連続培養による化学品の製造方法および製造装置
【課題】膜ろ過流量が変化しても連続培養成績が変化しにくく連続培養法による化学品の製造を長期間に亘って安定に行うことができる方法および装置を提供する。
【解決手段】培養反応槽に貯留されている微生物もしくは培養細胞の培養液を連続的に分離膜へ供給循環し、培養によって生産された化学品を含む濾液を分離膜の透過側で回収するとともに、前記分離膜で濾過されなかった未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流して連続培養を行うに際し、培養反応槽内の酸素移動容量係数ｋＬａの設定値からの減少率を該設定値の３０％以内に抑制する。
【解決手段】培養反応槽に貯留されている微生物もしくは培養細胞の培養液を連続的に分離膜へ供給循環し、培養によって生産された化学品を含む濾液を分離膜の透過側で回収するとともに、前記分離膜で濾過されなかった未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流して連続培養を行うに際し、培養反応槽内の酸素移動容量係数ｋＬａの設定値からの減少率を該設定値の３０％以内に抑制する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の連続培養による化学品の製造方法および製造装置に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、連続培養を行いながら、微生物の培養液から分離膜を通して培養によって生産された化学品を含む液を効率よく濾過・回収する、高い生産性で化学品を製造することが可能な化学品の製造方法および製造装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法のひとつである発酵法は、大きく（１）回分発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と（２）連続培養法に分類することができる。
【０００３】
回分および流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないというメリットがある。しかし、時間経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性及び収率が低下してくる。このため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するのが困難である。
【０００４】
連続培養法は、一般的に、培養装置内で目的物質が高濃度に蓄積するのを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。例えば、非特許文献１には、Ｌ−グルタミン酸やＬ−リジンの発酵について連続培養法が開示されている。しかし、この文献に記載の方法では、培養液へ培養原料の連続的な供給を行うとともに、微生物や培養細胞を含んだ培養液を抜き出すために、培養液中の微生物や培養細胞が希釈される。そのため、現実的には生産効率の向上が限定されたものであった。
【０００５】
また、特許文献１には、連続培養法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を培養液に保持または還流させることで、培養液中の微生物や細胞濃度を高く維持する方法が提案されており、例えば、簡便な操作条件で長時間にわたり安定して高生産性を維持することができる連続培養技術が開示されている。しかしながら、培養液を膜分離槽に循環させながら連続培養を行うと、膜の目詰まりが生じるため、膜ろ過流量の制御が必要になる。一方、膜ろ過流量の制御を行うために循環量（培養反応槽からの送液量）を変化させると、培養成績（対糖収率）が変化してしまう。そのため、培養成績を低下させることなく長期間安定に連続培養を行えない虞がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Toshihiko Hirao et. al. （ヒラオ・トシヒコ ら）、 Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９）
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２５２３６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
背景技術にあるように、長時間にわたり安定して行える連続培養法による化学品の製造方法を提供するにあたり、本発明者らは、鋭意研究を行った結果、膜ろ過流量の制御が重要であることを見出したが、膜ろ過流量の制御のためには、循環量を変化させる必要があり、循環量を変化させることで連続培養成績が変化し安定しないといった問題が新たに発生した。
【０００９】
そこで本発明は、膜ろ過流量が変化しても連続培養成績が変化しにくく連続培養法による化学品の製造を長期間に亘って安定に行うことができる方法および装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、未濾過培養液を培養反応槽に貯留されている培養液中に直接還流させることで課題であった培養成績を低下させることなく長期間安定に連続培養を維持できることを見出し、本発明を完成した。更に未濾過培養液を培養液中に直接環流させることの効果について解析したところ、発酵成績に影響を与える因子の一つである酸素移動容量係数の変化が著しく抑えられることがあることもわかった。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下のいずれかの構成を特徴とするものである。
（１）培養反応槽に貯留されている微生物もしくは培養細胞の培養液を連続的に分離膜へ供給循環し、培養によって生産された化学品を含む濾液を分離膜の透過側で回収するとともに、前記分離膜で濾過されなかった未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流して連続培養を行うに際し、培養反応槽内の酸素移動容量係数ｋＬａの設定値からの減少率を該設定値の３０％以内に抑制することを特徴とする連続培養による化学品の製造方法。
（２）前記未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流するに際し、前記未濾過培養液は、前記培養反応槽に貯留されている培養液中に直接還流させる、前記（１）に記載の連続培養による化学品の製造方法。
（３）前記設定値が７．０であり、前記化学品としてＬ−乳酸またはＤ−乳酸を回収する、前記（１）または（２）に記載の連続培養による化学品の製造方法。
（４）前記微生物が酵母である、前記（３）に記載の連続培養による化学品の製造方法。
（５）微生物もしくは培養細胞を培養した培養液を貯留するための培養反応槽と、該培養反応槽から連続的に循環される前記培養液を濾過する分離膜が配置される膜分離槽と、前記培養液を前記培養反応槽から前記膜分離槽へ循環するとともに濾過されなかった未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流する培養液循環配管とを備え、前記培養反応槽には、前記培養液循環配管の、前記培養反応槽から前記膜分離槽へ前記培養液を供給するための送液口と、前記未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流するための環流口とが接続され、かつ、前記送液口および前記環流口が、前記培養反応槽に貯留される前記培養液に浸漬する位置に開口してなることを特徴とする連続培養による化学品の製造装置。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、簡便装置で、従来以上の長時間にわたり所望の発酵生産物の高生産性を維持する安定した連続培養が可能となり、連続培養によって化学品を低コストで安定して生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の一実施形態を示す連続培養による化学品の製造装置の概略模式図である。
【図２】図２は、本発明の他の実施形態を示す連続培養による化学品の製造装置の概略模式図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一実施形態を示す概略斜視図である。
【図４】図４は、本発明で用いられる分離膜エレメントの他の実施形態を示す概略斜視図である。
【図５】図５は、従来の、連続培養による化学品の製造装置概略模式図である。
【図６】図６は、酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、培養反応槽に貯留されている微生物の培養液を連続的に分離膜へ供給循環し、培養によって生産された化学品を含む濾液を分離膜の透過側で回収するとともに、前記分離膜で濾過されなかった未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流して連続培養を行うに際し、培養反応槽内の酸素移動容量係数（１／ｈ）の設定値からの減少率を該設定値の３０％以内に抑制することを特徴とする連続培養による化学品の製造方法であり、かかる製法は例えば図１に示す装置により実施することができる。
【００１５】
図１に示す装置は、基本的に培養反応槽１と膜分離槽１２と差圧制御装置３とで構成されている。培養反応槽１の外部に設置された膜分離槽１２には、分離膜エレメント２が単数もしくは複数収容されており、また、培養反応槽１と膜分離槽１２は、培養液循環ポンプ１１を介在させた培養液循環配管１１０により、培養液が循環できるように連結されている。そして、該培養液循環配管１１０は、培養反応槽１から膜分離槽１２へ培養液を供給するための送液口１１１と未濾過培養液を培養反応槽１へ還流するための環流口１１２とが、培養反応槽に貯留された培養液に浸漬する位置に開口している。
【００１６】
培養反応槽１には、培養液の攪拌、温度、ｐＨ、溶存酸素濃度、液量などを培養にとって好適な条件に調整することができるように、攪拌機５、温度調節器１０、ｐＨセンサ・制御装置９、ｐＨ調整溶液供給ポンプ８、気体供給装置４、培地供給ポンプ７などが設けられている。
【００１７】
分離膜エレメント１２は、上記したように、培養反応槽の外部に設けられた膜分離槽１２の内部に設けられている。
【００１８】
培養反応槽１と該培養反応槽の外部に設置される膜分離槽１２との間には、培養液を循環させる手段、例えば培養液循環ポンプ１１が設けられる。該ポンプ１１には、例えば渦巻きポンプ、チューブポンプ、ダイヤフラムポンプなど様々な種類があるが、本発明においては、ポンプの出力設定により循環液量が算出できるものが好ましく、好ましくはダイヤフラムポンプが挙げられる。
【００１９】
このような図１の装置において、培養反応槽１には、微生物や培養細胞、さらには培養に用いられる栄養素（培養原料）を含む培地が貯留される。そして、所定の温度等に制御することで培養、発酵が進み、化学品が生成される。
【００２０】
このとき、培地供給ポンプ７によって培地を培養反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で培養反応槽１内の発酵培養液を攪拌したり、培養反応槽内に気体供給装置４で気体を供給する。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって培養液のｐＨを調整したり、温度調節器１０によって培養液の温度を調節する。このようにすることにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００２１】
装置内の培養液は、培養液循環ポンプ１１によって培養反応槽１と膜分離槽１２との間を循環させ、例えば定期的に膜分離を作動させることにより発酵生産物（化学品）を系外に取り出す。すなわち、膜分離槽に送られた培養液は分離膜エレメント２によって微生物を含む未濾過培養液と発酵生産物を含む濾液とに濾過・分離されるため、膜透過側で発酵生産物を含む濾液を回収することで、化学品を装置系から取り出すことができる。一方、濾過・分離された微生物は、培養液循環配管１１０により培養反応槽１に還流することで培養反応系内にとどまることになり、培養反応系内の微生物濃度を高く維持でき、生産性の高い発酵生産を可能としている。
【００２２】
分離膜エレメント２による濾過・分離は、培養反応槽１の水面と膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって、特別な動力を使用することなく実施可能であるが、必要に応じて、レベルセンサ６および差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の発酵培養液量を適当に調節することができる。分離膜エレメント２による濾過・分離は、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することによっても行うことができる。
【００２３】
図２に、本発明の化学品の製造方法を実施するために用いられる他の装置の概略斜視図を示す。図２は、培養液循環配管１１０にも気体供給装置４を設置した以外は図１の装置と同じである。培養液循環配管１１０にも気体供給装置４を設けることで、培養液循環配管１１０および膜分離槽１２に、効率よく気体を循環させることができ、装置の培養・発酵が行われる箇所全体におなじ体積比で気体を供給することが可能である。
【００２４】
次に、上記図１、図２に示すような装置において好ましく用いられる分離膜エレメント２について、説明する。
【００２５】
分離膜エレメント２には、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを用いることができる。
【００２６】
具体的に分離膜エレメント２は、例えば図３に示すように、中空糸膜で構成された分離膜束１３と上部樹脂封止層１４、下部樹脂封止層１５によって主に構成される。分離膜束１３は上部樹脂封止層１４および下部樹脂封止層１５よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層１５による接着・固定化は中空糸膜の中空部を封止しており、培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１４は中空糸膜の中空部を封止しておらず、集水パイプ１７に濾液（すなわち培養によって生産された化学品を含む液）が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム１６を介して膜分離槽に設置することが可能である。分離膜束１３を構成する中空糸膜の外表面を透過して中空部に進入してきた濾液は、該中空部を通り、集水パイプ１７を介して膜分離槽外部に取り出される。濾液を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【００２７】
分離膜エレメント２は、例えば図４示すような構成でもよい。図４に示す分離膜エレメントは、剛性を有する支持板１８の両面に、流路材１９と分離膜２０をこの順序で配して構成されている。支持板１８は、両面に凹部２１を有している。分離膜２０は、培養液をろ過する。流路材１９は、分離膜２０を透過した濾液を効率よく支持板１８に流すためのものである。支持板１８に流れた濾液は、支持板１８の凹部２１を通り、集水パイプ２２を介して膜分離槽外部に取り出される。濾液を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【００２８】
これら分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性を有する部材であることが好ましい。培養反応槽に加えて膜分離槽内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避でき、より安定した連続発酵が可能となる。具体的に分離膜エレメントを構成する部材としては、１２１℃で１５分間という高圧蒸気滅菌の条件に耐性を有するものであることが好ましい。例えば、ステンレス、アルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂、ポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定できる。
【００２９】
次に、本発明で用いることができる分離膜について説明する。
【００３０】
分離膜としては、被処理液の性状や用途に応じた分離性能と透過性能を有する多孔性膜であることが好ましい。多孔性膜としては、セラミックスなどの無機材料、樹脂などの有機材料を素材とした多孔性膜を用いることが可能であるが、好ましくは多孔質樹脂層を含む多孔性の分離膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質樹脂層は多孔質基材に浸透していても浸透していなくてもどちらでも良いが、強度の点で多孔質基材に浸透させた膜が好ましく採用される。
【００３１】
多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与えるものであり、材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布等である。中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは、５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
【００３２】
多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂等が挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有されることをいう。中でも、多孔質樹脂層を構成する膜素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂またはポリオレフィン系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはポリオレフィン系樹脂がより好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００３３】
ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましいが、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。また、ポリオレフィン系樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレンまたは塩素化ポリプロピレンが挙げられるが、塩素化ポリエチレンが好ましく用いられる。
【００３４】
本発明で用いられる分離膜の形状については特に限定はなく、具体的には平膜や中空糸膜が挙げられる。分離膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下である。分離膜の形状が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは、２００μｍ以上５０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは、２０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００３５】
本発明において分離膜として好ましく用いられる多孔性膜の作成法の概要を例示して説明する。
【００３６】
まず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要について説明する。平膜は、多孔質基材の表面に、多孔性樹脂層を構成する樹脂と溶媒とを含む製膜原液の被膜を形成するとともに、その製膜原液を多孔質基材に含浸させ、その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを非溶媒を含む凝固浴と接触させ樹脂を凝固させて多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成することで得られる。
【００３７】
次に、中空糸膜の作成法の概要について説明する。中空糸膜は、多孔性樹脂層を構成する樹脂と溶媒からなる製膜原液を二重管式口金の外側の管から吐出するとともに、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。
【００３８】
得られた中空糸膜の外表面には、別の多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。このような多孔性樹脂層の積層は中空糸膜の性質、例えば、親水・疎水性、細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。
【００３９】
かかる表面に積層される多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて該樹脂を凝固させることによって作製できる。積層の方法は特に限定されず、製膜原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に製膜原液を塗布してもよく、積層後、付着した製膜原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることで積層量を調整することもできる。
【００４０】
以上のように作成される中空糸膜は樹脂などの部材で中空部を接着・封止することで、また平膜は支持体に設置することによって、図３、図４に示す分離膜エレメントとすることができる。なお、本発明においては体積あたりの膜面積を増加させるうえで有利であるという観点から中空糸膜を用いることが好ましい。
【００４１】
本発明の化学品の製造方法においては、以上のような装置を用いて微生物または培養細胞を培養し、培養液を連続的に培養反応槽から分離膜へ供給循環するとともに、例えば定期的に分離膜の原液側と透過液側とに差圧を生じさせて分離膜の透過側で化学品を含む濾液を回収することにより培養液に含まれる化学品を抽出する。なお、膜分離を行っている最中、分離膜で濾過されなかった未濾過培養液は、前記培養反応槽へ還流する。また、微生物または培養細胞を増殖しつつ化学品を生成する連続培養を行うことができるのであれば、培養装置の数は問わない。連続培養操作は、通常、単一の培養装置で行うのが管理上好ましいが、培養装置の容量が小さい等の理由から、複数の培養装置を用いることも可能である。この場合、複数の培養装置を配管で並列または直列に接続して連続培養を行うことで、高い生産性で発酵生産物を得ることができる。
【００４２】
本発明で使用される微生物や培養細胞としては、例えば、工業的によく使用される酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物や細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。これらの微生物や培養細胞のうち、目的とする化学品の生産能力が高いものを選択して用いることが好ましい。なお、本発明においては微生物の培養を「発酵」または「発酵培養」と称することがある。
【００４３】
培養には、微生物または培養細胞の生育を促し、微生物または培養細胞の増殖が連続的に行われ、目的とする化学品が良好に生産されるようにするため、栄養素などの培養原料も用いられる。
【００４４】
培養原料となる栄養素の具体例としては、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなどが使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。
【００４５】
本発明に使用する微生物または培養細胞が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。
【００４６】
栄養素等の培養原料は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、適宜追加されるが、その際、培養開始時の原料組成から適宜変更しても良い。
【００４７】
また、培養にあたっては、消泡剤を必要に応じて使用する。
【００４８】
本発明において、培養反応槽内の培養液中の糖類濃度は５ｇ／ｌ以下に保持されるのが好ましい。当該糖類濃度を５ｇ／ｌ以下に保持することが好ましい理由は、培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。一方、培養反応槽内の培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが、生産性をよくする上で好ましい。該微生物または培養細胞の濃度は、例えば乾燥重量として５ｇ／ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。
【００４９】
なお、本発明において、培養液とは、培養原料により微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言う。
【００５０】
また、微生物または培養細胞の培養は、通常、ｐＨ４−８、温度２０−４０℃の範囲で行われる。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４−８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養反応槽内を加圧して培養する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００５１】
本発明の化学品の製造方法では、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物濃度を高くした後に、連続培養および培養液の引き抜き（膜分離）を開始しても良い。本発明の化学品の製造方法では、微生物濃度を高くした後に、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養および培養液の引き抜きを行っても良い。すなわち、本発明の化学品の製造方法では、適当な時期から培養原料の供給及び培養液の引き抜きを行うことが可能である。培養原料の供給と培養液の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、培養原料の供給と培養液引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
【００５２】
引き抜いた培養液、すなわち、分離膜の透過側で回収した化学品を含む液は、濃縮、蒸留、および晶析などの処理をさらに行って、濃度を高めて回収することが好ましい。
【００５３】
また、本発明の化学品の製造方法では、必要に応じて培養装置内から微生物または培養細胞を引き抜くことができる。例えば、培養装置内の微生物濃度や培養細胞濃度が高くなりすぎると分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、微生物や培養細胞を引き抜くことで分離膜の閉塞を回避することができる。また、培養装置内の微生物濃度や培養細胞濃度によって化学品の生産性能が変化することがあることから、生産性能を指標として微生物または培養細胞を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
【００５４】
なお、引き抜いた微生物や培養細胞は、高圧蒸気滅菌などして死滅させた後、廃棄することが好ましい。
【００５５】
本発明においては、培養液を連続的に培養反応槽から分離膜へ供給し循環させるが、目的とする化学品の生産速度を向上させるには、式（１）に示す通り培養液の抜き取り速度、すなわち濾液流量を大きくすればよい。しかし、濾液流量を大きくすれば、微生物による目詰まりが起こりやすくなり、濾過性能を長期間安定に制御することが困難になる。そこで、本発明においては、培養反応槽と膜分離槽とを循環する培養液の循環量を大きくすることで、膜分離槽内の分離膜の表面を流れる培養液の線速度を増加させ、膜の目詰まりを防ぐことが好ましい。この結果、目的とする化学品の生産速度向上が可能となる。なお、循環量とは培養反応槽から培養液循環配管をへて膜分離槽へと送液される培養液の流量のことを示す。また、発酵培養液量とは、培養反応槽１内の培養液量と培養液循環配管１１０および膜分離槽１２の中の培養液量の合計をいう。
【００５６】
【数１】
【００５７】
そして、本発明においては、以上のような連続培養を行うにあたり、例えば培養液循環配管１１０の、培養液を培養反応槽１から膜分離槽１２へ供給するための送液口１１１および未濾過培養液を膜分離槽１２から培養反応槽１へ還流するための環流口１１２を、培養反応槽１に貯留された培養液に浸漬する位置に開口するようにしておくことで、培養反応槽１内の酸素移動容量係数ｋＬａの設定値からの減少率を該設定値の３０％以内の範囲に抑制する。
【００５８】
ここで、酸素移動容量係数ｋＬａについて説明する。酸素移動容量係数ｋＬａ（以下、単にｋＬａと略す）は、通気攪拌培養時において、単位時間に気相から液相へ酸素を移動させ溶存酸素を生成させる能力を示すものであり、以下の式（２）で表すことができる。また、ｋＬａは、通気攪拌培養時において、気相から供給される酸素と微生物によって消費される酸素とによって表される培養液中の酸素の収支式、式（３）において用いられる（生物工学実験書、日本生物工学会編、培風館、ｐ．３１０（１９９２））。
【００５９】
【数２】
【００６０】
【数３】
【００６１】
培養反応槽におけるｋＬａは、亜硫酸酸化法(バッチ法・連続法)、気体置換法（Gassing out法(スタティック法、ダイナミック法)）、排気ガス分析法などで測定できる（前掲生物工学実験書、ｐ３１１等）。以下に、気体置換法（ダイナミック法）によるｋＬａの測定の一例を示す。
【００６２】
まず、培養反応槽に水あるいは使用する培地をいれ、これらの液体中の酸素を窒素ガスにより置換するかあるいは亜硫酸ナトリムをほぼ飽和濃度に達する程度に加えることなどにより脱酸素するかして、該液体の酸素濃度を低下させる。次いで、かかる液体中に溶存酸素濃度電極を差し込み、通気速度、攪拌速度および温度を任意の条件に設定し、その条件での溶存酸素の上昇過程を測定する。ここで、上記式（２）より、下記式（４）が導かれるため、通気した時間に対して、Ｃ＊−Ｃの対数をプロットすることで、ｋＬａを求めることができる。
【００６３】
【数４】
【００６４】
本発明においては、予めこの測定を繰り返して発酵力価が高く維持されるｋＬａ（設定値）を見出しておき、連続培養により化学品を製造する際に、その設定値に対して減少率が当該設定値の３０％以内になるようにする。
【００６５】
ｋＬａは様々な要素で変動する。当該要素は、例えば、培養液の液量、培養反応槽の攪拌、通気量、温度などが挙げられ、これらは連続培養中にも比較的制御が容易である。また、ｋＬａは、液面の振動によっても変化する。たとえば未濾過培養液を培養反応槽１に環流する際に、培養反応槽１内の培養液液面から離れた上方位置から未濾過培養液を落とし入れるように戻すと、培養液の液面が大きく振動しｋLaが大きく変化する。しかしながら、液面の振動は制御が困難である。そこで、本発明においては、培養液循環配管１１０を、培養反応槽１から膜分離槽１２へ培養液を供給するための送液口１１１と、未濾過培養液を培養反応槽１へ還流するための環流口１１２とが、培養反応槽１に貯留された培養液に浸漬する位置に開口するように設け、未濾過培養液が膜分離槽１２を経て培養反応槽１へ還流するに際し、培養反応槽１に貯留されている培養液の中に直接還流するようにすることが好ましい。こうすることで、液面を大きく乱すことがなくなり、結果的にｋＬａの設定値からの減少率を３０％以内の範囲に抑制することが可能である。
【００６６】
培養反応槽内の酸素移動容量係数ｋＬａの設定値からの減少率を該設定値の３０％以内に抑えて培養することにより、高発酵力価を維持した培養が可能となる。たとえば、ｋＬａが設定値より３０％以上減少すると、最適培養条件よりも嫌気培養になりすぎて、糖消費速度が低下し、炭素源が過剰にあまり、目的の化学品の生産速度が低下する。これに対して、ｋＬａの減少率を３０％以内に抑制する本発明によれば、対糖収率などの連続培養成績が変化しにくく、安定して連続発酵を行うことができるので、従来の回分発酵と比較して、高い体積生産速度で化学品が得られ、極めて効率のよい化学品の製造が可能となる。
【００６７】
ここで、連続培養における化学品の生産速度は、次の式（５）で計算される。また、連続培養における対糖収率は、次の式（６）で計算され、ある一定期間内で原料炭素源を消費し生成された化学品量（ｇ）を、その期間の投入炭素源量（ｇ）で除して求められる。
【００６８】
【数５】
【００６９】
【数６】
【００７０】
なお、回分培養での化学品生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【００７１】
本発明における化学品としては、微生物または培養細胞が培養液中に生産する物質であれば制限はなく、培養する微生物や培養細胞によって適宜選択されうる。該化学品の具体例としては、アルコール、有機酸など発酵工業において大量生産が望まれる物質を挙げることができる。例えば、アルコールとして、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオール、グリセロールなど、また、有機酸として、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、などである。また、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ―フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−チロシン、メチオニン、セリン、バリン、ロイシンなどのアミノ酸や、イノシン、グアノシンなど核酸、カダベリンなどのジアミン化合物、酵素、抗生物質、組換えタンパク質を挙げることができる。
【００７２】
次に、上述の化学品の製造に用いることができる微生物または培養細胞を、具体的な化学品を例示しながら説明する。
【００７３】
本発明の化学品の製造方法は、例えばＬ−乳酸の生産に用いることが出来る。Ｌ−乳酸とは、乳酸の光学異性体の一種であり、その鏡像体であるＤ−乳酸と明確に区別することができる。Ｌ−乳酸の製造に用いられる微生物あるいは培養細胞としては、Ｌ−乳酸を生産することが可能な微生物であれば特に制限はないが、例えば乳酸菌を用いることができる。ここで乳酸菌とは、消費したグルコースに対して対糖収率として５０％以上の乳酸を産生する原核微生物として定義することができる。
【００７４】
好ましい乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラゲノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バゴコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｇｅｎｕｓ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アトポビウム属（Ｇｅｎｕｓ Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する乳酸菌が挙げられる。それらの中でも、乳酸の対糖収率が高い乳酸菌を選択して乳酸の生産に好ましく用いることができ、更にその中でも、Ｌ―乳酸の対糖収率の高い乳酸菌を選択して乳酸の生産に好ましく用いることができる。
【００７５】
Ｌ−乳酸の対糖収率が高い乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ラクトバシラス・アニマリス（Lactobacillus animalis）、ラクトバシラス・アジリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバシラス・アビアリエス（Lactobacillus aviaries）、ラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス・デルブレッキ（Lactobacillus delbruekii）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバシラス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシラス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ラクトバシラス・サリバリス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバシラス・シャーピイ（Lactobacillus sharpeae）、ラクトバシラス・デクストリニクス（Pediococcus dextrinicus）、およびラクトバシラス・ラクティス（Lactococcus lactis）などが挙げられ、これらを選択して、Ｌ−乳酸の生産に用いることが可能である。
【００７６】
また、本発明によりＬ−乳酸を製造する場合、人為的に乳酸生産能力を付与、あるいは増強した微生物または培養細胞を用いることができる。例えば、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｌ−ＬＤＨと言うことがある）を導入して、Ｌ−乳酸生産能力を付与、あるいは増強した微生物または培養細胞を用いることができる。Ｌ−乳酸生産能力を付与、あるいは増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物がＬ−ＬＤＨを組み込むことによりＬ−乳酸生産能力が増強した組換え微生物が挙げられる。
