試料分析用試薬、試料分析用試薬キット及び試料分析方法
【課題】試料中の有核赤血球及び好塩基球を他の白血球からより明確に弁別し、計数することができる試料測定用試薬及び試料測定方法を提供することを課題とする。
【解決手段】全炭素数が４〜８のアルコールと、一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される蛍光色素の少なくとも１種とを含む好塩基球及び／又は有核赤血球を測定するための試料分析用試薬により上記の課題を解決する。
【解決手段】全炭素数が４〜８のアルコールと、一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される蛍光色素の少なくとも１種とを含む好塩基球及び／又は有核赤血球を測定するための試料分析用試薬により上記の課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体から採取された試料中の血球を分析するための試料分析用試薬、試料分析用試薬キット及び試料分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査分野において、試料中の血球成分の分析は、被験者の循環器等における様々な疾患を診断する上で非常に有用である。疾患によっては、特定の血球数が増加又は減少したり、通常では存在しない血液細胞が末梢血に出現したりすることがある。
近年、フローサイトメトリの原理を応用した種々の自動血球計数装置が市販されており、血球細胞の分類・計数は、一般検査室で行なわれている。これらの自動血球計数装置を用いると、試料中の白血球の分類・計数を自動で行うことができる。
【０００３】
白血球の分類・計数を行うには、まず、血液試料中の赤血球を溶解して試料を調製する。調製した試料を検出器に導き、電気インピーダンス信号を検出することにより、白血球を３種類に分類することができる。一方、白血球は、通常、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球の５種類が存在する。白血球は、赤血球溶解処理に加えてさらに蛍光染色を行い、蛍光染色された血球に励起光を照射し、該染色された血球から発せられる蛍光信号及び散乱光信号を検出し、解析することで５種類に分類することができる。好塩基球は通常数が少ないため、一度の測定で白血球を５種類に分類するよりも、好塩基球が酸性条件下では他の白血球に比べて破壊されにくいといった特性を利用して、血液試料を好塩基球測定専用に処理を行って好塩基球数測定を行い（特許文献１参照）、他の方法で得られた白血球分類結果と組み合わせて、より正確に白血球５分類を行うことができる。
【０００４】
なお、白血球測定でしばしば問題になるのは有核赤血球の出現である。有核赤血球は核を持つため、赤血球溶解処理を行っても核が残存し、上記のような測定においてリンパ球に近い信号を有するため、これが白血球数の測定時にプラスの誤差を与える。この影響を排除するには、有核赤血球測定専用の処理を行って有核赤血球数の測定を行い（特許文献２参照）、別の方法で得られた白血球数から有核赤血球を差し引くことで正確な白血球数を得ることができる。
【０００５】
しかしながら、正確な白血球分類を行うために、特定の血球専用の処理を増やすと、手間がかかる上に、装置が複雑化或いは大型化するおそれがある。また、特定の血球測定専用試薬を複数使用すると、血液検査全体のコストが高くなる。このような観点から、特定の血球専用の処理はできるだけ少ない方が好ましい。
【０００６】
ところで、好塩基球も有核赤血球も、血液試料を酸性条件下で処理することによって測定を行うことができる。従って、血液試料を酸性条件下で処理すれば、一回の測定で好塩基球と有核赤血球の両方を測定できる可能性がある。このような試みの１つとして、特許文献３（特開２００２−１４８２６１号公報）には、白血球及び異常細胞を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤と界面活性剤とを含む水溶液を試料と混合し、蛍光色素を含む染色液を加えて染色し、フローサイトメータで測定して蛍光強度及び散乱光強度を測定することにより、好塩基球及び赤芽球（有核赤血球）を測定できることが記載されている。
【特許文献１】特公平６−８８１７号公報
【特許文献２】特開平１０−３３９７２９号公報
【特許文献３】特開２００２−１４８２６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記のような従来の方法では、白血球数が多い検体などでは、好塩基球と好塩基球以外の白血球との分離がよくないことがある。
本発明の目的は、試料中の有核赤血球及び好塩基球を他の白血球からより明確に弁別し、計数することができる試料測定用試薬及び試料測定方法を提供することである。
【０００８】
本発明者らは、上記の現状に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、全炭素数４〜８のアルコールを特定の界面活性剤及び蛍光色素とともに含む試料分析用試薬用いることにより、好塩基球を好塩基球以外の白血球成分からより明確に弁別することが可能であることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
よって本発明は、好塩基球及び／又は有核赤血球を測定するための試料分析用試薬であって、
全炭素数が４〜８のアルコールと、
一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
Ｒ1及びＲ2は互いに同一又は異なってアルキル基であり；
【００１０】
【化２】
であり；
【００１１】
【化３】
であり；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は互いに同一又は異なって、水素原子又はアルキル基であり；
Ｘ-はアニオンである）
の蛍光色素、及び一般式（ＩＩ）：
【００１２】
【化４】
（式中、
Ｒ7及びＲ8は互いに同一又は異なって酸性基を有していてもよいアルキル基であり；
【００１３】
【化５】
であり；
【００１４】
【化６】
【００１５】
であり；
Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は互いに同一又は異なって、水素原子又は酸性基であるが、
但し、Ｒ7〜Ｒ12のいずれか１つには酸性基が存在し；
Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基は塩を形成していてもよいが、但し、Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基のうちいずれか１つは、プロトンを放出した遊離酸の基である）
の蛍光色素から選択される少なくとも１種の蛍光色素とを含む試料分析用試薬である。
【００１６】
また、本発明は、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与える界面活性剤と全炭素数が４〜８のアルコールとを含む溶液と、上記の一般式（Ｉ）の蛍光色素及び一般式（ＩＩ）の蛍光色素の少なくとも１種の蛍光色素を含む溶液とを含む、好塩基球及び／又は有核赤血球を測定するための試料分析用試薬キットである。
【００１７】
さらに、本発明は、全炭素数が４〜８のアルコールと、上記の一般式（Ｉ）の蛍光色素及び一般式（ＩＩ）の蛍光色素の少なくとも１種の蛍光色素とにより、試料中の血球を染色する工程；前記染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程；及び前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球及び／又は有核赤血球を計数する工程を含む、試料分析方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、有核赤血球と好塩基球を他の血球成分からより明確に弁別し、計数することが可能になり、疾患の検査・診断をより正確に行うことが可能になる。本発明では、一度の測定で有核赤血球と好塩基球を計数できるが、検査目的によっては、有核赤血球と好塩基球の何れか一方のみを測定すればよい場合もある。そのような場合でも、何れか一方のみを測定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明により測定することができる好塩基球は、塩基性色素により染色される大型の酸性顆粒を有する白血球の一種である。また、有核赤血球は、一般的に赤芽球とも呼ばれ、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球及び正染性赤芽球を含む。
本明細書において、「試料」とは、哺乳動物、好ましくはヒトから採取された血液、骨髄液、尿、アフェレーシスなどで採取した試料などの体液試料をいう。
【００２０】
本発明の試料分析用試薬は、全炭素数が４〜８のアルコールを含有する。本明細書において「全炭素数４〜８のアルコール」とは、アルコール１分子中の全炭素数が４〜８のアルコールを意味する。上記のアルコールは、フェニル基又はフェノキシ基で置換されていてもよい全炭素数が４〜８の脂肪族のアルコールが好ましい。上記のアルコールとしては、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、イソブタノール（２−メチル−１−プロパノール）、イソアミルアルコール（イソペンチルアルコール）、イソオクチルアルコール、２−フェニルエタノール、２−フェノキシエタノールなどが挙げられる。上記のアルコールは、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ペンタノール、１−ヘプタノール、イソブタノール（２−メチル−プロパノール）、イソアミルアルコール、２−フェニルエタノール及び２−フェノキシエタノールからなる群より選択されるものがより好ましく、これらの１種又は２種以上を用いることができる。
