サンドイッチ法によるアッセイ、第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を備えている場合には競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００２０】
なお、上記において、試料セルに備えられた消光防止性蛍光物質は、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなるものである。なお、消光防止性蛍光物質の消光防止材料に含まれる蛍光色素分子の数は１個でもよいが、複数であることがより好ましい。なお、消光防止性蛍光物質が複数の蛍光色素分子を備えるものである場合には、少なくとも１つの蛍光色素分子が消光防止材料に包まれていればよく、他の蛍光色素分子の一部が消光防止材料の外部に露出していてもよい。
【００２１】
前記消光防止性蛍光物質の粒径は、５３００ｎｍ以下であることが好ましく、７０ｎｍ〜９００ｎｍであることがさらに好ましく、さらには１３０ｎｍ〜５００ｎｍであることが特に好ましい。なお、本明細書において、消光防止性蛍光物質の粒径は、その形状が略球状の粒子である場合にはその直径であり、球状でない粒子の場合にはその最大幅と最小幅の平均の長さで定義するものとする。
【００２２】
また、誘電体プレートに設けられる前記金属膜は、励起光の照射により表面プラズモンを生じさせるものであればよく、金属薄膜により構成されていてもよいし、回折格子のように周期状の凹凸表面を有する金属微細構造体により構成されていてもよい。その材料としては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とすることが望ましい。なおここで、「主成分」は、含量９０質量％以上の成分と定義する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の表面プラズモン放射光検出方法および装置は、蛍光標識として、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる、消光防止性蛍光物質を用いているため、金属膜上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜と蛍光色素分子との距離をある程度離間させることができる。従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、センサ部の製造工程を複雑化させることなく、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して信号を検出することができる。
【００２４】
本発明の表面プラズモン放射光検出用試料セルは、流路内の、センサチップ部より上流側に固定された、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または第１の結合物質と特異的に結合すると共に被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を備えており、消光防止性蛍光物質は、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなるものであることから、金属膜上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜と蛍光色素分子との距離をある程度離間させることができる。従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、センサ部の製造工程を複雑化させることなく、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して信号を検出することができる。
【００２５】
本発明の表面プラズモン放射光検出用キットは、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に、流路内に流下される、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質または第１の結合物質と特異的に結合すると共に被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を含む標識用溶液を備えており、消光防止性蛍光物質は、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなるものであるから、金属膜上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜と蛍光色素分子との距離をある程度離間させることができる。従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、センサ部の製造工程を複雑化させることなく、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して信号を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
＜第１の実施形態＞
図面を参照して、本発明の第１実施形態に係る表面プラズモン放射光検出方法およびそれに用いられる装置について説明する。図１は装置の全体図である。各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【００２７】
図１に示す表面プラズモン放射光検出装置１は、誘電体プレート１１と、その一面の所定領域に設けられた金属膜１２とを備えたセンサチップ１０、励起光Ｌｏを誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で全反射条件となる入射角度で、センサチップ１０の金属膜形成面とは反対の面側から励起光Ｌｏを照射する励起光照射光学系２０と、金属膜１２に接触している試料中に蛍光標識が付与された被検出物質が存在する場合に、該蛍光標識が付与された被検出物質（実質的には蛍光標識Ｆ）から生じる蛍光Ｌｆが金属膜１２に新たに表面プラズモンを誘起し、この新たに誘起された表面プラズモンからの放射光Ｌｅ（以下、単に放射光Ｌｅという）を検出する光検出器３０とを備えている。光検出器３０は、誘電体プレート１１の励起光が入射する面と同じ面からの放射光Ｌｅを検出するように配置されている。光検出器３０としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳ等を適宜用いることができる。
【００２８】
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、誘電体プレート１１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とを備えている。プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌｏが全反射するように誘電体プレート１１内に励起光Ｌｏを導光するものである。なお、プリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。光源２１は、プリズム２２の他の一面からセンサチップ１０の試料接触面１０ａで励起光Ｌｏが全反射角以上で、かつ金属膜で表面プラズモン共鳴を生じさせる特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。なお、励起光Ｌｏは、表面プラズモンを誘起するようにｐ偏光で界面に対して入射される。
なお、本実施形態においては、センサチップ１０上に液体試料Ｓを保持する試料保持部１３が備えられ、センサチップ１０と試料保持部１３により液体試料を保持可能な箱状セルが構成されている。
【００２９】
センサチップ１０は、ガラス板などの誘電体プレート１１の一表面の所定領域に金属膜１２が成膜されたものである。金属膜１２は、所定領域に開口を有するマスクをプレート１１の一表面に形成し、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１２の厚みは、金属膜１２の材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、励起光として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００３０】
表面プラズモン放射光検出装置の放射光検出の原理について説明する。
励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント波Ｅｗが滲み出し、このエバネッセント波Ｅｗによって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜１２表面に電界分布が生じ、電場増強領域が形成される。このとき、エバネッセント波Ｅｗの滲み出し領域において蛍光標識Ｆが存在する場合、その蛍光標識Ｆが励起されて蛍光が発生する。このとき、エバネッセント波の染み出し領域とほぼ同等の領域に存在する表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。なお、エバネッセント波Ｅｗの滲み出し領域外の蛍光標識Ｆは励起されず蛍光を発しない。金属膜１２上で生じた蛍光Ｌｆが、金属膜の表面プラズモンを新たに励起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属膜形成面と反対側のプリズム２２から特定の角度で放射光Ｌｅが射出される。光検出器３０は、蛍光標識Ｆから生じた蛍光が金属膜の表面プラズモンを新たに誘起し、この新たに誘起された表面プラズモンから生じるこの放射光Ｌｅを検出する。放射光Ｌｅは蛍光が金属膜の特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光の波長に応じてその結合する波数は定まり、その波数に応じて放射光の出射角度が定まる。通常励起光Ｌｏの波長と蛍光の波長とは異なることから、する表面プラズモンは、励起光Ｌｏにより生じた表面プラズモンとは異なる波数のものとなり、励起光Ｌｏの入射角度とは異なる角度で放射光Ｌｅは射出される。
【００３１】
本実施形態の表面プラズモン放射光検出方法では、被検出物質Ａに、蛍光標識として消光防止性蛍光物質Ｆを付与してセンシングを行う。消光防止性蛍光物質Ｆは、蛍光色素分子１５と、該蛍光色素分子１５を内包する、該蛍光色素分子１５から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料１６とからなる。消光防止性蛍光物質Ｆは蛍光色素分子が消光防止材料で覆われているものであるため、金属膜上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜と蛍光色素分子との距離をある程度離間させることができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止することができる。
【００３２】
また、ここでは、消光防止性蛍光物質Ｆは複数の蛍光色素分子１５を内包するものであり、従来の蛍光色素分子１５自体を標識として用いる場合と比較すると、発光する蛍光量を大幅に増加することができる。
【００３３】
なお、消光防止性蛍光物質Ｆは粒径が、５３００ｎｍ以下であることが好ましく、７０ｎｍ〜９００ｎｍであることがさらに好ましく、さらには１３０ｎｍ〜５００ｎｍであることが特に好ましい。消光防止材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられるが、蛍光色素分子１５を内包でき、かつ、該蛍光色素分子１５からの蛍光を透過した外部に放出でき、蛍光色素分子１５の金属消光を防止できるものであれば特に制限されない。
【００３４】
蛍光により金属膜の表面プラズモンを励起させるためには、金属膜表面から５ｎｍ〜２０ｎｍ程度の範囲で蛍光が生じることが望ましい。
【００３５】
