複数核酸の検出方法
【課題】本発明の目的は、検体の取り違えと、検体間のコンタミネーションによる誤検出を防止することができ、医療現場で求められる高い安全性と信頼性を備えた検出方法が提供することにある。
【解決手段】本発明は、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、第1〜第nの核酸サンプルを、第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、第1〜第nのウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、第1〜第nのウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【解決手段】本発明は、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、第1〜第nの核酸サンプルを、第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、第1〜第nのウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、第1〜第nのウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸プローブが固定化された核酸サンプル検出用デバイスを用いて核酸サンプルを検出する方法であり、特に、一度に複数の核酸サンプルを検出する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年の分子生物学分野の発展に伴い、多くの疾患遺伝子が同定され、遺伝子診断による疾患の特定が可能となっている。また、遺伝子診断の結果に基づいて各患者に最適な治療を提供するテーラーメイド医療も実現化しつつある。
【0003】
遺伝子診断の実効性が増加するにつれて、臨床現場で取り扱う検査数も飛躍的に増大し、多量の核酸サンプルを同時に検査する検査アレイおよび検査方法が強く切望され、その一部がすでに実現されている(特許文献1)。
【特許文献1】特開2005−345243
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかしながら、多量の核酸サンプルを同時に検査する場合、検体の取り違えやコンタミネーションの問題が生じる。遺伝子診断は、発症前診断であることが多く、診断結果に基づいてしばしば予防的治療が行なわれることから、正確な診断結果を得ることが不可欠である。
【0005】
本発明の目的は、検体の取り違えと、検体間のコンタミネーションによる誤検出を防止することができ、医療現場で求められる高い安全性と信頼性を備えた検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
(第1の実施態様)
即ち、本発明は、第1の実施態様として、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第1〜第nのウェル中の第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、第1〜第nの核酸サンプルを、各々第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【0007】
(第2の実施態様)
また、本発明は、第2の実施態様として、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含み、第1のネガティブコントロール固定化領域が、(n−1)個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む各核酸プローブがそれぞれ独立して固定され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域が、(n−1)個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む各核酸プローブがそれぞれ独立して固定された、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第1〜第nのウェル中の第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、第1〜第nの核酸サンプルを、各々第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を検出する。
【0008】
(第3の実施態様)
さらにまた、本発明は、第3の実施態様として、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含み、第1のネガティブコントロール固定化領域が、1つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む核酸プローブがともに固定され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域が、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む核酸プローブがともに固定された、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第1〜第nのウェル中の第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、第1〜第nの核酸サンプルを、各々第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【0009】
(第4の実施態様)
さらにまた、本発明は、第4の実施態様として、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップであって、第1の核酸サンプル識別用試薬が、第1のポジティブコントロール固定化領域に固定された第1のポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第1のポジティブコントロール判定用試薬と、第2〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の複数の核酸を含む、第1のネガティブコントロール判定用試薬とで構成され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)の核酸サンプル識別用試薬が、第kのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kのポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第kのポジティブコントロール判定用試薬と、第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の複数の核酸を含む、第kのネガティブコントロール判定用試薬とで構成された、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、第1〜第nの核酸サンプルを、第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【0010】
(第5の実施態様)
さらにまた、本発明は、第5の実施態様として、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第nのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された第kの核酸サンプルを検出するための第kの核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップであって、第1の核酸サンプル識別用試薬が、第1のポジティブコントロール固定化領域に固定された第1のポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第1のポジティブコントロール判定用試薬と、第2〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有し、かつ第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定化された第2〜第nのポジティブコントロール用核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する複数の核酸を含む、第1のネガティブコントロール判定用試薬とで構成され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)の核酸サンプル識別用試薬が、第kのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kのポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第kのポジティブコントロール判定用試薬と、第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有し、かつ第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する複数の核酸を含む、第kのネガティブコントロール判定用試薬とで構成された、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、第1〜第nの核酸サンプルを、第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【発明の効果】
【0011】
本発明の複数核酸の検出方法によって、検体の取り違えと、検体間のコンタミネーションによる誤検出を防止することができ、医療現場で求められる高い安全性と信頼性を備えた検出方法が実現される。
【発明を実施するための最良の形態】
【0012】
<基本的構成>
以下、(1)核酸サンプル検出用デバイス、(2)検出の手法、(3)核酸サンプル、および(4)検出の手順について説明する。
【0013】
(1)核酸サンプル検出用デバイス
本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、例えば、基板と、基板上に複数形成された核酸プローブ固定化領域と、前記核酸プローブ固定化領域を仕切るための枠を備えることを特徴とする。前記枠は、少なくとも1以上のウェルを形成し、各ウェルが1核酸サンプルを検出するための1検査レーンを構成し、検査対象となる核酸プローブが固定化された核酸プローブ固定化領域(以下、検出核酸プローブ固定化領域という)が各ウェル中にそれぞれ形成されている。
【0014】
前記基板および枠の材料は、特に限定されることなく、当業者に既知の任意の材料を使用することもできる。たとえば、ガラス、石英ガラス、シリコン、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどの有機材料を使用することができる。基板の形状には、特に制限はなく、平面形状、凹凸形状いずれでもよく、さらに多孔質体であってもよい。
【0015】
前記核酸プローブ固定化領域は、検出核酸プローブ固定化領域と、ポジティブコントロール固定化領域と、ネガティブコントロール固定化領域とで構成される。
【0016】
「検出核酸プローブ固定化領域」は、検査対象となる標的核酸配列の有無を検出するための領域である。例えば、ある疾患遺伝子の有無を検査する場合、その疾患遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブを固定しておくことにより、核酸サンプル中の疾患遺伝子の有無を判定することができる。検出核酸プローブ固定化領域を複数設け、それぞれに異なる塩基配列を含む核酸プローブを固定しておくことによって、複数の検出項目について同時に検査を行うことができる。なお、「疾患遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブ」とは、疾患遺伝子の少なくとも一部分と相補的な配列を有する核酸プローブを意味する。
【0017】
「ポジティブコントロール固定化領域」は、核酸サンプルの取り違えの有無を確認するための領域である。従来の核酸サンプル検出用デバイスには、この「ポジティブコントロール固定化領域」が存在しなかったため、複数の核酸サンプルを同時に検出する場合、ある核酸サンプルを別の核酸サンプルと取り違えたとしても、その事実を確認することができなかった。一方、本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、この「ポジティブコントロール固定化領域」によって核酸サンプルの取り違えの有無を確認することができるので、サンプルの取り違えのない、高い安全性と信頼性を備えた核酸サンプル検出用デバイスを提供することができる。
【0018】
「ネガティブコントロール固定化領域」は、コンタミネーションの有無を確認するための領域である。従来の核酸サンプル検出用デバイスには、この「ネガティブコントロール固定化領域」が存在しなかったため、複数の核酸サンプルを同時に検出する場合、ある核酸サンプル中に他の核酸サンプルが混入(コンタミネーション)したとしても、その事実を確認することができなかった。一方、本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、この「ネガティブコントロール固定化領域」によって他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)の有無を確認することができるので、コンタミネーションのない、高い安全性と信頼性を備えた核酸サンプル検出用デバイスを提供することができる。
【0019】
前記核酸プローブ固定化領域に固定される核酸プローブの材料は、特に限定されることなく、当業者に既知の任意の材料を使用することができる。たとえば、DNA、RNA、PNA、メチルホスホネート骨格の核酸、その他の核酸類似体、またはこれらのキメラ核酸を使用することができる。使用するプローブの長さは、特に制限はないが、たとえば、8〜200塩基、好ましくは10〜100塩基、さらに好ましくは12〜50塩基である。
【0020】
前記核酸プローブ固定化領域を作製するために、核酸プローブを固定化する方法は、特に限定されることなく、当業者に既知の任意の方法を使用して固定することができる。たとえば、物理吸着、化学吸着、疎水結合、抱埋、および共有結合などによって固定化することができる。より具体的には、たとえばプローブの末端に導入したアミノ基を介して、カルボジイミドなどの縮合剤を用いて基板上に共有結合することができる。また、基板上にアニオン性の有機物を被覆しておくことで、イオン結合で固定化することもできる。さらに、プローブの末端にビオチンを導入しておくと、ビオチン-アビジン結合で固定化することもできる。また、プローブの末端にチオール基を導入しておき、基板上に被覆したチオール含有物質との間でS−Sを形成させ、強固に固定化することもできる。これらの場合、あらかじめ基板表面を官能基を有する分子で修飾しておくことによって、固定化を容易にすることができる。なお、プローブと末端の修飾基の間には基板表面とプローブとの立体障害を抑制するためにスペーサーを導入することが望ましい。スペーサー分子は特に限定されないが、たとえばアルカン骨格、アルキン骨格、アルケン骨格、エチレングリコール骨格、さらには核酸鎖であってもよい。また、分子構造は、直鎖であっても、分岐鎖であってもよい。スペーサー部分の長さは特に限定されないが、好ましくは、炭素-炭素結合に換算して10〜500、好ましくは20〜200、さらに好ましくは50〜100である。
【0021】
基板上への核酸プローブの固定化の際には、DNAスポッターやDNAアレイヤ−と呼ばれる固定化装置を用いると比較的容易にプローブの固定化を行うことができる。この際、表面を傷つけないために、インクジェット方式や静電方式のスポッターを用いることが望ましい。また、基板表面で直接、核酸鎖の合成を行うこともできる。
【0022】
また、核酸プローブを固定化して核酸プローブ固定化領域を形成する工程は、基板と枠を密着させる前に行うことが望ましいが、密着後であっても固定化することは可能である。さらに、本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、必ずしも核酸プローブ固定化領域に核酸プローブが固定化された状態で提供される必要はなく、核酸プローブが固定化されていない基板として提供されてもよい。この場合、核酸サンプル検出用デバイスを使用する際に、所望の核酸プローブを上述したように基板上に固定して使用する。
【0023】
また、枠によって形成されるウェルの形状も特に限定されるものではなく、円形、四角形あるいは多角形であってもよい。また、ウェルの底が無い状態で枠を作製し、核酸プローブ固定化領域を形成した基板を作製した後に密着させて使用することにより、本実施形態の核酸検出基板の作成が容易になるであろう。枠と基板を密着させるには、接着、圧着等、液漏れを防ぐような強固な密着方法が望ましいが、シリコンのパッキンなどを利用して密着することもできる。
【0024】
また、本実施形態の核酸検出基板は、核酸プローブ固定化領域が形成された基板と枠が、必ずしも一体として提供される必要はなく、両者が分離した状態で提供されてもよい。この場合、核酸検出基板を使用する際に、上記のように基板と枠を密着させて使用する。
【0025】
本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、複数の核酸サンプルを検出するため、上記枠で形成されるウェルは、複数存在する。個数は特に限定されないが、好ましくは3個以上100個であり、より好ましくは4個以上50個以下、さらに好ましくは5個以上20個以下である。これらのウェルは、同一デバイス中に形成されているが、必ずしも基板は1個とは限らない。1個の基板上に全ウェルが形成されてもよく、複数の基板上に複数のウェルが形成されてもよい。例えば、1つのウェルが形成された1個の基板を複数用意することによって、複数の核酸サンプルを同時に検出してもよい。この場合、1核酸サンプルの検出が1個の基板によって行われる。
【0026】
(2)検出の手法
本発明には、当業者に既知の全ての検出の手法が含まれ、検出の手法において限定的に解釈されるべきではない。例えば、蛍光色素による蛍光強度による検出や、放射性同位元素を用いた検出、挿入剤分子の電気化学応答を用いた検出、静電容量変化による検出などを用いることができる。特に、代表的な検出手法として、蛍光による検出と電気化学的な検出がある。蛍光による検出は、結果を視覚的に認識することができるので、検出結果の判定ミスを防止することができる。一方、電気化学的な検出は、電流値のみによって検査を行うことができるので、装置の小型化、検査費用の低額化、検査時間の短縮化が可能になる。なお、電気化学的な検出を行う場合、前記各核酸プローブ固定化領域は電極として構成され、電極上に各核酸プローブが固定される。
【0027】
蛍光による検出の場合、核酸試料を予め蛍光物質で標識しておく。例えば、蛍光物質で標識されたプライマーを使用して標的核酸をPCR増幅する。核酸プローブとハイブリッド鎖を形成した標的核酸は、洗浄後も核酸プローブ固定化領域内にとどまるため、蛍光発光が得られる。蛍光物質には、公知の任意のものを使用することができ、例えば、FITC、Cy3、Cy5またはローダミンなどが使用される。蛍光物質の発光は、蛍光検出器を用いて検出することができる。得られた蛍光発光量から各核酸プローブに対応する標的核酸の存在の有無を識別することができる。
【0028】
さらに、蛍光検出方法において、核酸プローブ固定化領域上への核酸や蛍光色素などの非特異的な吸着を抑制するために、核酸プローブ固定化領域の表面を、メルカプトエタノール、メルカプトヘキサノール、メルカプトヘプタノール、メルカプトエチレングリコール、メルカプトオリゴエチレングリコール、メルカプトポリエチレングリコール、炭素鎖が30〜50のアルカンチオールなどのメルカプタンや、ステアリルアミンなどの脂質、界面活性剤、アルブミン、核酸などで被覆することが望ましい。
【0029】
一方、電気化学的な検出の場合は、例えば、電気化学的活性を有する分子を用いる。電気化学的活性を有する分子とは、ハイブリッド鎖に結合し、電位の印加によって電子を放出する分子を意味する。前記分子には、公知の任意のものを使用することができ、例えば、ヘキスト33258(登録商標)(カルビオケム(CALBIOCHEM)より入手可能)、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーターなどが使用される。特に好ましくは、ヘキスト33258が使用される。ヘキスト33258は、化学物質p-(5-(5-(4-メチルピペラジン-1-イル)ベンズイミダゾール-2-イル)ベンズイミダゾール-2-イル)フェノールによって構成された分子である。さらに、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン(ジシクロペンタジエニル鉄)、ビオロゲンなどで修飾してもよい。前記分子の濃度は適宜選択されるが、一般的には1ng/mL〜1000ng/mLの範囲内である。この際、イオン強度0.01〜5、pH5〜10の範囲内の緩衝液を使用することができる。
【0030】
前記分子は、前記ハイブリッド鎖を認識し、これにインターカレートする。ここで、電極に電位を印加すると、酸化還元反応が起こり、インターカレートした前記分子から電子が放出されて電流が流れる。この際、電位は定速で掃引するか、パルスで印加するか、あるいは定電位を印加してもよい。電位掃引速度は、10〜1000mV/secの範囲内である。測定の際、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーターなどの装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。前記分子に由来する電流が電極に流れ、この電流値を測定することによって各核酸プローブに対応する標的核酸の存在の有無を検出することができる。
【0031】
さらに、電気化学的検出方法において、核酸プローブ固定化領域(電極)上への核酸や挿入剤などの非特異的な吸着を抑制するために、電極表面を、メルカプトエタノール、メルカプトヘキサノール、メルカプトヘプタノール、メルカプトエチレングリコール、メルカプトオリゴエチレングリコール、メルカプトポリエチレングリコール、炭素鎖が30〜50のアルカンチオールなどのメルカプタンや、ステアリルアミンなどの脂質、界面活性剤、アルブミン、核酸などで被覆することが望ましい。
【0032】
(3)核酸サンプル
本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスによって検出する核酸サンプルは特に限定されることなく、たとえば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、培養細胞、喀痰、食品、土壌、排水、廃水、空気など試料の試料から抽出した、あるいは抽出後に増幅処理を行うことにより得られた核酸サンプルが対象となる。本実施形態の検出方法は、たとえば、肝炎ウイルス(A、B、C、D、E、F、G型)、HIV、インフルエンザウイルス(A、B、C、D、E、F)、ヘルペス群ウイルス、アデノウイルス、ヒトポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパルボウイルス、ムンプスウイルス、ヒトロタウイルス、エンテロウイルス、日本脳炎ウイルス、天然痘ウイルス、コロナウイルス、SARS、デングウイルス、風疹ウイルス、HTLVなどのウイルス感染症、黄色ブドウ球菌、溶血性連鎖球菌、病原性大腸菌、腸炎ビブリオ菌、ヘリコバクターピロリ菌、カンピロバクター、コレラ菌、赤痢菌、サルモネラ菌、炭疽菌、エルシニア、淋菌、リステリア菌、レプトスピラ、レジオネラ菌、スピロヘータ、肺炎マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、マラリア、赤痢アメーバ、病原真菌などの細菌感染症、または寄生虫、真菌の検出等のために使用することができる。
【0033】
さらに、本実施形態の検出方法は、上記感染症を発症させる微生物の型の判定(ジェノタイピング)に用いることもできる。たとえば、C型肝炎ウイルスの1a、1b、2a、2b、3a、3b、およびヒトパピローマウイルスの癌化に関連している16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、54、56、58、59、66、68、69、および癌化に関連していない6、11、34、40、42、43、44、70などである。さらに、薬剤耐性遺伝子を検出することもでき、たとえば、結核菌、エイズウイルス、および呼吸器感染症起因菌の薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、遺伝性疾患、網膜芽細胞腫、ウイルス腫瘍、家族性大腸ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、神経腺維腫症、家族性乳ガン、色素性乾皮症、脳腫瘍、口腔癌、食道癌、胃ガン、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺ガン、甲状腺腫瘍、乳腺腫瘍、泌尿器腫瘍、男性器腫瘍、女性器腫瘍、皮膚腫瘍、骨・軟部腫瘍、白血病、リンパ腫、および固形腫瘍などの腫瘍性疾患を検査することができる。また、医療以外にも、食品検査、検疫、医薬品検査、法医学、農業、畜産、漁業、林業などで遺伝子検査が必要なものに全て適応できる。さらに、制限酵素断片多系(RFLP)や1塩基多型(SNPs)、マイクロサテライト配列などの検出もできる。また、未知の塩基配列解析に用いることもできる。
【0034】
(4)検出の手順
試料に含まれる核酸を検出するためには、まず該試料から核酸成分の抽出を行い、核酸サンプルを得る。抽出方法は特に限定されないが、たとえばフェノール−クロロホルム法などの液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、QIAamp(QIAGEN社製)、スマイテスト(住友金属社製)などの市販の核酸抽出方法を利用することもできる。これらの試料をマイクロタイタープレートなどに分注して、遺伝子検出に供される。遺伝子の抽出の際、疎水性膜を保持したマイクロタイタープレートなどを用いると、より簡便に検出操作に移行することができる。抽出した核酸は、適切な溶液に溶解しておくことが好ましい。
【0035】
核酸とプローブ固定化領域に固定されたプローブとでハイブリダイゼーション反応を際は、反応溶液として、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。反応溶液中には、ハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、サケ精子DNA、牛胸腺DNA、EDTA、および界面活性剤などを添加することができる。さらに、塩濃度調整用試薬や、ポジティブコントロール用試薬などを添加することができる。また、場合によっては前処理として核酸増幅反応を行ってもよい。核酸増幅反応はPCR法、LAMP法、ICAN法など、特に限定されない。次に、抽出した核酸を反応溶液に添加し、90℃以上で熱変性させる。核酸を含む反応溶液とプローブ固定化電極の接触は、変性直後または0℃に急冷後に行うこともできる。反応中は、撹拌または振とうなどの操作によって反応速度を高めることもできる。反応温度は、10℃〜90℃の範囲で、また反応時間は、1分以上1晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、プローブ固定化領域の洗浄を行う。洗浄には、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いる。このとき、核酸を含む反応溶液中に、核酸サンプル識別用試薬を予め添加しておく。核酸サンプル識別用試薬には、ポジティブコントロール用核酸プローブ、ネガティブコントロール用核酸プローブに応じた組成が含まれる。
【0036】
洗浄後、ハイブリダイゼーションの有無を検出する。検出の手法は特に限定されることなく、上述したとおり、蛍光色素による蛍光強度による検出や、放射性同位元素を用いた検出、挿入剤分子の電気化学応答を用いた検出、静電容量変化による検出などを用いることができる。
【0037】
本実施形態の検出方法によれば、該基板に形成された反応用ウェル毎に異なる検体に由来する試料を使用して、同時に複数の試料における核酸鎖の存在を検出することができる。
【0038】
また、上記核酸反応および核酸検出は自動化することができる。自動化することにより、ハンドリングなどに起因する検査毎のバラつきを少なくすることができる。自動検査装置は、抽出反応、増幅反応、ハイブリダイゼーション反応、洗浄反応などの反応温度を制御する温度制御系を備えることができる。温度制御系はペルティエ素子を利用したもの、電熱ヒーターを利用したものなどが使用できる。また、自動検査装置は各試薬を送液するための送液系を備えることができる。送液系は、ポンプ、配管、流速モニタ、脱気機構、気液検知モニタなどが使用できる。また、自動検査装置は二本鎖核酸、一本鎖核酸を検出するための検出系を備えることができる。検出系は、検出方式により様々だが、蛍光検出方式では、レーザー照射装置、CCDカメラなどが使用できる。電流検出方式では、2電極式もしくは3電極式の電流電圧制御装置が使用できる。また、自動検査装置は、得られた信号を元に自動判定を行う信号処理系を備えることができる。予めコンピュータに内蔵されたデータベースと閾値などを利用し、得られた信号を元にサンプル核酸の配列決定、あるいは目的核酸の有無などを判定することができる。上記自動化装置は一度に複数の核酸サンプル検出用デバイスを処理することができる。また、装置は1台で全工程を行うこともできるし、複数台で工程を分担することもできる。
【0039】
<本発明の実施態様>
以下、図面を用いて本発明の実施態様について説明する。なお、以下に示す実施態様は、本発明の構成を詳細に説明するために例示的に示したものに過ぎない。従って、本発明は、以下の実施態様に記載された説明に基づいて限定解釈されるべきではない。本発明の範囲には、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内にある限り、以下の実施態様の種々の変形、改良形態を含む全ての実施態様が含まれる。
【0040】
(1)第1の実施態様
図1
図1は、第1の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス11を示した模式図である。核酸サンプル検出用デバイス11は、基板16と、基板上に複数形成された核酸プローブ固定化領域と、前記核酸プローブ固定化領域を仕切るための枠17を備えることを特徴とする。前記枠17は、少なくとも1以上のウェル12を形成し、各ウェルが1核酸サンプルを検出するための1検査レーンを構成し、検査対象となる核酸プローブが固定化された検出核酸プローブ固定化領域13が各ウェル12中にそれぞれ形成されている。
【0041】
第1〜第nのウェル121−nには、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルを注入するための注入ポート151−n(以下、第1〜第nの注入ポート151−nともいう)が備え付けられている。第1のウェル121は、第1の核酸サンプルを検出するためのウェルであり、第k(kは2以上の自然数)のウェル12kは、第kの核酸サンプルを検出するためのウェルである。
【0042】
ここで、第1のウェル121は、第1の核酸サンプルを検出するための検出核酸プローブ固定化領域131(以下、第1の検出核酸プローブ固定化領域131ともいう)と、第1の核酸サンプルを識別するためのポジティブコントロール固定化領域141(以下、第1のポジティブコントロール固定化領域141ともいう)とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェル12kは、第kの核酸サンプルを検出するための核酸プローブ固定化領域13k(以下、第kの検出核酸プローブ固定化領域13kともいう)、第kの核酸サンプルを識別するためのポジティブコントロール固定化領域14k(以下、第kのポジティブコントロール固定化領域14kともいう)とを含む。該構成を備える核酸サンプル検出用デバイス11は、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出することができる。
【0043】
図1では、例示的に第1〜第4(n=4)の核酸サンプル(核酸サンプルS1〜S4)を検出することができる、核酸サンプル検出用デバイス11を示した。第1〜第4のウェル121−4には、それぞれ第1〜第4の核酸サンプルを注入するための第1〜第4の注入ポート151−4が備え付けられている。
【0044】
「ポジティブコントロール固定化領域」には、それぞれ異なる識別用の核酸プローブが固定されている。例えば、第1のポジティブコントロール固定化領域141には、第1のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC1が固定され、第2のポジティブコントロール固定化領域142には、第2のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC2が固定され、第3のポジティブコントロール固定化領域143には、第3のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC3が固定され、第4のポジティブコントロール固定化領域144には、第4のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC4が固定される。
