遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）の測定用液状試薬
【課題】液状で長期間安定なＮＥＦＡ測定用試薬およびそれを用いた簡便且つ正確なＮＥＦＡ測定方法の提供。
【解決手段】ＣｏＡ、ＡＣＳおよびＡＴＰを含む液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに当該試薬の安定化に有効な量の、置換α-CD、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物をさらに含有する、安定化された液状試薬。ＡＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体およびＮＥＭを含み、ＮＥＭの安定化に有効なｐＨを有する液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該試薬の安定化に有効な量のＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有する、安定化された液状試薬。該第１及び第２液状試薬を安定化する方法。該第１及び／又は第２液状試薬を含んでなるＮＥＦＡ測定用キット、及び該キットを用いたＮＥＦＡ測定方法。
【解決手段】ＣｏＡ、ＡＣＳおよびＡＴＰを含む液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに当該試薬の安定化に有効な量の、置換α-CD、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物をさらに含有する、安定化された液状試薬。ＡＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体およびＮＥＭを含み、ＮＥＭの安定化に有効なｐＨを有する液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該試薬の安定化に有効な量のＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有する、安定化された液状試薬。該第１及び第２液状試薬を安定化する方法。該第１及び／又は第２液状試薬を含んでなるＮＥＦＡ測定用キット、及び該キットを用いたＮＥＦＡ測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液状で長期保存可能であり、かつ遊離脂肪酸（以下、ＮＥＦＡという）を測定可能である、コエンザイムＡ（以下、ＣｏＡという）、アシルコエンザイムＡシンテターゼ（以下、ＡＣＳという）及びＡＴＰを含む第１の液状試薬、並びにアシルコエンザイムＡオキシダーゼ（以下、ＡＣＯという）、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体及びＮ−エチルマレイミド（以下、ＮＥＭという）を含む第２の液状試薬、それらの製造における安定化方法、それらを備えるＮＥＦＡ測定用キット、並びにそれらを用いたＮＥＦＡ測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の自動分析試薬の市販キットは、凍結乾燥品と溶解液の組み合わせとして供給され、使用時に溶解して測定に用いてきた。ところが、凍結乾燥品の場合、試薬調製の煩雑さに加えて、調製時のミスにより誤った測定結果が得られたり、溶解後の有効期間が短い（安定性に欠ける）といった問題があった。従って、最近の臨床検査においては、そのような問題を回避すべく、液状試薬の使用が主流となってきている。
【０００３】
ＮＥＦＡの定量法として、まず第一試薬中で、Ｍｇ++やＭｎ++等の２価金属イオンおよびアデノシン５'-三リン酸（以下、ＡＴＰという）の共存下でＡＣＳの作用により、ＣｏＡと試料中のＮＥＦＡからアシルＣｏＡを産生させる第一工程、および第二試薬中で、ＡＣＯの作用によりアシルＣｏＡを酸化することにより生じる過酸化水素を、ＮＥＭの存在下でペルオキシダーゼと発色性基質とを組み合わせて定量する第二工程からなる方法が広く採用されている。
【０００４】
しかしながら、ＮＥＦＡ測定試薬には不安定な成分が多く含まれるため、液状化は困難であるとされてきた。例えば、ＣｏＡを含む従来公知のＮＥＦＡ測定用第一試薬は、一旦溶解してしまうと、その有効期間は冷蔵で５〜１５日程度であった。
さらに、ＮＥＭは中性付近より高ｐＨの領域では不安定となり、またＡＣＯはＮＥＭによって変性を受けるため、一旦ＮＥＭとＡＣＯとを中性付近の溶液中で共存させると、両者とも急激に安定性が低下してしまう。そのため、ＮＥＭとＡＣＯの共存溶液は、長期間にわたって測定試薬としての性能を維持することが困難であるとされ、従来はＮＥＭを強酸性溶液中に保存し、ＡＣＯは凍結乾燥して保存するというように、ＮＥＭとＡＣＯを別々に保存してそれらの安定性を確保するのが一般的であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、酵素を用いたＮＥＦＡ測定法において、第一試薬及び第二試薬を安定化し、長期間にわたって測定の性能を維持できる安定なＮＥＦＡ測定用液状試薬を提供することを目的とする。さらに、本発明は、これらの試薬を用いて、より簡便且つ正確なＮＥＦＡ測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、キレート剤、並びに置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物を第一試薬に共存させることにより、第一試薬を安定化できることを見出した。また、本発明者らは、ＡＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体及びＮＥＭを含み、ＮＥＭの安定化に有効なｐＨを有する第二試薬に、フラビンアデニンジヌクレオチド（以下、ＦＡＤという）、並びに6,6'-ジチオジニコチン酸（以下、ＤＴＤＮという）及び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有させることで第二試薬をさらに安定化することにも成功して、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、従来成し得なかった長期の保存が可能である、以下の（１）〜（４）の第１の液状試薬、及び（５）〜（８）の第２の液状試薬を提供する。
（１）コエンザイムＡ、アシルコエンザイムＡシンテターゼおよびＡＴＰを含む液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに当該試薬の安定化に有効な量の、置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物をさらに含有する、安定化された液状試薬。
（２）キレート剤としてジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸を少なくとも含む、上記（１）記載の液状試薬。
（３）置換α−シクロデキストリンを少なくとも含む、上記（１）又は（２）記載の液状試薬。
（４）置換α−シクロデキストリンが2,6-ジ-O-メチル-α-シクロデキストリン及び／又は6-O-α-D-マルトシル-α-シクロデキストリンである、上記（３）記載の液状試薬。
（５）アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体およびＮ−エチルマレイミドを含み、Ｎ−エチルマレイミドの安定化に有効なｐＨを有する液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該試薬の安定化に有効な量の6,6'-ジチオジニコチン酸及び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有する、安定化された液状試薬。
（６）フェロシアン化カリウムの濃度が0.12mg/100mL以上である、上記（５）記載の液状試薬。
（７）6,6'-ジチオジニコチン酸の濃度が0.4mmol/L以上である、上記（５）又は（６）記載の液状試薬。
（８）陰イオン性界面活性剤をさらに含有する、上記（５）〜（７）のいずれかに記載の液状試薬。
【０００８】
また、本発明は、従来成し得なかった長期の保存が可能である、以下の遊離脂肪酸測定用キットを提供する。
（９）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の液状試薬、並びにアシルコエンザイムＡを定量するための試薬を含む、遊離脂肪酸測定用キット。
（１０）アシルコエンザイムＡを定量するための試薬が、上記（５）〜（８）のいずれかに記載の液状試薬である、上記（９）記載のキット。
（１１）遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに変換する反応用の試薬、並びに上記（５）〜（８）のいずれかに記載の液状試薬を含む、遊離脂肪酸測定用キット。
【０００９】
また、本発明は、試薬の製造における以下の試薬安定化法を提供する。
（１２）コエンザイムＡ、アシルコエンザイムＡシンテターゼおよびＡＴＰを含む試薬溶液に、当該試薬の安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに当該試薬の安定化に有効な量の、置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物を添加することを特徴とする、該試薬溶液を遊離脂肪酸測定用液状試薬として使用し得る程度に安定化する方法。
（１３）キレート剤としてジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸を少なくとも含む、上記（１２）記載の方法。
（１４）少なくとも置換α−シクロデキストリンを添加する、上記（１２）又は（１３）記載の方法。
（１５）置換α−シクロデキストリンが2,6-ジ-O-メチル-α-シクロデキストリン及び／又は6-O-α-D-マルトシル-α-シクロデキストリンである、上記（１４）記載の方法。
（１６）アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体およびＮ−エチルマレイミドを含む試薬溶液に、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該試薬の安定化に有効な量の6,6'-ジチオジニコチン酸及び／又はフェロシアン化カリウムを添加し、且つ当該溶液をＮ−エチルマレイミドの安定化に有効なｐＨに調整することを特徴とする、該試薬溶液を遊離脂肪酸測定用液状試薬として使用し得る程度に安定化する方法。
