遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム由来の核酸を含む核酸構築物、及び該核酸構築物を導入した細胞
本発明は、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上の、５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡ、該レプリコンＲＮＡを導入したレプリコン複製細胞、及び該レプリコンＲＮＡの複製効率を増大させる方法に関する。
【背景技術】
Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ、ＨＣＶ）は、フラビウイルス科に属する、一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡをゲノムとするウイルスであり、Ｃ型肝炎の原因となることが知られている。近年の研究により、Ｃ型肝炎ウイルスは遺伝子型又は血清型により多数の型に分類されることが分かってきた。現在主流であるＨＣＶ遺伝子型の分類法である、ＳｉｍｍｏｎｄｓらによるＨＣＶ株の塩基配列を用いた系統解析法ではＨＣＶは遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型３ａ、遺伝子型３ｂの６タイプに分類され（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，（１９９４）１０，ｐ．１３２１−１３２４を参照）、さらにそれらの各タイプがいくつかのサブタイプに分類されている。現在では、ＨＣＶの複数の遺伝子型についてゲノム全長の塩基配列が決定されている（特開２００２−１７１９７８号公報、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８９）２４４，ｐ．３５９−３６２、Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００１）６４（３）ｐ．３３４−３３９、Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，（１９９２）７３ ｐ．６７３−６７９、及びＭｏｒｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｉｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，（１９９２）１８３，ｐ．３３４−３４２を参照）。
ＨＣＶは持続的に感染することにより慢性肝炎を引き起こす。現在、世界的規模で認められる慢性肝炎の主たる原因がＨＣＶ持続感染である。実際、持続感染者の５０％程度が慢性肝炎を発症し、そのうち約２０％の患者が１０年〜２０年を経て肝硬変に移行し、さらにその一部は肝癌といった致死的な病態へと進展する。
Ｃ型肝炎に対する現在の主な治療は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、及びインターフェロン−αとプリン−ヌクレオシド誘導体であるリバビリンとの併用療法により行われている。しかしながら、これらの治療を行っても、全治療者の約６０％に治療効果が認められるだけであり、効果が出た後に治療を中止すると半分以上の患者が再燃する。インターフェロンの治療効果は、ＨＣＶの遺伝子型と関連することが知られており、遺伝子型１ｂに対しては効果が低く、遺伝子型２ａに対してはより効果が高いと言われている（Ｙｏｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，（１９９２）１６（２）：ｐ．２９３−２９９を参照）。
工業国において罹患率が高く、最終的に深刻な結果を招き、かつ現在は原因治療法が存在しないＣ型肝炎に対する効果的な治療薬又は予防薬の開発は重要な目標である。そのため、ＨＣＶ特異的な化学療法、ワクチン療法の発展が切望されている。抗ＨＣＶ薬開発のターゲットとしては、ＨＣＶの複製抑制やＨＣＶの細胞感染の抑制が考えられる。
最近まで、ＨＣＶを細胞培養系で増やすこと、培養細胞に感染させることは困難であり、また、ＨＣＶに感染可能かつ実験可能な動物はチンパンジーしかなかったため、ＨＣＶの複製機構や感染機構の研究は困難であった。しかし最近になって、ＨＣＶ由来の自律複製能を有するＲＮＡとして、ＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンが作製されたことにより（特開２００１−１７１８７号公報、Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９）２８５，ｐ．１１０−１１３、Ｂｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０００）２９０，ｐ．１９７２−１９７４、Ｆｒｉｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００１）７５（２４）：ｐ．１２０４７−１２０５７、及びＩｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００２）７６（６）：ｐ．２９９７−３００６を参照）、培養細胞を用いてＨＣＶの複製機構を解析することが可能となった。これらのＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンは、遺伝子型１ｂのＨＣＶゲノムＲＮＡの５’非翻訳領域中のＨＣＶ ＩＲＥＳの下流に存在する構造タンパク質を、ネオマイシン耐性遺伝子及びその下流に連結したＥＭＣＶ ＩＲＥＳによって置換したものである。このＲＮＡレプリコンは、ヒト肝癌細胞Ｈｕｈ７に導入してネオマイシン存在下で培養することにより、Ｈｕｈ７細胞内で自律複製することが証明された。
しかしながら、このようなＨＣＶの細胞内ＲＮＡ複製系は、未だ遺伝子型１ｂのＨＣＶのゲノムＲＮＡを用いたものしか作製されていない。異なる遺伝子型のＨＣＶではコードされるウイルスタンパク質にも違いがあることが報告されていることから、遺伝子型１ｂのＨＣＶ由来のサブゲノムＲＮＡレプリコンの解析だけでは、ＨＣＶの複製機構を十分に解明することは難しいと考えられる。さらに、インターフェロンの治療効果がＨＣＶの遺伝子型によって異なることから、遺伝子型１ｂのＨＣＶのサブゲノムＲＮＡレプリコンを含むＨＣＶ複製系のみを用いて色々なタイプのＨＣＶに効果を及ぼす抗ＨＣＶ薬を開発することは特に難しいと考えられる。
【発明の開示】
本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる特願２００３−１４８２４２号及び特願２００３−３２９１１５号に記載された内容を包含する。
本発明は、未だレプリコンＲＮＡが作製されていない遺伝子型のＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、遺伝子型２ａのＨＣＶのレプリコンＲＮＡを作製することに成功した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上の、５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡ。このレプリコンＲＮＡは、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子、及び少なくとも１つのＩＲＥＳ配列をさらに含むことが好ましい。
［２］ 配列番号９又は１０のいずれか１つで示される塩基配列からなる５’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、配列番号１１又は１２のいずれか１つで示される塩基配列からなる３’非翻訳領域とを含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡ。
