装置

【課題】よりコミットした細胞を未分化細胞に逆分化させる手段を有する、未分化細胞を調製する装置を提供する。
【解決手段】チャンバー６と、コミットした細胞を含む細胞集団を該チャンバーに導入する手段７と、コミットした細胞を未分化細胞に逆分化させることができる逆分化手段を前記チャンバーに導入する手段１０，１１と、コミットした細胞が未分化細胞に逆分化するように、コミットした前記細胞を前記逆分化手段の存在下でインキュベーションするインキュベーション手段とを有する、コミットした細胞を含む細胞集団中で未分化細胞を形成する及び／又は該未分化細胞の相対数を増加させる装置１。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、装置に関する。より詳しくは、本発明は未分化細胞を調製する装置に関する。限定されるわけではないが特に、本発明は、よりコミットした細胞から未分化細胞を調整する装置に関する。別の側面において、本発明は、未分化細胞を形成する方法にも関する。前記装置は、例えば遠隔で新規試薬を注文するために、及び／又は操作が正しく行われていることや行われていたことを確認するために、生産業者、流通業者、製造会社、コールセンター、サービスセンターなどとの遠隔地間での情報伝達を可能にする。よって本発明は、例えば生産業者，流通業者，製造業社，コールセンター，サービスセンターなどと遠隔で情報伝達し、生産業者，流通業者，製造業社，コールセンター，サービスセンターなどが、かかる情報伝達に対して応答するなどの（例えば、注文を受領して該注文に応じることや、操作及び／又は操作の適正さに関するデータを受領し，及び／又は前記データや情報を処理し，及び／又は前記データや情報に対して応答する）、前記装置が関わるビジネスを行う方法及び前記装置の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
分化は、未成熟造血前駆体からＴ細胞やＢ細胞が形成されるなど細胞の構造や機能が徐々にコミットすることで、より特化した細胞が生じる過程である。したがって、細胞がコミットするにつれて、該細胞はより特異的となる。多くの哺乳類細胞タイプにおいて、細胞分化は、最終段階において最終分化した細胞（ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｃｅｌｌ）になるという一方向のプロセスである。生存中に分裂することも代替されることもなく存続しつづける細胞型もあるが、細胞型の多くは、生物体の生存中に分裂や再生を行い続ける。前記プロセスは、単純分裂（例えば肝細胞）によるものであってよいし、娘細胞の１つが、造血細胞や上皮細胞などの場合のように比較的未分化な幹細胞が分裂した後、その後不可逆的分化となるプログラムにコミットすることによるものであってもよい。しかし、かかるプロセスは全て、共通の特徴を有する。すなわち細胞は、分化状態を維持する又はさらに分化するかのいずれかに限られている。細胞が未分化となったり、分化程度が低くなる（ｌｅｓｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）ことはない。
【０００３】
逆分化とは、細胞の構造及び機能が漸進的に変化して、より特定化されていない細胞を生じさせるプロセスである。細胞によっては、組織損傷に応答してインビトロで限定的な逆性分化（逆分化）が自然に行われるものもある。例えば、肝細胞が肝臓再生プロセス時に胎児の酵素パターンに似た酵素発現パターンを示すことが、これまでに観察されている（ＣｕｒｔｉｎａｎｄＳｎｅｌｌ，１９８３，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．４８；４９５−５０５）。
【０００４】
ＷＯ９６／２３８７０では、分化細胞を細胞が幹細胞などの未分化細胞になるように処理することが可能であったことが示されている。かかる未分化細胞は、増殖して同系譜又は他系譜の再分化した子孫を生み出すことができた。逆分化した造血細胞の場合、かかる幹細胞は分化多能で、複数の細胞系譜を生じさせることができる。ＷＯ９６／２３８７０の独創性に富んだ発見は、完全に予想を超えたものであった。
【０００５】
前記発見が臨床にもたらす意義は、非常に大きい。まず、幹細胞をヒト患者から得ることが大変難しい。さらに幹細胞は、胎盤組織や骨髄や血液から通常得られるが、幹細胞は前記組織中にごく少量しか存在しない。そこで本発明は、よりコミットしている細胞から、特に逆分化のプロセスにより幹細胞を作製する装置を提供する。
【０００６】
米国特許第６，０８７，１６８号は、適切な培地を用いて上皮細胞を脱分化又は逆分化させて、上皮細胞を神経細胞に分化転換させる方法を開示している。同様に、ＬａｋｅＪＡｅｔａｌ．（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１１３，５５６−５６６，２０００）やＲａｔｈｊｅｎＪｅｔａｌ．（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１１２，６０１−６１２，１９９９）は、２つの分離可能な因子に応答する場合に、胚幹細胞（ＥＳ細胞）が原始外胚葉様細胞（ＥＰＬ細胞）に逆分化することを開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１１３，５５６−５６６，２０００
【非特許文献２】ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１１２，６０１−６１２，１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の要約
広い観点では、本発明は、装置がよりコミットした細胞を未分化細胞に逆分化させる手段を有することを特徴とする、未分化細胞を調製する装置を提供する。
【０００９】
先行技術（例えば、米国特許第６，０８７，１８７号，Ｌａｋｅｅｔａｌ．，Ｒａｔｈｉｊｅｎｅｔａｌ．）において、未分化細胞の調製に適した装置を開示している文献はこれまでにない。未分化細胞の調製は、当該技術分野において通常の知識を有する者が本発明の装置を用いずに行うことができるが、最終製品は手順を行うたびに一貫しない傾向にあり、結果は手順を行った者の技術と経験に依存する。加えて、未分化細胞を人手で調製するのに必要な実施時間は膨大であるため、かかる方法は実験室用として費用効率的でない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
実施例の一つでは、本発明は、装置がチャンバーと、コミットした細胞を含む細胞集団を該チャンバーに導入する手段と、コミットした細胞を未分化細胞に逆分化させることができる逆分化手段を前記チャンバーに導入する手段と、コミットした細胞が未分化細胞に逆分化するように、コミットした前記細胞を前記逆分化手段の存在下でインキュベーションするインキュベーション手段とを有することを特徴とする、コミットした細胞を含む細胞集団中で未分化細胞を形成する及び／又は該未分化細胞の相対数を増加させる装置を提供する。
【００１１】
他の実施例では、本発明は、装置がチャンバーと、コミットした細胞を含む細胞集団を該チャンバーに導入する手段と、コミットした細胞を未分化細胞に逆分化させる試薬を前記チャンバーに導入する手段と、コミットした細胞が未分化細胞に逆分化するように、該試薬及びコミットした細胞をインキュベーションするインキュベーション手段とを有することを特徴とする、コミットした細胞を含む細胞集団中で未分化細胞を形成する及び／又は該未分化細胞の相対数を増加させる装置を提供する。
【００１２】
前記試薬は、コミットした細胞の表面上で抗原の捕捉、認識又は提示に介在する受容体に関するものが好ましい。さらに好ましくは、該受容体が、ヒト白血球会合（ＨＬＡ）−Ａ受容体，ＨＬＡ−Ｂ受容体，ＨＬＡ−Ｃ受容体，ＨＬＡ−Ｅ受容体，ＨＬＡ−Ｆ受容体又はＨＬＡ−Ｇ受容体の群から選ばれるＭＨＣクラスＩ抗原、又はＨＬＡ−ＤＭ受容体，ＨＬＡ−ＤＰ受容体，ＨＬＡ−ＤＱ受容体又はＨＬＡ−ＤＲ受容体の群から選ばれるＭＨＣクラスＩＩ抗原であることが好ましい。
【００１３】
同様に、前記受容体は、相同領域を有するβ鎖を有していてもよい。前記受容体は、少なくともＨＬＡ−ＤＲのβ鎖の相同領域を有していることが好ましい。
【００１４】
コミットした細胞は、分化細胞であることが通常である。コミットした該細胞は、コミットした造血細胞、さらに好ましくはＴ細胞コロニー形成細胞（ＣＦＣ−Ｔ細胞）、Ｂ細胞コロニー形成細胞（ＣＦＣ−Ｂ細胞）、好酸球コロニー形成細胞（ＣＦＣ−Ｅｏｓｉｎ細胞）、好塩基球コロニー形成細胞（ＣＦＣ−Ｂａｓ細胞）、顆粒球／単球コロニー形成細胞（ＣＦＣ−ＧＭ細胞）、巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＣ−ＭＥＧ細胞）、赤血球バースト形成細胞（ＢＦＣ−Ｅ細胞）、赤血球コロニー形成細胞（ＣＦＣ−Ｅ細胞）、Ｔ細胞及びＢ細胞から選ばれる細胞であることが望ましい。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、よりコミットした細胞が癌細胞でないことが望ましい。本発明の別の実施形態において、試薬が発癌性でなく、また試薬が癌成長を促進しないものであることが好ましい。
【００１６】
好ましい実施例において、試薬が、受容体に対するモノクロナール抗体などの受容体に対する抗体であることが好ましい。具体例には、ＣＲ３／４３及びモノクロナール抗体ＴＡＬ．１Ｂ５が含まれる。
【００１７】
好ましい実施例において、試薬はＭＨＣ遺伝子発現を調節する。同様に、該試薬はＭＨＣクラスＩ^＋の発現及び／又はＭＨＣクラスＩＩ^＋の発現を調節してもよい。
【００１８】
前記試薬は、例えばシクロホスホアミドである又はシクロホスホアミドを含有するアルキル化剤などの生物反応修飾物質と共に用いられることが好ましい。
【００１９】
未分化細胞は、幹細胞抗原を含有していることが好ましい。好ましい実施形態では、未分化細胞が胚幹細胞，分化多能幹細胞，リンパ系幹細胞，造血幹細胞，神経幹細胞，上皮幹細胞，間葉幹細胞，内胚葉幹細胞及び骨髄性幹細胞から選ばれる。未分化細胞は、ＣＤ３４^＋，ＨＬＡ−ＤＲ⁻，ＣＤ３８⁻，ＣＤ１１７，ＡＣ１３３，ＣＤ９０及び／又はＣＤ４５ｌｏｗのうち、１又は２以上の細胞表面マーカーにより特徴づけられることが好ましい。さらに、未分化細胞がＣＤ３４^＋やＣＤ３８⁻であることが好ましく、またさらにＣＤ３４^＋、ＣＤ３８⁻、ＨＬＡ−ＤＲ⁻やＣＤ４５ｌｏｗであることが好ましい。
【００２０】
よって好ましい実施形態において、本発明は、コミットした細胞を含む細胞集団における細胞表面マーカーである、ＣＤ３４^＋及び／又はＣＤ３８⁻及び／又はＨＬＡ−ＤＲ⁻及び／又はＣＤ４５ｌｏｗ及び／又はＣＤ９０及び／又はＣＤ１１７及び／又はＡＣ１３３を有する細胞の相対数を増加させる装置も提供する。該装置は以下のものを有する。
（ｉ）チャンバー，
（ｉｉ）コミットした細胞を含む細胞集団を該チャンバーに導入する手段，
（ｉｉｉ）コミットした該細胞を操作的に関与させる試薬を前記チャンバーに導入する手段，
（ｉｖ）前記関与の結果として、ＣＤ３４^＋及び／又はＣＤ３８⁻及び／又はＨＬＡ−ＤＲ⁻及び／又はＣＤ４５ｌｏｗ及び／又はＣＤ９０及び／又はＣＤ１１７及び／又はＡＣ１３３細胞の相対数が増加するように、前記チャンバーにおいて前記試薬が関与するコミットした前記細胞をインキュベーションすることができるインキュベーション手段。
【００２１】
本発明による装置は、前記未分化細胞を濃縮し、前記試薬を除去し、及び／又は変化した細胞集団から前記未分化細胞を回収するための精製手段又は単離手段をさらに随意的に有していてもよい。精製手段は、未分化細胞表面上にある細胞表面マーカーや、コミットした細胞表面上にあるが、未分化細胞の細胞表面上に実質的にない細胞表面マーカーを同定する手段を有することが好ましい。同様に、精製手段は、例えば細胞表面マーカーに対する抗体を用いてもよい。適したマーカーの具体例には、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲが含まれる。一例をあげると、適切な精製手段はＣｌｉｎｉＭＡＣｓ／ＩｓｏｌｅｘＣＤ３４^＋精製システムである。精製又は単離手段などの本発明の他の実施例は、別の手段として任意に提供することができる。
【００２２】
本発明による装置は、上流のネガティブセレクション及び／又は細胞濃縮手段をさらに任意に有していてもよい。他の方法として、該細胞集団は、任意にネガティブセレクション及び／又は前記装置に挿入する前に増殖された細胞であってもよい。
【００２３】
好ましい他の実施例において、本発明の未分化細胞は、ＣＤ３４⁻、ＣＤ４５⁻で造血系マーカーに対してネガティブである。
【００２４】
よりコミットした細胞は、もともとコミットしていた細胞と同一の系統でも異なる系統であってもよい。
【００２５】
よって、未分化細胞を作製するのと同様に、本発明の装置はある系譜の細胞を他系譜の細胞に転換するのに用いることができる。
したがって、他の側面として、本発明は、ある造血系譜の、コミットした造血系細胞を含む細胞集団において、他の造血系譜の細胞となるように誘導する装置を提供する。該装置は以下のものを有する。
（ｉ）チャンバー，
（ｉｉ）コミットした細胞を含む細胞集団を該チャンバーに導入する手段，
（ｉｉｉ）コミットした造血細胞の表面上で抗体の捕捉、認識又は提示を介在する受容体を操作的に関与させる試薬を前記チャンバーに導入する手段，及び
（ｉｖ）前記関与の結果として前記造血細胞が他の造血系譜の細胞になるように、前記チャンバー中で前記試薬が関与する、コミットした前記造血細胞をインキュベーションすることができるインキュベーション手段。
【００２６】
コミットした前記造血細胞がＢ細胞系譜であり、該細胞がＴ細胞系譜及び骨髄系譜から選択される、他の造血系譜の細胞となることが好ましい。
【００２７】
本発明の装置によって作製される未分化細胞は、免疫疾患又は免疫疾病の治療薬の製造に用いることができる。同様に、本発明の方法に従って作製された、再コミットした細胞は、免疫疾患又は免疫疾病の治療薬を製造するのに用いることができる。
【００２８】
本発明は、よりコミットした細胞から未分化細胞を容易に調製することができることから、かかる未分化細胞をインビトロ、インビボ又は両者の組合せでも疾患治療用の治療薬として用いたり、調製することができる点で、大変有利である。
【００２９】
また本発明は、すでによりコミットしていた細胞を訂正又は除去するという点や、該細胞の産出物を訂正又は除去するという点で、新規分化細胞などのような逆分化により調製された未分化細胞を再コミットした細胞にコミットさせる装置を用いることができる点で有利である。例えば、未分化細胞は、肺胞を並べる細胞などの再コミットした細胞を作製するのに用いることができ、これにより損傷した又は疾病にかかった肺組織を交換又は修復することができるメカニズムを作製する（ＬｅＰａｇｅ，ＮｅｗＳｃｉｅｎｔｉｓｔ１９Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０００，ｐ．２０を参照）。
【００３０】
「再コミットした細胞」という語とは、未分化細胞由来の細胞、すなわち新規によりコミットした細胞を意味する。「よりコミットした」とは、より分化していることを意味し、公知である細胞分化経路及び細胞分化段階を参照することにより容易に決定することができる。
【００３１】
最も未分化な細胞及び分化した細胞には、主要組織適合性遺伝子複合体（ＨＭＣ）クラスＩ抗原及び／又はクラスＩＩ抗原が含まれる。かかる抗原が前記細胞と結合する場合、該抗体はクラスＩ^＋及び／又はクラスＩＩ^＋と呼ばれる。よりコミットした細胞がＭＨＣクラスＩ^＋及び／又はＭＨＣクラスＩＩ^＋未分化細胞に逆分化できることが好ましい。
【００３２】
よりコミットした細胞が、幹細胞抗原を含む未分化細胞に逆分化できることが好ましい。
【００３３】
よりコミットした細胞が、ＣＤ３４^＋未分化細胞に逆分化できることが好ましい。
【００３４】
よりコミットした細胞が、リンパ球造血（ｌｙｍｐｈｏｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）前駆細胞に逆分化できることが好ましい。
【００３５】
よりコミットした細胞が、多機能幹細胞に逆分化できることが好ましい。
【００３６】
前記増加が２４時間以内に生じることが好ましく、該増加が（いかなる変化も細胞増殖によってのみ説明することができないような）４〜８時間以内に生じるのがさらに好ましい。
【００３７】
典型的に、未分化細胞数の変化の測定は、未分化細胞に特徴的な細胞表面マーカーを有する細胞数の変化を観察することにより行われる。適した細胞表面マーカーの例には、ＣＤ３４^＋，ＨＬＡ−ＤＲ⁻，ＣＤ３８⁻，ＡＣ１３３，ＣＤ９０及び／又はＣＤ４５ｌｏｗが含まれる。他の方法として又は追加として、分化細胞に典型的であるが、未分化細胞に典型的でない細胞表面マーカーを有する細胞数の減少を測定することもできる。
【００３８】
同様に、本発明の装置は、未分化細胞に特徴的な細胞表面マーカーを有する細胞数の変化を観察する追跡手段をさらに随意的に有していてよい。
【００３９】
前記測定において用いられるコミットした細胞は、ＣＦＣ−Ｔ細胞，ＣＦＣ−Ｂ細胞，ＣＦＣ−Ｅｏｓｉｎ細胞、ＣＦＣ−Ｂａｓ細胞，ＣＦＣ−ＧＭ細胞，ＣＦＣ−ＭＥＧ細胞，ＢＦＣ−Ｅ細胞，ＣＦＣ−Ｅ細胞，Ｔ細胞及びＢ細胞の群から選ばれる細胞、より好ましくはＢ細胞などのコミットした造血細胞であることが好ましい。
【００４０】
さらに本発明の装置は、以下の特徴の１又は２以上、好ましくは２又は３以上、さらに好ましくは３又は４以上、そしてさらに好ましくは４又は５以上を含んでいることが好ましい。
（ｉ）細胞集団の容量を測定する測定手段，
（ｉｉ）細胞数を計算して細胞集団の細胞濃度を測定する（例えばコールターカウンター（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔｅｒ）、必要な場合は小型化されたもの又は他の適切なサイトメーター（ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）など）計算手段，
（ｉｉｉ）搬送手段が任意的に例えばポンプなど有することを特徴とする、貯蔵容器からチャンバーに（所定の量などの）ある量の細胞集団を搬送する搬送手段，
（ｉｖ）細胞集団の容量と細胞濃度との両方に依存する、チャンバーに加えられる試薬量を計算する計算手段，
（ｖ）搬送手段がさらに例えばステッパーモータなどのモーターによって駆動されるシリンジを任意的に有することを特徴とする、（例えば計算された量など）ある量の試薬をチャンバーに搬送するさらなる搬送手段，
（ｖｉ）チャンバー内の二酸化炭素濃度を調節する（例えばインキュベーション手段の一部としての）手段を調節する二酸化炭素調節手段，
（ｖｉｉ）チャンバー内の温度を調節する（例えばインキュベーション手段の一部としての）温度調節手段，
（ｖｉｉｉ）チャンバー内部で細胞集団と試薬とを混合するための（例えばインキュベーション手段の一部としての）混合手段，
（ｉｖ）インキュベーション時間を計測し、残り時間を使用者に示すディスプレイ手段及び／又はインキュベーション時間の終了を使用者に知らせるアラーム手段とを随意的に有する（例えばインキュベーション手段の一部としての）時間計測手段，
（ｘ）チャンバーから細胞を回収する、特にチャンバーから未分化細胞を回収する回収手段，
（ｘｉ）該除去手段が例えばポンプを有していてよい、チャンバーから貯蔵容器に未分化細胞を含む細胞集団を除去する除去手段，及び
（ｘｉｉ）未分化細胞を含む細胞集団を含む貯蔵容器をシールするシール手段。
【００４１】
同様に、本発明の装置において、搬送手段（ｉｉｉ）は、患者から前記チャンバーに直接（すなわち貯蔵容器を必要とせずに）細胞集団の（所定の量などの）量を搬送してもよく、及び／又は除去手段（ｘｉ）は、チャンバーから直接患者に（すなわち貯蔵容器を必要とせずに）、未分化細胞を含む細胞集団を除去してもよい。
【００４２】
同様に、搬送手段（ｉｉｉ）は、例えば配管などの連結手段を介して貯蔵容器からチャンバーに細胞集団を搬送するぜん動ポンプを有していてもよい。連結手段は、（（ｉｉ）で述べたように）コールターカウンターや他の適切なサイトメーターを通過してもよい。このようにして、貯蔵容器からチャンバーまでの細胞集団の搬送の間に該細胞集団の細胞濃度を計算することができる。
【００４３】
（ｉｉｉ）及び（ｘｉ）で上述の貯蔵容器は、好ましくは使い捨てである貯蔵バッグであることが好ましい。さらに、（ｉｉｉ）の貯蔵容器は、（ｘｉ）の貯蔵容器と異なり、前者が入力貯蔵容器であり、後者が出力貯蔵容器であることが好ましい。
【００４４】
さらに搬送手段（ｖ）は、いかなる時も充分な試薬を供給できるようにするため、試薬貯蔵器を有することが好ましい。搬送手段がシリンジである場合、該試薬貯蔵器はさらにシリンジを有していてもよく、１つのシリンジが空になった時に他方のシリンジが試薬の供給を開始する。
【００４５】
チャンバー内の二酸化炭素濃度を調節するための二酸化炭素調節手段は、ガスシリンダーから所定量の二酸化炭素を導入することができるバルブを有していることが好ましい。チャンバー、配管及び出力貯蔵容器中の、すでにわかっている空気量から二酸化炭素の所定量が計算され、入力貯蔵容器から細胞集団の測定量が計算される。同様に、二酸化炭素は試薬が添加されるのと同一のポート（ｐｏｒｔ）を介してチャンバー中に導入され、二酸化炭素がかかる方法によりポート及び周辺器具中の全ての残存試薬を吹き飛ばすのに用いられる。上記に加えて、二酸化炭素調節手段は、システム中にさらに二酸化炭素を導入することから生じる余分な空気量を調和させるために、可膨張性の気胞を有していてもよい。該方法のかわりに、一度空になった入力所蔵容器が、気胞として機能してもよい。二酸化炭素は、チャンバー中の最終濃度が５％となるように導入されるのが好ましい。
【００４６】
同様に、温度調節手段（ｖｉｉ）は、例えば加熱手段がチャンバー下部に位置する加熱プレートにより供される加熱手段を有していてもよい。該方法のかわりに、加熱手段がチャンバー又はその一部に隣接して位置する温水ジャケット（ｈｅａｔｅｄｗａｔｅｒｊａｃｋｅｔ）によるものでもよい。さらに、チャンバー内の温度が約２５℃から約３７℃の間に調節されていることが好ましい。
【００４７】
混合手段（ｖｉｉｉ）は、チャンバー内で細胞集団と試薬とを混合するためにゆっくり回転する、パドルアーム（ｐａｄｄｌｅａｒｍ）を少なくとも一つ有することが好ましい。該方法のかわりに、電磁撹拌機を用いてもよい。
さらに前記方法のかわりに、例えば緩やかな撹拌で機械的に前記チャンバーを撹拌してもよい。パドルアームを少なくとも一つ有する混合手段を用いることの利点は、該アームが細胞を回収する間にスクレーパとして働くように、すなわち該アームがゆっくり回転する時にチャンバー表面に付着した細胞を緩やかに取り除くように設計することもできる点である。混合手段が旋回動作することができる点で、有利である。
【００４８】
除去手段（ｘｉ）は、ぜん動ポンプを有することが好ましい。該除去手段が例えばチャンバー底部にある出力ポートを通じて、配管などの連結手段を介して及び出力貯蔵容器中に、未分化細胞を含む細胞集団を吸引する点で、有利である。
【００４９】
前記方法のかわりに又は前記除去手段に加えて、例えばＥＤＴＡなどの抗凝固剤などの遊離イオン封鎖（ｆｒｅｅｉｏｎｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ）剤及び／又はキレート剤を、細胞集団を除去する前にチャンバーに添加してもよい。チャンバーにかかるイオン封鎖及び／又はキレート剤を添加すると、幹細胞コロニーが脱凝集して単細胞懸濁液となり、これにより洗浄手段により前記チャンバーからの細胞除去が容易になる。
【００５０】
シール手段（ｘｉｉ）は、容器の２箇所又は完全にシールするまでの容器手前にある連結手段の２箇所を共に加圧することにより出力貯蔵容器を密封するヒートシール装置を有することが好ましい。例えば、該ヒートシール装置は、幅が約２ｃｍであるシールとなってよく、続いて該ヒートシール装置が中央部分に沿ってシールを切断する。
【００５１】
本発明の装置の各部分は、中央のコンピューターシステムによって独立して制御されていていることが好ましい。該コンピューターシステムは、該装置の部分から入力情報を受信し、かかる入力信号に基づいて計算を行い、該装置の同一又は他の部分に出力情報を発信することができる点で、有利である。
【００５２】
本発明の装置には、特に該装置が、手順が実行されるごとに安定した結果が得られること、及び貴重な試薬の無駄が生じないようにするなど、数々の長所がある。加えて、該装置は逆分化が終了した時を使用者に知らせるように、及び／又は終了前の残り時間を表示するようにプログラムされていてよい。かかるプログラミングがされている場合、該装置は新たに試薬を購入するように使用者に知らせることができる。言い換えると、該装置は試薬の使用状況及び貯蔵量をモニターすることができ、貯蔵試薬量が臨界値以下に下がっている場合に利用者に知らせることができる。
【００５３】
本発明の装置は、例えば筋肉，毛髪，神経細胞などの異なる細胞系譜にコミットした未分化細胞を各々作製する複数のチャンバーをさらに有していてもよい。よって、異なる細胞系譜にコミットした未分化細胞を同時に作製することができる。複数のチャンバーが用いられる時には、各チャンバーが個別の排出ポート及び個別の出力貯蔵容器を有していることが好ましい。
【００５４】
細胞系譜は、チャンバーに対して異なる処理をしたプラスチックを用いることによって、又は各チャンバーに異なる化学試薬を添加することによって本発明の装置中で調節してもよい。
【００５５】
装置の１又は２以上の部分が使い捨てであることが好ましい。例えば、チャンバー，入力貯蔵容器，出力貯蔵容器，貯蔵容器をチャンバーと連結させている連結手段及び他の搬送手段（ｖ）などの１又は２以上の部分が使い捨てであってよい。同様に使い捨て可能な部分は、前記装置に挿入されるカートリッジ式で供給されてもよい。一例を挙げると、カートリッジは、チャンバーが配管（連結手段）によって第１血液袋（入力貯蔵容器）及び第２（出力）血液袋にそれぞれ連結していることを特徴とする、第１血液袋、チャンバー及び第２血液袋を有していてよい。同様に、前記装置は、部分的に道具であって、部分的に使い捨てであるシステムとして考えることができる。
【００５６】
細胞集団と接触する、チャンバー及び／又は装置の他の部分は、米国特許分類クラスＶＩ（ＵＳＰＣｌａｓｓＶＩ）の材料、ポリカーボネートプラーク又は細胞の形質転換体の他の形式を生じさせることができない他のプラスチックから形成されていてもよい。
【００５７】
コミットした細胞を有する細胞集団は、血液であることが好ましい。試薬は、抗体であることが好ましい。
【００５８】
他の側面において、本発明は、よりコミットした細胞の逆分化が軟層血液サンプル（ｂｕｆｆｙｃｏａｔｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅ）中又は軟層血液サンプルから得たよりコミットした細胞に対して生じることを特徴とする、よりコミットした細胞を未分化細胞に逆分化させる過程を含む、未分化細胞の調整方法を提供する。
【００５９】
さらに別の側面において、本発明は、軟層血液サンプル中又は軟層血液サンプルからのよりコミットした細胞と、よりコミットした細胞を未分化細胞に逆分化させる試薬とを接触させる過程を含む、未分化細胞の調整方法を提供する。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態の一つでは、よりコミットした細胞は癌細胞でない。本発明の好ましい他の実施形態では、試薬は発癌性でも癌の増殖を促進することができるものでもない。
【００６１】
コミットした細胞は、分化していることが好ましい。コミットした細胞は、ＣＦＣ−Ｔ細胞，ＣＦＣ−Ｂ細胞，ＣＦＣ−Ｅｏｓｉｎ細胞，ＣＦＣ−Ｂａｓ細胞，ＣＦＣ−ＧＭ細胞，ＣＦＣ−ＭＥＧ細胞，ＢＦＣ−Ｅ細胞，ＣＦＣ−Ｅ細胞，Ｔ細胞，及びＢ細胞、より好ましくはＢ細胞などのコミットした造血細胞であることが好ましい。
【００６２】
未分化細胞は、分化多能幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、間充織幹細胞及び胚幹細胞から選ばれる未分化細胞であることが好ましい。さらに該未分化細胞が、ＣＤ３４^＋，ＨＬＡ−ＤＲ⁻，ＣＤ３８⁻，ＣＤ１１７，ＡＣ１３３，ＣＤ９０及び／又はＣＤ４５ｌｏｗの細胞表面マーカーのうち１又は２以上により特徴づけられることが好ましい。さらに好ましくは、前記未分化細胞が、ＣＤ３４^＋及びＣＤ３８⁻、さらに好ましくは、ＣＤ３４^＋，ＣＤ３８⁻，ＨＬＡ−ＤＲ⁻及びＣＤ４５ｌｏｗであることが好ましい。
【００６３】
同様に、未分化細胞は、ＭＨＣクラスＩ^＋及び／又はＭＨＣクラスＩＩ^＋細胞であることが好ましい。
【００６４】
試薬は、コミットした細胞表面における抗原の捕捉、認識又は提示を介在する受容体に関与することが好ましい。さらに該受容体が、ヒト白血球会合（Ｈｕｍａｎ−Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）（ＨＬＡ）−Ａ受容体，ＨＬＡ−Ｂ受容体，ＨＬＡ−Ｃ受容体，ＨＬＡ−Ｅ受容体，ＨＬＡ−Ｆ受容体又はＨＬＡ−Ｇ受容体から選ばれるクラスＩ抗原や、ＨＬＡ−ＤＭ受容体，ＨＬＡ−ＤＰ受容体，ＨＬＡ−ＤＱ受容体又はＨＬＡ−ＤＲ受容体から選ばれるクラスＩＩ抗原であることを特徴とする、ＭＨＣクラスＩ抗原又はＭＨＣクラスＩＩ抗原であることが好ましい。
【００６５】
同様に、該受容体は相同領域を有するβ鎖を有していてよい。実施形態の一つにおいて、該受容体がＨＬＡ−ＤＲのβ鎖の相同領域を少なくとも有していてよい。
【００６６】
好ましい実施例において、試薬は、受容体に対するモノクロナール抗体などの、受容体に対する抗体である。具体例には、ＣＲ３／３４やモノクロナール抗体ＴＡＬ．１Ｂ５などが含まれる。
【００６７】
同様に、試薬は、例えばＭＨＣクラスＩ^＋発現及び／又はＭＨＣクラスＩＩ^＋発現などのＭＨＣ発現遺伝子発現を調節してもよい。
【００６８】
本発明のさらに好ましい実施形態においては、バフィーコート血液サンプル中の細胞表面マーカーであるＣＤ３４^＋及び／又はＨＬＡ−ＤＲ⁻及び／又はＣＤ３８⁻及び／又はＣＤ１１７及び／又はＡＣ１３３及び／又はＣＤ９０及び／又はＣＤ４５ｌｏｗを有する細胞の相対数を増加させる方法、すなわちバフィーコート血液サンプル中のよりコミットした細胞を前期コミットした細胞に操作的に関与する試薬とを接触させ、ＣＤ３４^＋細胞及び／又はＨＬＡ−ＤＲ⁻細胞及び／又はＣＤ３８⁻細胞及び／又はＣＤ１１７細胞及び／又はＡＣ１３３細胞及び／又はＣＤ９０細胞及び／又はＣＤ４５ｌｏｗ細胞の相対数が該関与の結果として増加する方法を提供する。
【００６９】
さらに別の側面において、本発明は未分化細胞を調製する方法、すなわち該方法が１又は２以上の該分化細胞が未分化細胞に逆分化することを特徴とする、細胞集団中の１又は２以上の分化細胞と、前記集団中における正常な分化細胞の割合を置き換えるための、効果的な逆分化手段とを接触させる過程を含む方法を提供する。
【００７０】
別の側面において、本発明は１又は２以上の前記分化細胞を未分化細胞に逆分化させるため、細胞集団中の正常な分化細胞の割合を置き換えるために逆分化手段を用いることを提供する。
【００７１】
さらに別の側面では、本発明は、未分化細胞を調製する方法、すなわち１又は２以上の分化細胞を含有する前記細胞集団を含む環境を、第１環境から、１又は２以上の前記分化細胞を未分化細胞に逆分化させるために、第１環境と比較して遊離イオン濃度を効果的に修飾した第２環境へと変化させることを特徴とする、細胞集団中の分化細胞を未分化細胞に逆分化する未分化細胞の調製方法を提供する。
【００７２】
さらに他の側面において、本発明は、未分化細胞の調製方法、すなわち細胞集団中の１又は２以上の分化細胞と、正常な分化細胞の割合を置換するのに効果的な逆分化手段とを接触される過程と、イオンなし又はイオン封鎖された第１環境中の細胞集団を培養する過程と、第１環境と比較して、第２環境に存在するイオン濃度を効果的に修飾した第２環境へと第１環境を変化させ、１又は２以上の分化細胞が未分化細胞に逆分化する過程とを含むことを特徴とする未分化細胞の調製方法を提供する。
【００７３】
逆分化手段は、以下ネガティブセレクションと呼ばれる、細胞集団中の正常な分化細胞の割合を細胞集団内で混乱させて、細胞集団中の正常な分化細胞の割合の混乱を引き起こす方法であることが好ましい。
【００７４】
例えば逆分化手段は、抗体（純粋又は共役（すなわち、例えば磁性、ガラス又はポリスチレンのビーズなどの固定された又は未固定のリガンドに結合している））、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ、ＬｙｍｐｈｏＰｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ社製）又は細胞密度に従って細胞を分離させるために用いられる他のいかなる密度勾配培地、又は（例えば赤血球を沈降させる）デキストランのうちの１又は２以上のものであってよい。細胞転置（ｃｅｌｌｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を生じさせる、同様の他の手段は、Ｖｅｔｔｅｓｅ−Ｄａｄｅｙ（ＴｈｅＳｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｓｅｐ１３１９９９，１３（１８）：２１）に示されている。
【００７５】
第２環境の遊離イオン濃度は、第１環境の遊離イオン濃度と比較して増加していることが好ましい。
【００７６】
さらに、第１環境及び第２環境の相対的遊離イオン濃度が増加する、すなわち第２環境における遊離イオン濃度が増加することが好ましい。相対的遊離イオン濃度は、１又は２以上の分化細胞を未分化細胞に逆分化させるために充分に増加していることが好ましい。一例として、５ｍＭのＥＤＴＡ（遊離イオン封鎖剤及び／又はキレート剤）を含有する培地から、低濃度のＥＤＴＡ又はＥＤＴＡを含まない他の培地に細胞を搬送すると、逆分化を引き起こすのに充分な遊離イオン濃度（例えばカルシウムイオン濃度など）の増加が生じる。
【００７７】
遊離イオンは、アニオンであることが好ましい。
【００７８】
遊離イオンは、第Ｉ類又は第ＩＩ類の金属であることが好ましい。
【００７９】
アニオンは、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンであることが好ましい。
【００８０】
同様に、環境の遊離イオン濃度は、該環境の遊離イオン濃度を相対的に変化させることができる試薬で該環境を処理することにより修飾されていてよい。
【００８１】
よって好ましい実施形態において、本発明は、未分化細胞を調製する方法、すなわち環境の遊離イオン濃度が、該環境の遊離イオン濃度を相対的に変更することができる試薬を用いて前記第１環境を処理して、第２環境を生じさせることにより修飾されることを特徴とする細胞集団中の分化細胞を未分化細胞に逆分化させる過程を含む方法を提供する。
【００８２】
例えば、第１環境は、試薬が続いて除去又は減少され、相対的に増加した遊離イオン濃度を有する第２環境に作用し、これにより細胞集団中の１又は２以上の分化細胞の逆分化を引き起こす、１又は２以上の遊離イオン封鎖剤でもって処理されてよい。すなわち例えば、封鎖剤が、第１環境から封鎖剤の全部又は一部を物理的／化学的に除去することによって、あるいはかかる遊離イオン封鎖剤を用いず又は第１環境中よりも低い濃度で遊離イオン封鎖剤を用いることにより細胞集団を第２環境に搬送することによって、除去又は減少されていてよい。