【００７７】
Ｌ−乳酸を製造する場合、組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましくは酵母である。酵母のうち好ましくはサッカロマイセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母であり、更に好ましくはサッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００７８】
Ｌ−ＬＤＨとしては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）とＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしていれば限定されない。例えば、Ｌ―乳酸の対糖収率の高い乳酸菌由来のＬ−ＬＤＨを用いることができる。好適にはほ乳類由来Ｌ−ＬＤＨを用いることができる。このうちホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来、およびカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることができる。カエルの中でもコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。
【００７９】
本発明に用いられるヒトまたはカエル由来のＬ−ＬＤＨには、遺伝的多型性や、変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいう。変異誘発は、例えば、部位特異的変異導入用キット（Mutan-K（タカラバイオ社製））を用いる方法や、ランダム変異導入用キット（BD Diversify PCR Random Mutagenesis（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いる方法などがある。また、本発明で使用するヒトまたはカエル由来のＬ−ＬＤＨは、ＮＡＤＨとピルビン酸をＮＡＤ＋とＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしているならば、塩基配列の一部に欠失または挿入が存在していても構わない。
【００８０】
本発明によりＬ―乳酸を製造する場合、分離膜の透過側で回収した化学品を含む液（以降、「濾過・分離発酵液」と称する場合がある）は、さらに従来から知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法により分離・精製することが好ましい。例えば、回収した濾過・分離発酵液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。中でも、濾過・分離発酵液の水分を蒸発させた濃縮Ｌ−乳酸溶液を蒸留操作にかける方法が好ましい。ここで、濃縮Ｌ−乳酸溶液を蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。Ｌ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｌ−乳酸を得ることができる。留出液としてエタノールや酢酸等の低沸点成分を含むＬ−乳酸水溶液が得られる場合は、低沸点成分をＬ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＬ−乳酸を得ることもできる。
【００８１】
本発明の化学品の製造方法は、例えばD−乳酸の生産に用いることも出来る。
【００８２】
Ｄ−乳酸生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、Ｄ−乳酸を生産することが可能な微生物であれば制限はないが、例えば、野生型株では、Ｄ−乳酸を合成する能力を有するラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物が挙げられる。
【００８３】
また、本発明によりＤ−乳酸を製造する場合、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｄ−ＬＤＨともいうことがある）の酵素活性を増強している野生型株の微生物を用いることも好ましい。酵素活性を増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物がＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組み込むことによりＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増強した組換え微生物が挙げられる。
【００８４】
Ｄ−乳酸を製造する場合、組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましくは酵母である。
【００８５】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、およびバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子であることが好ましく、更に好ましくはバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子である。
【００８６】
なお、本発明によりＤ−乳酸を製造する場合も、先に記載したＬ―乳酸を製造する場合と同様に、濾過・分離発酵液に含まれるＤ−乳酸の分離・精製を行うことが好ましい。
【００８７】
そして、本発明によりエタノールを製造する場合は、ピルビン酸を生産することが可能な微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はないが、例えば、サッカロミセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルベロマイセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母を用いることができる。このうちサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）を好適に用いることができる。また、ラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ザイモモナス属（Ｇｅｎｕｓ Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌も好ましく用いることができる。このうち、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）を好適に用いることができる。
【００８８】
エタノールの生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、人為的にエタノール生産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよい。具体的には、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。一部性質が改変されたものの一例としては、リゾパス属に属するカビのグルコアミラーゼ遺伝子を組み込み生でんぷんの資化能力を獲得した酵母を挙げることができる（微生物、３：５５５−５６４（１９８７））。
【００８９】
また、本発明によりエタノールを製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるエタノールの分離・精製は、例えば、蒸留法による精製法や、ＮＦ、ＲＯ膜、あるいはゼオライト製の分離膜を用いた濃縮・精製法により好適に行うことができる。
【００９０】
本発明によりピルビン酸を製造する場合は、ピルビン酸を生産することが可能な微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はないが、例えば、シュードモナス属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アシネトバクター属（Ｇｅｎｕｓ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌を好ましく用いることができる。さらに好ましくは、シュードモナス・フルオレエセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエロギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌を用いることができる。これら細菌を突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変したものを用いてもよい。例えば、酸化的リン酸化によるＡＴＰ生産に直接関与するＡＴＰａｓｅ遺伝子を変異、または欠失させた細菌も好ましく用いられる。またカビ、酵母なども好ましく用いることができる。例えば、サッカロミセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ）、カンジダ属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｎｄｉｄａ）、シゾフィリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）に属するカビ、酵母を用いることができる。さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・コプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｏｐｓｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ）、シゾフィリウム・コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）などのカビ、酵母を用いてピルビン酸を製造することが出来る。
【００９１】
本発明によりピルビン酸を製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるピルビン酸の分離・精製は、陰イオン交換カラムを用いた方法により行うことができる。例えば、特開平６−３４５６８３に示される弱塩性イオン交換体を用いた精製法を好適に用いることができる。
【００９２】
次に、本発明によりコハク酸を製造する場合は、コハク酸を生産することが可能な微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はないが、例えば、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属やアクチノバシラス（Actinobacillus）属に属する細菌を好適に利用することができる。具体的には、米国特許第５１４３８３３号明細書に記載のアナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）やJames B. Mckinlay （ジェームズ Ｂ.マッキンリー）らが開示しているアクチノバシラス・サクシノジェネス（Actinobacillus succinogenes）を挙げることができる（Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー）,７１,６６５１−６６５６ （２００５）。また、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属やブレビバクテリウム（Brevibacterium）属などのコリネ型細菌（Coryneform bacterium）、および大腸菌（Escherichia）なども利用可能である。コリネ型細菌では、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）などが好適である。
【００９３】
また、微生物としては、遺伝子組換えによって、コハク酸の生産能力が改善された微生物を用いることができ、これによりコハク酸の生産性を向上させることも可能である。このような微生物としては、例えば、特開２００５−２７５３３号公報に記載の乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase）を欠損したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）や、非特許文献１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、米国特許第５７７０４３５号明細書に記載のピルビン酸・ギ酸開裂酵素（pyruvate formate lyase）と乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase）の欠損株である大腸菌ＡＦＰ111株などを使用することができる。
【００９４】
本発明によりコハク酸を製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるコハク酸の分離・精製には、通常のコハク酸の精製法を適用することができる。例えば、特開２００５−３３３８８６号公報に示されている水分解電気透析処理と減圧濃縮・晶析を組み合わせた精製法を好適に用いることができる。
【００９５】
本発明によりイタコン酸を製造する場合は、イタコン酸を生産することが可能な微生物であれば特に制限はないが、例えばカビあるいは酵母を好ましく用いることができる。更に好ましくは、アスペルギルス属（Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、あるいはウスティラゴ属（Ｇｅｎｕｓ Ｕｓｔｉｌａｇｏ）に属するカビ、およびカンジダ属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｇｅｎｕｓ Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）に属する酵母を用いたイタコン酸の生産が挙げられる。中でも、アスペルギルス テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス イタコニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｉｔａｃｏｎｉｃｕｓ）、ウスティラゴ メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、ウスティラゴ シノドンティス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）、およびウスティラゴ ラベンホルスティナ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｒａｂｅｎｈｏｒｓｔｉｎａ）のカビ、あるいはカンジダ アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）を、イタコン酸の生産に好ましく用いることができる。
【００９６】
本発明によりイタコン酸を製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるイタコン酸の分離・精製は、好ましくは、限外濾過や電気透析を用いて行うことができる。例えば、特公昭−５０９５８号公報に示される限外濾過、および塩型カチオン交換樹脂膜を用いた電気透析による精製法を好適に用いることができる。
【００９７】
本発明により１，３−プロパンジオールを製造する場合は、１，３−プロパンジオールを生産することが可能な微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はないが、例えば、野生型株ではグリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有するクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が挙げられる。
【００９８】
そして、１，３−プロパンジオールを製造する場合、微生物は、（ａ）グリセロールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｂ）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子；及び（ｃ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでいることが好ましい。本発明では、更に好ましくは、微生物は、組換え微生物で１，３−プロパンジオールを生産可能にすることが挙げられる。
【００９９】
かかる組換え微生物としては、１，３−プロパンジオールを製造する場合、グリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有する微生物は、好ましくは、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクテル（Ｃｙｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテル（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）より成る群から選ばれる組換え微生物が好ましく、更に好ましくはエッシェリシア コリである。
【０１００】
また、組換え微生物は、グルコースから効率よく１，３−プロパンジオールを生産する事ができるようにする改良を行ったほうが好ましい。組換え微生物は、例えば、（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び（ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んだ組換え微生物であることが好ましく。
【０１０１】
更にグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子がｄｈａレギュロンから単離されるｏｒｆＸ及びｏｒｆＺによりコードされる遺伝子を含んだ組換え微生物であることが更に好ましい。更には、組換え微生物は、グリセロールキナーゼ活性および／またはグリセロールデヒドロゲナーゼ活性および／またはトリオースリン酸イソメラーゼ活性を欠失した組換え微生物であることが好ましい。
【０１０２】
本発明により１，３−プロパンジオールを製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれる１，３−プロパンジオールの分離・精製は、濃縮、晶析により行うことができる。例えば、特開平−３５７８５号公報に示される減圧濃縮・晶析を用いた精製法を好適に用いることができる。
【０１０３】
本発明によりカダベリンを製造する場合は、カダベリンを生産することが可能な微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はないが、例えば、リジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターの酵素活性を増強している微生物が好ましい。更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターをコードする遺伝子を組み込んだ組換え微生物が挙げられる。更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が１または２種類以上組み込まれている組換え微生物である。
【０１０４】
カダベリンを製造する場合、組換え微生物としては大腸菌およびコリネ型細菌が好ましく、更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素活性を有し、かつホモセリン栄養要求性またはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性の少なくともいずれか１つの特徴を有しているコリネ型細菌である。更には、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることが好ましく。遺伝子挿入変異生成によりホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることが更に好ましい。また、コリネ型細菌の属が、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属からなる群より選ばれる少なくとも１つの属であることが好ましい。更に好ましくは、コリネバクテリア・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｕｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。
【０１０５】
本発明によりカダベリンを製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるカダベリンの分離・精製は、濃縮、蒸留および晶析などの従来知られている方法を組み合わせて行うことができる。例えば、特開２００４−２２２５６９号公報に示される晶析を用いた精製法を好適に用いることができる。本発明によって得られるカダベリンは、連続培養の際に用いられる酸によって様々なポリマー原料にすることができるが、好純度が求められるポリマー原料用途では晶析による精製方法が好ましく用いられる。塩酸により培養液のｐＨを維持すると、濾過・分離発酵液からは晶析工程によりカダベリン二塩酸塩を回収することができる。更に、連続培養の際にジカルボン酸により培養液のｐＨを維持し、濾過・分離発酵液から晶析工程によりカダベリン・ジカルボン酸塩を回収することも好ましい。そのジカルボン酸は、官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族および／または芳香族のジカルボン酸であることが、更にはアジピン酸、セバシン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸またはテレフタル酸のいずれかであることが、好ましい。
【実施例】
【０１０６】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために、上記化学品として、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、エタノール、ピルビン酸、コハク酸、１，３−プロパンジオール、イタコン酸、カダベリンを選定し、それぞれの化学品を生産する能力のある微生物あるいは培養細胞による、図１および図２に示す装置を用いた連続発酵の具体的な実施形態について、実施例を挙げて説明する。
【０１０７】
（参考例１） 多孔性膜の作製（その１）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し、製膜原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【０１０８】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社製、商品名“イオネットＴ−２０Ｃ”（登録商標））を５重量％、および水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して、コーティング原液を調整した。このコーティング原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させ、以下の実施例、比較例で用いる中空糸膜（多孔性膜）を製作した。
【０１０９】
得られた多孔性膜の被処理液側表面（外側表面）の平均細孔径は、０．０５μｍであった。また、この多孔性膜について純水透過係数を評価したところ、５．５×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。なお、純水透過係数の測定は、逆浸透膜で調製した２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差は０．００６μｍであった。
【０１１０】
（参考例２） 多孔性膜の作製（その２）
ポリフッ化ビニリデン１５．９重量％、塩化リチウム０．９重量％、水３．７重量％およびポリビニルピロリドン２．３重量％を、溶媒のジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）７７．２重量％に加えて混合し十分に溶解させ製膜原液を調製した。次に、得られた製膜原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、ポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、相対湿度が８０％の空気に２分間放置し、直ちに５０℃の温度の温水浴中に５分間浸漬して、多孔質基材上に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
【０１１１】
得られた多孔性膜の多孔質樹脂層表面を、倍率１，５００倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細孔すべての直径の平均は、２．０μｍであった。また、この多孔性膜について、純水透過係数を評価した結果、３．０×１０−６ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。なお、純水透過係数の測定は、逆浸透膜で調製した２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。
【０１１２】
（参考例３） Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
乳酸生産能力を有する酵母として、配列番号１に記載の塩基配列を有するアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子がＰＤＣ１遺伝子、ＳＥＤ１遺伝子、およびＴＤＨ３遺伝子座に導入された酵母を作製した。アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子のクローニングはＰＣＲ法により行った。ＰＣＲには、アフリカツメガエルの腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（STRATAGENE社製）より付属のプロトコールに従い調製したファージミドＤＮＡを鋳型とした。
【０１１３】
ＰＣＲ増幅反応には、KOD-Plus polymerase（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のように付属のプロトコールに従い調整したファージミドＤＮＡを５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号２，３）には、５末端側にはＳａｌＩ認識配列、3末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【０１１４】
ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をT4 polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。
【０１１５】
上記アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、定法に従いアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子を含む断片を精製した。得られたｌｄｈ遺伝子を含む断片を、図６に示す発現ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断することにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入された発現ベクターを選抜した。以後、このようにして作製したアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子を組み込んだ発現ベクターをｐＴＲＳ１０２とする。
【０１１６】
このｐＴＲＳ１０２を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，５）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子及びＴＤＨ３ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号４は、ＰＤＣ１遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【０１１７】
次に、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号６，７）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＴＲＰ１遺伝子を含む１．２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号７は、ＰＤＣ１遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【０１１８】
それぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，７）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、５末端・３末端にそれぞれＰＤＣ１遺伝子の上流・下流６０ｂｐに相当する配列が付加された、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーター及びＴＲＰ１遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
【０１１９】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、酵母サッカロミセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換し、トリプトファン非添加培地で培養することにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【０１２０】
上記のようにして得られた形質転換株が、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号７，８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、Ｂ２株とする。なお、ＰＤＣ１遺伝子の上流及び下流配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（URL:http://www.yeastgenome.org/）より取得することができる。
【０１２１】
続いてこのＢ２株に、配列番号１に記載のｌｄｈ遺伝子をＳＥＤ１遺伝子座に導入した。ＳＥＤ１遺伝子座への導入は、参考例１で作製したｐＴＲＳ１０２を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号５，９）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子及びＴＤＨ３ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号９は、ＳＥＤ１遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【０１２２】
次に、プラスミドｐＲＳ４２３を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号６，１０）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＨＩＳ３遺伝子を含む約１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号１０は、ＳＥＤ１遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【０１２３】
それぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた二種類の約１．３ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号９，１０）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、５末端・３末端にそれぞれＳＥＤ１遺伝子の上流・下流６０ｂｐに相当する配列が付加された、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーター及びＨＩＳ３遺伝子が連結された約２．６ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
【０１２４】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、Ｂ２株に形質転換し、ヒスチジン非添加培地で培養することにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＳＥＤ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【０１２５】
上記のようにして得られた形質転換株が、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＳＥＤ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１１，１２）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．９ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約１．４ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＳＥＤ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、ＳＵ０１４−Ｉ株とする。
【０１２６】
続いてＳＵ０１４−Ｉに配列番号１に記載のｌｄｈ遺伝子をＴＤＨ３遺伝子座に導入した。ＴＤＨ３遺伝子座への導入は、ｐＴＲＳ１０２のＴＤＨ３ターミネーターをＡＤＨ１ターミネーターに変更したプラスミドを作製した。
【０１２７】
まず、ＮＢＲＣ１０５０５株からゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）によりゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号１３，１４）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＡＤＨ１プロモーターを含むＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号１３には、５末端側にはＮｏｔＩ認識配列、配列番号１４には3末端側にはＨｉｎｄＩＩＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【０１２８】
ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をT4 polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＡＤＨ１ターミネーターが挿入されているプラスミドを選抜した。作製したプラスミドをｐＵＣ１１８−ＡＤＨ１ｔとする。
【０１２９】
次にｐＵＣ１１８−ＡＤＨ１ｔを制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常定法に従いＡＤＨ１ターミネーターを含む断片を精製した。得られたＡＤＨ１ターミネーターを含む断片を、ｐＴＲＳ１０２のＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、ＴＤＨ３ターミネーターがＡＤＨ１ターミネーターに変更されたプラスミドを選抜した。以後、このようにして作製したプラスミドをｐＴＲＳ１５０とする。
【０１３０】
このｐＴＲＳ１５０を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１５，１６）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子及びＡＤＨ１ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号１６のプライマーは、ＴＤＨ３遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【０１３１】
次に、プラスミドｐＲＳ４２６を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１７，１８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＵＲＡ３遺伝子を含む１．２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号１８のプライマーは、ＴＤＨ３遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【０１３２】
それぞれのＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１６，１８）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子、ＡＤＨ１ターミネーター及びＵＲＡ３遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
【０１３３】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、ＳＵ０１４−Ｉ株に形質転換し、ウラシル非添加培地で培養することにより、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【０１３４】
上記のようにして得られた形質転換株が、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１９，２０）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株をＳＵ０１４−ＩＩ株とする。
【０１３５】
次に、国際公開ＷＯ２００７／０９７２６０号公報に記載されている、ｐｄｃ５遺伝子に温度感受性変異を有する酵母ＳＷ０１５株と上記得られたＳＵ０１４−ＩＩ株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得し、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞の中から、ｐｄｃ１遺伝子、ｓｅｄ１遺伝子、ｔｄｈ３遺伝子座にアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入され、かつ、ｐｄｃ５遺伝子に温度感受性変異を有する（３４℃で生育不能）株をＭＡＴａ、およびＭＡＴαのそれぞれの接合型を選択した。得られた酵母株のうちＭＡＴａの接合型を有する株をＳＵ０１４―８Ａ株、ＭＡＴαの接合型を有する株をＳＵ０１４―３Ｂ株とした。
【０１３６】
（参考例４） リジン栄養要求性復帰株の作成
参考例３で得られたＳＵ０１４−８Ａ株のリジン要求性を復帰させた。フナコシ社製のＢＹ４７４１のゲノムDNA を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号２１，２２）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＬＹＳ２遺伝子の前半約２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅させた。上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、ＳＵ０１４―８Ａ株に形質転換し、ｌｙｓ２遺伝子のアンバー変異を解除した。リジン非添加培地で培養することにより、リジン合成能が復帰した形質転換株を選択した。
【０１３７】
上記のようにして得られた形質転換株が、ｌｙｓ２遺伝子のアンバー変異を解除された酵母であることの確認は下記のように行った。まず、得られた形質転換体と野生型のＬＹＳ２遺伝子を持つ２０ＧＹ７７株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得し、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞のすべてがリジン合成能を持っていることを確認した。なお、ｌｙｓ２の変異が解除されずにリジン合成能が復帰した場合には、上記で得られる１倍体細胞のうち、リジン合成能を持たない細胞が得られる。以下ＳＵ０１４−８Ａ株のリジン合成能が復帰した株をＨＩ００１とする。
【０１３８】
（参考例５） リジン栄養要求性復帰株の取得
参考例３で得られたＳＵ０１４−３Ｂ株のロイシン要求性を復帰させた。ＰＲＳ４２５ を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号２３，２４）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＬＥＵ２遺伝子のＰＣＲ断片約２ｋｂを増幅させた。上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、ＳＵ０１４―３Ｂ株に形質転換し、ｌｅｕ２遺伝子の変異を解除した。ロイシン非添加培地で培養することにより、ロイシン合成能が復帰した形質転換株を選択した。
【０１３９】
上記のようにして得られた形質転換株が、ｌｅｕ２遺伝子の変異を解除された酵母であることの確認は下記のように行った。まず、得られた形質転換体と野生型のＬＥＵ２遺伝子を持つ２０ＧＹ７株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得し、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞のすべてがロイシン合成能を持っていることを確認した。なお、ｌｅｕ２遺伝子の変異が解除されずにロイシン合成能が復帰した場合には、上記で得られる１倍体細胞のうち、ロイシン合成能を持たない細胞が得られる。以下ＳＵ０１４−３Ｂ株のロイシン合成能が復帰した株をＨＩ００２とする。
【０１４０】
（参考例６） ２倍体原栄養株の取得
参考例４及び参考例５で得られたＨＩ００１株とＨＩ００２株とを接合させ、栄養要求性のない２倍体原栄養株を得た。得られた株を以下ＨＩ００３とする。
【０１４１】
（参考例７） ２倍体栄養要求性株の取得
参考例３で得られたＳＵ０１４−８Ａ株とＳＵ０１４−３Ｂ株とを接合させ、栄養要求性のある２倍体栄養要求性株を得た。得られた株をＳＵ０１４とする。
【０１４２】
（参考例８） 乳酸など培地成分の定量
乳酸は、濾液の遠心上清について、以下の条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
【０１４３】
カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【０１４４】
また、Ｌ−乳酸およびＤ−乳酸の濃度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【０１４５】
カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：３０℃。
【０１４６】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算した。
【０１４７】
光学純度（%）＝100×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【０１４８】
また、スクロース、グルコース、フラクトース濃度の測定は、濾液の遠心上清について、以下の条件でＨＰＬＣ法により測定することで確認した。
【０１４９】
カラム：Asahipak NH2P-50 4E(SHODEX社製)
移動相：75 %アセトニトリル溶液
検出方法：示差屈折率
温度：３０℃
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ。
【０１５０】
（比較例１） ２倍体原栄養株を用いたバッチ培養
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行い、Ｌ−乳酸生産性を評価した。すなわち、図１の連続培養装置の培養反応槽１のみを用いた回分発酵試験を行った。酵母乳酸発酵培地には、表１に示すように原料糖（粗糖）等を使用した。原料糖としては、ムソー株式会社の優糖精（商品名）を使用した。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。微生物としては上記の参考例６で造成した酵母ＨＩ００３株を用い、濾液中の生産物（乳酸）の濃度および濾糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣ法を用いた。
【０１５１】
【表１】
【０１５２】
培養の条件を以下に示す。
【０１５３】
・培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
・温度調整：３２（℃）
・培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ Ｃａ(ＯＨ)２によりｐＨ５に調整
・培養反応槽は１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
【０１５４】
具体的には、まず、ＨＩ００３株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を図１の連続培養装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、通気した。温度の調整とｐＨの調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働させることなく、回分発酵培養を行った。回分発酵の結果を表２に示す。乳酸対糖収率は、８０％であった。また、この培養時のｋＬａは７．０であった。
【０１５５】
【表２】
【０１５６】
（比較例２） 外部循環装置を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造
Ｌ−乳酸を生産させる微生物として上記の参考例６で造成した酵母ＨＩ００３株を用い、培地として表３に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、図５の連続培養装置によりＬ−乳酸の製造を行った。なお、図５に示す装置は、分離膜エレメント２が、培養反応槽１の外部に設置され、培養反応槽１には、培養液循環配管１１０の培養反応槽１から膜分離槽１２へ培養液を供給するための送液口１１１と、未濾過培養液を膜分離槽１２から培養反応槽１へ還流するための環流口１１２とが接続され、かつ、送液口１１１が培養反応槽１に貯留される培養液に浸漬する位置に開口してなり、環流口１１２が培養反応槽１に貯留される培養液に浸漬しない位置に開口しているものであり、環流口１１２が培養液に浸漬しない位置に開口している以外は図１の連続培養装置と同じものである。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０１５７】
【表３】
【０１５８】
培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。濾液中の生産物（乳酸）の濃度および糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０１５９】
培養の条件を以下に示す。
【０１６０】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
温度調整：３２（℃）
培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ Ｃａ(ＯＨ)２によりｐＨ５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
培養液の循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
濾液流量制御：膜間差圧による流量制御
（膜間差圧：０．１ｋＰａ〜２０ｋＰａ未満で制御）
具体的には、まず、ＨＩ００３株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図５に示す連続培養装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働させ（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量が２Ｌ（培養反応槽分１．５Ｌ、培養液循環配管分および膜分離槽分で合計０．５Ｌ）となるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの濾液量の制御は、差圧制御装置３により、適宜変化させることで行った。適宜、濾液中のＬ−乳酸濃度および残存糖濃度を測定した。
【０１６１】
８００時間の連続発酵試験を行った結果を表４に示す。図５に示す連続培養装置を用いて外部循環を行いながら発酵を行うことで、回分発酵の比較例１より若干乳酸対糖収率が低下した。乳酸対糖収率は、７３％であった。また、この培養時のｋＬａは９．１であった。
【０１６２】
【表４】
【０１６３】
（比較例３） 循環量を変化させたときのろ過流量の変化
生産速度を向上させるには、上記式（１）、式（５）に示した通り培養液の抜き取り速度すなわち濾液流量を大きくすれば向上する。しかし、濾液流量を大きくすれば、微生物による目詰まりが起こりやすくなり、濾過性能を長期間安定に制御することが困難になる。
【０１６４】
そこで、培養反応槽−膜分離槽間の培養液の循環量を大きくすることで、クロスフロー流速を発生させ、膜表面を洗浄することにより、微生物による目詰まりが起こりにくくなり、濾液流量を大きくしても濾過性能を安定に維持できるか、以下の運転条件にて確認を行った。
【０１６５】
Ｌ−乳酸を生産させる微生物として、上記の参考例６で造成した酵母ＨＩ００３株を用い、培地として表３に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、図５の連続培養装置によりＬ−乳酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０１６６】
培養の条件を以下に示す。
【０１６７】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
温度調整：３２（℃）
培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ Ｃａ(ＯＨ)２によりｐＨ５に調整
培養液循の循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）。
【０１６８】
具体的には、まず、ＨＩ００３株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図５に示す連続培養装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働させ（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。また、循環量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。６００時間の連続発酵試験を行った結果を表５に示す。循環量を大きくすることで、濾液流量が向上することが明らかとなった。また、循環量ごとのｋＬａを測定した結果、０．２５Ｌ／ｍｉｎの運転時にｋＬａが回分培養時と同じ７．０となった。また、０．５Ｌ／ｍｉｎの運転時はｋＬａが３．１、１．０Ｌ／ｍｉｎの運転時はｋＬａが１．９であった。
【０１６９】
【表５】
【０１７０】
（実施例１） 酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その１）
Ｌ−乳酸を生産する微生物として、上記の参考例６で造成した酵母ＨＩ００３株を用い、培地として表３に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、図１の連続培養装置によりＬ−乳酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物である乳酸の濃度および残存糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０１７１】
培養の条件を以下に示す。
【０１７２】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
温度調整：３２（℃）
培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０１７３】
具体的には、まず、ＨＩ００３株を試験管で５ｍｌの酵母乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な酵母乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の１．５Ｌの酵母発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、酵母乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。また、循環量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中のＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。
【０１７４】
６００時間の連続発酵試験を行った結果を表６に示す。ｋＬａは、回分培養で対糖収率の高かった７．０（設定値）の条件で培養を開始したところ、循環量を大きくすると低下したものの、その減少率は設定値の３０％以内に収まっていた。図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定した収率でＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１７５】
なお、ｋＬａの減少率は、ｋＬａの設定値とある時点でのｋＬａ値との差を当該設定値で除し、その値に１００を乗じることで算出する。
【０１７６】
（実施例２） 酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜として参考例２で作製した多孔性膜、図４に示す分離膜エレメントを構成した以外は実施例１と同様の条件で、Ｌ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表６に示す。ｋＬａは、回分培養で対糖収率の高かった７．０（設定値）の条件で培養を開始したところ、循環量を大きくすると低下したものの、その減少率は設定値の３０％以内に収まっていた。図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定した収率でＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
（実施例３） 酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その３）
Ｌ−乳酸を生産する微生物として、上記の参考例６で造成した酵母ＨＩ００３株を用い、培地として表３に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、図２の連続培養装置によりＬ−乳酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物である乳酸の濃度および残存糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０１７７】
培養条件を以下に示す。
【０１７８】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
温度調整：３２（℃）
培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．０３（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０１７９】
具体的には、まず、ＨＩ００３株を試験管で５ｍｌの酵母乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な酵母乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示す連続培養装置の１．５Ｌの酵母発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、酵母乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。また、循環量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。
【０１８０】
６００時間の連続発酵試験を行った結果を表６に示す。ｋＬａは、回分培養で対糖収率の高かった７．０（設定値）の条件で培養を開始したところ、循環量を大きくしてもほぼ一定であり、その減少率は設定値の３０％以内に収まっていた。図２に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、高収率で安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１８１】
（比較例４） 酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その４）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用いた以外は実施例１と同様に、Ｌ−乳酸連続発酵試験を行った。適宜、濾液中のＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該Ｌ−乳酸およびグルコース濃度から算出された該Ｌ−乳酸対糖収率を表６に示した。ｋＬａは、回分培養で対糖収率の高かった７．０（設定値）の条件で培養を開始したところ、循環量を大きくすると低下し、その減少率は設定値の３０％以上であった。
【０１８２】
（比較例５） 酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その５）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用いた以外は実施例２と同様に行った。その結果を表６に示した。ｋＬａは、回分培養で対糖収率の高かった７．０（設定値）の条件で培養を開始したところ、循環量を大きくすると低下し、その減少率は設定値の３０％以上であった。
【０１８３】
【表６】
【０１８４】
表６に示した結果（比較例４および比較例５）を見ると、培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している連続培養装置（図５）で循環量を変化させ培養を行うと、循環量を大きくするほど連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下してしまった。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。一方、培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬している位置に開口している連続培養装置（図１および図２）では、循環量を変化させても連続培養成績の一つである対糖収率が変化せず安定に長期間運転可能であった。さらに、図２の連続培養装置を用いて、培養液循環配管部分に培養反応槽内と同じ体積比で通気を行うことで、より高収率で安定に長期間培養が可能であった。
【０１８５】
（実施例４） 連続発酵によるエタノールの製造（その１）
エタノールを生産する微生物としてＮＢＲＣ１０５０５株を用い、培地として表７に示す組成のエタノール発酵培地を用い、図１の連続培養装置によりエタノールの製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるエタノールの濃度の評価には、ガスクロマトグラフ法により定量した。Shimadzu GC-2010キャピラリーGC TC-1(GL science) 15 meter L.＊0.53 mm I.D., df1.5 μmを用いて、水素炎イオン化検出器により検出・算出して、評価した。残存糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０１８６】
【表７】
【０１８７】
培養の条件を以下に示す。
【０１８８】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３２（℃）
培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０１８９】
具体的には、まず、ＮＢＲＣ１０５０５株を試験管で５ｍｌのエタノール発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮なエタノール発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の１．５Ｌのエタノール発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、エタノール発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるエタノールの製造を行った。また、還流量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたエタノール濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表８に示す。
【０１９０】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したエタノールの連続発酵による製造が可能であった。
【０１９１】
（実施例５） 連続発酵によるエタノールの製造（その２）
エタノールを生産する微生物としてＮＢＲＣ１０５０５株を用い、培地として表７に示す組成のエタノール発酵培地を用い、図２の連続培養装置によりエタノールの製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるエタノールの濃度の評価には、ガスクロマトグラフ法により定量した。残存糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０１９２】
培養条件を以下に示す。
【０１９３】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３２（℃）
培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．０３（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０１９４】
具体的には、まず、ＮＢＲＣ１０５０５株を試験管で５ｍｌのエタノール発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮なエタノール発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示す連続培養装置の１．５Ｌのエタノール発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、エタノール発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるエタノールの製造を行った。また、還流量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。その結果を表８に示す。
【０１９５】
図２に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したエタノールの連続発酵による製造が可能であった。
【０１９６】
（比較例６） 連続発酵によるエタノールの製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例４と同様に行った。
【０１９７】
結果を表８に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下してしまった。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０１９８】
【表８】
【０１９９】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０２００】
（実施例６） 連続発酵によるピルビン酸の製造（その１）
ピルビン酸を生産する微生物としてトルロプシス・グラブラータＰ１２０−５ａ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６７４５）を用い、培地として表９に示す組成のピルビン酸発酵培地を用い、図１の連続培養装置によりピルビン酸の製造を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２０１】
【表９】
【０２０２】
生産物であるピルビン酸の濃度は、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により測定した。また、残存糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０２０３】
カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【０２０４】
培養の条件を以下に示す。
【０２０５】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３０（℃）
培養反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２０６】
具体的には、まず、Ｐ１２０−５ａ株を試験管で５ｍｌのピルビン酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮なピルビン酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の１．５Ｌのピルビン酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、ピルビン酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるピルビン酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１０に示す。
【０２０７】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したピルビン酸の連続発酵による製造が可能であった。
（実施例７） 連続発酵によるピルビン酸の製造（その２）
ピルビン酸を生産する微生物としてトルロプシス・グラブラータＰ１２０−５ａ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６７４５）を用い、培地として表９に示す組成のピルビン酸発酵培地を用い、図２の連続培養装置によりピルビン酸の製造を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２０８】
生産物であるピルビン酸の濃度は、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により測定した。また、残存糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０２０９】
カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【０２１０】
培養の条件を以下に示す。
【０２１１】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３０（℃）
培養反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２１２】
具体的には、まず、Ｐ１２０−５ａ株を試験管で５ｍｌのピルビン酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮なピルビン酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示す連続培養装置の１．５Ｌのピルビン酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、ピルビン酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるピルビン酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１０に示す。
【０２１３】
図２に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したピルビン酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２１４】
（比較例７） 連続発酵によるピルビン酸の製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例６と同様に行った。
【０２１５】
結果を表１０に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下してしまった。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０２１６】
【表１０】
【０２１７】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０２１８】
（実施例８） 連続発酵によるコハク酸の連続製造（その１）
コハク酸を生産する微生物として、アナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）ＡＴＣＣ53488株を用い、培地として表１１に示す組成のコハク酸発酵培地を用い、図１に示す連続培養装置によりコハク酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した
【０２１９】
【表１１】
【０２２０】
コハク酸の製造におけるコハク酸およびグルコースは、特に断らない限り、以下の方法で測定した。
【０２２１】
コハク酸は、培養液の遠心上清について、ＨＰＬＣ（島津 ＬＣ１０Ａ、ＲＩモニター：ＲＩＤ-１０Ａ、カラム：アミネックスＨＰＸ-８７Ｈ）で分析した。カラム温度は５０℃、０.０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４でカラムを平衡化した後、サンプルをインジェクションし、０.０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で溶出して分析を行った。グルコースは、グルコースセンサー（ＢＦ−４、王子計測機器）を用いて測定した。
【０２２２】
培養の条件を以下に示す。
【０２２３】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３９（℃）
培養反応槽ＣＯ２通気量：１０（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：１（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ６.４に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２２４】
具体的には、まず、発酵培地を１２５ｍＬ容三角フラスコに入れ加熱滅菌し、その後、嫌気グローブボックス内で、３０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３ １ｍＬと１８０ｍＭ Ｈ２ＳＯ４ ０.１５ｍＬを加え、さらに、０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓからなる還元溶液０.５ｍＬを加えた後、ＡＴＣＣ53488株を接種し、３９℃で一晩静置培養した（前々培養）。その後、図１に示す連続培養装置の１．５Ｌのコハク酸発酵培地に、０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏからなる還元溶液５ｍLを加えた後、前々培養液５０ｍＬを植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。
【０２２５】
前培養完了後直ちに、コハク酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるよう濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるコハク酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１２に示す。
【０２２６】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したコハク酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２２７】
（実施例９） 連続発酵によるコハク酸の連続製造（その２）
コハク酸を生産する微生物として、アナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）ＡＴＣＣ53488株を用い、培地として表１２に示す組成のコハク酸発酵培地を用い、図２に示す連続培養装置によりコハク酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２２８】
コハク酸の製造におけるコハク酸およびグルコースは、特に断らない限り、以下の方法で測定した。
【０２２９】
コハク酸は、培養液の遠心上清について、ＨＰＬＣ（島津 ＬＣ１０Ａ、ＲＩモニター：ＲＩＤ-１０Ａ、カラム：アミネックスＨＰＸ-８７Ｈ）で分析した。カラム温度は５０℃、０.０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４でカラムを平衡化した後、サンプルをインジェクションし、０.０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で溶出して分析を行った。グルコースは、グルコースセンサー（ＢＦ−４、王子計測機器）を用いて測定した。
