連続発酵による化学品の製造法
【課題】
連続発酵法において、微生物や細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や細胞を発酵培養液に還流させ、培養液中の微生物や細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることで高い物質生産性を維持する連続発酵法による化学品の製造方法を提供する。
【解決手段】
微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収し、さらに、未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵において、前記の分離膜として平均細孔径が０．０１μｍ以上５μｍ以下の細孔を有する中空糸多孔性膜を用い、その膜間差圧を０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ未満の範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による化学品の製造方法。
連続発酵法において、微生物や細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や細胞を発酵培養液に還流させ、培養液中の微生物や細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることで高い物質生産性を維持する連続発酵法による化学品の製造方法を提供する。
【解決手段】
微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収し、さらに、未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵において、前記の分離膜として平均細孔径が０．０１μｍ以上５μｍ以下の細孔を有する中空糸多孔性膜を用い、その膜間差圧を０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ未満の範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による化学品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養を行いながら、微生物または培養細胞の発酵培養液から、目詰まりが生じにくい多孔性分離膜を通して生産物を含む液を効率よく濾過・回収することおよび未濾過液を発酵培養液に戻すことにより、発酵に関与する微生物濃度を向上させて高い生産性を得ることができる連続発酵による化学品の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）回分発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と（２）連続発酵法に分類することができる。
【０００３】
上記（１）の回分発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、時間経過と共に発酵培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持することが困難である。
【０００４】
また、上記（２）の連続発酵法は、発酵反応槽内で目的物質が高濃度に蓄積することを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。この連続発酵法については、Ｌ−グルタミン酸やＬ−リジンの発酵について連続培養法が開示されている（非特許文献１参照。）。しかしながら、この例では、発酵培養液に原料の連続的な供給を行うと共に、微生物や培養細胞を含んだ発酵培養液を抜き出すために、発酵培養液中の微生物や培養細胞が希釈されることから、生産効率の向上は限定されたものであった。
【０００５】
連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を発酵培養液に保持または還流させることにより、発酵培養液中の微生物や培養細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。
【０００６】
例えば、セラミックス膜を用いた連続発酵装置において、連続発酵する技術が提案されている（特許文献１、特許文献２および特許文献３参照。）。しかしながら、提案された技術は、セラミックス膜の目詰りによる濾過流量や濾過効率の低下に問題があり、目詰まり防止のために、逆洗浄等を行っている。
【０００７】
また別に、分離膜を用いたコハク酸の製造方法が提案されている（特許文献４参照。）。この提案では、膜分離において、高い濾過圧（約２００ｋＰａ）が採用されている。高い濾過圧は、コスト的にも不利であるばかりでなく、濾過処理において微生物や培養細胞が圧力によって物理的なダメージを受けることから、微生物や培養細胞を連続的に発酵培養液に戻す連続発酵法においては適切ではない。
【０００８】
このように従来の連続培養は、発酵反応槽に新鮮培地を一定速度で供給し、これと同量の発酵培養液を発酵反応槽外に排出することによって、発酵反応槽内の液量を常に一定に保つ連続培養法である。回分培養では初発基質濃度が消費されると培養が終了するが、連続培養では理論的には無限に培養を持続させることができる。すなわち、理論的には無限に発酵させることができる。
【０００９】
一方、上述従来の連続培養では発酵培養液と共に微生物も発酵反応槽外に排出され、発酵反応槽内の微生物濃度を高く維持することは難しい。そこで、発酵生産を行う場合には発酵を行う微生物を高濃度に保つことができれば、発酵容積当たりの発酵生産効率を向上させることができる。そのためには、微生物を発酵反応槽内に保持あるいは還流させる必要がある。微生物を発酵反応槽内に保持あるいは還流させる方法としては、排出された発酵培養液を重力、例えば遠心分離により固液分離し、沈殿物である微生物を発酵反応槽に返送する方法や、ろ過することにより固形分である微生物を分離し、発酵培養液上清のみを発酵反応槽外に排出する方法等が挙げられる。しかしながら、遠心分離による方法は動力費が高く現実的ではなく、ろ過による方法は、前述のようにろ過するために高い圧力要することから、実験室レベルでの検討がほとんどであった。
【００１０】
このように、従来の連続発酵法には様々な問題があり、産業的応用が難しかった。すなわち、連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を発酵培養液に還流させ、発酵培養液中の微生物や培養細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることで高い物質生産性を得ることは、依然として困難であり、技術の革新が望まれていた。
【特許文献１】特開平５−９５７７８号公報
【特許文献２】特開昭６２−１３８１８４号公報
【特許文献３】特開平１０−１７４５９４号公報
【特許文献４】特開２００５−３３３８８６号公報
【非特許文献１】Toshihiko Hirao et. al.（ヒラノ・トシヒコ ら）、 Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による化学品の製造方法を提供することにある。具体的に本発明の目的は、連続発酵法において、微生物や細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や細胞を発酵培養液に還流させ、培養液中の微生物や細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることで高い物質生産性を維持する連続発酵法による化学品の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収し、さらに、未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵において、前記の分離膜として平均細孔径が０．０１μｍ以上５μｍ以下の細孔を有する中空糸多孔性膜を用い、その膜間差圧を０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ未満の範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による化学品の製造方法である。
【００１３】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法の好ましい様態によれば、前記の中空糸多孔性膜は多孔質樹脂層を含む多孔性膜である。
【００１４】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法の好ましい様態によれば、前記の多孔質樹脂層は、有機高分子化合物からなる有機高分子膜である。
【００１５】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法の好ましい様態によれば、前記の有機高分子化合物はポリフッ化ビニリデンである。
【００１６】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法の好ましい様態によれば、前記の微生物または培養細胞の発酵培養液および発酵原料が、糖類を含むことである。
【００１７】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法の好ましい様態によれば、化学品が、有機酸であり、さらに好ましくは、有機酸が、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸あるいはコハク酸である。
【００１８】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法の好ましい様態によれば、化学品がアルコールであり、さらに好ましくはアルコールが、１，３−プロパンジオールである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明において分離膜として用いられる中空糸多孔性膜について説明する。
【００２１】
まず、中空糸多孔性膜の構成について説明する。本発明で用いられる中空糸多孔性膜は、好ましくは被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。
【００２２】
中空糸多孔性膜は、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む中空糸多孔性膜であることが好ましい。
【００２３】
多孔質樹脂層を含む中空糸多孔性膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜である中空糸多孔性膜に強度を与える。
【００２４】
本発明で用いられる中空糸多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。
【００２５】
多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
【００２６】
また、多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
【００２７】
多孔質樹脂層は、多孔質有機高分子膜を好適に使用することができる。多孔質有機高分子膜を構成する有機高分子化合物としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。多孔質有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。多孔質有機高分子膜を構成する有機高分子化合物は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００２８】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００２９】
本発明で使用される中空糸多孔性膜は、平均細孔径が、０.０１μｍ以上５μｍ未満であることが重要である。中空糸多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上５μｍ未満であると、発酵に使用される微生物や培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有する。また、中空糸多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、微生物あるいは培養細胞がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。
【００３０】
中空糸多孔性膜の平均細孔径が微生物もしくは培養細胞の大きさに近いと、これらが直接孔を塞いでしまう場合があるので、中空糸多孔性膜の平均細孔径は、１μｍ未満であることが好ましい。中空糸多孔性膜の平均細孔径は、微生物もしくは培養細胞の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物もしくは培養細胞の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。微生物もしくは培養細胞のうち、細胞の小さい細菌などを用いる場合には、平均細孔径として０.４μｍ以下が好ましく、０.２μｍ未満であれば、より好適に実施することができる。
【００３１】
また、微生物もしくは培養細胞が目的とする化学品以外の物質、例えば、タンパク質や多糖類など凝集しやすい物質を生産する場合があり、更に、発酵培養液中の微生物もしくは培養細胞の一部が死滅することにより細胞の破砕物が生成する場合があり、これら物質によって中空糸多孔性膜の閉塞することから回避するために、平均細孔径が０．１μｍ以下であることが好適である。
【００３２】
一般的に、中空糸多孔性膜の平均細孔径は、０.４μｍ以下であることが好ましく、０.２μｍ未満、あるいは、０．１μｍ以下であることがより好ましい態様である。平均細孔径が小さすぎると中空糸多孔性膜の透水性能が低下し、中空糸多孔性膜が汚れていなくても効率的な運転ができなくなるため、本発明における中空糸多孔性膜の平均細孔径は、０.０１μｍ以上である。中空糸多孔性膜の平均細孔径は、好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００３３】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。平均細孔径は、あるいは、膜表面を走査型電子顕微鏡を用いて倍率１０，０００倍で写真撮影し、１０個以上、好ましくは２０個以上の細孔を無作為に選び、それら細孔の直径を測定し、数平均して求めることもできる。細孔が円状でない場合、画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する円（等価円）を求め、等価円直径を細孔の直径とする方法により求められる。
【００３４】
本発明で用いられる中空糸多孔性膜の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。平均細孔径の標準偏差は小さければ小さい方が望ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
【００３５】
【数１】
【００３６】
本発明で用いられる中空糸多孔性膜においては、発酵培養液の透過性が重要な性能の一つである。中空糸多孔性膜の透過性の指標として、使用前の中空糸多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、０．５×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であることが好ましく、純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上２×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
【００３７】
本発明で用いられる中空糸多孔性膜において、表面粗さとは、表面に対して垂直方向の高さの平均値である。膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物もしくは培養細胞が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。中空糸多孔性膜の表面粗さは、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０．１μｍ以下であると、中空糸多孔性膜に付着した微生物もしくは培養細胞が剥がれやすい。
【００３８】
中空糸多孔性膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、微生物もしくは培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物や培養細胞の破壊が抑制され、中空糸多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が、より容易に可能になる。中空糸多孔性膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、中空糸多孔性膜が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好である。目詰まりを抑えることにより、安定した連続発酵が可能になることから、中空糸多孔性膜の表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
【００３９】
ここで、膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定することができる。
・装置 原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件
（探針） ＳｉＮカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
（走査範囲） １０μｍ、２５μｍ四方（気中測定）
５μｍ、１０μｍ四方（水中測定）
（走査解像度）５１２×５１２
（料調製） 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００４０】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）により各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
【００４１】
【数２】
【００４２】
本発明で用いられる中空糸多孔性膜の形状は中空糸膜である。多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、更に好ましくは２００μｍ以上２０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下であり、更に好ましくは１００μｍ以上１０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００４３】
次に、本発明で用いられる中空糸多孔性膜の作成法の概要を例示して説明する。
【００４４】
中空糸多孔性膜は、樹脂と溶媒からなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出すると共に、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。
【００４５】
原液は、樹脂を溶媒に溶解させて調製する。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。溶媒は、樹脂を溶解するものであり、樹脂に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成することを促すものである。溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ − メチル− ２ − ピロリドン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメチル、シクロヘキサノン、イソホロン、γ − ブチロラクトン、メチルイソアミルケトン、フタル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジアセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。中でも、樹脂の溶解性の高いＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を好ましく用いることができる。これらの溶媒は単独で用いても良いし、２種類以上を混合して用いても良い。
【００４６】
また例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびグリセリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。溶媒に非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水や、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。中でも、非溶媒として、価格の点から水やメタノールが好ましく用いられる。溶媒以外の成分および非溶媒は、混合物であってもよい。
【００４７】
原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリン等を用いることができる。
【００４８】
ここで、原液は、樹脂を２０重量％以上６０重量％以下の濃度で、溶媒に溶解させることにより調製することができる。
【００４９】
また、中空部形成用流体には、通常、気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中空糸多孔性膜の外表面に、新たな多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。積層は、中空糸多孔性膜の性質、例えば、親水性や疎水性および細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。積層される新たな多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製することができる。その樹脂の材質は、例えば、上述の多孔質有機高分子膜の材質と同様のものを好ましく用いることができる。また、新たな多孔性樹脂層の積層方法は、原液に中空糸多孔性膜を浸漬してもよいし、中空糸多孔性膜の表面に原液を塗布してもよく、積層後に付着した原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることにより積層量を調整することもできる。
【００５０】
本発明で用いられる中空糸多孔性膜は、樹脂などの部材を用いて中空糸膜の中空部を接着・封止し、支持体に設置することによって分離膜エレメントとすることができる。すなわち、本発明で用いられる中空糸多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明で用いられる中空糸多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明で用いられる中空糸多孔性膜を有する分離膜エレメントの好適な形態の一つである。透水量を大きくするために、支持板の両面に中空糸多孔性膜を配することも分離膜エレメントの好ましい態様である。
【００５１】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法は、上記中空糸多孔性膜の膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２００ｋＰａ未満の範囲にして濾過処理するものである。発酵培養液をろ過するために、２００ｋＰａより高い膜間差圧で濾過処理すると、動力費が高くなり、化学品を製造するときの経済効果が低下する。２００ｋＰａ以上の高い膜間差圧を加えることによって微生物あるいは培養細胞が破砕されることが多くなり、化学品を生産する能力が低下する。また、膜間差圧が０．１ｋＰａ未満では、透水速度が低下して、化学品の生産性能が低下する。本発明の連続発酵による化学品の製造方法は、ろ過圧力である膜間差圧が０.１ｋＰａ以上２００ｋＰａ未満であり、発酵培養液の透過水量が多く、微生物あるいは培養細胞の破砕による化学品製造能力の低下もないことから、化学品を生産する能力を高く維持することが可能である。
【００５２】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法は、発酵原料を使用する。本発明で使用される発酵原料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を良好に生産させ得るものであればよい。
【００５３】
本発明で使用される発酵原料は、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリンなどが使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。
【００５４】
本発明に使用する微生物または培養細胞が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤を必要に応じて使用することができる。本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
【００５５】
本発明において、発酵培養液中の糖類濃度は５ｇ／ｌ以下に保持されることが好ましい。発酵培養液中の糖類濃度を５ｇ／ｌ以下に保持することが好ましい理由は、発酵培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。
【００５６】
微生物もしくは培養細胞の培養は、通常、ｐＨ４−８、温度２０−４０℃の範囲で行われる。発酵培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４−８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、発酵培養液を加圧する、攪拌速度を上げる、あるいは通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００５７】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法では、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って、微生物濃度を高くした後に、連続培養（引き抜き）を開始しても良い。本発明の連続発酵による化学品の製造方法では、微生物濃度を高くした後に、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。本発明の連続発酵による化学品の製造方法では、適当な時期から原料培養液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
【００５８】
原料培養液には菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。発酵培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、発酵培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが、効率よい生産性を得る上で好ましい態様である。発酵培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、一例として、乾燥重量として、５ｇ／Ｌ以上に維持することにより良好な生産効率が得られる。
【００５９】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法では、必要に応じて発酵槽内から微生物または培養細胞を引き抜くことができる。例えば、発酵槽内の微生物または培養細胞濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、引き抜くことで、閉塞から回避することができる。また、発酵槽内の微生物または培養細胞濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として微生物または培養細胞を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
【００６０】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法では、発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、菌体を増殖させつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。本発明の連続発酵による化学品の製造方法では、連続培養操作は、通常、培養管理上単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることも可能である。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。
【００６１】
次に、本発明の反応化学品の製造方法に用いることができる微生物あるいは培養細胞について説明する。本発明で使用される微生物や培養細胞は、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌やコリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用される微生物や培養細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００６２】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で製造される化学品としては、上記の微生物や培養細胞が発酵培養液中に生産する物質である。本発明の化学品の連続発酵による製造方法で製造される化学品としては、アルコール、有機酸、アミノ酸および核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。アルコールとしては、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオールおよびグリセロールなどが挙げられる。有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸およびクエン酸などが挙げられる。核酸であれば、イノシンやグアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸やグアニル酸などのヌクレオチド、またカダベリンなどのジアミン化合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質および組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。
【００６３】
次に、本発明の化学品の製造方法に用いることができる微生物あるいは培養細胞について、具体的な化学品を例示しながら説明する。
【００６４】
