複数のＣＴＰ付加を有するホルモンアナログ
【課題】本発明は延長された半減期を有するペプチド及びタンパク質医薬用化合物を提供する。
【解決手段】本発明の修飾ペプチド及びタンパク質はＣ端にヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのカルボキシル端部位を含む、少なくとも２つの直列付加を含む。これらの”ＣＴＰユニット”は本質的に、ＨＣＧ−β配列の１１２−１１８位から１４５位に本来存在するアミノ酸配列またはそれらの保存的修飾から構成される。
【解決手段】本発明の修飾ペプチド及びタンパク質はＣ端にヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのカルボキシル端部位を含む、少なくとも２つの直列付加を含む。これらの”ＣＴＰユニット”は本質的に、ＨＣＧ−β配列の１１２−１１８位から１４５位に本来存在するアミノ酸配列またはそれらの保存的修飾から構成される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術の分野
本発明はｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性が向上するように修飾を受けた医薬用化合物に関する。より具体的には本発明はヒト絨毛性血清性性腺刺激ホルモンのカルボキシル端ペプチドを直列に付加すること（ｔａｎｄｅｍ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）による、薬学的に重要なペプチドの修飾に関する。
【背景技術】
【０００２】
技術背景
１９９０年９月７日に公開され、本明細書中に参考文献として取り込まれるＰＣＴ出願第ＷＯ９０／０９８００号は、生殖ホルモンの様々な修飾について記載している。更に、この公開は、タンパク薬剤及び一般のホルモンのｉｎ ｖｉｖｏにおける生物学的半減期を延長するために、ＨＣＧ−βサブユニットまたはその変異体のカルボキシル端部位を、該タンパク薬剤等のカルボキシル端に結合するという修飾を行うことができることを開示する。ＰＣＴ出願の開示は多数のＨＣＧ−β鎖カルボキシル端部位（ＣＴＢ）を直列に付加することを特異的に記載するものではない。本発明はそのような直列の付加を記載する。
【０００３】
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（Ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）（ＨＣＧ）は少なくとも４つの生殖ホルモンからなるファミリーの１つであり、このファミリーには濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン及び甲状腺刺激ホルモンを含む。これらのホルモンはすべて、グループ間で同一であるαサブユニット及びファミリーのメンバーごとに異なるβサブユニットから成る。ＨＣＧのβサブユニットは残りの３つのホルモンのβサブユニットよりもかなり大きく、本明細書中にはカルボキシル端部位（ＣＴＰ）と記載するおよそ３４の余分なアミノ酸をＣ端に含んでおり、それが他の性腺刺激ホルモンに比べてｈＣＧが血清中で比較的長い半減期をもつ原因と考えられている（Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ （１９８９）１２６：３７６）。天然のホルモンではこのＣＴＰ付加は４つのムチン様Ｏ−結合オリゴ糖鎖を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は延長された半減期を有するペプチド及びタンパク質医薬用化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明はカルボキシル端に少なくとも２つのＣＴＰ配列の直列付加を含むことにより生物学的半減期が延長した、修飾ペプチド及びタンパク質を提供する。これらの付加タンパク質は未修飾のものと同等の生物学的機能を有するが、生物学的半減期の延長により投与量を減らすことができるなどの利点を有する。
【０００６】
このように、１つの側面において、本発明はＣ端に少なくとも２つのＣＴＰ配列の直列付加という修飾を受け、動物体内において生物学的機能を有するペプチドあるいはタンパク質を目的とする。別の側面において、本発明はこのような付加を与えることにより、ペプチドあるいはタンパク質の生物学的半減期を延長させる方法を目的とする。さらに別の側面において本発明は本発明の修飾タンパク質を構築するための組み換え材料及び組み換え方法、そしてこれらと特異的に免疫反応を起こす抗体を目的とする。
【０００７】
発明の実施様式
生物学的に重要なペプチドまたはタンパク質はすべて本発明の方法に従った修飾を受け得る。従って、このような修飾の対象候補に含まれるのは上記の４つのヒト”生殖”ホルモン、特にそれらのβ鎖；インスリン；ヒト成長ホルモン；エンケファリン；ＡＣＴＨ；グルカゴン；等のようなペプチドホルモンである。また本発明の修飾を受けるものとして有用なものにはインスリン様成長因子；表皮成長因子；酸性及び塩基性繊維芽細胞成長因子；血小板由来成長因子などの様々な成長因子、顆粒球ＣＳＦ；大食細胞ＣＳＦ等のような様々なコロニー刺激因子、並びにＩＬ−２，ＩＬ−３及びそのほか非常に多くのインターロイキンタンパク質；様々なインターフェロン；腫瘍壊死因子；等のような様々なサイトカインがある。また本発明の方法を用いる候補として、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）；ソマトスタチン；成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）；及びエンドルフィンのような短いペプチド配列がある。肺胞界面活性タンパク質；ナトリウム利尿性因子；アドヘシン；受容体ペプチド；一般の受容体結合リガンド；抗体及びその断片；並びに、所望の生物学的機能を有するその他の有用なペプチドまたはタンパク質、等のタンパク質薬剤もまた本明細書中に記載された方法に従って修飾を受け得る。
【０００８】
本明細書中に使用されている”ＣＴＰユニット”はヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのカルボキシル端のアミノ酸１１２−１１８から１４５残基目に存在するアミノ酸配列に関する。このようにペプチドまたはタンパク質のカルボキシル端の修飾に用いる各ＣＴＰユニットはＣＴＰのＮ端に応じてそれぞれ独立に２８−３４アミノ酸を含んでいてよい。”ＣＴＰユニット”は天然のＣＴＰ配列に正確に一致していてもよく、配列中に含まれる１−５のアミノ酸がその位置で保存的なアナログに置換されていても良く、この場合置換は累積的に起こり、ＣＴＰユニットの特性である安定性には大きな変化は生じない。”保存的なアナログ”は慣用された意味において、置換後の残基が置換されたアミノ酸残基と同じ一般的アミノ酸範疇に入るようなアナログを意味する。当該技術分野において理解されているように、アミノ酸は例えばＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （１９７２） ５：８９−９９ に記載されているようにこのようなグループに分類されている。一般に酸性アミノ酸が１つのグループをつくり、塩基性アミノ酸がまた１つのグループをつくり、中性疎水性アミノ酸がまた別のグループをつくる、というようになっている。
【０００９】
より具体的には、アミノ酸残基は一般に下記のような主に４つのサブクラスに亜分類される：
酸性：生理的ｐＨにおいて残基はＨイオンを失って負の電荷をもち、水性溶液に誘引される。このため、この残基を含むペプチドが生理的ｐＨの水性環境中に存在する場合、残基はペプチドの構造中、表面に位置しようとする。
【００１０】