【０２３０】
培養の条件を以下に示す。
【０２３１】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３９（℃）
培養反応槽ＣＯ２通気量：１０（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：１（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．０３（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ６.４に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２３２】
具体的には、まず、発酵培地を１２５ｍＬ容三角フラスコに入れ加熱滅菌し、その後、嫌気グローブボックス内で、３０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３１ｍＬと１８０ｍＭ Ｈ２ＳＯ４ ０.１５ｍＬを加え、さらに、０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓからなる還元溶液０.５ｍＬを加えた後、ＡＴＣＣ53488株を接種し、３９℃で一晩静置培養した（前々培養）。
【０２３３】
その後、図２に示す連続培養装置の１．５Ｌのコハク酸発酵培地に、０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏからなる還元溶液５ｍLを加えた後、前々培養液５０ｍＬを植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。
【０２３４】
前培養完了後直ちに、コハク酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるよう濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるコハク酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１２に示す。
【０２３５】
図２に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したコハク酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２３６】
（比較例８） 連続発酵によるコハク酸の製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例８と同様に行った。
【０２３７】
結果を表１２に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下してしまった。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０２３８】
【表１２】
【０２３９】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０２４０】
（実施例１０） 連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その１）
１，３−プロパンジオールを生産する微生物としてクレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を用い、培地として表１３に示す組成の１，３−プロパンジオール生産培地を用い、図１の連続培養装置により１，３−プロパンジオールの製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２４１】
【表１３】
【０２４２】
生産物である１，３−プロパンジオールの測定は、以下のように行った。１．０ｍＬの培養上澄み液に３０μＬの濃（７０％ｖ／ｖ）過塩素酸を加え、混合の後、試料を凍結乾燥した。ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド：ピリジンの１：１混合物（３００μＬ）を凍結乾燥された材料に加え、激しく混合し、６５℃において１時間置いた。遠心により不溶性材料を除いて試料を透明にした。得られる液体は２相に分かれ、その上相を分析に用いた。試料をＤＢ−５カラム（４８ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚さ０．２５μｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから）上でクロマトグラフィーにより分析した。また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０２４３】
培養の条件を以下に示す。
【０２４４】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養反応槽Ｎ２通気量：０．６（Ｌ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２４５】
具体的には、まず、クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を試験管で５ｍｌの１，３−プロパンジオール生産培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な１，３−プロパンジオール生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続培養装置の１．５Ｌの１，３−プロパンジオール生産培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、１，３−プロパンジオール生産培地（グリセロール濃度は１００ｇ／Ｌ）の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるよう濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産された１，３−プロパンジオール濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１４に示す。
【０２４６】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定した１，３−プロパンジオールの連続発酵による製造が可能であった。
【０２４７】
（実施例１１） 連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その２）
１，３−プロパンジオールを生産する微生物としてクレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を用い、培地として表１３に示す組成の１，３−プロパンジオール生産培地を用い、図２の連続培養装置により１，３−プロパンジオールの製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２４８】
生産物である１，３−プロパンジオールの測定は、以下のように行った。１．０ｍＬの培養上澄み液に３０μＬの濃（７０％ｖ／ｖ）過塩素酸を加え、混合の後、試料を凍結乾燥した。ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド：ピリジンの１：１混合物（３００μＬ）を凍結乾燥された材料に加え、激しく混合し、６５℃において１時間置いた。遠心により不溶性材料を除いて試料を透明にした。得られる液体は２相に分かれ、その上相を分析に用いた。試料をＤＢ−５カラム（４８ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚さ０．２５μｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから）上でクロマトグラフィーにより分析した。また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０２４９】
培養の条件を以下に示す。
【０２５０】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養反応槽Ｎ２通気量：０．６（Ｌ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．０１７Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２５１】
具体的には、まず、クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を試験管で５ｍｌの１，３−プロパンジオール生産培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な１，３−プロパンジオール生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続培養装置の１．５Ｌの１，３−プロパンジオール生産培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、１，３−プロパンジオール生産培地（グリセロール濃度は１００ｇ／Ｌ）の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるよう濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産された１，３−プロパンジオール濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１４に示す。
【０２５２】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定した１，３−プロパンジオールの連続発酵による製造が可能であった。
【０２５３】
（比較例９） 連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例１０と同様に行った。
【０２５４】
結果を表１４に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下した。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０２５５】
【表１４】
【０２５６】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０２５７】
（実施例１２） 連続発酵によるイタコン酸の製造（その１）
イタコン酸を生産する微生物としてアスペルギルス テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ１００２０株を用い、培地として表１５に示す組成のイタコン酸発酵培地を用い、図１に示す連続培養装置によりイタコン酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌処理（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるイタコン酸の濃度は、コッペシャール（Ｋｏｐｐｅｓｈａａｒ）の方法（共立出版、微生物光学講座第５巻「カビの利用工業」ｐ７２−７３、昭和３１年発行）の方法で測定した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０２５８】
【表１５】
【０２５９】
培養の条件を以下に示す。
【０２６０】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３５（℃）
培養反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２６１】
具体的には、まず、アスペルギルス テレウスＡＴＣＣ１００２０株を、試験管で表１５に示す５ｍｌの前培養培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な前培養培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで４８時間、３５℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の１．５Ｌの連続・回分発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、イタコン酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるイタコン酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたイタコン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１６に示す。
【０２６２】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したイタコン酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２６３】
（実施例１３） 連続発酵によるイタコン酸の製造（その２）
イタコン酸を生産する微生物としてアスペルギルス テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ１００２０株を用い、培地として表１５に示す組成のイタコン酸発酵培地を用い、図２に示す連続培養装置によりイタコン酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌処理（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２６４】
生産物であるイタコン酸の濃度は、コッペシャール（Ｋｏｐｐｅｓｈａａｒ）の方法（共立出版、微生物光学講座第５巻「カビの利用工業」ｐ７２−７３、昭和３１年発行）の方法で測定した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０２６５】
培養の条件を以下に示す。
【０２６６】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３５（℃）
培養反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．５Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２６７】
具体的には、まず、アスペルギルス テレウスＡＴＣＣ１００２０株を、試験管で表１５に示す５ｍｌの前培養培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な前培養培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで４８時間、３５℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示す連続培養装置の１．５Ｌの連続・回分発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、イタコン酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるイタコン酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたイタコン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１６に示す。
【０２６８】
（比較例１０） 連続発酵によるイタコン酸の製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例１２と同様に行った。
【０２６９】
結果を表１６に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下した。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０２７０】
【表１６】
【０２７１】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０２７２】
（実施例１４） 連続発酵によるカダベリンの製造（その１）
カダベリンを生産させる微生物として、特開２００４−２２２５６９号公報に記載のコリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株用い、培地として表１７に示す組成のカダベリン生産培地を用い、図１に示す連続培養装置によりカダベリンの製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２７３】
【表１７】
【０２７４】
カダベリンは以下に示すＨＰＬＣ法によって評価した。
【０２７５】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：ＵＶ３６０ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として、１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μｌおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し、３７℃の温度で１時間保温する。上記の反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬社製）を用いた。
【０２７６】
培養の条件を以下に示す。
【０２７７】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３０（℃）
培養反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：３Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ アンモニア水によりｐＨ７．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２７８】
具体的には、まず、コリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株を、試験管で５ｍｌのカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン発酵培地添加で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で培養を行った（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の１．５Ｌのカダベリン発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。
【０２７９】
前培養完了後直ちに、カダベリン発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるよう濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるカダベリンの製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたカダベリン濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１８に示す。
【０２８０】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したカダベリンの連続発酵による製造が可能であった。
【０２８１】
（実施例１５） 連続発酵によるカダベリンの製造（その２）
カダベリンを生産させる微生物として、特開２００４−２２２５６９号公報に記載のコリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株用い、培地として表１７に示す組成のカダベリン生産培地を用い、図２に示す連続培養装置によりカダベリンの製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２８２】
カダベリンは以下に示すＨＰＬＣ法によって評価した。
【０２８３】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：ＵＶ３６０ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として、１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μｌおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し、３７℃の温度で１時間保温する。上記の反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬社製）を用いた。
【０２８４】
培養の条件を以下に示す。
【０２８５】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３０（℃）
培養反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．５Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：３Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ アンモニア水によりｐＨ７．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２８６】
具体的には、まず、コリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株を、試験管で５ｍｌのカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン発酵培地添加で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で培養を行った（前々培養）。前々培養液を、図２に示す連続培養装置の１．５Ｌのカダベリン発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。
【０２８７】
前培養完了後直ちに、カダベリン発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるよう濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるカダベリンの製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたカダベリン濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１８に示す。
【０２８８】
（比較例１１） 連続発酵によるカダベリンの製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例１４と同様に行った。
【０２８９】
結果を表１８に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下した。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０２９０】
【表１８】
【０２９１】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０２９２】
（実施例１６） 乳酸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その１）
Ｌ−乳酸を生産する微生物として、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＪＣＭ７６３８株を用い、培地として表１９に示す組成の乳酸菌乳酸発酵培地を用い、図１に示す連続培養装置によりＬ−乳酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるＬ−乳酸の濃度は、参考例８に示したＨＰＬＣ法により評価した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０２９３】
【表１９】
【０２９４】
培養の条件を以下に示す。
【０２９５】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養反応槽Ｎ２通気量：５０（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：５（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：８Ｎ アンモニア水溶液によりｐＨ６．５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２９６】
具体的には、まず、ラクトコッカス ラクティス ＪＣＭ７６３８株を、試験管で表２０に示す５ｍｌの窒素ガスでパージした乳酸発酵培地で２４時間、３７℃の温度で静置培養した（前々々培養）。得られた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地５０ｍｌに植菌し、４８時間、３７℃の温度で静置培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の窒素ガスでパージした１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表２０に示す。
【０２９７】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２９８】
（実施例１７） 乳酸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
Ｌ−乳酸を生産する微生物として、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＪＣＭ７６３８株を用い、培地として表１９に示す組成の乳酸菌乳酸発酵培地を用い、図２に示す連続培養装置によりＬ−乳酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるＬ−乳酸の濃度は、参考例８に示したＨＰＬＣ法により評価した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０２９９】
培養の条件を以下に示す。
【０３００】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養反応槽Ｎ２通気量：５０（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：５（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：１．７（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：８Ｎ アンモニア水溶液によりｐＨ６．５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０３０１】
具体的には、まず、ラクトコッカス ラクティス ＪＣＭ７６３８株を、試験管で表２０に示す５ｍｌの窒素ガスでパージした乳酸発酵培地で２４時間、３７℃の温度で静置培養した（前々々培養）。得られた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地５０ｍｌに植菌し、４８時間、３７℃の温度で静置培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の窒素ガスでパージした１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表２０に示す。
【０３０２】
（比較例１２） 乳酸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例１６と同様に行った。
【０３０３】
結果を表２０に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下した。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０３０４】
【表２０】
【０３０５】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０３０６】
（実施例１８） 乳酸菌を用いた連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その１）
Ｄ−乳酸を生産する微生物として、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を用い、培地として表２１に示す組成のＤ−乳酸生産培地を用い、図１に示す連続培養装置によりＤ−乳酸の製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるＤ−乳酸の濃度は参考例８に示したＨＰＬＣ法により測定した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬社製）を用いた。
【０３０７】
【表２１】
【０３０８】
培養の条件を以下に示す。
【０３０９】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養反応槽Ｎ２通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：２（ｍＬ／ｍｉｎ）
膜分離槽通気量：なし
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：８Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ６．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０３１０】
具体的には、まず、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を試験管中で１０ｍｌの乳酸発酵培地を用い、嫌気条件下で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なＤ−乳酸生産培地５０ｍｌに植菌し、嫌気条件下、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の１．５ＬのＤ−乳酸生産培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。
【０３１１】
前培養完了後直ちに、Ｄ−乳酸生産培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産された乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表２２に示す。
【０３１２】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０３１３】
（実施例１９） 乳酸菌を用いた連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その２）
Ｄ−乳酸を生産する微生物として、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を用い、培地として表２１に示す組成のＤ−乳酸生産培地を用い、図２に示す連続培養装置によりＤ−乳酸の製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるＤ−乳酸の濃度は参考例８に示したＨＰＬＣ法により測定した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬社製）を用いた。
【０３１４】
培養の条件を以下に示す。
【０３１５】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養反応槽Ｎ２通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：２（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．７（ｍＬ／ｍｉｎ）
膜分離槽通気量：なし
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：８Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ６．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０３１６】
具体的には、まず、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を試験管中で１０ｍｌの乳酸発酵培地を用い、嫌気条件下で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なＤ−乳酸生産培地５０ｍｌに植菌し、嫌気条件下、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示す連続培養装置の１．５ＬのＤ−乳酸生産培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。
【０３１７】
前培養完了後直ちに、Ｄ−乳酸生産培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産された乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表２２に示す。
【０３１８】
（比較例１３） 乳酸菌を用いた連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例１８と同様に行った。
【０３１９】
結果を表２２に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下した。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０３２０】
【表２２】
【０３２１】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【符号の説明】
【０３２２】
１ 培養反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 分離膜束
１４ 上部樹脂封止層
１５ 下部樹脂封止層
１６ 支持フレーム
１７ 集水パイプ
１８ 支持板
１９ 流路材
２０ 分離膜
２１ 凹部
２２ 集水パイプ
１１０ 培養液循環配管
１１１ 送液口
１１２ 環流口
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の連続培養による化学品の製造方法および製造装置に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、連続培養を行いながら、微生物の培養液から分離膜を通して培養によって生産された化学品を含む液を効率よく濾過・回収する、高い生産性で化学品を製造することが可能な化学品の製造方法および製造装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法のひとつである発酵法は、大きく（１）回分発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と（２）連続培養法に分類することができる。
【０００３】
回分および流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないというメリットがある。しかし、時間経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性及び収率が低下してくる。このため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するのが困難である。
【０００４】
連続培養法は、一般的に、培養装置内で目的物質が高濃度に蓄積するのを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。例えば、非特許文献１には、Ｌ−グルタミン酸やＬ−リジンの発酵について連続培養法が開示されている。しかし、この文献に記載の方法では、培養液へ培養原料の連続的な供給を行うとともに、微生物や培養細胞を含んだ培養液を抜き出すために、培養液中の微生物や培養細胞が希釈される。そのため、現実的には生産効率の向上が限定されたものであった。
【０００５】
また、特許文献１には、連続培養法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を培養液に保持または還流させることで、培養液中の微生物や細胞濃度を高く維持する方法が提案されており、例えば、簡便な操作条件で長時間にわたり安定して高生産性を維持することができる連続培養技術が開示されている。しかしながら、培養液を膜分離槽に循環させながら連続培養を行うと、膜の目詰まりが生じるため、膜ろ過流量の制御が必要になる。一方、膜ろ過流量の制御を行うために循環量（培養反応槽からの送液量）を変化させると、培養成績（対糖収率）が変化してしまう。そのため、培養成績を低下させることなく長期間安定に連続培養を行えない虞がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Toshihiko Hirao et. al. （ヒラオ・トシヒコ ら）、 Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９）
