試料中のブドウ球菌のメチシリン耐性を試験する方法
【課題】 生きたメチシリン耐性ブドウ球菌のメチシリン耐性を迅速に判定するために、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの迅速かつ高感度な検出方法を提供する。
【解決手段】 試料中のメチシリン耐性ブドウ球菌に由来するｍｅｃＡ ｍＲＮＡを、（１）前記ブドウ球菌をβ−ラクタム系抗生物質存在下でインキュベートして誘導する工程、（２）続いて、前記ブドウ球菌からｍｅｃＡ ｍＲＮＡを抽出する工程、（３）抽出されたｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程、からなる方法により検出する。同時に、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを高効率に増幅するためのプライマーセットを提供する。
【解決手段】 試料中のメチシリン耐性ブドウ球菌に由来するｍｅｃＡ ｍＲＮＡを、（１）前記ブドウ球菌をβ−ラクタム系抗生物質存在下でインキュベートして誘導する工程、（２）続いて、前記ブドウ球菌からｍｅｃＡ ｍＲＮＡを抽出する工程、（３）抽出されたｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程、からなる方法により検出する。同時に、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを高効率に増幅するためのプライマーセットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブドウ球菌のメチシリン耐性を迅速かつ高感度に判定するために、メチシリン耐性ブドウ球菌のメチシリン耐性遺伝子（ｍｅｃＡ） ｍＲＮＡを簡便、迅速、かつ高感度に測定する方法を提供する。したがって、本発明は、医学分野における感染症の診療において、ブドウ球菌等の薬剤感受性の試験、予防及び感染拡大防止のための薬剤感受性菌のモニタリング、薬剤感受性菌の治療効果モニタリング、さらには抗菌薬投与の指標のために有用である。また、微生物学、分子生物学、及び生化学などの分野における、薬剤耐性試験、薬剤耐性機構の解析、抗菌薬スクリーニング及びｍｅｃＡの発現解析のために有用である。
【背景技術】
【０００２】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、メチシリン耐性に係わる遺伝子ｍｅｃＡを獲得した黄色ブドウ球菌であり、幅広い抗生物質に対する耐性を示す。ｍｅｃＡは、ＰＢＰ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）−２’（ＰＢＰ−２ａとも呼ばれる）をコードする。通常、ＭＲＳＡ以外の黄色ブドウ球菌は、主として４種のＰＢＰ−１〜４を産生する。ＰＢＰは、細胞壁のペプチドグリカン合成のペプチド転移反応に係わるプロテアーゼ活性を有し、細胞壁合成に関与する。β−ラクタム系抗生物質は、ＰＢＰの活性部位に結合して前記活性を不活化するが、特に細胞増殖に必須なＰＢＰ−１〜３に対して強い親和性を有する。一方、ＰＢＰ−２’は、β−ラクタム系抗生物質との親和性が低いため、ＰＢＰ−２’産生菌以外のブドウ球菌に対しては致死的な量のβ−ラクタム系抗生物質が存在しても、細胞増殖に必須な前記活性を補完することが可能である（非特許文献１及び２）。
【０００３】
ＭＲＳＡは院内感染の主要な病原菌で、治療薬の切り札的存在とみなされているバンコマイシンに対しても耐性を示す菌株も検出されている（非特許文献３）。特に、高齢者や新生児など、抵抗力が低い易感染者に対する感染は依然として深刻な問題となっている。また、以前は、ＭＲＳＡが病院等の施設から市中に出ても、健常者にはほとんど感染しないと考えられていた。しかし、１９８０年代に市中で感染を起こす市中感染型ＭＲＳＡ（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＭＲＳＡ、ＣＡ−ＭＲＳＡ）が報告されて以来、ＣＡ−ＭＲＳＡは増加傾向にあり、さらに小児の肺炎、敗血症で死亡例が報告されるなど、公衆衛生上の大きな問題になっている（非特許文献４）。
【０００４】
一般に、黄色ブドウ球菌はコアグラーゼ陰性ブドウ球菌より強病原性といわれるためブドウ球菌の中でＭＲＳＡが重要視される傾向はあるが、表皮ブドウ球菌などのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の中で前記ｍｅｃＡ遺伝子を獲得したメチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＭＲ−ＣＮＳ）についても、易感染者に対する感染が重要視されるようになってきた（非特許文献５）。メチシリン耐性ブドウ球菌の院内感染や市中感染への対策として、鼻咽頭への定着菌の除菌、菌保有者の隔離、及び抗菌薬の選定等を迅速に実施する必要がある。そのため、臨床現場においては、診断、治療及び予防を目的として、簡便・迅速なメチシリン耐性菌の検出が望まれてきた。
【０００５】
メチシリン耐性を試験する方法としては、培養による薬剤感受性試験、ｍｅｃＡがコードするＰＢＰ−２'を抗ＰＢＰ−２'抗体を用いたイムノアッセイで検出する方法、ｍｅｃＡ又はｍｅｃＡと連鎖するＤＮＡをＰＣＲで増幅して検出する方法などが実施されている。
【０００６】
【特許文献１】特許第３７３５４００号
【特許文献２】特開平６−１６５６８１号
【特許文献３】特表２００４−５３４５３７号
【特許文献４】特許第２６５０１５９号
【特許文献５】特許第３１５２９２７号
【特許文献６】特許第３２４１７１７号
【特許文献７】特開２０００−１４４００号
【特許文献８】特開２００１−３７５００号
【特許文献９】特開２００１−３５３０００号
【特許文献１０】特開２００１−３３３７８３号
【非特許文献１】Ｃｈａｎｂｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１０（４），７８１−７９１．
【非特許文献２】Ｓｔｅｐｌｅｔｏｎ，Ｐ．Ｄ． ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．Ｗ．（２００２）Ｓｃｉ．Ｐｒｏｇ．，８５（Ｐｔ１），５７−７２．
【非特許文献３】Ｗｅｉｇｅｌ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０２，１５６９−１５７１．
【非特許文献４】山本 達男 他（２００８）モダンメディア，５４（３），９５−１０３．
【非特許文献５】辺 夏蓮 他（２００８）臨床病理，５６，９５５−９６０．
【非特許文献６】Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９（１０），２２４０−２２４４．
【非特許文献７】Ｉｔｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３９１，８７−１０２．
【非特許文献８】Ｈｕｌｅｔｓｋｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２（５），１８７５−１８８４．
【非特許文献９】Ｇｒｉｓｏｌｄ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４０（７），２３９２−２３９７．
【非特許文献１０】Ｆａｒｌｙ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６（２），７４３−７４６．
【非特許文献１１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，１２４７−１２５２．
【非特許文献１２】Ｗｅｌｌｅｒ，Ｔ．Ｍ．（１９９９）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４３，１５−２２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
薬剤感受性試験については、使用する薬剤や試験方法により判定がばらつくという問題が指摘されている。また、イムノアッセイによるＰＢＰ−２'の検出は、感度が十分ではなく、他法と乖離するという問題点が指摘されている（非特許文献５）。加えて、薬剤感受性試験やイムノアッセイは、いずれも検体の採取から判定まで４８時間以上を要し、院内感染や市中感染における感染者の隔離や投与薬の選定などで迅速な対応を求められる臨床現場への適用のために十分な性能とはいえなかった。一方、ｍｅｃＡ又はｍｅｃＡと連鎖する遺伝子をＰＣＲで増幅して検出する方法（特許文献１〜３、非特許文献６〜１０）の中には、数時間で検出可能な方法もあるが、ＰＣＲは、原則的に熱変性、プライマー・アニール、伸長反応からなる急激な温度サイクルを必要とし、システム化を考える場合に簡素化及び低コスト化のための大きな障壁となっていた。さらに、ｍｅｃＡは宿主の染色体ＤＮＡ上にあるが、ＤＮＡは一般に安定で、ブドウ球菌が死滅しても試料中に長時間にわたり存在し続けることが知られている。したがって、ＤＮＡを標的とするＰＣＲの場合、臨床的には意味のない死菌を検出してしまうという問題点がある。これに対し、ＲＮＡはＤＮＡに比して不安定であり、とりわけｍＲＮＡは菌が死ぬと速やかに分解されるため、ｍＲＮＡを標的とした場合は生菌を反映した結果が得られることが知られている。したがって、臨床的に意味のある、死滅していないブドウ球菌のメチシリン耐性を迅速・高感度に試験するためには、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを検出することが最も有効であるといえる。
【０００８】
ｍＲＮＡを検出する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を核酸増幅法として用いる方法が汎用されている。該増幅法は、通常、ｍＲＮＡを抽出後、抽出したＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する工程、及び、該ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し検出する工程、と二段階の工程（場合によってはさらに検出工程を別個に実施する必要がある）が必要であるため、操作の煩雑性や煩雑さに伴う二次汚染の危険性及び再現性の不良が問題とされる。また、前記薬剤感受性試験よりは迅速であるものの、前記二段階の工程を実施するのに通常２〜３時間以上が必要であり、複数の工程の実施による再現性不良、多数検体処理や検査コストの削減の点で問題があった。反応時間短縮のため、前記二工程を同時に行うワンステップＲＴ−ＰＣＲ法も開発されているが、各工程を別個に行うＲＴ−ＰＣＲ法に比べて検出感度の低下や非特異的増幅産物が産生されやすいことなどが指摘されている。さらに、ＰＣＲ法による増幅は２本鎖ＤＮＡを増幅するため、混入する染色体ＤＮＡを増幅してしまう可能性があり、厳密にｍＲＮＡのみを検出するためにはＤＮａｓｅ等による消化を行い染色体ＤＮＡを完全に除く必要があった。このため、操作の更なる煩雑化や再現性不良を招いていた。
【０００９】
一方、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法として、ＮＡＳＢＡ法（特許文献４及び５）、ＴＭＡ法（特許文献６）及びＴＲＣ法（特許文献７及び８、非特許文献１１）などが報告されている。これらのＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素及び必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、この２本鎖ＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の特定塩基配列を含むＲＮＡを生産し、このＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。
【００１０】
前記ＲＮＡ増幅法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、通常、ＮＡＳＢＡ法やＴＭＡ法ではその実施に９０分以上必要であり、迅速な結果を得るに至っていない。さらに、増幅工程は一定温度であるものの、通例は増幅工程前に変性のための加温（例えば、６５℃）が必要であり（特許文献５実施例１及び特許文献６実施例１に記載）、反応装置の省力化や低コスト化のための課題となっていた。
【００１１】
一定温度、一段階でＲＮＡを増幅・測定する方法として、ＴＲＣ法（特許文献７〜９、非特許文献１１）が挙げられる。当該方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識され、標的核酸と相補的に２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記２本鎖部分にインターカレートすることによって、蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブ存在下、前記ＲＮＡ増幅法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、プライマーなどの結合領域を標的ＲＮＡの（二次構造を計算して推定した）高次構造フリー領域に設定することで、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅及び測定を、同時にかつ迅速（３０分以内）、簡便に実施することが可能である（非特許文献１１）。このＲＮＡ増幅測定法は、前記ｍＲＮＡ検出法の中で、迅速性、簡便性、信頼性の点から、特に好適な方法といえる。ただし、該ＲＮＡ増幅測定法は、比較的一定の低温度（３５〜６０℃）で実施され、変性工程を伴わないため、標的ＲＮＡの高次構造の影響だけでなく、プライマーダイマー等の非特異的増幅の影響も受けやすいため、そのプライマーセットの設計には細心の配慮が必要で、汎用されているＰＣＲプライマー用の設計手法では不十分なことが明らかである。
【００１２】
ＴＲＣ法におけるｍｅｃＡ ｍＲＮＡ増幅測定方法のために設計されたプライマーの一例が特許文献９及び１０に開示されている。しかし、本発明者は、メチシリン耐性ブドウ球菌が抗生物質のプレッシャーのない条件に生育した場合、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡをほとんど発現しない場合があることを見出した。このような場合には、このプライマーセットとｍｅｃＡ ｍＲＮＡ検出に有効なＴＲＣ法によっても、検出は困難である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、試料中のブドウ球菌のメチシリン耐性を試験するための改良された方法を完成した。すなわち、本発明は、試料中のブドウ球菌のメチシリン耐性を試験する方法であって、（１）前記試料にβ−ラクタム系抗生物質を添加する工程、（２）前記試料からｍＲＮＡを含む核酸を抽出する工程、（３）抽出した核酸中のｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程、からなることを特徴とする、試料中のブドウ球菌のメチシリン耐性を試験する方法である。
【００１４】
本発明におけるｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程は、好ましくは（１）ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ＤＮＡ）が前記ｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ｍＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成する工程、（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー（ＤＮＡ）がハイブリダイズし（ここで前記第二または第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能な、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とする前記ＲＮＡを転写する工程（ここで、該ＲＮＡは、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物が生成される）及び、（５）前記転写されたＲＮＡを検出する工程、からなることを特徴とする。
【００１５】
本発明においては、好ましくは、前記第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなり、前記第二のプライマーが配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。なお、配列番号１で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端９８２番のＣから１００６番のＡまでの配列部分に相補的な塩基配列である。配列番号２で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１７６番のＴから１１９６番のＴまでの配列部分に相同的な塩基配列である。配列番号３で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１７８番のＴから１１９８番のＡまでの配列部分に相同的な塩基配列である。配列番号４で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１７２番のＡから１１９２番のＣまでの配列部分に相同的な塩基配列である。
