試料における生体分子の含量を正規化するための方法
本発明は、以下の工程を有する、試料における生体分子の含量を正規化するための方法に関する：
ａ）容器表面が高塩条件下で生体分子を可逆的に結合できるように少なくとも定位置で、好ましくは容器の内部で官能化されている容器表面を有する反応容器を提供すること、
ｂ）少なくとも１つの試料調製工程を実施すること、
ｃ）高塩条件下で、調製された試料からの生体分子を容器表面に結合させること（「結合及び正規化の工程」）、
ｄ）任意に洗浄すること（「洗浄工程」）、及び
ｅ）少なくとも１つの後続の反応を実施すること。
ａ）容器表面が高塩条件下で生体分子を可逆的に結合できるように少なくとも定位置で、好ましくは容器の内部で官能化されている容器表面を有する反応容器を提供すること、
ｂ）少なくとも１つの試料調製工程を実施すること、
ｃ）高塩条件下で、調製された試料からの生体分子を容器表面に結合させること（「結合及び正規化の工程」）、
ｄ）任意に洗浄すること（「洗浄工程」）、及び
ｅ）少なくとも１つの後続の反応を実施すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料における生体分子の含量を正規化するための方法、使用及び装置に関する。該方法、該用途及び該装置は、たとえば、生化学、分子生物学、分子遺伝学、微生物学、分子診断学及び／又は分子法医学における応用に好適である。
【背景技術】
【０００２】
試料における生体分子の含量を正規化することは、たとえば、分子診断学において、遺伝子発現の解析のために、活性物質に基づいた転写物レベルの解析、分子法医学、配列決定又は遺伝子型決定において試料の解析で主要な役割を担う。
【０００３】
正規化の理由は、場合によっては、検出される生体分子、特に核酸及び／又はタンパク質が試料中に異なった量で存在する可能性があることである。加えて、調製試料の処理工程、たとえば、溶解、細胞変性、単離工程、又は逆転写は、異なったレベルの効率で問題の生体分子を提供する可能性がある。
【０００４】
双方の場合、このことは、上述の不確定要素による試料における生体分子の未知の部分が、さらなる調製工程及び解析工程の再現性及び精度を複雑にし、又は定量のために追加の工程を必要とすることを意味する。
【０００５】
このことは、既知の方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写、免疫−ＰＣＲ（イムノＰＣＲ））を用いてその後に検出される核酸を含有する試料の調製にとって特に重要である。この場合、所望のサイクル数を達成するために、工程パラメーター、特に試料における生体分子の含量を調整することが重要である。
【０００６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、試験管内でＤＮＡを増幅するシステムとしてこの２、３０年で確立されたものである。同時に、ＰＣＲは、単なる複製から定性分析及び定量のための「リアルタイム」ＰＣＲに向かった技術のさらなる開発の結果、広く使用される解析ツール及びアッセイツールになっている。いわゆるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、特定の遺伝子断片のＲＮＡ転写物の検出は目下、標準のアプリケーションである。この点で、プライマー（多くはポリｄＴ）と酵素（逆転写酵素）とを用いて、試料に存在するｍＲＮＡがすべてＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写され、こうして形成されたｃＤＮＡがＰＣＲアッセイで検出される。このようにして、一工程プロトコール又は二工程プロトコールにてアッセイを実施することが可能である。一工程プロトコールでは、逆転写（ＲＴ）及びＰＣＲアッセイ自体がＰＣＲ機器において実施されるが、二工程プロトコールでは、逆転写が別に実施され、反応のアリコートがＰＣＲマスターミックスに添加される。しかしながら、ｍＲＮＡのレベルは、異なる試料では極めて異なる可能性があり、加えて、ＲＴの効率は変動しやすい可能性がある。このことは、ＰＣＲ反応に導入されるｃＤＮＡの量が極めて異なるという結果を生じることがある。
【０００７】
従来技術では、通例、たとえば、ＯＤ測定又は蛍光測定を利用して、逆転写を開始する前に試料のＲＮＡ含量を決定する。逆転写の完了後、ヌクレオチド、リボゾームＲＮＡ及びそのほかの構成物質の存在がｃＤＮＡの定量を複雑にするので、ｃＤＮＡレベルでの定量は一般に実施されない。
【０００８】
そのような定量のやり方は、特にいわゆる二工程法で実施されてもよく、その際、試料の調製（たとえば、溶解、細胞変性、単離工程又は逆転写による）及びさらなる試料の処理（たとえば、ＰＣＲによる）は、別々の工程及び／又は異なった容器で実施されるので、２つの工程の間でピペッティング工程が行われてもよい。そのような工程は、すでに調製されてもよい試料がＰＣＲ工程に直接供される方法にも好適である。
【０００９】
従来技術の二工程ＰＣＲの場合については、逆転写を別の容器で実施し、次いでＰＣＲマスターミックスにピペットで入れる。この点で、逆転写後のｃＤＮＡの量は分光法で一回定量されうる。しかしながら、追加のレベルの尽力のためにこれは普通省かれ、ＲＴ反応のアリコートだけがｑＰＣＲに使用される。ＰＣＲマスターミックスの過剰な希釈を防ぐために、マスターミックス量の最大たった１０％がアリコートとしてそれに添加されるべきである。このことは、２．５μＬを用いた２５μＬのＰＣＲでは、ＰＣＲ反応では１０％をやや上回る逆転写産物を使用してもよく、又は今一度さらに多い体積を回避しなければならないことを意味する。同時に、追加のピペッティング工程は、手動操作の場合のように、さらなる不正確を生じる。交差汚染のさらなるリスクもある。
【００１０】
本方法では、ｃＤＮＡは反応容器の決められた表面に可逆的に結合するので、ＰＣＲ反応アッセイにおける追加の体積を考慮する必要はない。
【００１１】
試料の調製（たとえば、溶解及び／又は逆転写による）及びさらなる試料の処理（たとえば、ＰＣＲによる）が同一の容器で生じ、可能であれば容器を閉じたままにする（いわゆる一工程法）方法にとって以前のやり方は実用的ではない。
【００１２】
従来技術の一工程法では、任意に分光法で定量される生体分子（たとえば、ｍＲＮＡ）の量が使用される。逆転写及びＰＣＲ法自体が同一の反応容器で実施される。従って、できれば処理中、反応容器を開けないので、逆転写のアッセイ全体がＰＣＲ反応に移される。しかしながら、使用される試料については、（たとえば、ｍＲＮＡの）生体分子含量が非常に異なる可能性があり、試料調製工程（たとえば、逆転写）の効率も変動しやすく、それが、試料調製工程の完了後、結果的に非常に異なった産物（たとえば、ｃＤＮＡ）の量を生じることがあり、次いでそれが後続の反応（たとえば、ＰＣＲ）に導入されて再現性のない反応結果を生じる。通常２０μＬの追加反応のアッセイ体積のために、さらに、ＰＣＲに慣例である２５μＬの体積で操作するのは可能ではない。通例、一工程ＲＴ−ＰＣＲは５０μＬ又は１００μＬのスケールで実施される。
【００１３】
本発明による方法及び本発明による装置では、ＯＤ測定又は蛍光測定を用いてそれを定量する代わりに、たとえば、本発明に従って作製される結合表面を用いて装置で、核酸の絶対量を正規化する。対照的に、いわゆる「ハウスキーパー法」は、生物系の状態について表示するのに使用してもよい内部参照(internal reference)又は内在参照(endogenous reference)を表す。特定のハウスキーパー遺伝子の標準値は特定の細胞型と併せてその発現レベルについて存在するので、ハウスキーパー遺伝子を用いてアッセイの質を評価してもよい。
【００１４】
しかしながら、この方法では、不確実性の可能性があるために正規化の精度は大きく限定されることが言及されなければならない。従って、理想的なハウスキーパー遺伝子は存在せず；すなわち、いずれの場合でも、複数のハウスキーパー遺伝子の使用によってさえ、完全に排除することができない遺伝子発現の種、型、段階又は状態に特異的な遺伝子発現の変動が認められる可能性がある。
【００１５】
加えて、ＵＳ２００７０２３１８９２では核酸を増幅するための方法が知られ、その際、溶解物中に含有される核酸を結合するために、容器中にて生物試料の溶解物をいわゆる「電荷スイッチ」("charge-switch")表面に接触させる。次いで結合しなかった溶解物を取り除き、結合した核酸を増幅する。参照される「電荷スイッチ」物質については、ｐＨが変化すると表面電荷に変化が生じる。弱いイオン交換体のこの特性は、たとえば、表面基のｐＫ値よりも低いｐＨにて出現するので、これらの表面基は正の表面電荷を有する。負に帯電した生体分子、特に核酸が次いで結合してもよい。他方、表面基のｐＫ値より大きいｐＨについては、電荷が正から中性又は負に変わるので、負に帯電した生体分子、特に核酸は今一度放出されてもよい。従って、種々のｐＨ値を有し、且つ低塩濃度も有する好適なバッファー（「低塩バッファー」）を用いることによってｐＨを介して結合と放出のプロセスがこうして制御されてもよい。
【００１６】
参照される「電荷スイッチ」物質は、特にアニオン交換体の特性を有する。この方法の欠点の１つは、好適な物質が、たとえば、ポリプロピレン製の微量反応容器の表面に永続的に共有結合できないということである。物質は表面への単純な積層によって一般に固定化される。しかしながら、表面への永続的な付着は保証されず、それは、これらの方法の再現性に疑問を投げかけ、相応して被覆された容器の複数回の使用を不可能にもする。
【００１７】
加えて、「電荷スイッチ」を使用し、かつ一般にアニオン交換体を使用した参照条件下での生物試料からのＲＮＡの単離は、遍在するＲＮＡ分解酵素のために問題がある。普及している低塩条件下でこれらは手付かずのままであるので、ＲＮＡは２、３秒以内にひどく分解され、検出はさらに困難になるか又は不可能にさえなる。
【００１８】
（定義）
本発明の意味の範囲内で用語「核酸」は、特に、天然の、好ましくは直鎖の、分枝鎖の又は環状の核酸、たとえば、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡ、一本鎖の及び二本鎖のウイルスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、又はリボザイム、ゲノムの、細菌の又はウイルスのＤＮＡ（一本鎖及び二本鎖）、染色体及びエピソームのＤＮＡ、自由に循環する核酸など、合成の又は修飾された核酸、たとえば、プラスミド又はオリゴヌクレオチド、特にＰＣＲに使用するためのプライマー、プローブ若しくは標準、ジゴキシゲニン、ビオチン若しくは蛍光色素で標識された核酸、又はいわゆる「ペプチド核酸」("peptide nucleic acid")（ＰＮＡ）を意味するように理解されるが、これらに限定されない。
【００１９】
用語「試料中の生体分子の含量を正規化すること」は、試料中の生体分子の含量が、（容器表面、好ましくは容器の内側の少なくとも一部の大きさと結合特性によって、本発明により）特定の程度を超えないことを保証する工程を意味するように理解される。これは、生体分子の含量を特定の値に定量する方法である。これには、この程度を超える生体分子のその後の廃棄が含まれ、また、試料が上述の特定の程度より少ない生体分子を含有するのであれば、正規化は奏功しない。
【００２０】
本発明の意味の範囲内で用語「固定化」は、特に、適切な固相への可逆的な固定化を意味するように理解されるが、これに限定されない。
【００２１】
用語「膜」は、特に、生体分子を可逆的に結合することができる固相を意味するように理解されるが、これに限定されない。
【００２２】
用語「高塩バッファー」は、特に、高塩濃度（好ましくはカオトロピック物質）、好ましくは≧１００ｍＭ、さらに好ましくは≧５００ｍＭ、一層さらに好ましくは≧１Ｍを有するバッファーを意味するように理解されるが、これに限定されない。
【００２３】
以下の用語「高塩条件」は、高塩バッファー、好ましくはカオトロピック塩を含有する高塩バッファーを使用する環境を意味するように理解される。高塩［バッファー］、好ましくはカオトロピック塩を含有する高塩バッファーを使用することによって水における核酸の溶解度を低下させる。理由は、水素架橋の切断と水中での核酸の二次構造及び三次構造の安定性の関連する低下である。そのとき極性の表面が水素架橋の供与体として提供されれば、その位置で水中よりそれらはさらに安定なので、核酸はこの表面に結合する。塩濃度が低下すると、極性表面よりも水が今一度良好な水素架橋供与体になり、核酸は表面から脱着されてもよい。
【００２４】
用語「カオトロピック物質」又は「カオトロピック塩」は特に、タンパク質及び／又は核酸の二次構造、三次構造及び／又は四次構造を変え、且つ、少なくとも一次構造(primary structure)をそのままにし、水中での極性物質の溶解度を低下させ、及び／又は疎水性の相互作用を強化する物質を意味するように理解されるが、これらに限定されない。好ましいカオトロピック物質は、塩酸グアニジン、（イソ）チオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム及び／又は尿素である。
【００２５】
用語「シラノール基」は特に、組成（ＳｉＯ2x（ＯＨ）α（ＯＥｔ）βを有し、化学量論因子αがｘ及びβの関数（すなわち、α＝４（１−ｘ）−β）である酸化珪素（非晶性、結晶性）又はポリ珪酸を意味するように理解されるが、それには限定されない。二酸化珪素又はポリ珪酸は１以上の以下の置換基を含有してもよく、又は以下の酸化物によって完全に置き換えられてもよい。
・Ｂ2Ｏ3（０〜３０％）
・Ａｌ2Ｏ3（０〜１００％）
・ＴｉＯ2（０〜１００％）
・ＺｒＯ2（０〜１００％）
【００２６】
物質は表面が官能化されてもよい。たとえば、シラノール基が、シランによるシラン化によって処理されてあってもよい。表面は疎水化されてもよく、又はアニオン基及び／又はカチオン基及び／又はキレート剤が適用されてもよい。たとえば、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）部分がキレート基として適用されてもよい。これによって結合される生体分子に吸収剤表面を適合させることができる。
【００２７】
別の選択肢は、シラン化プロセスを用いてシラノール基にハロゲン含有の原子移転ラジカル開始剤を適用することであり、シラノール基にて「グラフトフロム」("grafting from")法を用いてポリマー鎖を作製することができる。グラフト共重合とも呼ばれるこの方法は、連鎖停止(chain termination)、不均衡(disproportionation)又は組換え(recombination)に向かう傾向がわずかである重合プロセスを必要とする。グラフト共重合を行うために開始剤はシラノール基に適用しなければならない。ハロゲンを含有するシランでＰＥＣＶＤ珪酸層を処理することによってこれを達成してもよい。或いは、ＰＥＣＶＤプロセスに開始剤を直接導入する。この点で、揮発性のハロゲン含有化合物をプロセスガス（ＰＥＣＶＤプロセスの前駆体）に加える。ＡＴＲＰをそのようなハロゲン化合物含有表面で行うのであれば、表面に共有結合するポリマー（ホモポリマー、コポリマー、ブロックコポリマー）がその場で作製される。好適なモノマーは、たとえば、アクリレート、メタクリレート、スチレン、及びスチレン誘導体のようなラジカル重合可能な化合物である。
【００２８】
原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）は、その場でのラジカル重合の形態である。ラジカルは、原子移動法を用いて、Ｃｕ（Ｉ）／Ｃｕ（ＩＩ）酸化還元平衡を介して有機ハロゲン化合物から形成される。酸化還元平衡は、遊離ラジカルの濃縮において大きな還元を生じる。従って、不均衡又は組換えによる連鎖停止反応は大きく抑制される。
【００２９】
用語「増幅反応」は、１以上の検体、好ましくは核酸の濃度を少なくとも二倍にすることができる方法を意味するように理解される。
【００３０】
ここで等温増幅反応と熱サイクル増幅反応との間で対比を行う。前者では、プロセス全体の間、温度は一定のままであるが、後者では、反応と増幅を制御するのに使用される熱サイクルが実施される。
【００３１】
以下は好ましい等温増幅反応の例である。
・ループ介在型等温増幅(loop mediated isothermal amplification)（ＬＡＭＰ）
・核酸配列に基づく増幅（nucleic acid sequence-based amplification）（ＮＡＳＢＡ）
・ローリングサークル連鎖反応(rolling circle chain reaction)（ＲＣＣＲ）又はローリングサークル増幅(rolling circle amplification)（ＲＣＡ）及び／又は
・転写介在型増幅（transcription mediated amplification）（ＴＭＡ）
【００３２】
以下は好ましい熱サイクル増幅反応の例である。
・リガーゼ連鎖反応(ligase chain reaction)（ＬＣＲ）及び／又は
・ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction)（ＰＣＲ）
【００３３】
用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は、たとえば、バートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）及びスターリング（Ｓｔｉｒｌｉｎｇ）（２００３）に記載されたように、核酸の試験管内増幅のための方法を意味するように理解される。
【００３４】
用語「リガーゼ連鎖反応」（ＬＣＲ）は、異なった酵素（ポリメラーゼの代わりにリガーゼ）を使用することを除いてポリメラーゼ連鎖反応と同様に機能する非常に少量の核酸のための検出方法を意味するように理解される。ＤＮＡ鎖当たり２つの試料を連結して１つの試料を形成する。１サイクルで得られる増幅産物はたった３０〜５０ｂｐの長さに過ぎないことが多く、それ自体、添加されたプライマーの出発点としてその後のサイクルで再利用される。
【００３５】
用語「ループ介在型等温増幅」（ＬＡＭＰ）は、標的配列の特定の領域を認識し、それに結合する６つの異なったプライマーを使用する等温核酸増幅のための方法を意味するように理解される。ＬＡＭＰは鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用し、およそ６５℃の定温で進行する。標的配列の増幅と検出とは単一工程で行われる。
【００３６】
用語「核酸配列に基づく増幅」（ＮＡＳＢＡ）は、ＲＮＡを増幅するための方法（コンプトン（Compton）, 1991)を意味するように理解される。ＲＮＡマトリクスを反応混合物に加え、第１のプライマーがマトリクスの３’末端の領域における相補的な配列に結合する。次いで逆転写酵素を用いてマトリクスと相補的なＤＮＡ鎖が重合される。その後、ＲＮＡ分解酵素Ｈ（ＲＮＡ分解酵素ＨはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを消化するが、一本鎖ＲＮＡは消化しない）を用いてＲＮＡマトリクスを消化する。次いで第２のプライマーがＤＮＡ鎖の５’末端に結合される。ＤＮＡ鎖に相補的であるＲＮＡ分子を合成するための出発点としてＴ７ＲＮＡポリメラーゼによってこのプライマーを使用し、このＲＮＡ分子を出発マトリクスとして今一度使用してもよい。ＮＡＳＢＡは通常、４１℃の定温で実施され、特定の状況下にてＰＣＲより速く且つ良好な結果を提供する。
【００３７】