塩基性：生理的ｐＨにおいて残基はＨイオンの結合によって正の電荷をもち、水性溶液に誘引される。このため、この残基を含むペプチドが生理的ｐＨの水性環境中に存在する場合、残基はペプチドの構造中、表面に位置しようとする。
【００１１】
中性／無極性：生理的ｐＨにおいて残基は電荷をもたず、水性溶液に反発される。このため、この残基を含むペプチドが生理的ｐＨの水性環境中に存在する場合、残基はペプチドの構造中、内部に位置しようとする。これらの残基は本明細書中、”疎水性”とも定義される。
【００１２】
中性／極性：生理的ｐＨにおいて残基は電荷をもたないが、水性溶液に誘引される。このため、この残基を含むペプチドが生理的ｐＨの水性環境中に存在する場合、残基はペプチドの構造中、外側に位置しようとする。
【００１３】
個々の残基分子の統計的な集合においてはある分子は電荷をもち、他の分子は電荷をもたず、多かれ少なかれ水性溶液に誘引または反発されるであろうことはもちろん理解されるであろう。”電荷をもつ”という定義に適合するには個々の分子の有意の割合（少なくともおよそ２５％）が生理的ｐＨにおいて電荷をもつ。極性または無極性に分類するために必要な誘引または反発の度合いは独断的なものであり、従って、本発明において特に意図されるアミノ酸はそのどちらかに分類される。特に定義されていないアミノ酸の多くは、それらの知られている行動に基づき分類できる。
【００１４】
アミノ酸残基はさらに、環式または非環式及び、芳香族または非芳香族という残基の側鎖の置換基による自明のクラス分け及び、小型または大型という亜分類ができる。カルボキシル基の炭素を含め合計４つ若しくはそれ以下の炭素原子を含む場合その残基は小型と考える。小型残基はもちろん常に非芳香族である。
【００１５】
自然界に存在するタンパク質アミノ酸の上記の提案にしたがった亜分類は以下のようになる。
酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸
塩基性／非環式：アルギニン、リジン
塩基性／環式：ヒスチジン
中性／極性／小型：グリシン、セリン、システイン
中性／無極性／小型：アラニン
中性／極性／大型／非芳香族：スレオニン、アスパラギン、グルタミン
中性／極性／大型／芳香族：チロシン
中性／無極性／大型／非芳香族：バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニ ン
中性／無極性／大型／芳香族：フェニルアラニン、及びトリプトファン
遺伝子にコードされている第２アミノ酸のプロリンは専門的には中性／無極性／大型／環式及び非芳香族のグループに入るが、ペプチド鎖の２次構造への既知の効果のため特別なケースとなり、従って、この定義グループには含まれない。 もし本発明の修飾ペプチドが遺伝子の修飾によって構築される場合、ＣＴＰユニットは遺伝子にコードされるアミノ酸による置換のみ含むことになるが、ＣＴＰユニットが標準的なペプチド合成法、例えば固相ペプチド合成法によって合成され、そして受け手のペプチドまたはタンパク質のＣ端に、例えば酵素的に結合される場合、アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）等のような遺伝子にコードされないアミノ酸も類似の相似物と置換され得る。
【００１６】
これらのコードされないアミノ酸は例えば、ベータアラニン（ｂｅｔａ−ａｌａ）、または３−アミノプロピオン酸、４−アミノブチル酸のようなオメガアミノ酸、及びサルコシン（Ｓａｒ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）、及びシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；１、２、３、４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸（Ｔｉｃ）、メルカプト吉草酸（Ｍｖｌ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；並びにメチオニンンスルフォキシド（ＭＳＯ）を含む。これらもまた、好都合にもある特定の範疇にはいる。
【００１７】
上記の定義に基づき、
Ｓａｒ及びｂｅｔａ−Ａｌａ及びＡｉｂは中性／無極性／小型；
ｔ−ＢｕＡ、ｔ−ＢｕＧ、Ｎ−ＭｅＩｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍｖｌ及びＣｈａは中性／無極性／大型／非芳香族；
Ｏｒｎは塩基性／非環式；
Ｃｙａは酸性；
Ｃｉｔ、アセチルＬｙｓ及びＭＳＯは中性／極性／大型／非芳香族、そして
Ｐｈｇ、Ｎａｌ、Ｔｈｉ及びＴｉｃは中性／無極性／大型／芳香族。
【００１８】
さまざまなオメガアミノ酸は大きさによって、中性／無極性／小型（ｂｅｔａ−Ａｌａ、すなわち３−アミノプロピオン酸、４−アミノブチル酸）または大型（その他もすべて）に分類される。
【００１９】
その他の、遺伝子にコードされるアミノによるアミノ酸置換も本発明の範囲内のペプチド化合物に含まれ、かつそれらの構造に従ってこの一般的なスキーム（ｓｃｈｅｍｅ）により分類され得る。
【００２０】
直列ＣＴＰ残基が結合するペプチドまたはタンパク質はまた、生物学的活性が失われない限り通常生物学的に存在する型から、修飾され得ることはもちろん特筆すべきことである。
【００２１】
本発明の修飾ペプチド及びタンパク質はリン酸化、グリコシル化、通常の糖鎖結合型の脱グリコシル化、アミノ酸側鎖の修飾（例えばプロリンのヒドロキシルプロリンへの転換）及び一般に起こることが知られている転写後の修飾に類似した同様の修飾のような、一般に理解されている方法によって派生アミノ酸配列へとさらに修飾され得る。
【００２２】
本発明の生物学的に活性な化合物である修飾ペプチド及びタンパク質を構築する方法は当該技術分野ではよく知られている。上記のように、遺伝子にコードされるアミノ酸のみが含まれる場合、現在最も実際的なアプローチは目的のペプチドをコードするＤＮＡを修飾することによってこれらの物質を組み換え合成することである。部位特異的突然変異誘発、付加配列の結合及び適切な発現システムの構築のための技術はすべて、現在では当該技術分野においてよく知られていることである。目的のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡに付加されるＣＴＰユニットをコードするＤＮＡは最も好都合には、標準的な固相技術を用いて合成的に構築され、その際、好ましくは結合を簡単にするため制限酵素認識部位を含むように合成され、候補のペプチドまたはタンパク質をコードする配列に結合される。候補のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列がそこに含まれているコーディング配列の転写及び翻訳を制御する適切な要素を含む発現システムの一部にまだなっていない場合、修飾されたＤＮＡコーディング配列がこれらの特徴をもって提供される。よく知られているように、現在、発現システムはバクテリアのような原核宿主、及び酵母、植物細胞、昆虫細胞、ホニュウ類細胞、鳥類細胞等のような真核宿主を含む、広く多様な宿主に適合するものが利用可能である。
【００２３】
また、候補となる生化学的薬剤が短いペプチドである場合、または酵素によるサブユニットの転移が効果的である場合には、本発明のＣＴＰユニットはｉｎ ｖｉｔｒｏ固相ペプチド合成技術を用いて直接合成されてもよく、これらの条件下で、もし望むならば、ＣＴＰユニットは遺伝子にコードされないアミノ酸アナログによって修飾されてもよい。
【００２４】
得られた修飾生化学的薬剤は少なくとも２つのＣＴＰユニットをＣ端に直列に含む。３つ若しくはそれ以上のＣＴＰユニットを含む複数ＣＴＰユニットもまた考えられ、本発明の範囲に含まれる。上記のように、Ｃ末端に直列に結合されたＣＴＰユニットは互いに同一である必要はない。Ｎ端の初めのアミノ酸（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβサブユニットの１１２−１１８位）に応じて、長さが異なっていてもよいし、天然の残基に対するアミノ酸置換がもしある場合には、含まれている直列配列の中で、その置換がユニットごとに異なっていてもよい。