【００２１】
本発明の試料分析用試薬は、全炭素数４〜８のアルコールを含有することにより、好塩基球と好塩基球以外の白血球との分画及び有核赤血球の分画の性能が、従来の試薬に比べてより向上したものとなる。
【００２２】
本発明の試料分析用試薬中の上記のアルコールの濃度は、用いられるアルコールの種類により適宜選択することができるが、例えば、試料分析用試薬の０．０１〜１０重量％が好ましく、より好ましくは０．０１〜５重量％である。この範囲の量のアルコールを含有することにより、好塩基球と好塩基球以外の白血球との分画、及び有核赤血球の分画の性能を向上させることができる。
【００２３】
本発明の試料分析用試薬に含まれる蛍光色素は、上記の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表されるものである。
本明細書において、一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）における「アルキル基」は、直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は、通常、１〜２０、好ましくは１〜１０であるが、蛍光色素の水溶性の観点から、炭素数１〜６がより好ましい。該アルキル基の好ましい例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルが挙げられる。
【００２４】
一般式（Ｉ）におけるアニオンＸ-としては、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-及びＩ-のようなハロゲンイオン、ＣＦ3ＳＯ3-、ＢＦ4-、ＣｌＯ4-などが挙げられる。
【００２５】
本明細書において、一般式（ＩＩ）において存在し得る「酸性基」とは、プロトンを放出し得る基及びプロトンを放出し得る基がプロトンを放出した遊離酸の基の両方を含む。プロトンを放出し得る基としては、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などが挙げられ、カルボキシル基又はスルホン酸基が好ましい。
【００２６】
上記の酸性基は塩を形成していてもよい。このような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩などが挙げられる。好ましい塩は、アルカリ金属塩又はアルキルアンモニウム塩であり、より好ましくは、ナトリウム塩又はトリエチルアンモニウム塩である。
【００２７】
上記の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）の蛍光色素は、１種又は２種以上を用いることができる。
上記の蛍光色素は、株式会社林原生物化学研究所から購入することができる。
【００２８】
本発明の試料分析用試薬中の色素の濃度は、色素の種類により適宜選択することができるが、一般に０．０１〜１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３〜６．０ｍｇ／Ｌである。
【００２９】
本発明の試料分析用試薬により血球を染色する際には、有核赤血球と白血球（リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球）との測定に障害となる赤血球を溶血させ、有核赤血球及び白血球の細胞膜に損傷を与えることが好ましい。この損傷により、蛍光色素の透過性が向上し、効率的に血球染色を行うことができる。
赤血球は、通常、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧で細胞膜に細孔を生じ、赤血球内部のヘモグロビンを溶出し光学的に透明になる（溶血する）。光学的に透明になった赤血球は実質的にフローサイトメトリを用いる測定の障害とはならない。赤血球の溶血には、低い浸透圧条件及び低いｐＨ条件が好ましい。この二つの条件を満足する浸透圧は、２０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜１５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【００３０】
本発明の試料分析用試薬のｐＨは、２．０〜４．５が好ましく、より好ましくは２．０〜３．５である。ｐＨがこの範囲内であれば、好塩基球の顆粒が安定する。また、白血球、有核赤血球などには過度の影響を与えずに赤血球を効率よく溶血させることができる。この処理により、無核の赤血球の散乱光や蛍光は極めて小さくなり、有核赤血球や白血球の測定に実質的に悪影響を及ぼさない。
【００３１】
上記の試料分析用試薬のｐＨは、緩衝剤を用いて調整してもよい。好ましい緩衝剤は、所望のｐＨ±２．０の付近にｐＫａを有する緩衝剤であり、例えば、クエン酸、リンゴ酸、ジグリコール酸、マロン酸、マレイン酸などが挙げられる。
本発明の試料分析用試薬中の上記の緩衝剤の濃度は、ｐＨを上記の範囲に保つことができるものであれば特に限定されない。
【００３２】
本発明の試料分析用試薬の浸透圧を赤血球の溶血に適当な範囲とするために、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌなどの電解質、糖類などを用いることができる。また、上記の緩衝剤の濃度によっても浸透圧を調整することができる。
【００３３】
本発明の試料分析用試薬は、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与える界面活性剤を含有することが好ましい。該界面活性剤は、カチオン界面活性剤が好ましく、より好ましくは第四級アンモニウム塩又はピリジニウム塩の型のものである。
上記の界面活性剤としては、次の式：
【００３４】
【化７】
【００３５】
（式中、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は同一又は異なって、水素原子、Ｃ1-8アルキル基又はＣ6-8アラルキル基であり；Ｒ10はＣ8-18アルキル基、Ｃ8-18アルケニル基又はＣ6-18アラルキル基であり；Ｘ-はアニオンである）
で表される四級アンモニウム塩、及び次の式：
【００３６】
【化８】
【００３７】
（式中、Ｒ11はＣ8-18アルキル基であり；Ｘ-はアニオンである）
で表されるピリジニウム塩が好ましく例示される。
このような界面活性剤は知られており、例えば特開２００２−１４８２６１号に開示されたものを用いることができる。
【００３８】
上記の界面活性剤の具体例としては、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、オクチルトリメチルアンモニウムクロライド、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロライド、ラウリルピリジニウムクロライドなどが挙げられる。
【００３９】
本発明の試料分析用試薬中の上記の界面活性剤の濃度は、１０〜１００００ｍｇ／ｌが好ましく、より好ましくは１００〜５０００ｍｇ／ｌである。この範囲の濃度であれば、白血球、有核赤血球などには過度の影響を与えずに赤血球を効率よく溶血させることができる。
【００４０】
本発明の試料分析用試薬は、分子内に少なくとも一つの芳香環を有する有機酸(以下、「芳香族有機酸」という)又はその塩を少なくとも１種類含有することが好ましい。このことにより、より効率的に短時間で赤血球を溶血することができる。好ましい芳香族有機酸は、サリチル酸又はフタル酸である。
本発明の試料分析用試薬中の上記の芳香族有機酸又はその塩の濃度は、試料分析用試薬のｐＨが上記の範囲となる濃度であれば特に限定されないが、０．１〜１００ｍＭが好ましく、１〜５０ｍＭがより好ましい。
【００４１】
本発明の試料分析用試薬は、上記の蛍光色素及び全炭素数４〜８のアルコールと、所望により上記の界面活性剤及び芳香族有機酸またはその塩とを上記の濃度になるように適切な水性溶媒に溶解し、所望によりＮａＯＨ、ＨＣｌなどを用いてｐＨを調整することにより得ることができる。また、適切な溶媒にそれぞれ溶解した蛍光色素の溶液及びアルコールの溶液と、所望により界面活性剤の溶液及び芳香族有機酸の溶液とを、これらの各成分の最終濃度が上記の範囲になるようにして混合して、所望によりＮａＯＨ、ＨＣｌなどを用いてｐＨを調整することにより得ることもできる。上記の適切な溶媒としては、これらの成分を溶解させることができるものであれば特に限定されないが、水、アルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、これらの混液などが挙げられる。
【００４２】
本発明の試料分析用試薬は、試料分析用試薬：試料の容量比が５〜１０００：１、より好ましくは１０〜５００：１となる量で試料と混合するのが好ましい。このような比で試料分析用試薬と試料とを混合して測定用試料とすることにより、赤血球の溶解が速やかに進行し、血球成分の染色を良好に行うことができる。また、試料の量は数μｌ〜１００μｌ程度あれば、測定を良好に行うことができる。
【００４３】