用語「転写介在型増幅」（ＴＭＡ）は、米国の会社ジェン-プローブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ）によって開発され、ＮＡＳＢＡに類似し、同様にＲＮＡポリメラーゼと逆転写酵素とを使用する等温増幅法（ヒル（Hill）, 2001）を意味するように理解される。
【００３８】
用語「ローリングサークル連鎖反応」（ＲＣＣＲ）又は「ローリングサークル増幅」（ＲＣＡ）は、ローリングサークル原理に従って一般的な核酸の複製を模倣した増幅方法を指し、数ある出典の中でも例えば米国特許第５，８５４，０３３号に記載されている。
【００３９】
用語「「免疫−ＰＣＲ」(イムノＰＣＲ)("immuno-PCR")（ＩＰＣＲ）は特に、標的特異的な抗体と核酸分子とのキメラ複合体が使用される、標的分子を検出する方法を意味するように理解される。
【００４０】
本質的に、参照される標的分子は、この分子種に対する特異性の高い抗体が最も容易に産生されるので、主としてタンパク質及び／又はオリゴペプチドを含む。しかしながら、参照される標的分子はまた、この生体分子種に対する特異性の高い抗体が産生されてもよいという条件で、そのほかの生体分子種、たとえば、オリゴ糖類及び多糖類、又は脂質を含んでもよく、その結果、免疫−ＰＣＲを用いて抗体が検出されてもよい。
【００４１】
核酸分子をマーカー又はプローブとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてシグナル生成のためにそれを増幅する。核酸増幅の非常に高い効率と結合の高い特異性とによって標的分子を検出する常法（たとえば、ＥＬＩＳＡ法）と比べて、感度で１００倍〜１０，０００倍の上昇を生じてもよい。ＩＰＣＲは１９９２年（サノら（Sano at al.）, 1992）に開発された。
【００４２】
用語「逆転写」は、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼも）が一般に使用される、ｍＲＮＡをＤＮＡ（いわゆるｃＤＮＡ）に転写するための方法を意味するように理解される。後者は最初に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によって一本鎖ＲＮＡからＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド鎖を合成する。タンパク質の無関係な部分、ＲＮＡ分解酵素Ｈの部分はＲＮＡ部分のその後の分解に関与する。一本鎖ＤＮＡ鎖からの二本鎖ＤＮＡの形成の完了は、ＤＮＡ堆積性のＤＮＡポリメラーゼ活性によって生じる。この方法によって生成されたｃＤＮＡは次いでＰＣＲを用いて増幅され、検出されてもよい。
【００４３】
ほかのＤＮＡポリメラーゼと同様に、逆転写酵素もＤＮＡ合成を開始するのにプライマーを必要とする。この場合、いわゆるオリゴｄ（Ｔ）プライマー、すなわち、多重チミン塩基が使用されることが多く、それは、ｍＲＮＡの３’末端におけるポリ（Ａ）尾部（テイル）に相補的である。
【００４４】
逆転写酵素とその後のＰＣＲとの組み合わせ（ＲＴ−ＰＣＲとも呼ばれる）を頻繁に使用して、たとえば、遺伝子発現の解析、遺伝子発現プロファイルの作成などで試料における１以上のｍＲＮＡの含量を検出する。いわゆる「二工程ＲＴ−ＰＣＲ」では、とりわけ、異なったプライマーを逆転写及びその後のＰＣＲで使用するが、「一工程ＲＴ−ＰＣＲ」では、逆転写で使用した遺伝子特異的なプライマーがその後のＰＣＲで使用されてもよく、２つの反応が同一容器で連続して行われる。使用される逆転写酵素（一般にウイルス起源）は使用されるＤＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｔａｑポリメラーゼ）より低温で変性し、知られているようにＤＮＡポリメラーゼは比較的高温でのみ変性するので、逆転写はその後のＰＣＲより低温で実施されるという事実によって使用が構成される。熱可逆的に阻害される、いわゆる「ホットスタート」ＤＮＡポリメラーゼを好ましくは使用する。逆転写のより低い温度レベルからＰＣＲのより高い温度レベルへのスイッチが入れられると、一方で、逆転写酵素が変性し、他方で、熱可逆的阻害を排除することによってＤＮＡポリメラーゼが活性化される。参照される熱可逆的阻害は、たとえば、ＤＮＡポリメラーゼの活性中心に結合する抗体を用いて、又はたとえば、アルデヒドを用いたポリメラーゼの可逆的な共有若しくは非共有の化学的修飾（たとえば、本出願人の米国特許第６，１８３，９９８号を参照）によって達成されてもよい。概要についてはバーチ（Ｂｉｒｃｈ）ら（１９９６年）も参照のこと。
【００４５】
用語「リアルタイムＰＣＲ」は、定量ＰＣＲ又はｑＰＣＲ（逆転写ＰＣＲと混同してはならない）を意味するように理解されるが、これは既知のポリメラーゼ連鎖反応に基づくものであり、増幅されたＤＮＡを定量することもできる。定量はＰＣＲサイクルの最中（従って、名称「リアルタイム」）に記録される蛍光測定によって行われる。ＰＣＲ産物の量に比例して蛍光が増加する。１回の実行（複数のサイクルから構成される）の終了時、受け取った蛍光シグナルに基づいてＰＣＲの指数期にて定量が行われる。最適な反応条件は指数期の間に存在するので、ＰＣＲのこの期（１回の実行で２、３サイクル続く）でのみ、正確な定量が可能である。従ってこの方法は、ほかの定量ＰＣＲ法とは異なり、ほかの定量的ＰＣＲ法は、ＰＣＲ（たとえば、競合ＰＣＲ）が進行した後、通常、ＰＣＲ断片のゲル電気泳動分離を含めて定量的解析を行う。
【００４６】
たとえば、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーンＩ及びＦＲＥＴプローブ又はいわゆる二重色素オリゴ（ＴａｑＭａｎプローブとも呼ばれる）のような染色は検出に好適である。
【００４７】
用語「ＣT値」（閾値サイクル）は、増幅産物が最初に検出できるＰＣＲサイクルを指し、通例、蛍光を測定し、初めてバックグラウンドの蛍光を超えた有意な増加があった最も直近のサイクルが示される。
【００４８】
ＰＣＲ反応の初期相では、鋳型（すなわち、増幅されるＤＮＡ上）の量がいまだに限定されるが、増幅の最終相では、産物の量は、これら産物が阻害を引き起こすように増大し、産物断片はますます互いにハイブリッド形成し、出発産物は徐々に消費される。中間の相においてのみ、増幅サイクルの数と増幅産物の量との間で指数関数の関係が存在する（「指数相」）。指数相が始まる時点を決定するために参照ＣT値が用いられる。
【００４９】
さらに、低いＣT値は少数のＰＣＲサイクルがバックグラウンドノイズを上回る蛍光での初めての有意な増加に十分である（すなわち、相対的に多数の鋳型が存在する）ことを示すが、高いＣT値は相応して、この目的で多数のＰＣＲサイクルを必要とする（すなわち、相対的に少ない鋳型が存在する）ことを示す。
【００５０】
用語「酵素結合免疫吸着測定法」("enzyme-linked immunosorbent assay")（ＥＬＩＳＡ）は、酵素呈色反応に基づく免疫的検出法を意味するように理解される。
【００５１】
ＥＬＩＳＡの使用によって、試料（血液血清、乳、尿など）においてタンパク質、ウイルス、並びにたとえば、ホルモン、毒素及び殺虫剤のような低分子化合物を検出することが可能である。この点で、使用は、検出される物質（抗原）に結合する特異抗体の特性で構成される。抗体又は抗原が酵素であらかじめ標識される。酵素によって触媒される反応を抗原の存在の裏付けとして用いる。いわゆる基質が酵素によって変換され、反応生成物は通常、色変化、蛍光又は化学発光によって検出されてもよい。シグナル強度は一般に抗原濃度の関数なので、定量的検出にＥＬＩＳＡを用いてもよい。
【００５２】
以下の用語「ハイブリッド捕捉アッセイ」("hybrid capture assay")（ＨＣＡ）は、求められる標的ＤＮＡのＲＮＡ試料とのインキュベートによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが形成される方法を意味するように理解される。ハイブリッドは表面に結合され、次いで酵素標識された抗体とインキュベートされる。ハイブリッド捕捉アッセイは特に、ダイジェン(Ｄｉｇｅｎｅ)社のＨＰＶアッセイで使用される。
【００５３】
以下の用語「ネストＰＣＲ」（"nested PCR"）は、すでに増幅されているＤＮＡ断片が時を改めて増幅される方法を意味するように理解され；この手順は、第１の反応で使用されたプライマー対の内部に提供された第２のプライマー対を用いて実施される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００５４】
本発明の目的は、従来技術から生じる上記の欠点を少なくとも実質的に克服し、試料における生体分子の含量を正規化するための方法、使用及び／又は装置を特に広い範囲のアプリケーションで提供することである。
【００５５】
本発明の特定の目的は、試料における生体分子を正規化するのにさらに好都合であり、且つ上述の一工程法及び二工程法と共に使用するために適切な方法、使用及び／又は装置を提供することである。
【００５６】
さらなる目的は、広い範囲のアプリケーションのために、試料における核酸の含量を正規化するための方法、使用及び装置を提供することである。
【００５７】
さらなる目的は、広い範囲のアプリケーションのために、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡから逆転写によって作製されたｃＤＮＡの含量を正規化するための方法、使用及び装置を提供することである。
【００５８】
さらなる目的は、広い範囲のアプリケーションのために、試料における核酸、特にＲＮＡの含量を正規化するための方法、使用及び装置を提供することである。
【００５９】
本発明の目的は、特に、高い精度及び再現性を特徴とする、試料における生体分子を正規化するための方法、使用及び／又は装置を提供することである。
【００６０】
さらなる目的は、試料における核酸の含量を正規化するための、且つ反応容器の複数回使用を可能にする方法、使用及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００６１】
これらの目的は、本発明の方法の独立請求項に記載の方法によって達成される。従って、以下の工程を有する、試料における生体分子の含量を正規化するために方法が提供される。
ａ）高塩条件下で容器表面が可逆的に生体分子を結合できるように少なくとも定位置で、好ましくは容器の内部で官能化された容器表面を有する反応容器を提供すること、
ｂ）少なくとも１つの試料調製工程を実施すること、
ｃ）高塩条件下で、調製された試料からの生体分子を容器表面に結合させること（「結合及び正規化の工程」）、
ｄ）任意に洗浄すること（「洗浄工程」）、及び
ｅ）少なくとも１つの後続の反応を実施すること。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明に係る反応容器で使用するためのヒト全血に由来するパックスジーン(ＰＡＸＧｅｎｅ)ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
【図２】本発明及び比較例に係る反応容器で使用するためのヒト全血に由来するパックスジーン（ＰＡＸＧｅｎｅ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
【図３】本発明及び比較例に係る反応容器で使用するためのヒト全血に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
【図４】本発明及び比較例に係る反応容器で使用するためのジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
【図５】本発明に係る反応容器及び異なったインキュベート時間で使用するためのジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
【図６ａ】本発明に係るワークフローの一般的なパターンを示す。
【図６ｂ】本発明に係るワークフローの一般的なパターンを示す。
【図７】本発明に従って官能化される表面を反応容器の内部に適用するための装置７０を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
従来技術で既知の方法とは対照的に、本件では、反応容器の表面が最初に、高塩条件下で規定された量の生体分子の可逆的結合のための吸着表面として作用するので、試料における生体分子の含量を正規化するための手段として作用する。従って、反応容器の表面は高塩条件下で可逆的に生体分子を結合できるように官能化される。官能化の種類は、また、特に結合される生体分子の種類に依存する。このことは以下でさらに議論する。表面に結合してもよい生体分子の量は、表面の大きさ、試料に接触する表面、この表面の化学的官能化の種類、生体分子の表面とのインキュベート時間及び使用される結合バッファーの厳密性によって調整される。
【００６４】
さらに、参照される高塩条件（上記定義を参照）は、存在するＲＮＡ分解酵素を失活させるのを助ける。このことは、電荷スイッチ物質に対して及び一般にアニオン交換体に対して存在する低塩条件の場合とは異なり、試料に含有されるＲＮＡが実質的に完全な且つ無傷の様態で単離され、検出に供給されてもよい。
【００６５】
従来技術では、前述のようにいわゆる「二工程法」については、必要に応じて後続の反応が実施される前に、単離された生体分子を新しい反応容器に移すために少なくとも１つの追加のピペッティング工程が必要である。この工程はまた、ｃＤＮＡのレベルで正規化する機会としても使用される。このように、結果が比較され、解釈されてもよいように、細胞投入の変動、ＲＮＡの質及び量、並びにＲＴ効率が補正される。
【００６６】
一工程ＲＴ−ＰＣＲ法では、ここで提案される手順を用いて、ｃＤＮＡがその場(in situ)で合成され、ポリメラーゼと直接反応するので、正規化はＲＮＡの投入レベルで行われる。このように、細胞投入における変動並びにＲＮＡの質及び量が補正されてもよい。
【００６７】
これらの工程に関連した前述の欠点は、本発明に係る方法については存在しない。生体分子は、本発明に係る表面が飽和されるまで本発明に係る反応容器の表面に可逆的に結合し、結果的に生体分子の量の正規化を生じる。この理由で、本発明に係る方法では、生体分子の単離された量について別個の定量工程を必要としない。さらに、追加のピペッティング工程なしで、後続の反応は、本発明に係る反応容器にて直接実施されてもよい。
【００６８】
正規化はさらに、細胞の投入、ＲＮＡの質／量、及び種々の試料についての逆転写の効率における差異に関して発現データを補正するというさらなる利点を有する（後者の原理は二工程ＲＴ−ＰＣＲにのみ適用される）。
【００６９】
参照される後続の反応が試料調製工程と同じ容器で実施されるということが好ましくは提供される。しかしながら、このことは絶対に必要であるわけではない。たとえば、結合及び正規化の工程の後、さらなる反応容器で少なくとも１つの後続の反応を実施するために、１以上のアリコートを反応容器から取り出し、１以上の新しい反応容器に移してもよい。
【００７０】
参照される生体分子が核酸であることが特に好ましく提供される。
【００７１】
核酸は、たとえば、ＰＣＲのような従来の増幅法を用いて特に検出されてもよい。
【００７２】
しかしながら、参照される生体分子は一般に、抗体を用いて検出可能である生体分子種であってもよい。特にオリゴヌクレオチド標識した抗体（「免疫ＰＣＲ」）又はＥＬＩＳＡ（下記参照）を用いて検出可能であるタンパク質が意図される。
【００７３】
参照される少なくとも１つの試料調製工程が以下を含む群から選択されることも好ましく提供される。
・細胞溶解、
・細胞変性、
・生体分子の単離、
・生体分子の精製、
・ＤＮＡへのＲＮＡの逆転写（ＲＴ）及び／又は
・酵素反応及び／又は試料の処理。
【００７４】
参照される酵素反応及び／又は試料の処理には好ましくは、ＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ分解酵素及び／又はプロテアーゼを用いた試料の消化が関与してもよい。
【００７５】
参照されるすくなくとも１つの後続の反応が以下を含む群から選択されることも好ましく提供される。
・増幅反応、
・酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び／又は
・ハイブリッド捕捉アッセイ。
【００７６】
参照される増幅反応が以下の群から選択される反応であることが特に好ましく提供される。
・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、
・ネストＰＣＲ、
・逆転写（ＲＴ）、
・免疫ＰＣＲ。
【００７７】
しかしながら、一般に、参照される生体分子種の少なくとも１つのためにほかの考えられる検出反応が提供されてもよい。
【００７８】
本発明に係る方法の特に好適な一例は、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写（試料調製工程）、容器表面への結合による形成されたｃＤＮＡの正規化（結合及び正規化の工程）及びリアルタイムＰＣＲによるｃＤＮＡをその後に検出すること（後続の反応）を有する方法である。この方法は、「ワークフロー１」として表１において言及される。
【００７９】
そのような方法では、逆転写は本発明に係る反応容器内で直接実施され、インキュベートの後、生成されたｃＤＮＡが本発明に係る表面に可逆的に結合される。こうして表面が飽和され、この方法で規定された量のｃＤＮＡを結合することが可能である。過剰なｃＤＮＡはその後の洗浄工程の間に取り除かれる。この洗浄工程の後、同一容器にてｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲに供してもよい。
【００８０】
従来技術の方法と比べた本発明に係るこの方法の利点は、逆転写の後、ｃＤＮＡの得られた量の定量も、新しい容器へのピペッティングの追加工程も必要ではないことである。これによってプロトコールが簡素化され、又は短縮されるので、手間のレベル及び／又は操作コストを有意に減らすと共に、追加のピペッティング工程が原因となる交差汚染及び／又は不正確性のリスクが軽減される。
【００８１】
従来技術の方法と比べた本発明に係るこの方法のさらなる利点は、ｃＤＮＡの得られた量の定量を省略するにもかかわらず、元々使用したＲＮＡの量にかかわりなく正規化された量のｃＤＮＡがＰＣＲに用いられることである。加えて、２５μＬの体積で操作を行ってもよく、それは、ＰＣＲにとっては慣例であり、結果的に有意なコスト削減を生じる。
【００８２】
逆転写並びにその後のＰＣＲも好ましくは、記載されたように同一の容器で実施する。しかしながら、結合及び正規化の工程の後、１以上のアリコートを反応容器から取り出し、さらなる反応容器でＰＣＲを行うために１以上の新しい反応容器に移すことも提供されてもよい。
【００８３】
本発明に係る方法の別の好適な例は、たとえば、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）製品、アールエヌイージー（ＲＮｅａｓｙ）を用いた、又は代わりに、たとえば、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）製品、オリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）及び／又はターボキャプチャー（ＴｕｒｂｏＣａｐｔｕｒｅ）を用いたｍＲＮＡの単離による試料の溶解及びその後のｍＲＮＡの回収（試料調製工程）と、容器表面への結合による放出された又は単離されたｍＲＮＡの正規化（結合及び正規化の工程）と、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへのその後の逆転写（後続の反応）を有する方法である。逆転写にはその後に追加の結合及び正規化の工程、並びに追加の後続の反応、たとえば、産生されたｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲが任意で続いてもよい（表１、ワークフロー６を参照）。