［３］ 遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡが、配列番号３又は５で示される塩基配列からなるＲＮＡである、上記［１］又は［２］記載のレプリコンＲＮＡ。
［４］ 以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡ。
（ａ）配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＲＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２で示される塩基配列において１〜１０個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ、自律複製能を有するＲＮＡ
［５］ 上記［１］〜［４］記載のいずれかのレプリコンＲＮＡを細胞に導入することにより作製された、レプリコン複製細胞。このレプリコン複製細胞において、レプリコンＲＮＡを導入する細胞は、真核細胞であることが好ましく、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがより好ましく、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、及び２９３細胞からなる群より選ばれるいずれかの細胞であることがさらに好ましい。
［６］ Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療剤若しくは診断剤の製造、又は評価のための、上記［１］〜［４］記載のレプリコンＲＮＡ。
［７］ Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療剤若しくは診断剤の製造、又は評価のための、上記［５］記載のレプリコン複製細胞。
［８］ Ｃ型肝炎ウイルス感染に対するワクチンの製造のための、上記［１］〜［４］記載のレプリコンＲＮＡ。
［９］ Ｃ型肝炎ウイルス感染に対するワクチンの製造のための、上記［５］記載のレプリコン複製細胞。
［１０］ 上記［５］記載のレプリコン複製細胞からレプリコンＲＮＡを抽出することを含む、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡの製造方法。
［１１］ 上記［５］記載のレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物からウイルスタンパク質を取得することを含む、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのウイルスタンパク質の製造方法。
［１２］ 被験物質の存在下で、上記［５］記載のレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製を検出することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングする方法。
［１３］ 上記［５］記載のレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得し、取得した複製レプリコンＲＮＡを該レプリコン複製細胞とは別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うことを含む、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡの複製効率を増大させる方法。この方法においては、複製効率の増大が、レプリコン複製細胞に最初に導入されたレプリコンＲＮＡの複製効率と比較して、少なくとも２倍の増大であることがより好ましい。
［１４］ 上記［５］記載のレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得し、取得した複製レプリコンＲＮＡを該レプリコン複製細胞とは別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うこと、及び最終的に得られたレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得することを含む、複製効率が増大した遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造する方法。
［１５］ 上記［１４］記載の方法によって製造された複製効率が増大したレプリコンＲＮＡについて、レプリコン複製細胞に最初に導入されたレプリコンＲＮＡとの間の塩基変異又はアミノ酸変異を検出すること、及び複製効率を増大させようとするレプリコンＲＮＡにその検出された塩基変異又はアミノ酸変異を導入することを含む、複製効率が増大した遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造する方法。
［１６］ 配列番号１で示される塩基配列上において、以下の（ａ）〜（ｕ）：
（ａ）塩基番号７１５７の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｂ）塩基番号４９５５の部位におけるＣからＵへの変異、
（ｃ）塩基番号４９３６の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｄ）塩基番号５０００の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｅ）塩基番号７２８８の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｆ）塩基番号５９０１の部位におけるＧからＵへの変異、
（ｇ）塩基番号６１１３の部位におけるＡからＵへの変異、
（ｈ）塩基番号２８９０の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｉ）塩基番号６８２６の部位におけるＣからＡへの変異、
（ｊ）塩基番号６８８７の部位におけるＣからＡへの変異、
（ｋ）塩基番号６５８０の部位におけるＵからＡへの変異、
（ｌ）塩基番号７１５９の部位におけるＵからＣへの変異、
（ｍ）塩基番号７２３０の部位におけるＵからＡへの変異、
（ｎ）塩基番号６９４３の部位におけるＣからＡへの変異、
（ｏ）塩基番号５６８７の部位におけるＧからＡへの変異、
（ｐ）塩基番号６１１０の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｑ）塩基番号５５５０の部位におけるＵからＣへの変異、
（ｒ）塩基番号７２１７の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｓ）塩基番号３６４３の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｔ）塩基番号５８５１の部位におけるＧからＡへの変異、及び
（ｕ）塩基番号５９１４の部位におけるＧからＡへの変異、
からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する塩基配列からなるレプリコンＲＮＡ。