本発明の化学品の連続発酵に製造方法において、Ｌ−乳酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、Ｌ−乳酸を生産することが可能な微生物である。本発明の連続発酵による化学品の製造方法において、Ｌ−乳酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞としては、好ましくは乳酸菌を用いることができる。ここで乳酸菌とは、消費したグルコースに対して対糖収率として５０％以上の乳酸を産生する原核微生物として定義することができる。好ましい乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラゲノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バゴコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｇｅｎｕｓ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アトポビウム属（Ｇｅｎｕｓ Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する乳酸菌が挙げられる。それらの中でも、乳酸の対糖収率が高い乳酸菌を選択して乳酸の生産に好ましく用いることができる。
【００６５】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法においては、更に、乳酸の中でも、Ｌ−乳酸の対糖収率の高い乳酸菌を選択して乳酸の生産に好ましく用いることができる。Ｌ−乳酸とは、乳酸の光学異性体の一種であり、その鏡像体であるＤ−乳酸と明確に区別することができる。Ｌ−乳酸の対糖収率が高い乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ラクトバシラス・アニマリス（Lactobacillus animalis）、ラクトバシラス・アジリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバシラス・アビアリエス（Lactobacillus aviaries）、ラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス・デルブレッキ（Lactobacillus delbruekii）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバシラス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシラス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ラクトバシラス・サリバリス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバシラス・シャーピイ（Lactobacillus sharpeae）、ラクトバシラス・デクストリニクス（Pediococcus dextrinicus）、およびラクトバシラス・ラクティス（Lactococcus lactis）などが挙げられ、これらを選択して、Ｌ−乳酸の生産に用いることが可能である。
【００６６】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＬ−乳酸を製造する場合、人為的に乳酸生産能力を付与、あるいは増強した微生物または培養細胞を用いることができる。例えば、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｌ−ＬＤＨと言うことがある。）を導入して、Ｌ−乳酸生産能力を付与あるいは増強した微生物または培養細胞を用いることができる。Ｌ−乳酸生産能力を付与あるいは増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物がＬ−ＬＤＨを組み込むことによりＬ−乳酸生産能力が増強した組換え微生物が挙げられる。
【００６７】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＬ−乳酸を製造する場合、組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましい宿主は酵母である。酵母のうち好ましくはサッカロマイセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母であり、更に好ましくはサッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００６８】
本発明で使用されるＬ−ＬＤＨとしては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）とＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしていれば限定されない。例えば、Ｌ−乳酸の対糖収率の高い乳酸菌由来のＬ−ＬＤＨを用いることができる。好適にはほ乳類由来Ｌ−ＬＤＨを用いることができる。このうちホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来、およびカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることができる。カエルの中でもコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。
【００６９】
本発明に用いられるヒトまたはカエル由来のＬ−ＬＤＨには、遺伝的多型性や変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいう。変異誘発は、例えば、部位特異的変異導入用キット（Mutan-K（タカラバイオ社製））を用いる方法や、ランダム変異導入用キット（BD Diversify PCR Random Mutagenesis（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いる方法などがある。
【００７０】
また、本発明で使用するヒトまたはカエル由来のＬ−ＬＤＨは、ＮＡＤＨとピルビン酸をＮＡＤ＋とＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしているならば、塩基配列の一部に欠失または挿入が存在していても構わない。
【００７１】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＬ−乳酸を製造する場合、製造された濾過・分離発酵培養液に含まれるＬ−乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。例えば、濾過・分離発酵培養液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。好ましくは、濾過・分離発酵培養液の水分を蒸発させた濃縮Ｌ−乳酸溶液を蒸留操作にかけることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。Ｌ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｌ−乳酸を得ることができる。留出液としてエタノールや酢酸等の低沸点成分を含むＬ−乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をＬ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＬ−乳酸を得ることもできる。
【００７２】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、Ｄ−乳酸生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞としてはＤ−乳酸を生産することが可能な微生物であれば制限はない。Ｄ−乳酸生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、例えば、野生型株では、Ｄ−乳酸を合成する能力を有するラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物が挙げられる。
【００７３】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、野生型株のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｄ−ＬＤＨともいうことがある。）の酵素活性を増強していることが好ましい。酵素活性を増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物がＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組み込むことにより、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増強した組換え微生物が挙げられる。
【００７４】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましい宿主は酵母である。
【００７５】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、およびバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子であることが好ましく、更に好ましくはバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子である。
【００７６】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるＤ−乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。例えば、濾過・分離発酵液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。
【００７７】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、好ましくは、濾過・分離発酵液の水分を蒸発させた濃縮Ｄ−乳酸溶液を蒸留操作にかけることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。Ｄ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｄ−乳酸を得ることができる。留出液として低沸点成分（エタノール、酢酸等）を含むＤ−乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をＤ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＤ−乳酸を得ることもできる。
【００７８】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でコハク酸を製造する場合、コハク酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞としては、コハク酸を生産することが可能な微生物であれば特に制限はない。コハク酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞としては、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属やアクチノバシラス（Actinobacillus）属に属する細菌を好適に利用することができる。具体的には、米国特許第５１４３８３３号明細書に記載のアナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）やJames B. Mckinlay （ジェームズ Ｂ.マッキンリー）らが開示しているアクチノバシラス・サクシノジェネス（Actinobacillus succinogenes）を挙げることができる（Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー）,７１,６６５１−６６５６ （２００５）。また、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属やブレビバクテリウム（Brevibacterium）属などのコリネ型細菌（Coryneform bacterium）、および大腸菌（Escherichia）なども利用可能である。コリネ型細菌では、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）などが好適である。
【００７９】
また、微生物としては、遺伝子組換えによって、コハク酸の生産能力が改善された微生物を用いることができ、これによりコハク酸の生産性を向上させることも可能である。このような微生物としては、例えば、特開２００５−２７５３３号公報に記載の乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase）を欠損したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）や、非特許文献１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、米国特許第５７７０４３５号明細書に記載のピルビン酸・ギ酸開裂酵素（pyruvate formate lyase）と乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase）の欠損株である大腸菌ＡＦＰ111株などを使用することができる。
【００８０】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でコハク酸を製造する場合、コハク酸の分離・精製は、通常のコハク酸の精製法を適用することができる。例えば、特開２００５−３３３８８６号公報に示されている水分解電気透析処理と減圧濃縮・晶析を組み合わせた精製法を好適に用いることができる。
【００８１】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で１，３−プロパンジオールを製造する場合、１，３−プロパンジオールの生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞としては、１，３−プロパンジオールを生産することが可能な微生物であれば特に制限はない。１，３−プロパンジオールの生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、例えば、野生型株ではグリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有するクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が挙げられる。
【００８２】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で１，３−プロパンジオールを製造する場合、微生物は、（ａ）グリセロールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｂ）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子；及び （ｃ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでいることが好ましい。本発明では、更に好ましくは、微生物は、組換え微生物で１，３−プロパンジオールを生産可能にすることが挙げられる。
【００８３】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で１，３−プロパンジオールを製造する場合、グリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有する微生物は、好ましくは、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクテル（Ｃｙｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテル（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）より成る群から選ばれる組換え微生物で、更に好ましくはエッシェリシア コリである。
【００８４】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で１，３−プロパンジオールを製造する場合、組換え微生物は、グルコースから効率よく１，３−プロパンジオールを生産することができるようにする改良を行った組換え微生物の方が好ましい。組換え微生物は、例えば、（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；および（ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んだ組換え微生物であることが好ましい。 更に、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子がｄｈａレギュロンから単離されるｏｒｆＸ及びｏｒｆＺによりコードされる遺伝子を含んだ組換え微生物であることが好ましい。更には、組換え微生物は、グリセロールキナーゼ活性および／またはグリセロールデヒドロゲナーゼ活性および／またはトリオースリン酸イソメラーゼ活性を欠失した組換え微生物であることが好ましい。
【００８５】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で１，３−プロパンジオールを製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれる１，３−プロパンジオールの分離・精製は、濃縮、晶析させて行うことができる。例えば、特開平−３５７８５号公報に示される減圧濃縮・晶析を用いた精製法を好適に用いることができる。
【００８６】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法に従って、連続発酵をおこなった場合、従来の回分発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における生産速度は、次の式（３）で計算される。
・発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ） ・・・・（式３）
また、回分培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【００８７】
次に、本発明の化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置について、図を用いて説明する。
【００８８】
図１は、本発明の連続発酵による化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置を例示説明するための概要側面図である。図１は、分離膜エレメントが、発酵反応槽の外部に設置された代表的な連続発酵装置の例である。
【００８９】
図１において、連続発酵装置は、発酵反応槽１と分離膜エレメント２を備えた膜分離層１２と差圧制御装置３で基本的に構成されている。ここで、分離膜エレメント２には、中空糸多孔性膜が組み込まれている。この分離膜エレメント２に関しては、後に詳述する。また、膜分離槽１２は、発酵液循環ポンプ１１を介して発酵反応槽１に接続されている。
【００９０】
図１において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１内に投入し、必要に応じて、攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵液を攪拌し、また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびよびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵培養液のｐＨを調整し、また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。さらに、装置内の発酵培養液は、発酵培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環する。発酵生産物を含む発酵培養液は、分離膜エレメント２によって微生物と発酵生産物に濾過・分離され、装置系から取り出すことができる。
【００９１】
また、濾過・分離された微生物は、装置系内にとどまることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離には膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって、特別な動力を使用することなく実施可能であるが、必要に応じて、レベルセンサ６および差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の発酵液量を適当に調節することができる。必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を膜分離槽１２内に供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。分離膜エレメント２による濾過・分離は、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。
【００９２】
また、別に用意した培養槽（図示せず）で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、必要に応じて発酵反応槽１内に供給することができる。培養槽で連続発酵により微生物または培養細胞を培養し、必要に応じて発酵反応槽１内に供給することにより、常にフレッシュで化学品の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【００９３】
次に、図２は、本発明で用いられる他の連続発酵装置を例示説明するための概要側面図である。図２は、分離膜エレメントが発酵反応槽の内部に設置された代表的な連続発酵装置の一例である。
【００９４】
図２において、連続発酵装置は、分離膜エレメント２を内部に備えた発酵反応槽１と差圧制御装置３で基本的に構成されている。発酵反応槽１内の分離膜エレメント２には中空糸多孔性膜が組み込まれている。分離膜エレメント２に関しては、追って詳述する。
【００９５】
図２の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。図２において、培地供給ポンプ７によって、培地が発酵反応槽１に連続的もしくは断続的に投入される。培地については、投入前に必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽１内の攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌する。
【００９６】
発酵生産時には、必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を発酵反応槽１内に供給することができる。発酵生産時は、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵反応槽１内の発酵液のｐＨを調整し、必要に応じて、温度調節器１０によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。ここでは、計装・制御装置による発酵液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰの制御、オンラインケミカルセンサーなどの分析装置により、発酵培養液中の化学品の濃度を測定し、発酵培養液中の化学品の濃度を指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入は、好ましくは、上記の計装装置による発酵培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節する。
【００９７】
図２において、発酵培養液は、発酵反応槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、微生物と発酵生産物が、濾過・分離され、発酵生産物が装置系から取り出される。また、濾過・分離された微生物が装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を使用することなく実施可能であるが、必要に応じて、レベルセンサ６および差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽１内の発酵培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメントによる濾過・分離には、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。
【００９８】
また、別途用意した培養槽（図示せず）で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、必要に応じて発酵反応槽１内に供給することができる。培養槽で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、必要に応じて発酵反応槽１内に供給することにより、常にフレッシュで化学品の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【００９９】
次に本発明の連続発酵による化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置で好ましく用いられる分離膜エレメントについて説明する。図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントを例示説明するための概略斜視図である。
【０１００】
図３において、分離膜エレメントは、図３に示されるように、中空糸多孔性膜で構成された分離膜束１３と上部樹脂封止層１４と下部樹脂封止層１５によって主に構成されている。この分離膜束１３と上部樹脂封止層１４と下部樹脂封止層１５によって構成されている分離膜エレメントによるろ過手段については、単独で分離膜エレメントとして用いても良いし、複数をもって分離膜エレメントとしても用いることができる。分離膜束１３は上部樹脂封止層１４および下部樹脂封止層１５よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層１５による接着・固定化は中空糸多孔性膜の中空部を封止しており、発酵培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１４は中空糸多孔性膜の内孔を封止しておらず、集水パイプ１７に透過水が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム１６を介して連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束１３によって濾過された透過水は、中空糸多孔性膜の中空部を通り、集水パイプ１７を介して発酵反応槽外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【０１０１】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置の分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。発酵装置内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避することができ、より安定した連続発酵が可能となる。分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である１２１℃の温度での１５分間処理に耐性であることが好ましい。分離膜エレメント部材は、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定できる。
【０１０２】
本明の連続発酵による化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置では、分離膜エレメントは、発酵反応槽外に設置しても良いし、発酵反応槽内に設置しても良い。発酵反応槽外に設置する場合には、別途膜分離槽を設けてその内部に分離膜エレメントを設置することができ、発酵反応槽と膜分離槽の間を発酵培養液を循環させながら、分離膜エレメントにより発酵反応液を連続的にろ過することができる。
【０１０３】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能なことが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。
【実施例】
【０１０４】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために、製造する化学品として、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、コハク酸および１，３−プロパンジオールを選定し、それぞれの化学品を生産する能力のある微生物あるいは培養細胞による、図１および図２に示す連続発酵装置を用いた連続発酵の具体的な実施形態について、実施例を挙げて説明する。
【０１０５】
実施例では、図１に示す連続発酵装置を使用した場合、発酵反応槽容積は２Ｌとし、膜分離槽容積は０．５Ｌで、連続発酵試験では本装置内の発酵培養液容量が２Ｌとなるように調整した。また、図２に示す連続発酵装置を使用した場合、発酵反応槽容積は２Ｌ、連続発酵試験では、本装置内の発酵液容量が１．５Ｌとなるように調整した。
【０１０６】
（参考例１）Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株を、下記のようにして造成した。ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、KOD-Plus-polymerase（東洋紡社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【０１０７】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen社製）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen社製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【０１０８】
上記の操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲにより、Ｌ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をＴ４ Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図４）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにして、ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）を得た。ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターである上記ｐＬ−ｌｄｈ５は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にＦＥＲＭ ＡＰ−２０４２１として寄託した（寄託日：平成１７年２月２１日）。
【０１０９】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、およびサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子及びＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を、常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【０１１０】