【００８４】
或いは、後続の反応として単純なハイブリッド形成反応が提供されてもよく；この場合、追加の結合及び正規化の工程は省略されてもよい（表１、ワークフロー２を参照）。
【００８５】
本発明に係る方法についてのワークフローのさらなる例は表１に提供される。ワークフロー１〜５は、方法の最中に新しい試薬を添加するのに容器を開ける必要がないので一工程法に関与する。ワークフロー６は、この場合、ｍＲＮＡレベル及びｃＤＮＡレベルの正規化が行われ、すなわち、第２の結合及び正規化の工程を開始するために２つの反応の間で容器が開けられるので、二工程法を示す。
【００８６】
【表１】
【００８７】
逆転写及び任意に続く第２の後続の反応（特にＰＣＲ）は試料調製工程と同一の容器で行ってもよい。しかしながら、第１の又は任意での第２の結合及び正規化の工程の後、１以上のアリコートを反応容器から取り出し、さらなる反応容器にて少なくとも１つの後続の反応を行うために、１以上の新しい反応容器に移すことも提供されてもよい。
【００８８】
参照される正規化工程については、たとえば、修飾された表面の大きさ及び確立された結合条件に応じて、１０〜５０ｎｇの生体分子（好ましくはＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）を試料から単離することができる。
【００８９】
本発明によれば、さらに
ａ）結合及び正規化の工程で結合バッファーが使用され、及び／又は
ｂ）洗浄工程で洗浄バッファーが使用されることが提供される。
【００９０】
少なくとも定位置にて官能化される容器表面は、
ａ）シラノール基、
ｂ）不飽和有機酸、
ｃ）カルボキシル基、スルホネート基及びそのほかの極性基、及び／又は
ｄ）ヒドロキシル基を含有する金属酸化物及び半金属酸化物を含有することも好ましく提供される。
【００９１】
上述の電荷スイッチ物質とは対照的に、参照される基は一貫して、好適な方法（以下を参照）を用いて微量反応容器及びＰＣＲ容器の表面に永続的に結合（すなわち、一般に共有結合）してもよい。
【００９２】
シリカマトリクスへの核酸の結合は用語「ボーム原理」によって知られ、たとえば、ＥＰ８１９６９６に記載されている（ボゲルステイン（Vogelstein）及びギレスピー(Gillespie) (1979)、並びにボーム（Boom）ら (1990)も参照）。
【００９３】
試料からの核酸の選択的な結合については、カオトロピック物質、たとえば、チオシアン酸グアニジニウムを含有するバッファーに試料をインキュベートする。任意で細胞を溶解し、得られたタンパク質を変性させ、核酸を、まだ遊離で利用できないのなら放出させ、カオトロピック物質の存在により核酸の周りの水和物の殻を溶解する。核酸は、シリカマトリクスのシラノール基（ＳｉＯｘ又はＳｉＯＨ基）と核酸のリン酸主鎖の負のイオン電荷との間の水素架橋を介してシリカ表面に結合する。試料の残りの構成成分はその後洗浄によって取り除かれてもよい。最後にＰＣＲの条件下でＤＮＡ又はＲＮＡが放出される。
【００９４】
核酸のアニオン交換体表面への結合は、核酸のリン酸主鎖の負のイオン電荷と本発明に係るアニオン交換体表面の正の表面電荷との間の静電相互作用に基づく。その電荷が結合バッファーのｐＨに無関係なので四級アンモニウム基は強い塩基性のアニオン交換体の基に属する。一級、二級及び三級アミンは弱い塩基性のアニオン交換体と呼ばれる。高いｐＨ値では、これらのアミンは脱プロトン化形態で存在し、結果的に交換体機能を失う。従って、弱い塩基性のアニオン交換体の交換能力は、使用される結合バッファーのｐＨに大きく依存する。
【００９５】
シラノール基、特にＳｉＯ2についてのものに似た現象は、表面にヒドロキシル基を有する金属酸化物及び半金属酸化物、特に酸化チタン、酸化アルミニウム及び酸化ジルコニウム、それぞれ、たとえば、ＴｉＯ2、Ａｌ2Ｏ3及びＺｒＯ2についても認められる。核酸はまた、カオトロピック塩の存在下でこれらの基と結合し、相応に被覆された又は官能化された表面は核酸を結合するために定まった条件下で同様に使用されてもよい。
【００９６】
参照される不飽和有機酸は重合可能でなければならず、すなわち、たとえば、マレイン酸のように少なくとも１つの不飽和Ｃ＝Ｃ結合（「ビニル性の基」）を含有しなければならない。加えて、さもなければ、それらはたとえば、ポリプロピレンに付着しないので、それらを純粋な形態で使用することはできない。従って、不飽和有機酸が、たとえばＰＥＣＶＤ法を用いてビニルシランとの組み合わせで表面に適用される。
【００９７】
この方法で結合する不飽和有機酸は高塩条件下で核酸を可逆的に結合することができるカルボキシル基（−ＣＯＯ-又は−ＣＯＯＨ基）を提供する。この点で、水素架橋供与体官能性を有する極性表面を作製するために、不飽和有機酸は、ＰＥＣＶＤ塗付ポリマーにカルボキシル基を導入する目的への手段に過ぎない。
【００９８】
水における核酸の溶解度は、高塩条件によって低下する。理由は、水素架橋の分解並びに水における核酸の二次及び三次構造の安定性の関連する低下である。次いで水素架橋供与体として極性表面が提供されれば、水中よりもその部位でそれらはさらに安定なので、核酸はこの表面に結合する。塩濃度が低下すると、水が今一度極性表面よりも良好な水素架橋供与体になり、核酸が表面から脱着してもよい。
【００９９】
また、本発明に従って提供されるのは、容器表面が参照されるプロセス条件下で生体分子を可逆的に結合できるように、少なくとも定位置で、好ましくは容器の内部で官能化されている容器表面を有する、上述のような方法を実施するための反応容器である。
【０１００】
本発明に従って官能化される反応容器の領域は、好ましくは容器当たり０．０１ｍｍ2〜１０ｃｍ2の表面、特に好ましくは０．０１ｍｍ2〜１ｃｍ2の表面、極めて特に好ましくは０．０１ｍｍ2〜５００ｍｍ2の表面、特に好ましくは０．０１ｍｍ2、特に好ましくは１００ｍｍ2の一層さらに好ましくは表面を占有する。このことは、たとえば、９６穴ＰＣＲプレート、ＰＣＲ８連ストリップ又はマルチタイタープレートが、そのウエルの数で乗じられた参照される被覆表面を有することを意味する。
【０１０１】
当該生体分子用の当該反応容器の結合能は、官能化された表面の特徴（特に、官能基の種類及び密度）並びに寸法を選択的に調整することによって正確に設定されてもよい。表面に加えて、結合される生体分子の量は、結合バッファーの接触時間及び厳密性（ストリンジェンシー）を介して影響されてもよい。しかしながら、目的は、反応容器にて提供された表面を生体分子によって完全に飽和することによって正規化を達成することである。
【０１０２】
反応容器当たりの結合能は、１ｎｇ〜４０μｇ、特に好ましくは１ｎｇ〜４μｇ、さらに好ましくは１ｎｇ〜２μｇ、非常に特に好ましくは１ｎｇ〜５００ｎｇの範囲内であることが好ましく提供される。
【０１０３】
たとえば、反応容器当たり５０ｎｇの結合能を想定すると、このことは、溶解、細胞変性、単離工程又は逆転写にあらかじめ供されている当該試料が、たとえば、５０ｎｇを超える当該生体分子種を含有する場合について、過剰分画の生体分子は結合せず、その後の洗浄工程で取り除かれることを意味する。従って、当該生体分子の定量的分画に関する情報は場合により失われてもよい。しかしながら、絶対的な量的情報の喪失は考えられるアプリケーションのシナリオの大半について認容される。
【０１０４】
逆に、このことは、試料が５０ｎｇ未満の当該生体分子種を含有するのであれば、結合能が完全に利用されないので、正規化を行うことができないことを意味する。
【０１０５】
このことは、実際には、それが試料における生体分子の量のむしろ下限以下で変化する傾向があるような方法で（上記参照）結合能を調整する傾向があることを意味する。
【０１０６】
少なくとも定位置で官能化される容器表面は、
ａ）シラノール基、
ｂ）不飽和有機酸、
ｃ）カルボキシル基、スルホネート基及びそのほかの極性基、及び／又は
ｄ）ヒドロキシル基を含有する金属酸化物及び半金属酸化物を含有することが好ましく提供される。
【０１０７】
上記で参照される官能基は、
ａ）プラズマコーティングによって反応容器の物質に適用され、
ｂ）湿式化学法によって反応容器の物質に適用され、及び／又は
ｃ）反応容器自体の物質の特性によって規定されることが好ましく提供される。
【０１０８】
本発明に係る反応容器の物質へのプラズマコーティングによる本発明に係るシラノール基の適用は好ましくは、たとえば、その内容全体が参照されるフラウンホファー表面工学及び薄膜ＩＳＴ研究所(Fraunhofer Institute for Surface Engineering and Thin Films IST)のＤＥ１０２００６０３６５３６Ｂ３及びＤＥ００００１０３２２６９６Ｂ３に記載されたような大気圧プラズマにて実施される。
【０１０９】
この方法はまた、「プラズマ化学気相堆積法」("plasma enhanced chemical vapor deposition")（ＰＥＣＶＤ）とも呼ばれる。この方法はプラズマの助けを借りた化学反応を介して薄層を表面に塗布する化学蒸着(chemical vapor deposition)（ＣＶＤ）の特殊な形態である。この目的のために、反応チャンバーにおいて、塗布される基材と対電極との間に強烈な電場が適用され、それはプラズマの点火を起こす。プラズマは、反応ガスとも呼ばれるガス蒸着媒体の結合の切断を結果的に生じ、それをガス相にてさらに反応する個々のラジカルに分解する。ガス相の反応産物は薄層（５０〜３００ｎｍの間の層厚）の形態で基材上に蒸着する。プラズマのために、ＣＶＤ法よりも高い蒸着率と同時により低い蒸着温度が、コロナ放電とも呼ばれるＰＥＣＶＤ法によって達成される。
【０１１０】
所与の物質の蒸着のための基本的な必要条件は、この物質がガス状の凝集状態で提供されることができなければならないということであり；このことは、いわゆる前駆体、すなわち、所与の温度で特定の蒸気圧を有さなければならない、且つ蒸着されるべきである化学的に結合した形態の物質に含有する化合物を用いて達成されることが多い。この方法では、使用される蒸着媒体は既にガス相であるので、反応チャンバーの外に位置するガス供給系から反応チャンバーの中へ容易に導入され、プラズマに供給されてもよい。従って、炭素含有コーティングを作製するための前駆体として、たとえば「ダイヤモンド様炭素」("diamond like carbon")（ＤＬＣ）又は炭素含有ガスアセチレン（Ｃ2Ｈ2）又はメタンが使用される。シリカコーティングを作製するためには、たとえば、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）又はテトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）が好適である。たとえば、ＴｉＯ2、Ａｌ2Ｏ3及びＺｒＯ2の蒸着には、追加の好適な前駆体が存在する。
【０１１１】
前駆体がプラズマの放電ゾーンに搬送され、そこでガスが加速されるイオンに分かれる。たとえば、テトラメチルシランを用いてシリカコーティングを作製するためには（しかしながら、アセチレンを用いた炭素含有コーティングを作製するためではなく）、前駆体における考えられる有機分画を燃焼させるために同時に酸素を搬送することが多い。
【０１１２】
次いでガスイオンが被覆される加工対象物の表面と高速で衝突し、そこで、それらは還元され、当該コーティングを形成する。表面の物質とコーティング物質の間でコーティングの物質への永続的な結合を保証する共有結合が形成されることが多い。
【０１１３】
従って、Ｃ−Ｃ結合及びＣ−Ｈ結合の均等分裂によってポリプロピレン表面にてプラズマ中でポリプロピレン（ＰＰ）上にラジカルが生じる。これらのラジカルは、たとえば、コーティング物質の酸素、珪素又は炭素と共有結合を形成してもよい。
【０１１４】
コーティング物質はこのようにしてポリプロピレン表面と共有結合する。前駆体としてのＴＥＯＳを用いたＳｉＯ2コーティングの場合、ＰＰへの共有結合はＳｉ−Ｏ−Ｃの結合及びＳｉ−Ｃの結合を介して生じる。前駆体としての有機モノマーの場合、ＰＰへの共有結合は、たとえば、Ｃ−Ｃ結合及びＣ−Ｏ−Ｃ結合を介して生じる。
【０１１５】
しかしながら、共有結合が形成されない場合でさえ、この方法で非常に耐久性のあるコーティングが達成される。
【０１１６】
ＰＥＣＶＤ法は、また、プラズマ中のガス相にて有機ポリマーが生成され、基材に蒸着されることを可能とする。この場合、たとえば、無水マレイン酸、アクリレート、ビニルシラン及びそのほかの重合可能な前駆体（モノマー）のようなモノマーを使用してもよい。キャリアガス中では酸素なしで済ませ、有機構成成分の酸化を防いでもよい。
【０１１７】
しかしながら、この方法を用いて直接アニオン交換体層を生じるシラノール基含有層を蒸着してもよい。前駆体、アミノプロピルトリメトキシシランによって、たとえば、ＰＥＣＶＤ層にてシラノール基及びアニオン交換体基の直接的製造が可能である。
【０１１８】
好適な前駆体の選択によってカルボキシル基を含有するシリカ層も作製してもよい。
【０１１９】
前駆体、ビニルトリメトキシシラン及び無水マレイン酸を用いてポリプロピレン上にカルボキシル基を含有する層も作製してもよい。
【０１２０】
ＰＥＣＶＤ法を用い、酸素を添加したガス相において、相応する前駆体（金属アルコキシド及び半金属アルコキシド）から同様に金属酸化物及び半金属酸化物を作製し、たとえば、ポリプロピレン上に蒸着させてもよい。
【０１２１】
金属アルコキシド及び半金属アルコキシドに加えて、たとえば、アクリレートのガス相ポリマー及びそのほかの不飽和化合物を作製し、ＰＥＣＶＤを介してその場(in situ)で被覆してもよい。モノマー（たとえば、ＨＥＭＡ、アクリル酸、無水マレイン酸など）及びビニルシランの適切な選択によって、たとえば、無水マレイン酸及びシラン（ビニルシラン）のような有機モノマーの混合コポリマーをポリプロピレン上に蒸着させてもよい。この場合、カルボキシル基並びにシラノール基を有するポリマーが作製される。
【０１２２】
ヒドロキシル基（ジェミナル、近接の）、ジオール基、カルボキシル基、アミノ基及びシラノール基は特に、ポリプロピレン上に水素架橋供与体特性を有する表面物質を提供するための好適な化学官能である。
【０１２３】
本発明の範囲内で、無水マレイン酸及びビニルシランのコポリマーもその場(in situ)で作製してもよい。この前駆体混合物がＰＥＣＶＤを介してガス相で重合可能であるのに十分な蒸気圧を有し、ポリプロピレン、すなわち、反応容器の物質上によく付着する層を形成することは有利である。
【０１２４】
ＰＥＣＶＤを介してスルホン基を蒸着させるための前駆体として、たとえば、スチレンスルホン酸を用いてもよい。
【０１２５】
上述のＣＶＤ法とは対照的に、ＰＥＣＶＤ法では、温度はほぼ室温のままである。従って、ＰＥＣＶＤ法は、本発明に係る反応容器に使用されることが多いプラスチック、たとえば、ポリプロピレン及びポリエチレンのコーティングに適する。
【０１２６】
本発明の発明者らはまた、好適なコーティング装置を用いて、テトラエトキシシランと、ビニルシラン及び無水マレイン酸のカルボキシル基含有コポリマーとを前駆体として用いて微量反応容器、特にＰＣＲ反応容器（「８連ストリップ」、９６穴プレート、マルチタイタープレート）、使い捨て反応容器及びピペットのチップの内部表面を被覆してもよいことも明らかにした。相当する装置を図７に示す。
【０１２７】
説明された装置は並行の配置で使用されてもよいので、複数の反応容器を同時に被覆することが可能である。
【０１２８】
例えば、ゾルゲル法はシアノール基を物質に適用するのに好ましい湿式化学法である。前駆体を規定された量の水及び考えられる触媒と一緒に溶媒、たとえば、水に溶解する。テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）は二酸化珪素前駆体として好ましくは使用される。
【０１２９】
しかしながら、たとえば、物質がガラスである場合、本発明自体に係る反応容器の物質の特性によって本発明に係るシラノール基が決定されることが特に提供されてもよい。
【０１３０】
本発明によれば、反応容器は、
ａ）ＰＣＲ容器、ＰＣＲ８連ストリップ若しくはＰＣＲ９６穴プレート、
ｂ）キャピラリー若しくは微量流体チャンネル(microfluid channel)、
ｃ）使い捨て反応容器
ｄ）ピペットチップ及び／又は
ｅ）マルチタイタープレート
を含む群からの容器であることも好ましく提供される。
【０１３１】
参照される微量反応容器は、たとえば、０．１〜２ｍＬの体積を有し、口語用法でＰＣＲ反応容器（エービーアイ（ＡＢＩ）、サーモ（Ｔｈｅｒｍｏ）など）とも呼ばれてもよい任意に密封可能な容器であってもよい。これらの容器は一般にポリプロピレン、ポリエチレン、ＣＯＣ、ＰＥＴ又はポリカーボネートからできている。
【０１３２】
これはまた、参照されるピペットチップにも同様に適用され、それは一般に自動ピペット（口語用法で「エッペンドルフピペット」とも呼ばれることが多い）と併せて使い捨て物品として使用される。
【０１３３】
マイクロタイタープレートは、本発明の意味の範囲内で複数の反応容器（「ウエル」）を有する単位である。そのようなマイクロタイタープレートは一般に６〜１５３６のウエルを有する。典型的なマイクロタイタープレート形式を表２に示す。
【表２】
【０１３４】
加えて、上述のような方法を実施するためにキットが提供され、該キットは、少なくとも
ａ）結合バッファー、
ｂ）洗浄バッファー、
ｃ）試料調製工程、好ましくは逆転写（ＲＴ）を実施するための任意の試薬、
ｄ）後続の反応、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するための任意の試薬、及び
ｅ）任意で上記記載に係る少なくとも１つの反応容器を有する。
【０１３５】
洗浄バッファーは、水、トリス、錯化剤、ポリオール、洗浄剤（デタージェント）及びポリマー、コポリマー及び／又はターポリマーを含有することも好ましく提供される。
【０１３６】
結合バッファーはカオトロピック物質を含有することも好ましく提供される。これは特に好ましくは、
・塩酸グアニジン
・（イソ）チオシアン酸グアニジニウム
・ヨウ化ナトリウム
・ヨウ化カリウム
・（イソ）チオシアン酸ナトリウム及び／又は
・尿素
又はこれらの混合物を含む群から選択される少なくとも１つの物質である。
【０１３７】
アニオン交換体表面にｃＤＮＡを結合するための結合バッファーは好ましくは低塩バッファーである。表面又は表面基のｐＫ値を下回るｐＨは好ましくは、結合工程でアニオン交換体が正の表面電荷を有するように設定されるので、負に荷電した核酸を結合することができる。
【０１３８】
また提供されるのは、試料における生体分子の含量を正規化するための、本発明に係る反応容器及び／又は本発明に係るキットの使用である。
【０１３９】
これには好ましくは、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡからの逆転写（ＲＴ）によって反応容器にて作製されているｃＤＮＡが関与し、該ｃＤＮＡは次いでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供される。
【０１４０】
上述の構成成分及び本発明に従って使用される例となる実施態様において主張される及び記載される構成成分は、その大きさ、形状、物質選択又は技術的設計に関して特定の例外の対象とはならないので、アプリケーションの分野で既知の選択基準は無制限の適用を有する。加えて、以下の実施例は、本特許出願の保護の範囲に限定的な影響を有さず、それは、クレームに基づいてのみ定義される。
