診断用遺伝子発現プラットフォーム
癌、好適には乳癌に特異的なオリゴヌクレオチドプローブセット、それを含むキット、および、標準パターンと試験パターンとの作成におけるそれらの使用、ならびに癌、好適には乳癌の診断方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析技術、特に診断技術に使用できる、細胞中の遺伝子転写レベルを評価するためのオリゴヌクレオチドプローブに関する。便宜上、前記プローブはキットの状態で提供される。遺伝子発現パターンを用意して様々な癌、好適には乳癌や、その病期を同定、診断、またはモニタリングするための技術に、様々なプローブセットを使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
たとえば診断用などの、試料分析の迅速かつ簡便な方法を見つけることは、いまだに多くの研究者の目標である。エンドユーザは、コスト効率がよく、統計的に有意な結果を生み、かつ熟練技術を有する個人を必要とせずに日常的に実施できる方法を求めている。
【０００３】
細胞内での遺伝子発現の分析は、それら細胞の状態について、何より、細胞が由来する個人の状態について、情報を提供するために使用されてきた。細胞中の様々な遺伝子の相対的発現が、体内のある特別な状態を反映しているとして同定されてきた。たとえば、癌細胞は様々なタンパク質の発現変化を呈することが知られ、したがって転写物や発現したタンパク質が病態のマーカーとして使用されうる。
【０００４】
したがって、これらマーカーの存在について生検組織が分析でき、疾病部位由来の細胞がマーカーの存在により身体の別の組織や体液中で同定できる。さらに、変化した発現の生成物が血流に放出されうるので、これら生成物を分析してもよい。さらに、疾患細胞に接触した細胞が、その疾患細胞との直接接触により影響を受け、その結果、遺伝子発現が変化するので、その発現や発現産物を同様に分析してもよい。
【０００５】
しかし、これら方法には限界がある。たとえば、癌の同定用の特定の腫瘍マーカーには数々の欠陥がある。たとえば、特異性や感度の欠如、マーカーが特定の種類の癌以外の病態と会合すること、無症候者の検出が困難であること、などである。
【０００６】
マーカー転写物またはタンパク質を１〜２種類分析することに加えて、より最近では、遺伝子発現パターンが分析されている。疾病の診断を念頭においた大規模な遺伝子発現分析を伴う研究の多くは、疾患組織または細胞由来の臨床試料を使用してきた。たとえば、いくつかの文献は似通った癌タイプを区別するために遺伝子発現データが使用できることを示しているが、そこでは疾患組織または細胞からの臨床試料が使用されていた（非特許文献１、２、３、４)。
【０００７】
しかし、これら方法は疾患細胞、またはそれら細胞の産物、または疾患細胞と接触した細胞を含有する試料の分析に依存してきた。かかる試料の分析は、疾患の存在およびその位置を知っていることが必要であるが、それは無症候患者においては困難であろう。さらに、たとえば脳の疾患の場合など、試料が疾患部位から採取できるとは限らない。
【０００８】
本発明の発明者たちは、非常に重要な発見において、細胞が由来する組織の状態に関する情報を提供するという、身体中の細胞すべてが持つ、まだ解明されていない潜在能力を見出した。特許文献１は、たとえば癌の部位から離れたところから採取された末梢血など、疾患部位から離れた場所の細胞の遺伝子発現の分析について記載している。特許文献２は乳癌やアルツハイマー病の診断用の特定のプローブを記載しており、この参照によりその内容をここに包含する。
【０００９】
この知見は、生命体の身体の各部が互いに動的に相互作用しているという前提に基づく。ある疾患が身体の一部に影響を及ぼす時、身体の他の部分も影響される。この相互作用は、疾患領域から放出されて身体の他の領域にも影響する、生化学的な広範囲のシグナルの結果である。放出されたシグナルの生化学的および生理的変化の性質は、異なる身体部分ごとに異なるが、この変化は遺伝子発現レベルで測定でき、診断目的に使用できる。
【００１０】
生物における細胞の生理学的状態は、そこにおける遺伝子の発現パターンによって判定される。前記パターンは、前記細胞に対する生物学的な内的、外的刺激によって決まり、これら刺激の範囲および性質のいずれかにおける変化により、パターンが変化して、細胞中に異なる遺伝子が発現する。生物学的試料中の細胞での遺伝子発現パターンの全身的変化を分析することにより、それらに作用している生物学的刺激の種類や性質に関する情報を提供することができる、ということが、広く理解されつつある。このように、たとえば試験試料中の細胞の数多くの遺伝子の発現をモニタリングすることにより、それら遺伝子が特定の疾病、状態、または病期に特徴的なパターンを伴って発現しているかどうかを判定することができる。たとえば組織や体液からの細胞における遺伝子活性の変化を測定することが、疾病の診断の強力なツールとなってきている。
【００１１】
かかる方法は様々な利点がある。しばしば、臨床試料を身体中の疾患のある領域から採取することが難しかったりすることがあり、たとえば癌の試料を採取するために生検がよく使用されるなど、身体に望ましくない侵襲を伴ったりすることがある。また、アルツハイマー病の場合など、死後にのみ罹患した脳の標本が採取できる場合がある。さらに、採取できる組織標本が不均一であり、疾患細胞と非疾患細胞とが混在していることも多く、生成された遺伝子発現データの分析を複雑かつ困難にする。
【００１２】
腫瘍の形態学的外観に関しては病原的に均質に見える腫瘍組織の集まりが、分子レベルでは非常に不均一なことがあり（非特許文献３）、実際に本質的に異なる疾病を表す腫瘍を含むことがある（非特許文献２、３)ことが示唆された。疾病、状態、その病期などを同定する目的のためには、臨床試料が疾患組織や細胞から直接由来するものであることを必要としない方法が非常に望ましい。なぜなら複数の種類の細胞の均質混合物である臨床試料が身体中の容易にアクセスできる領域から採取できるからである。
【００１３】
乳癌は、世界中の女性の間で最も多い癌であり、毎年、推定１３０万人が新たに患者となり、４６万５千人が亡くなっている。乳癌死亡率を低減するためには、早期発見と適切な治療が鍵となる。このことから、腫瘍成長中にできるだけ早く治療を開始できるよう早期発見の重要性が強調されている。マンモグラフィ検査、理学的検査、および自己検査が今日主に行われている乳癌検出方法だが、マンモグラフィ検査のみが死亡率を低下させていることが示されている。
【００１４】
触診またはマンモグラフィによって胸部に腫瘍が検出可能になるまでには、腫瘍はすでに数年間存在した可能性があり、離れた臓器にも広がった可能性もある。胸部腫瘍の成長率は個々によりかなり異なる。成長が非常に速くて年２回の検査プログラムが間に合わず、マンモグラフィによる検出にいたる前に臨床症状を呈するものもある。さらに、閉経前の女性や更年期ホルモン治療を受けている女性に見られるような、胸部組織の緻密な女性においてはマンモグラフィの感度はかなり落ちる。緻密な胸部組織の女性にはマンモグラフィの感度が低いため、乳癌検診には、超音波診断法、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ)など、他の画像診断方法が導入されてきた。しかし、超音波は、技師によって差が非常に大きく、時間がかかり、偽陽性結果を伴うことが多い。ＭＲＩは高価であり、偽陽性結果率が高く、また、財源が限られ、世界共通の画像診断ガイドラインが無いため、検診現場でのＭＲＩの使用は制限されている。正確に乳癌を、とくに早期に、検出する改良された方法を必要とすることが、非常に望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】WO98/49342
【特許文献２】WO04/046382
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Alon et al. 1999, PNAS, 96, p6745-6750
【非特許文献２】Golub et al. 1999, Science, 286, p531-537
【非特許文献３】Alizadeh et al., 2000, Nature, 403, p503-511
【非特許文献４】Bittner et al., 2000, Nature, 406, p536-540
【発明の概要】
【００１７】
本発明の発明者たちは、調査中の個人の細胞、たとえば末梢血細胞の遺伝子発現プロファイルによって、癌、好適には早期乳癌を含む乳癌を同定するための予期しない有用性のある新規のプローブセットを見出した。
【００１８】
本発明に至るまでの研究で、本発明の発明者たちは、乳癌患者の多数の遺伝子の発現レベルを、正常患者と対比して調べた。かなりの数の遺伝子が変化した発現を呈していたことが判明し、これら遺伝子は、変化した発現を呈しかつ有用であると考えられるクロスバリデーション（cross validation）モデルの数に応じて、分類することができた。このように、たとえば、発生頻度１００％のものは、クロスバリデーションモデルすべてにおいて変化した発現を呈しかつ有用と考えられたものに関連し、頻度０％のものは、クロスバリデーションモデルの中の少なくとも一つにおいて変化した発現を呈しかつ有用と考えられた。このように、これら遺伝子から、特にその発生頻度に基づいて、相当するプローブが生成できるであろう集まり（pool）が得られ、個人における遺伝子発現のフィンガープリントが生成される。これら遺伝子の発現は癌、好適には乳癌や、個人の中で変化し、したがってその状態に有用と考えられるので、プローブ収集物から生成されたフィンガープリントは、正常な状態と対比して、その疾病を示していると考えられうる。
【００１９】
したがって、本発明は、癌、好適には乳癌、またはその病期に特有の発現パターンになっている細胞中の遺伝子に相当するオリゴヌクレオチドプローブセットであって、前記遺伝子は、前記癌、好適には乳癌、またはその病期によって全身的に影響される、オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。好適には、前記遺伝子は、構成的に中程度または高度に発現する。好適には、前記遺伝子は、疾患（癌、好適には乳癌）細胞からの細胞やかかる疾患細胞に接触した細胞中ではなく、試料中の細胞中で中程度または高度に発現する。
【００２０】
かかるプローブは、特に疾患部位から離れた細胞から単離した時に、病状が臨床的に認識できるレベルへ進行していることには依存せず、癌、好適には乳癌、またはその病期の検出を、発病後の非常に早い段階、他の主観的または客観的な症状が現れる数年前であっても、可能にする。
【００２１】
本明細書で言う「全身的に」影響される遺伝子とは、その発現が体内で疾患細胞または疾患部位に直接接触せずに影響される遺伝子のことであり、検査される前記細胞は疾患細胞ではない。
【００２２】
本明細書で言う「接触」とは、一つの細胞が他の細胞に及ぼす直接の影響、たとえば、免疫反応など、が観察できるくらいに細胞同士がきわめて接近しあうことであって、かかる反応が、第一の細胞から放出され長い距離を超えて第二の細胞に影響する二次的な分子によって仲介されることがないということである。好適には、接触は物理的な接触、または、立体的に可能な限り近接した接触を言い、便宜上、互いに接触する細胞が、たとえば１ｃｍ3以内などの同じ単位体積中に観察されることを意味する。
【００２３】
「疾患細胞」とは、表現形の変化を明示する細胞であって、その存続期間中のある時間に疾患部位に存在している、つまり本件の場合、腫瘍部位の癌細胞、または腫瘍から拡散された癌細胞、好適には乳癌細胞である。
【００２４】
「中程度または高度」に発現した遺伝子とは、コピー数が３０〜１００コピー／細胞（細胞中のｍＲＮＡ分子が平均3(105であると仮定）を超える静止細胞中に存在する遺伝子を言う。
【００２５】
上記の特性を有する特定のプローブが、本明細書中に記載のように提供される。
【００２６】
したがって、一態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブセットであって、前記セットは少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドを含み、前記１０個のオリゴヌクレオチドの各々は、表５に記載されているかまたは表５に記載の配列から誘導されたオリゴヌクレオチド、表５の配列またはその誘導配列の相補配列を有するオリゴヌクレオチド、機能的に同等のオリゴヌクレオチドから選択される、オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。
【００２７】
好適には、前記１０個のプローブの各々は表５に記載の異なるオリゴヌクレオチドに相当するが、前記オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上が、前記相当する誘導されたオリゴヌクレオチド、相補配列または機能的に同等のオリゴヌクレオチドと置換されてもよい、すなわち、同じ遺伝子転写物に結合するオリゴヌクレオチドと置換されてもよい。もしたとえばプライマーのみが使用されるなら、ほぼ確実にオリゴヌクレオチドすべてが誘導されたオリゴヌクレオチドであり、たとえば前記の配列の一部などであろう。
【００２８】
かかるプローブを本発明の製品および方法に使用することは、本発明の別の態様である。
【００２９】
前記「誘導された」オリゴヌクレオチドには、上記表に記載された配列に相当する遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチドがある。表５は、前記の様々な配列の遺伝子識別子（すなわち、提示されたオリゴヌクレオチドに相当する遺伝子配列）を提示している。このことは、ＡＢＩ１７００識別子を示す「ABI Probe ID」という見出しの列に記載されている。前記遺伝子の詳細は、遺伝子、転写物、およびタンパク質についてのPanther Classification System（http://www.pantherdb.org/genes）から得られる。または、詳細はアメリカ合衆国、カリフォルニア州のApplied Biosystems社から直接得られる。
【００３０】
本明細書で言う「オリゴヌクレオチド」は、高分子構造中に少なくとも６つのモノマー、すなわちヌクレオチドまたはその修飾形態を有する核酸分子である。核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡ（ペプチド核酸）、前記核酸分子のハイブリッドまたは修飾型である。それらはたとえば、メチル化によるか、または修飾されたかもしくは非天然の塩基から合成中に構成された、化学的に修飾された形態、例えば、ＬＮＡ（固定核酸）であってもよい。ただし、これらは、相補的配列に結合する能力を保持している。かかるオリゴヌクレオチドは、プローブの標的となる配列に対して本発明に準じて使用され、本明細書ではオリゴヌクレオチドプローブとも、また単に「プローブ」とも称される。
【００３１】
本明細書で言う「プローブ」とは、関連する転写物に結合し、結合した標的分子の存在または量が検出されるようにする、オリゴヌクレオチドである。かかるプローブは、たとえば、標的分子に対する標識（以後、標識プローブと記載する）として作用するか、または、シグナルの生成をたとえばプライマーなど別の手段によって可能にする、プローブであってもよい。
【００３２】
本明細書で言う「標識プローブ」は、標的の配列に結合し、結合した標的の配列と標識プローブが検出可能な標識を備えるようにするプローブ、またはその関連付けの形成により評価されるようなプローブを言う。たとえば、これは標識化されたプローブを使用して達成されてもよく、または前記プローブが下記に記載するように標識化された配列の捕捉プローブとして働いてもよい。
【００３３】
プライマーとして使用される場合、前記プローブは標的配列に結合し、また必要に応じて、別の関連するプライマーと共に、評価および／または定量される標的配列の存在を示す増幅産物の生成を可能にする。前記プライマーは標識を含んでいてもよく、または、前記増幅プロセスが標識を含むかまたは増幅中に示すかして検出を可能にしてもよい。標的配列に結合して検出可能なシグナルの生成を直接または間接的に可能にするオリゴヌクレオチドはいずれも、本発明の範囲内に含まれる。
【００３４】
「プライマー」は、標的配列に対してハイブリッドを形成する一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを指し、適切な条件下で（すなわちヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在下で、かつ適切な温度およびｐHで）、合成開始点として働き、たとえばＰＣＲを介するなど、プライマー配列からの伸長によって標的配列を増幅することを可能にする。
【００３５】
プライマーに依拠する方法においては、好適にはリアルタイム定量的ＰＣＲが使用され、これはリアルタイム定量的ＰＣＲがリアルタイムで少量のＲＮＡを効率よく検出および定量するからである。この後、ｍＲＮＡがまずｃＤＮＡに転写されて、配列特異的プライマーの助けを受けて短ＤＮＡ配列を増幅するために使用される、一般的なＲＴ−ＰＣＲ法がおこなわれる。リアルタイムＰＣＲにおける生産物を検出するための二つの一般的な方法がある。（１）ＳＹＢＲグリーンなど、二本鎖ＤＮＡと結合する非特異性蛍光染料、および（２）たとえばABI TaqMan Systemなど、相補ＤＮＡ標的を有するプローブのハイブリダイゼーション後のみに検出を可能にする蛍光レポーターで標識化されたオリゴヌクレオチドから成る、配列特異性ＤＮＡプローブ（実施例で詳細を検討する）、である。
【００３６】
「表５（または他の表）に記載された配列から誘導されたオリゴヌクレオチド」は、たとえば長さや機能などにおいて本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプローブの用件を満たす、前記表に開示された配列の一部、またはその相補配列を含む。好適には、前記一部は、本発明における使用に適切なサイズのプローブ（プライマーを含む）のために、以下に記載されるサイズを有する。このような誘導されたオリゴヌクレオチドは、開示された配列または相補配列の一部に相当するプライマーなどのプローブを含む。一つよりも多いオリゴヌクレオチドが配列から誘導されてもよく、たとえば一対のプライマーおよび／または標識プローブを生成してもよい。
【００３７】
上記のような「誘導された」オリゴヌクレオチドは、上記表に記載された配列（すなわち、提示されたオリゴヌクレオチドまたは表に挙げられた遺伝子配列）に相当する遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチドも含む。この場合、前記オリゴヌクレオチドは、表５に記載の配列がその一部をなす遺伝子配列の一部を形成する。表５は、ＡＢＩ１７００遺伝子識別子を記載しており、誘導されたオリゴヌクレオチドは上記遺伝子の一部（またはその転写物）またはその相補配列を形成してもよい。したがって、たとえば、識別プローブまたはプライマー配列は、遺伝子上のいずれかの部分から誘導されてもよく、前記遺伝子またはその転写物への特異的な結合が可能である。
【００３８】
好適には、前記セットを形成するオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１５塩基の長さであり、標的分子への結合が可能である。特に好適には、前記オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１０、２０、３０、４０、または５０塩基、かつ、２００、１５０、１００、または５０塩基未満の長さであり、たとえば２０〜２００塩基の長さ、たとえば３０〜１５０塩基の長さ、好適には５０〜１００塩基の長さである。
【００３９】
前記プローブがプライマーの場合も同様であるが、好適には前記プライマーは１０〜３０塩基の長さであり、たとえば１５〜２８塩基の長さであり、たとえば２０〜２５塩基の長さである。プライマーの成長について通常の考察が適用され、たとえば好適には、効率を上げるためにプライマーはＣ＋Ｇ含有量が５０〜６０％であり、ＧまたはＣまたはＣＧまたはＧＣの３’末端で終端すべきであり、前記３’末端はプライマーダイマーを回避するために相補的であってはならず、プライマー自己相補性を回避し、かつ、３’末端のＣやＧの３つ以上の連続を回避すべきである。プライマーは、誘発剤の存在下で所望の伸長生成物の合成を準備するために十分な長さがなければならない。
【００４０】
本発明の実行のための適切なプライマーを同定するために、表に記載された遺伝子配列またはプローブ配列がプライマーまたはプローブを設計するために使用されてもよい。好適には、前記プライマーは、短ＤＮＡ配列を増幅するために生成される（たとえば、７５〜６００塩基）。好適には短い単位複製配列が増幅され、たとえば好適には７５〜１５０塩基などである。前記プローブおよびプライマーはエクソン内で設計されることができ、または、エクソン連結に架かってもよい。たとえば、表５は、ＡＢＩマイクロアレイプローブＩＤを記載し、これはPanther Classification System for Genes, Transcripts and Proteins （http://www.pantherdb.org/genes）を使用して、対応ＡＢＩ Ｔａｑｍａｎ アッセイＩＤを同定するために使用されてもよい。Ｔａｑｍａｎアッセイが同定されれば、それを供給業者から得ることができる。または、遺伝子名や遺伝子記号を使用して、相当する遺伝子配列を、たとえばthe National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)などの公開データベースで同定することができる。もしくは、記載されたオリゴヌクレオチド配列を使用して、それらをＮＣＢＩのNucleotide Blast (Blastn)プログラムを利用して周知の配列に並べ替え、相当する遺伝子や転写物を同定することができる。遺伝子または転写物の配列を使用して、たとえばApplied Biosystems のthe Primer Express Softwareなど、オリゴヌクレオチドやプライマーの設計用のフリープログラムや市販のプログラムを利用することにより、プローブやプライマーを設計できる。
【００４１】
本明細書で言う「相補配列」という用語は、連続した相補塩基（たとえば、Ｔ：Ａ,Ｇ：Ｃ）を有した配列を言い、かかる相補配列はしたがってその相補性により互いに結合できる。
【００４２】
「１０のオリゴヌクレオチド」とは、１０個の異なるオリゴヌクレオチドを言う。表５のオリゴヌクレオチド、表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチド、それらの機能的同等物は、異なるオリゴヌクレオチドとみなされるが、相補的オリゴヌクレオチドは異なるオリゴヌクレオチドとはみなされない。しかし、好適には、少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドは、１０個の表５のオリゴヌクレオチド（または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチド、もしくはそれらの機能的同等物）である。前記１０個の異なるオリゴヌクレオチドは好適には１０個の異なる転写物と結合することができるものである。
【００４３】
好適には、前記オリゴヌクレオチドは表５に記載のものであるか、表５に記載の配列から誘導されたものである。前記誘導されたオリゴヌクレオチドは、これら表に記載された配列に相当する遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチド、またはその相補配列を含む。
【００４４】
好適な態様において、前記オリゴヌクレオチドは、表７Ｃまたは８Ｂに記載されたものであるか、または表７Ｃまたは８Ｂに記載された配列から誘導されたものである。表７Ｃに記載のオリゴヌクレオチドは、その表に載っているオリゴヌクレオチドである。表８Ｂに記載のオリゴヌクレオチドは、表５のオリゴヌクレオチドであって、その表５のＡＢＩ番号が表８Ｂに示されているものである（すなわち表８Ｂのオリゴヌクレオチドは、表５を相互参照することにより得られる）。表５、７Ｃ、および８Ｂに記載の配列は、前記記載されたオリゴヌクレオチド配列と、前記遺伝子識別子（ＡＢＩ Ｎｏ.）が付与されている遺伝子配列とを含む。前記誘導されたオリゴヌクレオチドは、これらの表に記載された配列に相当する遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチド、またはその相補配列を含む。表７Ｃおよび８Ｂは、表５からのＩＤ番号で識別される表５からのプローブのサブセットを示す。本明細書中での表５の参照は、同様に表７Ｃまたは８Ｂの参照と考えてよい。
【００４５】
特に好適には、オリゴヌクレオチドは、表５、７Ｃ、または８Ｂに記載の発生頻度に基づき選択される（表８Ｂの配列の発生頻度情報は、表５の相当する配列から求められてもよい）。このように、好適には、前記プローブセットは、表５、７Ｃ、８Ｂに記載の、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または１００％の頻度を有するものから選択される。特に好適な態様では、セット中のオリゴヌクレオチドすべてが、上記％頻度を有している（または、かかるオリゴヌクレオチドから誘導されている）。別の実施形態では、セット中のオリゴヌクレオチドが、０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の頻度を有していてもよく、すなわち、表５、７Ｃ、または８Ｂのプローブは、セット選択用の１１個のサブグループに分類され、好適にはセット中のオリゴヌクレオチドすべてがこの％頻度を有する。
【００４６】
好適な実施形態において、前記セットは表５、７Ｃ、または８Ｂのプローブ（すなわちオリゴヌクレオチド）（またはその誘導配列、相補配列、または機能的同等物）または上述したサブセットのプローブのすべてを含んでいる。このように、一つの態様においては、前記セットは表５、７Ｃ、または８Ｂのプローブ（またはその誘導配列、相補配列、または機能的同等物）をすべて含み、または、別の様態においては、前記セットは０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の頻度を有するプローブ（またはその誘導配列、相補配列、または機能的同等物）をすべて含み、また、別の様態においては、上記表の少なくとも０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の頻度を有するプローブ（またはその誘導配列、相補配列、または機能的同等物）をすべて含めばよい。好適な様態において、前記セットは、前述のプローブ（またはその誘導配列、相補配列、または機能的同等物）のみから成る。
【００４７】
上述の「セット」とは、ユニークな（すなわち、固有の配列を有する）オリゴヌクレオチドプローブの集まりを言い、好適には、１０００個未満のオリゴヌクレオチドプローブ、特に、５００、４００、３００、２００、または１００個未満のプローブから成り、好適には、１０、２０、３０、４０、または５０個より多いプローブから成り、たとえば、好適には１０〜５００個、たとえば１０〜１００、２００、または３００個、特に好適には２０〜１００個、たとえば３０〜１００個のプローブから成る。場合によっては、１０個未満のプローブ、たとえば、２〜９個のプローブ、５〜９個のプローブ、などが使用されてもよい。
【００４８】
プローブの数を増やせば、問題の特定の遺伝子の発現を同様に変化させうる別の疾患と比較することにより、分析が失敗する可能性、たとえば誤診などを防ぐであろう。本明細書に記載されていない他のオリゴヌクレオチドプローブも、とりわけそれらが前記オリゴヌクレオチドプローブセットの最終使用に役立つ場合、存在してもよい。しかし好適には、前記セットは、前記表５、７Ｃ、または８Ｂのオリゴヌクレオチド、前記表５、７Ｃ、または８Ｃに記載されたものから誘導されたオリゴヌクレオチド、相補配列のオリゴヌクレオチド、機能的に同等なオリゴヌクレオチド、またはそのサブセット（たとえば、前述のようなサイズや種類のもの）のみから成る。
【００４９】
前記ユニークなオリゴヌクレオチドの各々の複数のコピー、たとえば、１０個以上のコピーが、各セットに存在してもよいが、前記コピーは単一のプローブのみを構成する。
【００５０】
オリゴヌクレオチドプローブセットは、好適には固体担体上に固定されていても、かかる固定用の手段を有していてもよく、上記に記載されたものから選択された少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドプローブを含んでいる。上述したように、これら１０個のプローブはユニークであって互いに異なる配列を有していなければならない。しかしながらそうは言うものの、同一の遺伝子を認識するが異なるスプライシング事象を反映する二つの別個のプローブが使用されてもよい。しかし、互いに相補的であり個別の遺伝子に結合するオリゴヌクレオチドプローブが好ましい。
【００５１】
前記セットのプローブがプライマーである場合、好適な様態において、プライマーの対が設けられる。かかる場合、存在すべきオリゴヌクレオチド（たとえば１０個のオリゴヌクレオチド）の参照はしたがって増大し、すなわち、各対が特定の標的配列に対して特異的である１０対のプライマーに相当する２０個のオリゴヌクレオチドとなる。または、前記プローブセットは単一の標的配列に対する標識プローブとプライマーとの両方を含んでもよい（たとえば、以下に詳細に記載されるＴａｑｍａｎアッセイ用）。この場合、存在すべきオリゴヌクレオチド（たとえば１０個のオリゴヌクレオチド）の参照はしたがって３０個のオリゴヌクレオチドまで増大し、すなわち、ある特定の標的配列のための１０対のプライマーとそれに相当する関連の標識プローブとなる。
【００５２】
したがって、好適な様態において、本発明のセットは、少なくとも２０個のオリゴヌクレオチドを含み、前記セットは、プライマーの対を含み、前記プライマーの対の各オリゴヌクレオチドが同じ転写物またはその相補配列に結合し、好適には前記プライマーの各対はそれぞれ異なる転写物に結合する。さらに好適な様態において、本発明は、少なくとも３０個のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブセットを提供し、前記セットは、プライマーの対と、前記プライマーの各対用の標識プローブとを含み、前記プライマーの対の各オリゴヌクレオチドと前記標識プローブは同じ転写物またはその相補配列に結合し、好適には前記プライマーの各対と前記標識プローブは異なる転写物に結合する。前記標識プローブが同じ転写物上で結合する標的配列の、上流または下流に前記プライマーが結合する場合に、前記標識プローブは、そのプライマーの対と「関連している」ということになる。
【００５３】
本明細書で言う、表５に記載のものと「機能的に同等な」オリゴヌクレオチド、またはそこから誘導されたものとは、表５に記載のオリゴヌクレオチドまたはそこから誘導されたものが同定する遺伝子と同じ遺伝子を同定できるオリゴヌクレオチドである。すなわち、それは、表５のオリゴヌクレオチドまたは表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチド（またはその相補配列）が結合するのと同じｍＲＮＡ分子（またはＤＮＡ)であって、遺伝子（標的核酸分子）から転写されたｍＲＮＡ分子に結合できる、オリゴヌクレオチドである。好適には、前記機能的に同等のオリゴヌクレオチドは、表５のオリゴヌクレオチドまたは表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドが認識するのと同じスプライシング産物を認識することができる、すなわち、それに結合することができる。好適には、前記ｍＲＮＡ分子は、表５のオリゴヌクレオチドまたは表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドに相当する、全長ｍＲＮＡ分子である。
【００５４】
本明細書で言う、「結合できる」または「結合する」とは、以下に記載する条件下でハイブリダイズする能力のことを言う。
【００５５】
言いかえると、機能的に同等のオリゴヌクレオチド（またはその相補配列）は、以下に記載するように、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチド、もしくはその相補オリゴヌクレオチドが結合する標的分子の領域に対して配列同一性を有する、または、ハイブリダイズする。好適には、機能的に同等なオリゴヌクレオチド（またはその相補配列）は、後に記載する条件下で、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドに相当するｍＲＮＡ配列の一つに対してハイブリダイズするか、または表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドに相当するｍＲＮＡ配列の一部分に対して配列同一性を有する。「部分」とはこの文脈においては、少なくとも５塩基、たとえば少なくとも１０または２０塩基であって、５〜１００塩基、たとえば１０〜５０や１５〜３０塩基などの一続きのもの（stretch)を言う。
【００５６】
特に好適な態様において、前記機能的に同等なオリゴヌクレオチドは、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドが結合する標的核酸分子（ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の領域のすべて、または一部分、に結合する。「標的」核酸分子は、前記遺伝子転写物または関連する産物、たとえばｍＲＮＡやｃＤＮＡなど、またはその増幅産物である。前記表５のオリゴヌクレオチドまたは表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドが結合する前記標的分子の前記「領域」は、相補性の存する一続き（stretch）である。この領域は、最も大きいもので、前記表５の配列または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドの全長であるが、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドの全体が前記標的配列の領域に対して相補的であるわけではなければ、もっと短くてもよい。
【００５７】
好適には、前記標的分子の領域の一部分は、少なくとも５塩基の一続き（stretch）で、たとえば少なくとも１０または２０塩基であり、たとえば５〜１００塩基、たとえば１０〜５０塩基、１５〜３０塩基などである。これは、たとえば、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドの塩基と同じ塩基を数個有する前記機能的に同等なオリゴヌクレオチドによって得ることができる。これら塩基は、たとえば機能的に同等なオリゴヌクレオチドの一部においてなど、連続したいくつかの範囲（stretches）にわたって同一であってもよく、または、非連続的に存在してもよいが、標的配列への結合を可能にするのに十分な相補性を提供するものである。
【００５８】