（１７）フェロシアン化カリウムの濃度が0.12mg/100mL以上である、上記（１６）記載の方法。
（１８）6,6'-ジチオジニコチン酸の濃度が0.4mmol/L以上である、上記（１６）又は（１７）記載の方法。
（１９）陰イオン性界面活性剤をさらに添加することを特徴とする、上記（１６）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
【００１０】
さらに、本発明は、以下の遊離脂肪酸の測定方法を提供する。
（２０）試料に、上記（１）〜（４）のいずれかの液状試薬、及びアシルコエンザイムＡを定量するための試薬を順次添加し、アシルコエンザイムＡ量を計測することを特徴とする、試料中の遊離脂肪酸の測定方法。
（２１）アシルコエンザイムＡを定量するための試薬が、上記（５）〜（８）のいずれかの液状試薬である、上記（２０）記載の方法。
（２２）試料に、遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに変換する反応用の試薬、及び上記（５）〜（８）のいずれかに記載の液状試薬を順次添加し、ペルオキシダーゼの反応による発色を計測することを特徴とする、試料中の遊離脂肪酸の測定方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の第１液状試薬は、ＣｏＡ、ＡＣＳ、ＡＴＰ及び１種以上のキレート剤に加え、置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物をさらに含有する。第１液状試薬は、ＣｏＡ、ＡＣＳ、ＡＴＰ及び１種以上のキレート剤でも安定化が可能であるが、置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物をさらに含有することで格別に安定化される。ＣｏＡの濃度は、該溶液が使用される酵素反応に適した範囲であれば特に制限はない。本発明に使用されるキレート剤としては、一般的に用いられる任意のキレートが使用されるが、好ましくは、例えば、ジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸（以下、ＤＴＰＡという）、トリエチレンテトラミン-N,N,N',N'',N''',N'''-六酢酸およびO,O'-ビス(2-アミノエチル)エチレングリコール-N,N,N',N'-四酢酸等が使用される。キレート剤としては、１種の化合物を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。より好ましくは、本発明に使用されるキレート剤は少なくともＤＴＰＡを含むものである。キレート剤の濃度は、ＣｏＡを安定化するのに有効な量であれば特に制限はなく、使用するキレート剤の種類によっても異なるが、例えば、ＤＴＰＡ単独の場合、0.1mmol/L以上で且つ保存温度で析出しない濃度が挙げられる。ＤＴＰＡは、ＮＥＦＡ測定用の第１液状試薬の調製に用いられる場合、同時に添加される２価金属イオンより低い濃度であればよい。より好ましくは、ＤＴＰＡの使用濃度は0.25〜10mmol/Lである。
【００１２】
第１液状試薬中に含まれる置換α−シクロデキストリンの濃度は、0.1〜10g/100mL、好ましくは1〜5g/100mLである。同様に、マンニトールの濃度は、0.1〜10g/100mL、好ましくは1〜5g/100mLであり、トレハロースの濃度は、0.1〜10g/100mL、好ましくは1〜5g/100mLである。本発明の第１液状試薬に使用される置換α−シクロデキストリンとしては、１以上の置換基を有する任意のα−シクロデキストリンが挙げられる。置換基としては、炭化水素基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル）、芳香族基（複素環基等を含む）、糖（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖等（鎖状又は分枝状でもよい））、アミノ酸（ペプチドを含む）及び脂質等の任意の天然又は合成化合物の置換基が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、置換α−シクロデキストリンは、2,6-ジ-O-メチル-α-シクロデキストリン又は6-O-α-D-マルトシル-α-シクロデキストリンである。これら置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースは、第１液状試薬中に単独で存在してもよいし、組み合わされて存在してもよい。尚、ここで第１液状試薬に関して「安定化に有効な量」とは、例えば、実用試験において、液状試薬を苛酷条件下（３７℃，１６日間）で保存後も液状試薬としての性能を担保し得るのに有効な量を意味する。また、第１液状試薬に関して「安定化された」とは、実用試験において液状試薬を上記苛酷条件下で保存後、調製直後の約６０％、より好ましくは約６５％以上の反応性残存率を保持することをいい、特に約６５％以上の反応性残存率を保持する場合に「格別に安定化された」という。この「安定化に有効な量」は、各化合物に対して個別に考慮されるべきではなく、第１液状試薬がそれぞれ異なった量の複数の化合物を含む場合、それら各化合物の効果の総和により第１液状試薬の「安定化」が達成されれば「安定化に有効な量」と解釈する。
【００１３】
本発明の第１液状試薬のｐＨは、ＡＣＳの反応に適した範囲であり、ＣｏＡおよび他の含有成分に悪影響を及ぼさず、且つキレート剤、並びに置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物による該試薬の安定化に適した範囲である限り特に制限はない。例えば、ｐＨは、６．５〜８．０であり、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、グッド(Good's)緩衝液等のこの範囲に緩衝能を有する緩衝液に各成分を溶解することにより、所望のｐＨを有する第１液状試薬を得ることができる。
【００１４】
本発明第１液状試薬中に含まれるＡＣＳおよびＡＴＰの濃度は、試料中のＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換するのに十分な量であれば特に制限はない。また、ＡＣＳは２価カチオン要求性であるので、本発明のＮＥＦＡ測定用第一試薬は、Ｍｇ++、Ｍｎ++等の２価金属イオンをさらに含有する。該２価金属イオンの濃度はＣｏＡ含有溶液に添加されるキレート剤よりも高濃度であって、ＡＣＳがＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換するのに十分な濃度であれば特に制限はない。
【００１５】
本発明の第２液状試薬は、ＡＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体及びＮＥＭを含み、ＮＥＭの安定化に有効なｐＨを有し、そして当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該試薬の安定化に有効な量のＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有する。第２液状試薬は、ＡＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体及びＮＥＭを含み、ＮＥＭの安定化に有効なｐＨを有し、そしてＦＡＤを含むことで安定化が可能であるが、ＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有することで格別に安定化される。ＡＣＯの濃度は、該溶液が使用される酵素反応に適した範囲であれば特に制限はなく、例えば、１〜２００Ｕ／ｍＬである。
【００１６】
ペルオキシダーゼは過酸化水素を利用して発色性基質である水素供与体を酸化し得る酵素であれば特に制限はなく、例えば、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）等が挙げられる。水素供与体はペルオキシダーゼによって酸化され４−アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリンなどの適当なカップラーとともに発色物質を生成するものであれば特に制限はなく、例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン、Ｎ−ブチル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｏ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｐ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＨＡＬＰＳ）、ｐ−クロロフェノール、ｐ−ブロモフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｎ−（３−スルホプロピル）３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’、４”−トリアミノトリフェニルメタンなどが挙げられる。
【００１７】
ＮＥＭの濃度は、ペルオキシダーゼによる発色の退色防止に有効な量であり、ＡＣＯの反応に悪影響を及ぼさない限り特に制限はなく、例えば0.1〜20mmol/Lである。本発明の第２液状試薬のｐＨは、第２液状試薬安定化剤を配合することにより酸性側に拡がったＡＣＯの安定ｐＨ範囲内で、ＮＥＭの安定化に有効なｐＨに調整される。好ましくは、本発明の第２液状試薬のｐＨは５．５〜６．８、より好ましくは５．８〜６．４であり、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、グッド(Good's)緩衝液等のこの範囲に緩衝能を有する緩衝液に各成分を溶解することにより、所望のｐＨを有する第２液状試薬を得ることができる。尚、ここで「ＮＥＭを安定化するのに有効なｐＨ」とは、後述する第２液状試薬の安定化を達成し得るに十分な程度にＮＥＭの安定性を担保し得るｐＨを意味する。
【００１８】