【００２５】
本発明タンパク質の結合型
当該技術分野において一般に知られているように、本発明の修飾ペプチド及びタンパク質は目的の応用に従って、ラベル、薬剤、標的因子、担体、固相支持体等に結合していてもよい。ラベルされた型の修飾生化学薬剤は代謝の結果を追跡するために使用されても良いし；この目的に適したラベルには特にヨウ素１３１、テクネチウム９９、インジウム１１１等のようなラジオアイソトープラベルが含まれる。ラベルはまた、分析系において修飾タンパク質またはペプチドの検出を媒介するのに使用されてもよい；この場合には、酵素ラベル、蛍光ラベル、色原体ラベル等と同様に、ラジオアイソトープを使用することもできる。このようなラベルの使用はペプチドまたはタンパク質がそれ自身、抗体または受容体リガンドのような標的因子である場合、特に有用である。
【００２６】
反対に、特に修飾ペプチドまたはタンパク質が標的因子であり、比較的代謝による活性の変化がない場合、本発明の修飾された化合物は抗炎症剤、抗生物質、毒素等のような適切な薬剤と結合してもよい。本発明の修飾化合物はまた、これらの新たな修飾された型に特異的に免疫反応を起こす抗体の調製において、免疫原性を増幅するために担体と結合してもよい。この目的に適切な担体は、キーホール リンペット ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びジフテリアトキソイド等を含む。本発明の修飾ペプチドを担体へ結合するために、２官能性リンカーの使用を含む標準的な結合技術が使用され得る。
【００２７】
他の方法に加えて、同様の結合技術が本発明の修飾ペプチド及びタンパク質を固相支持体に結合させるのに使用され得る。結合すると、次にこれらの修飾ペプチド及びタンパク質は目的の化合物を分離するための特異的反応を引き起こす親和性試薬として使用され得る。
【００２８】
最後に、本発明の修飾ペプチド及びタンパク質はこれらの新たな化合物と特異的に免疫反応をおこす抗体を作成するために使用されてもよい。これらの抗体は未修飾のペプチド及びタンパク質の生物学的活性の性質に応じて、様々な診断及び治療への応用に有用である。
【００２９】
本発明の修飾ペプチド及びタンパク質はこれらに対応する未修飾のペプチド及びタンパク質と同様の方法によって調製され、投与される。このように、調製及び投与方法は候補の未修飾型に従って変わる。しかし、修飾ペプチドまたはタンパク質の生物学的半減期の延長を考慮すれば投与の量及び頻度は未修飾型にくらべて減少してもよい。
【００３０】
本発明の好ましい態様
本発明は、好ましい態様として以下のものを含む。
１．２つ若しくはそれ以上の直列ＣＴＰユニットをＣ端に付加された、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を含む、修飾ペプチドまたはタンパク質。
【００３１】
２．ＣＴＰユニットが、本質的に、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの１１２−１１８位から１４５位に天然に存在するアミノ酸配列からなる態様１に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質。
【００３２】
３．少なくとも１つのＣＴＰユニットがヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの１１２−１１８位から１４５位に存在する天然のアミノ酸配列に関して、少なくとも１つの保存的なアミノ酸置換を含む、態様１に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質。
【００３３】
４．態様１の修飾ペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
５．修飾ペプチドまたはタンパク質をコードし、発現をもたらすための制御配列に機能的に結合されているＤＮＡを含み；
組み換え宿主細胞内に含まれる場合に該修飾ペプチドまたはタンパク質を生産できる、組み換え発現システムであって、
該修飾ペプチドまたはタンパク質は、２つ若しくはそれ以上の直列ＣＴＰユニットをＣ端に付加された、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を含む、
組み換え発現系システム。
【００３４】
６．態様５の発現システムで形質導入または形質転換された、組み換え宿主細胞。
７．２つ若しくはそれ以上の直列ＣＴＰユニットをＣ端に付加された、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を含む修飾ペプチドまたはタンパク質の製造方法であって、
該コーディングＤＮＡが発現される条件下で態様６の請求の細胞を培養し；そして
該修飾ペプチドまたはタンパク質を回収する、
ことからなる方法。
【００３５】
８．生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質の生物学的半減期を延長する方法であって、該ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に少なくとも２つの直列ＣＴＰユニットを付加することからなる方法。
【００３６】
９．さらにアミノ酸配列は変化させない追加の置換体と結合している、態様１に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質。
１０．追加の置換体が固相支持体、ラベル、薬剤、糖質、及び免疫原性を与える担体から選ばれる、態様９に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質。
１１．態様１に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質と特異的に免疫反応性をもつ抗体。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、制限するためのものではない。
実施例１
２つのＣＴＰユニット直列付加を有するヒトβサブユニットの分離
図１Ａ及び１ＢはヒトＦＳＨのβ鎖が２つのＣＴＰユニットを含むように修飾されている発現ベクターのコンストラクションを示す。図１Ｂに示されるように、より付加されたβサブユニットを得るために、１つのＣＴＰユニットが付加したヒトＦＳＨβ鎖の３’端のＨｉｎｄＩＩＩ部位をヒトＨＣＧ−β遺伝子の３’端由来のＣＴＰユニットを結合するのに用いる。次に付加された型のＦＳＨ−β鎖の、ホニュウ類の細胞内での生産を可能にする発現システムを得るため、ｈＦＳＨ−β（ＣＴＰ）２遺伝子を発現ベクターｐＭ２へ結合する。宿主発現ベクターのコンストラクションはＭａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ （１９８７） ８４：６３５４−６３５８；Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８８） １０６：１０４９−１０５９に記載されている。
【００３８】