一方で、既述の通り、金属膜の極近傍に蛍光色素が存在する場合、金属へのエネルギー移動により消光を起こす。エネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、金属膜と、蛍光色素分子との間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。
蛍光標識として消光防止性蛍光物質Ｆを用いれば、蛍光色素分子は消光防止材料１６で覆われていることから直接金属膜に触れることがなく、金属消光を防止するための既述の膜を設ける複雑な作業を行う必要がない。また、本実施形態では消光防止性蛍光物質中に複数の蛍光色素分子が内包されていることから、金属膜から１０〜２０ｎｍの距離の範囲に複数の蛍光色素分子が存在する状態を容易に達成することができる。
【００３６】
上記構成の表面プラズモン放射光検出装置１を用いた放射光検出方法によるセンシングについて説明する。
まず、センサチップ１０の金属膜１２上に検査対象となる試料Ｓを接触させる。ここでは、一例として、試料Ｓに含まれる被測定物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。金属膜１２上には抗原Ａと特異的に結合する第１の結合物質として１次抗体Ｂ１が修飾されている。試料保持部１３中に試料Ｓが流され、次いで同様に抗原２と特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２が表面に修飾された消光防止性蛍光物質Ｆが流される。この場合、金属膜１２に表面修飾される１次抗体Ｂ１と蛍光標識に表面修飾される２次抗体Ｂ２とは、被検出物質である抗原Ａに対して互いに別の部位に結合するものが用いられる。その後、誘電体プレート１１の所定領域に向けて励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが照射され、また光検出器３０により放射光Ｌｅの検出がなされる。このとき、光検出器３０によって所定の放射光Ｌｅが検出されたなら、上記２次抗体Ｂ２と抗原Ａとの結合、すなわち試料中における抗原Ａの存在を確認できることになる。
【００３７】
なお、被検出物質（抗原Ａ）の標識のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を第１の結合物質（１次抗体Ｂ１）に結合させる前に、予め試料に蛍光標識を添加しておいてもよい。
【００３８】
なお、消光防止性蛍光物質Ｆは、以下のようにして作製することができる。
まず、ポリスチレン粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ社、φ５００ｎｍ、１０％ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、製品番号Ｋ１−０５０）を調液して０．１％ｓｏｌｉｄ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。
次に、蛍光色素（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＥ、製品番号Ｄ２１８４）０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。以上の工程により、金属消光を防止する機能を有するポリスチレンにより蛍光色素を内包してなる消光防止性蛍光物質Ｆを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素を含浸させて作製された消光防止性蛍光物質Ｆの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ５００ｎｍ）となる。
【００３９】
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態の蛍光検出方法および装置２を図２から図４を参照して説明する。ここでは、第１実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
【００４０】
図２に示す蛍光検出装置２は、該蛍光検出装置における蛍光検出方法に使用される本発明の一実施形態の試料セル５０と、試料セル５０の所定領域に励起光Ｌｏを照射させる励起光照射光学系２０と、放射光Ｌｅを検出する光検出器３０とを備えている。
【００４１】
図３（Ａ）は、試料セル５０の構成を示す平面図、同図（Ｂ）は試料セル５０の側断面図である。
試料セル５０は、基台５１と、該基台５１上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、試料Ｓを注入する注入口５４ａおよび排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とを備えている。また、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。なお、本実施形態では、スペーサ５３により構成された流路を上部に有する基台５１は誘電体プレートで構成されており、センサチップ部の誘電体プレートを兼ねている。基台はセンサチップ部となる一部のみ誘電体プレートで構成されたものであってもよい。流路５２の高さｈは例えば、３０μｍ程度である。
【００４２】
試料セル５０の基台５１上には流路５２上流側から、２次抗体Ｂ２が表面修飾された消光防止性蛍光物質Ｆを物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７、１次抗体Ｂ１が固定された第１の測定エリア５８、標識２次抗体と特異的に結合する１次抗体Ｂ０が固定された第２の測定エリア５９が順に設けられている。この第１および第２の測定エリアがセンサチップ部に相当する。なお、図２中においては、試料が注入されて抗体が２次抗体と結合して流れた後の試料セル５０を示しているために標識２次抗体吸着エリア５６はもはや存在していない。
【００４３】
第１の測定エリア５８および第２の測定エリア５９の、基台５１上にはそれぞれ金属膜として、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａが形成されている。第１の測定エリア５８のＡｕ膜５８ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１が固定され、第２の測定エリア５９のＡｕ膜５９ａ上にはさらに１次抗体Ｂ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている以外は第１の測定エリア５８と第２の測定エリア５９は同一の構成である。なお、第２の測定エリア５９に固定されている１次抗体Ｂ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体Ｂ２と直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学系２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｂ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は２次抗体により表面修飾された消光防止性蛍光物質と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる消光防止性蛍光物質であってもよい。さらには金属微粒子などであってもよい。この場合、励起光照射光学系２０、金膜５８ａ、５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に標識２次抗体Ｂ２、既知量の標識物質のどちらを固定するかは、較正目的・方法によって適宜定めればよい。
【００４４】
試料セル５０は、励起光照射光学系２０および検出器３０に相対的にＸ方向に移動可能とされており、第１の測定エリア５７からの蛍光検出測定の後、第２の測定エリア５８を蛍光検出領域に移動させて第２の測定エリア５８からの蛍光検出を行うように構成されている。なお、ここでは測定エリアを２つ有するセンサ部を備えた例を挙げたが、測定エリアは１つのみとしてもよい。
【００４５】
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）からなる光源２１と、誘電体プレート１０に一面が接触するように配置されたプリズム２２とに加え、光源２１から出射された励起光Ｌｏを集光し、プリズム２２の一面から入射させるレンズ２４およびミラー２５からなる導光部材と半導体レーザ光源２１を駆動するドライバ２８とを備えている。
【００４６】
上記構成の表面プラズモン放射光検出装置２を用いた放射光検出方法の原理は第１の実施形態と同様であり、本実施形態においても蛍光標識として消光防止性蛍光物質を用いているから、第１の実施形態の場合と同様の効果を得ることができ、簡易な方法で非常に精度の高い測定を行うことができる。
【００４７】
さらに、この第２の実施形態の表面プラズモン放射光検出装置２および検出方法を利用した、センシングについて説明する。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル６１の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図４を参照して説明する。
【００４８】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓoに被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓoは毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ３：流路５２に染み出した血液Ｓoと標識２次抗体Ｂ２が付与された消光防止性蛍光物質とが混ぜ合わされ、抗原Ａが標識２次抗体Ｂ２と結合する。
ｓｔｅｐ４-５：血液Ｓoは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、標識２次抗体Ｂ２と結合した抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【００４９】
このように、血液を注入口から注入し、抗原が１次抗体と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ５の後、第１の測定エリア５８からの放射光強度を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの放射光を検出できるように試料セル５０をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの放射光強度を検出する。第２の測定エリア５９からの信号は標識２次抗体の流下した量、活性などの反応条件を反映した信号であると考えられ、この信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、既述の通り、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定した場合であっても、同様に、第２の測定エリア５９からの信号をリファレンスとして第１の測定エリアからの信号を補正することができる。
【００５０】
＜第３の実施形態＞
第３の実施形態の表面プラズモン放射光検出方法として、本発明の一実施形態の表面プラズモン放射光検出用キットを用いた方法について図５および６を参照して説明する。図５、６において、上述の試料セルと同一の要素には同一符号を付し、詳細な説明を省略する。
【００５１】
図５（Ａ）は放射光検出用キット６０の試料セル６１の構成を示す平面図、同図（Ｂ）は試料セルの即断面図、同図（Ｃ）は標識用溶液入りアンプル６２を示す図である。
【００５２】
放射光検出用キット６０は、試料セル６１と、表面プラズモン放射光検出測定を行うにあたり、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に、試料セル６１の流路内に流下される、抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質として２次抗体Ｂ２が修飾された消光防止性蛍光物質Ｆを含む標識用溶液６３とを備えている。