本発明の第２液状試薬は、必須の安定化剤としてＦＡＤを含有する。ＦＡＤの使用濃度は第２液状試薬を安定化するのに有効な量であれば特に制限はないが、例えば、10μmol/L以上、より好ましくは100〜2000μmol/Lの濃度が挙げられる。尚、ここで第２液状試薬に関して「安定化に有効な量」とは、例えば、実用試験において、液状試薬を苛酷条件下（３７℃，１６日間、２２日間又は２９日間）で保存後も液状試薬としての性能を担保し得るのに有効な量を意味する。また、第２液状試薬に関して「安定化された」とは、実用試験において、液状試薬を３７℃で１６日間保存後、調製直後の約７０％、好ましくは約７５％、より好ましくは約８０％以上の反応性残存率を保持することをいい、特に、約７５％以上の反応性残存率を保持する場合に「格別に安定化された」という。また、３７℃で２２日間保存後では、調製直後の約７０％、好ましくは約７５％、より好ましくは約８０％以上の反応性残存率を保持することをいい、特に、約７５％以上の反応性残存率を保持する場合に「格別に安定化された」という。また、３７℃で２９日間保存後では、調製直後の約６０％、好ましくは約６５％以上の反応性残存率を保持することをいい、特に、約６５％以上の反応性残存率を保持する場合に「格別に安定化された」という。この「安定化に有効な量」は、ＦＡＤ単独の効果として考慮されるべきではなく、第２液状試薬にともに含有されるＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウム（必要に応じてさらに界面活性剤）との効果の総和により第２液状試薬の「安定化」が達成されれば「安定化に有効な量」と解釈する。
【００１９】
本発明の第２液状試薬は、ＦＡＤに加えてＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムを安定化剤としてさらに含有する。ＤＴＤＮの使用濃度は、第２液状試薬を安定化するのに有効な量であれば特に制限はなく、例えば、0.4mmol/L以上、より好ましくは0.8〜5mmol/Lである。フェロシアン化カリウムの使用濃度も第２液状試薬を安定化するのに有効な量であれば特に制限はなく、例えば、0.12mg/100mL以上、より好ましくは0.35〜2.8mg/100mLである。ここで「安定化に有効な量」とは、上記ＦＡＤについて定義したのと同様であり、これらの量は各化合物単独の効果として捉えるべきではなく、第２液状試薬にともに含有されるＦＡＤとの効果の総和により、また、ＤＴＤＮとフェロシアン化カリウムをともに含む場合にはこれら両者とＦＡＤとの効果の総和により、さらに界面活性剤を含有する場合はさらに界面活性剤の効果との総和により、第２液状試薬の安定化が達成されれば、各安定化剤はそれぞれ「安定化に有効な量」であると解するものとする。
【００２０】
好ましくは、本発明の第２液状試薬は、ＦＡＤに加えてＤＴＤＮとフェロシアン化カリウムの両方を安定化剤として含有する。
【００２１】
好ましい実施態様においては、第２液状試薬は界面活性剤をさらに含有する。界面活性剤の共存により第２液状試薬の安定性がより高められる。界面活性剤の種類はＡＣＯ及びペルオキシダーゼの反応を阻害しない限り特に限定されないが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、より好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンジアルキルアリルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンアルケニルアリルエーテル硫酸およびそれらの塩であり、これらのうちの１種を単独で使用してもよいし、２種以上を混合して使用してもよい。より具体的には、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩［例：ハイテノール１８Ｅ（第一工業製薬（株）製）；エマール２０Ｃおよび２０Ａ，レベノールＷＸ（以上、花王（株）製）］、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩［例：ハイテノールＮ−１７（第一工業製薬（株）製）；エマールＮＣ，レベノールＷＺ（以上、花王（株）製）］、ポリオキシエチレンジアルキルアリルエーテル硫酸塩［例：ハイテノールＮＥ−１５（第一工業製薬（株）製）］、ポリオキシエチレンアルケニルアリルエーテル硫酸塩［例：ハイテノールＮＦ−１３（第一工業製薬（株）製）］等が挙げられる。界面活性剤の使用濃度も第２液状試薬を安定化するのに有効な量で且つＡＣＯ及びペルオキシダーゼの反応及び測定に悪影響を及ぼさない範囲であれば特に制限はなく、界面活性剤の種類によっても異なるが、例えば、ハイテノール１８Ｅの場合、50mg/100mL以上、好ましくは100〜1000mg/100mLである。
【００２２】
界面活性剤の添加により、同時に溶液の濁り防止が達成される。例えば、ハイテノール１８Ｅを用いた場合、濁り防止効果は50mg/100mL以上で達成される。
【００２３】
本発明のＮＥＦＡ測定用キットは、本発明の第１液状試薬、および／または第２液状試薬を含む。本発明の第１液状試薬または第２液状試薬のいずれか一方のみを含む場合には、本発明のＮＥＦＡ測定用キットは、例えば、従来公知のＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換する反応用の試薬、又は従来公知のアシルＣｏＡを定量するための試薬とそれぞれ組み合わせてキット化することができる。従来公知のＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換する反応用の試薬は、ＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換するいかなる試薬でもよいが、ＡＣＳを含有する試薬が好ましい。また、従来公知のアシルＣｏＡを定量するための試薬は、アシルＣｏＡを定量可能であるいかなる試薬でもよいが、ＡＣＯを含有する試薬が好ましい。この場合、ＡＣＯの反応により生成する過酸化水素を測定することによりＮＥＦＡの測定が可能となる。過酸化水素は酸素を消費するセンサーを用いて直接測定してもよいし、シュウ酸ジエステルを用いた化学発光、あるいはルミノールとペルオキシダーゼを用いた化学発光によって測定してもよい。
【００２４】
また、本発明は、試薬溶液をＮＥＦＡ測定用液状試薬として使用し得る程度に安定化する方法を提供する。第１液状試薬を安定化する方法は、ＣｏＡ、ＡＣＳ及びＡＴＰを含む試薬溶液に、安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに安定化に有効な量の置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物を添加することを特徴とする。これらキレート剤、並びに置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースを任意の順番で別々に添加してもよいし、又は一旦他の溶液中にこれらを溶解し、その後に試薬溶液に添加してもよい。また添加量は、これらの安定化剤が全体として試薬溶液を安定化する限り特に制限はなく、例えば、本発明の第１液状試薬に関して上記したような量が好ましく用いられる。
【００２５】
本発明の第２液状試薬を安定化する方法は、ＡＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体及びＮＥＭを含む試薬溶液に、安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに安定化に有効な量のＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムを添加し、且つ当該溶液をＮＥＭの安定化に有効なｐＨに調整することを特徴とする。これらＦＡＤ、ＤＴＤＮ及びフェロシアン化カリウムを任意の順番で別々に添加してもよいし、又は一旦他の溶液中にこれらを溶解し、その後に試薬溶液に添加してもよい。また添加量は、これらの安定化剤が全体として試薬溶液を安定化する限り特に制限はなく、例えば、本発明の第２液状試薬に関して上記したような量が好ましく用いられる。また、ｐＨの調整は、添加前でも添加後でもよい。
【００２６】
本発明のＮＥＦＡ測定方法は、試料に、ＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換する反応用の試薬、好ましくは本発明のＮＥＦＡ測定用第１液状試薬を添加して、試料中のＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換し、次いで、アシルＣｏＡを定量するための試薬、好ましくはアシルＣｏＡを酸化して過酸化水素を生成する試薬及び生成した過酸化水素を定量するための試薬を含んでなる試薬、より好ましくは本発明のＮＥＦＡ測定用第２液状試薬を該反応液に添加し、生成したアシルＣｏＡ（過酸化水素）を定量することを特徴とする（但し、少なくとも本発明のＮＥＦＡ測定用の第１または第２液状試薬のいずれか一方を使用する）。本発明のＮＥＦＡ測定用の第１または第２液状試薬を使用しない場合、ＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換する反応用の試薬、並びにアシルＣｏＡを定量するための試薬は、それぞれ従来公知のＮＥＦＡ測定用の第１および第２液状試薬であってよい。
【００２７】
本発明のＮＥＦＡ測定の対象となる試料は、ＮＥＦＡを含有すると考えられる任意の試料である。この試料が、ＮＥＦＡ測定の阻害因子、又は感度、正確性若しくは再現性を低下させる因子を含む場合、試料は、かかる因子を除去するために前処理されてもよい。この試料としては、血液、血清、血漿、リンパ液、胆汁、尿、糞便、唾液、体液（精液、膣液、汗、涙液等を含む）、羊水、滑液、歯肉滲出液、胸膜液、脳室液及び脳脊髄液等の生体試料、生体組織から抽出により得られた液体試料、並びに生体以外から得られる任意の試料が挙げられるがこれらに限定されない。
【実施例】
【００２８】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００２９】
（実施例１ 糖類及びシクロデキストリン添加による第１液状試薬の安定化）