したがって、好適な特徴においては、前記機能的に同等なオリゴヌクレオチドは、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチド、もしくはその相補配列に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。言いかえると、前記機能的に同等なオリゴヌクレオチドは、表５のオリゴヌクレオチドのすべてまたは一部分に対して高度な配列同一性を呈する。好適には、前記機能的に同等なオリゴヌクレオチドは、表５のオリゴヌクレオチドの全て、またはその一部分に対して、配列同一性が少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％、たとえば少なくとも９０、９５、９８、または９９％である。この文脈において使用されるように、「一部分」とは、前記表５のオリゴヌクレオチドにおいて、少なくとも５塩基の範囲、たとえば、少なくとも１０または２０塩基の一続き（stretch）であって、５〜１００塩基の一続き、たとえば１０〜５０塩基、または１５〜３０塩基の一続きを言う。前記表５のオリゴヌクレオチドの一部分のみに対して配列同一性が存する場合、特に好適には、前記配列同一性は高く、たとえば上記のように少なくとも８０％である。
【００５９】
上述した機能的な用件を満足する、機能的に同等なオリゴヌクレオチドには、表５のオリゴヌクレオチドから誘導されたものと、単一または複数のヌクレオチド塩基（またはその同等物）の置換、付加、および／または欠失によって修飾されて、たとえば、表５のオリゴヌクレオチドまたはそこからさらに誘導または変更されたものと同じ標的分子に結合するなど、機能的な活性を維持するものと、が挙げられる。好適には、前記修飾は、１〜５０塩基、たとえば１０〜３０塩基、好適には１〜５塩基である。特に好適には、たとえば１０未満の塩基における変更など、わずかな修飾のみが存在することであり、たとえば５未満の塩基の変更である。
【００６０】
「付加」同等物の意味の範囲内に含まれるのは、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドが結合する標的分子上の塩基の連続した一続き（consecutive stretch）に相補的である付加配列を含むオリゴヌクレオチドである。または、前記付加は、異なる、関連しない配列を含んでもよく、それは、たとえばさらなる特性を付与するものであってもよく、たとえば前記オリゴヌクレオチドプローブを固体担体に結合させるリンカー等、固定化の手段を提供するものであってもよい。
【００６１】
特に好適なのは、生物学的変異型など、天然の同等物であり、たとえば、対立遺伝子変異型、地理的変異型、アロタイプ変異型で、たとえば、異なる種に存在するような遺伝的変異型に相当するオリゴヌクレオチドなどである。
【００６２】
機能的同等物には、たとえば非天然塩基などを使用した、修飾塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。かかる誘導物は、合成中や生成後の修飾によって調製されてもよい。
【００６３】
低ストリンジェンシー条件下で結合する「ハイブリダイゼーション」配列とは、非ストリンゲンシー条件下（たとえば、６(ＳＳＣ/５０％ホルミアミド、室温）で結合し、低ストリンジェンシー条件下（２(ＳＳＣ、室温、より好適には２(ＳＳＣ、４２℃）で洗浄した時に結合状態を保つものである。高ストリンジェンシー下でハイブリダイズするとは、洗浄を２(ＳＳＣ、６５℃で行う上記条件を言う。（ＳＳＣ＝０．１５Ｍ塩化ナトリウム, ０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）
【００６４】
本明細書で言う「配列同一性」とは、下記のパラメータを用いてＣｌｕｓｔａｌＷ（Thompson et al., 1994, Nucl. Acids Res., 22, p4673-4680)を使用して評価した時に得られる値である。
ペアワイズアラインメントパラメータ − 方法：正確、マトリクス：ＩＵＢ、ギャップ開始ペナルティ：１５．００、ギャップ伸長ペナルティ：６．６６、
マルチプルアラインメントパラメータ − マトリクス：ＩＵＢ、ギャップ開始ペナルティ：１５．００、％アイデンティティーフォーディレイ（% identity for delay)：３０、ネガティブマトリクス：無し、ギャップ伸長ペナルティ：６．６６、ＤＮＡトランジションウェイティング（transition weighting）：０．５
【００６５】
特定の塩基での配列同一性は、単純に誘導された同一の塩基を含む。
【００６６】
上記のように、便宜上、前記オリゴヌクレオチドプロ―ブセットは一つ以上の固体担体に固定されてもよい。各ユニークなプローブの一つまたは好適には複数のコピーが前記担体に接着され（associated）、各ユニークなプローブのたとえば１０個以上、たとえば少なくとも１００個のコピーが存在する。
【００６７】
一つ以上の特異なオリゴヌクレオチドプローブが個別の固体担体に接着され（associated）、それらが複数の固体担体に固定されたプローブのセットを形成してもよく、たとえば一つ以上のユニークなプローブが複数のビーズ、膜、フィルタ、バイオチップなどに固定され、それらがプローブセットを形成し、それらが後に記載するキットのモジュールを構成してもよい。異なるモジュールの固体担体は、便宜上物理的に結合している（associated）が、各プローブに関連する（associated）シグナル（後に記載するように生成される）は、個別に判定可能でなければならない。
【００６８】
または、前記プローブは、同じ固体担体の個別の部分に固定されてもよく、たとえば、各ユニークなオリゴヌクレオチドプローブが、たとえば複数のコピーの状態で、単一のフィルタまたは膜の異なった個別の部分または領域に固定されて、たとえばアレイを形成してもよい。
【００６９】
かかる手法を組み合わせて使用してもよく、たとえばいくつかの固体担体が使用され、それぞれがいくつかのユニークなプローブを固定してもよい。
【００７０】
「固体担体」という表現は、疎水性、イオン性、または共有結合性の架橋によってオリゴヌクレオチドを結合できる固体材料を意味する。
【００７１】
本明細書で言う「固定する」とは、かかる結合（binding）により前記プローブが前記固体担体へ可逆的または不可逆的に結合すること（association）である。可逆的である場合、前記プローブは、本発明の方法が行われるのに十分な時間の間、前記固体担体に結合（association）した状態である。
【００７２】
本発明による固定部分に適した固定担体は多数、当該技術分野において周知であり、文献に広く記載されている。一般的に言えば、固体担体は、化学的または生化学的方法において、固定化、分離などに現在広く使用されるかまたは提案されている周知の担体またはマトリックスのいずれかでよい。このような材料には、合成有機ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン；またはニトロセルロースおよび酢酸セルロース；またはトシル活性化表面；またはガラスもしくはナイロン、または核酸の共有結合に好適な基を担持するいずれかの表面などがあるが、これらには限定されない。該固定化部分は、例えば、高分子材料、例えば、アガロース、セルロース、アルギナート、テフロン、ラテックス、ポリスチレンまたは磁気ビーズからできている、粒子、シート、ゲル、フィルタ、膜、マイクロファイバーストリップ、チューブまたはプレート、繊維またはキャピラリーの形態をとることができる。好適には一次元での配列の形態を可能とする固体担体、例えば、シート、フィルタ、膜、プレートまたはバイオチップが好ましい。
【００７３】
固体担体への核酸分子の接着（attachment)は、直接的または間接的におこなうことができる。例えば、フィルタを使用する場合には、接着は、ＵＶ誘発架橋によりおこなうことができる。または、接着を、結合部分がオリゴヌクレオチドプローブおよび／または固体担体上に担持された状態で使用されることにより間接的におこなってもよい。したがって、例えば、一対のアフィニティ結合（binding）パートナー、例えば、アビジン、ストレプトアビジンもしくはビオチン、ＤＮＡもしくはＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ｌａｃIレプレッサータンパク質、またはそれが結合するｌａｃオペレータ配列のいずれか）、抗体（モノクローナルまたはポリクローナルでよい）、抗体断片または抗体のエピトープまたはハプテンなどを使用してもよい。これらの場合、結合対の片方を固体担体に結合する（または前記片方が固有的に固体担体の一部分である）か、結合対の他方を核酸分子に結合する（または前記他方が固有的に核酸分子の一部分である）。
【００７４】
本明細書で言う「アフィニティ結合対」とは、特異的に（すなわち、他の分子への結合に優先して）互いを認識しかつ結合する（bind)２つの成分を意味する。かかる結合対は、互いに結合したときに、複合体を形成する。
【００７５】
固体担体への適切な官能基の接着（attachment）は、当該技術分野において周知の方法によりおこなうことができる。このような方法には、例えば、固体担体を処理して好適な表面塗膜を提供することにより形成できる水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基を介した接着が含まれる。結合（binding）パートナーの結合（attachment）に適当な部分を与える固体担体は、当該技術分野において周知の通常の方法により製造できる。
【００７６】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブへの適当な官能基の接着（attachment）は、ライゲーションによりおこなうか、または適当な部分、例えば、ビオチンまたは特定の捕捉配列を担持したプライマーを使用した合成または増幅中に導入されてもよい。
【００７７】
便宜的には、上記したプローブセットは、キットの形態で提供される。
【００７８】
したがって、さらなる態様によれば、本発明は、必要に応じて一種またはそれ以上の固体担体上に固定化された、上記のようなオリゴヌクレオチドプローブセットを含むキットを提供する。
【００７９】
好適には、前記プローブ類を単一の固体担体上に固定化し、各ユニークなプローブを該固体担体の異なる領域に接着させる。しかしながら、複数の固体担体に接着させたとき、前記複数の固体担体は、キットを構成するモジュールを形成する。特に好適には、前記担体は、シート、フィルタ、膜、プレートまたはバイオチップである。
【００８０】
必要に応じて、キットは、正常試料または疾病試料（該キットの使用に関して以下で詳細に説明する）、標準化材料、例えば、比較用の正常試料および／または疾病試料からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ、ｃＤＮＡへの取込み用標識、増幅用核酸配列導入用アダプター、増幅用プライマーおよび／または適当な酵素、バッファーおよび溶液により生成されるシグナルに関係する情報を含んでいてもよい。必要に応じて、前記キットは、添付文書を含んでいてもよい。この添付文書には、本発明の方法をどのように実施するかが記載されており、本発明を実施したときに得られる標準的なグラフ、データまたは結果を解釈するためのソフトウエアが必要に応じて付けられている。
【００８１】
以下に記載される標準的な診断遺伝子転写物パターンを作成するこのようなキットの使用は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００８２】
本明細書に記載のプローブセットには、種々の用途がある。しかしながら、主にこれらは、試験細胞の遺伝子発現状態を評価して、前記細胞が由来する生物に関係する情報を得ることに使用される。したがって、プローブは、生物における癌、好適には乳癌、またはその病期を診断、同定またはモニタリングするのに有用である。
【００８３】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、上記のオリゴヌクレオチドプローブセットまたはキットの使用であって、上記オリゴヌクレオチドプローブが結合する遺伝子の遺伝子発現のレベルを反映する細胞の遺伝子発現パターンを判定するための使用が提供される。この使用は、少なくとも
ａ）前記細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と；
ｂ）工程（ａ）のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプローブセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と；
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して前記パターンを作成する工程と、
を含む。
【００８４】
上述したように、オリゴヌクレオチドプローブは、標的配列の直接標識として働くか（標的配列およびプローブの複合体が標識を担持する場合）、またはプライマーとして使用されてもよい。前者の場合、工程c)はハイブリダイゼーション体を検出する適切な手段によって行われ、たとえばｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが標識される場合、キット中の標識の保持が評価されてもよい。プライマーの場合、これらプライマーは評価される増幅産物を生成するために使用されてもよい。この場合、工程ｂ）において、前記プローブがｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズされて、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしくはその一部分を（本明細書に記載された部分用のサイズ、または、単位複製配列の好適なサイズに）増幅するために使用され、工程ｃ）において、前記パターンを作成するために増幅産物の量が評価される。
【００８５】
プライマーと標識プローブの双方が使用される技術の場合、上記方法で前記プライマーおよび標識プローブが、工程ｂ）においてｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズされて、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしくはその一部分を増幅するために使用さる。この増幅により、関連する標的配列に結合しているプローブを置換し、シグナルを生成する。この場合、工程ｃ）において、生成されたシグナルの存在または量を判定することにより、プローブをハイブリダイズしたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量が評価される。したがって、好適な態様において、前記プローブは標識プローブとプライマー対であり、工程ｂ）において前記標識プローブとプライマーはｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズし、前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしくはその一部分が前記プライマーを使用して増幅され、前記標識プローブが標的配列に結合した時、それは増幅中に置換され、シグナルを生成し、工程ｃ）において、生成されたシグナルの量が評価されて前記パターンを作成する。本明細書中に記載されたような前記プローブの標的配列への結合の存在または量の検出のモデルはすべて、上述された方法および以下に記載される本発明の方法によってカバーされる。
【００８６】
この方法および以下で述べる方法において言及されるｍＲＮＡおよびｃＤＮＡは、前記分子の誘導体またはコピー、例えば、相補鎖の増幅または調製により製造されるもののような分子のコピーであるが、ｍＲＮＡ配列の同一性が保持されており、すなわち、前記分子の少なくともある領域について相補性または配列の同一性が高いので、直接転写物（またはその相補的配列）にハイブリダイズするようなものを含む。当然のことながら、転写物をトランケート（truncate）したり、あるいは例えば、プライマー増幅により新しい配列を導入する手法が使用された領域全体にわたって、相補性が存在するわけではない。便宜上、前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、工程ｂ）の前に増幅することが好ましい。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと同様に、前記分子は、例えば、相補性が維持されるならば合成中に非天然塩基を使用して修飾してもよい。また、このような分子は、シグナル伝達手段または固定化手段などのさらなる部分を担持していてもよい。
【００８７】
このようなパターンを作成する方法に含まれる様々な工程を、以下詳細に説明する。
【００８８】
本明細書で言う「遺伝子発現」とは、特定の遺伝子の転写により特異的ｍＲＮＡ産物（すなわち、特定のスプライシング産物）が生成することを意味する。遺伝子発現レベルは、転写ｍＲＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子から逆転写されたｃＤＮＡ分子、または例えば増幅によりこれらの分子から得られた産物のレベルを評価することにより判定することができる。
【００８９】
この手法により得られた「パターン」は、例えば、表の形またはグラフ状に表すことができる情報を言い、二種またはそれ以上のオリゴヌクレオチドと関係するシグナルについての情報を伝達する。好適には、前記パターンは、各プローブと関連した発現レベルに関する数のアレイ（array）として表される。
【００９０】
好適には、前記パターンは、以下の線形モデルを用いて確定される：
ｙ＝Ｘｂ＋ｆ 式１
（式中、Ｘは遺伝子発現データのマトリックスであり、ｙは反応変数であり、ｂは回帰係数ベクトルであり、ｆは推定残余ベクトルである。式１に表される関係を確定するのに種々の異なる方法を使用することができるが、式１の関係を確定するためには、特に好適には部分最小二乗回帰（ＰＬＳＲ）を使用する。
【００９１】
したがって、前記プローブは、細胞が単離される時点での遺伝子発現を反映するパターンを作成するのに使用される。その発現パターンは、細胞を取り巻く周囲の状況に特徴的なものであり、細胞に及ぼされる影響により異なる。したがって、癌、好適には乳癌、またはその病期を有する個体からの細胞について特徴的な遺伝子転写パターンの標準またはフィンガープリント（標準プローブパターン）を作成して、試験細胞の転写パターンとの比較に使用されてもよい。これは、生物が癌、好適には乳癌を患っているかまたはその特定の病期にあるかどうかを診断、モニタリングまたは同定することに用いることができるのは明らかである。
【００９２】
前記標準パターンは、癌、好適には乳癌を有するか、その病期にある一つまたはそれ以上の生物から得た試料の細胞についての全ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡまたは関連産物）のプローブへの結合の程度を求めることにより作成される。これは、ユニークなプローブの各々に相当し、存在する転写物レベルを反映する。異なるプローブに結合する核酸物質の量を評価し、この情報をあわせてその癌、好適には乳癌、またはその病期に関する遺伝子転写パターン標準を形成する。このような標準パターン各々は、癌、好適には乳癌、または癌の病期に特徴的なものである。
【００９３】
したがって、さらなる態様によれば、本発明は、生物における癌、好適には乳癌、またはその病期に特徴的な標準遺伝子転写パターンを作成する方法であって、少なくとも
ａ）癌、好適には乳癌、またはその病期にある一つまたはそれ以上の生物の試料細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と；
ｂ）工程（ａ）のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、調査中の生物およびその試料に相当する生物およびその試料中の前記癌、好適には乳癌、またはその病期に特異的な前記オリゴヌクレオチドセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と；
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して、前記癌、好適には乳癌、またはその病期の試料において、前記オリゴヌクレオチドが結合する遺伝子の遺伝子発現のレベルを反映する特徴的なパターンを作成する工程と、
を含む方法を提供する。
【００９４】
便宜上、好適には、前記オリゴヌクレオチドは、一種またはそれ以上の固体担体上に固定化されている。
【００９５】
ただし、好適な態様において、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしくはその一部分を増幅するプライマーを使用して前記方法が行われ、増幅産物の量が評価されて前記パターンが作成される。上述したように、本発明の好適な態様においては、標識プローブとプライマーとの両方が使用される。
【００９６】
特定のプローブを用いた、様々な癌、好適には乳癌、およびその異なる病期についての標準パターンをデータベースに蓄積して、要望に応じて検査室で利用できるようにしてもよい。
【００９７】
本明細書における「疾病」の試料および生物、あるいは「癌」の試料および生物は、例えば、腫瘍などの固形塊において異常細胞が増殖している生物（または前記生物からの試料）を意味する。このような生物は、調査中の癌（たとえば乳癌）または癌の病期を有するまたは示すことが知られているものである。
【００９８】
本明細書で言う「癌」には、胃癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、皮膚癌、結腸癌、卵巣癌が含まれ、好適には乳癌である。
【００９９】
本明細書で言う「乳癌」には、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、炎症性乳癌、およびパジェット病などの全種の乳癌、ならびに、髄様乳癌、粘液性（ムコイドまたはコロイド）乳癌、管状腺乳癌、胸部の腺様嚢胞癌、乳頭乳癌、化生性乳癌、胸部の血管肉腫、葉状腫瘍または葉状嚢肉腫、胸部のリンパ腫、および基底乳癌などの、まれなタイプの乳癌が含まれる。
【０１００】
本明細書に記載の方法は、個人が癌、たとえば乳癌を有しているかどうか、特定の癌、たとえば特定の乳癌が存在するかどうかについて、これら条件についての適切な分類モデルを開発することにより、同定または診断するために使用されてもよい。
【０１０１】
癌の「病期」は、特定の生理的または代謝的変化を示しても、示さなくてもよいが、遺伝子発現の変化として検出できる遺伝子レベルでの変化を示す、癌の種々の病期を意味する。当然のことながら、癌の進行中（または治療中）、種々の転写物の発現が異なってもよい。したがって、種々の病期で、発現変化が特定の転写物について「正常」試料と比較して示されなくてもよい。しかしながら、癌の進行を通して一つまたはそれ以上の病期で発現変化を示すいくつかの転写物から得た情報を組み合わせて使用すると、癌の特定の病期を示す特徴的なパターンを得ることができる。したがって、例えば癌の種々の病期、例えば、前段階I（たとえば病期０）、病期I、病期II、病期IIまたは病期IVを識別できる。好適な態様において、本明細書に記載の方法は、たとえば、乳癌、ＤＣＩＳまたはＬＣＩＳの場合、たとえば胸部が何らかの転移の兆候を示したり乳管を超えて移動したりする以前に病期０の癌を検出するために使用されてもよく、また、疾病の種々の病期を区別するために使用することもできる。
【０１０２】
本明細書で使用される用語「正常」とは、比較の目的に使用される生物または試料を意味する。好適には、これらは、特にこれらが正常標準として使用される癌、たとえば乳癌に関する遺伝子発現に影響を及ぼしそうな、なんらかの疾病または状態の兆候を示さない、あるいは、そのような疾病または状態を有するとは思われない、という意味において「正常」のものである。しかし当然のことながら、癌、好適には乳癌の種々の病期を比較してもよく、そのような場合における「正常」試料は、当該癌、好適には乳癌の初期の病期に相当するものでもよい。
【０１０３】
本明細書で使用される用語「試料」は、生物、例えば、細胞を含有する調査中のヒトまたはヒト以外の動物から得た材料を意味し、組織、体液または体内老廃物を含み、あるいは原核生物の場合には、その生物自体を含む。「体液」には、血液、唾液、髄液、精液、リンパ液などがある。「体内老廃物」には、尿、喀痰物（肺疾患患者）、便などがある。「組織試料」には、バイオプシー、外科的介入または他の手段、例えば、胎盤により得られた組織などがある。しかしながら、好適には、試験試料は、癌、好適には乳癌に侵されていないと思われる体の領域からのものである。このような試料における細胞は、疾患細胞、すなわち、癌細胞ではなく、このような疾患細胞と接触状態にあったものではなく、かつ癌部位に由来するものではない。「疾病部位」は、客観的に測定できる方法で疾病、例えば腫瘍を発現する体の領域であると考えられ、たとえば乳癌では疾病部位は胸部である。好適には、末梢血が診断に使用されてもよく、その血液に癌からの悪性細胞または播種性細胞が存在する必要はない。
【０１０４】
また、当然のことながら、標準転写パターンの作成方法および本発明の他の方法は、真核生物の生きている部分、例えば、培養細胞および臓器培養ならびに外植片への使用にも適用できる。
【０１０５】
本明細書で使用される「相当する」試料などは、好適には同じ組織、体液または体内老廃物からの細胞を意味するが、それ以外でもさらに標準または試験パターンを作成する目的に充分に同じである組織、体液または体内老廃物からの細胞をも含む。プローブに「相当する」遺伝子に関して使用するとき、これはプローブに対し、配列（相補的でもよい）によって関連づけられる遺伝子を意味するが、プローブは発現の異なるスプライシング産物を反映するものでよい。
【０１０６】
本明細書で使用される用語「評価」は、絶対的または相対的な観点で判定できる定量的評価および定性的評価の両方を意味する。
【０１０７】
本発明は、以下のようにして実施できる。
【０１０８】
癌、好適には乳癌、またはその病期のための標準転写パターンを作成するために、試料ｍＲＮＡを、癌、好適には乳癌、またはその病期にある個体または生物から公知の手法（例えば、Sambrookら (1989)、Molecular Cloning:A laboratory manual（実験マニュアル）、2nd ED.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、参照）により、組織、体液または体内老廃物の細胞から抽出する。
【０１０９】
ＲＮＡを用いて操作することが困難であるので、好適にはＲＮＡを逆転写して第一鎖ｃＤＮＡを形成する。しかしながら、ｃＤＮＡのクローニング、あるいはｃＤＮＡライブラリーからまたはｃＤＮＡライブラリーを用いての選択は、本発明におけるこの方法または他の方法では必要ない。好適には、第一鎖ｃＤＮＡの相補的鎖、すなわち、第二鎖ｃＤＮＡを合成するが、これは、いずれの対応鎖がオリゴヌクレオチドプローブに存在するかによって決まる。しかしながら、または、ＲＮＡは、逆転写なしで直接使用することができ、必要に応じて標識することもできる。
【０１１０】
好適には、ｃＤＮＡ鎖を、適当なプライマーを使用することにより、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの公知の増幅方法により増幅させる。または、ｃＤＮＡ鎖を、大腸菌などのバクテリアを形質転換するのに使用されるベクターを用いてクローニングした後、成長させて核酸分子を増殖させてもよい。ｃＤＮＡの配列が既知のものでない場合には、プライマーを、導入された核酸分子の領域に向けてもよい。したがって、例えば、アダプターを、ｃＤＮＡ分子、およびこれらの部分に向けられたプライマーにライゲーションして、ｃＤＮＡ分子を増幅することができる。または、真核生物試料の場合には、ＲＮＡのポリＡテールおよびキャップを利用して適当なプライマーを調製してもよい。
【０１１１】
癌、好適には乳癌、またはその病期の標準診断遺伝子転写パターンまたはフィンガープリントを作成するために、上記オリゴヌクレオチドプローブを使用して、疾病試料のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを探索（probe）することにより、各特定のオリゴヌクレオチドプローブ種、すなわち、ユニークな各プローブにハイブリダイズさせるためのシグナルを生成する。また、必要に応じて、正常試料からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、標準対照遺伝子転写パターンを作成してもよい。したがって、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、適当な条件下でオリゴヌクレオチドプローブと接触させてハイブリダイズさせる。または、高度および中程度発現の遺伝子についての特異的プライマー配列を設計してもよく、定量的ＲＴ−ＰＣＲなどの方法を使用して高度および中程度発現の遺伝子、特に本明細書に記載のような遺伝子のレベルを判定することもできる。したがって、当業者は、生物学的試料においてｍＲＮＡの相対レベルを判定するのに当該技術分野において公知である種々の方法を使用することができる。
【０１１２】
複数の試料を調査（probe）するときには、例えば、一つ以上の固体担体、すなわち、プローブキットモジュール上で同じプローブを用いて連続的に実施するか、あるいは対応するプローブ、例えば、対応のプローブキットのモジュールに同時にハイブリダイズさせることにより実施できる。
【０１１３】
ハイブリダイゼーションがいつ生じたかを確認し、転写物の数／（オリゴヌクレオチドプローブに結合するようになったｃＤＮＡ分子）という指標を得るためには、転写物（または関連する分子）がハイブリダイズするとき（例えば、二本鎖核酸分子を検出することにより、または例えば、洗浄により未結合分子を除去した後に結合した分子の数を検出することにより、または、増幅産物により生成されたシグナルの検出により）に生成するシグナルを確認する必要がある。
【０１１４】
シグナルを得るために、ハイブリダイズする一方または両方の成分（すなわち、プローブおよび転写物）は、情報伝達手段またはその一部分を担持するかまたは形成する。この「情報伝達手段」は、シグナルの生成または存在により直接的または間接的に検出できる部分である。該シグナルは、いずれの検出可能な物理的特性、例えば、放射線放出、散乱または吸収の特性、磁気特性または他の物理的特性、例えば、存在する分子の電荷、サイズまたは結合特性（例えば、標識）、あるいは生成することがある分子（例えば、ガス放出など）により付与されるものでよい。シグナル増幅できる方法、例えば、酵素の触媒作用により単一の活性結合部位から複数のシグナル事象を生成して、複数の検出可能な産物を生成する方法が好ましい。
【０１１５】
便宜的には、情報伝達手段は、自ら検出可能なシグナルを与える標識であることがある。また便宜的には、これは、ｃＤＮＡ産生中、相補的ｃＤＮＡ鎖の調製、標的ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡの増幅中に組み込まれることがあるか、または標的核酸分子に直接付加される、放射性または他の標識を使用することによりおこなう。
【０１１６】
適切な標識は、転写物／ｃＤＮＡの存在を直接的または間接的に検出または測定することを可能にするものが適当である。このような標識には、例えば、放射能標識、化学標識、例えば、発色団または蛍光体（例えば、フルオレセインおよびローダミンなどの染料）、または高電子密度の試薬、例えば、フェリチン、ヘモシアニンまたは金コロイドなどがある。または、標識は、酵素、例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリ性フォスファターゼでもよい。この場合、酵素の存在は、好適な実体物、例えば、基質との相互作用により可視化される。また、標識は、情報伝達ペアの一部分を形成してもよい。この場合、このペアの他のメンバーは、転写物／ｃＤＮＡが結合するオリゴヌクレオチドプローブ上に見られるか、またはオリゴヌクレオチドプローブの近くに見られるものである。例えば、蛍光性化合物およびクエンチ蛍光性基質を使用できる。また、標識を、抗体などの異なる実体物上に設けることもできる。この異なる実体物は、転写物／ｃＤＮＡに付着させた（attached)、例えば、合成または増幅中に使用された塩基に付着させたペプチド部分を認識する。
【０１１７】
シグナルは、ハイブリダイゼーション工程の前、間または後の標識の導入により得ることができる。または、ハイブリダイズする転写物の存在は、他の物理的性質、例えば、それらの吸光度により確認できる。この場合、情報伝達手段は、複合体自体である。
【０１１８】
次に、各オリゴヌクレオチドプローブに関係したシグナルの量を評価する。評価は、定量的でも、定性的でもよく、各プローブへの単一の転写物種（または関連するｃＤＮＡまたは他の産生物）の結合、あるいはユニークなプローブ各々の複数のコピーへの複数の転写物種の結合に基づくものでよい。当然のことながら、定量的な結果により、蓄積される癌の、好適には乳癌の、またはその病期の転写物フィンガープリントについてのさらなる情報が得られる。このデータは、絶対値（マクロアレイの場合）で表してもよいし、または特定の標準または基準、例えば、正常対照試料と比較して求めてもよい。
【０１１９】
さらに、当然のことながら、標準診断遺伝子パターン転写物を、一種またはそれ以上の疾病（癌、好適には乳癌）試料（および使用する場合には正常試料）を用いて調製し、ハイブリダイゼーション工程を実施することにより遺伝子発現において特定の個人のバラツキの方向に偏らないパターンを得ることができる。
【０１２０】
特定の生物における癌、好適には乳癌、またはその病期の同定、診断またはモニタリングの目的のために作成される標準パターンおよび標準診断遺伝子転写物パターンの作成における上記プローブの使用は、本発明のさらなる態様を構成する。
【０１２１】
選択されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて癌、好適には乳癌、またはその病期について、標準診断フィンガープリントまたはパターンを一旦決定したら、この情報を、異なる試験生物または個体におけるその癌、好適には乳癌の有無または程度または病期を同定するのに使用できる。
【０１２２】
試験試料の遺伝子発現パターンを調べるために、標準パターンの作成に使用した試料に相当する細胞を含有する組織、体液または体内老廃物の試験試料を、調査される患者または生物から得る。次に、試験遺伝子転写パターンを、標準パターンについて上記した方法で作成する。
【０１２３】
したがって、さらなる態様によれば、本発明は、試験遺伝子転写パターンの作成方法であって、少なくとも
ａ）前記試験生物の試料の細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と；
ｂ）工程（ａ）のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、調査中の生物およびその試料に対応する生物およびその試料中の癌、好適には乳癌、またはその病期に特異的なオリゴヌクレオチドセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と；
