試料の検査装置及び検査方法
【課題】液体に含まれた検査対象試料の観察又は検査を良好に行うことのできる試料検査において、装置のメインテナンスの向上を可能にする検査装置及び検査方法を提供する。
【解決手段】検査装置は、第１の面３２ａに液状試料２０が保持される膜３２と、膜３２の第２の面３２ｂに接する雰囲気を減圧する真空室１１と、真空室１１に接続され膜３２を介して試料２０に一次線７を照射する一次線照射手段１と、真空室１１内において、膜３２と一次線照射手段１との間の空間を部分的に仕切るシャッター４とを備え、一次線７の照射により試料２０から発生する二次線である反射電子６１をシャッター４に照射させることによって、三次的信号である二次電子６２を発生させ、二次電子６２を信号検出手段１４により検出する。本装置は、真空室１１内の圧力を検知する真空計１５を備える。
【解決手段】検査装置は、第１の面３２ａに液状試料２０が保持される膜３２と、膜３２の第２の面３２ｂに接する雰囲気を減圧する真空室１１と、真空室１１に接続され膜３２を介して試料２０に一次線７を照射する一次線照射手段１と、真空室１１内において、膜３２と一次線照射手段１との間の空間を部分的に仕切るシャッター４とを備え、一次線７の照射により試料２０から発生する二次線である反射電子６１をシャッター４に照射させることによって、三次的信号である二次電子６２を発生させ、二次電子６２を信号検出手段１４により検出する。本装置は、真空室１１内の圧力を検知する真空計１５を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体に含まれた検査対象試料（検査対象物）や、液体の培地内で培養されて該培地内に存在する細胞等からなる検査対象試料の観察又は検査を良好に行うことのできる検査装置及び検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々生物は多細胞動物であり、細胞間の情報伝達が正常に行えなくなる事や、ウイルスや化学物質が細胞に取り付く事によって病気が発症する。このようなことから、分子生物学や、製薬分野では、生体から剥離した細胞をシャーレ（ディッシュ）上で培養し、その細胞に刺激（電気、化学物質、薬等）を与え、その反応を細胞レベルで観察することで研究を行っている。従来、このような観察には光学顕微鏡が使用され、細胞の刺激にはマニピュレータやピペットが用いられていたが、観察すべき重要な箇所は光学顕微鏡では観察不可能な０．１μｍ以下の微小領域であることも多い。
【０００３】
例えば、細胞間の物質のやり取りが正常に行えなくなることに起因する病気に高血圧症、尿崩症、不整脈、筋肉疾患、糖尿病、うつ病等がある。この細胞間の物質のやり取りは細胞膜にある１０ｎｍ程度の大きさのイオンチャンネルにより行われる。このようなイオンチャンネルは、光学顕微鏡では観察困難である為、分解能の高い走査型電子顕微鏡（以下、「ＳＥＭ」（Scanning Electron Microscope）という）を用いた観察が望まれていた。
【０００４】
しかし、ＳＥＭの構成を備える検査装置において、検査対象となる試料は、通常、真空引きにより減圧された試料室内に配置される。そして、このように減圧雰囲気とされた試料室内に配置された試料に電子線（荷電粒子線）が照射され、当該照射により試料から発生する二次電子や反射電子（後方散乱電子）等の二次的信号が検出される。このようなＳＥＭによる試料検査では、試料が減圧雰囲気に晒されることとなる。よって、試料から水分が蒸発して細胞が死んでしまい、生きた状態の細胞における刺激に対する反応を観察することは不可能であった。
【０００５】
また、蛋白の固定された細胞（死細胞）においても、真空に試料を載置する際には、真空中での水分蒸発に伴う形状変化を防止する為、手間と、熟練の必要な脱水、乾燥、及び金属蒸着の前処理が必要であった。その為、観察までには膨大な時間が必要で、高スループット観察は不可能であった。
【０００６】
従って、試料に水分が含まれた状態で検査を行う際には、試料から水分が蒸発しないように、試料を減圧雰囲気に晒さないようにする必要がある。このように試料が減圧雰囲気に晒されることなくＳＥＭを用いて検査を行う例の一つとして、膜により開口（アパーチャ）が密封された試料容器（サンプルカプセル、もしくは密封型サンプルカプセル）の内部に試料を配置し、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内に、このサンプルカプセルを設置する手法が考えられている。
【０００７】
ここで、試料が配置されるサンプルカプセルの内部は減圧されない。そして、サンプルカプセルに形成された当該開口を覆う膜は、ＳＥＭの試料室内の減圧雰囲気とサンプルカプセル内の減圧されていない雰囲気（例えば、大気圧雰囲気）との間の圧力差に耐えられるとともに、電子線が透過するものとなっている（特許文献１参照）。
【０００８】
試料検査を行う際には、まずサンプルカプセル内に細胞と共に培地を入れ、該膜上で細胞を培養させる。その後、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内にサンプルカプセルを配置し、サンプルカプセルの当該膜を介して、サンプルカプセルの外部からサンプルカプセル内の試料に電子線を照射する。電子線が照射された試料からは反射電子が発生し、この反射電子はサンプルカプセルの当該膜を通過して、ＳＥＭの試料室内に設けられた反射電子検出器によって検出される。これにより、ＳＥＭによる像（ＳＥＭ画像）が取得されることとなる。
【０００９】
しかしながら、この発明では試料は閉じた空間内に封入させるので、マニピュレータやピペットを用いて細胞に刺激（電圧印加や試薬投与）を与えることは不可能であった。さらに、サンプルカプセル内に入れられる培地の量は１５μｌ程度なので培地の蒸発にともなう塩濃度上昇により、細胞培養は困難であり、その細胞を生きた状態で観察・検査をする場合には問題があった。この問題は、サンプルカプセルを大きくし、中に入れられる容量を増加させることで解決可能である。しかし、膜が電子線や機械的な刺激に対し破壊された場合、大量の培地が流出して、装置内が培地で汚染されるという新たな問題が発生する。
【００１０】
なお、このように真空と大気圧との圧力差に耐えられる膜を介して試料に電子線を照射し、試料から発生する反射電子を検出してＳＥＭ画像を取得する例は、非特許文献１（当該文献のChapter1 Introduction）にも記載されている。
【００１１】
また、このような膜を対向して設置して一対の膜を構成し、該一対の膜の間に試料を配置して透過型電子顕微鏡による像を取得する例は、特許文献２及び特許文献３に記載されている。特に、特許文献２には、このような一対の膜を利用して、その間に配置された試料のＳＥＭ画像を取得する場合についても述べられている。
【００１２】
さらに、特許文献４には、水分を含む試料を保持する膜の破壊が生じたときに、真空室内の汚染発生を防止するための開閉バルブを備える試料検査装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表２００４−５１５０４９号公報
【特許文献２】特開昭４７−２４９６１号公報
【特許文献３】特開平６−３１８４４５号公報
【特許文献４】特開２００７−２９２７０２号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】「Atmospheric scanning electron microscopy」 Green、 Evan Drake Harriman、 Ph.D.、 Stanford University、 1993
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
細胞の微小領域を観察するためには、光学顕微鏡では分解能不足であり、ＳＥＭを用いた高分解能観察が必要である。液体を保持したまま細胞をＳＥＭで観察する為には、従来技術においては、シャーレ上で培養していた試料（細胞）をサンプルカプセルに封入し、サンプルカプセルに備えられた膜を介して電子線を試料に照射することで像（試料像）を得ていた。
【００１６】
しかし、サンプルカプセルは狭く閉じた空間である為、外部からマニピュレータやピペット等を用いて刺激（電圧印加や試薬投与）を与えた直後の様子を観察することが不可能であるという課題があった。さらに、サンプルカプセル内では、カプセル内の容量が少ないことから、水分の蒸発に伴う塩濃度上昇により細胞の長時間培養が困難で、細胞の長時間観察には問題があった。
【００１７】
そこで、液体を含む試料を常圧の開放状態で膜の試料保持面（上面）に保持し、該膜における試料保持面の反対側の面（下面）に接する雰囲気を減圧状態とし、この減圧状態とされた雰囲気側から該膜を介して試料に電子線を照射することのできるＳＥＭの開発が行われている。このようなＳＥＭにおいては、膜の試料保持面に保持された試料は開放されているので、マニピュレータやピペット等によるアクセスが可能となる（特許文献４参照）。
【００１８】
しかしながら、このような構成のＳＥＭにおいて、膜の上下面に加わる圧力の差に起因して、膜の破壊が生じる場合がある。特許文献４に記載されたＳＥＭの構成においては、真空室内における一次線照射手段と膜との間の空間を仕切るための開閉バルブを装置に設け、膜破壊が生じた場合には、当該開閉バルブを閉じるようにしている。しかし、このような開閉バルブの閉動作では、真空室内を完全に仕切るようにしているので、動作に時間がかかるという要改善点（課題）があった。
【００１９】
本発明は、このような点に鑑みてなされたものであり、真空室内を部分的に仕切ることのできるシャッターを導入するとともに、試料からの二次線がこのシャッターに到達したときに該シャッターから発生する三次的信号を検出し、これにより検出された三次的信号に基づいて試料像を得るようにすることにより、シャッターの閉動作が速やかに行われて装置のメインテナンスが容易となり、かつシャッターの低コスト化を実現することのできる試料の検査装置及び検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明に基づく検査装置は、第１の面に試料が保持される膜と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する真空室と、該真空室に接続され該膜を介して試料に一次線を照射する一次線照射手段と、該真空室内において該膜と該一次線照射手段との間に配置され、該一次線照射手段からの一次線が通過する構成を有するとともに、該膜と該一次線照射手段との間の空間を部分的に仕切るシャッターと、一次線の照射によって試料から発生する二次線が該膜を通過して該シャッターに到達し、これより該シャッターから発生する三次的信号を検出する信号検出手段とを備えることを特徴とする。
【００２１】
本発明に基づく一の検査方法は、前記検査装置により試料の検査を行うことを特徴とする。
【００２２】
本発明に基づく他の検査方法は、膜の第１の面に試料を保持する工程と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する工程と、一次線照射手段により、該膜の第２の面側から該膜を介して試料に一次線を照射する工程と、一次線の照射により試料から発生した二次線を、該膜と該一次線照射手段との間の空間を部分的に仕切るシャッターに当てる工程と、これにより該シャッターから発生する三次的信号を検出する工程とを備えることを特徴とする。
【００２３】