【００１６】
本発明における前記転写されたＲＮＡを検出する工程は、好ましくは、検出されるべきＲＮＡ（標的ＲＮＡ）と相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で当該蛍光特性の変化を測定することによってなされる。この蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、配列番号５に示された配列又はその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である配列からなることを特徴とする。なお、配列番号５で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１０６８番のＡから１０４９番のＣまでの配列部分に相補的な塩基配列である。
【００１７】
より好ましくは、本発明における配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列は配列番号６で示された配列であり、前記配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列は配列番号７〜９で示された配列のいずれか一以上であることを特徴とする。
【００１８】
また本発明は、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅するための第一のプライマー及び第二のプライマーからなるプライマーセットであって、前記第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。
【００１９】
より好ましくは、本発明のプライマーセットにおける配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列は配列番号６で示された配列であり、前記配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列は配列番号７〜９で示された配列のいずれか一以上であることを特徴とする。
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明中の試料とは、鼻腔及び咽頭等のぬぐい液、血液、その他の分泌液、体液、組織洗浄液、液体培地及び寒天培地で培養した菌株である。本発明が試験の対象とするブドウ球菌とは、スタフィロコッカス属に属する菌種である。もっとも主要で臨床的にも重要な菌種としては、コアグラーゼ陽性の黄色ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性の表皮ブドウ球菌が挙げられるが、特に限定されるものでない。本明細書では、これらを単にブドウ球菌と記載し、特に必要がある場合を除いて区別しない。
【００２２】
本発明は、試料にβ−ラクタム系抗生物質を添加し、試料中のブドウ球菌にβ−ラクタム系抗生物質を接触させることでｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現を誘導するという構成に特徴を有する。この構成により、ブドウ球菌が増殖する条件やタンパク質を過剰に生産する条件で試料中のブドウ球菌をインキュベートする必要はなくなり、インキュベートに要する時間やブドウ球菌の増殖を待つ時間を省くことを可能としている。実施例に記載した形態では、本発明は３０分程度で実施可能である。ＰＢＰ−２’の誘導には４８時間以上のインキュベートが必要である（非特許文献２及び５）ことと比較すると、わずか３０分でメチシリン耐性を試験可能とする本発明は、メチシリン耐性ブドウ球菌のメチシリン耐性を迅速かつ高感度に試験するという、臨床の現場の要請に応えるものである。
【００２３】
β−ラクタム系抗生物質は、メチシリン類似の抗生物質であれば制限はない。例えば、β−ラクタム構造を有する抗生物質で、ペニシリン系及びセフェム系に属する抗生物質が例示できるが、比較的低濃度でもｍｅｃＡ ｍＲＮＡの誘導が可能な、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン又はジクロキサシリンなどのメチシリン類似のペニシリン系抗生物質から選ばれた少なくとも１つの抗生物質が好ましい。β−ラクタム系抗生物質を添加した後には、試料を適当に加温してｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現を誘導することが好ましい。なお、試料それ自体がブドウ球菌のｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現に不適当である場合には、ブドウ球菌が生育可能な液体培地に試料を添加するようにしても良い。なお、本発明では、この工程にてｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現を誘導できれば良いので、ブドウ球菌が増殖する条件やタンパク質を過剰に生産する培地、条件を採用する必要はない。β−ラクタム系抗生物質と接触させる時間は特に限定されないが、本発明ではブドウ球菌を増殖する必要がないため、３０分程度で実施可能である。
【００２４】
核酸を抽出する工程は、ｍＲＮＡを含む核酸を抽出できる、既知の方法が採用可能であり、特に限定されるものではない。ＲＮＡのみを分離・精製する方法である必要はないが、好ましくは、引き続き実施するｍｅｃＡ ｍＲＮＡの増幅と検出を阻害しない程度に純度の高いｍＲＮＡが得られれば良い。この核酸を抽出する工程においては、実際の抽出操作に先立って、試料中のブドウ球菌を溶菌酵素と接触させておくことが好ましい。溶菌酵素は、細胞壁構成成分を分解する作用を有する酵素ならば特に限定されないが、汎用されている、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、ラビアーゼ、リソスタフィン、ムタノリシンなどから選ばれた少なくとも１つの酵素であることが好ましい。
【００２５】
ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程では、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＴＲＣなどのＲＮＡの増幅法が使用可能であり、特に限定されないが、混入する染色体ＤＮＡの影響を受けず、迅速な試験のために一定温度で実施可能なＲＮＡ増幅法であるＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＴＲＣが特に好ましい。また当該工程では、既知の核酸検出方法が使用可能であるが、ハイブリダイズすることによって蛍光特性が変化するように設計された蛍光物質標識プローブを使用することが好ましい。該蛍光物質標識プローブとしては、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブやインターカレーター標識プローブなどが挙げられる。前記ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程における最も好適な方法は、前記したＴＲＣにおける一定温度、一段階でのＲＮＡの増幅工程において、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの増幅と同時に増幅されたｍｅｃＡ ＲＮＡ（特定塩基配列）をモニタリングできるインターカレーター標識プローブ（特許文献９及び非特許文献１１）の使用である。
【００２６】
本発明の好ましいｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程では、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ中の特定塩基配列を増幅し検出するが、この特定塩基配列とは、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを他のＲＮＡから識別し得る程度に特徴的な配列であって、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの塩基配列の中で、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列に相当するＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列を示す。言い換えれば、第一及び第二のプライマーは、前記したような特徴的な配列の前後に存在する、これもまたｍｅｃＡ ｍＲＮＡを他のＲＮＡから識別し得る程度に特徴的な配列に対してデザインされる。
【００２７】
本発明中のストリンジェントな条件とは特に限定されるものではなく、通常の状態と比較してＤＮＡ同士又はＤＮＡとＲＮＡが二重鎖を形成し難い条件をいうが、例えば、４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び７５ｍＭクエン酸ナトリウムが共存する条件等が挙げられる。本明細書中で単にハイブリダイズすると記載した場合、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることを意味するものである。なお、該条件におけるハイブリダイゼーションの十分な特異性や効率が得られる範囲内で、塩基の置換、欠失、付加、修飾等が可能であり、長さも任意に設定できることはいうまでもない。
【００２８】
本発明では、第一のプライマーは配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなり、前記第二のプライマーが配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。より具体的には、配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列としては配列番号６で示された配列、又は、配列番号６の少なくとも連続する１５塩基からなる配列を例示することができる。配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列としては配列番号７〜９で示された配列、又は、配列番号７〜９の少なくとも連続する１５塩基からなる配列のいずれか一以上であることを例示できる。
【００２９】
ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ＤＮＡ）がｍｅｃＡ ｍＲＮＡにハイブリダイズすると、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡが合成され、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖が生成する。この２本鎖はヘテロなものであることから、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、ＲＮＡは分解され、結果的に１本鎖ＤＮＡが生成することになる。この１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー（ＤＮＡ）がハイブリダイズすると、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能な、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡが生成される。第二のプライマーがその５’端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する場合、当該２本鎖ＤＮＡは前記特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なものとなり、第一のプライマーがその５’端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する場合、当該２本鎖ＤＮＡは前記特定塩基配列に相同的な配列のＲＮＡを転写可能なものとなる。プロモーター配列は既知のものなら特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用されるバクテリアファージ由来の、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼなどを使用することができる。
【００３０】
ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、上記のようにして生成した２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを転写するが、該ＲＮＡは、最初の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となるため、連鎖的にＲＮＡ転写産物が生成されることになる。
【００３１】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素、及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個又は種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素などが使用可能である。
【００３２】
以上のようにして転写されたＲＮＡを検出することにより、試料中のブドウ球菌のメチシリン耐性を試験することができるが、この検出には、例えば検出されるべきＲＮＡ（標的ＲＮＡ）と相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを使用することが提示できる。中でも、その共存下で前記増幅、検出の工程を実施可能なプローブを使用することが特に好ましい。その共存下で増幅、検出の工程を実施することが可能であれば、増幅を行いつつ、試料からの蛍光特性の変化を測定することによる検出を同時に実施して、リアルタイムモニタリングを実現できるからである。このような蛍光物質標識プローブとして、特に、インターカレーター性蛍光色素を適当なリンカーを介してオリゴヌクレオチドプローブと結合したインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを使用することが好ましい。インターカレーター性蛍光色素は２本鎖核酸にインターカレートし、蛍光増感を示すものであれば特に限定されないが、分子生物学分野で汎用されるオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロミド、及びこれらの誘導体が例示できる。これらは、適当な官能基を導入してリンカーと結合して使用すれば良い。オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは配列番号５に示された配列、又はその相補配列にハイブリダイズ可能な配列からなることが好ましい。更にオリゴヌクレオチドプローブは、前記増幅工程に共存させた場合にＤＮＡポリメラーゼの作用によってその３’末端からの伸長が起きないようにするため、そのＯＨ基を修飾しておくことが好ましい。修飾の手段としては、汎用されている既知の末端修飾であるグリコール酸付加、ビオチン化、アミノ化などが挙げられる。
【００３３】
本発明のｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程において、第一のプライマーの５’末端にプロモーター配列を付加した場合は、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ中の特定塩基配列の５’末端領域で当該ｍＲＮＡをトリミングすることが好ましい。該トリミングの手段としては、既知の特異的核酸切断法が利用可能であり、特に限定されるものではないが、前記ｍＲＮＡ中の特定塩基配列５’末端領域及びその５’末端のさらに５’末端側に隣接する領域に対してハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）（切断オリゴと呼ぶ）と、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を使用することが例示できる。前記特定塩基配列５’末端領域及びその５’末端に隣接する領域の長さは特に限定されないが、特定塩基配列の５’末端領域は５〜２０塩基、その５’末端に隣接する領域は５〜５０塩基が好ましい。例えば、第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列にハイブリダイズ可能な配列からなる場合、切断オリゴとして配列番号１０に示された配列中の少なくとも連続する１５塩基よりなる配列を使用することが例示できる。切断オリゴは、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡにハイブリダイズしてＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成するため、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素によってＲＮＡ部分が消化され、結果としてｍｅｃＡ ｍＲＮＡの特定塩基配列５’末端付近で切断される。引き続き、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によるｃＤＮＡ合成が行われると、該ｃＤＮＡの３’末端が規定され、当該ｃＤＮＡの３’末端領域に第一のプライマーがハイブリダイズした際に、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によるプロモーター（２本鎖ＤＮＡ）構造の構築が可能となる。