より詳細には、ｈＣＧβサブユニット（ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ））のＯ−結合末端部位を１ユニットもつｈＦＳＨβキメラを作成するために、ｈＦＳＨβ遺伝子のコドン１１１の停止コドン及びｈＣＧＨ遺伝子のコドン１１８にＨｉｎｄＩＩＩ部位を作成した（図１Ａ）。ｈＦＳＨβ遺伝子由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＣＧβ由来のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに結合した。このキメラ（ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ））は結合部位にＳｅｒ１１８からＡｌａ１１８への変化を含むが、これはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって訂正された。２つの直列ＣＴＰ反復を含むキメラ（ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）２）はｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）キメラの停止コドンに新たなＨｉｎｄＩＩＩ部位を作成することによって構築した（図１Ｂ）。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｈＣＧβ由来のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに結合した。つくられたａｌａコドンは上記の方法によってｓｅｒコドンへ再転換され得る。
【００３９】
ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）またはｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）２遺伝子を真核発現ベクターｐＭ２に挿入するために、クレノー酵素及びＢａｍＨＩオリゴヌクレオチドリンカーを用いて５’端のＨｉｎｄＩＩＩ部位をＢａｍＨＩ部位へ転換し（図１Ｃ）、そしてｈＦＳＨβＣＴＰまたはｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）２遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＭ２のＢａｍＨＩ部位に挿入した。正しい方向で挿入されたことを制限酵素解析によって確認し、そして突然変異誘発の特異性を確かめるためにエクソンIII全体の配列を塩基配列決定した。
実施例２
ＣＴＰ直列付加の効果
上記の実施例１で示したように作成した、２つのＣＴＰユニットを付加したβサブユニットを含むヒトＦＳＨをラットに投与した。２４匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙメスのラットをこの実験に使用した。１２のラットにはそれぞれ、ＭＥＭ培地中で作成された１０ ＩＵの未修飾ＦＳＨを投与し、残りの１２のラットにはそれぞれ、ＭＥＭ培地中で作成された１０ ＩＵのｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）２付加ＦＳＨを投与した。血清を、投与直後、及び１時間以内に数回、そして２、４、及び８時間後に採取した。ＦＳＨホルモンに対する標準的なラジオイムノアッセイを用いて血清を解析した。結果を図２に示す。
【００４０】
図２に示されるように、血清中の未修飾ＦＳＨの量は８時間の間に０．５ ＩＵ／ｍｌから０．０５ ＩＵ／ｍｌ未満に減少したが、２つのＣＴＰユニットを含む本発明の修飾ＦＳＨ量はこの時間を経ても殆ど変化せず、約０．８ ＩＵ／ｍｌから約０．５ ＩＵ／ｍｌに減少するだけである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｃは１つまたは２つのＣＴＰユニットをカルボキシル端付加として含むヒト濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のβサブユニット組み換え体の製造のためのベクターのコンストラクションを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｃは１つまたは２つのＣＴＰユニットをカルボキシル端付加として含むヒト濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のβサブユニット組み換え体の製造のためのベクターのコンストラクションを示す。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｃは１つまたは２つのＣＴＰユニットをカルボキシル端付加として含むヒト濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のβサブユニット組み換え体の製造のためのベクターのコンストラクションを示す。
【図２】図２は野生型ＦＳＨと比較してβサブユニットに２つのＣＴＰユニットＣ端付加を含むＦＳＨの生物学的安定性の増強を示す。
【技術分野】
【０００１】
技術の分野
本発明はｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性が向上するように修飾を受けた医薬用化合物に関する。より具体的には本発明はヒト絨毛性血清性性腺刺激ホルモンのカルボキシル端ペプチドを直列に付加すること（ｔａｎｄｅｍ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）による、薬学的に重要なペプチドの修飾に関する。
【背景技術】
【０００２】
技術背景
１９９０年９月７日に公開され、本明細書中に参考文献として取り込まれるＰＣＴ出願第ＷＯ９０／０９８００号は、生殖ホルモンの様々な修飾について記載している。更に、この公開は、タンパク薬剤及び一般のホルモンのｉｎ ｖｉｖｏにおける生物学的半減期を延長するために、ＨＣＧ−βサブユニットまたはその変異体のカルボキシル端部位を、該タンパク薬剤等のカルボキシル端に結合するという修飾を行うことができることを開示する。ＰＣＴ出願の開示は多数のＨＣＧ−β鎖カルボキシル端部位（ＣＴＢ）を直列に付加することを特異的に記載するものではない。本発明はそのような直列の付加を記載する。
【０００３】
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（Ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）（ＨＣＧ）は少なくとも４つの生殖ホルモンからなるファミリーの１つであり、このファミリーには濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン及び甲状腺刺激ホルモンを含む。これらのホルモンはすべて、グループ間で同一であるαサブユニット及びファミリーのメンバーごとに異なるβサブユニットから成る。ＨＣＧのβサブユニットは残りの３つのホルモンのβサブユニットよりもかなり大きく、本明細書中にはカルボキシル端部位（ＣＴＰ）と記載するおよそ３４の余分なアミノ酸をＣ端に含んでおり、それが他の性腺刺激ホルモンに比べてｈＣＧが血清中で比較的長い半減期をもつ原因と考えられている（Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ （１９８９）１２６：３７６）。天然のホルモンではこのＣＴＰ付加は４つのムチン様Ｏ−結合オリゴ糖鎖を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は延長された半減期を有するペプチド及びタンパク質医薬用化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明はカルボキシル端に少なくとも２つのＣＴＰ配列の直列付加を含むことにより生物学的半減期が延長した、修飾ペプチド及びタンパク質を提供する。これらの付加タンパク質は未修飾のものと同等の生物学的機能を有するが、生物学的半減期の延長により投与量を減らすことができるなどの利点を有する。
【０００６】