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２５２３６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
背景技術にあるように、長時間にわたり安定して行える連続培養法による化学品の製造方法を提供するにあたり、本発明者らは、鋭意研究を行った結果、膜ろ過流量の制御が重要であることを見出したが、膜ろ過流量の制御のためには、循環量を変化させる必要があり、循環量を変化させることで連続培養成績が変化し安定しないといった問題が新たに発生した。
【０００９】
そこで本発明は、膜ろ過流量が変化しても連続培養成績が変化しにくく連続培養法による化学品の製造を長期間に亘って安定に行うことができる方法および装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、未濾過培養液を培養反応槽に貯留されている培養液中に直接還流させることで課題であった培養成績を低下させることなく長期間安定に連続培養を維持できることを見出し、本発明を完成した。更に未濾過培養液を培養液中に直接環流させることの効果について解析したところ、発酵成績に影響を与える因子の一つである酸素移動容量係数の変化が著しく抑えられることがあることもわかった。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下のいずれかの構成を特徴とするものである。
（１）培養反応槽に貯留されている微生物もしくは培養細胞の培養液を連続的に分離膜へ供給循環し、培養によって生産された化学品を含む濾液を分離膜の透過側で回収するとともに、前記分離膜で濾過されなかった未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流して連続培養を行うに際し、培養反応槽内の酸素移動容量係数ｋＬａの設定値からの減少率を該設定値の３０％以内に抑制することを特徴とする連続培養による化学品の製造方法。
（２）前記未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流するに際し、前記未濾過培養液は、前記培養反応槽に貯留されている培養液中に直接還流させる、前記（１）に記載の連続培養による化学品の製造方法。
（３）前記設定値が７．０であり、前記化学品としてＬ−乳酸またはＤ−乳酸を回収する、前記（１）または（２）に記載の連続培養による化学品の製造方法。
（４）前記微生物が酵母である、前記（３）に記載の連続培養による化学品の製造方法。
（５）微生物もしくは培養細胞を培養した培養液を貯留するための培養反応槽と、該培養反応槽から連続的に循環される前記培養液を濾過する分離膜が配置される膜分離槽と、前記培養液を前記培養反応槽から前記膜分離槽へ循環するとともに濾過されなかった未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流する培養液循環配管とを備え、前記培養反応槽には、前記培養液循環配管の、前記培養反応槽から前記膜分離槽へ前記培養液を供給するための送液口と、前記未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流するための環流口とが接続され、かつ、前記送液口および前記環流口が、前記培養反応槽に貯留される前記培養液に浸漬する位置に開口してなることを特徴とする連続培養による化学品の製造装置。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、簡便装置で、従来以上の長時間にわたり所望の発酵生産物の高生産性を維持する安定した連続培養が可能となり、連続培養によって化学品を低コストで安定して生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の一実施形態を示す連続培養による化学品の製造装置の概略模式図である。
【図２】図２は、本発明の他の実施形態を示す連続培養による化学品の製造装置の概略模式図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一実施形態を示す概略斜視図である。
【図４】図４は、本発明で用いられる分離膜エレメントの他の実施形態を示す概略斜視図である。
【図５】図５は、従来の、連続培養による化学品の製造装置概略模式図である。
【図６】図６は、酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、培養反応槽に貯留されている微生物の培養液を連続的に分離膜へ供給循環し、培養によって生産された化学品を含む濾液を分離膜の透過側で回収するとともに、前記分離膜で濾過されなかった未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流して連続培養を行うに際し、培養反応槽内の酸素移動容量係数（１／ｈ）の設定値からの減少率を該設定値の３０％以内に抑制することを特徴とする連続培養による化学品の製造方法であり、かかる製法は例えば図１に示す装置により実施することができる。
【００１５】
図１に示す装置は、基本的に培養反応槽１と膜分離槽１２と差圧制御装置３とで構成されている。培養反応槽１の外部に設置された膜分離槽１２には、分離膜エレメント２が単数もしくは複数収容されており、また、培養反応槽１と膜分離槽１２は、培養液循環ポンプ１１を介在させた培養液循環配管１１０により、培養液が循環できるように連結されている。そして、該培養液循環配管１１０は、培養反応槽１から膜分離槽１２へ培養液を供給するための送液口１１１と未濾過培養液を培養反応槽１へ還流するための環流口１１２とが、培養反応槽に貯留された培養液に浸漬する位置に開口している。
【００１６】
培養反応槽１には、培養液の攪拌、温度、ｐＨ、溶存酸素濃度、液量などを培養にとって好適な条件に調整することができるように、攪拌機５、温度調節器１０、ｐＨセンサ・制御装置９、ｐＨ調整溶液供給ポンプ８、気体供給装置４、培地供給ポンプ７などが設けられている。
【００１７】
分離膜エレメント１２は、上記したように、培養反応槽の外部に設けられた膜分離槽１２の内部に設けられている。
【００１８】
培養反応槽１と該培養反応槽の外部に設置される膜分離槽１２との間には、培養液を循環させる手段、例えば培養液循環ポンプ１１が設けられる。該ポンプ１１には、例えば渦巻きポンプ、チューブポンプ、ダイヤフラムポンプなど様々な種類があるが、本発明においては、ポンプの出力設定により循環液量が算出できるものが好ましく、好ましくはダイヤフラムポンプが挙げられる。
【００１９】
このような図１の装置において、培養反応槽１には、微生物や培養細胞、さらには培養に用いられる栄養素（培養原料）を含む培地が貯留される。そして、所定の温度等に制御することで培養、発酵が進み、化学品が生成される。
【００２０】
このとき、培地供給ポンプ７によって培地を培養反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で培養反応槽１内の発酵培養液を攪拌したり、培養反応槽内に気体供給装置４で気体を供給する。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって培養液のｐＨを調整したり、温度調節器１０によって培養液の温度を調節する。このようにすることにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００２１】
装置内の培養液は、培養液循環ポンプ１１によって培養反応槽１と膜分離槽１２との間を循環させ、例えば定期的に膜分離を作動させることにより発酵生産物（化学品）を系外に取り出す。すなわち、膜分離槽に送られた培養液は分離膜エレメント２によって微生物を含む未濾過培養液と発酵生産物を含む濾液とに濾過・分離されるため、膜透過側で発酵生産物を含む濾液を回収することで、化学品を装置系から取り出すことができる。一方、濾過・分離された微生物は、培養液循環配管１１０により培養反応槽１に還流することで培養反応系内にとどまることになり、培養反応系内の微生物濃度を高く維持でき、生産性の高い発酵生産を可能としている。
【００２２】
分離膜エレメント２による濾過・分離は、培養反応槽１の水面と膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって、特別な動力を使用することなく実施可能であるが、必要に応じて、レベルセンサ６および差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の発酵培養液量を適当に調節することができる。分離膜エレメント２による濾過・分離は、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することによっても行うことができる。
【００２３】
図２に、本発明の化学品の製造方法を実施するために用いられる他の装置の概略斜視図を示す。図２は、培養液循環配管１１０にも気体供給装置４を設置した以外は図１の装置と同じである。培養液循環配管１１０にも気体供給装置４を設けることで、培養液循環配管１１０および膜分離槽１２に、効率よく気体を循環させることができ、装置の培養・発酵が行われる箇所全体におなじ体積比で気体を供給することが可能である。
【００２４】
次に、上記図１、図２に示すような装置において好ましく用いられる分離膜エレメント２について、説明する。
【００２５】
分離膜エレメント２には、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを用いることができる。
【００２６】
具体的に分離膜エレメント２は、例えば図３に示すように、中空糸膜で構成された分離膜束１３と上部樹脂封止層１４、下部樹脂封止層１５によって主に構成される。分離膜束１３は上部樹脂封止層１４および下部樹脂封止層１５よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層１５による接着・固定化は中空糸膜の中空部を封止しており、培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１４は中空糸膜の中空部を封止しておらず、集水パイプ１７に濾液（すなわち培養によって生産された化学品を含む液）が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム１６を介して膜分離槽に設置することが可能である。分離膜束１３を構成する中空糸膜の外表面を透過して中空部に進入してきた濾液は、該中空部を通り、集水パイプ１７を介して膜分離槽外部に取り出される。濾液を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【００２７】
分離膜エレメント２は、例えば図４示すような構成でもよい。図４に示す分離膜エレメントは、剛性を有する支持板１８の両面に、流路材１９と分離膜２０をこの順序で配して構成されている。支持板１８は、両面に凹部２１を有している。分離膜２０は、培養液をろ過する。流路材１９は、分離膜２０を透過した濾液を効率よく支持板１８に流すためのものである。支持板１８に流れた濾液は、支持板１８の凹部２１を通り、集水パイプ２２を介して膜分離槽外部に取り出される。濾液を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【００２８】
これら分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性を有する部材であることが好ましい。培養反応槽に加えて膜分離槽内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避でき、より安定した連続発酵が可能となる。具体的に分離膜エレメントを構成する部材としては、１２１℃で１５分間という高圧蒸気滅菌の条件に耐性を有するものであることが好ましい。例えば、ステンレス、アルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂、ポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定できる。
【００２９】
次に、本発明で用いることができる分離膜について説明する。
【００３０】
分離膜としては、被処理液の性状や用途に応じた分離性能と透過性能を有する多孔性膜であることが好ましい。多孔性膜としては、セラミックスなどの無機材料、樹脂などの有機材料を素材とした多孔性膜を用いることが可能であるが、好ましくは多孔質樹脂層を含む多孔性の分離膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質樹脂層は多孔質基材に浸透していても浸透していなくてもどちらでも良いが、強度の点で多孔質基材に浸透させた膜が好ましく採用される。
【００３１】
多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与えるものであり、材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布等である。中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは、５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
【００３２】
多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂等が挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有されることをいう。中でも、多孔質樹脂層を構成する膜素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂またはポリオレフィン系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはポリオレフィン系樹脂がより好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００３３】
ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましいが、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。また、ポリオレフィン系樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレンまたは塩素化ポリプロピレンが挙げられるが、塩素化ポリエチレンが好ましく用いられる。
【００３４】
本発明で用いられる分離膜の形状については特に限定はなく、具体的には平膜や中空糸膜が挙げられる。分離膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下である。分離膜の形状が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは、２００μｍ以上５０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは、２０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００３５】
本発明において分離膜として好ましく用いられる多孔性膜の作成法の概要を例示して説明する。
【００３６】
まず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要について説明する。平膜は、多孔質基材の表面に、多孔性樹脂層を構成する樹脂と溶媒とを含む製膜原液の被膜を形成するとともに、その製膜原液を多孔質基材に含浸させ、その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを非溶媒を含む凝固浴と接触させ樹脂を凝固させて多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成することで得られる。
【００３７】
次に、中空糸膜の作成法の概要について説明する。中空糸膜は、多孔性樹脂層を構成する樹脂と溶媒からなる製膜原液を二重管式口金の外側の管から吐出するとともに、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。
【００３８】
得られた中空糸膜の外表面には、別の多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。このような多孔性樹脂層の積層は中空糸膜の性質、例えば、親水・疎水性、細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。
【００３９】
かかる表面に積層される多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて該樹脂を凝固させることによって作製できる。積層の方法は特に限定されず、製膜原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に製膜原液を塗布してもよく、積層後、付着した製膜原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることで積層量を調整することもできる。
【００４０】
以上のように作成される中空糸膜は樹脂などの部材で中空部を接着・封止することで、また平膜は支持体に設置することによって、図３、図４に示す分離膜エレメントとすることができる。なお、本発明においては体積あたりの膜面積を増加させるうえで有利であるという観点から中空糸膜を用いることが好ましい。
【００４１】
本発明の化学品の製造方法においては、以上のような装置を用いて微生物または培養細胞を培養し、培養液を連続的に培養反応槽から分離膜へ供給循環するとともに、例えば定期的に分離膜の原液側と透過液側とに差圧を生じさせて分離膜の透過側で化学品を含む濾液を回収することにより培養液に含まれる化学品を抽出する。なお、膜分離を行っている最中、分離膜で濾過されなかった未濾過培養液は、前記培養反応槽へ還流する。また、微生物または培養細胞を増殖しつつ化学品を生成する連続培養を行うことができるのであれば、培養装置の数は問わない。連続培養操作は、通常、単一の培養装置で行うのが管理上好ましいが、培養装置の容量が小さい等の理由から、複数の培養装置を用いることも可能である。この場合、複数の培養装置を配管で並列または直列に接続して連続培養を行うことで、高い生産性で発酵生産物を得ることができる。
【００４２】
本発明で使用される微生物や培養細胞としては、例えば、工業的によく使用される酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物や細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。これらの微生物や培養細胞のうち、目的とする化学品の生産能力が高いものを選択して用いることが好ましい。なお、本発明においては微生物の培養を「発酵」または「発酵培養」と称することがある。
【００４３】
培養には、微生物または培養細胞の生育を促し、微生物または培養細胞の増殖が連続的に行われ、目的とする化学品が良好に生産されるようにするため、栄養素などの培養原料も用いられる。
【００４４】
培養原料となる栄養素の具体例としては、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなどが使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。
【００４５】
本発明に使用する微生物または培養細胞が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。
【００４６】
栄養素等の培養原料は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、適宜追加されるが、その際、培養開始時の原料組成から適宜変更しても良い。
【００４７】
また、培養にあたっては、消泡剤を必要に応じて使用する。
【００４８】
本発明において、培養反応槽内の培養液中の糖類濃度は５ｇ／ｌ以下に保持されるのが好ましい。当該糖類濃度を５ｇ／ｌ以下に保持することが好ましい理由は、培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。一方、培養反応槽内の培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが、生産性をよくする上で好ましい。該微生物または培養細胞の濃度は、例えば乾燥重量として５ｇ／ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。
【００４９】
なお、本発明において、培養液とは、培養原料により微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言う。
【００５０】
また、微生物または培養細胞の培養は、通常、ｐＨ４−８、温度２０−４０℃の範囲で行われる。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４−８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養反応槽内を加圧して培養する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００５１】
本発明の化学品の製造方法では、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物濃度を高くした後に、連続培養および培養液の引き抜き（膜分離）を開始しても良い。本発明の化学品の製造方法では、微生物濃度を高くした後に、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養および培養液の引き抜きを行っても良い。すなわち、本発明の化学品の製造方法では、適当な時期から培養原料の供給及び培養液の引き抜きを行うことが可能である。培養原料の供給と培養液の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、培養原料の供給と培養液引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
【００５２】
引き抜いた培養液、すなわち、分離膜の透過側で回収した化学品を含む液は、濃縮、蒸留、および晶析などの処理をさらに行って、濃度を高めて回収することが好ましい。
【００５３】
また、本発明の化学品の製造方法では、必要に応じて培養装置内から微生物または培養細胞を引き抜くことができる。例えば、培養装置内の微生物濃度や培養細胞濃度が高くなりすぎると分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、微生物や培養細胞を引き抜くことで分離膜の閉塞を回避することができる。また、培養装置内の微生物濃度や培養細胞濃度によって化学品の生産性能が変化することがあることから、生産性能を指標として微生物または培養細胞を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
【００５４】
なお、引き抜いた微生物や培養細胞は、高圧蒸気滅菌などして死滅させた後、廃棄することが好ましい。
【００５５】
本発明においては、培養液を連続的に培養反応槽から分離膜へ供給し循環させるが、目的とする化学品の生産速度を向上させるには、式（１）に示す通り培養液の抜き取り速度、すなわち濾液流量を大きくすればよい。しかし、濾液流量を大きくすれば、微生物による目詰まりが起こりやすくなり、濾過性能を長期間安定に制御することが困難になる。そこで、本発明においては、培養反応槽と膜分離槽とを循環する培養液の循環量を大きくすることで、膜分離槽内の分離膜の表面を流れる培養液の線速度を増加させ、膜の目詰まりを防ぐことが好ましい。この結果、目的とする化学品の生産速度向上が可能となる。なお、循環量とは培養反応槽から培養液循環配管をへて膜分離槽へと送液される培養液の流量のことを示す。また、発酵培養液量とは、培養反応槽１内の培養液量と培養液循環配管１１０および膜分離槽１２の中の培養液量の合計をいう。
【００５６】
【数１】
【００５７】
そして、本発明においては、以上のような連続培養を行うにあたり、例えば培養液循環配管１１０の、培養液を培養反応槽１から膜分離槽１２へ供給するための送液口１１１および未濾過培養液を膜分離槽１２から培養反応槽１へ還流するための環流口１１２を、培養反応槽１に貯留された培養液に浸漬する位置に開口するようにしておくことで、培養反応槽１内の酸素移動容量係数ｋＬａの設定値からの減少率を該設定値の３０％以内の範囲に抑制する。
【００５８】
ここで、酸素移動容量係数ｋＬａについて説明する。酸素移動容量係数ｋＬａ（以下、単にｋＬａと略す）は、通気攪拌培養時において、単位時間に気相から液相へ酸素を移動させ溶存酸素を生成させる能力を示すものであり、以下の式（２）で表すことができる。また、ｋＬａは、通気攪拌培養時において、気相から供給される酸素と微生物によって消費される酸素とによって表される培養液中の酸素の収支式、式（３）において用いられる（生物工学実験書、日本生物工学会編、培風館、ｐ．３１０（１９９２））。
【００５９】
【数２】
【００６０】
【数３】
【００６１】
培養反応槽におけるｋＬａは、亜硫酸酸化法(バッチ法・連続法)、気体置換法（Gassing out法(スタティック法、ダイナミック法)）、排気ガス分析法などで測定できる（前掲生物工学実験書、ｐ３１１等）。以下に、気体置換法（ダイナミック法）によるｋＬａの測定の一例を示す。
【００６２】
まず、培養反応槽に水あるいは使用する培地をいれ、これらの液体中の酸素を窒素ガスにより置換するかあるいは亜硫酸ナトリムをほぼ飽和濃度に達する程度に加えることなどにより脱酸素するかして、該液体の酸素濃度を低下させる。次いで、かかる液体中に溶存酸素濃度電極を差し込み、通気速度、攪拌速度および温度を任意の条件に設定し、その条件での溶存酸素の上昇過程を測定する。ここで、上記式（２）より、下記式（４）が導かれるため、通気した時間に対して、Ｃ＊−Ｃの対数をプロットすることで、ｋＬａを求めることができる。
【００６３】
【数４】
【００６４】
本発明においては、予めこの測定を繰り返して発酵力価が高く維持されるｋＬａ（設定値）を見出しておき、連続培養により化学品を製造する際に、その設定値に対して減少率が当該設定値の３０％以内になるようにする。
【００６５】
ｋＬａは様々な要素で変動する。当該要素は、例えば、培養液の液量、培養反応槽の攪拌、通気量、温度などが挙げられ、これらは連続培養中にも比較的制御が容易である。また、ｋＬａは、液面の振動によっても変化する。たとえば未濾過培養液を培養反応槽１に環流する際に、培養反応槽１内の培養液液面から離れた上方位置から未濾過培養液を落とし入れるように戻すと、培養液の液面が大きく振動しｋLaが大きく変化する。しかしながら、液面の振動は制御が困難である。そこで、本発明においては、培養液循環配管１１０を、培養反応槽１から膜分離槽１２へ培養液を供給するための送液口１１１と、未濾過培養液を培養反応槽１へ還流するための環流口１１２とが、培養反応槽１に貯留された培養液に浸漬する位置に開口するように設け、未濾過培養液が膜分離槽１２を経て培養反応槽１へ還流するに際し、培養反応槽１に貯留されている培養液の中に直接還流するようにすることが好ましい。こうすることで、液面を大きく乱すことがなくなり、結果的にｋＬａの設定値からの減少率を３０％以内の範囲に抑制することが可能である。
【００６６】
培養反応槽内の酸素移動容量係数ｋＬａの設定値からの減少率を該設定値の３０％以内に抑えて培養することにより、高発酵力価を維持した培養が可能となる。たとえば、ｋＬａが設定値より３０％以上減少すると、最適培養条件よりも嫌気培養になりすぎて、糖消費速度が低下し、炭素源が過剰にあまり、目的の化学品の生産速度が低下する。これに対して、ｋＬａの減少率を３０％以内に抑制する本発明によれば、対糖収率などの連続培養成績が変化しにくく、安定して連続発酵を行うことができるので、従来の回分発酵と比較して、高い体積生産速度で化学品が得られ、極めて効率のよい化学品の製造が可能となる。
【００６７】
ここで、連続培養における化学品の生産速度は、次の式（５）で計算される。また、連続培養における対糖収率は、次の式（６）で計算され、ある一定期間内で原料炭素源を消費し生成された化学品量（ｇ）を、その期間の投入炭素源量（ｇ）で除して求められる。
【００６８】
【数５】
【００６９】
【数６】
【００７０】
なお、回分培養での化学品生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【００７１】
本発明における化学品としては、微生物または培養細胞が培養液中に生産する物質であれば制限はなく、培養する微生物や培養細胞によって適宜選択されうる。該化学品の具体例としては、アルコール、有機酸など発酵工業において大量生産が望まれる物質を挙げることができる。例えば、アルコールとして、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオール、グリセロールなど、また、有機酸として、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、などである。また、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ―フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−チロシン、メチオニン、セリン、バリン、ロイシンなどのアミノ酸や、イノシン、グアノシンなど核酸、カダベリンなどのジアミン化合物、酵素、抗生物質、組換えタンパク質を挙げることができる。
【００７２】
次に、上述の化学品の製造に用いることができる微生物または培養細胞を、具体的な化学品を例示しながら説明する。
【００７３】
本発明の化学品の製造方法は、例えばＬ−乳酸の生産に用いることが出来る。Ｌ−乳酸とは、乳酸の光学異性体の一種であり、その鏡像体であるＤ−乳酸と明確に区別することができる。Ｌ−乳酸の製造に用いられる微生物あるいは培養細胞としては、Ｌ−乳酸を生産することが可能な微生物であれば特に制限はないが、例えば乳酸菌を用いることができる。ここで乳酸菌とは、消費したグルコースに対して対糖収率として５０％以上の乳酸を産生する原核微生物として定義することができる。
【００７４】
好ましい乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラゲノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バゴコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｇｅｎｕｓ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アトポビウム属（Ｇｅｎｕｓ Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する乳酸菌が挙げられる。それらの中でも、乳酸の対糖収率が高い乳酸菌を選択して乳酸の生産に好ましく用いることができ、更にその中でも、Ｌ―乳酸の対糖収率の高い乳酸菌を選択して乳酸の生産に好ましく用いることができる。
【００７５】
Ｌ−乳酸の対糖収率が高い乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ラクトバシラス・アニマリス（Lactobacillus animalis）、ラクトバシラス・アジリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバシラス・アビアリエス（Lactobacillus aviaries）、ラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス・デルブレッキ（Lactobacillus delbruekii）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバシラス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシラス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ラクトバシラス・サリバリス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバシラス・シャーピイ（Lactobacillus sharpeae）、ラクトバシラス・デクストリニクス（Pediococcus dextrinicus）、およびラクトバシラス・ラクティス（Lactococcus lactis）などが挙げられ、これらを選択して、Ｌ−乳酸の生産に用いることが可能である。
【００７６】
また、本発明によりＬ−乳酸を製造する場合、人為的に乳酸生産能力を付与、あるいは増強した微生物または培養細胞を用いることができる。例えば、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｌ−ＬＤＨと言うことがある）を導入して、Ｌ−乳酸生産能力を付与、あるいは増強した微生物または培養細胞を用いることができる。Ｌ−乳酸生産能力を付与、あるいは増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物がＬ−ＬＤＨを組み込むことによりＬ−乳酸生産能力が増強した組換え微生物が挙げられる。
【００７７】
Ｌ−乳酸を製造する場合、組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましくは酵母である。酵母のうち好ましくはサッカロマイセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母であり、更に好ましくはサッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００７８】
Ｌ−ＬＤＨとしては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）とＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしていれば限定されない。例えば、Ｌ―乳酸の対糖収率の高い乳酸菌由来のＬ−ＬＤＨを用いることができる。好適にはほ乳類由来Ｌ−ＬＤＨを用いることができる。このうちホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来、およびカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることができる。カエルの中でもコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。
【００７９】
本発明に用いられるヒトまたはカエル由来のＬ−ＬＤＨには、遺伝的多型性や、変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいう。変異誘発は、例えば、部位特異的変異導入用キット（Mutan-K（タカラバイオ社製））を用いる方法や、ランダム変異導入用キット（BD Diversify PCR Random Mutagenesis（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いる方法などがある。また、本発明で使用するヒトまたはカエル由来のＬ−ＬＤＨは、ＮＡＤＨとピルビン酸をＮＡＤ＋とＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしているならば、塩基配列の一部に欠失または挿入が存在していても構わない。
【００８０】
本発明によりＬ―乳酸を製造する場合、分離膜の透過側で回収した化学品を含む液（以降、「濾過・分離発酵液」と称する場合がある）は、さらに従来から知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法により分離・精製することが好ましい。例えば、回収した濾過・分離発酵液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。中でも、濾過・分離発酵液の水分を蒸発させた濃縮Ｌ−乳酸溶液を蒸留操作にかける方法が好ましい。ここで、濃縮Ｌ−乳酸溶液を蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。Ｌ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｌ−乳酸を得ることができる。留出液としてエタノールや酢酸等の低沸点成分を含むＬ−乳酸水溶液が得られる場合は、低沸点成分をＬ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＬ−乳酸を得ることもできる。
【００８１】
本発明の化学品の製造方法は、例えばD−乳酸の生産に用いることも出来る。
【００８２】