【００３４】
本発明は、前記したｍｅｃＡ ｍＲＮＡの増幅工程で使用することのできる、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを高効率に増幅するための第一及び第二のプライマーのセットであって、第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号２〜４から選ばれた塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。より具体的には、配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列としては配列番号６で示された配列、又は、配列番号６の少なくとも連続する１５塩基からなる配列を例示することができる。配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列としては配列番号７〜９で示された配列、又は、配列番号７〜９の少なくとも連続する１５塩基からなる配列のいずれか一以上であることを例示できる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明では、試料にβ−ラクタム系抗生物質を添加し、試料中のブドウ球菌にβ−ラクタム系抗生物質を接触させてｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現を誘導するという構成を採用したことで、メチシリン耐性であるにもかかわらず抗生物質のプレッシャーのない条件に生育したためにｍｅｃＡ ｍＲＮＡをほとんど発現しないという菌であっても、確実に検出することが可能である。
【００３６】
本発明は、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの増幅工程を低温度（３５〜６０℃）かつ一定で行うことができ、また好ましくインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ等を使用することによって検出の工程を前記増幅工程と同時に実施することができるため、昇温、下温を繰り返すために要する時間や変性処理に要する時間、更には増幅後に別途検出を行う時間等を省き、実施例に記載したように、３０分という極めて短時間の内に、迅速に実施をすることが可能である。しかも、ｍＲＮＡの検出によりメチシリン耐性を試験するため、死滅していないブドウ球菌のメチシリン耐性を試験することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは一例であり、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
プライマーセットの決定
以下の実施例で使用した標準ＲＮＡはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｙ００６８８として登録された配列の１番目〜２０１３番目を含む精製ＲＮＡであり、２６０ｎｍにおける吸光度から分子数（コピー数）を計算したものである。
以下の実施例で使用したインターカレーター標識プローブは、配列番号５からなり、５’末端から６番目のＧと７番目のＡの間のリン酸ジエステルにリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させた図１に示した構造を有する。
（１）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＰＣＲ ｔｕｂｅ ｗｉｔｈ ｄｏｍｅ ｃａｐ、ＳＳＩ社製）に分注し、これに、０コピー、３０コピー、及び１０＾６コピーの前記ＲＮＡを含有する試料５μＬを添加した。
【００３９】
反応液（２０μＬ）の組成
９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
２７ｍＭ 塩化マグネシウム
１５０ｍＭ 塩化カリウム
１．５ｍＭ ＤＴＴ
各０．３７５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各４．５ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
５．４ｍＭ ＩＴＰ
１．５μＭ 第一のプライマー（配列番号６、その５’末端にはＴ７プロモーター配列（配列番号１２、特開２００９−０１７８２４において配列番号１３として開示された配列の５’端１番のＡから２８番のＡまでの配列部分に相同的な配列）が付加されている。なお、配列番号６で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端９８２番のＣから１００６番のＡまでの配列部分に相同的な塩基配列であり、配列番号１の配列と相補的である）
１．５μＭ 第二のプライマー（配列番号７、８、９、１１より選ばれたプライマー、なお配列番号７で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１７６番のＴから１１９６番のＴまでの配列部分に相補的な塩基配列であり、配列番号２の配列と相補的である、配列番号８で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１７８番のＴから１１９８番のＡまでの配列部分に相補的な塩基配列であり、配列番号３の配列と相補的である、配列番号９で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１７２番のＡから１１９２番のＣまでの配列部分に相補的な塩基配列であり、配列番号４の配列と相補的である、配列番号１１で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１５６番のＡから１１７３番のＡまでの配列部分に相補的な塩基配列である）
０．２４μＭ 切断オリゴ（配列番号１０、該切断オリゴの３'末端はアミノ化されている。なお、配列番号１０で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端９３８番のＡから９８６番のＡまでの配列部分に相補的な塩基配列である）
３０ｎＭ インターカレーター標識プローブ（配列番号５）
６ユニット リボヌクレアーゼ インヒビター（タカラバイオ社製）
１９．５％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４０】
酵素液（５μＬ）の組成
１２％ ソルビトール
６．４ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）
１４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）
０．７２ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（東ソー社製）を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。酵素添加（反応開始）時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が有意な増加を示した（強度比１．２を超えた）時間を検出時間とし、増加を示さなかった場合を陰性判定とした。当該検出時間は、増幅効率や標的ＲＮＡコピー数と相関するため、以降の図において、検出時間が小さいほど、増幅効率が高い、又はＲＮＡコピー数が高いことを示す。各種プライマーセットを用い、前記試料を測定した場合の検出時間を図２に示した。ここで、第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号１１）からなるプライマーセット（図中の６−１１）は特許文献９に開示されたものである。図２から、第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号７）のプライマーセット（図中の６−７）、第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号８）のプライマーセット（図中の６−８）、第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号９）のプライマーセット（図中の６−９）のそれぞれを用いた場合、前記６−１１より検出時間が顕著に迅速化しており、既知のプライマーセットである前記６−１１に比べて、本発明のプライマーセット（６−７、６−８、６−９）を用いると増幅効率が向上することが示された。該６−７、６−８、６−９間では著しい差は認められないものの、中でも６−７は最も検出時間が短く、最も機能的であると考えられた。
【実施例２】
【００４１】
抗生物質非存在下におけるｍｅｃＡ ｍＲＮＡ発現の検討
β−ラクタム系抗生物質非存在下で生育したＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ７００６９９及びＡＴＣＣ ３３５９２）のｍｅｃＡ ｍＲＮＡ発現量を解析することとした。
（１）ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ７００６９９及びＡＴＣＣ ３３５９２）を、血液寒天培地（β−ラクタム系抗生物質非添加）及びＭＲＳＡ分離用寒天培地（セフェム系抗生物質含有）で培養した（３７℃、一夜）。
（２）コロニーを釣菌し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）−１ｍＭ ＥＤＴＡ中に懸濁し、１０倍希釈系列を調製した。なお、希釈系列の５０μＬをＭＲＳＡ分離用寒天培地にまいて（３７℃、一夜）ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ（ｃｆｕ）も計測した。
（３）前記希釈系列１００μＬをとり、アクロモペプチダーゼ（和光純薬社製）を添加し（終濃度０．５ｕｎｉｔｓ／μＬ）、３７℃、１０分間インキュベートした。
（４）これに、メーカープロトコールに従って、Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ（ニッポンジーン社製）を添加し、ＲＮＡ抽出を行った。
（５）得られたＲＮＡのペレットを５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ）に溶解し、ＲＮＡ試料とした。
（６）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＰＣＲ ｔｕｂｅ ｗｉｔｈ ｄｏｍｅ ｃａｐ、ＳＳＩ製）に分注し、これに、前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４２】
反応液（２０μＬ）の組成
９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
２７ｍＭ 塩化マグネシウム
１５０ｍＭ 塩化カリウム
１．５ｍＭ ＤＴＴ
各０．３７５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各４．５ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
５．４ｍＭ ＩＴＰ
１．５μＭ 第一のプライマー（配列番号６、その５’末端にはＴ７プロモーター配列（配列番号１２）が付加されている。）
１．５μＭ 第二のプライマー（配列番号７）
０．２４μＭ 切断オリゴ（配列番号１０、該切断オリゴの３'末端はアミノ化されている。）
３０ｎＭ インターカレーター標識プローブ（配列番号５）
６．０ユニット リボヌクレアーゼ インヒビター（タカラバイオ社製）
１９．５％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４３】
酵素液（５μＬ）の組成
１２％ ソルビトール
６．４ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）
１４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）
０．７２ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（東ソー社製）を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。酵素添加（反応開始）時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が有意な増加を示した（強度比１．２を超えた）時間を検出時間とし、増加を示さなかった場合を陰性判定とした。前記希釈系列由来のＲＮＡ試料を測定した場合の検出時間を図３（ＡＴＣＣ ３３５９２の結果をＡに、ＡＴＣＣ ７００６９９の結果をＢ）に示した。また、検出感度を調べるために、図３中のブロック矢印の点に相当するＲＮＡ試料の２倍希釈系列を調製し、測定した結果を図４に示した。図３から、ＡＴＣＣ ３３５９２及びＡＴＣＣ ７００６９は、いずれも、β−ラクタム系抗生物質有りに比べて無しの方が、１ＬＯＧ〜２ＬＯＧ程度低ｃｆｕ側にシフトし、すなわち、ＲＮＡ発現量が１／１０〜１／１００程度であった。さらに、図４から、前記株の検出感度は、β−ラクタム系抗生物質有りに比べて無しの方が２０〜７０倍程度不良であった。すなわち、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ検出において、ＭＲＳＡであっても抗生物質のプレッシャーのない条件で生育した菌株の中には、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現量が低く、高感度に検出できないものがあることが示唆された。
【実施例３】
【００４４】
ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの誘導の検討（１）
β−ラクタム系抗生物質非存在下で生育したＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９２）を、核酸抽出に先立ってβ−ラクタム系抗生物質存在下でインキュベートすることによって、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ発現量を誘導できるか検討することとした。
（１）ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９２）を、血液寒天培地（β−ラクタム系抗生物質非添加）で培養した（３７℃、一夜）。
（２）コロニーを釣菌し、終濃度１０μｇ／ｍＬオキサシリン（和光純薬社製）添加又はオキサシリン非添加トリプチケース・ソイ ブロス（ベクトン・ディッキンソン社製）中に懸濁した。各々の懸濁液から前記ブロスを用いて、それぞれ１０倍希釈系列（オキサシリン添加又はオキサシリン非添加）を調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。なお、インキュベート後、希釈系列の５０μＬをＭＲＳＡ分離用寒天培地にまいて（３７℃、一夜）ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ（ｃｆｕ）も計測した。
（３）前記希釈系列１００μＬをとり、アクロモペプチダーゼ（和光純薬社製）を添加し（終濃度０．５ｕｎｉｔｓ／μＬ）、３７℃、１０分間インキュベートした。
（４）これに、メーカープロトコールに従って、Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ（ニッポンジーン社製）を添加し、ＲＮＡ抽出を行った。
（５）得られたＲＮＡのペレットを５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）−１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し、ＲＮＡ試料とした。
（６）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＰＣＲ ｔｕｂｅ ｗｉｔｈ ｄｏｍｅ ｃａｐ、ＳＳＩ製）に分注し、これに、前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４５】
反応液（２０μＬ）の組成
９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
２７ｍＭ 塩化マグネシウム
１５０ｍＭ 塩化カリウム
１．５ｍＭ ＤＴＴ
各０．３７５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各４．５ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
５．４ｍＭ ＩＴＰ
１．５μＭ 第一のプライマー（配列番号６、その５’末端にはＴ７プロモーター配列（配列番号１２）が付加されている。）
１．５μＭ 第二のプライマー（配列番号７）
０．２４μＭ 切断オリゴ（配列番号１０、該切断オリゴの３'末端はアミノ化されている。）
３０ｎＭ インターカレーター標識プローブ （配列番号５）
６．０ユニット リボヌクレアーゼ インヒビター（タカラバイオ社製）
１９．５％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４６】
酵素液（５μＬ）の組成
１２％ ソルビトール
６．４ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）