このように、１つの側面において、本発明はＣ端に少なくとも２つのＣＴＰ配列の直列付加という修飾を受け、動物体内において生物学的機能を有するペプチドあるいはタンパク質を目的とする。別の側面において、本発明はこのような付加を与えることにより、ペプチドあるいはタンパク質の生物学的半減期を延長させる方法を目的とする。さらに別の側面において本発明は本発明の修飾タンパク質を構築するための組み換え材料及び組み換え方法、そしてこれらと特異的に免疫反応を起こす抗体を目的とする。
【０００７】
発明の実施様式
生物学的に重要なペプチドまたはタンパク質はすべて本発明の方法に従った修飾を受け得る。従って、このような修飾の対象候補に含まれるのは上記の４つのヒト”生殖”ホルモン、特にそれらのβ鎖；インスリン；ヒト成長ホルモン；エンケファリン；ＡＣＴＨ；グルカゴン；等のようなペプチドホルモンである。また本発明の修飾を受けるものとして有用なものにはインスリン様成長因子；表皮成長因子；酸性及び塩基性繊維芽細胞成長因子；血小板由来成長因子などの様々な成長因子、顆粒球ＣＳＦ；大食細胞ＣＳＦ等のような様々なコロニー刺激因子、並びにＩＬ−２，ＩＬ−３及びそのほか非常に多くのインターロイキンタンパク質；様々なインターフェロン；腫瘍壊死因子；等のような様々なサイトカインがある。また本発明の方法を用いる候補として、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）；ソマトスタチン；成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）；及びエンドルフィンのような短いペプチド配列がある。肺胞界面活性タンパク質；ナトリウム利尿性因子；アドヘシン；受容体ペプチド；一般の受容体結合リガンド；抗体及びその断片；並びに、所望の生物学的機能を有するその他の有用なペプチドまたはタンパク質、等のタンパク質薬剤もまた本明細書中に記載された方法に従って修飾を受け得る。
【０００８】
本明細書中に使用されている”ＣＴＰユニット”はヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのカルボキシル端のアミノ酸１１２−１１８から１４５残基目に存在するアミノ酸配列に関する。このようにペプチドまたはタンパク質のカルボキシル端の修飾に用いる各ＣＴＰユニットはＣＴＰのＮ端に応じてそれぞれ独立に２８−３４アミノ酸を含んでいてよい。”ＣＴＰユニット”は天然のＣＴＰ配列に正確に一致していてもよく、配列中に含まれる１−５のアミノ酸がその位置で保存的なアナログに置換されていても良く、この場合置換は累積的に起こり、ＣＴＰユニットの特性である安定性には大きな変化は生じない。”保存的なアナログ”は慣用された意味において、置換後の残基が置換されたアミノ酸残基と同じ一般的アミノ酸範疇に入るようなアナログを意味する。当該技術分野において理解されているように、アミノ酸は例えばＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （１９７２） ５：８９−９９ に記載されているようにこのようなグループに分類されている。一般に酸性アミノ酸が１つのグループをつくり、塩基性アミノ酸がまた１つのグループをつくり、中性疎水性アミノ酸がまた別のグループをつくる、というようになっている。
【０００９】
より具体的には、アミノ酸残基は一般に下記のような主に４つのサブクラスに亜分類される：
酸性：生理的ｐＨにおいて残基はＨイオンを失って負の電荷をもち、水性溶液に誘引される。このため、この残基を含むペプチドが生理的ｐＨの水性環境中に存在する場合、残基はペプチドの構造中、表面に位置しようとする。
【００１０】
塩基性：生理的ｐＨにおいて残基はＨイオンの結合によって正の電荷をもち、水性溶液に誘引される。このため、この残基を含むペプチドが生理的ｐＨの水性環境中に存在する場合、残基はペプチドの構造中、表面に位置しようとする。
【００１１】
中性／無極性：生理的ｐＨにおいて残基は電荷をもたず、水性溶液に反発される。このため、この残基を含むペプチドが生理的ｐＨの水性環境中に存在する場合、残基はペプチドの構造中、内部に位置しようとする。これらの残基は本明細書中、”疎水性”とも定義される。
【００１２】
中性／極性：生理的ｐＨにおいて残基は電荷をもたないが、水性溶液に誘引される。このため、この残基を含むペプチドが生理的ｐＨの水性環境中に存在する場合、残基はペプチドの構造中、外側に位置しようとする。
【００１３】
個々の残基分子の統計的な集合においてはある分子は電荷をもち、他の分子は電荷をもたず、多かれ少なかれ水性溶液に誘引または反発されるであろうことはもちろん理解されるであろう。”電荷をもつ”という定義に適合するには個々の分子の有意の割合（少なくともおよそ２５％）が生理的ｐＨにおいて電荷をもつ。極性または無極性に分類するために必要な誘引または反発の度合いは独断的なものであり、従って、本発明において特に意図されるアミノ酸はそのどちらかに分類される。特に定義されていないアミノ酸の多くは、それらの知られている行動に基づき分類できる。
【００１４】
アミノ酸残基はさらに、環式または非環式及び、芳香族または非芳香族という残基の側鎖の置換基による自明のクラス分け及び、小型または大型という亜分類ができる。カルボキシル基の炭素を含め合計４つ若しくはそれ以下の炭素原子を含む場合その残基は小型と考える。小型残基はもちろん常に非芳香族である。
【００１５】
自然界に存在するタンパク質アミノ酸の上記の提案にしたがった亜分類は以下のようになる。
酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸
塩基性／非環式：アルギニン、リジン
塩基性／環式：ヒスチジン
中性／極性／小型：グリシン、セリン、システイン
中性／無極性／小型：アラニン
中性／極性／大型／非芳香族：スレオニン、アスパラギン、グルタミン
中性／極性／大型／芳香族：チロシン
中性／無極性／大型／非芳香族：バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニ ン
中性／無極性／大型／芳香族：フェニルアラニン、及びトリプトファン
遺伝子にコードされている第２アミノ酸のプロリンは専門的には中性／無極性／大型／環式及び非芳香族のグループに入るが、ペプチド鎖の２次構造への既知の効果のため特別なケースとなり、従って、この定義グループには含まれない。 もし本発明の修飾ペプチドが遺伝子の修飾によって構築される場合、ＣＴＰユニットは遺伝子にコードされるアミノ酸による置換のみ含むことになるが、ＣＴＰユニットが標準的なペプチド合成法、例えば固相ペプチド合成法によって合成され、そして受け手のペプチドまたはタンパク質のＣ端に、例えば酵素的に結合される場合、アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）等のような遺伝子にコードされないアミノ酸も類似の相似物と置換され得る。
【００１６】
これらのコードされないアミノ酸は例えば、ベータアラニン（ｂｅｔａ−ａｌａ）、または３−アミノプロピオン酸、４−アミノブチル酸のようなオメガアミノ酸、及びサルコシン（Ｓａｒ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）、及びシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；１、２、３、４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸（Ｔｉｃ）、メルカプト吉草酸（Ｍｖｌ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；並びにメチオニンンスルフォキシド（ＭＳＯ）を含む。これらもまた、好都合にもある特定の範疇にはいる。
【００１７】
上記の定義に基づき、
Ｓａｒ及びｂｅｔａ−Ａｌａ及びＡｉｂは中性／無極性／小型；
ｔ−ＢｕＡ、ｔ−ＢｕＧ、Ｎ−ＭｅＩｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍｖｌ及びＣｈａは中性／無極性／大型／非芳香族；