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して、前記試験試料において、前記オリゴヌクレオチドが結合する遺伝子の遺伝子発現レベルを示す前記パターンを作成する工程と、
を含む方法を提供する。
【０１２４】
好適な態様において、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしくはその一部分を増幅するプライマーを使用して前記方法が行われ、増幅産物の量が評価されて前記パターンが作成される。上述したように、本発明の好適な態様においては、標識プローブとプライマーとの両方が使用される。
【０１２５】
次に、この試験パターンを、一つまたはそれ以上の標準パターンと比較して、試料が癌または癌の病期を有する細胞を含有するかどうかを評価することができる。
【０１２６】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、生物における癌、好適には乳癌、またはその病期を診断または同定またはモニタリングする方法が提供される。この方法は、
ａ）前記生物の試料の細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と；
ｂ）工程（ａ）のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、調査中の生物およびその試料に対応する生物およびその試料中の該癌または癌の病期に特異的な前記オリゴヌクレオチドセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と；
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して、前記試料において、前記オリゴヌクレオチドが結合する遺伝子の遺伝子発現のレベルを示す特徴的なパターンを作成する工程と；
ｄ）前記パターンを、前記調査中の生物および試料に対応する生物からの試料を用いて本発明の方法により作成された標準的な診断パターンと比較して、前記調査中の生物において前記癌、好適には乳癌の有無、またはその病期を示す相関関係の度合いを判定する工程と；
を含む。
【０１２７】
工程ｃ）までおよびその工程ｃ）を含む方法は、上記した試験パターンの作成である。
【０１２８】
好適な態様において、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしくはその一部分を増幅するプライマーを使用して前記方法が行われ、増幅産物の量が評価されて前記パターンが作成される。上述したように、本発明の好適な態様においては、標識プローブとプライマーとの両方が使用される。
【０１２９】
本明細書で使用される用語「診断」は、生物における癌、好適には乳癌の有無、またはその病期の判定を意味する。「モニタリング」は、特に個体が癌、好適には乳癌を患っていることが知られているときに癌、好適には乳癌の程度を確定することを意味し、例えば、癌、好適には乳癌の治療効果または進行をモニタリングし、例えば、治療の適切性を判定したり、予後をおこなうことを意味する。好適な態様において、患者はたとえば手術、放射線療法、化学療法などによる治療後、モニタリングされ、正常な発現パターンへの回復により治療の有効性を判断する。
【０１３０】
したがって、好適な様態において、本発明は、生物における癌、好適には乳癌、またはその病期をモニタリングする方法であって、上記ａ）〜ｄ）を含み、前記モニタリングは前記生物における癌、好適には乳癌の治療後、前記治療の有効性を判断するために行われる、モニタリング方法を提供する。試料と標準的な癌、好適には乳癌（またはその病期）との間の相関関係の度合いによって、癌、好適には乳癌に特有の遺伝子発現が残っているかどうか、したがって治療が成功したかどうかが示される。正常な発現パターンへの回復（正常な標準パターンと比較して）が治療の成功を示す。
【０１３１】
癌、好適には乳癌、またはその病期が存在するかどうかは、標準パターンと試験試料パターンとの間の相関の度合いを求めることにより決定できる。これには、正常試料および疾病試料について得られる値の範囲を考慮する必要がある。これは、プローブに結合しているいくつかの代表的な試料についての標準偏差を得て標準を得ることにより確定できるけれども、試験試料が標準に対して密に相関している場合には、単一の試料でも癌、好適には乳癌を同定するための標準パターンを生成するのに充分であると考えてもよい。便宜的には、試験試料における癌、好適には乳癌、またはその病期の有無または程度は、試験試料における有益なプローブの発現レベルに関係するデータを、式１により確定される標準診断プローブパターンに挿入することにより予測できる。
【０１３２】
上記した方法を用いて生成したデータは、最も基本的な視覚表示に表すこと（例えば、強度に関して）から、定量化でき、かつ数学的に表すことができ、種々のプローブが結合する各遺伝子の発現レベルの相互関係を反映した基礎パターンを同定するためのもっと複雑なデータ操作まで、種々の方法を用いて解析できる。便宜的には、このように生成した生データは、以下で記載するデータ処理および統計的方法、特にデータを正規化および標準化し、データを類別モデル（classification model）にあてはめて操作し、前記試験データが癌、好適には乳癌、またはその病期のパターンを反映するかどうかを決定する。
【０１３３】
本発明の方法は、オリゴヌクレオチドプローブが有用である癌、好適には乳癌、またはその病期または進行の確認、モニタリングまたは診断に使用することができる。本発明の「有用な」プローブは、当該癌、好適には乳癌、またはその特定の病期における発現の変化を示す遺伝子を反映するものである。診断目的には本明細書に記載の個別のプローブは、単独で使用したときにはその有用性は充分ではないが、例えば、上記のセットなど、特徴的なパターンを得るためのいくつかのプローブのうちの、一つとして使用するときには有用である。
【０１３４】
好適には、前記プローブは、前記癌、好適には乳癌、またはその病期により全身的に影響される遺伝子に対応する。とりわけ好適には、本発明のプローブに結合し、転写物が得られる前記遺伝子が、中程度または高度に発現する。中程度または高度に発現した遺伝子に対するプローブを使用すると、必要な遺伝子発現データの組を生成するのに必要とする臨床試料が少なくてよく、例えば、血液試料が１ｍｌ未満でよいという利点がある。
【０１３５】
さらに、すでに活発に転写しているこのような遺伝子は、新しい刺激によりポジティブまたはネガティブな形で影響されやすいことが分かった。さらに、該転写物は、すでに一般的に検出可能なレベルで生成されているので、これらのレベルの小さな変化は、例えば、検出可能な一定のしきい値に到達する必要がないので容易に検出できる。
【０１３６】
したがって、さらなる態様において、本発明は、癌、好適には乳癌、またはその病期の診断、同定、またはその進行のモニタリングに使用することができる以下に記載のようなプローブセットを提供する。
【０１３７】
この診断法は、他の診断法の代替法として単独で使用してもよいし、このような方法に加えて使用してもよい。例えば、本発明の方法は具体的に腫瘍の同定および／または診断において、画像形成法、例えば、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、超音波像形成、核イメージングまたはＸ線イメージングを用いた診断の代替法またはそれに付加した診断方法として使用できる。
【０１３８】
本発明の方法は、原核生物または真核生物からの細胞について実施できる。原核生物または真核生物は、いずれの真核生物、例えば、ヒト、他の哺乳動物および動物、鳥、昆虫、魚および植物、および原核生物、例えば、バクテリアでもよい。
【０１３９】
本発明の方法を実施できる好ましい非ヒト動物には、哺乳動物、特に霊長類、家畜、肉畜および実験動物などがあるが、これらには限定されない。したがって、診断に好ましい動物には、マウス、ラット、モルモット、猫、犬、豚、牛、ヤギ、羊、馬などがある。特に好適には、ヒトの癌、好適には乳癌を、診断し、同定し、またはモニタリングする。
【０１４０】
上記したように、調査中の試料は、生物から得ることができるいずれかの手頃な試料であってもよい。しかしながら、好適には上記のように、試料を疾病部位から離れた部位から得る。このような試料における細胞は、異常細胞ではなく、そのような細胞と接触したことはなく、そして疾病部位からのものではない。このような場合、試料は、これらの基準を満足しない細胞を含有していてもよいが、含有していない方が望ましい。しかしながら、本発明のプローブは、これらの基準を満足する細胞において発現が変化している転写物に関係しているので、たとえ他のバックグランド細胞の存在下であっても、該プローブはこれらの細胞における転写レベルの変化を特異的に検出できるようになっている。
【０１４１】
標準パターンおよび試験パターンの作成方法および診断法では、有用なオリゴヌクレオチドプローブを使用して遺伝子発現データを生成する。場合によっては、特定の方法、例えば、特定の癌、好適には乳癌、またはその病期を診断するのに有用なこれらのプローブを、利用できるプローブ、例えば、表５に記載のオリゴヌクレオチド、表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチド、それらの相補配列および機能的に等価なオリゴヌクレオチドから選択することが必要である。前記誘導オリゴヌクレオチドには、遺伝子識別子が提示されているこれらの表に記載された配列に相当する遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチドなどがある。以下の方法論は、このような有用なプローブを同定するために便利な方法を記載し、より詳細には、本明細書に記載のプローブから好適なプローブのサブセットを選択する方法を記載している。
【０１４２】
特定の癌、好適には乳癌、またはその病期を分析するためのプローブは、当該技術分野において公知の多数の方法により同定できる。これらの方法には、例えば、差分的発現またはライブラリーサブトラクションなどがある（例えば、ＷＯ９８／４９３４２参照）。ＷＯ０４／０４６３８２に記載され、また以下でも記載するように、ほとんどの転写物に情報量が多いことに鑑み、出発点として、本明細書に記載の配列ファミリーに相当するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ種のランダムなサブセットを単純に分析し、そのサブセットから最も有用なプローブを採取することもできる。この場合、選択対象となるプローブが提示される。以下の方法では、異なる試料から得たｍＲＮＡ（または関連分子）が結合した、固定化オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、本発明のプローブ）を使用して、どのプローブが癌、好適には乳癌、例えば、疾病試料、を同定するのに最も有用かを確認する。または、本明細書に記載された方法のために、以下に記載されるサブセットが使用されてもよい。以下の方法では、本明細書に開示されているプローブからのサブセットをどのように同定するか、または本明細書に開示されているプローブと共に使用できる付加的な有用なプローブをどのように同定するか、が示される。以下の方法ではまた、前記プローブがいったん選択された後に試料の分析に使用される統計的な方法が示される。
【０１４３】
固定化プローブは、種々の関連性のない生物または関連した生物から誘導することができる。ここで必要なことは、固定化プローブは、試験生物における相同的な対応物に特異的に結合するものでなければならないことだけである。また、プローブは、市販または公開のデータベースから誘導し且つ固体担体に固定化することもでき、または上述したように、ｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択し単離して固体担体に固定化できる。
【０１４４】
固体担体に固定化されたプローブの長さは、標的配列に特定の結合を可能とするのに充分な長さでなければならない。固定化プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの修飾産物またはＰＮＡ（ペプチド核酸）の形態でよい。好適には、固定化されたプローブは、試験生物において高度または中程度発現の遺伝子であるそれらの相同的対応物に特異的に結合しなければならない。便宜的には、使用されるプローブは、本明細書に記載のプローブである。
【０１４５】
生物試料における細胞の遺伝子発現パターンは、以下で説明するマイクロアレイまたはマクロアレイなどの従来技術を用いるか、または本明細書に記載の方法を用いて作成できる。現在では、高密度オリゴアレイといった、生物試料において多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタリングするためのいくつかの技術が開発されている（Lockhart et al., 1996, Nat. Biotech., 14、p1675-1680）、cDNA microarrays（ｃＤＮＡマイクロアレイ）（Schena et al, 1995, Science,270,p467-470）、およびcDNA macroarrays（ｃＤＮＡマクロアレイ）（Maier E et al., 1994, Nucl. Acids Res., 22, p3423-3424; Bernard et al., 1996, Nucl. Acids Res., 24, p1435-1442）。
【０１４６】
高密度オリゴアレイおよびｃＤＮＡミクロアレイにおいて、数百および数千もののプローブオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡが、スライドガラスまたはナイロン膜上に斑点状に滴下するか、またはバイオチップ上に合成される。試験試料および基準試料から単離したｍＲＮＡを、赤色または緑色の蛍光染料を用いて逆転写により標識し、混合し、ミクロアレイにハイブリダイズさせる。洗浄後、結合した蛍光染料を、レーザーにより検出し、２つの像（各染料について一つ）を得る。２つの像についての得られた赤色スポットおよび緑色スポットの比により、試験試料および基準試料における遺伝子の発現レベルの変化についての情報を得る。または、単一のチャンネルまたは複数のチャンネルミクロアレイによる検討を行ってもよい。
【０１４７】
生成された遺伝子発現データを予備処理する必要がある。これは、いくつかの因子が、ハイブリダイゼーションシグナルの質および量に影響することがあるからである。たとえば、例えば、単離されたｍＲＮＡの質および量の試料ごとのバラツキ、各反応の間における標的分子の標識効率の微小変動、ならびに異なるマクロアレイ間での非特異的結合の量のバラツキは、すべて得られるデータセットにおけるノイズの一因であり、解析前に補正する必要がある。たとえば、分析前に、低い信号／ノイズ比で測定されたものをデータの一群から除去することができる。
【０１４８】
前記データはその後、データ構造の分散を安定にし、プローブ強度の差について正規化するために変換できる。いくつかの変換法が文献には記載されており、Cui, Kerr and Churchill http://www.jax.org/research/churchill/research/expression/Cui-Transform.pdfに概要が記載されている。遺伝子発現データを正規化するためのいくつかの方法が報告されている（Richmond and Somerville, 2000、Current Opin. Plant Biol., 3, p108-116; Finkelstein et al., 2001, "Method of Microarray Data Analysis（マイクロアレイデータ解析法）, CAMDAからの論文、Lin & Johnsom編、Kluwer Academic, p57-68; Yang et al., 2001", "Optical Technologies and Informatics（光技術と情報学）"、 Bittner、Chen, Dorsel & Dougherty編, Proceedings of SPIE, 4266, P141-152; Dudoit et al., 2000, J. AM. Stat. Ass., 97, p77-87; Alter et al. 2000, supra; Newton et al., 2001、J. Comp. Biol., 8, p37-52）。一般的に、倍率またはスケーリング関数をまず計算して強度効果を補正した後、強度の正規化に使用する。正規化の改善に外部コントロールの使用も示唆されている。
【０１４９】
大規模遺伝子発現解析に伴うもう一つの大きな難題は、異なる時間に実施される実験から採取したデータの標準化である。同一実験で得られた試料についての遺伝子発現データは、バックグラウンド補正および正規化後に効率的に比較できることを見いだした。しかしながら、異なる時間に実施された実験で得られた試料からのデータには、解析の前にさらなる標準化が必要である。これは、異なる実験間で実験パラメータにおける微妙な差、例えば、異なる時間に抽出したｍＲＮＡの品質および量の差、標的分子の標識に使用される時間、ハイブリダイゼーション時間または露光時間の差が、測定値に影響するからである。また、調査中の転写物の配列の性質といった因子（それらのＧＣ含量）およびそれらの相対量により、これらが実験プロセスにおける微妙な変動によりどのように影響されるかが決まる。例えば、特定の転写物に対応する第一鎖ｃＤＮＡが第一鎖合成中にどのように効率的に転写され、かつ標識されるか、あるいはハイブリダイゼーション中に相当する標識標的分子がそれらの相補配列にどのように効率的に結合するかが決まる。また、プリントプロセスにおけるバッチ間の差も、作成された発現データにおけるバラツキについての主要な因子である。
【０１５０】
これらの影響に適切に相当し、修正できないと、実験シリーズ間の差、すなわち、異なる実験シリーズからの組み合わせたデータ内の差が、遺伝子発現データセットに含まれる意図する主要情報が悪いものとなる。したがって、必要に応じて、発現データは、データ解析前にバッチ調整しなければならない。
【０１５１】
いくつかの試料における多数の遺伝子の発現をモニタリングすると、多量のデータが得られ、複雑すぎて容易には解釈できない。いくつかの管理されていない、および管理されている多変量データ解析法は、これらの多量のデータセットから有用な生物学的情報を抽出するのに有用であることがすでにわかっている。クラスター分析は、遺伝子発現解析に使用されるいままで最も一般的に使用された手法であり、同様の方法で調節される遺伝子を確認するのに行なわれたり、および／または遺伝子発現プロファイルを用いた新しい／未知腫瘍クラスを確認するのに実施されてきた（Eisen et al., 1998, PNAS, 95, P14863-14868, 上記, Alizadeh et al.、2000, Perou et al., 2000, Nature, 406, p747-752;Ross et al., 2000, Nature Genetics, 24(3), p227-235;Herwig et al, 1999, Genome Res., 9, p1093-1105;Tamayo et al., 1999, Science, PNAS, 96, p2907-2912）。
【０１５２】
クラスタリング法では、遺伝子を、それらの発現プロファイルに基づいて、２つの基準を満足する機能的カテゴリー（クラスター）にグループ化する："均質性"−同じクラスターにおける遺伝子は、発現において極めて類似性が高い；および"分離"−異なるクラスターにおける遺伝子は、発現の類似性は互いに低い。
【０１５３】
遺伝子発現解析に使用されてきた種々のクラスタリング法として、例えば、階層クラスタリング（Eisen et al., 1998, 上記; Alizadeh et al. 2000, 上記; Perou et al. 2000, 上記; Ross et al, 2000, 上記）、Ｋ手段クラスタリング（Herwig et al., 1999, 上記; Tavazoie et al, 1999, Nature Genetics, 22(3), p. 281-285）、遺伝子シェービング（Hastie et al., 2000, Genome Biology, 1(2), research 0003.1-0003.21)、ブロッククラスタリング（Tibshirani et al., 1999, Tech report Univ Stanford.）、格子縞モデル（Lazzeroni, 2002, Stat. Sinica, 12, p61-86）および自己組織化マップ（Tamayo et al. 1999, 上記）などがある。また、多変量統計解析の関連法、例えば、特異値分析（Alter et al., 2000, PNAS, 97(18), p10101-10106; Ross et al. 2000, 上記）または多次元スケーリングを用いたものは、調査中の対象物のディメンションを減らすのに効果的である。
【０１５４】
しかしながら、クラスター解析および特異値分析などの方法は、純粋に調査のためであり、データに存在する内部構造の全体像が得られるだけである。これらは、調査中のクラスの性質に関する入手可能情報が解析に使用されない非管理法である。特定の試料がかけられた生物学的摂動（biological perturbation）の性質は、公知である。例えば、遺伝子発現パターンが解析されている試料が疾病個体由来のものであるか、あるいは健康個体由来のものであるかが分かることがある。そうした場合に、判別解析は、試料を遺伝子発現データに基づく種々のグループに類別するのに使用できる。
【０１５５】
このような解析では、所定クラスのメンバーと非メンバーとの間を識別できるデータをトレーニングすることにより分級器（classifier）が構成される。次に、トレーニングされた分級器を使用して、未知の試料のクラスを予測できる。文献に記載されている判別法として、例えば、スーパーベクトルマシン法（Support Vector Machines）（Brown et al, 2000, PNAS, 97, p262-267)、最隣接（Nearest Neighbour)(Dudoit et al., 2000, supra））、類別ツリー（Classification tree）、（Dudoit et al., 2000, 上記）、ボーテッドクラスフィケーション（Voted Classification）（Dudoit et al., 2000, 上記）、重み付き遺伝子ボーティング（Weighted Gene Voting）（Golub et al., 1999, 上記）およびベイズ類別（Bayesian Classification）（Keller et al., 2000、Tec report Univ of Washington）などがある。ＰＬＳ（部分最小二乗（Partial Least Square））回帰分析を最初に使用して遺伝子発現データセットにおけるディメンションを減少させた後に、ロジスティック判別分析解析および二次判別解析（LDおよびQDA）を用いる類別がなされる手法も、最近報告されている（Nguyen&Rocke, 2002, Bioinformatics, 18、p39-50および1216-1226）。
【０１５６】
遺伝子発現データが従来の判別法に及ぼす困難は、発現が解析する遺伝子の数が、解析している試料の数と比較して極めて多いことである。しかしながら、ほとんどの場合において、判別解析の問題に有用であるのは、これら遺伝子のほんの少しの部分に過ぎない。さらに、無関係の遺伝子からのノイズが有効な遺伝子からの情報をマスクしまたはゆがめる恐れがある。マイクロアレイ研究に有用である遺伝子を確認および選択するのに有効であるいくつかの方法が文献、例えば、ｔ統計量（Dudoit et al., 2002, J. AM. Stat. Ass., 97、p77-87）、分散分析（Kerr et al., 2000, PNAS, 98j, p8961ー8965）、近接解析（Neighbourhood Analysis）（Golub et al., 1999, 上記）、群間：群内平方和の比（Ratio of Between Groups to Within Groups Sum of Squares）（Dudoit et al.,2002, 上記）、ノンパラメトリックコアリング（Non Parametric Scoring）（Park et al., 2002, Pacific Symposium on Biocomputing, p52-63）および尤度選択（Likelihood Selection）（Keller et al., 2000, 上記）において示唆された。
【０１５７】
本明細書に記載の方法において、正規化および標準化された遺伝子発現データは、部分最小二乗回帰（ＰＬＳＲ）を用いることにより解析される。ＰＬＳＲは主に連続量データの回帰分析に使用される方法であるけれども、バイナリーコードに基づくダミー応答マトリックス(dummy response matrix)を用いたモデル構築および判別分析のための方法としても利用できる。クラスの割り当ては、単純な二分識別、例えば、乳癌（クラス１）／健康（クラス２）に基づくもの、または複数疾病診断、例えば、乳癌（クラス１）／卵巣癌（クラス２）／健康（クラス３）に基づく複数識別に基づくものである。類別用疾病リストは、他の癌または癌の病期に対応する、入手可能な試料に応じて増加できる。
【０１５８】
類別法として適用されるＰＬＳＲは、ＰＬＳ−ＤＡ（ＤＡは、判別解析を意味する）と称される。ＰＬＳ−ＤＡは、Ｙマトリックスがｎ行（試料数に相当する）およびＫ列（クラス数に相当）を含むダミーマトリックスであるＰＬＳＲアルゴリズムの延長である。Ｙマトリックスは、１を第ｋ列に挿入し、−１を他のすべての列に挿入することにより構成される（Ｘの相当する第ｉ番目の対象がクラスｋに属する場合）。ＹをＸ上に回帰することにより、新しい試料の分類は、適合式
【数１】
の最大成分に相当するグループを選択することにより達成される。したがって、−１／１応答マトリックスにおいて、０未満の予測値は、試料が−１としたクラスに属することを意味し、一方０を超える予測値は、試料が１としたクラスに属することを意味する。
【０１５９】
通常、ＰＬＡ−ＤＡを、共線データを取り扱えるので、類別問題のための出発点として使用し、ＰＬＳＲの特質をディメンション減少法として使用することが好ましい。この目的が満足されたら、さらなる情報を抽出するのに有効であることが判明した線形判別分析ＬＤＡなどの他の方法を使用することができる（Indahl et al., 1999, Chem. and Intell. Lab. Syst., 49, p19-31）。この手法は、まずＰＬＳ−ＤＡを用いてデータを分解した後、スコアベクトル（最初の変数の代わりに）をＬＤＡへの入力として用いる。ＬＤＡについての詳細は、Duda and Hart（Classification and Scene Analysis, 1973, Whiley, 米国）に記載されている。
【０１６０】
モデル構築に続く工程は、モデルバリデーションである。この工程は、多変量分析の最も重要な面に含まれると考えられ、構築された校正モデルの「良好性」を試験する。この作業において、クロスバリデーション（cross validation）法が、バリデーションに使用された。この方法において、モデルが残りのデータに基づいて完全クロスバリデーションを用いて構築される間に、各セグメントにおいて１つまたは数個の試料は除外されている。次に、除外された試料は、予測／類別に使用される。単純クロスバリデーションプロセスを数回反復（各クロスバリデーションについて異なる試料を保持する）して、いわゆる二重クロスバリデーション法をおこなう。この方法は、本明細書に記載の実施例のいくつかに示すような限定されたデータ量の場合にうまくいくことが分かった。また、クロスバリデーション工程は数回反復されるため、モデルバイアスおよびオーバーフィッティングの危険が減少する。
【０１６１】
校正モデルがいったん構築されかつバリデーションされると、モデルにおける所望の情報を表す最も関係のある発現パターンを示す遺伝子を、本明細書に記載の変数選択についての従来技術に記載されている方法により選択できる。変数選択は、最終的なモデルの複雑さを減少させるのに役立ち、削ぎ落としたモデルが得られ、したがって、予測に使用できる信頼のおけるモデルが実現できる。さらに、診断目的の遺伝子の数が少ないほど、診断産物のコストが減少する。かようにして関連のある遺伝子に結合するであろう有用なプローブを同定できる。
【０１６２】
本発明者らは、校正モデルを構築した後、再サンプリング法に基づくジャックナイフ（Effron、1982、The Jacknife, the Bootstrap and other resampling plans（ジャックナイフ、ブートストラップおよび他の再サンプリングプラン）、Society for Industrian and Applied mathematics、米国フィラデルフィア）のような統計的手法が、有意な変数（有用なプローブ）を選択または確認するのに効率的に使用できることを見いだした。ＰＬＳ回帰係数Ｂの近似不確定分散は、下式により推定できる。
【０１６３】
【数２】
式中、
Ｓ2Ｂ＝Ｂの推定不確定分散；
Ｂ＝すべてのＮ対象を用いたクロスバリデーションランクＡでの回帰係数；
Ｂm＝クロスバリデーションセグメントｍにおいて除外された対象を除くすべての対象を用いたランクＡでの回帰係数；および
ｇ＝スケーリング係数（但し、ｇ＝１）。
【０１６４】
本発明者らの手法において、ジャックナイフを、クロスバリデーションとともに実施した。各変数について、クロスバリデーションサブモデルにおけるＢ係数Ｂiと総モデルについてのＢtotとの間の差を、まず算出する。次に、その差の平方和を、すべてのサブモデルにおいて算出して変数についてのＢi推定値の分散を得る。Ｂiの推定値の有意性を、ｔ検定を用いて計算する。したがって、得られた回帰係数を、２標準偏差に対応する不確定限界を用いて示すことができ、それから、有意な変数が検出される。
【０１６５】
この工程の実施または使用については、市販のソフトウエア（The Unscrambler、CAMO ASA、Norway）で実施されているので、ここではさらに詳細には説明しない。また、ジャックナイフを用いた変数選択についての詳細も、Westad & Martens（2000、J.Near Inf. Spectr., 8, p117-124）において記載されている。
【０１６６】
以下の手法は、遺伝子発現データセットから有用なプローブを選択するのに使用できる：
ａ）一クロスバリデーションセグメント当たり一つのユニークな試料（データセットに存在する場合にはその反復を含む）を除外する；
ｂ）ＰＬＳＲ−ＤＡを用いて残りの試料について校正モデル（クロスバリデーションセグメント）を構築する；
ｃ）ジャックナイフ基準を用いて、工程ｂ）におけるモデルについて有意な遺伝子を選択する；
ｄ）上記３つの工程を、データセットにおけるすべてのユニークな試料を一度は除外する（工程ａ）で述べたように）まで繰り返す。例えば、データセットに７５のユニークな試料が存在する場合には、７５の異なる校正モデルを構築して、７５組の異なる有意なプローブ群を得る；
ｅ）工程ｄ）で作成した有意なプローブの組において発生頻度基準を用いて最も有意な変数を選択する。例えば、すべての組（１００％）において現れるプローブセットは、工程ｄ）において作成した組の５０％にしか現れないプローブよりも有用である。かかる方法は実施例１で行われる。
【０１６７】
疾病についての有用なプローブを選択したら、最終モデルを作成し、バリデーションする。モデルをバリデーションする最も一般的に使用されている２つの方法は、クロスバリデーション（ＣＶ；cross validation）および試験セットバリデーションである。クロスバリデーション（交差確認）では、データを、ｋ個のサブセットに分ける。次に、モデルをｋ回トレーニングし、毎回、トレーニングからサブセットのうちの一つを除外する。この場合、除外されたサブセットのみを用いてエラー基準、ＲＭＳＥＰ （予測の二乗平均平方根誤差）を算出する。ｋが試料サイズと等しい場合、これを、「一除外（Ｌｅａｖｅ−Ｏｎｅ−Ｏｕｔ）」クロスバリデーションと称する。一つのバリデーションセグメント当たり一つまたは数個の試料を除外することは、種々の実験間の共分散がゼロである場合のみに有効である。したがって、「一回一試料」法は、複製物を含む場合には有効であるとは言えない。これは、複製物の一つのみを除外することは、本発明者らの解析において組織的バイアスが導入されるからである。この場合の正しい手法は、一度に同じ試料のすべての複製物を除外することである。これはＣＶセグメント間の共分散がゼロであるという前提を満足するからである。
【０１６８】
モデルバリデーションの第二の方法は、校正モデルをバリデーションするために別個の試験組を使用するものである。これには、別個の一組の実験を試験の組として実施する必要がある。これは、実地試験データが得られることを前提として好ましい方法である。
【０１６９】
次に、最終モデルを、試験試料における癌、好適には乳癌、またはその病期を同定するのに使用する。このために、選択された有用な遺伝子の発現データを試験試料から作成した後、最終モデルを使用して、試料が疾病クラスまたは非疾病クラスであるかどうか、すなわち、試料が癌、好適には乳癌、またはその病期を有する個人からのものであるかどうかを判定する。
【０１７０】
好適には、類別を目的としたモデルを、上記の方法にしたがって同定したプローブ、および／または、上述されたプローブに関するデータを用いて作成する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ｃＤＮＡ（用語「オリゴヌクレオチド」の範囲に含まれる）を用いる場合には、かなりの長さを有している。有用なプローブとしてこのようなｃＤＮＡ分子を同定することにより、ｃＤＮＡ分子の特異性を反映するが、製造および取り扱いが容易であるもっと短いオリゴヌクレオチドの開発が実現できる。
【０１７１】
次に、上記モデルを使用して試験試料のデータを作成および解析でき、したがって、本発明の診断法に使用できる。このような方法において、試験試料から作成したデータにより、遺伝子発現データセットが得られ、上記した方法で正規化および標準化する。これを、上記した校正モデルにフィッティングして分類する。
【０１７２】
本発明の方法で使用するために単離された集団のうちの多量または中程度の量で発現する遺伝子を同定するために、意図する試料におけるそれらの転写物の相対レベルについての情報を、いくつかの従来技術を用いて作成できる。この目的には、ディファレンシャルディスプレイまたはＲＮＡフィンガープリントといった配列に依存しない方法と、マイクロアレイまたはマクロアレイなどの配列に基づく方法の両方を使用できる。または、高度および中程度発現の遺伝子についての特異的プライマー配列を構成してもよく、定量的ＲＴ−ＰＣＲなどの方法を使用して高度および中程度発現の遺伝子のレベルを決定することもできる。したがって、当業者は、生物学的試料においてｍＲＮＡの相対レベルを決定するのに当該技術分野において公知である種々の方法を使用することができる。