上記検査装置及び検査方法において、前記シャッターには、一次線が通過する構成として一次線通過用の孔が形成されていてもよく、膜の破壊時に真空室内に流入する試料を受け取る受け皿構造を有するとよい。該第一の面はアクセス可能なように開放状態で試料を保持してもよい。前記膜の破壊を検知する破壊検知手段とその検知により該シャッターを自動的に動作させ、該空間を部分的に仕切る機能を有する。この破壊検知装置は、前記膜の破壊に伴う前記真空室の圧力上昇を検知する。前記膜の第１の面が該膜の上面となっており、当該膜の第２の面が該膜の下面となっていてもよい。
【００２４】
前記一次線は、荷電粒子線又は電子線であり、前記二次線は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであり、前記三次的信号は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、第１の面に試料が保持される膜と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する真空室と、該真空室に接続され該膜を介して試料に一次線を照射する一次線照射手段と、該真空室内において該膜と該一次線照射手段との間に配置され、該一次線照射手段からの一次線が通過する構成を有するとともに、該膜と該一次線照射手段との間の空間を部分的に仕切るシャッターと、一次線の照射によって試料から発生する二次線が該膜を通過して該シャッターに到達し、これより該シャッターから発生する三次的信号を検出する信号検出手段とを備えることを特徴とする検査装置、もしくは該検査装置を用いた検査方法に関し、装置のメインテナンスを容易にするものである。
【００２６】
すなわち、該真空室内において、該膜と該一次線照射手段との間の空間を部分的に仕切るシャッター兼、三次的信号を発生させるシャッターを有する。これにより、膜が破れ、膜に保持された試料が真空室に流入したとしても、速やかにシャッターが一次線照射手段と膜との間を仕切り、試料による一次線照射手段の汚染を防止することができる。この場合、シャッターは汚染されるが、洗浄もしくは交換を行えばよい。
【００２７】
シャッターの構造は単純であるため、コスト低減につながる。従来では膜が破損される度に装置内の洗浄が必要となったが、本発明により、その洗浄が容易もしくは不要（部品交換による）になる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である（シャッター開状態）。
【図２】本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である（シャッター開状態）。
【図３】本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である（シャッター閉状態）。
【図４】本発明における試料保持体の構成を示す断面図である。
【図５】本発明における試料保持体を構成する枠状部材の概略図である。
【図６】本発明における試料保持体を構成する枠状部材の作成方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、図面を参照して、本発明における検査装置及び検査方法について説明する。
【００３０】
図１は、本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である。構成の主部分は、光学顕微鏡２７、マニピュレータ２６、及び電子線装置部２９（試料保持体４０より下の部分）である。
【００３１】
この図において、一次線照射手段である鏡筒１には、電子銃（電子源）２が配置されている。電子銃２から加速された状態で上方に向けて放出された一次線としての電子線（荷電粒子線）７は、集束レンズ（対物レンズ）３により集束される。
【００３２】
これにより集束された電子線７は、試料保持体４０に形成された試料保持膜３２（後述）を介して、試料保持体４０に保持された液状試料２０に照射される。この液状試料２０には、本実施例では、検査対象となる細胞３８と培地３９（それぞれ、図２を参照）が含まれている。
【００３３】
鏡筒１の先端側は真空室１１に接続されている。また、電子銃２が設けられた鏡筒１の基端側は真空室１１の下方に位置している。この構成により、電子銃２から放出された電子線７は、鏡筒１内を上方向に進み、真空室１１内の空間及び試料保持膜３２を通過し、液状試料２０に到達する。
【００３４】
当該照射時において、電子線７は図示しない偏向手段により偏向され、これにより電子線７は液状試料２０を走査する。このときには、液状試料２０に含まれる細胞等の検査対象試料も電子線７により走査される。
【００３５】
このように、この鏡筒１は、一次線照射手段を構成し、本実施例では倒立型鏡筒となっている。真空室１１内であって鏡筒１の先端側には、シャッター４が設けられている。
【００３６】
図２に、装置においてシャッター４が位置する部分の近傍の拡大図を示す。シャッター４は、液状試料２０に電子線７を照射した際に、該試料２０（細胞３８及び培地３９を含む）から発生する反射電子６１が照射される位置に配置されている。当該反射電子６１がシャッター４に到達する（照射される）と、シャッター４からは、二次電子６２が発生する。シャッター４には、二次電子６２が発生しやすいように、表面には金や酸化マグネシウム等をコーティングしておくとよい。
【００３７】
なお、シャッター４には、電子線７が通過できる孔４ａが形成されている。図１及び図２に示す状態では、シャッター４は、真空室１１内において開状態となる位置となっており、シャッター４の孔４ａは、鏡筒１から放出される電子線７の経路上に位置する。これにより、鏡筒からの電子線７は、孔４ａを通過し、試料保持膜３２を介して試料２０に到達することとなる。
【００３８】
シャッター４で発生した二次電子６１は、検出器１６によって検出される。検出器１６は例えば、例えばPN接合を利用した半導体型検出器やYAG結晶等を用いたシンチレータ型検出器が用いられる。
【００３９】
ここで再び、図１の説明に戻る。検出器１６により検出された検出信号は、真空室１１の外部に配置された画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データは、ＳＥＭ画像（試料像）に対応する画像データとなる。当該画像データは、表示装置２３に送られる。表示装置２３は、送られた画像データに基づく画像を表示する。表示された画像は、ＳＥＭ画像となる。
【００４０】
また、画像形成装置２２により形成された画像データは、必要に応じてコンピュータ２５に送られる。コンピュータ２５は、画像処理を当該画像データに対して施すとともに、当該画像処理の結果に基づく検査対象試料（検査対象物）についての判定を実行する。
【００４１】
鏡筒１内は排気手段８により真空引きされて、所定の圧力まで減圧される。また、真空室１１内は、排気手段９により真空引きされ、これにより所定の圧力まで減圧される。ここで、真空室１１は、除振装置１３を介して、架台１０に載置されている。
【００４２】
真空室１１の上部には、試料保持体載置部１２が設けられている。試料保持体載置部１２には、電子線７を試料保持膜３２に照射させるための孔１２ａが形成されている。この試料保持体載置部１２には、Ｏリング２１（図２参照）を介して、試料保持体４０が載置されている。これにより、試料保持体４０は真空室１１に着脱自在に支持される。
【００４３】
また、真空室１１には、真空室１１内の圧力を検知する真空計１５が設置されている。鏡筒１先端と試料保持膜３２の間には、前述したようにシャッター４が設けられており、シャッター駆動部１４（図１及び図２では開放の状態）が動作することにより、真空室１１内において鏡筒１から試料保持膜３２へ向かう電子線７の経路を塞ぐようにシャッター４を移動させる（閉鎖の状態とする）ことができる。
【００４４】
このシャッター駆動部１４は、試料保持膜３２が破壊され、真空計１５が所定の圧力上昇を検知した際に自動的に図３のように移動し、電子線７の上記経路を塞ぐ。例えば、試料保持膜３２が破壊され液状試料２０が真空室１１内に流入することで真空室が１００Ｐａより高い気圧になった場合、シャッター駆動部１４を図３のように動作させる。これにより、真空室１１内へ流入した液体試料２０をシャッター４で受け止めることができ、鏡筒１や検出器１６の汚染を防止する。シャッター４には図２のように液状試料を受け取る受け皿５が備え付けてあると多量の液体試料の流入に対応できる。
【００４５】
シャッター４は、真空室１１を上下２つの空間に完全ではなく、部分的に仕切る。その為、構造が簡単で動作も高速にできる。本実施例では、真空計１５が圧力上昇を検知し、その後０．１秒でシャッターを動作する（図１の状態から図３の状態にする）ことが可能である。
【００４６】
また、シャッター４の厚みも薄く出来るので、鏡筒１の先端と試料保持膜３２の距離（ＳＥＭでのワーキングディスタンス）を縮め、高分解能を達成することも可能である。
【００４７】
ここで、鏡筒１及び真空室１１を備える電子線装置部２９（シャッター４、シャッター駆動部１４、真空計１５、及び検出器１６も含む）は電子線制御部２４により制御される。また、試料保持体載置部１２には、液状試料２０（検査対象試料を含む）に刺激（電圧、化学物質、薬等）を与え、必要に応じて試料を移動させるマニピュレータ２６と、試料２０の観察やマニピュレータ２６の位置を確認する光学顕微鏡２７が載置されている。これらは制御部２８で制御されている。
【００４８】
なお、光学顕微鏡２７と電子線７の光軸は一致しており、もしくは、光学顕微鏡２７とＳＥＭ画像の視野中心は一致しており、光学顕微鏡の観察領域がＳＥＭ画像にほぼ一致させることができる。さらに、ＳＥＭ画像の視野と光学顕微鏡２７の視野調整は、マニピュレータ２６や、試料保持体４０が搭載されている試料保持体載置部１２を移動させる（移動機構は図示していない）ことによって行う。
【００４９】
本発明における検査装置は、電子線装置部２９、マニピュレータ２６、光学顕微鏡２７、電子線制御部２４、制御部２８、画像形成装置２２、及び表示装置２３を備えており、各部とコンピュータ２５が接続され、各部の情報がやり取りされることも可能である。
【００５０】
試料保持体４０は、図４のような構成となっている。この試料保持体４０は、プラスチック又はガラスからなる皿状の本体部３７と、電子線７が透過する試料保持膜３２が設けられた膜保持体（枠状部材）１８とから構成される。本体部３７の内側に位置する凹部の底面は、試料保持面３７ａを構成する。この試料保持面３７ａは、開放されている。
【００５１】
本体部３７の試料保持面３７ａの一部（図４の例では中央部）には、貫通孔３７ｂが形成されている。この孔３７ｂの試料保持面３７ａ側には、段差部３７ｃが設けられている。この段差部３７ｃに、膜保持体１８が配置されている。膜保持体１８は試料保持膜３２を備えており、この試料保持膜３２の第１の面３２ａは試料保持面３７ａを構成し、本体部３７の試料保持面３７ａとほぼ面一となっている。これにより、試料保持体４０の試料保持面３７ａの少なくとも一部は試料保持膜３２により構成されている。
【００５２】
また、孔３７ｂの試料保持面３７ａ側の反対側には、テーパ部３７ｄが設けられている。このテーパ部３７ｄは、試料保持面３７ａの反対側の面に向けて広がるように開いているテーパ構造となっており、その開き角度は９０度〜１２０度に設定されている。
【００５３】
さらに、試料保持体４０の下面で真空雰囲気に晒され、電子線７が照射される可能性のある領域には、電子線７の照射に伴う帯電を防止するため導電膜３０１が形成されている。導電膜３０１は膜保持体１８に接しており、電子線７の照射により蓄積された電荷を膜保持体１８（シリコン製）を介して液状試料２０へ逃がすことができる。この導電膜３０１があることにより試料保持体４０の下面での帯電を低減させ、電子線７の軌道変位や、（電子線７が液状試料２０に照射された際に発生する）反射電子の軌道変位により生ずるＳＥＭ画像の歪や輝度斑を防止することができる。
【００５４】