【００５３】
試料セル６１は、試料セル内に２次抗体で表面修飾した消光防止性蛍光物質を物理吸着した物理吸着エリアを備えない点でのみ上述の試料セル５０と異なり、その他は試料セル５０と略同一の構成である。
【００５４】
表面プラズモン放射光検出装置としては図２に示した第２の実施形態のものを同様に用いることができ、本実施形態の放射光検出用キット６０を用いれば、第２の実施形態の場合と同様に被検出物質に消光防止性蛍光物質による標識がなされるため、同様に精度の高い測定を行うことができる。
【００５５】
さらに、この放射光検出用キット６０を用いた場合の表面プラズモン放射光検出装置２におけるセンシングについて説明する。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル６１の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図６を参照して説明する。
【００５６】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓo中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓoが毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ３：血液Ｓoは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、血液Ｓo中の抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合する。
ｓｔｅｐ４：２次抗体Ｂ２が修飾された消光防止性蛍光物質Ｆを含む標識用溶液６３を供給口５４ａから注入する。
ｓｔｅｐ５：２次抗体Ｂ２が修飾された消光防止性蛍光物質Ｆが毛細管現象により流路５２に染み出す。
ｓｔｅｐ６：消光防止性蛍光物質Ｆは徐々に下流側に流れ、消光防止性蛍光物質Ｆに修飾されている２次抗体が抗原Ａと結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【００５７】
このように、血液を注入口から注入し、抗原が１次抗体および２次抗体と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８からの放射光強度を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの放射光を検出できるように試料セル６１をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの信号を検出する。第２の測定エリア５９からの信号は標識２次抗体の流下した量、活性などの反応条件を反映した信号であると考えられ、この信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定しておき、第２の測定エリア５９からの信号をリファレンスとして第１の測定エリアからの信号を補正してもよい。
【００５８】
消光防止性蛍光物質への２次抗体修飾方法および標識用溶液の作製方法の一例を説明する。
前述の手順で作製した消光防止性蛍光物質溶液（蛍光物質の直径５００ｎｍ、励起波長５０２ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファーおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより消光防止性蛍光物質への抗体の修飾がなされる。
【００５９】
次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により消光防止性蛍光物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、消光防止性蛍光物質を再分散させて標識用溶液とする。
【００６０】
上述の各実施形態においては励起光Ｌｏとして、界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光としては、図７に模式的に示すような、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームの場合、プリズム１２２とプリズム上の金属膜１１２との界面に対して、角度θ−Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、この角度範囲内に共鳴角があれば、金属膜１１２に表面プラズモンを励起することができる。金属膜上への試料供給の前後において、金属膜上の媒質の屈折率が変化し、そのために表面プラズモンが生じる共鳴角が変化する。上述の実施形態のように平行光を励起光として用いる場合、共鳴角が変化するたびに平行光の入射角度を調整する必要がある。しかし、図７に示すような、界面に入射する入射角度に幅を持たせたファンビームを用いることにより、入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。
【００６１】
また、上記各実施形態においては、全て非競合法であるサンドイッチ法によるアッセイについて説明したが、本発明の蛍光検出方法および装置、試料セルおよび測定キットはサンドイッチ法のみならず、競合法によるアッセイの場合にも適用することができる。
【００６２】
図８を参照して、競合法について簡単に説明する。
図８（Ａ）に示すように、被検出物質（例えば、抗原）Ａと同一の免疫反応を示す第３の結合物質Ｃ３を消光防止性蛍光物質Ｆに修飾させておく。金属膜１２上には、被検出物質Ａおよび第３の結合物質Ｃ３といずれとも特異的に結合する第１の結合物質Ｃ１（例えば、１次抗体）を固定化しておく。第３の結合物質Ｃ３（例えば、２次抗体）が修飾された消光防止性蛍光物質Ｆを所定濃度で、被検出物質Ａと混合し、金属膜１２上に固定化された第１の結合物質Ｃ１に競合的に反応させる（抗原−抗体反応）。抗原と消光防止性蛍光物質との混合時における消光防止性蛍光物質の濃度は既知である。
【００６３】
競合法では、図８（Ｂ）に示すように、被検出物質Ａの濃度が高ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が少なく、すなわち金属膜１２上の消光防止性蛍光物質Ｆの数が少なくなるため蛍光強度が小さくなり、一方、図８（Ｃ）に示すように、被検出物質Ａの濃度が低ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が多く、すなわち金属膜上の消光防止性蛍光物質の数が多くなるため蛍光強度が大きくなる。競合法は被検出物質にエピトープが一つあれば測定が可能であることから、低分子量の物質の検出に適している。
【００６４】
図９は、本発明の他の実施形態の試料セル５０’を用いた競合法によるアッセイ手順を示す図である。試料セル５０’は、第２の実施形態の蛍光検出装置２において、試料セル５０に換えて用いることができる。試料セル５０とは、流路内に備えられている抗体が異なり、本試料セル５０’は競合法によるアッセイに適用されるものである。
【００６５】
試料セル５０’においては、基台５１上には流路５２上流側から、被検出物質である抗原Ａとは結合せず、後述の１次抗体と特異的に結合する２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）が表面修飾された消光防止性蛍光物質Ｆを物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７’、被検出物質である抗原Ａおよび第２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）が固定された第１の測定エリア５８’、被検出物質である抗原Ａとは結合せず標識２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ０が固定された第２の測定エリア５９’が順に設けられている。
【００６６】
試料セル５０’においては、第１の測定エリア５８’のＡｕ膜５８ａ上にさらに１次抗体Ｃ１が固定され、第２の測定エリア５９’のＡｕ膜５９ａ上にさらに１次抗体Ｃ１とは異なる１次抗体Ｃ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は第１の測定エリア５８’と第２の測定エリア５９’は同一の構成である。抗原Ａと標識２次抗体Ｃ３とは、第１の測定エリア５８’に固定されている１次抗体Ｃ１に競合的に結合するものである。第２の測定エリア５９’に固定されている１次抗体Ｃ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体Ｃ３と直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｃ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は２次抗体により表面修飾された消光防止性蛍光物質と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる消光防止性蛍光物質であってもよい。この場合、励起光照射光学２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に標識２次抗体Ｃ２、既知量の標識物質のどちらを固定するかは較正目的・方法によって適宜、選択することができる。
【００６７】
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル５０の注入口から注入し、アッセイを行う手順について説明する。
【００６８】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。
ｓｔｅｐ２：全血液Ｓoは毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ３：流路５２に染み出した血液Ｓ０と標識２次抗体Ｃ３が付与された消光防止性蛍光物質Ｆとが混ぜ合わされ、血液Ｓｏは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れる。
ｓｔｅｐ４−５：抗原Ａと標識２次抗体Ｃ３とが競合して、第１の測定エリア５８’上に固定されている１次抗体Ｃ１と結合する。第１の測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１と結合しなかった標識２次抗体Ｃ３の一部は、第２の測定エリア５９’上に固定されている１次抗体Ｃ０と結合する。
【００６９】
このように、血液を注入口から注入し、測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１に抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３が競合結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ５の後、第１の測定エリア５８’および第２の測定エリア５９’からの放射光強度を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。
【００７０】
本実施形態の試料セルを用いた蛍光検出方法においても蛍光標識として消光防止性蛍光物質を用いているから、上記各実施形態の場合と同様の効果を得ることができ、簡易な方法で精度の高い測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の第１実施形態による表面プラズモン放射光検出装置を示す概略構成図
【図２】本発明の第２実施形態による表面プラズモン放射光検出装置を示す概略構成図
【図３】本発明の１実施形態の試料セルを示す（Ａ）平面図および（Ｂ）側断面図
【図４】本発明の第２実施形態の表面プラズモン放射光検出装置におけるアッセイ手順を示す図
【図５】本発明の１実施形態の蛍光検出用キットの（Ａ）試料セルを示す平面図、（Ｂ）試料セルを示す側断面図および（Ｃ）標識用溶液を示す図