本発明により、遺伝子型２ａのＨＣＶ株に由来するＨＣＶ−ＲＮＡレプリコンが初めて提供された。本発明に係るレプリコン複製細胞は、遺伝子型２ａのＨＣＶ由来のＲＮＡ及びＨＣＶタンパク質を持続的に産生させるための培養系として用いることができる。さらに本発明に係るレプリコン複製細胞は、ＨＣＶの複製及び／又はＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に係るＨＣＶ−ＲＮＡレプリコンを作製するための鋳型ＤＮＡの構築手順を示す概略図である。図１の上段は、ｐＪＦＨ１及びｐＪＣＨ１のウイルスゲノム挿入領域の構造を示す。図１の下段は、ｐＪＦＨ１及びｐＪＣＨ１のウイルスゲノム挿入領域の一部をネオマイシン耐性遺伝子とＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含むＤＮＡ断片で置換することにより構築したプラスミドＤＮＡ ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１及びｐＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１のウイルスゲノム挿入領域の構造を示す。図中の記号は以下のとおりである。Ｔ７：Ｔ７ ＲＮＡプロモーター、Ｇ：挿入したＪＦＨ−１又はＪＣＨ−１由来ＤＮＡの５’端の上流かつＴ７ ＲＮＡプロモーター配列の３’端の下流に挿入したｄＧＴＰ、５’ＮＴＲ：５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅ：コアタンパク質、３’ＮＴＲ：３’非翻訳領域。Ｅ１、Ｅ２：エンベロープタンパク質。ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ：非構造タンパク質。Ａｇｅ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ：制限酵素Ａｇｅ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ及びＸｂａ Ｉの切断部位。ＧＤＤ：ＮＳ５Ｂタンパク質の活性中心に相当するアミノ酸モチーフＧＤＤの位置。ｎｅｏ：ネオマイシン耐性遺伝子、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位）。
図２Ａ〜Ｆは、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の塩基配列を示す。
図３Ａ〜Ｆは、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１の塩基配列を示す。
図４は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤ及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤをそれぞれトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞のコロニー形成を示した写真である。トランスフェクションしたＲＮＡの量は、上段の３つはいずれも１００ｎｇ、下段の３つはいずれも３００ｎｇである。各培養ディッシュには、１．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した。
図５は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１をそれぞれトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞の、培地中のＧ４１８の濃度が０．５ｍｇ／ｍｌである場合のコロニー形成を示した写真である。トランスフェクションしたＲＮＡの量は、いずれも１００ｎｇである。
図６は、トランスフェクション細胞のコロニー形成能に対する、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理の影響を示した写真である。トランスフェクションしたｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１ ＲＮＡの量は、いずれも１００ｎｇである。いずれも培地中のＧ４１８の濃度は１．０ｍｇ／ｍｌである。
図７は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションして樹立したレプリコン複製細胞クローン由来のトータル細胞性ＲＮＡを新たなＨｕｈ７細胞に再トランスフェクションした場合に示されるコロニー形成を示す写真である。左側写真は、レプリコン複製細胞クローン６由来のトータル細胞性ＲＮＡを用いて９６コロニーの形成がみとめられた結果、右側写真：プールクローン由来のトータル細胞性ＲＮＡを用いて７７コロニーの形成がみとめられた結果を示す。いずれもレプリコンＲＮＡを１×１０７コピー含む量を再トランスフェクションした。
図８は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションして樹立したレプリコン複製細胞クローン由来のトータル細胞性ＲＮＡを新たなＨｕｈ７細胞に再トランスフェクションして得た細胞クローン由来のトータルＲＮＡに対して、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブを用いてノーザンブロット法による検出を行った結果を示す写真である。レーンの説明は以下のとおりである。１０８：Ｈｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の８乗コピー加えたサンプル、１０７：Ｈｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の７乗コピー加えたサンプル、Ｈｕｈ７：トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡ、プールクローン：プールクローンから抽出したトータルＲＮＡ、１〜１１：細胞クローン１〜１１のそれぞれから抽出したトータルＲＮＡ。「レプリコンＲＮＡ」は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の分子量サイズを示すマーカー、「２８Ｓ」は４．５ｋｂの分子量サイズを示すリボソームＲＮＡマーカー、「１８Ｓ」は１．９ｋｂの分子量サイズを示すリボソームＲＮＡマーカーの泳動位置を示す。
図９は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１又はｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来複製レプリコンＲＮＡが再トランスフェクションされた細胞クローンにおける、ネオマイシン耐性遺伝子の宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みの有無を示す写真である。左側写真のレーンの説明は以下のとおりである。Ｍ：ＤＮＡ分子量マーカー、１〜８：ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来細胞クローン１〜８、Ｎ：トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞、Ｐ：陽性対照（ネオマイシン耐性遺伝子のＰＣＲ増幅産物）。一方、右側写真のレーンの説明は以下のとおりである。Ｍ：ＤＮＡ分子量マーカー、１〜６：ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン１〜６。