本発明の試料分析用試薬キットは、上記の界面活性剤、全炭素数４〜８のアルコール、及び蛍光色素を含む。これらのうち、界面活性剤及び全炭素数４〜８のアルコールを同一の容器に収容して第一試薬とし、蛍光色素を含む第二試薬とすることが好ましい。これらの溶液に用いられる溶媒としては、界面活性剤又は蛍光色素を溶解させることができるものであれば特に限定されないが、水、アルコール、有機溶媒（エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）など）、これらの混液などが挙げられる。蛍光色素は水溶液中での長期保存安定性が低い場合があり、その場合は上記の有機溶媒中に溶解させるのが好ましい。
【００４４】
第一試薬は、上記の芳香族有機酸又はその塩を含んでいてもよい。
あるいは、本発明のキットは、第一試薬及び第二試薬とは別に芳香族有機酸又はその塩を含む第三試薬をさらに含んでもよい。
【００４５】
本発明の試料分析方法は、上記の蛍光色素及び全炭素数４〜８のアルコールにより試料中の血球を染色する工程、該染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程、及び得られた散乱光情報及び蛍光情報に基づいて、試料中の好塩基球を他の白血球成分と分類して計数する工程を含む。該染色工程では、赤血球を溶血させ、溶血させた赤血球以外の血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、損傷を受けた血球を染色するのが好ましい。
【００４６】
該染色工程では、蛍光色素と全炭素数４〜８のアルコールと試料とを混合する。この工程においては、好ましくは、蛍光色素と全炭素数４〜８のアルコールと上記の界面活性剤と試料とを混合する。この場合、この界面活性剤は血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えるので、界面活性剤と試料とを混合することによって測定対象の血球を効率的に蛍光染色することが可能となる。
該染色工程において、界面活性剤を用いる場合、界面活性剤と蛍光色素と全炭素数４〜８のアルコールと試料とを混合する順序としては特に限定されない。界面活性剤と蛍光色素と全炭素数４〜８のアルコールとを先に混合し、この混合液と試料とを混合してもよいし、界面活性剤と試料とを先に混合し、この混合液と蛍光色素と全炭素数４〜８のアルコールとを混合してもよい。いずれの順序で混合しても同等の測定結果を得ることができる。
上記の染色工程では、本発明の試料分析用試薬を試料と混合するか、又は本発明の試料分析用試薬キットの各構成成分を試料と混合することもできる。
【００４７】
上記の染色工程では、蛍光色素と全炭素数４〜８のアルコールと試料とを混合した後に、１５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃の温度で５〜１２０秒間、好ましくは５〜３０秒間反応させるのが好ましい。
【００４８】
上記の染色工程において染色された血球は、フローサイトメータを用いることにより分析することができる。以下、フローサイトメータを用いた血球の分析について説明する。染色された血球がフローサイトメータのフローセルを通過する際に、血球に光を照射することにより、散乱光情報及び蛍光情報を得ることができる。散乱光情報としては、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光であれば特に限定されず、前方散乱光（例えば、受光角度０〜２０度付近）、側方散乱光（受光角度９０度付近）などの散乱光の散乱光幅、散乱光強度などが挙げられる。一般に、側方散乱光は細胞の核や顆粒などの内部情報を反映し、前方散乱光は細胞の大きさの情報を反映することが知られている。本発明の方法においては、散乱光情報として前方散乱光強度を用いることが好ましい。
【００４９】
蛍光情報とは、適当な波長の光を測定用試料に照射して、励起された蛍光を測定して得られるものである。使用する蛍光色素に応じて適当な受光波長を選択することができる。蛍光は、上記の蛍光色素によって染色された細胞内の核酸や顆粒などから発せられる。
【００５０】
用いるフローサイトメータの光源は特に限定されず、蛍光色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例えば、赤半導体レーザ、青半導体レーザ、アルゴンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザなどが使用される。特に半導体レーザは気体レーザに比べて非常に安価であり、好適である。
【００５１】
上記のようにして測定した散乱光と蛍光とに基づいて、有核赤血球及び好塩基球を他の成分から弁別して計数することができる。この工程は、（１）例えば蛍光情報と前方散乱光情報とを二軸とするスキャッタグラムを作成し、（２）得られたスキャッタグラムを適当な解析ソフトで解析することを含むのが好ましい。Ｘ軸に蛍光強度、Ｙ軸に前方散乱光強度をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば図１に示すように、各細胞は集団（クラスター）を形成して分布する。このようなスキャッタグラムにおいては、有核赤血球は顆粒球（好中球、好酸球及び好塩基球）よりもサイズが小さいため、顆粒球よりも前方散乱光強度が小さい領域に出現し、また、白血球よりも蛍光強度が小さい領域に出現する。このことにより、白血球と有核赤血球とを明確に弁別することができる。また、好塩基球は好酸球や好中球よりも蛍光強度が小さい領域に出現する。このことにより、好塩基球を他の顆粒球と明確に弁別することができる。なお、スキャッタグラム上の各集団がどの血球に対応するかは、各血球のみを含む試料を本発明の試薬で処理した後、測定を行い出現位置を確認することによって特定することができる。
【００５２】
スキャッタグラム上の集団を、適当な解析ソフトで解析することにより、有核赤血球及び好塩基球の数と割合を算出することができる。具体的には、スキャッタグラムにおいて、ある所定の細胞が出現すると考えられる位置に細胞集団が認められた場合、まずこの集団の中心を特定する。この中心から他の細胞集団の出現領域までの間で、所定の細胞集団の細胞が出現している部分までをこの細胞集団の境界とすることができる。設定された領域内に出現する細胞を、所定の細胞として計数することができる。また、好塩基球以外の白血球も計数することにより、全白血球に対する好塩基球の比率（好塩基球／全白血球：以下、「好塩基球比率」という）と、全白血球に対する有核赤血球の比率（有核赤血球／全白血球：以下、「有核赤血球比率」という）とを算出することができる。なお、有核赤血球比率は、通常１００個の白血球当たりに出現する有核赤血球の百分率で表され、単位は「個／１００ＷＢＣ」と表記される。
【００５３】
本願発明の試料分析用試薬、試料分析用試薬キット及び試料分析方法を用いると、有核赤血球が形成する集団、好塩基球が形成する集団がそれぞれ他の血球細胞が形成する集団から明確に分離されるので、より正確な計数を行うことができる。
【００５４】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であり、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例において用いた蛍光色素は、次のとおりである。
ＮＫ−３３８３
【００５６】
【化９】
【００５７】
ＮＫ−１８４０
【００５８】
【化１０】
【００５９】
ＮＫ−２９２９
【００６０】
【化１１】
【００６１】
ＮＫ−５０５６
【００６２】
【化１２】
【００６３】
ＮＫ−９００１
【００６４】
【化１３】
【００６５】
ＮＫ−９００２
【００６６】
【化１４】
【００６７】
ＮＫ−９００３
【００６８】
【化１５】
【００６９】
ＮＫ−４２４９
【００７０】
【化１６】
【００７１】
ＮＫ−３６０６
【００７２】
【化１７】
【００７３】
比較例１
被験者２名からそれぞれ採取された血液試料２検体に含まれる好塩基球を、自動血球計数装置ＸＥ−２１００（シスメックス製：赤半導体レーザ（６３３ｎｍ）を搭載）を用いて測定し、好塩基球比率を算出した。なお、試薬としては、ストマトライザーＦＢＩＩ（シスメックス製）を用いた。
測定の結果、これら試料は好塩基球の含量が高いことが認められた（以下、この試料をＢａｓｏ試料１及びＢａｓｏ試料２とする）。Ｂａｓｏ試料１の好塩基球比率は２．３％、Ｂａｓｏ試料１の好塩基球比率は１．２％であった。これらの結果を実施例１の対照とした。
次に、上記とは別の被験者２名からそれぞれ採取された血液試料２検体に含まれる有核赤血球を、自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて測定し、有核赤血球比率を算出した。なお、試薬としては、ストマトライザーＮＲ（シスメックス製）を用いた。
測定の結果、これらの試料は有核赤血球が出現していることが認められた（以下、この試料をＮＲＢＣ試料１及びＮＲＢＣ試料２とする）。ＮＲＢＣ試料１の有核赤血球比率は４．０個／１００ＷＢＣ、ＮＲＢＣ試料２の有核赤血球比率は２０．２個／１００ＷＢＣであった。これらの結果を実施例１の対照とした。
【００７４】
実施例１
サリチル酸１０ｍＭ（ｐＨ：２．７）、１−ブタノール２％及びＤＴＡＢ３０００ｐｐｍを含有する水溶液１ｍＬを、３５℃の恒温槽に入れた。ここに、図２及び３に記載の各色素（ＮＫ−３３８３ ６ｐｐｍ、ＮＫ−１８４０ ２ｐｐｍ、ＮＫ−２９２９ ６ｐｐｍ、ＮＫ−５０５６ ６ｐｐｍ、ＮＫ−９００１ ２ｐｐｍ、ＮＫ−９００２ ２ｐｐｍ、ＮＫ−９００３ ２ｐｐｍ、ＮＫ−４２４９ ２ｐｐｍ、及びＮＫ−３６０６ ２ｐｐｍ）を、それぞれ上記の濃度になるように加えて溶解させて、試料分析用試薬を得た。
【００７５】