【０１７３】
とりわけ好適には、上記方法におけるｍＲＮＡの単離のための試料は、上記したようなものであり、好適には疾病部位からのものではなく、前記試料中の細胞は疾病細胞ではなく、また疾病細胞と接触したものでなく、たとえば末梢血試料を使用する。
【０１７４】
以下、あくまでも例として、実施例を添付図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】図１は、発生頻度０％のプローブが予備処理済みの遺伝子発現データ（１１２１７個のプローブ）から除去されたときのＰＬＳＲ成分すべてについての予測モデルの精度を示す。
【図２】図２は、ＴａｑＭａｎ ＬＤＡ分析にて９６穴アッセイフォーマットを使用した、異なるＰＬＳ成分の予測モデルの精度を示す。
【図３】図３は、表５のオリゴヌクレオチドから５個以上のプローブをランダムに選択する有効性と、乳癌試料の正確な分類におけるその精度とを示す。
【実施例】
【０１７６】
実施例１：有用なプローブの同定と、乳癌診断での前記プローブの使用
【０１７７】
材料と方法
被験者の情報、およびマイクロアレイ実験用の血液採取
２００２年から２００４年の間に、ノルウェー国内の二つの病院（Ulleval University HospitalおよびHaukeland University Hospital）で、ノルウェーのRegional Ethical Committeeの承認（参照番号416-01151）の下に、書面での同意後、２００の血液試料が収集された。被験者は、１次スクリーニングでのマンモグラムで罹患の疑いがあるとされて２次検査によばれた女性からランダムに選択された。診断用マンモグラフィと、マンモグラフィで所見が陽性の場合には生検または細針吸引と、を含む臨床検査を行う前に、前記試料が収集された。悪性であるか良性であるかは、細胞診で解明した。マンモグラフィでは異常の無かった被験者については、確定診断はマンモグラフィのみであった。
【０１７８】
各女性から、血液２．５ｍｌがＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）チューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ社（スイス）製）に採取され、一晩室温で静置された後、使用するまで−８０℃で保存された。様々な遺伝子発現プラットフォームの方法開発および試験の結果、当初採取された２００の試料中１２１のみが本調査に使用された。診断用マンモグラムと組織病理学的結果により、これら１２１人の女性のうち、５７人が浸潤性乳癌であり、１０人が非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）であり、５４人は悪性の疾患の兆候を示していなかったことがわかった。後者５４人中、１２人には、線維腺腫、嚢胞などの良性の所見、および詳細不明の所見があった（表１）。
【０１７９】
乳癌被験者については、腫瘍の病期、悪性度、およびその他の関連する臨床データが記録された（表１および２）。前記試験グループのメンバーと対照実験グループのメンバーとでは、年齢、閉経状態、および以前の更年期ホルモン療法についてバランスをとった（表３）。前記１２１の試料に加え、二人の健康な女性から複数時点で５つの血液試料を採取し（生物学的複製）、妊娠中の女性から３つの血液試料を採取し、かつ、授乳中の健康な女性から１つの血液試料を採取した。このように遺伝子発現分析用に１２７人の個人から１３０の試料を得た（表１）。
【０１８０】
調査設計
異なるマイクロアレイ製造バッチ、試薬やキットのロット間のバラツキ、日ごとの変動、異なる実験技師に関連した影響などの技術的なバラツキを制御するために、厳密な実験設計に従って行われた。試料はランダムに１０ずつのバッチに分けられ、乳癌患者の女性の試料数と疾患の兆候の無い女性の試料数とがバッチ間で同数になるように含められた。各バッチ中の試料は全てる実験工程を経て処理された。実験工程の各々が単一の技師のみによって行われ、技師たちは癌の病態を知らされていなかった。各バッチには２つの対照実験試料が含まれ、それ以外の１０個と同じ実験手順を経た。これら対照実験試料は、一人の健康な女性から単離された全ＲＮＡから成る。バッチ内の試料の順番はランダム化された。バッチ変動を補正するために、Tibshirani（Tibshirani et al., 2002, PNAS, 99, p6567-6572）によって記載されたバッチ調整法を使用した。１３０の試料と２６の技術的対照試料とを含む、全部で１３のバッチが、分析された。
【０１８１】
ＲＮＡ抽出
ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）チューブが１２チューブのバッチで一晩解凍され、製造者プロトコルにしたがって全ＲＮＡが抽出された。全ＲＮＡは分析まで−８０℃で保存された。２１００バイオアナライザ（Agilent Technologies、米国カリフォルニア州）とＮａｎｏＤｒｏｐＮＤ−１０００分光光度計（Thermo Scientific、米国デラウェア州）をそれぞれ使用して、ＲＮＡの質と量を測定した。
【０１８２】
マイクロアレイ手順
マイクロアレイ遺伝子発現調査は、３２、８７８個のプローブを含み、２９，０９８個の遺伝子を表現する単一チャネルのApplied Biosystems Human Genome Survey microarrays v2.0を使用して行われた。各試料からは、５００ｎｇの全ＲＮＡが、ＮａｎｏＡｍｐＲＴ−ＩＶＴ標識キットプロトコルにしたがって増幅・標識され、１６時間５５℃でアレイ上でハイブリダイズされた。ハイブリダイズ後、ＡＢ１７００リーダを使用して撮像する前に、製造者推奨によりスライドが手作業で洗浄され調製された。Applied Biosystems社のExpression Systemソフトウエアを利用して、遺伝子発現シグナルの同定と定量化、信号−ノイズ比、不良スポットのフラグ立てを行った。さらなる分析のために、原データがエクスポートされた。
【０１８３】
データ分析
Ｒ（R Development Core Team製、R：A Language and Environment for Statistical Computing. 2009）と、Bioconductor project（Gentleman et al., 2004, Genome Biol., , R80）のツールを、必要に応じて適合させて使用し、データ分析を行った。データは以下のように予備処理した。データをｌｏｇ２変換し、信号−ノイズ＜３、またはフラグ値＜８１９１、である個々の測定値は欠測値と設定した。全１５６アレイについて５％を超える欠測値を有するプローブは除外した。予備処理後、１５６個の試料と１１２１７個のプローブが残り、それをさらに分析した。データを標準化（すなわちセンタリングおよびスケーリング）し、欠測値をｋ−近傍転嫁法（Troyanskaya et al., 2001, Bioinformatics, 17, p520-525）によりｋ＝１０を使用して入力した。各遺伝子について主要成分分析および分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を行ったところ、前記データには大きなバッチ効果があることが判明した。同じタイプのデータについて、同様のバッチ効果が以前報告されていた（Dumeaux V, et al.、検討中）。Tibshirani（Tibshirani et al., 2002, 上記）に記載されているように一元配置分散分析法（one-way ANOVA procedure）を使用して、バッチ効果について各プローブを処理した。その後２６個の技術的対照試料が除外された。生物学的複製（一人の被験者からの複数の試料）のために、シグナル強度が各プローブについて平均化された。したがって、それぞれが各個人からの１２７個のアレイが分析に残った。最終的に、グローバルミーンサブトラクション（global mean subtraction）によってアレイ内正規化がおこなわれた。
【０１８４】
発生基準に基づくプローブの同定
上記のように処理されたデータを使用して、
ａ）一クロスバリデーションセグメント当たり一つのユニークな試料（選択された試料のすべての反復を含む）を除外し、
ｂ）ＰＬＳＲ−ＤＡを使用して残っている試料について校正モデル（クロスバリデーションされた）を構築し、
ｃ）ジャックナイフ基準を用いて、工程ｂ）におけるモデルについて有意の遺伝子の組を選択し、
ｄ）ユニークな試料すべてが一旦除外されるまで、前記工程ａ）、ｂ）、およびｃ）を反復し（したがって、（工程ｂ）を１２７回繰り返した後に）全部で１２７の異なる校正モデルが構築され、その結果（工程ｃ）を１２７回繰り返した後に）有意なプローブのセットが１２７通り出来）、
ｅ）有意なプローブの１２７通りのセットから、発生頻度基準を使用して、有意な変数を選択する
ことにより、有用なプローブを単離した。
【０１８５】
上記方法では、遺伝子発現データはダミーコード化応答ベクトルを予測するための予知因子として働いた。前記応答ベクトルは、それが健康な対照物であるか、それとも乳癌試料であるかによって、各試料につき−１または１の値が与えられた。新たな遺伝子発現試料は、もし予測値がゼロより多ければ疾患であると分類され、そうでなければ健康であると分類された。
【０１８６】
使用する分級器（classifier）を構築し試験するために、ダブルクロスバリデーションを伴った、部分最小二乗回帰（ＰＬＳＲ）（Nguyen & Rocke, 2002, Bioinformatics, 18, p1625-1632; Wold: Estimation of principal components and related models by iterative least squares. In Multivariate Analysis. Edited by Krishnaiah PR. New York: Academic Press; 1966, p391-420）を使用した。ジャックナイフ試験と組み合わせて一除外クロスバリデーション（ＬＯＯ−ＣＶ）を伴ったＰＬＳＲを使用して（Gidskehaug et al., 2007, BMC Bioinformatics, 8, p346; Wu: Jackknife, bootstrap and other resampling plans in regression analysis. The Annals of Statistics, 1986, 14, p1261 -1350）、有意なプローブを選択した。詳細には、ＬＯＯ−ＣＶは最適な数の成分と各プローブに関する回帰係数の一組とを示し、ジャックナイフ特性選択は０ではない回帰係数を有するプローブを選択するために使用される（ｐ値≦0.05）。ＰＬＳＲモデルがこれら有意なプローブ上に再構築され、再度、最適な数の成分を選択するためにＬＯＯ-ＣＶが使用された。最後に、分級器の精度を試験するために、ＬＯＯ-ＣＶの独立ループに上記の分析が組み込まれた（Varma & Simon, 2006, BMC Bioinformatics, 7, p91)。
【０１８７】
このように、発生基準に基づいて選択された有用なプローブが、分類モデルを構築するために使用された。同定された有用なプローブは、発生頻度に基づいてグループ化された。たとえば、１２７クロスバリデーションモデルの全てで有用なプローブは１００％に分類され、クロスバリデーションモデルの９０％のみにおいて有用なプローブは、９０％に分類され、少なくとも１つのバリデーションセグメントで有用であったプローブは０％に分類された。
【０１８８】
結果
表４は、発生頻度基準に基づいて同定されたプローブの数と、およびこれらプローブに基づいた遺伝子発現特性の推定診断精度とを示す。遺伝子選択手順がインナー二重クロスバリデーションルーチン（inner double cross validation routine）に基づくので、選択バイアスを回避しバイアスの無い精度推定値を得るために、三重クロスバリデーション法を使用した。その結果、発生頻度基準にしたがって０〜９０％に分類されたプローブから、約７５％の精度が予期されることが示された。
【０１８９】
図１は０％プローブ（１２７のクロスバリデーションモデルのうち少なくとも１つにおいて有用であると同定されたプローブ）がデータから除外されたとき、残りのデータに基づくモデルの精度が、全ＰＬＳＲ成分にわたって大きく下がり（最大５７％）、関連する診断情報のほとんどがこのデータから得られていることを示している。
【０１９０】
表５は、識別プローブのオリゴヌクレオチド配列と、ＡＢＩ１７００番号によって識別されるその遺伝子配列とを示している。この表に示されているプローブ番号は、提示されている配列の配列番号を示す。
【０１９１】
実施例２：種々の試料用の、種々のプラットフォーム上の、有用なプローブのサブセットの検証
実施例１では、診断上関連する遺伝子発現特性を構築するために使用できる遺伝子プローブ（０％〜１００％の発生）セットを同定した。ただし、今後の試料の予測において、同定されたプローブの信頼性には疑問があった。ある特定の実験から有用であると同定された変数は、データ主導であり得ることが知られている。使用されている試料の一群に依存していること以外に、発現データを測定するために使用されるプラットフォームもまた、データの質に影響を及ぼしている。したがって、遺伝子プローブセットが一つのプラットフォームにおいて有用であると同定されても、別のプラットフォームがデータ生成に使用される場合に、必ずしも診断の妥当性を保持するとは限らない。これは、プラットフォーム特異的なノイズ成分が、異なるプラットフォーム間では変動するからである。また、測定されている遺伝子発現変化が実際にはわずかであると、たとえば、微細な検査室間のバラツキのために起こる、処理における小さな技術的差異もまた、個々の遺伝子プローブから測定された値に影響し、その情報内容を保持するか失うかを決定づけるかもしれない。
【０１９２】
したがって、異なるシナリオで同定されたプローブの有効性を試験するために、分析を拡張して行った。同定されたプローブの診断的情報が、新規の試料群を使用して別の検査室で行われた個々の実験で保持されたかどうかを試験するために、別の検査室において、ただし同じＡＢＩプラットフォームを使用し、新規の試料群（表６Ａ、４０の試料、２０の乳癌、および２０の非乳癌）を使用してデータが生成された調査の、そのデータを再分析した。
【０１９３】
表６Ｂは、別の検査室で新規の試料群を使用して実験が行われたときであっても、プローブ（０％〜１００％）の様々なセットのすべてがその診断的情報を保持していたことを示している。調査１（実施例１）の０％〜１００％プローブに相当するプローブを使用して診断モデルが展開され、それらは遺伝子発現データの予備処理の後の新たなデータに存在していた（調査２）。精度をクロスバリデーションで推定した。
【０１９４】
さらに異なるプラットフォームの影響を試験するため、調査１（実施例１）で同定された有用なプローブを含むよう展開した、カスタマイズしたアレイ上に存在する有用なプローブのいくつかを分析した。カスタマイズしたアレイの一つは、マイクロアレイ技術に基づくが、異なるプラットフォームプロバイダ（Codelink, GE）によって提供されたアレイであった。その他のアレイは、リアルタイム定量的ＰＣＲ技術に基づいていた。
【０１９５】
前記Ｃｏｄｅｌｉｎｋ調査（調査３）は、その前の実験と比較して、乳癌試料と非乳癌試料の新規の独立した群を使用した（表７Ａ）。３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが、表５に記載されたプローブのいくつかに設計された。使用されたプローブは表７Ｃに示され、表７Ｃはまた、ＡＢＩ１７００遺伝子識別子の参照により同定される、相当する遺伝子をも示している（表５参照）。
【０１９６】
表５に記載のオリゴヌクレオチド配列から良好なプライマーを設計することが難しい場合は、関連する転写物を同定するために、ＡＢＩプローブＩＤ、オリゴヌクレオチド配列、および遺伝子名が使用される。特定の転写物について複数のオリゴヌクレオチドプライマーも設計される場合もある。これは、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドがその相当する転写物に効率的にハイブリダイズするようにするためのものである。
【０１９７】
データの予備処理が、概ね実施例１に記載の通りになされた。表７Ｂは、調査１〜３のいずれにも使用されたカスタマイズしたＣｏｄｅｌｉｎｋプラットフォームに存在した、相当する０％〜１００％プローブに基づく推定精度を示す。その結果、異なるマイクロアレイプラットフォームが使用されても前記様々なプローブセット（０％〜１００％）はその診断情報内容を保持していたことが再度示された。
【０１９８】
調査４において、ＴａｑＭａｎプロトコルが使用された。ＴａｑＭａｎシステムは、各伸長サイクル中に蛍光ＤＮＡプローブ上のＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用してＰＣＲ産物を検出する。前記Ｔａｑｍａｎプローブ（通常２５ｍｅｒ）は、５’末端で蛍光レポーター染料によって、かつ、３’末端で蛍光消光染料によって、標識されている。前記プローブが損なわれていなければ、前記消光染料は前記レポーター染料の発光強度を低減する。もし標的配列が存在すると、前記プローブはその標的にアニールし、プライマー伸長が進むにつれてＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断される。前記プローブの切断によってレポーター染料が消光染料から分離されると、レポーター染料の蛍光はＰＣＲサイクル数に応じて増加する。標的核酸の初期濃度が高ければ高いほど、蛍光の相当な増加がより早く観察される。
【０１９９】
前記「ＴａｑＭａｎプローブ」は、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に共有結合した蛍光色素分子と３’末端の消光分子とから成る。通常２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましいが、長さは変わってもよい。重要ポイントは、前記オリゴヌクレオチドプローブが標的配列に特異的に結合しなければならないということである。いくつかの異なる蛍光色素分子（たとえば、６−カルボキシフルオレセイン、略語：ＦＡＭ、またはテトラクロロフルオレセイン、略語：ＴＥＴ）および消光分子（たとえば、テトラメチルローダミン、略語：ＴＡＭＲＡ、またはジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド・マイナーグルーブバインダー、略語：ＭＧＢ）が、それぞれ５’末端および３’末端に結合して使用できる（かつ、これらが本発明での使用に好適な識別子を構成する）。
【０２００】
ＴａｑＭａｎＬＤＡ用に、６０個の試料から単離された全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した（表８Ａ）。内在性対照物を含む３８４個の選択されたアッセイを使用して、ABI Prism 7900HT Fast System上で遺伝子発現分析を行った。欠測値または平均ｃｔ＞３０があるアッセイはデータ分析以前に除外された（全部で１６６個のアッセイとなった）。ＴａｑＭａｎＬＤＡにおける２０８個のアッセイのデータ（前記２０８個のアッセイをその遺伝子識別子（ＡＢＩ１７００、表５を参照）および機能と連携させて示す、表８を参照）を使用して、正規化および質制御用のアッセイを含む９６穴アッセイフォーマットに適した、限定数のアッセイを同定した。
【０２０１】
図２は、９６穴アッセイフォーマットを使用したモデルの精度を示す（種々のＰＬＳ成分について）。最適５ＰＬＳ成分で、顕著になった特性により、４９／６０試料（８２％）のクラスが正確に予測された。ここでもまた、遺伝子発現特性を発現させるために異なるプラットフォームや技術が使用されても、実施例１（調査１）から誘導されたプローブには診断情報が保持されていた結果が示された。
【０２０２】
図３は、乳癌試料の正確な分類において、表５からランダムに選択した５以上のプローブを使用することの精度を示す。
【０２０３】
【表１】
【０２０４】
【表２】
【０２０５】
【表３】
【０２０６】
【表４】
【０２０７】
【表５−０１】
【表５−０２】
【表５−０３】
【表５−０４】
【表５−０５】
【表５−０６】
【表５−０７】
【表５−０８】
【表５−０９】
【表５−１０】
【表５−１１】
【表５−１２】
【表５−１３】
【表５−１４】
【表５−１５】
【表５−１６】
【表５−１７】
【表５−１８】
【表５−１９】
【表５−２０】
【表５−２１】
【表５−２２】
【表５−２３】
【表５−２４】
【表５−２５】
【表５−２６】
【表５−２７】
【表５−２８】
【表５−２９】
【表５−３０】
【表５−３１】
【表５−３２】
【表５−３３】
【表５−３４】
【表５−３５】
【表５−３６】
【表５−３７】
【表５−３８】
【表５−３９】
【表５−４０】
【表５−４１】
【表５−４２】
【表５−４３】
【表５−４４】
【表５−４５】
【表５−４６】
【表５−４７】
【表５−４８】
【表５−４９】
【表５−５０】
【表５−５１】
【表５−５２】
【表５−５３】
【表５−５４】
【表５−５５】
【表５−５６】
【表５−５７】
【表５−５８】
【表５−５９】
【表５−６０】
【表５−６１】
【表５−６２】
【表５−６３】
【表５−６４】
【０２０８】
表６：同じプラットフォームを使用するが、異なる試料群を用いて異なるラボで行った検定結果
【表６Ａ】
【表６Ｂ】
【０２０９】
表７：異なるプラットフォーム（ＣｏｄｅＬｉｎｋ，ＧＥ）を使用した、異なる検査室および異なるサンプル群での検証結果
【表７Ａ】
【表７Ｂ】
【表７Ｃ−０１】
【表７Ｃ−０２】
【表７Ｃ−０３】
【表７Ｃ−０４】
【表７Ｃ−０５】
【表７Ｃ−０６】
【表７Ｃ−０７】
【表７Ｃ−０８】
【表７Ｃ−０９】
【表７Ｃ−１０】
【表７Ｃ−１１】
【表７Ｃ−１２】
【表７Ｃ−１３】
【表７Ｃ−１４】
【表７Ｃ−１５】
【表７Ｃ−１６】
【表７Ｃ−１７】
【表７Ｃ−１８】
【表７Ｃ−１９】
【表７Ｃ−２０】
【表７Ｃ−２１】
【表７Ｃ−２２】
【表７Ｃ−２３】
【表７Ｃ−２４】
【表７Ｃ−２５】
【表７Ｃ−２６】
【表７Ｃ−２７】
【表７Ｃ−２８】
【０２１０】
表８：リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）によるプローブの検証
【表８Ａ】
【表８Ｂ−１】
【表８Ｂ−２】
【表８Ｂ−３】
【表８Ｂ−４】
【表８Ｂ−５】
【表８Ｂ−６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析技術、特に診断技術に使用できる、細胞中の遺伝子転写レベルを評価するためのオリゴヌクレオチドプローブに関する。便宜上、前記プローブはキットの状態で提供される。遺伝子発現パターンを用意して様々な癌、好適には乳癌や、その病期を同定、診断、またはモニタリングするための技術に、様々なプローブセットを使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
たとえば診断用などの、試料分析の迅速かつ簡便な方法を見つけることは、いまだに多くの研究者の目標である。エンドユーザは、コスト効率がよく、統計的に有意な結果を生み、かつ熟練技術を有する個人を必要とせずに日常的に実施できる方法を求めている。
【０００３】
細胞内での遺伝子発現の分析は、それら細胞の状態について、何より、細胞が由来する個人の状態について、情報を提供するために使用されてきた。細胞中の様々な遺伝子の相対的発現が、体内のある特別な状態を反映しているとして同定されてきた。たとえば、癌細胞は様々なタンパク質の発現変化を呈することが知られ、したがって転写物や発現したタンパク質が病態のマーカーとして使用されうる。
【０００４】
したがって、これらマーカーの存在について生検組織が分析でき、疾病部位由来の細胞がマーカーの存在により身体の別の組織や体液中で同定できる。さらに、変化した発現の生成物が血流に放出されうるので、これら生成物を分析してもよい。さらに、疾患細胞に接触した細胞が、その疾患細胞との直接接触により影響を受け、その結果、遺伝子発現が変化するので、その発現や発現産物を同様に分析してもよい。
【０００５】
しかし、これら方法には限界がある。たとえば、癌の同定用の特定の腫瘍マーカーには数々の欠陥がある。たとえば、特異性や感度の欠如、マーカーが特定の種類の癌以外の病態と会合すること、無症候者の検出が困難であること、などである。
【０００６】
マーカー転写物またはタンパク質を１〜２種類分析することに加えて、より最近では、遺伝子発現パターンが分析されている。疾病の診断を念頭においた大規模な遺伝子発現分析を伴う研究の多くは、疾患組織または細胞由来の臨床試料を使用してきた。たとえば、いくつかの文献は似通った癌タイプを区別するために遺伝子発現データが使用できることを示しているが、そこでは疾患組織または細胞からの臨床試料が使用されていた（非特許文献１、２、３、４)。
【０００７】
しかし、これら方法は疾患細胞、またはそれら細胞の産物、または疾患細胞と接触した細胞を含有する試料の分析に依存してきた。かかる試料の分析は、疾患の存在およびその位置を知っていることが必要であるが、それは無症候患者においては困難であろう。さらに、たとえば脳の疾患の場合など、試料が疾患部位から採取できるとは限らない。
【０００８】
本発明の発明者たちは、非常に重要な発見において、細胞が由来する組織の状態に関する情報を提供するという、身体中の細胞すべてが持つ、まだ解明されていない潜在能力を見出した。特許文献１は、たとえば癌の部位から離れたところから採取された末梢血など、疾患部位から離れた場所の細胞の遺伝子発現の分析について記載している。特許文献２は乳癌やアルツハイマー病の診断用の特定のプローブを記載しており、この参照によりその内容をここに包含する。
【０００９】
この知見は、生命体の身体の各部が互いに動的に相互作用しているという前提に基づく。ある疾患が身体の一部に影響を及ぼす時、身体の他の部分も影響される。この相互作用は、疾患領域から放出されて身体の他の領域にも影響する、生化学的な広範囲のシグナルの結果である。放出されたシグナルの生化学的および生理的変化の性質は、異なる身体部分ごとに異なるが、この変化は遺伝子発現レベルで測定でき、診断目的に使用できる。
【００１０】
生物における細胞の生理学的状態は、そこにおける遺伝子の発現パターンによって判定される。前記パターンは、前記細胞に対する生物学的な内的、外的刺激によって決まり、これら刺激の範囲および性質のいずれかにおける変化により、パターンが変化して、細胞中に異なる遺伝子が発現する。生物学的試料中の細胞での遺伝子発現パターンの全身的変化を分析することにより、それらに作用している生物学的刺激の種類や性質に関する情報を提供することができる、ということが、広く理解されつつある。このように、たとえば試験試料中の細胞の数多くの遺伝子の発現をモニタリングすることにより、それら遺伝子が特定の疾病、状態、または病期に特徴的なパターンを伴って発現しているかどうかを判定することができる。たとえば組織や体液からの細胞における遺伝子活性の変化を測定することが、疾病の診断の強力なツールとなってきている。
【００１１】
かかる方法は様々な利点がある。しばしば、臨床試料を身体中の疾患のある領域から採取することが難しかったりすることがあり、たとえば癌の試料を採取するために生検がよく使用されるなど、身体に望ましくない侵襲を伴ったりすることがある。また、アルツハイマー病の場合など、死後にのみ罹患した脳の標本が採取できる場合がある。さらに、採取できる組織標本が不均一であり、疾患細胞と非疾患細胞とが混在していることも多く、生成された遺伝子発現データの分析を複雑かつ困難にする。
【００１２】
腫瘍の形態学的外観に関しては病原的に均質に見える腫瘍組織の集まりが、分子レベルでは非常に不均一なことがあり（非特許文献３）、実際に本質的に異なる疾病を表す腫瘍を含むことがある（非特許文献２、３)ことが示唆された。疾病、状態、その病期などを同定する目的のためには、臨床試料が疾患組織や細胞から直接由来するものであることを必要としない方法が非常に望ましい。なぜなら複数の種類の細胞の均質混合物である臨床試料が身体中の容易にアクセスできる領域から採取できるからである。
【００１３】
乳癌は、世界中の女性の間で最も多い癌であり、毎年、推定１３０万人が新たに患者となり、４６万５千人が亡くなっている。乳癌死亡率を低減するためには、早期発見と適切な治療が鍵となる。このことから、腫瘍成長中にできるだけ早く治療を開始できるよう早期発見の重要性が強調されている。マンモグラフィ検査、理学的検査、および自己検査が今日主に行われている乳癌検出方法だが、マンモグラフィ検査のみが死亡率を低下させていることが示されている。
【００１４】
触診またはマンモグラフィによって胸部に腫瘍が検出可能になるまでには、腫瘍はすでに数年間存在した可能性があり、離れた臓器にも広がった可能性もある。胸部腫瘍の成長率は個々によりかなり異なる。成長が非常に速くて年２回の検査プログラムが間に合わず、マンモグラフィによる検出にいたる前に臨床症状を呈するものもある。さらに、閉経前の女性や更年期ホルモン治療を受けている女性に見られるような、胸部組織の緻密な女性においてはマンモグラフィの感度はかなり落ちる。緻密な胸部組織の女性にはマンモグラフィの感度が低いため、乳癌検診には、超音波診断法、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ)など、他の画像診断方法が導入されてきた。しかし、超音波は、技師によって差が非常に大きく、時間がかかり、偽陽性結果を伴うことが多い。ＭＲＩは高価であり、偽陽性結果率が高く、また、財源が限られ、世界共通の画像診断ガイドラインが無いため、検診現場でのＭＲＩの使用は制限されている。正確に乳癌を、とくに早期に、検出する改良された方法を必要とすることが、非常に望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】WO98/49342
【特許文献２】WO04/046382
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Alon et al. 1999, PNAS, 96, p6745-6750
【非特許文献２】Golub et al. 1999, Science, 286, p531-537
【非特許文献３】Alizadeh et al., 2000, Nature, 403, p503-511
【非特許文献４】Bittner et al., 2000, Nature, 406, p536-540
【発明の概要】
【００１７】
本発明の発明者たちは、調査中の個人の細胞、たとえば末梢血細胞の遺伝子発現プロファイルによって、癌、好適には早期乳癌を含む乳癌を同定するための予期しない有用性のある新規のプローブセットを見出した。
【００１８】
本発明に至るまでの研究で、本発明の発明者たちは、乳癌患者の多数の遺伝子の発現レベルを、正常患者と対比して調べた。かなりの数の遺伝子が変化した発現を呈していたことが判明し、これら遺伝子は、変化した発現を呈しかつ有用であると考えられるクロスバリデーション（cross validation）モデルの数に応じて、分類することができた。このように、たとえば、発生頻度１００％のものは、クロスバリデーションモデルすべてにおいて変化した発現を呈しかつ有用と考えられたものに関連し、頻度０％のものは、クロスバリデーションモデルの中の少なくとも一つにおいて変化した発現を呈しかつ有用と考えられた。このように、これら遺伝子から、特にその発生頻度に基づいて、相当するプローブが生成できるであろう集まり（pool）が得られ、個人における遺伝子発現のフィンガープリントが生成される。これら遺伝子の発現は癌、好適には乳癌や、個人の中で変化し、したがってその状態に有用と考えられるので、プローブ収集物から生成されたフィンガープリントは、正常な状態と対比して、その疾病を示していると考えられうる。
【００１９】
したがって、本発明は、癌、好適には乳癌、またはその病期に特有の発現パターンになっている細胞中の遺伝子に相当するオリゴヌクレオチドプローブセットであって、前記遺伝子は、前記癌、好適には乳癌、またはその病期によって全身的に影響される、オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。好適には、前記遺伝子は、構成的に中程度または高度に発現する。好適には、前記遺伝子は、疾患（癌、好適には乳癌）細胞からの細胞やかかる疾患細胞に接触した細胞中ではなく、試料中の細胞中で中程度または高度に発現する。
【００２０】
かかるプローブは、特に疾患部位から離れた細胞から単離した時に、病状が臨床的に認識できるレベルへ進行していることには依存せず、癌、好適には乳癌、またはその病期の検出を、発病後の非常に早い段階、他の主観的または客観的な症状が現れる数年前であっても、可能にする。
【００２１】
本明細書で言う「全身的に」影響される遺伝子とは、その発現が体内で疾患細胞または疾患部位に直接接触せずに影響される遺伝子のことであり、検査される前記細胞は疾患細胞ではない。
【００２２】
本明細書で言う「接触」とは、一つの細胞が他の細胞に及ぼす直接の影響、たとえば、免疫反応など、が観察できるくらいに細胞同士がきわめて接近しあうことであって、かかる反応が、第一の細胞から放出され長い距離を超えて第二の細胞に影響する二次的な分子によって仲介されることがないということである。好適には、接触は物理的な接触、または、立体的に可能な限り近接した接触を言い、便宜上、互いに接触する細胞が、たとえば１ｃｍ3以内などの同じ単位体積中に観察されることを意味する。
【００２３】
「疾患細胞」とは、表現形の変化を明示する細胞であって、その存続期間中のある時間に疾患部位に存在している、つまり本件の場合、腫瘍部位の癌細胞、または腫瘍から拡散された癌細胞、好適には乳癌細胞である。
【００２４】
「中程度または高度」に発現した遺伝子とは、コピー数が３０〜１００コピー／細胞（細胞中のｍＲＮＡ分子が平均3(105であると仮定）を超える静止細胞中に存在する遺伝子を言う。
【００２５】
上記の特性を有する特定のプローブが、本明細書中に記載のように提供される。
【００２６】
したがって、一態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブセットであって、前記セットは少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドを含み、前記１０個のオリゴヌクレオチドの各々は、表５に記載されているかまたは表５に記載の配列から誘導されたオリゴヌクレオチド、表５の配列またはその誘導配列の相補配列を有するオリゴヌクレオチド、機能的に同等のオリゴヌクレオチドから選択される、オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。
【００２７】
好適には、前記１０個のプローブの各々は表５に記載の異なるオリゴヌクレオチドに相当するが、前記オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上が、前記相当する誘導されたオリゴヌクレオチド、相補配列または機能的に同等のオリゴヌクレオチドと置換されてもよい、すなわち、同じ遺伝子転写物に結合するオリゴヌクレオチドと置換されてもよい。もしたとえばプライマーのみが使用されるなら、ほぼ確実にオリゴヌクレオチドすべてが誘導されたオリゴヌクレオチドであり、たとえば前記の配列の一部などであろう。