【００８３】
いずれにせよ、第２環境は、第１環境と比較して遊離イオン濃度が増加しており、これにより細胞集団における１又は２以上の分化細胞の逆分化を生じさせる。
【００８４】
他の方法として、該細胞集団は、遊離イオンが低い濃度又は濃度ゼロである第１環境において培養されてもよい。その後、細胞集団を第１環境に搬送することにより又は第１環境を調節することにより、第１環境がイオンを有する又は第１環境よりも高濃度のイオンを有する第２環境になり、細胞集団中の１又は２以上の分化細胞の逆分化を生じる。ここで用いられる「低い」という文言には、第２環境の最終濃度との関係で相対的に低い遊離イオン出発濃度を有する環境が含まれる。
【００８５】
よって好ましい実施形態において、本発明は、未分化細胞の調製方法、すなわち１又は２以上の分化細胞を含む前記細胞集団を含む環境を、低濃度又は濃度ゼロの遊離カルシウムイオン又は遊離マグネシウムイオンを含む第１環境から、遊離カルシウムイオン若しくは遊離マグネシウムイオンを有する、又は第１環境よりも高濃度の遊離カルシウムイオン若しくは遊離マグネシウムイオンを有する第２環境に変化させることにより、細胞集団中の１又は２以上の分化細胞を逆分化させることを特徴とする未分化細胞の調製方法を提供する。
【００８６】
理論に縛られることを望まなければ、イオン濃度の変化、特にイオン濃度の増加は、細胞集団中の細胞をコロニーに凝集させ（例えば、ホモタイプの凝集を引き起こすなど）、かかる細胞間の物理的接触が該細胞の逆分化を誘導しうると考えられる。
【００８７】
封鎖剤は、イオンキレート剤であることが好ましい。
【００８８】
封鎖剤は、アミン基とカルボキシル基の両方を含むことが好ましい。
【００８９】
封鎖剤は、ｎ＝１又はｎ＝２である、複数のＮ（ＣＨ_２ＣＯ_２Ｈ）_ｎ基を有することが好ましい。
【００９０】
同様に、封鎖剤は、ＥＤＴＡ，ヘパリン，ＥＧＴＡ，ＤＴＰＡ，３ナトリウム及び他の類似のキレート試薬及び／又は抗凝固剤の群から１又は２以上選ばれていてよい。
【００９１】
同様に、封鎖剤は、該剤の存在を除去することにより逆分化が生じるように、充分に高濃度で添加されているべきである。典型的には、該剤の存在が除去される場合、逆分化を生じさせるのに充分な封鎖剤の濃度は、約２ｍＭ以上又はそれと同一である。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態において、よりコミットした細胞が癌細胞でないことが望ましい。本発明の他の実施形態において、試薬が発癌性でなく、かつ癌成長を促進できないことが好ましい。
【００９３】
コミットした細胞は、分化していることが好ましい。分化した細胞は、ＣＦＣ−Ｔ細胞，ＣＦＣ−Ｂ細胞，ＣＦＣ−Ｅｏｓｉｎ細胞，ＣＦＣ−Ｂａｓ細胞，ＣＦＣ−ＧＭ細胞，ＣＦＣ−ＭＥＧ細胞，ＢＦＣ−Ｅ細胞，ＣＦＣ−Ｅ細胞，Ｔ細胞及びＢ細胞より、好ましくはＢ細胞などのコミットした造血細胞であることが好ましい。
【００９４】
未分化細胞は、分化多能幹細胞，造血幹細胞，神経幹細胞，上皮幹細胞，間葉幹細胞及び骨髄性幹細胞から選ばれる未分化細胞であることが好ましい。未分化細胞は、ＣＤ３４^＋、ＨＬＡ−ＤＲ⁻、ＣＤ３８⁻、ＣＤ１１７、ＡＣ１３３、ＣＤ９０及び／又はＣＤ４５ｌｏｗのうち、１又は２以上の細胞表面マーカーにより特徴づけられるものが好ましい。さらに、未分化細胞がＣＤ３４^＋及びＣＤ３８⁻であることが好ましく、またさらにＣＤ３４^＋、ＣＤ３８⁻、ＨＬＡ−ＤＲ⁻及びＣＤ４５ｌｏｗであることが好ましい。
【００９５】
よって他の好ましい実施形態において、本発明は、未分化細胞の調製方法、すなわち１又は２以上の分化造血系細胞を含有する前記細胞集団を含む環境を、第１環境から、前記分化造血系細胞が未分化細胞に逆分化するように、遊離イオン濃度を第１環境と比較して効果的に修飾した第２環境へと変化させることを特徴とする未分化細胞の調製方法を提供する。
【００９６】
同様に、未分化細胞は、ＭＨＣクラスＩ^＋細胞及び／又はＭＨＣクラスＩＩ^＋細胞であることが好ましい。
【００９７】
実施形態の一つにおいて、コミットした細胞を含む細胞集団はバフィーコート血液サンプル又はバフィーコート血液サンプル由来のものであることが好ましい。
【００９８】
本発明の方法は、例えば赤血球が血液供給の不足を補充するのに用いられるように、赤血球の産生用に赤血球前駆体を効果的に培養するために用いることができる点で、有利である。同様に、本発明の方法は、血小板産生に用いられる巨核球を産出するためにも用いることができる。
【００９９】
本発明が明確に理解され、実施が容易になるように、例示を目的として添付図面の説明を行う。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、前面パネルが開いている本発明による装置の透視図であり、挿入図は周囲から外された装置部分を示す図である。
【図２】図２は、前面パネルが閉じている、図１の装置透視図を示す図である。
【図３】図３は、血液細胞の写真を示す図である。
【図４】図４は、Ｔ細胞及びＢ細胞を形成するＬＳＣの分化のチャートを示す図である。
【図５】図５は、好酸球、好塩基球、好中球、巨核球、単球、赤血球、顆粒球、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞及びリンパ球を形成するＭＳＣの分化のチャートを示す図である。
【図６】図６は、リンパ球造血（ｌｙｍｐｈｏｈａｅｍａｔｏｐｉｅｔｉｃ）前駆細胞を示す図である。
【図７】図７は、ＣＲ３／４３抗体を用いて処理した後のＣＤ４５細胞ＣＤ１４細胞の出現を示す図である。
【図８】図８は、分化したＢ細胞の顕微鏡写真を示す図である。
【図９】図９は、Ｂ細胞を逆分化させることにより形成された未分化細胞の顕微鏡写真を示す図である。
【図１０】図１０は、図９と同一の未分化細胞の顕微鏡写真を低倍率で示す図である。
【図１１】図１１は、分化したＢ細胞の顕微鏡写真を示す図である。
【図１２】図１２は、Ｂ細胞を逆分化させることにより形成された未分化細胞の顕微鏡写真を示す図である。
【図１３】図１３は、図１２と同一の未分化細胞から分化した顆粒球細胞を形成する顕微鏡写真を示す図である。
【図１４】図１４は、Ｂ−ＣＬＬ患者から得た未処理血液サンプルの顕微鏡写真を、２つの異なる倍率で示す図である。
【図１５】図１５は、処理された血液サンプルの顕微鏡写真を示す図である。
【図１６】図１６は、血液サンプル処理中の経時的な顕微鏡写真を示す図である。
【図１７Ａ】図１７は、血液サンプル処理中の経時的な顕微鏡写真を示す図である。
【図１７Ｂ】図１７は、血液サンプル処理中の経時的な顕微鏡写真を示す図である。
【図１７Ｃ】図１７は、血液サンプル処理中の経時的な顕微鏡写真を示す図である。
【図１７Ｄ】図１７は、血液サンプル処理中の経時的な顕微鏡写真を示す図である。
【図１７Ｅ】図１７は、血液サンプル処理中の経時的な顕微鏡写真を示す図である。
【図１８】図１８は、サザンブロット法による結果を示す図である。
【図１９】図１９は、Ｂ−ＣＬＬ患者から得た末梢血細胞を用いて、さらにサザンブロット法を行って得た結果を示す図である。
【図２０】図２０は、細胞集団におけるＣＤ３４^＋細胞の相対数を増加させる３種類の試薬を用いた結果を示す図である。
【図２１】図２１は、倒立型明視野照明顕微鏡を用いた幹細胞のコロニーアッセイの結果を示す図である。
【図２２】図２２は、倒立型明視野照明顕微鏡を用いて観察した場合の接着細胞層を示す図である。
【図２３】図２３は、ＣＲ３／４３ｍａｂでＢ細胞を処理する間の経時的ビデオからの２つの電子スチールを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０１】
発明の詳細な説明
Ｉ．装置
装置は番号１で通常記載されており、該装置１の内部にアクセスするために空けることができる前方パネル３を有する収容箱（ｈｏｕｓｉｎｇ）２を有する。注入貯蔵容器、すなわち血液バッグ４は、支持フック５から掛けられている。該支持フック５は、電気秤（図示なし）の一部を形成しており、入力血液バッグ４の重量を測定するために働く。
【０１０２】
前記装置は、配管７を介して入力血液バッグ４に連結するチャンバー６をさらに有している。該配管７は、コールターカウンターフローセル（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗｃｅｌｌ）９内部に位置する、透明な窓８を有する。ぜん動ポンプ（図示なし）は、入力血液バッグ４からコールターカウンターフローセル９を通ってチャンバー６中に血液を吸引することができる。
【０１０３】
シリンジ１０及び１１は抗原を含んでおり、各シリンジはステッパーモータ（ｓｔｅｐｐｅｒ−ｍｏｔｏｒ）（図示なし）によって駆動される。シリンジ１０及び１１は、施錠可能で断熱されたＰｅｌｔｉｅｒ「冷蔵庫」（ａｌｏｃｋａｂｌｅｉｎｓｕｌａｔｅｄＰｅｌｔｉｅｒ“ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｏｒ”）内で常に４℃に保たれる。２つのシリンジ１０及び１１は、前記装置が充分な抗体を常に供給することを確保するために設けられている。シリンジ１０及び１１の無菌性は、抗生物質と（番号１３として通常指示される）使い捨て可能な０．２μｍのフィルタとの両方により維持されている。
【０１０４】
前記装置は、ガスボンベ（図示なし）から配管１５を介してチャンバー６中に二酸化炭素を移す二酸化炭素注入ポート１４をさらに有する。シリンジ１０及び１１は、配管１５を介してチャンバー６と連通もしている。バルブ１６は、配管１５を介して二酸化炭素及び抗原の流れを調節する。加熱手段（図示なし）がチャンバー６の下部に設けられている。チャンバー６内部には、回転可能なパドル１７があり、チャンバー６内部の抗体及び血液を混合させる働きをする。時間測定装置（図示なし）は、抗体及び血液がチャンバー６内部に残っている時のインキュベーション時間をモニターする。インキュベーションの残り時間は、コントロールパネルディスプレイ１８上に表示されてよい。
【０１０５】
排出貯蔵容器、すなわち排出血液バッグ１９も、装置１内部に掛けられており、配管２０を介してチャンバー６と連結している。配管２０は、配管２０をシールして排出血液バッグ１９とする働きをする、ヒートシール装置２１を通っている。他のぜん動ポンプ（図示なし）は、チャンバー６の内容物を排出血液バッグ１９中に吸引するために設けられている。
【０１０６】
配管７及び２０及び出力血液バッグ１９と共に、チャンバー６は各手順後に廃棄されてよい、使い捨て品目である。
【０１０７】
操作時には、使用者は出力血液バッグ１９、チャンバー６及び配管７及び２０を装置１に挿入する。配管２０がヒートシール装置２１及びぜん動ポンプを通るようにする。配管７が他のぜん動ポンプ及びコールターカウンターフローセル９を通るようにする。使用者は、患者から得た血液を含む血液バッグ４を挿入して、配管７に該血液バッグを取り付ける。上記に加えて、使用者はチャンバー６の配管１５を無菌フィルター１３に取り付ける。次に使用者は、収容箱２の前面パネル３を閉めて、装置のキーパッド２２を用いて該装置１を作動させる。
【０１０８】
装置１は、入力血液バッグ４の重量を自動的に測定する。入力血液バッグ４の重量は、装置１内部に設けられている中央計算システム（図示なし）に自動的に送られる。入力血液バッグ４の重量から、計算システムがバッグ４中の血液の容量を決定することができる。次にぜん動ポンプは、配管７を介して入力血液バッグ４から血液を吸引する。血液は、配管７の透明窓８を通して流れ、コールターカウンター９が配管７を通過する細胞濃度を決定する。コールターカウンターは、中央計算システムに信号を送信する。中央計算システムは血液の計算した容量及び細胞濃度から１又は２以上のシリンジ１０及び１１によってチャンバー６中に注入するのに必要である、適切な抗体量を決定する。ぜん動ポンプは、ポンプを停止させる中央計算システムから信号が受信されるまで、バッグ４から血液を吸引し続ける。中央計算システムからの信号は、他の細胞が窓８を通過しないことをコールターカウンター９が感知する時に送信される、コールターカウンター９から中央計算システムへの信号に応答して送信される。
【０１０９】
次に中央計算システムは、配管１５を介してチャンバー６中に所定量の抗体を注入するために１又は２以上のシリンジ１０、１１を圧縮する、シリンジ１０，１１に付いているステッパーモータ（図示なし）に信号を送信する。
【０１１０】
次に装置は、バルブ１６を開くことにより（バルブ１６を開閉する機構は、中央計算システムによって制御されうる）二酸化炭素注入ポート１４を通じて二酸化炭素を随意的に導入する。加えられる二酸化炭素の量はチャンバー６、チューブ７、２０及び出力血液バッグ１９中のすでにわかっている空気量と、入力血液バッグから計算される血液量とに基づいて、中央計算システムにより計算される。チャンバー６中の二酸化炭素の最終濃度は、約５％となる。二酸化炭素は、配管１５を介してチャンバー６中に導入される。二酸化炭素は、配管１５中に残存している抗体を吹き飛ばし、放出された全ての抗体がチャンバー６に加えられるようにしている。一度空になった入力血液バッグ４は、空気胞として機能し、二酸化炭素の導入に続いて付加的なガスの量を調整する。
【０１１１】
装置は、中央計算システムの制御下にあり、チャンバー６の下部に設けられ、２５℃から３７℃の間にチャンバー６中の温度を制御する加熱装置（図示なし）をさらに有していてよい。加熱装置に連結している自動温度調節器が過剰加熱や加熱不足を防止する。
【０１１２】
次に血液及び抗体試薬は、一定時間、チャンバー６でインキュベーションされる。適切なインキュベーション時間は２４時間を超えず、該時間は４時間８時間の間であることが好ましい。選択された時間は、逆分化反応が生じるのに充分である必要がある。
【０１１３】
インキュベーションの間、パドルアーム１７は抗体と血液とを混合させるためにゆっくり回転する。
【０１１４】
インキュベーション時間の完了時に、パドルアーム１７は、回転を続けてチャンバー６の表面に付着した細胞を取り去るスクレーパとして効果的に働き、これにより細胞の回収が容易となる。ぜん動ポンプは、チャンバー６底部からチャンバー６の内容物（すなわち、幹細胞である未分化細胞を含む血液）を出力血液バッグ１９中に吸引する。該ポンプは、（目盛付きのぜん動ポンプを用いて測定されるように）測定量の血液が出力血液バッグ１９に入るまで吸引を続ける。
【０１１５】
最後に、ヒートシール装置２１が、配管２０を固定して配管２０を長さ約２ｃｍにシールし、次に該シール装置２１が該シールの概ね中央部分で配管２０を切断する。
【０１１６】
装置１は、過程が終了することを使用者に知らせてもよい。
【０１１７】
次に使用者は、出力血液バッグ１９を取り除くことができる。配管７，２０及び入力血液バッグ４と共に、チャンバー６は廃棄されてよい。
【０１１８】
必要であれば、出力血液バッグ１９は、形態的変化も指標として用いることができるが、例えば未分化細胞の特徴である細胞表面マーカーを有する細胞を同定するシステムなどの精製システムに移動することもできる。該精製システムは、抗体試薬を除去するために、及び／又は未分化（幹）細胞を随意的に増殖させるために用られてもよい。好ましい精製システムは、ＣｌｉｎｉＭＡＣｓ／Ｉｓｏｌｅｘ精製システムである。
【０１１９】
ＩＩ．未分化細胞及び分化細胞
インビボで見つかっている未分化細胞及び分化細胞はたくさんあり、一般的技術分野はかかる細胞についての各種一般的技術に満ちている。
【０１２０】
例えば、造血細胞系譜に関して、なかでもＬｅｖｉｔｔａｎｄＭｅｒｔｅｌｓｍａｎ１９９５（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒＩｎｃ社により出版されたＨａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、特に第４５５９頁）及びＲｏｉｔｔｅｔａｌ．（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、Ｒｏｉｔｔ，ＢｒｏｓｔｏｆｆａｎｄＭａｌｅ（編）１９９６、Ｐｕｂｌ．Ｍｏｓｂｙ、特に第１０章）を挙げることができる。
【０１２１】
未分化細胞は、成熟した分化特性を示さないが、かかる特性を示す前駆体を産生することができる未成熟細胞である。公地の未分化細胞の例としては、幹細胞がある。
【０１２２】
幹細胞は、自己再生（限りない細胞分裂）及び分化（特異化）することができる未分化未成熟細胞である。かかる幼若細胞は、発達段階にある胚において豊富である。しかし該細胞の数は、成長が進むにしたがって減少する。対照的に成体は、特定の体の部分に限って、限られた数の幹細胞を有する。
【０１２３】
幹細胞は、単能性（ｍｏｎｏｐｏｔｅｎｔ）、両能性（ｂｉｐｏｔｅｎｔ）又は分化多能性のいずれかであると一般的に考えられている。単能性幹細胞及び両能性幹細胞は、発達過程においてより制限されていることから、１又は２タイプの特異化細胞をそれぞれ生じさせるにとどまる。対照的に、分化多能幹細胞（ＰＳＣ）は、多くの異なるタイプの細胞に分化することができることから、（生体を構成する）組織、又は分化全能幹細胞の場合には完全な生体を生じさせる。
【０１２４】
分化多能幹細胞は、単能性細胞や両能性細胞と異なり、複数の系譜に分化することができ、異なるタイプ又異なる系譜の細胞の集合からなる組織を生じさせる。
【０１２５】
造血幹細胞は、骨髄細胞中で見つかった分化多能幹細胞の一例であり、（白血球や赤血球を含む）全ての各種血液細胞を生じさせる。
【０１２６】
血液は、液体組織であり、リンパ球（Ｌｙ），単球（Ｍｏ），好中球（Ｎｅ），好塩基球（Ｂａ），好酸球（Ｅｓｏ），血小板（Ｐｌ）及び赤血球細胞（Ｒｂｃ）からなる。図３を参照されたい。かかる特異化組織は、造血幹細胞（Ｈｓｃ）の分化により産生される。一般的に、（より大きな枠内で）白血細胞は感染物と戦うが、（より小さな枠内で）赤血細胞は体内で栄養素、酸素及び廃棄物を搬送している。
【０１２７】
これまで、造血幹細胞は、（ｉ）骨髄、（ｉｉ）成長因子動員末梢血（ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｍｏｂｉｌｉｓｅｄｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄ）又は（ｉｉｉ）臍帯血（胎盤）から単離することにより抽出されていた。近年、造血幹細胞は、インビトロでの授精技術を用いて得た胚から抽出される胚幹（ＥＳ）細胞から調製されるようになった。かかる未分化細胞は、複数の系譜への分化と、全ての体組織の再構成とを行うことができる。すなわち該未分化細胞は分化全能である。
【０１２８】
上記抽出方法は、手間がかるうえに時々危険であり、特に胚幹細胞抽出方法の例のように、場合によっては非倫理的であると批判される可能性がある。
【０１２９】
造血系譜の未分化幹細胞には多くの種類がある。かかる細胞には、分化多能幹細胞（ＰＳＣ），リンパ系幹細胞（ＬＳＣ）及び骨髄性幹細胞（ＭＳＣ）などの総称的にリンパ球造血（ｌｙｍｐｈｏｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）前駆細胞（ＬＰＣ）として知られているものが含まれる。
【０１３０】
ＬＳＣ及びＭＳＣは、ＰＳＣの分化によってそれぞれ形成される。よって、ＬＳＣ及びＭＳＣは、ＰＳＣよりもさらにコミットしている。
【０１３１】
造血系譜の分化細胞の例には、Ｔ細胞，Ｂ細胞，好酸球，好塩基球，好中球，巨核球，単球，赤血球，顆粒球，肥満細胞，リンパ球が含まれる。
【０１３２】
Ｔ細胞及びＢ細胞は、ＬＳＣの分化によって形成される。よって、Ｔ細胞及びＢ細胞は、ＬＳＣよりもさらにコミットしている。より詳しくは、分化の連鎖が、ＬＳＣ→ｐｒｏＢ細胞又は前胸腺細胞であり、ｐｒｏＢ細胞→ｐｒｅＢ細胞→成熟Ｂ細胞→形質細胞となり、前胸腺細胞→通常の胸腺細胞→成熟胸腺細胞（ヘルパー／インデューサ系譜又は細胞毒／サプレッサ系譜）となる。図４を参照されたい。
【０１３３】
好酸球，好塩基球，好中球，巨核球，単球，赤血球，顆粒球，肥満細胞，ナチュラルキラー細胞及びリンパ球は、ＭＣＳの分化によって形成される。よって、前記各細胞は、ＭＳＣよりもさらにコミットしている。より詳しくは、分化の連鎖が、ＭＳＣ→未成熟巨核球（→巨核芽球→巨核球→血小板）又は前赤芽球（→赤芽球→網状赤血球→赤血球）又は骨髄単球幹細胞、骨髄芽球（→前骨髄球→骨髄球→顆粒球）又は単芽球（→前単球→単球→マクロファージ）のいずれかに分化する両能性（ｂｉｏｔｅｎｔ）幹細胞となる。図５を参照されたい。
【０１３４】
造血系の分化経路は、幅広く特徴づけられており、各種細胞ステージは、形態及び系譜特異的な細胞表面マーカーによって容易に同定することができる（下記参照）。
【０１３５】
他の幹細胞には、神経幹細胞、すなわち神経，星状細胞及びオリゴデンドロサイトを生成することができる分化多能細胞が含まれる（ＮａｋａｆｕｋｕａｎｄＮａｋａｍｕｒａ，１９９５，Ｊ．ＮｅｕｒｏｓｃｉＲｅｓ．，ｖｏｌ４１（２）：１５３−６８；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９４，ＦＡＳＥＢＪ．，ｖｏｌ８（１０）：７０７−１３；Ｍｏｒｓｈｅａｄｅｔａｌ．，１９９４，Ｎｅｕｒｏｎ，Ｖｏｌ１３（５）：１０７１−８２）。骨格筋衛星細胞は、別のタイプの幹細胞であり、より詳しくは成体において静止幹細胞として維持される筋形成細胞という別のクラスであり、必要な場合に新規の筋肉細胞を生じさせる（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，１９８６，ＤｅｖＢｉｏｌ．，Ｖｏｌ１１５（１）：１２９−３９）。他のタイプの幹細胞としては、上皮幹細胞，基底細胞の一部，内胚葉幹細胞及び間充織幹細胞がある。
【０１３６】
大変重要な幹細胞は、胚幹（ＥＳ）細胞である。かかる細胞は、幅広く研究され、特徴づけられてきた。実際、ＥＳ細胞は、トランスジェニック動物の作製において通常用いられる。ＥＳ細胞は、リンパ系前駆体（Ｐｏｔｏｃｎｉｋｅｔａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯＪ．，ｖｏｌ．１３（２２）：５２７４−８３）及び神経細胞を含む多くの細胞タイプにインビトロで分化することが示されてきている。米国特許第５，８４３，７８０号及び米国特許第６，２００，８０６は、霊長類のＥＳ細胞の単離方法を開示している。ＥＳ細胞は、ステージ特異的な胚マーカー３及び４（ＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４）や、高分子量グリコプロテインであるＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１や、アルカリホスファターゼなどの多くのステージ特異的マーカーによって特徴づけられる（Ａｎｄｒｅｗｅｔａｌ．，１９８４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，ｖｏｌ．３：３４７−３６１；．Ｋａｎｎａｇｉｅｔａｌ．，１９８３，ＥＭＢＯＪ．，ｖｏｌ．２：２３５５−２３６１；Ｆｏｘｅｔａｌ．，１９８４，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１０３：２６３−２６６；Ｏｚａｗａｅｔａｌ．，１９８５，Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒ．，ｖｏｌ．１６：１６９−１７３）。
【０１３７】
各種抗原は、未分化細胞及び分化細胞と会合する。「会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」という文言は、各種抗原を発現する若しくは発現することができる、又は各種抗原を提示する若しくは提示することができる、又は各抗原を含む細胞を意味する。
【０１３８】
最も未分化である細胞及び最も分化した細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原及び／又はクラスＩＩ抗原を有する。かかる抗原が前記細胞と会合する場合、該細胞はクラスＩ^＋細胞及び／又はクラスＩＩ^＋細胞と呼ばれる。
【０１３９】
未分化細胞又は分化細胞と会合する各特異的抗原は、マーカーとして機能する。よって、異なるタイプの細胞は、前記会合特異的抗原に基づいて又は会合抗原の特異的結合性に基づいて、それぞれ区別されうる。
【０１４０】
かかるマーカー抗原の例には、ＣＤ３４、ＣＤ１９及びＣＤ３の抗原が含まれる。前記抗原が現れた場合、前記特定細胞はそれぞれＣＤ３４^＋細胞、ＣＤ１９^＋細胞及びＣＤ３^＋細胞と呼ばれる。前記抗原が現れなかった場合、前記細胞はそれぞれＣＤ３４⁻細胞、ＣＤ１９⁻細胞及びＣＤ３⁻細胞と呼ばれる。
【０１４１】
さらに詳しくは、ＰＳＣは、ＣＤ３４^＋，ＤＲ⁻，ＴｄＴ⁻細胞（他の有用なマーカーがＣＤ３８⁻及びＣＤ３６^＋）である。ＬＳＣは、ＤＲ^＋，ＣＤ３４^＋及びＴｄＴ^＋細胞（さらにＣＤ３８^＋細胞も）である。ＭＳＣは、ＣＤ３４⁻，ＤＲ^＋，ＣＤ１３^＋，ＣＤ３３^＋，ＣＤ７^＋，ＴｄＴ^＋細胞である。Ｂ細胞は、ＣＤ１９^＋，ＣＤ２１^＋，ＣＤ２２^＋及びＤＲ⁻細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ２^＋，ＣＤ３^＋及びＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋細胞である。未成熟リンパ球は、ＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋細胞である。活化されたＴ細胞は、ＤＲ^＋細胞である。ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）は、ＣＤ５６^＋及びＣＤ１６^＋細胞である。Ｔリンパ球は、ＣＤ７^＋細胞である。白血球は、ＣＤ４５^＋細胞である。顆粒球は、ＣＤ１３^＋及びＣＤ３３^＋細胞である。単核マクロファージ細胞は、ＣＤ１４^＋及びＤＲ^＋細胞である。さらなる詳細は、図４及び図５に記載されている。
【０１４２】
胚幹細胞は、ＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４と、高分子グリコプロテインであるＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１と、アルカリホスファターゼを発現する。また該細胞は、分化の指標となるＳＳＥＡ−１を発現しなかった。他のマーカーは、神経上皮幹細胞に対するネスチン（ｎｅｓｔｅｉｎ）などの、他のタイプの幹細胞について公知である（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９８５，ｖｏｌ．５：３３１０）。間充織幹細胞は、例えばＳＨ２、ＳＨ３、ＣＤ２９，ＣＤ４４，ＣＤ７１，ＣＤ９０，ＣＤ１０６，ＣＤ１２０ａ及びＣＤ１２４に対してポジティブであり、ＣＤ３４，ＣＤ４５及びＣＤ１４に対してネガティブである。
【０１４３】
他の方法として又は前記方法に加えて、細胞の多くは、形態学的特徴によって同定することもできる。随意的に染色技術を使用してもよい、顕微鏡を用いての細胞の同定は、組織学という名の大変発達した科学分野であり、関連技術は、当該技術分野において広く共有されている。細胞を明確に染色することは、染料が一般的に細胞を殺してしまうことから、同定を確かめるために細胞の割合に基づいてのみ行われる。
【０１４４】
よって、上記の抗原マーカーの存在を調べることにより、特定の細胞タイプ（例えば、細胞が未分化細胞又は分化細胞のいずれであるかなど）及び細胞タイプの特異性（例えば、細胞がＴ細胞又はＢ細胞のいずれであるかなど）を同定することができる。
【０１４５】
未分化細胞は、抗原提示、抗原捕捉又は抗原認識に関与する部分を有していてよい。未分化細胞は、ＭＨＣクラスＩ^＋細胞及び／又はＭＨＣクラスＩＩ^＋細胞であることが好ましい。
【０１４６】
よりコミットした細胞は、抗原提示、抗原捕捉又は抗原認識に関与する部分を有していてよい。よりコミットしている細胞は、ＭＨＣクラスＩ^＋細胞及び／又はＭＨＣクラスＩＩ^＋細胞であることが好ましい。
【０１４７】
よりコミットした細胞は、未分化細胞から得られる、又は未分化細胞から得ることが可能な細胞である。よって、好ましい実施形態において、よりコミットした細胞も未分化細胞である。したがって、一例として、よりコミットした未分化細胞はリンパ系幹細胞又は骨髄幹細胞であってよく、未分化細胞は分化多能幹細胞であってよい。
【０１４８】
好ましい他の実施形態では、よりコミットした細胞は、ＣＦＣ−Ｔ細胞，ＣＦＣ−Ｂ細胞，ＣＦＣ−Ｅｏｓｉｎ細胞，ＣＦＣ−Ｂａｓ細胞，ＣＦＣ−Ｂａｓ細胞，ＣＦＣ−ＧＭ細胞，ＣＦＣ−ＭＥＧ細胞，ＢＦＣ−Ｅ細胞，ＣＦＣ−Ｅ細胞，Ｔ細胞，Ｂ細胞，好酸球，好塩基球，好中球，単球，巨核球や赤血球などの分化細胞であり、未分化細胞は骨髄幹細胞、リンパ系幹細胞又は分化多能幹細胞である。
【０１４９】
よりコミットした細胞が分化細胞である場合、該分化細胞が（活化されている又は活化されていない）Ｂリンパ球，（活化されている又は活化されていない）Ｔリンパ球，マクロファージ単球系譜由来の細胞，クラスＩ又はクラスＩＩ抗原を発現することができる核形成細胞，クラスＩ又はクラスＩＩ抗原の発現を誘導することができる細胞，及び核形成細胞（すなわち、赤血球細胞など、核を有さない細胞）であることが好ましい。
【０１５０】
好ましい他の実施形態において、分化細胞は、ＣＤ５６及び／又はＣＤ１６細胞表面受容体をそれぞれ発現する、大型顆粒リンパ球，ヌルリンパ球及びナチュラルキラー細胞からなる細胞の群からいずれか１つ選択される。
【０１５１】
分化細胞は、核形成細胞の核形成によって形成されてもよい。
【０１５２】
ＩＩＩ．試薬
試薬は、よりコミットした細胞に作用して該細胞を未分化細胞に逆分化させる。この点について、よりコミットした細胞を未分化細胞に逆分化するための試薬は、該細胞に直接関与する形又は間接的に関与する形で作用してもよい。
【０１５３】
試薬は、よりコミットした細胞の細胞内部で作用してよい。しかし、該試薬は、よりコミットした細胞の外部で作用することが好ましい。
【０１５４】
直接的関与の例は、よりコミットした細胞が、試薬が細胞表面受容体に直接関与し、Ｂ細胞で見つけることができるような相同領域（同一又は類似の配列を有することが一般的にわかっている領域）を有するβ鎖などの、細胞表面上に少なくとも１つの細胞表面受容体を有する場合である。他の例は、よりコミットした細胞が、試薬が細胞表面受容体に直接関与し、Ｔ細胞で見つけることができるような相同領域を有するα鎖などの、細胞表面上に少なくとも１つの細胞表面受容体を有する場合である。
【０１５５】
間接的関与の例は、よりコミットした細胞が細胞表面上に細胞表面受容体を少なくとも２つ有しており、該受容体の一つと試薬とを関与させることで、よりコミットした細胞の逆分化を誘導する他の受容体に作用する場合である。
【０１５６】
よりコミットした細胞を未分化細胞に逆分化する試薬は、化学化合物又は化学組成物であってよい。しかし、試薬はよりコミットした細胞表面上で細胞表面受容体を関与させることができることが好ましい。よって、好ましい実施形態において、試薬は、よりコミットした細胞によって発現される受容体などの、よりコミットした細胞によって発現することができる受容体であって、よりコミットした細胞の表面上に存在する受容体に関与することができる。
【０１５７】
例えば、好ましい試薬には、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ），ＣＤ４分子，ＣＤ８分子，Ｔ細胞受容体の一部又は全部，（固定された又は遊離な）リガンド，ペプチド，Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ），抗体，交差反応抗体，モノクロナール抗体又はポリクロナール抗体のうちの１又は２以上が含まれる。例えばエリトロポエチンや顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの造血成長因子などの成長因子も用いられうる。
【０１５８】
試薬が抗体，交差反応抗体，モノクロナール抗体又はポリクロナール抗体である場合、該試薬が、ＭＨＣクラスＩＩ抗原のβ鎖，ＭＨＣＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖，ＭＨＣクラスＩ抗原又はＭＨＣクラスＩＩ抗原のα鎖，ＨＬＡ−ＤＲ抗原のα鎖、ＭＨＣクラスＩＩ抗原の又はＭＨＣクラスＩ抗原のα鎖及びβ鎖のうち１又は２以上に対する、抗体、交差反応抗体、モノクロナール抗体又はポリクロナール抗体のうちの１又は２以上であることが好ましい。好ましい抗体の一例は、（Ｄａｋｏ社が供給する）ＣＲ３／４３である。
【０１５９】
「抗体」という文言には、（タンパク質の分割又は組換え技術のいずれから派生しているかにより）抗Ｆａｂ抗体や，抗Ｆ（ａｂ’）_２抗体や，抗ｓｃＦｖ抗体や，該抗体の擬似物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）やバイオソスターズ（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅｓ）などの、結合活性を保持する各種フラグメント、及び誘導体が含まれる。他に抗体に含まれるものとしては、アミノ酸配列の幾つかが例えば結合を促進させるためにアミノ酸残基の置換により改変された、遺伝子工学的に作製された変種や、有害な免疫反応の可能性を減少させるために、本発明の方法に従って処理されることを要する細胞を有する生物体と異なる種において抗体が作製される、遺伝子工学的に作製された変種がある（例えば、「ヒト化」マウスモノクロナール抗体がその一例である）。
【０１６０】
よりコミットした細胞を未分化細胞に転換するのに用いられる試薬は、よりコミットした細胞の細胞外で作用することが好ましい。特に、よりコミットした細胞が該試薬によって随意的に関与することができる受容体を有し、試薬が該受容体に随意的に関与することが好ましい。
【０１６１】
例えば受容体は、細胞表面受容体であってよい。細胞表面受容体の具体例には、ＭＨＣクラスＩ受容体及びＭＨＣクラスＩＩ受容体が含まれる。該受容体は、ＭＨＣクラスＩ受容体又はＭＨＣクラスＩＩ受容体の場合と同様に、α−部分（α−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）及び／又は、β−部分（β−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を有していることが好ましい。
【０１６２】
さらに、前記受容体は、例えば少なくともＨＬＡ−ＤＲのＢ鎖との相同領域などの相同領域を有するβ鎖を有することが好ましい。
【０１６３】
あるいは、又はさらに、前記受容体は、例えば少なくともＨＬＡ−ＤＲのα鎖との相同領域などの相同領域を有するα鎖を有する。
【０１６４】
前記受容体は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ抗原又はクラスＩＩ抗原であることが好ましい。好ましい実施形態において、細胞表面受容体は、ＨＬＡ−ＤＲ受容体，ＤＭ受容体，ＤＰ受容体，ＤＱ受容体，ＨＬＡ−Ａ受容体，ＨＬＡ−Ｂ受容体，ＨＬＡ−Ｃ受容体，ＨＬＡ−Ｅ受容体，ＨＬＡ−Ｆ受容体又はＨＬＡ−Ｇ受容体のうちから選ばれる受容体である。さらに好ましい実施形態において、該細胞受容体はＨＬＡ−ＤＲ受容体である。