【図６】蛍光検出用キットを用いた場合のアッセイ手順を示す図
【図７】励起光照射光学系の他の例を示す図
【図８】競合法の原理を説明するための模式図
【図９】本発明の他の実施形態の試料セルを用いたアッセイ（競合法）手順を示す図
【符号の説明】
【００７２】
１、２ 表面プラズモン放射光検出装置
１０ センサチップ
１１ 誘電体プレート
１２ 金属膜
１５ 蛍光色素分子
１６ 消光防止材料
２０ 励起光照射光学系
２１ 光源
２２ プリズム
３０ 光検出器
５０、６１ 試料セル
５１ 誘電体プレート
５２ 流路
５３ スペーサ
５４ 上板
５７ 消光防止性蛍光物質吸着エリア
５８、５９ 検出エリア
Ａ 抗原（被検出物質）
Ｂ１ １次抗体（第１の結合物質）
Ｂ２ ２次抗体（第２の結合物質）
Ｆ 消光防止性蛍光物質
Ｌｏ 励起光
Ｌｆ 蛍光
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の特定物質を検出する表面プラズモン放射光検出方法および装置、表面プラズモン放射光検出用試料セルおよびキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって検出対象物質の存在を確認する方法である。また、検出対象物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素分子で標識されて検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００３】
また、このような蛍光検出法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献１などに提案されている。これは、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属膜を設けたセンサチップを備え、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属膜形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射させ、この励起光の照射により金属膜に表面プラズモンが生じ、その電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりＳ／Ｎを向上させるものである。
【０００４】
しかしながら、蛍光信号を発する反応部と光検出器との間には一般に数百μｍ程度の距離があり、医療診断に応用される場合、一般にサンプルは血液や血清あるいは血漿のような体液中に存在する状態で供給されるため、その数百μｍ間に体液等の溶媒が存在することになる。サンプルが血清や血漿であれば、比較的透明で光吸収が少ないため信号の減衰は無視できるが、サンプルとして血液をそのまま使う場合は血液による光吸収のための信号の減衰が大きく検出が十分にできない。
【０００５】
そのため、通常の蛍光測定においては、血液を遠心分離し赤血球などの着色成分を除去したり、血球フィルタを通して血清あるいは血漿状態にしたりするという前処理が行われている。しかしながら、この前処理を行うため手間が掛かると共に、血球フィルタなどの高価な分離フィルタを要するためコスト高となっていた。
【０００６】
一方、特許文献２および非特許文献１には蛍光色素からの蛍光を検出するのではなく、該蛍光が金属膜に新たに表面プラズモンを誘起して生じる放射光をプリズム側から取り出す方法が提案されている。このような、蛍光が新たな表面プラズモンを誘起し、この新たな表面プラズモンから生じる放射光（SPCE: Surface Plasmon-Coupled Emission)を利用する検出方法を医療診断に応用すれば、蛍光が溶媒を通過する距離は数十ｎｍ程度とすることができるため、血液における光吸収をほぼ無視することができ、血液に前述の前処理を行うことなく測定が可能となる。
【０００７】
ところが、表面プラズモン増強蛍光検出装置においては、非特許文献１に示されているように、試料中の蛍光色素と金属膜とが接近し過ぎていると、蛍光色素内で励起されたエネルギーが蛍光を発生させる前に金属膜へ遷移してしまい、蛍光が生じないという現象（いわゆる金属消光）が起こり得る。
【０００８】
そこで、非特許文献２では、金属膜上にカルボキシメチルデキストラン(ＣＭＤ)膜を作製して距離を離す方法が提案されている。
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００５３９７４号明細書
【非特許文献１】Thorsten Liebermann Wolfgang Knoll, "Surface-plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy" Colloids and Surfaces A 171(2000)115-130
【非特許文献２】W.Knoll他、Analytical Chemistry（Anal.Chem.）76(2004) p.6765
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、金属膜上にＣＭＤ膜を形成する場合、金膜上にＳＡＭ（自己組織化膜）を付けてからさらにＣＭＤ膜を作製する必要があることから、金属消光を防止するための手立てに時間がかかり、またセンサ部の製造工程が複雑なものとなり実用的でないという問題がある。
【００１０】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、センサ部の製造工程を複雑化させることなく、高い感度で表面プラズモン放射光を検出することができる検出方法および装置を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、表面プラズモン放射光検出方法に用いられる試料セルおよびキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の表面プラズモン放射光検出方法は、誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属膜を備えたセンサチップを用意し、
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に、前記誘電体プレートの前記一面とは反対の面から全反射条件で励起光を照射して前記金属膜に表面プラズモンを誘起し、
前記表面プラズモンに起因して前記金属膜上に生じる電場増強場内において、前記試料に含まれる被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識から生じる蛍光が、前記金属膜に新たに表面プラズモンを誘起し、前記誘電体プレートの前記反対の面から出射される、前記新たに誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法において、
前記蛍光標識として、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質を用いたことを特徴とする。
【００１３】
なお、ここで「蛍光標識物質」は蛍光標識が付与された被検出物質であってもよいし、被検出物質と競合する、蛍光標識が付与された競合物質であってもよい。一般に、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には被検出物質に蛍光標識が付与され、競合法によるアッセイを行う場合には被検出物質と競合する競合物質に蛍光標識が付与される。本発明の蛍光検出方法は、サンドイッチ法、競合法のいずれの方法によるアッセイにも対応可能である。
【００１４】
また、消光防止性蛍光物質の消光防止材料に含まれる蛍光色素分子の数は１個でもよいが、複数であることがより好ましい。なお、消光防止性蛍光物質が複数の蛍光色素分子を備えるものである場合には、少なくとも１つの蛍光色素分子が金属消光を防止する材料に包まれていればよく、他の蛍光色素分子の一部が消光防止材料の外部に露出していてもよい。
【００１５】
本発明の表面プラズモン放射光検出装置は、誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属膜を備えたセンサチップと、
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に、前記誘電体プレートの前記試料保持面とは反対の面から、前記金属膜において表面プラズモン共鳴を生じる全反射条件で励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記金属膜に試料を接触させた状態の前記センサチップへの、前記励起光の照射により生じた電場増強場内において、前記試料に含まれる被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識から生じる蛍光が、前記金属膜に新たに表面プラズモンを誘起し、前記誘電体プレートの前記反対の面から出射される、前記新たに誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出手段とを備え、
前記蛍光標識が、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質であることを特徴とする。
【００１６】
本発明の表面プラズモン放射光検出用試料セルは、被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識からの蛍光により誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法に使用される試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記流路の前記注入口と前記空気孔との間の壁面の少なくとも一部に設けられた、所定の光を透過する誘電体プレート、および該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属膜からなるセンサチップ部と、
前記金属膜上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質と、
前記流路内の前記センサチップ部より上流側に固定されてなる、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質とを備えてなることを特徴とする。
【００１７】
なお、本発明の試料セルは第２の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を備えている場合には、サンドイッチ法によるアッセイ、第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を備えている場合には競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００１８】
本発明の表面プラズモン放射光検出用キットは、被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識からの蛍光により誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法に使用される表面プラズモン放射光検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記流路の前記注入口と前記空気孔との間の壁面の少なくとも一部に設けられた、所定の光を透過する誘電体プレート、および該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属膜からなるセンサチップ部と、前記金属膜上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質とを備えた試料セル、および
表面プラズモン放射光検出測定を行うにあたり、前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下するための、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を含む標識用溶液を備えたことを特徴とする。