Ｏｒｎは塩基性／非環式；
Ｃｙａは酸性；
Ｃｉｔ、アセチルＬｙｓ及びＭＳＯは中性／極性／大型／非芳香族、そして
Ｐｈｇ、Ｎａｌ、Ｔｈｉ及びＴｉｃは中性／無極性／大型／芳香族。
【００１８】
さまざまなオメガアミノ酸は大きさによって、中性／無極性／小型（ｂｅｔａ−Ａｌａ、すなわち３−アミノプロピオン酸、４−アミノブチル酸）または大型（その他もすべて）に分類される。
【００１９】
その他の、遺伝子にコードされるアミノによるアミノ酸置換も本発明の範囲内のペプチド化合物に含まれ、かつそれらの構造に従ってこの一般的なスキーム（ｓｃｈｅｍｅ）により分類され得る。
【００２０】
直列ＣＴＰ残基が結合するペプチドまたはタンパク質はまた、生物学的活性が失われない限り通常生物学的に存在する型から、修飾され得ることはもちろん特筆すべきことである。
【００２１】
本発明の修飾ペプチド及びタンパク質はリン酸化、グリコシル化、通常の糖鎖結合型の脱グリコシル化、アミノ酸側鎖の修飾（例えばプロリンのヒドロキシルプロリンへの転換）及び一般に起こることが知られている転写後の修飾に類似した同様の修飾のような、一般に理解されている方法によって派生アミノ酸配列へとさらに修飾され得る。
【００２２】
本発明の生物学的に活性な化合物である修飾ペプチド及びタンパク質を構築する方法は当該技術分野ではよく知られている。上記のように、遺伝子にコードされるアミノ酸のみが含まれる場合、現在最も実際的なアプローチは目的のペプチドをコードするＤＮＡを修飾することによってこれらの物質を組み換え合成することである。部位特異的突然変異誘発、付加配列の結合及び適切な発現システムの構築のための技術はすべて、現在では当該技術分野においてよく知られていることである。目的のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡに付加されるＣＴＰユニットをコードするＤＮＡは最も好都合には、標準的な固相技術を用いて合成的に構築され、その際、好ましくは結合を簡単にするため制限酵素認識部位を含むように合成され、候補のペプチドまたはタンパク質をコードする配列に結合される。候補のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列がそこに含まれているコーディング配列の転写及び翻訳を制御する適切な要素を含む発現システムの一部にまだなっていない場合、修飾されたＤＮＡコーディング配列がこれらの特徴をもって提供される。よく知られているように、現在、発現システムはバクテリアのような原核宿主、及び酵母、植物細胞、昆虫細胞、ホニュウ類細胞、鳥類細胞等のような真核宿主を含む、広く多様な宿主に適合するものが利用可能である。
【００２３】
また、候補となる生化学的薬剤が短いペプチドである場合、または酵素によるサブユニットの転移が効果的である場合には、本発明のＣＴＰユニットはｉｎ ｖｉｔｒｏ固相ペプチド合成技術を用いて直接合成されてもよく、これらの条件下で、もし望むならば、ＣＴＰユニットは遺伝子にコードされないアミノ酸アナログによって修飾されてもよい。
【００２４】
得られた修飾生化学的薬剤は少なくとも２つのＣＴＰユニットをＣ端に直列に含む。３つ若しくはそれ以上のＣＴＰユニットを含む複数ＣＴＰユニットもまた考えられ、本発明の範囲に含まれる。上記のように、Ｃ末端に直列に結合されたＣＴＰユニットは互いに同一である必要はない。Ｎ端の初めのアミノ酸（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβサブユニットの１１２−１１８位）に応じて、長さが異なっていてもよいし、天然の残基に対するアミノ酸置換がもしある場合には、含まれている直列配列の中で、その置換がユニットごとに異なっていてもよい。
【００２５】
本発明タンパク質の結合型
当該技術分野において一般に知られているように、本発明の修飾ペプチド及びタンパク質は目的の応用に従って、ラベル、薬剤、標的因子、担体、固相支持体等に結合していてもよい。ラベルされた型の修飾生化学薬剤は代謝の結果を追跡するために使用されても良いし；この目的に適したラベルには特にヨウ素１３１、テクネチウム９９、インジウム１１１等のようなラジオアイソトープラベルが含まれる。ラベルはまた、分析系において修飾タンパク質またはペプチドの検出を媒介するのに使用されてもよい；この場合には、酵素ラベル、蛍光ラベル、色原体ラベル等と同様に、ラジオアイソトープを使用することもできる。このようなラベルの使用はペプチドまたはタンパク質がそれ自身、抗体または受容体リガンドのような標的因子である場合、特に有用である。
【００２６】
反対に、特に修飾ペプチドまたはタンパク質が標的因子であり、比較的代謝による活性の変化がない場合、本発明の修飾された化合物は抗炎症剤、抗生物質、毒素等のような適切な薬剤と結合してもよい。本発明の修飾化合物はまた、これらの新たな修飾された型に特異的に免疫反応を起こす抗体の調製において、免疫原性を増幅するために担体と結合してもよい。この目的に適切な担体は、キーホール リンペット ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びジフテリアトキソイド等を含む。本発明の修飾ペプチドを担体へ結合するために、２官能性リンカーの使用を含む標準的な結合技術が使用され得る。
【００２７】
他の方法に加えて、同様の結合技術が本発明の修飾ペプチド及びタンパク質を固相支持体に結合させるのに使用され得る。結合すると、次にこれらの修飾ペプチド及びタンパク質は目的の化合物を分離するための特異的反応を引き起こす親和性試薬として使用され得る。
【００２８】
最後に、本発明の修飾ペプチド及びタンパク質はこれらの新たな化合物と特異的に免疫反応をおこす抗体を作成するために使用されてもよい。これらの抗体は未修飾のペプチド及びタンパク質の生物学的活性の性質に応じて、様々な診断及び治療への応用に有用である。
【００２９】
本発明の修飾ペプチド及びタンパク質はこれらに対応する未修飾のペプチド及びタンパク質と同様の方法によって調製され、投与される。このように、調製及び投与方法は候補の未修飾型に従って変わる。しかし、修飾ペプチドまたはタンパク質の生物学的半減期の延長を考慮すれば投与の量及び頻度は未修飾型にくらべて減少してもよい。
【００３０】
本発明の好ましい態様
本発明は、好ましい態様として以下のものを含む。
１．２つ若しくはそれ以上の直列ＣＴＰユニットをＣ端に付加された、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を含む、修飾ペプチドまたはタンパク質。
【００３１】
２．ＣＴＰユニットが、本質的に、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの１１２−１１８位から１４５位に天然に存在するアミノ酸配列からなる態様１に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質。
【００３２】
３．少なくとも１つのＣＴＰユニットがヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの１１２−１１８位から１４５位に存在する天然のアミノ酸配列に関して、少なくとも１つの保存的なアミノ酸置換を含む、態様１に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質。
【００３３】
４．態様１の修飾ペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
５．修飾ペプチドまたはタンパク質をコードし、発現をもたらすための制御配列に機能的に結合されているＤＮＡを含み；
組み換え宿主細胞内に含まれる場合に該修飾ペプチドまたはタンパク質を生産できる、組み換え発現システムであって、