また、電荷の蓄積を確実に防止するためには、液状試料２０へのアース線の接続や、導電膜３０１を試料保持体載置部１２と電気的に繋げておくことが有効である。導電膜３０１は、例えばアルミニウム、金、もしくは酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）を蒸着もしくはスパッタリングすることによって形成させても、銀ペーストで塗りつけてもよい。
【００５５】
膜保持体１８の構成を図５に示す。シリコン基板３４に試料保持膜３２が形成されており、この試料保持膜３２の第１の面３２ａ（図５では下面、図４では上面）は露出されている。この試料保持膜３２の第１の面（試料保持面）３２ａには、培地等の液体（液体試料）３９及び検査対象試料（細胞）３８を含む液状試料２０が配置される。第一の面３２ａは大気圧下にあるので、液状試料２０からの水分の蒸発を極力抑えることができる。
【００５６】
また、シリコン基板３４の中央には開口３４ａ（図５では上面、図１および図４では下面）が形成されており、この開口３４ａは、試料保持膜３２により覆われている。ここで、試料保持膜３２における第２の面３２ｂの中央部は、該開口３４ａを介して真空室１１の内部雰囲気に露出されている。
【００５７】
次に、膜保持体１８の作成方法を、図６を用いて説明する。まず、シリコン基板５０１にＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）を用いて窒化シリコン膜５０２、５０３を形成する（図６（ａ））。代表的な厚みは３０ｎｍである。この窒化シリコン膜５０２、５０３上にレジスト５０４、５０５を塗布する（図６（ｂ））。レジスト５０５を、フォトリソグラフィー装置を用いてパターンニングし、レジスト５０５ａを残す（図６（ｃ））。レジストパターンをマスクとしてドライエッチングで窒化シリコン膜５０３を加工し、窒化シリコン膜５０３ａを残す（図６（ｄ））。このパターンをマスクとしてシリコン基板５０１をＫＯＨでウエットエッチングし、開口５１０を作る（図６（ｅ））。アッシングによりレジスト５０４、５０５aを除去し（図６（ｆ））、膜保持体１８が完成する。
【００５８】
このようにして作成された膜保持体１８は、図５の状態から上下反転され、試料保持膜３２である窒化シリコン膜５０２の第１の面３２ａを上面とする。なお、第２の面３２ｂを上面にすることも可能である。
【００５９】
この膜保持体１８を、試料保持体４０を構成する本体部３７に形成された孔３７ｂの上記段差部３７ｃに固着し、これにより試料保持体４０を作成する（図４）。この固着には、エポキシ系、シリコーン系の接着剤等による接着、又は熱、超音波若しくはレーザによる融着によって行うことができる。これにより、膜保持体１８は、本体部３７の試料保持面３７ａにおける孔３７ｂに対応する位置に固着される。
【００６０】
また、本実施例では、本体部３７と膜保持体１８を組み合わせて試料保持体４０を製作したが、本体部３７に試料保持膜３２を直接固着したり、本体部３７と試料保持膜３２を一体的に形成したりするようにしてもよい。さらに、試料保持膜３２の第１の面３２ａを含む試料保持面３７ａに、試料付着用分子としての細胞接着分子（後述）を塗布することができる。
【００６１】
ここで、窒化シリコン膜５０２の厚みは、１０〜１０００ｎｍの範囲に設定される。なお、膜保持体１８の試料保持膜３２として用いられる膜としては、窒化シリコン膜の他に、酸化シリコン、窒化ボロン、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、若しくはカーボンからなる膜を用いても良い。これらの膜を用いた場合でも、その膜厚は１０〜１０００ｎｍに設定される。上述した素材からなる試料保持膜３２は、電子線７が透過するが気体や液体は透過しないものとなる。さらに、膜の両面で少なくとも一気圧の圧力差に耐えられる必要がある。なお、このような試料保持膜３２は、その厚さが薄ければ電子線７の散乱が少なくなるので分解能が向上するが破損しやすくなり、また、その厚さが厚くなれば電子線７の散乱が増加して分解能が低下するが破損しにくくなる。好適な膜厚としては２０〜２００ｎｍとなる。
【００６２】
次に、本発明における検査方法について説明する。まず、図４のように試料保持体４０を用いて、検査対象試料となる細胞３８を培地３９中で培養させる。細胞３８をこのように培養させるには、予め細胞を培養してあるシャーレから試料保持体４０へ植え接ぎを行う必要がある。それには、以下に示す通常の方法を用いる。
【００６３】
まず、予め細胞の培養してあるシャーレ内から培地（例えばSigma社 D5796）を捨て、Tripsin＋EDTA（ethylenediaminetetraacetic acid）混合液を当該シャーレの中に入れることで、このシャーレに吸着した細胞を剥がす。次に、剥がれた細胞を遠沈管に回収して培地を加え、Tripsinの活性を止めた後に遠沈させる。その後、遠沈管内から上澄み液を捨て、培地で攪拌する。その攪拌された液（細胞３８を含む）の例えば１／１０を試料保持体４０に入れ、培地（液体試料）３９を継ぎ足す。この状態で、培養室に静置後、数時間で試料保持体４０の試料保持面３７ａ（試料保持膜３２の表面３２ａを含む）に細胞３８が吸着し、増殖し始める。上記方法は細胞により異なり、一例として示した。これにより、試料保持体４０内において、観察・検査対象である検査対象試料となる細胞３８が培養され、培養された細胞３８と培地３９を含有する液状試料２０が構成されることとなる。
【００６４】
なお、細胞によっては試料保持体４０の試料保持面３７ａ、特に電子線による観察領域である試料保持膜３２の第一の面（試料保持面）３２ａに細胞接着分子（試料付着用分子）を塗布しておくと培養が容易になる。細胞接着分子とは、培養のために配置された細胞及び培養により増殖した細胞を試料保持面に吸着させる作用を有し、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、インテグリン、クローディン、デスモグレイン、ニューロリギン、ニューレキシン、セレクチン、ラミニン、及びポリLリジンである。
【００６５】
上述のように試料保持体４０内で細胞が培養された後、試料保持体載置部１２に当該試料保持体４０を載置する。このとき、シャッター４は閉じられており、図３の状態になっている。続いて、排気手段８、９を用いて真空室１１および鏡筒１内を所定の真空にする。例えば、真空室１１内の圧力は、１Ｐａ程度、鏡筒１１内（特に電子銃２周囲）の圧力は、例えば、１０−４Ｐａ〜１０−５Ｐａ程度に設定される。
【００６６】
次に、光学顕微鏡２７で細胞３８とマニピュレータ２６の位置を確認する。マニピュレータ先端はガラス微小管（中に微小電極を設置）が設置してあり、微小電極による細胞への電圧の印加や、ガラス微小管による液体の流出及流入が可能になっている。
【００６７】
この状態で、光学顕微鏡２７で観察しながら細胞３８とガラス微小管が近接するようにマニピュレータ２６を移動させる。その後、ガラス微小管に負の圧力を掛けて細胞膜と密着させる。これにより、電位応答が測定可能となる。
【００６８】
以上のようなマニピュレータ２６の移動の際、誤って試料保持膜３２を破損させ、真空室１１内に液体試料２０が流入することがあっても、シャッター４が閉まっているので、液状試料２０をシャッター４で受け止め、鏡筒１の内部が汚染されることは無い。特に、シャッター４の閉状態において試料保持膜３２の直下に位置する受け皿５によって液状試料２０を受け止めることができるので、確実に液状試料２０を受け止めることができるとともに、真空室１１内部への汚染を最小限度に抑えることができる。これまでは、このような機構が無かった為、液状試料２０は鏡筒１内に入り込み、鏡筒１内の洗浄が必要で、時には装置が使用不可能な状態になっていた。
【００６９】
再び、観察の手順に戻る。液状試料２０が載置された試料保持膜３２が破壊されないことを確認した後、図１、２のようにシャッター４を開け、電子線７の経路を開ける。この状態では、真空室１１内において、鏡筒１から放出される電子線７は、シャッター４の孔４ａを通過して、試料保持膜３２に到達可能な状態となる。これにより、電子線７を、試料保持膜３２を介して試料２０に照射させる準備ができる。
【００７０】
その後、光が試料保持膜３２を介して反射電子検出器４に入射させない為に、光学顕微鏡２７の光の照射を止め、外光の遮蔽手段（図への記載は略）によって、外光の遮蔽を行う。この遮蔽は、膜保持体１８や液状試料２０に電子線７が照射した際に発生する放射線の防護の役目も果たしている。
【００７１】
次に、図１、２のように鏡筒１から電子線７を液状試料２０（細胞３８を含む）に向けて照射して撮像を行う。電子線７は試料保持体４０の試料保持膜３２を透過して、検査対象試料である細胞３８に照射され、当該照射に基づいて細胞３８から発生する二次線としての反射電子（後方散乱電子）はシャッター４に照射され、これによりシャッター４から発生した三次的信号である二次電子６２を検出器１６で検出する。
【００７２】
このとき、試料保持体４０を構成する本体部３７の孔３７ｂには、上述したテーパ部３７ｄが設けられているので、反射電子が孔３７ｂの内側面に衝突して遮られることを極力防止することができ、シャッター４に当たる反射電子６１の数を向上させることができる。
【００７３】
検出器１６からの検出信号は、画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データに基づいて、表示装置２３は画像（ＳＥＭ画像）を表示する。
【００７４】
これに引き続き、細胞３８に、マニピュレータ２６の先端に設置してある微小電極を用いて電気刺激を加え、先ほどと同様にＳＥＭ画像を取得し、刺激に対する細胞３８の応答を確認する。
【００７５】
撮像後はシャッター４を図３のように閉じることにより、万が一にでも試料保持膜３２が破壊される場合での鏡筒１への汚染を防止する。なお、上記のように細胞３８に刺激を与えた後の変化をＳＥＭで観察する前に、光学顕微鏡２７で観察する場合もある。その際も、シャッター４を閉じておくと、試料保持膜３２が破れた際の汚染のリスクを低減できる。すなわち、電子線７を液状試料２０に照射させない時はシャッター４を閉じておくことで、装置内部の汚染を防ぐことができる。
【００７６】
また、マニピュレータ２６には、化学物質や薬物を液状試料２０中に散布可能な機構を有すことができ、ＳＥＭで細胞を観察しながら化学物質や薬物に対する細胞３８の挙動も観察・検査することができる。また、マニピュレータ２６には、液体の流出機能を有することもでき、これにより散布した物質の回収を行うことや、培地のｐＨや浸透圧を一定にすることが可能になる。
【００７７】
上記において、像を形成するための二次線（二次的信号）としては、試料からの反射電子を用いた。反射電子は、原子番号に比例した信号強度を持つ。その為、生物試料のようにほぼ全体が低原子番号の物質で構成されている場合、像のコントラストが非常に弱く、分解能を向上させることが困難である。そこで、細胞３８の挙動で注目すべき部位に、金などの重金属を吸着させておくと良い。具体的には、該部位（抗原）に吸着する性質を持つ金粒子を標識した抗体を細胞に散布することで、抗原抗体反応を利用して、その部位（抗原）に該抗体を介して金を吸着させる。また、予め、電子線が照射されると発光する蛍光色素や量子ドット（例えばＳｉのナノ粒子、ＣｄＳｅをＺｎＳでコーティングした１０〜２０ｎｍの粒子）を細胞３８の特定部位に吸着させ発光を光学顕微鏡で観察しても良い。
【００７８】
上記実施例において、通常用いられる金粒子は１０〜３０ｎｍの粒径である。しかし、抗体と金粒子との吸着力が弱く、１０〜３０ｎｍの金粒子を付けられないこともある。その場合には、まず粒径数ｎｍと非常に小さな金（ナノゴールド）を抗体に付ける。このままでは金が小さすぎ、ＳＥＭでの観察は困難であるが、銀増感を利用して該金の周りに銀を吸着させることで、ＳＥＭで検出し易くする方法を用いても良い。