ＮＥＦＡ値 約2300μEq/Lのコントロール血清〔セラクリアLP（(株)アズウェル製）にＮＥＦＡを添加することにより調製したもの〕を実用試験のサンプルとして使用した。試験用ＮＥＦＡ測定第１液状試薬として、60mmol/L トリスヒドロキシメチルアミノメタン（以下、Trisという）、1.1mmol/L 4-アミノアンチピリン、1.2mmol/L アデノシン5'-三リン酸二ナトリウム三水和物（オリエンタル酵母(株)製）、1.2mmol/L コエンザイムＡ三リチウム（オリエンタル酵母(株)製）、0.25U/mL ＡＣＳ（旭化成(株)製）、1mmol/L ＤＴＰＡ（同仁化学(株)製）、1.25mmol/L 塩化マグネシウムおよび2g/100mLの各種の糖類又はシクロデキストリンを含有するｐＨ７．６の溶液を調製し、３７℃で１６日間保存した。ＮＥＦＡ測定第２液状試薬として、ネスコートNEFA-V2（ＮＥＦＡ測定自動分析用キット；(株)アズウェル製）のＲ２を、能書に従って用事調製して用いた。各種糖類又はシクロデキストリンを添加した試験用第１液状試薬の反応性は、日立７１７０自動分析装置を用いて以下のようにして測定した。試料3μlに第１液状試薬200μlを添加し、３７℃で５分間反応後、ネスコートNEFA-V2のＲ２ 50μlを添加して、さらに３７℃、５分間反応させ、主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで、測光ポイント１６から３４の吸光度変化を求めた。試験用第１液状試薬の調製当日と、３７℃にて１６日間保存後のものについて上記操作により試料を測定し、調製当日の試験用第１液状試薬の反応性を１００％として、３７℃にて１６日間保存後のものの反応率（％）を求めた。結果を表１に示す。表１の結果から、2,6-ジ-O-メチル-α-シクロデキストリン、6-O-α-D-マルトシル-α-シクロデキストリン等の置換α-シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースが無添加のコントロールと比較して高い反応性残存率を保持していることが明らかになった。
【００３０】
【表１】
【００３１】
（実施例２ フェロシアン化カリウム添加による第２液状試薬の安定化）
ＮＥＦＡ値 約2300μEq/Lのコントロール血清〔セラクリアLP（(株)アズウェル製）にＮＥＦＡを添加することにより調製したもの〕を実用試験のサンプルとして使用した。ＮＥＦＡ測定第１液状試薬として、ネスコートNEFA-V2（ＮＥＦＡ測定自動分析用キット；(株)アズウェル製）のＲ１を、能書に従って用事調製して用いた。試験用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬として、10mmol/Lリン酸緩衝液、6mg/mL ＴＯＯＳ、4mmol/L ＮＥＭ、2mmol/L ＦＡＤ、500mg/100mL ハイテノール18E、1U/mL ＨＲＰ（東洋紡績(株)製）、60U/mL ＡＣＯ（旭化成(株)製）、及び0.12〜2.80mg/100mL フェロシアン化カリウムを含有するｐＨ６．０の溶液を調製し、３７℃で１６日間保存した。試料3μlにネスコートNEFA-V2のＲ１ 200μlを添加し、３７℃で５分間反応後、試験用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬50μlを添加して、さらに３７℃、５分間反応させ、主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定ポイント１６から３４の吸光度変化を求めた。試験用第２液状試薬の調製当日と、３７℃にて１６日間保存後のものについて上記操作により試料を測定し、調製当日の試験用第２液状試薬の反応性を１００％として、３７℃にて１６日間保存後のものの反応率（％）を求めた。結果を表２に示す。表２の結果から、フェロシアン化カリウムを第２液状試薬に添加すると、用量依存的な様式で安定性を向上することが明らかとなった。
【００３２】
【表２】
【００３３】
（実施例３ フェロシアン化カリウム存在下の各種の化合物添加による第２液状試薬の安定化）
ＮＥＦＡ値 約2300μEq/Lのコントロール血清〔セラクリアLP（(株)アズウェル製）にＮＥＦＡを添加することにより調製したもの〕を実用試験のサンプルとして使用した。ＮＥＦＡ測定第１液状試薬として、ネスコートNEFA-V2（ＮＥＦＡ測定自動分析用キット；(株)アズウェル製）のＲ１を、能書に従って用事調製して用いた。試験用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬として、10mmol/Lリン酸緩衝液、6mg/mL ＴＯＯＳ、4mmol/L ＮＥＭ、2mmol/L ＦＡＤ、500mg/100mL ハイテノール18E、2.80mg/100mL フェロシアン化カリウム、1U/mL ＨＲＰ（東洋紡績(株)製）、60U/mL ＡＣＯ（旭化成(株)製）、及び1mmol/L 各種の化合物を含有するｐＨ６．０の溶液を調製し、３７℃で２２日間保存した。試験用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬の反応性を実施例２に記載の方法で測定した。試験用第２液状試薬の調製当日と、３７℃にて２２日間保存後のものについて上記操作により試料を測定し、調製当日の試験用第２液状試薬の反応性を１００％として、３７℃にて２２日間保存後のものの反応率（％）を求めた。結果を表３に示す。表３の結果は、ＤＴＤＮの添加のみが第２液状試薬の安定性を向上させたことを示す。従って、ＤＴＤＮの上記のような優れた長期間の安定化効果についてさらに検討した。
【００３４】
【表３】
【００３５】
（実施例４ フェロシアン化カリウム存在下の第２液状試薬に対するＤＴＤＮの用量依存的な安定化効果）
ＮＥＦＡ値 約2300μEq/Lのコントロール血清〔セラクリアLP（(株)アズウェル製）にＮＥＦＡを添加することにより調製したもの〕を実用試験のサンプルとして使用した。ＮＥＦＡ測定第１液状試薬として、ネスコートNEFA-V2（ＮＥＦＡ測定自動分析用キット；(株)アズウェル製）のＲ１を、能書に従って用事調製して用いた。試験用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬として、10mmol/Lリン酸緩衝液、6mg/mL ＴＯＯＳ、4mmol/L ＮＥＭ、2mmol/L ＦＡＤ、500mg/100mL ハイテノール18E、2.80mg/100mL フェロシアン化カリウム、1U/mL HRP（東洋紡績(株)製）、60U/mL ＡＣＯ（旭化成(株)製）、及び0.2〜5.0mmol/L ＤＴＤＮを含有するｐＨ６．０の溶液を調製し、３７℃で２９日間保存した。試験用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬の反応性を実施例２に記載の方法で測定した。試験用第２液状試薬の調製当日と、３７℃にて２９日間保存後のものについて上記操作により試料を測定し、調製当日の試験用第２液状試薬の反応性を１００％として、３７℃にて２９日間保存後のものの反応率（％）を求めた。結果を表４に示す。表４の結果から、ＤＴＤＮが用量依存的に第２液状試薬を安定化することが明らかになった。特に、ＤＴＤＮは、第２液状試薬中、約1.0〜3.0mmol/Lの濃度で顕著な安定化効果を示すことが明らかとなった。
【００３６】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００３７】
上述のように、第１液状試薬安定化剤として、１種以上のキレート剤、並びに置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物を第１液状試薬に添加することにより、ＮＥＦＡ測定における第１液状試薬の性能を液状で長期にわたって安定化することができる。また、第２液状試薬安定化剤として、ＦＡＤ、並びにＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムを第２液状試薬に添加することによりＮＥＦＡ測定における第２液状試薬の性能を液状で長期にわたって安定化することができる。さらにこれら第１及び第２液状試薬を用いることにより、液状で長期間安定なＮＥＦＡ測定用キットを提供することが可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液状で長期保存可能であり、かつ遊離脂肪酸（以下、ＮＥＦＡという）を測定可能である、コエンザイムＡ（以下、ＣｏＡという）、アシルコエンザイムＡシンテターゼ（以下、ＡＣＳという）及びＡＴＰを含む第１の液状試薬、並びにアシルコエンザイムＡオキシダーゼ（以下、ＡＣＯという）、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体及びＮ−エチルマレイミド（以下、ＮＥＭという）を含む第２の液状試薬、それらの製造における安定化方法、それらを備えるＮＥＦＡ測定用キット、並びにそれらを用いたＮＥＦＡ測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の自動分析試薬の市販キットは、凍結乾燥品と溶解液の組み合わせとして供給され、使用時に溶解して測定に用いてきた。ところが、凍結乾燥品の場合、試薬調製の煩雑さに加えて、調製時のミスにより誤った測定結果が得られたり、溶解後の有効期間が短い（安定性に欠ける）といった問題があった。従って、最近の臨床検査においては、そのような問題を回避すべく、液状試薬の使用が主流となってきている。
【０００３】
ＮＥＦＡの定量法として、まず第一試薬中で、Ｍｇ++やＭｎ++等の２価金属イオンおよびアデノシン５'-三リン酸（以下、ＡＴＰという）の共存下でＡＣＳの作用により、ＣｏＡと試料中のＮＥＦＡからアシルＣｏＡを産生させる第一工程、および第二試薬中で、ＡＣＯの作用によりアシルＣｏＡを酸化することにより生じる過酸化水素を、ＮＥＭの存在下でペルオキシダーゼと発色性基質とを組み合わせて定量する第二工程からなる方法が広く採用されている。
【０００４】
しかしながら、ＮＥＦＡ測定試薬には不安定な成分が多く含まれるため、液状化は困難であるとされてきた。例えば、ＣｏＡを含む従来公知のＮＥＦＡ測定用第一試薬は、一旦溶解してしまうと、その有効期間は冷蔵で５〜１５日程度であった。
さらに、ＮＥＭは中性付近より高ｐＨの領域では不安定となり、またＡＣＯはＮＥＭによって変性を受けるため、一旦ＮＥＭとＡＣＯとを中性付近の溶液中で共存させると、両者とも急激に安定性が低下してしまう。そのため、ＮＥＭとＡＣＯの共存溶液は、長期間にわたって測定試薬としての性能を維持することが困難であるとされ、従来はＮＥＭを強酸性溶液中に保存し、ＡＣＯは凍結乾燥して保存するというように、ＮＥＭとＡＣＯを別々に保存してそれらの安定性を確保するのが一般的であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、酵素を用いたＮＥＦＡ測定法において、第一試薬及び第二試薬を安定化し、長期間にわたって測定の性能を維持できる安定なＮＥＦＡ測定用液状試薬を提供することを目的とする。さらに、本発明は、これらの試薬を用いて、より簡便且つ正確なＮＥＦＡ測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、キレート剤、並びに置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物を第一試薬に共存させることにより、第一試薬を安定化できることを見出した。また、本発明者らは、ＡＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体及びＮＥＭを含み、ＮＥＭの安定化に有効なｐＨを有する第二試薬に、フラビンアデニンジヌクレオチド（以下、ＦＡＤという）、並びに6,6'-ジチオジニコチン酸（以下、ＤＴＤＮという）及び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有させることで第二試薬をさらに安定化することにも成功して、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、従来成し得なかった長期の保存が可能である、以下の（１）〜（４）の第１の液状試薬、及び（５）〜（８）の第２の液状試薬を提供する。