得られた試料分析用試薬１ｍｌと、血液試料（Ｂａｓｏ試料１若しくは２又はＮＲＢＣ試料１若しくは２）２０μｌとを充分に混和した。３５℃で２０秒間反応させた後、測定用試料を恒温槽から取り出し、測定用試料を６３３ｎｍの励起光源を有するフローサイトメータの検出部に導き、測定用試料中の細胞に励起光を照射し、外債棒から発せられる散乱光信号及び蛍光信号を検出し、得られた信号を解析して測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。この測定は、自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて行われた。
【００７６】
なお、Ｂａｓｏ試料１には、ＮＫ３３８３を含む試薬、ＮＫ１８４０を含む試薬、ＮＫ２９２９を含む試薬、及びＮＫ５０５６を含む試薬をそれぞれ添加して測定を行った。
Ｂａｓｏ試料２には、ＮＫ９００１を含む試薬、ＮＫ９００２を含む試薬、ＮＫ９００３を含む試薬、ＮＫ４２４９を含む試薬、及びＮＫ３６０６を含む試薬をそれぞれ添加して測定を行った。
ＮＲＢＣ試料１には、ＮＫ３３８３を含む試薬、ＮＫ１８４０を含む試薬、ＮＫ２９２９を含む試薬、及びＮＫ５０５６を含む試薬をそれぞれ添加して測定を行った。
ＮＲＢＣ試料２には、ＮＫ９００１を含む試薬、ＮＫ９００２を含む試薬、ＮＫ９００３を含む試薬、ＮＫ４２４９を含む試薬、及びＮＫ３６０６を含む試薬をそれぞれ添加して測定を行った。
【００７７】
それぞれの測定用試料について、蛍光強度及び前方散乱光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。このスキャッタグラムを図２及び図３に示す。このスキャッタグラムに基づいて、全白血球、好塩基球及び有核赤血球を計数し、好塩基球比率及び有核赤血球比率を算出した。比較例１及び本実施例で算出されたＢａｓｏ試料中の好塩基球比率を表１に、ＮＲＢＣ試料中の有核赤血球比率を表２に示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
【表２】
【００８０】
図２及び３に示すように、本発明の試料分析用試薬を用いた場合、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に分画され、有核赤血球も明確に分画されることがわかる。このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図２及び３に示すようにしてスキャッタグラム上で一定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることができた。
また、表１及び２より、実施例１で算出された比率と比較例１で算出された比率とは近似した値であった。従って、本発明の試料分析用試薬を用いると、有核赤血球と好塩基球とをそれぞれ別々の試薬を用いて測定した場合と同程度の精度で測定を行うことができることが確認された。
【００８１】
実施例２
サリチル酸１０ｍＭ（ｐＨ：３．０）及びデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）３０００ｐｐｍを含有する水溶液１ｍＬを、３５℃の恒温槽に入れた。ここに、図４及び５に示すアルコール（１−ヘプタノール ０．０５％、１−ペンタノール ２％、１−ブタノール ２％、イソブタノール ２％、２−ブタノール １％、イソアミルアルコール １％、２−フェノキシエタノール ０．５％、２−フェニルエタノール ０．５％）をそれぞれ上記の濃度になるように加えた。蛍光色素ＮＫ−２９２９を６ｐｐｍになるよう添加した。得られた試料分析用試薬１ｍｌに対して血液試料２０μｌを添加し、充分に混和した。３５℃で２０秒間反応させた後、測定用試料を恒温槽から取り出し、実施例１と同様にしてフローサイトメータで測定した。
【００８２】
それぞれの測定用試料について、蛍光強度及び前方散乱光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。このスキャッタグラムを図４及び図５に示す。このスキャッタグラムに基づいて、全白血球、好塩基球及び有核赤血球を計数し、好塩基球比率及び有核赤血球比率を算出した。
【００８３】
また、上記の測定に用いたものと同じ試料について、比較例１に記載のようにして好塩基求比率又は有核赤血球比率について自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて測定した。
これらの結果を表３及び４に示す。表３は、試料中の好塩基求比率についての結果を示し、表４は、試料中の有核赤血球比率を示す。
【００８４】
【表３】
【００８５】
【表４】
【００８６】
図４及び５並びに表３及び４の結果から、全炭素数４〜８のアルコールを含有する本発明の試料分析用試薬を用いると、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に分画され、有核赤血球も明確に分画されることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムの模式図を示す。
【図２】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す（実施例１）。
【図３】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す（実施例１）。
【図４】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す（実施例２）。
【図５】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す（実施例２）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体から採取された試料中の血球を分析するための試料分析用試薬、試料分析用試薬キット及び試料分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査分野において、試料中の血球成分の分析は、被験者の循環器等における様々な疾患を診断する上で非常に有用である。疾患によっては、特定の血球数が増加又は減少したり、通常では存在しない血液細胞が末梢血に出現したりすることがある。
近年、フローサイトメトリの原理を応用した種々の自動血球計数装置が市販されており、血球細胞の分類・計数は、一般検査室で行なわれている。これらの自動血球計数装置を用いると、試料中の白血球の分類・計数を自動で行うことができる。
【０００３】
白血球の分類・計数を行うには、まず、血液試料中の赤血球を溶解して試料を調製する。調製した試料を検出器に導き、電気インピーダンス信号を検出することにより、白血球を３種類に分類することができる。一方、白血球は、通常、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球の５種類が存在する。白血球は、赤血球溶解処理に加えてさらに蛍光染色を行い、蛍光染色された血球に励起光を照射し、該染色された血球から発せられる蛍光信号及び散乱光信号を検出し、解析することで５種類に分類することができる。好塩基球は通常数が少ないため、一度の測定で白血球を５種類に分類するよりも、好塩基球が酸性条件下では他の白血球に比べて破壊されにくいといった特性を利用して、血液試料を好塩基球測定専用に処理を行って好塩基球数測定を行い（特許文献１参照）、他の方法で得られた白血球分類結果と組み合わせて、より正確に白血球５分類を行うことができる。
【０００４】
なお、白血球測定でしばしば問題になるのは有核赤血球の出現である。有核赤血球は核を持つため、赤血球溶解処理を行っても核が残存し、上記のような測定においてリンパ球に近い信号を有するため、これが白血球数の測定時にプラスの誤差を与える。この影響を排除するには、有核赤血球測定専用の処理を行って有核赤血球数の測定を行い（特許文献２参照）、別の方法で得られた白血球数から有核赤血球を差し引くことで正確な白血球数を得ることができる。
【０００５】
しかしながら、正確な白血球分類を行うために、特定の血球専用の処理を増やすと、手間がかかる上に、装置が複雑化或いは大型化するおそれがある。また、特定の血球測定専用試薬を複数使用すると、血液検査全体のコストが高くなる。このような観点から、特定の血球専用の処理はできるだけ少ない方が好ましい。
【０００６】
ところで、好塩基球も有核赤血球も、血液試料を酸性条件下で処理することによって測定を行うことができる。従って、血液試料を酸性条件下で処理すれば、一回の測定で好塩基球と有核赤血球の両方を測定できる可能性がある。このような試みの１つとして、特許文献３（特開２００２−１４８２６１号公報）には、白血球及び異常細胞を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤と界面活性剤とを含む水溶液を試料と混合し、蛍光色素を含む染色液を加えて染色し、フローサイトメータで測定して蛍光強度及び散乱光強度を測定することにより、好塩基球及び赤芽球（有核赤血球）を測定できることが記載されている。
【特許文献１】特公平６−８８１７号公報
【特許文献２】特開平１０−３３９７２９号公報
【特許文献３】特開２００２−１４８２６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記のような従来の方法では、白血球数が多い検体などでは、好塩基球と好塩基球以外の白血球との分離がよくないことがある。
本発明の目的は、試料中の有核赤血球及び好塩基球を他の白血球からより明確に弁別し、計数することができる試料測定用試薬及び試料測定方法を提供することである。
【０００８】