図１０は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１又はｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来複製レプリコンＲＮＡが再トランスフェクションされた細胞クローンにおいて、発現されたＮＳ３タンパク質の検出結果を示す写真である。左側写真のレーン１〜８：ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来細胞クローン１〜８。右側写真のレーン１〜６：ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン１〜６。右側写真のレーンのＰ：ＮＳ３タンパク質（陽性対照）、Ｎ：トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞から抽出したタンパク質（陰性対照）。
図１１は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡのＨｕｈ７細胞への再トランスフェクションを経て樹立した２１の細胞クローンから取得したレプリコンＲＮＡ中の塩基変異の位置を示す図である。変異の位置は、表４に示す塩基番号を付記した縦線で示している。太い縦線は非同義置換、細い縦線は同義置換を表す。
図１２は、Ａ：ＨｅｐＧ２細胞、Ｂ：ＩＭＹ−Ｎ９細胞、Ｃ：２９３細胞、又はＤ：Ｈｅｌａ細胞を用いたｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１トランスフェクションの結果を示す写真である。各培養ディッシュには、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した。
図１３は、レプリコン複製細胞クローンのノーザンブロッティングの結果を示す写真である。レーン１：ＨｅｐＧ２（陰性対照）、レーン２：合成ＲＮＡ １０８コピー、レーン３：合成ＲＮＡ １０７コピー、レーン４：Ｈｅｐ−ＩＨ−１（ＨｅｐＧ２細胞由来）、レーン５：Ｈｅｐ−ＩＨ−３（ＨｅｐＧ２細胞由来）、レーン６：Ｈｅｐ−ＩＨ−５（ＨｅｐＧ２細胞由来）、レーン７：Ｈｅｐ−ＩＨ−１１（ＨｅｐＧ２細胞由来）、レーン８：Ｈｅｐ−ＩＨ−１３（ＨｅｐＧ２細胞由来）、レーン９：ＩＭＹ−ＩＨ−３（ＩＭＹ−Ｎ９細胞由来）、レーン１０：ＩＭＹ−ＩＨ−４（ＩＭＹ−Ｎ９細胞由来）、レーン１１：ＩＭＹ−ＩＨ−７（ＩＭＹ−Ｎ９細胞由来）、レーン１２：ＩＭＹ−ＩＨ−１０（ＩＭＹ−Ｎ９細胞由来）、レーン１３：２９３−ＩＨをトランスフェクトした細胞プール（２９３細胞由来）、レーン１４：ＨｅＬａ−ＩＨ−９（ＨｅＬａ細胞由来）、レーン１５：ＨｅＬａ−ＩＨ−１２（ＨｅＬａ細胞由来）、レーン１６：ＨｅＬａ−ＩＨ−１３（ＨｅＬａ細胞由来）、レーン１７：ＨｅＬａ（陰性対照）。
図１４は、ネオマイシン耐性遺伝子のゲノムＤＮＡへの組み込みを確認するための電気泳動の結果を示す写真である。ＨｅｐＧ２レプリコン細胞（上段）及びＩＭＹ−Ｎ９レプリコン細胞（下段）のそれぞれのゲノムＤＮＡについて、ＰＣＲ解析によりネオマイシン耐性遺伝子を検出した。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー、Ｐ：陽性対照、Ｈ：
図１５は、レプリコン複製細胞クローン由来のタンパク質ＮＳ３及びＮＳ５ａをウエスタンブロット法により解析した結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明に係るＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡ
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のゲノムは、約９６００ヌクレオチドからなる（＋）鎖の一本鎖ＲＮＡである。このゲノムＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ又は５’ＵＴＲとも表記する）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、及び３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ又は３’ＵＴＲとも表記する）からなる。その構造領域にはＨＣＶの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。
このようなＨＣＶの構造タンパク質と非構造タンパク質は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによって限定分解を受けて構造タンパク質（Ｃｏｒｅ、Ｅ１、及びＥ２）と非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ）とが各タンパク質として遊離することにより、生成される。これらの構造タンパク質及び非構造タンパク質（すなわち、ＨＣＶのウイルスタンパク質）のうち、Ｃｏｒｅはコアタンパク質であり、Ｅ１及びＥ２はエンベロープタンパク質であり、非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ）はウイルス自身の複製に関与するタンパク質である。ＮＳ２はメタロプロテアーゼ活性、ＮＳ３はセリンプロテアーゼ活性（Ｎ末端側の３分の１）とヘリカーゼ活性（Ｃ末端側の３分の２）を有することが知られている。またＮＳ４ＡはＮＳ３のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有することも報告されている。そして、遺伝子型２ａのＨＣＶのゲノムも同様の遺伝子構造を有することがすでに報告されている（特開２００２−１７１９７８号公報を参照）。
本発明者らは、このような遺伝子型２ａのＨＣＶゲノムを用いて、自律的に複製することが可能なＲＮＡを構築した。すなわち本発明のＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡは、遺伝子型２ａのＨＣＶゲノムの全体又は部分ＲＮＡを含む自律複製能を有するＲＮＡ構築物である。
本明細書では、自律複製能を有しておりＨＣＶウイルスゲノムを改変して作製されたＲＮＡを、「レプリコンＲＮＡ」又は「ＲＮＡレプリコン」と呼び、遺伝子型２ａのＨＣＶから人為的に作製される自律複製能を有するＲＮＡを、遺伝子型２ａのＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡと称する。本明細書においてＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡは、ＨＣＶ−ＲＮＡレプリコンとも称する。
本発明において、「遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルス」「遺伝子型２ａのＨＣＶ」とは、Ｓｉｍｍｏｎｄｓらによる国際分類に従って遺伝子型２ａと同定されるＣ型肝炎ウイルスを意味する。本発明における「遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルス」「遺伝子型２ａのＨＣＶ」には、天然由来のＨＣＶゲノムＲＮＡを有するウイルスだけでなく、天然由来のＨＣＶゲノム配列に人為的な改変を加えたゲノムＲＮＡを有するウイルスも包含する。遺伝子型２ａのＨＣＶの具体例としては、ＪＦＨ−１株及びＪＣＨ−１株（特開２００２−１７１９７８号公報を参照）等のウイルスが挙げられる。
さらに「遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ」とは、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスの一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡからなるゲノムの全領域にわたる塩基配列を有するＲＮＡを意味する。限定するものではないが、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡは、好ましくは配列番号３又は５で示される塩基配列からなるＲＮＡである。