Ｄ−乳酸生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、Ｄ−乳酸を生産することが可能な微生物であれば制限はないが、例えば、野生型株では、Ｄ−乳酸を合成する能力を有するラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物が挙げられる。
【００８３】
また、本発明によりＤ−乳酸を製造する場合、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｄ−ＬＤＨともいうことがある）の酵素活性を増強している野生型株の微生物を用いることも好ましい。酵素活性を増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物がＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組み込むことによりＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増強した組換え微生物が挙げられる。
【００８４】
Ｄ−乳酸を製造する場合、組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましくは酵母である。
【００８５】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、およびバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子であることが好ましく、更に好ましくはバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子である。
【００８６】
なお、本発明によりＤ−乳酸を製造する場合も、先に記載したＬ―乳酸を製造する場合と同様に、濾過・分離発酵液に含まれるＤ−乳酸の分離・精製を行うことが好ましい。
【００８７】
そして、本発明によりエタノールを製造する場合は、ピルビン酸を生産することが可能な微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はないが、例えば、サッカロミセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルベロマイセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母を用いることができる。このうちサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）を好適に用いることができる。また、ラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ザイモモナス属（Ｇｅｎｕｓ Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌も好ましく用いることができる。このうち、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）を好適に用いることができる。
【００８８】
エタノールの生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、人為的にエタノール生産能力を高めた微生物あるいは培養細胞であってもよい。具体的には、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。一部性質が改変されたものの一例としては、リゾパス属に属するカビのグルコアミラーゼ遺伝子を組み込み生でんぷんの資化能力を獲得した酵母を挙げることができる（微生物、３：５５５−５６４（１９８７））。
【００８９】
また、本発明によりエタノールを製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるエタノールの分離・精製は、例えば、蒸留法による精製法や、ＮＦ、ＲＯ膜、あるいはゼオライト製の分離膜を用いた濃縮・精製法により好適に行うことができる。
【００９０】
本発明によりピルビン酸を製造する場合は、ピルビン酸を生産することが可能な微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はないが、例えば、シュードモナス属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アシネトバクター属（Ｇｅｎｕｓ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌を好ましく用いることができる。さらに好ましくは、シュードモナス・フルオレエセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエロギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌を用いることができる。これら細菌を突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変したものを用いてもよい。例えば、酸化的リン酸化によるＡＴＰ生産に直接関与するＡＴＰａｓｅ遺伝子を変異、または欠失させた細菌も好ましく用いられる。またカビ、酵母なども好ましく用いることができる。例えば、サッカロミセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ）、カンジダ属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｎｄｉｄａ）、シゾフィリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）に属するカビ、酵母を用いることができる。さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・コプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｏｐｓｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ）、シゾフィリウム・コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）などのカビ、酵母を用いてピルビン酸を製造することが出来る。
【００９１】
本発明によりピルビン酸を製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるピルビン酸の分離・精製は、陰イオン交換カラムを用いた方法により行うことができる。例えば、特開平６−３４５６８３に示される弱塩性イオン交換体を用いた精製法を好適に用いることができる。
【００９２】
次に、本発明によりコハク酸を製造する場合は、コハク酸を生産することが可能な微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はないが、例えば、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属やアクチノバシラス（Actinobacillus）属に属する細菌を好適に利用することができる。具体的には、米国特許第５１４３８３３号明細書に記載のアナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）やJames B. Mckinlay （ジェームズ Ｂ.マッキンリー）らが開示しているアクチノバシラス・サクシノジェネス（Actinobacillus succinogenes）を挙げることができる（Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー）,７１,６６５１−６６５６ （２００５）。また、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属やブレビバクテリウム（Brevibacterium）属などのコリネ型細菌（Coryneform bacterium）、および大腸菌（Escherichia）なども利用可能である。コリネ型細菌では、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）などが好適である。
【００９３】
また、微生物としては、遺伝子組換えによって、コハク酸の生産能力が改善された微生物を用いることができ、これによりコハク酸の生産性を向上させることも可能である。このような微生物としては、例えば、特開２００５−２７５３３号公報に記載の乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase）を欠損したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）や、非特許文献１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、米国特許第５７７０４３５号明細書に記載のピルビン酸・ギ酸開裂酵素（pyruvate formate lyase）と乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase）の欠損株である大腸菌ＡＦＰ111株などを使用することができる。
【００９４】
本発明によりコハク酸を製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるコハク酸の分離・精製には、通常のコハク酸の精製法を適用することができる。例えば、特開２００５−３３３８８６号公報に示されている水分解電気透析処理と減圧濃縮・晶析を組み合わせた精製法を好適に用いることができる。
【００９５】
本発明によりイタコン酸を製造する場合は、イタコン酸を生産することが可能な微生物であれば特に制限はないが、例えばカビあるいは酵母を好ましく用いることができる。更に好ましくは、アスペルギルス属（Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、あるいはウスティラゴ属（Ｇｅｎｕｓ Ｕｓｔｉｌａｇｏ）に属するカビ、およびカンジダ属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｇｅｎｕｓ Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）に属する酵母を用いたイタコン酸の生産が挙げられる。中でも、アスペルギルス テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス イタコニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｉｔａｃｏｎｉｃｕｓ）、ウスティラゴ メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、ウスティラゴ シノドンティス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）、およびウスティラゴ ラベンホルスティナ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｒａｂｅｎｈｏｒｓｔｉｎａ）のカビ、あるいはカンジダ アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）を、イタコン酸の生産に好ましく用いることができる。
【００９６】
本発明によりイタコン酸を製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるイタコン酸の分離・精製は、好ましくは、限外濾過や電気透析を用いて行うことができる。例えば、特公昭−５０９５８号公報に示される限外濾過、および塩型カチオン交換樹脂膜を用いた電気透析による精製法を好適に用いることができる。
【００９７】
本発明により１，３−プロパンジオールを製造する場合は、１，３−プロパンジオールを生産することが可能な微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はないが、例えば、野生型株ではグリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有するクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が挙げられる。
【００９８】
そして、１，３−プロパンジオールを製造する場合、微生物は、（ａ）グリセロールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｂ）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子；及び（ｃ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでいることが好ましい。本発明では、更に好ましくは、微生物は、組換え微生物で１，３−プロパンジオールを生産可能にすることが挙げられる。
【００９９】
かかる組換え微生物としては、１，３−プロパンジオールを製造する場合、グリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有する微生物は、好ましくは、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクテル（Ｃｙｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテル（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）より成る群から選ばれる組換え微生物が好ましく、更に好ましくはエッシェリシア コリである。
【０１００】
また、組換え微生物は、グルコースから効率よく１，３−プロパンジオールを生産する事ができるようにする改良を行ったほうが好ましい。組換え微生物は、例えば、（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び（ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んだ組換え微生物であることが好ましく。
【０１０１】
更にグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子がｄｈａレギュロンから単離されるｏｒｆＸ及びｏｒｆＺによりコードされる遺伝子を含んだ組換え微生物であることが更に好ましい。更には、組換え微生物は、グリセロールキナーゼ活性および／またはグリセロールデヒドロゲナーゼ活性および／またはトリオースリン酸イソメラーゼ活性を欠失した組換え微生物であることが好ましい。
【０１０２】
本発明により１，３−プロパンジオールを製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれる１，３−プロパンジオールの分離・精製は、濃縮、晶析により行うことができる。例えば、特開平−３５７８５号公報に示される減圧濃縮・晶析を用いた精製法を好適に用いることができる。
【０１０３】
本発明によりカダベリンを製造する場合は、カダベリンを生産することが可能な微生物あるいは培養細胞であれば特に制限はないが、例えば、リジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターの酵素活性を増強している微生物が好ましい。更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターをコードする遺伝子を組み込んだ組換え微生物が挙げられる。更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が１または２種類以上組み込まれている組換え微生物である。
【０１０４】
カダベリンを製造する場合、組換え微生物としては大腸菌およびコリネ型細菌が好ましく、更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素活性を有し、かつホモセリン栄養要求性またはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性の少なくともいずれか１つの特徴を有しているコリネ型細菌である。更には、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることが好ましく。遺伝子挿入変異生成によりホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることが更に好ましい。また、コリネ型細菌の属が、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属からなる群より選ばれる少なくとも１つの属であることが好ましい。更に好ましくは、コリネバクテリア・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｕｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。
【０１０５】
本発明によりカダベリンを製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるカダベリンの分離・精製は、濃縮、蒸留および晶析などの従来知られている方法を組み合わせて行うことができる。例えば、特開２００４−２２２５６９号公報に示される晶析を用いた精製法を好適に用いることができる。本発明によって得られるカダベリンは、連続培養の際に用いられる酸によって様々なポリマー原料にすることができるが、好純度が求められるポリマー原料用途では晶析による精製方法が好ましく用いられる。塩酸により培養液のｐＨを維持すると、濾過・分離発酵液からは晶析工程によりカダベリン二塩酸塩を回収することができる。更に、連続培養の際にジカルボン酸により培養液のｐＨを維持し、濾過・分離発酵液から晶析工程によりカダベリン・ジカルボン酸塩を回収することも好ましい。そのジカルボン酸は、官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族および／または芳香族のジカルボン酸であることが、更にはアジピン酸、セバシン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸またはテレフタル酸のいずれかであることが、好ましい。
【実施例】
【０１０６】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために、上記化学品として、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、エタノール、ピルビン酸、コハク酸、１，３−プロパンジオール、イタコン酸、カダベリンを選定し、それぞれの化学品を生産する能力のある微生物あるいは培養細胞による、図１および図２に示す装置を用いた連続発酵の具体的な実施形態について、実施例を挙げて説明する。
【０１０７】
（参考例１） 多孔性膜の作製（その１）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し、製膜原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【０１０８】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社製、商品名“イオネットＴ−２０Ｃ”（登録商標））を５重量％、および水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して、コーティング原液を調整した。このコーティング原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させ、以下の実施例、比較例で用いる中空糸膜（多孔性膜）を製作した。
【０１０９】
得られた多孔性膜の被処理液側表面（外側表面）の平均細孔径は、０．０５μｍであった。また、この多孔性膜について純水透過係数を評価したところ、５．５×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。なお、純水透過係数の測定は、逆浸透膜で調製した２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差は０．００６μｍであった。
【０１１０】
（参考例２） 多孔性膜の作製（その２）
ポリフッ化ビニリデン１５．９重量％、塩化リチウム０．９重量％、水３．７重量％およびポリビニルピロリドン２．３重量％を、溶媒のジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）７７．２重量％に加えて混合し十分に溶解させ製膜原液を調製した。次に、得られた製膜原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、ポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、相対湿度が８０％の空気に２分間放置し、直ちに５０℃の温度の温水浴中に５分間浸漬して、多孔質基材上に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
【０１１１】
得られた多孔性膜の多孔質樹脂層表面を、倍率１，５００倍で走査型電子顕微鏡観察を行った。観察できる細孔すべての直径の平均は、２．０μｍであった。また、この多孔性膜について、純水透過係数を評価した結果、３．０×１０−６ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。なお、純水透過係数の測定は、逆浸透膜で調製した２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。
【０１１２】
（参考例３） Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
乳酸生産能力を有する酵母として、配列番号１に記載の塩基配列を有するアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子がＰＤＣ１遺伝子、ＳＥＤ１遺伝子、およびＴＤＨ３遺伝子座に導入された酵母を作製した。アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子のクローニングはＰＣＲ法により行った。ＰＣＲには、アフリカツメガエルの腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（STRATAGENE社製）より付属のプロトコールに従い調製したファージミドＤＮＡを鋳型とした。
【０１１３】
ＰＣＲ増幅反応には、KOD-Plus polymerase（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のように付属のプロトコールに従い調整したファージミドＤＮＡを５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号２，３）には、５末端側にはＳａｌＩ認識配列、3末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【０１１４】
ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をT4 polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。
【０１１５】
上記アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、定法に従いアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子を含む断片を精製した。得られたｌｄｈ遺伝子を含む断片を、図６に示す発現ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断することにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入された発現ベクターを選抜した。以後、このようにして作製したアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子を組み込んだ発現ベクターをｐＴＲＳ１０２とする。
【０１１６】
このｐＴＲＳ１０２を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，５）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子及びＴＤＨ３ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号４は、ＰＤＣ１遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【０１１７】
次に、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号６，７）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＴＲＰ１遺伝子を含む１．２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号７は、ＰＤＣ１遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【０１１８】
それぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，７）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、５末端・３末端にそれぞれＰＤＣ１遺伝子の上流・下流６０ｂｐに相当する配列が付加された、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーター及びＴＲＰ１遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
【０１１９】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、酵母サッカロミセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換し、トリプトファン非添加培地で培養することにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【０１２０】
上記のようにして得られた形質転換株が、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号７，８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、Ｂ２株とする。なお、ＰＤＣ１遺伝子の上流及び下流配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（URL:http://www.yeastgenome.org/）より取得することができる。
【０１２１】
続いてこのＢ２株に、配列番号１に記載のｌｄｈ遺伝子をＳＥＤ１遺伝子座に導入した。ＳＥＤ１遺伝子座への導入は、参考例１で作製したｐＴＲＳ１０２を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号５，９）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子及びＴＤＨ３ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号９は、ＳＥＤ１遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【０１２２】
次に、プラスミドｐＲＳ４２３を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号６，１０）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＨＩＳ３遺伝子を含む約１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号１０は、ＳＥＤ１遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【０１２３】
それぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた二種類の約１．３ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号９，１０）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、５末端・３末端にそれぞれＳＥＤ１遺伝子の上流・下流６０ｂｐに相当する配列が付加された、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーター及びＨＩＳ３遺伝子が連結された約２．６ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
【０１２４】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、Ｂ２株に形質転換し、ヒスチジン非添加培地で培養することにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＳＥＤ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【０１２５】
上記のようにして得られた形質転換株が、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＳＥＤ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１１，１２）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．９ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約１．４ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＳＥＤ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、ＳＵ０１４−Ｉ株とする。
【０１２６】
続いてＳＵ０１４−Ｉに配列番号１に記載のｌｄｈ遺伝子をＴＤＨ３遺伝子座に導入した。ＴＤＨ３遺伝子座への導入は、ｐＴＲＳ１０２のＴＤＨ３ターミネーターをＡＤＨ１ターミネーターに変更したプラスミドを作製した。
【０１２７】
まず、ＮＢＲＣ１０５０５株からゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）によりゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号１３，１４）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＡＤＨ１プロモーターを含むＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号１３には、５末端側にはＮｏｔＩ認識配列、配列番号１４には3末端側にはＨｉｎｄＩＩＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【０１２８】
ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をT4 polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＡＤＨ１ターミネーターが挿入されているプラスミドを選抜した。作製したプラスミドをｐＵＣ１１８−ＡＤＨ１ｔとする。
【０１２９】
次にｐＵＣ１１８−ＡＤＨ１ｔを制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常定法に従いＡＤＨ１ターミネーターを含む断片を精製した。得られたＡＤＨ１ターミネーターを含む断片を、ｐＴＲＳ１０２のＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、ＴＤＨ３ターミネーターがＡＤＨ１ターミネーターに変更されたプラスミドを選抜した。以後、このようにして作製したプラスミドをｐＴＲＳ１５０とする。
【０１３０】
このｐＴＲＳ１５０を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１５，１６）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子及びＡＤＨ１ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号１６のプライマーは、ＴＤＨ３遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【０１３１】
次に、プラスミドｐＲＳ４２６を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１７，１８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＵＲＡ３遺伝子を含む１．２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号１８のプライマーは、ＴＤＨ３遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【０１３２】
それぞれのＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１６，１８）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子、ＡＤＨ１ターミネーター及びＵＲＡ３遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
【０１３３】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、ＳＵ０１４−Ｉ株に形質転換し、ウラシル非添加培地で培養することにより、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【０１３４】
上記のようにして得られた形質転換株が、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１９，２０）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株をＳＵ０１４−ＩＩ株とする。
【０１３５】
次に、国際公開ＷＯ２００７／０９７２６０号公報に記載されている、ｐｄｃ５遺伝子に温度感受性変異を有する酵母ＳＷ０１５株と上記得られたＳＵ０１４−ＩＩ株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得し、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞の中から、ｐｄｃ１遺伝子、ｓｅｄ１遺伝子、ｔｄｈ３遺伝子座にアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入され、かつ、ｐｄｃ５遺伝子に温度感受性変異を有する（３４℃で生育不能）株をＭＡＴａ、およびＭＡＴαのそれぞれの接合型を選択した。得られた酵母株のうちＭＡＴａの接合型を有する株をＳＵ０１４―８Ａ株、ＭＡＴαの接合型を有する株をＳＵ０１４―３Ｂ株とした。
【０１３６】
（参考例４） リジン栄養要求性復帰株の作成
参考例３で得られたＳＵ０１４−８Ａ株のリジン要求性を復帰させた。フナコシ社製のＢＹ４７４１のゲノムDNA を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号２１，２２）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＬＹＳ２遺伝子の前半約２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅させた。上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、ＳＵ０１４―８Ａ株に形質転換し、ｌｙｓ２遺伝子のアンバー変異を解除した。リジン非添加培地で培養することにより、リジン合成能が復帰した形質転換株を選択した。
【０１３７】
上記のようにして得られた形質転換株が、ｌｙｓ２遺伝子のアンバー変異を解除された酵母であることの確認は下記のように行った。まず、得られた形質転換体と野生型のＬＹＳ２遺伝子を持つ２０ＧＹ７７株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得し、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞のすべてがリジン合成能を持っていることを確認した。なお、ｌｙｓ２の変異が解除されずにリジン合成能が復帰した場合には、上記で得られる１倍体細胞のうち、リジン合成能を持たない細胞が得られる。以下ＳＵ０１４−８Ａ株のリジン合成能が復帰した株をＨＩ００１とする。
【０１３８】
（参考例５） リジン栄養要求性復帰株の取得