【０１６５】
前記試薬は前記受容体に対する抗体であることが好ましく、さらに前記試薬は前記受容体に対するモノクロナール抗体であることが好ましい。
【０１６６】
試薬の好ましい他の実施例では、ＭＨＣクラスＩ^＋発現及び／又はＭＨＣクラス^＋発現などのＭＨＣ遺伝子発現を調節する試薬である。
【０１６７】
好ましい実施形態において、該試薬は、生物反応修飾物と共に用いられる。生物反応修飾物の例には、アルキル化剤，免疫調整剤，成長因子、サイトカイン、細胞表面受容体、ホルモン、核酸、ヌクレオチド配列、抗原又はペプチドが含まれる。アルキル化剤は、シクロホスホアミドであるか、該物質を含むものであることが好ましい。
【０１６８】
他の好ましい生物反応修飾物には、ＭＨＣクラスＩ抗原発現及び／又はＭＨＣクラスＩＩ抗原発現をアップレギュレートすることができる化合物が含まれる。好ましい実施形態には、より効果的に作用するために試薬がＭＨＣ受容体に結合できるために、そのようになっている。
【０１６９】
ＭＨＣクラスＩ抗原及び／又はＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現させるためにいかなるタイプの細胞を用いることができるので、幅広い各種細胞タイプがクラスＩ抗原及び／又はクラスＩＩＭＨＣ抗原を構造的に発現するか否かにより、該各種細胞に逆分化の方法が提供されるであろう。
【０１７０】
ＩＶ．逆分化細胞の方法
本発明の方法において、コミットした細胞を含む細胞の集団は、該集団中で１又は２以上のコミットした細胞に関与しうる試薬と接触させられる。次に細胞集団は、試薬に作用された前記細胞が逆分化過程を経て最終的に未分化となるように、インキュベーションされる。
【０１７１】
接触段階は、前記試薬が、クラスＩ抗原のα鎖の相同領域、クラスＩＩ抗原のα鎖の相同領域，ＣＤ４細胞表面受容体，ＣＤ８細胞表面受容体，リンパ球の存在下におけるクラスＩＩ抗原のβ鎖の相同領域，リンパ球の存在下におけるクラスＩ抗原のα鎖の相同領域，又はリンパ球の存在下におけるクラスＩＩ抗原のα鎖の相同領域のうち１又は２以上と関与する試薬を含むことが好ましい。前記接触段階は、生物反応修飾物（上記を参照）の存在下で行われることが好ましい。
【０１７２】
典型的に細胞集団は、血液組織や骨髄を含む関連組織や，中枢神経系又は末梢神経系由来の神経組織や，筋肉組織や，（例えば口腔から擦り取ることで得た）皮膚由来の表皮組織及び／又は真皮組織などの生体サンプルに由来している。生体材料は、生後由来のものであることが好ましい。被験者からの採取が最小限の医療監督で行うことができることから、血漿やバフィーコートなどの全血又はその産生物を用いることが好ましい。血液サンプルは、ヘパリンやクエン酸などの抗凝固剤でもって典型的に処理される。生体サンプル中の細胞は、特定の細胞を増殖させ、特定の細胞を除去し又は組織全体から細胞を分離させるために処理されてよい。細胞を精製する又は分離するのに有用な方法には、（例えば密度勾配遠心分離などの）遠心分離、フローサイトメトリーや（細胞表面マーカーに対するモノクロナール抗体を含む磁気ビーズの使用やパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）などの）アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。（Ｖｅｔｔｅｓｅ−ＤａｄｅｙＴｈｅＳｃｉｅｎｔｉｓｔ（Ｓｅｐ．１３１９９９）１３（１８）：２１）を参照のこと）。例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ分離は、リンパ球や単球などの単核細胞を残すために赤血球や顆粒球を除去するのに用いられる。
【０１７３】
前記細胞は、本質的に１次培養物であるので、細胞集団の生存を維持させるために適切な栄養素を用いて補助する必要がある。適切な培養条件は、当該技術分野における通常の知識を有する者によって知られている。しかし、細胞集団の処理は、典型的には１２時間以内に、好ましくは２〜４時間以内に、患者から得た生体サンプルの除去を行った後できるだけ早く開始することが好ましい。細胞の生存性は、トリパンブルー排除（ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）試験などの公知の技術を用いることで確認される。
【０１７４】
細胞集団は、少なくとも２時間、典型的には２〜２４時間、好ましくは２〜１２時間、試薬を用いて通常インキュベーションされる。インキュベーションは、例えば３３℃を含む室温約２２℃〜約３７℃までの間で典型的に行われる。逆分化過程の進行状況は、サンプルを少量取り出して、顕微鏡及び／又はサイトメトリーを用いて細胞を調べることにより、経時的に確認することができる。他の方法としては、装置が逆分化過程の進行状況をオンラインでモニターする追跡手段を備えていてもよい。
【０１７５】
所望の細胞タイプの相対量が、例えば低くて０．１％程度、高くて５％程度という適切レベルにまで増加したら、残存の改変された細胞集団を各種方法で用いてもよい。形成された未分化細胞の数に関しては、幹細胞の増殖能力を調べることが重要である。形成された幹細胞又は他の未分化細胞の数は状況により低いようであるが、わずか５０個の分化多能造血幹細胞がドナーマウス中の造血システム全体を再構成することができることが研究で明らかにされている。よって、医療用途として大量の細胞を形成する必要はない。
【０１７６】
よりコミットした細胞の未分化細胞への転換は、患者に前記試薬を投与し、医療用保持体又は希釈剤で混合させることにより、インビボで行うこともできる。しかし多くの場合、逆分化はインビトロ／エクスビボで行われることが好ましい。
【０１７７】
インビトロで得た処理済みの細胞集団は、最小手順でもって徐々に用いることができる。例えば、細胞集団は医療用に容認された保持体又は希釈剤と簡単に結合し、幹細胞を必要とする患者に投与することができる。
【０１７８】
しかし、未分化細胞の細胞集団を増殖させたり、該細胞集団から得られた細胞を精製する方が好ましいようである。かかる過程は、多くの方法（Ｖａｔｔｅｓｅ−Ｄａｄｅｙ−ＴｈｅＳｃｉｅｎｔｉｓｔ１３（１８）：２１Ｓｅｐ１９９９を参照）を用いて通常行うことができる。本発明の装置は、かかる未分化細胞を増殖させるために、又は改変された細胞集団からかかる未分化細胞を回収するために、精製又は単離手段を随意的に含むことができる。例えば、細胞は、クロマトグラフィー及び／又はフローサイトメトリーを用いて細胞表面マーカーに基づき精製されてもよい。しかし、細胞集団中に存在する他の細胞（例えば間質細胞）が幹細胞の生存及び機能を維持することもあるため、細胞集団から未分化細胞を大幅に精製することは必要でなく又好ましくないこともしばしばある。
【０１７９】
フローサイトメトリーは、細胞を分別するのと同様、混合集団内で細胞を特徴づける、確立され、信頼性が高く、かつ強力な技術である。よって、精製又は単離手段は、フローサイトメーターを有していてよい。フローサイトメトリーは、光線を用いて調べた時に区別することができる懸濁液中の粒子の物理的特徴に基づき行われる。かかる粒子は、もちろん細胞でもありうる。物理的特徴には、細胞のサイズ及び構造、又は近年大変広まってきた、蛍光分子と共役するモノクロナール抗体によって結合される細胞表面マーカーが含まれる。
【０１８０】
Ｋｒｅｓｓｅｇｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ３（４）：２６３−８９は、「抗ＣＤ３４モノクロナール抗体が利用可能になったことから、マルチパラメータフローサイトメトリー（ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒｙ）は、造血幹細胞細及び造血前駆細胞を測定するために道具として選べるようになってきた。」と述べており、続けてフローサイトメトリーによるＣＤ３４発現細胞の定量化及び特徴づけに対する一般的技術について記載している。さらに、Ｋｏｒｂｌｉｎｇｅｔａｌ．，１９９４，ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：６４９−５４は、免疫吸収によるＣＤ３４^＋細胞の精製方法とそれに続くＨＬＡ−ＤＲに基づくフローサイトメトリーを教示している。上記のように、ＣＤ３４^＋は、幹細胞／前駆細胞と関連する有用なマーカーである。
【０１８１】
他の物理的特徴づけに基づいて幹細胞を分別するためのフローサイトメトリー技術も用いることができる。例えば、Ｖｉｓｓｅｒｅｔａｌ．，１９８０，ＢｌｏｏｄＣｅｌｌｓ６：３９１−４０７は、幹細胞がサイズ及び構造化された程度に基づいて単離することができることを教示している。Ｇｒｏｇａｎｅｔａｌ．，１９８０，ＢｌｏｏｄＣｅｌｌｓ，６：６２５−４４も、「生存可能な幹細胞は、高度で検証可能な精度で単純な造血組織から分別されうる。」ことを教示している。
【０１８２】
細胞表面マーカー又は他の物理的特性（ポジティブセレクション）の存在に基づいて細胞を選択する方法と同様に、細胞集団は、ネガティブな判定基準を用いて増殖及び精製されうる。例えば、ＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ４２，ＣＤ３などの系譜特異的マーカーを有する細胞は、フローサイトメトリー又はアフィニティークロマトグラフィーによって細胞集団から除去されうる。
【０１８３】
細胞を精製するのに大変有用な技術には、磁気ビーズと結合した抗体又は他のアフィニティーリガンドを用いることが含まれる。該ビーズは細胞集団とインキュベーションされ、アフィニティーリガンドが結合する、例えばＣＤ３４などの細胞表面マーカーを有する細胞が捕らえられる。細胞を含むサンプルチューブは、ビーズがチューブ側面に引き付けられる磁気サンプル濃縮器（ｍａｇｎｅｔｉｃｓａｍｐｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）中に設置される。１又は２以上の洗浄過程を経た後、所望の細胞は、部分的に又は実質的に完全に他の細胞から精製される。ネガティブセレクション形式で用いられた場合、液体相を廃棄することによりビーズに結合した細胞を洗浄するかわりに液体相は維持され、その結果、ビーズに結合した細胞が細胞集団から効果的に除去される。
【０１８４】
これらアフィニティーリガンドに基づく精製方法は、適切なマーカーが特徴づけられている又は特徴づけられうる、いかなる細胞タイプでも用いることができる。
【０１８５】
Ｕｒｂａｎｋｏｖａｅｔａｌ．，１９９６．（Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢＢｉｏｍｅｄＡｐｐｌ．６８７：４４９−５２）は、重力によるフィールドフロー分割（ｇｒａｖｉｔａｔｉｏｎａｌｆｉｌｅｄ−ｆｌｏｗｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）によってマウス骨髄懸濁液から造血幹細胞をミクロ精製すること教示している。さらにＵｒｂａｎｋｏｖａｅｔａｌ．１９９６は、該細胞が骨髄中の他の細胞よりも大きく、混合物から該細胞を分別することが可能であることから、該方法がマウス骨髄からの幹細胞を特徴づけるのに用いられていたと述べている。よって、細胞表面マーカー以外の他の物理的パラメータは、幹細胞の精製／増殖に用いられうる。
【０１８６】
本発明の方法により作製された未分化細胞及び精製された未分化細胞を含む細胞集団は、公知の方法を用いてインビトロで維持することができる。典型的には、前記細胞にとって適切な生育環境を提供するために、ＦＢＳなどの哺乳類血清と随意的に自家血漿とを添加した、Ｈａｎｋｓ，ＲＰＭＩ１６４０，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉａ（ＤＭＥＭ）又は、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏＭｅｄｉｕｍなどの最小成長培地が用いられる。好ましい実施形態では、幹細胞は、間質細胞層などの支持細胞層上で培養される（Ｄｅｒｙｕｇｉｎａｅｔａｌ．，１９９３，ＣｒｉｔＲｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１３：１１５−１５０を参照）。間質細胞は、前駆細胞を未分化状態に維持する因子を分泌すると考えられている。幹細胞の長期培養システムは、Ｄｅｘｔｅｒｅｔａｌ．，１９９７（Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，ｖｏｌ．９１：３３５）及びＤｅｘｔｅｒｅｔａｌ．，１９７９（Ａｃｔａ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，ｖｏｌ．６２：２９９）に記載されている。
【０１８７】
例えば、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，１９９２（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ５３（５）：１０１１−９）は、ヒトＣＤ３４^＋造血細胞がポリスチレン表面上に共有的に固定されたモノクロナール抗体の使用に基づく技術を用いて精製されうること、及び該方法により精製されたＣＤ３４^＋細胞が８５％よりも高い生存率で維持されることを教示している。Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，１９９３（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ，２（３）：３３９−４２）は、ヒトＣＤ３４^＋細胞をどのように単離して培養するかも開示している。各種方法の概説については、Ｈａｙｌｏｃｋｅｔａｌ．，１９９４（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．５（３）：２１７−２５）も参照されたい。
【０１８８】
幹細胞同定の確認は、ＣＦＣアッセイ（実施例も参照）など様々なインビトロアッセイでもって行うことができる。非常に原始的な造血幹細胞は、長時間培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイ（Ｅａｖｅｓｅｔａｌ．１９９１．Ｊ．Ｔｉｓｓ．Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．Ｖｏｌ１３：５５−６２）を用いてしばしば測定されている。ＬＴＣ−ＩＣは、造血系を５−１２週間維持する。
【０１８９】
未分化細胞、及び未分化細胞を含む精製調製物を含む細胞集団は、将来利用するために凍結されてもよい。細胞を凍結させてその後解凍する適切な技術は、当該技術分野においてすでに公知である。本発明の装置は、未分化細胞、及び／又は未分化細胞を含む精製調製物を含む細胞集団を凍結させる凍結手段をさらに随意的に有していてもよい。
【０１９０】
一側面において、逆分化は、バフィーコート血液サンプルから得た細胞又はバフィーコート血液サンプル中の細胞に対して生じていることが好ましい。「バフィーコート（ｂｕｆｆｙｃｏａｔ）」という文言は、未凝固の血液が遠心分離され又は放置された時、赤色細胞層と血漿との間に形成される白色細胞層を意味する。
【０１９１】
Ｖ．細胞集団中における正常分化細胞の割合の変位（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）
正常な組織では、所定の時間における分化細胞及び未分化細胞を含む各種タイプの細胞の相対数は、通常一定である。例えば、健康な２１歳の人の白血球の数は、典型的に１ｍｌにつき約８×１０^６個で、そのうち２７％がリンパ球、６％が単球及び６７％が顆粒球である。（相対数及び絶対細胞数の両方を含めて）かかる細胞レベルは、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＢＣＬＬ）の患者の白血病の血液の例のように、疾患中に混乱する。
【０１９２】
分化細胞の相対数（すなわち割合）は、ヒストペーク（ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）上に全血又はバフィーコートを敷くことにより、顆粒球を除去し、つまり、分化細胞を未分化細胞に逆分化させ、それが置換した細胞を補給するためにかかる未分化細胞が自己再生（増殖）して各種細胞タイプに逆分化するなどにより、例えば単核細胞画分中で混乱させ、妨害し又は転換させる（ｐｅｒｔｕｒｂ，ｄｉｓｔｕｒｂｏｒｄｉｓｐｌａｃｅ）ことができる。
【０１９３】
分化細胞の相対数（すなわち割合）は、（密度勾配培地上で遠心分離することにより又は抗体でコートされた磁気ビーズを用いるネガティブセレクションにより）赤血球、血小板、顆粒球、単球及びＴリンパ球を除去した後に、例えば（健康な血液ドナーから得た）バフィーコート中で混乱させ、妨害し又は転換させることができる。かかる処理は、特定のタイプの分化細胞のネガティブセレクション又は増殖と呼ぶことができ、転換された組織の例である。かかる細胞を培養した後、例えばＩｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏｓＭｅｄｉｕｍ（ＩＳＤＭ）などのカルシウム含有培地において培養され、分化細胞は未分化細胞に逆分化して、該未分化細胞は転換された細胞を補給するために自己再生（増殖）し、各種細胞タイプに再分化する。
【０１９４】
かかる過程の間、細胞は、逆分化を行うためにまずコロニーを形成する（ホモサイト凝集（ｈｏｍｏｃｙｔｉｃａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を行う）ことが観察されている。よりコミットした細胞が未分化細胞に転換したら、該細胞は転換された細胞の相対数を補給しようとして、各種の再分化細胞タイプに増殖及び発達する能力を獲得する。
【０１９５】
細胞集団中の正常な分化細胞の割合を転換することができる逆分化手段には、例えば（純粋及び共役の、すなわち磁気，ガラスやポリスチレンビーズなどの固定リガンド又は遊離リガンドに結合した）抗体，Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ，ＬｙｍｐｈｏＰｒｅｐ又は細胞密度に従って細胞を分別するのに用いられるいかなる密度勾配培地，又は（例えば、赤血球の沈降を引き起こすことができる）Ｄｅｘｔｒａｎを含む。他の適切な逆分化手段は、Ｖｅｔｔｅｓｅ−Ｄａｄｅｙによる論文中に記載されている（ＴｈｅＳｃｉｅｎｔｉｓｔ（Ｓｅｐ．１３１９９９）１３（１８）：２１を参照）。
【０１９６】
転換された細胞をＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びヘパリンを含む適切なキレート試薬（キレート試薬は、ここでは生物反応修飾物とみなされる）に露出することにより、さらによりコミットした細胞が未分化細胞に逆分化することができる。例えば、コルチゾンを含有するカルシウム含有培地中で細胞を培養後に、転換された細胞をＥＤＴＡに所定の時間露出すると、よりコミットした細胞が未分化細胞に逆分化する。次にかかる細胞は、自己再生して新規の分化経路を辿り、バースト形成単位−赤芽球（ＢＦＵ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ）などの赤芽球前駆体を生じさせる。該赤芽球前駆体は培養され、長時間増殖させ、赤血球疾患及び赤血球欠乏の治療に用いられうる。
【０１９７】
ＶＩ．細胞集団を含む培地の遊離イオン濃度の変更
一定時間、例えばＥＧＴＡなどのイオンキレート剤中に分化細胞を露出した後に、例えばＩＭＤＭなど、ヒドロコルチゾンを含有するカルシウム含有培地中でかかる細胞を培養すると、よりコミットした細胞が未分化細胞に逆分化する。次にかかる細胞は、順に自己再生して、最終的に血小板を生じさせる巨核球コロニー形成単位（ＣＦＵＭｅｇ）などの巨核球前駆体を生じさせる新規の分化経路を辿る。
【０１９８】
ＶＩＩ．未分化細胞を再コミットさせる方法
本発明の未分化細胞の重要な応用の一つは、例えば神経細胞や造血細胞などの組織の再構成である。該再構成には、本発明の方法により作製された未分化細胞を分化する過程が含まれる。該再構成は、典型的に骨髄や、脊髄や肺など特定部位において、患者に未分化細胞を単に投与して、患者体内の自然な生理的条件でもって分化を生じさせることにより行うことができる。かかる再構成の具体例としては、例えばＣＤ４^＋リンパ球の数が減少したエイズ患者における、造血システムの再構成又は補強がある。
【０１９９】
他の方法として、分化（ここでは「再コミット」とも呼ぶ）は、インビトロで行われ、細胞を増殖させ、その後例えば治療として投与されてよい。該分化は、成長因子を投与することにより一般的に行われる。例えば、レチノイン酸がＥＳ細胞を神経細胞に分化させるためにこれまで用いられてきた。骨髄間質細胞株及びＩＬ７との共培養を後に行うが、メチルセルロースが、ＥＳ細胞をリンパ球前駆体に分化するために用いられてきた（Ｎｉｓｉｔａｎｉｅｔａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．，ｖｏｌ．６（６）：９０９−９１６）。ＬｅＰａｇｅ（ＮｅｗＳｃｉｅｎｔｉｓｔ１６Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０００）は、ＥＳ細胞が肺上皮細胞に分化できることを教示している。Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，１９８６（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ１１５（１）：１２９−３９）は、筋衛星細胞が成熟筋繊維にどのように分化するかを教示している。神経前駆細胞は、塩基性繊維細胞増殖因子及び上皮増殖因子を用いて増殖させることができる（ＮａｋａｆｕｋｕａｎｄＮａｋａｍｕｒａ，１９９５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．４１（２）：１５３−１６８）。造血幹細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ，エリスロポエチン，幹細胞因子やインターロイキン（ＩＬ１，ＩＬ３，ＩＬ６）などの増殖因子を数多く用いて増殖させることができる。かかる各種因子の概説は、Ｍｅｔｃａｌｆ，１９８９（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３３９：２７−３０）を参照のこと。
【０２００】
Ｐｏｔｏｃｎｉｋｅｔａｌ．，１９９４（ＥＭＢＯＪ．，ｖｏｌ．１３（２２）：５２７４−８３）は、低酸素（５％）条件を用いて、ＥＳ細胞が造血細胞に分化することをさらに示した。
【０２０１】
よって、本発明の好ましい実施形態において、未分化細胞は、分化細胞などの再コミットした細胞にコミットする。再コミットした細胞は、未分化細胞が得られたよりコミットした細胞と同一の系譜であってよい。あるいは、再コミットした細胞は、未分化細胞が得られたよりコミットした細胞と異なる系譜であってよい。例えば、Ｂリンパ球は、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８ＨＬＡＤＲ幹細胞に逆分化してもよい。該幹細胞は、Ｂ細胞系譜（同一の系譜）又はリンパ系譜（異なる系譜）に従って、続けて再コミットしてもよい。
【０２０２】
分化細胞などの再コミットした細胞に未分化細胞をコミットさせることは、当業者にとってすでに公知の各種方法でもって行うことができる。重要なことは、特定の方法及び特定の培地で未分化細胞を培養することにより、選択された細胞への分化を行うことができる点である。
【０２０３】
ほんの一例として、未分化細胞は、以下の培養形態に従って心筋細胞に分化することができる。
【０２０４】
第１日目：汚染された繊維芽細胞からの培養物を得るために、ゼラチン化したプレート上に通常の密度で未分化細胞を置く。
【０２０５】
コロニーが除去されるまで通常の手順で細胞をトリプシン化する。緩やかに結合している細胞の固まりを維持するために、静かに扱う。次に、白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含まないＥＳ細胞培養培地の細菌勾配（ｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒａｄｅ）ペトリ皿中に１：３の割合で細胞をプレート上に直接置く（以下参照）。
【０２０６】
第３日目：注意深く培地を吸引する。凝集体をたくさん吸引しないようにする。その後、新規の培地を添加する。
【０２０７】
第５日目：第３日目と同様に吸引を行い、培地を交換する。
【０２０８】
第７日目：２４ホイール組織培養勾配プレート（２４ｗｈｅｅｌｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｇｒａｄｅｐｌａｔｅ）中に細胞を置く。
【０２０９】
第９日目：培地の半分を交換して、撹拌を続ける。
【０２１０】
第１１日目：培地の半分を交換して、撹拌を続ける。
【０２１１】
さらに一例として、未分化細胞は、以下の手順に従うことによりグリア細胞及び神経細胞に分化することができる。
【０２１２】
第１日目：おせんされた繊維芽細胞からの培養物を得るために、ゼラチン化したプレート上に通常の密度で未分化細胞を置く。
【０２１３】
コロニーが除去されるまで通常の手順で細胞をトリプシン化する。緩やかに結合している細胞の固まりを維持するために、静かに扱う。次に、１μＭのオールトランス型レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ社から入手可能）を含有する、白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含まない培養培地の細菌勾配（ｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒａｄｅ）ペトリ皿中に１：３の割合で細胞をプレート上に直接置く。
【０２１４】
第３日目：細胞凝集体を回収し、ＬＩＦ又はＲＡを含有しないＥＳ細胞培養培地における組織培養皿中に（６ｃｍの組織培養皿につき約２５個の細胞凝集体の割合で）再度置く。該培地を注意深く吸引する。
【０２１５】
第８日目：培地の半分を交換する。この日から、細胞の少なくとも１０％が神経細胞表現形を示す。該神経表現形は、クレシルバイオレットを用いて特異的に染色され、ＮＣＡＭ抗原に対して強く陽性反応を示す。
【０２１６】
当業者は、未分化細胞を選択されたいかなる分化細胞にコミットさせる適切な手順は容易にわかることができる。
【０２１７】
本発明の未分化幹細胞は、通常のいかなる胚幹（ＥＳ）細胞培養技術を用いて培養を行ってもよい。ほんの一例として、未分化細胞又はＥＳ細胞を培養するのに適切な培地を以下に示す。
【０２１８】
１００ｍｌの培地を調製するために、
ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製，カタログ番号１１９６５０６２）８０ｍｌ
１５％のＦＣＳ１５ｍｌ
Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ１ｍｌ
Ｌグルタミン１ｍｌ
ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ社製，カタログ番号１１１４０−０
５０）１ｍｌ
Ｌｉｆ（１０^５Ｕ／ｍｌ）１ｍｌ
ＢＭＥ（０．１Ｍ）０．２ｍｌ
Ｌｉｆは、１０^７Ｕ／ｍｌのＬＩＦＥＳＧＲＯＡＭＲＡＤとして１ｍｌのアンプルで入手でき、該Ｌｉｆは、１００ｍｌのＤＭＥＭ及び１０％のＦＣＳで希釈し、５ｍｌに分注して、−２０℃で貯蔵することができる。
【０２１９】
ＢＭＥに関して、０．１ｍｌのＢＭＥ（１４．４Ｍ）は、１４．３ｍｌのＰＢＳに添加し、０．２ミクロンのアクロディスク（ａｃｒｏｄｉｓｃ）を通じて、−２０℃で最高１ヶ月まで貯蔵することができる。
【０２２０】
さらに適切な培地は、例えばＰＭＥＦ培地であってよく、１００ｍｌの該培地は以下のように調製される。
【０２２１】
ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製，カタログ番号１１９６５０６２）８８ｍｌ
１０％のＦＣＳ１０ｍｌ
Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ１ｍｌ
Ｌグルタミン１ｍｌ
ＢＭＥ（０．１Ｍ）０．２ｍｌ
ＥＳ細胞を培養するための他の適切な培地は、当業者にとって明らかであろう。
【０２２２】
ＶＩＩＩ．逆分化試薬を同定するアッセイ
上記試薬に加えて、さらに適切な試薬は、ＷＯ９６／２３８７０の測定方法又は本発明の測定方法を用いて同定されてよい。後者については、本発明は、コミットした／分化した細胞を未分化細胞に逆分化させることができる物質を同定する方法、すなわちコミットした細胞を含む細胞集団と候補物質とを接触させる過程と、該細胞集団中の未分化細胞の相対数が、増加しているかを測定する過程とを含む前記接触がバフィーコートの存在下で生じることを特徴とする同定方法をも提供している。
【０２２３】
適切な候補物質には、細胞表面受容体に結合する抗体などの（例えば、モノクロナール抗体，ポリクロナール抗体，単鎖抗体，キメラ抗体及びＣＤＲ移植抗体などの）抗体産生物などの細胞表面受容体に結合するリガンドが含まれる。特に関心の高い細胞表面受容体は上述されており、該細胞表面受容体には、例えばＣＤ４やＣＤ８などのＣＤ指示物を有する、ＭＨＣ受容体及び表面タンパク質が含まれる。細胞表面受容体に結合する他のリガンドには、成長因子が含まれる。
【０２２４】
さらに、組換えライブラリー，ペプチド及び擬似ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃｓ），定義された化学物質，オリゴヌクレオチド及び天然産生物ライブラリーが、逆分化試薬としての活性でスクリーニングされてよい。候補物質は、第１スクリーニングにおいて、例えば反応につき１０種類の物質のバッチで用いられてもよく、阻害性を示したバッチの物質を個別に調べてよい。
【０２２５】
典型的なアッセイは、マルチウェルプレートなどの適切な容器中にコミットした細胞を含む細胞を分注する過程を含む。候補物質はウェルに追加され、前記細胞はウェル中でインキュベーションされる。インキュベーションは、室温程度、例えば約２２℃から約３７℃までの、３３℃を含む範囲内で典型的に行われる。
【０２２６】
逆分化は、少量の細胞分注液を除去し，顕微鏡で細胞を測定するために顕微鏡及び／又はフローサイトメトリーで未分化細胞の数が変化したかを検査して測定されてよい。典型的には、未分化細胞の数における変化の測定は、形態的変化も指標とすることができるが、未分化細胞に特徴的な細胞表面マーカーを有する細胞の数の変化を観察することによって行われる。適切な細胞表面マーカーの例には、ＣＤ３４^＋が含まれる。あるいは、又はさらに、分化細胞は典型的だが、未分化細胞には典型的でない細胞表面マーカーを有する細胞の数の減少、例えばＣＤ３，ＣＤ４及びＣＤ８などの系譜特異的マーカーを有する細胞の相対数における減少が、観察されてよい。
【０２２７】
未分化細胞に典型的な特徴を有する細胞の数のいかなる増加は、２４時間以内に生じることが好ましく、いかなる変化も細胞増殖によってでしか説明することができないように、該増加が４〜８時間以内に生じるのがさらに好ましい。
【０２２８】
例えば、ＭＨＣクラスＩ受容体やＭＨＣクラスＩＩ受容体などの細胞表面受容体に結合する試薬を前スクリーニングすることが好ましい。標的細胞表面受容体に結合すると同定されたいかなる試薬も、逆分化に対する効果を測定するために、上記アッセイで用いることができる。特定の例として、抗体結合ドメインを発現するファージディスプレイライブラリーは、ＭＨＣクラスＩＩ受容体のβ鎖の相同領域などの、標的細胞表面マーカーに結合する抗体フラグメント（典型的にはｓｃＦｖｓ）を同定するために用いてよい。ファージディスプレイライブラリーの作製及びスクリーニングと同様に、適切な結合アッセイは、当該技術分野において公知である。アッセイは、例えば逆分化をすでに起こすことがわかっている抗体の誘導体の組換えライブラリーをスクリーニングするために、至適な抗体又は抗体フラグメントを同定するためにも用いることができる。
【０２２９】
ＩＸ．使用
本発明は、コミットした細胞を未分化細胞に逆分化する方法及び装置を提供する。特に本発明は、より分化した細胞から幹細胞を調製する方法及び装置を提供する。幹細胞は各種医療的応用に幅広く用いられているが、現在まで該細胞を得ることは難しく、面倒で、時に倫理的に問題となっていたため、本発明の医療的意味合いは大きい。
【０２３０】
本発明により作製された幹細胞は、ＣＤ４Ｔ−リンパ球などの造血細胞集団又は該細胞の下位集団などの、患者体内の特定の細胞集団を再集団化させるために用いられてよい。幹細胞を作製するために用いられるよりコミットした細胞は、同一の患者又は適合したドナーから得てよい。よって、本発明に従って作製された幹細胞は、特定化した細胞組織及び器官を治癒し、再構成させるために用いられてよい。例えば、未分化細胞は、肺胞の内層細胞などの再コミットした細胞を作製するのに用いることができ、これにより損傷した又は疾病にかかった肺組織を交換する又は修復するメカニズムが作られる（ＬｅＰａｇｅ，ＮｅｗＳｃｉｅｎｔｉｓｔ１９Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０００，ｐ２０を参照）。
【０２３１】
よって、本発明に従って作製された幹細胞は、患者体内で細胞を再集団化させるために、患者体内に導入されてもよい。したがって幹細胞は、最初に移植されてから再集団化する。
【０２３２】
したがって、幹細胞は、リポソーム搬送体を用いてインビボで導入されてもよい。
【０２３３】
よって、本発明は、前記過程のいずれか又は適切な希釈剤、保持体又は賦形剤を用いて混合する装置により調製される未分化細胞を含む医薬品も含む。
【０２３４】
実施形態の一つでは、未分化細胞を含む医薬品は、正しくないゲノム構造を有するよりコミットした細胞により生じた又は該細胞が関与している症状又は条件を緩和するために、正しいゲノム構造を有するなど、有益なよりコミットした細胞を作製するのに用いられてよい。よって本発明は、該発明が本発明の方法により未分化細胞を形成する過程を含むことを特徴とする、よりコミットした細胞から得られた変異型を除去する過程と、細胞のゲノム及び／又は核の配置又は再配置により変異体が除去されることを特徴とする、再コミットした細胞に未分化細胞をコミットさせる過程とを含む方法も提供する。
【０２３５】
遺伝子は、ゲノムの免疫グロブリン部位又はＴＣＲ部位に挿入されることが好ましい。
【０２３６】
本発明は、欠陥細胞又は好ましくない細胞から生じる病気又は疾患を患う患者を治療する方法、すなわち該方法がよりコミットした細胞を未分化細胞に逆分化させる試薬と、よりコミットした細胞とを接触させることにより、未分化細胞を調製する過程と、未分化細胞又は再コミットした細胞が欠陥細胞又は好ましくない細胞に作用して病気や疾患の症状を緩和する、又は該病気や該疾患の患者を治療することを特徴とする、未分化細胞を再コミットした細胞に随意的にコミットさせる過程とを含む方法を提供する。
【０２３７】