（１）コエンザイムＡ、アシルコエンザイムＡシンテターゼおよびＡＴＰを含む液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに当該試薬の安定化に有効な量の、置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物をさらに含有する、安定化された液状試薬。
（２）キレート剤としてジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸を少なくとも含む、上記（１）記載の液状試薬。
（３）置換α−シクロデキストリンを少なくとも含む、上記（１）又は（２）記載の液状試薬。
（４）置換α−シクロデキストリンが2,6-ジ-O-メチル-α-シクロデキストリン及び／又は6-O-α-D-マルトシル-α-シクロデキストリンである、上記（３）記載の液状試薬。
（５）アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体およびＮ−エチルマレイミドを含み、Ｎ−エチルマレイミドの安定化に有効なｐＨを有する液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該試薬の安定化に有効な量の6,6'-ジチオジニコチン酸及び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有する、安定化された液状試薬。
（６）フェロシアン化カリウムの濃度が0.12mg/100mL以上である、上記（５）記載の液状試薬。
（７）6,6'-ジチオジニコチン酸の濃度が0.4mmol/L以上である、上記（５）又は（６）記載の液状試薬。
（８）陰イオン性界面活性剤をさらに含有する、上記（５）〜（７）のいずれかに記載の液状試薬。
【０００８】
また、本発明は、従来成し得なかった長期の保存が可能である、以下の遊離脂肪酸測定用キットを提供する。
（９）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の液状試薬、並びにアシルコエンザイムＡを定量するための試薬を含む、遊離脂肪酸測定用キット。
（１０）アシルコエンザイムＡを定量するための試薬が、上記（５）〜（８）のいずれかに記載の液状試薬である、上記（９）記載のキット。
（１１）遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに変換する反応用の試薬、並びに上記（５）〜（８）のいずれかに記載の液状試薬を含む、遊離脂肪酸測定用キット。
【０００９】
また、本発明は、試薬の製造における以下の試薬安定化法を提供する。
（１２）コエンザイムＡ、アシルコエンザイムＡシンテターゼおよびＡＴＰを含む試薬溶液に、当該試薬の安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに当該試薬の安定化に有効な量の、置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物を添加することを特徴とする、該試薬溶液を遊離脂肪酸測定用液状試薬として使用し得る程度に安定化する方法。
（１３）キレート剤としてジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸を少なくとも含む、上記（１２）記載の方法。
（１４）少なくとも置換α−シクロデキストリンを添加する、上記（１２）又は（１３）記載の方法。
（１５）置換α−シクロデキストリンが2,6-ジ-O-メチル-α-シクロデキストリン及び／又は6-O-α-D-マルトシル-α-シクロデキストリンである、上記（１４）記載の方法。
（１６）アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体およびＮ−エチルマレイミドを含む試薬溶液に、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該試薬の安定化に有効な量の6,6'-ジチオジニコチン酸及び／又はフェロシアン化カリウムを添加し、且つ当該溶液をＮ−エチルマレイミドの安定化に有効なｐＨに調整することを特徴とする、該試薬溶液を遊離脂肪酸測定用液状試薬として使用し得る程度に安定化する方法。
（１７）フェロシアン化カリウムの濃度が0.12mg/100mL以上である、上記（１６）記載の方法。
（１８）6,6'-ジチオジニコチン酸の濃度が0.4mmol/L以上である、上記（１６）又は（１７）記載の方法。
（１９）陰イオン性界面活性剤をさらに添加することを特徴とする、上記（１６）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
【００１０】
さらに、本発明は、以下の遊離脂肪酸の測定方法を提供する。
（２０）試料に、上記（１）〜（４）のいずれかの液状試薬、及びアシルコエンザイムＡを定量するための試薬を順次添加し、アシルコエンザイムＡ量を計測することを特徴とする、試料中の遊離脂肪酸の測定方法。
（２１）アシルコエンザイムＡを定量するための試薬が、上記（５）〜（８）のいずれかの液状試薬である、上記（２０）記載の方法。
（２２）試料に、遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに変換する反応用の試薬、及び上記（５）〜（８）のいずれかに記載の液状試薬を順次添加し、ペルオキシダーゼの反応による発色を計測することを特徴とする、試料中の遊離脂肪酸の測定方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の第１液状試薬は、ＣｏＡ、ＡＣＳ、ＡＴＰ及び１種以上のキレート剤に加え、置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物をさらに含有する。第１液状試薬は、ＣｏＡ、ＡＣＳ、ＡＴＰ及び１種以上のキレート剤でも安定化が可能であるが、置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物をさらに含有することで格別に安定化される。ＣｏＡの濃度は、該溶液が使用される酵素反応に適した範囲であれば特に制限はない。本発明に使用されるキレート剤としては、一般的に用いられる任意のキレートが使用されるが、好ましくは、例えば、ジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸（以下、ＤＴＰＡという）、トリエチレンテトラミン-N,N,N',N'',N''',N'''-六酢酸およびO,O'-ビス(2-アミノエチル)エチレングリコール-N,N,N',N'-四酢酸等が使用される。キレート剤としては、１種の化合物を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。より好ましくは、本発明に使用されるキレート剤は少なくともＤＴＰＡを含むものである。キレート剤の濃度は、ＣｏＡを安定化するのに有効な量であれば特に制限はなく、使用するキレート剤の種類によっても異なるが、例えば、ＤＴＰＡ単独の場合、0.1mmol/L以上で且つ保存温度で析出しない濃度が挙げられる。ＤＴＰＡは、ＮＥＦＡ測定用の第１液状試薬の調製に用いられる場合、同時に添加される２価金属イオンより低い濃度であればよい。より好ましくは、ＤＴＰＡの使用濃度は0.25〜10mmol/Lである。
【００１２】
第１液状試薬中に含まれる置換α−シクロデキストリンの濃度は、0.1〜10g/100mL、好ましくは1〜5g/100mLである。同様に、マンニトールの濃度は、0.1〜10g/100mL、好ましくは1〜5g/100mLであり、トレハロースの濃度は、0.1〜10g/100mL、好ましくは1〜5g/100mLである。本発明の第１液状試薬に使用される置換α−シクロデキストリンとしては、１以上の置換基を有する任意のα−シクロデキストリンが挙げられる。置換基としては、炭化水素基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル）、芳香族基（複素環基等を含む）、糖（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖等（鎖状又は分枝状でもよい））、アミノ酸（ペプチドを含む）及び脂質等の任意の天然又は合成化合物の置換基が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、置換α−シクロデキストリンは、2,6-ジ-O-メチル-α-シクロデキストリン又は6-O-α-D-マルトシル-α-シクロデキストリンである。これら置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースは、第１液状試薬中に単独で存在してもよいし、組み合わされて存在してもよい。尚、ここで第１液状試薬に関して「安定化に有効な量」とは、例えば、実用試験において、液状試薬を苛酷条件下（３７℃，１６日間）で保存後も液状試薬としての性能を担保し得るのに有効な量を意味する。また、第１液状試薬に関して「安定化された」とは、実用試験において液状試薬を上記苛酷条件下で保存後、調製直後の約６０％、より好ましくは約６５％以上の反応性残存率を保持することをいい、特に約６５％以上の反応性残存率を保持する場合に「格別に安定化された」という。この「安定化に有効な量」は、各化合物に対して個別に考慮されるべきではなく、第１液状試薬がそれぞれ異なった量の複数の化合物を含む場合、それら各化合物の効果の総和により第１液状試薬の「安定化」が達成されれば「安定化に有効な量」と解釈する。
【００１３】