【００１９】
なお、本発明の蛍光検出用キットは、標識用溶液に第２の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を備えている場合には、サンドイッチ法によるアッセイ、第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を備えている場合には競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００２０】
なお、上記において、試料セルに備えられた消光防止性蛍光物質は、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなるものである。なお、消光防止性蛍光物質の消光防止材料に含まれる蛍光色素分子の数は１個でもよいが、複数であることがより好ましい。なお、消光防止性蛍光物質が複数の蛍光色素分子を備えるものである場合には、少なくとも１つの蛍光色素分子が消光防止材料に包まれていればよく、他の蛍光色素分子の一部が消光防止材料の外部に露出していてもよい。
【００２１】
前記消光防止性蛍光物質の粒径は、５３００ｎｍ以下であることが好ましく、７０ｎｍ〜９００ｎｍであることがさらに好ましく、さらには１３０ｎｍ〜５００ｎｍであることが特に好ましい。なお、本明細書において、消光防止性蛍光物質の粒径は、その形状が略球状の粒子である場合にはその直径であり、球状でない粒子の場合にはその最大幅と最小幅の平均の長さで定義するものとする。
【００２２】
また、誘電体プレートに設けられる前記金属膜は、励起光の照射により表面プラズモンを生じさせるものであればよく、金属薄膜により構成されていてもよいし、回折格子のように周期状の凹凸表面を有する金属微細構造体により構成されていてもよい。その材料としては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とすることが望ましい。なおここで、「主成分」は、含量９０質量％以上の成分と定義する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の表面プラズモン放射光検出方法および装置は、蛍光標識として、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる、消光防止性蛍光物質を用いているため、金属膜上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜と蛍光色素分子との距離をある程度離間させることができる。従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、センサ部の製造工程を複雑化させることなく、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して信号を検出することができる。
【００２４】
本発明の表面プラズモン放射光検出用試料セルは、流路内の、センサチップ部より上流側に固定された、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または第１の結合物質と特異的に結合すると共に被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を備えており、消光防止性蛍光物質は、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなるものであることから、金属膜上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜と蛍光色素分子との距離をある程度離間させることができる。従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、センサ部の製造工程を複雑化させることなく、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して信号を検出することができる。
【００２５】
本発明の表面プラズモン放射光検出用キットは、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に、流路内に流下される、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質または第１の結合物質と特異的に結合すると共に被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を含む標識用溶液を備えており、消光防止性蛍光物質は、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなるものであるから、金属膜上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜と蛍光色素分子との距離をある程度離間させることができる。従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、センサ部の製造工程を複雑化させることなく、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して信号を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
＜第１の実施形態＞
図面を参照して、本発明の第１実施形態に係る表面プラズモン放射光検出方法およびそれに用いられる装置について説明する。図１は装置の全体図である。各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【００２７】
図１に示す表面プラズモン放射光検出装置１は、誘電体プレート１１と、その一面の所定領域に設けられた金属膜１２とを備えたセンサチップ１０、励起光Ｌｏを誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で全反射条件となる入射角度で、センサチップ１０の金属膜形成面とは反対の面側から励起光Ｌｏを照射する励起光照射光学系２０と、金属膜１２に接触している試料中に蛍光標識が付与された被検出物質が存在する場合に、該蛍光標識が付与された被検出物質（実質的には蛍光標識Ｆ）から生じる蛍光Ｌｆが金属膜１２に新たに表面プラズモンを誘起し、この新たに誘起された表面プラズモンからの放射光Ｌｅ（以下、単に放射光Ｌｅという）を検出する光検出器３０とを備えている。光検出器３０は、誘電体プレート１１の励起光が入射する面と同じ面からの放射光Ｌｅを検出するように配置されている。光検出器３０としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳ等を適宜用いることができる。
【００２８】
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、誘電体プレート１１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とを備えている。プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌｏが全反射するように誘電体プレート１１内に励起光Ｌｏを導光するものである。なお、プリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。光源２１は、プリズム２２の他の一面からセンサチップ１０の試料接触面１０ａで励起光Ｌｏが全反射角以上で、かつ金属膜で表面プラズモン共鳴を生じさせる特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。なお、励起光Ｌｏは、表面プラズモンを誘起するようにｐ偏光で界面に対して入射される。
なお、本実施形態においては、センサチップ１０上に液体試料Ｓを保持する試料保持部１３が備えられ、センサチップ１０と試料保持部１３により液体試料を保持可能な箱状セルが構成されている。
【００２９】
センサチップ１０は、ガラス板などの誘電体プレート１１の一表面の所定領域に金属膜１２が成膜されたものである。金属膜１２は、所定領域に開口を有するマスクをプレート１１の一表面に形成し、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１２の厚みは、金属膜１２の材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、励起光として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００３０】
表面プラズモン放射光検出装置の放射光検出の原理について説明する。
励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント波Ｅｗが滲み出し、このエバネッセント波Ｅｗによって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜１２表面に電界分布が生じ、電場増強領域が形成される。このとき、エバネッセント波Ｅｗの滲み出し領域において蛍光標識Ｆが存在する場合、その蛍光標識Ｆが励起されて蛍光が発生する。このとき、エバネッセント波の染み出し領域とほぼ同等の領域に存在する表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。なお、エバネッセント波Ｅｗの滲み出し領域外の蛍光標識Ｆは励起されず蛍光を発しない。金属膜１２上で生じた蛍光Ｌｆが、金属膜の表面プラズモンを新たに励起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属膜形成面と反対側のプリズム２２から特定の角度で放射光Ｌｅが射出される。光検出器３０は、蛍光標識Ｆから生じた蛍光が金属膜の表面プラズモンを新たに誘起し、この新たに誘起された表面プラズモンから生じるこの放射光Ｌｅを検出する。放射光Ｌｅは蛍光が金属膜の特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光の波長に応じてその結合する波数は定まり、その波数に応じて放射光の出射角度が定まる。通常励起光Ｌｏの波長と蛍光の波長とは異なることから、する表面プラズモンは、励起光Ｌｏにより生じた表面プラズモンとは異なる波数のものとなり、励起光Ｌｏの入射角度とは異なる角度で放射光Ｌｅは射出される。
【００３１】
本実施形態の表面プラズモン放射光検出方法では、被検出物質Ａに、蛍光標識として消光防止性蛍光物質Ｆを付与してセンシングを行う。消光防止性蛍光物質Ｆは、蛍光色素分子１５と、該蛍光色素分子１５を内包する、該蛍光色素分子１５から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料１６とからなる。消光防止性蛍光物質Ｆは蛍光色素分子が消光防止材料で覆われているものであるため、金属膜上に金属消光防止のための膜を設けなくても、金属膜と蛍光色素分子との距離をある程度離間させることができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止することができる。
【００３２】
また、ここでは、消光防止性蛍光物質Ｆは複数の蛍光色素分子１５を内包するものであり、従来の蛍光色素分子１５自体を標識として用いる場合と比較すると、発光する蛍光量を大幅に増加することができる。
【００３３】
なお、消光防止性蛍光物質Ｆは粒径が、５３００ｎｍ以下であることが好ましく、７０ｎｍ〜９００ｎｍであることがさらに好ましく、さらには１３０ｎｍ〜５００ｎｍであることが特に好ましい。消光防止材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられるが、蛍光色素分子１５を内包でき、かつ、該蛍光色素分子１５からの蛍光を透過した外部に放出でき、蛍光色素分子１５の金属消光を防止できるものであれば特に制限されない。
【００３４】