得られた形質転換細胞がヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のようにして行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
・カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
・移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・温度：４５℃。
【０１１１】
また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
・カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
・移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
・温度：３０℃。
【０１１２】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
・光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
（ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度を表し、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。）。
【０１１３】
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がＬ−乳酸生産能力を持つことが確認された。得られた形質転換細胞を酵母ＳＷ−１株として、続く実施例に用いた。
【０１１４】
（参考例２）中空糸多孔性膜の作製（その１）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【０１１５】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社、商品名イオネットＴ−２０Ｃ）を５重量％、水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた本発明で用いる中空糸多孔性膜を製作した。得られた中空糸多孔性膜の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である中空糸多孔性膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
【０１１６】
（参考例３）中空糸多孔性膜の作製（その２）
重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーとセルロースアセテートとＮ-メチル-２-ピロリドンとモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを、それぞれ１５重量％と１重量％と７７重量％と７重量％との割合で混合し、１１０℃の温度で溶解した。このポリマー溶液を参考例２と同様な中空糸膜の外表面に塗布し、２５℃の温度の水で凝固して、その後水洗により脱溶媒して本発明で用いる中空糸多孔性膜を得た。得られた中空糸多孔性膜の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０１μｍであった。
【０１１７】
（参考例４） 中空糸多孔性膜の作製（その３）
重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーと水とジメチルホルムアミドを、それぞれ１２重量％と３重量％と８５重量％の割合で混合し、１００℃の温度で溶解した。このポリマー溶液を参考例２と同様な中空糸膜の外表面に塗布し、４０℃の温度の水で凝固して、その後水洗により脱溶媒して本発明で用いる中空糸多孔性膜を得た。得られた中空糸多孔性膜の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０９μｍであった。
【０１１８】
（実施例１）酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その１）
参考例１で作製した酵母ＳＷ−１株を用いて、図１の連続発酵装置と表１に示す組成の酵母乳酸発酵培地によってＬ−乳酸の製造を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、参考例２で作製した中空糸多孔性膜を用いた。
【０１１９】
実施例１における運転条件は、特に断らない限り次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜分離槽通気量：０．３（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵培養液循環装置による循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１Ｐａ以上５ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：１００ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下で制御）。
【０１２０】
生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養し培養液を得た（前々培養）。得られた前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、発酵液循環ポンプ１０を稼働させることなく、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量が２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、差圧制御装置３により膜間差圧を測定し、上記の膜透過水量制御条件で変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵培養液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。
【０１２３】
３００時間の連続発酵試験を行った結果を、表２に示す。図１に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１２４】
（実施例２）酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１２５】
（実施例３）酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その３）
分離膜には、参考例４で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１２６】
（実施例４）酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その４）
図２に示す連続発酵装置と表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、Ｌ−乳酸の製造を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には参考例２で作製した中空糸多孔性膜を用いた。実施例４における運転条件は、特に断らない限り次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１Ｐａ以上５ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下で制御）。
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０ｍｉｎ間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
【０１２７】
微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、培地として表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１２８】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養し培養液を得た（前々培養）。得られた前々培養液を、図２に示した連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、差圧制御装置３により膜間差圧を測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該Ｌ−乳酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたＬ−乳酸対糖収率とＬ−乳酸生産速度を表２に示した。
【０１２９】
３００時間の発酵試験を行った結果、図２に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１３０】
（実施例５）酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その５）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例４と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１３１】
（実施例６）酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その６）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例５と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１３２】
（比較例１）回分発酵によるＬ−乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行い、そのＬ−乳酸生産性を評価した。表１に示す乳酸発酵培地を用い、２Ｌ容ミニジャーファーメンター（エイブル社製）用いた回分発酵試験を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。比較例１でも、微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬）を用いた。比較例１の運転条件を下記する。
・発酵反応槽容量（乳酸発酵培地量）：１（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整。
【０１３３】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液をミニジャーファーメンターの１Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、回分発酵培養を行った。回分発酵の結果を表２に示す。
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
図１および図２に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、Ｌ−乳酸の生産速度が大幅に向上した。
【０１３６】
（実施例７）連続発酵によるコハク酸の連続製造（その１）
図１に示す連続発酵装置を用いたコハク酸の製造を行った。コハク酸の製造におけるコハク酸およびグルコースは、特に断らない限り、次の方法で測定した。コハク酸は、発酵培養液の遠心上清について、ＨＰＬＣ（島津社製 ＬＣ１０Ａ、ＲＩモニター：ＲＩＤ-１０Ａ、カラム：アミネックスＨＰＸ-８７Ｈ）で分析した。カラム温度は５０℃、０.０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４でカラムを平衡化した後、サンプルをインジェクションし、０.０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で溶出して分析を行った。グルコースは、グルコースセンサー（ＢＦ−４、王子計測機器社製）を用いて測定した。
【０１３７】
使用する培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜には、参考例２で作製した中空糸多孔性膜を用いた。実施例７における運転条件は、特に断らない限り次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
・温度調整：３９（℃）
・発酵反応槽ＣＯ２通気量：１０（ｍＬ／ｍｉｎ）
・膜分離槽ＣＯ２通気量：１００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ６.４に調整
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵培養液循環装置による循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御。
【０１３８】
（連続発酵開始後〜７０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御
７０時間〜１４０時間：０．１Ｐａ以上５ｋＰａ以下で制御
１４０時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下で制御）。
【０１３９】
この実施例７ではコハク酸の生産能力のある微生物として、アナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）ＡＴＣＣ53488株によるコハク酸の連続製造を行った。２０ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ ポリペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０.２ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０.２ｇ/Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏからなる種培養用培地１００ｍＬを、１２５ｍＬ容三角フラスコに入れ加熱滅菌した。嫌気グローブボックス内で、３０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３ １ｍＬと１８０ｍＭ Ｈ２ＳＯ４ ０.１５ｍＬを加え、さらに、０.２５ｇ／Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ／Ｌ Ｎａ２Ｓからなる還元溶液０.５ｍＬを加えた後、ＡＴＣＣ53488株を接種し、３９℃の温度で一晩静置培養した（前々培養）。図１に示す連続発酵装置の１．５Ｌのコハク酸発酵培地（表３）に、０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ／Ｌ Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏからなる還元溶液５ｍLを加えた後、前々培養液５０ｍＬを植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって２００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１のＣＯ２通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。
【０１４０】
【表３】
【０１４１】
前培養完了後直ちに、コハク酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるコハク酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、差圧制御装置３により膜間差圧を測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、コハク酸およびグルコース濃度から算出されたコハク酸生産速度およびコハク酸の生成収率を、表４に示した。
【０１４２】
（実施例８）連続発酵によるコハク酸の連続製造（その２）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例５と同様のコハク酸連続発酵試験を行った。その結果を表４に示す。その結果、安定したコハク酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１４３】
（実施例７）連続発酵によるコハク酸の連続製造（その３）
分離膜には、参考例４で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例５と同様のコハク酸連続発酵試験を行った。その結果を表４に示す。その結果、安定したコハク酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１４４】
（比較例２）回分培養によるコハク酸の製造（その１）
アナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）の回分発酵によるコハク酸製造は、次のように行った。
【０１４５】
２０ｇ/Ｌ グルコース、１０ｇ/Ｌ ポリペプトン、５ｇ/Ｌ 酵母エキス、３ｇ/Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ/Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ/Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０.２ｇ/Ｌ ＭｇＣｌ２、０.２ｇ/Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏからなる種培養用培地１００ｍＬを、１２５ｍＬ容三角フラスコに入れ加熱滅菌した。嫌気グローブボックス内で、３０ＭｍＮａ２ＣＯ３１ｍＬと１８０ｍＭＨ２ＳＯ４ ０.１５ｍＬを加え、さらに、０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓからなる還元溶液０.５ｍＬを加えた後、アナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）ＡＴＣＣ５３４８８を接種し、３９℃で一晩静置培養した。表３に示す発酵培地１Ｌを、ミニジャーファーメンター（ＡＢＬＥ社製、ＢＭＪ型、２Ｌ）に加え、１２０℃の温度で２０分間加熱滅菌した。
【０１４６】
ＣＯ２ガスをスパージャーから、１０ｍＬ／ｍｉｎで通気し、３ＭＮａ２ＣＯ３溶液１０ｍＬを加えた後、硫酸溶液でｐＨを６.８に調整した。０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏからなる還元溶液５ｍLを加えた後、上記の種培養液５０ｍL接種し、撹拌速度２００ｒｐｍ、温度は３９℃、２ＭＮａ２ＣＯ３溶液でｐＨ６.４に調整しながら培養を行った。その結果を表４に示す。
【０１４７】
【表４】
【０１４８】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、コハク酸の生産速度が大幅に向上した。
【０１４９】
（実施例１０）連続発酵によるコハク酸の連続製造（その５）
図１に示す連続発酵装置を用いたコハク酸の製造を行った。コハク酸およびグルコース濃度の測定は、実施例７と同様の方法で行った。使用する培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜には、参考例２で作製した中空糸多孔性膜を用いた。この実施例１０おける運転条件は、下記の膜透過水量制御以外、実施例７と同様である。
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御。
【０１５０】
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１４０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１４０時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下で制御）。
【０１５１】
実施例１０では、コハク酸の生産能力のある微生物として、大腸菌Ｂ株（Escherichia coli Ｂ）ＡＴＣＣ１１３０３株を用いたコハク酸の連続製造を行った。大腸菌によるコハク酸製造では、１２ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ ポリペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.２ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる種培養用培地１５０ｍＬを２００ｍＬ容三角フラスコに入れ、ｐＨを６.８に調整した。ＭｇＣＯ３７.５ｇを添加した後、加熱滅菌し、３７℃の温度まで冷却した後、嫌気グローブボックス内で、ＡＴＣＣ１１３０３株を接種し、３７℃の温度で一晩静置培養した（前々培養）。図１に示す連続発酵装置に、１２ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ ポリペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.２ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなるコハク酸発酵培地１．５Ｌを仕込み、前々培養液１５０ｍＬを植菌した。培養温度を３７℃としたこと以外は、実施例７と同様の条件でコハク酸の連続発酵を行った。
【０１５２】
２４時間培養の前培養後、表５に示すコハク酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量が２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養を行った。結果を表６に示す。
【０１５３】
【表５】
【０１５４】
適宜、膜透過発酵培養液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。該コハク酸、及びグルコース濃度から算出されたコハク酸生産速度およびコハク酸の生成収率を、表６に示した。
【０１５５】
（実施例１１）連続発酵によるコハク酸の連続製造（その５）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１０と同様のコハク酸連続発酵試験を行った。その結果を表６に示す。その結果、安定したコハク酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１５６】
（実施例１２）連続発酵によるコハク酸の連続製造（その６）
分離膜には、参考例４で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１０と同様のコハク酸連続発酵試験を行った。その結果を表６に示す。その結果、安定したコハク酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１５７】
（比較例３）回分培養によるコハク酸の製造（その３）
大腸菌（Escherichia coli）を用いた回分発酵によるコハク酸製造は、次のようにして行った。
【０１５８】
１２ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ ポリペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.２ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる種培養用培地１００ｍＬを１２５０ｍＬ容三角フラスコに入れ、ｐＨを６.８に調整した。ＭｇＣＯ３を５ｇ添加した後、加熱滅菌し、３７℃の温度まで冷却した後、嫌気グローブボックス内で、大腸菌Ｂ株（Escherichia coli Ｂ）ＡＴＣＣ１１３０３株を接種し、３７℃の温度で一晩静置培養した。１２ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ ポリペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.２ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる発酵培地１ＬをｐＨ６.８に調整後、ミニジャーファーメンター（ＡＢＬＥ社製、ＢＭＪ型、２Ｌ）に加え、加熱滅菌（１２０℃、２０min）した。ＣＯ２ガスをスパージャーから５０ｍＬ／ｍｉｎで通気し、温度を３７℃に調整した。上記の種培養１００ｍＬを接種し、付属の撹拌羽根を用いて６００ｒｐｍで撹拌し、５.５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３でｐＨを６.８に調整しながら培養した。培養液中のグルコース濃度が、２０ｇ/Ｌを超えないように、１００ｇ／Ｌグルコース溶液２００ｍＬを少量ずつ追加しながら培養を行った。その結果を表６に示す。
【０１５９】
【表６】
【０１６０】
図１に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、コハク酸の生産速度が大幅に向上した。
【０１６１】
（実施例１３）連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その１）
図１の連続発酵装置と表７に示す組成の１，３−プロパンジオール生産培地を用い、１，３−プロパンジオールの製造を行った。まず、生産物である１，３−プロパンジオールの単離、同定、および測定法について説明する。
【０１６２】
ＨＰＬＣによりグリセロールの１，３−プロパンジオールへの転換を確認した。分析は標準的方法およびクロマトグラフィーの技術分野における熟練者に利用可能な材料を用いて行った。１つの適した方法として、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１Ｐ プレカラム（６ｍｍｘ５０ｍｍ）を接続したＷａｔｅｒｓ Ｍａｘｉｍａ ８２０ ＨＰＬＣシステムを使用して、ＵＶ（２１０ｎｍ）及びＲＩによる検出を行った。５０℃の温度に温度制御されたＳｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１カラム（８ｍｍｘ３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡから購入）上に、移動相として０．０１Ｎ Ｈ2ＳＯ4を用い、０．５ｍＬ／分の流量で試料を注入した。定量的分析を行う場合、外部標準として既知量のトリメチル酢酸を用いて試料を調製した。グルコース（ＲＩ検出）、グリセロール、１，３−プロパンジオール（ＲＩ検出）およびトリメチル酢酸（ＵＶおよびＲＩ検出）の保持時間は、それぞれおよそ１５分、２０分、２６分および３５分であった。
【０１６３】
ＧＣ／ＭＳにより、１，３−プロパンジオールの生産を確認した。ＧＣ／ＭＳは、標準的方法用いて行った。Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５９７１ Ｓｅｒｉｅｓ質量選択的検出器（ＥＩ）およびＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚さ０．２５ミクロン）に連結されたＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５８９０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩガスクロマトグラフを用いた。生成した１，３−プロパンジオールの保持時間及び質量スペクトルを１，３−プロパンジオール標準品（ｍ／ｅ：５７，５８）のそれらと比較した。
【０１６４】
試料の誘導体化は、次のように行った。１．０ｍＬの試料（例えば、培養上澄み液）に３０μＬの濃（７０％ｖ／ｖ）過塩素酸を加え、混合した後、試料を凍結乾燥した。ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド：ピリジンの１：１混合物（３００μＬ）を、凍結乾燥した試料に加え、強く混合し、６５℃の温度において１時間置いた。遠心により不溶物を除いて、上清を回収した。得られた液体は２相に分かれ、その上相を分析に用いた。得られた１,３−プロパンジオールのトリメチルシリル化誘導体試料を、ＤＢ−５カラム（４８ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚さ０．２５μｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから）上でクロマトグラフィーにかけ、１，３−プロパンジオールトリメチルシリル化誘導体の保持時間および質量スペクトルを、基準の標準試料から得た保持時間および質量スペクトルと比較した。１，３−プロパンジオールのトリメチルシリル化誘導体の質量スペクトルは、２０５、１７７、１３０および１１５ＡＭＵの特徴的イオンを含有する。
【０１６５】
培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、参考例２で作製した多孔性膜を用いた。この実施例１３における運転条件は、特に断らない限り、次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．６（Ｌ／ｍｉｎ）窒素ガス
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１４０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１４０時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下で制御）。
【０１６６】
微生物としてクレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を用い、培地として表７に示す組成の１，３−プロパンジオール生産培地を用い、生産物である１，３−プロパンジオールの濃度の評価は上述のＨＰＬＣ法により測定した。
【０１６７】
また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１６８】
【表７】
【０１６９】
まず、クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を、試験管で５ｍｌの１，３−プロパンジオール生産培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な１，３−プロパンジオール生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続発酵装置の１．５Ｌの１，３−プロパンジオール生産培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプを稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、１，３−プロパンジオール生産培地（グリセロール濃度は１００ｇ／Ｌ）の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、差圧制御装置３により膜間差圧を測定し、上記の膜透過水量制御条件で変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された１，３−プロパンジオール濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、１，３−プロパンジオールおよび投入グリセロールから算出された１，３−プロパンジオール生産速度を表８に示した。
【０１７０】