１４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）
０．７２ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（東ソー社製）を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。酵素添加（反応開始）時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が有意な増加を示した（強度比１．２を超えた）時間を検出時間とし、増加を示さなかった場合を陰性判定とした。前記希釈系列由来のＲＮＡ試料を測定した場合の検出時間を図５Ａに示した。また、検出感度を調べるために、図５中のブロック矢印の点に相当するＲＮＡ試料の３倍希釈系列を調製し、測定した結果を図５Ｂに示した。図５Ａから、オキサシリン含有ブロスでインキュベートしたものはオキサシリン非添加の場合より、１．４ＬＯＧ程度高ｃｆｕ側にシフトし、ＲＮＡ発現量が２０倍以上に誘導されたと考えられた。さらに、図５Ｂから、検出感度は、オキサシリン含有ブロスでインキュベートした方がオキサシリン非添加に比べて、５０倍程度向上した。すなわち、抗生物質のプレッシャーのない条件で生育したＭＲＳＡであっても、β−ラクタム系抗生物質存在下で、３０分間インキュベートすれば、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現を誘導することが可能であり、結果として、メチシリン耐性菌を高感度に検出可能であることが示された。
【実施例４】
【００４７】
ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの誘導の検討（２）
β−ラクタム系抗生物質非存在下で生育したＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９２）を、核酸抽出に先立って異なる種類のβ−ラクタム系抗生物質存在下でインキュベートする場合に、抗生物質の種類によって、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ誘導に差があるか検討することとした。
（１）ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９２）を、血液寒天培地（β−ラクタム系抗生物質非添加）で培養した（３７℃、一夜）。
（２）１白金耳量を釣菌し、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）のトリプチケース・ソイ ブロス（ベクトン・ディッキンソン社製）２００μＬ中に懸濁した。各々の懸濁液を対応する前記ブロスにて、それぞれ１０＾５倍希釈し、３７℃で３０分間インキュベートした。
（ｉ）５μｇ／ｍＬ オキサシリン（ＯＸ）（和光純薬社製）含有トリプチケース・ソイ ブロス。
（ｉｉ）１０μｇ／ｍＬ オキサシリン（ＯＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。
（ｉｉｉ）２０μｇ／ｍＬ オキサシリン（ＯＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。
（ｉｖ）５μｇ／ｍＬ セフォキシチン（ＣＦＸ）（シグマ・アルドリッチ社製）含有トリプチケース・ソイ ブロス。
（ｖ）１０μｇ／ｍＬ セフォキシチン（ＣＦＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。
（ｖｉ）２０μｇ／ｍＬ セフォキシチン（ＣＦＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。
（ｖｉｉ）抗生物質非添加トリプチケース・ソイ ブロス。
（３）前記希釈液１００μＬをとり、メーカープロトコールに従って、ＥｘｔｒａｇｅｎII（東ソー社製）によるＲＮＡ抽出を行った。
（５）得られたＲＮＡのペレットを５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）−１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し、ＲＮＡ試料とした。
（６）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＰＣＲ ｔｕｂｅ ｗｉｔｈ ｄｏｍｅ ｃａｐ、ＳＳＩ製）に分注し、これに、前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４８】
反応液（２０μＬ）の組成
９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
２７ｍＭ 塩化マグネシウム
１５０ｍＭ 塩化カリウム
１．５ｍＭ ＤＴＴ
各０．３７５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各４．５ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
５．４ｍＭ ＩＴＰ
１．５μＭ 第一のプライマー（配列番号６、その５’末端にはＴ７プロモーター配列（配列番号１２）が付加されている。）
１．５μＭ 第二のプライマー（配列番号７）
０．２４μＭ 切断オリゴ（配列番号１０、該切断オリゴの３'末端はアミノ化されている。）
３０ｎＭ インターカレーター標識プローブ （配列番号５）
６．０ユニット リボヌクレアーゼ インヒビター（タカラバイオ社製）
１９．５％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４９】
酵素液（５μＬ）の組成
１２％ ソルビトール
６．４ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）
１４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）
０．７２ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（東ソー社製）を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。酵素添加（反応開始）時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が有意な増加を示した（強度比１．２を超えた）時間を検出時間とし、前記ＲＮＡ試料を測定した場合の検出時間を図６に示した。図６から、オキサシリンは５μｇ／ｍＬでもｍｅｃＡ ｍＲＮＡの誘導が起こっており、セフォキシチンは５〜２０μｇ／ｍＬで濃度増加に応じたｍｅｃＡ ｍＲＮＡ発現量の増加が認められた。オキサシリンに比べてセフォキシチンの誘導の程度は小さいが、セフォキシチンも２０μｇ／ｍＬ以上で用いればオキサシリンと同等の誘導が可能と推定された。すなわち、濃度は適切に設定する必要はあるが、いずれの抗生物質もわずか３０分間インキュベートするだけで前記ｍＲＮＡを誘導することが可能であった。β−ラクタム系抗生物質のうち、オキサシリンはメチシリン類似のペニシリン系抗生物質の典型的なもので、セフォキシチンはセフェム系抗生物質の典型的なものである。したがって、前記抗生物質と同様の作用機序や構造を有する他のβ−ラクタム系抗生物質を用いても本実施例と同様の結果が得られると考えられる。その中でも、オキサシリンに代表されるメチシリン類似のペニシリン系抗生物質は、低濃度で前記ｍＲＮＡを誘導できる点においてより有効である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ（インターカレーター標識プローブ）の構造を示した。リン酸ジエステルのリンにリンカーを介してオキサゾールイエローが結合している。Ｂ１〜Ｂ４は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はウラシルのいずれかを示す。
【図２】以下に示したプライマーセット（ｉ）〜（ｉｖ）を用い、０コピー（陰性、Ｎｅｇａ）、３０コピー、１０＾６コピーの標準ＲＮＡを添加した５μＬ試料を測定した時の検出時間（分間）（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）を示した。凡例は、ひし形が陰性、正方形が３０コピー、三角形が１０＾６コピーを示す。検出時間＞３０は反応時間３０分における陰性判定を表す。（ｉ）６−１１：第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号１１）からなるプライマーセット（特許文献９で開示）。（ｉｉ）６−７：第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号７）からなるプライマーセット。（ｉｉｉ）６−８：第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号８）からなるプライマーセット。（ｉｖ）６−９：第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号９）からなるプライマーセット。
【図３】β−ラクタム系抗生物質添加寒天培地（（＋）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）及びβ−ラクタム系抗生物質非添加寒天培地（（−）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）で生育したＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ７００６９９及びＡＴＣＣ ３３５９２）の１０倍希釈系列よりＲＮＡを抽出して、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを測定した場合の検出時間（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）を示した。横軸は、希釈系列１００μＬ中のｃｆｕの対数値（ＬＯＧ（ｃｆｕ／１００μＬ））、縦軸は検出時間（分間）を示す。凡例は、ひし形が抗生物質非添加、三角形が抗生物質添加を示す。検出時間＞３０は反応時間３０分における陰性判定を表す。ＡＴＣＣ ３３５９２を用いた結果をＡに、ＡＴＣＣ ７００６９９を用いた結果をＢに示した。
【図４】図３中のブロック矢印で指した点の抽出ＲＮＡ試料から、ＴＥで２倍希釈系列を調製し、測定した時の検出時間（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）を示した。横軸（対数目盛）は希釈率から計算したＭＲＳＡ希釈系列１００μＬ中のｃｆｕ（Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｃｆｕ／１００μＬ）を表す。図中（ ）内のｃｆｕ値は検出率２／２が得られた検出限界を示す。凡例は、丸がＡＴＣＣ ７００６９９の抗生物質非添加、ひし形がＡＴＣＣ ７００６９９の抗生物質添加、三角がＡＴＣＣ ３３５９２の抗生物質非添加、正方形がＡＴＣＣ３３５９２の抗生物質添加、を示す。検出時間＞３０は反応時間３０分における陰性判定を表す。
【図５】Ａの図には、β−ラクタム系抗生物質非添加寒天培地で生育したＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９２）を用い、β−ラクタム系抗生物質添加液体培地（（＋）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）及びβ−ラクタム系抗生物質非添加液体培地（（−）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）で１０倍希釈系列を調製し、３７℃、３０分間インキュベートした後、ＲＮＡを抽出してｍｅｃＡ ｍＲＮＡを測定した場合の検出時間（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）を示した。横軸は、希釈系列１００μＬ中のｃｆｕの対数値（ＬＯＧ（ｃｆｕ／１００μＬ））、縦軸は検出時間（分間）を示す。Ａの図中のブロック矢印で指した点の抽出ＲＮＡ試料から、ＴＥにより３倍希釈系列を調製し、測定した時の検出時間をＢに示した。横軸（対数目盛）は希釈率から計算したＭＲＳＡ希釈系列１００μＬ中のｃｆｕ（Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｃｆｕ／１００μＬ）を表す。図中（ ）内のｃｆｕ値は検出率２／２が得られた検出限界を示す。凡例は、ひし形が抗生物質非添加、三角形が抗生物質添加を示す。検出時間＞３０は反応時間３０分における陰性判定を表す。
【図６】β−ラクタム系抗生物質非添加寒天培地で生育したＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９２）を、以下に示した（ｉ）〜（ｖｉｉ）の液体培地に懸濁し、３７℃、３０分間インキュベートした後、ＲＮＡを抽出してｍｅｃＡ ｍＲＮＡを測定した場合の検出時間（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）を示した。検出時間＞３０は反応時間３０分における陰性判定を表す。（ｉ）５μｇ／ｍＬ オキサシリン（ＯＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。（ｉｉ）１０μｇ／ｍＬ オキサシリン（ＯＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。（ｉｉｉ）２０μｇ／ｍＬ オキサシリン（ＯＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。（ｉｖ）５μｇ／ｍＬ セフォキシチン（ＣＦＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。（ｖ）１０μｇ／ｍＬ セフォキシチン（ＣＦＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。（ｖｉ）２０μｇ／ｍＬ セフォキシチン（ＣＦＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。（ｖｉｉ）抗生物質非添加トリプチケース・ソイ ブロス（（−）ＡＢ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブドウ球菌のメチシリン耐性を迅速かつ高感度に判定するために、メチシリン耐性ブドウ球菌のメチシリン耐性遺伝子（ｍｅｃＡ） ｍＲＮＡを簡便、迅速、かつ高感度に測定する方法を提供する。したがって、本発明は、医学分野における感染症の診療において、ブドウ球菌等の薬剤感受性の試験、予防及び感染拡大防止のための薬剤感受性菌のモニタリング、薬剤感受性菌の治療効果モニタリング、さらには抗菌薬投与の指標のために有用である。また、微生物学、分子生物学、及び生化学などの分野における、薬剤耐性試験、薬剤耐性機構の解析、抗菌薬スクリーニング及びｍｅｃＡの発現解析のために有用である。
【背景技術】
【０００２】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、メチシリン耐性に係わる遺伝子ｍｅｃＡを獲得した黄色ブドウ球菌であり、幅広い抗生物質に対する耐性を示す。ｍｅｃＡは、ＰＢＰ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）−２’（ＰＢＰ−２ａとも呼ばれる）をコードする。通常、ＭＲＳＡ以外の黄色ブドウ球菌は、主として４種のＰＢＰ−１〜４を産生する。ＰＢＰは、細胞壁のペプチドグリカン合成のペプチド転移反応に係わるプロテアーゼ活性を有し、細胞壁合成に関与する。β−ラクタム系抗生物質は、ＰＢＰの活性部位に結合して前記活性を不活化するが、特に細胞増殖に必須なＰＢＰ−１〜３に対して強い親和性を有する。一方、ＰＢＰ−２’は、β−ラクタム系抗生物質との親和性が低いため、ＰＢＰ−２’産生菌以外のブドウ球菌に対しては致死的な量のβ−ラクタム系抗生物質が存在しても、細胞増殖に必須な前記活性を補完することが可能である（非特許文献１及び２）。
【０００３】
ＭＲＳＡは院内感染の主要な病原菌で、治療薬の切り札的存在とみなされているバンコマイシンに対しても耐性を示す菌株も検出されている（非特許文献３）。特に、高齢者や新生児など、抵抗力が低い易感染者に対する感染は依然として深刻な問題となっている。また、以前は、ＭＲＳＡが病院等の施設から市中に出ても、健常者にはほとんど感染しないと考えられていた。しかし、１９８０年代に市中で感染を起こす市中感染型ＭＲＳＡ（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＭＲＳＡ、ＣＡ−ＭＲＳＡ）が報告されて以来、ＣＡ−ＭＲＳＡは増加傾向にあり、さらに小児の肺炎、敗血症で死亡例が報告されるなど、公衆衛生上の大きな問題になっている（非特許文献４）。
【０００４】
一般に、黄色ブドウ球菌はコアグラーゼ陰性ブドウ球菌より強病原性といわれるためブドウ球菌の中でＭＲＳＡが重要視される傾向はあるが、表皮ブドウ球菌などのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の中で前記ｍｅｃＡ遺伝子を獲得したメチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＭＲ−ＣＮＳ）についても、易感染者に対する感染が重要視されるようになってきた（非特許文献５）。メチシリン耐性ブドウ球菌の院内感染や市中感染への対策として、鼻咽頭への定着菌の除菌、菌保有者の隔離、及び抗菌薬の選定等を迅速に実施する必要がある。そのため、臨床現場においては、診断、治療及び予防を目的として、簡便・迅速なメチシリン耐性菌の検出が望まれてきた。