【００７９】
なお、上記においては、予めシャーレにおいて培養されていた細胞を取り出して、試料保持体４０に植え接ぎをして培養を行っていたが、生体から細胞を取り出して、この取り出された細胞を直接試料保持体４０の試料保持面３７ａに配置し、試料保持体４０内で当該細胞の培養をするようにしてもよい。
【００８０】
ＳＥＭで観察中（シャッター４は、図１のように開放状態）に試料保持膜３２が破れた場合には、液体試料２０が真空室１１に流入し圧力は上昇する。その圧力上昇を真空計１５で、例えば１００Ｐａより高い圧力を検知した場合、その情報が電子線制御部２４に送られ、シャッター駆動部１４にシャッター４を閉鎖する命令が送られる。その結果、図３のようにシャッター４は閉鎖され、液体試料２０はシャッター４で受け止められることとなる。この場合、真空室１１内へ侵入する液体試料２０の量が多い場合を想定して、図２のようにシャッター４には受け皿５が設けられている。
【００８１】
圧力上昇を検知して、シャッター１４を閉鎖するまでに要した時間は０．１秒以下であり、鏡体１の汚染を洗浄不要な程度にまで低減させることができる。このように、本発明により装置の使い勝手を向上することができる。
【００８２】
このように、本発明を用いて試料保持膜３２を介して液中試料のＳＥＭ観察が可能になった。特に開放された試料室を用いているため、外部から試料へのアクセスが可能で細胞に容易に刺激を与えることができる。
【００８３】
本発明では倒立型ＳＥＭを用いたが、試料によっては密封型サンプルカプセル（背景技術参照）を用いた通常の正立型ＳＥＭでも問題は無い。ただし、この場合でもシャッター４は密封型サンプルカプセルと鏡筒１の先端の間にあることが必要である。
【００８４】
なお、上記実施例においては、一次線として電子線を用いたが、試料保持膜３２が他の荷電粒子（ヘリウムイオンビーム等）の照射に対する耐衝撃性及び強度が十分に高ければ、当該他の荷電粒子線を用いた場合でも適用可能である。
【００８５】
また、上記実施例では二次線として反射電子を用いたが、それ以外でも二次電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光、及び細胞（試料）３８への吸収電流を検出することにより、細胞３８の情報を得ることが可能である。なお、吸収電流の測定はマニピュレータ２６を用いると便利である。
【００８６】
本実施例での試料保持膜３２は、少なくとも一気圧の圧力差に耐えることができ、気体や液体の流入出がないことが必要である。具体的な物質としては、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、カーボン、酸化シリコン、窒化シリコン、又は窒化ボロンのうちの少なくとも一つを含むものを用いることができる。
【００８７】
また、試料保持体４０で細胞を培養し、グルタールアルデヒドやホルムアルデヒドを用いた細胞の固定を行った後、細胞を光学顕微鏡やＳＥＭで観察しやすいように染色を行う用途にも適する。
【００８８】
以上のように、シャッターに、試料からの二次線に基づく三次線発生機能を付加し、さらにシャッターに受け皿を設けることで、試料保持膜３２が破壊されたとしても、大量の液体を受け皿で受け止めることができる。その際、シャッター及びその受け皿が汚染される（濡れる）為、シャッターの洗浄もしくは交換が必要となるが、構造が簡単な為、洗浄が容易で交換してもコスト低減が実現できる。
【００８９】
このように、本発明における検査装置は、第１の面３２ａに試料が保持される膜３２と、該膜３２の第２の面３２ｂに接する雰囲気を減圧する真空室１１と、該真空室１１に接続され該膜３２を介して試料に一次線７を照射する一次線照射手段１と、該真空室内１１において該膜３２と該一次線照射手段１との間に配置され、該一次線照射手段１からの一次線７が通過する構成を有するとともに、該膜３２と該一次線照射手段１との間の空間を部分的に仕切るシャッター４と、一次線７の照射によって試料から発生する反射電子等の二次線が該膜３２を通過して該シャッター４に到達し、これより該シャッター４から発生する三次的信号を検出する信号検出手段１５とを備える。
【００９０】
そして、本発明における検査方法では、上記検査装置により試料の検査が行われる。
【００９１】
また、さらに本発明の検査方法は、膜３２の第１の面３２ａに試料を保持する工程と、該膜３２の第２の面３２ｂに接する雰囲気を減圧する工程と、一次線照射手段１により、該膜３２の第２の面３２ｂ側から該膜３２を介して試料に一次線７を照射する工程と、一次線７の照射により試料から発生した反射電子等の二次線を、該膜３２と該一次線照射手段１との間の空間を部分的に仕切るシャッター４に照射させる工程と、これにより該シャッター４から発生する三次的信号を検出する工程とを備える。
【００９２】
上記検査装置及び検査方法において、シャッター４には、前記構成として、一次線７が通過する孔４ａが形成されている。さらに、シャッター４には、受け皿構造５が備えられている。また、膜３２の第一の面３２ａは、アクセス可能なように開放状態で試料を保持する。
【００９３】
そして、検査装置には膜３２の破壊を検知する膜破壊検知手段１５が備えられており、該膜破壊検知手段１５による膜３２の破壊の検知時には、検査装置は、シャッター４を移動させ、試料室１内部における上記空間内において一次線照射手段１から膜３２に向かう一次線７の照射経路をシャッター４により遮断する。膜破壊検知手段１５は、膜３２の破壊に伴う真空室１１内の圧力上昇を検知する。
【００９４】
ここで、膜３２の第１の面は該膜３２３２ａの上面となっており、当該膜３２の第２の面３２ｂは該膜３２の下面となっている。
【００９５】
さらに、上記一次線は、荷電粒子線又は電子線とし、上記二次線は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つとし、上記三次的信号は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つとすることができる。
【００９６】
このような構成により、膜３２が破れ、膜３２に保持された液状の試料２０が真空室１１に流入したとしても、速やかにシャッター４が一次線照射手段１と膜３２との間を仕切り、試料２０による一次線照射手段１の汚染を防止することができる。このとき、シャッター４は汚染されるが、洗浄もしくは交換を行えばよい。
【００９７】
そして、シャッター４の構造は単純であるため、コスト低減につながる。従来では膜３２が破損（破壊）される度に装置内の洗浄が必要となったが、本発明により、その洗浄が容易もしくは不要（部品交換による）になる。
【符号の説明】
【００９８】
１…鏡筒（一次線照射手段）、２…電子銃、３…集束レンズ、４…シャッター、４ａ…孔、５…受け皿、７…電子線（一次線）、８…排気手段、９…排気手段、１０…架台、１１…真空室、１２…試料保持体載置部（載置手段）、１３…除震装置、１４…シャッター駆動部、１６…検出器（信号検出手段）、１５…真空計、１８…膜保持体（枠状部材）、２０…液状試料、２１…Ｏリング、２２…画像形成装置、２３…表示装置、２４…電子線制御部、２５…コンピュータ、２６…マニピュレータ、２７…光学顕微鏡（光学像取得手段）、２８…制御部、２９…電子線装置部、３２…試料保持膜（膜）、３２ａ…第１の面（試料保持面）、３２ｂ…第２の面、３４…シリコン基板、３４ａ…開口、３７…本体部、３７ａ…試料保持面、３７ｂ…孔、３７ｃ…段差部、３７ｄ…テーパ部、３８…細胞（検査対象試料）、３９…培地、４０…試料保持体、６１…反射電子（二次線）、６２…二次電子（三次的信号（三次線））、３０１…導電膜、５０１…シリコン基板、５０２…窒化シリコン膜、５０３…窒化シリコン膜、５０３ａ…窒化シリコン膜、５０４…レジスト、５０５…レジスト、５０５ａ…レジスト、５１０…開口
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体に含まれた検査対象試料（検査対象物）や、液体の培地内で培養されて該培地内に存在する細胞等からなる検査対象試料の観察又は検査を良好に行うことのできる検査装置及び検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々生物は多細胞動物であり、細胞間の情報伝達が正常に行えなくなる事や、ウイルスや化学物質が細胞に取り付く事によって病気が発症する。このようなことから、分子生物学や、製薬分野では、生体から剥離した細胞をシャーレ（ディッシュ）上で培養し、その細胞に刺激（電気、化学物質、薬等）を与え、その反応を細胞レベルで観察することで研究を行っている。従来、このような観察には光学顕微鏡が使用され、細胞の刺激にはマニピュレータやピペットが用いられていたが、観察すべき重要な箇所は光学顕微鏡では観察不可能な０．１μｍ以下の微小領域であることも多い。
【０００３】
例えば、細胞間の物質のやり取りが正常に行えなくなることに起因する病気に高血圧症、尿崩症、不整脈、筋肉疾患、糖尿病、うつ病等がある。この細胞間の物質のやり取りは細胞膜にある１０ｎｍ程度の大きさのイオンチャンネルにより行われる。このようなイオンチャンネルは、光学顕微鏡では観察困難である為、分解能の高い走査型電子顕微鏡（以下、「ＳＥＭ」（Scanning Electron Microscope）という）を用いた観察が望まれていた。
【０００４】
しかし、ＳＥＭの構成を備える検査装置において、検査対象となる試料は、通常、真空引きにより減圧された試料室内に配置される。そして、このように減圧雰囲気とされた試料室内に配置された試料に電子線（荷電粒子線）が照射され、当該照射により試料から発生する二次電子や反射電子（後方散乱電子）等の二次的信号が検出される。このようなＳＥＭによる試料検査では、試料が減圧雰囲気に晒されることとなる。よって、試料から水分が蒸発して細胞が死んでしまい、生きた状態の細胞における刺激に対する反応を観察することは不可能であった。
【０００５】
また、蛋白の固定された細胞（死細胞）においても、真空に試料を載置する際には、真空中での水分蒸発に伴う形状変化を防止する為、手間と、熟練の必要な脱水、乾燥、及び金属蒸着の前処理が必要であった。その為、観察までには膨大な時間が必要で、高スループット観察は不可能であった。
【０００６】
従って、試料に水分が含まれた状態で検査を行う際には、試料から水分が蒸発しないように、試料を減圧雰囲気に晒さないようにする必要がある。このように試料が減圧雰囲気に晒されることなくＳＥＭを用いて検査を行う例の一つとして、膜により開口（アパーチャ）が密封された試料容器（サンプルカプセル、もしくは密封型サンプルカプセル）の内部に試料を配置し、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内に、このサンプルカプセルを設置する手法が考えられている。
【０００７】
ここで、試料が配置されるサンプルカプセルの内部は減圧されない。そして、サンプルカプセルに形成された当該開口を覆う膜は、ＳＥＭの試料室内の減圧雰囲気とサンプルカプセル内の減圧されていない雰囲気（例えば、大気圧雰囲気）との間の圧力差に耐えられるとともに、電子線が透過するものとなっている（特許文献１参照）。
【０００８】
試料検査を行う際には、まずサンプルカプセル内に細胞と共に培地を入れ、該膜上で細胞を培養させる。その後、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内にサンプルカプセルを配置し、サンプルカプセルの当該膜を介して、サンプルカプセルの外部からサンプルカプセル内の試料に電子線を照射する。電子線が照射された試料からは反射電子が発生し、この反射電子はサンプルカプセルの当該膜を通過して、ＳＥＭの試料室内に設けられた反射電子検出器によって検出される。これにより、ＳＥＭによる像（ＳＥＭ画像）が取得されることとなる。