２００時間の発酵試験を行った結果、図１に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、安定した１，３−プロパンジオールの連続発酵による製造が可能であった。
【０１７１】
（実施例１４）連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その２）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１３と同様の１，３−プロパンジオール連続発酵試験を行った。その結果を表８に示す。その結果、安定した１，３−プロパンジオールの連続発酵による製造が可能であった。
【０１７２】
（実施例１５）連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その３）
分離膜には、参考例４で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１３と同様の１，３−プロパンジオール連続発酵試験を行った。その結果を表８に示す。その結果、安定した１，３−プロパンジオールの連続発酵による製造が可能であった。
【０１７３】
（比較例４）フェドバッチ発酵による１，３−プロパンジオールの製造
微生物を用いた発酵形態としてよく実施されるフェドバッチ発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、１，３−プロパンジオール生産性を評価した。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。比較例４では、微生物としてクレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を用い、生産物である１，３−プロパンジオールの濃度の評価は、実施例１３に示した方法に従ってＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。比較例４の運転条件を次に示す。
・発酵反応槽容量（１，３−プロパンジオール生産培地量）：１．０（Ｌ）
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．４（Ｌ／ｍｉｎ）窒素ガス
・発酵反応槽攪拌速度：３００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整。
【０１７４】
まず、クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を試験管で５ｍｌの１，３−プロパンジオール生産培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な１，３−プロパンジオール生産培地５０ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液をジャーファーメンターの１．５Ｌの１，３−プロパンジオール生産培地に植菌した。１，３−プロパンジオール生産培地（グリセロール濃度は５００ｇ／Ｌ）を用い、グリセロール濃度が０ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌになるように連続的に供給し、フェドバッチ発酵を行った。その結果を表８に示す。
【０１７５】
【表８】
【０１７６】
図１に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、１，３−プロパンジオールの生産速度が大幅に向上した。
【０１７７】
（実施例１６）乳酸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その１）
図１に示す連続発酵装置を用いたＬ−乳酸の製造を行った。培地には表９に示すＬ−乳酸菌乳酸発酵培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜には、参考例２で作製した中空糸多孔性膜を用いた。この実施例１６における運転条件は、特に断らない限り、次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：５０（ｍＬ−窒素／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：６００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：８Ｎ アンモニア水溶液によりｐＨ６．５に調整
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１４０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１４０時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下で制御）。
【０１７８】
原核微生物として、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＪＣＭ７６３８株を用い、培地として表９に示す組成の乳酸菌乳酸発酵培地を用いた。発酵培養液に含まれるＬ−乳酸は、参考例１と同様の方法で評価した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１７９】
【表９】
【０１８０】
まず、ラクトコッカス ラクティス ＪＣＭ７６３８株を、試験管で表９に示す５ｍｌの窒素ガスでパージした乳酸発酵培地で２４時間、３７℃の温度で静置培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地５０ｍｌに植菌し、４８時間、３７℃の温度で静置培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の窒素ガスでパージした１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって６００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３７℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。このとき、気体供給装置から窒素ガスを発酵反応槽内に供給し、排出されたガスを回収して再度発酵反応槽に供給した。すなわち、窒素ガスを含む気体のリサイクル供給を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、差圧制御装置３により膜間差圧を測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、Ｌ−乳酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたＬ−乳酸対糖収率とＬ−乳酸生産速度を、表１０に示した。
【０１８１】
２００時間の発酵試験を行った結果、連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１８２】
（実施例１７）乳酸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１６と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表１０に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１８３】
（実施例１８）乳酸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜には、参考例５で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１６と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表１０に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１８４】
（比較例５）回分発酵によるＬ−乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、そのＬ−乳酸生産性を評価した。培地には表９に示す培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。この比較例５では、原核微生物としてラクトコッカス ラクティス ＪＣＭ７６３８株を用い、生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価は、参考例１に示した方法を用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。比較例５の運転条件を次に示す。
・発酵反応槽容量：１（Ｌ）
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：５０（ｍＬ−窒素／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：２００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：８Ｎ アンモニア水溶液によりｐＨ６．５に調整。
【０１８５】
まず、ラクトコッカス ラクティス ＪＣＭ７６３８株を、試験管で表９に示す５ｍｌの窒素ガスでパージした乳酸発酵培地で２４時間、３７℃の温度で静置培養し培養液を得た（前々培養）。得られた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地５０ｍｌに植菌し、４８時間、３７℃の温度で静置培養した（前培養）。前培養液をジャーファーメンターの１Ｌの表９に示す連続・回分発酵培地に植菌し、回分発酵を行った。回分発酵の結果を、表１０に示す。
【０１８６】
【表１０】
【０１８７】
図１に示す発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、Ｌ−乳酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。
【０１８８】
（参考例５）バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡの調製
バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３を、ＧＹＰ培地（特開２００３−０８８３９２号公報に記載のＧＹＰ培地）１００ｍｌに接種し、温度３０℃の温度で２４時間培養して培養物を得た。得られた培養物を３０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離処理し湿潤菌体０．５ｇを得た後、その湿潤菌体から、斎藤、三浦の方法（Biochem．Biophys．Acta.，72，619（1963））により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この染色体ＤＮＡ６０μｇおよび制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ、３ユニットを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4および１ｍＭ ジチオスレイトール含有（ｐＨ ７．４））に各々混合し、温度３７℃で３０分間反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＳａｕ３ＡＩで消化されたバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡ断片５０μｇを得た。
【０１８９】
（参考例６）プラスミドベクターＤＮＡを利用したバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の遺伝子ライブラリーの作製
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で自律複製可能なプラスミドベクターＤＮＡ（ｐＵＣ１９）２０μｇおよび制限酵素ＢａｍＨＩ２００ユニットを、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌおよび１０ｍＭ硫酸マグネシウム含有（ｐＨ７．４））に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、得られた消化液を常法によりフェノール抽出し、更にエタノール沈澱処理を行った。
【０１９０】
その後、プラスミドベクター由来のＤＮＡフラグメントが再結合することを防止するため、バクテリアルアルカリホスファターゼ処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理を行った。
【０１９１】
このＢａｍＨＩで消化されたｐＵＣ１９を１μｇ、参考例４で得られたＳａｕ３ＡＩで消化されたバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡ断片１μｇ、および２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトールおよび１０ｍＭＡＴＰを含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で１６時間反応させ、ＤＮＡを連結させた。次いで、得られたＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換し、これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地上にまき、約２０，０００個のコロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。約２０，０００個のコロニーより、組換えＤＮＡの回収を行なった。回収の方法は、上記に示した斎藤、三浦の方法に従った。
【０１９２】
（参考例７）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング用宿主の作製
バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３株のＤ−ＬＤＨ遺伝子のスクリーニングを、機能相補によって行った。その原理の詳細は、「（Dominique, G., Appl. Environ. Microbiol., United States, (1995), 61, 266-272.）」に記載されている。すなわち、エッシェリシア・コリのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性およびピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素活性を欠失した株の嫌気条件下での生育を回復させる遺伝子をスクリーニングする手法である。キリルらの方法（Kirill, A., Proc. Natl. Acad. Sci., United States, (2000), 97, 6640-6645.）によって、エッシェリシア・コリのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）およびピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子（ｐｆｌＢおよびｐｆｌＤ）を破壊欠失した株を作製した。このようにして作製した株を、エシェリヒア・コリ ＴＭ３３株（Ｅ．ｃｏｌｉ ΔｌｄｈＡ ΔｐｆｌＢ：：Ｋｍｒ ΔｐｆｌＤ：：Ｃｍｒ）と命名し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング用宿主とした。
【０１９３】
（参考例８）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング
エシェリヒア・コリ ＴＭ３３株を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン硫酸塩および１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、温度３７℃で２４時間培養し、培養物を得た。このようにして得られた培養物を、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離処理し、湿潤菌体０．８ｇを得た。得られた湿潤菌体を１０％グリセロール溶液１０ｍｌで３度洗浄した後、１０％グリセロール溶液０．１ｍｌにけん濁しコンピテントセルとした。このコンピテントセルに、参考例６で得られたバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３株の遺伝子ライブラリーを１μｌ加え、電気穿孔法の常法に従い導入した株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＭ９ＧＰ寒天培地（Ｍ９培地＋０．４％グルコース＋０．２％ペプトン）上にまき、嫌気条件下で生育可能であった株を数株得た。
【０１９４】
（参考例９）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡの塩基配列の解析
上記で得られた組換えＤＮＡを含有するエシェリヒア・コリ ＴＭ３３／ｐＢＬ２から、常法に従いプラスミドを調製し、得られた組換えＤＮＡを用い塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用いＳａｎｇｅｒの方法に従って行った。得られたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列は、２，９９５塩基対あった。この配列についてGenetyx（ソフトウェア開発株式会社製）を用いてオープン・リーディング・フレーム検索を行い、１，０１１塩基対のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１０）を仮決定した。
【０１９５】
（参考例１０）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターの作製
バシラス・ラエボラクティカスから、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子をクローニングした。Ｄ−ＬＤＨ遺伝子は、全てＰＣＲ法によりクローニングを行い、同様の方法で発現ベクターに導入している。クローニング方法を以下に示す。
【０１９６】
バシラス・ラエボラクティカスを培養し遠心回収後、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO社製）を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。詳細な操作方法は、付属のプロトコールに従った。得られたゲノムＤＮＡを続くＰＣＲの鋳型とした。上記で得られたＤＮＡを鋳型として、それぞれＰＣＲによりＤ−ＬＤＨ遺伝子のクローニングを行った。ＰＣＲ増幅反応には、Ｔａｑの５０倍の正確性を持つとされるＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いた。反応バッファーおよびｄＮＴＰｍｉｘなどは、付属のものを使用した。Ｄ−ＬＤＨ遺伝子増幅用プライマー（配列番号１１、１２）は、５末端側にはＸｈｏＩ認識配列、３末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【０１９７】
各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（TAKARA社製）を用いて行った。エシェリヒア・コリ ＤＨ５αに形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子がサブクローニングされたプラスミドが得られた。この各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで切断し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図４）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に導入した。このようにして作製したＤ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクターをｐＴＭ６３と示す。
【０１９８】
（参考例１１）Ｄ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクターの酵母への導入
参考例１０で得られたｐＴＭ６３を酵母サッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換した。形質転換は、YEASTMAKER Yeast Transformation System（CLONTECH社製）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするサッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＭ６３の持つＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＭ６３の導入された形質転換体の選択が可能である。
【０１９９】
このようにして得られた形質転換体へのＤ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクター導入の確認は、ウラシル非添加の液体培地で培養した形質転換株から、ゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（TAKARA社製）によりプラスミドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰｒｅＭｉｘ Ｔａｑ（TAKARA社製）を用いたＰＣＲにより行った。プライマーには、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子をクローニングした際に用いたプライマーを使用した。その結果、全ての形質転換体において、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が導入されていることが確認された。
ｐＴＭ６３が導入されたサッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株を以下、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株と示す。
【０２００】
（実施例１９）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その１）
図１に示す連続発酵装置と表１１に示す組成のＤ−乳酸生産培地を用い、Ｄ−乳酸の製造を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、参考例２で作製した多孔性膜を用いた。実施例１９における運転条件は、特に断らない限り、次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２．０（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）空気
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５０ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上１００ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上１５０ｋＰａ以下で制御）。
【０２０１】
微生物として、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を用い、生産物であるＤ−乳酸の濃度の評価は参考例１と同様のＨＰＬＣ法により測定した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０２０２】
【表１１】
【０２０３】
まず、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を、試験管で５ｍｌのＤ−乳酸生産培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なＤ−乳酸生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の２．０ＬのＤ−乳酸生産培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。
【０２０４】
前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、Ｄ−乳酸生産培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量が２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、差圧制御装置３により膜間差圧を測定し、上記の膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。２４０時間の連続発酵試験を行った結果を表１２に示す。
【０２０５】
連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２０６】
（実施例２０）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その２）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１９と同様のＤ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表１２に示す。その結果、安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２０７】
（実施例２１）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その３）
分離膜には、参考例４で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１９と同様のＤ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表１２に示す。その結果、安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２０８】
（比較例６）回分発酵によるＤ−乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、そのＤ−乳酸生産性を評価した。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。比較例６では、微生物としてＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を用い、生産物であるＤ−乳酸の濃度の評価はＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。本比較例の運転条件は、下記のとおりである。
・発酵反応槽容量（Ｄ−乳酸生産培地量）：１．０（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）空気
・発酵反応槽攪拌速度：３００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整。
【０２０９】
まず、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を試験管で５ｍｌのＤ−乳酸生産培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮なＤ−乳酸生産培地５０ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前培養）。前培養液をジャーファーメンターの１．５ＬのＤ−乳酸生産培地に植菌した。Ｄ−乳酸生産培地を用い、回分発酵を行った。その結果を表１２に示す。
【０２１０】
【表１２】
【０２１１】
図１に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、Ｄ−乳酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。
【産業上の利用可能性】
【０２１２】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法は、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵が可能であり、広く発酵工業において、発酵生産物である化学品を低コストで安定に生産することが可能となり有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】図１は、本発明で用いられる連続発酵装置を例示説明するための概略側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる他の連続発酵装置を例示説明するための概略側面図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントを例示説明するための概略斜視図である。
【図４】図４は、酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【符号の説明】
【０２１４】
１ 発酵反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 差圧制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 発酵培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 分離膜束
１４ 上部樹脂封止層
１５ 下部樹脂封止層
１６ 支持フレーム
１７ 集水パイプ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養を行いながら、微生物または培養細胞の発酵培養液から、目詰まりが生じにくい多孔性分離膜を通して生産物を含む液を効率よく濾過・回収することおよび未濾過液を発酵培養液に戻すことにより、発酵に関与する微生物濃度を向上させて高い生産性を得ることができる連続発酵による化学品の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）回分発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と（２）連続発酵法に分類することができる。
【０００３】
上記（１）の回分発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、時間経過と共に発酵培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持することが困難である。
【０００４】
また、上記（２）の連続発酵法は、発酵反応槽内で目的物質が高濃度に蓄積することを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。この連続発酵法については、Ｌ−グルタミン酸やＬ−リジンの発酵について連続培養法が開示されている（非特許文献１参照。）。しかしながら、この例では、発酵培養液に原料の連続的な供給を行うと共に、微生物や培養細胞を含んだ発酵培養液を抜き出すために、発酵培養液中の微生物や培養細胞が希釈されることから、生産効率の向上は限定されたものであった。
【０００５】