本発明の第１液状試薬のｐＨは、ＡＣＳの反応に適した範囲であり、ＣｏＡおよび他の含有成分に悪影響を及ぼさず、且つキレート剤、並びに置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物による該試薬の安定化に適した範囲である限り特に制限はない。例えば、ｐＨは、６．５〜８．０であり、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、グッド(Good's)緩衝液等のこの範囲に緩衝能を有する緩衝液に各成分を溶解することにより、所望のｐＨを有する第１液状試薬を得ることができる。
【００１４】
本発明第１液状試薬中に含まれるＡＣＳおよびＡＴＰの濃度は、試料中のＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換するのに十分な量であれば特に制限はない。また、ＡＣＳは２価カチオン要求性であるので、本発明のＮＥＦＡ測定用第一試薬は、Ｍｇ++、Ｍｎ++等の２価金属イオンをさらに含有する。該２価金属イオンの濃度はＣｏＡ含有溶液に添加されるキレート剤よりも高濃度であって、ＡＣＳがＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換するのに十分な濃度であれば特に制限はない。
【００１５】
本発明の第２液状試薬は、ＡＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体及びＮＥＭを含み、ＮＥＭの安定化に有効なｐＨを有し、そして当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該試薬の安定化に有効な量のＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有する。第２液状試薬は、ＡＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体及びＮＥＭを含み、ＮＥＭの安定化に有効なｐＨを有し、そしてＦＡＤを含むことで安定化が可能であるが、ＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有することで格別に安定化される。ＡＣＯの濃度は、該溶液が使用される酵素反応に適した範囲であれば特に制限はなく、例えば、１〜２００Ｕ／ｍＬである。
【００１６】
ペルオキシダーゼは過酸化水素を利用して発色性基質である水素供与体を酸化し得る酵素であれば特に制限はなく、例えば、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）等が挙げられる。水素供与体はペルオキシダーゼによって酸化され４−アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリンなどの適当なカップラーとともに発色物質を生成するものであれば特に制限はなく、例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン、Ｎ−ブチル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｏ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｐ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＨＡＬＰＳ）、ｐ−クロロフェノール、ｐ−ブロモフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｎ−（３−スルホプロピル）３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’、４”−トリアミノトリフェニルメタンなどが挙げられる。
【００１７】
ＮＥＭの濃度は、ペルオキシダーゼによる発色の退色防止に有効な量であり、ＡＣＯの反応に悪影響を及ぼさない限り特に制限はなく、例えば0.1〜20mmol/Lである。本発明の第２液状試薬のｐＨは、第２液状試薬安定化剤を配合することにより酸性側に拡がったＡＣＯの安定ｐＨ範囲内で、ＮＥＭの安定化に有効なｐＨに調整される。好ましくは、本発明の第２液状試薬のｐＨは５．５〜６．８、より好ましくは５．８〜６．４であり、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、グッド(Good's)緩衝液等のこの範囲に緩衝能を有する緩衝液に各成分を溶解することにより、所望のｐＨを有する第２液状試薬を得ることができる。尚、ここで「ＮＥＭを安定化するのに有効なｐＨ」とは、後述する第２液状試薬の安定化を達成し得るに十分な程度にＮＥＭの安定性を担保し得るｐＨを意味する。
【００１８】
本発明の第２液状試薬は、必須の安定化剤としてＦＡＤを含有する。ＦＡＤの使用濃度は第２液状試薬を安定化するのに有効な量であれば特に制限はないが、例えば、10μmol/L以上、より好ましくは100〜2000μmol/Lの濃度が挙げられる。尚、ここで第２液状試薬に関して「安定化に有効な量」とは、例えば、実用試験において、液状試薬を苛酷条件下（３７℃，１６日間、２２日間又は２９日間）で保存後も液状試薬としての性能を担保し得るのに有効な量を意味する。また、第２液状試薬に関して「安定化された」とは、実用試験において、液状試薬を３７℃で１６日間保存後、調製直後の約７０％、好ましくは約７５％、より好ましくは約８０％以上の反応性残存率を保持することをいい、特に、約７５％以上の反応性残存率を保持する場合に「格別に安定化された」という。また、３７℃で２２日間保存後では、調製直後の約７０％、好ましくは約７５％、より好ましくは約８０％以上の反応性残存率を保持することをいい、特に、約７５％以上の反応性残存率を保持する場合に「格別に安定化された」という。また、３７℃で２９日間保存後では、調製直後の約６０％、好ましくは約６５％以上の反応性残存率を保持することをいい、特に、約６５％以上の反応性残存率を保持する場合に「格別に安定化された」という。この「安定化に有効な量」は、ＦＡＤ単独の効果として考慮されるべきではなく、第２液状試薬にともに含有されるＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウム（必要に応じてさらに界面活性剤）との効果の総和により第２液状試薬の「安定化」が達成されれば「安定化に有効な量」と解釈する。
【００１９】
本発明の第２液状試薬は、ＦＡＤに加えてＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムを安定化剤としてさらに含有する。ＤＴＤＮの使用濃度は、第２液状試薬を安定化するのに有効な量であれば特に制限はなく、例えば、0.4mmol/L以上、より好ましくは0.8〜5mmol/Lである。フェロシアン化カリウムの使用濃度も第２液状試薬を安定化するのに有効な量であれば特に制限はなく、例えば、0.12mg/100mL以上、より好ましくは0.35〜2.8mg/100mLである。ここで「安定化に有効な量」とは、上記ＦＡＤについて定義したのと同様であり、これらの量は各化合物単独の効果として捉えるべきではなく、第２液状試薬にともに含有されるＦＡＤとの効果の総和により、また、ＤＴＤＮとフェロシアン化カリウムをともに含む場合にはこれら両者とＦＡＤとの効果の総和により、さらに界面活性剤を含有する場合はさらに界面活性剤の効果との総和により、第２液状試薬の安定化が達成されれば、各安定化剤はそれぞれ「安定化に有効な量」であると解するものとする。
【００２０】
好ましくは、本発明の第２液状試薬は、ＦＡＤに加えてＤＴＤＮとフェロシアン化カリウムの両方を安定化剤として含有する。
【００２１】
好ましい実施態様においては、第２液状試薬は界面活性剤をさらに含有する。界面活性剤の共存により第２液状試薬の安定性がより高められる。界面活性剤の種類はＡＣＯ及びペルオキシダーゼの反応を阻害しない限り特に限定されないが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、より好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンジアルキルアリルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンアルケニルアリルエーテル硫酸およびそれらの塩であり、これらのうちの１種を単独で使用してもよいし、２種以上を混合して使用してもよい。より具体的には、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩［例：ハイテノール１８Ｅ（第一工業製薬（株）製）；エマール２０Ｃおよび２０Ａ，レベノールＷＸ（以上、花王（株）製）］、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩［例：ハイテノールＮ−１７（第一工業製薬（株）製）；エマールＮＣ，レベノールＷＺ（以上、花王（株）製）］、ポリオキシエチレンジアルキルアリルエーテル硫酸塩［例：ハイテノールＮＥ−１５（第一工業製薬（株）製）］、ポリオキシエチレンアルケニルアリルエーテル硫酸塩［例：ハイテノールＮＦ−１３（第一工業製薬（株）製）］等が挙げられる。界面活性剤の使用濃度も第２液状試薬を安定化するのに有効な量で且つＡＣＯ及びペルオキシダーゼの反応及び測定に悪影響を及ぼさない範囲であれば特に制限はなく、界面活性剤の種類によっても異なるが、例えば、ハイテノール１８Ｅの場合、50mg/100mL以上、好ましくは100〜1000mg/100mLである。
【００２２】
界面活性剤の添加により、同時に溶液の濁り防止が達成される。例えば、ハイテノール１８Ｅを用いた場合、濁り防止効果は50mg/100mL以上で達成される。
【００２３】
本発明のＮＥＦＡ測定用キットは、本発明の第１液状試薬、および／または第２液状試薬を含む。本発明の第１液状試薬または第２液状試薬のいずれか一方のみを含む場合には、本発明のＮＥＦＡ測定用キットは、例えば、従来公知のＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換する反応用の試薬、又は従来公知のアシルＣｏＡを定量するための試薬とそれぞれ組み合わせてキット化することができる。従来公知のＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換する反応用の試薬は、ＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換するいかなる試薬でもよいが、ＡＣＳを含有する試薬が好ましい。また、従来公知のアシルＣｏＡを定量するための試薬は、アシルＣｏＡを定量可能であるいかなる試薬でもよいが、ＡＣＯを含有する試薬が好ましい。この場合、ＡＣＯの反応により生成する過酸化水素を測定することによりＮＥＦＡの測定が可能となる。過酸化水素は酸素を消費するセンサーを用いて直接測定してもよいし、シュウ酸ジエステルを用いた化学発光、あるいはルミノールとペルオキシダーゼを用いた化学発光によって測定してもよい。