本願明細書において、「５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ又は５’ＵＴＲ）」、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」、「Ｃｏｒｅタンパク質をコードする配列（Ｃｏｒｅ領域又はＣ領域）」、「Ｅ１タンパク質をコードする配列（Ｅ１領域）」、「Ｅ２タンパク質をコードする配列（Ｅ２領域）」、「Ｎ２タンパク質をコードする配列（ＮＳ２領域）」、「ＮＳ３タンパク質をコードする配列（ＮＳ３領域）」、「ＮＳ４Ａタンパク質をコードする配列（ＮＳ４Ａ領域）」、「ＮＳ４Ｂタンパク質をコードする配列（ＮＳ４Ｂ領域）」、「ＮＳ５Ａタンパク質をコードする配列（ＮＳ５Ａ領域）」、「ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列（ＮＳ５Ｂ領域）」、及び「３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ又は３’ＵＴＲ）」、並びにその他の特定の領域若しくは部位は、遺伝子型２ａのＨＣＶであるＪＦＨ−１株のゲノム全領域をコードする全長ｃＤＮＡ（ＪＦＨ−１クローン）の塩基配列（配列番号３）を基準として、定めるものとする。配列番号３の塩基配列は、国際ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）からアクセッション番号ＡＢ０４７６３９により取得可能である。具体的には、配列番号３で示される塩基配列に対して特定のＨＣＶのＲＮＡ配列をアラインメントしたときに、配列番号３で示される塩基配列上の塩基番号１〜３４０にアラインメントされる配列がそのＲＮＡの「５’非翻訳領域」、同塩基番号３４３１〜９４４２にアラインメントされる配列が「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」、同塩基番号３４３１〜５３２３にアラインメントされる配列が「ＮＳ３タンパク質をコードする配列」、塩基番号５３２４〜５４８５にアラインメントされる配列が「ＮＳ４Ａタンパク質をコードする配列」、同塩基番号５４８６〜６２６８にアラインメントされる配列が「ＮＳ４Ｂタンパク質をコードする配列」、同塩基番号６２６９〜７６６６にアラインメントされる配列が「ＮＳ５Ａタンパク質をコードする配列」、塩基番号７６６７〜９４４２にアラインメントされる配列が「ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」、同塩基番号９４４３〜９６７８にアラインメントされる配列が「３’非翻訳領域」である。また、この場合「アラインメント」される配列にはギャップ、付加、欠失、置換等が存在していてもよい。さらに上記の「特定のＨＣＶ」は、限定するものではないが、ＪＦＨ−１株若しくはＪＣＨ−１株又はそれらの誘導体であるウイルス株を包含する。
本発明に係るＨＣＶ ＲＮＡ−レプリコンの一つの実施形態は、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上の、５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、３’非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡである。このレプリコンＲＮＡは、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子、及び少なくとも１つのＩＲＥＳ配列をさらに含んでもよい。さらにこのレプリコンＲＮＡは、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上の、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂタンパク質以外のウイルスタンパク質をコードする配列を、含んでもよい。
本発明に係るＨＣＶ ＲＮＡ−レプリコンの別の好適な実施形態は、配列番号９又は１０で示される塩基配列からなる５’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、配列番号１１又は１２で示される塩基配列からなる３’非翻訳領域とを含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡである。ここで配列番号９及び１０で示される塩基配列は、それぞれ、本発明に係るレプリコンＲＮＡであるｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１（配列番号１）及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１（配列番号２）の５’非翻訳領域の配列である。また配列番号１１及び１２で示される塩基配列は、それぞれ、本発明に係るレプリコンＲＮＡであるｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１（配列番号１）及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１（配列番号２）の３’非翻訳領域の配列である。
本発明に係るＨＣＶ ＲＮＡ−レプリコンのさらに好ましい１つの実施形態は、配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡである。さらに、この配列番号１又は２で示される塩基配列において、１〜５０個、１〜３０個、１〜１０個、１〜６個、１〜数個（２〜５個）の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるレプリコンＲＮＡであって、かつ、自律複製能を有するＲＮＡも、好適な実施形態として本発明の範囲に含まれる。本発明において「自律複製能を有する」とは、レプリコンＲＮＡを細胞中に導入したときに、そのレプリコンＲＮＡが細胞内でそのレプリコンＲＮＡ自身の全長を複製することができることを意味する。限定するものではないが、この自律複製能は、例えば、レプリコンＲＮＡをＨｕｈ７細胞中にトランスフェクションし、Ｈｕｈ７細胞を培養し、得られる培養物中の細胞から抽出したＲＮＡについて、導入したレプリコンＲＮＡを特異的に検出可能なプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションを行ってレプリコンＲＮＡの存在を検出することにより、確認することができる。自律複製能を確認するための具体的な操作は、本明細書の実施例に記載されたコロニー形成能の測定、ＨＣＶタンパク質の発現確認、レプリコンＲＮＡの検出等の記載に従って行うことができる。
本発明において「選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子が発現された細胞だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられるが、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましい。但し本発明における選択マーカー遺伝子はこれらに限定されるものではない。