【０００９】
しかしながら、この発明では試料は閉じた空間内に封入させるので、マニピュレータやピペットを用いて細胞に刺激（電圧印加や試薬投与）を与えることは不可能であった。さらに、サンプルカプセル内に入れられる培地の量は１５μｌ程度なので培地の蒸発にともなう塩濃度上昇により、細胞培養は困難であり、その細胞を生きた状態で観察・検査をする場合には問題があった。この問題は、サンプルカプセルを大きくし、中に入れられる容量を増加させることで解決可能である。しかし、膜が電子線や機械的な刺激に対し破壊された場合、大量の培地が流出して、装置内が培地で汚染されるという新たな問題が発生する。
【００１０】
なお、このように真空と大気圧との圧力差に耐えられる膜を介して試料に電子線を照射し、試料から発生する反射電子を検出してＳＥＭ画像を取得する例は、非特許文献１（当該文献のChapter1 Introduction）にも記載されている。
【００１１】
また、このような膜を対向して設置して一対の膜を構成し、該一対の膜の間に試料を配置して透過型電子顕微鏡による像を取得する例は、特許文献２及び特許文献３に記載されている。特に、特許文献２には、このような一対の膜を利用して、その間に配置された試料のＳＥＭ画像を取得する場合についても述べられている。
【００１２】
さらに、特許文献４には、水分を含む試料を保持する膜の破壊が生じたときに、真空室内の汚染発生を防止するための開閉バルブを備える試料検査装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表２００４−５１５０４９号公報
【特許文献２】特開昭４７−２４９６１号公報
【特許文献３】特開平６−３１８４４５号公報
【特許文献４】特開２００７−２９２７０２号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】「Atmospheric scanning electron microscopy」 Green、 Evan Drake Harriman、 Ph.D.、 Stanford University、 1993
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
細胞の微小領域を観察するためには、光学顕微鏡では分解能不足であり、ＳＥＭを用いた高分解能観察が必要である。液体を保持したまま細胞をＳＥＭで観察する為には、従来技術においては、シャーレ上で培養していた試料（細胞）をサンプルカプセルに封入し、サンプルカプセルに備えられた膜を介して電子線を試料に照射することで像（試料像）を得ていた。
【００１６】
しかし、サンプルカプセルは狭く閉じた空間である為、外部からマニピュレータやピペット等を用いて刺激（電圧印加や試薬投与）を与えた直後の様子を観察することが不可能であるという課題があった。さらに、サンプルカプセル内では、カプセル内の容量が少ないことから、水分の蒸発に伴う塩濃度上昇により細胞の長時間培養が困難で、細胞の長時間観察には問題があった。
【００１７】
そこで、液体を含む試料を常圧の開放状態で膜の試料保持面（上面）に保持し、該膜における試料保持面の反対側の面（下面）に接する雰囲気を減圧状態とし、この減圧状態とされた雰囲気側から該膜を介して試料に電子線を照射することのできるＳＥＭの開発が行われている。このようなＳＥＭにおいては、膜の試料保持面に保持された試料は開放されているので、マニピュレータやピペット等によるアクセスが可能となる（特許文献４参照）。
【００１８】
しかしながら、このような構成のＳＥＭにおいて、膜の上下面に加わる圧力の差に起因して、膜の破壊が生じる場合がある。特許文献４に記載されたＳＥＭの構成においては、真空室内における一次線照射手段と膜との間の空間を仕切るための開閉バルブを装置に設け、膜破壊が生じた場合には、当該開閉バルブを閉じるようにしている。しかし、このような開閉バルブの閉動作では、真空室内を完全に仕切るようにしているので、動作に時間がかかるという要改善点（課題）があった。
【００１９】
本発明は、このような点に鑑みてなされたものであり、真空室内を部分的に仕切ることのできるシャッターを導入するとともに、試料からの二次線がこのシャッターに到達したときに該シャッターから発生する三次的信号を検出し、これにより検出された三次的信号に基づいて試料像を得るようにすることにより、シャッターの閉動作が速やかに行われて装置のメインテナンスが容易となり、かつシャッターの低コスト化を実現することのできる試料の検査装置及び検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明に基づく検査装置は、第１の面に試料が保持される膜と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する真空室と、該真空室に接続され該膜を介して試料に一次線を照射する一次線照射手段と、該真空室内において該膜と該一次線照射手段との間に配置され、該一次線照射手段からの一次線が通過する構成を有するとともに、該膜と該一次線照射手段との間の空間を部分的に仕切るシャッターと、一次線の照射によって試料から発生する二次線が該膜を通過して該シャッターに到達し、これより該シャッターから発生する三次的信号を検出する信号検出手段とを備えることを特徴とする。
【００２１】
本発明に基づく一の検査方法は、前記検査装置により試料の検査を行うことを特徴とする。
【００２２】
本発明に基づく他の検査方法は、膜の第１の面に試料を保持する工程と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する工程と、一次線照射手段により、該膜の第２の面側から該膜を介して試料に一次線を照射する工程と、一次線の照射により試料から発生した二次線を、該膜と該一次線照射手段との間の空間を部分的に仕切るシャッターに当てる工程と、これにより該シャッターから発生する三次的信号を検出する工程とを備えることを特徴とする。
【００２３】
上記検査装置及び検査方法において、前記シャッターには、一次線が通過する構成として一次線通過用の孔が形成されていてもよく、膜の破壊時に真空室内に流入する試料を受け取る受け皿構造を有するとよい。該第一の面はアクセス可能なように開放状態で試料を保持してもよい。前記膜の破壊を検知する破壊検知手段とその検知により該シャッターを自動的に動作させ、該空間を部分的に仕切る機能を有する。この破壊検知装置は、前記膜の破壊に伴う前記真空室の圧力上昇を検知する。前記膜の第１の面が該膜の上面となっており、当該膜の第２の面が該膜の下面となっていてもよい。
【００２４】
前記一次線は、荷電粒子線又は電子線であり、前記二次線は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであり、前記三次的信号は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、第１の面に試料が保持される膜と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する真空室と、該真空室に接続され該膜を介して試料に一次線を照射する一次線照射手段と、該真空室内において該膜と該一次線照射手段との間に配置され、該一次線照射手段からの一次線が通過する構成を有するとともに、該膜と該一次線照射手段との間の空間を部分的に仕切るシャッターと、一次線の照射によって試料から発生する二次線が該膜を通過して該シャッターに到達し、これより該シャッターから発生する三次的信号を検出する信号検出手段とを備えることを特徴とする検査装置、もしくは該検査装置を用いた検査方法に関し、装置のメインテナンスを容易にするものである。
【００２６】
すなわち、該真空室内において、該膜と該一次線照射手段との間の空間を部分的に仕切るシャッター兼、三次的信号を発生させるシャッターを有する。これにより、膜が破れ、膜に保持された試料が真空室に流入したとしても、速やかにシャッターが一次線照射手段と膜との間を仕切り、試料による一次線照射手段の汚染を防止することができる。この場合、シャッターは汚染されるが、洗浄もしくは交換を行えばよい。
【００２７】
シャッターの構造は単純であるため、コスト低減につながる。従来では膜が破損される度に装置内の洗浄が必要となったが、本発明により、その洗浄が容易もしくは不要（部品交換による）になる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である（シャッター開状態）。
【図２】本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である（シャッター開状態）。
【図３】本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である（シャッター閉状態）。
【図４】本発明における試料保持体の構成を示す断面図である。
【図５】本発明における試料保持体を構成する枠状部材の概略図である。
【図６】本発明における試料保持体を構成する枠状部材の作成方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、図面を参照して、本発明における検査装置及び検査方法について説明する。
【００３０】
図１は、本発明における試料検査装置の第１実施例を示す概略構成図である。構成の主部分は、光学顕微鏡２７、マニピュレータ２６、及び電子線装置部２９（試料保持体４０より下の部分）である。
【００３１】
この図において、一次線照射手段である鏡筒１には、電子銃（電子源）２が配置されている。電子銃２から加速された状態で上方に向けて放出された一次線としての電子線（荷電粒子線）７は、集束レンズ（対物レンズ）３により集束される。
【００３２】
これにより集束された電子線７は、試料保持体４０に形成された試料保持膜３２（後述）を介して、試料保持体４０に保持された液状試料２０に照射される。この液状試料２０には、本実施例では、検査対象となる細胞３８と培地３９（それぞれ、図２を参照）が含まれている。
【００３３】
鏡筒１の先端側は真空室１１に接続されている。また、電子銃２が設けられた鏡筒１の基端側は真空室１１の下方に位置している。この構成により、電子銃２から放出された電子線７は、鏡筒１内を上方向に進み、真空室１１内の空間及び試料保持膜３２を通過し、液状試料２０に到達する。
【００３４】
当該照射時において、電子線７は図示しない偏向手段により偏向され、これにより電子線７は液状試料２０を走査する。このときには、液状試料２０に含まれる細胞等の検査対象試料も電子線７により走査される。
【００３５】
このように、この鏡筒１は、一次線照射手段を構成し、本実施例では倒立型鏡筒となっている。真空室１１内であって鏡筒１の先端側には、シャッター４が設けられている。
【００３６】
図２に、装置においてシャッター４が位置する部分の近傍の拡大図を示す。シャッター４は、液状試料２０に電子線７を照射した際に、該試料２０（細胞３８及び培地３９を含む）から発生する反射電子６１が照射される位置に配置されている。当該反射電子６１がシャッター４に到達する（照射される）と、シャッター４からは、二次電子６２が発生する。シャッター４には、二次電子６２が発生しやすいように、表面には金や酸化マグネシウム等をコーティングしておくとよい。
【００３７】
なお、シャッター４には、電子線７が通過できる孔４ａが形成されている。図１及び図２に示す状態では、シャッター４は、真空室１１内において開状態となる位置となっており、シャッター４の孔４ａは、鏡筒１から放出される電子線７の経路上に位置する。これにより、鏡筒からの電子線７は、孔４ａを通過し、試料保持膜３２を介して試料２０に到達することとなる。