【０００５】
メチシリン耐性を試験する方法としては、培養による薬剤感受性試験、ｍｅｃＡがコードするＰＢＰ−２'を抗ＰＢＰ−２'抗体を用いたイムノアッセイで検出する方法、ｍｅｃＡ又はｍｅｃＡと連鎖するＤＮＡをＰＣＲで増幅して検出する方法などが実施されている。
【０００６】
【特許文献１】特許第３７３５４００号
【特許文献２】特開平６−１６５６８１号
【特許文献３】特表２００４−５３４５３７号
【特許文献４】特許第２６５０１５９号
【特許文献５】特許第３１５２９２７号
【特許文献６】特許第３２４１７１７号
【特許文献７】特開２０００−１４４００号
【特許文献８】特開２００１−３７５００号
【特許文献９】特開２００１−３５３０００号
【特許文献１０】特開２００１−３３３７８３号
【非特許文献１】Ｃｈａｎｂｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１０（４），７８１−７９１．
【非特許文献２】Ｓｔｅｐｌｅｔｏｎ，Ｐ．Ｄ． ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．Ｗ．（２００２）Ｓｃｉ．Ｐｒｏｇ．，８５（Ｐｔ１），５７−７２．
【非特許文献３】Ｗｅｉｇｅｌ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０２，１５６９−１５７１．
【非特許文献４】山本 達男 他（２００８）モダンメディア，５４（３），９５−１０３．
【非特許文献５】辺 夏蓮 他（２００８）臨床病理，５６，９５５−９６０．
【非特許文献６】Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９（１０），２２４０−２２４４．
【非特許文献７】Ｉｔｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３９１，８７−１０２．
【非特許文献８】Ｈｕｌｅｔｓｋｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２（５），１８７５−１８８４．
【非特許文献９】Ｇｒｉｓｏｌｄ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４０（７），２３９２−２３９７．
【非特許文献１０】Ｆａｒｌｙ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６（２），７４３−７４６．
【非特許文献１１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，１２４７−１２５２．
【非特許文献１２】Ｗｅｌｌｅｒ，Ｔ．Ｍ．（１９９９）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４３，１５−２２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
薬剤感受性試験については、使用する薬剤や試験方法により判定がばらつくという問題が指摘されている。また、イムノアッセイによるＰＢＰ−２'の検出は、感度が十分ではなく、他法と乖離するという問題点が指摘されている（非特許文献５）。加えて、薬剤感受性試験やイムノアッセイは、いずれも検体の採取から判定まで４８時間以上を要し、院内感染や市中感染における感染者の隔離や投与薬の選定などで迅速な対応を求められる臨床現場への適用のために十分な性能とはいえなかった。一方、ｍｅｃＡ又はｍｅｃＡと連鎖する遺伝子をＰＣＲで増幅して検出する方法（特許文献１〜３、非特許文献６〜１０）の中には、数時間で検出可能な方法もあるが、ＰＣＲは、原則的に熱変性、プライマー・アニール、伸長反応からなる急激な温度サイクルを必要とし、システム化を考える場合に簡素化及び低コスト化のための大きな障壁となっていた。さらに、ｍｅｃＡは宿主の染色体ＤＮＡ上にあるが、ＤＮＡは一般に安定で、ブドウ球菌が死滅しても試料中に長時間にわたり存在し続けることが知られている。したがって、ＤＮＡを標的とするＰＣＲの場合、臨床的には意味のない死菌を検出してしまうという問題点がある。これに対し、ＲＮＡはＤＮＡに比して不安定であり、とりわけｍＲＮＡは菌が死ぬと速やかに分解されるため、ｍＲＮＡを標的とした場合は生菌を反映した結果が得られることが知られている。したがって、臨床的に意味のある、死滅していないブドウ球菌のメチシリン耐性を迅速・高感度に試験するためには、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを検出することが最も有効であるといえる。
【０００８】
ｍＲＮＡを検出する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を核酸増幅法として用いる方法が汎用されている。該増幅法は、通常、ｍＲＮＡを抽出後、抽出したＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する工程、及び、該ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し検出する工程、と二段階の工程（場合によってはさらに検出工程を別個に実施する必要がある）が必要であるため、操作の煩雑性や煩雑さに伴う二次汚染の危険性及び再現性の不良が問題とされる。また、前記薬剤感受性試験よりは迅速であるものの、前記二段階の工程を実施するのに通常２〜３時間以上が必要であり、複数の工程の実施による再現性不良、多数検体処理や検査コストの削減の点で問題があった。反応時間短縮のため、前記二工程を同時に行うワンステップＲＴ−ＰＣＲ法も開発されているが、各工程を別個に行うＲＴ−ＰＣＲ法に比べて検出感度の低下や非特異的増幅産物が産生されやすいことなどが指摘されている。さらに、ＰＣＲ法による増幅は２本鎖ＤＮＡを増幅するため、混入する染色体ＤＮＡを増幅してしまう可能性があり、厳密にｍＲＮＡのみを検出するためにはＤＮａｓｅ等による消化を行い染色体ＤＮＡを完全に除く必要があった。このため、操作の更なる煩雑化や再現性不良を招いていた。
【０００９】
一方、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法として、ＮＡＳＢＡ法（特許文献４及び５）、ＴＭＡ法（特許文献６）及びＴＲＣ法（特許文献７及び８、非特許文献１１）などが報告されている。これらのＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素及び必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、この２本鎖ＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の特定塩基配列を含むＲＮＡを生産し、このＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。
【００１０】
前記ＲＮＡ増幅法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、通常、ＮＡＳＢＡ法やＴＭＡ法ではその実施に９０分以上必要であり、迅速な結果を得るに至っていない。さらに、増幅工程は一定温度であるものの、通例は増幅工程前に変性のための加温（例えば、６５℃）が必要であり（特許文献５実施例１及び特許文献６実施例１に記載）、反応装置の省力化や低コスト化のための課題となっていた。
【００１１】
一定温度、一段階でＲＮＡを増幅・測定する方法として、ＴＲＣ法（特許文献７〜９、非特許文献１１）が挙げられる。当該方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識され、標的核酸と相補的に２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記２本鎖部分にインターカレートすることによって、蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブ存在下、前記ＲＮＡ増幅法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、プライマーなどの結合領域を標的ＲＮＡの（二次構造を計算して推定した）高次構造フリー領域に設定することで、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅及び測定を、同時にかつ迅速（３０分以内）、簡便に実施することが可能である（非特許文献１１）。このＲＮＡ増幅測定法は、前記ｍＲＮＡ検出法の中で、迅速性、簡便性、信頼性の点から、特に好適な方法といえる。ただし、該ＲＮＡ増幅測定法は、比較的一定の低温度（３５〜６０℃）で実施され、変性工程を伴わないため、標的ＲＮＡの高次構造の影響だけでなく、プライマーダイマー等の非特異的増幅の影響も受けやすいため、そのプライマーセットの設計には細心の配慮が必要で、汎用されているＰＣＲプライマー用の設計手法では不十分なことが明らかである。
【００１２】
ＴＲＣ法におけるｍｅｃＡ ｍＲＮＡ増幅測定方法のために設計されたプライマーの一例が特許文献９及び１０に開示されている。しかし、本発明者は、メチシリン耐性ブドウ球菌が抗生物質のプレッシャーのない条件に生育した場合、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡをほとんど発現しない場合があることを見出した。このような場合には、このプライマーセットとｍｅｃＡ ｍＲＮＡ検出に有効なＴＲＣ法によっても、検出は困難である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、試料中のブドウ球菌のメチシリン耐性を試験するための改良された方法を完成した。すなわち、本発明は、試料中のブドウ球菌のメチシリン耐性を試験する方法であって、（１）前記試料にβ−ラクタム系抗生物質を添加する工程、（２）前記試料からｍＲＮＡを含む核酸を抽出する工程、（３）抽出した核酸中のｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程、からなることを特徴とする、試料中のブドウ球菌のメチシリン耐性を試験する方法である。
【００１４】
本発明におけるｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程は、好ましくは（１）ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ＤＮＡ）が前記ｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ｍＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成する工程、（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー（ＤＮＡ）がハイブリダイズし（ここで前記第二または第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能な、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とする前記ＲＮＡを転写する工程（ここで、該ＲＮＡは、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物が生成される）及び、（５）前記転写されたＲＮＡを検出する工程、からなることを特徴とする。
【００１５】
本発明においては、好ましくは、前記第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなり、前記第二のプライマーが配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。なお、配列番号１で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端９８２番のＣから１００６番のＡまでの配列部分に相補的な塩基配列である。配列番号２で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１７６番のＴから１１９６番のＴまでの配列部分に相同的な塩基配列である。配列番号３で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１７８番のＴから１１９８番のＡまでの配列部分に相同的な塩基配列である。配列番号４で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１７２番のＡから１１９２番のＣまでの配列部分に相同的な塩基配列である。
【００１６】
本発明における前記転写されたＲＮＡを検出する工程は、好ましくは、検出されるべきＲＮＡ（標的ＲＮＡ）と相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で当該蛍光特性の変化を測定することによってなされる。この蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、配列番号５に示された配列又はその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である配列からなることを特徴とする。なお、配列番号５で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１０６８番のＡから１０４９番のＣまでの配列部分に相補的な塩基配列である。
【００１７】
より好ましくは、本発明における配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列は配列番号６で示された配列であり、前記配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列は配列番号７〜９で示された配列のいずれか一以上であることを特徴とする。
【００１８】
また本発明は、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅するための第一のプライマー及び第二のプライマーからなるプライマーセットであって、前記第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。
【００１９】
より好ましくは、本発明のプライマーセットにおける配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列は配列番号６で示された配列であり、前記配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列は配列番号７〜９で示された配列のいずれか一以上であることを特徴とする。
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明中の試料とは、鼻腔及び咽頭等のぬぐい液、血液、その他の分泌液、体液、組織洗浄液、液体培地及び寒天培地で培養した菌株である。本発明が試験の対象とするブドウ球菌とは、スタフィロコッカス属に属する菌種である。もっとも主要で臨床的にも重要な菌種としては、コアグラーゼ陽性の黄色ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性の表皮ブドウ球菌が挙げられるが、特に限定されるものでない。本明細書では、これらを単にブドウ球菌と記載し、特に必要がある場合を除いて区別しない。
【００２２】
本発明は、試料にβ−ラクタム系抗生物質を添加し、試料中のブドウ球菌にβ−ラクタム系抗生物質を接触させることでｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現を誘導するという構成に特徴を有する。この構成により、ブドウ球菌が増殖する条件やタンパク質を過剰に生産する条件で試料中のブドウ球菌をインキュベートする必要はなくなり、インキュベートに要する時間やブドウ球菌の増殖を待つ時間を省くことを可能としている。実施例に記載した形態では、本発明は３０分程度で実施可能である。ＰＢＰ−２’の誘導には４８時間以上のインキュベートが必要である（非特許文献２及び５）ことと比較すると、わずか３０分でメチシリン耐性を試験可能とする本発明は、メチシリン耐性ブドウ球菌のメチシリン耐性を迅速かつ高感度に試験するという、臨床の現場の要請に応えるものである。
【００２３】
β−ラクタム系抗生物質は、メチシリン類似の抗生物質であれば制限はない。例えば、β−ラクタム構造を有する抗生物質で、ペニシリン系及びセフェム系に属する抗生物質が例示できるが、比較的低濃度でもｍｅｃＡ ｍＲＮＡの誘導が可能な、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン又はジクロキサシリンなどのメチシリン類似のペニシリン系抗生物質から選ばれた少なくとも１つの抗生物質が好ましい。β−ラクタム系抗生物質を添加した後には、試料を適当に加温してｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現を誘導することが好ましい。なお、試料それ自体がブドウ球菌のｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現に不適当である場合には、ブドウ球菌が生育可能な液体培地に試料を添加するようにしても良い。なお、本発明では、この工程にてｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現を誘導できれば良いので、ブドウ球菌が増殖する条件やタンパク質を過剰に生産する培地、条件を採用する必要はない。β−ラクタム系抗生物質と接触させる時間は特に限定されないが、本発明ではブドウ球菌を増殖する必要がないため、３０分程度で実施可能である。