また本発明において「リポーター遺伝子」とは、その遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。リポーター遺伝子の一般的な例としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、トランスポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ若しくはβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のイクリオン遺伝子、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子等が挙げられる。但し本発明におけるリポーター遺伝子はこれらに限定されるものではない。
上記の選択マーカー遺伝子及びリポーター遺伝子は、レプリコンＲＮＡ中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。
本発明における「ＩＲＥＳ配列」とは、ＲＮＡの内部にリボソームを結合させて翻訳を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。本発明におけるＩＲＥＳ配列の好適な例としては、以下に限定するものではないがＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、ＦＭＤＶ ＩＲＥＳ、ＨＣＶ ＩＲＥＳ等が挙げられるが、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及びＨＣＶ ＩＲＥＳがより好ましく、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳが最も好ましい。
さらに本発明に係るレプリコンＲＮＡは、他のＨＣＶ株又は他の遺伝子型のＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型１ｂのＨＣＶゲノムの断片を含んでもよい。他のＨＣＶ株としては、例えばＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｈ、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣＴ−１８、Ｈ７７、ＤＫ−７、ＵＳ１１、Ｓ１４、ＨＣＴ２３、ＨＣＶ−Ｔｈ、ＤＲ１、ＤＲ４、ＨＣＴ２７、Ｓ１８、ＳＷ１、ＤＫ９、Ｈ９０、ＴＤ−６Ｅ１、Ｓ９、ＨＣＶ−ＢＫ、Ｔ１０、ＤＫ１、ＨＣ−Ｊ４、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＫ３、ＨＫ８、ＨＫ５、ＨＣＶ−Ｇ３、ＩＮＤ５、ＩＮＤ８、Ｐ１０、Ｄ１、Ｄ３、ＳＷ２、Ｔ３、Ｓ４５、ＳＡ１０、ＵＳ６、ＨＣＶ−ＪＫ１、ＨＣＶ−ＪＫ４、ＨＣＶ−ＪＫ３、ＨＣＶ−ＪＫ２、ＨＣＶ−ＪＴ、ＨＣ−Ｊ２、ＨＣＶ−Ｔ、ＨＫ４、ＨＣ−Ｇ９、Ｚ１、Ｂｉ，Ｓ．Ｉ．、Ｃｈｏ，Ｊ．Ｍ．、ＨＣＶ−Ｊ６、Ｔ４、Ｔ９、ＵＳ１０、ＨＣ−Ｊ５、Ｔ２、ＨＣ−Ｊ７、ＤＫ１１、ＳＷ３、ＤＫ８、Ｔ８、ＨＣ−Ｊ８、Ｓ８３、ＨＫ２、ＨＣ−Ｊ６、ＨＣ−Ｊ８、ＢＥＢＥ１、ＨＣＶ−Ｊ６、ＨＣＶ−Ｊ８、ＨＤ１０−２、ＢＲ３６−９、Ｓ５２、Ｓ５４、Ｓ２、ＢＲ３３−１、ＨＫ１０、ＤＫ１２、ＨＣＶ−ＴＲ、ＢＡ−１、ＢＡ−２、ＤＫ１３、Ｚ１、Ｚ４、Ｚ６、Ｚ７、ＨＫ２、ＳＡ１、ＳＡ４、ＳＡ５、ＳＡ７、ＳＡ１３、ＳＡ６、ＮＺＬ１、ＳＡ３０、ＥＧ−１３、ＨＣＶ−Ｋ３ａ／６５０、ＥＤ４３、ＥＵＨ１４８０、ＥＵＨＫ２、Ｔｈ５８０、ＶＮ２３５、ＶＮ４０５、ＶＮ００４、ＪＫ０４９、ＪＫ０４６、ＪＦＨ−１、ＪＣＨ−１、ＪＣＨ−２、ＪＣＨ−３、ＪＣＨ−４、ＪＣＨ−５、ＪＣＨ−６、Ｊ６ＣＦ、Ｈ７７等が挙げられるが、これらに限定するものではない。
本発明に係るレプリコンＲＮＡは、好ましくは、最も５’側に遺伝子型２ａのＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の５’非翻訳領域を、最も３’側に遺伝子型２ａのＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の３’非翻訳領域を有する。選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子は、ＩＲＥＳ配列の上流に連結されてもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の上流又は下流に連結されてもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の中に挿入されてもよい。
本発明に係るレプリコンＲＮＡは、より好ましくは、最も５’側に遺伝子型２ａのＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の５’非翻訳領域を有し、それよりも下流に選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」とをこの順番で有し、さらに最も３’側に遺伝子型２ａのＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の３’非翻訳領域を有する。
本発明に係るレプリコンＲＮＡには、上記したような配列の他に、レプリコンＲＮＡを導入する細胞内で発現させたい任意の外来遺伝子を含むＲＮＡを含んでもよい。外来遺伝子は、５’非翻訳領域の下流に連結してもよいし、選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子の上流又は下流に連結させてもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の上流又は下流に連結してもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の中に挿入してもよい。外来遺伝子を含むレプリコンＲＮＡは、導入された細胞内で翻訳される際に、該外来遺伝子にコードされたタンパク質を発現することができる。従って外来遺伝子を含むレプリコンＲＮＡは、遺伝子治療などの、特定の遺伝子産物を細胞内で生成させることを目的とする場合にも、好適に使用することができる。
また本発明に係るレプリコンＲＮＡには、さらにリボザイムを含んでいてもよい。リボザイムは、５’側のレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子又は外来遺伝子と、それより３’側のＩＲＥＳ配列及び「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」とを連結するように挿入し、リボザイムの自己切断活性により両者が切断されて分離するようにすることができる。
本発明に係るレプリコンＲＮＡにおいては、上述したような選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上のウイルスタンパク質をコードする配列、遺伝子型２ａ以外のＨＣＶのウイルスタンパク質コード配列、及び外来遺伝子等が、レプリコンＲＮＡから正しい読み枠で翻訳されるように連結される。それらの配列のうちでタンパク質をコードする配列は、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスの「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」から翻訳されるポリタンパク質とともに融合タンパク質として発現させた後で、プロテアーゼによって各タンパク質へと分離するように、プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させてもよい。
２．本発明に係るレプリコンＲＮＡの作製
本発明に係るＨＣＶ ＲＮＡ−レプリコンは、当業者に公知である任意の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。限定するものではないが、ＨＣＶ ＲＮＡ−レプリコンは、例えば以下のような方法で作製することができる。