【０１４１】
図面と実施例
本発明の主題のさらなる詳細、特徴及び利点は、サブクレームから生じ、関連する図面及び実施例の以下の記載から生じるが、その際、本発明の複数の例となる実施形態及びアプリケーションの分野は実施例により説明される。
【０１４２】
図１は、本発明に係る反応容器で使用するためのヒト全血に由来するパックスジーン(ＰＡＸＧｅｎｅ)ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
図２は、本発明及び比較例に係る反応容器で使用するためのヒト全血に由来するパックスジーン（ＰＡＸＧｅｎｅ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
図３は、本発明及び比較例に係る反応容器で使用するためのヒト全血に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
図４は、本発明及び比較例に係る反応容器で使用するためのジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
図５は、本発明に係る反応容器及び異なったインキュベート時間で使用するためのジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
図６は、本発明に係るワークフローの一般的なパターンを示す。
図７は、本発明に従って官能化される表面を反応容器の内部に適用するための装置７０を示す。
【０１４３】
以下の例となる実施形態を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、それらに限定されることは意図されない。
【実施例】
【０１４４】
（実施例１）
以下の手順を実施した：
本発明に従って使用される表面を修飾した反応容器（バイオザイム（Ｂｉｏｚｙｍ）からのＰＣＲ容器、０．２ｍＬ、薄壁、ＰＣＲソフトストリップ）を大気圧プラズマ中にてテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）で被覆した。
【０１４５】
実施した試験では、ヒト全血由来のパックスジーン（ＰＡＸＧｅｎｅ）ＲＮＡ及びキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡ、並びにジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡを用いた。キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）のクオンティテクト（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ）キットとオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）キットを利用し、ポリｄＴプライマーを用いて逆転写を行った。
【０１４６】
６ＭのＧｕＨＣｌ、０．１Ｍのフタル酸水素カリウム（ｐＨ２．５）を結合バッファーとして用い、ＴＥバッファーにおいて２％ノニデット(Nonidet)（登録商標）Ｐ４０及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリ（メチルビニルエーテル−アルト−マレイン酸）（poly(methylvinyl ether-alt-maleic acid)を洗浄バッファーとして用いた。エービーアイ（ＡＢＩ）のタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）β-アクチン試料キットを用いてＡＢＩ７７００にてＰＣＲを行った。
【０１４７】
試験のプロトコールを表３に示す。
【表３】
【０１４８】
ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）ＮＤ−１０００分光光度計を用いて、逆転写に使用したＲＮＡをあらかじめ定量した。
【０１４９】
対照として、それぞれの場合で、被覆されていないＰＣＲ容器におけるＲＴアッセイのアリコートを試験し、ＲＴ反応のアリコートをピペットで直接ＰＣＲマスターミックスに入れた。
【０１５０】
ＰＣＲ実験のそれぞれにて８重の測定を行い、すなわち、定められた値は８つの個々の値の平均に相当し、誤差バーは標準偏差を示す。
【０１５１】
（実施例２）
図１は、ヒト全血からのパックスジーン（ＰＡＸＧｅｎｅ）ＲＮＡのクオンティテクト（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ）ｃＤＮＡ合成に由来するｃＤＮＡについて実施されたタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）の結果を示す。使用したＲＮＡの量は、小さな範囲内（１１３〜２９３ｎｇ）で変化した。
【０１５２】
結果は驚くべきことに、本発明に係る反応容器を使用する場合、使用したＲＮＡの１３５ｎｇから１８０ｎｇへの推移の後、１８．４〜１９．１の間の相対的に均一なＣTレベル、従ってＣT値の正規化が達成されたことを示す。
【０１５３】
（実施例３）
図２は同様にヒト全血からのパックスジーン（ＰＡＸＧｅｎｅ）ＲＮＡのクオンティテクト（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ）ｃＤＮＡ合成に由来するｃＤＮＡについて実施されたタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）の結果を示す。ＲＮＡの量は１５０〜４５０ｎｇの間で変化し（カラム１〜５）、さらに各場合で、逆転写のアリコートを、ＰＣＲマトリクスを含有する未処理の容器にピペットで入れた（カラム６〜１０）。これらのアリコートについて、その中に含有されるＲＮＡの出発量が示されている。使用したＲＮＡの量は最初の実施例に比べてさらに広い範囲にわたって変化した。
【０１５４】
結果は、本発明に係る反応容器を使用する場合、１５０〜４５０ｎｇのＲＮＡの使用について、１７．９〜１８．９の間の相対的に均一なＣTレベル、従ってＣT値の正規化が同様に達成されたことを示す。未処理の反応容器における対照試験は予想どおり、逆転写に出発材料として使用されるＲＮＡが多ければ多いほど、相当するＣT値の低下が大きかったことを示している。
【０１５５】
（実施例４）
図３は、ヒト全血からのキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）のｃＤＮＡ合成に由来するｃＤＮＡについて実施されたタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）の結果を示す。ＲＮＡの量は１００〜１１００ｎｇＲＮＡの間で変化し、対照試験は同様に非被覆容器で実施した。
【０１５６】
結果は、本発明に係る反応容器を使用する場合、１００〜１１００ｎｇのＲＮＡの使用について、１７．２前後の相対的に均一なＣTレベルが存在したので、ＣT値の正規化が同様に達成されたことを示す。未処理の反応容器における対照試験は予想どおり、逆転写に出発材料として使用されるＲＮＡが多ければ多いほど、相当するＣT値の低下が大きいことを示した。
【０１５７】
（実施例５）
図４は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）ＲＮＡのオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）のｃＤＮＡ合成に由来するｃＤＮＡについて実施されたタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）の結果を示す。ＲＮＡの量は１００〜１１００ｎｇのＲＮＡの間で変化し、対照試験は今一度非被覆容器で実施した。
【０１５８】
結果は、本発明に係る反応容器を使用する場合、１００〜１１００ｎｇのＲＮＡの使用について、ＣT値の正規化が達成されたことを示す。未処理の反応容器における対照試験は今一度、逆転写に出発材料として使用されたＲＮＡが多ければ多いほど、相当するＣT値の低下が大きいことを示した。
【０１５９】
（実施例６）
図５は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）ＲＮＡのオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）のｃＤＮＡ合成に由来するｃＤＮＡについて実施されたタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）の結果を示す。ＲＮＡの量は１００〜８００ｎｇＲＮＡの間で変化した。さらに、異なったインキュベート時間を選択した、すなわち、１００〜４００ｎｇのＲＮＡについては２４０分間及び５００〜８００ｎｇのＲＮＡについては２０分間。
【０１６０】
結果は驚くべきことに、インキュベート時間を２０分間から２４０分間に延ばすことによって、最低量のＲＮＡ（１００ｎｇ）のＣT値を、２０分のインキュベート時間を用いた大量のＲＮＡ（５００〜８００ｎｇ）の飽和のレベルに持っていくことが可能だったことを示す。この実施例から、使用したＲＮＡの３００〜４００ｎｇの平均量と２４０分間の長いインキュベート時間について、相対的に低い１５．９のＣTレベルにて飽和が達成されたことも明らかである。
【０１６１】
図６ａは、試料調製工程２、結合及び正規化の工程３、洗浄工程４並びに後続の反応６を含む、本発明に係るワークフローの一般的なパターンを示す。後続の反応には任意で第２の結合及び正規化の工程並びに第２の後続の反応（表１を参照）が続いてもよい。
【０１６２】
図６ｂには参照されるワークフローがＰＣＲストリップでも実施されてもよいことを示す。
【０１６３】
図７は、本発明に従って官能化される表面を反応容器の内部に適用するための装置７０を示す。
【０１６４】
参照される装置は平坦な電極７２が設置されるチャンバー７１を有する。チャンバーはまた、前駆体ガス７３のためのガス導入装置、及びコーティング電極７４も有する。前駆体ガスはたとえば、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）である。ガス導入装置７３とコーティング電極７４とを図７に係る装置において合わせ、その形状が被覆される反応容器７５の内部に適合されている複合装置を形成する（本件では、口語用法では「エッペンドルフ容器」と呼ばれる０．２ｍＬの体積を有するポリプロピレンのＰＣＲ微量反応容器）。
【０１６５】
次いで、周波数発生器７６を用いて平坦な電極７２とコーティング電極７４との間に高周波交流電圧（たとえば、１３．５６ＭＨｚ）を適用し、反応容器内部にてプラズマが発生する。プラズマは前駆体ガスの結合の切断を生じ、基材上に蒸着し、その位置でシリカ分子の化学蒸着反応をもたらす個々のラジカルにそれを分解する。
【０１６６】
本発明に従って官能化された反応容器を使用する場合、この方法で作製される官能化された表面は生体分子の反応容器内部への結合を生じる（たとえば、カオトロピック塩の存在下で官能化表面上のシラノール基への核酸の結合）。
【０１６７】
説明される装置はまた、複数の反応容器、たとえば、複数の「エッペンドルフ容器」又はたとえば、複数のウェルを有するマルチタイタープレートの同時コーティングにも好適である。
【０１６８】
反応容器の被覆される表面の大きさは本質的に電極の大きさの関数であり、０．２ｍＬのＰＣＲ容器では１０ｍｍ2〜３００ｍｍ2であってもよい。
【０１６９】
（実施例７）
大気圧下にてＰＥＣＶＤ法を用いて０．２ｍＬの体積を有するポリプロピレンのＰＣＲ容器をテトラエトキシシランで被覆した。核酸の５００ｎｇまでの結合能が達成された。
【０１７０】
ＰＥＣＶＤ法については、他の因子の中でも互いに対する電極（陰極、陽極）の大きさ及び位置決めによって、コーティングの間に作製される表面は規定される。本件では、大きさはおよそ１５０ｍｍ2だった。
【０１７１】
（参照文献）
・バートレット（Bartlett）及びスターリング（Stirling）(2003), メソッドス・イン・モレキュラー・バイオロジー（Methods Mol. Biol.）226:3-6
・サノら（Sano et al.）(1992), サイエンス（Science） 258, 120-122
・バーチら（Birch et al.）(1996),ネイチャー（Nature）381, 445
・ボゲルステイン（Vogelstein）及びギレスピー（Gillespie）(1979), 米国科学アカデミー紀要（PNAS）76: 615-619
・ブームら（Boom et al）(1990),ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（J. Clin. Microbiol.） 1990 ３月（Mar）; 28(3):495-503
・コンプトン（Compton）(1991),ネイチャー（Nature）350, 91
・ヒル（Hill）(2001),エキスパート・レビュー・オブ・モレキュラー・ダイアグノスティックス（Expert Reviews of Molecular Diagnostics） 1, 445
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料における生体分子の含量を正規化するための方法、使用及び装置に関する。該方法、該用途及び該装置は、たとえば、生化学、分子生物学、分子遺伝学、微生物学、分子診断学及び／又は分子法医学における応用に好適である。
【背景技術】
【０００２】
試料における生体分子の含量を正規化することは、たとえば、分子診断学において、遺伝子発現の解析のために、活性物質に基づいた転写物レベルの解析、分子法医学、配列決定又は遺伝子型決定において試料の解析で主要な役割を担う。
【０００３】
正規化の理由は、場合によっては、検出される生体分子、特に核酸及び／又はタンパク質が試料中に異なった量で存在する可能性があることである。加えて、調製試料の処理工程、たとえば、溶解、細胞変性、単離工程、又は逆転写は、異なったレベルの効率で問題の生体分子を提供する可能性がある。
【０００４】
双方の場合、このことは、上述の不確定要素による試料における生体分子の未知の部分が、さらなる調製工程及び解析工程の再現性及び精度を複雑にし、又は定量のために追加の工程を必要とすることを意味する。
【０００５】
このことは、既知の方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写、免疫−ＰＣＲ（イムノＰＣＲ））を用いてその後に検出される核酸を含有する試料の調製にとって特に重要である。この場合、所望のサイクル数を達成するために、工程パラメーター、特に試料における生体分子の含量を調整することが重要である。
【０００６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、試験管内でＤＮＡを増幅するシステムとしてこの２、３０年で確立されたものである。同時に、ＰＣＲは、単なる複製から定性分析及び定量のための「リアルタイム」ＰＣＲに向かった技術のさらなる開発の結果、広く使用される解析ツール及びアッセイツールになっている。いわゆるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、特定の遺伝子断片のＲＮＡ転写物の検出は目下、標準のアプリケーションである。この点で、プライマー（多くはポリｄＴ）と酵素（逆転写酵素）とを用いて、試料に存在するｍＲＮＡがすべてＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写され、こうして形成されたｃＤＮＡがＰＣＲアッセイで検出される。このようにして、一工程プロトコール又は二工程プロトコールにてアッセイを実施することが可能である。一工程プロトコールでは、逆転写（ＲＴ）及びＰＣＲアッセイ自体がＰＣＲ機器において実施されるが、二工程プロトコールでは、逆転写が別に実施され、反応のアリコートがＰＣＲマスターミックスに添加される。しかしながら、ｍＲＮＡのレベルは、異なる試料では極めて異なる可能性があり、加えて、ＲＴの効率は変動しやすい可能性がある。このことは、ＰＣＲ反応に導入されるｃＤＮＡの量が極めて異なるという結果を生じることがある。
【０００７】
従来技術では、通例、たとえば、ＯＤ測定又は蛍光測定を利用して、逆転写を開始する前に試料のＲＮＡ含量を決定する。逆転写の完了後、ヌクレオチド、リボゾームＲＮＡ及びそのほかの構成物質の存在がｃＤＮＡの定量を複雑にするので、ｃＤＮＡレベルでの定量は一般に実施されない。
【０００８】
そのような定量のやり方は、特にいわゆる二工程法で実施されてもよく、その際、試料の調製（たとえば、溶解、細胞変性、単離工程又は逆転写による）及びさらなる試料の処理（たとえば、ＰＣＲによる）は、別々の工程及び／又は異なった容器で実施されるので、２つの工程の間でピペッティング工程が行われてもよい。そのような工程は、すでに調製されてもよい試料がＰＣＲ工程に直接供される方法にも好適である。
【０００９】
従来技術の二工程ＰＣＲの場合については、逆転写を別の容器で実施し、次いでＰＣＲマスターミックスにピペットで入れる。この点で、逆転写後のｃＤＮＡの量は分光法で一回定量されうる。しかしながら、追加のレベルの尽力のためにこれは普通省かれ、ＲＴ反応のアリコートだけがｑＰＣＲに使用される。ＰＣＲマスターミックスの過剰な希釈を防ぐために、マスターミックス量の最大たった１０％がアリコートとしてそれに添加されるべきである。このことは、２．５μＬを用いた２５μＬのＰＣＲでは、ＰＣＲ反応では１０％をやや上回る逆転写産物を使用してもよく、又は今一度さらに多い体積を回避しなければならないことを意味する。同時に、追加のピペッティング工程は、手動操作の場合のように、さらなる不正確を生じる。交差汚染のさらなるリスクもある。
【００１０】
本方法では、ｃＤＮＡは反応容器の決められた表面に可逆的に結合するので、ＰＣＲ反応アッセイにおける追加の体積を考慮する必要はない。
【００１１】
試料の調製（たとえば、溶解及び／又は逆転写による）及びさらなる試料の処理（たとえば、ＰＣＲによる）が同一の容器で生じ、可能であれば容器を閉じたままにする（いわゆる一工程法）方法にとって以前のやり方は実用的ではない。
【００１２】
従来技術の一工程法では、任意に分光法で定量される生体分子（たとえば、ｍＲＮＡ）の量が使用される。逆転写及びＰＣＲ法自体が同一の反応容器で実施される。従って、できれば処理中、反応容器を開けないので、逆転写のアッセイ全体がＰＣＲ反応に移される。しかしながら、使用される試料については、（たとえば、ｍＲＮＡの）生体分子含量が非常に異なる可能性があり、試料調製工程（たとえば、逆転写）の効率も変動しやすく、それが、試料調製工程の完了後、結果的に非常に異なった産物（たとえば、ｃＤＮＡ）の量を生じることがあり、次いでそれが後続の反応（たとえば、ＰＣＲ）に導入されて再現性のない反応結果を生じる。通常２０μＬの追加反応のアッセイ体積のために、さらに、ＰＣＲに慣例である２５μＬの体積で操作するのは可能ではない。通例、一工程ＲＴ−ＰＣＲは５０μＬ又は１００μＬのスケールで実施される。
【００１３】
本発明による方法及び本発明による装置では、ＯＤ測定又は蛍光測定を用いてそれを定量する代わりに、たとえば、本発明に従って作製される結合表面を用いて装置で、核酸の絶対量を正規化する。対照的に、いわゆる「ハウスキーパー法」は、生物系の状態について表示するのに使用してもよい内部参照(internal reference)又は内在参照(endogenous reference)を表す。特定のハウスキーパー遺伝子の標準値は特定の細胞型と併せてその発現レベルについて存在するので、ハウスキーパー遺伝子を用いてアッセイの質を評価してもよい。