参考例３で得られたＳＵ０１４−３Ｂ株のロイシン要求性を復帰させた。ＰＲＳ４２５ を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号２３，２４）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、ＬＥＵ２遺伝子のＰＣＲ断片約２ｋｂを増幅させた。上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、ＳＵ０１４―３Ｂ株に形質転換し、ｌｅｕ２遺伝子の変異を解除した。ロイシン非添加培地で培養することにより、ロイシン合成能が復帰した形質転換株を選択した。
【０１３９】
上記のようにして得られた形質転換株が、ｌｅｕ２遺伝子の変異を解除された酵母であることの確認は下記のように行った。まず、得られた形質転換体と野生型のＬＥＵ２遺伝子を持つ２０ＧＹ７株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得し、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞のすべてがロイシン合成能を持っていることを確認した。なお、ｌｅｕ２遺伝子の変異が解除されずにロイシン合成能が復帰した場合には、上記で得られる１倍体細胞のうち、ロイシン合成能を持たない細胞が得られる。以下ＳＵ０１４−３Ｂ株のロイシン合成能が復帰した株をＨＩ００２とする。
【０１４０】
（参考例６） ２倍体原栄養株の取得
参考例４及び参考例５で得られたＨＩ００１株とＨＩ００２株とを接合させ、栄養要求性のない２倍体原栄養株を得た。得られた株を以下ＨＩ００３とする。
【０１４１】
（参考例７） ２倍体栄養要求性株の取得
参考例３で得られたＳＵ０１４−８Ａ株とＳＵ０１４−３Ｂ株とを接合させ、栄養要求性のある２倍体栄養要求性株を得た。得られた株をＳＵ０１４とする。
【０１４２】
（参考例８） 乳酸など培地成分の定量
乳酸は、濾液の遠心上清について、以下の条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
【０１４３】
カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【０１４４】
また、Ｌ−乳酸およびＤ−乳酸の濃度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【０１４５】
カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：３０℃。
【０１４６】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算した。
【０１４７】
光学純度（%）＝100×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【０１４８】
また、スクロース、グルコース、フラクトース濃度の測定は、濾液の遠心上清について、以下の条件でＨＰＬＣ法により測定することで確認した。
【０１４９】
カラム：Asahipak NH2P-50 4E(SHODEX社製)
移動相：75 %アセトニトリル溶液
検出方法：示差屈折率
温度：３０℃
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ。
【０１５０】
（比較例１） ２倍体原栄養株を用いたバッチ培養
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行い、Ｌ−乳酸生産性を評価した。すなわち、図１の連続培養装置の培養反応槽１のみを用いた回分発酵試験を行った。酵母乳酸発酵培地には、表１に示すように原料糖（粗糖）等を使用した。原料糖としては、ムソー株式会社の優糖精（商品名）を使用した。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。微生物としては上記の参考例６で造成した酵母ＨＩ００３株を用い、濾液中の生産物（乳酸）の濃度および濾糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣ法を用いた。
【０１５１】
【表１】
【０１５２】
培養の条件を以下に示す。
【０１５３】
・培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
・温度調整：３２（℃）
・培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ Ｃａ(ＯＨ)２によりｐＨ５に調整
・培養反応槽は１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
【０１５４】
具体的には、まず、ＨＩ００３株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液を図１の連続培養装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、通気した。温度の調整とｐＨの調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働させることなく、回分発酵培養を行った。回分発酵の結果を表２に示す。乳酸対糖収率は、８０％であった。また、この培養時のｋＬａは７．０であった。
【０１５５】
【表２】
【０１５６】
（比較例２） 外部循環装置を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造
Ｌ−乳酸を生産させる微生物として上記の参考例６で造成した酵母ＨＩ００３株を用い、培地として表３に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、図５の連続培養装置によりＬ−乳酸の製造を行った。なお、図５に示す装置は、分離膜エレメント２が、培養反応槽１の外部に設置され、培養反応槽１には、培養液循環配管１１０の培養反応槽１から膜分離槽１２へ培養液を供給するための送液口１１１と、未濾過培養液を膜分離槽１２から培養反応槽１へ還流するための環流口１１２とが接続され、かつ、送液口１１１が培養反応槽１に貯留される培養液に浸漬する位置に開口してなり、環流口１１２が培養反応槽１に貯留される培養液に浸漬しない位置に開口しているものであり、環流口１１２が培養液に浸漬しない位置に開口している以外は図１の連続培養装置と同じものである。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０１５７】
【表３】
【０１５８】
培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。濾液中の生産物（乳酸）の濃度および糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０１５９】
培養の条件を以下に示す。
【０１６０】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
温度調整：３２（℃）
培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ Ｃａ(ＯＨ)２によりｐＨ５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
培養液の循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
濾液流量制御：膜間差圧による流量制御
（膜間差圧：０．１ｋＰａ〜２０ｋＰａ未満で制御）
具体的には、まず、ＨＩ００３株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図５に示す連続培養装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働させ（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量が２Ｌ（培養反応槽分１．５Ｌ、培養液循環配管分および膜分離槽分で合計０．５Ｌ）となるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの濾液量の制御は、差圧制御装置３により、適宜変化させることで行った。適宜、濾液中のＬ−乳酸濃度および残存糖濃度を測定した。
【０１６１】
８００時間の連続発酵試験を行った結果を表４に示す。図５に示す連続培養装置を用いて外部循環を行いながら発酵を行うことで、回分発酵の比較例１より若干乳酸対糖収率が低下した。乳酸対糖収率は、７３％であった。また、この培養時のｋＬａは９．１であった。
【０１６２】
【表４】
【０１６３】
（比較例３） 循環量を変化させたときのろ過流量の変化
生産速度を向上させるには、上記式（１）、式（５）に示した通り培養液の抜き取り速度すなわち濾液流量を大きくすれば向上する。しかし、濾液流量を大きくすれば、微生物による目詰まりが起こりやすくなり、濾過性能を長期間安定に制御することが困難になる。
【０１６４】
そこで、培養反応槽−膜分離槽間の培養液の循環量を大きくすることで、クロスフロー流速を発生させ、膜表面を洗浄することにより、微生物による目詰まりが起こりにくくなり、濾液流量を大きくしても濾過性能を安定に維持できるか、以下の運転条件にて確認を行った。
【０１６５】
Ｌ−乳酸を生産させる微生物として、上記の参考例６で造成した酵母ＨＩ００３株を用い、培地として表３に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、図５の連続培養装置によりＬ−乳酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０１６６】
培養の条件を以下に示す。
【０１６７】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
温度調整：３２（℃）
培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ Ｃａ(ＯＨ)２によりｐＨ５に調整
培養液循の循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）。
【０１６８】
具体的には、まず、ＨＩ００３株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図５に示す連続培養装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働させ（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。また、循環量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。６００時間の連続発酵試験を行った結果を表５に示す。循環量を大きくすることで、濾液流量が向上することが明らかとなった。また、循環量ごとのｋＬａを測定した結果、０．２５Ｌ／ｍｉｎの運転時にｋＬａが回分培養時と同じ７．０となった。また、０．５Ｌ／ｍｉｎの運転時はｋＬａが３．１、１．０Ｌ／ｍｉｎの運転時はｋＬａが１．９であった。
【０１６９】
【表５】
【０１７０】
（実施例１） 酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その１）
Ｌ−乳酸を生産する微生物として、上記の参考例６で造成した酵母ＨＩ００３株を用い、培地として表３に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、図１の連続培養装置によりＬ−乳酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物である乳酸の濃度および残存糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０１７１】
培養の条件を以下に示す。
【０１７２】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
温度調整：３２（℃）
培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０１７３】
具体的には、まず、ＨＩ００３株を試験管で５ｍｌの酵母乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な酵母乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の１．５Ｌの酵母発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、酵母乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。また、循環量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中のＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。
【０１７４】
６００時間の連続発酵試験を行った結果を表６に示す。ｋＬａは、回分培養で対糖収率の高かった７．０（設定値）の条件で培養を開始したところ、循環量を大きくすると低下したものの、その減少率は設定値の３０％以内に収まっていた。図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定した収率でＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１７５】
なお、ｋＬａの減少率は、ｋＬａの設定値とある時点でのｋＬａ値との差を当該設定値で除し、その値に１００を乗じることで算出する。
【０１７６】
（実施例２） 酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜として参考例２で作製した多孔性膜、図４に示す分離膜エレメントを構成した以外は実施例１と同様の条件で、Ｌ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表６に示す。ｋＬａは、回分培養で対糖収率の高かった７．０（設定値）の条件で培養を開始したところ、循環量を大きくすると低下したものの、その減少率は設定値の３０％以内に収まっていた。図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定した収率でＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
（実施例３） 酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その３）
Ｌ−乳酸を生産する微生物として、上記の参考例６で造成した酵母ＨＩ００３株を用い、培地として表３に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、図２の連続培養装置によりＬ−乳酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物である乳酸の濃度および残存糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０１７７】
培養条件を以下に示す。
【０１７８】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
温度調整：３２（℃）
培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．０３（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０１７９】
具体的には、まず、ＨＩ００３株を試験管で５ｍｌの酵母乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な酵母乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示す連続培養装置の１．５Ｌの酵母発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、酵母乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。また、循環量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。
【０１８０】
６００時間の連続発酵試験を行った結果を表６に示す。ｋＬａは、回分培養で対糖収率の高かった７．０（設定値）の条件で培養を開始したところ、循環量を大きくしてもほぼ一定であり、その減少率は設定値の３０％以内に収まっていた。図２に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、高収率で安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１８１】
（比較例４） 酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その４）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用いた以外は実施例１と同様に、Ｌ−乳酸連続発酵試験を行った。適宜、濾液中のＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該Ｌ−乳酸およびグルコース濃度から算出された該Ｌ−乳酸対糖収率を表６に示した。ｋＬａは、回分培養で対糖収率の高かった７．０（設定値）の条件で培養を開始したところ、循環量を大きくすると低下し、その減少率は設定値の３０％以上であった。
【０１８２】
（比較例５） 酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その５）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用いた以外は実施例２と同様に行った。その結果を表６に示した。ｋＬａは、回分培養で対糖収率の高かった７．０（設定値）の条件で培養を開始したところ、循環量を大きくすると低下し、その減少率は設定値の３０％以上であった。
【０１８３】
【表６】
【０１８４】
表６に示した結果（比較例４および比較例５）を見ると、培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している連続培養装置（図５）で循環量を変化させ培養を行うと、循環量を大きくするほど連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下してしまった。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。一方、培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬している位置に開口している連続培養装置（図１および図２）では、循環量を変化させても連続培養成績の一つである対糖収率が変化せず安定に長期間運転可能であった。さらに、図２の連続培養装置を用いて、培養液循環配管部分に培養反応槽内と同じ体積比で通気を行うことで、より高収率で安定に長期間培養が可能であった。
【０１８５】
（実施例４） 連続発酵によるエタノールの製造（その１）
エタノールを生産する微生物としてＮＢＲＣ１０５０５株を用い、培地として表７に示す組成のエタノール発酵培地を用い、図１の連続培養装置によりエタノールの製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるエタノールの濃度の評価には、ガスクロマトグラフ法により定量した。Shimadzu GC-2010キャピラリーGC TC-1(GL science) 15 meter L.＊0.53 mm I.D., df1.5 μmを用いて、水素炎イオン化検出器により検出・算出して、評価した。残存糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０１８６】
【表７】
【０１８７】
培養の条件を以下に示す。
【０１８８】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３２（℃）
培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０１８９】
具体的には、まず、ＮＢＲＣ１０５０５株を試験管で５ｍｌのエタノール発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮なエタノール発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の１．５Ｌのエタノール発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、エタノール発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるエタノールの製造を行った。また、還流量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたエタノール濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表８に示す。
【０１９０】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したエタノールの連続発酵による製造が可能であった。
【０１９１】
（実施例５） 連続発酵によるエタノールの製造（その２）
エタノールを生産する微生物としてＮＢＲＣ１０５０５株を用い、培地として表７に示す組成のエタノール発酵培地を用い、図２の連続培養装置によりエタノールの製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるエタノールの濃度の評価には、ガスクロマトグラフ法により定量した。残存糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０１９２】
培養条件を以下に示す。
【０１９３】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３２（℃）
培養反応槽通気量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．０３（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０１９４】
具体的には、まず、ＮＢＲＣ１０５０５株を試験管で５ｍｌのエタノール発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮なエタノール発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示す連続培養装置の１．５Ｌのエタノール発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、エタノール発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるエタノールの製造を行った。また、還流量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。その結果を表８に示す。
【０１９５】
図２に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したエタノールの連続発酵による製造が可能であった。
【０１９６】
（比較例６） 連続発酵によるエタノールの製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例４と同様に行った。
【０１９７】
結果を表８に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下してしまった。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０１９８】
【表８】
【０１９９】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０２００】
（実施例６） 連続発酵によるピルビン酸の製造（その１）
ピルビン酸を生産する微生物としてトルロプシス・グラブラータＰ１２０−５ａ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６７４５）を用い、培地として表９に示す組成のピルビン酸発酵培地を用い、図１の連続培養装置によりピルビン酸の製造を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２０１】
【表９】
【０２０２】
生産物であるピルビン酸の濃度は、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により測定した。また、残存糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０２０３】
カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【０２０４】
培養の条件を以下に示す。
【０２０５】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３０（℃）
培養反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２０６】
具体的には、まず、Ｐ１２０−５ａ株を試験管で５ｍｌのピルビン酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮なピルビン酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の１．５Ｌのピルビン酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、ピルビン酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるピルビン酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１０に示す。
【０２０７】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したピルビン酸の連続発酵による製造が可能であった。
（実施例７） 連続発酵によるピルビン酸の製造（その２）
ピルビン酸を生産する微生物としてトルロプシス・グラブラータＰ１２０−５ａ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６７４５）を用い、培地として表９に示す組成のピルビン酸発酵培地を用い、図２の連続培養装置によりピルビン酸の製造を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２０８】
生産物であるピルビン酸の濃度は、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により測定した。また、残存糖類の定量には、上記の参考例８に示したＨＰＬＣを用いた。
【０２０９】
カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【０２１０】
培養の条件を以下に示す。
【０２１１】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３０（℃）
培養反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２１２】
具体的には、まず、Ｐ１２０−５ａ株を試験管で５ｍｌのピルビン酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮なピルビン酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示す連続培養装置の１．５Ｌのピルビン酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、ピルビン酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるピルビン酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１０に示す。
【０２１３】
図２に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したピルビン酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２１４】
（比較例７） 連続発酵によるピルビン酸の製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例６と同様に行った。
【０２１５】
結果を表１０に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下してしまった。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０２１６】
【表１０】
【０２１７】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０２１８】
（実施例８） 連続発酵によるコハク酸の連続製造（その１）
コハク酸を生産する微生物として、アナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）ＡＴＣＣ53488株を用い、培地として表１１に示す組成のコハク酸発酵培地を用い、図１に示す連続培養装置によりコハク酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した
【０２１９】
【表１１】
【０２２０】
コハク酸の製造におけるコハク酸およびグルコースは、特に断らない限り、以下の方法で測定した。
【０２２１】
コハク酸は、培養液の遠心上清について、ＨＰＬＣ（島津 ＬＣ１０Ａ、ＲＩモニター：ＲＩＤ-１０Ａ、カラム：アミネックスＨＰＸ-８７Ｈ）で分析した。カラム温度は５０℃、０.０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４でカラムを平衡化した後、サンプルをインジェクションし、０.０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で溶出して分析を行った。グルコースは、グルコースセンサー（ＢＦ−４、王子計測機器）を用いて測定した。
【０２２２】
培養の条件を以下に示す。
【０２２３】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３９（℃）
培養反応槽ＣＯ２通気量：１０（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：１（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ６.４に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２２４】
具体的には、まず、発酵培地を１２５ｍＬ容三角フラスコに入れ加熱滅菌し、その後、嫌気グローブボックス内で、３０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３ １ｍＬと１８０ｍＭ Ｈ２ＳＯ４ ０.１５ｍＬを加え、さらに、０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓからなる還元溶液０.５ｍＬを加えた後、ＡＴＣＣ53488株を接種し、３９℃で一晩静置培養した（前々培養）。その後、図１に示す連続培養装置の１．５Ｌのコハク酸発酵培地に、０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏからなる還元溶液５ｍLを加えた後、前々培養液５０ｍＬを植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。
【０２２５】
前培養完了後直ちに、コハク酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるよう濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるコハク酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１２に示す。
【０２２６】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したコハク酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２２７】
（実施例９） 連続発酵によるコハク酸の連続製造（その２）
コハク酸を生産する微生物として、アナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）ＡＴＣＣ53488株を用い、培地として表１２に示す組成のコハク酸発酵培地を用い、図２に示す連続培養装置によりコハク酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２２８】
コハク酸の製造におけるコハク酸およびグルコースは、特に断らない限り、以下の方法で測定した。
【０２２９】
コハク酸は、培養液の遠心上清について、ＨＰＬＣ（島津 ＬＣ１０Ａ、ＲＩモニター：ＲＩＤ-１０Ａ、カラム：アミネックスＨＰＸ-８７Ｈ）で分析した。カラム温度は５０℃、０.０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４でカラムを平衡化した後、サンプルをインジェクションし、０.０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で溶出して分析を行った。グルコースは、グルコースセンサー（ＢＦ−４、王子計測機器）を用いて測定した。
【０２３０】
培養の条件を以下に示す。
【０２３１】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３９（℃）
培養反応槽ＣＯ２通気量：１０（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：１（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．０３（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ６.４に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２３２】
具体的には、まず、発酵培地を１２５ｍＬ容三角フラスコに入れ加熱滅菌し、その後、嫌気グローブボックス内で、３０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３１ｍＬと１８０ｍＭ Ｈ２ＳＯ４ ０.１５ｍＬを加え、さらに、０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓからなる還元溶液０.５ｍＬを加えた後、ＡＴＣＣ53488株を接種し、３９℃で一晩静置培養した（前々培養）。
【０２３３】
その後、図２に示す連続培養装置の１．５Ｌのコハク酸発酵培地に、０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏからなる還元溶液５ｍLを加えた後、前々培養液５０ｍＬを植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。
【０２３４】
前培養完了後直ちに、コハク酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるよう濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるコハク酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１２に示す。
【０２３５】
図２に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したコハク酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２３６】
（比較例８） 連続発酵によるコハク酸の製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例８と同様に行った。
【０２３７】
結果を表１２に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下してしまった。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０２３８】
【表１２】
【０２３９】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０２４０】
（実施例１０） 連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その１）
１，３−プロパンジオールを生産する微生物としてクレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を用い、培地として表１３に示す組成の１，３−プロパンジオール生産培地を用い、図１の連続培養装置により１，３−プロパンジオールの製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２４１】
【表１３】
【０２４２】