【００２８】
かかるプローブを本発明の製品および方法に使用することは、本発明の別の態様である。
【００２９】
前記「誘導された」オリゴヌクレオチドには、上記表に記載された配列に相当する遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチドがある。表５は、前記の様々な配列の遺伝子識別子（すなわち、提示されたオリゴヌクレオチドに相当する遺伝子配列）を提示している。このことは、ＡＢＩ１７００識別子を示す「ABI Probe ID」という見出しの列に記載されている。前記遺伝子の詳細は、遺伝子、転写物、およびタンパク質についてのPanther Classification System（http://www.pantherdb.org/genes）から得られる。または、詳細はアメリカ合衆国、カリフォルニア州のApplied Biosystems社から直接得られる。
【００３０】
本明細書で言う「オリゴヌクレオチド」は、高分子構造中に少なくとも６つのモノマー、すなわちヌクレオチドまたはその修飾形態を有する核酸分子である。核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡ（ペプチド核酸）、前記核酸分子のハイブリッドまたは修飾型である。それらはたとえば、メチル化によるか、または修飾されたかもしくは非天然の塩基から合成中に構成された、化学的に修飾された形態、例えば、ＬＮＡ（固定核酸）であってもよい。ただし、これらは、相補的配列に結合する能力を保持している。かかるオリゴヌクレオチドは、プローブの標的となる配列に対して本発明に準じて使用され、本明細書ではオリゴヌクレオチドプローブとも、また単に「プローブ」とも称される。
【００３１】
本明細書で言う「プローブ」とは、関連する転写物に結合し、結合した標的分子の存在または量が検出されるようにする、オリゴヌクレオチドである。かかるプローブは、たとえば、標的分子に対する標識（以後、標識プローブと記載する）として作用するか、または、シグナルの生成をたとえばプライマーなど別の手段によって可能にする、プローブであってもよい。
【００３２】
本明細書で言う「標識プローブ」は、標的の配列に結合し、結合した標的の配列と標識プローブが検出可能な標識を備えるようにするプローブ、またはその関連付けの形成により評価されるようなプローブを言う。たとえば、これは標識化されたプローブを使用して達成されてもよく、または前記プローブが下記に記載するように標識化された配列の捕捉プローブとして働いてもよい。
【００３３】
プライマーとして使用される場合、前記プローブは標的配列に結合し、また必要に応じて、別の関連するプライマーと共に、評価および／または定量される標的配列の存在を示す増幅産物の生成を可能にする。前記プライマーは標識を含んでいてもよく、または、前記増幅プロセスが標識を含むかまたは増幅中に示すかして検出を可能にしてもよい。標的配列に結合して検出可能なシグナルの生成を直接または間接的に可能にするオリゴヌクレオチドはいずれも、本発明の範囲内に含まれる。
【００３４】
「プライマー」は、標的配列に対してハイブリッドを形成する一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを指し、適切な条件下で（すなわちヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在下で、かつ適切な温度およびｐHで）、合成開始点として働き、たとえばＰＣＲを介するなど、プライマー配列からの伸長によって標的配列を増幅することを可能にする。
【００３５】
プライマーに依拠する方法においては、好適にはリアルタイム定量的ＰＣＲが使用され、これはリアルタイム定量的ＰＣＲがリアルタイムで少量のＲＮＡを効率よく検出および定量するからである。この後、ｍＲＮＡがまずｃＤＮＡに転写されて、配列特異的プライマーの助けを受けて短ＤＮＡ配列を増幅するために使用される、一般的なＲＴ−ＰＣＲ法がおこなわれる。リアルタイムＰＣＲにおける生産物を検出するための二つの一般的な方法がある。（１）ＳＹＢＲグリーンなど、二本鎖ＤＮＡと結合する非特異性蛍光染料、および（２）たとえばABI TaqMan Systemなど、相補ＤＮＡ標的を有するプローブのハイブリダイゼーション後のみに検出を可能にする蛍光レポーターで標識化されたオリゴヌクレオチドから成る、配列特異性ＤＮＡプローブ（実施例で詳細を検討する）、である。
【００３６】
「表５（または他の表）に記載された配列から誘導されたオリゴヌクレオチド」は、たとえば長さや機能などにおいて本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプローブの用件を満たす、前記表に開示された配列の一部、またはその相補配列を含む。好適には、前記一部は、本発明における使用に適切なサイズのプローブ（プライマーを含む）のために、以下に記載されるサイズを有する。このような誘導されたオリゴヌクレオチドは、開示された配列または相補配列の一部に相当するプライマーなどのプローブを含む。一つよりも多いオリゴヌクレオチドが配列から誘導されてもよく、たとえば一対のプライマーおよび／または標識プローブを生成してもよい。
【００３７】
上記のような「誘導された」オリゴヌクレオチドは、上記表に記載された配列（すなわち、提示されたオリゴヌクレオチドまたは表に挙げられた遺伝子配列）に相当する遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチドも含む。この場合、前記オリゴヌクレオチドは、表５に記載の配列がその一部をなす遺伝子配列の一部を形成する。表５は、ＡＢＩ１７００遺伝子識別子を記載しており、誘導されたオリゴヌクレオチドは上記遺伝子の一部（またはその転写物）またはその相補配列を形成してもよい。したがって、たとえば、識別プローブまたはプライマー配列は、遺伝子上のいずれかの部分から誘導されてもよく、前記遺伝子またはその転写物への特異的な結合が可能である。
【００３８】
好適には、前記セットを形成するオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１５塩基の長さであり、標的分子への結合が可能である。特に好適には、前記オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１０、２０、３０、４０、または５０塩基、かつ、２００、１５０、１００、または５０塩基未満の長さであり、たとえば２０〜２００塩基の長さ、たとえば３０〜１５０塩基の長さ、好適には５０〜１００塩基の長さである。
【００３９】
前記プローブがプライマーの場合も同様であるが、好適には前記プライマーは１０〜３０塩基の長さであり、たとえば１５〜２８塩基の長さであり、たとえば２０〜２５塩基の長さである。プライマーの成長について通常の考察が適用され、たとえば好適には、効率を上げるためにプライマーはＣ＋Ｇ含有量が５０〜６０％であり、ＧまたはＣまたはＣＧまたはＧＣの３’末端で終端すべきであり、前記３’末端はプライマーダイマーを回避するために相補的であってはならず、プライマー自己相補性を回避し、かつ、３’末端のＣやＧの３つ以上の連続を回避すべきである。プライマーは、誘発剤の存在下で所望の伸長生成物の合成を準備するために十分な長さがなければならない。
【００４０】
本発明の実行のための適切なプライマーを同定するために、表に記載された遺伝子配列またはプローブ配列がプライマーまたはプローブを設計するために使用されてもよい。好適には、前記プライマーは、短ＤＮＡ配列を増幅するために生成される（たとえば、７５〜６００塩基）。好適には短い単位複製配列が増幅され、たとえば好適には７５〜１５０塩基などである。前記プローブおよびプライマーはエクソン内で設計されることができ、または、エクソン連結に架かってもよい。たとえば、表５は、ＡＢＩマイクロアレイプローブＩＤを記載し、これはPanther Classification System for Genes, Transcripts and Proteins （http://www.pantherdb.org/genes）を使用して、対応ＡＢＩ Ｔａｑｍａｎ アッセイＩＤを同定するために使用されてもよい。Ｔａｑｍａｎアッセイが同定されれば、それを供給業者から得ることができる。または、遺伝子名や遺伝子記号を使用して、相当する遺伝子配列を、たとえばthe National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)などの公開データベースで同定することができる。もしくは、記載されたオリゴヌクレオチド配列を使用して、それらをＮＣＢＩのNucleotide Blast (Blastn)プログラムを利用して周知の配列に並べ替え、相当する遺伝子や転写物を同定することができる。遺伝子または転写物の配列を使用して、たとえばApplied Biosystems のthe Primer Express Softwareなど、オリゴヌクレオチドやプライマーの設計用のフリープログラムや市販のプログラムを利用することにより、プローブやプライマーを設計できる。
【００４１】
本明細書で言う「相補配列」という用語は、連続した相補塩基（たとえば、Ｔ：Ａ,Ｇ：Ｃ）を有した配列を言い、かかる相補配列はしたがってその相補性により互いに結合できる。
【００４２】
「１０のオリゴヌクレオチド」とは、１０個の異なるオリゴヌクレオチドを言う。表５のオリゴヌクレオチド、表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチド、それらの機能的同等物は、異なるオリゴヌクレオチドとみなされるが、相補的オリゴヌクレオチドは異なるオリゴヌクレオチドとはみなされない。しかし、好適には、少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドは、１０個の表５のオリゴヌクレオチド（または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチド、もしくはそれらの機能的同等物）である。前記１０個の異なるオリゴヌクレオチドは好適には１０個の異なる転写物と結合することができるものである。
【００４３】
好適には、前記オリゴヌクレオチドは表５に記載のものであるか、表５に記載の配列から誘導されたものである。前記誘導されたオリゴヌクレオチドは、これら表に記載された配列に相当する遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチド、またはその相補配列を含む。
【００４４】
好適な態様において、前記オリゴヌクレオチドは、表７Ｃまたは８Ｂに記載されたものであるか、または表７Ｃまたは８Ｂに記載された配列から誘導されたものである。表７Ｃに記載のオリゴヌクレオチドは、その表に載っているオリゴヌクレオチドである。表８Ｂに記載のオリゴヌクレオチドは、表５のオリゴヌクレオチドであって、その表５のＡＢＩ番号が表８Ｂに示されているものである（すなわち表８Ｂのオリゴヌクレオチドは、表５を相互参照することにより得られる）。表５、７Ｃ、および８Ｂに記載の配列は、前記記載されたオリゴヌクレオチド配列と、前記遺伝子識別子（ＡＢＩ Ｎｏ.）が付与されている遺伝子配列とを含む。前記誘導されたオリゴヌクレオチドは、これらの表に記載された配列に相当する遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチド、またはその相補配列を含む。表７Ｃおよび８Ｂは、表５からのＩＤ番号で識別される表５からのプローブのサブセットを示す。本明細書中での表５の参照は、同様に表７Ｃまたは８Ｂの参照と考えてよい。
【００４５】
特に好適には、オリゴヌクレオチドは、表５、７Ｃ、または８Ｂに記載の発生頻度に基づき選択される（表８Ｂの配列の発生頻度情報は、表５の相当する配列から求められてもよい）。このように、好適には、前記プローブセットは、表５、７Ｃ、８Ｂに記載の、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または１００％の頻度を有するものから選択される。特に好適な態様では、セット中のオリゴヌクレオチドすべてが、上記％頻度を有している（または、かかるオリゴヌクレオチドから誘導されている）。別の実施形態では、セット中のオリゴヌクレオチドが、０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の頻度を有していてもよく、すなわち、表５、７Ｃ、または８Ｂのプローブは、セット選択用の１１個のサブグループに分類され、好適にはセット中のオリゴヌクレオチドすべてがこの％頻度を有する。
【００４６】
好適な実施形態において、前記セットは表５、７Ｃ、または８Ｂのプローブ（すなわちオリゴヌクレオチド）（またはその誘導配列、相補配列、または機能的同等物）または上述したサブセットのプローブのすべてを含んでいる。このように、一つの態様においては、前記セットは表５、７Ｃ、または８Ｂのプローブ（またはその誘導配列、相補配列、または機能的同等物）をすべて含み、または、別の様態においては、前記セットは０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の頻度を有するプローブ（またはその誘導配列、相補配列、または機能的同等物）をすべて含み、また、別の様態においては、上記表の少なくとも０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の頻度を有するプローブ（またはその誘導配列、相補配列、または機能的同等物）をすべて含めばよい。好適な様態において、前記セットは、前述のプローブ（またはその誘導配列、相補配列、または機能的同等物）のみから成る。
【００４７】
上述の「セット」とは、ユニークな（すなわち、固有の配列を有する）オリゴヌクレオチドプローブの集まりを言い、好適には、１０００個未満のオリゴヌクレオチドプローブ、特に、５００、４００、３００、２００、または１００個未満のプローブから成り、好適には、１０、２０、３０、４０、または５０個より多いプローブから成り、たとえば、好適には１０〜５００個、たとえば１０〜１００、２００、または３００個、特に好適には２０〜１００個、たとえば３０〜１００個のプローブから成る。場合によっては、１０個未満のプローブ、たとえば、２〜９個のプローブ、５〜９個のプローブ、などが使用されてもよい。
【００４８】
プローブの数を増やせば、問題の特定の遺伝子の発現を同様に変化させうる別の疾患と比較することにより、分析が失敗する可能性、たとえば誤診などを防ぐであろう。本明細書に記載されていない他のオリゴヌクレオチドプローブも、とりわけそれらが前記オリゴヌクレオチドプローブセットの最終使用に役立つ場合、存在してもよい。しかし好適には、前記セットは、前記表５、７Ｃ、または８Ｂのオリゴヌクレオチド、前記表５、７Ｃ、または８Ｃに記載されたものから誘導されたオリゴヌクレオチド、相補配列のオリゴヌクレオチド、機能的に同等なオリゴヌクレオチド、またはそのサブセット（たとえば、前述のようなサイズや種類のもの）のみから成る。
【００４９】
前記ユニークなオリゴヌクレオチドの各々の複数のコピー、たとえば、１０個以上のコピーが、各セットに存在してもよいが、前記コピーは単一のプローブのみを構成する。
【００５０】
オリゴヌクレオチドプローブセットは、好適には固体担体上に固定されていても、かかる固定用の手段を有していてもよく、上記に記載されたものから選択された少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドプローブを含んでいる。上述したように、これら１０個のプローブはユニークであって互いに異なる配列を有していなければならない。しかしながらそうは言うものの、同一の遺伝子を認識するが異なるスプライシング事象を反映する二つの別個のプローブが使用されてもよい。しかし、互いに相補的であり個別の遺伝子に結合するオリゴヌクレオチドプローブが好ましい。
【００５１】
前記セットのプローブがプライマーである場合、好適な様態において、プライマーの対が設けられる。かかる場合、存在すべきオリゴヌクレオチド（たとえば１０個のオリゴヌクレオチド）の参照はしたがって増大し、すなわち、各対が特定の標的配列に対して特異的である１０対のプライマーに相当する２０個のオリゴヌクレオチドとなる。または、前記プローブセットは単一の標的配列に対する標識プローブとプライマーとの両方を含んでもよい（たとえば、以下に詳細に記載されるＴａｑｍａｎアッセイ用）。この場合、存在すべきオリゴヌクレオチド（たとえば１０個のオリゴヌクレオチド）の参照はしたがって３０個のオリゴヌクレオチドまで増大し、すなわち、ある特定の標的配列のための１０対のプライマーとそれに相当する関連の標識プローブとなる。
【００５２】
したがって、好適な様態において、本発明のセットは、少なくとも２０個のオリゴヌクレオチドを含み、前記セットは、プライマーの対を含み、前記プライマーの対の各オリゴヌクレオチドが同じ転写物またはその相補配列に結合し、好適には前記プライマーの各対はそれぞれ異なる転写物に結合する。さらに好適な様態において、本発明は、少なくとも３０個のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブセットを提供し、前記セットは、プライマーの対と、前記プライマーの各対用の標識プローブとを含み、前記プライマーの対の各オリゴヌクレオチドと前記標識プローブは同じ転写物またはその相補配列に結合し、好適には前記プライマーの各対と前記標識プローブは異なる転写物に結合する。前記標識プローブが同じ転写物上で結合する標的配列の、上流または下流に前記プライマーが結合する場合に、前記標識プローブは、そのプライマーの対と「関連している」ということになる。
【００５３】
本明細書で言う、表５に記載のものと「機能的に同等な」オリゴヌクレオチド、またはそこから誘導されたものとは、表５に記載のオリゴヌクレオチドまたはそこから誘導されたものが同定する遺伝子と同じ遺伝子を同定できるオリゴヌクレオチドである。すなわち、それは、表５のオリゴヌクレオチドまたは表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチド（またはその相補配列）が結合するのと同じｍＲＮＡ分子（またはＤＮＡ)であって、遺伝子（標的核酸分子）から転写されたｍＲＮＡ分子に結合できる、オリゴヌクレオチドである。好適には、前記機能的に同等のオリゴヌクレオチドは、表５のオリゴヌクレオチドまたは表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドが認識するのと同じスプライシング産物を認識することができる、すなわち、それに結合することができる。好適には、前記ｍＲＮＡ分子は、表５のオリゴヌクレオチドまたは表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドに相当する、全長ｍＲＮＡ分子である。
【００５４】
本明細書で言う、「結合できる」または「結合する」とは、以下に記載する条件下でハイブリダイズする能力のことを言う。
【００５５】
言いかえると、機能的に同等のオリゴヌクレオチド（またはその相補配列）は、以下に記載するように、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチド、もしくはその相補オリゴヌクレオチドが結合する標的分子の領域に対して配列同一性を有する、または、ハイブリダイズする。好適には、機能的に同等なオリゴヌクレオチド（またはその相補配列）は、後に記載する条件下で、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドに相当するｍＲＮＡ配列の一つに対してハイブリダイズするか、または表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドに相当するｍＲＮＡ配列の一部分に対して配列同一性を有する。「部分」とはこの文脈においては、少なくとも５塩基、たとえば少なくとも１０または２０塩基であって、５〜１００塩基、たとえば１０〜５０や１５〜３０塩基などの一続きのもの（stretch)を言う。
【００５６】
特に好適な態様において、前記機能的に同等なオリゴヌクレオチドは、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドが結合する標的核酸分子（ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の領域のすべて、または一部分、に結合する。「標的」核酸分子は、前記遺伝子転写物または関連する産物、たとえばｍＲＮＡやｃＤＮＡなど、またはその増幅産物である。前記表５のオリゴヌクレオチドまたは表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドが結合する前記標的分子の前記「領域」は、相補性の存する一続き（stretch）である。この領域は、最も大きいもので、前記表５の配列または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドの全長であるが、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドの全体が前記標的配列の領域に対して相補的であるわけではなければ、もっと短くてもよい。
【００５７】
好適には、前記標的分子の領域の一部分は、少なくとも５塩基の一続き（stretch）で、たとえば少なくとも１０または２０塩基であり、たとえば５〜１００塩基、たとえば１０〜５０塩基、１５〜３０塩基などである。これは、たとえば、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドの塩基と同じ塩基を数個有する前記機能的に同等なオリゴヌクレオチドによって得ることができる。これら塩基は、たとえば機能的に同等なオリゴヌクレオチドの一部においてなど、連続したいくつかの範囲（stretches）にわたって同一であってもよく、または、非連続的に存在してもよいが、標的配列への結合を可能にするのに十分な相補性を提供するものである。
【００５８】
したがって、好適な特徴においては、前記機能的に同等なオリゴヌクレオチドは、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチド、もしくはその相補配列に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。言いかえると、前記機能的に同等なオリゴヌクレオチドは、表５のオリゴヌクレオチドのすべてまたは一部分に対して高度な配列同一性を呈する。好適には、前記機能的に同等なオリゴヌクレオチドは、表５のオリゴヌクレオチドの全て、またはその一部分に対して、配列同一性が少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％、たとえば少なくとも９０、９５、９８、または９９％である。この文脈において使用されるように、「一部分」とは、前記表５のオリゴヌクレオチドにおいて、少なくとも５塩基の範囲、たとえば、少なくとも１０または２０塩基の一続き（stretch）であって、５〜１００塩基の一続き、たとえば１０〜５０塩基、または１５〜３０塩基の一続きを言う。前記表５のオリゴヌクレオチドの一部分のみに対して配列同一性が存する場合、特に好適には、前記配列同一性は高く、たとえば上記のように少なくとも８０％である。
【００５９】
上述した機能的な用件を満足する、機能的に同等なオリゴヌクレオチドには、表５のオリゴヌクレオチドから誘導されたものと、単一または複数のヌクレオチド塩基（またはその同等物）の置換、付加、および／または欠失によって修飾されて、たとえば、表５のオリゴヌクレオチドまたはそこからさらに誘導または変更されたものと同じ標的分子に結合するなど、機能的な活性を維持するものと、が挙げられる。好適には、前記修飾は、１〜５０塩基、たとえば１０〜３０塩基、好適には１〜５塩基である。特に好適には、たとえば１０未満の塩基における変更など、わずかな修飾のみが存在することであり、たとえば５未満の塩基の変更である。
【００６０】
「付加」同等物の意味の範囲内に含まれるのは、表５のオリゴヌクレオチド、または表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチドが結合する標的分子上の塩基の連続した一続き（consecutive stretch）に相補的である付加配列を含むオリゴヌクレオチドである。または、前記付加は、異なる、関連しない配列を含んでもよく、それは、たとえばさらなる特性を付与するものであってもよく、たとえば前記オリゴヌクレオチドプローブを固体担体に結合させるリンカー等、固定化の手段を提供するものであってもよい。
【００６１】
特に好適なのは、生物学的変異型など、天然の同等物であり、たとえば、対立遺伝子変異型、地理的変異型、アロタイプ変異型で、たとえば、異なる種に存在するような遺伝的変異型に相当するオリゴヌクレオチドなどである。
【００６２】
機能的同等物には、たとえば非天然塩基などを使用した、修飾塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。かかる誘導物は、合成中や生成後の修飾によって調製されてもよい。
【００６３】
低ストリンジェンシー条件下で結合する「ハイブリダイゼーション」配列とは、非ストリンゲンシー条件下（たとえば、６(ＳＳＣ/５０％ホルミアミド、室温）で結合し、低ストリンジェンシー条件下（２(ＳＳＣ、室温、より好適には２(ＳＳＣ、４２℃）で洗浄した時に結合状態を保つものである。高ストリンジェンシー下でハイブリダイズするとは、洗浄を２(ＳＳＣ、６５℃で行う上記条件を言う。（ＳＳＣ＝０．１５Ｍ塩化ナトリウム, ０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）
【００６４】
本明細書で言う「配列同一性」とは、下記のパラメータを用いてＣｌｕｓｔａｌＷ（Thompson et al., 1994, Nucl. Acids Res., 22, p4673-4680)を使用して評価した時に得られる値である。
ペアワイズアラインメントパラメータ − 方法：正確、マトリクス：ＩＵＢ、ギャップ開始ペナルティ：１５．００、ギャップ伸長ペナルティ：６．６６、
マルチプルアラインメントパラメータ − マトリクス：ＩＵＢ、ギャップ開始ペナルティ：１５．００、％アイデンティティーフォーディレイ（% identity for delay)：３０、ネガティブマトリクス：無し、ギャップ伸長ペナルティ：６．６６、ＤＮＡトランジションウェイティング（transition weighting）：０．５
【００６５】
特定の塩基での配列同一性は、単純に誘導された同一の塩基を含む。
【００６６】
上記のように、便宜上、前記オリゴヌクレオチドプロ―ブセットは一つ以上の固体担体に固定されてもよい。各ユニークなプローブの一つまたは好適には複数のコピーが前記担体に接着され（associated）、各ユニークなプローブのたとえば１０個以上、たとえば少なくとも１００個のコピーが存在する。
【００６７】
一つ以上の特異なオリゴヌクレオチドプローブが個別の固体担体に接着され（associated）、それらが複数の固体担体に固定されたプローブのセットを形成してもよく、たとえば一つ以上のユニークなプローブが複数のビーズ、膜、フィルタ、バイオチップなどに固定され、それらがプローブセットを形成し、それらが後に記載するキットのモジュールを構成してもよい。異なるモジュールの固体担体は、便宜上物理的に結合している（associated）が、各プローブに関連する（associated）シグナル（後に記載するように生成される）は、個別に判定可能でなければならない。
【００６８】
または、前記プローブは、同じ固体担体の個別の部分に固定されてもよく、たとえば、各ユニークなオリゴヌクレオチドプローブが、たとえば複数のコピーの状態で、単一のフィルタまたは膜の異なった個別の部分または領域に固定されて、たとえばアレイを形成してもよい。
【００６９】
かかる手法を組み合わせて使用してもよく、たとえばいくつかの固体担体が使用され、それぞれがいくつかのユニークなプローブを固定してもよい。
【００７０】
「固体担体」という表現は、疎水性、イオン性、または共有結合性の架橋によってオリゴヌクレオチドを結合できる固体材料を意味する。
【００７１】
本明細書で言う「固定する」とは、かかる結合（binding）により前記プローブが前記固体担体へ可逆的または不可逆的に結合すること（association）である。可逆的である場合、前記プローブは、本発明の方法が行われるのに十分な時間の間、前記固体担体に結合（association）した状態である。
【００７２】
本発明による固定部分に適した固定担体は多数、当該技術分野において周知であり、文献に広く記載されている。一般的に言えば、固体担体は、化学的または生化学的方法において、固定化、分離などに現在広く使用されるかまたは提案されている周知の担体またはマトリックスのいずれかでよい。このような材料には、合成有機ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン；またはニトロセルロースおよび酢酸セルロース；またはトシル活性化表面；またはガラスもしくはナイロン、または核酸の共有結合に好適な基を担持するいずれかの表面などがあるが、これらには限定されない。該固定化部分は、例えば、高分子材料、例えば、アガロース、セルロース、アルギナート、テフロン、ラテックス、ポリスチレンまたは磁気ビーズからできている、粒子、シート、ゲル、フィルタ、膜、マイクロファイバーストリップ、チューブまたはプレート、繊維またはキャピラリーの形態をとることができる。好適には一次元での配列の形態を可能とする固体担体、例えば、シート、フィルタ、膜、プレートまたはバイオチップが好ましい。
【００７３】
固体担体への核酸分子の接着（attachment)は、直接的または間接的におこなうことができる。例えば、フィルタを使用する場合には、接着は、ＵＶ誘発架橋によりおこなうことができる。または、接着を、結合部分がオリゴヌクレオチドプローブおよび／または固体担体上に担持された状態で使用されることにより間接的におこなってもよい。したがって、例えば、一対のアフィニティ結合（binding）パートナー、例えば、アビジン、ストレプトアビジンもしくはビオチン、ＤＮＡもしくはＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ｌａｃIレプレッサータンパク質、またはそれが結合するｌａｃオペレータ配列のいずれか）、抗体（モノクローナルまたはポリクローナルでよい）、抗体断片または抗体のエピトープまたはハプテンなどを使用してもよい。これらの場合、結合対の片方を固体担体に結合する（または前記片方が固有的に固体担体の一部分である）か、結合対の他方を核酸分子に結合する（または前記他方が固有的に核酸分子の一部分である）。
【００７４】
本明細書で言う「アフィニティ結合対」とは、特異的に（すなわち、他の分子への結合に優先して）互いを認識しかつ結合する（bind)２つの成分を意味する。かかる結合対は、互いに結合したときに、複合体を形成する。
【００７５】
固体担体への適切な官能基の接着（attachment）は、当該技術分野において周知の方法によりおこなうことができる。このような方法には、例えば、固体担体を処理して好適な表面塗膜を提供することにより形成できる水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基を介した接着が含まれる。結合（binding）パートナーの結合（attachment）に適当な部分を与える固体担体は、当該技術分野において周知の通常の方法により製造できる。
【００７６】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブへの適当な官能基の接着（attachment）は、ライゲーションによりおこなうか、または適当な部分、例えば、ビオチンまたは特定の捕捉配列を担持したプライマーを使用した合成または増幅中に導入されてもよい。
【００７７】
便宜的には、上記したプローブセットは、キットの形態で提供される。
【００７８】
したがって、さらなる態様によれば、本発明は、必要に応じて一種またはそれ以上の固体担体上に固定化された、上記のようなオリゴヌクレオチドプローブセットを含むキットを提供する。
【００７９】
好適には、前記プローブ類を単一の固体担体上に固定化し、各ユニークなプローブを該固体担体の異なる領域に接着させる。しかしながら、複数の固体担体に接着させたとき、前記複数の固体担体は、キットを構成するモジュールを形成する。特に好適には、前記担体は、シート、フィルタ、膜、プレートまたはバイオチップである。
【００８０】
必要に応じて、キットは、正常試料または疾病試料（該キットの使用に関して以下で詳細に説明する）、標準化材料、例えば、比較用の正常試料および／または疾病試料からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ、ｃＤＮＡへの取込み用標識、増幅用核酸配列導入用アダプター、増幅用プライマーおよび／または適当な酵素、バッファーおよび溶液により生成されるシグナルに関係する情報を含んでいてもよい。必要に応じて、前記キットは、添付文書を含んでいてもよい。この添付文書には、本発明の方法をどのように実施するかが記載されており、本発明を実施したときに得られる標準的なグラフ、データまたは結果を解釈するためのソフトウエアが必要に応じて付けられている。
【００８１】
以下に記載される標準的な診断遺伝子転写物パターンを作成するこのようなキットの使用は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００８２】
本明細書に記載のプローブセットには、種々の用途がある。しかしながら、主にこれらは、試験細胞の遺伝子発現状態を評価して、前記細胞が由来する生物に関係する情報を得ることに使用される。したがって、プローブは、生物における癌、好適には乳癌、またはその病期を診断、同定またはモニタリングするのに有用である。
【００８３】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、上記のオリゴヌクレオチドプローブセットまたはキットの使用であって、上記オリゴヌクレオチドプローブが結合する遺伝子の遺伝子発現のレベルを反映する細胞の遺伝子発現パターンを判定するための使用が提供される。この使用は、少なくとも
ａ）前記細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と；
ｂ）工程（ａ）のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプローブセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と；
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して前記パターンを作成する工程と、
を含む。
【００８４】