【0045】
「検出核酸プローブ固定化領域」には、検出対象となる1以上の標的配列に相補的な核酸プローブが、それぞれ独立した領域に固定されている。例えば検出対象となる標的配列が2以上ある場合は、検出核酸プローブ固定化領域は、2以上の独立した固定化領域を備え、各固定化領域には、それぞれ1つの標的配列に相補的な核酸プローブが固定されている。図1では、検出対象となる標的配列が4つある場合を例示しており、各ウェル中の検出用の核酸プローブ固定化領域は、それぞれ4つの独立した固定化領域を備え、各固定化領域には、それぞれ1つの標的配列に相補的な核酸プローブD1、D2、D3、およびD4が固定されている。なお、ここで「標的配列」とは、例えば検査対象となる疾患遺伝子の少なくとも1部分と相補的な配列を有することを意味する。一般的には、検査対象となる遺伝子の特徴的な配列部位に着目し、この配列部位に相補的な配列を含む核酸プローブを設計し、これを検出核酸プローブ固定化領域に固定することによって検出が行われる。
【0046】
図2
図2は、図1に示した核酸サンプル検出用デバイス11を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図である。
【0047】
第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する。第1の核酸サンプル識別用試薬は、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1に相補的な配列を有する、「第1のポジティブコントロール用核酸」を含む。第k(kは2〜nの自然数)の核酸サンプル識別用試薬は、第kのポジティブコントロール固定化領域14kに固定された核酸プローブC(k)に相補的な配列を有する、第kのポジティブコントロール用核酸を含む。該成分を含む第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬が添加された第1〜第nの核酸サンプルを、第1〜第nのウェル中に備えられた第1〜第nの注入ポート151−nからそれぞれ注入することによって、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域141−nにおけるハイブリダイゼーション反応が生じるため、これを検出することにより、第1〜第nの核酸サンプルにおける検体の取り違えがなかったことを確認することができる。
【0048】
図2では、第1の核酸サンプル識別用試薬(試薬1)が第1の核酸サンプル(サンプルS1)中に添加され(図2a)、第2の核酸サンプル識別用試薬(試薬2)が第2の核酸サンプル(サンプルS2)中に添加される(図2b)。同様に、第3の核酸サンプル識別用試薬(試薬3)が第3の核酸サンプル(サンプルS3)中に添加され、第4の核酸サンプル識別用試薬(試薬4)が第4の核酸サンプル(サンプルS4)中に添加される。
【0049】
第1の核酸サンプル識別用試薬(試薬1)は、第1のポジティブコントロール(PC)固定化領域141に固定された核酸プローブC1と相補的な配列を有する核酸T1を含み(図2(a))、第2の核酸サンプル識別用試薬(試薬2)は、第2のポジティブコントロール(PC)固定化領域142に固定された核酸プローブC2と相補的な配列を有する核酸T2を含む(図2(b))。同様に、第3の核酸サンプル識別用試薬(試薬3)は、第3のポジティブコントロール固定化領域143に固定された核酸プローブC3と相補的な配列を有する核酸T3を含み、第4の核酸サンプル識別用試薬(試薬4)は、第4のポジティブコントロール固定化領域144に固定された核酸プローブC4と相補的な配列を有する核酸T4を含む。
【0050】
第1〜第4の核酸サンプル識別用試薬(試薬1〜4)を添加された第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)は、それぞれ第1〜第4のウェル141〜144に注入される。各サンプルの注入は、第1〜第4のウェル141〜144に備え付けられた第1〜第4の注入ポート151〜154を使用して行われる。例えば、第1の核酸サンプル識別用試薬(試薬1)を添加された第1の核酸サンプルが第1のウェル121に注入された場合、試薬1に含まれる核酸T1が、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1とハイブリダイズする(図2(a))。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号を検出することができる。逆に、第1の核酸サンプルが誤って第2のウェル122に注入された場合、試薬1に含まれる核酸T1は、第2のポジティブコントロール固定化領域142に固定された核酸プローブC2とハイブリダイズすることができない。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号を検出することができず、検体の取り違えがあったことを確実かつ容易に確認することができる。
【0051】
(2)第2の実施態様
図3
図3は、第2の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス31を示した模式図である。第2の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス31は、各ウェル中にポジティブコントロール固定化領域141−nの他に、第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域321−nを含む。
【0052】
第1のネガティブコントロール固定化領域321は、(n−1)個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC2〜Cnがそれぞれ独立して固定され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域32kは、(n−1)個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第kのポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC(k)を除く、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC1〜Cnがそれぞれ独立して固定されている。
【0053】
図3では、例示的に第1〜第4(n=4)の核酸サンプルを検出することができる、核酸サンプル検出用デバイス31を示した。第1のネガティブコントロール固定化領域321は、3つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第2、第3および第4のポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC2、C3およびC4がそれぞれ独立して固定され、第2のネガティブコントロール固定化領域322は、3つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第1、第3および第4のポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1、C3およびC4がそれぞれ独立して固定され、第3のネガティブコントロール固定化領域323は、3つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第1、第2および第4のポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1、C2およびC4がそれぞれ独立して固定され、第4のネガティブコントロール固定化領域324は、3つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第1、第2および第3のポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1、C2およびC3がそれぞれ独立して固定されている。
【0054】
図4
図4は、図3に示した核酸サンプル検出用デバイス31を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図である。第2の実施態様の第1の実施態様との相違は、各ウェル中にネガティブコントロールを配置したことにより、核酸サンプルの取り違えのみならず、核酸サンプル中への他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)の有無を検出することができることにある。
【0055】
第1の実施態様と同様、第1〜第4の核酸サンプル識別用試薬(試薬1〜4)を添加された第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)を、それぞれ第1〜第4のウェル121〜124に注入する。各サンプルの注入は、第1〜第4のウェル121〜124に備え付けられた第1〜第4の注入ポート151〜154を使用して行われる。例えば、第1の核酸サンプル識別用試薬(試薬1)を添加された第1の核酸サンプルが第1のウェル121に注入された場合、試薬1に含まれる核酸T1が、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1とハイブリダイズする(図4(a))。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号を検出することができる。一方、試薬1に含まれる核酸T1は、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブC2、C3およびC4にはいずれもハイブリダイズしない(図4(b))。その結果、第1のネガティブコントロール固定化領域321からは信号が検出されず、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)が無かったことを確認することができる。
【0056】
逆に、第1のネガティブコントロール固定化領域321から信号が検出された場合、他の核酸サンプルの混入を検出することができる。例えば、第2の核酸サンプル識別用試薬(試薬2)を添加した第2の核酸サンプル(サンプルS2)が、第1の核酸サンプル(サンプルS1)に混入した場合(図4(c))、第1の核酸サンプル(サンプルS1)中には、試薬2に含まれる核酸T2が混入しているので、核酸T2が、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブC2とハイブリダイズする(図4(d))。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号が検出され、他の核酸の混入(コンタミネーション)があったことを検出することができる。第2の実施態様では、各核酸サンプルの取り違えの有無を検出できるとともに、コンタミネーションの有無も検出することができるので、より安全性および信頼性の高い検出方法を提供することができる。
【0057】
(3)第3の実施態様
図5
図5は、第3の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス51を示した模式図である。第3の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス51は、第2の実施形態においては複数設けられていた各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域が、1つの固定化領域で構成されていることを特徴とする。
【0058】
第1のネガティブコントロール固定化領域は、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC2〜C(n)と同一配列の核酸プローブがともに固定され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域は、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第kのポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC(k)を除く、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブと同一配列の核酸プローブがともに固定されている。
【0059】
図5では、例示的に第1〜第4(n=4)の核酸サンプルを検出することができる、核酸サンプル検出用デバイス51を示した。第1のネガティブコントロール固定化領域321は、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第2、第3および第4のポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC2、C3およびC4がともに固定され、第2のネガティブコントロール固定化領域322は、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第1、第3および第4のポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC1、C3およびC4がともに固定され、第3のネガティブコントロール固定化領域323は、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第1、第2および第4のポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC1、C2およびC4がともに固定され、第4のネガティブコントロール固定化領域324は、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第1、第2および第3のポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC1、C2およびC3がともに固定されている。
【0060】
図6
図6は、図5に示したネガティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを示した模式図である。第3の実施態様の第2の実施態様との相違は、ネガティブコントロール固定化領域が1つの領域で構成されていることにある。ネガティブコントロールはポジティブコントロールとは異なり、核酸サンプル数が増加するにつれてネガティブコントロールとして必要な核酸プローブ数が増える。1つの固定化領域に複数の核酸プローブを一緒に固定すれば、核酸サンプル数が増加してもネガティブコントロール固定化領域の数を増加させる必要がなくなり、サンプル数の増減に関わらず、基板上に検査項目のための十分なスペースを恒常的に確保することができる。
【0061】
複数のネガティブコントロールを1つの領域に配置する場合、その配置の態様には、例えば、ネガティブコントロールを構成する複数種の核酸プローブを並列的に固定化したタイプ(図6(a))、複数種の核酸プローブを直列的に接合した核酸鎖を固定化したタイプ(図6(b))、また、複数種の核酸プローブを直列的に接合した核酸鎖であって、各核酸プローブの端部を他の核酸プローブの端部と重なり合うように配置するタイプ(図6(c))などがある。複数種の核酸プローブを並列的に混在させたタイプ(図6(a))では、ネガティブコントロール数が増加した場合、2つまたは3つの領域に分割して固定してもよい。例えば、ネガティブコントロールが8種類の核酸プローブで構成される場合、4種類ずつを混合して2つの領域に固定する、あるいはネガティブコントロールが9種類の核酸プローブで構成される場合、3種類ずつを混合して3つの領域に固定する、などである。ネガティブコントロール数がさらに増加した場合は、さらに4つ、5つ、またはそれ以上の領域に分割して固定してもよい。
【0062】
検査基板の小型化が進む現在、各検査スポットも微小化の傾向にある。また、同時にサンプル数の一層の増加も予想される。サンプル数の増加は、ネガティブコントロール数の増加を意味するが、将来的に実現が予想されるような極微小領域上に数多くのネガティブコントロールを並列的に混在させた場合(図6(a))、1つ1つのネガティブコントロールの固定量が少なくなり、結果として十分なシグナルを検出することができなくなるおそれがある。しかしながら、複数種の核酸プローブを直列的に接合し、空間的展開をすることによって(図6(b))、1つ1つのネガティブコントロールの固定量を維持することができる。これによって将来的に実現が予想されるような極微小領域であっても数多くのネガティブコントロールを1つの領域に固定することができる。また、直列に接合するに際し、各核酸プローブの端部を他の核酸プローブの端部と重なり合うように配置することによって、直列接合に伴う核酸プローブの長さの増大を抑制することができ(図6(c))、特にサンプル数が増加した場合に有効である。
【0063】
図7
図7は、図5に示した核酸サンプル検出用デバイス51を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図である。第3の実施態様の第2の実施態様との相違は、ネガティブコントロール固定化領域が1つの領域で構成されていることにある。ネガティブコントロール固定化領域を1つにすることによってネガティブコントロールに必要な基板上のスペースを著しく節約することができ、その効果は、サンプル数が増えれば増えるほど顕著になる。
【0064】
第2の実施態様と同様、第1〜第4の核酸サンプル識別用試薬(試薬1〜4)を添加された第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)を、それぞれ第1〜第4のウェル121〜124に注入する。各サンプルの注入は、第1〜第4のウェル121〜124に備え付けられた第1〜第4の注入ポート151〜154を使用して行われる。例えば、第1の核酸サンプル識別用試薬(試薬1)を添加された第1の核酸サンプルが第1のウェル121に注入された場合、試薬1に含まれる核酸T1が、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1とハイブリダイズする(図7a)。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号を検出することができる。一方、試薬1に含まれる核酸T1は、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブC2、C3およびC4にはいずれもハイブリダイズしない(図7b)。その結果、第1のネガティブコントロール固定化量領域321からは信号が検出されず、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)が無かったことを確認することができる。図7では、ネガティブコントロールを構成する複数種の核酸プローブを混在して固定したタイプのネガティブコントロール固定化領域を示したが、複数種の核酸プローブを直列に接合して固定するタイプ(図6b)、複数種の核酸プローブを端部を重ねながら直列に接合して固定するタイプ(図6c)、いずれのタイプのネガティブコントロール固定化領域であってもよい。
【0065】
逆に、第1のネガティブコントロール固定化領域321から信号が検出された場合、他の核酸サンプルの混入を検出することができる。例えば、第2の核酸サンプル識別用試薬(試薬2)を添加した第2の核酸サンプル(サンプルS2)が、第1の核酸サンプル(サンプルS1)に混入した場合(図7c)、第1の核酸サンプル中には、試薬2に含まれる核酸T2が混入しているので、核酸T2が、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブC2とハイブリダイズする(図7d)。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号が検出され、他の核酸の混入(コンタミネーション)があったことを検出することができる。
【0066】
第3の実施態様では、第2の実施態様と同様、各核酸サンプルの取り違えの有無を検出できるとともに、コンタミネーションの有無も検出することができるので、より安全性および信頼性の高い検出方法を提供することができる。さらに、第3の実施態様は、ネガティブコントロール固定化領域に固定される核酸プローブを1つの領域にまとめて固定しているので、核酸サンプル数が増えてもネガティブコントロール固定化領域の数を増加させる必要がない。このため、検出基板の大部分の領域を検査項目のために割り当てることができ、検査項目数の多い核酸サンプルの検出であっても小型の検出基板において一度に大量に検査することができる。
【0067】
(4)第4の実施態様
図8
図8は、第4の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス81を示した模式図である。第4の実施態様の特徴は、ポジティブコントロール用の試薬(「ポジティブコントロール判定用試薬」)と共に、ネガティブコントロール用の新たな試薬を調製し、この「ネガティブコントロール判定用試薬」を混合して他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)の有無を検出する点にある。
【0068】
装置の基本的構成は、第1〜第3の実施態様と同様である。すなわち、核酸サンプル検出用デバイス81は、第1〜第nの核酸サンプルを注入するための注入ポート151−nがそれぞれ備え付けられた、第1〜第nのウェル121−nを備える。
【0069】
ここで、第1のウェル121は、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域131と、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域141と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール固定化領域321とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェル12kは、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域13kと、第kの核酸サンプルを識別するためのポジティブコントロール固定化領域14kと、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域32kとを含む。
【0070】
第1の核酸サンプルには、第1のポジティブコントロール判定用試薬と、第1のネガティブコントロール判定用試薬とが添加される。第1のポジティブコントロール判定用試薬は、第1〜第3の実施形態において説明した第1の核酸サンプル識別用試薬と同様であり、「第1のポジティブコントロール用核酸」、つまり、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1と相補的な配列を有する核酸T1を含む。一方、第1のネガティブコントロール判定用試薬は、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域322−nに固定された核酸プローブH2〜H(n)とそれぞれ相補的な配列を有する核酸U2〜U(n)を含む。
【0071】
同様に、第kの核酸サンプルには、第kのポジティブコントロール判定用試薬と、第kのネガティブコントロール判定用試薬とが添加される。第kのポジティブコントロール判定用試薬は、第kのポジティブコントロール固定化領域14kに固定された核酸プローブC(k)と相補的な配列を有する核酸T(k)を含む。一方、第kのネガティブコントロール判定用試薬は、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域32kに固定された核酸プローブH(k)と相補的な配列を有する核酸U(k)を除く、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域321−nに固定された核酸プローブH1〜H(n)とそれぞれ相補的な配列を有する核酸U1〜U(n)を含む。
【0072】
上述した第1〜第nのポジティブコントロール判定用試薬と、第1〜第nのネガティブコントロール判定用試薬を使用することによって、各ネガティブコントロール固定化領域に固定する核酸プローブを1種類に限定することができる。なお、ポジティブコントロール判定用試薬およびネガティブコントロール判定用試薬は、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、「核酸サンプル識別用試薬」としてもよい。また、「核酸サンプル識別用試薬」には、任意の添加剤、例えば塩濃度調整用バッファなどが含まれていてもよい。
【0073】
図8では、例示的に第1〜第4(n=4)の核酸サンプル(核酸サンプルS1〜S4)を検出することができる、核酸サンプル検出用デバイス81を示した。第1〜第4のウェル121−4には、それぞれ第1〜第4の核酸サンプルを注入するための注入ポート151−4が備え付けられている。
【0074】
「ポジティブコントロール固定化領域」には、それぞれ異なる識別用の核酸プローブC1〜C4が固定されている。例えば、第1のポジティブコントロール固定化領域141には、第1のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC1が固定され、第2のポジティブコントロール固定化領域142には、第2のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC2が固定され、第3のポジティブコントロール固定化領域143には、第3のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC3が固定され、第4のポジティブコントロール固定化領域144には、第4のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC4が固定される。
【0075】
「ネガティブコントロール固定化領域」には、「ポジティブコントロール固定化領域」に固定された核酸プローブC1〜C4とは異なる識別用の核酸プローブH1〜H4が固定されている。例えば、第1のネガティブコントロール固定化領域141には、第1のネガティブコントロールを構成する核酸プローブH1が固定され、第2のネガティブコントロール固定化領域142には、第2のネガティブコントロールを構成する核酸プローブH2が固定され、第3のネガティブコントロール固定化領域143には、第3のネガティブコントロールを構成する核酸プローブH3が固定され、第4のネガティブコントロール固定化領域144には、第4のポジティブコントロールを構成する核酸プローブH4が固定される。
【0076】
第1〜第4のポジティブコントロール判定用試薬(試薬1A〜4A)は第1〜第3の実施形態において説明した第1〜第4の核酸サンプル識別用試薬と同様である。
【0077】
次に、第1〜第4のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B〜4B)について説明する。
【0078】
先ず、第1のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B)は、第1の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬1Bは、第2のネガティブコントロール(NC)固定化領域322に固定された核酸プローブH2と相補的な配列を有する「核酸U2」、第3のネガティブコントロール(NC)固定化領域323に固定された核酸プローブH3と相補的な配列を有する「核酸U3」、第4のネガティブコントロール(NC)固定化領域324に固定された核酸プローブH4と相補的な配列を有する「核酸U4」、以上3つの核酸U2、U3、U4を含む試薬である。
【0079】
第1のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B)は、第1のポジティブコントロール判定用試薬(試薬1A)とともに第1の核酸サンプル(サンプルS1)中に添加される。なお、試薬1Aおよび試薬1Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬1E」としてもよい。
【0080】
次に、第2のネガティブコントロール判定用試薬(試薬2B)は、第1の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬2Bは、第1のネガティブコントロール(NC)固定化領域321に固定された核酸プローブH1と相補的な配列を有する「核酸U1」、第3のネガティブコントロール(NC)固定化領域323に固定された核酸プローブH3と相補的な配列を有する「核酸U3」、第4のネガティブコントロール(NC)固定化領域324に固定された核酸プローブH4と相補的な配列を有する「核酸U4」、以上3つの核酸U1、U3、U4を含む試薬である。
【0081】
第2のネガティブコントロール判定用試薬(試薬2B)は、第2のポジティブコントロール判定用試薬(試薬2A)とともに第2の核酸サンプル(サンプルS2)中に添加される。なお、試薬2Aおよび試薬2Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬2E」としてもよい。
【0082】
続いて、第3のネガティブコントロール判定用試薬(試薬3B)は、第1の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬3Bは、第1のネガティブコントロール(NC)固定化領域321に固定された核酸プローブH1と相補的な配列を有する「核酸U1」、第2のネガティブコントロール(NC)固定化領域322に固定された核酸プローブH2と相補的な配列を有する「核酸U2」、第4のネガティブコントロール(NC)固定化領域324に固定された核酸プローブH4と相補的な配列を有する「核酸U4」、以上3つの核酸U1、U2、U4を含む試薬である。
【0083】
第3のネガティブコントロール判定用試薬(試薬3B)は、第3のポジティブコントロール判定用試薬(試薬3A)とともに第3の核酸サンプル(サンプルS3)中に添加される。なお、試薬3Aおよび試薬3Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬3E」としてもよい。
【0084】
最後に、第4のネガティブコントロール判定用試薬(試薬4B)は、第1の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬4Bは、第1のネガティブコントロール(NC)固定化領域321に固定された核酸プローブH1と相補的な配列を有する「核酸U1」、第2のネガティブコントロール(NC)固定化領域322に固定された核酸プローブH2と相補的な配列を有する「核酸U2」、第3のネガティブコントロール(NC)固定化領域323に固定された核酸プローブH3と相補的な配列を有する「核酸U3」、以上3つの核酸U1、U2、U3を含む試薬である。
【0085】
第4のネガティブコントロール判定用試薬(試薬4B)は、第4のポジティブコントロール判定用試薬(試薬4A)とともに第4の核酸サンプル(サンプルS4)中に添加される。なお、試薬4Aおよび試薬4Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬4E」としてもよい。
【0086】
図9
図9は、図8に示した核酸サンプル検出用デバイス81を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図である。
【0087】
試薬1Aおよび1Bを添加された第1の核酸サンプル(サンプルS1)を、注入ポート151を介してウェル121に注入する。このとき、試薬1Aに含まれる核酸T1は、ポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1にハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される(図9a)。一方、試薬1Bに含まれる核酸U2、U3、U4は、いずれもネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1とハイブリダイズすることができないので、ネガティブコントロール固定化領域においては信号が検出されない(図9b)。
【0088】
同様に、試薬2Aおよび2Bを添加された第1の核酸サンプル(サンプルS2)を、注入ポート152を介してウェル122に注入する。このとき、試薬2Aに含まれる核酸T2は、ポジティブコントロール固定化領域142に固定された核酸プローブC2にハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される(図9c)。一方、試薬2Bに含まれる核酸U1、U3、U4は、いずれもネガティブコントロール固定化領域322に固定された核酸プローブH2とハイブリダイズすることができないので、ネガティブコントロール固定化領域においては信号が検出されない(図9d)。以下、第3の核酸サンプル(サンプルS3)、第4の核酸サンプル(サンプルS4)についても同様の反応機構が成立する。
【0089】
ここで、第1の核酸サンプル(サンプルS1)に第2の核酸サンプル(サンプルS2)が混入(コンタミネーション)した場合について説明する(図9e)。サンプルS2がサンプルS1に混入した場合、サンプルS2に添加された試薬2B内に含まれる核酸U1が、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1とハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される(図9f)。ネガティブコントロール固定化領域321から信号が検出されたことによって、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)があったことを確認することができる。