【００２４】
また、本発明は、試薬溶液をＮＥＦＡ測定用液状試薬として使用し得る程度に安定化する方法を提供する。第１液状試薬を安定化する方法は、ＣｏＡ、ＡＣＳ及びＡＴＰを含む試薬溶液に、安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに安定化に有効な量の置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物を添加することを特徴とする。これらキレート剤、並びに置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースを任意の順番で別々に添加してもよいし、又は一旦他の溶液中にこれらを溶解し、その後に試薬溶液に添加してもよい。また添加量は、これらの安定化剤が全体として試薬溶液を安定化する限り特に制限はなく、例えば、本発明の第１液状試薬に関して上記したような量が好ましく用いられる。
【００２５】
本発明の第２液状試薬を安定化する方法は、ＡＣＯ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体及びＮＥＭを含む試薬溶液に、安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに安定化に有効な量のＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムを添加し、且つ当該溶液をＮＥＭの安定化に有効なｐＨに調整することを特徴とする。これらＦＡＤ、ＤＴＤＮ及びフェロシアン化カリウムを任意の順番で別々に添加してもよいし、又は一旦他の溶液中にこれらを溶解し、その後に試薬溶液に添加してもよい。また添加量は、これらの安定化剤が全体として試薬溶液を安定化する限り特に制限はなく、例えば、本発明の第２液状試薬に関して上記したような量が好ましく用いられる。また、ｐＨの調整は、添加前でも添加後でもよい。
【００２６】
本発明のＮＥＦＡ測定方法は、試料に、ＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換する反応用の試薬、好ましくは本発明のＮＥＦＡ測定用第１液状試薬を添加して、試料中のＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換し、次いで、アシルＣｏＡを定量するための試薬、好ましくはアシルＣｏＡを酸化して過酸化水素を生成する試薬及び生成した過酸化水素を定量するための試薬を含んでなる試薬、より好ましくは本発明のＮＥＦＡ測定用第２液状試薬を該反応液に添加し、生成したアシルＣｏＡ（過酸化水素）を定量することを特徴とする（但し、少なくとも本発明のＮＥＦＡ測定用の第１または第２液状試薬のいずれか一方を使用する）。本発明のＮＥＦＡ測定用の第１または第２液状試薬を使用しない場合、ＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換する反応用の試薬、並びにアシルＣｏＡを定量するための試薬は、それぞれ従来公知のＮＥＦＡ測定用の第１および第２液状試薬であってよい。
【００２７】
本発明のＮＥＦＡ測定の対象となる試料は、ＮＥＦＡを含有すると考えられる任意の試料である。この試料が、ＮＥＦＡ測定の阻害因子、又は感度、正確性若しくは再現性を低下させる因子を含む場合、試料は、かかる因子を除去するために前処理されてもよい。この試料としては、血液、血清、血漿、リンパ液、胆汁、尿、糞便、唾液、体液（精液、膣液、汗、涙液等を含む）、羊水、滑液、歯肉滲出液、胸膜液、脳室液及び脳脊髄液等の生体試料、生体組織から抽出により得られた液体試料、並びに生体以外から得られる任意の試料が挙げられるがこれらに限定されない。
【実施例】
【００２８】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００２９】
（実施例１ 糖類及びシクロデキストリン添加による第１液状試薬の安定化）
ＮＥＦＡ値 約2300μEq/Lのコントロール血清〔セラクリアLP（(株)アズウェル製）にＮＥＦＡを添加することにより調製したもの〕を実用試験のサンプルとして使用した。試験用ＮＥＦＡ測定第１液状試薬として、60mmol/L トリスヒドロキシメチルアミノメタン（以下、Trisという）、1.1mmol/L 4-アミノアンチピリン、1.2mmol/L アデノシン5'-三リン酸二ナトリウム三水和物（オリエンタル酵母(株)製）、1.2mmol/L コエンザイムＡ三リチウム（オリエンタル酵母(株)製）、0.25U/mL ＡＣＳ（旭化成(株)製）、1mmol/L ＤＴＰＡ（同仁化学(株)製）、1.25mmol/L 塩化マグネシウムおよび2g/100mLの各種の糖類又はシクロデキストリンを含有するｐＨ７．６の溶液を調製し、３７℃で１６日間保存した。ＮＥＦＡ測定第２液状試薬として、ネスコートNEFA-V2（ＮＥＦＡ測定自動分析用キット；(株)アズウェル製）のＲ２を、能書に従って用事調製して用いた。各種糖類又はシクロデキストリンを添加した試験用第１液状試薬の反応性は、日立７１７０自動分析装置を用いて以下のようにして測定した。試料3μlに第１液状試薬200μlを添加し、３７℃で５分間反応後、ネスコートNEFA-V2のＲ２ 50μlを添加して、さらに３７℃、５分間反応させ、主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで、測光ポイント１６から３４の吸光度変化を求めた。試験用第１液状試薬の調製当日と、３７℃にて１６日間保存後のものについて上記操作により試料を測定し、調製当日の試験用第１液状試薬の反応性を１００％として、３７℃にて１６日間保存後のものの反応率（％）を求めた。結果を表１に示す。表１の結果から、2,6-ジ-O-メチル-α-シクロデキストリン、6-O-α-D-マルトシル-α-シクロデキストリン等の置換α-シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースが無添加のコントロールと比較して高い反応性残存率を保持していることが明らかになった。
【００３０】
【表１】
【００３１】
（実施例２ フェロシアン化カリウム添加による第２液状試薬の安定化）
ＮＥＦＡ値 約2300μEq/Lのコントロール血清〔セラクリアLP（(株)アズウェル製）にＮＥＦＡを添加することにより調製したもの〕を実用試験のサンプルとして使用した。ＮＥＦＡ測定第１液状試薬として、ネスコートNEFA-V2（ＮＥＦＡ測定自動分析用キット；(株)アズウェル製）のＲ１を、能書に従って用事調製して用いた。試験用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬として、10mmol/Lリン酸緩衝液、6mg/mL ＴＯＯＳ、4mmol/L ＮＥＭ、2mmol/L ＦＡＤ、500mg/100mL ハイテノール18E、1U/mL ＨＲＰ（東洋紡績(株)製）、60U/mL ＡＣＯ（旭化成(株)製）、及び0.12〜2.80mg/100mL フェロシアン化カリウムを含有するｐＨ６．０の溶液を調製し、３７℃で１６日間保存した。試料3μlにネスコートNEFA-V2のＲ１ 200μlを添加し、３７℃で５分間反応後、試験用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬50μlを添加して、さらに３７℃、５分間反応させ、主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定ポイント１６から３４の吸光度変化を求めた。試験用第２液状試薬の調製当日と、３７℃にて１６日間保存後のものについて上記操作により試料を測定し、調製当日の試験用第２液状試薬の反応性を１００％として、３７℃にて１６日間保存後のものの反応率（％）を求めた。結果を表２に示す。表２の結果から、フェロシアン化カリウムを第２液状試薬に添加すると、用量依存的な様式で安定性を向上することが明らかとなった。
【００３２】
【表２】
【００３３】
（実施例３ フェロシアン化カリウム存在下の各種の化合物添加による第２液状試薬の安定化）
ＮＥＦＡ値 約2300μEq/Lのコントロール血清〔セラクリアLP（(株)アズウェル製）にＮＥＦＡを添加することにより調製したもの〕を実用試験のサンプルとして使用した。ＮＥＦＡ測定第１液状試薬として、ネスコートNEFA-V2（ＮＥＦＡ測定自動分析用キット；(株)アズウェル製）のＲ１を、能書に従って用事調製して用いた。試験用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬として、10mmol/Lリン酸緩衝液、6mg/mL ＴＯＯＳ、4mmol/L ＮＥＭ、2mmol/L ＦＡＤ、500mg/100mL ハイテノール18E、2.80mg/100mL フェロシアン化カリウム、1U/mL ＨＲＰ（東洋紡績(株)製）、60U/mL ＡＣＯ（旭化成(株)製）、及び1mmol/L 各種の化合物を含有するｐＨ６．０の溶液を調製し、３７℃で２２日間保存した。試験用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬の反応性を実施例２に記載の方法で測定した。試験用第２液状試薬の調製当日と、３７℃にて２２日間保存後のものについて上記操作により試料を測定し、調製当日の試験用第２液状試薬の反応性を１００％として、３７℃にて２２日間保存後のものの反応率（％）を求めた。結果を表３に示す。表３の結果は、ＤＴＤＮの添加のみが第２液状試薬の安定性を向上させたことを示す。従って、ＤＴＤＮの上記のような優れた長期間の安定化効果についてさらに検討した。
【００３４】
【表３】
【００３５】
（実施例４ フェロシアン化カリウム存在下の第２液状試薬に対するＤＴＤＮの用量依存的な安定化効果）