【００１４】
しかしながら、この方法では、不確実性の可能性があるために正規化の精度は大きく限定されることが言及されなければならない。従って、理想的なハウスキーパー遺伝子は存在せず；すなわち、いずれの場合でも、複数のハウスキーパー遺伝子の使用によってさえ、完全に排除することができない遺伝子発現の種、型、段階又は状態に特異的な遺伝子発現の変動が認められる可能性がある。
【００１５】
加えて、ＵＳ２００７０２３１８９２では核酸を増幅するための方法が知られ、その際、溶解物中に含有される核酸を結合するために、容器中にて生物試料の溶解物をいわゆる「電荷スイッチ」("charge-switch")表面に接触させる。次いで結合しなかった溶解物を取り除き、結合した核酸を増幅する。参照される「電荷スイッチ」物質については、ｐＨが変化すると表面電荷に変化が生じる。弱いイオン交換体のこの特性は、たとえば、表面基のｐＫ値よりも低いｐＨにて出現するので、これらの表面基は正の表面電荷を有する。負に帯電した生体分子、特に核酸が次いで結合してもよい。他方、表面基のｐＫ値より大きいｐＨについては、電荷が正から中性又は負に変わるので、負に帯電した生体分子、特に核酸は今一度放出されてもよい。従って、種々のｐＨ値を有し、且つ低塩濃度も有する好適なバッファー（「低塩バッファー」）を用いることによってｐＨを介して結合と放出のプロセスがこうして制御されてもよい。
【００１６】
参照される「電荷スイッチ」物質は、特にアニオン交換体の特性を有する。この方法の欠点の１つは、好適な物質が、たとえば、ポリプロピレン製の微量反応容器の表面に永続的に共有結合できないということである。物質は表面への単純な積層によって一般に固定化される。しかしながら、表面への永続的な付着は保証されず、それは、これらの方法の再現性に疑問を投げかけ、相応して被覆された容器の複数回の使用を不可能にもする。
【００１７】
加えて、「電荷スイッチ」を使用し、かつ一般にアニオン交換体を使用した参照条件下での生物試料からのＲＮＡの単離は、遍在するＲＮＡ分解酵素のために問題がある。普及している低塩条件下でこれらは手付かずのままであるので、ＲＮＡは２、３秒以内にひどく分解され、検出はさらに困難になるか又は不可能にさえなる。
【００１８】
（定義）
本発明の意味の範囲内で用語「核酸」は、特に、天然の、好ましくは直鎖の、分枝鎖の又は環状の核酸、たとえば、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡ、一本鎖の及び二本鎖のウイルスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、又はリボザイム、ゲノムの、細菌の又はウイルスのＤＮＡ（一本鎖及び二本鎖）、染色体及びエピソームのＤＮＡ、自由に循環する核酸など、合成の又は修飾された核酸、たとえば、プラスミド又はオリゴヌクレオチド、特にＰＣＲに使用するためのプライマー、プローブ若しくは標準、ジゴキシゲニン、ビオチン若しくは蛍光色素で標識された核酸、又はいわゆる「ペプチド核酸」("peptide nucleic acid")（ＰＮＡ）を意味するように理解されるが、これらに限定されない。
【００１９】
用語「試料中の生体分子の含量を正規化すること」は、試料中の生体分子の含量が、（容器表面、好ましくは容器の内側の少なくとも一部の大きさと結合特性によって、本発明により）特定の程度を超えないことを保証する工程を意味するように理解される。これは、生体分子の含量を特定の値に定量する方法である。これには、この程度を超える生体分子のその後の廃棄が含まれ、また、試料が上述の特定の程度より少ない生体分子を含有するのであれば、正規化は奏功しない。
【００２０】
本発明の意味の範囲内で用語「固定化」は、特に、適切な固相への可逆的な固定化を意味するように理解されるが、これに限定されない。
【００２１】
用語「膜」は、特に、生体分子を可逆的に結合することができる固相を意味するように理解されるが、これに限定されない。
【００２２】
用語「高塩バッファー」は、特に、高塩濃度（好ましくはカオトロピック物質）、好ましくは≧１００ｍＭ、さらに好ましくは≧５００ｍＭ、一層さらに好ましくは≧１Ｍを有するバッファーを意味するように理解されるが、これに限定されない。
【００２３】
以下の用語「高塩条件」は、高塩バッファー、好ましくはカオトロピック塩を含有する高塩バッファーを使用する環境を意味するように理解される。高塩［バッファー］、好ましくはカオトロピック塩を含有する高塩バッファーを使用することによって水における核酸の溶解度を低下させる。理由は、水素架橋の切断と水中での核酸の二次構造及び三次構造の安定性の関連する低下である。そのとき極性の表面が水素架橋の供与体として提供されれば、その位置で水中よりそれらはさらに安定なので、核酸はこの表面に結合する。塩濃度が低下すると、極性表面よりも水が今一度良好な水素架橋供与体になり、核酸は表面から脱着されてもよい。
【００２４】
用語「カオトロピック物質」又は「カオトロピック塩」は特に、タンパク質及び／又は核酸の二次構造、三次構造及び／又は四次構造を変え、且つ、少なくとも一次構造(primary structure)をそのままにし、水中での極性物質の溶解度を低下させ、及び／又は疎水性の相互作用を強化する物質を意味するように理解されるが、これらに限定されない。好ましいカオトロピック物質は、塩酸グアニジン、（イソ）チオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム及び／又は尿素である。
【００２５】
用語「シラノール基」は特に、組成（ＳｉＯ2x（ＯＨ）α（ＯＥｔ）βを有し、化学量論因子αがｘ及びβの関数（すなわち、α＝４（１−ｘ）−β）である酸化珪素（非晶性、結晶性）又はポリ珪酸を意味するように理解されるが、それには限定されない。二酸化珪素又はポリ珪酸は１以上の以下の置換基を含有してもよく、又は以下の酸化物によって完全に置き換えられてもよい。
・Ｂ2Ｏ3（０〜３０％）
・Ａｌ2Ｏ3（０〜１００％）
・ＴｉＯ2（０〜１００％）
・ＺｒＯ2（０〜１００％）
【００２６】
物質は表面が官能化されてもよい。たとえば、シラノール基が、シランによるシラン化によって処理されてあってもよい。表面は疎水化されてもよく、又はアニオン基及び／又はカチオン基及び／又はキレート剤が適用されてもよい。たとえば、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）部分がキレート基として適用されてもよい。これによって結合される生体分子に吸収剤表面を適合させることができる。
【００２７】
別の選択肢は、シラン化プロセスを用いてシラノール基にハロゲン含有の原子移転ラジカル開始剤を適用することであり、シラノール基にて「グラフトフロム」("grafting from")法を用いてポリマー鎖を作製することができる。グラフト共重合とも呼ばれるこの方法は、連鎖停止(chain termination)、不均衡(disproportionation)又は組換え(recombination)に向かう傾向がわずかである重合プロセスを必要とする。グラフト共重合を行うために開始剤はシラノール基に適用しなければならない。ハロゲンを含有するシランでＰＥＣＶＤ珪酸層を処理することによってこれを達成してもよい。或いは、ＰＥＣＶＤプロセスに開始剤を直接導入する。この点で、揮発性のハロゲン含有化合物をプロセスガス（ＰＥＣＶＤプロセスの前駆体）に加える。ＡＴＲＰをそのようなハロゲン化合物含有表面で行うのであれば、表面に共有結合するポリマー（ホモポリマー、コポリマー、ブロックコポリマー）がその場で作製される。好適なモノマーは、たとえば、アクリレート、メタクリレート、スチレン、及びスチレン誘導体のようなラジカル重合可能な化合物である。
【００２８】
原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）は、その場でのラジカル重合の形態である。ラジカルは、原子移動法を用いて、Ｃｕ（Ｉ）／Ｃｕ（ＩＩ）酸化還元平衡を介して有機ハロゲン化合物から形成される。酸化還元平衡は、遊離ラジカルの濃縮において大きな還元を生じる。従って、不均衡又は組換えによる連鎖停止反応は大きく抑制される。
【００２９】
用語「増幅反応」は、１以上の検体、好ましくは核酸の濃度を少なくとも二倍にすることができる方法を意味するように理解される。
【００３０】
ここで等温増幅反応と熱サイクル増幅反応との間で対比を行う。前者では、プロセス全体の間、温度は一定のままであるが、後者では、反応と増幅を制御するのに使用される熱サイクルが実施される。
【００３１】
以下は好ましい等温増幅反応の例である。
・ループ介在型等温増幅(loop mediated isothermal amplification)（ＬＡＭＰ）
・核酸配列に基づく増幅（nucleic acid sequence-based amplification）（ＮＡＳＢＡ）
・ローリングサークル連鎖反応(rolling circle chain reaction)（ＲＣＣＲ）又はローリングサークル増幅(rolling circle amplification)（ＲＣＡ）及び／又は
・転写介在型増幅（transcription mediated amplification）（ＴＭＡ）
【００３２】
以下は好ましい熱サイクル増幅反応の例である。
・リガーゼ連鎖反応(ligase chain reaction)（ＬＣＲ）及び／又は
・ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction)（ＰＣＲ）
【００３３】
用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は、たとえば、バートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）及びスターリング（Ｓｔｉｒｌｉｎｇ）（２００３）に記載されたように、核酸の試験管内増幅のための方法を意味するように理解される。
【００３４】
用語「リガーゼ連鎖反応」（ＬＣＲ）は、異なった酵素（ポリメラーゼの代わりにリガーゼ）を使用することを除いてポリメラーゼ連鎖反応と同様に機能する非常に少量の核酸のための検出方法を意味するように理解される。ＤＮＡ鎖当たり２つの試料を連結して１つの試料を形成する。１サイクルで得られる増幅産物はたった３０〜５０ｂｐの長さに過ぎないことが多く、それ自体、添加されたプライマーの出発点としてその後のサイクルで再利用される。
【００３５】
用語「ループ介在型等温増幅」（ＬＡＭＰ）は、標的配列の特定の領域を認識し、それに結合する６つの異なったプライマーを使用する等温核酸増幅のための方法を意味するように理解される。ＬＡＭＰは鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用し、およそ６５℃の定温で進行する。標的配列の増幅と検出とは単一工程で行われる。
【００３６】
用語「核酸配列に基づく増幅」（ＮＡＳＢＡ）は、ＲＮＡを増幅するための方法（コンプトン（Compton）, 1991)を意味するように理解される。ＲＮＡマトリクスを反応混合物に加え、第１のプライマーがマトリクスの３’末端の領域における相補的な配列に結合する。次いで逆転写酵素を用いてマトリクスと相補的なＤＮＡ鎖が重合される。その後、ＲＮＡ分解酵素Ｈ（ＲＮＡ分解酵素ＨはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを消化するが、一本鎖ＲＮＡは消化しない）を用いてＲＮＡマトリクスを消化する。次いで第２のプライマーがＤＮＡ鎖の５’末端に結合される。ＤＮＡ鎖に相補的であるＲＮＡ分子を合成するための出発点としてＴ７ＲＮＡポリメラーゼによってこのプライマーを使用し、このＲＮＡ分子を出発マトリクスとして今一度使用してもよい。ＮＡＳＢＡは通常、４１℃の定温で実施され、特定の状況下にてＰＣＲより速く且つ良好な結果を提供する。
【００３７】
用語「転写介在型増幅」（ＴＭＡ）は、米国の会社ジェン-プローブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ）によって開発され、ＮＡＳＢＡに類似し、同様にＲＮＡポリメラーゼと逆転写酵素とを使用する等温増幅法（ヒル（Hill）, 2001）を意味するように理解される。
【００３８】
用語「ローリングサークル連鎖反応」（ＲＣＣＲ）又は「ローリングサークル増幅」（ＲＣＡ）は、ローリングサークル原理に従って一般的な核酸の複製を模倣した増幅方法を指し、数ある出典の中でも例えば米国特許第５，８５４，０３３号に記載されている。
【００３９】
用語「「免疫−ＰＣＲ」(イムノＰＣＲ)("immuno-PCR")（ＩＰＣＲ）は特に、標的特異的な抗体と核酸分子とのキメラ複合体が使用される、標的分子を検出する方法を意味するように理解される。
【００４０】
本質的に、参照される標的分子は、この分子種に対する特異性の高い抗体が最も容易に産生されるので、主としてタンパク質及び／又はオリゴペプチドを含む。しかしながら、参照される標的分子はまた、この生体分子種に対する特異性の高い抗体が産生されてもよいという条件で、そのほかの生体分子種、たとえば、オリゴ糖類及び多糖類、又は脂質を含んでもよく、その結果、免疫−ＰＣＲを用いて抗体が検出されてもよい。
【００４１】
核酸分子をマーカー又はプローブとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてシグナル生成のためにそれを増幅する。核酸増幅の非常に高い効率と結合の高い特異性とによって標的分子を検出する常法（たとえば、ＥＬＩＳＡ法）と比べて、感度で１００倍〜１０，０００倍の上昇を生じてもよい。ＩＰＣＲは１９９２年（サノら（Sano at al.）, 1992）に開発された。
【００４２】
用語「逆転写」は、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼも）が一般に使用される、ｍＲＮＡをＤＮＡ（いわゆるｃＤＮＡ）に転写するための方法を意味するように理解される。後者は最初に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によって一本鎖ＲＮＡからＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド鎖を合成する。タンパク質の無関係な部分、ＲＮＡ分解酵素Ｈの部分はＲＮＡ部分のその後の分解に関与する。一本鎖ＤＮＡ鎖からの二本鎖ＤＮＡの形成の完了は、ＤＮＡ堆積性のＤＮＡポリメラーゼ活性によって生じる。この方法によって生成されたｃＤＮＡは次いでＰＣＲを用いて増幅され、検出されてもよい。
【００４３】
ほかのＤＮＡポリメラーゼと同様に、逆転写酵素もＤＮＡ合成を開始するのにプライマーを必要とする。この場合、いわゆるオリゴｄ（Ｔ）プライマー、すなわち、多重チミン塩基が使用されることが多く、それは、ｍＲＮＡの３’末端におけるポリ（Ａ）尾部（テイル）に相補的である。
【００４４】
逆転写酵素とその後のＰＣＲとの組み合わせ（ＲＴ−ＰＣＲとも呼ばれる）を頻繁に使用して、たとえば、遺伝子発現の解析、遺伝子発現プロファイルの作成などで試料における１以上のｍＲＮＡの含量を検出する。いわゆる「二工程ＲＴ−ＰＣＲ」では、とりわけ、異なったプライマーを逆転写及びその後のＰＣＲで使用するが、「一工程ＲＴ−ＰＣＲ」では、逆転写で使用した遺伝子特異的なプライマーがその後のＰＣＲで使用されてもよく、２つの反応が同一容器で連続して行われる。使用される逆転写酵素（一般にウイルス起源）は使用されるＤＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｔａｑポリメラーゼ）より低温で変性し、知られているようにＤＮＡポリメラーゼは比較的高温でのみ変性するので、逆転写はその後のＰＣＲより低温で実施されるという事実によって使用が構成される。熱可逆的に阻害される、いわゆる「ホットスタート」ＤＮＡポリメラーゼを好ましくは使用する。逆転写のより低い温度レベルからＰＣＲのより高い温度レベルへのスイッチが入れられると、一方で、逆転写酵素が変性し、他方で、熱可逆的阻害を排除することによってＤＮＡポリメラーゼが活性化される。参照される熱可逆的阻害は、たとえば、ＤＮＡポリメラーゼの活性中心に結合する抗体を用いて、又はたとえば、アルデヒドを用いたポリメラーゼの可逆的な共有若しくは非共有の化学的修飾（たとえば、本出願人の米国特許第６，１８３，９９８号を参照）によって達成されてもよい。概要についてはバーチ（Ｂｉｒｃｈ）ら（１９９６年）も参照のこと。
【００４５】
用語「リアルタイムＰＣＲ」は、定量ＰＣＲ又はｑＰＣＲ（逆転写ＰＣＲと混同してはならない）を意味するように理解されるが、これは既知のポリメラーゼ連鎖反応に基づくものであり、増幅されたＤＮＡを定量することもできる。定量はＰＣＲサイクルの最中（従って、名称「リアルタイム」）に記録される蛍光測定によって行われる。ＰＣＲ産物の量に比例して蛍光が増加する。１回の実行（複数のサイクルから構成される）の終了時、受け取った蛍光シグナルに基づいてＰＣＲの指数期にて定量が行われる。最適な反応条件は指数期の間に存在するので、ＰＣＲのこの期（１回の実行で２、３サイクル続く）でのみ、正確な定量が可能である。従ってこの方法は、ほかの定量ＰＣＲ法とは異なり、ほかの定量的ＰＣＲ法は、ＰＣＲ（たとえば、競合ＰＣＲ）が進行した後、通常、ＰＣＲ断片のゲル電気泳動分離を含めて定量的解析を行う。
【００４６】
たとえば、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーンＩ及びＦＲＥＴプローブ又はいわゆる二重色素オリゴ（ＴａｑＭａｎプローブとも呼ばれる）のような染色は検出に好適である。
【００４７】
用語「ＣT値」（閾値サイクル）は、増幅産物が最初に検出できるＰＣＲサイクルを指し、通例、蛍光を測定し、初めてバックグラウンドの蛍光を超えた有意な増加があった最も直近のサイクルが示される。
【００４８】
ＰＣＲ反応の初期相では、鋳型（すなわち、増幅されるＤＮＡ上）の量がいまだに限定されるが、増幅の最終相では、産物の量は、これら産物が阻害を引き起こすように増大し、産物断片はますます互いにハイブリッド形成し、出発産物は徐々に消費される。中間の相においてのみ、増幅サイクルの数と増幅産物の量との間で指数関数の関係が存在する（「指数相」）。指数相が始まる時点を決定するために参照ＣT値が用いられる。
【００４９】
さらに、低いＣT値は少数のＰＣＲサイクルがバックグラウンドノイズを上回る蛍光での初めての有意な増加に十分である（すなわち、相対的に多数の鋳型が存在する）ことを示すが、高いＣT値は相応して、この目的で多数のＰＣＲサイクルを必要とする（すなわち、相対的に少ない鋳型が存在する）ことを示す。
【００５０】
用語「酵素結合免疫吸着測定法」("enzyme-linked immunosorbent assay")（ＥＬＩＳＡ）は、酵素呈色反応に基づく免疫的検出法を意味するように理解される。
【００５１】
ＥＬＩＳＡの使用によって、試料（血液血清、乳、尿など）においてタンパク質、ウイルス、並びにたとえば、ホルモン、毒素及び殺虫剤のような低分子化合物を検出することが可能である。この点で、使用は、検出される物質（抗原）に結合する特異抗体の特性で構成される。抗体又は抗原が酵素であらかじめ標識される。酵素によって触媒される反応を抗原の存在の裏付けとして用いる。いわゆる基質が酵素によって変換され、反応生成物は通常、色変化、蛍光又は化学発光によって検出されてもよい。シグナル強度は一般に抗原濃度の関数なので、定量的検出にＥＬＩＳＡを用いてもよい。