該修飾ペプチドまたはタンパク質は、２つ若しくはそれ以上の直列ＣＴＰユニットをＣ端に付加された、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を含む、
組み換え発現系システム。
【００３４】
６．態様５の発現システムで形質導入または形質転換された、組み換え宿主細胞。
７．２つ若しくはそれ以上の直列ＣＴＰユニットをＣ端に付加された、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を含む修飾ペプチドまたはタンパク質の製造方法であって、
該コーディングＤＮＡが発現される条件下で態様６の請求の細胞を培養し；そして
該修飾ペプチドまたはタンパク質を回収する、
ことからなる方法。
【００３５】
８．生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質の生物学的半減期を延長する方法であって、該ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に少なくとも２つの直列ＣＴＰユニットを付加することからなる方法。
【００３６】
９．さらにアミノ酸配列は変化させない追加の置換体と結合している、態様１に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質。
１０．追加の置換体が固相支持体、ラベル、薬剤、糖質、及び免疫原性を与える担体から選ばれる、態様９に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質。
１１．態様１に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質と特異的に免疫反応性をもつ抗体。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、制限するためのものではない。
実施例１
２つのＣＴＰユニット直列付加を有するヒトβサブユニットの分離
図１Ａ及び１ＢはヒトＦＳＨのβ鎖が２つのＣＴＰユニットを含むように修飾されている発現ベクターのコンストラクションを示す。図１Ｂに示されるように、より付加されたβサブユニットを得るために、１つのＣＴＰユニットが付加したヒトＦＳＨβ鎖の３’端のＨｉｎｄＩＩＩ部位をヒトＨＣＧ−β遺伝子の３’端由来のＣＴＰユニットを結合するのに用いる。次に付加された型のＦＳＨ−β鎖の、ホニュウ類の細胞内での生産を可能にする発現システムを得るため、ｈＦＳＨ−β（ＣＴＰ）２遺伝子を発現ベクターｐＭ２へ結合する。宿主発現ベクターのコンストラクションはＭａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ （１９８７） ８４：６３５４−６３５８；Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８８） １０６：１０４９−１０５９に記載されている。
【００３８】
より詳細には、ｈＣＧβサブユニット（ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ））のＯ−結合末端部位を１ユニットもつｈＦＳＨβキメラを作成するために、ｈＦＳＨβ遺伝子のコドン１１１の停止コドン及びｈＣＧＨ遺伝子のコドン１１８にＨｉｎｄＩＩＩ部位を作成した（図１Ａ）。ｈＦＳＨβ遺伝子由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＣＧβ由来のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに結合した。このキメラ（ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ））は結合部位にＳｅｒ１１８からＡｌａ１１８への変化を含むが、これはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって訂正された。２つの直列ＣＴＰ反復を含むキメラ（ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）２）はｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）キメラの停止コドンに新たなＨｉｎｄＩＩＩ部位を作成することによって構築した（図１Ｂ）。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｈＣＧβ由来のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに結合した。つくられたａｌａコドンは上記の方法によってｓｅｒコドンへ再転換され得る。
【００３９】
ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）またはｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）２遺伝子を真核発現ベクターｐＭ２に挿入するために、クレノー酵素及びＢａｍＨＩオリゴヌクレオチドリンカーを用いて５’端のＨｉｎｄＩＩＩ部位をＢａｍＨＩ部位へ転換し（図１Ｃ）、そしてｈＦＳＨβＣＴＰまたはｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）２遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＭ２のＢａｍＨＩ部位に挿入した。正しい方向で挿入されたことを制限酵素解析によって確認し、そして突然変異誘発の特異性を確かめるためにエクソンIII全体の配列を塩基配列決定した。
実施例２
ＣＴＰ直列付加の効果
上記の実施例１で示したように作成した、２つのＣＴＰユニットを付加したβサブユニットを含むヒトＦＳＨをラットに投与した。２４匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙメスのラットをこの実験に使用した。１２のラットにはそれぞれ、ＭＥＭ培地中で作成された１０ ＩＵの未修飾ＦＳＨを投与し、残りの１２のラットにはそれぞれ、ＭＥＭ培地中で作成された１０ ＩＵのｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）２付加ＦＳＨを投与した。血清を、投与直後、及び１時間以内に数回、そして２、４、及び８時間後に採取した。ＦＳＨホルモンに対する標準的なラジオイムノアッセイを用いて血清を解析した。結果を図２に示す。
【００４０】
図２に示されるように、血清中の未修飾ＦＳＨの量は８時間の間に０．５ ＩＵ／ｍｌから０．０５ ＩＵ／ｍｌ未満に減少したが、２つのＣＴＰユニットを含む本発明の修飾ＦＳＨ量はこの時間を経ても殆ど変化せず、約０．８ ＩＵ／ｍｌから約０．５ ＩＵ／ｍｌに減少するだけである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｃは１つまたは２つのＣＴＰユニットをカルボキシル端付加として含むヒト濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のβサブユニット組み換え体の製造のためのベクターのコンストラクションを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｃは１つまたは２つのＣＴＰユニットをカルボキシル端付加として含むヒト濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のβサブユニット組み換え体の製造のためのベクターのコンストラクションを示す。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｃは１つまたは２つのＣＴＰユニットをカルボキシル端付加として含むヒト濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のβサブユニット組み換え体の製造のためのベクターのコンストラクションを示す。