【0090】
第4の実施態様では、ネガティブコントロール判定用試薬を新たに調製し、第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定される核酸プローブ数をそれぞれ1種類に限定したことに特徴がある。第4の実施態様では、核酸サンプル数が増加しても各ネガティブコントロール固定化領域に固定される核酸プローブ数はつねに1種類である。従って、核酸サンプル数の増減に伴うネガティブコントロール固定化領域の設計上の変更が不要であり、簡易かつ迅速に大量の核酸プローブ検出用デバイスを提供することができる。
【0091】
(5)第5の実施態様
図10
図10は、第5の実施態様における複数核酸の検出方法を示した模式図である。第5の実施態様の第4の実施態様との相違は、使用する「ネガティブコントロール判定用試薬」にある。第5の実施態様で使用するネガティブコントロール判定用試薬は、ネガティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブH1〜H(n)と、ポジティブコントロール判定用試薬に含まれる核酸T1〜T(n)とを直列に接合させるリンカー配列を有する核酸V1〜V(n)を含む。該リンカー配列を有する核酸V1〜V(n)(以下、単にリンカー配列V1〜V(n)ともいう)を使用することによって、ネガティブコントロールで形成されるハイブリダイズ鎖の長さが長くなるので、より高感度な検出が可能になる。
【0092】
第5の実施態様では、第4の実施態様と同様、図8に示した核酸サンプル検出用デバイス81を使用することができる。以下、第5の実施態様について、核酸サンプル検出用デバイス81を使用した、第1〜第4の核酸サンプルの検出方法を例にとって説明する。
【0093】
先ず、第1〜第4のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B〜4B)について説明する。
【0094】
第1のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B)は、第1の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬1Bは、核酸V2、V3、V4を含む試薬である。核酸V2は、その一端において、第2のネガティブコントロール固定化領域322に固定された核酸プローブH2と相補的な配列を有し、かつその他端において、第2のポジティブコントロール固定化領域142に固定された核酸プローブC2にハイブリダイズする「核酸T2」と相補的な配列を有する。核酸V3は、その一端において、第3のネガティブコントロール固定化領域323に固定された核酸プローブH3と相補的な配列を有し、かつその他端において、第3のポジティブコントロール固定化領域143に固定された核酸プローブC3にハイブリダイズする「核酸T3」と相補的な配列を有する。核酸V4は、その一端において、第4のネガティブコントロール固定化領域324に固定された核酸プローブH4と相補的な配列を有し、かつその他端において、第4のポジティブコントロール固定化領域144に固定された核酸プローブC4にハイブリダイズする「核酸T4」と相補的な配列を有する。
【0095】
第1のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B)は、第1のポジティブコントロール判定用試薬(試薬1A)とともに第1の核酸サンプル(サンプルS1)中に添加される。なお、試薬1Aおよび試薬1Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬1E」としてもよい。
【0096】
次に、第2のネガティブコントロール判定用試薬(試薬2B)は、第2の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬2Bは、核酸V1、V3、V4を含む試薬である。核酸V1は、その一端において、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1と相補的な配列を有し、かつその他端において、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1にハイブリダイズする「核酸T1」と相補的な配列を有する。核酸V3は、その一端において、第3のネガティブコントロール固定化領域323に固定された核酸プローブH3と相補的な配列を有し、かつその他端において、第3のポジティブコントロール固定化領域143に固定された核酸プローブC3にハイブリダイズする「核酸T3」と相補的な配列を有する。核酸V4は、その一端において、第4のネガティブコントロール固定化領域324に固定された核酸プローブH4と相補的な配列を有し、かつその他端において、第4のポジティブコントロール固定化領域144に固定された核酸プローブC4にハイブリダイズする「核酸T4」と相補的は配列を有する。
【0097】
第2のネガティブコントロール判定用試薬(試薬2B)は、第2のポジティブコントロール判定用試薬(試薬2A)とともに第2の核酸サンプル(サンプルS2)中に添加される。なお、試薬2Aおよび試薬2Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、「核酸サンプル識別用試薬2E」としてもよい。
【0098】
続いて、第3のネガティブコントロール判定用試薬(試薬3B)は、第3の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬3Bは、核酸V1、V2、V4を含む試薬である。核酸V1は、その一端において、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1と相補的な配列を有し、かつその他端において、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1にハイブリダイズする「核酸T1」と相補的な配列を有する。核酸V2は、その一端において、第2のネガティブコントロール固定化領域322に固定された核酸プローブH2と相補的な配列を有し、かつその他端において、第2のポジティブコントロール固定化領域142に固定された核酸プローブC2にハイブリダイズする「核酸T2」と相補的な配列を有する。核酸V4は、その一端において、第4のネガティブコントロール固定化領域324に固定された核酸プローブH4と相補的な配列を有し、かつその他端において、第4のポジティブコントロール固定化領域144に固定された核酸プローブC4にハイブリダイズする「核酸T4」と相補的は配列を有する。
【0099】
第3のネガティブコントロール判定用試薬(試薬3B)は、第3のポジティブコントロール判定用試薬(試薬3A)とともに第3の核酸サンプル(サンプルS3)中に添加される。なお、試薬3Aおよび試薬3Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、「核酸サンプル識別用試薬3E」としてもよい。
【0100】
最後に、第4のネガティブコントロール判定用試薬(試薬4B)は、第4の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬4Bは、核酸V1、V2、V3を含む試薬である。核酸V1は、その一端において、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1と相補的な配列を有し、かつその他端において、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1にハイブリダイズする「核酸T1」と相補的な配列を有する。核酸V2は、その一端において、第2のネガティブコントロール固定化領域322に固定された核酸プローブH2と相補的な配列を有し、かつその他端において、第2のポジティブコントロール固定化領域142に固定された核酸プローブC2にハイブリダイズする「核酸T2」と相補的な配列を有する。核酸V3は、その一端において、第3のネガティブコントロール固定化領域323に固定された核酸プローブH3と相補的な配列を有し、かつその他端において、第3のポジティブコントロール固定化領域143に固定された核酸プローブC3にハイブリダイズする「核酸T3」と相補的は配列を有する。
【0101】
第4のネガティブコントロール判定用試薬(試薬4B)は、第4のポジティブコントロール判定用試薬(試薬4A)とともに第4の核酸サンプル(サンプルS4)中に添加される。なお、試薬4Aおよび試薬4Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、「核酸サンプル識別用試薬4E」としてもよい。
【0102】
次に、第5の実施態様における検出機構について説明する。
【0103】
試薬1Aおよび1Bを添加された第1の核酸サンプル(サンプルS1)を、注入ポート151を介してウェル121に注入する。このとき、試薬1Aに含まれる核酸T1は、ポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1にハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される(図10a)。一方、試薬1Bに含まれる核酸V2、V3、V4は、いずれもネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1とハイブリダイズすることができないので、ネガティブコントロール固定化領域においては信号が検出されない(図10b)。
【0104】
同様に、試薬2Aおよび2Bを添加された第1の核酸サンプル(サンプルS2)を、注入ポート152を介してウェル122に注入する。このとき、試薬2Aに含まれる核酸T2は、ポジティブコントロール固定化領域142に固定された核酸プローブC2にハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される(図10c)。一方、試薬2Bに含まれる核酸V1、V3、V4は、いずれもネガティブコントロール固定化領域322に固定された核酸プローブH2とハイブリダイズすることができないので、ネガティブコントロール固定化領域においては信号が検出されない(図10d)。以下、第3の核酸サンプル(サンプルS3)、第4の核酸サンプル(サンプルS4)についても同様の反応機構が成立する。
【0105】
ここで、第1の核酸サンプル(サンプルS1)に第2の核酸サンプル(サンプルS2)が混入(コンタミネーション)した場合について説明する(図10e)。サンプルS2がサンプルS1に混入した場合、サンプルS2に添加された試薬2B中に含まれる核酸V1が、その一端において、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1とハイブリダイズする。このとき、核酸V1の他端の一本鎖部分に、試薬1A中に含まれる核酸T1がハイブリダイズし、全体として長い二本鎖領域が形成される(図10f)。二本鎖領域を特異的に認識するような検出方法を採用した場合、例えば、電気化学的検出方法においては、長い二本鎖領域により多くの挿入剤が結合できるので、検出される電気量も多くなり、結果としてより高感度な検出が実現される。したがって、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)の有無をより正確かつ確実に検出することができる。
【0106】
図11
図10に示したネガティブコントロール判定用試薬のうち、第1のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B)を構成する核酸の態様を模式的に示した図である。
【0107】
試薬1Bには、試薬1Bに含まれる核酸V2、V3、V4を、それぞれ独立した核酸として調製するタイプ(図11a)、互いに直列に接合して1つの核酸として調製するタイプ(図11a)、および各核酸プローブの端部が他の核酸プローブの端部と重なり合うように互いに直列に接合することによって、配列の全長を短く設計したタイプ(図11c)がある。なお、当然ながら、第2〜第nのネガティブコントロール判定用試薬(試薬2B〜(n)B)についても同様のタイプがある。
【0108】
核酸サンプル数の増加に伴いネガティブコントロール判定用試薬に含まれる核酸の種類も増加する。各核酸試薬を直列に接合することにより(図11b)、独立した核酸の種類を減らすことができ、迅速かつ容易にネガティブコントロール判定用試薬を提供することができる。また、各核酸を直列に接合した場合、その端部を重ね合わせることにより(図11c)、各核酸の全長を短く設計することができ、特に、核酸サンプル数が増加した場合に有効である。
【0109】
(6)核酸サンプル検出用キット
上述した第1〜第5の実施態様において使用される核酸サンプル検出用キットを提供することができる。該核酸サンプル検出用キットには、第1〜第5の実施態様において使用される核酸サンプル検出用デバイスと、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプル識別用試薬とが含まれる。核酸サンプル検出用デバイスの検出核酸プローブ固定化領域には、検査対象となる特定の疾患遺伝子に相補的な配列を有する核酸プローブが固定されており、複数の核酸サンプルをキットに含まれる核酸サンプル識別用試薬で処理後、核酸サンプル検出用デバイスに注入することによって、同時かつ迅速な検査結果を得ることができる。
【0110】
キットに含まれる核酸サンプル検出用デバイスは、1核酸サンプルを検出するための各検査レーンが1つの基板に一体に形成されていてもよいし、あるいは各検査レーンが独立した基体に形成されていてもよい。さらに、例えば、8つの核酸サンプルを検出するために4つの検査レーンを含む基板が2つ用意されていたり、9つの核酸サンプルを検出するために3つの検査レーンを含む基板が3つ用意されているものであってもよい。
【0111】
また、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬が、それぞれ独立した第1〜第nのポジティブコントロール判定用試薬と、第1〜第nのネガティブコントロール判定用試薬とで構成されてもよいし、任意の添加剤、例えば塩濃度調整用バッファなどが試薬として存在していてもよい。
【実施例】
【0112】
実施例1(第1の実施態様)
1.使用機器、使用材料等
(1)核酸検出用デバイス
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図1に示したとおりである。すなわち、1つのポジティブコントロール固定化領域と、1以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。本実施例では、図1に示したとおり、検出項目数を4とし、核酸プローブD1〜D4がそれぞれ独立して固定された、4つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。
【0113】
また、本実施例では、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。すなわち、各ウェルに形成された複数の核酸プローブ固定化領域は、いずれも金電極を備え、各固定化領域で形成された2本鎖核酸に由来した電気的信号を検出することができる。電気的信号は、2本鎖核酸に特異的に結合する挿入剤によって得ることができる。本実施例では、挿入剤として「ヘキスト33258」を使用した。
【0114】
(2)核酸プローブ
ポジティブコントロール固定化領域141−4に固定された核酸プローブC1〜C4の配列は、以下のとおりである。
C1: TTCAGTTATGTGGATGAT
C2: TCAGTTATGTCGATGATG
C3: TTTCAGTTATGTTGATGATGT
C4: TTTCAGTTATGTAGATGATG
検出核酸プローブ固定化領域131−4に固定された核酸プローブD1〜D4の配列は、以下のとおりである。
D1: ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA
D2: TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
D3: TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT
D4: AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。
【0115】
(3)判定用試薬
ポジティブコントロール判定試薬(試薬1〜4)に含まれる核酸T1〜T4の配列は、以下のとおりである。
試薬1(核酸T1(C1と相補的な配列)を含有)
試薬2(核酸T2(C2と相補的な配列)を含有)
試薬3(核酸T3(C3と相補的な配列)を含有)
試薬4(核酸T4(C4と相補的な配列)を含有)。
【0116】
(4)核酸サンプル
検出対象となる第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)の配列は、以下の配列を含む。
サンプルS1:(検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む)
サンプルS2:(検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む)
サンプルS3:(検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む)
サンプルS4:(検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む)
2.実験手順
第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬(試薬1〜4)を添加した。次に、サンプルS1〜S4を、それぞれ注入ポートを介して第1〜第4のウェルに注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第1〜第4の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図12に示した。
【0117】
次に、サンプルの入れ違えを模擬するため、S1とS2を故意に入れ替えて同様の検出を行った。電流値の測定結果を示したグラフを図13に示した。
【0118】
3.実験結果
図12は、サンプルS1〜S4のそれぞれについて検出された電流値を棒グラフで表わしたものである。S1〜S4は、第1〜第4の各核酸サンプルS1〜S4を意味する。ポジティブコントロール用プローブ(PCP)は、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された核酸プローブC1〜C4における電流値を示す。検出用プローブ(DP)は、検出核酸プローブ固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された4つの核酸プローブD1〜D4における電流値を示す。
【0119】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、核酸が2本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出される。逆に、2本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。なお、わずかながら電流値が検出される理由は、洗浄作業において完全に除去できなかった非特異的な吸着核酸によるものと考えられる。
【0120】
図12をみると、4つの全てのウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られており、各核酸サンプルの間で入れ間違えが無かったことを確認することができた。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、61nA、核酸サンプルS2では、72nA、核酸サンプルS3では、62nA、核酸サンプルS4では、69nAの電流値が検出された。
【0121】
そして、検出核酸プローブ固定化領域D1〜D4から得られた電流値から各核酸サンプルに含まれる核酸の配列を特定することができた。すなわち、核酸サンプルS1では、核酸プローブD1において82nAが検出され、核酸サンプルS1には核酸プローブD1に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルS2では、核酸プローブD2において62nAが検出され、核酸サンプルS2には核酸プローブD2に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルS3では、核酸プローブD3において73nAが検出され、核酸サンプルS3には核酸プローブD3に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらにまた、核酸サンプルS4では、核酸プローブD4において66nAが検出され、核酸サンプルS4には核酸プローブD4に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【0122】
次に図13をみると、第1のウェルと第2のウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られておらず、核酸サンプルの入れ違えが正しく確認できたことがわかった。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、19nA、核酸サンプルS2では、17nA、核酸サンプルS3では、70nA、核酸サンプルS4では、72nAの電流値が検出された。
【0123】
その他、核酸サンプルS3、S4については、サンプルの入れ違えが無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルS3では、核酸プローブD3において66nAが検出され、核酸サンプルS3には核酸プローブD3に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルS4では、核酸プローブD4において73nAが検出され、核酸サンプルS4には核酸プローブD4に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【0124】
実施例2(第2の実施態様)
1.使用機器、使用材料等
(1)核酸検出用デバイス
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図3に示したとおりである。すなわち、1つのポジティブコントロール固定化領域と、3つのネガティブコントロール固定化領域と、1以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。本実施例では、図3に示したとおり、検出項目数を4とし、核酸プローブD1〜D4がそれぞれ独立して固定された、4つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。また、本実施例では、実施例1と同様、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。
【0125】
(2)核酸プローブ、判定用試薬
いずれも、実施例1に示したとおりである。なお、実施例2では、ネガティブコントロール固定化領域321−4を使用する。ネガティブコントロール固定化領域321−4に固定された核酸プローブC1〜C4は、ポジティブコントロール固定化領域141−4に固定された核酸プローブC1〜C4と同一である。
【0126】
(3)核酸サンプル
検出対象となる第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)の配列は、以下の配列を含む。
サンプルS1:(検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む)
サンプルS2:(検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む)
サンプルS3:(検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む)
サンプルS4:(検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む)。
【0127】
2.実験手順
第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬(試薬1〜4)を添加した。次に、サンプルS1〜S4を、それぞれ注入ポートを介して第1〜第4のウェルに注入したが、サンプルの混入を模擬するため、第1のウェルにはS1とS2を故意に混合したサンプル(S1+S2)を注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第1〜第4の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、実施例1と同様、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図14に示した。
【0128】
3.実験結果
図13は、サンプルS1〜S4のそれぞれについて検出された電流値を棒グラフで表わしたものである。S1〜S4は、第1〜第4の各核酸サンプルS1〜S4を意味する。ポジティブコントロール用プローブ(PCP)は、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された核酸プローブC1〜C4における電流値を示す。ネガティブコントロール用プローブ(NCP)は、ネガティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された核酸プローブC1〜C4における電流値を示す。検出用プローブ(DP)は、検出核酸プローブ固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された4つの核酸プローブD1〜D4における電流値を示す。
【0129】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、実施例1と同様、核酸が2本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出され、逆に、2本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。
【0130】
図14をみると、4つの全てのウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られており、各核酸サンプルの間で入れ間違えが無かったことを確認することができた。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、71nA、核酸サンプルS2では、66nA、核酸サンプルS3では、70nA、核酸サンプルS4では、73nAの電流値が検出された。
【0131】
また、第1のウェルにおいて、ネガティブコントロール用プローブ(NCP)から閾値以上の電流値が得られており、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)があったことを正しく確認することができた。
【0132】
その他、核酸サンプルS2、S3、S4については、サンプルの入れ違えが無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルS2では、核酸プローブD2において72nAが検出され、核酸サンプルS2には核酸プローブD2に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルS3では、核酸プローブD3において69nAが検出され、核酸サンプルS3には核酸プローブD3に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルS4では、核酸プローブD4において72nAが検出され、核酸サンプルS4には核酸プローブD4に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【0133】
実施例3(第3の実施態様)
1.使用機器、使用材料等
(1)核酸検出用デバイス
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図5に示したとおりである。すなわち、1つのポジティブコントロール固定化領域と、1つのネガティブコントロール固定化領域と、1以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。1つのネガティブコントロール固定化領域には、3種類の異なる核酸プローブが混在して固定されている。本実施例では、図5に示したとおり、検出項目数を4とし、核酸プローブD1〜D4がそれぞれ独立して固定された、4つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。また、本実施例では、実施例1および2と同様、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。
【0134】
(2)核酸プローブ、判定用試薬
いずれも、実施例1に示したとおりである。なお、実施例3では、ネガティブコントロール固定化領域321−4を使用する。ネガティブコントロール固定化領域321−4に固定された核酸プローブC1〜C4は、ポジティブコントロール固定化領域141−4に固定された核酸プローブC1〜C4と同一である。
【0135】
(3)核酸サンプル
検出対象となる第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)の配列は、以下の配列を含む。
サンプルS1:(検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む)
サンプルS2:(検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む)
サンプルS3:(検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む)
サンプルS4:(検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む)。
【0136】
2.実験手順
第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬(試薬1〜4)を添加した。次に、サンプルS1〜S4を、それぞれ注入ポートを介して第1〜第4のウェルに注入したが、サンプルの入れ違えを模擬するため、S3とS4を故意に入れ替えて注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第1〜第4の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、実施例1と同様、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図15に示した。
【0137】
3.実験結果
図15に示す各記号は、図14と同じである。なお、本実施例では、1つのポジティブコントロール固定化領域に3種類の核酸プローブが混在して固定されている。
【0138】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、実施例1および2と同様、核酸が2本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出され、逆に、2本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。
【0139】
図15をみると、第3のウェルと第4のウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られておらず、核酸サンプルの入れ違えが正しく確認できたことがわかった。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、62nA、核酸サンプルS2では、68nA、核酸サンプルS3では、22nA、核酸サンプルS4では、25nAの電流値が検出された。
【0140】
また、第3のウェルと第4のウェルにおいて、ネガティブコントロール用プローブ(NCP)から閾値以上の電流値が得られており、この結果からも核酸サンプルの入れ違えが正しく確認できたことがわかった。
【0141】
その他、核酸サンプルS1、S2については、コンタミネーションが無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルS1では、核酸プローブD1において65nAが検出され、核酸サンプルS1には核酸プローブD1に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルS2では、核酸プローブD2において72nAが検出され、核酸サンプルS2には核酸プローブD2に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【0142】
実施例4(第4の実施態様)
1.使用機器、使用材料等
(1)核酸検出用デバイス