あるいは、未分化細胞は、正しくないゲノム構造を有するよりコミットした細胞によって引き起こされた又は該細胞が関与している症状又は条件を治療する物質を産出するよりコミットした細胞を作製するために用いることもできる。
【０２３８】
例えば、本発明は、抗体や、未分化細胞に逆分化するよりコミットした細胞によって発現される抗体に対するＴ細胞受容体を作製するのに用いてよい。この点、抗原は、胎児特異的抗原又は交差反応胎児特異的抗原であってよい。
【０２３９】
本発明には、未分化細胞及びよりコミットした細胞のレベルを調節する方法及び装置が含まれる。例えば、本発明には、本発明の方法により未分化細胞を形成する過程と、細胞死を生じさせるなど、未分化細胞に作用するためにアポトーシス遺伝子を活化させる過程とを含む方法が含まれる。
【０２４０】
好ましい実施例において、本発明は、よりコミットした細胞中に遺伝子を導入する過程を含むことを特徴とする、未分化細胞のゲノムに遺伝子を導入する過程と、遺伝子が未分化細胞中に存在することによる、本発明の方法によって未分化細胞を調製する過程とを含む方法に関する。
【０２４１】
好ましい実施形態において、本発明は、よりコミットした細胞のゲノム中に遺伝子を導入する過程を含むことを特徴とする、未分化細胞のゲノム中に遺伝子を導入する過程と、遺伝子が未分化細胞中に存在することによる、本発明の方法によって未分化細胞を調製する過程とを含む方法に関する。
【０２４２】
遺伝子は、未分化細胞及び該細胞から得たよりコミットした細胞に、ウイルス感染などの病理学的感染に対する抵抗力を持たせる遺伝子であればよい。例示として特に、エイズ患者から得たＢリンパ球は、ＨＩＶ感染に対して抵抗力を有するように設計された幹細胞を作製するのに用いられてよい。増殖され、患者体内に導入された場合、結果として得られたヘルパーＴリンパ球も、ＨＩＶ感染に対して抵抗力を有するであろう。
【０２４３】
他の実施形態において、本発明は、よりコミットした細胞のゲノム中に遺伝子を挿入する過程を含むことを特徴とする、未分化細胞に遺伝子を導入する過程と、遺伝子が未分化細胞のゲノム中で存在することを特徴とする、本発明の方法により未分化細胞を調製する過程とを含む方法に関する。
【０２４４】
加えて、本発明は、再コミットした細胞に未分化細胞をコミットさせる過程と、該再コミットした細胞を骨髄腫に融合させる過程とを含むことを特徴とする、未分化細胞を調製する本発明の方法も含む。該方法により、例えば抗体や抗原やホルモンなどの所望の産出物をインビトロで大量に発現させることができる。
【０２４５】
本発明は、本発明の前記方法のいずれかにより調製された未分化細胞を含む。
【０２４６】
他の実施形態において、本発明の装置及び／又は方法は、例えば血液供給の不足を補うために用いられてよい赤血球を産出するために赤芽球前駆体を効果的に培養するために用いられてよい。同様に、本発明の方法は、血小板の産生に用いられる巨核球を産生するために用いられてよい。
【０２４７】
他の実施形態において、本発明の装置及び／又は方法は、例えば処理細胞の塊など、未分化細胞の塊の調製に用いられてよい。
【０２４８】
本発明の他の側面には、以下の事項が含まれる。
【０２４９】
よりコミットした細胞から未分化細胞を調製するための、本発明のいずれかの試薬の使用方法。
【０２５０】
Ｂリンパ球又はＴリンパ球由来のモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体又は特定の抗体のいずれか一つ；マクロファージ単球系譜の細胞；クラスＩ抗原又はクラスＩＩ抗原を発現することができる核形成された細胞；クラスＩ抗原又はクラスＩＩ抗原の発現を誘導することができる細胞；核形成細胞；フラグメント細胞；又はアポトーシス細胞のいずれか１つを産生する、本発明の方法に従って産生された未分化細胞の使用。
【０２５１】
Ｂリンパ球からエフェクターＴリンパ球を産生する及び／又はその逆を産生する、本発明の方法に従って作製された未分化細胞の使用方法。
【０２５２】
Ｂリンパ球，Ｔリンパ球，マクロファージ単球系譜由来の細胞，クラスＩ抗原又はクラスＩＩ抗原を発現することができる核形成された細胞，クラスＩ抗原又はクラスＩＩ抗原の発現を誘導することができる細胞，又は核形成細胞の群の中から１又は２以上を作製するための、本発明の方法に従って作製された未分化細胞の使用方法。
【０２５３】
本発明は、前記使用方法を用いる過程及びかかる過程から調製された産生物又は組成物も含む。
【０２５４】
本発明は、本発明の未分化細胞を含む医薬品又は適切な希釈剤，保持体又は賦形剤と混合して得られた産生物も含む。
【０２５５】
好ましい実施例の一つにおいて、医薬品には、適切な希釈剤，保持体又は賦形剤と混合した本発明の未分化細胞から得た抗体又は抗原が含まれる。
【０２５６】
医薬品は、癌，自己免疫病，血液疾患，細胞再生，組織再生、臓器再生，臓器移植治療，組織移植治療又は先天性代謝疾患のいずれかの治療に用いられることが好ましい。
【０２５７】
本発明の方法や、例えば未分化細胞など、かかる方法により得られた産生物は、例えば逆分化や分化の研究など研究用に用いられてもよく、該方法や該産生物は、新規に発生する抗原やクラスター分化抗原の同定や研究に用いられてもよい。
【０２５８】
Ｘ．投与
細胞を逆分化させる試薬と同様に、本発明の幹細胞及びよりコミットした細胞は、治療方法において用いられてよい。本発明の細胞及び試薬は、各種要素と結合して、本発明の組成物を産出することが好ましい。さらに該組成物が、医療的に使用可能な保持体又は希釈剤と結合して、（ヒト又は動物に対して用いられてよい）医療用組成物を産生いることが好ましい。適切な保持体及び希釈剤には、例えばリン酸緩衝生理食塩水などの等張性生理食塩水が含まれる。本発明の組成物は、直接注入することにより投与されてもよい。前記組成物は、非経口投与，筋肉内投与，静脈内投与，皮下投与，眼内投与，経口投与又は経皮投与用に形成されてよい。
【０２５９】
細胞を含む組成物は、典型的に注射又は移植により搬送される。細胞は、懸濁液中に搬送されたり、天然及び／又は合成による生物分解可能なマトリックスなどのサポートマトリックス中に埋め込まれてもよい。天然のマトリックスには、コラーゲンマトリックスが含まれる。合成による生物分解可能なマトリックスには、ポリ無水物やポリ乳酸が含まれる。かかるマトリックスは、インビボで脆弱な細胞に対するサポートを提供し、非造血細胞にとって好ましい。
【０２６０】
搬送は、例えば数分から数時間又は数日などの一定時間に、調節された搬送であってもよい。搬送は、（例えば静脈注射による場合のように）全身的なものでも、所望の特定部位に関するものであってもよい。
【０２６１】
細胞は、１ｋｇにつき１×１０^５〜１×１０^７個の細胞を投与量として典型的に投与される。例えば、体重が７０ｋｇの患者には、造血組織を再構成させるために１４×１０^６個のＣＤ３４^＋細胞が投与されてよい。
【０２６２】
当該技術分野の専門家がいかなる特定患者や特定条件に対して至適の投与手順及び投与量を容易に決定することができることから、上記の投与手順及び投与量は、単に目安であることが意図されている。
【０２６３】
以下に詳細に示す方法はすべて、本発明の装置を使用するのに適している。
【０２６４】
Ａ．材料及び方法
患者
Ｂ細胞慢性リンパ性白血病の患者，（ＩｇＡ欠損症やＸ連鎖性小児伴性低γグロブリン血症を含む）抗体欠損症の患者，ＨＩＶ感染及びエイズ症候群の患者，ＣＭＶ感染患者，ホジキンリンパ腫を有する患者，急性Ｔ細胞白血病の患者，ｂｌａｓｔｃｙｔｏｓｉｓを有する生後６日目の小児、各種感染症及び慢性状態の各種患者，脊髄由来，骨髄由来で健常な血液ドナーの増殖されたＢリンパ球調製物由来の血液サンプルを、ＥＤＴＡを含有するラベンダートップチューブ（ｌａｖｅｎｄｅｒｔｏｐｔｕｂｅ）中で得た。加えて、バフィーコート血液サンプルを健常なドナーから得た。
【０２６５】
臨床的条件及び実験的条件
血液サンプルに用いる各種処理方法を含む、患者の臨床的処理条件及び実験的処理条件は、表１に記載されている。コールターカウンターを用いることにより、異なる白血球（ＷＢＣ）が得られた。結果を同表中に示す。
【０２６６】
血液処理
得られた血液サンプルは、ＨＬＡＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対する純粋なモノクロナール抗体（Ｄａｋｏ社製）と共にチャンバー中に導入され、最大で２４時間室温で混合させた。いくつかのサンプルが２２℃でチャンバー内でインキュベーションされた後、該サンプルは最初の１５分間混合された。血液サンプルに添加されたモノクロナール抗体の濃度は、血液に対して１０〜５０μｌ／ｍｌであった。
【０２６７】
加えて、他の処理が同一濃度で行われ、該処理には、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のα鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体の添加，クラスＩ抗原の相同領域に対するモノクロナール抗体の添加，ＣＤ４に対するモノクロナール抗体の添加，ＣＤ８に対するモノクロナール抗体の添加，ＨＬＡＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するＰＥ共役モノクロナール抗体の添加が含まれる。
【０２６８】
他の処理には、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のα鎖及びβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を血液サンプルに同時に添加することが含まれる。
【０２６９】
さらに、シクロホスホアミドなどのアルキル化剤が、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対する純粋なモノクロナール抗体と組み合わせて、血液サンプル中に添加された。
【０２７０】
前記処理に続いて、血液サンプルは、製造者マニュアルに従って標識されたモノクロナール抗体のパネルで染色され、フローサイトメトリーを用いて分析した。
【０２７１】
モノクロナール抗体を用いたインキュベーション時間については、２時間の間隔，４時間の間隔，６時間の間隔，１２時間の間隔から２４時間の間隔と幅がある。
【０２７２】
標識抗体
以下のモノクロナール抗体が、フローサイトメトリーにより細胞上の以下のマーカーを検出するために用いられる。ＣＤ１９及びＣＤ３，ＣＤ４及びＣＤ８，ＤＲ及びＣＤ３，ＣＤ５６＆１６及びＣＤ３，ＣＤ４５及びＣＤ１４，ＣＤ８及びＣＤ３，ＣＤ８及びＣＤ２８，シミュレストコントロール（ｓｉｍｕｌｅｓｔｃｏｎｔｒｏｌ）（ＩｇＧ１ＦＩＴＣ＋ＩｇＧ２ａＰＥ），ＣＤ３４及びＣＤ２，ＣＤ１７及びＣＤ１３＆３３，ＣＤ１０及びＣＤ２５，ＣＤ５及びＣＤ１０，ＣＤ５及びＣＤ２１，ＣＤ７及びＣＤ５，ＣＤ１３及びＣＤ２０，ＣＤ２３及びＣＤ５７，ＣＤ２５及びＣＤ４５ＲＡ（Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社製及びＤＡＫＯ社製）。追加のマーカーには、ＣＤ７１（赤血球細胞マーカー），ＣＤ６１（巨核球マーカー），グリコホリンＡ（赤血球細胞マーカー），ＡＣ１３３（幹細胞マーカー），ＣＤ３８（原始幹細胞マーカー），ＣＤ９０（幹細胞マーカー）及びＣＤ１１７（分化多能幹細胞マーカー）が含まれる。
【０２７３】
バフィーコートサンプルを含む、処理済み及び未処理の各患者の細胞サンプルは、異なるタイプの処理を伴う免疫表現形的変化を説明するために、本発明の装置中で複数の上記パネルを用いて分析された。該分析は、同一の血液サンプルを別々に分注して行われた。未処理サンプル及び他のコントロール処理物を染色して、同時に調べた。
【０２７４】
フローサイトメトリー
白血球サンプルは、製造者マニュアルに従って染色され、溶解された。フローサイトメトリー分析は、ネガティブコントロール後方処理（ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓｂａｃｋｔｒａｃｋｉｎｇ）を含むｓｉｍｕｌｔｅｓｔ又はＰＡＩＮＴＡＧＡＴＥソフトウェア（ＢＤＩＳ社製）のいずれかを用いてＦＡＣＳｃａｎ＠上で行われた。１０，０００〜２０，０００の事象が得られ、リストモードファイルに貯蔵された。
【０２７５】
形態
形態は、顕微鏡及びＷｒｉｇｈｔ染料を用いて調べた。
【０２７６】
増殖した若しくは精製されたＢ細胞（若しくは正常の）リンパ球からの又はバフィーコート血液サンプルからの幹細胞の調製無菌技術が、以下の過程を通じて用いられる。
【０２７７】
（Ａ）単核細胞の分離：
（ｉ）ヒストペーク（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ），リンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）又はリンパ球分離培地（ｓｐ．ｇｒａｖ１．０７７）を、４００ｇで３０分間遠心分離することにより、末梢血液／バフィーコートアンプルから単球細胞を得る。
（ｉｉ）５０ｍｌの円錐管中の単球細胞を回収し、２％の加熱によって活性化したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び２ｍＭのＥＤＴＡ又は０．６％のクエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）を含有する、３０ｍｌのＨａｎｋ’ｓ平衡塩類溶液（Ｃａ^２＋なし及びＭｇ^＋なし、Ｓｉｇｍａ社製）を用いて洗浄し、４００ｇで１０分間遠心分離する。
（ｉｉｉ）洗浄後、ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ及びｈａｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて細胞を数えて、視覚化した。
（ｉｖ）Ｂ細胞の数が７０％（白血球細胞に対して２０×１０^９／Ｌ）以上と高い場合、Ａ（ｖｉ）に直接進む。
（ｖ）Ｂ細胞の数が（白血球細胞に対して２０×１０^９／Ｌ）以下と低い場合、後述のセクションＣに記載されるように、Ｍａｃｓミクロビーズ（ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ）又はＦａｃｓバンテージ（Ｖａｎｔａｇｅ）精製技術を用いてネガティブセレクションを行う。
（ｖｉ）１０％の（熱不活化）ＦＣＳ及び１０％の（熱不活化）ＨＳを含むＩＭＤＭ培地（１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）中で、３×１０^６／ｍｌの濃度で細胞ペレットを再懸濁し、血液バッグ中に入れる。注意事項：ＦＣＳ及びＨＳが入手可能でない場合、２０％〜５０％の自己プラズマ（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｐｌａｓｍａ）を使用する。
【０２７８】
Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＢＣＬＬ）の末梢血液サンプルから得た単核画分中の幹（未分化）細胞の調製
白血球が、該白血球細胞の５０％がＢ細胞である、１ｍｌにつき２０×１０^６個をこえる細胞である場合、ネガティブセレクションを行わないことを除いて、前記単球細胞分離（Ａ）の手順に従う。
以下の手順は、本発明の装置中で行われてよい。
【０２７９】
（Ｂ）純粋なＣＲ３／４３（Ｄａｋｏ社製）を用いる細胞の処理：
単核細胞分離がＡ（ｖｉ）でなされた後、以下の手順に進む。
（ｉ）支持フック上に（上記Ａ（ｖｉ）からの）血液バッグを置く。
（ｉｉ）６ウェルを有するチャンバーを用いて、該マルチウェル培養皿又はチャンバーの各ウェル中に、（上記Ａ（ｖｉ）からの）入力血液バッグから２ｍｌの細胞懸濁液を加えるように装置にプログラムする。
（ｉｉｉ）ＣＲ３／４３ｍａｂを含むシリンジから、ＣＲ３／４３（純粋なモノクロナール抗体，Ｄａｋｏ社製）の９９μｌ／ｍｌ（又はバフィーコートサンプルに関して４９．５μｌ／ｍｌ）をそれぞれ有する適当数のウェルを処理する装置にプログラミングして、他のウェルを未処理（ネガティブコントロール）のままにする。
（ｉｖ）多湿の環境において、３７℃で５％のＣＯ_２中でチャンバーをインキュベーションする。
【０２８０】
（Ｃ）細胞の精製：
細胞の分離及び精製する各種方法が公知である（Ｖｅｔｔｅｓｅ−ＤａｄｅｙＳｃｉｅｎｔｉｓｔ１３（１８）：２１Ｓｅｐ１３１９９９を参照）。
【０２８１】
適切な方法の一つは、ＭＡＣＳミクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製。ここでは製造者マニュアルに従うのが最もよい）を用いるＢ細胞のネガティブセレクションである。
（ｉ）上記セクションＡにおける単核細胞を得る。
（ｉｉ）（２％のＦＣＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡ又は０．６％のクエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）からなる）ＨＢＳＳ中で、１０^８個の全細胞につき最終量が３００μｌの細胞をペレットし、再懸濁する。
（ｉｉｉ）１０^８個の全細胞につき、ＣＤ２に対する純粋なモノクロナール抗体（ＩｇＧ１、Ｄａｋｏ社製）を１００μｌ添加する。
（ｉｖ）１０^８個の全細胞につき、ＣＤ３３に対する純粋なモノクロナール抗体（ＩｇＧ１、Ｄａｋｏ社製）５０μｌを同一の懸濁液に添加する。
（ｖ）インキュベーションするために、室温で１０分間該混合物を放置する。
（ｖｉ）（２％のＦＣＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む）ＨＢＳＳを用いて細胞を洗浄し、１０^８個の全細胞につき４００μｌの最終濃度で同一の緩衝液と共に再懸濁する。４００ｇで１０分間遠心分離する。（上記通り）ＨＢＳＳ中のペレットを再懸濁する。
（ｖｉｉ）１０^８個の全細胞につき１００μｌのウサギ抗マウスＩｇＧ１抗体で標識されたミクロビーズを加える（又は製造者マニュアルに従う）。
（ｖｉｉｉ）細胞を完全に混合させ、１５分間６℃〜１２℃（冷蔵庫）でインキュベーションする。
（ｉｘ）（２％のＦＣＳ及び２ｍＭのＤＥＴＡを含む）ＨＢＳＳを用いて再び洗浄し、４００ｇ×１０分間遠心分離し、１０^８個の全細胞につき５００μｌの最終濃度で同一の緩衝液と共に再懸濁する。
（ｘ）ＭＡＣＳ分離器（ｓｅｐａｒａｔｏｒ）の磁界（ｍａｇｎｅｔｉｃｆｉｅｌｄ）の中でＭＳ^＋／ＲＳ^＋を集める。単核細胞数が大きい場合、ＭＳ^＋／ＲＳ^＋カラムを二つ用いる。
（ｘｉ）（２％のＦＣＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む）３ｍｌのＨＢＳＳを用いてカラムを洗浄する。
（ｘｉｉ）カラムに細胞を通し、（２％のＦＣＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む）ＨＢＳＳを用いて、４×５００μｌで洗浄する。
（ｘｉｉｉ）円錐管中に細胞を抽出（ｅｌｕｔｅ）して回収し、次にＩＭＤＭ中でペレットして再懸濁し、セクションＡ（ｖｉ）にあるような血液バッグ中に入れる。
【０２８２】
Ｄ）蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）バンテージ（Ｖａｎｔａｇｅ）精製Ｂ細胞：
（ｉ）上記セクションＡ記載のように、ＢＣＬＬ患者の末梢血液サンプルから単核細胞を得る。
（ｉｉ）Ｂ細胞を同定するために、ＣＤ１９ＰＥ共役モノクロナール抗体及びＣＤ２０ＦＩＴＣ共役モノクロナール抗体の組合せを用いて前記細胞を染色する。
（ｉｉｉ）ＣＤ１９／ＣＤ２０の蛍光に基づき、ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｅｎｓｏｎ社製ＦＡＣＳバンテージ（Ｖａｎｔａｇｅ）及び４８８ｎｍで放射するアルゴンレーザーを用いて、約１０^７個の細胞を区別する。
（ｉｖ）５０％のＦＣＳを含有するＨａｎｋｓ平衡塩類溶液を用いて精製された細胞を洗浄し、次に５％のＣＯ_２で高湿度にしたインキュベーター中で、３７℃一晩かけて回復させる。
（ｖ）細胞をペレットして再懸濁し、上記セクションＡ（ｖｉ）記載のように血液バッグに入れ、上記セクションＢ記載のようにＣＲ３／４３を用いて処理する。
【０２８３】
白血球中の幹細胞の調製
白血球中の純粋なＣＲ３／４３（Ｄａｋｏ社製）モノクロナール抗体を用いての細胞の処理は、本発明の装置中で行われてよい。
（ｉ）（Ｂリンパ球が７３〜９５％の範囲にある）３０〜２００×１０^９／ＬのＷＢＣ細胞数の患者を選択する。
（ｉｉ）クエン酸、ＥＤＴＡ−又は防腐剤無添加のヘパリン含有チューブ中に静脈穿刺（ｖｅｎｉｐｕｎｃｔｕｒｅ）により細胞を回収し、血液バッグ中に血液を入れる。回収された細胞は直ちに用いられる。さらに回収から約６時間以内に用いられることが好ましい。しかし、窒素下で貯蔵／凍結された血液は、解凍後に用いることができる。
（ｉｉｉ）本発明の装置中の全血を含有する（ｉｉ）から血液バッグを置く。
（ｉｖ）自動化された分化白血球細胞測定は、コールターカウンターを用いて行われる。（６０９５％がＢ細胞である）１ｍｌにつき３０２００×１０^６個の白血球を有する患者を選択することが好ましい。
（ｖ）血液の生存は、自動的に測定されてもよく、好ましい方法には、ピロピジウムヨウ化物（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ）とフローサイトメトリー、又はトリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ）と塩化アンモニウム溶液を使用した赤血球の溶解に続く血球計算器（ａｈａｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒｆｏｌｌｏｗｉｎｇｌｙｓｉｓｏｆｒｅｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）のいずれかを用いる方法が含まれる。
（ｖｉ）ＣＲ３／４３抗体が、（例えば白血球の数が、５０×１０^９／Ｌの場合、５０μｌのＣＲ３／４３モノクロナール抗体、１５９μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ濃度が血液１ｍｌにつき添加されるべきである。）１〜３μｌ／１０^６細胞の最終濃度で、前記装置のチャンバー中で全血のサンプルに添加される。
（ｖｉｉ）前記装置のチャンバー中のパドルを用いて血液と抗体とを混合させ、インキュベーションしたチャンバー中で、室温、好ましくは１８℃〜３７℃の間で、２時間以下でない所定の時間放置する。
（ｖｉｉｉ）前記装置の追跡手段を用いて、ｍＡｂを添加してから０時間後，２時間後，６時間後及び２４時間後に、フローサイトメトリー，クローンアッセイ，長時間培養及び／又はＰＣＴ分析を用いて血液細胞を分析する。
【０２８４】
注意事項：ｍＡｂＣＲ３／４３により誘導される、テストチューブ底部において、Ｂ細胞がホモタイプ凝集（ｈｏｍｏｔｙｐｉｃａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）し、接着細胞が形成されることから、分析前に広口ピペットチップ（ｗｉｄｅ−ｂｏｒｅｐｉｐｅｔｔｅｔｉｐｓ）を用いて細胞を完全に混合してサンプルとする。
【０２８５】
前記分析において均一した細胞集団を得るために、ＣＲ３／４３による処理を行う前に複数のチャンバー中で個別に分注液中に血液サンプルを分ける。
【０２８６】
ＣＲ３／４３モノクロナール抗体を用いて培養されたＢ細胞を処理して得られた幹細胞を分析するための調製
本発明の方法を用いて産生された幹細胞は、例えば２時間ごと，７時間ごと，２４時間ごと，毎日，７日ごと又はさらに長時間（長時間培養培地を毎週細胞に与えることにより、毎月）など、各種時間点で測定することができる。後の時点で分析する処理物及びコントロールウェルを残しておいて、１又は２以上の処理物及びコントロールウェルを、各時間点で分析することができる。
【０２８７】
前記測定方法は、本発明の装置に設けられた追跡手段によって自動的に行われてもよい。
【０２８８】
（ｉ）広口ピペット（ｗｉｄｅｂｏｒｅｐｉｐｅｔｔｅ）を用いて非接着層を静かに除去し、単一細胞懸濁液を得るために広口ピペットでの吸引を繰り返すことにより、細胞の塊をｄｉｓｒｕｐｔする。
（ｉｉ）細胞スクレーパを用いて、接着層をはがして、単一細胞懸濁液を得るためにｗｉｄｅｂｏｒｅｐｉｐｅｔｔｅでの吸引を繰り返すことにより、細胞の塊を静かにくずす。
（ｉｉｉ）他の方法として、最初にＨＢＳＳで洗浄して接着層をトリプシン化し、続けて１ウェルにつき０．２５％のトリプシンを２ｍｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベーションする。
（ｉｖ）広口ピペットで繰り返しピペットすることにより、細胞の塊を静かに乱す。
（ｖ）１０分後、トリプシンを不活化するために２０％のＦＣＳを用いてインキュベーションして最終濃度にする。
（ｖｉ）上記（ｉｉ）又は（ｖ）で得られた培養細胞は、各時点でタイプ（例えば、処理細胞及び未処理細胞）ごとにプールされ、４００ｇで１０分間遠心分離されてよい。
（ｖｉｉ）ＰＣＲ分析（Ｃを参照）を行うために、（ｖｉ）で得られた細胞ペレット（処理細胞及び未処理細胞）は、直接使用される。
（ｖｉｉｉ）クローンアッセイを行うために、上記過程（ｉｉ）及び（ｖ）で得られた細胞ペレット（処理細胞及び未処理細胞）は、２％の加熱活性化ＦＣＳを含むＩＭＤＭ中で再懸濁される。少量の細胞分注液が、細胞数を数えるために取り出され、トリパンブルー及び血球計算器（ｈａｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて細胞の生死を判別した。
（ｉｘ）ＦＡＣ分析を行うために、２％の加熱活性化ＦＣＳ及び５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＨａｎｋｓ平衡塩類溶液（カルシウムフリー及びマグネシウムフリー）中で、上記過程（ｉｉ）及び過程（ｖ）で得られた細胞ペレット（処理細胞及び未処理細胞）を再懸濁した。
【０２８９】
幹細胞の分析：
以下の方法を、幹細胞の測定に用いることができる。本発明の装置には、以下に詳細が記載されている方法の全部又は一部を行う追跡方法が含まれる。
【０２９０】
（Ａ）免疫表現型（ｉｍｍｕｎｐｏｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）：
全血サンプルを（フローサイトメトリーを用いて）免疫表現型分析を行うため、（ｉ）（製造者マニュアルに従って）免疫染色し、赤血球を溶解させ、インキュベーション時間後に細胞を洗浄し、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で処理する。ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製の溶解液及び洗浄溶液が、典型的に用いられる。
（ｉｉ）（全血，単核細胞画分，ＭＡＣＳミクロビーズ，ネガティブに選択されたＢ細胞又は貯蔵されたＢ−ＣＬＬ中の）白血球は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）に直接共役するｍＡｂで標識されるべきである。
（ｉｉｉ）免疫表現型分析で用いられるパネルマーカーは、以下のものであってよい。
・ＣＤ３８ＰＥ＋ＣＤ４５ＦＩＴＣ＋ＣＤ３４ＰＥ−Ｃｙ５
・ＣＤ１９ＰＥ＋ＣＤ１０ＦＩＴＣ＋ＣＤ３４ＰＥ−Ｃｙ５
・ＣＤ１１７ＰＥ＋ＣＤ３ＦＩＴＣ＋ＣＤ３４ＰＥ−Ｃｙ５
・ＣＤ３３ＰＥ＋ＣＤ６１ＦＩＴＣ＋ＣＤ３４ＰＥ−Ｃｙ５
・グリコホリンＡＰＥ＋ＣＤ７１ＦＩＴＣ＋ＣＤ３４ＰＥ−Ｃｙ５
・ＡＣ１３３ＰＥ＋ＣＤ９０ＦＩＴＣ＋ＣＤ３４ＰＥ−Ｃｙ５
・ＣＤ１９ＰＥ＋ＣＤ５ＦＩＴＣ
・ＩｇＧ１ＰＥ＋ＩｇＧ１ＦＩＴＣ＋ＩｇＧ１ＰＥ−Ｃｙ５（アイソタイプネガティブコントロール）
（ｉｖ）以下のモノクロナール抗体のペアからなる、ＩＭＫ＋ｋｉｔ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた二重標識を行ってもよい。
・ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及びＣＤ１４−ＰＥ；
・ＣＤ１９−ＰＥ及びＣＤ３−ＦＩＴＣ；
・ＣＤ８−ＰＥ及びＣＤ４−ＦＩＴＣ；
・ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ及びＣＤ３ＦＩＴＣ；及び
・ＣＤ５６，ＣＤ１６−ＰＥ及びＣＤ３−ＦＩＴＣ。
【０２９１】
また、ＩｇＧ_１−ＦＩＴＣ及びＩｇＧ_２ａ−ＰＥに対するアイソタイプ適合ネガティブコントロール（ｉｓｏｔｙｐｅｍａｔｃｈｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ）が含まれる。
【０２９２】
（ｖ）Ｄａｋｏ社及びＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社によって作製された以下の付加的な抗体も用いることができる。
ＰＥ−共役：抗ＣＤ８抗体，抗ＣＤ３３抗体，抗１３抗体，抗ＣＤ３４抗体，抗ＣＤ１９抗体，抗ＣＤ２２抗体，抗ＣＤ１４抗体，抗ＣＤ３３抗体，抗ＣＤ５抗体；
ＦＩＴＣ−共役：抗ＣＤ３抗体，抗ＣＤ７抗体，抗ＩｇＭ抗体，抗ＣＤ２２抗体，抗ＣＤ２０抗体，抗ＣＤ１０抗体，抗ＣＤ７抗体，抗ＣＤ１６抗体，抗ＴＣＲαβ抗体。
【０２９３】
（ｖｉ）以下のものを用いることもできる。
・ＣＤ３４に特異的なアフィニティー精製ＩｇＧ_３モノクローナル抗体（Ｄａｋｏ社製）も用いることができ、かかる抗体は、第２抗体としてＦＩＴＣ−又はＰＥ−標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンＦ（ａｂ）’_２抗体フラグメント（Ｄａｋｏ社製）を用いて検出される。
・ＱｕａｎｔｕｍＲｅｄ（ＰＥ−Ｃｙ５）−共役抗ＣＤ３４抗体（Ｄａｋｏ社製）も用いられた。
【０２９４】
（ｖｉｉ）ＦＡＣＳｃａｎ又はＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）又は他のフローサイトメーターを用いて細胞を分析する。１００，０００個の細胞と同数の事象が観察され、時間が記録されるべきある。
（ｖｉｉｉ）ＰｒｏｐｒｉｅｔａｒｙＰａｉｎｔ−ａ−Ｇａｔｅ，ＬｙｓｉｓＩＩ，Ｃｏｎｓｏｒｔ３０及びＣｅｌｌＱｕｅｓｔのソフトウェアを用いてデータを分析する。
【０２９５】
（フローサイトメトリーを用いた）バフィーコートサンプルの免疫表現型分析には、例えば、
（ｉ）（製造者マニュアルに従って）免疫染色し、赤血球を溶解し、インキュベーション時間後に細胞を洗浄し、モノクローナル抗体で処理する。ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社の溶解液及び溶液が典型的に用いられる。
（ｉｉ）白血球は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、又はＲＰＥ−Ｃｙ５に直接共役されるモノクローナル抗体を用いて二重に又は単独で標識されるべきである。
【０２９６】
以下の標識済マーカーが適切に用いられてよい。
ＣＤ３４（幹細胞マーカー）；ＣＤ１９（Ｂリンパ球マーカー）；ＣＤ４５（白血球マーカー）；ＣＤ３（Ｔリンパ球マーカー）；ＣＤ３３（骨髄マーカー（ｍｙｅｌｏｃｙｔｅｍａｒｋｅｒ））；ＣＤ７１（赤血球マーカー）；ＣＤ６１（巨核球マーカー）；グリコホリンＡ（赤血球マーカー）；ＡＣ１３３（幹細胞マーカー）；ＣＤ３８（原始幹細胞マーカー），ＣＤ９０（幹細胞マーカー）；ＣＤ１０（リンパ系幹細胞マーカー）；ＣＤ１１７（分化多能幹細胞マーカー）；ＩｇＧ１（ネガティブコントロール）。
【０２９７】
（Ｂ）形態学：
形態学的分析としては：
光学顕微鏡
（ｉ）広口ピペットチップを用いて、２％の加熱活性化ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ中で完全に細胞を再懸濁する。
（ｉｉ）適切な染色溶液を用いてＬｅｉｔｚ顕微鏡下で調べる。例えば、ＭａｙａｎｄＧｒｅｅｎｗａｌｄ染色溶液（ＢＤＨＣｈｅｍｉｃａｌＬｔｄ社製）を、骨髄性細胞及びリンパ系細胞の分析に用いてもよい。当該技術分野において通常の技術を有する者は、例えばＷｒｉｇｈｔ染料又はギムザ（Ｇｉｅｍｓａ）染色など、他のコロニーを同定するのに適切な他の染料について容易に気づくであろう。
（ｉｉｉ）Ｂ−ＣＬＬリンパ球の形態的分析は、血液フィルム中で又は細胞遠心分離を行った調製物（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）でそれぞれ行うことができる。
【０２９８】
共焦点顕微鏡
（ｉ）上記のように、Ｂ細胞を得る（健康な血液ドナーのバフィーコートから得られるＢ−ＣＬＬ又は正常なＢ細胞）。
（ｉｉ）上記のように、ＣＲ３／４３モノクローナル抗体でＢ細胞を処理する。
（ｉｉｉ）器官培養皿に２ｍｌの細胞懸濁液を加える（該皿の底は、カバーガラスを有するように設計されている）。
（ｉｖ）ＣＤ１９ＦＩＴＣ−共役物に１５μｌのモノクローナル抗体を加え、ＣＤ３４ＰＥ／Ｃｙ５−共役物（ＱｕａｎｔｕｍＲｅｄ）に１５μｌのモノクローナル抗体を加える。
（ｖ）生存可能性を査定するためにヨウ化プロピジウム（ＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ）を用い、核を染色するためにヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）を用いる。
【０２９９】
（Ｃ）ＶＤＪ／ＪＨＦ遺伝子再配列のＰＣＲ分析
ＩｇＨ遺伝子のＶＤＪ及び／又はＪＨＦ領域は、抗体処理の前と後（２時間後、６時間後及び２４時間後）にＢ−ＣＬＬ末梢血及びバフィーコートから得たテンプレートＤＮＡを用いてＰＣＲ法（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ）により分析された。かかる実験手順は、Ｓｔｏｌｃｅｔａｌ（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ３８：１−８：１９９１）から採用されている。ＪＨＦプライマーは、生殖系列配置中の免疫グロブリン重鎖遺伝子の正の検出のために用いられる。ＪＨ６プライマーは、免疫グロブリン重鎖遺伝子に対する正の内部制御として用いられる。Ｂ細胞では、正常のリンパ球と同様に白血病のリンパ球においてもＪＨＦ領域が常に削除されているのため、該細胞は増殖できないが、内部制御するＪＨ６遺伝子はそのまま残っている。β−アクチン遺伝子は、コントロールとして用いられた。
【０３００】
（ｉ）ＱｉａｇｅｎＱｉＡｍｐＭａｘｉｂｌｏｏｄｋｉｔを用いて全血からＤＮＡを単離する。最大限産出が行われる手順を用いる。（処理済み又は未処理の）各サンプルから全ＤＮＡを抽出する。
（ｉｉ）濃度と質を測定するため、１．５％のアガロースゲル上で未希釈のＤＮＡ及び１：５の割合で希釈したＤＮＡを流した。
（ｉｉｉ）ＰＣＲ分析−９６℃で５分間、２〜３μＬの未希釈のゲノムＤＮＡテンプレートを熱した。
【０３０１】
Ｉ）ＪＨ６ａ／ＪＨ６ｇＪＨＦａ／ＪＨＦｇ
以下に記載の表に従って、４人の患者に充分な「マスターミックス（ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）」（処理済みと未処理とで８つの反応）を調製する。該マスターミックスは、適切に上下に調節される。
【０３０２】
【表１】