【図２】図２は野生型ＦＳＨと比較してβサブユニットに２つのＣＴＰユニットＣ端付加を含むＦＳＨの生物学的安定性の増強を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ若しくはそれより多くの直列ＣＴＰユニットをＣ末端に付加された、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を含む、修飾ペプチドまたはタンパク質であって、
前記ＣＴＰユニットは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの１１２−１１８位から１４５位に天然に存在するアミノ酸配列、
非修飾型の生物学的活性を保持している、前記修飾ペプチドまたはタンパク質。
【請求項２】
請求項１の修飾ペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
修飾ペプチドまたはタンパク質をコードし、発現をもたらすための制御配列に機能的に結合されているＤＮＡを含み；
組換え宿主細胞内含まれる場合に該修飾ペプチドまたはタンパク質を生産できる、組換え発現システムであって、
該修飾ペプチドまたはタンパク質は、２つ若しくはそれより多くの直列ＣＴＰユニットをＣ末端に付加された、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を含み、非修飾型の生物学的活性を保持している、
ここにおいて、前記ＣＴＰユニットは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの１１２−１１８位から１４５位に天然に存在するアミノ酸配列からなる、
前記組換え発現システム。
【請求項４】
請求項３の発現システムで形質導入または形質転換された、組換え宿主細胞。
【請求項５】
２つ若しくはそれより多くの直列ＣＴＰユニットをＣ末端に付加された、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を含む、修飾ペプチドまたはタンパク質であって、
前記ＣＴＰユニットは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの１１２−１１８位から１４５位に天然に存在するアミノ酸配列からなる、
非修飾型の生物学的活性を保持している、前記修飾ペプチドまたはタンパク質、の製造方法であって、
前記修飾ペプチドまたはタンパク質が発現される条件下で請求項４記載の細胞を培養し；そして
前記修飾ペプチドまたはタンパク質を回収する
ことを含む、前記方法。
【請求項６】
生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質の生物学的半減期を延長する方法であって、該ペプチドまたはタンパク質に少なくとも２つの直列ＣＴＰユニットを付加する
ここにおいて、前記ＣＴＰユニットは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの１１２−１１８位から１４５位に天然に存在するアミノ酸配列からなる、
ことを含む、前記方法。
【請求項７】
さらに、固相支持体、ラベル、薬剤、糖質、免疫原性を与える単体、及びリン酸化残基からなるグループから選択される追加の置換体と結合している、請求項１に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質。
【請求項１】
２つ若しくはそれより多くの直列ＣＴＰユニットをＣ末端に付加された、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を含む、修飾ペプチドまたはタンパク質であって、
前記ＣＴＰユニットは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの１１２−１１８位から１４５位に天然に存在するアミノ酸配列、
非修飾型の生物学的活性を保持している、前記修飾ペプチドまたはタンパク質。
【請求項２】
請求項１の修飾ペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
修飾ペプチドまたはタンパク質をコードし、発現をもたらすための制御配列に機能的に結合されているＤＮＡを含み；
組換え宿主細胞内含まれる場合に該修飾ペプチドまたはタンパク質を生産できる、組換え発現システムであって、
該修飾ペプチドまたはタンパク質は、２つ若しくはそれより多くの直列ＣＴＰユニットをＣ末端に付加された、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を含み、非修飾型の生物学的活性を保持している、
ここにおいて、前記ＣＴＰユニットは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの１１２−１１８位から１４５位に天然に存在するアミノ酸配列からなる、
前記組換え発現システム。
【請求項４】
請求項３の発現システムで形質導入または形質転換された、組換え宿主細胞。
【請求項５】
２つ若しくはそれより多くの直列ＣＴＰユニットをＣ末端に付加された、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を含む、修飾ペプチドまたはタンパク質であって、
前記ＣＴＰユニットは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの１１２−１１８位から１４５位に天然に存在するアミノ酸配列からなる、
非修飾型の生物学的活性を保持している、前記修飾ペプチドまたはタンパク質、の製造方法であって、
前記修飾ペプチドまたはタンパク質が発現される条件下で請求項４記載の細胞を培養し；そして
前記修飾ペプチドまたはタンパク質を回収する
ことを含む、前記方法。
【請求項６】
生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質の生物学的半減期を延長する方法であって、該ペプチドまたはタンパク質に少なくとも２つの直列ＣＴＰユニットを付加する
ここにおいて、前記ＣＴＰユニットは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットの１１２−１１８位から１４５位に天然に存在するアミノ酸配列からなる、
ことを含む、前記方法。
【請求項７】
さらに、固相支持体、ラベル、薬剤、糖質、免疫原性を与える単体、及びリン酸化残基からなるグループから選択される追加の置換体と結合している、請求項１に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【公開番号】特開２００８−７３０５７（Ｐ２００８−７３０５７Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３０６９２８（Ｐ２００７−３０６９２８）
【出願日】平成１９年１１月２８日（２００７．１１．２８）
【分割の表示】特願平５−５０７０９３の分割
【原出願日】平成４年１０月２日（１９９２．１０．２）
【出願人】（５９２１０５７４５）ワシントン ユニバーシティ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２８日（２００７．１１．２８）
【分割の表示】特願平５−５０７０９３の分割
【原出願日】平成４年１０月２日（１９９２．１０．２）
【出願人】（５９２１０５７４５）ワシントン ユニバーシティ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
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