【００２４】
核酸を抽出する工程は、ｍＲＮＡを含む核酸を抽出できる、既知の方法が採用可能であり、特に限定されるものではない。ＲＮＡのみを分離・精製する方法である必要はないが、好ましくは、引き続き実施するｍｅｃＡ ｍＲＮＡの増幅と検出を阻害しない程度に純度の高いｍＲＮＡが得られれば良い。この核酸を抽出する工程においては、実際の抽出操作に先立って、試料中のブドウ球菌を溶菌酵素と接触させておくことが好ましい。溶菌酵素は、細胞壁構成成分を分解する作用を有する酵素ならば特に限定されないが、汎用されている、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、ラビアーゼ、リソスタフィン、ムタノリシンなどから選ばれた少なくとも１つの酵素であることが好ましい。
【００２５】
ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程では、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＴＲＣなどのＲＮＡの増幅法が使用可能であり、特に限定されないが、混入する染色体ＤＮＡの影響を受けず、迅速な試験のために一定温度で実施可能なＲＮＡ増幅法であるＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＴＲＣが特に好ましい。また当該工程では、既知の核酸検出方法が使用可能であるが、ハイブリダイズすることによって蛍光特性が変化するように設計された蛍光物質標識プローブを使用することが好ましい。該蛍光物質標識プローブとしては、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブやインターカレーター標識プローブなどが挙げられる。前記ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程における最も好適な方法は、前記したＴＲＣにおける一定温度、一段階でのＲＮＡの増幅工程において、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの増幅と同時に増幅されたｍｅｃＡ ＲＮＡ（特定塩基配列）をモニタリングできるインターカレーター標識プローブ（特許文献９及び非特許文献１１）の使用である。
【００２６】
本発明の好ましいｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程では、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ中の特定塩基配列を増幅し検出するが、この特定塩基配列とは、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを他のＲＮＡから識別し得る程度に特徴的な配列であって、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの塩基配列の中で、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列に相当するＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列を示す。言い換えれば、第一及び第二のプライマーは、前記したような特徴的な配列の前後に存在する、これもまたｍｅｃＡ ｍＲＮＡを他のＲＮＡから識別し得る程度に特徴的な配列に対してデザインされる。
【００２７】
本発明中のストリンジェントな条件とは特に限定されるものではなく、通常の状態と比較してＤＮＡ同士又はＤＮＡとＲＮＡが二重鎖を形成し難い条件をいうが、例えば、４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び７５ｍＭクエン酸ナトリウムが共存する条件等が挙げられる。本明細書中で単にハイブリダイズすると記載した場合、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることを意味するものである。なお、該条件におけるハイブリダイゼーションの十分な特異性や効率が得られる範囲内で、塩基の置換、欠失、付加、修飾等が可能であり、長さも任意に設定できることはいうまでもない。
【００２８】
本発明では、第一のプライマーは配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなり、前記第二のプライマーが配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。より具体的には、配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列としては配列番号６で示された配列、又は、配列番号６の少なくとも連続する１５塩基からなる配列を例示することができる。配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列としては配列番号７〜９で示された配列、又は、配列番号７〜９の少なくとも連続する１５塩基からなる配列のいずれか一以上であることを例示できる。
【００２９】
ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ＤＮＡ）がｍｅｃＡ ｍＲＮＡにハイブリダイズすると、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡが合成され、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖が生成する。この２本鎖はヘテロなものであることから、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、ＲＮＡは分解され、結果的に１本鎖ＤＮＡが生成することになる。この１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー（ＤＮＡ）がハイブリダイズすると、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能な、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡが生成される。第二のプライマーがその５’端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する場合、当該２本鎖ＤＮＡは前記特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なものとなり、第一のプライマーがその５’端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する場合、当該２本鎖ＤＮＡは前記特定塩基配列に相同的な配列のＲＮＡを転写可能なものとなる。プロモーター配列は既知のものなら特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用されるバクテリアファージ由来の、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼなどを使用することができる。
【００３０】
ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、上記のようにして生成した２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを転写するが、該ＲＮＡは、最初の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となるため、連鎖的にＲＮＡ転写産物が生成されることになる。
【００３１】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素、及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個又は種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素などが使用可能である。
【００３２】
以上のようにして転写されたＲＮＡを検出することにより、試料中のブドウ球菌のメチシリン耐性を試験することができるが、この検出には、例えば検出されるべきＲＮＡ（標的ＲＮＡ）と相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを使用することが提示できる。中でも、その共存下で前記増幅、検出の工程を実施可能なプローブを使用することが特に好ましい。その共存下で増幅、検出の工程を実施することが可能であれば、増幅を行いつつ、試料からの蛍光特性の変化を測定することによる検出を同時に実施して、リアルタイムモニタリングを実現できるからである。このような蛍光物質標識プローブとして、特に、インターカレーター性蛍光色素を適当なリンカーを介してオリゴヌクレオチドプローブと結合したインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを使用することが好ましい。インターカレーター性蛍光色素は２本鎖核酸にインターカレートし、蛍光増感を示すものであれば特に限定されないが、分子生物学分野で汎用されるオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロミド、及びこれらの誘導体が例示できる。これらは、適当な官能基を導入してリンカーと結合して使用すれば良い。オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは配列番号５に示された配列、又はその相補配列にハイブリダイズ可能な配列からなることが好ましい。更にオリゴヌクレオチドプローブは、前記増幅工程に共存させた場合にＤＮＡポリメラーゼの作用によってその３’末端からの伸長が起きないようにするため、そのＯＨ基を修飾しておくことが好ましい。修飾の手段としては、汎用されている既知の末端修飾であるグリコール酸付加、ビオチン化、アミノ化などが挙げられる。
【００３３】
本発明のｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程において、第一のプライマーの５’末端にプロモーター配列を付加した場合は、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ中の特定塩基配列の５’末端領域で当該ｍＲＮＡをトリミングすることが好ましい。該トリミングの手段としては、既知の特異的核酸切断法が利用可能であり、特に限定されるものではないが、前記ｍＲＮＡ中の特定塩基配列５’末端領域及びその５’末端のさらに５’末端側に隣接する領域に対してハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）（切断オリゴと呼ぶ）と、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を使用することが例示できる。前記特定塩基配列５’末端領域及びその５’末端に隣接する領域の長さは特に限定されないが、特定塩基配列の５’末端領域は５〜２０塩基、その５’末端に隣接する領域は５〜５０塩基が好ましい。例えば、第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列にハイブリダイズ可能な配列からなる場合、切断オリゴとして配列番号１０に示された配列中の少なくとも連続する１５塩基よりなる配列を使用することが例示できる。切断オリゴは、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡにハイブリダイズしてＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成するため、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素によってＲＮＡ部分が消化され、結果としてｍｅｃＡ ｍＲＮＡの特定塩基配列５’末端付近で切断される。引き続き、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によるｃＤＮＡ合成が行われると、該ｃＤＮＡの３’末端が規定され、当該ｃＤＮＡの３’末端領域に第一のプライマーがハイブリダイズした際に、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によるプロモーター（２本鎖ＤＮＡ）構造の構築が可能となる。
【００３４】
本発明は、前記したｍｅｃＡ ｍＲＮＡの増幅工程で使用することのできる、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを高効率に増幅するための第一及び第二のプライマーのセットであって、第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号２〜４から選ばれた塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。より具体的には、配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列としては配列番号６で示された配列、又は、配列番号６の少なくとも連続する１５塩基からなる配列を例示することができる。配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列としては配列番号７〜９で示された配列、又は、配列番号７〜９の少なくとも連続する１５塩基からなる配列のいずれか一以上であることを例示できる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明では、試料にβ−ラクタム系抗生物質を添加し、試料中のブドウ球菌にβ−ラクタム系抗生物質を接触させてｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現を誘導するという構成を採用したことで、メチシリン耐性であるにもかかわらず抗生物質のプレッシャーのない条件に生育したためにｍｅｃＡ ｍＲＮＡをほとんど発現しないという菌であっても、確実に検出することが可能である。
【００３６】
本発明は、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの増幅工程を低温度（３５〜６０℃）かつ一定で行うことができ、また好ましくインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ等を使用することによって検出の工程を前記増幅工程と同時に実施することができるため、昇温、下温を繰り返すために要する時間や変性処理に要する時間、更には増幅後に別途検出を行う時間等を省き、実施例に記載したように、３０分という極めて短時間の内に、迅速に実施をすることが可能である。しかも、ｍＲＮＡの検出によりメチシリン耐性を試験するため、死滅していないブドウ球菌のメチシリン耐性を試験することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは一例であり、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
プライマーセットの決定
以下の実施例で使用した標準ＲＮＡはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｙ００６８８として登録された配列の１番目〜２０１３番目を含む精製ＲＮＡであり、２６０ｎｍにおける吸光度から分子数（コピー数）を計算したものである。
以下の実施例で使用したインターカレーター標識プローブは、配列番号５からなり、５’末端から６番目のＧと７番目のＡの間のリン酸ジエステルにリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させた図１に示した構造を有する。
（１）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＰＣＲ ｔｕｂｅ ｗｉｔｈ ｄｏｍｅ ｃａｐ、ＳＳＩ社製）に分注し、これに、０コピー、３０コピー、及び１０＾６コピーの前記ＲＮＡを含有する試料５μＬを添加した。
【００３９】
反応液（２０μＬ）の組成
９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
２７ｍＭ 塩化マグネシウム
１５０ｍＭ 塩化カリウム
１．５ｍＭ ＤＴＴ
各０．３７５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各４．５ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
５．４ｍＭ ＩＴＰ
１．５μＭ 第一のプライマー（配列番号６、その５’末端にはＴ７プロモーター配列（配列番号１２、特開２００９−０１７８２４において配列番号１３として開示された配列の５’端１番のＡから２８番のＡまでの配列部分に相同的な配列）が付加されている。なお、配列番号６で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端９８２番のＣから１００６番のＡまでの配列部分に相同的な塩基配列であり、配列番号１の配列と相補的である）