連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を発酵培養液に保持または還流させることにより、発酵培養液中の微生物や培養細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。
【０００６】
例えば、セラミックス膜を用いた連続発酵装置において、連続発酵する技術が提案されている（特許文献１、特許文献２および特許文献３参照。）。しかしながら、提案された技術は、セラミックス膜の目詰りによる濾過流量や濾過効率の低下に問題があり、目詰まり防止のために、逆洗浄等を行っている。
【０００７】
また別に、分離膜を用いたコハク酸の製造方法が提案されている（特許文献４参照。）。この提案では、膜分離において、高い濾過圧（約２００ｋＰａ）が採用されている。高い濾過圧は、コスト的にも不利であるばかりでなく、濾過処理において微生物や培養細胞が圧力によって物理的なダメージを受けることから、微生物や培養細胞を連続的に発酵培養液に戻す連続発酵法においては適切ではない。
【０００８】
このように従来の連続培養は、発酵反応槽に新鮮培地を一定速度で供給し、これと同量の発酵培養液を発酵反応槽外に排出することによって、発酵反応槽内の液量を常に一定に保つ連続培養法である。回分培養では初発基質濃度が消費されると培養が終了するが、連続培養では理論的には無限に培養を持続させることができる。すなわち、理論的には無限に発酵させることができる。
【０００９】
一方、上述従来の連続培養では発酵培養液と共に微生物も発酵反応槽外に排出され、発酵反応槽内の微生物濃度を高く維持することは難しい。そこで、発酵生産を行う場合には発酵を行う微生物を高濃度に保つことができれば、発酵容積当たりの発酵生産効率を向上させることができる。そのためには、微生物を発酵反応槽内に保持あるいは還流させる必要がある。微生物を発酵反応槽内に保持あるいは還流させる方法としては、排出された発酵培養液を重力、例えば遠心分離により固液分離し、沈殿物である微生物を発酵反応槽に返送する方法や、ろ過することにより固形分である微生物を分離し、発酵培養液上清のみを発酵反応槽外に排出する方法等が挙げられる。しかしながら、遠心分離による方法は動力費が高く現実的ではなく、ろ過による方法は、前述のようにろ過するために高い圧力要することから、実験室レベルでの検討がほとんどであった。
【００１０】
このように、従来の連続発酵法には様々な問題があり、産業的応用が難しかった。すなわち、連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を発酵培養液に還流させ、発酵培養液中の微生物や培養細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることで高い物質生産性を得ることは、依然として困難であり、技術の革新が望まれていた。
【特許文献１】特開平５−９５７７８号公報
【特許文献２】特開昭６２−１３８１８４号公報
【特許文献３】特開平１０−１７４５９４号公報
【特許文献４】特開２００５−３３３８８６号公報
【非特許文献１】Toshihiko Hirao et. al.（ヒラノ・トシヒコ ら）、 Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による化学品の製造方法を提供することにある。具体的に本発明の目的は、連続発酵法において、微生物や細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や細胞を発酵培養液に還流させ、培養液中の微生物や細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることで高い物質生産性を維持する連続発酵法による化学品の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収し、さらに、未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵において、前記の分離膜として平均細孔径が０．０１μｍ以上５μｍ以下の細孔を有する中空糸多孔性膜を用い、その膜間差圧を０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ未満の範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による化学品の製造方法である。
【００１３】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法の好ましい様態によれば、前記の中空糸多孔性膜は多孔質樹脂層を含む多孔性膜である。
【００１４】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法の好ましい様態によれば、前記の多孔質樹脂層は、有機高分子化合物からなる有機高分子膜である。
【００１５】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法の好ましい様態によれば、前記の有機高分子化合物はポリフッ化ビニリデンである。
【００１６】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法の好ましい様態によれば、前記の微生物または培養細胞の発酵培養液および発酵原料が、糖類を含むことである。
【００１７】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法の好ましい様態によれば、化学品が、有機酸であり、さらに好ましくは、有機酸が、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸あるいはコハク酸である。
【００１８】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法の好ましい様態によれば、化学品がアルコールであり、さらに好ましくはアルコールが、１，３−プロパンジオールである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明において分離膜として用いられる中空糸多孔性膜について説明する。
【００２１】
まず、中空糸多孔性膜の構成について説明する。本発明で用いられる中空糸多孔性膜は、好ましくは被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。
【００２２】
中空糸多孔性膜は、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む中空糸多孔性膜であることが好ましい。
【００２３】
多孔質樹脂層を含む中空糸多孔性膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜である中空糸多孔性膜に強度を与える。
【００２４】
本発明で用いられる中空糸多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。
【００２５】
多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
【００２６】
また、多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
【００２７】
多孔質樹脂層は、多孔質有機高分子膜を好適に使用することができる。多孔質有機高分子膜を構成する有機高分子化合物としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。多孔質有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。多孔質有機高分子膜を構成する有機高分子化合物は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００２８】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００２９】
本発明で使用される中空糸多孔性膜は、平均細孔径が、０.０１μｍ以上５μｍ未満であることが重要である。中空糸多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上５μｍ未満であると、発酵に使用される微生物や培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有する。また、中空糸多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、微生物あるいは培養細胞がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。
【００３０】
中空糸多孔性膜の平均細孔径が微生物もしくは培養細胞の大きさに近いと、これらが直接孔を塞いでしまう場合があるので、中空糸多孔性膜の平均細孔径は、１μｍ未満であることが好ましい。中空糸多孔性膜の平均細孔径は、微生物もしくは培養細胞の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物もしくは培養細胞の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。微生物もしくは培養細胞のうち、細胞の小さい細菌などを用いる場合には、平均細孔径として０.４μｍ以下が好ましく、０.２μｍ未満であれば、より好適に実施することができる。
【００３１】
また、微生物もしくは培養細胞が目的とする化学品以外の物質、例えば、タンパク質や多糖類など凝集しやすい物質を生産する場合があり、更に、発酵培養液中の微生物もしくは培養細胞の一部が死滅することにより細胞の破砕物が生成する場合があり、これら物質によって中空糸多孔性膜の閉塞することから回避するために、平均細孔径が０．１μｍ以下であることが好適である。
【００３２】
一般的に、中空糸多孔性膜の平均細孔径は、０.４μｍ以下であることが好ましく、０.２μｍ未満、あるいは、０．１μｍ以下であることがより好ましい態様である。平均細孔径が小さすぎると中空糸多孔性膜の透水性能が低下し、中空糸多孔性膜が汚れていなくても効率的な運転ができなくなるため、本発明における中空糸多孔性膜の平均細孔径は、０.０１μｍ以上である。中空糸多孔性膜の平均細孔径は、好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００３３】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。平均細孔径は、あるいは、膜表面を走査型電子顕微鏡を用いて倍率１０，０００倍で写真撮影し、１０個以上、好ましくは２０個以上の細孔を無作為に選び、それら細孔の直径を測定し、数平均して求めることもできる。細孔が円状でない場合、画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する円（等価円）を求め、等価円直径を細孔の直径とする方法により求められる。
【００３４】
本発明で用いられる中空糸多孔性膜の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。平均細孔径の標準偏差は小さければ小さい方が望ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
【００３５】
【数１】
【００３６】
本発明で用いられる中空糸多孔性膜においては、発酵培養液の透過性が重要な性能の一つである。中空糸多孔性膜の透過性の指標として、使用前の中空糸多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、０．５×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であることが好ましく、純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上２×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
【００３７】
本発明で用いられる中空糸多孔性膜において、表面粗さとは、表面に対して垂直方向の高さの平均値である。膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物もしくは培養細胞が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。中空糸多孔性膜の表面粗さは、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０．１μｍ以下であると、中空糸多孔性膜に付着した微生物もしくは培養細胞が剥がれやすい。
【００３８】
中空糸多孔性膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、微生物もしくは培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物や培養細胞の破壊が抑制され、中空糸多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が、より容易に可能になる。中空糸多孔性膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、中空糸多孔性膜が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好である。目詰まりを抑えることにより、安定した連続発酵が可能になることから、中空糸多孔性膜の表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
【００３９】
ここで、膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定することができる。
・装置 原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件
（探針） ＳｉＮカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
（走査範囲） １０μｍ、２５μｍ四方（気中測定）
５μｍ、１０μｍ四方（水中測定）
（走査解像度）５１２×５１２
（料調製） 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００４０】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）により各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
【００４１】
【数２】
【００４２】
本発明で用いられる中空糸多孔性膜の形状は中空糸膜である。多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、更に好ましくは２００μｍ以上２０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下であり、更に好ましくは１００μｍ以上１０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００４３】
次に、本発明で用いられる中空糸多孔性膜の作成法の概要を例示して説明する。
【００４４】
中空糸多孔性膜は、樹脂と溶媒からなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出すると共に、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。
【００４５】
原液は、樹脂を溶媒に溶解させて調製する。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。溶媒は、樹脂を溶解するものであり、樹脂に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成することを促すものである。溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ − メチル− ２ − ピロリドン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメチル、シクロヘキサノン、イソホロン、γ − ブチロラクトン、メチルイソアミルケトン、フタル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジアセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。中でも、樹脂の溶解性の高いＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を好ましく用いることができる。これらの溶媒は単独で用いても良いし、２種類以上を混合して用いても良い。
【００４６】
また例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびグリセリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。溶媒に非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水や、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。中でも、非溶媒として、価格の点から水やメタノールが好ましく用いられる。溶媒以外の成分および非溶媒は、混合物であってもよい。
【００４７】
原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリン等を用いることができる。
【００４８】
ここで、原液は、樹脂を２０重量％以上６０重量％以下の濃度で、溶媒に溶解させることにより調製することができる。
【００４９】
また、中空部形成用流体には、通常、気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中空糸多孔性膜の外表面に、新たな多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。積層は、中空糸多孔性膜の性質、例えば、親水性や疎水性および細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。積層される新たな多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製することができる。その樹脂の材質は、例えば、上述の多孔質有機高分子膜の材質と同様のものを好ましく用いることができる。また、新たな多孔性樹脂層の積層方法は、原液に中空糸多孔性膜を浸漬してもよいし、中空糸多孔性膜の表面に原液を塗布してもよく、積層後に付着した原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることにより積層量を調整することもできる。
【００５０】
本発明で用いられる中空糸多孔性膜は、樹脂などの部材を用いて中空糸膜の中空部を接着・封止し、支持体に設置することによって分離膜エレメントとすることができる。すなわち、本発明で用いられる中空糸多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明で用いられる中空糸多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明で用いられる中空糸多孔性膜を有する分離膜エレメントの好適な形態の一つである。透水量を大きくするために、支持板の両面に中空糸多孔性膜を配することも分離膜エレメントの好ましい態様である。
【００５１】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法は、上記中空糸多孔性膜の膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２００ｋＰａ未満の範囲にして濾過処理するものである。発酵培養液をろ過するために、２００ｋＰａより高い膜間差圧で濾過処理すると、動力費が高くなり、化学品を製造するときの経済効果が低下する。２００ｋＰａ以上の高い膜間差圧を加えることによって微生物あるいは培養細胞が破砕されることが多くなり、化学品を生産する能力が低下する。また、膜間差圧が０．１ｋＰａ未満では、透水速度が低下して、化学品の生産性能が低下する。本発明の連続発酵による化学品の製造方法は、ろ過圧力である膜間差圧が０.１ｋＰａ以上２００ｋＰａ未満であり、発酵培養液の透過水量が多く、微生物あるいは培養細胞の破砕による化学品製造能力の低下もないことから、化学品を生産する能力を高く維持することが可能である。
【００５２】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法は、発酵原料を使用する。本発明で使用される発酵原料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を良好に生産させ得るものであればよい。
【００５３】
本発明で使用される発酵原料は、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリンなどが使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。
【００５４】
本発明に使用する微生物または培養細胞が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤を必要に応じて使用することができる。本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
【００５５】
本発明において、発酵培養液中の糖類濃度は５ｇ／ｌ以下に保持されることが好ましい。発酵培養液中の糖類濃度を５ｇ／ｌ以下に保持することが好ましい理由は、発酵培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。
【００５６】
微生物もしくは培養細胞の培養は、通常、ｐＨ４−８、温度２０−４０℃の範囲で行われる。発酵培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４−８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、発酵培養液を加圧する、攪拌速度を上げる、あるいは通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００５７】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法では、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って、微生物濃度を高くした後に、連続培養（引き抜き）を開始しても良い。本発明の連続発酵による化学品の製造方法では、微生物濃度を高くした後に、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。本発明の連続発酵による化学品の製造方法では、適当な時期から原料培養液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
【００５８】
原料培養液には菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。発酵培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、発酵培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが、効率よい生産性を得る上で好ましい態様である。発酵培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、一例として、乾燥重量として、５ｇ／Ｌ以上に維持することにより良好な生産効率が得られる。
【００５９】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法では、必要に応じて発酵槽内から微生物または培養細胞を引き抜くことができる。例えば、発酵槽内の微生物または培養細胞濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、引き抜くことで、閉塞から回避することができる。また、発酵槽内の微生物または培養細胞濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として微生物または培養細胞を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
【００６０】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法では、発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、菌体を増殖させつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。本発明の連続発酵による化学品の製造方法では、連続培養操作は、通常、培養管理上単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることも可能である。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。
【００６１】
次に、本発明の反応化学品の製造方法に用いることができる微生物あるいは培養細胞について説明する。本発明で使用される微生物や培養細胞は、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌やコリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用される微生物や培養細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００６２】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で製造される化学品としては、上記の微生物や培養細胞が発酵培養液中に生産する物質である。本発明の化学品の連続発酵による製造方法で製造される化学品としては、アルコール、有機酸、アミノ酸および核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。アルコールとしては、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオールおよびグリセロールなどが挙げられる。有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸およびクエン酸などが挙げられる。核酸であれば、イノシンやグアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸やグアニル酸などのヌクレオチド、またカダベリンなどのジアミン化合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質および組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。
【００６３】
次に、本発明の化学品の製造方法に用いることができる微生物あるいは培養細胞について、具体的な化学品を例示しながら説明する。
【００６４】
本発明の化学品の連続発酵に製造方法において、Ｌ−乳酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、Ｌ−乳酸を生産することが可能な微生物である。本発明の連続発酵による化学品の製造方法において、Ｌ−乳酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞としては、好ましくは乳酸菌を用いることができる。ここで乳酸菌とは、消費したグルコースに対して対糖収率として５０％以上の乳酸を産生する原核微生物として定義することができる。好ましい乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラゲノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バゴコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｇｅｎｕｓ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アトポビウム属（Ｇｅｎｕｓ Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する乳酸菌が挙げられる。それらの中でも、乳酸の対糖収率が高い乳酸菌を選択して乳酸の生産に好ましく用いることができる。
【００６５】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法においては、更に、乳酸の中でも、Ｌ−乳酸の対糖収率の高い乳酸菌を選択して乳酸の生産に好ましく用いることができる。Ｌ−乳酸とは、乳酸の光学異性体の一種であり、その鏡像体であるＤ−乳酸と明確に区別することができる。Ｌ−乳酸の対糖収率が高い乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus yamanashiensis）、ラクトバシラス・アニマリス（Lactobacillus animalis）、ラクトバシラス・アジリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバシラス・アビアリエス（Lactobacillus aviaries）、ラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス・デルブレッキ（Lactobacillus delbruekii）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバシラス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシラス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）、ラクトバシラス・サリバリス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバシラス・シャーピイ（Lactobacillus sharpeae）、ラクトバシラス・デクストリニクス（Pediococcus dextrinicus）、およびラクトバシラス・ラクティス（Lactococcus lactis）などが挙げられ、これらを選択して、Ｌ−乳酸の生産に用いることが可能である。
【００６６】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＬ−乳酸を製造する場合、人為的に乳酸生産能力を付与、あるいは増強した微生物または培養細胞を用いることができる。例えば、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｌ−ＬＤＨと言うことがある。）を導入して、Ｌ−乳酸生産能力を付与あるいは増強した微生物または培養細胞を用いることができる。Ｌ−乳酸生産能力を付与あるいは増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物がＬ−ＬＤＨを組み込むことによりＬ−乳酸生産能力が増強した組換え微生物が挙げられる。
【００６７】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＬ−乳酸を製造する場合、組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましい宿主は酵母である。酵母のうち好ましくはサッカロマイセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母であり、更に好ましくはサッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００６８】