【０３０３】
変性したゲノムＤＮＡを含む各チューブ中に、９５μＬの「マスターミックス」を分注する。１分３０秒間を９５℃；２分間を５５℃；１分３０秒間を７２℃（３５サイクル）；５分間を７２℃（１サイクル）にｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒを設定する。
【０３０４】
ＩＩ）β−アクチン
上記Ｉ）記載のように８つの反応に対して充分な「マスターミックス」を調製する。該マスターミックスは、適切に上下に調節される。
【０３０５】
【表２】

【０３０６】
変性したゲノムＤＮＡを含む各チューブ中に、９５μＬの「マスターミックス」を分注する。１分３０秒間を９５℃；２分間を５５℃；１分３０秒間を７２℃（２５サイクル）；５分間を７２℃（１サイクル）にサーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）を設定する。
【０３０７】
ＰＣＲ法に用いるプライマー
ＩｇＨＪＨＦ遺伝子の２４０ｂｐフラグメントを増幅するために設計された、第１群のプライマーは、以下の通りである。
ＪＨＦａＡＡＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＧＧＴＣＣＣＣＴＧ
ＪＨＦｂＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＴＡＴＴＣＡＧＣ
領域６に参加する、ＩｇＨＪＨＦ遺伝子の２４２ｂｐフラグメントを増幅するために設計された、第２群のプライマーは、以下の通りである。
ＪＨ６ａＣＡＴＴＧＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＪＨ６ｂＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＴＧＣ
β−アクチン遺伝子の２４９ｂｐフラグメントを増幅するために設計された、第３群のプライマーは、以下の通りである。
ベータＡＣＴ−１ＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴ
ベータＡＣＴ−２ＴＣＧＧＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧ
（Ｄ）ＶＤＪの遺伝子再配列のサザン分析
（ｉ）ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩを用いて、（Ｂ−ＣＬＬ患者から得た）処理済み及び未処理の末梢血サンプル又は精製されたＢ細胞から得たゲノムＤＮＡを消化する。典型的には、分析を行うのに充分な量のＤＮＡを得るためには、多数のウェルから得た細胞が必要となる。
（ｉｉ）消化物は、０．８％のアガロースゲル上で分解され、製造者指示（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５）に従ってＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ナイロン膜（Ｄｕｐｏｎｔ社製）に移される。
（ｉｉｉ）ＩｇＨ遺伝子の再配列は、胎盤ゲノムＤＮＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）から単離された^３２Ｐ−標識ヒトＪ_ＨＤＮＡプローブを用いて、ＩｇＨ座のＪ領域を分析することにより特徴づけられる。
（ｉｖ）オートラジオグラフは、発達前の数日間−７０℃に保たれる。
【０３０８】
（Ｅ）長期培養：
上記方法により調製された細胞培養物は、長期培養培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏｓＭｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭＧｉｂｃｏＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＬｔｄ．社製），１０％の熱活化されたＦＣＳ，１０％の熱活化されたウマ血清（ＨＳ），１％のヒドロコルチゾン，１％のペニシリン／ストレプトマイシン５×１０^−７Ｍ貯蔵溶液）を用いて毎週育成することにより、より長期時間維持（長期培養）されうる。
（ｉ）まず、ＣＲ３／４３処理開始から一定時間、例えば２４時間後に、２ｍｌの長期培養物を添加することで各ウェル中の細胞を希釈する。
（ｉｉ）ウェルを毎週育成し、成長培地の半分を除去する。
（ｉｉｉ）位相差顕微鏡を用いてウェルを観察する。
【０３０９】
（Ｆ）クローンアッセイ：
（ｉ）処理開始後の各一定時間後に、３００μｌの培養培地中に非接着細胞が上記方法で得られる。
（ｉｉ）上記培養培地中の細胞懸濁液中に、３ｍｌのメトカルトＧＦＨ４４３４（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＩＭＤＭ，ＦＣＳ，ＢＳＡ，Ｌ−グルタミン，ｒｈ幹細胞因子，ｒｈＧＭＣＳＦ，ｒｈＩＬ−３及びｒｈエリトロポエチンからなる）を添加する。
（ｉｉｉ）１．１ｍｌの細胞混合物を取り出し、三つのプレートに置く。
（ｉｖ）１４日間、５％のＣＯ_２と５％のＯ_２を含む多湿のペトリ皿中で、３７℃でプレートをインキュベーションする。
（ｖ）位相差顕微鏡を用いてＣＲ３／４３モノクロナール抗体を用いて処理する前後のウェルを観察する。
（ｖｉ）１４日後、前記細胞（コロニー）は、フローサイトメトリー，共焦点顕微鏡及び／又はＰＣＲにより分析される。
（ｖｉｉ）コロニーアッセイを行う場合、アルコールエーロゾルは、細胞に衝撃を与える又は破壊して、（処理済み及び未処理の）両タイプの細胞の生存を妨害することから、避けるべきである。
【０３１０】
Ｂ．結果
ＣＤ１９及びＣＤ３パネル
ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いる、本発明の装置中で血液サンプルを処理すると、ＣＤ１９^＋細胞の相対数が常に減少した。かかるマーカーは、全Ｂ細胞抗原である（表を参照）。前記抗原は、成熟過程の全段階において全てのヒトＢリンパ球上に現れているが、前記抗原は、終局的に分化した血漿細胞上では消失している。よって、かかる事実は、Ｂ細胞が未分化細胞に逆分化したことを示すものである。
【０３１１】
同一の処理により、ＣＤ３^＋細胞の相対数が、ＣＤ３−ＣＤ１９⁻細胞の相対数の増加を常に伴って、Ｂ−ＣＬＬ患者の血液中で特に顕著に増加する。ＣＤ３は、全ての成熟Ｔリンパ球上及び６５％〜８５％のチモサイト（ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ）に現れる。かかるマーカーは、α ／β 又はガンマ／デルタＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と会合して常に観察され、かかる複合体は、細胞内部にシグナルを伝達する上で重要である。よって、かかる事実は、Ｂ細胞が未分化細胞に逆分化し、該Ｂ細胞が新規の分化細胞、すなわちＴ細胞にコミットしたことを示すものである。
【０３１２】
新規の細胞クローンが、ＣＤ１９マーカー及びＣＤ３マーカー、すなわちＣＤ１９^＋細胞及びＣＤ３^＋細胞を共発現する、Ｂ−ＣＬＬ患者の処理済みの血液中に現れる（チャート１中の、処理開始から２時間後，６時間後及び２４時間後の患者２，３及び４を参照）が、かかる処理は本発明の装置中で行ってよい。異なる条件を有する他の患者は、かかる細胞クローンの相対数の増加を示した。前記細胞は、例外的に巨大で、非常に顆粒球化しており、高レベルのＣＤ１９が細胞膜上に発現していた。前記ＣＤ３マーカーは、通常の成熟リンパ球上で発現するＣＤ３マーカーと同様レベルで前記細胞上に発現するようである。
【０３１３】
表２では、患者番号２、３及び４は、実際に同一患者を示す番号であり、かかる説明は時間の経過による血液の処理効果を単に示すためのものである（前記患者の実験的及び臨床的条件については、表１を参照のこと）。
【０３１４】
処理サンプル中のＣＤ１９^＋クローン及びＣＤ３^＋クローンは、時間の経過により減少するようであり、未処理サンプル中で測定されたレベルである本来のレベルに２時間，６時間及び２４時間で到達する。
【０３１５】
同一のサイズ及び顆粒性を有する他の細胞タイプは、処理サンプル中において検出され、かかる細胞は、該表面上で高レベルのＣＤ１９を発現させたが、該細胞は、ＣＤ３マーカーに対してネガティブで、また該細胞は、ＦＣ受容体を豊富に有していた。しかし、かかる細胞の相対数は、時間の経過により減少するようである。興味深いことに、血液サンプル（２、３及び４）を２４時間処理する場合、血液サンプルを２時間及び６時間処理した後、最初に増加を示した細胞群中において、ＣＤ１９⁻ＣＤ３⁻細胞の相対数が減少した。しかし、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖と相同性を示す領域に対するモノクロナール抗体を有する血液を処理すると、ＷＢＣ集団をコールターカウンターで数えた結果が減少した。かかる発見は、前記タイプの処理がコールターにより検出されない異型細胞を生じさせるが（表１）、表面マーカー、サイズ及び顆粒性に基づいて細胞を数えるフローサイトメトリーでもって測定すると説明可能であることを示している。さらに、前記異型細胞は、Ｗｒｉｇｈｔ染料を用いて顕微鏡下で形態を分析することにより説明される。かかる現象のフローサイトメトリーの図は、チャート（１、２、３及び４）に示されており、血液サンプルを処理することにより得られた免疫表現形の変化は、ＣＤ１９^＋及びＣＤ３^＋リンパ球が相互に関連した細胞群であるものの、幹細胞と比較してＣＤ１９及びＣＤ３の相対的発現に基づいて該細胞が区別可能であることを示すようである。
【０３１６】
表２では、患者番号５及び６が同一の患者を表しているが、処理済み及び未処理の血液サンプルの分析が、経時的かつ同一時間に観察された（表１を参照）。
【０３１７】
Ｂ細胞に悪性がない患者の血液は、Ｂ−ＣＬＬ患者の血液と比較された時、免疫表現形の変化に同様の傾向を示したが、該変化の程度は同じでなかった。しかし、かかる患者の血液中のＢリンパ球及びＭＨＣクラスＩＩポジティブ細胞の相対数及び絶対数は、Ｂ−ＣＬＬ患者の血液中で観察されたＢリンパ球及びＭＨＣクラスＩＩポジティブ細胞の相対数及び絶対数と比較して、極度に低かった。
【０３１８】
Ｂ細胞が欠乏している、Ｘ連鎖性小児伴性低γグロブリン血症の兄弟２人では、血液処理によりＣＤ３^＋細胞の相対数において、異なった免疫表現形の変化が観察された。未発病である生後２ヶ月の弟では、血液を処理するとＣＤ３⁻ＣＤ１９⁻細胞の相対数が減少に伴い、ＣＤ３^＋細胞の相対数が若干増加した。一方、すでに発病して、ＤＲ抗原を発現する活性化されたＴ細胞の数が比較的高い２才の兄では、血液を処理するとＣＤ３^＋細胞の数が減少した。前記患者から得られた血液サンプルはごく少量であったことから、他のマーカーを用いて、他に生じたかもしれない免疫表現形の変化を調べることはしなかった（表２、ＩＤ４３／ＢＤ及び０４／ＢＤ）。
【０３１９】
表２の患者９１では、ＣＤ３⁻ＣＤ１９⁻細胞の相対数の増加を伴う血液処理に従って、ＣＤ３^＋細胞の相対数が減少した。しかし、ＣＤ４やＣＤ８などの他の表面マーカーの分析（表３を参照）において、患者の血液中のＣＤ４^＋ＣＤ８^＋細胞の相対数が高いことが観察され、かかる結果はＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体で血液サンプルを処理する前に観察され、かかる二重ポジティブ細胞が血液処理に従って大幅に減少する。さらに、他のマーカーが分析された時、ＣＤ３^＋細胞の相対数は増加したようであった（表４を参照）。
【０３２０】
本発明の装置中でＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体を用いて処理した場合、正常な血液ドナーから得たＢリンパ球を増殖させる調製を行うと、ＣＤ１９^＋細胞の相対数の減少と、ＣＤ１９⁻ＣＤ３⁻細胞の相対数の増加を常に伴う、ＣＤ３^＋細胞の相対数の顕著な増加が見られた。例えばＣＤ４やＣＤ８などのマーカーを用いてさらに分析を行うと、かかるマーカーの相対数に付随的な増加が見られた。しかし、同じモノクロナール抗体を用いて処理する場合、同一の血液ドナーのＴリンパ球を増殖させる処理を行うと、同じ変化は見られなかった。
【０３２１】
ＣＤ４及びＣＤ８パネル
ＣＤ４抗原は、ヒト免疫不全ウイルスに対する受容体である。ＣＤ４分子は、クラスＩ抗原上のＣＤ８結合部位に類似する領域である、Ｂ２ドメイン中でＭＨＣクラスＩＩ抗原と結合する。クラスＩＩ抗原に対してＣＤ４を結合すると、抗原に対するＴ細胞の応答性が促進され、クラスＩ抗原に対するＣＤ８の結合も促進される。ＣＤ８抗原は、ナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球のサブセットや多くの正常なチモサイトと同様に、ヒトサプレッサー／細胞毒性Ｔリンパ球のサブセット上に存在する。ＣＤ４及びＣＤ８抗原は、チモサイト上で共発現し、かかる細胞は、Ｔリンパ球に成熟するにつれていずれかのマーカーを失う。
【０３２２】
表２に記載の血液サンプルの大部分から得たＣＤ４及びＣＤ８マーカーの分析（以下参照）では、Ｂリンパ球が未分化細胞に逆分化する過程及びその後Ｔリンパ球に分化する過程の存在を支持する染色パターンが現れた。
【０３２３】
二重ポジティブ細胞であるＣＤ４^＋ＣＤ８^＋細胞は、β鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いて血液サンプルを処理した後で常に現れ、かかるタイプの細胞は、Ｂ−ＣＬＬ患者の血液処理サンプル中で大幅に増加するが、未処理サンプル中では全く存在しない（表３及びチャート１，２，３及び４を参照）。また同じ例では、例えばＣＤ８^＋細胞やＣＤ４^＋細胞などの単一ポジティブ細胞の相対数が同時に増加することが観察された。さらに、少なくともＢ−ＣＬＬの例でＢ細胞に対応するＣＤ４⁻ＣＤ８⁻細胞の相対数は、経時的に測定された場合に同じレベルのままである未処理の例と比較した場合、処理サンプル中で大幅に減少することが観察された。しかし、処理サンプル中で経時的にＣＤ４^＋ＣＤ８^＋細胞の相対数が測定された場合、二重ポジティブ細胞の相対数の減少と共に、単一ポジティブ細胞の相対数の増加が付随して生じた。かかる免疫表現形の変化は、胸腺におけるＴリンパ球系譜の前駆細胞の胸腺発達の特徴である（患者番号２、３及び４）。ＣＤ４抗原は、ヘルパー／誘導Ｔリンパ球のサブセット（ＣＤ４^＋ＣＤ３^＋）上及び正常なチモサイト上の大部分に存在する。しかし、かかる抗原は、単球の細胞表面上及び単球やマクロファージの細胞質中において低密度で存在する（ＣＤ３⁻ＣＤ４^＋）。
【０３２４】
ＣＤ４^＋が低い細胞の相対数は、本発明の装置中で処理した、異なる血液サンプル中で個別に作用される。かかる細胞タイプの相対数は、未処理サンプルと比較した場合、Ｂ−ＣＬＬ患者の処理済み血液サンプル中で影響を受けなかったようである。かかる低レベルのＣＤ４発現は、単球上及び最初期のチモサイト上で観察された。
【０３２５】
処理済みのＨＩＶ^＋患者２５では、ＣＤ４とＣＤ８とを同時に発現する二重ポジティブ細胞の数が増加した。一方、処理済みの患者９１では、前記細胞のサブタイプが減少し、かかる現象は経時依存的であった。ＣＤ８^＋細胞の相対数は、経時的に測定された場合、Ｂ−ＣＬＬ患者の未処理血液サンプル中で増加することが観察されたが、ＣＤ４^＋及びＣＤ４^＋が低い細胞の相対数は、同じ時間で減少することが観察された（表３の患者２、３及び４）。
【０３２６】
ＤＲ及びＣＤ３パネル
ＤＲマーカーは、単球，樹上細胞，Ｂ細胞及び活性化されたＴリンパ球上に存在する。
【０３２７】
このパネルで分析された処理済み及び未処理サンプルは、ＣＤ１９マーカー及びＣＤ３マーカー（表２を参照）を用いて分析した場合に得られたサンプルに対して同様の免疫表現形の変化を示した。上述の抗原は、それぞれ全Ｂ細胞マーカー及びＴ細胞マーカーである。
【０３２８】
本発明の装置中でモノクロナール抗体を用いて血液を処理すると、ＤＲ^＋Ｂリンパ球の相対数に影響するようであり、ＤＲ^＋細胞が減少した。これに対し、ＣＤ３^＋（Ｔ細胞）細胞の相対数は、大幅に増加した。（表４及びチャートを参照）。さらに、Ｂ−ＣＬＬ患者の処理済み血液サンプルの多くで、活性化されたＴ細胞の相対数が大幅に増加し、かかる細胞タイプは他の条件の患者の処理済みサンプル中で様々に影響を受けた。
【０３２９】
さらに、ＤＲに対して高いポジティブ細胞の相対数は、Ｂ−ＣＬＬ患者及び血液中でＤＲ^＋ＣＤ３４^＋芽球が増加した生後６日目の小児の処理サンプル中において大幅数で出現した。しかし、患者血液中に存在した芽球は、処理前後でＴ細胞マーカー及びＢ細胞マーカーに対してネガティブであったが、処理後骨髄系譜抗原に対してよりポジティブになった。ＣＤ３⁻ＤＲ⁻細胞の相対数は、処理血液サンプルの大部分で増加し、ＣＤ３^＋細胞（Ｔ細胞）の相対数の増加に比例しており、ＤＲ^＋細胞（Ｂ細胞）の相対数の減少に反比例する。
【０３３０】
ＣＤ５６＆１６及びＣＤ３パネル
ＣＤ５６＆ＣＤ１６マーカーは、大型顆粒リンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球として通常知られているリンパ球のサブセットである、異質性のグループの細胞上で見られる。ＣＤ１６抗原は、事実上全ての静止ＮＫリンパ球上で発現し、また該抗原は、特定の個体から得たＣＤ３^＋Ｔリンパ球のいくつかで弱く発現した。前記抗原は顆粒球上でさらに低量見つかり、さらに該抗原は大きなアズール親和性の顆粒を含有するリンパ球と会合する。ＣＤ１６抗原は、ＩｇＧＦＣ受容体ＩＩＩである。
【０３３１】
ＣＤ１６^＋リンパ球の可変数は、ＣＤ５７抗原又は低密度のＣＤ８抗原のいずれか、あるいは両方を共発現する。個体のほとんどでは、ＣＤ５、ＣＤ４又はＣＤ３抗原などの他のＴリンパ球抗原との重なり合いは、事実上ない。ＣＤ５６抗原は、事実上全ての静止ＣＤ１６^＋ＮＫリンパ球上及び活性化されたＣＤ１６^＋ＮＫリンパ球上に存在し、かかる細胞のサブセットは、非主要組織適合遺伝子複合体限定の細胞傷害性を有している。
【０３３２】
Ｂ−ＣＬＬ及び他の条件の患者の処理済み及び未処理血液サンプルの免疫表現形では、大幅に顆粒球化した中型サイズのＣＤ５６＆ＣＤ１６抗原を共発現する細胞の相対数が増加した（表５及びチャート１、２、３及び４）。かかる観察は、（ＣＤ５６マーカー及びＣＤ１６マーカーを発現しない）ＣＤ３抗原のみを発現する細胞の相対数及びＣＤ５６＆ＣＤ１６マーカー及びＣＤ３マーカーを一緒に共発現する細胞の相対数の大幅な増加を伴っていた。
【０３３３】
表５では、患者番号２、３及び４が、同じ血液サンプルを表すが、（処理前後の）それぞれ２時間、６時間及び２４時間で分析がなされている。前記サンプルは、ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対してモノクロナール抗体と共に血液を処理すると、ＣＤ５６^＋及びＣＤ１６^＋細胞、ＣＤ３^＋細胞及びＣＤ５６^＋及びＣＤ１６^＋ＣＤ３^＋細胞が同時に産生され、かかる観察がＢ細胞マーカー（ＣＤ１９、ＤＲ、ＣＤ５６、ＣＤ１６⁻ＣＤ３⁻）の消失を常に伴うことを示す。
【０３３４】
処理前後のかかる血液サンプルのさらなる分析では、ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ１６^＋細胞のレベルが経時的に低下し、ＣＤ３^＋細胞のレベルが経時的に増加することが示された。
【０３３５】
Ｂ−ＣＬＬの患者７の血液サンプルは、処理済み及び未処理サンプル中で観察された免疫表現形の変化と比較した場合、ＣＤ５６抗原、ＣＤ１６抗原及びＣＤ３抗原を発現する細胞数において、いかなる変化も示さなかったが、これは添加されたモノクロナール抗体の量が、Ｂリンパ球の数に対して大幅に少なかったことによる。しかし、適切量のモノクロナール抗体を用いて別機会に患者の血液サンプルを処理すると、ＣＤ３^＋細胞，ＣＤ５６^＋＆ＣＤ１６^＋細胞及びＣＤ５６^＋細胞及びＣＤ１６^＋ＣＤ３^＋細胞の相対量が大幅に増加することが示された。
【０３３６】
他の条件の他の患者の血液サンプルは、該細胞のレベルが可変的変化を示したが、この結果は処理前の血液中に存在したＢリンパ球数や、処理時間や恐らく患者の臨床的状態に依存するようである。
【０３３７】
ＣＤ４５及びＣＤ１４パネル
ＣＤ４５抗原は、末梢血、胸腺、脾臓、扁桃腺中のリンパ球、単球、多形核細胞、好酸球、及び好塩基球や、骨髄中の白血球前駆体など、全てのヒト白血球に存在する。
【０３３８】
ＣＤ１４は、正常な末梢血単球の７０％〜９３％、胸部流動食細胞又は腹部流動食細胞の７７％〜９０％に存在する。前記抗原は、顆粒球上に弱く発現するが、前記抗原は刺激されていないリンパ球，マイトジェン活性化Ｔリンパ球、赤血球又は血小板上に存在しない。
【０３３９】
ＣＤ４５抗体は、プロテインチロシンホスファターゼのファミリーの代表例であり、この分子は、外部刺激（抗原）と相互作用してＳｃｒ−ファミリーメンバーを介してシグナル伝達を行い、細胞増殖及び分化を調節する。
【０３４０】
処理済み血液サンプル中のＤＲ抗原、特にＢ−ＣＬＬ患者から得たＤＲ抗原のβ鎖が関与することにより、かかる処理がＢリンパ球上のＣＤ４５抗原のレベルに影響が生じる。ＤＲ抗原のβ鎖を刺激することで生じる全体的な免疫表現形の変化は、前方散乱光及び側方散乱光（それぞれサイズ及び顆粒性）によって測定される形態と同様に、ＣＤ４５及びＣＤ１４の発現レベルに基づいて区別することができる、異なる細胞タイプを生じさせるようであり、かかる結果が表６及びチャート（１，２、３及び４）に示されている。ＣＲ３／４３抗体を用いて処理した後のＣＤ４５⁻ＣＤ１４⁻細胞の出現を示す図７も参照のこと。かかる細胞は、造血系細胞でない。
【０３４１】
本発明の装置中で処理を行うと、（未処理サンプルと比較した場合、）ＣＤ４５ｌｏｗ細胞の相対数は大幅に増加し、ＣＤ４５抗原及びＣＤ１４抗原を共発現する細胞の相対数も同様に増加する。前記免疫表現形タイプの変化は、（未処理サンプルと比較して）ＣＤ４５ｈｉｇｈ細胞の相対数の減少と合致している。しかし、後者の細胞集団は、形態及びＣＤ４５の発現程度に基づいてさらに分けられる。タイプの一つは非常に大型で、チャート中の残りの細胞と比較した場合、該タイプは非常に高レベルのＣＤ４５抗原を有していた（チャート１、２、３及び４を参照）。経時的処理の後、前記パネルの分析を行うと（表６の患者２，３及び４と、チャート１を参照）、ＣＤ４５^＋細胞の相対数は、開始時に大幅に減少し、経時的にＣＤ４５ｌｏｗ細胞が生じるようになる。しかし、２４時間後に血液を分析すると、状況は逆であった。
【０３４２】
サンプル５及び７は、他のＢ−ＣＬＬ患者から得た他のサンプルを用いて得られた変化と反対の免疫表現形の変化を示すが、これはインキュベーション時間のかなりの初期段階でモノクロナール抗体を用いてサンプルを分析したことによる。実際、処理後の血液サンプルを連続的に分析すると、Ｂリンパ球により生じた免疫表現形の変化は時間依存的であったが、これは発達段階を示すものであり、Ｘ時間に測定された免疫表現形の変化が（一度誘導されたら固定されない）Ｘプラス時間において同じにならないことによる。しかし、前記タイプの変化は体内でより厳格な方法で生じなければならず、それ以外は免疫病理学の予測通りである。Ｂ細胞に異常がない他の患者から得た血液サンプル処理を影響させると、細胞の免疫表現形における可変的な変化が見られたが、これはＢリンパ球が低量で存在することによる。しかし、正常な血液ドナーから得たＢリンパ球の増殖された画分を処理すると、Ｂリンパ球数が多いＢ−ＣＬＬから得た免疫表現形の変化に類似する免疫表現の変化が見られた。
【０３４３】
ＣＤ８及びＣＤ３パネル
ＣＤ８抗原決定基は、クラスＩＭＨＣ分子と相互作用して、結果としてＣＤ８＋Ｔリンパ球と標的細胞との間の接着を増強した。前記相互作用のタイプは、静止リンパ球の活性化を増進する。ＣＤ８抗原は、プロテインタイロシンキナーゼ（ｐ５６ｉｃｋ）と共役し、次にＣＤ８／ｐ５６ｉｃｋ複合体がＴリンパ球活性化において役割を果たす。
【０３４４】
本発明の装置中で、Ｂ鎖に対するモノクロナール抗体を用いてＢ−ＣＬＬ患者から得た血液サンプルを処理すると、ＣＤ３ＣＤ８ポジティブ細胞及び（ＣＤ４ＣＤ３である可能性が高い）ＣＤ３ポジティブ細胞の相対数が大幅に増加し、開始時に生成された二重ポジティブ細胞が成熟Ｔリンパ球に発達することがより明確に示される。これは、ＣＤ１９やＤＲによって直接に、ＣＤ８⁻ＣＤ３⁻抗原によって間接的に測定される過程である。経時的に同一患者の処理済み血液サンプルを連続して測定すると、チモサイト発達の過程と一致することがわかる（表７の患者２、３及び４と、チャート１）。
【０３４５】
ＣＤ８^＋細胞の相対数は処理済みサンプル及び未処理サンプルにおいて経時的に増加するが、該相対数は未処理サンプルにおいてより大幅に増加する。一方、ＣＤ８^＋ＣＤ３^＋細胞の相対数は、未処理サンプルにおいて経時的に減少した。しかし、経時的に測定された場合、処理済血液サンプル中でＣＤ３^＋細胞の相対数は増加し、前記細胞タイプはＣＤ４^＋ＣＤ３^＋単一ポジティブ細胞、すなわちチモサイトの成熟型に大幅に対応している。加えて、（表３、４、５及び６で上述したように）前記サンプルが他のパネルとの免疫表現形でもあったことから、全体の変化はＴリンパ球前駆体及び先駆物（ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ）の生成においてＢ細胞を大幅に生じさせる。
【０３４６】
Ｂ−ＣＬＬ患者（番号２、３及び４、表１、２、３、４、５、６、７）の分注された血液サンプルは、何も用いないものと、ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するＰＥ共役モノクロナール抗体と、同じモノクロナール抗体の未共役型とでそれぞれ処理された。ＰＥ共役型を比較するにあたり処理を行ったところ、同じ血液サンプルを未共役型の抗体を用いて処理した場合に大幅に観察されたＣＤ３ポジティブ細胞、及びＣＤ４などの会合されたマーカーの相対数に明確な変化は見られなかった。しかし、経時的に測定した場合、細胞表面上に発現するＤＲ抗原を有さないＣＤ４５ポジティブ細胞の数の増加が見られた（表８を参照）。かかる結果と類似の発見は、経時的に免疫表現された場合の未処理サンプルにおいて見られた（表６）。さらに、ＣＤ４５ｌｏｗを発現する細胞の相対数は経時的に低下するが、かかる現象は同一患者の未処理サンプルにおいても（経時的に測定した場合に）見られた（チャート１Ａを参照）。
【０３４７】
ヒトバフィーコートサンプル由来細胞のＦＡＣ分析
本発明の装置中で、ＣＲ３／４３モノクロナール抗体を用いてバフィーコートを処理すると、ＣＤ３４のより大きな発生（幹細胞マーカー）と、ＣＤ１９（Ｂリンパ球マーカー）のより小さな発生が生じた。表２１を参照のこと。
【０３４８】
コロニー形成アッセイにより、未処理サンプル中で優位なコロニーは、赤芽球タイプのものであるが、処理済みサンプル中のコロニータイプの可変性は、主要コロニーが分化多能細胞コロニー，赤芽球コロニー形成単位と一緒の顆粒球／マクロファージ及び巨核球と大変大きい。
【０３４９】
かかる結果は、処理済み細胞が他の造血系経路に沿ってさらに分化することができ、その結果各種特異的細胞系になることを示している。
【０３５０】
Ｃ．Ｔリンパ球に対して異なる特異性を有する他のモノクロナール抗体の作用の比較
ＣＤ１９及びＣＤ３パネル
本発明の装置中で、ＤＲ抗原のα鎖の相同領域と、ＭＨＣクラスＩ抗原の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いて血液サンプルを処理すると、ＣＤ３^＋細胞の数が減少し、ＣＤ１９^＋細胞の数が増加した。ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いて同じ血液を処理すると、ＣＤ１９^＋細胞の数が減少し、ＣＤ３^＋細胞の数が増加した。シクロホスホアミドを用いて後者のモノクロナール抗体を処理すると、同様の影響を示した（２時間処理したＢ−ＣＬＬの患者５／６、表１４を参照）。
【０３５１】
同じサンプル中のＣＤ１９^＋細胞及びＣＤ３^＋細胞をさらに分析すると、ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いて処理した血液中でのみ、ＣＤ３^＋細胞の相対数がさらに増加した（処理後２４時間の時点の患者５／６、表１４を参照）。しかし、ＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体を加えて、シクロホスホアミドを用いて処理した血液サンプルをさらに分析すると（２４時間後の時点の患者５／６、表１４を参照）、全く同一の条件下で２時間インキュベーションした時点で観察された結果と比較した場合、ＣＤ１９^＋細胞及びＣＤ３^＋細胞の相対数が逆転した。
【０３５２】
一般的に、ＤＲ抗原のα鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体又はクラスＩ抗原のα鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いて、同一患者の血液サンプルを処理すると、未処理サンプルと比較した場合、ＣＤ１９^＋細胞（全Ｂマーカー）の相対数の増加が見られた。ＣＤ１９⁻ＣＤ３⁻細胞の相対数は、ＤＲ抗原のα鎖に対するモノクロナール抗体を用いて処理した、又はクラスＩ抗原に対するモノクロナール抗体を用いて処理した血液サンプル中で僅かに減少した（表１４及びチャート２、３及び４を参照）。クラスＩ抗原に対するモノクロナール抗体を用いて患者０９の血液サンプルを処理すると、ＣＤ３^＋細胞の相対数は増加し、ＣＤ１９^＋細胞及びＣＤ１９⁻ＣＤ３⁻細胞の相対数は僅かに減少した。しかし、ＤＲ抗原のα鎖又はβ鎖に対するモノクロナール抗体を用いて正常な血液ドナーから得て増殖調製されたＢリンパ球を処理すると、Ｂ−ＣＬＬ患者で得られたのと同様の免疫表現形の変化が見られた。
【０３５３】
ＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体を用いてＨＩＶ^＋及びＩｇＡ欠損患者を処理すると、ＣＤ３^＋細胞の相対数が増加し、ＣＤ１９^＋細胞の相対数が減少した。しかし、クラスＩ抗原の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いて同じ血液サンプルを処理すると、同じ効果を示さなかった。Ｂ細胞欠損患者（３４／ＢＤ及び０４／ＢＤ）から得た血液サンプルを処理すると、ＤＲ抗原のβ鎖、クラスＩ抗原及びＣＤ４抗原に対するモノクロナール抗体を用いて処理した場合、可変的な免疫表現形の変化が見られた。
【０３５４】
ＣＤ４及びＣＤ８パネル
ＣＤ１９及びＣＤ３パネル（表１４）を用いて分析された血液サンプルは、ＣＤ４及びＣＤ８パネル（表１５）と免疫表現形でもあった。両パネルは、相互に一致し、確証している。ＤＲ抗原に対するβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いて、又はシクロホスホアミドを加えた該モノクロナール抗体を用いてＢ−ＣＬＬ患者の血液サンプルを２時間インキュベーションすると（表１５、患者５／６及び１０、チャート２、３及び４）ＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋細胞と両マーカーを共発現する細胞の相対数が増加した。一方、ＤＲ抗原のα鎖の相同領域、クラスＩ抗原のα鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いて同じサンプルを処理しても、同じ効果が生じなかった。
【０３５５】
シクロホスホアミドを加えた、ＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体を用いて２時間及び２４時間のインキュベーション時間で得た免疫表現形の傾向を比較すると、ＣＤ４及びＣＤ８ポジティブ細胞の相対数が逆の変化を示し（表１５、２時間及び２４時間時のＢ−ＣＬＬ患者５／６）、かかる変化は、同じ細胞サンプルがＣＤ１９及びＣＤ３パネルを用いて分析された場合に得られる変化と合致していた（表１４の同一患者）。後の発見から、未分化細胞はＴリンパ球又はＢリンパ球に分化するので、以降の分化は可逆的であることがわかった。
【０３５６】
ＤＲ及びＣＤ３パネル
ＤＲ及びＣＤ３パネルを用いて得られた免疫表現形の変化（表１６）は、２時間時点での分析で、ＤＲ抗原のベータ又はアルファ側の相同領域に対するモノクロナール抗体、又はクラスＩ抗原に対するモノクロナール抗体又はシクロホスホアミドを加えたＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体を用いて同じ血液サンプルを処理したＣＤ１９及びＣＤ３パネルとＣＤ４及びＣＤ８パネル（表１４及び１５、チャート２、３及び４）を用いて得られた結果を確認する。