蛍光により金属膜の表面プラズモンを励起させるためには、金属膜表面から５ｎｍ〜２０ｎｍ程度の範囲で蛍光が生じることが望ましい。
【００３５】
一方で、既述の通り、金属膜の極近傍に蛍光色素が存在する場合、金属へのエネルギー移動により消光を起こす。エネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、金属膜と、蛍光色素分子との間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。
蛍光標識として消光防止性蛍光物質Ｆを用いれば、蛍光色素分子は消光防止材料１６で覆われていることから直接金属膜に触れることがなく、金属消光を防止するための既述の膜を設ける複雑な作業を行う必要がない。また、本実施形態では消光防止性蛍光物質中に複数の蛍光色素分子が内包されていることから、金属膜から１０〜２０ｎｍの距離の範囲に複数の蛍光色素分子が存在する状態を容易に達成することができる。
【００３６】
上記構成の表面プラズモン放射光検出装置１を用いた放射光検出方法によるセンシングについて説明する。
まず、センサチップ１０の金属膜１２上に検査対象となる試料Ｓを接触させる。ここでは、一例として、試料Ｓに含まれる被測定物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。金属膜１２上には抗原Ａと特異的に結合する第１の結合物質として１次抗体Ｂ１が修飾されている。試料保持部１３中に試料Ｓが流され、次いで同様に抗原２と特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２が表面に修飾された消光防止性蛍光物質Ｆが流される。この場合、金属膜１２に表面修飾される１次抗体Ｂ１と蛍光標識に表面修飾される２次抗体Ｂ２とは、被検出物質である抗原Ａに対して互いに別の部位に結合するものが用いられる。その後、誘電体プレート１１の所定領域に向けて励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが照射され、また光検出器３０により放射光Ｌｅの検出がなされる。このとき、光検出器３０によって所定の放射光Ｌｅが検出されたなら、上記２次抗体Ｂ２と抗原Ａとの結合、すなわち試料中における抗原Ａの存在を確認できることになる。
【００３７】
なお、被検出物質（抗原Ａ）の標識のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を第１の結合物質（１次抗体Ｂ１）に結合させる前に、予め試料に蛍光標識を添加しておいてもよい。
【００３８】
なお、消光防止性蛍光物質Ｆは、以下のようにして作製することができる。
まず、ポリスチレン粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ社、φ５００ｎｍ、１０％ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、製品番号Ｋ１−０５０）を調液して０．１％ｓｏｌｉｄ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。
次に、蛍光色素（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＥ、製品番号Ｄ２１８４）０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。以上の工程により、金属消光を防止する機能を有するポリスチレンにより蛍光色素を内包してなる消光防止性蛍光物質Ｆを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素を含浸させて作製された消光防止性蛍光物質Ｆの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ５００ｎｍ）となる。
【００３９】
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態の蛍光検出方法および装置２を図２から図４を参照して説明する。ここでは、第１実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
【００４０】
図２に示す蛍光検出装置２は、該蛍光検出装置における蛍光検出方法に使用される本発明の一実施形態の試料セル５０と、試料セル５０の所定領域に励起光Ｌｏを照射させる励起光照射光学系２０と、放射光Ｌｅを検出する光検出器３０とを備えている。
【００４１】
図３（Ａ）は、試料セル５０の構成を示す平面図、同図（Ｂ）は試料セル５０の側断面図である。
試料セル５０は、基台５１と、該基台５１上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、試料Ｓを注入する注入口５４ａおよび排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とを備えている。また、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。なお、本実施形態では、スペーサ５３により構成された流路を上部に有する基台５１は誘電体プレートで構成されており、センサチップ部の誘電体プレートを兼ねている。基台はセンサチップ部となる一部のみ誘電体プレートで構成されたものであってもよい。流路５２の高さｈは例えば、３０μｍ程度である。
【００４２】
試料セル５０の基台５１上には流路５２上流側から、２次抗体Ｂ２が表面修飾された消光防止性蛍光物質Ｆを物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７、１次抗体Ｂ１が固定された第１の測定エリア５８、標識２次抗体と特異的に結合する１次抗体Ｂ０が固定された第２の測定エリア５９が順に設けられている。この第１および第２の測定エリアがセンサチップ部に相当する。なお、図２中においては、試料が注入されて抗体が２次抗体と結合して流れた後の試料セル５０を示しているために標識２次抗体吸着エリア５６はもはや存在していない。
【００４３】
第１の測定エリア５８および第２の測定エリア５９の、基台５１上にはそれぞれ金属膜として、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａが形成されている。第１の測定エリア５８のＡｕ膜５８ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１が固定され、第２の測定エリア５９のＡｕ膜５９ａ上にはさらに１次抗体Ｂ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている以外は第１の測定エリア５８と第２の測定エリア５９は同一の構成である。なお、第２の測定エリア５９に固定されている１次抗体Ｂ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体Ｂ２と直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学系２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｂ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は２次抗体により表面修飾された消光防止性蛍光物質と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる消光防止性蛍光物質であってもよい。さらには金属微粒子などであってもよい。この場合、励起光照射光学系２０、金膜５８ａ、５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に標識２次抗体Ｂ２、既知量の標識物質のどちらを固定するかは、較正目的・方法によって適宜定めればよい。
【００４４】
試料セル５０は、励起光照射光学系２０および検出器３０に相対的にＸ方向に移動可能とされており、第１の測定エリア５７からの蛍光検出測定の後、第２の測定エリア５８を蛍光検出領域に移動させて第２の測定エリア５８からの蛍光検出を行うように構成されている。なお、ここでは測定エリアを２つ有するセンサ部を備えた例を挙げたが、測定エリアは１つのみとしてもよい。
【００４５】
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）からなる光源２１と、誘電体プレート１０に一面が接触するように配置されたプリズム２２とに加え、光源２１から出射された励起光Ｌｏを集光し、プリズム２２の一面から入射させるレンズ２４およびミラー２５からなる導光部材と半導体レーザ光源２１を駆動するドライバ２８とを備えている。
【００４６】
上記構成の表面プラズモン放射光検出装置２を用いた放射光検出方法の原理は第１の実施形態と同様であり、本実施形態においても蛍光標識として消光防止性蛍光物質を用いているから、第１の実施形態の場合と同様の効果を得ることができ、簡易な方法で非常に精度の高い測定を行うことができる。
【００４７】
さらに、この第２の実施形態の表面プラズモン放射光検出装置２および検出方法を利用した、センシングについて説明する。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル６１の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図４を参照して説明する。
【００４８】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓoに被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓoは毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ３：流路５２に染み出した血液Ｓoと標識２次抗体Ｂ２が付与された消光防止性蛍光物質とが混ぜ合わされ、抗原Ａが標識２次抗体Ｂ２と結合する。
ｓｔｅｐ４-５：血液Ｓoは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、標識２次抗体Ｂ２と結合した抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【００４９】
このように、血液を注入口から注入し、抗原が１次抗体と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ５の後、第１の測定エリア５８からの放射光強度を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの放射光を検出できるように試料セル５０をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの放射光強度を検出する。第２の測定エリア５９からの信号は標識２次抗体の流下した量、活性などの反応条件を反映した信号であると考えられ、この信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、既述の通り、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定した場合であっても、同様に、第２の測定エリア５９からの信号をリファレンスとして第１の測定エリアからの信号を補正することができる。
【００５０】
＜第３の実施形態＞
第３の実施形態の表面プラズモン放射光検出方法として、本発明の一実施形態の表面プラズモン放射光検出用キットを用いた方法について図５および６を参照して説明する。図５、６において、上述の試料セルと同一の要素には同一符号を付し、詳細な説明を省略する。
【００５１】
図５（Ａ）は放射光検出用キット６０の試料セル６１の構成を示す平面図、同図（Ｂ）は試料セルの即断面図、同図（Ｃ）は標識用溶液入りアンプル６２を示す図である。
【００５２】