上述したように、オリゴヌクレオチドプローブは、標的配列の直接標識として働くか（標的配列およびプローブの複合体が標識を担持する場合）、またはプライマーとして使用されてもよい。前者の場合、工程c)はハイブリダイゼーション体を検出する適切な手段によって行われ、たとえばｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが標識される場合、キット中の標識の保持が評価されてもよい。プライマーの場合、これらプライマーは評価される増幅産物を生成するために使用されてもよい。この場合、工程ｂ）において、前記プローブがｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズされて、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしくはその一部分を（本明細書に記載された部分用のサイズ、または、単位複製配列の好適なサイズに）増幅するために使用され、工程ｃ）において、前記パターンを作成するために増幅産物の量が評価される。
【００８５】
プライマーと標識プローブの双方が使用される技術の場合、上記方法で前記プライマーおよび標識プローブが、工程ｂ）においてｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズされて、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしくはその一部分を増幅するために使用さる。この増幅により、関連する標的配列に結合しているプローブを置換し、シグナルを生成する。この場合、工程ｃ）において、生成されたシグナルの存在または量を判定することにより、プローブをハイブリダイズしたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量が評価される。したがって、好適な態様において、前記プローブは標識プローブとプライマー対であり、工程ｂ）において前記標識プローブとプライマーはｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズし、前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしくはその一部分が前記プライマーを使用して増幅され、前記標識プローブが標的配列に結合した時、それは増幅中に置換され、シグナルを生成し、工程ｃ）において、生成されたシグナルの量が評価されて前記パターンを作成する。本明細書中に記載されたような前記プローブの標的配列への結合の存在または量の検出のモデルはすべて、上述された方法および以下に記載される本発明の方法によってカバーされる。
【００８６】
この方法および以下で述べる方法において言及されるｍＲＮＡおよびｃＤＮＡは、前記分子の誘導体またはコピー、例えば、相補鎖の増幅または調製により製造されるもののような分子のコピーであるが、ｍＲＮＡ配列の同一性が保持されており、すなわち、前記分子の少なくともある領域について相補性または配列の同一性が高いので、直接転写物（またはその相補的配列）にハイブリダイズするようなものを含む。当然のことながら、転写物をトランケート（truncate）したり、あるいは例えば、プライマー増幅により新しい配列を導入する手法が使用された領域全体にわたって、相補性が存在するわけではない。便宜上、前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、工程ｂ）の前に増幅することが好ましい。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと同様に、前記分子は、例えば、相補性が維持されるならば合成中に非天然塩基を使用して修飾してもよい。また、このような分子は、シグナル伝達手段または固定化手段などのさらなる部分を担持していてもよい。
【００８７】
このようなパターンを作成する方法に含まれる様々な工程を、以下詳細に説明する。
【００８８】
本明細書で言う「遺伝子発現」とは、特定の遺伝子の転写により特異的ｍＲＮＡ産物（すなわち、特定のスプライシング産物）が生成することを意味する。遺伝子発現レベルは、転写ｍＲＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子から逆転写されたｃＤＮＡ分子、または例えば増幅によりこれらの分子から得られた産物のレベルを評価することにより判定することができる。
【００８９】
この手法により得られた「パターン」は、例えば、表の形またはグラフ状に表すことができる情報を言い、二種またはそれ以上のオリゴヌクレオチドと関係するシグナルについての情報を伝達する。好適には、前記パターンは、各プローブと関連した発現レベルに関する数のアレイ（array）として表される。
【００９０】
好適には、前記パターンは、以下の線形モデルを用いて確定される：
ｙ＝Ｘｂ＋ｆ 式１
（式中、Ｘは遺伝子発現データのマトリックスであり、ｙは反応変数であり、ｂは回帰係数ベクトルであり、ｆは推定残余ベクトルである。式１に表される関係を確定するのに種々の異なる方法を使用することができるが、式１の関係を確定するためには、特に好適には部分最小二乗回帰（ＰＬＳＲ）を使用する。
【００９１】
したがって、前記プローブは、細胞が単離される時点での遺伝子発現を反映するパターンを作成するのに使用される。その発現パターンは、細胞を取り巻く周囲の状況に特徴的なものであり、細胞に及ぼされる影響により異なる。したがって、癌、好適には乳癌、またはその病期を有する個体からの細胞について特徴的な遺伝子転写パターンの標準またはフィンガープリント（標準プローブパターン）を作成して、試験細胞の転写パターンとの比較に使用されてもよい。これは、生物が癌、好適には乳癌を患っているかまたはその特定の病期にあるかどうかを診断、モニタリングまたは同定することに用いることができるのは明らかである。
【００９２】
前記標準パターンは、癌、好適には乳癌を有するか、その病期にある一つまたはそれ以上の生物から得た試料の細胞についての全ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡまたは関連産物）のプローブへの結合の程度を求めることにより作成される。これは、ユニークなプローブの各々に相当し、存在する転写物レベルを反映する。異なるプローブに結合する核酸物質の量を評価し、この情報をあわせてその癌、好適には乳癌、またはその病期に関する遺伝子転写パターン標準を形成する。このような標準パターン各々は、癌、好適には乳癌、または癌の病期に特徴的なものである。
【００９３】
したがって、さらなる態様によれば、本発明は、生物における癌、好適には乳癌、またはその病期に特徴的な標準遺伝子転写パターンを作成する方法であって、少なくとも
ａ）癌、好適には乳癌、またはその病期にある一つまたはそれ以上の生物の試料細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と；
ｂ）工程（ａ）のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、調査中の生物およびその試料に相当する生物およびその試料中の前記癌、好適には乳癌、またはその病期に特異的な前記オリゴヌクレオチドセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と；
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して、前記癌、好適には乳癌、またはその病期の試料において、前記オリゴヌクレオチドが結合する遺伝子の遺伝子発現のレベルを反映する特徴的なパターンを作成する工程と、
を含む方法を提供する。
【００９４】
便宜上、好適には、前記オリゴヌクレオチドは、一種またはそれ以上の固体担体上に固定化されている。
【００９５】
ただし、好適な態様において、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしくはその一部分を増幅するプライマーを使用して前記方法が行われ、増幅産物の量が評価されて前記パターンが作成される。上述したように、本発明の好適な態様においては、標識プローブとプライマーとの両方が使用される。
【００９６】
特定のプローブを用いた、様々な癌、好適には乳癌、およびその異なる病期についての標準パターンをデータベースに蓄積して、要望に応じて検査室で利用できるようにしてもよい。
【００９７】
本明細書における「疾病」の試料および生物、あるいは「癌」の試料および生物は、例えば、腫瘍などの固形塊において異常細胞が増殖している生物（または前記生物からの試料）を意味する。このような生物は、調査中の癌（たとえば乳癌）または癌の病期を有するまたは示すことが知られているものである。
【００９８】
本明細書で言う「癌」には、胃癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、皮膚癌、結腸癌、卵巣癌が含まれ、好適には乳癌である。
【００９９】
本明細書で言う「乳癌」には、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、炎症性乳癌、およびパジェット病などの全種の乳癌、ならびに、髄様乳癌、粘液性（ムコイドまたはコロイド）乳癌、管状腺乳癌、胸部の腺様嚢胞癌、乳頭乳癌、化生性乳癌、胸部の血管肉腫、葉状腫瘍または葉状嚢肉腫、胸部のリンパ腫、および基底乳癌などの、まれなタイプの乳癌が含まれる。
【０１００】
本明細書に記載の方法は、個人が癌、たとえば乳癌を有しているかどうか、特定の癌、たとえば特定の乳癌が存在するかどうかについて、これら条件についての適切な分類モデルを開発することにより、同定または診断するために使用されてもよい。
【０１０１】
癌の「病期」は、特定の生理的または代謝的変化を示しても、示さなくてもよいが、遺伝子発現の変化として検出できる遺伝子レベルでの変化を示す、癌の種々の病期を意味する。当然のことながら、癌の進行中（または治療中）、種々の転写物の発現が異なってもよい。したがって、種々の病期で、発現変化が特定の転写物について「正常」試料と比較して示されなくてもよい。しかしながら、癌の進行を通して一つまたはそれ以上の病期で発現変化を示すいくつかの転写物から得た情報を組み合わせて使用すると、癌の特定の病期を示す特徴的なパターンを得ることができる。したがって、例えば癌の種々の病期、例えば、前段階I（たとえば病期０）、病期I、病期II、病期IIまたは病期IVを識別できる。好適な態様において、本明細書に記載の方法は、たとえば、乳癌、ＤＣＩＳまたはＬＣＩＳの場合、たとえば胸部が何らかの転移の兆候を示したり乳管を超えて移動したりする以前に病期０の癌を検出するために使用されてもよく、また、疾病の種々の病期を区別するために使用することもできる。
【０１０２】
本明細書で使用される用語「正常」とは、比較の目的に使用される生物または試料を意味する。好適には、これらは、特にこれらが正常標準として使用される癌、たとえば乳癌に関する遺伝子発現に影響を及ぼしそうな、なんらかの疾病または状態の兆候を示さない、あるいは、そのような疾病または状態を有するとは思われない、という意味において「正常」のものである。しかし当然のことながら、癌、好適には乳癌の種々の病期を比較してもよく、そのような場合における「正常」試料は、当該癌、好適には乳癌の初期の病期に相当するものでもよい。
【０１０３】
本明細書で使用される用語「試料」は、生物、例えば、細胞を含有する調査中のヒトまたはヒト以外の動物から得た材料を意味し、組織、体液または体内老廃物を含み、あるいは原核生物の場合には、その生物自体を含む。「体液」には、血液、唾液、髄液、精液、リンパ液などがある。「体内老廃物」には、尿、喀痰物（肺疾患患者）、便などがある。「組織試料」には、バイオプシー、外科的介入または他の手段、例えば、胎盤により得られた組織などがある。しかしながら、好適には、試験試料は、癌、好適には乳癌に侵されていないと思われる体の領域からのものである。このような試料における細胞は、疾患細胞、すなわち、癌細胞ではなく、このような疾患細胞と接触状態にあったものではなく、かつ癌部位に由来するものではない。「疾病部位」は、客観的に測定できる方法で疾病、例えば腫瘍を発現する体の領域であると考えられ、たとえば乳癌では疾病部位は胸部である。好適には、末梢血が診断に使用されてもよく、その血液に癌からの悪性細胞または播種性細胞が存在する必要はない。
【０１０４】
また、当然のことながら、標準転写パターンの作成方法および本発明の他の方法は、真核生物の生きている部分、例えば、培養細胞および臓器培養ならびに外植片への使用にも適用できる。
【０１０５】
本明細書で使用される「相当する」試料などは、好適には同じ組織、体液または体内老廃物からの細胞を意味するが、それ以外でもさらに標準または試験パターンを作成する目的に充分に同じである組織、体液または体内老廃物からの細胞をも含む。プローブに「相当する」遺伝子に関して使用するとき、これはプローブに対し、配列（相補的でもよい）によって関連づけられる遺伝子を意味するが、プローブは発現の異なるスプライシング産物を反映するものでよい。
【０１０６】
本明細書で使用される用語「評価」は、絶対的または相対的な観点で判定できる定量的評価および定性的評価の両方を意味する。
【０１０７】
本発明は、以下のようにして実施できる。
【０１０８】
癌、好適には乳癌、またはその病期のための標準転写パターンを作成するために、試料ｍＲＮＡを、癌、好適には乳癌、またはその病期にある個体または生物から公知の手法（例えば、Sambrookら (1989)、Molecular Cloning:A laboratory manual（実験マニュアル）、2nd ED.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、参照）により、組織、体液または体内老廃物の細胞から抽出する。
【０１０９】
ＲＮＡを用いて操作することが困難であるので、好適にはＲＮＡを逆転写して第一鎖ｃＤＮＡを形成する。しかしながら、ｃＤＮＡのクローニング、あるいはｃＤＮＡライブラリーからまたはｃＤＮＡライブラリーを用いての選択は、本発明におけるこの方法または他の方法では必要ない。好適には、第一鎖ｃＤＮＡの相補的鎖、すなわち、第二鎖ｃＤＮＡを合成するが、これは、いずれの対応鎖がオリゴヌクレオチドプローブに存在するかによって決まる。しかしながら、または、ＲＮＡは、逆転写なしで直接使用することができ、必要に応じて標識することもできる。
【０１１０】
好適には、ｃＤＮＡ鎖を、適当なプライマーを使用することにより、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの公知の増幅方法により増幅させる。または、ｃＤＮＡ鎖を、大腸菌などのバクテリアを形質転換するのに使用されるベクターを用いてクローニングした後、成長させて核酸分子を増殖させてもよい。ｃＤＮＡの配列が既知のものでない場合には、プライマーを、導入された核酸分子の領域に向けてもよい。したがって、例えば、アダプターを、ｃＤＮＡ分子、およびこれらの部分に向けられたプライマーにライゲーションして、ｃＤＮＡ分子を増幅することができる。または、真核生物試料の場合には、ＲＮＡのポリＡテールおよびキャップを利用して適当なプライマーを調製してもよい。
【０１１１】
癌、好適には乳癌、またはその病期の標準診断遺伝子転写パターンまたはフィンガープリントを作成するために、上記オリゴヌクレオチドプローブを使用して、疾病試料のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを探索（probe）することにより、各特定のオリゴヌクレオチドプローブ種、すなわち、ユニークな各プローブにハイブリダイズさせるためのシグナルを生成する。また、必要に応じて、正常試料からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、標準対照遺伝子転写パターンを作成してもよい。したがって、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、適当な条件下でオリゴヌクレオチドプローブと接触させてハイブリダイズさせる。または、高度および中程度発現の遺伝子についての特異的プライマー配列を設計してもよく、定量的ＲＴ−ＰＣＲなどの方法を使用して高度および中程度発現の遺伝子、特に本明細書に記載のような遺伝子のレベルを判定することもできる。したがって、当業者は、生物学的試料においてｍＲＮＡの相対レベルを判定するのに当該技術分野において公知である種々の方法を使用することができる。
【０１１２】
複数の試料を調査（probe）するときには、例えば、一つ以上の固体担体、すなわち、プローブキットモジュール上で同じプローブを用いて連続的に実施するか、あるいは対応するプローブ、例えば、対応のプローブキットのモジュールに同時にハイブリダイズさせることにより実施できる。
【０１１３】
ハイブリダイゼーションがいつ生じたかを確認し、転写物の数／（オリゴヌクレオチドプローブに結合するようになったｃＤＮＡ分子）という指標を得るためには、転写物（または関連する分子）がハイブリダイズするとき（例えば、二本鎖核酸分子を検出することにより、または例えば、洗浄により未結合分子を除去した後に結合した分子の数を検出することにより、または、増幅産物により生成されたシグナルの検出により）に生成するシグナルを確認する必要がある。
【０１１４】
シグナルを得るために、ハイブリダイズする一方または両方の成分（すなわち、プローブおよび転写物）は、情報伝達手段またはその一部分を担持するかまたは形成する。この「情報伝達手段」は、シグナルの生成または存在により直接的または間接的に検出できる部分である。該シグナルは、いずれの検出可能な物理的特性、例えば、放射線放出、散乱または吸収の特性、磁気特性または他の物理的特性、例えば、存在する分子の電荷、サイズまたは結合特性（例えば、標識）、あるいは生成することがある分子（例えば、ガス放出など）により付与されるものでよい。シグナル増幅できる方法、例えば、酵素の触媒作用により単一の活性結合部位から複数のシグナル事象を生成して、複数の検出可能な産物を生成する方法が好ましい。
【０１１５】
便宜的には、情報伝達手段は、自ら検出可能なシグナルを与える標識であることがある。また便宜的には、これは、ｃＤＮＡ産生中、相補的ｃＤＮＡ鎖の調製、標的ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡの増幅中に組み込まれることがあるか、または標的核酸分子に直接付加される、放射性または他の標識を使用することによりおこなう。
【０１１６】
適切な標識は、転写物／ｃＤＮＡの存在を直接的または間接的に検出または測定することを可能にするものが適当である。このような標識には、例えば、放射能標識、化学標識、例えば、発色団または蛍光体（例えば、フルオレセインおよびローダミンなどの染料）、または高電子密度の試薬、例えば、フェリチン、ヘモシアニンまたは金コロイドなどがある。または、標識は、酵素、例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリ性フォスファターゼでもよい。この場合、酵素の存在は、好適な実体物、例えば、基質との相互作用により可視化される。また、標識は、情報伝達ペアの一部分を形成してもよい。この場合、このペアの他のメンバーは、転写物／ｃＤＮＡが結合するオリゴヌクレオチドプローブ上に見られるか、またはオリゴヌクレオチドプローブの近くに見られるものである。例えば、蛍光性化合物およびクエンチ蛍光性基質を使用できる。また、標識を、抗体などの異なる実体物上に設けることもできる。この異なる実体物は、転写物／ｃＤＮＡに付着させた（attached)、例えば、合成または増幅中に使用された塩基に付着させたペプチド部分を認識する。
【０１１７】
シグナルは、ハイブリダイゼーション工程の前、間または後の標識の導入により得ることができる。または、ハイブリダイズする転写物の存在は、他の物理的性質、例えば、それらの吸光度により確認できる。この場合、情報伝達手段は、複合体自体である。
【０１１８】
次に、各オリゴヌクレオチドプローブに関係したシグナルの量を評価する。評価は、定量的でも、定性的でもよく、各プローブへの単一の転写物種（または関連するｃＤＮＡまたは他の産生物）の結合、あるいはユニークなプローブ各々の複数のコピーへの複数の転写物種の結合に基づくものでよい。当然のことながら、定量的な結果により、蓄積される癌の、好適には乳癌の、またはその病期の転写物フィンガープリントについてのさらなる情報が得られる。このデータは、絶対値（マクロアレイの場合）で表してもよいし、または特定の標準または基準、例えば、正常対照試料と比較して求めてもよい。
【０１１９】
さらに、当然のことながら、標準診断遺伝子パターン転写物を、一種またはそれ以上の疾病（癌、好適には乳癌）試料（および使用する場合には正常試料）を用いて調製し、ハイブリダイゼーション工程を実施することにより遺伝子発現において特定の個人のバラツキの方向に偏らないパターンを得ることができる。
【０１２０】
特定の生物における癌、好適には乳癌、またはその病期の同定、診断またはモニタリングの目的のために作成される標準パターンおよび標準診断遺伝子転写物パターンの作成における上記プローブの使用は、本発明のさらなる態様を構成する。
【０１２１】
選択されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて癌、好適には乳癌、またはその病期について、標準診断フィンガープリントまたはパターンを一旦決定したら、この情報を、異なる試験生物または個体におけるその癌、好適には乳癌の有無または程度または病期を同定するのに使用できる。
【０１２２】
試験試料の遺伝子発現パターンを調べるために、標準パターンの作成に使用した試料に相当する細胞を含有する組織、体液または体内老廃物の試験試料を、調査される患者または生物から得る。次に、試験遺伝子転写パターンを、標準パターンについて上記した方法で作成する。
【０１２３】
したがって、さらなる態様によれば、本発明は、試験遺伝子転写パターンの作成方法であって、少なくとも
ａ）前記試験生物の試料の細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と；
ｂ）工程（ａ）のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、調査中の生物およびその試料に対応する生物およびその試料中の癌、好適には乳癌、またはその病期に特異的なオリゴヌクレオチドセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と；
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して、前記試験試料において、前記オリゴヌクレオチドが結合する遺伝子の遺伝子発現レベルを示す前記パターンを作成する工程と、
を含む方法を提供する。
【０１２４】
好適な態様において、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしくはその一部分を増幅するプライマーを使用して前記方法が行われ、増幅産物の量が評価されて前記パターンが作成される。上述したように、本発明の好適な態様においては、標識プローブとプライマーとの両方が使用される。
【０１２５】
次に、この試験パターンを、一つまたはそれ以上の標準パターンと比較して、試料が癌または癌の病期を有する細胞を含有するかどうかを評価することができる。
【０１２６】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、生物における癌、好適には乳癌、またはその病期を診断または同定またはモニタリングする方法が提供される。この方法は、
ａ）前記生物の試料の細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と；
ｂ）工程（ａ）のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、調査中の生物およびその試料に対応する生物およびその試料中の該癌または癌の病期に特異的な前記オリゴヌクレオチドセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と；
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して、前記試料において、前記オリゴヌクレオチドが結合する遺伝子の遺伝子発現のレベルを示す特徴的なパターンを作成する工程と；
ｄ）前記パターンを、前記調査中の生物および試料に対応する生物からの試料を用いて本発明の方法により作成された標準的な診断パターンと比較して、前記調査中の生物において前記癌、好適には乳癌の有無、またはその病期を示す相関関係の度合いを判定する工程と；
を含む。
【０１２７】
工程ｃ）までおよびその工程ｃ）を含む方法は、上記した試験パターンの作成である。
【０１２８】
好適な態様において、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡもしくはその一部分を増幅するプライマーを使用して前記方法が行われ、増幅産物の量が評価されて前記パターンが作成される。上述したように、本発明の好適な態様においては、標識プローブとプライマーとの両方が使用される。
【０１２９】
本明細書で使用される用語「診断」は、生物における癌、好適には乳癌の有無、またはその病期の判定を意味する。「モニタリング」は、特に個体が癌、好適には乳癌を患っていることが知られているときに癌、好適には乳癌の程度を確定することを意味し、例えば、癌、好適には乳癌の治療効果または進行をモニタリングし、例えば、治療の適切性を判定したり、予後をおこなうことを意味する。好適な態様において、患者はたとえば手術、放射線療法、化学療法などによる治療後、モニタリングされ、正常な発現パターンへの回復により治療の有効性を判断する。
【０１３０】
したがって、好適な様態において、本発明は、生物における癌、好適には乳癌、またはその病期をモニタリングする方法であって、上記ａ）〜ｄ）を含み、前記モニタリングは前記生物における癌、好適には乳癌の治療後、前記治療の有効性を判断するために行われる、モニタリング方法を提供する。試料と標準的な癌、好適には乳癌（またはその病期）との間の相関関係の度合いによって、癌、好適には乳癌に特有の遺伝子発現が残っているかどうか、したがって治療が成功したかどうかが示される。正常な発現パターンへの回復（正常な標準パターンと比較して）が治療の成功を示す。
【０１３１】
癌、好適には乳癌、またはその病期が存在するかどうかは、標準パターンと試験試料パターンとの間の相関の度合いを求めることにより決定できる。これには、正常試料および疾病試料について得られる値の範囲を考慮する必要がある。これは、プローブに結合しているいくつかの代表的な試料についての標準偏差を得て標準を得ることにより確定できるけれども、試験試料が標準に対して密に相関している場合には、単一の試料でも癌、好適には乳癌を同定するための標準パターンを生成するのに充分であると考えてもよい。便宜的には、試験試料における癌、好適には乳癌、またはその病期の有無または程度は、試験試料における有益なプローブの発現レベルに関係するデータを、式１により確定される標準診断プローブパターンに挿入することにより予測できる。
【０１３２】
上記した方法を用いて生成したデータは、最も基本的な視覚表示に表すこと（例えば、強度に関して）から、定量化でき、かつ数学的に表すことができ、種々のプローブが結合する各遺伝子の発現レベルの相互関係を反映した基礎パターンを同定するためのもっと複雑なデータ操作まで、種々の方法を用いて解析できる。便宜的には、このように生成した生データは、以下で記載するデータ処理および統計的方法、特にデータを正規化および標準化し、データを類別モデル（classification model）にあてはめて操作し、前記試験データが癌、好適には乳癌、またはその病期のパターンを反映するかどうかを決定する。
【０１３３】
本発明の方法は、オリゴヌクレオチドプローブが有用である癌、好適には乳癌、またはその病期または進行の確認、モニタリングまたは診断に使用することができる。本発明の「有用な」プローブは、当該癌、好適には乳癌、またはその特定の病期における発現の変化を示す遺伝子を反映するものである。診断目的には本明細書に記載の個別のプローブは、単独で使用したときにはその有用性は充分ではないが、例えば、上記のセットなど、特徴的なパターンを得るためのいくつかのプローブのうちの、一つとして使用するときには有用である。
【０１３４】
好適には、前記プローブは、前記癌、好適には乳癌、またはその病期により全身的に影響される遺伝子に対応する。とりわけ好適には、本発明のプローブに結合し、転写物が得られる前記遺伝子が、中程度または高度に発現する。中程度または高度に発現した遺伝子に対するプローブを使用すると、必要な遺伝子発現データの組を生成するのに必要とする臨床試料が少なくてよく、例えば、血液試料が１ｍｌ未満でよいという利点がある。
【０１３５】
さらに、すでに活発に転写しているこのような遺伝子は、新しい刺激によりポジティブまたはネガティブな形で影響されやすいことが分かった。さらに、該転写物は、すでに一般的に検出可能なレベルで生成されているので、これらのレベルの小さな変化は、例えば、検出可能な一定のしきい値に到達する必要がないので容易に検出できる。
【０１３６】
したがって、さらなる態様において、本発明は、癌、好適には乳癌、またはその病期の診断、同定、またはその進行のモニタリングに使用することができる以下に記載のようなプローブセットを提供する。
【０１３７】
この診断法は、他の診断法の代替法として単独で使用してもよいし、このような方法に加えて使用してもよい。例えば、本発明の方法は具体的に腫瘍の同定および／または診断において、画像形成法、例えば、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、超音波像形成、核イメージングまたはＸ線イメージングを用いた診断の代替法またはそれに付加した診断方法として使用できる。
【０１３８】
本発明の方法は、原核生物または真核生物からの細胞について実施できる。原核生物または真核生物は、いずれの真核生物、例えば、ヒト、他の哺乳動物および動物、鳥、昆虫、魚および植物、および原核生物、例えば、バクテリアでもよい。
【０１３９】
本発明の方法を実施できる好ましい非ヒト動物には、哺乳動物、特に霊長類、家畜、肉畜および実験動物などがあるが、これらには限定されない。したがって、診断に好ましい動物には、マウス、ラット、モルモット、猫、犬、豚、牛、ヤギ、羊、馬などがある。特に好適には、ヒトの癌、好適には乳癌を、診断し、同定し、またはモニタリングする。
【０１４０】
上記したように、調査中の試料は、生物から得ることができるいずれかの手頃な試料であってもよい。しかしながら、好適には上記のように、試料を疾病部位から離れた部位から得る。このような試料における細胞は、異常細胞ではなく、そのような細胞と接触したことはなく、そして疾病部位からのものではない。このような場合、試料は、これらの基準を満足しない細胞を含有していてもよいが、含有していない方が望ましい。しかしながら、本発明のプローブは、これらの基準を満足する細胞において発現が変化している転写物に関係しているので、たとえ他のバックグランド細胞の存在下であっても、該プローブはこれらの細胞における転写レベルの変化を特異的に検出できるようになっている。
【０１４１】
標準パターンおよび試験パターンの作成方法および診断法では、有用なオリゴヌクレオチドプローブを使用して遺伝子発現データを生成する。場合によっては、特定の方法、例えば、特定の癌、好適には乳癌、またはその病期を診断するのに有用なこれらのプローブを、利用できるプローブ、例えば、表５に記載のオリゴヌクレオチド、表５のものから誘導されたオリゴヌクレオチド、それらの相補配列および機能的に等価なオリゴヌクレオチドから選択することが必要である。前記誘導オリゴヌクレオチドには、遺伝子識別子が提示されているこれらの表に記載された配列に相当する遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチドなどがある。以下の方法論は、このような有用なプローブを同定するために便利な方法を記載し、より詳細には、本明細書に記載のプローブから好適なプローブのサブセットを選択する方法を記載している。
【０１４２】
特定の癌、好適には乳癌、またはその病期を分析するためのプローブは、当該技術分野において公知の多数の方法により同定できる。これらの方法には、例えば、差分的発現またはライブラリーサブトラクションなどがある（例えば、ＷＯ９８／４９３４２参照）。ＷＯ０４／０４６３８２に記載され、また以下でも記載するように、ほとんどの転写物に情報量が多いことに鑑み、出発点として、本明細書に記載の配列ファミリーに相当するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ種のランダムなサブセットを単純に分析し、そのサブセットから最も有用なプローブを採取することもできる。この場合、選択対象となるプローブが提示される。以下の方法では、異なる試料から得たｍＲＮＡ（または関連分子）が結合した、固定化オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、本発明のプローブ）を使用して、どのプローブが癌、好適には乳癌、例えば、疾病試料、を同定するのに最も有用かを確認する。または、本明細書に記載された方法のために、以下に記載されるサブセットが使用されてもよい。以下の方法では、本明細書に開示されているプローブからのサブセットをどのように同定するか、または本明細書に開示されているプローブと共に使用できる付加的な有用なプローブをどのように同定するか、が示される。以下の方法ではまた、前記プローブがいったん選択された後に試料の分析に使用される統計的な方法が示される。
【０１４３】
固定化プローブは、種々の関連性のない生物または関連した生物から誘導することができる。ここで必要なことは、固定化プローブは、試験生物における相同的な対応物に特異的に結合するものでなければならないことだけである。また、プローブは、市販または公開のデータベースから誘導し且つ固体担体に固定化することもでき、または上述したように、ｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択し単離して固体担体に固定化できる。
【０１４４】
固体担体に固定化されたプローブの長さは、標的配列に特定の結合を可能とするのに充分な長さでなければならない。固定化プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの修飾産物またはＰＮＡ（ペプチド核酸）の形態でよい。好適には、固定化されたプローブは、試験生物において高度または中程度発現の遺伝子であるそれらの相同的対応物に特異的に結合しなければならない。便宜的には、使用されるプローブは、本明細書に記載のプローブである。
【０１４５】