本発明で使用されるＬ−ＬＤＨとしては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）とＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしていれば限定されない。例えば、Ｌ−乳酸の対糖収率の高い乳酸菌由来のＬ−ＬＤＨを用いることができる。好適にはほ乳類由来Ｌ−ＬＤＨを用いることができる。このうちホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来、およびカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることができる。カエルの中でもコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。
【００６９】
本発明に用いられるヒトまたはカエル由来のＬ−ＬＤＨには、遺伝的多型性や変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいう。変異誘発は、例えば、部位特異的変異導入用キット（Mutan-K（タカラバイオ社製））を用いる方法や、ランダム変異導入用キット（BD Diversify PCR Random Mutagenesis（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いる方法などがある。
【００７０】
また、本発明で使用するヒトまたはカエル由来のＬ−ＬＤＨは、ＮＡＤＨとピルビン酸をＮＡＤ＋とＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしているならば、塩基配列の一部に欠失または挿入が存在していても構わない。
【００７１】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＬ−乳酸を製造する場合、製造された濾過・分離発酵培養液に含まれるＬ−乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。例えば、濾過・分離発酵培養液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。好ましくは、濾過・分離発酵培養液の水分を蒸発させた濃縮Ｌ−乳酸溶液を蒸留操作にかけることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。Ｌ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｌ−乳酸を得ることができる。留出液としてエタノールや酢酸等の低沸点成分を含むＬ−乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をＬ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＬ−乳酸を得ることもできる。
【００７２】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、Ｄ−乳酸生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞としてはＤ−乳酸を生産することが可能な微生物であれば制限はない。Ｄ−乳酸生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞は、例えば、野生型株では、Ｄ−乳酸を合成する能力を有するラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物が挙げられる。
【００７３】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、野生型株のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｄ−ＬＤＨともいうことがある。）の酵素活性を増強していることが好ましい。酵素活性を増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物がＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組み込むことにより、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増強した組換え微生物が挙げられる。
【００７４】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましい宿主は酵母である。
【００７５】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、およびバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子であることが好ましく、更に好ましくはバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子である。
【００７６】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれるＤ−乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。例えば、濾過・分離発酵液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。
【００７７】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でＤ−乳酸を製造する場合、好ましくは、濾過・分離発酵液の水分を蒸発させた濃縮Ｄ−乳酸溶液を蒸留操作にかけることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。Ｄ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｄ−乳酸を得ることができる。留出液として低沸点成分（エタノール、酢酸等）を含むＤ−乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をＤ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＤ−乳酸を得ることもできる。
【００７８】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でコハク酸を製造する場合、コハク酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞としては、コハク酸を生産することが可能な微生物であれば特に制限はない。コハク酸の生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞としては、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属やアクチノバシラス（Actinobacillus）属に属する細菌を好適に利用することができる。具体的には、米国特許第５１４３８３３号明細書に記載のアナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）やJames B. Mckinlay （ジェームズ Ｂ.マッキンリー）らが開示しているアクチノバシラス・サクシノジェネス（Actinobacillus succinogenes）を挙げることができる（Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー）,７１,６６５１−６６５６ （２００５）。また、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属やブレビバクテリウム（Brevibacterium）属などのコリネ型細菌（Coryneform bacterium）、および大腸菌（Escherichia）なども利用可能である。コリネ型細菌では、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）などが好適である。
【００７９】
また、微生物としては、遺伝子組換えによって、コハク酸の生産能力が改善された微生物を用いることができ、これによりコハク酸の生産性を向上させることも可能である。このような微生物としては、例えば、特開２００５−２７５３３号公報に記載の乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase）を欠損したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）や、非特許文献１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、米国特許第５７７０４３５号明細書に記載のピルビン酸・ギ酸開裂酵素（pyruvate formate lyase）と乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase）の欠損株である大腸菌ＡＦＰ111株などを使用することができる。
【００８０】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法でコハク酸を製造する場合、コハク酸の分離・精製は、通常のコハク酸の精製法を適用することができる。例えば、特開２００５−３３３８８６号公報に示されている水分解電気透析処理と減圧濃縮・晶析を組み合わせた精製法を好適に用いることができる。
【００８１】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で１，３−プロパンジオールを製造する場合、１，３−プロパンジオールの生産に用いることができる微生物あるいは培養細胞としては、１，３−プロパンジオールを生産することが可能な微生物であれば特に制限はない。１，３−プロパンジオールの生産に用いることが出来る微生物あるいは培養細胞としては、例えば、野生型株ではグリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有するクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が挙げられる。
【００８２】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で１，３−プロパンジオールを製造する場合、微生物は、（ａ）グリセロールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｂ）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子；及び （ｃ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでいることが好ましい。本発明では、更に好ましくは、微生物は、組換え微生物で１，３−プロパンジオールを生産可能にすることが挙げられる。
【００８３】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で１，３−プロパンジオールを製造する場合、グリセロールから１，３−プロパンジオールを合成する能力を有する微生物は、好ましくは、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクテル（Ｃｙｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテル（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）より成る群から選ばれる組換え微生物で、更に好ましくはエッシェリシア コリである。
【００８４】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で１，３−プロパンジオールを製造する場合、組換え微生物は、グルコースから効率よく１，３−プロパンジオールを生産することができるようにする改良を行った組換え微生物の方が好ましい。組換え微生物は、例えば、（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；および（ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んだ組換え微生物であることが好ましい。 更に、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子がｄｈａレギュロンから単離されるｏｒｆＸ及びｏｒｆＺによりコードされる遺伝子を含んだ組換え微生物であることが好ましい。更には、組換え微生物は、グリセロールキナーゼ活性および／またはグリセロールデヒドロゲナーゼ活性および／またはトリオースリン酸イソメラーゼ活性を欠失した組換え微生物であることが好ましい。
【００８５】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で１，３−プロパンジオールを製造する場合、濾過・分離発酵液に含まれる１，３−プロパンジオールの分離・精製は、濃縮、晶析させて行うことができる。例えば、特開平−３５７８５号公報に示される減圧濃縮・晶析を用いた精製法を好適に用いることができる。
【００８６】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法に従って、連続発酵をおこなった場合、従来の回分発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における生産速度は、次の式（３）で計算される。
・発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ） ・・・・（式３）
また、回分培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【００８７】
次に、本発明の化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置について、図を用いて説明する。
【００８８】
図１は、本発明の連続発酵による化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置を例示説明するための概要側面図である。図１は、分離膜エレメントが、発酵反応槽の外部に設置された代表的な連続発酵装置の例である。
【００８９】
図１において、連続発酵装置は、発酵反応槽１と分離膜エレメント２を備えた膜分離層１２と差圧制御装置３で基本的に構成されている。ここで、分離膜エレメント２には、中空糸多孔性膜が組み込まれている。この分離膜エレメント２に関しては、後に詳述する。また、膜分離槽１２は、発酵液循環ポンプ１１を介して発酵反応槽１に接続されている。
【００９０】
図１において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１内に投入し、必要に応じて、攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵液を攪拌し、また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびよびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵培養液のｐＨを調整し、また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。さらに、装置内の発酵培養液は、発酵培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環する。発酵生産物を含む発酵培養液は、分離膜エレメント２によって微生物と発酵生産物に濾過・分離され、装置系から取り出すことができる。
【００９１】
また、濾過・分離された微生物は、装置系内にとどまることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離には膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって、特別な動力を使用することなく実施可能であるが、必要に応じて、レベルセンサ６および差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の発酵液量を適当に調節することができる。必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を膜分離槽１２内に供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。分離膜エレメント２による濾過・分離は、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。
【００９２】
また、別に用意した培養槽（図示せず）で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、必要に応じて発酵反応槽１内に供給することができる。培養槽で連続発酵により微生物または培養細胞を培養し、必要に応じて発酵反応槽１内に供給することにより、常にフレッシュで化学品の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【００９３】
次に、図２は、本発明で用いられる他の連続発酵装置を例示説明するための概要側面図である。図２は、分離膜エレメントが発酵反応槽の内部に設置された代表的な連続発酵装置の一例である。
【００９４】
図２において、連続発酵装置は、分離膜エレメント２を内部に備えた発酵反応槽１と差圧制御装置３で基本的に構成されている。発酵反応槽１内の分離膜エレメント２には中空糸多孔性膜が組み込まれている。分離膜エレメント２に関しては、追って詳述する。
【００９５】
図２の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。図２において、培地供給ポンプ７によって、培地が発酵反応槽１に連続的もしくは断続的に投入される。培地については、投入前に必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽１内の攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌する。
【００９６】
発酵生産時には、必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を発酵反応槽１内に供給することができる。発酵生産時は、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵反応槽１内の発酵液のｐＨを調整し、必要に応じて、温度調節器１０によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。ここでは、計装・制御装置による発酵液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰの制御、オンラインケミカルセンサーなどの分析装置により、発酵培養液中の化学品の濃度を測定し、発酵培養液中の化学品の濃度を指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入は、好ましくは、上記の計装装置による発酵培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節する。
【００９７】
図２において、発酵培養液は、発酵反応槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、微生物と発酵生産物が、濾過・分離され、発酵生産物が装置系から取り出される。また、濾過・分離された微生物が装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を使用することなく実施可能であるが、必要に応じて、レベルセンサ６および差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽１内の発酵培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメントによる濾過・分離には、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。
【００９８】
また、別途用意した培養槽（図示せず）で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、必要に応じて発酵反応槽１内に供給することができる。培養槽で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、必要に応じて発酵反応槽１内に供給することにより、常にフレッシュで化学品の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【００９９】
次に本発明の連続発酵による化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置で好ましく用いられる分離膜エレメントについて説明する。図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントを例示説明するための概略斜視図である。
【０１００】
図３において、分離膜エレメントは、図３に示されるように、中空糸多孔性膜で構成された分離膜束１３と上部樹脂封止層１４と下部樹脂封止層１５によって主に構成されている。この分離膜束１３と上部樹脂封止層１４と下部樹脂封止層１５によって構成されている分離膜エレメントによるろ過手段については、単独で分離膜エレメントとして用いても良いし、複数をもって分離膜エレメントとしても用いることができる。分離膜束１３は上部樹脂封止層１４および下部樹脂封止層１５よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層１５による接着・固定化は中空糸多孔性膜の中空部を封止しており、発酵培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１４は中空糸多孔性膜の内孔を封止しておらず、集水パイプ１７に透過水が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム１６を介して連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束１３によって濾過された透過水は、中空糸多孔性膜の中空部を通り、集水パイプ１７を介して発酵反応槽外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【０１０１】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置の分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。発酵装置内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避することができ、より安定した連続発酵が可能となる。分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である１２１℃の温度での１５分間処理に耐性であることが好ましい。分離膜エレメント部材は、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定できる。
【０１０２】
本明の連続発酵による化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置では、分離膜エレメントは、発酵反応槽外に設置しても良いし、発酵反応槽内に設置しても良い。発酵反応槽外に設置する場合には、別途膜分離槽を設けてその内部に分離膜エレメントを設置することができ、発酵反応槽と膜分離槽の間を発酵培養液を循環させながら、分離膜エレメントにより発酵反応液を連続的にろ過することができる。
【０１０３】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能なことが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。
【実施例】
【０１０４】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために、製造する化学品として、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、コハク酸および１，３−プロパンジオールを選定し、それぞれの化学品を生産する能力のある微生物あるいは培養細胞による、図１および図２に示す連続発酵装置を用いた連続発酵の具体的な実施形態について、実施例を挙げて説明する。
【０１０５】
実施例では、図１に示す連続発酵装置を使用した場合、発酵反応槽容積は２Ｌとし、膜分離槽容積は０．５Ｌで、連続発酵試験では本装置内の発酵培養液容量が２Ｌとなるように調整した。また、図２に示す連続発酵装置を使用した場合、発酵反応槽容積は２Ｌ、連続発酵試験では、本装置内の発酵液容量が１．５Ｌとなるように調整した。
【０１０６】
（参考例１）Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株を、下記のようにして造成した。ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、KOD-Plus-polymerase（東洋紡社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【０１０７】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen社製）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen社製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【０１０８】
上記の操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲにより、Ｌ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をＴ４ Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図４）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにして、ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）を得た。ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターである上記ｐＬ−ｌｄｈ５は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にＦＥＲＭ ＡＰ−２０４２１として寄託した（寄託日：平成１７年２月２１日）。
【０１０９】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、およびサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子及びＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を、常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【０１１０】
得られた形質転換細胞がヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のようにして行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
・カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
・移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・温度：４５℃。
【０１１１】
また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
・カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
・移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
・温度：３０℃。
【０１１２】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
・光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
（ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度を表し、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。）。
【０１１３】
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がＬ−乳酸生産能力を持つことが確認された。得られた形質転換細胞を酵母ＳＷ−１株として、続く実施例に用いた。
【０１１４】
（参考例２）中空糸多孔性膜の作製（その１）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【０１１５】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社、商品名イオネットＴ−２０Ｃ）を５重量％、水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた本発明で用いる中空糸多孔性膜を製作した。得られた中空糸多孔性膜の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である中空糸多孔性膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
【０１１６】
（参考例３）中空糸多孔性膜の作製（その２）
重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーとセルロースアセテートとＮ-メチル-２-ピロリドンとモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを、それぞれ１５重量％と１重量％と７７重量％と７重量％との割合で混合し、１１０℃の温度で溶解した。このポリマー溶液を参考例２と同様な中空糸膜の外表面に塗布し、２５℃の温度の水で凝固して、その後水洗により脱溶媒して本発明で用いる中空糸多孔性膜を得た。得られた中空糸多孔性膜の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０１μｍであった。
【０１１７】
（参考例４） 中空糸多孔性膜の作製（その３）
重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーと水とジメチルホルムアミドを、それぞれ１２重量％と３重量％と８５重量％の割合で混合し、１００℃の温度で溶解した。このポリマー溶液を参考例２と同様な中空糸膜の外表面に塗布し、４０℃の温度の水で凝固して、その後水洗により脱溶媒して本発明で用いる中空糸多孔性膜を得た。得られた中空糸多孔性膜の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０９μｍであった。
【０１１８】
（実施例１）酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その１）