放射光検出用キット６０は、試料セル６１と、表面プラズモン放射光検出測定を行うにあたり、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に、試料セル６１の流路内に流下される、抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質として２次抗体Ｂ２が修飾された消光防止性蛍光物質Ｆを含む標識用溶液６３とを備えている。
【００５３】
試料セル６１は、試料セル内に２次抗体で表面修飾した消光防止性蛍光物質を物理吸着した物理吸着エリアを備えない点でのみ上述の試料セル５０と異なり、その他は試料セル５０と略同一の構成である。
【００５４】
表面プラズモン放射光検出装置としては図２に示した第２の実施形態のものを同様に用いることができ、本実施形態の放射光検出用キット６０を用いれば、第２の実施形態の場合と同様に被検出物質に消光防止性蛍光物質による標識がなされるため、同様に精度の高い測定を行うことができる。
【００５５】
さらに、この放射光検出用キット６０を用いた場合の表面プラズモン放射光検出装置２におけるセンシングについて説明する。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル６１の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図６を参照して説明する。
【００５６】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓo中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓoが毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ３：血液Ｓoは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、血液Ｓo中の抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合する。
ｓｔｅｐ４：２次抗体Ｂ２が修飾された消光防止性蛍光物質Ｆを含む標識用溶液６３を供給口５４ａから注入する。
ｓｔｅｐ５：２次抗体Ｂ２が修飾された消光防止性蛍光物質Ｆが毛細管現象により流路５２に染み出す。
ｓｔｅｐ６：消光防止性蛍光物質Ｆは徐々に下流側に流れ、消光防止性蛍光物質Ｆに修飾されている２次抗体が抗原Ａと結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【００５７】
このように、血液を注入口から注入し、抗原が１次抗体および２次抗体と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８からの放射光強度を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの放射光を検出できるように試料セル６１をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの信号を検出する。第２の測定エリア５９からの信号は標識２次抗体の流下した量、活性などの反応条件を反映した信号であると考えられ、この信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定しておき、第２の測定エリア５９からの信号をリファレンスとして第１の測定エリアからの信号を補正してもよい。
【００５８】
消光防止性蛍光物質への２次抗体修飾方法および標識用溶液の作製方法の一例を説明する。
前述の手順で作製した消光防止性蛍光物質溶液（蛍光物質の直径５００ｎｍ、励起波長５０２ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファーおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより消光防止性蛍光物質への抗体の修飾がなされる。
【００５９】
次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により消光防止性蛍光物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、消光防止性蛍光物質を再分散させて標識用溶液とする。
【００６０】
上述の各実施形態においては励起光Ｌｏとして、界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光としては、図７に模式的に示すような、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームの場合、プリズム１２２とプリズム上の金属膜１１２との界面に対して、角度θ−Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、この角度範囲内に共鳴角があれば、金属膜１１２に表面プラズモンを励起することができる。金属膜上への試料供給の前後において、金属膜上の媒質の屈折率が変化し、そのために表面プラズモンが生じる共鳴角が変化する。上述の実施形態のように平行光を励起光として用いる場合、共鳴角が変化するたびに平行光の入射角度を調整する必要がある。しかし、図７に示すような、界面に入射する入射角度に幅を持たせたファンビームを用いることにより、入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。
【００６１】
また、上記各実施形態においては、全て非競合法であるサンドイッチ法によるアッセイについて説明したが、本発明の蛍光検出方法および装置、試料セルおよび測定キットはサンドイッチ法のみならず、競合法によるアッセイの場合にも適用することができる。
【００６２】
図８を参照して、競合法について簡単に説明する。
図８（Ａ）に示すように、被検出物質（例えば、抗原）Ａと同一の免疫反応を示す第３の結合物質Ｃ３を消光防止性蛍光物質Ｆに修飾させておく。金属膜１２上には、被検出物質Ａおよび第３の結合物質Ｃ３といずれとも特異的に結合する第１の結合物質Ｃ１（例えば、１次抗体）を固定化しておく。第３の結合物質Ｃ３（例えば、２次抗体）が修飾された消光防止性蛍光物質Ｆを所定濃度で、被検出物質Ａと混合し、金属膜１２上に固定化された第１の結合物質Ｃ１に競合的に反応させる（抗原−抗体反応）。抗原と消光防止性蛍光物質との混合時における消光防止性蛍光物質の濃度は既知である。
【００６３】
競合法では、図８（Ｂ）に示すように、被検出物質Ａの濃度が高ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が少なく、すなわち金属膜１２上の消光防止性蛍光物質Ｆの数が少なくなるため蛍光強度が小さくなり、一方、図８（Ｃ）に示すように、被検出物質Ａの濃度が低ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が多く、すなわち金属膜上の消光防止性蛍光物質の数が多くなるため蛍光強度が大きくなる。競合法は被検出物質にエピトープが一つあれば測定が可能であることから、低分子量の物質の検出に適している。
【００６４】
図９は、本発明の他の実施形態の試料セル５０’を用いた競合法によるアッセイ手順を示す図である。試料セル５０’は、第２の実施形態の蛍光検出装置２において、試料セル５０に換えて用いることができる。試料セル５０とは、流路内に備えられている抗体が異なり、本試料セル５０’は競合法によるアッセイに適用されるものである。
【００６５】
試料セル５０’においては、基台５１上には流路５２上流側から、被検出物質である抗原Ａとは結合せず、後述の１次抗体と特異的に結合する２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）が表面修飾された消光防止性蛍光物質Ｆを物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７’、被検出物質である抗原Ａおよび第２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）が固定された第１の測定エリア５８’、被検出物質である抗原Ａとは結合せず標識２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ０が固定された第２の測定エリア５９’が順に設けられている。
【００６６】
試料セル５０’においては、第１の測定エリア５８’のＡｕ膜５８ａ上にさらに１次抗体Ｃ１が固定され、第２の測定エリア５９’のＡｕ膜５９ａ上にさらに１次抗体Ｃ１とは異なる１次抗体Ｃ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は第１の測定エリア５８’と第２の測定エリア５９’は同一の構成である。抗原Ａと標識２次抗体Ｃ３とは、第１の測定エリア５８’に固定されている１次抗体Ｃ１に競合的に結合するものである。第２の測定エリア５９’に固定されている１次抗体Ｃ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体Ｃ３と直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｃ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は２次抗体により表面修飾された消光防止性蛍光物質と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる消光防止性蛍光物質であってもよい。この場合、励起光照射光学２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に標識２次抗体Ｃ２、既知量の標識物質のどちらを固定するかは較正目的・方法によって適宜、選択することができる。
【００６７】
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液（全血）を試料セル５０の注入口から注入し、アッセイを行う手順について説明する。
【００６８】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓoを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原が含まれている場合について説明する。
ｓｔｅｐ２：全血液Ｓoは毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ３：流路５２に染み出した血液Ｓ０と標識２次抗体Ｃ３が付与された消光防止性蛍光物質Ｆとが混ぜ合わされ、血液Ｓｏは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れる。
ｓｔｅｐ４−５：抗原Ａと標識２次抗体Ｃ３とが競合して、第１の測定エリア５８’上に固定されている１次抗体Ｃ１と結合する。第１の測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１と結合しなかった標識２次抗体Ｃ３の一部は、第２の測定エリア５９’上に固定されている１次抗体Ｃ０と結合する。
【００６９】
このように、血液を注入口から注入し、測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１に抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３が競合結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ５の後、第１の測定エリア５８’および第２の測定エリア５９’からの放射光強度を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。
【００７０】
本実施形態の試料セルを用いた蛍光検出方法においても蛍光標識として消光防止性蛍光物質を用いているから、上記各実施形態の場合と同様の効果を得ることができ、簡易な方法で精度の高い測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の第１実施形態による表面プラズモン放射光検出装置を示す概略構成図