ＮＥＦＡ値 約2300μEq/Lのコントロール血清〔セラクリアLP（(株)アズウェル製）にＮＥＦＡを添加することにより調製したもの〕を実用試験のサンプルとして使用した。ＮＥＦＡ測定第１液状試薬として、ネスコートNEFA-V2（ＮＥＦＡ測定自動分析用キット；(株)アズウェル製）のＲ１を、能書に従って用事調製して用いた。試験用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬として、10mmol/Lリン酸緩衝液、6mg/mL ＴＯＯＳ、4mmol/L ＮＥＭ、2mmol/L ＦＡＤ、500mg/100mL ハイテノール18E、2.80mg/100mL フェロシアン化カリウム、1U/mL HRP（東洋紡績(株)製）、60U/mL ＡＣＯ（旭化成(株)製）、及び0.2〜5.0mmol/L ＤＴＤＮを含有するｐＨ６．０の溶液を調製し、３７℃で２９日間保存した。試験用ＮＥＦＡ測定第２液状試薬の反応性を実施例２に記載の方法で測定した。試験用第２液状試薬の調製当日と、３７℃にて２９日間保存後のものについて上記操作により試料を測定し、調製当日の試験用第２液状試薬の反応性を１００％として、３７℃にて２９日間保存後のものの反応率（％）を求めた。結果を表４に示す。表４の結果から、ＤＴＤＮが用量依存的に第２液状試薬を安定化することが明らかになった。特に、ＤＴＤＮは、第２液状試薬中、約1.0〜3.0mmol/Lの濃度で顕著な安定化効果を示すことが明らかとなった。
【００３６】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００３７】
上述のように、第１液状試薬安定化剤として、１種以上のキレート剤、並びに置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物を第１液状試薬に添加することにより、ＮＥＦＡ測定における第１液状試薬の性能を液状で長期にわたって安定化することができる。また、第２液状試薬安定化剤として、ＦＡＤ、並びにＤＴＤＮ及び／又はフェロシアン化カリウムを第２液状試薬に添加することによりＮＥＦＡ測定における第２液状試薬の性能を液状で長期にわたって安定化することができる。さらにこれら第１及び第２液状試薬を用いることにより、液状で長期間安定なＮＥＦＡ測定用キットを提供することが可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体およびＮ−エチルマレイミドを含み、Ｎ−エチルマレイミドの安定化に有効なｐＨを有する液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該試薬の安定化に有効な量の6,6'-ジチオジニコチン酸及び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有する、安定化された液状試薬。
【請求項２】
フェロシアン化カリウムの濃度が0.12mg/100mL以上である、請求項１記載の液状試薬。
【請求項３】
6,6'-ジチオジニコチン酸の濃度が0.4mmol/L以上である、請求項１又は２記載の液状試薬。
【請求項４】
陰イオン性界面活性剤をさらに含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の液状試薬。
【請求項５】
遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに変換する反応用の試薬、並びに請求項１〜４のいずれかに記載の液状試薬を含む、遊離脂肪酸測定用キット。
【請求項６】
遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに変換する反応用の試薬が、コエンザイムＡ、アシルコエンザイムＡシンテターゼおよびＡＴＰを含む液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに当該試薬の安定化に有効な量の、置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物をさらに含有する、安定化された液状試薬である、請求項５記載のキット。
【請求項７】
アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体およびＮ−エチルマレイミドを含む試薬溶液に、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該試薬の安定化に有効な量の6,6'-ジチオジニコチン酸及び／又はフェロシアン化カリウムを添加し、且つ当該溶液をＮ−エチルマレイミドの安定化に有効なｐＨに調整することを特徴とする、該試薬溶液を遊離脂肪酸測定用液状試薬として使用し得る程度に安定化する方法。
【請求項８】
フェロシアン化カリウムの濃度が0.12mg/100mL以上である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
6,6'-ジチオジニコチン酸の濃度が0.4mmol/L以上である、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
陰イオン性界面活性剤をさらに添加することを特徴とする、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
試料に、下記（ａ）の液状試薬、及び下記（ｂ）の試薬を順次添加し、アシルコエンザイムＡ量を計測することを特徴とする、試料中の遊離脂肪酸の測定方法：
（ａ）コエンザイムＡ、アシルコエンザイムＡシンテターゼおよびＡＴＰを含む液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに当該試薬の安定化に有効な量の、置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物をさらに含有する、安定化された液状試薬；及び
（ｂ）請求項１〜４のいずれかに記載の液状試薬。
【請求項１２】
試料に、遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに変換する反応用の試薬、及び請求項１〜４のいずれかに記載の液状試薬を順次添加し、ペルオキシダーゼの反応による発色を計測することを特徴とする、試料中の遊離脂肪酸の測定方法。
【請求項１】
アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体およびＮ−エチルマレイミドを含み、Ｎ−エチルマレイミドの安定化に有効なｐＨを有する液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該試薬の安定化に有効な量の6,6'-ジチオジニコチン酸及び／又はフェロシアン化カリウムをさらに含有する、安定化された液状試薬。
【請求項２】
フェロシアン化カリウムの濃度が0.12mg/100mL以上である、請求項１記載の液状試薬。
【請求項３】
6,6'-ジチオジニコチン酸の濃度が0.4mmol/L以上である、請求項１又は２記載の液状試薬。
【請求項４】
陰イオン性界面活性剤をさらに含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の液状試薬。
【請求項５】
遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに変換する反応用の試薬、並びに請求項１〜４のいずれかに記載の液状試薬を含む、遊離脂肪酸測定用キット。
【請求項６】
遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに変換する反応用の試薬が、コエンザイムＡ、アシルコエンザイムＡシンテターゼおよびＡＴＰを含む液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに当該試薬の安定化に有効な量の、置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物をさらに含有する、安定化された液状試薬である、請求項５記載のキット。
【請求項７】
アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの発色性基質である水素供与体およびＮ−エチルマレイミドを含む試薬溶液に、当該試薬の安定化に有効な量のＦＡＤ、並びに当該試薬の安定化に有効な量の6,6'-ジチオジニコチン酸及び／又はフェロシアン化カリウムを添加し、且つ当該溶液をＮ−エチルマレイミドの安定化に有効なｐＨに調整することを特徴とする、該試薬溶液を遊離脂肪酸測定用液状試薬として使用し得る程度に安定化する方法。
【請求項８】
フェロシアン化カリウムの濃度が0.12mg/100mL以上である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
6,6'-ジチオジニコチン酸の濃度が0.4mmol/L以上である、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
陰イオン性界面活性剤をさらに添加することを特徴とする、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
試料に、下記（ａ）の液状試薬、及び下記（ｂ）の試薬を順次添加し、アシルコエンザイムＡ量を計測することを特徴とする、試料中の遊離脂肪酸の測定方法：
（ａ）コエンザイムＡ、アシルコエンザイムＡシンテターゼおよびＡＴＰを含む液状試薬であって、当該試薬の安定化に有効な量の１種以上のキレート剤、並びに当該試薬の安定化に有効な量の、置換α−シクロデキストリン、マンニトール及びトレハロースからなる群より選択される１種以上の化合物をさらに含有する、安定化された液状試薬；及び
（ｂ）請求項１〜４のいずれかに記載の液状試薬。
【請求項１２】
試料に、遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに変換する反応用の試薬、及び請求項１〜４のいずれかに記載の液状試薬を順次添加し、ペルオキシダーゼの反応による発色を計測することを特徴とする、試料中の遊離脂肪酸の測定方法。
【公開番号】特開２００７−８２５６１（Ｐ２００７−８２５６１Ａ）
【公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３４３０４１（Ｐ２００６−３４３０４１）
【出願日】平成１８年１２月２０日（２００６．１２．２０）
【分割の表示】特願２００２−３２９１８（Ｐ２００２−３２９１８）の分割
【原出願日】平成１４年２月８日（２００２．２．８）
【出願人】（０００２３１３９４）アルフレッサファーマ株式会社 (27)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２０日（２００６．１２．２０）
【分割の表示】特願２００２−３２９１８（Ｐ２００２−３２９１８）の分割
【原出願日】平成１４年２月８日（２００２．２．８）
【出願人】（０００２３１３９４）アルフレッサファーマ株式会社 (27)
【Ｆターム（参考）】
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