本発明者らは、上記の現状に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、全炭素数４〜８のアルコールを特定の界面活性剤及び蛍光色素とともに含む試料分析用試薬用いることにより、好塩基球を好塩基球以外の白血球成分からより明確に弁別することが可能であることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
よって本発明は、好塩基球及び／又は有核赤血球を測定するための試料分析用試薬であって、
全炭素数が４〜８のアルコールと、
一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
Ｒ1及びＲ2は互いに同一又は異なってアルキル基であり；
【００１０】
【化２】
であり；
【００１１】
【化３】
であり；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は互いに同一又は異なって、水素原子又はアルキル基であり；
Ｘ-はアニオンである）
の蛍光色素、及び一般式（ＩＩ）：
【００１２】
【化４】
（式中、
Ｒ7及びＲ8は互いに同一又は異なって酸性基を有していてもよいアルキル基であり；
【００１３】
【化５】
であり；
【００１４】
【化６】
【００１５】
であり；
Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は互いに同一又は異なって、水素原子又は酸性基であるが、
但し、Ｒ7〜Ｒ12のいずれか１つには酸性基が存在し；
Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基は塩を形成していてもよいが、但し、Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基のうちいずれか１つは、プロトンを放出した遊離酸の基である）
の蛍光色素から選択される少なくとも１種の蛍光色素とを含む試料分析用試薬である。
【００１６】
また、本発明は、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与える界面活性剤と全炭素数が４〜８のアルコールとを含む溶液と、上記の一般式（Ｉ）の蛍光色素及び一般式（ＩＩ）の蛍光色素の少なくとも１種の蛍光色素を含む溶液とを含む、好塩基球及び／又は有核赤血球を測定するための試料分析用試薬キットである。
【００１７】
さらに、本発明は、全炭素数が４〜８のアルコールと、上記の一般式（Ｉ）の蛍光色素及び一般式（ＩＩ）の蛍光色素の少なくとも１種の蛍光色素とにより、試料中の血球を染色する工程；前記染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程；及び前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球及び／又は有核赤血球を計数する工程を含む、試料分析方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、有核赤血球と好塩基球を他の血球成分からより明確に弁別し、計数することが可能になり、疾患の検査・診断をより正確に行うことが可能になる。本発明では、一度の測定で有核赤血球と好塩基球を計数できるが、検査目的によっては、有核赤血球と好塩基球の何れか一方のみを測定すればよい場合もある。そのような場合でも、何れか一方のみを測定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明により測定することができる好塩基球は、塩基性色素により染色される大型の酸性顆粒を有する白血球の一種である。また、有核赤血球は、一般的に赤芽球とも呼ばれ、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球及び正染性赤芽球を含む。
本明細書において、「試料」とは、哺乳動物、好ましくはヒトから採取された血液、骨髄液、尿、アフェレーシスなどで採取した試料などの体液試料をいう。
【００２０】
本発明の試料分析用試薬は、全炭素数が４〜８のアルコールを含有する。本明細書において「全炭素数４〜８のアルコール」とは、アルコール１分子中の全炭素数が４〜８のアルコールを意味する。上記のアルコールは、フェニル基又はフェノキシ基で置換されていてもよい全炭素数が４〜８の脂肪族のアルコールが好ましい。上記のアルコールとしては、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、イソブタノール（２−メチル−１−プロパノール）、イソアミルアルコール（イソペンチルアルコール）、イソオクチルアルコール、２−フェニルエタノール、２−フェノキシエタノールなどが挙げられる。上記のアルコールは、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ペンタノール、１−ヘプタノール、イソブタノール（２−メチル−プロパノール）、イソアミルアルコール、２−フェニルエタノール及び２−フェノキシエタノールからなる群より選択されるものがより好ましく、これらの１種又は２種以上を用いることができる。
【００２１】
本発明の試料分析用試薬は、全炭素数４〜８のアルコールを含有することにより、好塩基球と好塩基球以外の白血球との分画及び有核赤血球の分画の性能が、従来の試薬に比べてより向上したものとなる。
【００２２】
本発明の試料分析用試薬中の上記のアルコールの濃度は、用いられるアルコールの種類により適宜選択することができるが、例えば、試料分析用試薬の０．０１〜１０重量％が好ましく、より好ましくは０．０１〜５重量％である。この範囲の量のアルコールを含有することにより、好塩基球と好塩基球以外の白血球との分画、及び有核赤血球の分画の性能を向上させることができる。
【００２３】
本発明の試料分析用試薬に含まれる蛍光色素は、上記の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表されるものである。
本明細書において、一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）における「アルキル基」は、直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は、通常、１〜２０、好ましくは１〜１０であるが、蛍光色素の水溶性の観点から、炭素数１〜６がより好ましい。該アルキル基の好ましい例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルが挙げられる。
【００２４】
一般式（Ｉ）におけるアニオンＸ-としては、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-及びＩ-のようなハロゲンイオン、ＣＦ3ＳＯ3-、ＢＦ4-、ＣｌＯ4-などが挙げられる。
【００２５】
本明細書において、一般式（ＩＩ）において存在し得る「酸性基」とは、プロトンを放出し得る基及びプロトンを放出し得る基がプロトンを放出した遊離酸の基の両方を含む。プロトンを放出し得る基としては、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などが挙げられ、カルボキシル基又はスルホン酸基が好ましい。
【００２６】
上記の酸性基は塩を形成していてもよい。このような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩などが挙げられる。好ましい塩は、アルカリ金属塩又はアルキルアンモニウム塩であり、より好ましくは、ナトリウム塩又はトリエチルアンモニウム塩である。
【００２７】
上記の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）の蛍光色素は、１種又は２種以上を用いることができる。
上記の蛍光色素は、株式会社林原生物化学研究所から購入することができる。
【００２８】
本発明の試料分析用試薬中の色素の濃度は、色素の種類により適宜選択することができるが、一般に０．０１〜１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３〜６．０ｍｇ／Ｌである。
【００２９】
本発明の試料分析用試薬により血球を染色する際には、有核赤血球と白血球（リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球）との測定に障害となる赤血球を溶血させ、有核赤血球及び白血球の細胞膜に損傷を与えることが好ましい。この損傷により、蛍光色素の透過性が向上し、効率的に血球染色を行うことができる。
赤血球は、通常、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧で細胞膜に細孔を生じ、赤血球内部のヘモグロビンを溶出し光学的に透明になる（溶血する）。光学的に透明になった赤血球は実質的にフローサイトメトリを用いる測定の障害とはならない。赤血球の溶血には、低い浸透圧条件及び低いｐＨ条件が好ましい。この二つの条件を満足する浸透圧は、２０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜１５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【００３０】
本発明の試料分析用試薬のｐＨは、２．０〜４．５が好ましく、より好ましくは２．０〜３．５である。ｐＨがこの範囲内であれば、好塩基球の顆粒が安定する。また、白血球、有核赤血球などには過度の影響を与えずに赤血球を効率よく溶血させることができる。この処理により、無核の赤血球の散乱光や蛍光は極めて小さくなり、有核赤血球や白血球の測定に実質的に悪影響を及ぼさない。