生物試料における細胞の遺伝子発現パターンは、以下で説明するマイクロアレイまたはマクロアレイなどの従来技術を用いるか、または本明細書に記載の方法を用いて作成できる。現在では、高密度オリゴアレイといった、生物試料において多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタリングするためのいくつかの技術が開発されている（Lockhart et al., 1996, Nat. Biotech., 14、p1675-1680）、cDNA microarrays（ｃＤＮＡマイクロアレイ）（Schena et al, 1995, Science,270,p467-470）、およびcDNA macroarrays（ｃＤＮＡマクロアレイ）（Maier E et al., 1994, Nucl. Acids Res., 22, p3423-3424; Bernard et al., 1996, Nucl. Acids Res., 24, p1435-1442）。
【０１４６】
高密度オリゴアレイおよびｃＤＮＡミクロアレイにおいて、数百および数千もののプローブオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡが、スライドガラスまたはナイロン膜上に斑点状に滴下するか、またはバイオチップ上に合成される。試験試料および基準試料から単離したｍＲＮＡを、赤色または緑色の蛍光染料を用いて逆転写により標識し、混合し、ミクロアレイにハイブリダイズさせる。洗浄後、結合した蛍光染料を、レーザーにより検出し、２つの像（各染料について一つ）を得る。２つの像についての得られた赤色スポットおよび緑色スポットの比により、試験試料および基準試料における遺伝子の発現レベルの変化についての情報を得る。または、単一のチャンネルまたは複数のチャンネルミクロアレイによる検討を行ってもよい。
【０１４７】
生成された遺伝子発現データを予備処理する必要がある。これは、いくつかの因子が、ハイブリダイゼーションシグナルの質および量に影響することがあるからである。たとえば、例えば、単離されたｍＲＮＡの質および量の試料ごとのバラツキ、各反応の間における標的分子の標識効率の微小変動、ならびに異なるマクロアレイ間での非特異的結合の量のバラツキは、すべて得られるデータセットにおけるノイズの一因であり、解析前に補正する必要がある。たとえば、分析前に、低い信号／ノイズ比で測定されたものをデータの一群から除去することができる。
【０１４８】
前記データはその後、データ構造の分散を安定にし、プローブ強度の差について正規化するために変換できる。いくつかの変換法が文献には記載されており、Cui, Kerr and Churchill http://www.jax.org/research/churchill/research/expression/Cui-Transform.pdfに概要が記載されている。遺伝子発現データを正規化するためのいくつかの方法が報告されている（Richmond and Somerville, 2000、Current Opin. Plant Biol., 3, p108-116; Finkelstein et al., 2001, "Method of Microarray Data Analysis（マイクロアレイデータ解析法）, CAMDAからの論文、Lin & Johnsom編、Kluwer Academic, p57-68; Yang et al., 2001", "Optical Technologies and Informatics（光技術と情報学）"、 Bittner、Chen, Dorsel & Dougherty編, Proceedings of SPIE, 4266, P141-152; Dudoit et al., 2000, J. AM. Stat. Ass., 97, p77-87; Alter et al. 2000, supra; Newton et al., 2001、J. Comp. Biol., 8, p37-52）。一般的に、倍率またはスケーリング関数をまず計算して強度効果を補正した後、強度の正規化に使用する。正規化の改善に外部コントロールの使用も示唆されている。
【０１４９】
大規模遺伝子発現解析に伴うもう一つの大きな難題は、異なる時間に実施される実験から採取したデータの標準化である。同一実験で得られた試料についての遺伝子発現データは、バックグラウンド補正および正規化後に効率的に比較できることを見いだした。しかしながら、異なる時間に実施された実験で得られた試料からのデータには、解析の前にさらなる標準化が必要である。これは、異なる実験間で実験パラメータにおける微妙な差、例えば、異なる時間に抽出したｍＲＮＡの品質および量の差、標的分子の標識に使用される時間、ハイブリダイゼーション時間または露光時間の差が、測定値に影響するからである。また、調査中の転写物の配列の性質といった因子（それらのＧＣ含量）およびそれらの相対量により、これらが実験プロセスにおける微妙な変動によりどのように影響されるかが決まる。例えば、特定の転写物に対応する第一鎖ｃＤＮＡが第一鎖合成中にどのように効率的に転写され、かつ標識されるか、あるいはハイブリダイゼーション中に相当する標識標的分子がそれらの相補配列にどのように効率的に結合するかが決まる。また、プリントプロセスにおけるバッチ間の差も、作成された発現データにおけるバラツキについての主要な因子である。
【０１５０】
これらの影響に適切に相当し、修正できないと、実験シリーズ間の差、すなわち、異なる実験シリーズからの組み合わせたデータ内の差が、遺伝子発現データセットに含まれる意図する主要情報が悪いものとなる。したがって、必要に応じて、発現データは、データ解析前にバッチ調整しなければならない。
【０１５１】
いくつかの試料における多数の遺伝子の発現をモニタリングすると、多量のデータが得られ、複雑すぎて容易には解釈できない。いくつかの管理されていない、および管理されている多変量データ解析法は、これらの多量のデータセットから有用な生物学的情報を抽出するのに有用であることがすでにわかっている。クラスター分析は、遺伝子発現解析に使用されるいままで最も一般的に使用された手法であり、同様の方法で調節される遺伝子を確認するのに行なわれたり、および／または遺伝子発現プロファイルを用いた新しい／未知腫瘍クラスを確認するのに実施されてきた（Eisen et al., 1998, PNAS, 95, P14863-14868, 上記, Alizadeh et al.、2000, Perou et al., 2000, Nature, 406, p747-752;Ross et al., 2000, Nature Genetics, 24(3), p227-235;Herwig et al, 1999, Genome Res., 9, p1093-1105;Tamayo et al., 1999, Science, PNAS, 96, p2907-2912）。
【０１５２】
クラスタリング法では、遺伝子を、それらの発現プロファイルに基づいて、２つの基準を満足する機能的カテゴリー（クラスター）にグループ化する："均質性"−同じクラスターにおける遺伝子は、発現において極めて類似性が高い；および"分離"−異なるクラスターにおける遺伝子は、発現の類似性は互いに低い。
【０１５３】
遺伝子発現解析に使用されてきた種々のクラスタリング法として、例えば、階層クラスタリング（Eisen et al., 1998, 上記; Alizadeh et al. 2000, 上記; Perou et al. 2000, 上記; Ross et al, 2000, 上記）、Ｋ手段クラスタリング（Herwig et al., 1999, 上記; Tavazoie et al, 1999, Nature Genetics, 22(3), p. 281-285）、遺伝子シェービング（Hastie et al., 2000, Genome Biology, 1(2), research 0003.1-0003.21)、ブロッククラスタリング（Tibshirani et al., 1999, Tech report Univ Stanford.）、格子縞モデル（Lazzeroni, 2002, Stat. Sinica, 12, p61-86）および自己組織化マップ（Tamayo et al. 1999, 上記）などがある。また、多変量統計解析の関連法、例えば、特異値分析（Alter et al., 2000, PNAS, 97(18), p10101-10106; Ross et al. 2000, 上記）または多次元スケーリングを用いたものは、調査中の対象物のディメンションを減らすのに効果的である。
【０１５４】
しかしながら、クラスター解析および特異値分析などの方法は、純粋に調査のためであり、データに存在する内部構造の全体像が得られるだけである。これらは、調査中のクラスの性質に関する入手可能情報が解析に使用されない非管理法である。特定の試料がかけられた生物学的摂動（biological perturbation）の性質は、公知である。例えば、遺伝子発現パターンが解析されている試料が疾病個体由来のものであるか、あるいは健康個体由来のものであるかが分かることがある。そうした場合に、判別解析は、試料を遺伝子発現データに基づく種々のグループに類別するのに使用できる。
【０１５５】
このような解析では、所定クラスのメンバーと非メンバーとの間を識別できるデータをトレーニングすることにより分級器（classifier）が構成される。次に、トレーニングされた分級器を使用して、未知の試料のクラスを予測できる。文献に記載されている判別法として、例えば、スーパーベクトルマシン法（Support Vector Machines）（Brown et al, 2000, PNAS, 97, p262-267)、最隣接（Nearest Neighbour)(Dudoit et al., 2000, supra））、類別ツリー（Classification tree）、（Dudoit et al., 2000, 上記）、ボーテッドクラスフィケーション（Voted Classification）（Dudoit et al., 2000, 上記）、重み付き遺伝子ボーティング（Weighted Gene Voting）（Golub et al., 1999, 上記）およびベイズ類別（Bayesian Classification）（Keller et al., 2000、Tec report Univ of Washington）などがある。ＰＬＳ（部分最小二乗（Partial Least Square））回帰分析を最初に使用して遺伝子発現データセットにおけるディメンションを減少させた後に、ロジスティック判別分析解析および二次判別解析（LDおよびQDA）を用いる類別がなされる手法も、最近報告されている（Nguyen&Rocke, 2002, Bioinformatics, 18、p39-50および1216-1226）。
【０１５６】
遺伝子発現データが従来の判別法に及ぼす困難は、発現が解析する遺伝子の数が、解析している試料の数と比較して極めて多いことである。しかしながら、ほとんどの場合において、判別解析の問題に有用であるのは、これら遺伝子のほんの少しの部分に過ぎない。さらに、無関係の遺伝子からのノイズが有効な遺伝子からの情報をマスクしまたはゆがめる恐れがある。マイクロアレイ研究に有用である遺伝子を確認および選択するのに有効であるいくつかの方法が文献、例えば、ｔ統計量（Dudoit et al., 2002, J. AM. Stat. Ass., 97、p77-87）、分散分析（Kerr et al., 2000, PNAS, 98j, p8961ー8965）、近接解析（Neighbourhood Analysis）（Golub et al., 1999, 上記）、群間：群内平方和の比（Ratio of Between Groups to Within Groups Sum of Squares）（Dudoit et al.,2002, 上記）、ノンパラメトリックコアリング（Non Parametric Scoring）（Park et al., 2002, Pacific Symposium on Biocomputing, p52-63）および尤度選択（Likelihood Selection）（Keller et al., 2000, 上記）において示唆された。
【０１５７】
本明細書に記載の方法において、正規化および標準化された遺伝子発現データは、部分最小二乗回帰（ＰＬＳＲ）を用いることにより解析される。ＰＬＳＲは主に連続量データの回帰分析に使用される方法であるけれども、バイナリーコードに基づくダミー応答マトリックス(dummy response matrix)を用いたモデル構築および判別分析のための方法としても利用できる。クラスの割り当ては、単純な二分識別、例えば、乳癌（クラス１）／健康（クラス２）に基づくもの、または複数疾病診断、例えば、乳癌（クラス１）／卵巣癌（クラス２）／健康（クラス３）に基づく複数識別に基づくものである。類別用疾病リストは、他の癌または癌の病期に対応する、入手可能な試料に応じて増加できる。
【０１５８】
類別法として適用されるＰＬＳＲは、ＰＬＳ−ＤＡ（ＤＡは、判別解析を意味する）と称される。ＰＬＳ−ＤＡは、Ｙマトリックスがｎ行（試料数に相当する）およびＫ列（クラス数に相当）を含むダミーマトリックスであるＰＬＳＲアルゴリズムの延長である。Ｙマトリックスは、１を第ｋ列に挿入し、−１を他のすべての列に挿入することにより構成される（Ｘの相当する第ｉ番目の対象がクラスｋに属する場合）。ＹをＸ上に回帰することにより、新しい試料の分類は、適合式
【数１】
の最大成分に相当するグループを選択することにより達成される。したがって、−１／１応答マトリックスにおいて、０未満の予測値は、試料が−１としたクラスに属することを意味し、一方０を超える予測値は、試料が１としたクラスに属することを意味する。
【０１５９】
通常、ＰＬＡ−ＤＡを、共線データを取り扱えるので、類別問題のための出発点として使用し、ＰＬＳＲの特質をディメンション減少法として使用することが好ましい。この目的が満足されたら、さらなる情報を抽出するのに有効であることが判明した線形判別分析ＬＤＡなどの他の方法を使用することができる（Indahl et al., 1999, Chem. and Intell. Lab. Syst., 49, p19-31）。この手法は、まずＰＬＳ−ＤＡを用いてデータを分解した後、スコアベクトル（最初の変数の代わりに）をＬＤＡへの入力として用いる。ＬＤＡについての詳細は、Duda and Hart（Classification and Scene Analysis, 1973, Whiley, 米国）に記載されている。
【０１６０】
モデル構築に続く工程は、モデルバリデーションである。この工程は、多変量分析の最も重要な面に含まれると考えられ、構築された校正モデルの「良好性」を試験する。この作業において、クロスバリデーション（cross validation）法が、バリデーションに使用された。この方法において、モデルが残りのデータに基づいて完全クロスバリデーションを用いて構築される間に、各セグメントにおいて１つまたは数個の試料は除外されている。次に、除外された試料は、予測／類別に使用される。単純クロスバリデーションプロセスを数回反復（各クロスバリデーションについて異なる試料を保持する）して、いわゆる二重クロスバリデーション法をおこなう。この方法は、本明細書に記載の実施例のいくつかに示すような限定されたデータ量の場合にうまくいくことが分かった。また、クロスバリデーション工程は数回反復されるため、モデルバイアスおよびオーバーフィッティングの危険が減少する。
【０１６１】
校正モデルがいったん構築されかつバリデーションされると、モデルにおける所望の情報を表す最も関係のある発現パターンを示す遺伝子を、本明細書に記載の変数選択についての従来技術に記載されている方法により選択できる。変数選択は、最終的なモデルの複雑さを減少させるのに役立ち、削ぎ落としたモデルが得られ、したがって、予測に使用できる信頼のおけるモデルが実現できる。さらに、診断目的の遺伝子の数が少ないほど、診断産物のコストが減少する。かようにして関連のある遺伝子に結合するであろう有用なプローブを同定できる。
【０１６２】
本発明者らは、校正モデルを構築した後、再サンプリング法に基づくジャックナイフ（Effron、1982、The Jacknife, the Bootstrap and other resampling plans（ジャックナイフ、ブートストラップおよび他の再サンプリングプラン）、Society for Industrian and Applied mathematics、米国フィラデルフィア）のような統計的手法が、有意な変数（有用なプローブ）を選択または確認するのに効率的に使用できることを見いだした。ＰＬＳ回帰係数Ｂの近似不確定分散は、下式により推定できる。
【０１６３】
【数２】
式中、
Ｓ2Ｂ＝Ｂの推定不確定分散；
Ｂ＝すべてのＮ対象を用いたクロスバリデーションランクＡでの回帰係数；
Ｂm＝クロスバリデーションセグメントｍにおいて除外された対象を除くすべての対象を用いたランクＡでの回帰係数；および
ｇ＝スケーリング係数（但し、ｇ＝１）。
【０１６４】
本発明者らの手法において、ジャックナイフを、クロスバリデーションとともに実施した。各変数について、クロスバリデーションサブモデルにおけるＢ係数Ｂiと総モデルについてのＢtotとの間の差を、まず算出する。次に、その差の平方和を、すべてのサブモデルにおいて算出して変数についてのＢi推定値の分散を得る。Ｂiの推定値の有意性を、ｔ検定を用いて計算する。したがって、得られた回帰係数を、２標準偏差に対応する不確定限界を用いて示すことができ、それから、有意な変数が検出される。
【０１６５】
この工程の実施または使用については、市販のソフトウエア（The Unscrambler、CAMO ASA、Norway）で実施されているので、ここではさらに詳細には説明しない。また、ジャックナイフを用いた変数選択についての詳細も、Westad & Martens（2000、J.Near Inf. Spectr., 8, p117-124）において記載されている。
【０１６６】
以下の手法は、遺伝子発現データセットから有用なプローブを選択するのに使用できる：
ａ）一クロスバリデーションセグメント当たり一つのユニークな試料（データセットに存在する場合にはその反復を含む）を除外する；
ｂ）ＰＬＳＲ−ＤＡを用いて残りの試料について校正モデル（クロスバリデーションセグメント）を構築する；
ｃ）ジャックナイフ基準を用いて、工程ｂ）におけるモデルについて有意な遺伝子を選択する；
ｄ）上記３つの工程を、データセットにおけるすべてのユニークな試料を一度は除外する（工程ａ）で述べたように）まで繰り返す。例えば、データセットに７５のユニークな試料が存在する場合には、７５の異なる校正モデルを構築して、７５組の異なる有意なプローブ群を得る；
ｅ）工程ｄ）で作成した有意なプローブの組において発生頻度基準を用いて最も有意な変数を選択する。例えば、すべての組（１００％）において現れるプローブセットは、工程ｄ）において作成した組の５０％にしか現れないプローブよりも有用である。かかる方法は実施例１で行われる。
【０１６７】
疾病についての有用なプローブを選択したら、最終モデルを作成し、バリデーションする。モデルをバリデーションする最も一般的に使用されている２つの方法は、クロスバリデーション（ＣＶ；cross validation）および試験セットバリデーションである。クロスバリデーション（交差確認）では、データを、ｋ個のサブセットに分ける。次に、モデルをｋ回トレーニングし、毎回、トレーニングからサブセットのうちの一つを除外する。この場合、除外されたサブセットのみを用いてエラー基準、ＲＭＳＥＰ （予測の二乗平均平方根誤差）を算出する。ｋが試料サイズと等しい場合、これを、「一除外（Ｌｅａｖｅ−Ｏｎｅ−Ｏｕｔ）」クロスバリデーションと称する。一つのバリデーションセグメント当たり一つまたは数個の試料を除外することは、種々の実験間の共分散がゼロである場合のみに有効である。したがって、「一回一試料」法は、複製物を含む場合には有効であるとは言えない。これは、複製物の一つのみを除外することは、本発明者らの解析において組織的バイアスが導入されるからである。この場合の正しい手法は、一度に同じ試料のすべての複製物を除外することである。これはＣＶセグメント間の共分散がゼロであるという前提を満足するからである。
【０１６８】
モデルバリデーションの第二の方法は、校正モデルをバリデーションするために別個の試験組を使用するものである。これには、別個の一組の実験を試験の組として実施する必要がある。これは、実地試験データが得られることを前提として好ましい方法である。
【０１６９】
次に、最終モデルを、試験試料における癌、好適には乳癌、またはその病期を同定するのに使用する。このために、選択された有用な遺伝子の発現データを試験試料から作成した後、最終モデルを使用して、試料が疾病クラスまたは非疾病クラスであるかどうか、すなわち、試料が癌、好適には乳癌、またはその病期を有する個人からのものであるかどうかを判定する。
【０１７０】
好適には、類別を目的としたモデルを、上記の方法にしたがって同定したプローブ、および／または、上述されたプローブに関するデータを用いて作成する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ｃＤＮＡ（用語「オリゴヌクレオチド」の範囲に含まれる）を用いる場合には、かなりの長さを有している。有用なプローブとしてこのようなｃＤＮＡ分子を同定することにより、ｃＤＮＡ分子の特異性を反映するが、製造および取り扱いが容易であるもっと短いオリゴヌクレオチドの開発が実現できる。
【０１７１】
次に、上記モデルを使用して試験試料のデータを作成および解析でき、したがって、本発明の診断法に使用できる。このような方法において、試験試料から作成したデータにより、遺伝子発現データセットが得られ、上記した方法で正規化および標準化する。これを、上記した校正モデルにフィッティングして分類する。
【０１７２】
本発明の方法で使用するために単離された集団のうちの多量または中程度の量で発現する遺伝子を同定するために、意図する試料におけるそれらの転写物の相対レベルについての情報を、いくつかの従来技術を用いて作成できる。この目的には、ディファレンシャルディスプレイまたはＲＮＡフィンガープリントといった配列に依存しない方法と、マイクロアレイまたはマクロアレイなどの配列に基づく方法の両方を使用できる。または、高度および中程度発現の遺伝子についての特異的プライマー配列を構成してもよく、定量的ＲＴ−ＰＣＲなどの方法を使用して高度および中程度発現の遺伝子のレベルを決定することもできる。したがって、当業者は、生物学的試料においてｍＲＮＡの相対レベルを決定するのに当該技術分野において公知である種々の方法を使用することができる。
【０１７３】
とりわけ好適には、上記方法におけるｍＲＮＡの単離のための試料は、上記したようなものであり、好適には疾病部位からのものではなく、前記試料中の細胞は疾病細胞ではなく、また疾病細胞と接触したものでなく、たとえば末梢血試料を使用する。
【０１７４】
以下、あくまでも例として、実施例を添付図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】図１は、発生頻度０％のプローブが予備処理済みの遺伝子発現データ（１１２１７個のプローブ）から除去されたときのＰＬＳＲ成分すべてについての予測モデルの精度を示す。
【図２】図２は、ＴａｑＭａｎ ＬＤＡ分析にて９６穴アッセイフォーマットを使用した、異なるＰＬＳ成分の予測モデルの精度を示す。
【図３】図３は、表５のオリゴヌクレオチドから５個以上のプローブをランダムに選択する有効性と、乳癌試料の正確な分類におけるその精度とを示す。
【実施例】
【０１７６】
実施例１：有用なプローブの同定と、乳癌診断での前記プローブの使用
【０１７７】
材料と方法
被験者の情報、およびマイクロアレイ実験用の血液採取
２００２年から２００４年の間に、ノルウェー国内の二つの病院（Ulleval University HospitalおよびHaukeland University Hospital）で、ノルウェーのRegional Ethical Committeeの承認（参照番号416-01151）の下に、書面での同意後、２００の血液試料が収集された。被験者は、１次スクリーニングでのマンモグラムで罹患の疑いがあるとされて２次検査によばれた女性からランダムに選択された。診断用マンモグラフィと、マンモグラフィで所見が陽性の場合には生検または細針吸引と、を含む臨床検査を行う前に、前記試料が収集された。悪性であるか良性であるかは、細胞診で解明した。マンモグラフィでは異常の無かった被験者については、確定診断はマンモグラフィのみであった。
【０１７８】
各女性から、血液２．５ｍｌがＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）チューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ社（スイス）製）に採取され、一晩室温で静置された後、使用するまで−８０℃で保存された。様々な遺伝子発現プラットフォームの方法開発および試験の結果、当初採取された２００の試料中１２１のみが本調査に使用された。診断用マンモグラムと組織病理学的結果により、これら１２１人の女性のうち、５７人が浸潤性乳癌であり、１０人が非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）であり、５４人は悪性の疾患の兆候を示していなかったことがわかった。後者５４人中、１２人には、線維腺腫、嚢胞などの良性の所見、および詳細不明の所見があった（表１）。
【０１７９】
乳癌被験者については、腫瘍の病期、悪性度、およびその他の関連する臨床データが記録された（表１および２）。前記試験グループのメンバーと対照実験グループのメンバーとでは、年齢、閉経状態、および以前の更年期ホルモン療法についてバランスをとった（表３）。前記１２１の試料に加え、二人の健康な女性から複数時点で５つの血液試料を採取し（生物学的複製）、妊娠中の女性から３つの血液試料を採取し、かつ、授乳中の健康な女性から１つの血液試料を採取した。このように遺伝子発現分析用に１２７人の個人から１３０の試料を得た（表１）。
【０１８０】
調査設計
異なるマイクロアレイ製造バッチ、試薬やキットのロット間のバラツキ、日ごとの変動、異なる実験技師に関連した影響などの技術的なバラツキを制御するために、厳密な実験設計に従って行われた。試料はランダムに１０ずつのバッチに分けられ、乳癌患者の女性の試料数と疾患の兆候の無い女性の試料数とがバッチ間で同数になるように含められた。各バッチ中の試料は全てる実験工程を経て処理された。実験工程の各々が単一の技師のみによって行われ、技師たちは癌の病態を知らされていなかった。各バッチには２つの対照実験試料が含まれ、それ以外の１０個と同じ実験手順を経た。これら対照実験試料は、一人の健康な女性から単離された全ＲＮＡから成る。バッチ内の試料の順番はランダム化された。バッチ変動を補正するために、Tibshirani（Tibshirani et al., 2002, PNAS, 99, p6567-6572）によって記載されたバッチ調整法を使用した。１３０の試料と２６の技術的対照試料とを含む、全部で１３のバッチが、分析された。
【０１８１】
ＲＮＡ抽出
ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）チューブが１２チューブのバッチで一晩解凍され、製造者プロトコルにしたがって全ＲＮＡが抽出された。全ＲＮＡは分析まで−８０℃で保存された。２１００バイオアナライザ（Agilent Technologies、米国カリフォルニア州）とＮａｎｏＤｒｏｐＮＤ−１０００分光光度計（Thermo Scientific、米国デラウェア州）をそれぞれ使用して、ＲＮＡの質と量を測定した。
【０１８２】
マイクロアレイ手順
マイクロアレイ遺伝子発現調査は、３２、８７８個のプローブを含み、２９，０９８個の遺伝子を表現する単一チャネルのApplied Biosystems Human Genome Survey microarrays v2.0を使用して行われた。各試料からは、５００ｎｇの全ＲＮＡが、ＮａｎｏＡｍｐＲＴ−ＩＶＴ標識キットプロトコルにしたがって増幅・標識され、１６時間５５℃でアレイ上でハイブリダイズされた。ハイブリダイズ後、ＡＢ１７００リーダを使用して撮像する前に、製造者推奨によりスライドが手作業で洗浄され調製された。Applied Biosystems社のExpression Systemソフトウエアを利用して、遺伝子発現シグナルの同定と定量化、信号−ノイズ比、不良スポットのフラグ立てを行った。さらなる分析のために、原データがエクスポートされた。
【０１８３】
データ分析
Ｒ（R Development Core Team製、R：A Language and Environment for Statistical Computing. 2009）と、Bioconductor project（Gentleman et al., 2004, Genome Biol., , R80）のツールを、必要に応じて適合させて使用し、データ分析を行った。データは以下のように予備処理した。データをｌｏｇ２変換し、信号−ノイズ＜３、またはフラグ値＜８１９１、である個々の測定値は欠測値と設定した。全１５６アレイについて５％を超える欠測値を有するプローブは除外した。予備処理後、１５６個の試料と１１２１７個のプローブが残り、それをさらに分析した。データを標準化（すなわちセンタリングおよびスケーリング）し、欠測値をｋ−近傍転嫁法（Troyanskaya et al., 2001, Bioinformatics, 17, p520-525）によりｋ＝１０を使用して入力した。各遺伝子について主要成分分析および分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を行ったところ、前記データには大きなバッチ効果があることが判明した。同じタイプのデータについて、同様のバッチ効果が以前報告されていた（Dumeaux V, et al.、検討中）。Tibshirani（Tibshirani et al., 2002, 上記）に記載されているように一元配置分散分析法（one-way ANOVA procedure）を使用して、バッチ効果について各プローブを処理した。その後２６個の技術的対照試料が除外された。生物学的複製（一人の被験者からの複数の試料）のために、シグナル強度が各プローブについて平均化された。したがって、それぞれが各個人からの１２７個のアレイが分析に残った。最終的に、グローバルミーンサブトラクション（global mean subtraction）によってアレイ内正規化がおこなわれた。
【０１８４】
発生基準に基づくプローブの同定
上記のように処理されたデータを使用して、
ａ）一クロスバリデーションセグメント当たり一つのユニークな試料（選択された試料のすべての反復を含む）を除外し、
ｂ）ＰＬＳＲ−ＤＡを使用して残っている試料について校正モデル（クロスバリデーションされた）を構築し、
ｃ）ジャックナイフ基準を用いて、工程ｂ）におけるモデルについて有意の遺伝子の組を選択し、
ｄ）ユニークな試料すべてが一旦除外されるまで、前記工程ａ）、ｂ）、およびｃ）を反復し（したがって、（工程ｂ）を１２７回繰り返した後に）全部で１２７の異なる校正モデルが構築され、その結果（工程ｃ）を１２７回繰り返した後に）有意なプローブのセットが１２７通り出来）、
ｅ）有意なプローブの１２７通りのセットから、発生頻度基準を使用して、有意な変数を選択する
ことにより、有用なプローブを単離した。
【０１８５】
上記方法では、遺伝子発現データはダミーコード化応答ベクトルを予測するための予知因子として働いた。前記応答ベクトルは、それが健康な対照物であるか、それとも乳癌試料であるかによって、各試料につき−１または１の値が与えられた。新たな遺伝子発現試料は、もし予測値がゼロより多ければ疾患であると分類され、そうでなければ健康であると分類された。
【０１８６】
使用する分級器（classifier）を構築し試験するために、ダブルクロスバリデーションを伴った、部分最小二乗回帰（ＰＬＳＲ）（Nguyen & Rocke, 2002, Bioinformatics, 18, p1625-1632; Wold: Estimation of principal components and related models by iterative least squares. In Multivariate Analysis. Edited by Krishnaiah PR. New York: Academic Press; 1966, p391-420）を使用した。ジャックナイフ試験と組み合わせて一除外クロスバリデーション（ＬＯＯ−ＣＶ）を伴ったＰＬＳＲを使用して（Gidskehaug et al., 2007, BMC Bioinformatics, 8, p346; Wu: Jackknife, bootstrap and other resampling plans in regression analysis. The Annals of Statistics, 1986, 14, p1261 -1350）、有意なプローブを選択した。詳細には、ＬＯＯ−ＣＶは最適な数の成分と各プローブに関する回帰係数の一組とを示し、ジャックナイフ特性選択は０ではない回帰係数を有するプローブを選択するために使用される（ｐ値≦0.05）。ＰＬＳＲモデルがこれら有意なプローブ上に再構築され、再度、最適な数の成分を選択するためにＬＯＯ-ＣＶが使用された。最後に、分級器の精度を試験するために、ＬＯＯ-ＣＶの独立ループに上記の分析が組み込まれた（Varma & Simon, 2006, BMC Bioinformatics, 7, p91)。
【０１８７】
このように、発生基準に基づいて選択された有用なプローブが、分類モデルを構築するために使用された。同定された有用なプローブは、発生頻度に基づいてグループ化された。たとえば、１２７クロスバリデーションモデルの全てで有用なプローブは１００％に分類され、クロスバリデーションモデルの９０％のみにおいて有用なプローブは、９０％に分類され、少なくとも１つのバリデーションセグメントで有用であったプローブは０％に分類された。
【０１８８】
結果
表４は、発生頻度基準に基づいて同定されたプローブの数と、およびこれらプローブに基づいた遺伝子発現特性の推定診断精度とを示す。遺伝子選択手順がインナー二重クロスバリデーションルーチン（inner double cross validation routine）に基づくので、選択バイアスを回避しバイアスの無い精度推定値を得るために、三重クロスバリデーション法を使用した。その結果、発生頻度基準にしたがって０〜９０％に分類されたプローブから、約７５％の精度が予期されることが示された。
【０１８９】
図１は０％プローブ（１２７のクロスバリデーションモデルのうち少なくとも１つにおいて有用であると同定されたプローブ）がデータから除外されたとき、残りのデータに基づくモデルの精度が、全ＰＬＳＲ成分にわたって大きく下がり（最大５７％）、関連する診断情報のほとんどがこのデータから得られていることを示している。
【０１９０】
表５は、識別プローブのオリゴヌクレオチド配列と、ＡＢＩ１７００番号によって識別されるその遺伝子配列とを示している。この表に示されているプローブ番号は、提示されている配列の配列番号を示す。
【０１９１】
実施例２：種々の試料用の、種々のプラットフォーム上の、有用なプローブのサブセットの検証