生産物である１，３−プロパンジオールの測定は、以下のように行った。１．０ｍＬの培養上澄み液に３０μＬの濃（７０％ｖ／ｖ）過塩素酸を加え、混合の後、試料を凍結乾燥した。ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド：ピリジンの１：１混合物（３００μＬ）を凍結乾燥された材料に加え、激しく混合し、６５℃において１時間置いた。遠心により不溶性材料を除いて試料を透明にした。得られる液体は２相に分かれ、その上相を分析に用いた。試料をＤＢ−５カラム（４８ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚さ０．２５μｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから）上でクロマトグラフィーにより分析した。また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０２４３】
培養の条件を以下に示す。
【０２４４】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養反応槽Ｎ２通気量：０．６（Ｌ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２４５】
具体的には、まず、クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を試験管で５ｍｌの１，３−プロパンジオール生産培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な１，３−プロパンジオール生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続培養装置の１．５Ｌの１，３−プロパンジオール生産培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、１，３−プロパンジオール生産培地（グリセロール濃度は１００ｇ／Ｌ）の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるよう濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産された１，３−プロパンジオール濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１４に示す。
【０２４６】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定した１，３−プロパンジオールの連続発酵による製造が可能であった。
【０２４７】
（実施例１１） 連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その２）
１，３−プロパンジオールを生産する微生物としてクレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を用い、培地として表１３に示す組成の１，３−プロパンジオール生産培地を用い、図２の連続培養装置により１，３−プロパンジオールの製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２４８】
生産物である１，３−プロパンジオールの測定は、以下のように行った。１．０ｍＬの培養上澄み液に３０μＬの濃（７０％ｖ／ｖ）過塩素酸を加え、混合の後、試料を凍結乾燥した。ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド：ピリジンの１：１混合物（３００μＬ）を凍結乾燥された材料に加え、激しく混合し、６５℃において１時間置いた。遠心により不溶性材料を除いて試料を透明にした。得られる液体は２相に分かれ、その上相を分析に用いた。試料をＤＢ−５カラム（４８ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚さ０．２５μｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから）上でクロマトグラフィーにより分析した。また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０２４９】
培養の条件を以下に示す。
【０２５０】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養反応槽Ｎ２通気量：０．６（Ｌ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．０１７Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２５１】
具体的には、まず、クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を試験管で５ｍｌの１，３−プロパンジオール生産培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な１，３−プロパンジオール生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続培養装置の１．５Ｌの１，３−プロパンジオール生産培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、１，３−プロパンジオール生産培地（グリセロール濃度は１００ｇ／Ｌ）の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるよう濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産された１，３−プロパンジオール濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１４に示す。
【０２５２】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定した１，３−プロパンジオールの連続発酵による製造が可能であった。
【０２５３】
（比較例９） 連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例１０と同様に行った。
【０２５４】
結果を表１４に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下した。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０２５５】
【表１４】
【０２５６】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０２５７】
（実施例１２） 連続発酵によるイタコン酸の製造（その１）
イタコン酸を生産する微生物としてアスペルギルス テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ１００２０株を用い、培地として表１５に示す組成のイタコン酸発酵培地を用い、図１に示す連続培養装置によりイタコン酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌処理（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるイタコン酸の濃度は、コッペシャール（Ｋｏｐｐｅｓｈａａｒ）の方法（共立出版、微生物光学講座第５巻「カビの利用工業」ｐ７２−７３、昭和３１年発行）の方法で測定した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０２５８】
【表１５】
【０２５９】
培養の条件を以下に示す。
【０２６０】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３５（℃）
培養反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２６１】
具体的には、まず、アスペルギルス テレウスＡＴＣＣ１００２０株を、試験管で表１５に示す５ｍｌの前培養培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な前培養培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで４８時間、３５℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の１．５Ｌの連続・回分発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、イタコン酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるイタコン酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたイタコン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１６に示す。
【０２６２】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したイタコン酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２６３】
（実施例１３） 連続発酵によるイタコン酸の製造（その２）
イタコン酸を生産する微生物としてアスペルギルス テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ１００２０株を用い、培地として表１５に示す組成のイタコン酸発酵培地を用い、図２に示す連続培養装置によりイタコン酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌処理（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２６４】
生産物であるイタコン酸の濃度は、コッペシャール（Ｋｏｐｐｅｓｈａａｒ）の方法（共立出版、微生物光学講座第５巻「カビの利用工業」ｐ７２−７３、昭和３１年発行）の方法で測定した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０２６５】
培養の条件を以下に示す。
【０２６６】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３５（℃）
培養反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．５Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２６７】
具体的には、まず、アスペルギルス テレウスＡＴＣＣ１００２０株を、試験管で表１５に示す５ｍｌの前培養培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な前培養培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで４８時間、３５℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示す連続培養装置の１．５Ｌの連続・回分発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、イタコン酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるイタコン酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたイタコン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１６に示す。
【０２６８】
（比較例１０） 連続発酵によるイタコン酸の製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例１２と同様に行った。
【０２６９】
結果を表１６に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下した。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０２７０】
【表１６】
【０２７１】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０２７２】
（実施例１４） 連続発酵によるカダベリンの製造（その１）
カダベリンを生産させる微生物として、特開２００４−２２２５６９号公報に記載のコリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株用い、培地として表１７に示す組成のカダベリン生産培地を用い、図１に示す連続培養装置によりカダベリンの製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２７３】
【表１７】
【０２７４】
カダベリンは以下に示すＨＰＬＣ法によって評価した。
【０２７５】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：ＵＶ３６０ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として、１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μｌおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し、３７℃の温度で１時間保温する。上記の反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬社製）を用いた。
【０２７６】
培養の条件を以下に示す。
【０２７７】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３０（℃）
培養反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：３Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ アンモニア水によりｐＨ７．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２７８】
具体的には、まず、コリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株を、試験管で５ｍｌのカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン発酵培地添加で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で培養を行った（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の１．５Ｌのカダベリン発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。
【０２７９】
前培養完了後直ちに、カダベリン発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるよう濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるカダベリンの製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたカダベリン濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１８に示す。
【０２８０】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したカダベリンの連続発酵による製造が可能であった。
【０２８１】
（実施例１５） 連続発酵によるカダベリンの製造（その２）
カダベリンを生産させる微生物として、特開２００４−２２２５６９号公報に記載のコリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株用い、培地として表１７に示す組成のカダベリン生産培地を用い、図２に示す連続培養装置によりカダベリンの製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。
【０２８２】
カダベリンは以下に示すＨＰＬＣ法によって評価した。
【０２８３】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：ＵＶ３６０ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として、１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μｌおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し、３７℃の温度で１時間保温する。上記の反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬社製）を用いた。
【０２８４】
培養の条件を以下に示す。
【０２８５】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３０（℃）
培養反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．５Ｌ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：３Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ アンモニア水によりｐＨ７．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２８６】
具体的には、まず、コリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株を、試験管で５ｍｌのカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン発酵培地添加で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したカダベリン生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で培養を行った（前々培養）。前々培養液を、図２に示す連続培養装置の１．５Ｌのカダベリン発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。
【０２８７】
前培養完了後直ちに、カダベリン発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるよう濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるカダベリンの製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたカダベリン濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表１８に示す。
【０２８８】
（比較例１１） 連続発酵によるカダベリンの製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例１４と同様に行った。
【０２８９】
結果を表１８に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下した。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０２９０】
【表１８】
【０２９１】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０２９２】
（実施例１６） 乳酸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その１）
Ｌ−乳酸を生産する微生物として、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＪＣＭ７６３８株を用い、培地として表１９に示す組成の乳酸菌乳酸発酵培地を用い、図１に示す連続培養装置によりＬ−乳酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるＬ−乳酸の濃度は、参考例８に示したＨＰＬＣ法により評価した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０２９３】
【表１９】
【０２９４】
培養の条件を以下に示す。
【０２９５】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養反応槽Ｎ２通気量：５０（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：５（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：８Ｎ アンモニア水溶液によりｐＨ６．５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０２９６】
具体的には、まず、ラクトコッカス ラクティス ＪＣＭ７６３８株を、試験管で表２０に示す５ｍｌの窒素ガスでパージした乳酸発酵培地で２４時間、３７℃の温度で静置培養した（前々々培養）。得られた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地５０ｍｌに植菌し、４８時間、３７℃の温度で静置培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の窒素ガスでパージした１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表２０に示す。
【０２９７】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２９８】
（実施例１７） 乳酸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
Ｌ−乳酸を生産する微生物として、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＪＣＭ７６３８株を用い、培地として表１９に示す組成の乳酸菌乳酸発酵培地を用い、図２に示す連続培養装置によりＬ−乳酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるＬ−乳酸の濃度は、参考例８に示したＨＰＬＣ法により評価した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。
【０２９９】
培養の条件を以下に示す。
【０３００】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養反応槽Ｎ２通気量：５０（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：５（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：１．７（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：８Ｎ アンモニア水溶液によりｐＨ６．５に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０３０１】
具体的には、まず、ラクトコッカス ラクティス ＪＣＭ７６３８株を、試験管で表２０に示す５ｍｌの窒素ガスでパージした乳酸発酵培地で２４時間、３７℃の温度で静置培養した（前々々培養）。得られた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地５０ｍｌに植菌し、４８時間、３７℃の温度で静置培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の窒素ガスでパージした１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表２０に示す。
【０３０２】
（比較例１２） 乳酸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例１６と同様に行った。
【０３０３】
結果を表２０に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下した。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０３０４】
【表２０】
【０３０５】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【０３０６】
（実施例１８） 乳酸菌を用いた連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その１）
Ｄ−乳酸を生産する微生物として、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を用い、培地として表２１に示す組成のＤ−乳酸生産培地を用い、図１に示す連続培養装置によりＤ−乳酸の製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるＤ−乳酸の濃度は参考例８に示したＨＰＬＣ法により測定した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬社製）を用いた。
【０３０７】
【表２１】
【０３０８】
培養の条件を以下に示す。
【０３０９】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養反応槽Ｎ２通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：２（ｍＬ／ｍｉｎ）
膜分離槽通気量：なし
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：８Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ６．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０３１０】
具体的には、まず、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を試験管中で１０ｍｌの乳酸発酵培地を用い、嫌気条件下で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なＤ−乳酸生産培地５０ｍｌに植菌し、嫌気条件下、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続培養装置の１．５ＬのＤ−乳酸生産培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。
【０３１１】
前培養完了後直ちに、Ｄ−乳酸生産培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産された乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表２２に示す。
【０３１２】
図１に示す連続培養装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０３１３】
（実施例１９） 乳酸菌を用いた連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その２）
Ｄ−乳酸を生産する微生物として、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を用い、培地として表２１に示す組成のＤ−乳酸生産培地を用い、図２に示す連続培養装置によりＤ−乳酸の製造を行った。培地は、高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。分離膜としては参考例１で作製した多孔性膜を用い、図３に示す分離膜エレメントを構成した。生産物であるＤ−乳酸の濃度は参考例８に示したＨＰＬＣ法により測定した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬社製）を用いた。
【０３１４】
培養の条件を以下に示す。
【０３１５】
培養反応槽容量：１．５（Ｌ）
膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜（参考例１）
膜分離エレメント有効濾過面積：２００平方ｃｍ
温度調整：３７（℃）
培養反応槽Ｎ２通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）
Ｏ２通気量：２（ｍＬ／ｍｉｎ）
培養液循環配管通気量：０．７（ｍＬ／ｍｉｎ）
膜分離槽通気量：なし
培養反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：８Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ６．０に調整
発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
循環液量：０．２５〜１（Ｌ／ｍｉｎ）の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：循環液量０．２５Ｌ／ｍｉｎ
２００時間〜４００時間：循環液量０．５Ｌ／ｍｉｎ
４００時間〜６００時間：循環液量１Ｌ／ｍｉｎ）
濾過量：５０ｍL〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
（連続発酵開始後〜２００時間：濾過量４００ｍＬ／ｈ
２００時間〜４００時間：濾過量６００ｍＬ／ｈ
４００時間〜６００時間：濾過量８００ｍＬ／ｈ）。
【０３１６】
具体的には、まず、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を試験管中で１０ｍｌの乳酸発酵培地を用い、嫌気条件下で一晩培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なＤ−乳酸生産培地５０ｍｌに植菌し、嫌気条件下、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示す連続培養装置の１．５ＬのＤ−乳酸生産培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、また、培養液循環配管部分に培養反応槽と同じ通気量（体積比）になるよう通気を行い、培養液循環ポンプ１１を稼働（循環液量：０．２５Ｌ／ｍｉｎ）させ、２４時間培養を行った（前培養）。
【０３１７】
前培養完了後直ちに、Ｄ−乳酸生産培地の連続供給を行い、連続培養装置の発酵液量を２Ｌとなるように濾液流量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。また、循環液量は２００時間ごとに０．２５、０．５、１．０Ｌ／ｍｉｎで可変制御した。濾液流量の制御は、２００時間ごとに４００，６００，８００ｍＬ／ｈで可変制御した。適宜、濾液中の生産された乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表２２に示す。
【０３１８】
（比較例１３） 乳酸菌を用いた連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その３）
培養液循環配管の環流口が培養反応槽において培養液に浸漬しない位置に開口している図５の連続培養装置を用い、それ以外は実施例１８と同様に行った。
【０３１９】
結果を表２２に示すが、循環量を変化させることで連続培養成績の一つである対糖収率が変化し低下した。このことから、図５の連続培養装置を用いて循環量を変化させる連続培養を行うことには培養成績が安定しないといった問題があることが明らかになった。
【０３２０】
【表２２】
【０３２１】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、循環量が変化しても連続培養成績が変化せず安定に長期間運転可能であった。
【符号の説明】
【０３２２】
１ 培養反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 分離膜束
１４ 上部樹脂封止層
１５ 下部樹脂封止層
１６ 支持フレーム
１７ 集水パイプ
１８ 支持板
１９ 流路材
２０ 分離膜
２１ 凹部
２２ 集水パイプ
１１０ 培養液循環配管
１１１ 送液口
１１２ 環流口
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養反応槽に貯留されている微生物もしくは培養細胞の培養液を連続的に分離膜へ供給循環し、培養によって生産された化学品を含む濾液を分離膜の透過側で回収するとともに、前記分離膜で濾過されなかった未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流して連続培養を行うに際し、培養反応槽内の酸素移動容量係数ｋＬａの設定値からの減少率を該設定値の３０％以内に抑制することを特徴とする連続培養による化学品の製造方法。
【請求項２】
前記未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流するに際し、前記未濾過培養液は、前記培養反応槽に貯留されている培養液中に直接還流させる、請求項１に記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項３】
前記設定値が７．０であり、前記化学品としてＬ−乳酸またはＤ−乳酸を回収する、請求項１または２に記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項４】
前記微生物が酵母である、請求項３に記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項５】
微生物もしくは培養細胞を培養した培養液を貯留するための培養反応槽と、該培養反応槽から連続的に循環される前記培養液を濾過する分離膜が配置される膜分離槽と、前記培養液を前記培養反応槽から前記膜分離槽へ循環するとともに濾過されなかった未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流する培養液循環配管とを備え、前記培養反応槽には、前記培養液循環配管の、前記培養反応槽から前記膜分離槽へ前記培養液を供給するための送液口と、前記未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流するための環流口とが接続され、かつ、前記送液口および前記環流口が、前記培養反応槽に貯留される前記培養液に浸漬する位置に開口してなることを特徴とする連続培養による化学品の製造装置。
【請求項１】
培養反応槽に貯留されている微生物もしくは培養細胞の培養液を連続的に分離膜へ供給循環し、培養によって生産された化学品を含む濾液を分離膜の透過側で回収するとともに、前記分離膜で濾過されなかった未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流して連続培養を行うに際し、培養反応槽内の酸素移動容量係数ｋＬａの設定値からの減少率を該設定値の３０％以内に抑制することを特徴とする連続培養による化学品の製造方法。
【請求項２】
前記未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流するに際し、前記未濾過培養液は、前記培養反応槽に貯留されている培養液中に直接還流させる、請求項１に記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項３】
前記設定値が７．０であり、前記化学品としてＬ−乳酸またはＤ−乳酸を回収する、請求項１または２に記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項４】
前記微生物が酵母である、請求項３に記載の連続培養による化学品の製造方法。
【請求項５】
微生物もしくは培養細胞を培養した培養液を貯留するための培養反応槽と、該培養反応槽から連続的に循環される前記培養液を濾過する分離膜が配置される膜分離槽と、前記培養液を前記培養反応槽から前記膜分離槽へ循環するとともに濾過されなかった未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流する培養液循環配管とを備え、前記培養反応槽には、前記培養液循環配管の、前記培養反応槽から前記膜分離槽へ前記培養液を供給するための送液口と、前記未濾過培養液を前記培養反応槽へ還流するための環流口とが接続され、かつ、前記送液口および前記環流口が、前記培養反応槽に貯留される前記培養液に浸漬する位置に開口してなることを特徴とする連続培養による化学品の製造装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−３６１４６（Ｐ２０１１−３６１４６Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８４１６７（Ｐ２００９−１８４１６７）
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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