本実施例では、実施例1〜3で使用したポジティブコントロール用判定試薬1A〜4Aの他に、ネガティブコントロール用判定試薬1B〜4Bを使用して、検体の取り違えやコンタミネーションの有無を検出する。
【0143】
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図8に示したとおりである。すなわち、1つのポジティブコントロール固定化領域と、1つのネガティブコントロール固定化領域と、1以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。1つのネガティブコントロール固定化領域には、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1〜C4とは異なる、核酸プローブH1〜H4が固定されている。核酸プローブH1〜H4は、ネガティブコントロールコントロール用の試薬1B〜4Bによって検出する。本実施例では、図8に示したとおり、検出項目数を4とし、核酸プローブD1〜D4がそれぞれ独立して固定された、4つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。また、本実施例では、実施例1〜3と同様、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。
【0144】
(2)核酸プローブ
ポジティブコントロール固定化領域141−4に固定された核酸プローブC1〜C4の配列は、以下のとおりである(実施例1と同じ)。
C1: TTCAGTTATGTGGATGAT
C2: TCAGTTATGTCGATGATG
C3: TTTCAGTTATGTTGATGATGT
C4: TTTCAGTTATGTAGATGATG
ネガティブコントロール固定化領域321−4に固定された核酸プローブH1〜H4の配列は、以下のとおりである。
H1: TCCGGGCGCAGAAAC
H2: GTGCTGCAGGTGCG
H3: CGTGATGACACCAAG
H4: ATGCTTTCCGTGGCA
検出核酸プローブ固定化領域131−4に固定された核酸プローブD1〜D4の配列は、以下のとおりである(実施例1と同じ)。
D1: ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA
D2: TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
D3: TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT
D4: AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。
【0145】
(3)判定用試薬
ポジティブコントロール判定試薬(試薬1A〜4A)に含まれる核酸T1〜T4の配列は、以下のとおりである。
試薬1A(核酸T1(C1と相補的な配列)を含有)
試薬2A(核酸T2(C2と相補的な配列)を含有)
試薬3A(核酸T3(C3と相補的な配列)を含有)
試薬4A(核酸T4(C4と相補的な配列)を含有)
ネガティブコントロール判定試薬(試薬1B〜4B)に含まれる核酸V1〜V4の配列は、以下のとおりである。
試薬1B(核酸U1(H1と相補的な配列)を含有)
試薬2B(核酸U2(H2と相補的な配列)を含有)
試薬3B(核酸U3(H3と相補的な配列)を含有)
試薬4B(核酸U4(H4と相補的な配列)を含有)。
【0146】
(4)核酸サンプル
検出対象となる第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)の配列は、以下の配列を含む。
【0147】
サンプルS1:(検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む)
サンプルS2:(検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む)
サンプルS3:(検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む)
サンプルS4:(検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む)
2.実験手順
第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬(試薬1A〜4A)およびネガティブコントロール判定試薬(試薬1B〜4B)を添加した。次に、サンプルS1〜S4を、それぞれ注入ポートを介して第1〜第4のウェルに注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第1〜第4の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、実施例1と同様、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図16に示した。
【0148】
次に、サンプルの入れ違えを模擬するため、S1とS2を故意に入れ替えて同様の検出を行った。電流値の測定結果を示したグラフを図17に示した。
【0149】
3.実験結果
図16に示す各記号は、図14および15と同じである。なお、本実施例のネガティブコントロール固定化領域には、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1〜C4とは異なる、核酸プローブH1〜H4が固定されている。
【0150】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、実施例1〜3と同様、核酸が2本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出され、逆に、2本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。
【0151】
図16をみると、4つの全てのウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られており、各核酸サンプルの間で入れ間違えが無かったことを確認することができた。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、60nA、核酸サンプルS2では、72nA、核酸サンプルS3では、68nA、核酸サンプルS4では、71nAの電流値が検出された。
【0152】
また、4つの全てのウェルにおいて、ネガティブコントロール用プローブ(NCP)から閾値40nA以上の電流値が得られなかったことから、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)も無かったことを確認することができた。
【0153】
そして、検出核酸プローブ固定化領域D1〜D4から得られた電流値から各核酸サンプルに含まれる核酸の配列を特定することができた。すなわち、核酸サンプルS1では、核酸プローブD1において56nAが検出され、核酸サンプルS1には核酸プローブD1に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルS2では、核酸プローブD2において67nAが検出され、核酸サンプルS2には核酸プローブD2に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルS3では、核酸プローブD3において56nAが検出され、核酸サンプルS3には核酸プローブD3に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらにまた、核酸サンプルS4では、核酸プローブD4において72nAが検出され、核酸サンプルS4には核酸プローブD4に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【0154】
次に図17をみると、第1のウェルと第2のウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られておらず、核酸サンプルの入れ違えが正しく確認できたことがわかった。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、18nA、核酸サンプルS2では、16nA、核酸サンプルS3では、78nA、核酸サンプルS4では、81nAの電流値が検出された。
【0155】
その他、核酸サンプルS3、S4については、サンプルの入れ違えが無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルS3では、核酸プローブD3において62nAが検出され、核酸サンプルS3には核酸プローブD3に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルS4では、核酸プローブD4において71nAが検出され、核酸サンプルS4には核酸プローブD4に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【0156】
実施例5(第5の実施態様)
1.使用機器、使用材料等
(1)核酸検出用デバイス
本実施例では、実施例1〜4で使用したポジティブコントロール用判定試薬1A〜4Aの他に、ネガティブコントロール用判定試薬1B〜4Bを使用して、検体の取り違えやコンタミネーションの有無を検出する。
【0157】
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図8に示したとおりである。すなわち、1つのポジティブコントロール固定化領域と、1つのネガティブコントロール固定化領域と、1以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。1つのネガティブコントロール固定化領域には、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1〜C4とは異なる、核酸プローブH1〜H4が固定されている。核酸プローブH1〜H4は、ネガティブコントロールコントロール用の試薬1B〜4Bによって検出する。本実施例では、図8に示したとおり、検出項目数を4とし、核酸プローブD1〜D4がそれぞれ独立して固定された、4つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。また、本実施例では、実施例1〜4と同様、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。
【0158】
(2)核酸プローブ
ポジティブコントロール固定化領域141−4に固定された核酸プローブC1〜C4の配列は、以下のとおりである(実施例1と同じ)。
C1: TTCAGTTATGTGGATGAT
C2: TCAGTTATGTCGATGATG
C3: TTTCAGTTATGTTGATGATGT
C4: TTTCAGTTATGTAGATGATG
ネガティブコントロール固定化領域321−4に固定された核酸プローブH1〜H4の配列は、以下のとおりである。
H1: TCCGGGCGCAGAAAC
H2: GTGCTGCAGGTGCG
H3: CGTGATGACACCAAG
H4: ATGCTTTCCGTGGCA
検出核酸プローブ固定化領域131−4に固定された核酸プローブD1〜D4の配列は、以下のとおりである(実施例1と同じ)。
D1: ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA
D2: TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
D3: TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT
D4: AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。
【0159】
(3)判定用試薬
ポジティブコントロール判定試薬(試薬1A〜4A)に含まれる核酸T1〜T4の配列は、以下のとおりである。
試薬1A(核酸T1(C1と相補的な配列)を含有)
試薬2A(核酸T2(C2と相補的な配列)を含有)
試薬3A(核酸T3(C3と相補的な配列)を含有)
試薬4A(核酸T4(C4と相補的な配列)を含有)
ネガティブコントロール判定試薬(試薬1B〜4B)に含まれる核酸V1〜V4の配列は、以下のとおりである。
試薬1B(核酸V1(H1と相補的な配列+T1と相補的な配列)を含有)
試薬2B(核酸V2(H2と相補的な配列+T2と相補的な配列)を含有)
試薬3B(核酸V3(H3と相補的な配列+T3と相補的な配列)を含有)
試薬4B(核酸V4(H4と相補的な配列+T4と相補的な配列)を含有)。
【0160】
(4)核酸サンプル
検出対象となる第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)の配列は、以下の配列を含む。
【0161】
サンプルS1:(検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む)
サンプルS2:(検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む)
サンプルS3:(検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む)
サンプルS4:(検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む)
2.実験手順
第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬(試薬1A〜4A)およびネガティブコントロール判定試薬(試薬1B〜4B)を添加した。次に、サンプルS1〜S4を、それぞれ注入ポートを介して第1〜第4のウェルに注入したが、サンプルの混入を模擬するため、第3のウェルにはS3とS4を故意に混合したサンプル(S3+S4)を注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第1〜第4の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、実施例1と同様、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図18に示した。
【0162】
3.実験結果
図18に示す各記号は、図17と同じである。なお、本実施例のネガティブコントロール固定化領域には、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1〜C4とは異なる、核酸プローブH1〜H4が固定されている。
【0163】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、実施例1〜4と同様、核酸が2本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出され、逆に、2本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。
【0164】
図18をみると、4つの全てのウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られており、各核酸サンプルの間で入れ間違えが無かったことを確認することができた。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、66nA、核酸サンプルS2では、65nA、核酸サンプルS3では、77nA、核酸サンプルS4では、81nAの電流値が検出された。
【0165】
また、第3のウェルにおいて、ネガティブコントロール用プローブ(NCP)から閾値以上の電流値が得られており、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)があったことを正しく確認することができたことがわかった。
【0166】
その他、核酸サンプルS1、S2、S4については、サンプルの混入が無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルS1では、核酸プローブD1において63nAが検出され、核酸サンプルS1には核酸プローブD1に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルS2では、核酸プローブD2において72nAが検出され、核酸サンプルS2には核酸プローブD2に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルS4では、核酸プローブD4において62nAが検出され、核酸サンプルS4には核酸プローブD4に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【図面の簡単な説明】
【0167】
【図1】第1の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス11を示した模式図
【図2】図1に示した核酸サンプル検出用デバイス11を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図
【図3】第2の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス31を示した模式図
【図4】図3に示した核酸サンプル検出用デバイス31を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図
【図5】第3の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス51を示した模式図
【図6】図5に示したネガティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを示した模式図
【図7】図5に示した核酸サンプル検出用デバイス51を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図
【図8】第4の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス81を示した模式図
【図9】図8に示した核酸サンプル検出用デバイス81を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図
【図10】第5の実施態様における複数核酸の検出方法を示した模式図
【図11】図10に示したネガティブコントロール判定用試薬に含まれる複数種の核酸を模式的に示した図
【図12】第1の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした第1の棒グラフ
【図13】第1の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした第2の棒グラフ
【図14】第2の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした棒グラフ
【図15】第3の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした棒グラフ
【図16】第4の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした第1の棒グラフ
【図17】第4の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした第2の棒グラフ
【図18】第5の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした棒グラフ
【符号の説明】
【0168】
11、31、51、81・・・核酸サンプル検出用デバイス、12・・・ウェル、13・・・検出核酸プローブ固定化領域、14・・・ポジティブコントロール固定化領域、15・・・注入ポート、16・・・基板、17・・・枠、32・・・ネガティブコントロール固定化領域。
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸プローブが固定化された核酸サンプル検出用デバイスを用いて核酸サンプルを検出する方法であり、特に、一度に複数の核酸サンプルを検出する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年の分子生物学分野の発展に伴い、多くの疾患遺伝子が同定され、遺伝子診断による疾患の特定が可能となっている。また、遺伝子診断の結果に基づいて各患者に最適な治療を提供するテーラーメイド医療も実現化しつつある。
【0003】
遺伝子診断の実効性が増加するにつれて、臨床現場で取り扱う検査数も飛躍的に増大し、多量の核酸サンプルを同時に検査する検査アレイおよび検査方法が強く切望され、その一部がすでに実現されている(特許文献1)。
【特許文献1】特開2005−345243
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかしながら、多量の核酸サンプルを同時に検査する場合、検体の取り違えやコンタミネーションの問題が生じる。遺伝子診断は、発症前診断であることが多く、診断結果に基づいてしばしば予防的治療が行なわれることから、正確な診断結果を得ることが不可欠である。
【0005】
本発明の目的は、検体の取り違えと、検体間のコンタミネーションによる誤検出を防止することができ、医療現場で求められる高い安全性と信頼性を備えた検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
(第1の実施態様)
即ち、本発明は、第1の実施態様として、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第1〜第nのウェル中の第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、第1〜第nの核酸サンプルを、各々第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【0007】
(第2の実施態様)
また、本発明は、第2の実施態様として、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含み、第1のネガティブコントロール固定化領域が、(n−1)個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む各核酸プローブがそれぞれ独立して固定され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域が、(n−1)個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む各核酸プローブがそれぞれ独立して固定された、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第1〜第nのウェル中の第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、第1〜第nの核酸サンプルを、各々第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を検出する。
【0008】
(第3の実施態様)
さらにまた、本発明は、第3の実施態様として、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含み、第1のネガティブコントロール固定化領域が、1つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む核酸プローブがともに固定され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域が、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む核酸プローブがともに固定された、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第1〜第nのウェル中の第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、第1〜第nの核酸サンプルを、各々第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【0009】
(第4の実施態様)
さらにまた、本発明は、第4の実施態様として、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップであって、第1の核酸サンプル識別用試薬が、第1のポジティブコントロール固定化領域に固定された第1のポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第1のポジティブコントロール判定用試薬と、第2〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の複数の核酸を含む、第1のネガティブコントロール判定用試薬とで構成され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)の核酸サンプル識別用試薬が、第kのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kのポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第kのポジティブコントロール判定用試薬と、第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の複数の核酸を含む、第kのネガティブコントロール判定用試薬とで構成された、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、第1〜第nの核酸サンプルを、第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【0010】
(第5の実施態様)
さらにまた、本発明は、第5の実施態様として、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第nのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された第kの核酸サンプルを検出するための第kの核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップであって、第1の核酸サンプル識別用試薬が、第1のポジティブコントロール固定化領域に固定された第1のポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第1のポジティブコントロール判定用試薬と、第2〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有し、かつ第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定化された第2〜第nのポジティブコントロール用核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する複数の核酸を含む、第1のネガティブコントロール判定用試薬とで構成され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)の核酸サンプル識別用試薬が、第kのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kのポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第kのポジティブコントロール判定用試薬と、第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有し、かつ第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する複数の核酸を含む、第kのネガティブコントロール判定用試薬とで構成された、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、第1〜第nの核酸サンプルを、第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、を含む、複数核酸の検出方法を提供する。
【発明の効果】
【0011】
本発明の複数核酸の検出方法によって、検体の取り違えと、検体間のコンタミネーションによる誤検出を防止することができ、医療現場で求められる高い安全性と信頼性を備えた検出方法が実現される。
【発明を実施するための最良の形態】
【0012】
<基本的構成>
以下、(1)核酸サンプル検出用デバイス、(2)検出の手法、(3)核酸サンプル、および(4)検出の手順について説明する。
【0013】
(1)核酸サンプル検出用デバイス
本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、例えば、基板と、基板上に複数形成された核酸プローブ固定化領域と、前記核酸プローブ固定化領域を仕切るための枠を備えることを特徴とする。前記枠は、少なくとも1以上のウェルを形成し、各ウェルが1核酸サンプルを検出するための1検査レーンを構成し、検査対象となる核酸プローブが固定化された核酸プローブ固定化領域(以下、検出核酸プローブ固定化領域という)が各ウェル中にそれぞれ形成されている。
【0014】
前記基板および枠の材料は、特に限定されることなく、当業者に既知の任意の材料を使用することもできる。たとえば、ガラス、石英ガラス、シリコン、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどの有機材料を使用することができる。基板の形状には、特に制限はなく、平面形状、凹凸形状いずれでもよく、さらに多孔質体であってもよい。
【0015】
前記核酸プローブ固定化領域は、検出核酸プローブ固定化領域と、ポジティブコントロール固定化領域と、ネガティブコントロール固定化領域とで構成される。
【0016】
「検出核酸プローブ固定化領域」は、検査対象となる標的核酸配列の有無を検出するための領域である。例えば、ある疾患遺伝子の有無を検査する場合、その疾患遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブを固定しておくことにより、核酸サンプル中の疾患遺伝子の有無を判定することができる。検出核酸プローブ固定化領域を複数設け、それぞれに異なる塩基配列を含む核酸プローブを固定しておくことによって、複数の検出項目について同時に検査を行うことができる。なお、「疾患遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブ」とは、疾患遺伝子の少なくとも一部分と相補的な配列を有する核酸プローブを意味する。
【0017】
「ポジティブコントロール固定化領域」は、核酸サンプルの取り違えの有無を確認するための領域である。従来の核酸サンプル検出用デバイスには、この「ポジティブコントロール固定化領域」が存在しなかったため、複数の核酸サンプルを同時に検出する場合、ある核酸サンプルを別の核酸サンプルと取り違えたとしても、その事実を確認することができなかった。一方、本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、この「ポジティブコントロール固定化領域」によって核酸サンプルの取り違えの有無を確認することができるので、サンプルの取り違えのない、高い安全性と信頼性を備えた核酸サンプル検出用デバイスを提供することができる。
【0018】
「ネガティブコントロール固定化領域」は、コンタミネーションの有無を確認するための領域である。従来の核酸サンプル検出用デバイスには、この「ネガティブコントロール固定化領域」が存在しなかったため、複数の核酸サンプルを同時に検出する場合、ある核酸サンプル中に他の核酸サンプルが混入(コンタミネーション)したとしても、その事実を確認することができなかった。一方、本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、この「ネガティブコントロール固定化領域」によって他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)の有無を確認することができるので、コンタミネーションのない、高い安全性と信頼性を備えた核酸サンプル検出用デバイスを提供することができる。
【0019】
前記核酸プローブ固定化領域に固定される核酸プローブの材料は、特に限定されることなく、当業者に既知の任意の材料を使用することができる。たとえば、DNA、RNA、PNA、メチルホスホネート骨格の核酸、その他の核酸類似体、またはこれらのキメラ核酸を使用することができる。使用するプローブの長さは、特に制限はないが、たとえば、8〜200塩基、好ましくは10〜100塩基、さらに好ましくは12〜50塩基である。
【0020】
前記核酸プローブ固定化領域を作製するために、核酸プローブを固定化する方法は、特に限定されることなく、当業者に既知の任意の方法を使用して固定することができる。たとえば、物理吸着、化学吸着、疎水結合、抱埋、および共有結合などによって固定化することができる。より具体的には、たとえばプローブの末端に導入したアミノ基を介して、カルボジイミドなどの縮合剤を用いて基板上に共有結合することができる。また、基板上にアニオン性の有機物を被覆しておくことで、イオン結合で固定化することもできる。さらに、プローブの末端にビオチンを導入しておくと、ビオチン-アビジン結合で固定化することもできる。また、プローブの末端にチオール基を導入しておき、基板上に被覆したチオール含有物質との間でS−Sを形成させ、強固に固定化することもできる。これらの場合、あらかじめ基板表面を官能基を有する分子で修飾しておくことによって、固定化を容易にすることができる。なお、プローブと末端の修飾基の間には基板表面とプローブとの立体障害を抑制するためにスペーサーを導入することが望ましい。スペーサー分子は特に限定されないが、たとえばアルカン骨格、アルキン骨格、アルケン骨格、エチレングリコール骨格、さらには核酸鎖であってもよい。また、分子構造は、直鎖であっても、分岐鎖であってもよい。スペーサー部分の長さは特に限定されないが、好ましくは、炭素-炭素結合に換算して10〜500、好ましくは20〜200、さらに好ましくは50〜100である。