【００３８】
シャッター４で発生した二次電子６１は、検出器１６によって検出される。検出器１６は例えば、例えばPN接合を利用した半導体型検出器やYAG結晶等を用いたシンチレータ型検出器が用いられる。
【００３９】
ここで再び、図１の説明に戻る。検出器１６により検出された検出信号は、真空室１１の外部に配置された画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データは、ＳＥＭ画像（試料像）に対応する画像データとなる。当該画像データは、表示装置２３に送られる。表示装置２３は、送られた画像データに基づく画像を表示する。表示された画像は、ＳＥＭ画像となる。
【００４０】
また、画像形成装置２２により形成された画像データは、必要に応じてコンピュータ２５に送られる。コンピュータ２５は、画像処理を当該画像データに対して施すとともに、当該画像処理の結果に基づく検査対象試料（検査対象物）についての判定を実行する。
【００４１】
鏡筒１内は排気手段８により真空引きされて、所定の圧力まで減圧される。また、真空室１１内は、排気手段９により真空引きされ、これにより所定の圧力まで減圧される。ここで、真空室１１は、除振装置１３を介して、架台１０に載置されている。
【００４２】
真空室１１の上部には、試料保持体載置部１２が設けられている。試料保持体載置部１２には、電子線７を試料保持膜３２に照射させるための孔１２ａが形成されている。この試料保持体載置部１２には、Ｏリング２１（図２参照）を介して、試料保持体４０が載置されている。これにより、試料保持体４０は真空室１１に着脱自在に支持される。
【００４３】
また、真空室１１には、真空室１１内の圧力を検知する真空計１５が設置されている。鏡筒１先端と試料保持膜３２の間には、前述したようにシャッター４が設けられており、シャッター駆動部１４（図１及び図２では開放の状態）が動作することにより、真空室１１内において鏡筒１から試料保持膜３２へ向かう電子線７の経路を塞ぐようにシャッター４を移動させる（閉鎖の状態とする）ことができる。
【００４４】
このシャッター駆動部１４は、試料保持膜３２が破壊され、真空計１５が所定の圧力上昇を検知した際に自動的に図３のように移動し、電子線７の上記経路を塞ぐ。例えば、試料保持膜３２が破壊され液状試料２０が真空室１１内に流入することで真空室が１００Ｐａより高い気圧になった場合、シャッター駆動部１４を図３のように動作させる。これにより、真空室１１内へ流入した液体試料２０をシャッター４で受け止めることができ、鏡筒１や検出器１６の汚染を防止する。シャッター４には図２のように液状試料を受け取る受け皿５が備え付けてあると多量の液体試料の流入に対応できる。
【００４５】
シャッター４は、真空室１１を上下２つの空間に完全ではなく、部分的に仕切る。その為、構造が簡単で動作も高速にできる。本実施例では、真空計１５が圧力上昇を検知し、その後０．１秒でシャッターを動作する（図１の状態から図３の状態にする）ことが可能である。
【００４６】
また、シャッター４の厚みも薄く出来るので、鏡筒１の先端と試料保持膜３２の距離（ＳＥＭでのワーキングディスタンス）を縮め、高分解能を達成することも可能である。
【００４７】
ここで、鏡筒１及び真空室１１を備える電子線装置部２９（シャッター４、シャッター駆動部１４、真空計１５、及び検出器１６も含む）は電子線制御部２４により制御される。また、試料保持体載置部１２には、液状試料２０（検査対象試料を含む）に刺激（電圧、化学物質、薬等）を与え、必要に応じて試料を移動させるマニピュレータ２６と、試料２０の観察やマニピュレータ２６の位置を確認する光学顕微鏡２７が載置されている。これらは制御部２８で制御されている。
【００４８】
なお、光学顕微鏡２７と電子線７の光軸は一致しており、もしくは、光学顕微鏡２７とＳＥＭ画像の視野中心は一致しており、光学顕微鏡の観察領域がＳＥＭ画像にほぼ一致させることができる。さらに、ＳＥＭ画像の視野と光学顕微鏡２７の視野調整は、マニピュレータ２６や、試料保持体４０が搭載されている試料保持体載置部１２を移動させる（移動機構は図示していない）ことによって行う。
【００４９】
本発明における検査装置は、電子線装置部２９、マニピュレータ２６、光学顕微鏡２７、電子線制御部２４、制御部２８、画像形成装置２２、及び表示装置２３を備えており、各部とコンピュータ２５が接続され、各部の情報がやり取りされることも可能である。
【００５０】
試料保持体４０は、図４のような構成となっている。この試料保持体４０は、プラスチック又はガラスからなる皿状の本体部３７と、電子線７が透過する試料保持膜３２が設けられた膜保持体（枠状部材）１８とから構成される。本体部３７の内側に位置する凹部の底面は、試料保持面３７ａを構成する。この試料保持面３７ａは、開放されている。
【００５１】
本体部３７の試料保持面３７ａの一部（図４の例では中央部）には、貫通孔３７ｂが形成されている。この孔３７ｂの試料保持面３７ａ側には、段差部３７ｃが設けられている。この段差部３７ｃに、膜保持体１８が配置されている。膜保持体１８は試料保持膜３２を備えており、この試料保持膜３２の第１の面３２ａは試料保持面３７ａを構成し、本体部３７の試料保持面３７ａとほぼ面一となっている。これにより、試料保持体４０の試料保持面３７ａの少なくとも一部は試料保持膜３２により構成されている。
【００５２】
また、孔３７ｂの試料保持面３７ａ側の反対側には、テーパ部３７ｄが設けられている。このテーパ部３７ｄは、試料保持面３７ａの反対側の面に向けて広がるように開いているテーパ構造となっており、その開き角度は９０度〜１２０度に設定されている。
【００５３】
さらに、試料保持体４０の下面で真空雰囲気に晒され、電子線７が照射される可能性のある領域には、電子線７の照射に伴う帯電を防止するため導電膜３０１が形成されている。導電膜３０１は膜保持体１８に接しており、電子線７の照射により蓄積された電荷を膜保持体１８（シリコン製）を介して液状試料２０へ逃がすことができる。この導電膜３０１があることにより試料保持体４０の下面での帯電を低減させ、電子線７の軌道変位や、（電子線７が液状試料２０に照射された際に発生する）反射電子の軌道変位により生ずるＳＥＭ画像の歪や輝度斑を防止することができる。
【００５４】
また、電荷の蓄積を確実に防止するためには、液状試料２０へのアース線の接続や、導電膜３０１を試料保持体載置部１２と電気的に繋げておくことが有効である。導電膜３０１は、例えばアルミニウム、金、もしくは酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）を蒸着もしくはスパッタリングすることによって形成させても、銀ペーストで塗りつけてもよい。
【００５５】
膜保持体１８の構成を図５に示す。シリコン基板３４に試料保持膜３２が形成されており、この試料保持膜３２の第１の面３２ａ（図５では下面、図４では上面）は露出されている。この試料保持膜３２の第１の面（試料保持面）３２ａには、培地等の液体（液体試料）３９及び検査対象試料（細胞）３８を含む液状試料２０が配置される。第一の面３２ａは大気圧下にあるので、液状試料２０からの水分の蒸発を極力抑えることができる。
【００５６】
また、シリコン基板３４の中央には開口３４ａ（図５では上面、図１および図４では下面）が形成されており、この開口３４ａは、試料保持膜３２により覆われている。ここで、試料保持膜３２における第２の面３２ｂの中央部は、該開口３４ａを介して真空室１１の内部雰囲気に露出されている。
【００５７】
次に、膜保持体１８の作成方法を、図６を用いて説明する。まず、シリコン基板５０１にＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）を用いて窒化シリコン膜５０２、５０３を形成する（図６（ａ））。代表的な厚みは３０ｎｍである。この窒化シリコン膜５０２、５０３上にレジスト５０４、５０５を塗布する（図６（ｂ））。レジスト５０５を、フォトリソグラフィー装置を用いてパターンニングし、レジスト５０５ａを残す（図６（ｃ））。レジストパターンをマスクとしてドライエッチングで窒化シリコン膜５０３を加工し、窒化シリコン膜５０３ａを残す（図６（ｄ））。このパターンをマスクとしてシリコン基板５０１をＫＯＨでウエットエッチングし、開口５１０を作る（図６（ｅ））。アッシングによりレジスト５０４、５０５aを除去し（図６（ｆ））、膜保持体１８が完成する。
【００５８】
このようにして作成された膜保持体１８は、図５の状態から上下反転され、試料保持膜３２である窒化シリコン膜５０２の第１の面３２ａを上面とする。なお、第２の面３２ｂを上面にすることも可能である。
【００５９】
この膜保持体１８を、試料保持体４０を構成する本体部３７に形成された孔３７ｂの上記段差部３７ｃに固着し、これにより試料保持体４０を作成する（図４）。この固着には、エポキシ系、シリコーン系の接着剤等による接着、又は熱、超音波若しくはレーザによる融着によって行うことができる。これにより、膜保持体１８は、本体部３７の試料保持面３７ａにおける孔３７ｂに対応する位置に固着される。
【００６０】
また、本実施例では、本体部３７と膜保持体１８を組み合わせて試料保持体４０を製作したが、本体部３７に試料保持膜３２を直接固着したり、本体部３７と試料保持膜３２を一体的に形成したりするようにしてもよい。さらに、試料保持膜３２の第１の面３２ａを含む試料保持面３７ａに、試料付着用分子としての細胞接着分子（後述）を塗布することができる。
【００６１】
ここで、窒化シリコン膜５０２の厚みは、１０〜１０００ｎｍの範囲に設定される。なお、膜保持体１８の試料保持膜３２として用いられる膜としては、窒化シリコン膜の他に、酸化シリコン、窒化ボロン、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、若しくはカーボンからなる膜を用いても良い。これらの膜を用いた場合でも、その膜厚は１０〜１０００ｎｍに設定される。上述した素材からなる試料保持膜３２は、電子線７が透過するが気体や液体は透過しないものとなる。さらに、膜の両面で少なくとも一気圧の圧力差に耐えられる必要がある。なお、このような試料保持膜３２は、その厚さが薄ければ電子線７の散乱が少なくなるので分解能が向上するが破損しやすくなり、また、その厚さが厚くなれば電子線７の散乱が増加して分解能が低下するが破損しにくくなる。好適な膜厚としては２０〜２００ｎｍとなる。
【００６２】
次に、本発明における検査方法について説明する。まず、図４のように試料保持体４０を用いて、検査対象試料となる細胞３８を培地３９中で培養させる。細胞３８をこのように培養させるには、予め細胞を培養してあるシャーレから試料保持体４０へ植え接ぎを行う必要がある。それには、以下に示す通常の方法を用いる。
【００６３】
まず、予め細胞の培養してあるシャーレ内から培地（例えばSigma社 D5796）を捨て、Tripsin＋EDTA（ethylenediaminetetraacetic acid）混合液を当該シャーレの中に入れることで、このシャーレに吸着した細胞を剥がす。次に、剥がれた細胞を遠沈管に回収して培地を加え、Tripsinの活性を止めた後に遠沈させる。その後、遠沈管内から上澄み液を捨て、培地で攪拌する。その攪拌された液（細胞３８を含む）の例えば１／１０を試料保持体４０に入れ、培地（液体試料）３９を継ぎ足す。この状態で、培養室に静置後、数時間で試料保持体４０の試料保持面３７ａ（試料保持膜３２の表面３２ａを含む）に細胞３８が吸着し、増殖し始める。上記方法は細胞により異なり、一例として示した。これにより、試料保持体４０内において、観察・検査対象である検査対象試料となる細胞３８が培養され、培養された細胞３８と培地３９を含有する液状試料２０が構成されることとなる。