まず、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡの全領域に対応するＤＮＡを、常法によりＲＮＡプロモーターの下流に連結し、ＤＮＡクローンを作製する。ここで、「ＲＮＡに対応するＤＮＡ」とは、当該ＲＮＡの塩基配列のＵ（ウラシル）をＴ（チミン）に置き換えた塩基配列を有するＤＮＡを意味する。前記ＲＮＡプロモーターは、プラスミドクローン中に含まれるものであることが好ましい。ＲＮＡプロモーターとしては、限定するものではないが、Ｔ７ ＲＮＡプロモーターが特に好ましい。
次に、作製したＤＮＡクローンについて、例えば、５’非翻訳領域の下流に位置する構造領域（Ｃｏｒｅ配列、Ｅ１配列、Ｅ２配列）及びＮＳ２タンパク質をコードする配列を、選択マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子とその下流に連結したＩＲＥＳ配列とを含むＤＮＡ断片によって置換する。この置換においては、構造領域以外の部分、例えば５’非翻訳領域の３’末端側の断片及びＮＳ３タンパク質をコードする配列の一部が、別の遺伝子型のＨＣＶに由来する配列に置換されてもよい。
次いで、その置換したＤＮＡクローンを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。ＲＮＡ合成は、５’非翻訳領域及びＩＲＥＳ配列から、常法により開始させることができる。鋳型ＤＮＡがプラスミドクローンの場合には、そのプラスミドクローンから、ＲＮＡプロモーターの下流に連結された上記ＤＮＡ領域を制限酵素によって切り出して、そのＤＮＡ断片を鋳型として用いてＲＮＡを合成することもできる。なお、好ましくは合成されるＲＮＡの３’末端がウイルスゲノムＲＮＡの３’非翻訳領域と一致し、他の配列が付加されたり削除されたりしないことが好ましい。このようにして合成されたＲＮＡが、本発明に係るレプリコンＲＮＡである。
３．遺伝子型２ａのＨＣＶのレプリコンＲＮＡを導入したレプリコン複製細胞の作製
上記のようにして作製されるレプリコンＲＮＡを、レプリコンＲＮＡを複製させるべき細胞に導入することにより、レプリコンＲＮＡが持続的に複製されている細胞を得ることができる。本明細書では、レプリコンＲＮＡが持続的に増幅されている細胞を「レプリコン複製細胞」と称する。
レプリコンＲＮＡを導入する細胞としては、継代培養することが可能な細胞であれば任意の細胞を用いることができるが、真核細胞であることが好ましく、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがより好ましく、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、及び２９３細胞からなる群より選ばれるいずれかの細胞であることがさらに好ましい。これらの細胞は、市販のものを利用してもよいし、細胞寄託機関から入手して使用してもよいし、任意の細胞（例えば癌細胞又は幹細胞）から株化した細胞を使用してもよい。
前記細胞は、ワクチン製造のようにＨＣＶタンパクの大量製造を目的とする場合には、大量培養が可能な細胞を用いることが望ましい。そのような観点からは、Ｈｕｈ７細胞以外の細胞であることが好ましい。
レプリコンＲＮＡの細胞内への導入は、当業者には公知の任意の技術を使用して行うことができる。そのような導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥセファロース法等が挙げられるが、エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。
レプリコンＲＮＡは、目的のレプリコンＲＮＡを単独で導入してもよいし、他の核酸と混合させたものを導入してもよい。導入するＲＮＡ量を一定にしてレプリコンＲＮＡの量を変化させたい場合には、目的のレプリコンＲＮＡを、導入する細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して、細胞内導入に用いればよい。細胞内導入に用いるレプリコンＲＮＡの量は、使用する導入法に応じて決めればよいが、好ましくは１ピコグラム〜１００マイクログラム、より好ましくは１０ピコグラム〜１０マイクログラムの量を使用する。
細胞内導入のために選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含有するレプリコンＲＮＡを用いる場合には、そのレプリコンＲＮＡが導入され持続的に複製している細胞を、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現を利用して、選択することができる。具体的には、例えば、そのようなレプリコンＲＮＡの細胞内導入処理を施した細胞を、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現により選択可能となる培地において培養すればよい。一例として、レプリコンＲＮＡにネオマイシン耐性遺伝子が選択マーカー遺伝子として含まれる場合には、そのレプリコンＲＮＡを用いて細胞内導入処理した細胞を培養ディッシュに播種し、１６〜２４時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を０．０５ミリグラム／ミリリットル〜３．０ミリグラム／ミリリットルの濃度で添加し、その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続し、播種時から好ましくは１０日間〜４０日間、より好ましくは１４日間〜２８日間培養した後にクリスタルバイオレットで生存細胞を染色することにより、レプリコンＲＮＡが導入され持続的に複製されている細胞を、形成されたコロニーとして選択することができる。
形成されたコロニーからは、常法により生存細胞をクローン化し、培養を継続することにより、細胞をクローン化することができる。このようにして得られる目的のレプリコンＲＮＡが持続的に複製されている細胞クローンを、本明細書では「レプリコン複製細胞クローン」と称する。
樹立した細胞クローンについては、導入されたレプリコンＲＮＡから該細胞クローン中で複製されているレプリコンＲＮＡの検出、導入されたレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認、及びＨＣＶタンパク質の発現の確認を行って、実際に目的のレプリコンＲＮＡが持続的に複製されていることを確認することが好ましい。
導入されたレプリコンＲＮＡから該細胞クローン中で複製されたレプリコンＲＮＡ（本明細書中では、以下便宜的に、「複製レプリコンＲＮＡ」と称する）の検出は、当業者には公知の任意のＲＮＡ検出法に従って行えばよいが、例えば、細胞クローンから抽出したトータルＲＮＡについて、導入されたレプリコンＲＮＡに対して特異的なＤＮＡ断片をプローブとして用いるノーザンハイブリダイゼーション法を実施することにより検出することができる。
また導入されたレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認は、限定するものではないが、例えば、細胞クローンから抽出した宿主ゲノムＤＮＡについて該選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の少なくとも一部を増幅するＰＣＲを行い、その増幅産物の有無を確認することによって行うことができる。増幅産物が確認された細胞クローンでは、宿主ゲノム中に選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子が組み込まれていると判断されることから、レプリコンＲＮＡ自体は該細胞内で持続的に複製されていない可能性がある。この場合、レプリコンＲＮＡが持続的に複製されているか否かを、次に示すＨＣＶタンパク質の発現の確認実験によって、確認することができる。