【００５２】
以下の用語「ハイブリッド捕捉アッセイ」("hybrid capture assay")（ＨＣＡ）は、求められる標的ＤＮＡのＲＮＡ試料とのインキュベートによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが形成される方法を意味するように理解される。ハイブリッドは表面に結合され、次いで酵素標識された抗体とインキュベートされる。ハイブリッド捕捉アッセイは特に、ダイジェン(Ｄｉｇｅｎｅ)社のＨＰＶアッセイで使用される。
【００５３】
以下の用語「ネストＰＣＲ」（"nested PCR"）は、すでに増幅されているＤＮＡ断片が時を改めて増幅される方法を意味するように理解され；この手順は、第１の反応で使用されたプライマー対の内部に提供された第２のプライマー対を用いて実施される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００５４】
本発明の目的は、従来技術から生じる上記の欠点を少なくとも実質的に克服し、試料における生体分子の含量を正規化するための方法、使用及び／又は装置を特に広い範囲のアプリケーションで提供することである。
【００５５】
本発明の特定の目的は、試料における生体分子を正規化するのにさらに好都合であり、且つ上述の一工程法及び二工程法と共に使用するために適切な方法、使用及び／又は装置を提供することである。
【００５６】
さらなる目的は、広い範囲のアプリケーションのために、試料における核酸の含量を正規化するための方法、使用及び装置を提供することである。
【００５７】
さらなる目的は、広い範囲のアプリケーションのために、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡから逆転写によって作製されたｃＤＮＡの含量を正規化するための方法、使用及び装置を提供することである。
【００５８】
さらなる目的は、広い範囲のアプリケーションのために、試料における核酸、特にＲＮＡの含量を正規化するための方法、使用及び装置を提供することである。
【００５９】
本発明の目的は、特に、高い精度及び再現性を特徴とする、試料における生体分子を正規化するための方法、使用及び／又は装置を提供することである。
【００６０】
さらなる目的は、試料における核酸の含量を正規化するための、且つ反応容器の複数回使用を可能にする方法、使用及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００６１】
これらの目的は、本発明の方法の独立請求項に記載の方法によって達成される。従って、以下の工程を有する、試料における生体分子の含量を正規化するために方法が提供される。
ａ）高塩条件下で容器表面が可逆的に生体分子を結合できるように少なくとも定位置で、好ましくは容器の内部で官能化された容器表面を有する反応容器を提供すること、
ｂ）少なくとも１つの試料調製工程を実施すること、
ｃ）高塩条件下で、調製された試料からの生体分子を容器表面に結合させること（「結合及び正規化の工程」）、
ｄ）任意に洗浄すること（「洗浄工程」）、及び
ｅ）少なくとも１つの後続の反応を実施すること。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明に係る反応容器で使用するためのヒト全血に由来するパックスジーン(ＰＡＸＧｅｎｅ)ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
【図２】本発明及び比較例に係る反応容器で使用するためのヒト全血に由来するパックスジーン（ＰＡＸＧｅｎｅ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
【図３】本発明及び比較例に係る反応容器で使用するためのヒト全血に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
【図４】本発明及び比較例に係る反応容器で使用するためのジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
【図５】本発明に係る反応容器及び異なったインキュベート時間で使用するためのジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
【図６ａ】本発明に係るワークフローの一般的なパターンを示す。
【図６ｂ】本発明に係るワークフローの一般的なパターンを示す。
【図７】本発明に従って官能化される表面を反応容器の内部に適用するための装置７０を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
従来技術で既知の方法とは対照的に、本件では、反応容器の表面が最初に、高塩条件下で規定された量の生体分子の可逆的結合のための吸着表面として作用するので、試料における生体分子の含量を正規化するための手段として作用する。従って、反応容器の表面は高塩条件下で可逆的に生体分子を結合できるように官能化される。官能化の種類は、また、特に結合される生体分子の種類に依存する。このことは以下でさらに議論する。表面に結合してもよい生体分子の量は、表面の大きさ、試料に接触する表面、この表面の化学的官能化の種類、生体分子の表面とのインキュベート時間及び使用される結合バッファーの厳密性によって調整される。
【００６４】
さらに、参照される高塩条件（上記定義を参照）は、存在するＲＮＡ分解酵素を失活させるのを助ける。このことは、電荷スイッチ物質に対して及び一般にアニオン交換体に対して存在する低塩条件の場合とは異なり、試料に含有されるＲＮＡが実質的に完全な且つ無傷の様態で単離され、検出に供給されてもよい。
【００６５】
従来技術では、前述のようにいわゆる「二工程法」については、必要に応じて後続の反応が実施される前に、単離された生体分子を新しい反応容器に移すために少なくとも１つの追加のピペッティング工程が必要である。この工程はまた、ｃＤＮＡのレベルで正規化する機会としても使用される。このように、結果が比較され、解釈されてもよいように、細胞投入の変動、ＲＮＡの質及び量、並びにＲＴ効率が補正される。
【００６６】
一工程ＲＴ−ＰＣＲ法では、ここで提案される手順を用いて、ｃＤＮＡがその場(in situ)で合成され、ポリメラーゼと直接反応するので、正規化はＲＮＡの投入レベルで行われる。このように、細胞投入における変動並びにＲＮＡの質及び量が補正されてもよい。
【００６７】
これらの工程に関連した前述の欠点は、本発明に係る方法については存在しない。生体分子は、本発明に係る表面が飽和されるまで本発明に係る反応容器の表面に可逆的に結合し、結果的に生体分子の量の正規化を生じる。この理由で、本発明に係る方法では、生体分子の単離された量について別個の定量工程を必要としない。さらに、追加のピペッティング工程なしで、後続の反応は、本発明に係る反応容器にて直接実施されてもよい。
【００６８】
正規化はさらに、細胞の投入、ＲＮＡの質／量、及び種々の試料についての逆転写の効率における差異に関して発現データを補正するというさらなる利点を有する（後者の原理は二工程ＲＴ−ＰＣＲにのみ適用される）。
【００６９】
参照される後続の反応が試料調製工程と同じ容器で実施されるということが好ましくは提供される。しかしながら、このことは絶対に必要であるわけではない。たとえば、結合及び正規化の工程の後、さらなる反応容器で少なくとも１つの後続の反応を実施するために、１以上のアリコートを反応容器から取り出し、１以上の新しい反応容器に移してもよい。
【００７０】
参照される生体分子が核酸であることが特に好ましく提供される。
【００７１】
核酸は、たとえば、ＰＣＲのような従来の増幅法を用いて特に検出されてもよい。
【００７２】
しかしながら、参照される生体分子は一般に、抗体を用いて検出可能である生体分子種であってもよい。特にオリゴヌクレオチド標識した抗体（「免疫ＰＣＲ」）又はＥＬＩＳＡ（下記参照）を用いて検出可能であるタンパク質が意図される。
【００７３】
参照される少なくとも１つの試料調製工程が以下を含む群から選択されることも好ましく提供される。
・細胞溶解、
・細胞変性、
・生体分子の単離、
・生体分子の精製、
・ＤＮＡへのＲＮＡの逆転写（ＲＴ）及び／又は
・酵素反応及び／又は試料の処理。
【００７４】
参照される酵素反応及び／又は試料の処理には好ましくは、ＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ分解酵素及び／又はプロテアーゼを用いた試料の消化が関与してもよい。
【００７５】
参照されるすくなくとも１つの後続の反応が以下を含む群から選択されることも好ましく提供される。
・増幅反応、
・酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び／又は
・ハイブリッド捕捉アッセイ。
【００７６】
参照される増幅反応が以下の群から選択される反応であることが特に好ましく提供される。
・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、
・ネストＰＣＲ、
・逆転写（ＲＴ）、
・免疫ＰＣＲ。
【００７７】
しかしながら、一般に、参照される生体分子種の少なくとも１つのためにほかの考えられる検出反応が提供されてもよい。
【００７８】
本発明に係る方法の特に好適な一例は、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写（試料調製工程）、容器表面への結合による形成されたｃＤＮＡの正規化（結合及び正規化の工程）及びリアルタイムＰＣＲによるｃＤＮＡをその後に検出すること（後続の反応）を有する方法である。この方法は、「ワークフロー１」として表１において言及される。
【００７９】
そのような方法では、逆転写は本発明に係る反応容器内で直接実施され、インキュベートの後、生成されたｃＤＮＡが本発明に係る表面に可逆的に結合される。こうして表面が飽和され、この方法で規定された量のｃＤＮＡを結合することが可能である。過剰なｃＤＮＡはその後の洗浄工程の間に取り除かれる。この洗浄工程の後、同一容器にてｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲに供してもよい。
【００８０】
従来技術の方法と比べた本発明に係るこの方法の利点は、逆転写の後、ｃＤＮＡの得られた量の定量も、新しい容器へのピペッティングの追加工程も必要ではないことである。これによってプロトコールが簡素化され、又は短縮されるので、手間のレベル及び／又は操作コストを有意に減らすと共に、追加のピペッティング工程が原因となる交差汚染及び／又は不正確性のリスクが軽減される。
【００８１】
従来技術の方法と比べた本発明に係るこの方法のさらなる利点は、ｃＤＮＡの得られた量の定量を省略するにもかかわらず、元々使用したＲＮＡの量にかかわりなく正規化された量のｃＤＮＡがＰＣＲに用いられることである。加えて、２５μＬの体積で操作を行ってもよく、それは、ＰＣＲにとっては慣例であり、結果的に有意なコスト削減を生じる。
【００８２】
逆転写並びにその後のＰＣＲも好ましくは、記載されたように同一の容器で実施する。しかしながら、結合及び正規化の工程の後、１以上のアリコートを反応容器から取り出し、さらなる反応容器でＰＣＲを行うために１以上の新しい反応容器に移すことも提供されてもよい。
【００８３】
本発明に係る方法の別の好適な例は、たとえば、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）製品、アールエヌイージー（ＲＮｅａｓｙ）を用いた、又は代わりに、たとえば、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）製品、オリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）及び／又はターボキャプチャー（ＴｕｒｂｏＣａｐｔｕｒｅ）を用いたｍＲＮＡの単離による試料の溶解及びその後のｍＲＮＡの回収（試料調製工程）と、容器表面への結合による放出された又は単離されたｍＲＮＡの正規化（結合及び正規化の工程）と、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへのその後の逆転写（後続の反応）を有する方法である。逆転写にはその後に追加の結合及び正規化の工程、並びに追加の後続の反応、たとえば、産生されたｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲが任意で続いてもよい（表１、ワークフロー６を参照）。
【００８４】
或いは、後続の反応として単純なハイブリッド形成反応が提供されてもよく；この場合、追加の結合及び正規化の工程は省略されてもよい（表１、ワークフロー２を参照）。
【００８５】
本発明に係る方法についてのワークフローのさらなる例は表１に提供される。ワークフロー１〜５は、方法の最中に新しい試薬を添加するのに容器を開ける必要がないので一工程法に関与する。ワークフロー６は、この場合、ｍＲＮＡレベル及びｃＤＮＡレベルの正規化が行われ、すなわち、第２の結合及び正規化の工程を開始するために２つの反応の間で容器が開けられるので、二工程法を示す。
【００８６】
【表１】
【００８７】
逆転写及び任意に続く第２の後続の反応（特にＰＣＲ）は試料調製工程と同一の容器で行ってもよい。しかしながら、第１の又は任意での第２の結合及び正規化の工程の後、１以上のアリコートを反応容器から取り出し、さらなる反応容器にて少なくとも１つの後続の反応を行うために、１以上の新しい反応容器に移すことも提供されてもよい。
【００８８】
参照される正規化工程については、たとえば、修飾された表面の大きさ及び確立された結合条件に応じて、１０〜５０ｎｇの生体分子（好ましくはＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）を試料から単離することができる。
【００８９】
本発明によれば、さらに
ａ）結合及び正規化の工程で結合バッファーが使用され、及び／又は
ｂ）洗浄工程で洗浄バッファーが使用されることが提供される。
【００９０】
少なくとも定位置にて官能化される容器表面は、
ａ）シラノール基、
ｂ）不飽和有機酸、
ｃ）カルボキシル基、スルホネート基及びそのほかの極性基、及び／又は
ｄ）ヒドロキシル基を含有する金属酸化物及び半金属酸化物を含有することも好ましく提供される。
【００９１】
上述の電荷スイッチ物質とは対照的に、参照される基は一貫して、好適な方法（以下を参照）を用いて微量反応容器及びＰＣＲ容器の表面に永続的に結合（すなわち、一般に共有結合）してもよい。
【００９２】
シリカマトリクスへの核酸の結合は用語「ボーム原理」によって知られ、たとえば、ＥＰ８１９６９６に記載されている（ボゲルステイン（Vogelstein）及びギレスピー(Gillespie) (1979)、並びにボーム（Boom）ら (1990)も参照）。
【００９３】
試料からの核酸の選択的な結合については、カオトロピック物質、たとえば、チオシアン酸グアニジニウムを含有するバッファーに試料をインキュベートする。任意で細胞を溶解し、得られたタンパク質を変性させ、核酸を、まだ遊離で利用できないのなら放出させ、カオトロピック物質の存在により核酸の周りの水和物の殻を溶解する。核酸は、シリカマトリクスのシラノール基（ＳｉＯｘ又はＳｉＯＨ基）と核酸のリン酸主鎖の負のイオン電荷との間の水素架橋を介してシリカ表面に結合する。試料の残りの構成成分はその後洗浄によって取り除かれてもよい。最後にＰＣＲの条件下でＤＮＡ又はＲＮＡが放出される。
【００９４】
核酸のアニオン交換体表面への結合は、核酸のリン酸主鎖の負のイオン電荷と本発明に係るアニオン交換体表面の正の表面電荷との間の静電相互作用に基づく。その電荷が結合バッファーのｐＨに無関係なので四級アンモニウム基は強い塩基性のアニオン交換体の基に属する。一級、二級及び三級アミンは弱い塩基性のアニオン交換体と呼ばれる。高いｐＨ値では、これらのアミンは脱プロトン化形態で存在し、結果的に交換体機能を失う。従って、弱い塩基性のアニオン交換体の交換能力は、使用される結合バッファーのｐＨに大きく依存する。
【００９５】
シラノール基、特にＳｉＯ2についてのものに似た現象は、表面にヒドロキシル基を有する金属酸化物及び半金属酸化物、特に酸化チタン、酸化アルミニウム及び酸化ジルコニウム、それぞれ、たとえば、ＴｉＯ2、Ａｌ2Ｏ3及びＺｒＯ2についても認められる。核酸はまた、カオトロピック塩の存在下でこれらの基と結合し、相応に被覆された又は官能化された表面は核酸を結合するために定まった条件下で同様に使用されてもよい。
【００９６】
参照される不飽和有機酸は重合可能でなければならず、すなわち、たとえば、マレイン酸のように少なくとも１つの不飽和Ｃ＝Ｃ結合（「ビニル性の基」）を含有しなければならない。加えて、さもなければ、それらはたとえば、ポリプロピレンに付着しないので、それらを純粋な形態で使用することはできない。従って、不飽和有機酸が、たとえばＰＥＣＶＤ法を用いてビニルシランとの組み合わせで表面に適用される。
【００９７】
この方法で結合する不飽和有機酸は高塩条件下で核酸を可逆的に結合することができるカルボキシル基（−ＣＯＯ-又は−ＣＯＯＨ基）を提供する。この点で、水素架橋供与体官能性を有する極性表面を作製するために、不飽和有機酸は、ＰＥＣＶＤ塗付ポリマーにカルボキシル基を導入する目的への手段に過ぎない。
【００９８】
水における核酸の溶解度は、高塩条件によって低下する。理由は、水素架橋の分解並びに水における核酸の二次及び三次構造の安定性の関連する低下である。次いで水素架橋供与体として極性表面が提供されれば、水中よりもその部位でそれらはさらに安定なので、核酸はこの表面に結合する。塩濃度が低下すると、水が今一度極性表面よりも良好な水素架橋供与体になり、核酸が表面から脱着してもよい。
【００９９】
また、本発明に従って提供されるのは、容器表面が参照されるプロセス条件下で生体分子を可逆的に結合できるように、少なくとも定位置で、好ましくは容器の内部で官能化されている容器表面を有する、上述のような方法を実施するための反応容器である。
【０１００】
本発明に従って官能化される反応容器の領域は、好ましくは容器当たり０．０１ｍｍ2〜１０ｃｍ2の表面、特に好ましくは０．０１ｍｍ2〜１ｃｍ2の表面、極めて特に好ましくは０．０１ｍｍ2〜５００ｍｍ2の表面、特に好ましくは０．０１ｍｍ2、特に好ましくは１００ｍｍ2の一層さらに好ましくは表面を占有する。このことは、たとえば、９６穴ＰＣＲプレート、ＰＣＲ８連ストリップ又はマルチタイタープレートが、そのウエルの数で乗じられた参照される被覆表面を有することを意味する。
【０１０１】
当該生体分子用の当該反応容器の結合能は、官能化された表面の特徴（特に、官能基の種類及び密度）並びに寸法を選択的に調整することによって正確に設定されてもよい。表面に加えて、結合される生体分子の量は、結合バッファーの接触時間及び厳密性（ストリンジェンシー）を介して影響されてもよい。しかしながら、目的は、反応容器にて提供された表面を生体分子によって完全に飽和することによって正規化を達成することである。
【０１０２】
反応容器当たりの結合能は、１ｎｇ〜４０μｇ、特に好ましくは１ｎｇ〜４μｇ、さらに好ましくは１ｎｇ〜２μｇ、非常に特に好ましくは１ｎｇ〜５００ｎｇの範囲内であることが好ましく提供される。
【０１０３】
たとえば、反応容器当たり５０ｎｇの結合能を想定すると、このことは、溶解、細胞変性、単離工程又は逆転写にあらかじめ供されている当該試料が、たとえば、５０ｎｇを超える当該生体分子種を含有する場合について、過剰分画の生体分子は結合せず、その後の洗浄工程で取り除かれることを意味する。従って、当該生体分子の定量的分画に関する情報は場合により失われてもよい。しかしながら、絶対的な量的情報の喪失は考えられるアプリケーションのシナリオの大半について認容される。