【００６４】
なお、細胞によっては試料保持体４０の試料保持面３７ａ、特に電子線による観察領域である試料保持膜３２の第一の面（試料保持面）３２ａに細胞接着分子（試料付着用分子）を塗布しておくと培養が容易になる。細胞接着分子とは、培養のために配置された細胞及び培養により増殖した細胞を試料保持面に吸着させる作用を有し、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、インテグリン、クローディン、デスモグレイン、ニューロリギン、ニューレキシン、セレクチン、ラミニン、及びポリLリジンである。
【００６５】
上述のように試料保持体４０内で細胞が培養された後、試料保持体載置部１２に当該試料保持体４０を載置する。このとき、シャッター４は閉じられており、図３の状態になっている。続いて、排気手段８、９を用いて真空室１１および鏡筒１内を所定の真空にする。例えば、真空室１１内の圧力は、１Ｐａ程度、鏡筒１１内（特に電子銃２周囲）の圧力は、例えば、１０−４Ｐａ〜１０−５Ｐａ程度に設定される。
【００６６】
次に、光学顕微鏡２７で細胞３８とマニピュレータ２６の位置を確認する。マニピュレータ先端はガラス微小管（中に微小電極を設置）が設置してあり、微小電極による細胞への電圧の印加や、ガラス微小管による液体の流出及流入が可能になっている。
【００６７】
この状態で、光学顕微鏡２７で観察しながら細胞３８とガラス微小管が近接するようにマニピュレータ２６を移動させる。その後、ガラス微小管に負の圧力を掛けて細胞膜と密着させる。これにより、電位応答が測定可能となる。
【００６８】
以上のようなマニピュレータ２６の移動の際、誤って試料保持膜３２を破損させ、真空室１１内に液体試料２０が流入することがあっても、シャッター４が閉まっているので、液状試料２０をシャッター４で受け止め、鏡筒１の内部が汚染されることは無い。特に、シャッター４の閉状態において試料保持膜３２の直下に位置する受け皿５によって液状試料２０を受け止めることができるので、確実に液状試料２０を受け止めることができるとともに、真空室１１内部への汚染を最小限度に抑えることができる。これまでは、このような機構が無かった為、液状試料２０は鏡筒１内に入り込み、鏡筒１内の洗浄が必要で、時には装置が使用不可能な状態になっていた。
【００６９】
再び、観察の手順に戻る。液状試料２０が載置された試料保持膜３２が破壊されないことを確認した後、図１、２のようにシャッター４を開け、電子線７の経路を開ける。この状態では、真空室１１内において、鏡筒１から放出される電子線７は、シャッター４の孔４ａを通過して、試料保持膜３２に到達可能な状態となる。これにより、電子線７を、試料保持膜３２を介して試料２０に照射させる準備ができる。
【００７０】
その後、光が試料保持膜３２を介して反射電子検出器４に入射させない為に、光学顕微鏡２７の光の照射を止め、外光の遮蔽手段（図への記載は略）によって、外光の遮蔽を行う。この遮蔽は、膜保持体１８や液状試料２０に電子線７が照射した際に発生する放射線の防護の役目も果たしている。
【００７１】
次に、図１、２のように鏡筒１から電子線７を液状試料２０（細胞３８を含む）に向けて照射して撮像を行う。電子線７は試料保持体４０の試料保持膜３２を透過して、検査対象試料である細胞３８に照射され、当該照射に基づいて細胞３８から発生する二次線としての反射電子（後方散乱電子）はシャッター４に照射され、これによりシャッター４から発生した三次的信号である二次電子６２を検出器１６で検出する。
【００７２】
このとき、試料保持体４０を構成する本体部３７の孔３７ｂには、上述したテーパ部３７ｄが設けられているので、反射電子が孔３７ｂの内側面に衝突して遮られることを極力防止することができ、シャッター４に当たる反射電子６１の数を向上させることができる。
【００７３】
検出器１６からの検出信号は、画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データに基づいて、表示装置２３は画像（ＳＥＭ画像）を表示する。
【００７４】
これに引き続き、細胞３８に、マニピュレータ２６の先端に設置してある微小電極を用いて電気刺激を加え、先ほどと同様にＳＥＭ画像を取得し、刺激に対する細胞３８の応答を確認する。
【００７５】
撮像後はシャッター４を図３のように閉じることにより、万が一にでも試料保持膜３２が破壊される場合での鏡筒１への汚染を防止する。なお、上記のように細胞３８に刺激を与えた後の変化をＳＥＭで観察する前に、光学顕微鏡２７で観察する場合もある。その際も、シャッター４を閉じておくと、試料保持膜３２が破れた際の汚染のリスクを低減できる。すなわち、電子線７を液状試料２０に照射させない時はシャッター４を閉じておくことで、装置内部の汚染を防ぐことができる。
【００７６】
また、マニピュレータ２６には、化学物質や薬物を液状試料２０中に散布可能な機構を有すことができ、ＳＥＭで細胞を観察しながら化学物質や薬物に対する細胞３８の挙動も観察・検査することができる。また、マニピュレータ２６には、液体の流出機能を有することもでき、これにより散布した物質の回収を行うことや、培地のｐＨや浸透圧を一定にすることが可能になる。
【００７７】
上記において、像を形成するための二次線（二次的信号）としては、試料からの反射電子を用いた。反射電子は、原子番号に比例した信号強度を持つ。その為、生物試料のようにほぼ全体が低原子番号の物質で構成されている場合、像のコントラストが非常に弱く、分解能を向上させることが困難である。そこで、細胞３８の挙動で注目すべき部位に、金などの重金属を吸着させておくと良い。具体的には、該部位（抗原）に吸着する性質を持つ金粒子を標識した抗体を細胞に散布することで、抗原抗体反応を利用して、その部位（抗原）に該抗体を介して金を吸着させる。また、予め、電子線が照射されると発光する蛍光色素や量子ドット（例えばＳｉのナノ粒子、ＣｄＳｅをＺｎＳでコーティングした１０〜２０ｎｍの粒子）を細胞３８の特定部位に吸着させ発光を光学顕微鏡で観察しても良い。
【００７８】
上記実施例において、通常用いられる金粒子は１０〜３０ｎｍの粒径である。しかし、抗体と金粒子との吸着力が弱く、１０〜３０ｎｍの金粒子を付けられないこともある。その場合には、まず粒径数ｎｍと非常に小さな金（ナノゴールド）を抗体に付ける。このままでは金が小さすぎ、ＳＥＭでの観察は困難であるが、銀増感を利用して該金の周りに銀を吸着させることで、ＳＥＭで検出し易くする方法を用いても良い。
【００７９】
なお、上記においては、予めシャーレにおいて培養されていた細胞を取り出して、試料保持体４０に植え接ぎをして培養を行っていたが、生体から細胞を取り出して、この取り出された細胞を直接試料保持体４０の試料保持面３７ａに配置し、試料保持体４０内で当該細胞の培養をするようにしてもよい。
【００８０】
ＳＥＭで観察中（シャッター４は、図１のように開放状態）に試料保持膜３２が破れた場合には、液体試料２０が真空室１１に流入し圧力は上昇する。その圧力上昇を真空計１５で、例えば１００Ｐａより高い圧力を検知した場合、その情報が電子線制御部２４に送られ、シャッター駆動部１４にシャッター４を閉鎖する命令が送られる。その結果、図３のようにシャッター４は閉鎖され、液体試料２０はシャッター４で受け止められることとなる。この場合、真空室１１内へ侵入する液体試料２０の量が多い場合を想定して、図２のようにシャッター４には受け皿５が設けられている。
【００８１】
圧力上昇を検知して、シャッター１４を閉鎖するまでに要した時間は０．１秒以下であり、鏡体１の汚染を洗浄不要な程度にまで低減させることができる。このように、本発明により装置の使い勝手を向上することができる。
【００８２】
このように、本発明を用いて試料保持膜３２を介して液中試料のＳＥＭ観察が可能になった。特に開放された試料室を用いているため、外部から試料へのアクセスが可能で細胞に容易に刺激を与えることができる。
【００８３】
本発明では倒立型ＳＥＭを用いたが、試料によっては密封型サンプルカプセル（背景技術参照）を用いた通常の正立型ＳＥＭでも問題は無い。ただし、この場合でもシャッター４は密封型サンプルカプセルと鏡筒１の先端の間にあることが必要である。
【００８４】
なお、上記実施例においては、一次線として電子線を用いたが、試料保持膜３２が他の荷電粒子（ヘリウムイオンビーム等）の照射に対する耐衝撃性及び強度が十分に高ければ、当該他の荷電粒子線を用いた場合でも適用可能である。
【００８５】
また、上記実施例では二次線として反射電子を用いたが、それ以外でも二次電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光、及び細胞（試料）３８への吸収電流を検出することにより、細胞３８の情報を得ることが可能である。なお、吸収電流の測定はマニピュレータ２６を用いると便利である。
【００８６】
本実施例での試料保持膜３２は、少なくとも一気圧の圧力差に耐えることができ、気体や液体の流入出がないことが必要である。具体的な物質としては、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、カーボン、酸化シリコン、窒化シリコン、又は窒化ボロンのうちの少なくとも一つを含むものを用いることができる。
【００８７】
また、試料保持体４０で細胞を培養し、グルタールアルデヒドやホルムアルデヒドを用いた細胞の固定を行った後、細胞を光学顕微鏡やＳＥＭで観察しやすいように染色を行う用途にも適する。
【００８８】
以上のように、シャッターに、試料からの二次線に基づく三次線発生機能を付加し、さらにシャッターに受け皿を設けることで、試料保持膜３２が破壊されたとしても、大量の液体を受け皿で受け止めることができる。その際、シャッター及びその受け皿が汚染される（濡れる）為、シャッターの洗浄もしくは交換が必要となるが、構造が簡単な為、洗浄が容易で交換してもコスト低減が実現できる。
【００８９】
このように、本発明における検査装置は、第１の面３２ａに試料が保持される膜３２と、該膜３２の第２の面３２ｂに接する雰囲気を減圧する真空室１１と、該真空室１１に接続され該膜３２を介して試料に一次線７を照射する一次線照射手段１と、該真空室内１１において該膜３２と該一次線照射手段１との間に配置され、該一次線照射手段１からの一次線７が通過する構成を有するとともに、該膜３２と該一次線照射手段１との間の空間を部分的に仕切るシャッター４と、一次線７の照射によって試料から発生する反射電子等の二次線が該膜３２を通過して該シャッター４に到達し、これより該シャッター４から発生する三次的信号を検出する信号検出手段１５とを備える。
【００９０】
そして、本発明における検査方法では、上記検査装置により試料の検査が行われる。
【００９１】
また、さらに本発明の検査方法は、膜３２の第１の面３２ａに試料を保持する工程と、該膜３２の第２の面３２ｂに接する雰囲気を減圧する工程と、一次線照射手段１により、該膜３２の第２の面３２ｂ側から該膜３２を介して試料に一次線７を照射する工程と、一次線７の照射により試料から発生した反射電子等の二次線を、該膜３２と該一次線照射手段１との間の空間を部分的に仕切るシャッター４に照射させる工程と、これにより該シャッター４から発生する三次的信号を検出する工程とを備える。
【００９２】
上記検査装置及び検査方法において、シャッター４には、前記構成として、一次線７が通過する孔４ａが形成されている。さらに、シャッター４には、受け皿構造５が備えられている。また、膜３２の第一の面３２ａは、アクセス可能なように開放状態で試料を保持する。
【００９３】