【図２】本発明の第２実施形態による表面プラズモン放射光検出装置を示す概略構成図
【図３】本発明の１実施形態の試料セルを示す（Ａ）平面図および（Ｂ）側断面図
【図４】本発明の第２実施形態の表面プラズモン放射光検出装置におけるアッセイ手順を示す図
【図５】本発明の１実施形態の蛍光検出用キットの（Ａ）試料セルを示す平面図、（Ｂ）試料セルを示す側断面図および（Ｃ）標識用溶液を示す図
【図６】蛍光検出用キットを用いた場合のアッセイ手順を示す図
【図７】励起光照射光学系の他の例を示す図
【図８】競合法の原理を説明するための模式図
【図９】本発明の他の実施形態の試料セルを用いたアッセイ（競合法）手順を示す図
【符号の説明】
【００７２】
１、２ 表面プラズモン放射光検出装置
１０ センサチップ
１１ 誘電体プレート
１２ 金属膜
１５ 蛍光色素分子
１６ 消光防止材料
２０ 励起光照射光学系
２１ 光源
２２ プリズム
３０ 光検出器
５０、６１ 試料セル
５１ 誘電体プレート
５２ 流路
５３ スペーサ
５４ 上板
５７ 消光防止性蛍光物質吸着エリア
５８、５９ 検出エリア
Ａ 抗原（被検出物質）
Ｂ１ １次抗体（第１の結合物質）
Ｂ２ ２次抗体（第２の結合物質）
Ｆ 消光防止性蛍光物質
Ｌｏ 励起光
Ｌｆ 蛍光
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属膜を備えたセンサチップを用意し、
該センサチップの前記金属膜に試料を接触させた状態で、前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に、前記誘電体プレートの前記一面とは反対の面から全反射条件で励起光を照射して前記金属膜に表面プラズモンを誘起し、
前記表面プラズモンに起因して前記金属膜上に生じる電場増強場内において、前記試料に含まれる被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識から生じる蛍光が前記金属膜に新たに表面プラズモンを誘起し、前記誘電体プレートの前記反対の面から出射される、前記新たに誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法において、
前記蛍光標識として、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質を用いたことを特徴とする表面プラズモン放射光検出方法。
【請求項２】
誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属膜を備えたセンサチップと、
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に、前記誘電体プレートの前記試料保持面とは反対の面から、前記金属膜において表面プラズモン共鳴を生じる全反射条件で励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記金属膜に試料を接触させた状態の前記センサチップへの、前記励起光の照射により生じた電場増強場内において、前記試料に含まれる被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識から生じる蛍光が、前記金属膜に新たに表面プラズモンを誘起し、前記誘電体プレートの前記反対の面から出射される、前記新たに誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出手段とを備え、
前記蛍光標識が、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質であることを特徴とする表面プラズモン放射光検出装置。
【請求項３】
被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識からの蛍光により誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法に使用される試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記流路の前記注入口と前記空気孔との間の壁面の少なくとも一部に設けられた、所定の光を透過する誘電体プレート、および該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属膜からなるセンサチップ部と、
前記金属膜上に固定されてなる、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質と、
前記流路内の前記センサチップ部より上流側に固定されてなる、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質とを備えてなることを特徴とする表面プラズモン放射光検出用試料セル。
【請求項４】
被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識からの蛍光により誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法に使用される表面プラズモン放射光検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記流路の前記注入口と前記空気孔との間の壁面の少なくとも一部に設けられた、所定の光を透過する誘電体プレート、および該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属膜からなるセンサチップ部と、前記金属膜上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質とを備えた試料セル、および
表面プラズモン放射光検出測定を行うにあたり、前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下するための、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を含む標識用溶液を備えたことを特徴とする表面プラズモン放射光検出用キット。
【請求項１】
誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属膜を備えたセンサチップを用意し、
該センサチップの前記金属膜に試料を接触させた状態で、前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に、前記誘電体プレートの前記一面とは反対の面から全反射条件で励起光を照射して前記金属膜に表面プラズモンを誘起し、
前記表面プラズモンに起因して前記金属膜上に生じる電場増強場内において、前記試料に含まれる被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識から生じる蛍光が前記金属膜に新たに表面プラズモンを誘起し、前記誘電体プレートの前記反対の面から出射される、前記新たに誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法において、
前記蛍光標識として、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質を用いたことを特徴とする表面プラズモン放射光検出方法。
【請求項２】
誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属膜を備えたセンサチップと、
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に、前記誘電体プレートの前記試料保持面とは反対の面から、前記金属膜において表面プラズモン共鳴を生じる全反射条件で励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記金属膜に試料を接触させた状態の前記センサチップへの、前記励起光の照射により生じた電場増強場内において、前記試料に含まれる被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識から生じる蛍光が、前記金属膜に新たに表面プラズモンを誘起し、前記誘電体プレートの前記反対の面から出射される、前記新たに誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出手段とを備え、
前記蛍光標識が、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質であることを特徴とする表面プラズモン放射光検出装置。
【請求項３】
被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識からの蛍光により誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法に使用される試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記流路の前記注入口と前記空気孔との間の壁面の少なくとも一部に設けられた、所定の光を透過する誘電体プレート、および該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属膜からなるセンサチップ部と、
前記金属膜上に固定されてなる、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質と、
前記流路内の前記センサチップ部より上流側に固定されてなる、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質とを備えてなることを特徴とする表面プラズモン放射光検出用試料セル。
【請求項４】
被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識からの蛍光により誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法に使用される表面プラズモン放射光検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記流路の前記注入口と前記空気孔との間の壁面の少なくとも一部に設けられた、所定の光を透過する誘電体プレート、および該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属膜からなるセンサチップ部と、前記金属膜上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質とを備えた試料セル、および
表面プラズモン放射光検出測定を行うにあたり、前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下するための、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、または前記第１の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第３の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を含む標識用溶液を備えたことを特徴とする表面プラズモン放射光検出用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００９−２５８０３４（Ｐ２００９−２５８０３４Ａ）
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１０９７９２（Ｐ２００８−１０９７９２）
【出願日】平成２０年４月２１日（２００８．４．２１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２１日（２００８．４．２１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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