【0021】
基板上への核酸プローブの固定化の際には、DNAスポッターやDNAアレイヤ−と呼ばれる固定化装置を用いると比較的容易にプローブの固定化を行うことができる。この際、表面を傷つけないために、インクジェット方式や静電方式のスポッターを用いることが望ましい。また、基板表面で直接、核酸鎖の合成を行うこともできる。
【0022】
また、核酸プローブを固定化して核酸プローブ固定化領域を形成する工程は、基板と枠を密着させる前に行うことが望ましいが、密着後であっても固定化することは可能である。さらに、本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、必ずしも核酸プローブ固定化領域に核酸プローブが固定化された状態で提供される必要はなく、核酸プローブが固定化されていない基板として提供されてもよい。この場合、核酸サンプル検出用デバイスを使用する際に、所望の核酸プローブを上述したように基板上に固定して使用する。
【0023】
また、枠によって形成されるウェルの形状も特に限定されるものではなく、円形、四角形あるいは多角形であってもよい。また、ウェルの底が無い状態で枠を作製し、核酸プローブ固定化領域を形成した基板を作製した後に密着させて使用することにより、本実施形態の核酸検出基板の作成が容易になるであろう。枠と基板を密着させるには、接着、圧着等、液漏れを防ぐような強固な密着方法が望ましいが、シリコンのパッキンなどを利用して密着することもできる。
【0024】
また、本実施形態の核酸検出基板は、核酸プローブ固定化領域が形成された基板と枠が、必ずしも一体として提供される必要はなく、両者が分離した状態で提供されてもよい。この場合、核酸検出基板を使用する際に、上記のように基板と枠を密着させて使用する。
【0025】
本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスは、複数の核酸サンプルを検出するため、上記枠で形成されるウェルは、複数存在する。個数は特に限定されないが、好ましくは3個以上100個であり、より好ましくは4個以上50個以下、さらに好ましくは5個以上20個以下である。これらのウェルは、同一デバイス中に形成されているが、必ずしも基板は1個とは限らない。1個の基板上に全ウェルが形成されてもよく、複数の基板上に複数のウェルが形成されてもよい。例えば、1つのウェルが形成された1個の基板を複数用意することによって、複数の核酸サンプルを同時に検出してもよい。この場合、1核酸サンプルの検出が1個の基板によって行われる。
【0026】
(2)検出の手法
本発明には、当業者に既知の全ての検出の手法が含まれ、検出の手法において限定的に解釈されるべきではない。例えば、蛍光色素による蛍光強度による検出や、放射性同位元素を用いた検出、挿入剤分子の電気化学応答を用いた検出、静電容量変化による検出などを用いることができる。特に、代表的な検出手法として、蛍光による検出と電気化学的な検出がある。蛍光による検出は、結果を視覚的に認識することができるので、検出結果の判定ミスを防止することができる。一方、電気化学的な検出は、電流値のみによって検査を行うことができるので、装置の小型化、検査費用の低額化、検査時間の短縮化が可能になる。なお、電気化学的な検出を行う場合、前記各核酸プローブ固定化領域は電極として構成され、電極上に各核酸プローブが固定される。
【0027】
蛍光による検出の場合、核酸試料を予め蛍光物質で標識しておく。例えば、蛍光物質で標識されたプライマーを使用して標的核酸をPCR増幅する。核酸プローブとハイブリッド鎖を形成した標的核酸は、洗浄後も核酸プローブ固定化領域内にとどまるため、蛍光発光が得られる。蛍光物質には、公知の任意のものを使用することができ、例えば、FITC、Cy3、Cy5またはローダミンなどが使用される。蛍光物質の発光は、蛍光検出器を用いて検出することができる。得られた蛍光発光量から各核酸プローブに対応する標的核酸の存在の有無を識別することができる。
【0028】
さらに、蛍光検出方法において、核酸プローブ固定化領域上への核酸や蛍光色素などの非特異的な吸着を抑制するために、核酸プローブ固定化領域の表面を、メルカプトエタノール、メルカプトヘキサノール、メルカプトヘプタノール、メルカプトエチレングリコール、メルカプトオリゴエチレングリコール、メルカプトポリエチレングリコール、炭素鎖が30〜50のアルカンチオールなどのメルカプタンや、ステアリルアミンなどの脂質、界面活性剤、アルブミン、核酸などで被覆することが望ましい。
【0029】
一方、電気化学的な検出の場合は、例えば、電気化学的活性を有する分子を用いる。電気化学的活性を有する分子とは、ハイブリッド鎖に結合し、電位の印加によって電子を放出する分子を意味する。前記分子には、公知の任意のものを使用することができ、例えば、ヘキスト33258(登録商標)(カルビオケム(CALBIOCHEM)より入手可能)、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーターなどが使用される。特に好ましくは、ヘキスト33258が使用される。ヘキスト33258は、化学物質p-(5-(5-(4-メチルピペラジン-1-イル)ベンズイミダゾール-2-イル)ベンズイミダゾール-2-イル)フェノールによって構成された分子である。さらに、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン(ジシクロペンタジエニル鉄)、ビオロゲンなどで修飾してもよい。前記分子の濃度は適宜選択されるが、一般的には1ng/mL〜1000ng/mLの範囲内である。この際、イオン強度0.01〜5、pH5〜10の範囲内の緩衝液を使用することができる。
【0030】
前記分子は、前記ハイブリッド鎖を認識し、これにインターカレートする。ここで、電極に電位を印加すると、酸化還元反応が起こり、インターカレートした前記分子から電子が放出されて電流が流れる。この際、電位は定速で掃引するか、パルスで印加するか、あるいは定電位を印加してもよい。電位掃引速度は、10〜1000mV/secの範囲内である。測定の際、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーターなどの装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。前記分子に由来する電流が電極に流れ、この電流値を測定することによって各核酸プローブに対応する標的核酸の存在の有無を検出することができる。
【0031】
さらに、電気化学的検出方法において、核酸プローブ固定化領域(電極)上への核酸や挿入剤などの非特異的な吸着を抑制するために、電極表面を、メルカプトエタノール、メルカプトヘキサノール、メルカプトヘプタノール、メルカプトエチレングリコール、メルカプトオリゴエチレングリコール、メルカプトポリエチレングリコール、炭素鎖が30〜50のアルカンチオールなどのメルカプタンや、ステアリルアミンなどの脂質、界面活性剤、アルブミン、核酸などで被覆することが望ましい。
【0032】
(3)核酸サンプル
本実施形態の核酸サンプル検出用デバイスによって検出する核酸サンプルは特に限定されることなく、たとえば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、培養細胞、喀痰、食品、土壌、排水、廃水、空気など試料の試料から抽出した、あるいは抽出後に増幅処理を行うことにより得られた核酸サンプルが対象となる。本実施形態の検出方法は、たとえば、肝炎ウイルス(A、B、C、D、E、F、G型)、HIV、インフルエンザウイルス(A、B、C、D、E、F)、ヘルペス群ウイルス、アデノウイルス、ヒトポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパルボウイルス、ムンプスウイルス、ヒトロタウイルス、エンテロウイルス、日本脳炎ウイルス、天然痘ウイルス、コロナウイルス、SARS、デングウイルス、風疹ウイルス、HTLVなどのウイルス感染症、黄色ブドウ球菌、溶血性連鎖球菌、病原性大腸菌、腸炎ビブリオ菌、ヘリコバクターピロリ菌、カンピロバクター、コレラ菌、赤痢菌、サルモネラ菌、炭疽菌、エルシニア、淋菌、リステリア菌、レプトスピラ、レジオネラ菌、スピロヘータ、肺炎マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、マラリア、赤痢アメーバ、病原真菌などの細菌感染症、または寄生虫、真菌の検出等のために使用することができる。
【0033】
さらに、本実施形態の検出方法は、上記感染症を発症させる微生物の型の判定(ジェノタイピング)に用いることもできる。たとえば、C型肝炎ウイルスの1a、1b、2a、2b、3a、3b、およびヒトパピローマウイルスの癌化に関連している16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、54、56、58、59、66、68、69、および癌化に関連していない6、11、34、40、42、43、44、70などである。さらに、薬剤耐性遺伝子を検出することもでき、たとえば、結核菌、エイズウイルス、および呼吸器感染症起因菌の薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、遺伝性疾患、網膜芽細胞腫、ウイルス腫瘍、家族性大腸ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、神経腺維腫症、家族性乳ガン、色素性乾皮症、脳腫瘍、口腔癌、食道癌、胃ガン、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺ガン、甲状腺腫瘍、乳腺腫瘍、泌尿器腫瘍、男性器腫瘍、女性器腫瘍、皮膚腫瘍、骨・軟部腫瘍、白血病、リンパ腫、および固形腫瘍などの腫瘍性疾患を検査することができる。また、医療以外にも、食品検査、検疫、医薬品検査、法医学、農業、畜産、漁業、林業などで遺伝子検査が必要なものに全て適応できる。さらに、制限酵素断片多系(RFLP)や1塩基多型(SNPs)、マイクロサテライト配列などの検出もできる。また、未知の塩基配列解析に用いることもできる。
【0034】
(4)検出の手順
試料に含まれる核酸を検出するためには、まず該試料から核酸成分の抽出を行い、核酸サンプルを得る。抽出方法は特に限定されないが、たとえばフェノール−クロロホルム法などの液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、QIAamp(QIAGEN社製)、スマイテスト(住友金属社製)などの市販の核酸抽出方法を利用することもできる。これらの試料をマイクロタイタープレートなどに分注して、遺伝子検出に供される。遺伝子の抽出の際、疎水性膜を保持したマイクロタイタープレートなどを用いると、より簡便に検出操作に移行することができる。抽出した核酸は、適切な溶液に溶解しておくことが好ましい。
【0035】
核酸とプローブ固定化領域に固定されたプローブとでハイブリダイゼーション反応を際は、反応溶液として、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。反応溶液中には、ハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、サケ精子DNA、牛胸腺DNA、EDTA、および界面活性剤などを添加することができる。さらに、塩濃度調整用試薬や、ポジティブコントロール用試薬などを添加することができる。また、場合によっては前処理として核酸増幅反応を行ってもよい。核酸増幅反応はPCR法、LAMP法、ICAN法など、特に限定されない。次に、抽出した核酸を反応溶液に添加し、90℃以上で熱変性させる。核酸を含む反応溶液とプローブ固定化電極の接触は、変性直後または0℃に急冷後に行うこともできる。反応中は、撹拌または振とうなどの操作によって反応速度を高めることもできる。反応温度は、10℃〜90℃の範囲で、また反応時間は、1分以上1晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、プローブ固定化領域の洗浄を行う。洗浄には、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いる。このとき、核酸を含む反応溶液中に、核酸サンプル識別用試薬を予め添加しておく。核酸サンプル識別用試薬には、ポジティブコントロール用核酸プローブ、ネガティブコントロール用核酸プローブに応じた組成が含まれる。
【0036】
洗浄後、ハイブリダイゼーションの有無を検出する。検出の手法は特に限定されることなく、上述したとおり、蛍光色素による蛍光強度による検出や、放射性同位元素を用いた検出、挿入剤分子の電気化学応答を用いた検出、静電容量変化による検出などを用いることができる。
【0037】
本実施形態の検出方法によれば、該基板に形成された反応用ウェル毎に異なる検体に由来する試料を使用して、同時に複数の試料における核酸鎖の存在を検出することができる。
【0038】
また、上記核酸反応および核酸検出は自動化することができる。自動化することにより、ハンドリングなどに起因する検査毎のバラつきを少なくすることができる。自動検査装置は、抽出反応、増幅反応、ハイブリダイゼーション反応、洗浄反応などの反応温度を制御する温度制御系を備えることができる。温度制御系はペルティエ素子を利用したもの、電熱ヒーターを利用したものなどが使用できる。また、自動検査装置は各試薬を送液するための送液系を備えることができる。送液系は、ポンプ、配管、流速モニタ、脱気機構、気液検知モニタなどが使用できる。また、自動検査装置は二本鎖核酸、一本鎖核酸を検出するための検出系を備えることができる。検出系は、検出方式により様々だが、蛍光検出方式では、レーザー照射装置、CCDカメラなどが使用できる。電流検出方式では、2電極式もしくは3電極式の電流電圧制御装置が使用できる。また、自動検査装置は、得られた信号を元に自動判定を行う信号処理系を備えることができる。予めコンピュータに内蔵されたデータベースと閾値などを利用し、得られた信号を元にサンプル核酸の配列決定、あるいは目的核酸の有無などを判定することができる。上記自動化装置は一度に複数の核酸サンプル検出用デバイスを処理することができる。また、装置は1台で全工程を行うこともできるし、複数台で工程を分担することもできる。
【0039】
<本発明の実施態様>
以下、図面を用いて本発明の実施態様について説明する。なお、以下に示す実施態様は、本発明の構成を詳細に説明するために例示的に示したものに過ぎない。従って、本発明は、以下の実施態様に記載された説明に基づいて限定解釈されるべきではない。本発明の範囲には、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内にある限り、以下の実施態様の種々の変形、改良形態を含む全ての実施態様が含まれる。
【0040】
(1)第1の実施態様
図1
図1は、第1の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス11を示した模式図である。核酸サンプル検出用デバイス11は、基板16と、基板上に複数形成された核酸プローブ固定化領域と、前記核酸プローブ固定化領域を仕切るための枠17を備えることを特徴とする。前記枠17は、少なくとも1以上のウェル12を形成し、各ウェルが1核酸サンプルを検出するための1検査レーンを構成し、検査対象となる核酸プローブが固定化された検出核酸プローブ固定化領域13が各ウェル12中にそれぞれ形成されている。
【0041】
第1〜第nのウェル121−nには、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルを注入するための注入ポート151−n(以下、第1〜第nの注入ポート151−nともいう)が備え付けられている。第1のウェル121は、第1の核酸サンプルを検出するためのウェルであり、第k(kは2以上の自然数)のウェル12kは、第kの核酸サンプルを検出するためのウェルである。
【0042】
ここで、第1のウェル121は、第1の核酸サンプルを検出するための検出核酸プローブ固定化領域131(以下、第1の検出核酸プローブ固定化領域131ともいう)と、第1の核酸サンプルを識別するためのポジティブコントロール固定化領域141(以下、第1のポジティブコントロール固定化領域141ともいう)とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェル12kは、第kの核酸サンプルを検出するための核酸プローブ固定化領域13k(以下、第kの検出核酸プローブ固定化領域13kともいう)、第kの核酸サンプルを識別するためのポジティブコントロール固定化領域14k(以下、第kのポジティブコントロール固定化領域14kともいう)とを含む。該構成を備える核酸サンプル検出用デバイス11は、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出することができる。
【0043】
図1では、例示的に第1〜第4(n=4)の核酸サンプル(核酸サンプルS1〜S4)を検出することができる、核酸サンプル検出用デバイス11を示した。第1〜第4のウェル121−4には、それぞれ第1〜第4の核酸サンプルを注入するための第1〜第4の注入ポート151−4が備え付けられている。
【0044】
「ポジティブコントロール固定化領域」には、それぞれ異なる識別用の核酸プローブが固定されている。例えば、第1のポジティブコントロール固定化領域141には、第1のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC1が固定され、第2のポジティブコントロール固定化領域142には、第2のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC2が固定され、第3のポジティブコントロール固定化領域143には、第3のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC3が固定され、第4のポジティブコントロール固定化領域144には、第4のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC4が固定される。
【0045】
「検出核酸プローブ固定化領域」には、検出対象となる1以上の標的配列に相補的な核酸プローブが、それぞれ独立した領域に固定されている。例えば検出対象となる標的配列が2以上ある場合は、検出核酸プローブ固定化領域は、2以上の独立した固定化領域を備え、各固定化領域には、それぞれ1つの標的配列に相補的な核酸プローブが固定されている。図1では、検出対象となる標的配列が4つある場合を例示しており、各ウェル中の検出用の核酸プローブ固定化領域は、それぞれ4つの独立した固定化領域を備え、各固定化領域には、それぞれ1つの標的配列に相補的な核酸プローブD1、D2、D3、およびD4が固定されている。なお、ここで「標的配列」とは、例えば検査対象となる疾患遺伝子の少なくとも1部分と相補的な配列を有することを意味する。一般的には、検査対象となる遺伝子の特徴的な配列部位に着目し、この配列部位に相補的な配列を含む核酸プローブを設計し、これを検出核酸プローブ固定化領域に固定することによって検出が行われる。
【0046】
図2
図2は、図1に示した核酸サンプル検出用デバイス11を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図である。
【0047】
第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する。第1の核酸サンプル識別用試薬は、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1に相補的な配列を有する、「第1のポジティブコントロール用核酸」を含む。第k(kは2〜nの自然数)の核酸サンプル識別用試薬は、第kのポジティブコントロール固定化領域14kに固定された核酸プローブC(k)に相補的な配列を有する、第kのポジティブコントロール用核酸を含む。該成分を含む第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬が添加された第1〜第nの核酸サンプルを、第1〜第nのウェル中に備えられた第1〜第nの注入ポート151−nからそれぞれ注入することによって、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域141−nにおけるハイブリダイゼーション反応が生じるため、これを検出することにより、第1〜第nの核酸サンプルにおける検体の取り違えがなかったことを確認することができる。
【0048】
図2では、第1の核酸サンプル識別用試薬(試薬1)が第1の核酸サンプル(サンプルS1)中に添加され(図2a)、第2の核酸サンプル識別用試薬(試薬2)が第2の核酸サンプル(サンプルS2)中に添加される(図2b)。同様に、第3の核酸サンプル識別用試薬(試薬3)が第3の核酸サンプル(サンプルS3)中に添加され、第4の核酸サンプル識別用試薬(試薬4)が第4の核酸サンプル(サンプルS4)中に添加される。
【0049】
第1の核酸サンプル識別用試薬(試薬1)は、第1のポジティブコントロール(PC)固定化領域141に固定された核酸プローブC1と相補的な配列を有する核酸T1を含み(図2(a))、第2の核酸サンプル識別用試薬(試薬2)は、第2のポジティブコントロール(PC)固定化領域142に固定された核酸プローブC2と相補的な配列を有する核酸T2を含む(図2(b))。同様に、第3の核酸サンプル識別用試薬(試薬3)は、第3のポジティブコントロール固定化領域143に固定された核酸プローブC3と相補的な配列を有する核酸T3を含み、第4の核酸サンプル識別用試薬(試薬4)は、第4のポジティブコントロール固定化領域144に固定された核酸プローブC4と相補的な配列を有する核酸T4を含む。
【0050】
第1〜第4の核酸サンプル識別用試薬(試薬1〜4)を添加された第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)は、それぞれ第1〜第4のウェル141〜144に注入される。各サンプルの注入は、第1〜第4のウェル141〜144に備え付けられた第1〜第4の注入ポート151〜154を使用して行われる。例えば、第1の核酸サンプル識別用試薬(試薬1)を添加された第1の核酸サンプルが第1のウェル121に注入された場合、試薬1に含まれる核酸T1が、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1とハイブリダイズする(図2(a))。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号を検出することができる。逆に、第1の核酸サンプルが誤って第2のウェル122に注入された場合、試薬1に含まれる核酸T1は、第2のポジティブコントロール固定化領域142に固定された核酸プローブC2とハイブリダイズすることができない。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号を検出することができず、検体の取り違えがあったことを確実かつ容易に確認することができる。
【0051】
(2)第2の実施態様
図3
図3は、第2の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス31を示した模式図である。第2の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス31は、各ウェル中にポジティブコントロール固定化領域141−nの他に、第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域321−nを含む。
【0052】
第1のネガティブコントロール固定化領域321は、(n−1)個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC2〜Cnがそれぞれ独立して固定され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域32kは、(n−1)個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第kのポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC(k)を除く、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC1〜Cnがそれぞれ独立して固定されている。
【0053】
図3では、例示的に第1〜第4(n=4)の核酸サンプルを検出することができる、核酸サンプル検出用デバイス31を示した。第1のネガティブコントロール固定化領域321は、3つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第2、第3および第4のポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC2、C3およびC4がそれぞれ独立して固定され、第2のネガティブコントロール固定化領域322は、3つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第1、第3および第4のポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1、C3およびC4がそれぞれ独立して固定され、第3のネガティブコントロール固定化領域323は、3つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第1、第2および第4のポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1、C2およびC4がそれぞれ独立して固定され、第4のネガティブコントロール固定化領域324は、3つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第1、第2および第3のポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1、C2およびC3がそれぞれ独立して固定されている。
【0054】
図4
図4は、図3に示した核酸サンプル検出用デバイス31を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図である。第2の実施態様の第1の実施態様との相違は、各ウェル中にネガティブコントロールを配置したことにより、核酸サンプルの取り違えのみならず、核酸サンプル中への他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)の有無を検出することができることにある。
【0055】
第1の実施態様と同様、第1〜第4の核酸サンプル識別用試薬(試薬1〜4)を添加された第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)を、それぞれ第1〜第4のウェル121〜124に注入する。各サンプルの注入は、第1〜第4のウェル121〜124に備え付けられた第1〜第4の注入ポート151〜154を使用して行われる。例えば、第1の核酸サンプル識別用試薬(試薬1)を添加された第1の核酸サンプルが第1のウェル121に注入された場合、試薬1に含まれる核酸T1が、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1とハイブリダイズする(図4(a))。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号を検出することができる。一方、試薬1に含まれる核酸T1は、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブC2、C3およびC4にはいずれもハイブリダイズしない(図4(b))。その結果、第1のネガティブコントロール固定化領域321からは信号が検出されず、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)が無かったことを確認することができる。
【0056】
逆に、第1のネガティブコントロール固定化領域321から信号が検出された場合、他の核酸サンプルの混入を検出することができる。例えば、第2の核酸サンプル識別用試薬(試薬2)を添加した第2の核酸サンプル(サンプルS2)が、第1の核酸サンプル(サンプルS1)に混入した場合(図4(c))、第1の核酸サンプル(サンプルS1)中には、試薬2に含まれる核酸T2が混入しているので、核酸T2が、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブC2とハイブリダイズする(図4(d))。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号が検出され、他の核酸の混入(コンタミネーション)があったことを検出することができる。第2の実施態様では、各核酸サンプルの取り違えの有無を検出できるとともに、コンタミネーションの有無も検出することができるので、より安全性および信頼性の高い検出方法を提供することができる。
【0057】
(3)第3の実施態様
図5
図5は、第3の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス51を示した模式図である。第3の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス51は、第2の実施形態においては複数設けられていた各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域が、1つの固定化領域で構成されていることを特徴とする。
【0058】
第1のネガティブコントロール固定化領域は、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC2〜C(n)と同一配列の核酸プローブがともに固定され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域は、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第kのポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC(k)を除く、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブと同一配列の核酸プローブがともに固定されている。
【0059】
図5では、例示的に第1〜第4(n=4)の核酸サンプルを検出することができる、核酸サンプル検出用デバイス51を示した。第1のネガティブコントロール固定化領域321は、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第2、第3および第4のポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC2、C3およびC4がともに固定され、第2のネガティブコントロール固定化領域322は、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第1、第3および第4のポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC1、C3およびC4がともに固定され、第3のネガティブコントロール固定化領域323は、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第1、第2および第4のポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC1、C2およびC4がともに固定され、第4のネガティブコントロール固定化領域324は、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第1、第2および第3のポジティブコントロール固定化領域に固定された各核酸プローブC1、C2およびC3がともに固定されている。
【0060】
図6
図6は、図5に示したネガティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを示した模式図である。第3の実施態様の第2の実施態様との相違は、ネガティブコントロール固定化領域が1つの領域で構成されていることにある。ネガティブコントロールはポジティブコントロールとは異なり、核酸サンプル数が増加するにつれてネガティブコントロールとして必要な核酸プローブ数が増える。1つの固定化領域に複数の核酸プローブを一緒に固定すれば、核酸サンプル数が増加してもネガティブコントロール固定化領域の数を増加させる必要がなくなり、サンプル数の増減に関わらず、基板上に検査項目のための十分なスペースを恒常的に確保することができる。
【0061】