【０３５７】
結果から、ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体は、ＤＲ^＋細胞からのＣＤ３ポジティブ細胞の産生を大幅に誘発することができるようである。
【０３５８】
さらに、ＤＲ抗原のα鎖の関与又はシクロホスホアミドと連携した該分子のβ側の関与を含む処理など（インキュベーション時間の延長）で、ＣＤ１９^＋細胞又はＤＲ^＋細胞の相対数の増加が促進された。
【０３５９】
ＣＤ５６＆１６及びＣＤ３パネル
本発明の装置中で、血液サンプル、特にＢリンパ球の数が高いＢ−ＣＬＬ患者の血液サンプルをＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いて処理すると、ＣＤ５６＆１６ポジティブ細胞の相対数が増加した。
【０３６０】
前記患者では、ＣＤ３^＋及びＣＤ５６^＋及びＣＤ１６^＋ＣＤ３^＋細胞の相対数は、同じ血液サンプルがＣＤ３及びＣＤ１９及びＤＲ及びＣＤ３パネルを用いて分析された場合、β鎖に対するモノクロナール抗体を用いて血液サンプルを処理後に、増加した。
【０３６１】
ＣＤ４５及びＣＤ１４パネル
本発明の装置中で、ＤＲ抗原のβ鎖又はα鎖，シクロホスホアミドを加えたβ鎖又はクラスＩ抗原に対するモノクロナール抗体を用いて処理された血液サンプルは、ＣＤ４５及びＣＤ１４パネルを用いても分析された（表１８）。ＣＤ４５ｌｏｗ，ＣＤ４５ｈｉｇｈ及びＣＤ４５ｍｅｄｉｕｍの区別は、恣意的なものである。ＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体又はシクロホスホアミドを加えた該モノクロナール抗体を用いて（２時間の時点で）血液サンプル５／６を処理すると、ＣＤ４５^＋ｌｏｗ細胞が生成され、ＣＤ４５^＋ｍｅｄｉｕｍ細胞の相対数が増加した。しかし、前者の処理は、ＣＤ４５^＋ｈｉｇｈ細胞の相対数を増加させ、後者の処理はＣＤ４５^＋ｍｅｄｉｕｍ細胞の相対数を減少させ、さらにかかる変化は経時依存的であった。
【０３６２】
クラスＩ抗原に対するモノクロナール抗体を用いて処理した、患者５／６及び１０（Ｂ−ＣＬＬ）の血液サンプルは、ＣＤ４５^＋ｍｅｄｉｕｍ細胞の相対数において減少を示し、類似の観察結果が、未処理サンプルと比較した場合、同じ処理をした血液サンプル０９及びＨＩＶ^＋中において見られた。クラスＩ抗原に対するモノクロナール抗体を用いて、ＨＩＶ^＋患者及びＩｇＡ／Ｄ患者の血液サンプルを処理すると、未処理サンプル又はＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体を用いて処理したサンプルと比較した場合、ＣＤ４５^＋ｌｏｗ細胞の相対数が増加した。しかし、前記患者の血液サンプルは、ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いて処理したＣＤ４５^＋ｍｅｄｉｕｍ細胞の相対数においては、減少を示した。ＭｅｄｉｕｍＣＤ４５^＋細胞は、クラスＩ抗原に対するモノクロナール抗体処理後にＩｇＡ／Ｄ患者の血液サンプル中で増加した。非常に大型で、かなりの程度顆粒化した、ＣＤ４５抗原を高レベルで発現する細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ抗原のＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いて処理された血液サンプル中で観察された（チャート１、２、３及び４を参照）。
【０３６３】
ＣＤ８及びＣＤ２８パネル
ＣＤ２８抗原は、約６０％〜８０％の末梢血Ｔ（ＣＤ３^＋）リンパ球、５０％のＣＤ８^＋Ｔリンパ球及び５％の未成熟ＣＤ３チモサイト上に存在する。チモサイトが成熟する間、ＣＤ２８抗原の発現は、低密度であったほとんどのＣＤ４^＋ＣＤ８^＋未成熟チモサイトから事実上全ての成熟ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋チモサイト上で高密度に増加した。細胞活性化は、ＣＤ２８抗原密度をさらに増加させた。ＣＤ２８の発現は、ＣＤ８^＋リンパ球を２つの機能グループにも分ける。ＣＤ８^＋ＣＤ２８^＋リンパ球は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ限定である、同種抗原特異的なサイトトキシンを介在する。細胞増殖の抑制は、ＣＤ８^＋ＣＤ２８⁻サブセットにより介在される。ＣＤ２８抗原は、細胞接着分子であり、活性化Ｂリンパ球上に存在するＢ７／ＢＢ−１抗原に対するリガンドとして機能する。
【０３６４】
本発明の装置中で、ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いてＢ−ＣＬＬ患者（表１９、患者５／６及び８）の血液サンプルを処理すると、ＣＤ８^＋、ＣＤ２８^＋及びＣＤ８^＋ＣＤ２８^＋細胞の相対数が増加し、他のタイプの処理では、かかる増加はなかった。
【０３６５】
ＣＤ３４及びＣＤ２パネル
ＣＤ３４抗原は、未成熟造血前駆細胞上に、及び単一性前駆体（ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ）及び分化多能前駆体（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＣＦＵ−Ｍｉｘ及びＣＦＵ−ｂｌａｓｔ）を含む、全ての骨髄中の造血コロニー形成細胞上に存在する。ＣＤ３４は、間質細胞前駆体上にも発現する。正常な骨髄中の最終的なデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）^＋Ｂリンパ球前駆体及びデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）^＋Ｔリンパ球前駆体は、ＣＤ３４^＋である。ＣＤ３４抗原は、ＣＤ３３抗原を発現する初期骨髄細胞上に存在するが、該抗原は、ＣＤ１４抗原上やＣＤ１５抗原上、ＣＤ７１抗原を発現し、ＣＤ４５抗原を僅かに発現する初期赤芽球細胞上には存在しない。前記ＣＤ３４抗原は、毛細血管内皮細胞上及び約１％のヒトチモサイト上でも見つかる。通常の末梢血リンパ球、単球、顆粒球及び血小板は、ＣＤ３４抗原を発現しない。ＣＤ３４抗原密度は、初期造血系前駆体上で最も高く、該細胞が成熟するにつれて減少する。前記抗原は、完全に分化した造血系細胞上に存在しない。
【０３６６】
コミットしていないＣＤ３４^＋前駆細胞は、ＣＤ３８⁻、ＤＲ⁻であり、また該前駆細胞は、例えばＣＤ７１、ＣＤ３３、ＣＤ１０やＣＤ５などの系譜特異的抗原を有さないが、系譜にコミットしているＣＤ３４^＋細胞はＣＤ３８抗原を高密度で発現する。
【０３６７】
ＣＤ３４^＋細胞のほとんどが、ＣＤ４５ＲＯ抗原又はＣＤ４５ＲＡ抗原のいずれかを相互に発現する。約６５％の急性Ｂリンパ系白血病及び急性骨髄白血病がＣＤ３４抗原を発現する。前記抗原は、慢性的リンパ系白血病（Ｂ系譜及びＴ系譜）又はリンパ腫上で発現しない。ＣＤ２抗原は、Ｔリンパ球及びナチュラルキラーリンパ球（ＮＫ）のサブセット上に存在する。
【０３６８】
結果は、チャート２、３及び４中に示される。
【０３６９】
ＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体又は同じ抗原のα鎖に対するモノクロナール抗体を用いた処理後、Ｂ−ＣＬＬ患者（表２０、２時間の時点における患者５／６）の血液サンプルの分析すると、前者の抗体を用いて処理した後、ＣＤ３４^＋細胞及びＣＤ３４^＋ＣＤ２^＋細胞の相対数が大幅に増加した。同一の血液サンプルは、他のマーカーに対する上記パネル（表１４〜１９を参照）と免疫表現形であることから、ここで観察されたＣＤ３４^＋及びＣＤ３４^＋ＣＤ２^＋細胞の相対数の増加は、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋、ＣＤ８^＋ＣＤ３^＋及びＣＤ４^＋ＣＤ３^＋単一ポジティブ（ＳＰ）細胞の相対数の増加と一致するようである。さらに、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖の関与が排除されるかかる発見は、前期過程がＢリンパ球後退を介してＴ−リンホポイエシス（Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｓｉｓ）を生じさせる、直接的な裏付けである。
【０３７０】
２４時間後に同一の処理を行ったところ、ＣＤ３４^＋細胞のレベルが低下して、Ｔリンパ球の相対数がさらに増加した。Ｔリンホポイエスを最初に生じさせる逆分化過程を逆転させて、Ｂリンホポイエシスを生じさせることができた。前者の現象は、シクロホスホアミドと加えたＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体を用いて２時間インキュベーションした時点で観察されたが、後者の過程は、同じサンプル中で同じ処理をして２４時間インキュベーションした時点で観察された（チャート２）。
【０３７１】
ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体を用いてＨＩＶ^＋患者（表２０のＨＩＶ^＋患者）の血液サンプルを処理すると、ＣＤ３４^＋及びＣＤ２^＋ＣＤ３４^＋細胞の相対数が大幅に増加し、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体と該抗原のα鎖に対するモノクロナール抗体とを一緒に加えて処理を行った場合も同様に、ＣＤ３４^＋及びＣＤ２^＋ＣＤ３４^＋細胞の相対数が大幅に増加した。しかし、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のα鎖に対するモノクロナール抗体を用いて前記血液サンプルを処理すると、ＣＤ３４^＋細胞のレベルに影響はなかった。白血病時に調査され、血液中に多数の異型細胞（胚）を有する生後６日目の小児から得た血液サンプル（ＢＢ／ＳＴ、表２０）を、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗原、同一の抗原のα鎖に対するモノクロナール抗体又は両モノクロナール抗体を一緒に加えて処理したところ、免疫表現形の変化が生じた。
【０３７２】
未処理の血液サンプルを分析すると、ＣＤ３４^＋及びＤＲ^＋細胞の相対数が大幅に増加し、β鎖に対するモノクロナール抗体を用いて処理すると、ＣＤ３４^＋細胞の相対数がさらに増加したが、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のα鎖に対するモノクロナール抗体を用いての処理、又は一緒に加えられた場合、前記分子のα鎖及びβ鎖に対するモノクロナール抗体を用いて処理すると、前記細胞は減少した。しかし、後者の処理は、ＣＤ３４^＋ＣＤ２^＋細胞の相対数が増加し、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のみのβ鎖に対するモノクロナール抗体を用いて同一の血液サンプルが処理された場合、逆の現象が生じた。同一患者の処理血液及び未処理血液のアリコットを２４時間後に分析すると、ＨＬＡ−ＤＲ抗原処理のβ鎖に対するモノクロナール抗体がより高いレベルで維持されたことを除いて、上記全ての処理においてＣＤ３４^＋の相対数が減少した。後者の処理の場合、２４時間後でもＣＤ３４^＋ＣＤ２^＋細胞の相対数が減少し続けた。
【０３７３】
かかる結果は、β鎖を介してＨＬＡ−ＤＲ抗原を関与させると、ＣＤ２^＋ＣＤ３４^＋プールからの又はＢ−ＣＬＬ患者のＢリンパ球などのより成熟した細胞タイプからのＣＤ３４^＋細胞の産生を促進することを示しており、かかる結果はこのタイプの処理が逆分化を促進することを示している。しかし、２４時間後の血液サンプルの免疫表現形は、前記細胞タイプが他の系譜に存在しているようであり、この場合細胞は処理済の血液サンプルをＣＤ７及びＣＤ１３＆３３パネルを用いて分析すると観察される、骨髄系譜に存在している又はコミットしているようである。
【０３７４】
形態は、Ｂ−ＣＬＬのＢリンパ球の免疫表現的特徴を変更し、ＭＨＣクラスＩＩ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いて処理した正常な個体の画分を（ＣＤ１９ビーズを用いて）増殖させた。前記過程は、Ｂリンパ球の形態における変化を伴った。Ｂリンパ球は、未処理血液中のガラススライドにコロニー化することが観察されており、未処理血液中で物質は、顆粒球，単球，原始細胞に見える多量の細胞及び核形成された赤血球細胞に置き換わる。有糸分形態と顕著な細胞死は、処理済み血液物質又は未処理血液物質中で見られなかった。
【０３７５】
表２０の結果は、本発明の方法に従ってより成熟した未分化細胞を逆分化させることにより未分化細胞を調整することが可能であるという、さらに重要な発見を示している。
【０３７６】
Ｄ．顕微鏡写真
上記方法の抗原テストに加えて、顕微鏡を視覚的に用いる本発明の方法が行われる。本発明の装置は、追跡手段により自動的に変更を追跡するようにプログラムされている。
【０３７７】
この点について、図８は、本発明の方法前の、分化されているＢ細胞の顕微鏡写真である。図９は、試薬がＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体であることを特徴とする、本発明に従ってＢ細胞を逆分化させることにより形成された未分化細胞の顕微鏡写真である。未分化細胞は、薄暗く染色された細胞の塊である。図１０は、同一の未分化細胞の顕微鏡写真であるが、より低い倍率によるものある。
【０３７８】
図８〜図１０は、本発明の方法により、Ｂ細胞の未分化幹細胞への逆分化を視覚的に示す。
【０３７９】
図１１は、本発明の方法を行う前の分化Ｂ細胞の顕微鏡写真である。図１２は、試薬がＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体であることを特徴とする、本発明に従ってＢ細胞の逆分化により形成される未分化細胞の顕微鏡写真である。先と同様に、未分化細胞は、薄暗く染色された細胞の塊である。図１３は、図１２中の同一の未分化細胞から分化した顆粒球を形成する顕微鏡写真である。
【０３８０】
したがって、図１１〜図１３は、本発明の方法によりＢ細胞を未分化幹細胞に逆分化し、新規分化細胞の未分化細胞へのコミットメントは元の分化細胞と異なる系譜のものであることを視覚的に示すものである。
【０３８１】
かかる顕微鏡実験は、上記のようにＣＲ３／４３モノクロナール抗体を用いて処理した、ＢＣＬＬ患者由来の血液を用いて行われた。上述のように、正常時よりもＢリンパ球数値が高いため、ＢＣＬＬ細胞からの血液は、逆分化過程を研究する上で有用な補助物である。結果は、図１４〜１７中で詳細に示されている。
【０３８２】
図１４は、２つの拡大図におけるＢＣＬＬ患者からの未処理血液サンプルを示す。未処理Ｂリンパ球（ブルーの細胞）は、典型的な形態、すなわち凝集した染色質構造及びまばらな細胞質を示す。残る細胞は、赤血球（赤色血液細胞）である。
【０３８３】
ＣＲ３／４３抗体を用いて血液サンプルを処理すると、Ｂリンパ球が凝集体にまず集合する（図１５）。
【０３８４】
集合したＢ細胞は、コボルストーン様細胞領域（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ−ｌｉｋｅ−ｃｅｌｌａｒｅａｓ）、染色質構造の脱凝縮、突出した核小体、細胞量の増大及び未分化細胞に典型的な細胞質の好塩基球の形成により特徴づけられる、典型的な形態を徐々に喪失する（図１６）。緩和した（脱凝縮した）染色質構造は、分化細胞と比較して、未分化細胞の重要な特徴である。前記特徴は、所定の細胞系譜に従いコミットするのに必要な遺伝子発現の変化を決定するために、転写単位に対してより大幅にアクセスする必要性によると思われる。
【０３８５】
未分化細胞の出現は、分化形態を有する細胞（１７Ａ〜１７Ｊ）の出現に常に伴って現われる。重要な点は、前記細胞が、（ｉ）インキュベーション時間が１又は２以上の完全な細胞分裂が生じるためには短すぎる、（ｉｉ）有糸分列形態は見られない、そして（ｉｉｉ）白血球の絶対数は、処理前後で同じままであることから、増殖により生じることはありえないことである。さらに比較的分化していない前駆体は、より分化した前駆体と会合したが（図１７Ｊの骨髄前駆体を参照のこと）、このことは前記特異的細胞が分化により生じたことを示している。
【０３８６】
図１７Ａ〜１７Ｊの顕微鏡写真は、ＣＲ３／４３モノクロナール抗体を用いてＢ−ＣＬＬリンパ球を処理後に観察された異なるタイプの細胞を示す。血小板（Ｐｌ）−図１７Ａ、好中球（Ｎｅ）−図１７Ｂ、好酸球（Ｅｓｏ）−図１７Ｃ、巨核球（Ｍｅｇ）−図１７Ｄ、好塩基球（Ｂａ）−図１７Ｇ、リンパ球（Ｌｙ）−図１７Ｈ、単球（Ｍｏ）−図１７Ｉ及び骨髄前駆体（Ｍｐ）−図１７Ｊ。赤芽球及びマクロファージも示されている（データなし）。
【０３８７】
よって要約すると、かかる顕微鏡の結果は、初めに密集して、前駆細胞から分化細胞という形態に程度差がある各種細胞の出現させる、高レベルの成熟Ｂリンパ球（好中球、好塩基球、好酸球、巨核球、血小板、リンパ球、リンパ球、マクロファージ、顆粒球、桿状顆粒球、間質様細胞）を有する、ＢＣＬＬ患者から得たサンプル中のＢ細胞形態の変化を示す。
【０３８８】
赤芽球前駆体及び骨髄前駆体の存在が観察されることは、非常に重要な他に加えるべき点である（図１７Ｊ−データなし）。骨髄前駆体は、より大型で異なる核形態を有し、細胞質顆粒を含む細胞と形態的に明らかに区別される。
【０３８９】
従って、顕微鏡データは、細胞表面マーカーに関してサイトメトリーのデータが示す形態的な結果を支持する。かかるデータから、ＭＨＣＨＬＡ−ＤＲβ鎖に対する抗体を用いてＢリンパ球を処理すると、Ｂリンパ球数が減少し、未成熟前駆体細胞を含む他の造血系譜の細胞数が増加すると結論できる。
【０３９０】
本発明の方法により、ＭＨＣクラスＩＩα鎖に対する抗体（ＴＡＬ．１Ｂ５モノクロナール抗体）で処理したＴ細胞を逆分化して、分化細胞であった時と異なる系譜の新規分化細胞に未分化細胞をコミットさせ、さらに顕微鏡による観察も行われた（データなし）。
【０３９１】
Ｅ．逆分化されたリンパ球における組換え再配列の分析
背景として、前記実験で用いられた分化細胞（Ｂリンパ球、又はＴリンパ球の特定の性質を有する細胞）は、再配列されて成熟Ｉｇ又はＴＣＲをそれぞれコードする遺伝子を有する。再配列の過程で、分節をコードする可変（Ｖ）領域と前記受容体をコードする不変（Ｃ）領域との間にあるＤＮＡ、発現されたＴＣＲ又はＩｇ遺伝子の一部でない、ＤＮＡの中間部分がゲノムからスプライシングされる。前記摘出フラグメントは、染色体外のＤＮＡの形式で細胞中に残存する。前記細胞が真に逆分化するために、摘出されたＤＮＡはゲノムに再挿入され、前記細胞は元々の分化以前と同じ状態にされる。このことから、再配列された遺伝子中の配列に対して相補的であるプローブは、分化状態を特徴づける、再配列されたＤＮＡと比較して、該ＤＮＡが未配列又は生殖系状態に戻った場合、より大型のＤＮＡ限定フラグメントにハイブリダイズすると考えられる。
【０３９２】
１．Ｄａｕｄｉ細胞におけるＴＣＲ遺伝子の再配列
図１８に示されるサザンブロットの実験において、再配列された（及び他の欠損された）ＴＣＲ遺伝子を１つ有するＢ細胞リンパ腫であるＤａｕｄｉという、公知の細胞株が用いられる。ゲノムＤＮＡは、Ｄａｕｄｉ細胞から調製され、ＥｃｏＲＩを用いて消化され、ゲル電気泳動にかけられ、標識ＴＣＲβ鎖ＤＮＡプローブで探索される。該細胞は、コロニーで関連したり、消化されたゲノムＤＮＡをサザンブロットすることで明確に確認することができる同一の遺伝子再配列を有する均一細胞集団を形成したりすることから、ヒト患者から精製されたＢリンパ球でなくＤａｕｄｉ細胞が用いられる。通常の血液サンプルにおいて、細胞が異なれば再配列も異なり、サザンブロットはスミア（ｓｍｅａｒ）のようであった。
【０３９３】
ＴＣＲ−β鎖をコードする機能的遺伝子は、リンパ球成熟中に生じて、リンパ球成熟過程においてＶセグメント（Ｖｓｅｇｍｅｎｔ），Ｄセグメント及びＪセグメントを一緒に生じさせる一連の体細胞再配列により、リンパ球に凝集する。かかる再配列過程の非常に明解な説明は、大学の標準的教科書であるＧｅｎｅｓＶＩ，Ｌｅｗｉｎ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１９９７（第１９９４〜１０２３頁）において成されている。特定の頁は、以下に記載されている。
【０３９４】
まず、Ｄセグメントは、Ｄ−Ｊ連結反応においていくつかのＪセグメントの１つに対する組換え過程により連結される。よって、多くの可能なＶセグメント（＜６０＞の１つは、ＤＪセグメント（Ｖ−Ｄ連結）と連結して、完全なＴＣＲβ３鎖遺伝子を形成する。ＲＮＡプロセシングの間にスプライシングされて再配列されたＶＤＪ遺伝子セグメントと近接の不変遺伝子エクソンにする介在Ｊセグメントが存在するかもしれないが、不変領域遺伝子は再配列ＶＤＪセグメントの直接の下流である（Ｌｅｗｉｎｐ．９９８）。
【０３９５】
ヒト細胞において、Ｃβ１及びＣβ２と表示され、２つの異なる座に存在し、各々が６又は７個の連結領域（Ｊβ）遺伝子セグメント（Ｊβ１及びＪβ２）のクラスター及び１個のＤセグメント（Ｄβ１及びＤβ２）による、２つの異なるＴＣＲβ鎖不変遺伝子セグメントが存在する（図１，Ｔｏｙｏｎａｇａｅｔａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：８６２４−８６２８及びＬｅｗｉｎ，ｐ．１０１７）。
【０３９６】
Ｖセグメント、Ｄセグメント及びＪ−Ｃセグメントを近接にする組換え事象は、Ｖ、Ｄ、Ｊ−Ｃ遺伝子配列の組換え末端に存在するノナマー（ｎｏｎａｍｅｒ）配列及びヘプタマー（ｈｅｐｔａｍｅｒ）配列を認識するＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２を含む、多くのタンパク質により触媒される。ノナマー／ヘプタマー配列の起原に依存する形で、組換えは、結果的に不活化又は削除のいずれかとなる。両タイプの事象は、ゲノムＤＮＡの制限酵素フラグメントパターンにおいて変化が生じる。さらに、削除事象は、抽出されたフラグメントを必ずしも完全には消失しない。むしろ、抽出されたフラグメントの末端は、細胞中に残存しているＤＮＡの環状性を産生するために再連結する（Ｏｋａｚａｋｉｅｔａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ４９：４４７−８５，Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７４３−６；ＬｉｖａｋａｎｄＳｃｈａｔｚ，１９９６，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１６：６０９−１８；Ｈａｒｒｉｍａｎｅｔａｌ．１９９３，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．１１：３６１−８４）。細胞は媒体染色体補体（ｄｉｐｌｏｉｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を有するもので、もちろん各遺伝子セグメントは、２つの対立遺伝子を有する。
【０３９７】
通常の生殖系の状態では、Ｃβ１及びＣβ２遺伝子は、Ｔｏｙｏｎａｇａｅｔａｌ．，１９８５の図１に示されるように配列されている。ＥｃｏＲＩを用いてゲノムＤＮＡを制限消化すると、本実験で用いられたプローブにより検出することができる２つの関連するバンド、すなわち（ｉ）Ｃβ配列を有する１２ｋｂのバンドと、（ｉｉ）Ｃβ２配列を有する４ｋｂのバンドが生じる（配列相同性の程度が高いので、前記プローブは、Ｃβ２にもハイブリダイズするＣβ１から得られた標識されたＤＮＡフラグメントである）。前記生殖系配置は、未分化未成熟細胞中で観察される（図１８のレーンＡ）。前期生殖系配置は、（ＣＲ３／４３抗体を用いて２時間）図１８のレーン３により完全に示され、該レーンはレーンＡと同一の配置パターンを生じさせた。
【０３９８】
分化状態では、Ｃβ１とＣβ２の両方の対立遺伝子は再配列され、Ｃβ１座において１２ｋｂのフラグメントやＣβ２座において４ｋｂのフラグメントがもはや存在しない。実際、Ｃβ１座から得たハイブリダイズするフラグメントは、ゲル上に存在しなかった（これは、組換えの結果として両方のＣβ１対立遺伝子からハイブリダイズする配列を削除したことによる）。Ｃβ２座に関して、両染色体上で再配列することから生じる、異なる「対立遺伝子」に対応して、実際には２つの主要なバンドがある。４ｋｂ以下で最も大型のバンドは、２つの再配列された対立遺伝子のうちの１つのフラグメントに対応する。最も低いバンドは、他の再配列された対立遺伝子のフラグメントである。中間の小さなバンドは、異なる再配列を用いてＤａｕｄｉ細胞のサブクローンから恐らく得られる。よって前記フラグメントは、対立遺伝子のいずれかに対するサブモル量（ｓｕｂｍｏｌａｒａｍｏｕｎｔ）中に存在する。しかし、再配列状態は、主要なバンドの両方が明確に視覚化されるレーン１において、非常に明確に示される。
【０３９９】
ＭＨＣ−ＤＲのα鎖に結合するネガティブコントロール抗体（ＴＡＬ．１Ｂ５）を用いて２時間経過させると、上方のバンドが消失するが、最も低いバンドはレーン１の未処理細胞と同じ強度を有していた（レーン２を参照）。前記結果に対する可能な説明は、前記細胞が分化し、対立遺伝子の１つのＣβ２座においてもさらに組換えが生じ、Ｃβ２配列が消失したというものである。前記説明は、公知の現象と完全に一致している。
【０４００】
ネガティブコントロール抗体を用いて２４時間経過させると、未処理細胞において観察される３つのバンドが修復される（レーン４参照）。しかし、該バンドは、レーン２で観察されたバンドよりもより低い位置で実際に移動する。どうしてこのようなことが生じたかは不明である。可能な説明としては、削除された配列の再統合が生じて、ルーピィングアウトエクサイションリインテグレーションモデル（ｌｏｏｐｉｎｇ−ｏｕｔ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ−ｒｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｍｏｄｅｌ）（Ｍａｌｉｓｓｅｎｅｔａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ３１９：２８−３２）と一致する。しかし、２時間又は２４時間の時点でＴＡＬ．１Ｂ５抗体を用いて結果のいずれも、生殖系パターンに対する再配列を示していない。レーン２及びレーン４は、ネガティブコントロールを示しており、α鎖に対する抗体は、生殖系配列の修復を行わない。
【０４０１】
対照的に、２時間後にＭＨＣ−ＤＲのβ鎖に対するモノクロナール抗体（ＣＲ３／４３）を用いて得た結果は、生殖系配列に対応するバンド、すなわち１２ｋｂバンドと４ｋｂバンド（レーンＡとレーン３を比較）のパターンを示す。言換えると、前記結果は、Ｃβ１座及びＣβ２座における生殖系に限定的なパターンが全ての対立遺伝子に対しても修復されることを示す。
【０４０２】
前記結果から、本発明者は、レーン３で見られたバンドのパターンが、未分化細胞のゲノムＤＮＡの再配列をして生殖系配置に再生することを示すと結論する。
【０４０３】
前記発見の重要性は、軽く見られるべきものではない。削除を含むゲノム再配列は、分化過程が生じる前に存在していた状態にゲノムを修復するために逆転されうる。最も妥当と思われる説明は、分化の過程でＣβ２対立遺伝子が再配列することによって生じた逆位が逆転され、１２ｋｂのバンドが消失したＣβ１配列の削除逆転されたというものである。喪失したＣβ１配列の起原は、元々の削除事象から得られた核中で存在するエピソーム環状ＤＮＡであると思われる。前記環状ＤＮＡの存在は、先行技術においてカタログ化されてきた（上記文献を参照のこと）。しかし、生殖系ゲノムの修復が生じた正確なメカニズムは重要でない。重要なことは、前記修復が生じたという事実である。
【０４０４】
本発明の装置中において、ＭＨＣ−ＤＲのβ鎖に対するモノクロナール抗体（ＣＲ３／４３）を用いて２４時間連続してインキュベーションした結果、より複合的な結合パターンが生じた（レーン５）。しかし、前記バンドは、未処理コントロール中で同一のバンドを示していない。特に、前記プローブにハイブリダイズする約１２ｋｂのフラグメントは、依然として存在する（「Ｃβ対立遺伝子」）。さらに、「Ｃβ対立遺伝子」とマークされているバンドは、未処理コントロール中で観察された４ｋｂのバンドよりも小さいものに対応していない（レーン１）。レーン５で見られる結果に対する最も妥当な説明は、ハイブリダイゼーションパターンが再配列されたＴＣＲ遺伝子によって特徴づけられるＴ細胞のパターンと似ている（かかる発明は、Ｔ細胞に特徴的な細胞マーカーを有する細胞において増加することを示すフローサイトメトリーのデータと一貫している）ことから、第２再配列過程が生じるというものである。しかし、正確な分子説明にも関わらず、ＣＲ３／４３抗体に対して２４時間曝露した時点で観察されたレーン５の結果は、レーン３における２時間の曝露で得られた結果を支持するものである。
【０４０５】
２．Ｂ−ＣＬＬ細胞におけるＩｇ遺伝子の再配列
表１９Ｂに示されるサザンブロットの結果は、慢性リンパ球白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の患者から得た末梢血細胞を用いて得られた。ゲノムＤＮＡは、前記大型のモノクロナール抗体から調製され、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化され、ゲル電気泳動にかけ、標識されたＴＣＲＤＮＡプローブで探索した。前記Ｂ−ＣＬＬ細胞は、上述のＣＲ３／４３（ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ及びＤＱの抗クラスＩＩＭＨＣ鎖）を用いて２４時間処理された。ブロットは、放射能標識されたＩｇＪ領域プローブを用いて探索された。レーンＡ中の未処理細胞から得た２つのバンドは、２つの再配列された対立遺伝子（父系及び母系）を表す。前記バンドは、細胞の抗体処理後２４時間の時点のパターンを示すレーンＢ中では現われなかった。前記バンドの代わりに、生殖系Ｉｇ遺伝子に特徴的である５．４ｋｂが現われる。
【０４０６】
図１９Ａに示される他の実験では、細胞は未処理のまま、又は抗クラスＩＩＭＨＣβ鎖抗体を用いて所定の時間処理された。前記ＩｇＶＤＪ領域は、分化（コントロール）及び抗体処理したＢ−ＣＬＬ細胞（ゲルの半分を残す）中でＰＣＲにより増殖された。これにより、未処理細胞からＶＤＪの増殖産生物が生成された。しかし、抽出されたゲノムＤＮＡを挿入する結果、前記「生殖系」ＤＮＡ配置がＶＤＪに対する特定のプライマーを用いたＰＣＲ増殖を受けやすいので、かかるバンドは前記抗体処理細胞中で観察されなかった。同一の実験（ゲルの右側）により、コントロールであり、ハウスキーピング（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ）する、βアクチンをコードする遺伝子の反応を視覚化する。処理に関わらず、βアクチンＰＣＲ増殖産生物に、違いはなかった。よって、前記「コントロール」遺伝子は、同一細胞のＩｇ遺伝子中に大きな変更を同一条件下で生じさせる逆分化による影響は受けないようである。
【０４０７】
上記の結果は、適切な細胞表面受容体に関与する試薬を用いて細胞を処理すると、分化状態を特徴づける染色体ＤＮＡの再配列の再生を観察することにより、分子レベルで証明される（及びモニターされる）前記細胞の逆分化が生じる。よって、分子遺伝的証拠及び形態学的証拠に基づき、クラスＩＩＭＨＣβ鎖が関与する試薬（ｍＡｂ）で処理されたＢリンパ球系譜の細胞が逆分化すること結論づけられる。一方、クラスＩＩα鎖が関与する抗体で処理した同一の細胞は、同様に逆分化しない。どちらかと言えば、該細胞はＢ細胞系譜にそって（前進的に）分化するようである。
【０４０８】
Ｆ．Ｂリンパ球の逆分化に関するさらなる研究
ＢＣＬＬ患者から得て、ＦＡＣｓＶａｎｔａｇｃで精製されたＢＣＬＬ細胞（９５％が純粋なＢ細胞）は、上記の方法で本発明の装置中でＣＲ３／４３抗体を用いて処理され、該細胞はフローサイトメトリーで処理した。表Ａに示される結果は、上記の結果をさらに確証する。Ｂリンパ球系譜の特徴である細胞表面マーカーを細胞数の大幅な減少を伴って、ＣＤ３４^＋細胞の数における大幅な増加が得られた（ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ２２）。表Ａから気がつく重要な点は、該表がＣＤ３４ネガティブ及び系譜ネガティブの両方である細胞に大幅な増加を示すことである。前記未分化細胞は造血系譜にコミットせず、該細胞はＣＤ３４^＋幹細胞の分化を進める。さらに、光学顕微鏡によりサンプルを調べると、非造血系細胞の形態的特徴を有する接着細胞タイプの範囲がわかる。
【０４０９】
【表３】