そして、検査装置には膜３２の破壊を検知する膜破壊検知手段１５が備えられており、該膜破壊検知手段１５による膜３２の破壊の検知時には、検査装置は、シャッター４を移動させ、試料室１内部における上記空間内において一次線照射手段１から膜３２に向かう一次線７の照射経路をシャッター４により遮断する。膜破壊検知手段１５は、膜３２の破壊に伴う真空室１１内の圧力上昇を検知する。
【００９４】
ここで、膜３２の第１の面は該膜３２３２ａの上面となっており、当該膜３２の第２の面３２ｂは該膜３２の下面となっている。
【００９５】
さらに、上記一次線は、荷電粒子線又は電子線とし、上記二次線は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つとし、上記三次的信号は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つとすることができる。
【００９６】
このような構成により、膜３２が破れ、膜３２に保持された液状の試料２０が真空室１１に流入したとしても、速やかにシャッター４が一次線照射手段１と膜３２との間を仕切り、試料２０による一次線照射手段１の汚染を防止することができる。このとき、シャッター４は汚染されるが、洗浄もしくは交換を行えばよい。
【００９７】
そして、シャッター４の構造は単純であるため、コスト低減につながる。従来では膜３２が破損（破壊）される度に装置内の洗浄が必要となったが、本発明により、その洗浄が容易もしくは不要（部品交換による）になる。
【符号の説明】
【００９８】
１…鏡筒（一次線照射手段）、２…電子銃、３…集束レンズ、４…シャッター、４ａ…孔、５…受け皿、７…電子線（一次線）、８…排気手段、９…排気手段、１０…架台、１１…真空室、１２…試料保持体載置部（載置手段）、１３…除震装置、１４…シャッター駆動部、１６…検出器（信号検出手段）、１５…真空計、１８…膜保持体（枠状部材）、２０…液状試料、２１…Ｏリング、２２…画像形成装置、２３…表示装置、２４…電子線制御部、２５…コンピュータ、２６…マニピュレータ、２７…光学顕微鏡（光学像取得手段）、２８…制御部、２９…電子線装置部、３２…試料保持膜（膜）、３２ａ…第１の面（試料保持面）、３２ｂ…第２の面、３４…シリコン基板、３４ａ…開口、３７…本体部、３７ａ…試料保持面、３７ｂ…孔、３７ｃ…段差部、３７ｄ…テーパ部、３８…細胞（検査対象試料）、３９…培地、４０…試料保持体、６１…反射電子（二次線）、６２…二次電子（三次的信号（三次線））、３０１…導電膜、５０１…シリコン基板、５０２…窒化シリコン膜、５０３…窒化シリコン膜、５０３ａ…窒化シリコン膜、５０４…レジスト、５０５…レジスト、５０５ａ…レジスト、５１０…開口
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の面に試料が保持される膜と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する真空室と、該真空室に接続され該膜を介して試料に一次線を照射する一次線照射手段と、該真空室内において該膜と該一次線照射手段との間に配置され、該一次線照射手段からの一次線が通過する構成を有するとともに、該膜と該一次線照射手段との間の空間を部分的に仕切るシャッターと、一次線の照射によって試料から発生する二次線が該膜を通過して該シャッターに到達し、これより該シャッターから発生する三次的信号を検出する信号検出手段とを備える検査装置。
【請求項２】
前記シャッターには、前記構成として、前記一次線が通過する孔が形成されていることを特徴とする請求項１記載の検査装置。
【請求項３】
前記シャッターには、受け皿構造が備えられていることを特徴とする請求項１又は２記載の検査装置。
【請求項４】
前記膜の第一の面は、アクセス可能なように開放状態で試料を保持することを特徴とする請求項１乃至３何れか記載の検査装置。
【請求項５】
前記膜の破壊を検知する膜破壊検知手段を備え、該膜破壊検知手段による前記膜の破壊の検知時には、前記シャッターを移動させ、前記空間内において前記一次線照射手段から前記膜に向かう一次線の照射経路を前記シャッターにより遮断することを特徴とする請求項１乃至４何れか記載の検査装置。
【請求項６】
前記膜破壊検知手段は、前記膜の破壊に伴う前記真空室内の圧力上昇を検知することを特徴とする請求項５記載の検査装置。
【請求項７】
前記膜の第１の面が該膜の上面となっており、当該膜の第２の面が該膜の下面となっていることを特徴とする請求項１乃至６何れか記載の検査装置。
【請求項８】
前記一次線は、荷電粒子線又は電子線であり、前記二次線は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであり、前記三次的信号は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１乃至７何れか記載の検査装置。
【請求項９】
請求項１乃至８何れか記載の検査装置により試料の検査を行うことを特徴とする検査方法。
【請求項１０】
膜の第１の面に試料を保持する工程と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する工程と、一次線照射手段により、該膜の第２の面側から該膜を介して試料に一次線を照射する工程と、一次線の照射により試料から発生した二次線を、該膜と該一次線照射手段との間の空間を部分的に仕切るシャッターに照射させる工程と、これにより該シャッターから発生する三次的信号を検出する工程とを備える検査方法。
【請求項１１】
前記シャッターには、前記一次線が通過する孔が形成されていることを特徴とする請求項１０記載の検査方法。
【請求項１２】
前記シャッターには、受け皿構造が備えられていることを特徴とする請求項１０又は１１記載の検査方法。
【請求項１３】
前記膜の第一の面は、アクセス可能なように開放状態で試料を保持することを特徴とする請求項１０乃至１２何れか記載の検査方法。
【請求項１４】
前記膜の破壊の検知時には、前記シャッターを移動させ、前記空間内において前記一次線照射手段から前記膜に向かう一次線の照射経路を前記シャッターにより遮断することを特徴とする請求項１０乃至１３何れか記載の検査方法。
【請求項１５】
前記膜の第２の面に接する雰囲気の圧力上昇を検知することにより、前記膜の破壊を検知する特徴とする請求項１４記載の検査方法。
【請求項１６】
前記膜の第１の面が該膜の上面となっており、当該膜の第２の面が該膜の下面となっていることを特徴とする請求項１０乃至１５何れか記載の検査方法。
【請求項１７】
前記一次線は、荷電粒子線又は電子線であり、前記二次線は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであり、前記三次的信号は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１０乃至１６何れか記載の検査方法。
【請求項１】
第１の面に試料が保持される膜と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する真空室と、該真空室に接続され該膜を介して試料に一次線を照射する一次線照射手段と、該真空室内において該膜と該一次線照射手段との間に配置され、該一次線照射手段からの一次線が通過する構成を有するとともに、該膜と該一次線照射手段との間の空間を部分的に仕切るシャッターと、一次線の照射によって試料から発生する二次線が該膜を通過して該シャッターに到達し、これより該シャッターから発生する三次的信号を検出する信号検出手段とを備える検査装置。
【請求項２】
前記シャッターには、前記構成として、前記一次線が通過する孔が形成されていることを特徴とする請求項１記載の検査装置。
【請求項３】
前記シャッターには、受け皿構造が備えられていることを特徴とする請求項１又は２記載の検査装置。
【請求項４】
前記膜の第一の面は、アクセス可能なように開放状態で試料を保持することを特徴とする請求項１乃至３何れか記載の検査装置。
【請求項５】
前記膜の破壊を検知する膜破壊検知手段を備え、該膜破壊検知手段による前記膜の破壊の検知時には、前記シャッターを移動させ、前記空間内において前記一次線照射手段から前記膜に向かう一次線の照射経路を前記シャッターにより遮断することを特徴とする請求項１乃至４何れか記載の検査装置。
【請求項６】
前記膜破壊検知手段は、前記膜の破壊に伴う前記真空室内の圧力上昇を検知することを特徴とする請求項５記載の検査装置。
【請求項７】
前記膜の第１の面が該膜の上面となっており、当該膜の第２の面が該膜の下面となっていることを特徴とする請求項１乃至６何れか記載の検査装置。
【請求項８】
前記一次線は、荷電粒子線又は電子線であり、前記二次線は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであり、前記三次的信号は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１乃至７何れか記載の検査装置。
【請求項９】
請求項１乃至８何れか記載の検査装置により試料の検査を行うことを特徴とする検査方法。
【請求項１０】
膜の第１の面に試料を保持する工程と、該膜の第２の面に接する雰囲気を減圧する工程と、一次線照射手段により、該膜の第２の面側から該膜を介して試料に一次線を照射する工程と、一次線の照射により試料から発生した二次線を、該膜と該一次線照射手段との間の空間を部分的に仕切るシャッターに照射させる工程と、これにより該シャッターから発生する三次的信号を検出する工程とを備える検査方法。
【請求項１１】
前記シャッターには、前記一次線が通過する孔が形成されていることを特徴とする請求項１０記載の検査方法。
【請求項１２】
前記シャッターには、受け皿構造が備えられていることを特徴とする請求項１０又は１１記載の検査方法。
【請求項１３】
前記膜の第一の面は、アクセス可能なように開放状態で試料を保持することを特徴とする請求項１０乃至１２何れか記載の検査方法。
【請求項１４】
前記膜の破壊の検知時には、前記シャッターを移動させ、前記空間内において前記一次線照射手段から前記膜に向かう一次線の照射経路を前記シャッターにより遮断することを特徴とする請求項１０乃至１３何れか記載の検査方法。
【請求項１５】
前記膜の第２の面に接する雰囲気の圧力上昇を検知することにより、前記膜の破壊を検知する特徴とする請求項１４記載の検査方法。
【請求項１６】
前記膜の第１の面が該膜の上面となっており、当該膜の第２の面が該膜の下面となっていることを特徴とする請求項１０乃至１５何れか記載の検査方法。
【請求項１７】
前記一次線は、荷電粒子線又は電子線であり、前記二次線は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであり、前記三次的信号は、二次電子、反射電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光のうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１０乃至１６何れか記載の検査方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２３０４１７（Ｐ２０１０−２３０４１７Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７６９０８（Ｐ２００９−７６９０８）
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（０００００４２７１）日本電子株式会社 (811)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（０００００４２７１）日本電子株式会社 (811)
【Ｆターム（参考）】
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