複数のネガティブコントロールを1つの領域に配置する場合、その配置の態様には、例えば、ネガティブコントロールを構成する複数種の核酸プローブを並列的に固定化したタイプ(図6(a))、複数種の核酸プローブを直列的に接合した核酸鎖を固定化したタイプ(図6(b))、また、複数種の核酸プローブを直列的に接合した核酸鎖であって、各核酸プローブの端部を他の核酸プローブの端部と重なり合うように配置するタイプ(図6(c))などがある。複数種の核酸プローブを並列的に混在させたタイプ(図6(a))では、ネガティブコントロール数が増加した場合、2つまたは3つの領域に分割して固定してもよい。例えば、ネガティブコントロールが8種類の核酸プローブで構成される場合、4種類ずつを混合して2つの領域に固定する、あるいはネガティブコントロールが9種類の核酸プローブで構成される場合、3種類ずつを混合して3つの領域に固定する、などである。ネガティブコントロール数がさらに増加した場合は、さらに4つ、5つ、またはそれ以上の領域に分割して固定してもよい。
【0062】
検査基板の小型化が進む現在、各検査スポットも微小化の傾向にある。また、同時にサンプル数の一層の増加も予想される。サンプル数の増加は、ネガティブコントロール数の増加を意味するが、将来的に実現が予想されるような極微小領域上に数多くのネガティブコントロールを並列的に混在させた場合(図6(a))、1つ1つのネガティブコントロールの固定量が少なくなり、結果として十分なシグナルを検出することができなくなるおそれがある。しかしながら、複数種の核酸プローブを直列的に接合し、空間的展開をすることによって(図6(b))、1つ1つのネガティブコントロールの固定量を維持することができる。これによって将来的に実現が予想されるような極微小領域であっても数多くのネガティブコントロールを1つの領域に固定することができる。また、直列に接合するに際し、各核酸プローブの端部を他の核酸プローブの端部と重なり合うように配置することによって、直列接合に伴う核酸プローブの長さの増大を抑制することができ(図6(c))、特にサンプル数が増加した場合に有効である。
【0063】
図7
図7は、図5に示した核酸サンプル検出用デバイス51を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図である。第3の実施態様の第2の実施態様との相違は、ネガティブコントロール固定化領域が1つの領域で構成されていることにある。ネガティブコントロール固定化領域を1つにすることによってネガティブコントロールに必要な基板上のスペースを著しく節約することができ、その効果は、サンプル数が増えれば増えるほど顕著になる。
【0064】
第2の実施態様と同様、第1〜第4の核酸サンプル識別用試薬(試薬1〜4)を添加された第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)を、それぞれ第1〜第4のウェル121〜124に注入する。各サンプルの注入は、第1〜第4のウェル121〜124に備え付けられた第1〜第4の注入ポート151〜154を使用して行われる。例えば、第1の核酸サンプル識別用試薬(試薬1)を添加された第1の核酸サンプルが第1のウェル121に注入された場合、試薬1に含まれる核酸T1が、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1とハイブリダイズする(図7a)。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号を検出することができる。一方、試薬1に含まれる核酸T1は、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブC2、C3およびC4にはいずれもハイブリダイズしない(図7b)。その結果、第1のネガティブコントロール固定化量領域321からは信号が検出されず、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)が無かったことを確認することができる。図7では、ネガティブコントロールを構成する複数種の核酸プローブを混在して固定したタイプのネガティブコントロール固定化領域を示したが、複数種の核酸プローブを直列に接合して固定するタイプ(図6b)、複数種の核酸プローブを端部を重ねながら直列に接合して固定するタイプ(図6c)、いずれのタイプのネガティブコントロール固定化領域であってもよい。
【0065】
逆に、第1のネガティブコントロール固定化領域321から信号が検出された場合、他の核酸サンプルの混入を検出することができる。例えば、第2の核酸サンプル識別用試薬(試薬2)を添加した第2の核酸サンプル(サンプルS2)が、第1の核酸サンプル(サンプルS1)に混入した場合(図7c)、第1の核酸サンプル中には、試薬2に含まれる核酸T2が混入しているので、核酸T2が、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブC2とハイブリダイズする(図7d)。その結果、形成されたハイブリッド鎖に由来した信号が検出され、他の核酸の混入(コンタミネーション)があったことを検出することができる。
【0066】
第3の実施態様では、第2の実施態様と同様、各核酸サンプルの取り違えの有無を検出できるとともに、コンタミネーションの有無も検出することができるので、より安全性および信頼性の高い検出方法を提供することができる。さらに、第3の実施態様は、ネガティブコントロール固定化領域に固定される核酸プローブを1つの領域にまとめて固定しているので、核酸サンプル数が増えてもネガティブコントロール固定化領域の数を増加させる必要がない。このため、検出基板の大部分の領域を検査項目のために割り当てることができ、検査項目数の多い核酸サンプルの検出であっても小型の検出基板において一度に大量に検査することができる。
【0067】
(4)第4の実施態様
図8
図8は、第4の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス81を示した模式図である。第4の実施態様の特徴は、ポジティブコントロール用の試薬(「ポジティブコントロール判定用試薬」)と共に、ネガティブコントロール用の新たな試薬を調製し、この「ネガティブコントロール判定用試薬」を混合して他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)の有無を検出する点にある。
【0068】
装置の基本的構成は、第1〜第3の実施態様と同様である。すなわち、核酸サンプル検出用デバイス81は、第1〜第nの核酸サンプルを注入するための注入ポート151−nがそれぞれ備え付けられた、第1〜第nのウェル121−nを備える。
【0069】
ここで、第1のウェル121は、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域131と、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域141と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール固定化領域321とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェル12kは、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域13kと、第kの核酸サンプルを識別するためのポジティブコントロール固定化領域14kと、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域32kとを含む。
【0070】
第1の核酸サンプルには、第1のポジティブコントロール判定用試薬と、第1のネガティブコントロール判定用試薬とが添加される。第1のポジティブコントロール判定用試薬は、第1〜第3の実施形態において説明した第1の核酸サンプル識別用試薬と同様であり、「第1のポジティブコントロール用核酸」、つまり、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1と相補的な配列を有する核酸T1を含む。一方、第1のネガティブコントロール判定用試薬は、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域322−nに固定された核酸プローブH2〜H(n)とそれぞれ相補的な配列を有する核酸U2〜U(n)を含む。
【0071】
同様に、第kの核酸サンプルには、第kのポジティブコントロール判定用試薬と、第kのネガティブコントロール判定用試薬とが添加される。第kのポジティブコントロール判定用試薬は、第kのポジティブコントロール固定化領域14kに固定された核酸プローブC(k)と相補的な配列を有する核酸T(k)を含む。一方、第kのネガティブコントロール判定用試薬は、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域32kに固定された核酸プローブH(k)と相補的な配列を有する核酸U(k)を除く、第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域321−nに固定された核酸プローブH1〜H(n)とそれぞれ相補的な配列を有する核酸U1〜U(n)を含む。
【0072】
上述した第1〜第nのポジティブコントロール判定用試薬と、第1〜第nのネガティブコントロール判定用試薬を使用することによって、各ネガティブコントロール固定化領域に固定する核酸プローブを1種類に限定することができる。なお、ポジティブコントロール判定用試薬およびネガティブコントロール判定用試薬は、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、「核酸サンプル識別用試薬」としてもよい。また、「核酸サンプル識別用試薬」には、任意の添加剤、例えば塩濃度調整用バッファなどが含まれていてもよい。
【0073】
図8では、例示的に第1〜第4(n=4)の核酸サンプル(核酸サンプルS1〜S4)を検出することができる、核酸サンプル検出用デバイス81を示した。第1〜第4のウェル121−4には、それぞれ第1〜第4の核酸サンプルを注入するための注入ポート151−4が備え付けられている。
【0074】
「ポジティブコントロール固定化領域」には、それぞれ異なる識別用の核酸プローブC1〜C4が固定されている。例えば、第1のポジティブコントロール固定化領域141には、第1のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC1が固定され、第2のポジティブコントロール固定化領域142には、第2のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC2が固定され、第3のポジティブコントロール固定化領域143には、第3のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC3が固定され、第4のポジティブコントロール固定化領域144には、第4のポジティブコントロールを構成する核酸プローブC4が固定される。
【0075】
「ネガティブコントロール固定化領域」には、「ポジティブコントロール固定化領域」に固定された核酸プローブC1〜C4とは異なる識別用の核酸プローブH1〜H4が固定されている。例えば、第1のネガティブコントロール固定化領域141には、第1のネガティブコントロールを構成する核酸プローブH1が固定され、第2のネガティブコントロール固定化領域142には、第2のネガティブコントロールを構成する核酸プローブH2が固定され、第3のネガティブコントロール固定化領域143には、第3のネガティブコントロールを構成する核酸プローブH3が固定され、第4のネガティブコントロール固定化領域144には、第4のポジティブコントロールを構成する核酸プローブH4が固定される。
【0076】
第1〜第4のポジティブコントロール判定用試薬(試薬1A〜4A)は第1〜第3の実施形態において説明した第1〜第4の核酸サンプル識別用試薬と同様である。
【0077】
次に、第1〜第4のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B〜4B)について説明する。
【0078】
先ず、第1のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B)は、第1の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬1Bは、第2のネガティブコントロール(NC)固定化領域322に固定された核酸プローブH2と相補的な配列を有する「核酸U2」、第3のネガティブコントロール(NC)固定化領域323に固定された核酸プローブH3と相補的な配列を有する「核酸U3」、第4のネガティブコントロール(NC)固定化領域324に固定された核酸プローブH4と相補的な配列を有する「核酸U4」、以上3つの核酸U2、U3、U4を含む試薬である。
【0079】
第1のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B)は、第1のポジティブコントロール判定用試薬(試薬1A)とともに第1の核酸サンプル(サンプルS1)中に添加される。なお、試薬1Aおよび試薬1Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬1E」としてもよい。
【0080】
次に、第2のネガティブコントロール判定用試薬(試薬2B)は、第1の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬2Bは、第1のネガティブコントロール(NC)固定化領域321に固定された核酸プローブH1と相補的な配列を有する「核酸U1」、第3のネガティブコントロール(NC)固定化領域323に固定された核酸プローブH3と相補的な配列を有する「核酸U3」、第4のネガティブコントロール(NC)固定化領域324に固定された核酸プローブH4と相補的な配列を有する「核酸U4」、以上3つの核酸U1、U3、U4を含む試薬である。
【0081】
第2のネガティブコントロール判定用試薬(試薬2B)は、第2のポジティブコントロール判定用試薬(試薬2A)とともに第2の核酸サンプル(サンプルS2)中に添加される。なお、試薬2Aおよび試薬2Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬2E」としてもよい。
【0082】
続いて、第3のネガティブコントロール判定用試薬(試薬3B)は、第1の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬3Bは、第1のネガティブコントロール(NC)固定化領域321に固定された核酸プローブH1と相補的な配列を有する「核酸U1」、第2のネガティブコントロール(NC)固定化領域322に固定された核酸プローブH2と相補的な配列を有する「核酸U2」、第4のネガティブコントロール(NC)固定化領域324に固定された核酸プローブH4と相補的な配列を有する「核酸U4」、以上3つの核酸U1、U2、U4を含む試薬である。
【0083】
第3のネガティブコントロール判定用試薬(試薬3B)は、第3のポジティブコントロール判定用試薬(試薬3A)とともに第3の核酸サンプル(サンプルS3)中に添加される。なお、試薬3Aおよび試薬3Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬3E」としてもよい。
【0084】
最後に、第4のネガティブコントロール判定用試薬(試薬4B)は、第1の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬4Bは、第1のネガティブコントロール(NC)固定化領域321に固定された核酸プローブH1と相補的な配列を有する「核酸U1」、第2のネガティブコントロール(NC)固定化領域322に固定された核酸プローブH2と相補的な配列を有する「核酸U2」、第3のネガティブコントロール(NC)固定化領域323に固定された核酸プローブH3と相補的な配列を有する「核酸U3」、以上3つの核酸U1、U2、U3を含む試薬である。
【0085】
第4のネガティブコントロール判定用試薬(試薬4B)は、第4のポジティブコントロール判定用試薬(試薬4A)とともに第4の核酸サンプル(サンプルS4)中に添加される。なお、試薬4Aおよび試薬4Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬4E」としてもよい。
【0086】
図9
図9は、図8に示した核酸サンプル検出用デバイス81を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図である。
【0087】
試薬1Aおよび1Bを添加された第1の核酸サンプル(サンプルS1)を、注入ポート151を介してウェル121に注入する。このとき、試薬1Aに含まれる核酸T1は、ポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1にハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される(図9a)。一方、試薬1Bに含まれる核酸U2、U3、U4は、いずれもネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1とハイブリダイズすることができないので、ネガティブコントロール固定化領域においては信号が検出されない(図9b)。
【0088】
同様に、試薬2Aおよび2Bを添加された第1の核酸サンプル(サンプルS2)を、注入ポート152を介してウェル122に注入する。このとき、試薬2Aに含まれる核酸T2は、ポジティブコントロール固定化領域142に固定された核酸プローブC2にハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される(図9c)。一方、試薬2Bに含まれる核酸U1、U3、U4は、いずれもネガティブコントロール固定化領域322に固定された核酸プローブH2とハイブリダイズすることができないので、ネガティブコントロール固定化領域においては信号が検出されない(図9d)。以下、第3の核酸サンプル(サンプルS3)、第4の核酸サンプル(サンプルS4)についても同様の反応機構が成立する。
【0089】
ここで、第1の核酸サンプル(サンプルS1)に第2の核酸サンプル(サンプルS2)が混入(コンタミネーション)した場合について説明する(図9e)。サンプルS2がサンプルS1に混入した場合、サンプルS2に添加された試薬2B内に含まれる核酸U1が、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1とハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される(図9f)。ネガティブコントロール固定化領域321から信号が検出されたことによって、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)があったことを確認することができる。
【0090】
第4の実施態様では、ネガティブコントロール判定用試薬を新たに調製し、第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定される核酸プローブ数をそれぞれ1種類に限定したことに特徴がある。第4の実施態様では、核酸サンプル数が増加しても各ネガティブコントロール固定化領域に固定される核酸プローブ数はつねに1種類である。従って、核酸サンプル数の増減に伴うネガティブコントロール固定化領域の設計上の変更が不要であり、簡易かつ迅速に大量の核酸プローブ検出用デバイスを提供することができる。
【0091】
(5)第5の実施態様
図10
図10は、第5の実施態様における複数核酸の検出方法を示した模式図である。第5の実施態様の第4の実施態様との相違は、使用する「ネガティブコントロール判定用試薬」にある。第5の実施態様で使用するネガティブコントロール判定用試薬は、ネガティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブH1〜H(n)と、ポジティブコントロール判定用試薬に含まれる核酸T1〜T(n)とを直列に接合させるリンカー配列を有する核酸V1〜V(n)を含む。該リンカー配列を有する核酸V1〜V(n)(以下、単にリンカー配列V1〜V(n)ともいう)を使用することによって、ネガティブコントロールで形成されるハイブリダイズ鎖の長さが長くなるので、より高感度な検出が可能になる。
【0092】
第5の実施態様では、第4の実施態様と同様、図8に示した核酸サンプル検出用デバイス81を使用することができる。以下、第5の実施態様について、核酸サンプル検出用デバイス81を使用した、第1〜第4の核酸サンプルの検出方法を例にとって説明する。
【0093】
先ず、第1〜第4のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B〜4B)について説明する。
【0094】
第1のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B)は、第1の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬1Bは、核酸V2、V3、V4を含む試薬である。核酸V2は、その一端において、第2のネガティブコントロール固定化領域322に固定された核酸プローブH2と相補的な配列を有し、かつその他端において、第2のポジティブコントロール固定化領域142に固定された核酸プローブC2にハイブリダイズする「核酸T2」と相補的な配列を有する。核酸V3は、その一端において、第3のネガティブコントロール固定化領域323に固定された核酸プローブH3と相補的な配列を有し、かつその他端において、第3のポジティブコントロール固定化領域143に固定された核酸プローブC3にハイブリダイズする「核酸T3」と相補的な配列を有する。核酸V4は、その一端において、第4のネガティブコントロール固定化領域324に固定された核酸プローブH4と相補的な配列を有し、かつその他端において、第4のポジティブコントロール固定化領域144に固定された核酸プローブC4にハイブリダイズする「核酸T4」と相補的な配列を有する。
【0095】
第1のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B)は、第1のポジティブコントロール判定用試薬(試薬1A)とともに第1の核酸サンプル(サンプルS1)中に添加される。なお、試薬1Aおよび試薬1Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、例えば、「核酸サンプル識別用試薬1E」としてもよい。
【0096】
次に、第2のネガティブコントロール判定用試薬(試薬2B)は、第2の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬2Bは、核酸V1、V3、V4を含む試薬である。核酸V1は、その一端において、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1と相補的な配列を有し、かつその他端において、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1にハイブリダイズする「核酸T1」と相補的な配列を有する。核酸V3は、その一端において、第3のネガティブコントロール固定化領域323に固定された核酸プローブH3と相補的な配列を有し、かつその他端において、第3のポジティブコントロール固定化領域143に固定された核酸プローブC3にハイブリダイズする「核酸T3」と相補的な配列を有する。核酸V4は、その一端において、第4のネガティブコントロール固定化領域324に固定された核酸プローブH4と相補的な配列を有し、かつその他端において、第4のポジティブコントロール固定化領域144に固定された核酸プローブC4にハイブリダイズする「核酸T4」と相補的は配列を有する。
【0097】
第2のネガティブコントロール判定用試薬(試薬2B)は、第2のポジティブコントロール判定用試薬(試薬2A)とともに第2の核酸サンプル(サンプルS2)中に添加される。なお、試薬2Aおよび試薬2Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、「核酸サンプル識別用試薬2E」としてもよい。
【0098】
続いて、第3のネガティブコントロール判定用試薬(試薬3B)は、第3の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬3Bは、核酸V1、V2、V4を含む試薬である。核酸V1は、その一端において、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1と相補的な配列を有し、かつその他端において、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1にハイブリダイズする「核酸T1」と相補的な配列を有する。核酸V2は、その一端において、第2のネガティブコントロール固定化領域322に固定された核酸プローブH2と相補的な配列を有し、かつその他端において、第2のポジティブコントロール固定化領域142に固定された核酸プローブC2にハイブリダイズする「核酸T2」と相補的な配列を有する。核酸V4は、その一端において、第4のネガティブコントロール固定化領域324に固定された核酸プローブH4と相補的な配列を有し、かつその他端において、第4のポジティブコントロール固定化領域144に固定された核酸プローブC4にハイブリダイズする「核酸T4」と相補的は配列を有する。
【0099】
第3のネガティブコントロール判定用試薬(試薬3B)は、第3のポジティブコントロール判定用試薬(試薬3A)とともに第3の核酸サンプル(サンプルS3)中に添加される。なお、試薬3Aおよび試薬3Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、「核酸サンプル識別用試薬3E」としてもよい。
【0100】
最後に、第4のネガティブコントロール判定用試薬(試薬4B)は、第4の核酸サンプルに添加される試薬である。試薬4Bは、核酸V1、V2、V3を含む試薬である。核酸V1は、その一端において、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1と相補的な配列を有し、かつその他端において、第1のポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1にハイブリダイズする「核酸T1」と相補的な配列を有する。核酸V2は、その一端において、第2のネガティブコントロール固定化領域322に固定された核酸プローブH2と相補的な配列を有し、かつその他端において、第2のポジティブコントロール固定化領域142に固定された核酸プローブC2にハイブリダイズする「核酸T2」と相補的な配列を有する。核酸V3は、その一端において、第3のネガティブコントロール固定化領域323に固定された核酸プローブH3と相補的な配列を有し、かつその他端において、第3のポジティブコントロール固定化領域143に固定された核酸プローブC3にハイブリダイズする「核酸T3」と相補的は配列を有する。
【0101】
第4のネガティブコントロール判定用試薬(試薬4B)は、第4のポジティブコントロール判定用試薬(試薬4A)とともに第4の核酸サンプル(サンプルS4)中に添加される。なお、試薬4Aおよび試薬4Bは、独立した試薬としてもよいが、当初からまとめて調製し、「核酸サンプル識別用試薬4E」としてもよい。
【0102】
次に、第5の実施態様における検出機構について説明する。
【0103】
試薬1Aおよび1Bを添加された第1の核酸サンプル(サンプルS1)を、注入ポート151を介してウェル121に注入する。このとき、試薬1Aに含まれる核酸T1は、ポジティブコントロール固定化領域141に固定された核酸プローブC1にハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される(図10a)。一方、試薬1Bに含まれる核酸V2、V3、V4は、いずれもネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1とハイブリダイズすることができないので、ネガティブコントロール固定化領域においては信号が検出されない(図10b)。
【0104】
同様に、試薬2Aおよび2Bを添加された第1の核酸サンプル(サンプルS2)を、注入ポート152を介してウェル122に注入する。このとき、試薬2Aに含まれる核酸T2は、ポジティブコントロール固定化領域142に固定された核酸プローブC2にハイブリダイズし、該ハイブリッド鎖に由来する信号が検出される(図10c)。一方、試薬2Bに含まれる核酸V1、V3、V4は、いずれもネガティブコントロール固定化領域322に固定された核酸プローブH2とハイブリダイズすることができないので、ネガティブコントロール固定化領域においては信号が検出されない(図10d)。以下、第3の核酸サンプル(サンプルS3)、第4の核酸サンプル(サンプルS4)についても同様の反応機構が成立する。
【0105】
ここで、第1の核酸サンプル(サンプルS1)に第2の核酸サンプル(サンプルS2)が混入(コンタミネーション)した場合について説明する(図10e)。サンプルS2がサンプルS1に混入した場合、サンプルS2に添加された試薬2B中に含まれる核酸V1が、その一端において、第1のネガティブコントロール固定化領域321に固定された核酸プローブH1とハイブリダイズする。このとき、核酸V1の他端の一本鎖部分に、試薬1A中に含まれる核酸T1がハイブリダイズし、全体として長い二本鎖領域が形成される(図10f)。二本鎖領域を特異的に認識するような検出方法を採用した場合、例えば、電気化学的検出方法においては、長い二本鎖領域により多くの挿入剤が結合できるので、検出される電気量も多くなり、結果としてより高感度な検出が実現される。したがって、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)の有無をより正確かつ確実に検出することができる。
【0106】
図11
図10に示したネガティブコントロール判定用試薬のうち、第1のネガティブコントロール判定用試薬(試薬1B)を構成する核酸の態様を模式的に示した図である。
【0107】
試薬1Bには、試薬1Bに含まれる核酸V2、V3、V4を、それぞれ独立した核酸として調製するタイプ(図11a)、互いに直列に接合して1つの核酸として調製するタイプ(図11a)、および各核酸プローブの端部が他の核酸プローブの端部と重なり合うように互いに直列に接合することによって、配列の全長を短く設計したタイプ(図11c)がある。なお、当然ながら、第2〜第nのネガティブコントロール判定用試薬(試薬2B〜(n)B)についても同様のタイプがある。
【0108】
核酸サンプル数の増加に伴いネガティブコントロール判定用試薬に含まれる核酸の種類も増加する。各核酸試薬を直列に接合することにより(図11b)、独立した核酸の種類を減らすことができ、迅速かつ容易にネガティブコントロール判定用試薬を提供することができる。また、各核酸を直列に接合した場合、その端部を重ね合わせることにより(図11c)、各核酸の全長を短く設計することができ、特に、核酸サンプル数が増加した場合に有効である。
【0109】
(6)核酸サンプル検出用キット
上述した第1〜第5の実施態様において使用される核酸サンプル検出用キットを提供することができる。該核酸サンプル検出用キットには、第1〜第5の実施態様において使用される核酸サンプル検出用デバイスと、第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプル識別用試薬とが含まれる。核酸サンプル検出用デバイスの検出核酸プローブ固定化領域には、検査対象となる特定の疾患遺伝子に相補的な配列を有する核酸プローブが固定されており、複数の核酸サンプルをキットに含まれる核酸サンプル識別用試薬で処理後、核酸サンプル検出用デバイスに注入することによって、同時かつ迅速な検査結果を得ることができる。
【0110】
キットに含まれる核酸サンプル検出用デバイスは、1核酸サンプルを検出するための各検査レーンが1つの基板に一体に形成されていてもよいし、あるいは各検査レーンが独立した基体に形成されていてもよい。さらに、例えば、8つの核酸サンプルを検出するために4つの検査レーンを含む基板が2つ用意されていたり、9つの核酸サンプルを検出するために3つの検査レーンを含む基板が3つ用意されているものであってもよい。
【0111】
また、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬が、それぞれ独立した第1〜第nのポジティブコントロール判定用試薬と、第1〜第nのネガティブコントロール判定用試薬とで構成されてもよいし、任意の添加剤、例えば塩濃度調整用バッファなどが試薬として存在していてもよい。
【実施例】
【0112】
実施例1(第1の実施態様)
1.使用機器、使用材料等
(1)核酸検出用デバイス
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図1に示したとおりである。すなわち、1つのポジティブコントロール固定化領域と、1以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。本実施例では、図1に示したとおり、検出項目数を4とし、核酸プローブD1〜D4がそれぞれ独立して固定された、4つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。
【0113】
また、本実施例では、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。すなわち、各ウェルに形成された複数の核酸プローブ固定化領域は、いずれも金電極を備え、各固定化領域で形成された2本鎖核酸に由来した電気的信号を検出することができる。電気的信号は、2本鎖核酸に特異的に結合する挿入剤によって得ることができる。本実施例では、挿入剤として「ヘキスト33258」を使用した。