【０４１０】
同じ細胞上のＣＤ３４細胞表面マーカーの出現を伴うＣＤ１９細胞表面マーカーの喪失は、共焦点顕微鏡によりリアルタイムでビデオに写し出され、記録された。ＣＲ３／４３モノクロナール抗体を加える前のＢリンパ球は、ＣＤ１９に対する抗原であるＦＩＴＣ共役モノクロナール抗体で緑色に染色した。ＣＲ３／４３モノクロナール抗体の添加後、細胞は緑色の蛍光色を失い、ＣＤ３４に対するＰＥ／Ｃｙ５（又は微量の赤）共役モノクロナール抗体を用いて、緑色でなく赤色に染色した（系時的ビデオからの２つの静止画像を示す図２３を参照）。この結果は、Ｂリンパ球逆分化の間、ＣＤ１９などの系譜特異的マーカーが消失するが、ＣＤ３４などの幹細胞マーカーは再発現されることを明確に確証するものである。
【０４１１】
Ｇ．Ｂリンパ球を造血幹細胞に逆分化させる他の試薬
最初の研究では、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリトロポイエチン及びモノクロナール抗体ＣＤ３／４３という、３つの試薬が実際に同定された。増殖され、精製された正常なＢリンパ球の調製は、本発明の装置中で、ＣＲ３／４３及びＴＡＬ．１Ｂ５について上述されたのと同様の方法で、３種類の前記試薬のうちの１つで処理された。また、上述の通り、サンプルをフローサイトメトリーで調べた。ネガティブコントロールと比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、エリトロポエチン又はモノクロナール抗体ＣＲ３／４３を用いて処理した３種類の全てのサンプルが逆分化と合致する変化を示した。特に、３種類全ての試薬は、細胞集団中のＣＤ３４^＋細胞の相対数を増加させた（図２０を参照）。しかし、最も大きな効果はＣＲ３／４３で観察され、その結果として前記試薬はここで提示されたよりもより詳細な研究において使用する場合にも選択された。
【０４１２】
Ｈ．逆分化過程により作製された造血系幹細胞の特性
コロニー形成アッセイ
フローサイトメトリーで観察されたＣＤ３４^＋細胞及び顕微鏡で同定された未分化細胞が、未分化造血系細胞の特性を有することを確認するために、クラスＩＩＭＨＣβ鎖に対する抗体で処理した血液サンプル（ＣＲ３／４３，上記を参照）は、原始造血系細胞の増殖能を測定するための、当該技術分野で公知の標準的方法であるコロニー形成アッセイにかけられた。前記コロニー形成アッセイは、追跡手段の一部として、本発明の装置で自動的に行うことができる。
【０４１３】
造血幹細胞をインビトロでクローンアッセイすると、増殖する能力、及び表現系的に及び機能的に成熟した骨髄細胞及び／又は赤血球細胞中へと分化、発達する能力を有する原始前駆体細胞を定量化することができる。例えば、インビトロでソフトゲルマトリックス中に播いた／固定化した場合、増殖因子の存在下において、幹細胞はクローン成長（増殖）する及び分化することができる。
【０４１４】
図２１は、倒立明視野顕微鏡を用いて、本発明の方法により作製された幹細胞のコロニーアッセイである。本アッセイでは、正常な血液ドナーのバフィーコートから得たＢ細胞は、ＣＲ３／４３モノクロナール抗体で処理され、材料及び方法部門中に記載されたコロニーアッセイにかけられた。
【０４１５】
図２１のパネル（ａ）〜（ｅ）は、以下の事項を示す。
ａ）肉眼でも容易に観察できる赤芽球コロニー，骨髄コロニー及び（成熟骨髄及び赤芽球からなる）混合コロニーを示す、３倍に拡大した培養皿の明視野顕微鏡。各コロニーは、増殖及びその後の分化により単一の造血幹細胞から生じる。
ｂ）ＭＩＸ−ＣＦＣ，単一の分化多能の造血幹細胞から生じるコロニー（骨髄系譜及び赤芽球系譜の細胞を生じさせることができる幹細胞）。
ｃ）Ｍ−ＣＦＣ，マクロファージからなるコロニー。
ｄ）ＧＭ−ＣＦＣ，マクロファージ，顆粒球及び巨核球を含む骨髄系譜からなるコロニー。
ｅ）ＢＦＵ−Ｅ，正赤芽球や非核形成赤色細胞などの赤芽球系譜に属する細胞からなるコロニー。細胞が赤色であることから、該細胞は充分へモグロビン化されていることがわかる。本コロニーのサイズが大きいことは、該コロニーが非常に原始的な幹細胞から生じたことを示している。
【０４１６】
同じ結果は、Ｂ−ＣＬＬ細胞で得られた（データなし）。未処理Ｂ細胞は、造血系コロニーを生じさせない（データなし）。従って、前記結果は、クラスＩＩＭＨＣβ鎖に対するモノクロナール抗体ＣＲ３／４３で処理した血液サンプル中に生存可能な造血幹細胞が存在することを示したが、未処理血液サンプルで中に該細胞は存在しないことを示す。
【０４１７】
長期培養
長期アッセイにより、造血幹細胞の自己再生能力が調べられる。本培養では、骨髄造血部分の大部分が、インビトロで再生される。前記培養の重要な特徴は、添加成長因子がなくても生じる造血が維持されることである。本アッセイにおいて、造血過程は、骨髄由来間質細胞の接着層の確立に絶対的に依存する（例えば、繊維芽細胞，脂肪細胞，間葉性システムに属する全ての細胞タイプを含む、各種非造血系細胞からなる）。適切な環境（増殖因子の分泌及び細胞該マトリックスの合成）を提供することにより、造血過程をサポートして、幹質細胞は、間細胞の生存，自己更新，増殖及び分化を促進する。
【０４１８】
本アッセイでは、正常な血液ドナーのバフィーコートから得たＢ細胞をＣＲ３／４３モノクロナール抗体で処理すると（同じ結果がＢ−ＣＬＬ細胞から得られたが）、該抗体を加える数時間の間に接着細胞層の形成が生じ、さらに該形成は経時的に増加した。
【０４１９】
（倒立型明視野照明顕微鏡で観察した場合に、繊維芽細胞／間葉性型細胞／光屈折性大型細胞から主としてなるブランケット細胞（ｂｌａｎｋｅｔｃｅｌｌ）、図２２を参照）間質細胞からなる接着層は、１２週又はそれ以上まで造血系細胞の増殖及び発達を支持する（かかる細胞は、造血系細胞と緊密な接触を示す）。さらに、造血系細胞の産出が延長された発端である（薄暗く発色する細胞のコブルストーン領域／クラスター（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅａｒｅａｓ／ｃｌｕｓｔｅｒｓ）としても知られている））原始造血系細胞の群は、接着層においても観察可能である。
【０４２０】
造血系焦点のクラスターを形成する小円形細胞からなる間質層（明るく現われる細胞のクラスター）の上部である非接着層には、該層は造血系の幹細胞及びよりコミットした前駆体が含まれる。前記非接着層は、（長期培養培地で２次培養した場合）（クローンアッセイを用いて測定されるように）ＭＩＸ−ＣＦＣ，ＧＭ−ＣＦＣ，Ｍ−ＣＦＣ，ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｆ（コロニー形成単位繊維芽細胞）を生じさせることができる。
【０４２１】
Ｉ．ＨＬＡ−ＤＲのβ鎖に対する抗体で処理した細胞のＲＴ−ＰＣＲ
遺伝子転写は、ＣＤ３４に対するＣＲ３／４３モノクロナール抗体，ｃ−ｋｉｔ（幹細胞因子のリガンド），ε−ヘモグロビン（ヘモグロビンの胚芽型）及びβアクチン遺伝子を用いて、Ｒｏｍａｓ（Ｂリンパ腫）細胞及びＫ５６２（赤芽球白血病）細胞中で測定された。
【０４２２】
方法
ｍＲＮＡは、ＲＮＡＺＯＬ（ＣＩＮＡＢＩＯＴＥＣＨ社製）を用いてＣＲ３／４３モノクロナール抗体による処理の前後に抽出された。ｍＲＮＡは、４μｌの標準的緩衝液，２μｌのｄＮＴＰｓ，１μｌのＲＮＡＳＩＮ，１μｌの逆プライマー（ランダムヘクサマープライマー）及び１μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて、室温で５分間インキュベーションすることにより、逆転写をプライミングするヘクサマーにかけられた。混合物は、３８℃で１時間さらにインキュベーションを行った。混合物は、ＣＤ３４，ｃ−ｋｉｔ，ε−ヘモグロビン及びβアクチン配列を増幅させるために設計されたプライマーを用いて、標準的条件下でＰＣＲにかけられた。プライマーは、公開済みのデータに従ってＲａｎｄｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅＫｉｎｇｓＣｏｌｌｅｇｅで合成された。
【０４２３】
結果
得られた結果は、βアクチンｍＲＮＡのレベルが変更しなかったのに対して、ＣＤ３４，ｃ−ｋｉｔ，ε−ヘモグロビンｍＲＮＡのレベルは、ＣＲ３／４３モノクロナール抗体による処理後、大幅に増加した。ＣＤ３４及びｃ−ｋｉｔに対する結果は、造血幹細胞を産生するＢリンパ球を逆分化することを示す、上記データに対するさらなる支持を提供する。
【０４２４】
ε−ヘモグロビンに対して得られた結果は、ヘモグロビンが胚細胞中でしか通常発現しないことからとても興味深い。従って、ＣＲ３／４３モノクロナール抗体を用いて処理すると、造血系幹細胞を生じさせるだけでなく、胚幹細胞などのさらに原始的な未分化細胞も生じさせることが可能である。
【０４２５】
Ｊ．要約
まとめると、本発明の装置は分化細胞を幹細胞に逆分化させるにあたり用いられてよい。実施例は、数時間で末梢血中のリンパ造血系に作用する、幹細胞の生成に利用可能なＴリンパ球及びＢリンパ球の個体発生及び発達過程に関する、大変興味深くまた将来性のある発見結果を示すインビトロでの実験について記載している。
【０４２６】
Ｂリンパ球数が高いＢ細胞慢性リンパ球白血球（Ｂ−ＣＬＬ）の患者から得た末梢血血液サンプルを、クラスＩＩ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体で処理すると、単一陽性（ＳＰ）Ｔリンパ球及び胸腺細胞マーカーＣＤ４抗原及びＣＤ８抗原に対して二重陽性であった該Ｔリンパ球の前駆体の相対数が激増し、該Ｔリンパ球と該前駆体の両者は同時に発現した。しかし、かかる現象は、Ｂリンパ球の相対数の大幅な減少を常に伴った。前記観察は、同一の血液サンプルがクラスＩＩ抗原のα鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体又はクラスＩ抗原の相同領域に対するモノクロナール抗体で処理された場合、観察されなかった。
【０４２７】
本発明の装置において、Ｂ細胞慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）の患者から得た全血液をＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体を用いて処理すると、Ｔリンパ球が生じる。前記事象は、ＣＤ４マーカーとＣＤ８マーカーを共発現する二重陽性細胞の出現、ＣＤ３４を発現する細胞の出現、単一陽性ＣＤ４^＋ＣＤ３^＋及びＣＤ８^＋ＣＤ３^＋リンパ球の数が付随して増加する。さらに、係る細胞の生成において生じた免疫表現形の変化は、胸腺細胞発達の変化、特に経時的に測定された場合の変化と同じであった。
【０４２８】
ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体で全血を２時間インキュベーション生成された二重陽性細胞（ＤＰ）の割合は、経時的に減少し、かかる事象は、単一陽性ＣＤ４^＋ＣＤ３^＋及びＣＤ８^＋ＣＤ３リンパ球の同時増加が付随し、一定時間経過後も同様であった。ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖は、前記タイプの細胞上でも発現する。
【０４２９】
Ｂリンパ球は、ＣＤ１９，ＣＤ２１，ＣＤ２３，ＩｇＭ及びＤＲなどのマーカーを絶えず消失し、これはＣＤ３４^＋細胞及びＣＤ３４^＋ＣＤ２^＋細胞の出現，ＣＤ７^＋細胞の増加，ＣＤ８^＋ＣＤ２８^＋細胞及びＣＤ２８^＋細胞の増加，ＣＤ２５^＋細胞の増加，ＣＤ１０^＋細胞及びＣＤ３４^＋細胞及びＣＤ３４^＋及びＣＤ１９^＋細胞の出現，ＣＤ５^＋細胞中の増加，ＣＤ４５抗原を低レベルで発現する細胞と同時に発生する。前記変化は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体でもって血液を処理することによるものであった。
【０４３０】
処理前のＢ−ＣＬＬ患者の血液中の白色血液細胞の大部分は、Ｂリンパ球であったことから、かかる処理と関連する免疫表現型の変化は、Ｂリンパ球の逆分化及び以降のコミットメント（すなわち再コミットメント）と合致している。さらに、シクロホスファアミドと、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体とで処理されてＴリンパ球に誘導された、Ｂ−ＣＬＬ患者のＢリンパ球は、該処理をして延長されたインキュベーションをしてＢリンパ球に戻すことができた。
【０４３１】
ＣＤ１６＆５６やＣＤ３やＣＤ８やＣＤ３パネルを用いて、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖に対するモノクロナール抗体を用いて処理されたサンプルを分析すると、前記マーカーを発現する細胞の相対数が、ＣＤ１９やＣＤ３やＤＲやＣＤ３などのパネルで測定された相対数に呼応して、少しずつ安定的に増加する。比濁法（ｎｅｐｈｌｏｍｅｔｒｙ）及び免疫電気泳動を用いてＨＩＶ患者の処理サンプル及び未処理サンプルの上澄みを調べると、Ｂ細胞が血漿細胞ステージを通過したにちがいないことを示すＩｇＧのレベルが増加した。上記全ての細胞の相対数の増加には、非常に大量のＣＤ５６＆１６抗原を発現する中型で非常に顆粒化された細胞の出現を伴う。非常に大型で非常に顆粒化された他の細胞が、一時的に観察され、該細胞はＣＤ３４に対して陽性で、ＣＤ４ＣＤ８マーカーに対して二重陽性であった。他の一時的な細胞も観察されたが、該細胞は、大型で顆粒化され、ＣＤ３受容体及びＣＤ１９受容体に対して陽性であった。多くのＢリンパ球に存在するＣＤ２５が消失し、ＣＤ２５は、数の増加が常に観察される新規形成のＴリンパ球により発現された。
【０４３２】
ＣＤ２８^＋ＣＤ８^＋及びＣＤ２８^＋細胞は、ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体でＢ−ＣＬＬ患者の全血を処理した後に出現した。かかる発見は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体で血液を処理することによる。
【０４３３】
前記方法で生じたＴリンパ球産生は、正常な血液ドナーの末梢血，臍帯血，骨髄，ＨＩＶ^＋個体やエイズ患者を含む各種感染症患者において、また、正常血液ドナー，ＩｇＡ欠乏患者及び各種他の条件を有する他の患者の血液サンプルから得たＢリンパ球に対する濃縮画分において観察された。さらに、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体で処理されたＢ−ＣＬＬ患者２人のサンプル中の骨髄マーカーを分析すると、ＣＤ１３やＣＤ３３などの骨髄マーカーを発現する細胞の相対数が大幅に増加していた。前記マーカーは、ＣＤ５６＆１６抗原又はＣＤ７抗原と共発現した。しかし、Ｔリンパ球マーカーを有するが、骨髄抗原を有さないＣＤ７^＋細胞の相対数は、別の細胞集団で観察された。かかる特定の観察結果は、未処理サンプル中で、又はクラスＩ抗原やＨＬＡ−ＤＲ抗原のα鎖の相同領域に対するモノクロナール抗体で処理したサンプル中で観察されなかった（チャート２＆３を参照）。かかる最終結果は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖を介して一度誘導されたＢリンパ球は、Ｔリンパ球前駆細胞に退行するだけでなく、骨髄系譜及び赤芽球系譜にも存在することができる。
【０４３４】
要約すると、本出願中で提示されたデータは、本発明の装置中で、（ｉ）ある系譜の正常な細胞を複数の他の系譜の細胞の細胞表面マーカーや形態的特徴を有する細胞に転換することができることや、（ｉｉ）分化したＢリンパ球やＴリンパ球から、（例えば幹細胞などの）原始前駆細胞の細胞表面マーカーや形態的特徴を有する細胞を得ることができることを示す。
【０４３５】
数々の実験がＢＣＬＬ細胞を用いて行われたことに注意されたい。ＢＣＬＬ細胞は、血漿細胞の最終的な分化段階に分化することができない成熟Ｂリンパ球である。その代わりに該細胞は染色体欠損により高レベルの増殖、そして多量のＢＣＬＬ患者血液中のＢリンパ球を示す。
。先行技術に記載されている多数の腫瘍細胞と比較して、ＢＣＬＬ細胞は、本発明の方法において用いられる以前には、いかなる形でも限定された逆転分化を起こしたことはない。さらに該細胞は、ゲノム構造，細胞マーカー又は細胞形態に関して、未分細胞のいかなる特徴も示さない。該細胞は、あらゆる点で成熟Ｂ細胞である。
【０４３６】
よって、悪性細胞のいくつかは未分化細胞の特徴をある程度有するかもしれないが、このことはＢＣＬＬ細胞の場合にはあてはまらず、Ｂリンパ球の研究にとって該細胞は完全に許容可能な実験系である。さらに、ＢＣＬＬ細胞やＤａｕｄｉ細胞は、前記実験に関連するいかなる側面においても通常の細胞と充分に区別されない。事実、ＢＣＬＬをモデルの系とすることの妥当性は、Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎｅｔａｌ．，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１６２５−１６２９により確証されている（第１６２５頁の第１段落右欄を参照）。
【０４３７】
加えて、ＣＲ３／４３モノクロナール抗体を有する正常ドナーから得たヒトバフィーコート血液サンプルを処理すると、ＣＤ３４（幹細胞マーカー）がより大量に発生し、ＣＤ１９（Ｂリンパ球マーカー）がより少量で発生した。
【０４３８】
本発明の方法により作製された幹細胞は、いかなる組織のものでもよく、リンパ造血型前駆細胞に必ずしも限定されるものではないことに注意されたい。
【０４３９】
本発明の他の改良については、当該分野において通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【０４４０】
当該分野において通常の知識を有する者にとって容易に明らかであるように、本発明の装置は本明細中で開示されているようにコミットした細胞及び／又は試薬を含む細胞集団を用いての使用に必ずしも限定されず、試薬を用いた液体の混合及びインキュベーションを必要とするいかなる手順での使用に適している。
【０４４１】
上記明細書中で述べられた出版物は、すべて本願に引用して援用している。本発明に記載の方法及びシステムの各種改良及び変形例は、本発明の範囲及び精神から離れることなく当該技術分野において通常の知識を有する者にとって明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態との関連で記載されてきたが、請求項記載の発明は、かかる特定の実施形態に不条理に限定されるべきでない。特に、分子生物学又は関連分野において通常の知識を有する者にとって自明である、ここに記載した本発明の実施形態に対する各種改良も、特許請求の範囲に属するものとする。
【０４４２】
【表４】