１．５μＭ 第二のプライマー（配列番号７、８、９、１１より選ばれたプライマー、なお配列番号７で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１７６番のＴから１１９６番のＴまでの配列部分に相補的な塩基配列であり、配列番号２の配列と相補的である、配列番号８で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１７８番のＴから１１９８番のＡまでの配列部分に相補的な塩基配列であり、配列番号３の配列と相補的である、配列番号９で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１７２番のＡから１１９２番のＣまでの配列部分に相補的な塩基配列であり、配列番号４の配列と相補的である、配列番号１１で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端１１５６番のＡから１１７３番のＡまでの配列部分に相補的な塩基配列である）
０．２４μＭ 切断オリゴ（配列番号１０、該切断オリゴの３'末端はアミノ化されている。なお、配列番号１０で示された塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｙ００６８８の５’端９３８番のＡから９８６番のＡまでの配列部分に相補的な塩基配列である）
３０ｎＭ インターカレーター標識プローブ（配列番号５）
６ユニット リボヌクレアーゼ インヒビター（タカラバイオ社製）
１９．５％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４０】
酵素液（５μＬ）の組成
１２％ ソルビトール
６．４ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）
１４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）
０．７２ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（東ソー社製）を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。酵素添加（反応開始）時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が有意な増加を示した（強度比１．２を超えた）時間を検出時間とし、増加を示さなかった場合を陰性判定とした。当該検出時間は、増幅効率や標的ＲＮＡコピー数と相関するため、以降の図において、検出時間が小さいほど、増幅効率が高い、又はＲＮＡコピー数が高いことを示す。各種プライマーセットを用い、前記試料を測定した場合の検出時間を図２に示した。ここで、第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号１１）からなるプライマーセット（図中の６−１１）は特許文献９に開示されたものである。図２から、第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号７）のプライマーセット（図中の６−７）、第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号８）のプライマーセット（図中の６−８）、第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号９）のプライマーセット（図中の６−９）のそれぞれを用いた場合、前記６−１１より検出時間が顕著に迅速化しており、既知のプライマーセットである前記６−１１に比べて、本発明のプライマーセット（６−７、６−８、６−９）を用いると増幅効率が向上することが示された。該６−７、６−８、６−９間では著しい差は認められないものの、中でも６−７は最も検出時間が短く、最も機能的であると考えられた。
【実施例２】
【００４１】
抗生物質非存在下におけるｍｅｃＡ ｍＲＮＡ発現の検討
β−ラクタム系抗生物質非存在下で生育したＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ７００６９９及びＡＴＣＣ ３３５９２）のｍｅｃＡ ｍＲＮＡ発現量を解析することとした。
（１）ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ７００６９９及びＡＴＣＣ ３３５９２）を、血液寒天培地（β−ラクタム系抗生物質非添加）及びＭＲＳＡ分離用寒天培地（セフェム系抗生物質含有）で培養した（３７℃、一夜）。
（２）コロニーを釣菌し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）−１ｍＭ ＥＤＴＡ中に懸濁し、１０倍希釈系列を調製した。なお、希釈系列の５０μＬをＭＲＳＡ分離用寒天培地にまいて（３７℃、一夜）ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ（ｃｆｕ）も計測した。
（３）前記希釈系列１００μＬをとり、アクロモペプチダーゼ（和光純薬社製）を添加し（終濃度０．５ｕｎｉｔｓ／μＬ）、３７℃、１０分間インキュベートした。
（４）これに、メーカープロトコールに従って、Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ（ニッポンジーン社製）を添加し、ＲＮＡ抽出を行った。
（５）得られたＲＮＡのペレットを５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ）に溶解し、ＲＮＡ試料とした。
（６）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＰＣＲ ｔｕｂｅ ｗｉｔｈ ｄｏｍｅ ｃａｐ、ＳＳＩ製）に分注し、これに、前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４２】
反応液（２０μＬ）の組成
９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
２７ｍＭ 塩化マグネシウム
１５０ｍＭ 塩化カリウム
１．５ｍＭ ＤＴＴ
各０．３７５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各４．５ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
５．４ｍＭ ＩＴＰ
１．５μＭ 第一のプライマー（配列番号６、その５’末端にはＴ７プロモーター配列（配列番号１２）が付加されている。）
１．５μＭ 第二のプライマー（配列番号７）
０．２４μＭ 切断オリゴ（配列番号１０、該切断オリゴの３'末端はアミノ化されている。）
３０ｎＭ インターカレーター標識プローブ（配列番号５）
６．０ユニット リボヌクレアーゼ インヒビター（タカラバイオ社製）
１９．５％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４３】
酵素液（５μＬ）の組成
１２％ ソルビトール
６．４ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）
１４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）
０．７２ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（東ソー社製）を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。酵素添加（反応開始）時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が有意な増加を示した（強度比１．２を超えた）時間を検出時間とし、増加を示さなかった場合を陰性判定とした。前記希釈系列由来のＲＮＡ試料を測定した場合の検出時間を図３（ＡＴＣＣ ３３５９２の結果をＡに、ＡＴＣＣ ７００６９９の結果をＢ）に示した。また、検出感度を調べるために、図３中のブロック矢印の点に相当するＲＮＡ試料の２倍希釈系列を調製し、測定した結果を図４に示した。図３から、ＡＴＣＣ ３３５９２及びＡＴＣＣ ７００６９は、いずれも、β−ラクタム系抗生物質有りに比べて無しの方が、１ＬＯＧ〜２ＬＯＧ程度低ｃｆｕ側にシフトし、すなわち、ＲＮＡ発現量が１／１０〜１／１００程度であった。さらに、図４から、前記株の検出感度は、β−ラクタム系抗生物質有りに比べて無しの方が２０〜７０倍程度不良であった。すなわち、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ検出において、ＭＲＳＡであっても抗生物質のプレッシャーのない条件で生育した菌株の中には、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現量が低く、高感度に検出できないものがあることが示唆された。
【実施例３】
【００４４】
ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの誘導の検討（１）
β−ラクタム系抗生物質非存在下で生育したＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９２）を、核酸抽出に先立ってβ−ラクタム系抗生物質存在下でインキュベートすることによって、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ発現量を誘導できるか検討することとした。
（１）ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９２）を、血液寒天培地（β−ラクタム系抗生物質非添加）で培養した（３７℃、一夜）。
（２）コロニーを釣菌し、終濃度１０μｇ／ｍＬオキサシリン（和光純薬社製）添加又はオキサシリン非添加トリプチケース・ソイ ブロス（ベクトン・ディッキンソン社製）中に懸濁した。各々の懸濁液から前記ブロスを用いて、それぞれ１０倍希釈系列（オキサシリン添加又はオキサシリン非添加）を調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。なお、インキュベート後、希釈系列の５０μＬをＭＲＳＡ分離用寒天培地にまいて（３７℃、一夜）ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ（ｃｆｕ）も計測した。
（３）前記希釈系列１００μＬをとり、アクロモペプチダーゼ（和光純薬社製）を添加し（終濃度０．５ｕｎｉｔｓ／μＬ）、３７℃、１０分間インキュベートした。
（４）これに、メーカープロトコールに従って、Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ（ニッポンジーン社製）を添加し、ＲＮＡ抽出を行った。
（５）得られたＲＮＡのペレットを５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）−１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し、ＲＮＡ試料とした。
（６）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＰＣＲ ｔｕｂｅ ｗｉｔｈ ｄｏｍｅ ｃａｐ、ＳＳＩ製）に分注し、これに、前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４５】
反応液（２０μＬ）の組成
９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
２７ｍＭ 塩化マグネシウム
１５０ｍＭ 塩化カリウム
１．５ｍＭ ＤＴＴ
各０．３７５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各４．５ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
５．４ｍＭ ＩＴＰ
１．５μＭ 第一のプライマー（配列番号６、その５’末端にはＴ７プロモーター配列（配列番号１２）が付加されている。）
１．５μＭ 第二のプライマー（配列番号７）
０．２４μＭ 切断オリゴ（配列番号１０、該切断オリゴの３'末端はアミノ化されている。）
３０ｎＭ インターカレーター標識プローブ （配列番号５）
６．０ユニット リボヌクレアーゼ インヒビター（タカラバイオ社製）
１９．５％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４６】
酵素液（５μＬ）の組成
１２％ ソルビトール
６．４ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）
１４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）
０．７２ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（東ソー社製）を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。酵素添加（反応開始）時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が有意な増加を示した（強度比１．２を超えた）時間を検出時間とし、増加を示さなかった場合を陰性判定とした。前記希釈系列由来のＲＮＡ試料を測定した場合の検出時間を図５Ａに示した。また、検出感度を調べるために、図５中のブロック矢印の点に相当するＲＮＡ試料の３倍希釈系列を調製し、測定した結果を図５Ｂに示した。図５Ａから、オキサシリン含有ブロスでインキュベートしたものはオキサシリン非添加の場合より、１．４ＬＯＧ程度高ｃｆｕ側にシフトし、ＲＮＡ発現量が２０倍以上に誘導されたと考えられた。さらに、図５Ｂから、検出感度は、オキサシリン含有ブロスでインキュベートした方がオキサシリン非添加に比べて、５０倍程度向上した。すなわち、抗生物質のプレッシャーのない条件で生育したＭＲＳＡであっても、β−ラクタム系抗生物質存在下で、３０分間インキュベートすれば、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの発現を誘導することが可能であり、結果として、メチシリン耐性菌を高感度に検出可能であることが示された。
【実施例４】
【００４７】
ｍｅｃＡ ｍＲＮＡの誘導の検討（２）
β−ラクタム系抗生物質非存在下で生育したＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９２）を、核酸抽出に先立って異なる種類のβ−ラクタム系抗生物質存在下でインキュベートする場合に、抗生物質の種類によって、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ誘導に差があるか検討することとした。
（１）ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９２）を、血液寒天培地（β−ラクタム系抗生物質非添加）で培養した（３７℃、一夜）。
（２）１白金耳量を釣菌し、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）のトリプチケース・ソイ ブロス（ベクトン・ディッキンソン社製）２００μＬ中に懸濁した。各々の懸濁液を対応する前記ブロスにて、それぞれ１０＾５倍希釈し、３７℃で３０分間インキュベートした。
（ｉ）５μｇ／ｍＬ オキサシリン（ＯＸ）（和光純薬社製）含有トリプチケース・ソイ ブロス。
（ｉｉ）１０μｇ／ｍＬ オキサシリン（ＯＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。
（ｉｉｉ）２０μｇ／ｍＬ オキサシリン（ＯＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。
（ｉｖ）５μｇ／ｍＬ セフォキシチン（ＣＦＸ）（シグマ・アルドリッチ社製）含有トリプチケース・ソイ ブロス。
（ｖ）１０μｇ／ｍＬ セフォキシチン（ＣＦＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。
（ｖｉ）２０μｇ／ｍＬ セフォキシチン（ＣＦＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。
（ｖｉｉ）抗生物質非添加トリプチケース・ソイ ブロス。
（３）前記希釈液１００μＬをとり、メーカープロトコールに従って、ＥｘｔｒａｇｅｎII（東ソー社製）によるＲＮＡ抽出を行った。
（５）得られたＲＮＡのペレットを５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）−１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し、ＲＮＡ試料とした。
（６）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＰＣＲ ｔｕｂｅ ｗｉｔｈ ｄｏｍｅ ｃａｐ、ＳＳＩ製）に分注し、これに、前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４８】
反応液（２０μＬ）の組成
９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
２７ｍＭ 塩化マグネシウム
１５０ｍＭ 塩化カリウム
１．５ｍＭ ＤＴＴ