【0114】
(2)核酸プローブ
ポジティブコントロール固定化領域141−4に固定された核酸プローブC1〜C4の配列は、以下のとおりである。
C1: TTCAGTTATGTGGATGAT
C2: TCAGTTATGTCGATGATG
C3: TTTCAGTTATGTTGATGATGT
C4: TTTCAGTTATGTAGATGATG
検出核酸プローブ固定化領域131−4に固定された核酸プローブD1〜D4の配列は、以下のとおりである。
D1: ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA
D2: TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
D3: TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT
D4: AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。
【0115】
(3)判定用試薬
ポジティブコントロール判定試薬(試薬1〜4)に含まれる核酸T1〜T4の配列は、以下のとおりである。
試薬1(核酸T1(C1と相補的な配列)を含有)
試薬2(核酸T2(C2と相補的な配列)を含有)
試薬3(核酸T3(C3と相補的な配列)を含有)
試薬4(核酸T4(C4と相補的な配列)を含有)。
【0116】
(4)核酸サンプル
検出対象となる第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)の配列は、以下の配列を含む。
サンプルS1:(検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む)
サンプルS2:(検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む)
サンプルS3:(検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む)
サンプルS4:(検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む)
2.実験手順
第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬(試薬1〜4)を添加した。次に、サンプルS1〜S4を、それぞれ注入ポートを介して第1〜第4のウェルに注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第1〜第4の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図12に示した。
【0117】
次に、サンプルの入れ違えを模擬するため、S1とS2を故意に入れ替えて同様の検出を行った。電流値の測定結果を示したグラフを図13に示した。
【0118】
3.実験結果
図12は、サンプルS1〜S4のそれぞれについて検出された電流値を棒グラフで表わしたものである。S1〜S4は、第1〜第4の各核酸サンプルS1〜S4を意味する。ポジティブコントロール用プローブ(PCP)は、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された核酸プローブC1〜C4における電流値を示す。検出用プローブ(DP)は、検出核酸プローブ固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された4つの核酸プローブD1〜D4における電流値を示す。
【0119】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、核酸が2本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出される。逆に、2本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。なお、わずかながら電流値が検出される理由は、洗浄作業において完全に除去できなかった非特異的な吸着核酸によるものと考えられる。
【0120】
図12をみると、4つの全てのウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られており、各核酸サンプルの間で入れ間違えが無かったことを確認することができた。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、61nA、核酸サンプルS2では、72nA、核酸サンプルS3では、62nA、核酸サンプルS4では、69nAの電流値が検出された。
【0121】
そして、検出核酸プローブ固定化領域D1〜D4から得られた電流値から各核酸サンプルに含まれる核酸の配列を特定することができた。すなわち、核酸サンプルS1では、核酸プローブD1において82nAが検出され、核酸サンプルS1には核酸プローブD1に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルS2では、核酸プローブD2において62nAが検出され、核酸サンプルS2には核酸プローブD2に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルS3では、核酸プローブD3において73nAが検出され、核酸サンプルS3には核酸プローブD3に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらにまた、核酸サンプルS4では、核酸プローブD4において66nAが検出され、核酸サンプルS4には核酸プローブD4に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【0122】
次に図13をみると、第1のウェルと第2のウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られておらず、核酸サンプルの入れ違えが正しく確認できたことがわかった。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、19nA、核酸サンプルS2では、17nA、核酸サンプルS3では、70nA、核酸サンプルS4では、72nAの電流値が検出された。
【0123】
その他、核酸サンプルS3、S4については、サンプルの入れ違えが無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルS3では、核酸プローブD3において66nAが検出され、核酸サンプルS3には核酸プローブD3に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルS4では、核酸プローブD4において73nAが検出され、核酸サンプルS4には核酸プローブD4に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【0124】
実施例2(第2の実施態様)
1.使用機器、使用材料等
(1)核酸検出用デバイス
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図3に示したとおりである。すなわち、1つのポジティブコントロール固定化領域と、3つのネガティブコントロール固定化領域と、1以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。本実施例では、図3に示したとおり、検出項目数を4とし、核酸プローブD1〜D4がそれぞれ独立して固定された、4つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。また、本実施例では、実施例1と同様、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。
【0125】
(2)核酸プローブ、判定用試薬
いずれも、実施例1に示したとおりである。なお、実施例2では、ネガティブコントロール固定化領域321−4を使用する。ネガティブコントロール固定化領域321−4に固定された核酸プローブC1〜C4は、ポジティブコントロール固定化領域141−4に固定された核酸プローブC1〜C4と同一である。
【0126】
(3)核酸サンプル
検出対象となる第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)の配列は、以下の配列を含む。
サンプルS1:(検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む)
サンプルS2:(検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む)
サンプルS3:(検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む)
サンプルS4:(検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む)。
【0127】
2.実験手順
第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬(試薬1〜4)を添加した。次に、サンプルS1〜S4を、それぞれ注入ポートを介して第1〜第4のウェルに注入したが、サンプルの混入を模擬するため、第1のウェルにはS1とS2を故意に混合したサンプル(S1+S2)を注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第1〜第4の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、実施例1と同様、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図14に示した。
【0128】
3.実験結果
図13は、サンプルS1〜S4のそれぞれについて検出された電流値を棒グラフで表わしたものである。S1〜S4は、第1〜第4の各核酸サンプルS1〜S4を意味する。ポジティブコントロール用プローブ(PCP)は、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された核酸プローブC1〜C4における電流値を示す。ネガティブコントロール用プローブ(NCP)は、ネガティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された核酸プローブC1〜C4における電流値を示す。検出用プローブ(DP)は、検出核酸プローブ固定化領域に固定された核酸プローブを意味し、各ウェル中に固定された4つの核酸プローブD1〜D4における電流値を示す。
【0129】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、実施例1と同様、核酸が2本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出され、逆に、2本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。
【0130】
図14をみると、4つの全てのウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られており、各核酸サンプルの間で入れ間違えが無かったことを確認することができた。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、71nA、核酸サンプルS2では、66nA、核酸サンプルS3では、70nA、核酸サンプルS4では、73nAの電流値が検出された。
【0131】
また、第1のウェルにおいて、ネガティブコントロール用プローブ(NCP)から閾値以上の電流値が得られており、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)があったことを正しく確認することができた。
【0132】
その他、核酸サンプルS2、S3、S4については、サンプルの入れ違えが無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルS2では、核酸プローブD2において72nAが検出され、核酸サンプルS2には核酸プローブD2に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルS3では、核酸プローブD3において69nAが検出され、核酸サンプルS3には核酸プローブD3に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルS4では、核酸プローブD4において72nAが検出され、核酸サンプルS4には核酸プローブD4に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【0133】
実施例3(第3の実施態様)
1.使用機器、使用材料等
(1)核酸検出用デバイス
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図5に示したとおりである。すなわち、1つのポジティブコントロール固定化領域と、1つのネガティブコントロール固定化領域と、1以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。1つのネガティブコントロール固定化領域には、3種類の異なる核酸プローブが混在して固定されている。本実施例では、図5に示したとおり、検出項目数を4とし、核酸プローブD1〜D4がそれぞれ独立して固定された、4つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。また、本実施例では、実施例1および2と同様、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。
【0134】
(2)核酸プローブ、判定用試薬
いずれも、実施例1に示したとおりである。なお、実施例3では、ネガティブコントロール固定化領域321−4を使用する。ネガティブコントロール固定化領域321−4に固定された核酸プローブC1〜C4は、ポジティブコントロール固定化領域141−4に固定された核酸プローブC1〜C4と同一である。
【0135】
(3)核酸サンプル
検出対象となる第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)の配列は、以下の配列を含む。
サンプルS1:(検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む)
サンプルS2:(検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む)
サンプルS3:(検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む)
サンプルS4:(検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む)。
【0136】
2.実験手順
第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬(試薬1〜4)を添加した。次に、サンプルS1〜S4を、それぞれ注入ポートを介して第1〜第4のウェルに注入したが、サンプルの入れ違えを模擬するため、S3とS4を故意に入れ替えて注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第1〜第4の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、実施例1と同様、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図15に示した。
【0137】
3.実験結果
図15に示す各記号は、図14と同じである。なお、本実施例では、1つのポジティブコントロール固定化領域に3種類の核酸プローブが混在して固定されている。
【0138】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、実施例1および2と同様、核酸が2本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出され、逆に、2本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。
【0139】
図15をみると、第3のウェルと第4のウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られておらず、核酸サンプルの入れ違えが正しく確認できたことがわかった。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、62nA、核酸サンプルS2では、68nA、核酸サンプルS3では、22nA、核酸サンプルS4では、25nAの電流値が検出された。
【0140】
また、第3のウェルと第4のウェルにおいて、ネガティブコントロール用プローブ(NCP)から閾値以上の電流値が得られており、この結果からも核酸サンプルの入れ違えが正しく確認できたことがわかった。
【0141】
その他、核酸サンプルS1、S2については、コンタミネーションが無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルS1では、核酸プローブD1において65nAが検出され、核酸サンプルS1には核酸プローブD1に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルS2では、核酸プローブD2において72nAが検出され、核酸サンプルS2には核酸プローブD2に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【0142】
実施例4(第4の実施態様)
1.使用機器、使用材料等
(1)核酸検出用デバイス
本実施例では、実施例1〜3で使用したポジティブコントロール用判定試薬1A〜4Aの他に、ネガティブコントロール用判定試薬1B〜4Bを使用して、検体の取り違えやコンタミネーションの有無を検出する。
【0143】
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図8に示したとおりである。すなわち、1つのポジティブコントロール固定化領域と、1つのネガティブコントロール固定化領域と、1以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。1つのネガティブコントロール固定化領域には、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1〜C4とは異なる、核酸プローブH1〜H4が固定されている。核酸プローブH1〜H4は、ネガティブコントロールコントロール用の試薬1B〜4Bによって検出する。本実施例では、図8に示したとおり、検出項目数を4とし、核酸プローブD1〜D4がそれぞれ独立して固定された、4つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。また、本実施例では、実施例1〜3と同様、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。
【0144】
(2)核酸プローブ
ポジティブコントロール固定化領域141−4に固定された核酸プローブC1〜C4の配列は、以下のとおりである(実施例1と同じ)。
C1: TTCAGTTATGTGGATGAT
C2: TCAGTTATGTCGATGATG
C3: TTTCAGTTATGTTGATGATGT
C4: TTTCAGTTATGTAGATGATG
ネガティブコントロール固定化領域321−4に固定された核酸プローブH1〜H4の配列は、以下のとおりである。
H1: TCCGGGCGCAGAAAC
H2: GTGCTGCAGGTGCG
H3: CGTGATGACACCAAG
H4: ATGCTTTCCGTGGCA
検出核酸プローブ固定化領域131−4に固定された核酸プローブD1〜D4の配列は、以下のとおりである(実施例1と同じ)。
D1: ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA
D2: TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
D3: TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT
D4: AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。
【0145】
(3)判定用試薬
ポジティブコントロール判定試薬(試薬1A〜4A)に含まれる核酸T1〜T4の配列は、以下のとおりである。
試薬1A(核酸T1(C1と相補的な配列)を含有)
試薬2A(核酸T2(C2と相補的な配列)を含有)
試薬3A(核酸T3(C3と相補的な配列)を含有)
試薬4A(核酸T4(C4と相補的な配列)を含有)
ネガティブコントロール判定試薬(試薬1B〜4B)に含まれる核酸V1〜V4の配列は、以下のとおりである。
試薬1B(核酸U1(H1と相補的な配列)を含有)
試薬2B(核酸U2(H2と相補的な配列)を含有)
試薬3B(核酸U3(H3と相補的な配列)を含有)
試薬4B(核酸U4(H4と相補的な配列)を含有)。
【0146】
(4)核酸サンプル
検出対象となる第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)の配列は、以下の配列を含む。
【0147】
サンプルS1:(検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む)
サンプルS2:(検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む)
サンプルS3:(検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む)
サンプルS4:(検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む)
2.実験手順
第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬(試薬1A〜4A)およびネガティブコントロール判定試薬(試薬1B〜4B)を添加した。次に、サンプルS1〜S4を、それぞれ注入ポートを介して第1〜第4のウェルに注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第1〜第4の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、実施例1と同様、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図16に示した。
【0148】
次に、サンプルの入れ違えを模擬するため、S1とS2を故意に入れ替えて同様の検出を行った。電流値の測定結果を示したグラフを図17に示した。
【0149】
3.実験結果
図16に示す各記号は、図14および15と同じである。なお、本実施例のネガティブコントロール固定化領域には、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1〜C4とは異なる、核酸プローブH1〜H4が固定されている。
【0150】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、実施例1〜3と同様、核酸が2本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出され、逆に、2本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。
【0151】
図16をみると、4つの全てのウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られており、各核酸サンプルの間で入れ間違えが無かったことを確認することができた。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、60nA、核酸サンプルS2では、72nA、核酸サンプルS3では、68nA、核酸サンプルS4では、71nAの電流値が検出された。
【0152】
また、4つの全てのウェルにおいて、ネガティブコントロール用プローブ(NCP)から閾値40nA以上の電流値が得られなかったことから、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)も無かったことを確認することができた。
【0153】
そして、検出核酸プローブ固定化領域D1〜D4から得られた電流値から各核酸サンプルに含まれる核酸の配列を特定することができた。すなわち、核酸サンプルS1では、核酸プローブD1において56nAが検出され、核酸サンプルS1には核酸プローブD1に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルS2では、核酸プローブD2において67nAが検出され、核酸サンプルS2には核酸プローブD2に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルS3では、核酸プローブD3において56nAが検出され、核酸サンプルS3には核酸プローブD3に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらにまた、核酸サンプルS4では、核酸プローブD4において72nAが検出され、核酸サンプルS4には核酸プローブD4に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【0154】
次に図17をみると、第1のウェルと第2のウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られておらず、核酸サンプルの入れ違えが正しく確認できたことがわかった。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、18nA、核酸サンプルS2では、16nA、核酸サンプルS3では、78nA、核酸サンプルS4では、81nAの電流値が検出された。
【0155】
その他、核酸サンプルS3、S4については、サンプルの入れ違えが無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルS3では、核酸プローブD3において62nAが検出され、核酸サンプルS3には核酸プローブD3に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルS4では、核酸プローブD4において71nAが検出され、核酸サンプルS4には核酸プローブD4に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【0156】
実施例5(第5の実施態様)
1.使用機器、使用材料等
(1)核酸検出用デバイス
本実施例では、実施例1〜4で使用したポジティブコントロール用判定試薬1A〜4Aの他に、ネガティブコントロール用判定試薬1B〜4Bを使用して、検体の取り違えやコンタミネーションの有無を検出する。
【0157】
本実施例で使用した核酸検出用デバイスの基本構造は、図8に示したとおりである。すなわち、1つのポジティブコントロール固定化領域と、1つのネガティブコントロール固定化領域と、1以上の検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。1つのネガティブコントロール固定化領域には、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1〜C4とは異なる、核酸プローブH1〜H4が固定されている。核酸プローブH1〜H4は、ネガティブコントロールコントロール用の試薬1B〜4Bによって検出する。本実施例では、図8に示したとおり、検出項目数を4とし、核酸プローブD1〜D4がそれぞれ独立して固定された、4つの検出核酸プローブ固定化領域が各ウェル中に形成されている。また、本実施例では、実施例1〜4と同様、電気化学的な検出が可能な核酸検出用デバイスを使用した。
【0158】
(2)核酸プローブ
ポジティブコントロール固定化領域141−4に固定された核酸プローブC1〜C4の配列は、以下のとおりである(実施例1と同じ)。
C1: TTCAGTTATGTGGATGAT
C2: TCAGTTATGTCGATGATG
C3: TTTCAGTTATGTTGATGATGT
C4: TTTCAGTTATGTAGATGATG
ネガティブコントロール固定化領域321−4に固定された核酸プローブH1〜H4の配列は、以下のとおりである。
H1: TCCGGGCGCAGAAAC
H2: GTGCTGCAGGTGCG
H3: CGTGATGACACCAAG
H4: ATGCTTTCCGTGGCA
検出核酸プローブ固定化領域131−4に固定された核酸プローブD1〜D4の配列は、以下のとおりである(実施例1と同じ)。
D1: ACCAATAAGGTTTATTGAATATTTGGGCATCAGA
D2: TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA
D3: TGGTCCTGGCACTGATAATAGGGAATGTAT
D4: AGTAGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGT。
【0159】
(3)判定用試薬
ポジティブコントロール判定試薬(試薬1A〜4A)に含まれる核酸T1〜T4の配列は、以下のとおりである。
試薬1A(核酸T1(C1と相補的な配列)を含有)
試薬2A(核酸T2(C2と相補的な配列)を含有)
試薬3A(核酸T3(C3と相補的な配列)を含有)
試薬4A(核酸T4(C4と相補的な配列)を含有)
ネガティブコントロール判定試薬(試薬1B〜4B)に含まれる核酸V1〜V4の配列は、以下のとおりである。
試薬1B(核酸V1(H1と相補的な配列+T1と相補的な配列)を含有)
試薬2B(核酸V2(H2と相補的な配列+T2と相補的な配列)を含有)
試薬3B(核酸V3(H3と相補的な配列+T3と相補的な配列)を含有)
試薬4B(核酸V4(H4と相補的な配列+T4と相補的な配列)を含有)。
【0160】
(4)核酸サンプル
検出対象となる第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)の配列は、以下の配列を含む。
【0161】
サンプルS1:(検出核酸プローブD1と相補的な配列を含む)
サンプルS2:(検出核酸プローブD2と相補的な配列を含む)
サンプルS3:(検出核酸プローブD3と相補的な配列を含む)
サンプルS4:(検出核酸プローブD4と相補的な配列を含む)
2.実験手順
第1〜第4の核酸サンプル(サンプルS1〜S4)に、塩濃度調整用バッファとともに、それぞれポジティブコントロール判定試薬(試薬1A〜4A)およびネガティブコントロール判定試薬(試薬1B〜4B)を添加した。次に、サンプルS1〜S4を、それぞれ注入ポートを介して第1〜第4のウェルに注入したが、サンプルの混入を模擬するため、第3のウェルにはS3とS4を故意に混合したサンプル(S3+S4)を注入した。各サンプルの注入後、45℃で10分間にわたってハイブリダイゼーション反応を行い、続いて、各ウェルに洗浄用バッファを注入し、30℃で10分間にわたって洗浄反応を行い、非特異的な吸着核酸を除去した。その後、第1〜第4の各ウェル中のポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中のネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出し、かつ、第1〜第4の各ウェル中の検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出した。反応の有無の検出は、実施例1と同様、挿入剤分子(50μMヘキスト33258)を各ウェルに注入し、各電極に電圧を印加し、挿入剤分子の酸化電流を測定することによって行った。電流値の測定結果を示したグラフを図18に示した。
【0162】
3.実験結果
図18に示す各記号は、図17と同じである。なお、本実施例のネガティブコントロール固定化領域には、ポジティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブC1〜C4とは異なる、核酸プローブH1〜H4が固定されている。
【0163】
本実施例で使用した電気化学的検出が可能な核酸検出用デバイスでは、実施例1〜4と同様、核酸が2本鎖を形成した場合、ある定められた閾値以上の電流値が検出され、逆に、2本鎖を形成しなかった場合、閾値以下の電流値が検出される。
【0164】
図18をみると、4つの全てのウェルにおいて、ポジティブコントロール用プローブ(PCP)から閾値以上の電流値が得られており、各核酸サンプルの間で入れ間違えが無かったことを確認することができた。なお、ここでの閾値は、40nAであり、核酸サンプルS1では、66nA、核酸サンプルS2では、65nA、核酸サンプルS3では、77nA、核酸サンプルS4では、81nAの電流値が検出された。
【0165】
また、第3のウェルにおいて、ネガティブコントロール用プローブ(NCP)から閾値以上の電流値が得られており、他の核酸サンプルの混入(コンタミネーション)があったことを正しく確認することができたことがわかった。
【0166】