【００３１】
上記の試料分析用試薬のｐＨは、緩衝剤を用いて調整してもよい。好ましい緩衝剤は、所望のｐＨ±２．０の付近にｐＫａを有する緩衝剤であり、例えば、クエン酸、リンゴ酸、ジグリコール酸、マロン酸、マレイン酸などが挙げられる。
本発明の試料分析用試薬中の上記の緩衝剤の濃度は、ｐＨを上記の範囲に保つことができるものであれば特に限定されない。
【００３２】
本発明の試料分析用試薬の浸透圧を赤血球の溶血に適当な範囲とするために、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌなどの電解質、糖類などを用いることができる。また、上記の緩衝剤の濃度によっても浸透圧を調整することができる。
【００３３】
本発明の試料分析用試薬は、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与える界面活性剤を含有することが好ましい。該界面活性剤は、カチオン界面活性剤が好ましく、より好ましくは第四級アンモニウム塩又はピリジニウム塩の型のものである。
上記の界面活性剤としては、次の式：
【００３４】
【化７】
【００３５】
（式中、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は同一又は異なって、水素原子、Ｃ1-8アルキル基又はＣ6-8アラルキル基であり；Ｒ10はＣ8-18アルキル基、Ｃ8-18アルケニル基又はＣ6-18アラルキル基であり；Ｘ-はアニオンである）
で表される四級アンモニウム塩、及び次の式：
【００３６】
【化８】
【００３７】
（式中、Ｒ11はＣ8-18アルキル基であり；Ｘ-はアニオンである）
で表されるピリジニウム塩が好ましく例示される。
このような界面活性剤は知られており、例えば特開２００２−１４８２６１号に開示されたものを用いることができる。
【００３８】
上記の界面活性剤の具体例としては、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、オクチルトリメチルアンモニウムクロライド、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロライド、ラウリルピリジニウムクロライドなどが挙げられる。
【００３９】
本発明の試料分析用試薬中の上記の界面活性剤の濃度は、１０〜１００００ｍｇ／ｌが好ましく、より好ましくは１００〜５０００ｍｇ／ｌである。この範囲の濃度であれば、白血球、有核赤血球などには過度の影響を与えずに赤血球を効率よく溶血させることができる。
【００４０】
本発明の試料分析用試薬は、分子内に少なくとも一つの芳香環を有する有機酸(以下、「芳香族有機酸」という)又はその塩を少なくとも１種類含有することが好ましい。このことにより、より効率的に短時間で赤血球を溶血することができる。好ましい芳香族有機酸は、サリチル酸又はフタル酸である。
本発明の試料分析用試薬中の上記の芳香族有機酸又はその塩の濃度は、試料分析用試薬のｐＨが上記の範囲となる濃度であれば特に限定されないが、０．１〜１００ｍＭが好ましく、１〜５０ｍＭがより好ましい。
【００４１】
本発明の試料分析用試薬は、上記の蛍光色素及び全炭素数４〜８のアルコールと、所望により上記の界面活性剤及び芳香族有機酸またはその塩とを上記の濃度になるように適切な水性溶媒に溶解し、所望によりＮａＯＨ、ＨＣｌなどを用いてｐＨを調整することにより得ることができる。また、適切な溶媒にそれぞれ溶解した蛍光色素の溶液及びアルコールの溶液と、所望により界面活性剤の溶液及び芳香族有機酸の溶液とを、これらの各成分の最終濃度が上記の範囲になるようにして混合して、所望によりＮａＯＨ、ＨＣｌなどを用いてｐＨを調整することにより得ることもできる。上記の適切な溶媒としては、これらの成分を溶解させることができるものであれば特に限定されないが、水、アルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、これらの混液などが挙げられる。
【００４２】
本発明の試料分析用試薬は、試料分析用試薬：試料の容量比が５〜１０００：１、より好ましくは１０〜５００：１となる量で試料と混合するのが好ましい。このような比で試料分析用試薬と試料とを混合して測定用試料とすることにより、赤血球の溶解が速やかに進行し、血球成分の染色を良好に行うことができる。また、試料の量は数μｌ〜１００μｌ程度あれば、測定を良好に行うことができる。
【００４３】
本発明の試料分析用試薬キットは、上記の界面活性剤、全炭素数４〜８のアルコール、及び蛍光色素を含む。これらのうち、界面活性剤及び全炭素数４〜８のアルコールを同一の容器に収容して第一試薬とし、蛍光色素を含む第二試薬とすることが好ましい。これらの溶液に用いられる溶媒としては、界面活性剤又は蛍光色素を溶解させることができるものであれば特に限定されないが、水、アルコール、有機溶媒（エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）など）、これらの混液などが挙げられる。蛍光色素は水溶液中での長期保存安定性が低い場合があり、その場合は上記の有機溶媒中に溶解させるのが好ましい。
【００４４】
第一試薬は、上記の芳香族有機酸又はその塩を含んでいてもよい。
あるいは、本発明のキットは、第一試薬及び第二試薬とは別に芳香族有機酸又はその塩を含む第三試薬をさらに含んでもよい。
【００４５】
本発明の試料分析方法は、上記の蛍光色素及び全炭素数４〜８のアルコールにより試料中の血球を染色する工程、該染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程、及び得られた散乱光情報及び蛍光情報に基づいて、試料中の好塩基球を他の白血球成分と分類して計数する工程を含む。該染色工程では、赤血球を溶血させ、溶血させた赤血球以外の血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、損傷を受けた血球を染色するのが好ましい。
【００４６】
該染色工程では、蛍光色素と全炭素数４〜８のアルコールと試料とを混合する。この工程においては、好ましくは、蛍光色素と全炭素数４〜８のアルコールと上記の界面活性剤と試料とを混合する。この場合、この界面活性剤は血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えるので、界面活性剤と試料とを混合することによって測定対象の血球を効率的に蛍光染色することが可能となる。
該染色工程において、界面活性剤を用いる場合、界面活性剤と蛍光色素と全炭素数４〜８のアルコールと試料とを混合する順序としては特に限定されない。界面活性剤と蛍光色素と全炭素数４〜８のアルコールとを先に混合し、この混合液と試料とを混合してもよいし、界面活性剤と試料とを先に混合し、この混合液と蛍光色素と全炭素数４〜８のアルコールとを混合してもよい。いずれの順序で混合しても同等の測定結果を得ることができる。
上記の染色工程では、本発明の試料分析用試薬を試料と混合するか、又は本発明の試料分析用試薬キットの各構成成分を試料と混合することもできる。
【００４７】
上記の染色工程では、蛍光色素と全炭素数４〜８のアルコールと試料とを混合した後に、１５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃の温度で５〜１２０秒間、好ましくは５〜３０秒間反応させるのが好ましい。
【００４８】
上記の染色工程において染色された血球は、フローサイトメータを用いることにより分析することができる。以下、フローサイトメータを用いた血球の分析について説明する。染色された血球がフローサイトメータのフローセルを通過する際に、血球に光を照射することにより、散乱光情報及び蛍光情報を得ることができる。散乱光情報としては、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光であれば特に限定されず、前方散乱光（例えば、受光角度０〜２０度付近）、側方散乱光（受光角度９０度付近）などの散乱光の散乱光幅、散乱光強度などが挙げられる。一般に、側方散乱光は細胞の核や顆粒などの内部情報を反映し、前方散乱光は細胞の大きさの情報を反映することが知られている。本発明の方法においては、散乱光情報として前方散乱光強度を用いることが好ましい。
【００４９】
蛍光情報とは、適当な波長の光を測定用試料に照射して、励起された蛍光を測定して得られるものである。使用する蛍光色素に応じて適当な受光波長を選択することができる。蛍光は、上記の蛍光色素によって染色された細胞内の核酸や顆粒などから発せられる。
【００５０】
用いるフローサイトメータの光源は特に限定されず、蛍光色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例えば、赤半導体レーザ、青半導体レーザ、アルゴンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザなどが使用される。特に半導体レーザは気体レーザに比べて非常に安価であり、好適である。
【００５１】