参考例１で作製した酵母ＳＷ−１株を用いて、図１の連続発酵装置と表１に示す組成の酵母乳酸発酵培地によってＬ−乳酸の製造を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、参考例２で作製した中空糸多孔性膜を用いた。
【０１１９】
実施例１における運転条件は、特に断らない限り次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜分離槽通気量：０．３（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵培養液循環装置による循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１Ｐａ以上５ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：１００ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下で制御）。
【０１２０】
生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養し培養液を得た（前々培養）。得られた前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、発酵液循環ポンプ１０を稼働させることなく、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量が２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、差圧制御装置３により膜間差圧を測定し、上記の膜透過水量制御条件で変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵培養液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。
【０１２３】
３００時間の連続発酵試験を行った結果を、表２に示す。図１に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１２４】
（実施例２）酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１２５】
（実施例３）酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その３）
分離膜には、参考例４で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１２６】
（実施例４）酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その４）
図２に示す連続発酵装置と表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、Ｌ−乳酸の製造を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には参考例２で作製した中空糸多孔性膜を用いた。実施例４における運転条件は、特に断らない限り次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１Ｐａ以上５ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下で制御）。
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０ｍｉｎ間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
【０１２７】
微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、培地として表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１２８】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養し培養液を得た（前々培養）。得られた前々培養液を、図２に示した連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、差圧制御装置３により膜間差圧を測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該Ｌ−乳酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたＬ−乳酸対糖収率とＬ−乳酸生産速度を表２に示した。
【０１２９】
３００時間の発酵試験を行った結果、図２に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１３０】
（実施例５）酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その５）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例４と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１３１】
（実施例６）酵母を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その６）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例５と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１３２】
（比較例１）回分発酵によるＬ−乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行い、そのＬ−乳酸生産性を評価した。表１に示す乳酸発酵培地を用い、２Ｌ容ミニジャーファーメンター（エイブル社製）用いた回分発酵試験を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。比較例１でも、微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬）を用いた。比較例１の運転条件を下記する。
・発酵反応槽容量（乳酸発酵培地量）：１（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整。
【０１３３】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液をミニジャーファーメンターの１Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、回分発酵培養を行った。回分発酵の結果を表２に示す。
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
図１および図２に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、Ｌ−乳酸の生産速度が大幅に向上した。
【０１３６】
（実施例７）連続発酵によるコハク酸の連続製造（その１）
図１に示す連続発酵装置を用いたコハク酸の製造を行った。コハク酸の製造におけるコハク酸およびグルコースは、特に断らない限り、次の方法で測定した。コハク酸は、発酵培養液の遠心上清について、ＨＰＬＣ（島津社製 ＬＣ１０Ａ、ＲＩモニター：ＲＩＤ-１０Ａ、カラム：アミネックスＨＰＸ-８７Ｈ）で分析した。カラム温度は５０℃、０.０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４でカラムを平衡化した後、サンプルをインジェクションし、０.０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で溶出して分析を行った。グルコースは、グルコースセンサー（ＢＦ−４、王子計測機器社製）を用いて測定した。
【０１３７】
使用する培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜には、参考例２で作製した中空糸多孔性膜を用いた。実施例７における運転条件は、特に断らない限り次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：６０平方ｃｍ
・温度調整：３９（℃）
・発酵反応槽ＣＯ２通気量：１０（ｍＬ／ｍｉｎ）
・膜分離槽ＣＯ２通気量：１００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ６.４に調整
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵培養液循環装置による循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御。
【０１３８】
（連続発酵開始後〜７０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御
７０時間〜１４０時間：０．１Ｐａ以上５ｋＰａ以下で制御
１４０時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下で制御）。
【０１３９】
この実施例７ではコハク酸の生産能力のある微生物として、アナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）ＡＴＣＣ53488株によるコハク酸の連続製造を行った。２０ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ ポリペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０.２ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０.２ｇ/Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏからなる種培養用培地１００ｍＬを、１２５ｍＬ容三角フラスコに入れ加熱滅菌した。嫌気グローブボックス内で、３０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３ １ｍＬと１８０ｍＭ Ｈ２ＳＯ４ ０.１５ｍＬを加え、さらに、０.２５ｇ／Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ／Ｌ Ｎａ２Ｓからなる還元溶液０.５ｍＬを加えた後、ＡＴＣＣ53488株を接種し、３９℃の温度で一晩静置培養した（前々培養）。図１に示す連続発酵装置の１．５Ｌのコハク酸発酵培地（表３）に、０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ／Ｌ Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏからなる還元溶液５ｍLを加えた後、前々培養液５０ｍＬを植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって２００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１のＣＯ２通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。
【０１４０】
【表３】
【０１４１】
前培養完了後直ちに、コハク酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を２Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるコハク酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、差圧制御装置３により膜間差圧を測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、コハク酸およびグルコース濃度から算出されたコハク酸生産速度およびコハク酸の生成収率を、表４に示した。
【０１４２】
（実施例８）連続発酵によるコハク酸の連続製造（その２）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例５と同様のコハク酸連続発酵試験を行った。その結果を表４に示す。その結果、安定したコハク酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１４３】
（実施例７）連続発酵によるコハク酸の連続製造（その３）
分離膜には、参考例４で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例５と同様のコハク酸連続発酵試験を行った。その結果を表４に示す。その結果、安定したコハク酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１４４】
（比較例２）回分培養によるコハク酸の製造（その１）
アナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）の回分発酵によるコハク酸製造は、次のように行った。
【０１４５】
２０ｇ/Ｌ グルコース、１０ｇ/Ｌ ポリペプトン、５ｇ/Ｌ 酵母エキス、３ｇ/Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ/Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ/Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０.２ｇ/Ｌ ＭｇＣｌ２、０.２ｇ/Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏからなる種培養用培地１００ｍＬを、１２５ｍＬ容三角フラスコに入れ加熱滅菌した。嫌気グローブボックス内で、３０ＭｍＮａ２ＣＯ３１ｍＬと１８０ｍＭＨ２ＳＯ４ ０.１５ｍＬを加え、さらに、０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓからなる還元溶液０.５ｍＬを加えた後、アナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）ＡＴＣＣ５３４８８を接種し、３９℃で一晩静置培養した。表３に示す発酵培地１Ｌを、ミニジャーファーメンター（ＡＢＬＥ社製、ＢＭＪ型、２Ｌ）に加え、１２０℃の温度で２０分間加熱滅菌した。
【０１４６】
ＣＯ２ガスをスパージャーから、１０ｍＬ／ｍｉｎで通気し、３ＭＮａ２ＣＯ３溶液１０ｍＬを加えた後、硫酸溶液でｐＨを６.８に調整した。０.２５ｇ/Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ/Ｌ Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏからなる還元溶液５ｍLを加えた後、上記の種培養液５０ｍL接種し、撹拌速度２００ｒｐｍ、温度は３９℃、２ＭＮａ２ＣＯ３溶液でｐＨ６.４に調整しながら培養を行った。その結果を表４に示す。
【０１４７】
【表４】
【０１４８】
図１および図２に示す発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、コハク酸の生産速度が大幅に向上した。
【０１４９】
（実施例１０）連続発酵によるコハク酸の連続製造（その５）
図１に示す連続発酵装置を用いたコハク酸の製造を行った。コハク酸およびグルコース濃度の測定は、実施例７と同様の方法で行った。使用する培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜には、参考例２で作製した中空糸多孔性膜を用いた。この実施例１０おける運転条件は、下記の膜透過水量制御以外、実施例７と同様である。
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御。
【０１５０】
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１４０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１４０時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下で制御）。
【０１５１】
実施例１０では、コハク酸の生産能力のある微生物として、大腸菌Ｂ株（Escherichia coli Ｂ）ＡＴＣＣ１１３０３株を用いたコハク酸の連続製造を行った。大腸菌によるコハク酸製造では、１２ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ ポリペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.２ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる種培養用培地１５０ｍＬを２００ｍＬ容三角フラスコに入れ、ｐＨを６.８に調整した。ＭｇＣＯ３７.５ｇを添加した後、加熱滅菌し、３７℃の温度まで冷却した後、嫌気グローブボックス内で、ＡＴＣＣ１１３０３株を接種し、３７℃の温度で一晩静置培養した（前々培養）。図１に示す連続発酵装置に、１２ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ ポリペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.２ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなるコハク酸発酵培地１．５Ｌを仕込み、前々培養液１５０ｍＬを植菌した。培養温度を３７℃としたこと以外は、実施例７と同様の条件でコハク酸の連続発酵を行った。
【０１５２】
２４時間培養の前培養後、表５に示すコハク酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量が２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養を行った。結果を表６に示す。
【０１５３】
【表５】
【０１５４】
適宜、膜透過発酵培養液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。該コハク酸、及びグルコース濃度から算出されたコハク酸生産速度およびコハク酸の生成収率を、表６に示した。
【０１５５】
（実施例１１）連続発酵によるコハク酸の連続製造（その５）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１０と同様のコハク酸連続発酵試験を行った。その結果を表６に示す。その結果、安定したコハク酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１５６】
（実施例１２）連続発酵によるコハク酸の連続製造（その６）
分離膜には、参考例４で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１０と同様のコハク酸連続発酵試験を行った。その結果を表６に示す。その結果、安定したコハク酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１５７】
（比較例３）回分培養によるコハク酸の製造（その３）
大腸菌（Escherichia coli）を用いた回分発酵によるコハク酸製造は、次のようにして行った。
【０１５８】
１２ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ ポリペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.２ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる種培養用培地１００ｍＬを１２５０ｍＬ容三角フラスコに入れ、ｐＨを６.８に調整した。ＭｇＣＯ３を５ｇ添加した後、加熱滅菌し、３７℃の温度まで冷却した後、嫌気グローブボックス内で、大腸菌Ｂ株（Escherichia coli Ｂ）ＡＴＣＣ１１３０３株を接種し、３７℃の温度で一晩静置培養した。１２ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ ポリペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.２ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる発酵培地１ＬをｐＨ６.８に調整後、ミニジャーファーメンター（ＡＢＬＥ社製、ＢＭＪ型、２Ｌ）に加え、加熱滅菌（１２０℃、２０min）した。ＣＯ２ガスをスパージャーから５０ｍＬ／ｍｉｎで通気し、温度を３７℃に調整した。上記の種培養１００ｍＬを接種し、付属の撹拌羽根を用いて６００ｒｐｍで撹拌し、５.５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３でｐＨを６.８に調整しながら培養した。培養液中のグルコース濃度が、２０ｇ/Ｌを超えないように、１００ｇ／Ｌグルコース溶液２００ｍＬを少量ずつ追加しながら培養を行った。その結果を表６に示す。
【０１５９】
【表６】
【０１６０】
図１に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、コハク酸の生産速度が大幅に向上した。
【０１６１】
（実施例１３）連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その１）
図１の連続発酵装置と表７に示す組成の１，３−プロパンジオール生産培地を用い、１，３−プロパンジオールの製造を行った。まず、生産物である１，３−プロパンジオールの単離、同定、および測定法について説明する。
【０１６２】
ＨＰＬＣによりグリセロールの１，３−プロパンジオールへの転換を確認した。分析は標準的方法およびクロマトグラフィーの技術分野における熟練者に利用可能な材料を用いて行った。１つの適した方法として、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１Ｐ プレカラム（６ｍｍｘ５０ｍｍ）を接続したＷａｔｅｒｓ Ｍａｘｉｍａ ８２０ ＨＰＬＣシステムを使用して、ＵＶ（２１０ｎｍ）及びＲＩによる検出を行った。５０℃の温度に温度制御されたＳｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１カラム（８ｍｍｘ３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡから購入）上に、移動相として０．０１Ｎ Ｈ2ＳＯ4を用い、０．５ｍＬ／分の流量で試料を注入した。定量的分析を行う場合、外部標準として既知量のトリメチル酢酸を用いて試料を調製した。グルコース（ＲＩ検出）、グリセロール、１，３−プロパンジオール（ＲＩ検出）およびトリメチル酢酸（ＵＶおよびＲＩ検出）の保持時間は、それぞれおよそ１５分、２０分、２６分および３５分であった。
【０１６３】
ＧＣ／ＭＳにより、１，３−プロパンジオールの生産を確認した。ＧＣ／ＭＳは、標準的方法用いて行った。Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５９７１ Ｓｅｒｉｅｓ質量選択的検出器（ＥＩ）およびＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚さ０．２５ミクロン）に連結されたＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５８９０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩガスクロマトグラフを用いた。生成した１，３−プロパンジオールの保持時間及び質量スペクトルを１，３−プロパンジオール標準品（ｍ／ｅ：５７，５８）のそれらと比較した。
【０１６４】
試料の誘導体化は、次のように行った。１．０ｍＬの試料（例えば、培養上澄み液）に３０μＬの濃（７０％ｖ／ｖ）過塩素酸を加え、混合した後、試料を凍結乾燥した。ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド：ピリジンの１：１混合物（３００μＬ）を、凍結乾燥した試料に加え、強く混合し、６５℃の温度において１時間置いた。遠心により不溶物を除いて、上清を回収した。得られた液体は２相に分かれ、その上相を分析に用いた。得られた１,３−プロパンジオールのトリメチルシリル化誘導体試料を、ＤＢ−５カラム（４８ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚さ０．２５μｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから）上でクロマトグラフィーにかけ、１，３−プロパンジオールトリメチルシリル化誘導体の保持時間および質量スペクトルを、基準の標準試料から得た保持時間および質量スペクトルと比較した。１，３−プロパンジオールのトリメチルシリル化誘導体の質量スペクトルは、２０５、１７７、１３０および１１５ＡＭＵの特徴的イオンを含有する。
【０１６５】
培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、参考例２で作製した多孔性膜を用いた。この実施例１３における運転条件は、特に断らない限り、次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．６（Ｌ／ｍｉｎ）窒素ガス
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１４０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１４０時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下で制御）。
【０１６６】
微生物としてクレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を用い、培地として表７に示す組成の１，３−プロパンジオール生産培地を用い、生産物である１，３−プロパンジオールの濃度の評価は上述のＨＰＬＣ法により測定した。
【０１６７】
また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１６８】
【表７】
【０１６９】
まず、クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を、試験管で５ｍｌの１，３−プロパンジオール生産培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な１，３−プロパンジオール生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続発酵装置の１．５Ｌの１，３−プロパンジオール生産培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度の調整、ｐＨの調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプを稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、１，３−プロパンジオール生産培地（グリセロール濃度は１００ｇ／Ｌ）の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、差圧制御装置３により膜間差圧を測定し、上記の膜透過水量制御条件で変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された１，３−プロパンジオール濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、１，３−プロパンジオールおよび投入グリセロールから算出された１，３−プロパンジオール生産速度を表８に示した。
【０１７０】
２００時間の発酵試験を行った結果、図１に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、安定した１，３−プロパンジオールの連続発酵による製造が可能であった。
【０１７１】
（実施例１４）連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その２）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１３と同様の１，３−プロパンジオール連続発酵試験を行った。その結果を表８に示す。その結果、安定した１，３−プロパンジオールの連続発酵による製造が可能であった。
【０１７２】
（実施例１５）連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造（その３）
分離膜には、参考例４で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１３と同様の１，３−プロパンジオール連続発酵試験を行った。その結果を表８に示す。その結果、安定した１，３−プロパンジオールの連続発酵による製造が可能であった。
【０１７３】
（比較例４）フェドバッチ発酵による１，３−プロパンジオールの製造
微生物を用いた発酵形態としてよく実施されるフェドバッチ発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、１，３−プロパンジオール生産性を評価した。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。比較例４では、微生物としてクレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を用い、生産物である１，３−プロパンジオールの濃度の評価は、実施例１３に示した方法に従ってＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。比較例４の運転条件を次に示す。
・発酵反応槽容量（１，３−プロパンジオール生産培地量）：１．０（Ｌ）
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．４（Ｌ／ｍｉｎ）窒素ガス
・発酵反応槽攪拌速度：３００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整。
【０１７４】
まず、クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ ２５９５５株を試験管で５ｍｌの１，３−プロパンジオール生産培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な１，３−プロパンジオール生産培地５０ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液をジャーファーメンターの１．５Ｌの１，３−プロパンジオール生産培地に植菌した。１，３−プロパンジオール生産培地（グリセロール濃度は５００ｇ／Ｌ）を用い、グリセロール濃度が０ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌになるように連続的に供給し、フェドバッチ発酵を行った。その結果を表８に示す。
【０１７５】
【表８】
【０１７６】
図１に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、１，３−プロパンジオールの生産速度が大幅に向上した。
【０１７７】
（実施例１６）乳酸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その１）