【０１０４】
逆に、このことは、試料が５０ｎｇ未満の当該生体分子種を含有するのであれば、結合能が完全に利用されないので、正規化を行うことができないことを意味する。
【０１０５】
このことは、実際には、それが試料における生体分子の量のむしろ下限以下で変化する傾向があるような方法で（上記参照）結合能を調整する傾向があることを意味する。
【０１０６】
少なくとも定位置で官能化される容器表面は、
ａ）シラノール基、
ｂ）不飽和有機酸、
ｃ）カルボキシル基、スルホネート基及びそのほかの極性基、及び／又は
ｄ）ヒドロキシル基を含有する金属酸化物及び半金属酸化物を含有することが好ましく提供される。
【０１０７】
上記で参照される官能基は、
ａ）プラズマコーティングによって反応容器の物質に適用され、
ｂ）湿式化学法によって反応容器の物質に適用され、及び／又は
ｃ）反応容器自体の物質の特性によって規定されることが好ましく提供される。
【０１０８】
本発明に係る反応容器の物質へのプラズマコーティングによる本発明に係るシラノール基の適用は好ましくは、たとえば、その内容全体が参照されるフラウンホファー表面工学及び薄膜ＩＳＴ研究所(Fraunhofer Institute for Surface Engineering and Thin Films IST)のＤＥ１０２００６０３６５３６Ｂ３及びＤＥ００００１０３２２６９６Ｂ３に記載されたような大気圧プラズマにて実施される。
【０１０９】
この方法はまた、「プラズマ化学気相堆積法」("plasma enhanced chemical vapor deposition")（ＰＥＣＶＤ）とも呼ばれる。この方法はプラズマの助けを借りた化学反応を介して薄層を表面に塗布する化学蒸着(chemical vapor deposition)（ＣＶＤ）の特殊な形態である。この目的のために、反応チャンバーにおいて、塗布される基材と対電極との間に強烈な電場が適用され、それはプラズマの点火を起こす。プラズマは、反応ガスとも呼ばれるガス蒸着媒体の結合の切断を結果的に生じ、それをガス相にてさらに反応する個々のラジカルに分解する。ガス相の反応産物は薄層（５０〜３００ｎｍの間の層厚）の形態で基材上に蒸着する。プラズマのために、ＣＶＤ法よりも高い蒸着率と同時により低い蒸着温度が、コロナ放電とも呼ばれるＰＥＣＶＤ法によって達成される。
【０１１０】
所与の物質の蒸着のための基本的な必要条件は、この物質がガス状の凝集状態で提供されることができなければならないということであり；このことは、いわゆる前駆体、すなわち、所与の温度で特定の蒸気圧を有さなければならない、且つ蒸着されるべきである化学的に結合した形態の物質に含有する化合物を用いて達成されることが多い。この方法では、使用される蒸着媒体は既にガス相であるので、反応チャンバーの外に位置するガス供給系から反応チャンバーの中へ容易に導入され、プラズマに供給されてもよい。従って、炭素含有コーティングを作製するための前駆体として、たとえば「ダイヤモンド様炭素」("diamond like carbon")（ＤＬＣ）又は炭素含有ガスアセチレン（Ｃ2Ｈ2）又はメタンが使用される。シリカコーティングを作製するためには、たとえば、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）又はテトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）が好適である。たとえば、ＴｉＯ2、Ａｌ2Ｏ3及びＺｒＯ2の蒸着には、追加の好適な前駆体が存在する。
【０１１１】
前駆体がプラズマの放電ゾーンに搬送され、そこでガスが加速されるイオンに分かれる。たとえば、テトラメチルシランを用いてシリカコーティングを作製するためには（しかしながら、アセチレンを用いた炭素含有コーティングを作製するためではなく）、前駆体における考えられる有機分画を燃焼させるために同時に酸素を搬送することが多い。
【０１１２】
次いでガスイオンが被覆される加工対象物の表面と高速で衝突し、そこで、それらは還元され、当該コーティングを形成する。表面の物質とコーティング物質の間でコーティングの物質への永続的な結合を保証する共有結合が形成されることが多い。
【０１１３】
従って、Ｃ−Ｃ結合及びＣ−Ｈ結合の均等分裂によってポリプロピレン表面にてプラズマ中でポリプロピレン（ＰＰ）上にラジカルが生じる。これらのラジカルは、たとえば、コーティング物質の酸素、珪素又は炭素と共有結合を形成してもよい。
【０１１４】
コーティング物質はこのようにしてポリプロピレン表面と共有結合する。前駆体としてのＴＥＯＳを用いたＳｉＯ2コーティングの場合、ＰＰへの共有結合はＳｉ−Ｏ−Ｃの結合及びＳｉ−Ｃの結合を介して生じる。前駆体としての有機モノマーの場合、ＰＰへの共有結合は、たとえば、Ｃ−Ｃ結合及びＣ−Ｏ−Ｃ結合を介して生じる。
【０１１５】
しかしながら、共有結合が形成されない場合でさえ、この方法で非常に耐久性のあるコーティングが達成される。
【０１１６】
ＰＥＣＶＤ法は、また、プラズマ中のガス相にて有機ポリマーが生成され、基材に蒸着されることを可能とする。この場合、たとえば、無水マレイン酸、アクリレート、ビニルシラン及びそのほかの重合可能な前駆体（モノマー）のようなモノマーを使用してもよい。キャリアガス中では酸素なしで済ませ、有機構成成分の酸化を防いでもよい。
【０１１７】
しかしながら、この方法を用いて直接アニオン交換体層を生じるシラノール基含有層を蒸着してもよい。前駆体、アミノプロピルトリメトキシシランによって、たとえば、ＰＥＣＶＤ層にてシラノール基及びアニオン交換体基の直接的製造が可能である。
【０１１８】
好適な前駆体の選択によってカルボキシル基を含有するシリカ層も作製してもよい。
【０１１９】
前駆体、ビニルトリメトキシシラン及び無水マレイン酸を用いてポリプロピレン上にカルボキシル基を含有する層も作製してもよい。
【０１２０】
ＰＥＣＶＤ法を用い、酸素を添加したガス相において、相応する前駆体（金属アルコキシド及び半金属アルコキシド）から同様に金属酸化物及び半金属酸化物を作製し、たとえば、ポリプロピレン上に蒸着させてもよい。
【０１２１】
金属アルコキシド及び半金属アルコキシドに加えて、たとえば、アクリレートのガス相ポリマー及びそのほかの不飽和化合物を作製し、ＰＥＣＶＤを介してその場(in situ)で被覆してもよい。モノマー（たとえば、ＨＥＭＡ、アクリル酸、無水マレイン酸など）及びビニルシランの適切な選択によって、たとえば、無水マレイン酸及びシラン（ビニルシラン）のような有機モノマーの混合コポリマーをポリプロピレン上に蒸着させてもよい。この場合、カルボキシル基並びにシラノール基を有するポリマーが作製される。
【０１２２】
ヒドロキシル基（ジェミナル、近接の）、ジオール基、カルボキシル基、アミノ基及びシラノール基は特に、ポリプロピレン上に水素架橋供与体特性を有する表面物質を提供するための好適な化学官能である。
【０１２３】
本発明の範囲内で、無水マレイン酸及びビニルシランのコポリマーもその場(in situ)で作製してもよい。この前駆体混合物がＰＥＣＶＤを介してガス相で重合可能であるのに十分な蒸気圧を有し、ポリプロピレン、すなわち、反応容器の物質上によく付着する層を形成することは有利である。
【０１２４】
ＰＥＣＶＤを介してスルホン基を蒸着させるための前駆体として、たとえば、スチレンスルホン酸を用いてもよい。
【０１２５】
上述のＣＶＤ法とは対照的に、ＰＥＣＶＤ法では、温度はほぼ室温のままである。従って、ＰＥＣＶＤ法は、本発明に係る反応容器に使用されることが多いプラスチック、たとえば、ポリプロピレン及びポリエチレンのコーティングに適する。
【０１２６】
本発明の発明者らはまた、好適なコーティング装置を用いて、テトラエトキシシランと、ビニルシラン及び無水マレイン酸のカルボキシル基含有コポリマーとを前駆体として用いて微量反応容器、特にＰＣＲ反応容器（「８連ストリップ」、９６穴プレート、マルチタイタープレート）、使い捨て反応容器及びピペットのチップの内部表面を被覆してもよいことも明らかにした。相当する装置を図７に示す。
【０１２７】
説明された装置は並行の配置で使用されてもよいので、複数の反応容器を同時に被覆することが可能である。
【０１２８】
例えば、ゾルゲル法はシアノール基を物質に適用するのに好ましい湿式化学法である。前駆体を規定された量の水及び考えられる触媒と一緒に溶媒、たとえば、水に溶解する。テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）は二酸化珪素前駆体として好ましくは使用される。
【０１２９】
しかしながら、たとえば、物質がガラスである場合、本発明自体に係る反応容器の物質の特性によって本発明に係るシラノール基が決定されることが特に提供されてもよい。
【０１３０】
本発明によれば、反応容器は、
ａ）ＰＣＲ容器、ＰＣＲ８連ストリップ若しくはＰＣＲ９６穴プレート、
ｂ）キャピラリー若しくは微量流体チャンネル(microfluid channel)、
ｃ）使い捨て反応容器
ｄ）ピペットチップ及び／又は
ｅ）マルチタイタープレート
を含む群からの容器であることも好ましく提供される。
【０１３１】
参照される微量反応容器は、たとえば、０．１〜２ｍＬの体積を有し、口語用法でＰＣＲ反応容器（エービーアイ（ＡＢＩ）、サーモ（Ｔｈｅｒｍｏ）など）とも呼ばれてもよい任意に密封可能な容器であってもよい。これらの容器は一般にポリプロピレン、ポリエチレン、ＣＯＣ、ＰＥＴ又はポリカーボネートからできている。
【０１３２】
これはまた、参照されるピペットチップにも同様に適用され、それは一般に自動ピペット（口語用法で「エッペンドルフピペット」とも呼ばれることが多い）と併せて使い捨て物品として使用される。
【０１３３】
マイクロタイタープレートは、本発明の意味の範囲内で複数の反応容器（「ウエル」）を有する単位である。そのようなマイクロタイタープレートは一般に６〜１５３６のウエルを有する。典型的なマイクロタイタープレート形式を表２に示す。
【表２】
【０１３４】
加えて、上述のような方法を実施するためにキットが提供され、該キットは、少なくとも
ａ）結合バッファー、
ｂ）洗浄バッファー、
ｃ）試料調製工程、好ましくは逆転写（ＲＴ）を実施するための任意の試薬、
ｄ）後続の反応、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するための任意の試薬、及び
ｅ）任意で上記記載に係る少なくとも１つの反応容器を有する。
【０１３５】
洗浄バッファーは、水、トリス、錯化剤、ポリオール、洗浄剤（デタージェント）及びポリマー、コポリマー及び／又はターポリマーを含有することも好ましく提供される。
【０１３６】
結合バッファーはカオトロピック物質を含有することも好ましく提供される。これは特に好ましくは、
・塩酸グアニジン
・（イソ）チオシアン酸グアニジニウム
・ヨウ化ナトリウム
・ヨウ化カリウム
・（イソ）チオシアン酸ナトリウム及び／又は
・尿素
又はこれらの混合物を含む群から選択される少なくとも１つの物質である。
【０１３７】
アニオン交換体表面にｃＤＮＡを結合するための結合バッファーは好ましくは低塩バッファーである。表面又は表面基のｐＫ値を下回るｐＨは好ましくは、結合工程でアニオン交換体が正の表面電荷を有するように設定されるので、負に荷電した核酸を結合することができる。
【０１３８】
また提供されるのは、試料における生体分子の含量を正規化するための、本発明に係る反応容器及び／又は本発明に係るキットの使用である。
【０１３９】
これには好ましくは、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡからの逆転写（ＲＴ）によって反応容器にて作製されているｃＤＮＡが関与し、該ｃＤＮＡは次いでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供される。
【０１４０】
上述の構成成分及び本発明に従って使用される例となる実施態様において主張される及び記載される構成成分は、その大きさ、形状、物質選択又は技術的設計に関して特定の例外の対象とはならないので、アプリケーションの分野で既知の選択基準は無制限の適用を有する。加えて、以下の実施例は、本特許出願の保護の範囲に限定的な影響を有さず、それは、クレームに基づいてのみ定義される。
【０１４１】
図面と実施例
本発明の主題のさらなる詳細、特徴及び利点は、サブクレームから生じ、関連する図面及び実施例の以下の記載から生じるが、その際、本発明の複数の例となる実施形態及びアプリケーションの分野は実施例により説明される。
【０１４２】
図１は、本発明に係る反応容器で使用するためのヒト全血に由来するパックスジーン(ＰＡＸＧｅｎｅ)ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
図２は、本発明及び比較例に係る反応容器で使用するためのヒト全血に由来するパックスジーン（ＰＡＸＧｅｎｅ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
図３は、本発明及び比較例に係る反応容器で使用するためのヒト全血に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
図４は、本発明及び比較例に係る反応容器で使用するためのジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
図５は、本発明に係る反応容器及び異なったインキュベート時間で使用するためのジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのＣT値を照合するための図を示す。
図６は、本発明に係るワークフローの一般的なパターンを示す。
図７は、本発明に従って官能化される表面を反応容器の内部に適用するための装置７０を示す。
【０１４３】
以下の例となる実施形態を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、それらに限定されることは意図されない。
【実施例】
【０１４４】
（実施例１）
以下の手順を実施した：
本発明に従って使用される表面を修飾した反応容器（バイオザイム（Ｂｉｏｚｙｍ）からのＰＣＲ容器、０．２ｍＬ、薄壁、ＰＣＲソフトストリップ）を大気圧プラズマ中にてテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）で被覆した。
【０１４５】
実施した試験では、ヒト全血由来のパックスジーン（ＰＡＸＧｅｎｅ）ＲＮＡ及びキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡ、並びにジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞に由来するキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡを用いた。キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）のクオンティテクト（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ）キットとオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）キットを利用し、ポリｄＴプライマーを用いて逆転写を行った。
【０１４６】
６ＭのＧｕＨＣｌ、０．１Ｍのフタル酸水素カリウム（ｐＨ２．５）を結合バッファーとして用い、ＴＥバッファーにおいて２％ノニデット(Nonidet)（登録商標）Ｐ４０及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリ（メチルビニルエーテル−アルト−マレイン酸）（poly(methylvinyl ether-alt-maleic acid)を洗浄バッファーとして用いた。エービーアイ（ＡＢＩ）のタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）β-アクチン試料キットを用いてＡＢＩ７７００にてＰＣＲを行った。
【０１４７】
試験のプロトコールを表３に示す。
【表３】
【０１４８】
ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）ＮＤ−１０００分光光度計を用いて、逆転写に使用したＲＮＡをあらかじめ定量した。
【０１４９】
対照として、それぞれの場合で、被覆されていないＰＣＲ容器におけるＲＴアッセイのアリコートを試験し、ＲＴ反応のアリコートをピペットで直接ＰＣＲマスターミックスに入れた。
【０１５０】
ＰＣＲ実験のそれぞれにて８重の測定を行い、すなわち、定められた値は８つの個々の値の平均に相当し、誤差バーは標準偏差を示す。
【０１５１】
（実施例２）
図１は、ヒト全血からのパックスジーン（ＰＡＸＧｅｎｅ）ＲＮＡのクオンティテクト（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ）ｃＤＮＡ合成に由来するｃＤＮＡについて実施されたタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）の結果を示す。使用したＲＮＡの量は、小さな範囲内（１１３〜２９３ｎｇ）で変化した。
【０１５２】
結果は驚くべきことに、本発明に係る反応容器を使用する場合、使用したＲＮＡの１３５ｎｇから１８０ｎｇへの推移の後、１８．４〜１９．１の間の相対的に均一なＣTレベル、従ってＣT値の正規化が達成されたことを示す。
【０１５３】
（実施例３）
図２は同様にヒト全血からのパックスジーン（ＰＡＸＧｅｎｅ）ＲＮＡのクオンティテクト（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ）ｃＤＮＡ合成に由来するｃＤＮＡについて実施されたタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）の結果を示す。ＲＮＡの量は１５０〜４５０ｎｇの間で変化し（カラム１〜５）、さらに各場合で、逆転写のアリコートを、ＰＣＲマトリクスを含有する未処理の容器にピペットで入れた（カラム６〜１０）。これらのアリコートについて、その中に含有されるＲＮＡの出発量が示されている。使用したＲＮＡの量は最初の実施例に比べてさらに広い範囲にわたって変化した。
【０１５４】
結果は、本発明に係る反応容器を使用する場合、１５０〜４５０ｎｇのＲＮＡの使用について、１７．９〜１８．９の間の相対的に均一なＣTレベル、従ってＣT値の正規化が同様に達成されたことを示す。未処理の反応容器における対照試験は予想どおり、逆転写に出発材料として使用されるＲＮＡが多ければ多いほど、相当するＣT値の低下が大きかったことを示している。
【０１５５】
（実施例４）
図３は、ヒト全血からのキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＲＮＡのオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）のｃＤＮＡ合成に由来するｃＤＮＡについて実施されたタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）の結果を示す。ＲＮＡの量は１００〜１１００ｎｇＲＮＡの間で変化し、対照試験は同様に非被覆容器で実施した。
【０１５６】