実施例１では、診断上関連する遺伝子発現特性を構築するために使用できる遺伝子プローブ（０％〜１００％の発生）セットを同定した。ただし、今後の試料の予測において、同定されたプローブの信頼性には疑問があった。ある特定の実験から有用であると同定された変数は、データ主導であり得ることが知られている。使用されている試料の一群に依存していること以外に、発現データを測定するために使用されるプラットフォームもまた、データの質に影響を及ぼしている。したがって、遺伝子プローブセットが一つのプラットフォームにおいて有用であると同定されても、別のプラットフォームがデータ生成に使用される場合に、必ずしも診断の妥当性を保持するとは限らない。これは、プラットフォーム特異的なノイズ成分が、異なるプラットフォーム間では変動するからである。また、測定されている遺伝子発現変化が実際にはわずかであると、たとえば、微細な検査室間のバラツキのために起こる、処理における小さな技術的差異もまた、個々の遺伝子プローブから測定された値に影響し、その情報内容を保持するか失うかを決定づけるかもしれない。
【０１９２】
したがって、異なるシナリオで同定されたプローブの有効性を試験するために、分析を拡張して行った。同定されたプローブの診断的情報が、新規の試料群を使用して別の検査室で行われた個々の実験で保持されたかどうかを試験するために、別の検査室において、ただし同じＡＢＩプラットフォームを使用し、新規の試料群（表６Ａ、４０の試料、２０の乳癌、および２０の非乳癌）を使用してデータが生成された調査の、そのデータを再分析した。
【０１９３】
表６Ｂは、別の検査室で新規の試料群を使用して実験が行われたときであっても、プローブ（０％〜１００％）の様々なセットのすべてがその診断的情報を保持していたことを示している。調査１（実施例１）の０％〜１００％プローブに相当するプローブを使用して診断モデルが展開され、それらは遺伝子発現データの予備処理の後の新たなデータに存在していた（調査２）。精度をクロスバリデーションで推定した。
【０１９４】
さらに異なるプラットフォームの影響を試験するため、調査１（実施例１）で同定された有用なプローブを含むよう展開した、カスタマイズしたアレイ上に存在する有用なプローブのいくつかを分析した。カスタマイズしたアレイの一つは、マイクロアレイ技術に基づくが、異なるプラットフォームプロバイダ（Codelink, GE）によって提供されたアレイであった。その他のアレイは、リアルタイム定量的ＰＣＲ技術に基づいていた。
【０１９５】
前記Ｃｏｄｅｌｉｎｋ調査（調査３）は、その前の実験と比較して、乳癌試料と非乳癌試料の新規の独立した群を使用した（表７Ａ）。３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが、表５に記載されたプローブのいくつかに設計された。使用されたプローブは表７Ｃに示され、表７Ｃはまた、ＡＢＩ１７００遺伝子識別子の参照により同定される、相当する遺伝子をも示している（表５参照）。
【０１９６】
表５に記載のオリゴヌクレオチド配列から良好なプライマーを設計することが難しい場合は、関連する転写物を同定するために、ＡＢＩプローブＩＤ、オリゴヌクレオチド配列、および遺伝子名が使用される。特定の転写物について複数のオリゴヌクレオチドプライマーも設計される場合もある。これは、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドがその相当する転写物に効率的にハイブリダイズするようにするためのものである。
【０１９７】
データの予備処理が、概ね実施例１に記載の通りになされた。表７Ｂは、調査１〜３のいずれにも使用されたカスタマイズしたＣｏｄｅｌｉｎｋプラットフォームに存在した、相当する０％〜１００％プローブに基づく推定精度を示す。その結果、異なるマイクロアレイプラットフォームが使用されても前記様々なプローブセット（０％〜１００％）はその診断情報内容を保持していたことが再度示された。
【０１９８】
調査４において、ＴａｑＭａｎプロトコルが使用された。ＴａｑＭａｎシステムは、各伸長サイクル中に蛍光ＤＮＡプローブ上のＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用してＰＣＲ産物を検出する。前記Ｔａｑｍａｎプローブ（通常２５ｍｅｒ）は、５’末端で蛍光レポーター染料によって、かつ、３’末端で蛍光消光染料によって、標識されている。前記プローブが損なわれていなければ、前記消光染料は前記レポーター染料の発光強度を低減する。もし標的配列が存在すると、前記プローブはその標的にアニールし、プライマー伸長が進むにつれてＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断される。前記プローブの切断によってレポーター染料が消光染料から分離されると、レポーター染料の蛍光はＰＣＲサイクル数に応じて増加する。標的核酸の初期濃度が高ければ高いほど、蛍光の相当な増加がより早く観察される。
【０１９９】
前記「ＴａｑＭａｎプローブ」は、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に共有結合した蛍光色素分子と３’末端の消光分子とから成る。通常２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましいが、長さは変わってもよい。重要ポイントは、前記オリゴヌクレオチドプローブが標的配列に特異的に結合しなければならないということである。いくつかの異なる蛍光色素分子（たとえば、６−カルボキシフルオレセイン、略語：ＦＡＭ、またはテトラクロロフルオレセイン、略語：ＴＥＴ）および消光分子（たとえば、テトラメチルローダミン、略語：ＴＡＭＲＡ、またはジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド・マイナーグルーブバインダー、略語：ＭＧＢ）が、それぞれ５’末端および３’末端に結合して使用できる（かつ、これらが本発明での使用に好適な識別子を構成する）。
【０２００】
ＴａｑＭａｎＬＤＡ用に、６０個の試料から単離された全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した（表８Ａ）。内在性対照物を含む３８４個の選択されたアッセイを使用して、ABI Prism 7900HT Fast System上で遺伝子発現分析を行った。欠測値または平均ｃｔ＞３０があるアッセイはデータ分析以前に除外された（全部で１６６個のアッセイとなった）。ＴａｑＭａｎＬＤＡにおける２０８個のアッセイのデータ（前記２０８個のアッセイをその遺伝子識別子（ＡＢＩ１７００、表５を参照）および機能と連携させて示す、表８を参照）を使用して、正規化および質制御用のアッセイを含む９６穴アッセイフォーマットに適した、限定数のアッセイを同定した。
【０２０１】
図２は、９６穴アッセイフォーマットを使用したモデルの精度を示す（種々のＰＬＳ成分について）。最適５ＰＬＳ成分で、顕著になった特性により、４９／６０試料（８２％）のクラスが正確に予測された。ここでもまた、遺伝子発現特性を発現させるために異なるプラットフォームや技術が使用されても、実施例１（調査１）から誘導されたプローブには診断情報が保持されていた結果が示された。
【０２０２】
図３は、乳癌試料の正確な分類において、表５からランダムに選択した５以上のプローブを使用することの精度を示す。
【０２０３】
【表１】
【０２０４】
【表２】
【０２０５】
【表３】
【０２０６】
【表４】
【０２０７】
【表５−０１】
【表５−０２】
【表５−０３】
【表５−０４】
【表５−０５】
【表５−０６】
【表５−０７】
【表５−０８】
【表５−０９】
【表５−１０】
【表５−１１】
【表５−１２】
【表５−１３】
【表５−１４】
【表５−１５】
【表５−１６】
【表５−１７】
【表５−１８】
【表５−１９】
【表５−２０】
【表５−２１】
【表５−２２】
【表５−２３】
【表５−２４】
【表５−２５】
【表５−２６】
【表５−２７】
【表５−２８】
【表５−２９】
【表５−３０】
【表５−３１】
【表５−３２】
【表５−３３】
【表５−３４】
【表５−３５】
【表５−３６】
【表５−３７】
【表５−３８】
【表５−３９】
【表５−４０】
【表５−４１】
【表５−４２】
【表５−４３】
【表５−４４】
【表５−４５】
【表５−４６】
【表５−４７】
【表５−４８】
【表５−４９】
【表５−５０】
【表５−５１】
【表５−５２】
【表５−５３】
【表５−５４】
【表５−５５】
【表５−５６】
【表５−５７】
【表５−５８】
【表５−５９】
【表５−６０】
【表５−６１】
【表５−６２】
【表５−６３】
【表５−６４】
【０２０８】
表６：同じプラットフォームを使用するが、異なる試料群を用いて異なるラボで行った検定結果
【表６Ａ】
【表６Ｂ】
【０２０９】
表７：異なるプラットフォーム（ＣｏｄｅＬｉｎｋ，ＧＥ）を使用した、異なる検査室および異なるサンプル群での検証結果
【表７Ａ】
【表７Ｂ】
【表７Ｃ−０１】
【表７Ｃ−０２】
【表７Ｃ−０３】
【表７Ｃ−０４】
【表７Ｃ−０５】
【表７Ｃ−０６】
【表７Ｃ−０７】
【表７Ｃ−０８】
【表７Ｃ−０９】
【表７Ｃ−１０】
【表７Ｃ−１１】
【表７Ｃ−１２】
【表７Ｃ−１３】
【表７Ｃ−１４】
【表７Ｃ−１５】
【表７Ｃ−１６】
【表７Ｃ−１７】
【表７Ｃ−１８】
【表７Ｃ−１９】
【表７Ｃ−２０】
【表７Ｃ−２１】
【表７Ｃ−２２】
【表７Ｃ−２３】
【表７Ｃ−２４】
【表７Ｃ−２５】
【表７Ｃ−２６】
【表７Ｃ−２７】
【表７Ｃ−２８】
【０２１０】
表８：リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）によるプローブの検証
【表８Ａ】
【表８Ｂ−１】
【表８Ｂ−２】
【表８Ｂ−３】
【表８Ｂ−４】
【表８Ｂ−５】
【表８Ｂ−６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドプローブセットであって、前記セットが少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドの各々が、表５、７Ｃ、または８Ｂに記載されているかまたは表５、７Ｃ、または８Ｂに記載の配列から誘導されたオリゴヌクレオチド、相補配列を有するオリゴヌクレオチド、機能的に同等のオリゴヌクレオチドから選択される、オリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項２】
前記少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドが、表５、７Ｃ、または８Ｂに記載されているかまたは表５、７Ｃ、または８Ｂに記載の配列から誘導された、少なくとも６０％、好適には少なくとも１００％の発生頻度を有するオリゴヌクレオチド、相補配列を有するオリゴヌクレオチド、機能的に同等のオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載のセット。
【請求項３】
前記セット中のオリゴヌクレオチドの各々が、表５、７Ｃ、または８Ｂに記載されているかまたは表５、７Ｃ、または８Ｂに記載の配列から誘導されるオリゴヌクレオチドから選択され、かつ好適には、少なくとも６０％、好適には少なくとも１００％の発生頻度を有し、または、相補配列を有するオリゴヌクレオチドであるか、または機能的に同等のオリゴヌクレオチドである、請求項１または２に記載のセット。
【請求項４】
前記セットが、表５、７Ｃ、または８Ｂに記載されていて少なくとも６０％、好適には少なくとも１００％の発生頻度を有するかまたは表５、７Ｃ、または８Ｂに記載の配列から誘導されたオリゴヌクレオチドのすべて、または相補配列を有するオリゴヌクレオチド、または機能的に同等のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれかに記載のセット。
【請求項５】
前記セットが、表５、７Ｃ、または８Ｂに記載されているかまたは表５、７Ｃ、または８Ｂに記載の配列から誘導されたオリゴヌクレオチドの全て、または相補配列を有するオリゴヌクレオチド、または機能的に同等のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のセット。
【請求項６】
前記セットの各プローブが異なる転写物に結合する、請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項７】
前記セットは少なくとも２０個のオリゴヌクレオチドを含み、前記セットはプライマー対を含み、前記プライマー対の各オリゴヌクレオチドは同じ転写物またはその相補配列に結合し、好適には前記プライマー対の各々が異なる転写物に結合する、請求項１〜５のいずれかに記載のセット。
【請求項８】
前記セットは少なくとも３０個のオリゴヌクレオチドを含み、前記セットはプライマー対と、プライマー対の各々について標識プローブとを含み、前記プライマー対と前記標識プローブとにおける各オリゴヌクレオチドは同じ転写物またはその相補配列に結合し、好適には前記プライマー対と前記標識プローブとの各々が異なる転写物に結合する、請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項９】
１０〜５００個のオリゴヌクレオチドプローブからなる、請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドプローブの各々が１５〜２００塩基の長さである、請求項１〜９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１１】
前記プローブが１以上の固体担体上に固定されている、請求項１〜１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１２】
前記固体担体が、シート、フィルタ、膜、プレートまたはバイオチップである、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１３】
好適には１以上の固体担体上に固定されている、請求項１１または１２に記載のオリゴヌクレオチドプローブセットを含むキット。
【請求項１４】
前記プローブが単一の固体担体に固定され、ユニークなプローブの各々が前記固体担体の異なる領域に付着されている、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
標準化材料をさらに含む、請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドプローブが結合する遺伝子の遺伝子発現レベルを反映する、細胞の遺伝子発現パターンを判定するための、請求項１〜１２のいずれかに記載のプローブセット、または請求項１３〜１５のいずれかに記載のキットの使用であって、前記使用は、少なくとも、
ａ）前記細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と、
ｂ）前記工程（ａ）のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と、
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して前記パターンを作成する工程と、
を含む、使用。
【請求項１７】
生物における癌または癌の病期に特徴的な標準遺伝子転写パターンを作成する方法であって、前記方法は少なくとも
ａ）癌または癌の病期である一つまたはそれ以上の生物の試料細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と、
ｂ）前記工程（ａ）の前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、調査中の前記生物およびその試料に相当する生物およびその試料の中の前記癌または癌の病期に特異的な請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と、
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して、前記癌または癌の病期である試料において、前記オリゴヌクレオチドが結合する遺伝子の遺伝子発現のレベルを反映する特徴的なパターンを作成する工程と、
を含む方法。
【請求項１８】
試験遺伝子転写パターンを作成する方法であって、前記方法は少なくとも
ａ）前記試験生物の前記試料細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と、
ｂ）前記工程（ａ）の前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、調査中の前記生物およびその試料に相当する生物およびその試料の中の癌または癌の病期に特異的な、請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と、
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して、前記試験試料において、前記オリゴヌクレオチドが結合する遺伝子の遺伝子発現のレベルを反映する前記パターンを作成する工程と、
を含む方法。
【請求項１９】
生物における癌または癌の病期を診断または同定またはモニタリングする方法であって、
ａ）前記生物の試料の細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と、
ｂ）前記工程（ａ）の前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、調査中の生物およびその試料に相当する生物およびその試料の中の該癌または癌の病期に特異的な、請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と、
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して、前記試料において、前記オリゴヌクレオチドが結合する遺伝子の遺伝子発現のレベルを反映する特徴的なパターンを作成する工程と、
ｄ）前記パターンを、前記調査中の生物および試料に相当する生物からの試料を用いて、請求項１７に記載の方法により作成された標準的な診断パターンと比較して、前記調査中の生物において前記癌の有無または癌の病期を示す相関関係の度合いを判定する工程と、
を含む方法。
【請求項２０】
前記プローブはプライマーであり、前記工程ｂ）において、前記プライマーを使用して前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはその一部分が増幅され、前記工程ｃ）において、増幅産物の量が評価され、前記パターンが作成される、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記プローブは標識プローブとプライマー対であり、前記工程ｂ）において、前記標識プローブとプライマーとが前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズされて前記前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはその一部分が前記プライマーを使用して増幅され、前記標識プローブが前記標的配列に結合した時に、増幅中にそれが置換されてシグナルを生成し、前記工程ｃ）において、生成されたシグナルの量が評価され、前記パターンが作成される、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、前記工程ｂ）以前に増幅される、請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドおよび／またはｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが標識される、請求項１７〜２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記パターンが、各プローブと関連した発現レベルに関する数のアレイとして表される、請求項１７〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記生物が真核生物であり、好適には哺乳類である、請求項１７〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記生物がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記パターンを構成するデータが、分類モデル上に数学的に投影されている、請求項１７〜２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が、組織、体液、または体内老廃物である、請求項１７〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が末梢血である、請求項１７〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記試料中の細胞が疾患細胞ではなく、かかる細胞と接触状態にあったものではなく、かつ前記疾患の部位または状態に由来するものではない、請求項１７〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記モニタリングが、前記生物の前記癌の治療後に行われて、前記治療の有効性を判定する、請求項１９〜３１のいずれかに記載の、生物中の癌またはその病期をモニタリングする方法。
【請求項３３】
前記癌が、胃癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、皮膚癌、結腸癌、または卵巣癌である、請求項１７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記癌が乳癌である、請求項３４に記載の方法。
【請求項１】
オリゴヌクレオチドプローブセットであって、前記セットが少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドの各々が、表５、７Ｃ、または８Ｂに記載されているかまたは表５、７Ｃ、または８Ｂに記載の配列から誘導されたオリゴヌクレオチド、相補配列を有するオリゴヌクレオチド、機能的に同等のオリゴヌクレオチドから選択される、オリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項２】
前記少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドが、表５、７Ｃ、または８Ｂに記載されているかまたは表５、７Ｃ、または８Ｂに記載の配列から誘導された、少なくとも６０％、好適には少なくとも１００％の発生頻度を有するオリゴヌクレオチド、相補配列を有するオリゴヌクレオチド、機能的に同等のオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１に記載のセット。
【請求項３】
前記セット中のオリゴヌクレオチドの各々が、表５、７Ｃ、または８Ｂに記載されているかまたは表５、７Ｃ、または８Ｂに記載の配列から誘導されるオリゴヌクレオチドから選択され、かつ好適には、少なくとも６０％、好適には少なくとも１００％の発生頻度を有し、または、相補配列を有するオリゴヌクレオチドであるか、または機能的に同等のオリゴヌクレオチドである、請求項１または２に記載のセット。
【請求項４】
前記セットが、表５、７Ｃ、または８Ｂに記載されていて少なくとも６０％、好適には少なくとも１００％の発生頻度を有するかまたは表５、７Ｃ、または８Ｂに記載の配列から誘導されたオリゴヌクレオチドのすべて、または相補配列を有するオリゴヌクレオチド、または機能的に同等のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれかに記載のセット。
【請求項５】
前記セットが、表５、７Ｃ、または８Ｂに記載されているかまたは表５、７Ｃ、または８Ｂに記載の配列から誘導されたオリゴヌクレオチドの全て、または相補配列を有するオリゴヌクレオチド、または機能的に同等のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のセット。
【請求項６】
前記セットの各プローブが異なる転写物に結合する、請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項７】
前記セットは少なくとも２０個のオリゴヌクレオチドを含み、前記セットはプライマー対を含み、前記プライマー対の各オリゴヌクレオチドは同じ転写物またはその相補配列に結合し、好適には前記プライマー対の各々が異なる転写物に結合する、請求項１〜５のいずれかに記載のセット。
【請求項８】
前記セットは少なくとも３０個のオリゴヌクレオチドを含み、前記セットはプライマー対と、プライマー対の各々について標識プローブとを含み、前記プライマー対と前記標識プローブとにおける各オリゴヌクレオチドは同じ転写物またはその相補配列に結合し、好適には前記プライマー対と前記標識プローブとの各々が異なる転写物に結合する、請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項９】
１０〜５００個のオリゴヌクレオチドプローブからなる、請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドプローブの各々が１５〜２００塩基の長さである、請求項１〜９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１１】
前記プローブが１以上の固体担体上に固定されている、請求項１〜１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１２】
前記固体担体が、シート、フィルタ、膜、プレートまたはバイオチップである、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１３】
好適には１以上の固体担体上に固定されている、請求項１１または１２に記載のオリゴヌクレオチドプローブセットを含むキット。
【請求項１４】
前記プローブが単一の固体担体に固定され、ユニークなプローブの各々が前記固体担体の異なる領域に付着されている、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
標準化材料をさらに含む、請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドプローブが結合する遺伝子の遺伝子発現レベルを反映する、細胞の遺伝子発現パターンを判定するための、請求項１〜１２のいずれかに記載のプローブセット、または請求項１３〜１５のいずれかに記載のキットの使用であって、前記使用は、少なくとも、
ａ）前記細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と、
ｂ）前記工程（ａ）のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と、
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して前記パターンを作成する工程と、
を含む、使用。
【請求項１７】
生物における癌または癌の病期に特徴的な標準遺伝子転写パターンを作成する方法であって、前記方法は少なくとも
ａ）癌または癌の病期である一つまたはそれ以上の生物の試料細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と、
ｂ）前記工程（ａ）の前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、調査中の前記生物およびその試料に相当する生物およびその試料の中の前記癌または癌の病期に特異的な請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と、
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して、前記癌または癌の病期である試料において、前記オリゴヌクレオチドが結合する遺伝子の遺伝子発現のレベルを反映する特徴的なパターンを作成する工程と、
を含む方法。
【請求項１８】
試験遺伝子転写パターンを作成する方法であって、前記方法は少なくとも
ａ）前記試験生物の前記試料細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と、
ｂ）前記工程（ａ）の前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、調査中の前記生物およびその試料に相当する生物およびその試料の中の癌または癌の病期に特異的な、請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と、
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して、前記試験試料において、前記オリゴヌクレオチドが結合する遺伝子の遺伝子発現のレベルを反映する前記パターンを作成する工程と、
を含む方法。
【請求項１９】
生物における癌または癌の病期を診断または同定またはモニタリングする方法であって、
ａ）前記生物の試料の細胞からｍＲＮＡを単離する工程であって、前記ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに逆転写してもよい工程と、
ｂ）前記工程（ａ）の前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、調査中の生物およびその試料に相当する生物およびその試料の中の該癌または癌の病期に特異的な、請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドセットまたはキットにハイブリダイズさせる工程と、
ｃ）前記プローブの各々にハイブリダイズしているｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を評価して、前記試料において、前記オリゴヌクレオチドが結合する遺伝子の遺伝子発現のレベルを反映する特徴的なパターンを作成する工程と、
ｄ）前記パターンを、前記調査中の生物および試料に相当する生物からの試料を用いて、請求項１７に記載の方法により作成された標準的な診断パターンと比較して、前記調査中の生物において前記癌の有無または癌の病期を示す相関関係の度合いを判定する工程と、
を含む方法。
【請求項２０】
前記プローブはプライマーであり、前記工程ｂ）において、前記プライマーを使用して前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはその一部分が増幅され、前記工程ｃ）において、増幅産物の量が評価され、前記パターンが作成される、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記プローブは標識プローブとプライマー対であり、前記工程ｂ）において、前記標識プローブとプライマーとが前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズされて前記前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはその一部分が前記プライマーを使用して増幅され、前記標識プローブが前記標的配列に結合した時に、増幅中にそれが置換されてシグナルを生成し、前記工程ｃ）において、生成されたシグナルの量が評価され、前記パターンが作成される、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、前記工程ｂ）以前に増幅される、請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドおよび／またはｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが標識される、請求項１７〜２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記パターンが、各プローブと関連した発現レベルに関する数のアレイとして表される、請求項１７〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記生物が真核生物であり、好適には哺乳類である、請求項１７〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記生物がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記パターンを構成するデータが、分類モデル上に数学的に投影されている、請求項１７〜２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が、組織、体液、または体内老廃物である、請求項１７〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が末梢血である、請求項１７〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記試料中の細胞が疾患細胞ではなく、かかる細胞と接触状態にあったものではなく、かつ前記疾患の部位または状態に由来するものではない、請求項１７〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記モニタリングが、前記生物の前記癌の治療後に行われて、前記治療の有効性を判定する、請求項１９〜３１のいずれかに記載の、生物中の癌またはその病期をモニタリングする方法。
【請求項３３】
前記癌が、胃癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、皮膚癌、結腸癌、または卵巣癌である、請求項１７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記癌が乳癌である、請求項３４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１３−５１６９６８（Ｐ２０１３−５１６９６８Ａ）
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４８４５２（Ｐ２０１２−５４８４５２）
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０４９３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８６１７４
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５１２１８４７１１）ダイアジェニック エーエスエー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０４９３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８６１７４
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５１２１８４７１１）ダイアジェニック エーエスエー (1)
【Ｆターム（参考）】
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