その他、核酸サンプルS1、S2、S4については、サンプルの混入が無かったことを確認することができ、正しい検査結果を得ることができた。すなわち、核酸サンプルS1では、核酸プローブD1において63nAが検出され、核酸サンプルS1には核酸プローブD1に相補的な配列が含まれることを確認することができた。また、核酸サンプルS2では、核酸プローブD2において72nAが検出され、核酸サンプルS2には核酸プローブD2に相補的な配列が含まれることを確認することができた。さらに、核酸サンプルS4では、核酸プローブD4において62nAが検出され、核酸サンプルS4には核酸プローブD4に相補的な配列が含まれることを確認することができた。
【図面の簡単な説明】
【0167】
【図1】第1の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス11を示した模式図
【図2】図1に示した核酸サンプル検出用デバイス11を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図
【図3】第2の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス31を示した模式図
【図4】図3に示した核酸サンプル検出用デバイス31を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図
【図5】第3の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス51を示した模式図
【図6】図5に示したネガティブコントロール固定化領域に固定された核酸プローブを示した模式図
【図7】図5に示した核酸サンプル検出用デバイス51を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図
【図8】第4の実施態様における核酸サンプル検出用デバイス81を示した模式図
【図9】図8に示した核酸サンプル検出用デバイス81を使用した複数核酸の検出方法を示した模式図
【図10】第5の実施態様における複数核酸の検出方法を示した模式図
【図11】図10に示したネガティブコントロール判定用試薬に含まれる複数種の核酸を模式的に示した図
【図12】第1の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした第1の棒グラフ
【図13】第1の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした第2の棒グラフ
【図14】第2の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした棒グラフ
【図15】第3の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした棒グラフ
【図16】第4の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした第1の棒グラフ
【図17】第4の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした第2の棒グラフ
【図18】第5の実施態様においてサンプルS1〜S4から検出された電流値を表わした棒グラフ
【符号の説明】
【0168】
11、31、51、81・・・核酸サンプル検出用デバイス、12・・・ウェル、13・・・検出核酸プローブ固定化領域、14・・・ポジティブコントロール固定化領域、15・・・注入ポート、16・・・基板、17・・・枠、32・・・ネガティブコントロール固定化領域。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、
互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第1〜第nのウェル中の第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、
第1〜第nの核酸サンプルを、各々第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、
第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、
第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項2】
第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含み、
第1のネガティブコントロール固定化領域が、(n−1)個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む各核酸プローブがそれぞれ独立して固定され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域が、(n−1)個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む各核酸プローブがそれぞれ独立して固定された、
核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、
互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第1〜第nのウェル中の第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、
第1〜第nの核酸サンプルを、各々第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、
第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、
第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、
第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項3】
第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含み、
第1のネガティブコントロール固定化領域が、1つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む核酸プローブがともに固定され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域が、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む核酸プローブがともに固定された、
核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、
互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第1〜第nのウェル中の第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、
第1〜第nの核酸サンプルを、各々第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、
第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、
第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、
第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項4】
前記第1のネガティブコントロール固定化領域上に固定された核酸プローブは、第2〜第nのポジティブコントロールプローブの各々と同一の配列のうちの少なくとも2種が互いに直列に接合しており、かつ、
前記第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域上に固定された核酸プローブは、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロールプローブの各々と同一の配列のうち少なくとも2種が互いに直列に接合していることを特徴とする、請求項3に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項5】
前記第1のネガティブコントロール固定化領域上に固定された核酸プローブは、第2〜第nのポジティブコントロールプローブの各々と同一の配列のうち少なくとも2種が互いに直列に接合しており、そのとき少なくとも1つの配列の端部が他の少なくとも1つの配列の端部と重なり合うように接合しており、かつ、
前記第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域上に固定された核酸プローブは、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロールプローブの各々と同一の配列のうち少なくとも2種が互いに直列に接合しており、そのとき、少なくとも1つの配列の端部が他の少なくとも1つの配列の端部と重なり合うように接合していることを特徴とする、請求項3に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項6】
第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップであって、
第1の核酸サンプル識別用試薬が、第1のポジティブコントロール固定化領域に固定された第1のポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第1のポジティブコントロール判定用試薬と、第2〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の複数の核酸を含む、第1のネガティブコントロール判定用試薬とで構成され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)の核酸サンプル識別用試薬が、第kのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kのポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第kのポジティブコントロール判定用試薬と、第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の複数の核酸を含む、第kのネガティブコントロール判定用試薬とで構成された、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、
第1〜第nの核酸サンプルを、第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、
第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、
第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、
第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項7】
第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第nのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された第kの核酸サンプルを検出するための第kの核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップであって、
第1の核酸サンプル識別用試薬が、第1のポジティブコントロール固定化領域に固定された第1のポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第1のポジティブコントロール判定用試薬と、第2〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有し、かつ第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定化された第2〜第nのポジティブコントロール用核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する複数の核酸を含む、第1のネガティブコントロール判定用試薬とで構成され、かつ、
第k(kは2〜nの自然数)の核酸サンプル識別用試薬が、第kのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kのポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第kのポジティブコントロール判定用試薬と、第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有し、かつ第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する複数の核酸を含む、第kのネガティブコントロール判定用試薬とで構成された、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、
第1〜第nの核酸サンプルを、第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、
第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、
第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、
第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項8】
前記第1のネガティブコントロール判定用試薬は、前記第2〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有する核酸と、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定化された第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する核酸とが、互いに直列に接合された複数の核酸を含み、かつ、
前記第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール判定用試薬は、前記第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有する核酸と、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する核酸とが、互いに直列に接合された複数の核酸を含む、ことを特徴とする、請求項7に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項9】
前記第1のネガティブコントロール判定用試薬は、前記第2〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有する核酸と、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定化された第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する核酸とが、互いに直列に接合しており、そのとき接合された各核酸の端部が他の核酸の端部と重なり合うように接合された複数の核酸を含み、かつ、
前記第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール判定用試薬は、前記第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有する核酸と、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する核酸とが、互いに直列に接合しており、そのとき接合された各核酸の端部が他の核酸の端部と重なり合うように接合された複数の核酸を含むことを特徴とする、請求項8に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項10】
前記第1〜第nのウェルが、それぞれ独立した核酸サンプル検出用デバイスであることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項11】
前記第1〜第nのウェルが、1つの核酸サンプル検出用デバイス上に設けられていることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項12】
請求項1〜9のいずれか1項に記載の複数核酸の検出方法において準備された核酸サンプル検出用デバイスと、
請求項1〜9のいずれか1項に記載の複数核酸の検出方法において準備された第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬と、
を含む、複数核酸を検出するためのキット。
【請求項13】
前記第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬が、第1〜第nのポジティブコントロール判定用試薬と、第1〜第nのネガティブコントロール判定用試薬とで構成される、複数核酸を検出するためのキット。
【請求項1】
第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、
互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第1〜第nのウェル中の第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、
第1〜第nの核酸サンプルを、各々第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、
第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、
第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項2】
第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含み、
第1のネガティブコントロール固定化領域が、(n−1)個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む各核酸プローブがそれぞれ独立して固定され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域が、(n−1)個の固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む各核酸プローブがそれぞれ独立して固定された、
核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、
互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第1〜第nのウェル中の第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、
第1〜第nの核酸サンプルを、各々第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、
第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、
第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、
第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項3】
第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含み、
第1のネガティブコントロール固定化領域が、1つの固定化領域で構成され、各固定化領域上に、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む核酸プローブがともに固定され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域が、1つの固定化領域で構成され、該固定化領域上に、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブと同一配列を含む核酸プローブがともに固定された、
核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、
互いに異なる核酸を含み、各核酸が、第1〜第nのウェル中の第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の核酸を含む、第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、
第1〜第nの核酸サンプルを、各々第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、
第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、
第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、
第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項4】
前記第1のネガティブコントロール固定化領域上に固定された核酸プローブは、第2〜第nのポジティブコントロールプローブの各々と同一の配列のうちの少なくとも2種が互いに直列に接合しており、かつ、
前記第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域上に固定された核酸プローブは、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロールプローブの各々と同一の配列のうち少なくとも2種が互いに直列に接合していることを特徴とする、請求項3に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項5】
前記第1のネガティブコントロール固定化領域上に固定された核酸プローブは、第2〜第nのポジティブコントロールプローブの各々と同一の配列のうち少なくとも2種が互いに直列に接合しており、そのとき少なくとも1つの配列の端部が他の少なくとも1つの配列の端部と重なり合うように接合しており、かつ、
前記第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール固定化領域上に固定された核酸プローブは、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロールプローブの各々と同一の配列のうち少なくとも2種が互いに直列に接合しており、そのとき、少なくとも1つの配列の端部が他の少なくとも1つの配列の端部と重なり合うように接合していることを特徴とする、請求項3に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項6】
第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第1のネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを検出するための第kの検出核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップであって、
第1の核酸サンプル識別用試薬が、第1のポジティブコントロール固定化領域に固定された第1のポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第1のポジティブコントロール判定用試薬と、第2〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の複数の核酸を含む、第1のネガティブコントロール判定用試薬とで構成され、かつ、第k(kは2〜nの自然数)の核酸サンプル識別用試薬が、第kのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kのポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第kのポジティブコントロール判定用試薬と、第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列の複数の核酸を含む、第kのネガティブコントロール判定用試薬とで構成された、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、
第1〜第nの核酸サンプルを、第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、
第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、
第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、
第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項7】
第1〜第n(nは2以上の自然数)の核酸サンプルを検出する、複数核酸の検出方法であって、
第1〜第nの核酸サンプルのそれぞれに対応する第1〜第nのウェルを備え、第1のウェルが、第1の検出核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを検出するための第1の検出核酸プローブ固定化領域と、第1のポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1の核酸サンプルを識別するための第1のポジティブコントロール固定化領域と、第1の核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第nのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第1のネガティブコントロール固定化領域とを含み、かつ、第k(kは2〜nの自然数)のウェルが、第kの検出核酸プローブが固定化された第kの核酸サンプルを検出するための第kの核酸プローブ固定化領域と、第kのポジティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプルを識別するための第kのポジティブコントロール固定化領域と、第kのネガティブコントロール核酸プローブが固定化された、第kの核酸サンプル以外の核酸サンプルの混入を検出するための第kのネガティブコントロール固定化領域とを含む、核酸サンプル検出用デバイスを準備する、第1のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップであって、
第1の核酸サンプル識別用試薬が、第1のポジティブコントロール固定化領域に固定された第1のポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第1のポジティブコントロール判定用試薬と、第2〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有し、かつ第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定化された第2〜第nのポジティブコントロール用核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する複数の核酸を含む、第1のネガティブコントロール判定用試薬とで構成され、かつ、
第k(kは2〜nの自然数)の核酸サンプル識別用試薬が、第kのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kのポジティブコントロール核酸プローブと相補的な配列の核酸を含む、第kのポジティブコントロール判定用試薬と、第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有し、かつ第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する複数の核酸を含む、第kのネガティブコントロール判定用試薬とで構成された、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を準備する、第2のステップと、
第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬を、それぞれ第1〜第nの核酸サンプルに添加する、第3のステップと、
第1〜第nの核酸サンプルを、第1〜第nのウェルに注入する、第4のステップと、
第1〜第nのポジティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第5のステップと、
第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域における反応の有無を検出する、第6のステップと、
第1〜第nの検出核酸プローブ固定化領域における反応の有無を検出する、第7のステップと、
を含む、複数核酸の検出方法。
【請求項8】
前記第1のネガティブコントロール判定用試薬は、前記第2〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有する核酸と、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定化された第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する核酸とが、互いに直列に接合された複数の核酸を含み、かつ、
前記第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール判定用試薬は、前記第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有する核酸と、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する核酸とが、互いに直列に接合された複数の核酸を含む、ことを特徴とする、請求項7に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項9】
前記第1のネガティブコントロール判定用試薬は、前記第2〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有する核酸と、第2〜第nのポジティブコントロール固定化領域に固定化された第2〜第nのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する核酸とが、互いに直列に接合しており、そのとき接合された各核酸の端部が他の核酸の端部と重なり合うように接合された複数の核酸を含み、かつ、
前記第k(kは2〜nの自然数)のネガティブコントロール判定用試薬は、前記第kを除く第1〜第nのネガティブコントロール固定化領域に固定された第2〜第nのネガティブコントロール核酸プローブとそれぞれ相補的な配列を有する核酸と、第kを除く第1〜第nのポジティブコントロール核酸プローブにハイブリダイズする核酸とそれぞれ相補的な配列を有する核酸とが、互いに直列に接合しており、そのとき接合された各核酸の端部が他の核酸の端部と重なり合うように接合された複数の核酸を含むことを特徴とする、請求項8に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項10】
前記第1〜第nのウェルが、それぞれ独立した核酸サンプル検出用デバイスであることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項11】
前記第1〜第nのウェルが、1つの核酸サンプル検出用デバイス上に設けられていることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の複数核酸の検出方法。
【請求項12】
請求項1〜9のいずれか1項に記載の複数核酸の検出方法において準備された核酸サンプル検出用デバイスと、
請求項1〜9のいずれか1項に記載の複数核酸の検出方法において準備された第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬と、
を含む、複数核酸を検出するためのキット。
【請求項13】
前記第1〜第nの核酸サンプル識別用試薬が、第1〜第nのポジティブコントロール判定用試薬と、第1〜第nのネガティブコントロール判定用試薬とで構成される、複数核酸を検出するためのキット。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【公開番号】特開2010−11791(P2010−11791A)
【公開日】平成22年1月21日(2010.1.21)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2008−174927(P2008−174927)
【出願日】平成20年7月3日(2008.7.3)
【出願人】(000003078)株式会社東芝 (54,554)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成22年1月21日(2010.1.21)
【国際特許分類】
【出願日】平成20年7月3日(2008.7.3)
【出願人】(000003078)株式会社東芝 (54,554)
【Fターム(参考)】
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