結果は、本発明に係る反応容器を使用する場合、１００〜１１００ｎｇのＲＮＡの使用について、１７．２前後の相対的に均一なＣTレベルが存在したので、ＣT値の正規化が同様に達成されたことを示す。未処理の反応容器における対照試験は予想どおり、逆転写に出発材料として使用されるＲＮＡが多ければ多いほど、相当するＣT値の低下が大きいことを示した。
【０１５７】
（実施例５）
図４は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）ＲＮＡのオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）のｃＤＮＡ合成に由来するｃＤＮＡについて実施されたタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）の結果を示す。ＲＮＡの量は１００〜１１００ｎｇのＲＮＡの間で変化し、対照試験は今一度非被覆容器で実施した。
【０１５８】
結果は、本発明に係る反応容器を使用する場合、１００〜１１００ｎｇのＲＮＡの使用について、ＣT値の正規化が達成されたことを示す。未処理の反応容器における対照試験は今一度、逆転写に出発材料として使用されたＲＮＡが多ければ多いほど、相当するＣT値の低下が大きいことを示した。
【０１５９】
（実施例６）
図５は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）ＲＮＡのオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）のｃＤＮＡ合成に由来するｃＤＮＡについて実施されたタックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）の結果を示す。ＲＮＡの量は１００〜８００ｎｇＲＮＡの間で変化した。さらに、異なったインキュベート時間を選択した、すなわち、１００〜４００ｎｇのＲＮＡについては２４０分間及び５００〜８００ｎｇのＲＮＡについては２０分間。
【０１６０】
結果は驚くべきことに、インキュベート時間を２０分間から２４０分間に延ばすことによって、最低量のＲＮＡ（１００ｎｇ）のＣT値を、２０分のインキュベート時間を用いた大量のＲＮＡ（５００〜８００ｎｇ）の飽和のレベルに持っていくことが可能だったことを示す。この実施例から、使用したＲＮＡの３００〜４００ｎｇの平均量と２４０分間の長いインキュベート時間について、相対的に低い１５．９のＣTレベルにて飽和が達成されたことも明らかである。
【０１６１】
図６ａは、試料調製工程２、結合及び正規化の工程３、洗浄工程４並びに後続の反応６を含む、本発明に係るワークフローの一般的なパターンを示す。後続の反応には任意で第２の結合及び正規化の工程並びに第２の後続の反応（表１を参照）が続いてもよい。
【０１６２】
図６ｂには参照されるワークフローがＰＣＲストリップでも実施されてもよいことを示す。
【０１６３】
図７は、本発明に従って官能化される表面を反応容器の内部に適用するための装置７０を示す。
【０１６４】
参照される装置は平坦な電極７２が設置されるチャンバー７１を有する。チャンバーはまた、前駆体ガス７３のためのガス導入装置、及びコーティング電極７４も有する。前駆体ガスはたとえば、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）である。ガス導入装置７３とコーティング電極７４とを図７に係る装置において合わせ、その形状が被覆される反応容器７５の内部に適合されている複合装置を形成する（本件では、口語用法では「エッペンドルフ容器」と呼ばれる０．２ｍＬの体積を有するポリプロピレンのＰＣＲ微量反応容器）。
【０１６５】
次いで、周波数発生器７６を用いて平坦な電極７２とコーティング電極７４との間に高周波交流電圧（たとえば、１３．５６ＭＨｚ）を適用し、反応容器内部にてプラズマが発生する。プラズマは前駆体ガスの結合の切断を生じ、基材上に蒸着し、その位置でシリカ分子の化学蒸着反応をもたらす個々のラジカルにそれを分解する。
【０１６６】
本発明に従って官能化された反応容器を使用する場合、この方法で作製される官能化された表面は生体分子の反応容器内部への結合を生じる（たとえば、カオトロピック塩の存在下で官能化表面上のシラノール基への核酸の結合）。
【０１６７】
説明される装置はまた、複数の反応容器、たとえば、複数の「エッペンドルフ容器」又はたとえば、複数のウェルを有するマルチタイタープレートの同時コーティングにも好適である。
【０１６８】
反応容器の被覆される表面の大きさは本質的に電極の大きさの関数であり、０．２ｍＬのＰＣＲ容器では１０ｍｍ2〜３００ｍｍ2であってもよい。
【０１６９】
（実施例７）
大気圧下にてＰＥＣＶＤ法を用いて０．２ｍＬの体積を有するポリプロピレンのＰＣＲ容器をテトラエトキシシランで被覆した。核酸の５００ｎｇまでの結合能が達成された。
【０１７０】
ＰＥＣＶＤ法については、他の因子の中でも互いに対する電極（陰極、陽極）の大きさ及び位置決めによって、コーティングの間に作製される表面は規定される。本件では、大きさはおよそ１５０ｍｍ2だった。
【０１７１】
（参照文献）
・バートレット（Bartlett）及びスターリング（Stirling）(2003), メソッドス・イン・モレキュラー・バイオロジー（Methods Mol. Biol.）226:3-6
・サノら（Sano et al.）(1992), サイエンス（Science） 258, 120-122
・バーチら（Birch et al.）(1996),ネイチャー（Nature）381, 445
・ボゲルステイン（Vogelstein）及びギレスピー（Gillespie）(1979), 米国科学アカデミー紀要（PNAS）76: 615-619
・ブームら（Boom et al）(1990),ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（J. Clin. Microbiol.） 1990 ３月（Mar）; 28(3):495-503
・コンプトン（Compton）(1991),ネイチャー（Nature）350, 91
・ヒル（Hill）(2001),エキスパート・レビュー・オブ・モレキュラー・ダイアグノスティックス（Expert Reviews of Molecular Diagnostics） 1, 445
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を有する、試料における生体分子の含量を正規化するための方法：
ａ）容器表面が高塩条件下で生体分子を可逆的に結合できるように少なくとも定位置で、好ましくは容器の内部で官能化されている容器表面を有する反応容器を提供すること、
ｂ）少なくとも１つの試料調製工程を実施すること、
ｃ）高塩条件下で、調製された試料からの生体分子を容器表面に結合させること（「結合及び正規化の工程」）、
ｄ）任意に洗浄すること（「洗浄工程」）、及び
ｅ）少なくとも１つの後続の反応を実施すること。
【請求項２】
前記生体分子が核酸であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの試料調製工程が以下を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法：
・細胞溶解、
・細胞変性、
・生体分子の単離、
・生体分子の精製、
・ＤＮＡへのＲＮＡの逆転写及び／又は
・酵素反応及び／又は試料の処理。
【請求項４】
前記少なくとも１つの後続の反応が以下を含む群から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法：
・増幅反応、
・酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び／又は
・ハイブリッド捕捉アッセイ。
【請求項５】
前記増幅反応が以下の群から選択される反応であることを特徴とする、請求項４に記載の方法：
・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、
・逆転写（ＲＴ）、
・ループ介在型等温増幅（ＬＡＭＰ）、
・核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、
・ローリングサークル連鎖反応（ＲＣＣＲ）又はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、
・転写介在型増幅（ＴＭＡ）、
・リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、
・ネストＰＣＲ及び／又は
・免疫ＰＣＲ。
【請求項６】
ａ）結合及び正規化の工程において結合バッファーが使用され、及び／又は
ｂ）洗浄工程において洗浄バッファーが使用される
ことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも定位置で官能化されている容器表面が、
ａ）シラノール基、
ｂ）不飽和有機酸、
ｃ）カルボキシル基、スルホネート基及びそのほかの極性基、及び／又は
ｄ）ヒドロキシル基を含有する金属酸化物及び半金属酸化物
を含有することを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記請求項のいずれか１項に記載の方法を実施するための反応容器であって、容器表面が参照されるプロセス条件下で生体分子を可逆的に結合できるように、反応容器が少なくとも定位置で好ましくは容器の内部で官能化されている容器表面を有することを特徴とする、上記反応容器。
【請求項９】
少なくとも定位置で官能化されている容器表面が、
ａ）シラノール基、
ｂ）不飽和有機酸、
ｃ）カルボキシル基、スルホネート基及びそのほかの極性基、及び／又は
ｄ）ヒドロキシル基を含有する金属酸化物及び半金属酸化物
を含有することを特徴とする、請求項８に記載の反応容器。
【請求項１０】
請求項９に記載の官能基が、
ａ）プラズマコーティングによって反応容器の物質に適用され、
ｂ）湿式化学法によって反応容器の物質に適用され、及び／又は
ｃ）反応容器自体の物質の特性によって規定される
ことを特徴とする、請求項９に記載の反応容器。
【請求項１１】
前記請求項のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、少なくとも
ａ）結合バッファー、
ｂ）洗浄バッファー、
ｃ）試料調製工程、好ましくは逆転写（ＲＴ）を実施するための任意の試薬、
ｄ）後続の反応、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するための任意の試薬、及び
ｅ）任意に請求項８から１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの反応容器
を有する、上記キット。
【請求項１２】
洗浄バッファーが、水、トリス、錯化剤、ポリオール、洗浄剤及びポリマー、コポリマー及び／又はターポリマーを含有することを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載のキット又は方法。
【請求項１３】
結合バッファーがカオトロピック物質を含有することを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載のキット又は方法。
【請求項１４】
カオトロピック物質が以下を含む群から選択される少なくとも１つの物質であることを特徴とする、請求項１３に記載のキット又は方法：
・塩酸グアニジン
・（イソ）チオシアン酸グアニジニウム
・ヨウ化ナトリウム
・ヨウ化カリウム
・（イソ）チオシアン酸ナトリウム及び／又は
・尿素
又はこれらの混合物。
【請求項１５】
試料における生体分子の含量を正規化するための、前記請求項のいずれか１項に記載の反応容器及び／又はキットの使用。
【請求項１６】
ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡからの逆転写（ＲＴ）によって前記反応容器において作製されているｃＤＮＡの含量を正規化するための、前記請求項のいずれか１項に記載の反応容器及び／又はキットの使用であって、ｃＤＮＡが次いでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供される、上記使用。
【請求項１７】
前記請求項のいずれか１項に記載の方法工程を有する、生体分子、好ましくは核酸、特に好ましくはＲＮＡを検出するための方法。
【請求項１】
以下の工程を有する、試料における生体分子の含量を正規化するための方法：
ａ）容器表面が高塩条件下で生体分子を可逆的に結合できるように少なくとも定位置で、好ましくは容器の内部で官能化されている容器表面を有する反応容器を提供すること、
ｂ）少なくとも１つの試料調製工程を実施すること、
ｃ）高塩条件下で、調製された試料からの生体分子を容器表面に結合させること（「結合及び正規化の工程」）、
ｄ）任意に洗浄すること（「洗浄工程」）、及び
ｅ）少なくとも１つの後続の反応を実施すること。
【請求項２】
前記生体分子が核酸であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの試料調製工程が以下を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法：
・細胞溶解、
・細胞変性、
・生体分子の単離、
・生体分子の精製、
・ＤＮＡへのＲＮＡの逆転写及び／又は
・酵素反応及び／又は試料の処理。
【請求項４】
前記少なくとも１つの後続の反応が以下を含む群から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法：
・増幅反応、
・酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び／又は
・ハイブリッド捕捉アッセイ。
【請求項５】
前記増幅反応が以下の群から選択される反応であることを特徴とする、請求項４に記載の方法：
・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、
・逆転写（ＲＴ）、
・ループ介在型等温増幅（ＬＡＭＰ）、
・核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、
・ローリングサークル連鎖反応（ＲＣＣＲ）又はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、
・転写介在型増幅（ＴＭＡ）、
・リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、
・ネストＰＣＲ及び／又は
・免疫ＰＣＲ。
【請求項６】
ａ）結合及び正規化の工程において結合バッファーが使用され、及び／又は
ｂ）洗浄工程において洗浄バッファーが使用される
ことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも定位置で官能化されている容器表面が、
ａ）シラノール基、
ｂ）不飽和有機酸、
ｃ）カルボキシル基、スルホネート基及びそのほかの極性基、及び／又は
ｄ）ヒドロキシル基を含有する金属酸化物及び半金属酸化物
を含有することを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記請求項のいずれか１項に記載の方法を実施するための反応容器であって、容器表面が参照されるプロセス条件下で生体分子を可逆的に結合できるように、反応容器が少なくとも定位置で好ましくは容器の内部で官能化されている容器表面を有することを特徴とする、上記反応容器。
【請求項９】
少なくとも定位置で官能化されている容器表面が、
ａ）シラノール基、
ｂ）不飽和有機酸、
ｃ）カルボキシル基、スルホネート基及びそのほかの極性基、及び／又は
ｄ）ヒドロキシル基を含有する金属酸化物及び半金属酸化物
を含有することを特徴とする、請求項８に記載の反応容器。
【請求項１０】
請求項９に記載の官能基が、
ａ）プラズマコーティングによって反応容器の物質に適用され、
ｂ）湿式化学法によって反応容器の物質に適用され、及び／又は
ｃ）反応容器自体の物質の特性によって規定される
ことを特徴とする、請求項９に記載の反応容器。
【請求項１１】
前記請求項のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、少なくとも
ａ）結合バッファー、
ｂ）洗浄バッファー、
ｃ）試料調製工程、好ましくは逆転写（ＲＴ）を実施するための任意の試薬、
ｄ）後続の反応、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するための任意の試薬、及び
ｅ）任意に請求項８から１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの反応容器
を有する、上記キット。
【請求項１２】
洗浄バッファーが、水、トリス、錯化剤、ポリオール、洗浄剤及びポリマー、コポリマー及び／又はターポリマーを含有することを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載のキット又は方法。
【請求項１３】
結合バッファーがカオトロピック物質を含有することを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載のキット又は方法。
【請求項１４】
カオトロピック物質が以下を含む群から選択される少なくとも１つの物質であることを特徴とする、請求項１３に記載のキット又は方法：
・塩酸グアニジン
・（イソ）チオシアン酸グアニジニウム
・ヨウ化ナトリウム
・ヨウ化カリウム
・（イソ）チオシアン酸ナトリウム及び／又は
・尿素
又はこれらの混合物。
【請求項１５】
試料における生体分子の含量を正規化するための、前記請求項のいずれか１項に記載の反応容器及び／又はキットの使用。
【請求項１６】
ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡからの逆転写（ＲＴ）によって前記反応容器において作製されているｃＤＮＡの含量を正規化するための、前記請求項のいずれか１項に記載の反応容器及び／又はキットの使用であって、ｃＤＮＡが次いでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供される、上記使用。
【請求項１７】
前記請求項のいずれか１項に記載の方法工程を有する、生体分子、好ましくは核酸、特に好ましくはＲＮＡを検出するための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５０２６４２（Ｐ２０１２−５０２６４２Ａ）
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２７３１０（Ｐ２０１１−５２７３１０）
【出願日】平成２１年９月１６日（２００９．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６１９９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３１７８４
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１６日（２００９．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６１９９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３１７８４
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
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