各０．３７５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各４．５ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
５．４ｍＭ ＩＴＰ
１．５μＭ 第一のプライマー（配列番号６、その５’末端にはＴ７プロモーター配列（配列番号１２）が付加されている。）
１．５μＭ 第二のプライマー（配列番号７）
０．２４μＭ 切断オリゴ（配列番号１０、該切断オリゴの３'末端はアミノ化されている。）
３０ｎＭ インターカレーター標識プローブ （配列番号５）
６．０ユニット リボヌクレアーゼ インヒビター（タカラバイオ社製）
１９．５％ ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４９】
酵素液（５μＬ）の組成
１２％ ソルビトール
６．４ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （ライフサイエンス社製）
１４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （インビトロジェン社製）
０．７２ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（東ソー社製）を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。酵素添加（反応開始）時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が有意な増加を示した（強度比１．２を超えた）時間を検出時間とし、前記ＲＮＡ試料を測定した場合の検出時間を図６に示した。図６から、オキサシリンは５μｇ／ｍＬでもｍｅｃＡ ｍＲＮＡの誘導が起こっており、セフォキシチンは５〜２０μｇ／ｍＬで濃度増加に応じたｍｅｃＡ ｍＲＮＡ発現量の増加が認められた。オキサシリンに比べてセフォキシチンの誘導の程度は小さいが、セフォキシチンも２０μｇ／ｍＬ以上で用いればオキサシリンと同等の誘導が可能と推定された。すなわち、濃度は適切に設定する必要はあるが、いずれの抗生物質もわずか３０分間インキュベートするだけで前記ｍＲＮＡを誘導することが可能であった。β−ラクタム系抗生物質のうち、オキサシリンはメチシリン類似のペニシリン系抗生物質の典型的なもので、セフォキシチンはセフェム系抗生物質の典型的なものである。したがって、前記抗生物質と同様の作用機序や構造を有する他のβ−ラクタム系抗生物質を用いても本実施例と同様の結果が得られると考えられる。その中でも、オキサシリンに代表されるメチシリン類似のペニシリン系抗生物質は、低濃度で前記ｍＲＮＡを誘導できる点においてより有効である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ（インターカレーター標識プローブ）の構造を示した。リン酸ジエステルのリンにリンカーを介してオキサゾールイエローが結合している。Ｂ１〜Ｂ４は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はウラシルのいずれかを示す。
【図２】以下に示したプライマーセット（ｉ）〜（ｉｖ）を用い、０コピー（陰性、Ｎｅｇａ）、３０コピー、１０＾６コピーの標準ＲＮＡを添加した５μＬ試料を測定した時の検出時間（分間）（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）を示した。凡例は、ひし形が陰性、正方形が３０コピー、三角形が１０＾６コピーを示す。検出時間＞３０は反応時間３０分における陰性判定を表す。（ｉ）６−１１：第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号１１）からなるプライマーセット（特許文献９で開示）。（ｉｉ）６−７：第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号７）からなるプライマーセット。（ｉｉｉ）６−８：第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号８）からなるプライマーセット。（ｉｖ）６−９：第一のプライマー（配列番号６）及び第二のプライマー（配列番号９）からなるプライマーセット。
【図３】β−ラクタム系抗生物質添加寒天培地（（＋）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）及びβ−ラクタム系抗生物質非添加寒天培地（（−）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）で生育したＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ７００６９９及びＡＴＣＣ ３３５９２）の１０倍希釈系列よりＲＮＡを抽出して、ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを測定した場合の検出時間（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）を示した。横軸は、希釈系列１００μＬ中のｃｆｕの対数値（ＬＯＧ（ｃｆｕ／１００μＬ））、縦軸は検出時間（分間）を示す。凡例は、ひし形が抗生物質非添加、三角形が抗生物質添加を示す。検出時間＞３０は反応時間３０分における陰性判定を表す。ＡＴＣＣ ３３５９２を用いた結果をＡに、ＡＴＣＣ ７００６９９を用いた結果をＢに示した。
【図４】図３中のブロック矢印で指した点の抽出ＲＮＡ試料から、ＴＥで２倍希釈系列を調製し、測定した時の検出時間（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）を示した。横軸（対数目盛）は希釈率から計算したＭＲＳＡ希釈系列１００μＬ中のｃｆｕ（Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｃｆｕ／１００μＬ）を表す。図中（ ）内のｃｆｕ値は検出率２／２が得られた検出限界を示す。凡例は、丸がＡＴＣＣ ７００６９９の抗生物質非添加、ひし形がＡＴＣＣ ７００６９９の抗生物質添加、三角がＡＴＣＣ ３３５９２の抗生物質非添加、正方形がＡＴＣＣ３３５９２の抗生物質添加、を示す。検出時間＞３０は反応時間３０分における陰性判定を表す。
【図５】Ａの図には、β−ラクタム系抗生物質非添加寒天培地で生育したＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９２）を用い、β−ラクタム系抗生物質添加液体培地（（＋）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）及びβ−ラクタム系抗生物質非添加液体培地（（−）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）で１０倍希釈系列を調製し、３７℃、３０分間インキュベートした後、ＲＮＡを抽出してｍｅｃＡ ｍＲＮＡを測定した場合の検出時間（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）を示した。横軸は、希釈系列１００μＬ中のｃｆｕの対数値（ＬＯＧ（ｃｆｕ／１００μＬ））、縦軸は検出時間（分間）を示す。Ａの図中のブロック矢印で指した点の抽出ＲＮＡ試料から、ＴＥにより３倍希釈系列を調製し、測定した時の検出時間をＢに示した。横軸（対数目盛）は希釈率から計算したＭＲＳＡ希釈系列１００μＬ中のｃｆｕ（Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｃｆｕ／１００μＬ）を表す。図中（ ）内のｃｆｕ値は検出率２／２が得られた検出限界を示す。凡例は、ひし形が抗生物質非添加、三角形が抗生物質添加を示す。検出時間＞３０は反応時間３０分における陰性判定を表す。
【図６】β−ラクタム系抗生物質非添加寒天培地で生育したＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９２）を、以下に示した（ｉ）〜（ｖｉｉ）の液体培地に懸濁し、３７℃、３０分間インキュベートした後、ＲＮＡを抽出してｍｅｃＡ ｍＲＮＡを測定した場合の検出時間（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）を示した。検出時間＞３０は反応時間３０分における陰性判定を表す。（ｉ）５μｇ／ｍＬ オキサシリン（ＯＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。（ｉｉ）１０μｇ／ｍＬ オキサシリン（ＯＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。（ｉｉｉ）２０μｇ／ｍＬ オキサシリン（ＯＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。（ｉｖ）５μｇ／ｍＬ セフォキシチン（ＣＦＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。（ｖ）１０μｇ／ｍＬ セフォキシチン（ＣＦＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。（ｖｉ）２０μｇ／ｍＬ セフォキシチン（ＣＦＸ）含有トリプチケース・ソイ ブロス。（ｖｉｉ）抗生物質非添加トリプチケース・ソイ ブロス（（−）ＡＢ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のブドウ球菌のメチシリン耐性を試験する方法であって、
（１）前記試料にβ−ラクタム系抗生物質を添加する工程、
（２）前記試料からｍＲＮＡを含む核酸を抽出する工程、
（３）抽出した核酸中のメチシリン耐性遺伝子（以下、ｍｅｃＡと記す）ｍＲＮＡを増幅し検出する工程、
からなることを特徴とする、試料中のブドウ球菌のメチシリン耐性を試験する方法。
【請求項２】
前記ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程が、
（１）ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ＤＮＡ）が前記ｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ｍＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー（ＤＮＡ）がハイブリダイズし（ここで前記第二または第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能な、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とする前記ＲＮＡを転写する工程（ここで、該ＲＮＡは、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物が生成される）及び、
（５）前記転写されたＲＮＡを検出する工程、
からなることを特徴とする請求項１に記載の試験方法。
【請求項３】
前記第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなり、前記第二のプライマーが配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記転写されたＲＮＡを検出する工程が、検出されるべきＲＮＡ（標的ＲＮＡ）と相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で当該蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする請求項２に記載の試験方法。
【請求項５】
前記蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号５に示された配列又はその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である配列からなることを特徴とする請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列が配列番号６で示された配列であり、前記配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列が配列番号７〜９で示された配列のいずれか一以上であることを特徴とする請求項３に記載の検出方法。
【請求項７】
ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅するための第一のプライマー及び第二のプライマーからなるプライマーセットであって、前記第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであることを特徴とするプライマーセット。
【請求項８】
前記配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列が配列番号６で示された配列であり、前記配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列が配列番号７〜９で示された配列のいずれか一以上であることを特徴とする請求項７に記載のプライマーセット。
【請求項１】
試料中のブドウ球菌のメチシリン耐性を試験する方法であって、
（１）前記試料にβ−ラクタム系抗生物質を添加する工程、
（２）前記試料からｍＲＮＡを含む核酸を抽出する工程、
（３）抽出した核酸中のメチシリン耐性遺伝子（以下、ｍｅｃＡと記す）ｍＲＮＡを増幅し検出する工程、
からなることを特徴とする、試料中のブドウ球菌のメチシリン耐性を試験する方法。
【請求項２】
前記ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅し検出する工程が、
（１）ｍｅｃＡ ｍＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ＤＮＡ）が前記ｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ｍＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー（ＤＮＡ）がハイブリダイズし（ここで前記第二または第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能な、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とする前記ＲＮＡを転写する工程（ここで、該ＲＮＡは、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物が生成される）及び、
（５）前記転写されたＲＮＡを検出する工程、
からなることを特徴とする請求項１に記載の試験方法。
【請求項３】
前記第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなり、前記第二のプライマーが配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記転写されたＲＮＡを検出する工程が、検出されるべきＲＮＡ（標的ＲＮＡ）と相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で当該蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする請求項２に記載の試験方法。
【請求項５】
前記蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号５に示された配列又はその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である配列からなることを特徴とする請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列が配列番号６で示された配列であり、前記配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列が配列番号７〜９で示された配列のいずれか一以上であることを特徴とする請求項３に記載の検出方法。
【請求項７】
ｍｅｃＡ ｍＲＮＡを増幅するための第一のプライマー及び第二のプライマーからなるプライマーセットであって、前記第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであることを特徴とするプライマーセット。
【請求項８】
前記配列番号１で示された塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列が配列番号６で示された配列であり、前記配列番号２〜４から選ばれた一の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列が配列番号７〜９で示された配列のいずれか一以上であることを特徴とする請求項７に記載のプライマーセット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−４５３１５（Ｐ２０１１−４５３１５Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９７８０１（Ｐ２００９−１９７８０１）
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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