図１に示す連続発酵装置を用いたＬ−乳酸の製造を行った。培地には表９に示すＬ−乳酸菌乳酸発酵培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜には、参考例２で作製した中空糸多孔性膜を用いた。この実施例１６における運転条件は、特に断らない限り、次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：５０（ｍＬ−窒素／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：６００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：８Ｎ アンモニア水溶液によりｐＨ６．５に調整
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１４０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１４０時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ以下で制御）。
【０１７８】
原核微生物として、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＪＣＭ７６３８株を用い、培地として表９に示す組成の乳酸菌乳酸発酵培地を用いた。発酵培養液に含まれるＬ−乳酸は、参考例１と同様の方法で評価した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１７９】
【表９】
【０１８０】
まず、ラクトコッカス ラクティス ＪＣＭ７６３８株を、試験管で表９に示す５ｍｌの窒素ガスでパージした乳酸発酵培地で２４時間、３７℃の温度で静置培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地５０ｍｌに植菌し、４８時間、３７℃の温度で静置培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の窒素ガスでパージした１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって６００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３７℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。このとき、気体供給装置から窒素ガスを発酵反応槽内に供給し、排出されたガスを回収して再度発酵反応槽に供給した。すなわち、窒素ガスを含む気体のリサイクル供給を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、差圧制御装置３により膜間差圧を測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、Ｌ−乳酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたＬ−乳酸対糖収率とＬ−乳酸生産速度を、表１０に示した。
【０１８１】
２００時間の発酵試験を行った結果、連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１８２】
（実施例１７）乳酸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１６と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表１０に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１８３】
（実施例１８）乳酸菌を用いた連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜には、参考例５で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１６と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表１０に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０１８４】
（比較例５）回分発酵によるＬ−乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、そのＬ−乳酸生産性を評価した。培地には表９に示す培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。この比較例５では、原核微生物としてラクトコッカス ラクティス ＪＣＭ７６３８株を用い、生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価は、参考例１に示した方法を用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。比較例５の運転条件を次に示す。
・発酵反応槽容量：１（Ｌ）
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：５０（ｍＬ−窒素／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：２００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：８Ｎ アンモニア水溶液によりｐＨ６．５に調整。
【０１８５】
まず、ラクトコッカス ラクティス ＪＣＭ７６３８株を、試験管で表９に示す５ｍｌの窒素ガスでパージした乳酸発酵培地で２４時間、３７℃の温度で静置培養し培養液を得た（前々培養）。得られた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地５０ｍｌに植菌し、４８時間、３７℃の温度で静置培養した（前培養）。前培養液をジャーファーメンターの１Ｌの表９に示す連続・回分発酵培地に植菌し、回分発酵を行った。回分発酵の結果を、表１０に示す。
【０１８６】
【表１０】
【０１８７】
図１に示す発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、Ｌ−乳酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。
【０１８８】
（参考例５）バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡの調製
バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３を、ＧＹＰ培地（特開２００３−０８８３９２号公報に記載のＧＹＰ培地）１００ｍｌに接種し、温度３０℃の温度で２４時間培養して培養物を得た。得られた培養物を３０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離処理し湿潤菌体０．５ｇを得た後、その湿潤菌体から、斎藤、三浦の方法（Biochem．Biophys．Acta.，72，619（1963））により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この染色体ＤＮＡ６０μｇおよび制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ、３ユニットを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4および１ｍＭ ジチオスレイトール含有（ｐＨ ７．４））に各々混合し、温度３７℃で３０分間反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＳａｕ３ＡＩで消化されたバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡ断片５０μｇを得た。
【０１８９】
（参考例６）プラスミドベクターＤＮＡを利用したバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の遺伝子ライブラリーの作製
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で自律複製可能なプラスミドベクターＤＮＡ（ｐＵＣ１９）２０μｇおよび制限酵素ＢａｍＨＩ２００ユニットを、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌおよび１０ｍＭ硫酸マグネシウム含有（ｐＨ７．４））に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、得られた消化液を常法によりフェノール抽出し、更にエタノール沈澱処理を行った。
【０１９０】
その後、プラスミドベクター由来のＤＮＡフラグメントが再結合することを防止するため、バクテリアルアルカリホスファターゼ処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理を行った。
【０１９１】
このＢａｍＨＩで消化されたｐＵＣ１９を１μｇ、参考例４で得られたＳａｕ３ＡＩで消化されたバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡ断片１μｇ、および２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトールおよび１０ｍＭＡＴＰを含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で１６時間反応させ、ＤＮＡを連結させた。次いで、得られたＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換し、これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地上にまき、約２０，０００個のコロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。約２０，０００個のコロニーより、組換えＤＮＡの回収を行なった。回収の方法は、上記に示した斎藤、三浦の方法に従った。
【０１９２】
（参考例７）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング用宿主の作製
バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３株のＤ−ＬＤＨ遺伝子のスクリーニングを、機能相補によって行った。その原理の詳細は、「（Dominique, G., Appl. Environ. Microbiol., United States, (1995), 61, 266-272.）」に記載されている。すなわち、エッシェリシア・コリのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性およびピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素活性を欠失した株の嫌気条件下での生育を回復させる遺伝子をスクリーニングする手法である。キリルらの方法（Kirill, A., Proc. Natl. Acad. Sci., United States, (2000), 97, 6640-6645.）によって、エッシェリシア・コリのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）およびピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子（ｐｆｌＢおよびｐｆｌＤ）を破壊欠失した株を作製した。このようにして作製した株を、エシェリヒア・コリ ＴＭ３３株（Ｅ．ｃｏｌｉ ΔｌｄｈＡ ΔｐｆｌＢ：：Ｋｍｒ ΔｐｆｌＤ：：Ｃｍｒ）と命名し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング用宿主とした。
【０１９３】
（参考例８）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング
エシェリヒア・コリ ＴＭ３３株を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン硫酸塩および１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、温度３７℃で２４時間培養し、培養物を得た。このようにして得られた培養物を、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離処理し、湿潤菌体０．８ｇを得た。得られた湿潤菌体を１０％グリセロール溶液１０ｍｌで３度洗浄した後、１０％グリセロール溶液０．１ｍｌにけん濁しコンピテントセルとした。このコンピテントセルに、参考例６で得られたバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３株の遺伝子ライブラリーを１μｌ加え、電気穿孔法の常法に従い導入した株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＭ９ＧＰ寒天培地（Ｍ９培地＋０．４％グルコース＋０．２％ペプトン）上にまき、嫌気条件下で生育可能であった株を数株得た。
【０１９４】
（参考例９）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡの塩基配列の解析
上記で得られた組換えＤＮＡを含有するエシェリヒア・コリ ＴＭ３３／ｐＢＬ２から、常法に従いプラスミドを調製し、得られた組換えＤＮＡを用い塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用いＳａｎｇｅｒの方法に従って行った。得られたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列は、２，９９５塩基対あった。この配列についてGenetyx（ソフトウェア開発株式会社製）を用いてオープン・リーディング・フレーム検索を行い、１，０１１塩基対のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１０）を仮決定した。
【０１９５】
（参考例１０）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターの作製
バシラス・ラエボラクティカスから、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子をクローニングした。Ｄ−ＬＤＨ遺伝子は、全てＰＣＲ法によりクローニングを行い、同様の方法で発現ベクターに導入している。クローニング方法を以下に示す。
【０１９６】
バシラス・ラエボラクティカスを培養し遠心回収後、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO社製）を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。詳細な操作方法は、付属のプロトコールに従った。得られたゲノムＤＮＡを続くＰＣＲの鋳型とした。上記で得られたＤＮＡを鋳型として、それぞれＰＣＲによりＤ−ＬＤＨ遺伝子のクローニングを行った。ＰＣＲ増幅反応には、Ｔａｑの５０倍の正確性を持つとされるＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いた。反応バッファーおよびｄＮＴＰｍｉｘなどは、付属のものを使用した。Ｄ−ＬＤＨ遺伝子増幅用プライマー（配列番号１１、１２）は、５末端側にはＸｈｏＩ認識配列、３末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【０１９７】
各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（TAKARA社製）を用いて行った。エシェリヒア・コリ ＤＨ５αに形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子がサブクローニングされたプラスミドが得られた。この各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで切断し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図４）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に導入した。このようにして作製したＤ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクターをｐＴＭ６３と示す。
【０１９８】
（参考例１１）Ｄ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクターの酵母への導入
参考例１０で得られたｐＴＭ６３を酵母サッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換した。形質転換は、YEASTMAKER Yeast Transformation System（CLONTECH社製）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするサッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＭ６３の持つＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＭ６３の導入された形質転換体の選択が可能である。
【０１９９】
このようにして得られた形質転換体へのＤ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクター導入の確認は、ウラシル非添加の液体培地で培養した形質転換株から、ゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（TAKARA社製）によりプラスミドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰｒｅＭｉｘ Ｔａｑ（TAKARA社製）を用いたＰＣＲにより行った。プライマーには、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子をクローニングした際に用いたプライマーを使用した。その結果、全ての形質転換体において、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が導入されていることが確認された。
ｐＴＭ６３が導入されたサッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株を以下、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株と示す。
【０２００】
（実施例１９）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その１）
図１に示す連続発酵装置と表１１に示す組成のＤ−乳酸生産培地を用い、Ｄ−乳酸の製造を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、参考例２で作製した多孔性膜を用いた。実施例１９における運転条件は、特に断らない限り、次のとおりである。
・発酵反応槽容量：２．０（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）空気
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５０ｋＰａ以下で制御
８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上１００ｋＰａ以下で制御
１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上１５０ｋＰａ以下で制御）。
【０２０１】
微生物として、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を用い、生産物であるＤ−乳酸の濃度の評価は参考例１と同様のＨＰＬＣ法により測定した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０２０２】
【表１１】
【０２０３】
まず、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を、試験管で５ｍｌのＤ−乳酸生産培地で一晩振とう培養し培養液を得た（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なＤ−乳酸生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の２．０ＬのＤ−乳酸生産培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。
【０２０４】
前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプ１０を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、Ｄ−乳酸生産培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量が２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、差圧制御装置３により膜間差圧を測定し、上記の膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過発酵液中の生産された乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。２４０時間の連続発酵試験を行った結果を表１２に示す。
【０２０５】
連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２０６】
（実施例２０）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その２）
分離膜には、参考例３で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１９と同様のＤ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表１２に示す。その結果、安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２０７】
（実施例２１）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その３）
分離膜には、参考例４で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１９と同様のＤ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表１２に示す。その結果、安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
【０２０８】
（比較例６）回分発酵によるＤ−乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、そのＤ−乳酸生産性を評価した。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。比較例６では、微生物としてＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を用い、生産物であるＤ−乳酸の濃度の評価はＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。本比較例の運転条件は、下記のとおりである。
・発酵反応槽容量（Ｄ−乳酸生産培地量）：１．０（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）空気
・発酵反応槽攪拌速度：３００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整。
【０２０９】
まず、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を試験管で５ｍｌのＤ−乳酸生産培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮なＤ−乳酸生産培地５０ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前培養）。前培養液をジャーファーメンターの１．５ＬのＤ−乳酸生産培地に植菌した。Ｄ−乳酸生産培地を用い、回分発酵を行った。その結果を表１２に示す。
【０２１０】
【表１２】
【０２１１】
図１に示す連続発酵装置を用いた本発明の連続発酵による化学品の製造方法により、Ｄ−乳酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。
【産業上の利用可能性】
【０２１２】
本発明の連続発酵による化学品の製造方法は、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵が可能であり、広く発酵工業において、発酵生産物である化学品を低コストで安定に生産することが可能となり有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】図１は、本発明で用いられる連続発酵装置を例示説明するための概略側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる他の連続発酵装置を例示説明するための概略側面図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントを例示説明するための概略斜視図である。
【図４】図４は、酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【符号の説明】
【０２１４】
１ 発酵反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 差圧制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 発酵培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 分離膜束
１４ 上部樹脂封止層
１５ 下部樹脂封止層
１６ 支持フレーム
１７ 集水パイプ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収し、さらに、未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵において、前記の分離膜として平均細孔径が０．０１μｍ以上５μｍ以下の細孔を有する中空糸多孔性膜を用い、その膜間差圧を０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ未満の範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項２】
中空糸多孔性膜が、多孔質樹脂層を含む多孔性膜である請求項１に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項３】
多孔質樹脂層が、有機高分子化合物からなる多孔質有機高分子膜である請求項１または２に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項４】
有機高分子化合物が、ポリフッ化ビニリデンである請求項３記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項５】
微生物または培養細胞の発酵培養液および発酵原料が、糖類を含む請求項１〜４のいずれかに記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項６】
化学品が、有機酸である請求項１〜５のいずれかに記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項７】
有機酸が、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸またはコハク酸である請求項６記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項８】
化学品が、アルコールである請求項１〜５のいずれかに記載の連続発酵による化学品の製造方法
【請求項９】
アルコールが、１，３−プロパンジオールである請求項８記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項１】
微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収し、さらに、未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵において、前記の分離膜として平均細孔径が０．０１μｍ以上５μｍ以下の細孔を有する中空糸多孔性膜を用い、その膜間差圧を０．１ｋＰａ以上２００ｋＰａ未満の範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項２】
中空糸多孔性膜が、多孔質樹脂層を含む多孔性膜である請求項１に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項３】
多孔質樹脂層が、有機高分子化合物からなる多孔質有機高分子膜である請求項１または２に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項４】
有機高分子化合物が、ポリフッ化ビニリデンである請求項３記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項５】
微生物または培養細胞の発酵培養液および発酵原料が、糖類を含む請求項１〜４のいずれかに記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項６】
化学品が、有機酸である請求項１〜５のいずれかに記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項７】
有機酸が、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸またはコハク酸である請求項６記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項８】
化学品が、アルコールである請求項１〜５のいずれかに記載の連続発酵による化学品の製造方法
【請求項９】
アルコールが、１，３−プロパンジオールである請求項８記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−２３７１０１（Ｐ２００８−２３７１０１Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８１７４４（Ｐ２００７−８１７４４）
【出願日】平成１９年３月２７日（２００７．３．２７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」に係る委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２７日（２００７．３．２７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」に係る委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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