上記のようにして測定した散乱光と蛍光とに基づいて、有核赤血球及び好塩基球を他の成分から弁別して計数することができる。この工程は、（１）例えば蛍光情報と前方散乱光情報とを二軸とするスキャッタグラムを作成し、（２）得られたスキャッタグラムを適当な解析ソフトで解析することを含むのが好ましい。Ｘ軸に蛍光強度、Ｙ軸に前方散乱光強度をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば図１に示すように、各細胞は集団（クラスター）を形成して分布する。このようなスキャッタグラムにおいては、有核赤血球は顆粒球（好中球、好酸球及び好塩基球）よりもサイズが小さいため、顆粒球よりも前方散乱光強度が小さい領域に出現し、また、白血球よりも蛍光強度が小さい領域に出現する。このことにより、白血球と有核赤血球とを明確に弁別することができる。また、好塩基球は好酸球や好中球よりも蛍光強度が小さい領域に出現する。このことにより、好塩基球を他の顆粒球と明確に弁別することができる。なお、スキャッタグラム上の各集団がどの血球に対応するかは、各血球のみを含む試料を本発明の試薬で処理した後、測定を行い出現位置を確認することによって特定することができる。
【００５２】
スキャッタグラム上の集団を、適当な解析ソフトで解析することにより、有核赤血球及び好塩基球の数と割合を算出することができる。具体的には、スキャッタグラムにおいて、ある所定の細胞が出現すると考えられる位置に細胞集団が認められた場合、まずこの集団の中心を特定する。この中心から他の細胞集団の出現領域までの間で、所定の細胞集団の細胞が出現している部分までをこの細胞集団の境界とすることができる。設定された領域内に出現する細胞を、所定の細胞として計数することができる。また、好塩基球以外の白血球も計数することにより、全白血球に対する好塩基球の比率（好塩基球／全白血球：以下、「好塩基球比率」という）と、全白血球に対する有核赤血球の比率（有核赤血球／全白血球：以下、「有核赤血球比率」という）とを算出することができる。なお、有核赤血球比率は、通常１００個の白血球当たりに出現する有核赤血球の百分率で表され、単位は「個／１００ＷＢＣ」と表記される。
【００５３】
本願発明の試料分析用試薬、試料分析用試薬キット及び試料分析方法を用いると、有核赤血球が形成する集団、好塩基球が形成する集団がそれぞれ他の血球細胞が形成する集団から明確に分離されるので、より正確な計数を行うことができる。
【００５４】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であり、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例において用いた蛍光色素は、次のとおりである。
ＮＫ−３３８３
【００５６】
【化９】
【００５７】
ＮＫ−１８４０
【００５８】
【化１０】
【００５９】
ＮＫ−２９２９
【００６０】
【化１１】
【００６１】
ＮＫ−５０５６
【００６２】
【化１２】
【００６３】
ＮＫ−９００１
【００６４】
【化１３】
【００６５】
ＮＫ−９００２
【００６６】
【化１４】
【００６７】
ＮＫ−９００３
【００６８】
【化１５】
【００６９】
ＮＫ−４２４９
【００７０】
【化１６】
【００７１】
ＮＫ−３６０６
【００７２】
【化１７】
【００７３】
比較例１
被験者２名からそれぞれ採取された血液試料２検体に含まれる好塩基球を、自動血球計数装置ＸＥ−２１００（シスメックス製：赤半導体レーザ（６３３ｎｍ）を搭載）を用いて測定し、好塩基球比率を算出した。なお、試薬としては、ストマトライザーＦＢＩＩ（シスメックス製）を用いた。
測定の結果、これら試料は好塩基球の含量が高いことが認められた（以下、この試料をＢａｓｏ試料１及びＢａｓｏ試料２とする）。Ｂａｓｏ試料１の好塩基球比率は２．３％、Ｂａｓｏ試料１の好塩基球比率は１．２％であった。これらの結果を実施例１の対照とした。
次に、上記とは別の被験者２名からそれぞれ採取された血液試料２検体に含まれる有核赤血球を、自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて測定し、有核赤血球比率を算出した。なお、試薬としては、ストマトライザーＮＲ（シスメックス製）を用いた。
測定の結果、これらの試料は有核赤血球が出現していることが認められた（以下、この試料をＮＲＢＣ試料１及びＮＲＢＣ試料２とする）。ＮＲＢＣ試料１の有核赤血球比率は４．０個／１００ＷＢＣ、ＮＲＢＣ試料２の有核赤血球比率は２０．２個／１００ＷＢＣであった。これらの結果を実施例１の対照とした。
【００７４】
実施例１
サリチル酸１０ｍＭ（ｐＨ：２．７）、１−ブタノール２％及びＤＴＡＢ３０００ｐｐｍを含有する水溶液１ｍＬを、３５℃の恒温槽に入れた。ここに、図２及び３に記載の各色素（ＮＫ−３３８３ ６ｐｐｍ、ＮＫ−１８４０ ２ｐｐｍ、ＮＫ−２９２９ ６ｐｐｍ、ＮＫ−５０５６ ６ｐｐｍ、ＮＫ−９００１ ２ｐｐｍ、ＮＫ−９００２ ２ｐｐｍ、ＮＫ−９００３ ２ｐｐｍ、ＮＫ−４２４９ ２ｐｐｍ、及びＮＫ−３６０６ ２ｐｐｍ）を、それぞれ上記の濃度になるように加えて溶解させて、試料分析用試薬を得た。
【００７５】
得られた試料分析用試薬１ｍｌと、血液試料（Ｂａｓｏ試料１若しくは２又はＮＲＢＣ試料１若しくは２）２０μｌとを充分に混和した。３５℃で２０秒間反応させた後、測定用試料を恒温槽から取り出し、測定用試料を６３３ｎｍの励起光源を有するフローサイトメータの検出部に導き、測定用試料中の細胞に励起光を照射し、外債棒から発せられる散乱光信号及び蛍光信号を検出し、得られた信号を解析して測定用試料中の好塩基球、有核赤血球及び全白血球を測定した。この測定は、自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて行われた。
【００７６】
なお、Ｂａｓｏ試料１には、ＮＫ３３８３を含む試薬、ＮＫ１８４０を含む試薬、ＮＫ２９２９を含む試薬、及びＮＫ５０５６を含む試薬をそれぞれ添加して測定を行った。
Ｂａｓｏ試料２には、ＮＫ９００１を含む試薬、ＮＫ９００２を含む試薬、ＮＫ９００３を含む試薬、ＮＫ４２４９を含む試薬、及びＮＫ３６０６を含む試薬をそれぞれ添加して測定を行った。
ＮＲＢＣ試料１には、ＮＫ３３８３を含む試薬、ＮＫ１８４０を含む試薬、ＮＫ２９２９を含む試薬、及びＮＫ５０５６を含む試薬をそれぞれ添加して測定を行った。
ＮＲＢＣ試料２には、ＮＫ９００１を含む試薬、ＮＫ９００２を含む試薬、ＮＫ９００３を含む試薬、ＮＫ４２４９を含む試薬、及びＮＫ３６０６を含む試薬をそれぞれ添加して測定を行った。
【００７７】
それぞれの測定用試料について、蛍光強度及び前方散乱光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。このスキャッタグラムを図２及び図３に示す。このスキャッタグラムに基づいて、全白血球、好塩基球及び有核赤血球を計数し、好塩基球比率及び有核赤血球比率を算出した。比較例１及び本実施例で算出されたＢａｓｏ試料中の好塩基球比率を表１に、ＮＲＢＣ試料中の有核赤血球比率を表２に示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
【表２】
【００８０】
図２及び３に示すように、本発明の試料分析用試薬を用いた場合、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に分画され、有核赤血球も明確に分画されることがわかる。このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図２及び３に示すようにしてスキャッタグラム上で一定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることができた。
また、表１及び２より、実施例１で算出された比率と比較例１で算出された比率とは近似した値であった。従って、本発明の試料分析用試薬を用いると、有核赤血球と好塩基球とをそれぞれ別々の試薬を用いて測定した場合と同程度の精度で測定を行うことができることが確認された。
【００８１】
実施例２
サリチル酸１０ｍＭ（ｐＨ：３．０）及びデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）３０００ｐｐｍを含有する水溶液１ｍＬを、３５℃の恒温槽に入れた。ここに、図４及び５に示すアルコール（１−ヘプタノール ０．０５％、１−ペンタノール ２％、１−ブタノール ２％、イソブタノール ２％、２−ブタノール １％、イソアミルアルコール １％、２−フェノキシエタノール ０．５％、２−フェニルエタノール ０．５％）をそれぞれ上記の濃度になるように加えた。蛍光色素ＮＫ−２９２９を６ｐｐｍになるよう添加した。得られた試料分析用試薬１ｍｌに対して血液試料２０μｌを添加し、充分に混和した。３５℃で２０秒間反応させた後、測定用試料を恒温槽から取り出し、実施例１と同様にしてフローサイトメータで測定した。
【００８２】
それぞれの測定用試料について、蛍光強度及び前方散乱光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。このスキャッタグラムを図４及び図５に示す。このスキャッタグラムに基づいて、全白血球、好塩基球及び有核赤血球を計数し、好塩基球比率及び有核赤血球比率を算出した。
【００８３】
また、上記の測定に用いたものと同じ試料について、比較例１に記載のようにして好塩基求比率又は有核赤血球比率について自動血球計数装置ＸＥ−２１００を用いて測定した。
これらの結果を表３及び４に示す。表３は、試料中の好塩基求比率についての結果を示し、表４は、試料中の有核赤血球比率を示す。
【００８４】
【表３】
【００８５】
【表４】
【００８６】
図４及び５並びに表３及び４の結果から、全炭素数４〜８のアルコールを含有する本発明の試料分析用試薬を用いると、好塩基球が好塩基球以外の白血球成分から明確に分画され、有核赤血球も明確に分画されることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムの模式図を示す。