【０４４３】
【表５】

【０４４４】
【表６】

【０４４５】
【表７】

【０４４６】
【表８】

【０４４７】
【表９】

【０４４８】
【表１０】

【０４４９】
【表１１】

【０４５０】
【表１２】

【０４５１】
【表１３】

【０４５２】
【表１４】

【０４５３】
【表１５】

【０４５４】
【表１６】

【０４５５】
【表１７】

【０４５６】
【表１８】

【０４５７】
【表１９】

【０４５８】
【表２０】

【０４５９】
【表２１】

【０４６０】
【表２２】

【０４６１】
【表２３】

【０４６２】
【表２４】

【０４６３】
【表２５】

【０４６４】
【表２６】

【０４６５】
【表２７】

【０４６６】
【表２８】

【０４６７】
【表２９】

【０４６８】
【表３０】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
チャンバーと、コミットした細胞を含む細胞集団を該チャンバーに導入する手段と、コミットした細胞を未分化細胞に逆分化させることができる逆分化手段を前記チャンバーに導入する手段と、コミットした細胞が未分化細胞に逆分化するように、前記逆分化手段の存在下で前記コミットした細胞をインキュベーションするインキュベーション手段とを有することを特徴とする、コミットした細胞を含む細胞集団中の未分化細胞の相対数を形成する及び／又は増加させる装置。
【請求項２】
チャンバーと、コミットした細胞を含む細胞集団を該チャンバーに導入する手段と、コミットした細胞を未分化細胞に逆分化させる試薬を前記チャンバーに導入する手段と、コミットした細胞が未分化細胞に逆分化するように前記試薬及び前記コミットした細胞をインキュベーションするインキュベーション手段とを有することを特徴とする、コミットした細胞を含む細胞集団中の未分化細胞の相対数を形成する及び／又は増加させる装置。
【請求項３】
装置が前記細胞集団の量を測定する測定手段を有することを特徴とする請求項１又は２記載の装置。
【請求項４】
装置が細胞数を計測して前記細胞集団の細胞濃度を測定する手段を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の装置。
【請求項５】
細胞数を計測する手段がコールターカウンター、好ましくは小型化されているコールターカウンター又は他の適切なサイトメーターであることを特徴とする請求項４記載の装置。
【請求項６】
装置が貯蔵容器からの一定量の前記細胞集団数を前記チャンバーに搬送する搬送手段を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の装置。
【請求項７】
装置が所定量の細胞集団を貯蔵容器から前記チャンバーに搬送する搬送手段を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の装置。
【請求項８】
装置がチャンバーに添加される試薬量を計算する計算手段を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の装置。
【請求項９】
装置がチャンバーに一定量の試薬を搬送する他の搬送手段、好ましくは該搬送手段がモーター駆動のシリンジであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の装置。
【請求項１０】
装置が計算された一定量の試薬をチャンバーに搬送する他の搬送装置を有することを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の装置。
【請求項１１】
他の搬送手段がモーター駆動によるシリンジであることを特徴とする請求項９又は１０記載の装置。
【請求項１２】
装置が前記チャンバー中の二酸化炭素濃度を調節する二酸化炭素調節手段を有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載の装置。
【請求項１３】
装置がチャンバー中の温度を調節する温度調節手段を有することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の装置。
【請求項１４】
装置がチャンバー内部で細胞集団と試薬とを混合する混合手段を有することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の装置。
【請求項１５】
装置がインキュベーション時間を時間計測する時間計測手段を有することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか記載の装置。
【請求項１６】
装置がインキュベーション時間の残存時間を使用者に表示する表示手段を有することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載の装置。
【請求項１７】
装置がインキュベーション時間の終了を使用者に知らせるアラーム手段を有することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか記載の装置。
【請求項１８】
装置がチャンバーから細胞を回収する回収手段を有することを有することを特徴とする請求項１〜１７のいずれか記載の装置。
【請求項１９】
回収手段がチャンバーから未分化細胞を回収することを特徴とする請求項１８記載の装置。
【請求項２０】
細胞が、チャンバーから貯蔵容器に未分化細胞を含む細胞サンプルを除去する除去装置を有することを特徴とする請求項１〜１９のいずれか記載の装置。
【請求項２１】
装置が、未分化細胞を含む細胞集団を含む貯蔵容器をシールするシール手段を有することを特徴とする請求項１〜２０のいずれか記載の装置。
【請求項２２】
コミットした細胞が非癌細胞であることを特徴とする請求項１〜２１のいずれか記載の装置。
【請求項２３】
コミットした細胞が分化細胞であることを特徴とする請求項１〜２２のいずれか記載の装置。
【請求項２４】
コミットした細胞がコミットした造血系細胞であることを特徴とする請求項１〜２３のいずれか記載の装置。
【請求項２５】
コミットした細胞がＣＦＣ−Ｔ細胞，ＣＦＣ−Ｂ細胞，ＣＦＣ−Ｅｏｓｉｎ細胞，ＣＦＣ−Ｂａｓ細胞，ＣＦＣ−ＧＭ細胞，ＣＦＣ−ＭＥＧ細胞，ＣＦＣ−Ｅ細胞，Ｔ細胞及びＢ細胞から選ばれることを特徴とする請求項１〜２４のいずれか記載の装置。
【請求項２６】
未分化細胞が分化多能幹細胞であることを特徴とする請求項１〜２５のいずれか記載の装置。
【請求項２７】
未分化細胞が造血系幹細胞，神経幹細胞，上皮幹細胞，間葉幹細胞，内胚葉幹細胞及び胚幹細胞からなる群から選ばれる幹細胞であることを特徴とする請求項１〜２６のいずれか記載の装置。
【請求項２８】
未分化細胞がＣＤ３４^＋，ＨＬＡ−ＤＲ⁻，ＣＤ３８⁻，ＣＤ１１７，ＡＣ１３３，ＣＤ９０及び／又はＣＤ４５ｌｏｗからなる群から選ばれる１又は２以上の細胞表面マーカーにより特徴づけられることを特徴とする請求項１〜２７のいずれか記載の装置。
【請求項２９】
未分化細胞がＭＨＣ^＋クラスＩ細胞及び／又はＭＨＣクラスＩＩ^＋細胞であることを特徴とする請求項１〜２８のいずれか記載の装置。
【請求項３０】
試薬が、コミットした細胞の表面上における抗原の捕捉、認識又は提示に介在する受容体に関与することを特徴とする請求項１〜２９のいずれか記載の装置。
【請求項３１】
受容体がＭＨＣクラスＩ抗原又はＭＨＣクラスＩＩ抗原であることを特徴とする請求項３０記載の装置。
【請求項３２】
クラスＩ抗原がＨＬＡ−Ａ受容体，ＨＬＡ−Ｂ受容体，ＨＬＡ−Ｃ受容体，ＨＬＡ−Ｅ受容体，ＨＬＡ−Ｆ受容体又はＨＬＡ−Ｇ受容体のいずれかであり、クラスＩＩ抗原がＨＬＡ−ＤＭ受容体，ＨＬＡ−ＤＰ受容体，ＨＬＡ−ＤＱ受容体又はＨＬＡ−ＤＲ受容体のいずれかであることを特徴とする請求項３１記載の装置。
【請求項３３】
受容体がＨＬＡ−ＤＲ受容体であることを特徴とする請求項３２記載の装置。
【請求項３４】
受容体が相同領域をもつβ鎖を有することを特徴とする請求項３０記載の装置。
【請求項３５】
受容体がＨＬＡ−ＤＲのβ鎖の相同領域を少なくとも有することを特徴とする請求項３４記載の装置。
【請求項３６】
試薬が受容体に対する抗体であることを特徴とする請求項３０記載の装置。
【請求項３７】
試薬が受容体に対するモノクロナール抗体であることを特徴とする請求項３６記載の装置。
【請求項３８】
抗体がモノクロナール抗体ＣＲ３／４３とモノクロナール抗体ＴＡＬ１Ｂ５からなる群から選ばれることを特徴とする請求項３６又は３７記載の装置。
【請求項３９】
試薬がＭＨＣ遺伝子発現を調節することを特徴とする請求項２〜３８のいずれか記載の装置。
【請求項４０】
試薬がＭＨＣクラスＩ^＋及び／又はＭＨＣクラスＩＩ^＋発現を調節することを特徴とする請求項３９記載の装置。
【請求項４１】
コミットした細胞を含む細胞集団がバフィーコート血液サンプルである又はバフィーコート血液サンプル由来であることを特徴とする請求項１〜４０のいずれか記載の装置。
【請求項４２】
チャンバーと、造血系細胞を含む細胞集団を前記チャンバーに導入する手段と、コミットした造血系細胞を未分化細胞に逆分化させることができる逆分化手段を前記チャンバー中に導入する手段と、コミットした造血系細胞が未分化細胞に逆分化するように、前記逆分化手段の存在下で前記コミットした細胞をインキュベーションするインキュベーション手段とを有することを特徴とする、造血幹細胞を含む細胞集団中で未分化細胞の相対数を形成又は増加させる装置。
【請求項４３】
チャンバーと、コミットした細胞を含む細胞集団を前記チャンバーに導入する手段と、前記コミットした細胞に対して操作的に関与する試薬を前記チャンバー中に導入する手段と、ＣＤ３４^＋及び／又はＨＬＡ−ＤＲ⁻及び／又はＣＤ３８⁻及び／又はＣＤ１１７及び／又はＡＣ１３３及び／又はＣＤ９０及び／又はＣＤ４５ｌｏｗ細胞の相対数が前記関与の結果として増加するように、前記チャンバー中で前記試薬の関与を受けた前記コミットした細胞を操作的にインキュベーションするインキュベーション手段とを含むことを特徴とする、コミットした細胞を含む細胞集団中にＣＤ３４^＋及び／又はＨＬＡ−ＤＲ⁻及び／又はＣＤ３８⁻及び／又はＣＤ１１７及び／又はＡＣ１３３及び／又はＣＤ９０及び／又はＣＤ４５ｌｏｗの細胞表面マーカーを有する細胞の相対数を形成する及び／又は増加させる装置。
【請求項４４】
よりコミットした細胞の逆分化を、バフィーコート血液サンプル中又は血液サンプル由来のよりコミットした細胞に生じさせて、よりコミットした細胞を未分化細胞に逆分化する過程を含むことを特徴とする未分化細胞の調製方法。
【請求項４５】
よりコミットした細胞を未分化細胞に逆分化させる試薬と、バフィーコート血液サンプル中のよりコミットした細胞とを接触させる過程を含むことを特徴とする、未分化細胞の調製方法。
【請求項４６】
コミットした細胞が非癌細胞であることを特徴とする請求項４４又は４５記載の方法。
【請求項４７】
コミットした細胞が分化細胞であることを特徴とする請求項４４〜４６のいずれか記載の方法。
【請求項４８】
コミットした細胞がコミットした造血系細胞であることを特徴とする請求項４４〜４７のいずれか記載の方法。
【請求項４９】
コミットした細胞が、ＣＦＣ−Ｔ細胞，ＣＦＣ−Ｂ細胞，ＣＦＣ−Ｅｏｓｉｎ細胞，ＣＦＣ−Ｂａｓ細胞，ＣＦＣ−ＧＭ細胞，ＣＦＣ−ＭＥＧ細胞，ＣＦＣ−Ｅ細胞，Ｔ細胞及びＢ細胞から選ばれることを特徴とする請求項４４〜４８のいずれか記載の方法。
【請求項５０】
未分化細胞が分化多能幹細胞であることを特徴とする請求項４４〜４９のいずれか記載の方法。
【請求項５１】
未分化細胞が造血幹細胞，神経幹細胞，上皮幹細胞，間葉幹細胞及び胚幹細胞からなる群から選ばれる幹細胞であることを特徴とする請求項４４〜５０のいずれか記載の方法。
【請求項５２】
未分化細胞がＣＤ３４^＋，ＨＬＡ−ＤＲ⁻，ＣＤ３８⁻，ＣＤ１１７，ＡＣ１３３，ＣＤ９０及び／又はＣＤ４５ｌｏｗの群から選ばれる１又は２以上の細胞表面マーカーにより特徴づけられることを特徴とする請求項１〜５１のいずれか記載の方法。
【請求項５３】
未分化細胞がＭＨＣクラスＩ^＋細胞及び／又はＭＨＣクラスＩＩ^＋細胞であることを特徴とする請求項４４〜５２のいずれか記載の方法。
【請求項５４】
試薬が、コミットした細胞の表面上における抗原の捕捉、認識又は提示に介在する受容体に関与することを特徴とする請求項４４〜５３のいずれか記載の方法。
【請求項５５】
受容体がＭＨＣクラスＩ抗原又はＭＨＣクラスＩＩ抗原であることを特徴とする請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
クラスＩ抗原がＨＬＡ−Ａ受容体，ＨＬＡ−Ｂ受容体，ＨＬＡ−Ｃ受容体，ＨＬＡ−Ｅ受容体，ＨＬＡ−Ｆ受容体又はＨＬＡ−Ｇ受容体のいずれかであり、クラスＩＩ抗原がＨＬＡ−ＤＭ受容体，ＨＬＡ−ＤＰ受容体，ＨＬＡ−ＤＱ受容体又はＨＬＡ−ＤＲ受容体のいずれかであることを特徴とする請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
受容体がＨＬＡ−ＤＲ受容体であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
受容体が相同領域をもつβ鎖を有することを特徴とする請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
受容体がＨＬＡ−ＤＲのβ鎖の相同領域を少なくとも有することを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
試薬が受容体に対する抗体であることを特徴とする請求項５４記載の方法。
【請求項６１】
試薬が受容体に対するモノクロナール抗体であることを特徴とする請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
抗体がモノクロナール抗体ＣＲ３／４３とモノクロナール抗体ＴＡＬ１Ｂ５からなる群から選ばれることを特徴とする請求項６０又は６１記載の方法。
【請求項６３】
試薬がＭＨＣ遺伝子発現を調節することを特徴とする請求項４５〜６２のいずれか記載の方法。
【請求項６４】
試薬がＭＨＣクラスＩ^＋及び／又はＭＨＣクラスＩＩ^＋発現を調節することを特徴とする請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
コミットした細胞に操作的に関与する試薬と、バフィーコート血液サンプル中のよりコミットした細胞とを接触させ、ＣＤ３４^＋及び／又はＨＬＡ−ＤＲ⁻及び／又はＣＤ３８⁻及び／又はＣＤ１１７及び／又はＡＣ１３３及び／又はＣＤ９０及び／又はＣＤ４５ｌｏｗの細胞が前記関与の結果として増加する過程を含むことを特徴とする、ＣＤ３４^＋及び／又はＨＬＡ−ＤＲ⁻及び／又はＣＤ３８⁻及び／又はＣＤ１１７及び／又はＡＣ１３３及び／又はＣＤ９０及び／又はＣＤ４５ｌｏｗの細胞表面マーカーを有する細胞の相対数をバフィーコート血液サンプル中で増加させる方法。
【請求項６６】
細胞中の正常な分化細胞の割合を置換するのに効果的な逆分化手段と、細胞集団中の１又は２以上の分化細胞とを接触させることにより、１又は２以上の分化細胞が未分化細胞に逆分化することを特徴とする未分化細胞の調製方法。
【請求項６７】
１又は２以上の前記分化細胞を未分化細胞に逆分化させる細胞集団における正常な分化細胞の割合を置換することを特徴とする逆分化手段の使用。
【請求項６８】
１又は２以上の分化細胞を含有する前記細胞集団を含む環境を、第１環境から、１又は２以上の前記分化細胞を未分化細胞に逆分化させるために、第１環境と比較して遊離イオン濃度を効果的に修飾した第２環境へと変化させることを特徴とする、細胞集団中の分化細胞を未分化細胞に逆分化する未分化細胞の調製方法。
【請求項６９】
細胞集団中の１又は２以上の分化細胞と、正常な分化細胞の割合を置換するのに効果的な逆分化手段とを接触される過程と、イオンなし又はイオン封鎖された第１環境中の細胞集団を培養する過程と、第１環境と比較して、第２環境に存在するイオン濃度を効果的に修飾した第２環境へと第１環境を変化させ、１又は２以上の分化細胞が未分化細胞に逆分化する過程とを含むことを特徴とする未分化細胞の調製方法。
【請求項７０】
逆分化手段が、細胞集団中でネガティブセレクションを引き起こして、細胞集団中の正常な分化細胞の割合を破壊する手段であることを特徴とする請求項６６〜６７又は６９のいずれか記載の方法又は使用。
【請求項７１】
逆分化手段が、抗体，細胞密度により細胞を分離するのに用いられる密度勾配培地、又は赤血球細胞の沈澱を生じさせる物質からなる群から選ばれる１又は２以上の手段であることを特徴とす、請求項６６〜６７又は６９〜７０のいずれか記載の方法又は使用。
【請求項７２】
第２環境の前記遊離イオン濃度が第１環境の遊離イオン濃度と比較して増加していることを特徴とする、請求項６８又は６９記載の方法。
【請求項７３】
第２環境の前記相対的な遊離イオン濃度が第１環境と比較して増加することを特徴とする請求項６８〜６９又は７２のいずれか記載の方法。
【請求項７４】
遊離イオンがアニオンであることを特徴とする請求項６８〜６９又は７２〜７３のいずれか記載の方法。
【請求項７５】
遊離イオンが第１類の金属又は第２類の金属であることを特徴とする請求項６８〜６９又は７２〜７４のいずれか記載の方法。
【請求項７６】
遊離イオンがカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンであることを特徴とする請求６８〜６９又は７２〜７５のいずれか記載の方法。
【請求項７７】
環境の遊離イオン濃度が、該環境の遊離イオン濃度を相対的に変更することができる試薬を用いて前記第１環境を処理して、第２環境を生じさせることにより修飾されることを特徴とする請求６８〜６９又は７２〜７６のいずれか記載の方法。
【請求項７８】
第１環境が、１又は２以上のイオン封鎖剤で処理され、その後該封鎖剤が除去され又は該封鎖剤濃度が減少され、比較的増加した遊離イオン濃度を有する第２環境とし、細胞集団中の１又は２以上の分化細胞を逆分化することを特徴とする請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
第１環境が、１又は２以上の遊離イオン封鎖剤を用いて処理され、第１環境と比較して遊離イオン濃度が増加している第２環境に、細胞集団を移すことにより、細胞集団中の１又は２以上の分化細胞を逆分化させることを特徴とする請求項６８〜６９又は７２〜７８記載のいずれか記載の方法。
【請求項８０】
細胞集団が、前記細胞集団が低濃度又は濃度ゼロの遊離イオンを含む第１環境中で培養され、その後該第１環境の細胞を移して又は第１環境を調節して、遊離イオンを含む又は第１環境よりも高濃度で遊離イオンを含む第２環境とし、細胞集団中で１又は２以上の分化細胞を逆分化することを特徴とする請求項６８〜６９又は７２〜７８のいずれか記載の方法。
【請求項８１】
封鎖剤が遊離イオンキレート剤であることを特徴とする請求項７８又は７９記載の方法。
【請求項８２】
封鎖剤がアミン基及びカルボキシル基の両方を含むことを特徴とする請求項７８〜７９又は８１のいずれか記載の方法。
【請求項８３】
封鎖剤が、ｎが１又は２である−Ｎ（ＣＨ_２ＣＯ_２Ｈ）_ｎ基を複数含むことを特徴とする請求項７８〜７９又は８１〜８２のいずれか記載の方法。
【請求項８４】
封鎖剤がＥＤＴＡ，ヘパリン，ＥＧＴＡ，ＤＴＰＡ，クエン酸三ナトリウム及び他の同様のキレート剤及び／又は抗凝固剤の群から１又は２以上選ばれることを特徴とする、請求項７８〜７９又は８１〜８３のいずれか記載の方法。
【請求項８５】
封鎖剤が充分高濃度で添加され、これにより前記封鎖剤の存在の除去が逆分化を生じさせることを特徴とする請求項７８〜７９又は８１〜８４のいずれか記載の方法。
【請求項８６】
封鎖剤が除去されたときに、逆分化を引き起こす充分な濃度が約２ｍＭ又はそれ以上であることを特徴とする請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
より分化した細胞が非癌細胞であることを特徴とする請求項６６〜８６のいずれか記載の方法又は使用。
【請求項８８】
より分化した細胞がコミットした造血系細胞であることを特徴とする請求項６６〜８７のいずれか記載の方法または使用。
【請求項８９】
より分化した細胞が、ＣＦＣ−Ｔ細胞，ＣＦＣ−Ｂ細胞，ＣＦＣ−Ｅｏｓｉｎ細胞，ＣＦＣ−Ｂａｓ細胞，ＣＦＣ−ＧＭ細胞，ＣＦＣ−ＭＥＧ細胞，ＣＦＣ−Ｅ細胞，Ｔ細胞及びＢ細胞から選ばれることを特徴とする請求項６６〜８８のいずれか記載の方法又は使用。
【請求項９０】
未分化細胞が分化多能幹細胞であることを特徴とする請求項６６〜８９のいずれか記載の方法又は使用。
【請求項９１】
未分化細胞が造血系細胞，神経幹細胞，上皮幹細胞，間葉幹細胞，内胚葉幹細胞及び胚幹細胞からなる群から選ばれる幹細胞であることを特徴とする請求項６６〜９０のいずれか記載の方法又は使用。
【請求項９２】
未分化細胞がＣＤ３４^＋，ＨＬＡ−ＤＲ⁻，ＣＤ３８⁻，ＣＤ１１７，ＡＣ１３３，ＣＤ９０及び／又はＣＤ４５ｌｏｗの群から選ばれる１又は２以上の細胞表面マーカーにより特徴づけられることを特徴とする請求項６６〜９１のいずれか記載の方法又は使用。
【請求項９３】
未分化細胞がＭＨＣクラスＩ^＋細胞及び／又はＭＨＣクラスＩＩ^＋細胞であることを特徴とする請求項６６〜９２のいずれか記載の方法又は使用。
【請求項９４】
コミットした細胞を含む細胞集団がバフィーコート血液サンプルである又はバフィーコート血液サンプル由来であることを特徴とする請求項６６〜９３のいずれか記載の方法又は使用。
【請求項９５】
細胞集団中の分化細胞を未分化細胞に逆分化させる方法において、１又は２以上の分化細胞を含む前記細胞集団を含む環境を、低濃度又は濃度ゼロの遊離カルシウムイオン又は遊離マグネシウムイオンを含む第１環境から、遊離カルシウムイオン若しくは遊離マグネシウムイオンを有する、又は第１環境よりも高濃度の遊離カルシウムイオン若しくは遊離マグネシウムイオンを有する第２環境に変化させることにより、細胞集団中の１又は２以上の分化細胞を逆分化させることを特徴とする未分化細胞の調製方法。
【請求項９６】
細胞集団中の分化造血系細胞を未分化細胞に逆分化させる方法において、１又は２以上の分化造血系細胞を含有する前記細胞集団を含む環境を、第１環境から、前記分化造血系細胞が未分化細胞に逆分化するように、遊離イオン濃度を第１環境と比較して効果的に修飾した第２環境へと変化させることを特徴とする未分化細胞の調製方法。
【請求項９７】
細胞集団中の分化細胞を未分化細胞に逆分化させる方法において、環境の遊離イオン濃度を相対的に修飾して第２環境を作り出すことができる試薬を用いて、第１環境を処理することにより、前記細胞集団を含む環境を修飾することを特徴とする未分化細胞の調製方法。

【図１】

【図２】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図２０】

【図３】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１７Ｃ】

【図１７Ｄ】

【図１７Ｅ】

【図１８】

【図１９】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【公開番号】特開２０１１−１５５９８４（Ｐ２０１１−１５５９８４Ａ）
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】

化学；冶金 (1,075,549)
- 生化学；ビール；酒精；ぶどう酒；酢；微生物学；酵素学；突然変異... (115,607)
  - 酵素学または微生物学のための装置 (8,885)
    - 酵素学または微生物学のための装置 (7,874)
      - 状態の測定または検出手段をもって測定または試験を行なうもの，例... (1,919)
  - 微生物または酵素；その組成物 (68,222)
    - ヒト，動物または植物の未分化細胞，例．セルライン；組織；その培... (10,252)
      - 動物細胞または組織 (1,187)
        
        脊椎動物細胞または組織，例．ヒト細胞または組織 (1,091)
        
        胚細胞または組織；胎児細胞または組織 (141)
        
        胚性幹細胞；胚性生殖細胞 (115)
        
        成体幹細胞 (77)
        
        間葉細胞，例．骨細胞，軟骨細胞，骨髄間質細胞，脂肪細胞または筋... (171)
        
        間葉系幹細胞；脂肪組織由来幹細胞 (102)
        
        血液または免疫系からの細胞 (283)
        
        幹細胞；多能性前駆細胞 (48)
        
        神経系の細胞 (69)
        
        幹細胞；前駆細胞 (33)

【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−８５５５９（Ｐ２０１１−８５５５９）
【出願日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【分割の表示】特願２００１−５８２５０６（Ｐ２００１−５８２５０６）の分割
【原出願日】平成１３年５月１０日（２００１．５．１０）
【出願人】（５０７２３７８１９）トライステム・トレイディング・（キプロス）・リミテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＴｒｉＳｔｅｍ　Ｔｒａｄｉｎｇ　（Ｃｙｐｒｕｓ）　Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】

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