【図２】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す（実施例１）。
【図３】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す（実施例１）。
【図４】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す（実施例２）。
【図５】本発明の試料分析用試薬を用いて試料を分析する際のスキャッタグラムを示す（実施例２）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好塩基球及び／又は有核赤血球を測定するための試料分析用試薬であって、
全炭素数が４〜８のアルコールと、
一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
Ｒ1及びＲ2は互いに同一又は異なってアルキル基であり；
【化２】
であり；
【化３】
であり；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は互いに同一又は異なって、水素原子又はアルキル基であり；
Ｘ-はアニオンである）
の蛍光色素、及び一般式（ＩＩ）：
【化４】
（式中、
Ｒ7及びＲ8は互いに同一又は異なって酸性基を有していてもよいアルキル基であり；
【化５】
であり；
【化６】
であり；
Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は互いに同一又は異なって、水素原子又は酸性基であるが、
但し、Ｒ7〜Ｒ12のいずれか１つには酸性基が存在し；
Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基は塩を形成していてもよいが、但し、Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基のうちいずれか１つは、プロトンを放出した遊離の基である）
の蛍光色素から選択される少なくとも１種の蛍光色素とを含む試料分析用試薬。
【請求項２】
前記アルコールが、ブタノール、ペンタノール、ヘプタノール、イソブタノール、イソアミルアルコール、２−フェニルエタノール及び２−フェノキシエタノールからなる群より選択される請求項１に記載の試料分析用試薬。
【請求項３】
前記一般式（ＩＩ）のＲ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基が、カルボキシル基又はスルホン酸基である請求項１又は２に記載の試料分析用試薬。
【請求項４】
前記一般式（ＩＩ）のＲ7〜Ｒ12に存在し得る塩を形成している酸性基が、アルカリ金属塩の基又はアルキルアンモニウム塩の基である請求項１〜３のいずれか１つに記載の試料分析用試薬。
【請求項５】
赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与える界面活性剤をさらに含有する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の試料分析用試薬。
【請求項６】
前記界面活性剤が、カチオン界面活性剤である請求項５に記載の試料分析用試薬。
【請求項７】
前記カチオン界面活性剤が、第四級アンモニウム塩又はピリジニウム塩の型である請求項６に記載の試料分析用試薬。
【請求項８】
ｐＨが２．０〜４．５である請求項１〜７のいずれか１つに記載の試料分析用試薬。
【請求項９】
芳香族有機酸をさらに含む請求項１〜８のいずれか１つに記載の試料分析用試薬。
【請求項１０】
前記芳香族有機酸が、サリチル酸、フタル酸及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つである請求項９に記載の試料分析用試薬。
【請求項１１】
好塩基球及び／又は有核赤血球を測定するための試料分析用試薬キットであって、
赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与える界面活性剤と、全炭素数が４〜８のアルコールとを含む溶液と、
請求項１の一般式（Ｉ）の蛍光色素及び請求項１の一般式（ＩＩ）の蛍光色素の少なくとも１種の蛍光色素を含む溶液
とを含む試料分析用試薬キット。
【請求項１２】
全炭素数が４〜８のアルコールと、請求項１の一般式（Ｉ）の蛍光色素及び請求項１の一般式（ＩＩ）の蛍光色素の少なくとも１種の蛍光色素とにより、試料中の血球を染色する工程；
前記染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程；及び
前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球及び／又は有核赤血球を計数する工程
を含む、試料分析方法。
【請求項１】
好塩基球及び／又は有核赤血球を測定するための試料分析用試薬であって、
全炭素数が４〜８のアルコールと、
一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
Ｒ1及びＲ2は互いに同一又は異なってアルキル基であり；
【化２】
であり；
【化３】
であり；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は互いに同一又は異なって、水素原子又はアルキル基であり；
Ｘ-はアニオンである）
の蛍光色素、及び一般式（ＩＩ）：
【化４】
（式中、
Ｒ7及びＲ8は互いに同一又は異なって酸性基を有していてもよいアルキル基であり；
【化５】
であり；
【化６】
であり；
Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は互いに同一又は異なって、水素原子又は酸性基であるが、
但し、Ｒ7〜Ｒ12のいずれか１つには酸性基が存在し；
Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基は塩を形成していてもよいが、但し、Ｒ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基のうちいずれか１つは、プロトンを放出した遊離の基である）
の蛍光色素から選択される少なくとも１種の蛍光色素とを含む試料分析用試薬。
【請求項２】
前記アルコールが、ブタノール、ペンタノール、ヘプタノール、イソブタノール、イソアミルアルコール、２−フェニルエタノール及び２−フェノキシエタノールからなる群より選択される請求項１に記載の試料分析用試薬。
【請求項３】
前記一般式（ＩＩ）のＲ7〜Ｒ12に存在し得る酸性基が、カルボキシル基又はスルホン酸基である請求項１又は２に記載の試料分析用試薬。
【請求項４】
前記一般式（ＩＩ）のＲ7〜Ｒ12に存在し得る塩を形成している酸性基が、アルカリ金属塩の基又はアルキルアンモニウム塩の基である請求項１〜３のいずれか１つに記載の試料分析用試薬。
【請求項５】
赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与える界面活性剤をさらに含有する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の試料分析用試薬。
【請求項６】
前記界面活性剤が、カチオン界面活性剤である請求項５に記載の試料分析用試薬。
【請求項７】
前記カチオン界面活性剤が、第四級アンモニウム塩又はピリジニウム塩の型である請求項６に記載の試料分析用試薬。
【請求項８】
ｐＨが２．０〜４．５である請求項１〜７のいずれか１つに記載の試料分析用試薬。
【請求項９】
芳香族有機酸をさらに含む請求項１〜８のいずれか１つに記載の試料分析用試薬。
【請求項１０】
前記芳香族有機酸が、サリチル酸、フタル酸及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１つである請求項９に記載の試料分析用試薬。
【請求項１１】
好塩基球及び／又は有核赤血球を測定するための試料分析用試薬キットであって、
赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与える界面活性剤と、全炭素数が４〜８のアルコールとを含む溶液と、
請求項１の一般式（Ｉ）の蛍光色素及び請求項１の一般式（ＩＩ）の蛍光色素の少なくとも１種の蛍光色素を含む溶液
とを含む試料分析用試薬キット。
【請求項１２】
全炭素数が４〜８のアルコールと、請求項１の一般式（Ｉ）の蛍光色素及び請求項１の一般式（ＩＩ）の蛍光色素の少なくとも１種の蛍光色素とにより、試料中の血球を染色する工程；
前記染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程；及び
前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球及び／又は有核赤血球を計数する工程
を含む、試料分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−３０６２（Ｐ２００８−３０６２Ａ）
【公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１７５７１６（Ｐ２００６−１７５７１６）
【出願日】平成１８年６月２６日（２００６．６．２６）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２６日（２００６．６．２６）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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