ＨＣＶタンパク質の発現の確認は、例えば、導入されたレプリコンＲＮＡから発現されるべきＨＣＶタンパク質に対する抗体を、細胞クローンから抽出したタンパク質と反応させることによって行うことができる。この方法は、当業者には公知の任意のタンパク質検出法によって行うことができるが、具体的には例えば、細胞クローンから抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗ＨＣＶタンパク質抗体（例えば、抗ＮＳ３特異的抗体、又はＣ型肝炎患者から採取した抗血清）を反応させ、さらにその抗ＨＣＶタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。細胞クローンから抽出したタンパク質中からＨＣＶタンパク質が検出されれば、その細胞クローンは、ＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡが持続的に複製してＨＣＶタンパク質を発現しているものと判断することができる。
以上のようにして、目的のレプリコンＲＮＡを持続的に複製していることが確認された細胞クローン（レプリコン複製細胞クローン）を得ることができる。また本発明においては、このレプリコン複製細胞から、例えばＲＮＡを抽出しその中からレプリコンＲＮＡを電気泳動法により分離する等の当業者には公知の任意の方法により、レプリコンＲＮＡを取得することができる。本発明はそのようなレプリコンＲＮＡの製造方法にも関する。さらに本発明に係るレプリコン複製細胞は、ＨＣＶタンパク質を製造するために好適に使用することができる。レプリコン複製細胞からのＨＣＶタンパク質の取得は、当業者であれば常法に従って行うことができる。具体的には例えば、レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞及び培養培地を含む）から常法によりタンパク質を採取し、さらにそのタンパク質から、抗ＨＣＶタンパク質抗体を用いた検出等によりウイルスタンパク質を選択的に得ることにより、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのウイルスタンパク質を製造することができる。
また本発明に係るレプリコン複製細胞が、外来遺伝子を含有するレプリコンＲＮＡを持続的に複製している場合には、そのレプリコン複製細胞を用いて外来遺伝子にコードされるタンパク質を発現させて取得することができる。具体的には例えば、レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞及び培養培地を含む）から常法によりタンパク質を採取し、さらにそのタンパク質から、目的のタンパク質に対する抗体を用いた検出等によりタンパク質を選択的に得ることにより、外来遺伝子にコードされたタンパク質を取得することができる。
４．遺伝子型２ａのＨＣＶのレプリコンＲＮＡへの複製効率を増大させる突然変異の導入
本発明に係るレプリコン複製細胞において複製され生成されたレプリコンＲＮＡ（複製レプリコンＲＮＡ）には、複製効率を向上させる突然変異が頻繁に生ずる。このような突然変異は適合変異であると思われる。
本発明では、このことを利用して、本発明に係るレプリコンＲＮＡに複製効率を向上させる突然変異の導入を促進することができる。
具体的には、第１のレプリコン複製細胞（好ましくは本発明に係るレプリコンＲＮＡを導入したレプリコン複製細胞）から、第１の複製レプリコンＲＮＡを抽出等により取得し、第１の複製レプリコンＲＮＡをさらに別の細胞に再導入して第２のレプリコン複製細胞を作製するという工程を、１回以上、好ましくは１〜１０回、より好ましくは１〜５回、さらに好ましくは１〜２回反復的に行うことにより、レプリコン複製細胞中で、レプリコンＲＮＡに複製効率を増大させる突然変異を高頻度に導入することができる。
複製レプリコンＲＮＡを再導入する細胞としては、任意の細胞を用いることができるが、最初にレプリコンＲＮＡを導入した細胞と同じ生物種由来の細胞であることが好ましく、最初にレプリコンＲＮＡを導入した細胞と同じ生物種由来の同じ組織由来の細胞であることが好ましく、最初にレプリコンＲＮＡを導入した細胞と同じ細胞株の細胞であることがさらに好ましい。
従って本発明では、上記の方法を用いて、複製効率を増大させる突然変異を導入したレプリコンＲＮＡを製造することができる。すなわち、まず第１のレプリコン複製細胞（好ましくは本発明に係るレプリコンＲＮＡを導入したレプリコン複製細胞）から、第１の複製レプリコンＲＮＡを抽出等により取得し、さらにこの第１の複製レプリコンＲＮＡをさらに別の細胞に再導入して第２のレプリコン複製細胞を作製する工程を、１回以上、好ましくは１〜１０回、より好ましくは１〜５回、さらに好ましくは１〜２回反復的に行った後、この反復工程の最後に得られる最終的なレプリコン複製細胞から、複製レプリコンＲＮＡを抽出等によって取得することにより、複製効率が増大したレプリコンＲＮＡを製造することができる。
本発明では、以上のような方法により、レプリコンＲＮＡの複製効率を少なくとも２倍、好ましくは１０〜１００倍、より好ましくは１００〜１００００倍に増大させることができる。
このような方法により製造した複製効率が増大したレプリコンＲＮＡについては、逆転写ＰＣＲによってｃＤＮＡを得てそれを塩基配列決定に供するなどの公知の方法により、塩基配列を決定することが好ましい。さらに、決定された塩基配列又はそれにコードされるアミノ酸配列を、最初に細胞に導入されたレプリコンＲＮＡの塩基配列と比較することにより、適合変異を同定することができる。複製効率を増大させる適合変異としては、特に、レプリコンＲＮＡにコードされたウイルスタンパク質のアミノ酸を変異させる非同義置換が好ましい。
また本発明は、そのようにして同定した適合変異を、複製効率を増大させようとするレプリコンＲＮＡに常法により導入することによって、複製効率が増大した遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造することができる方法も提供する。
以上のようにして製造された複製効率が増大したレプリコンＲＮＡは、その方法に使用した細胞中においてレプリコンＲＮＡを大量に製造するために使用することができる。
本発明に係るレプリコンＲＮＡの複製効率は、当業者に公知の方法により決定することができるが、例えば次のような方法に従って決定すればよい。たとえばＨｕｈ７細胞に０．０００１、０．０００３、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１．０マイクログラムの量のレプリコンＲＮＡをトランスフェクションして、前述の実験手法と同様の方法でＧ４１８による選択培養を２１日間行った後にコロニー形成数（コロニー数）を測定する。導入したＲＮＡ量とコロニー形成数とを比較して容量依存的にコロニー形成が増加するレプリコンＲＮＡ導入量の範囲を決定し、その範囲内でのコロニー形成数を、導入したＲＮＡ量で除算して得られる値を、１マイクログラムあたりのコロニー形成率とする。この計算式は、以下のとおりである。
コロニー形成率［（Ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ；ＣＦＵ）／マイクログラム］＝コロニー形成数［個］／導入したＲＮＡ量［マイクログラム］
こうして算出されたコロニー形成率を、導入したレプリコンＲＮＡの複製効率を示す値とする。すなわち、コロニー形成率が高いほど、そのレプリコンＲＮＡの複製効率は高い。またレプリコンＲＮＡの複製効率は、形成されたコロニー１個あたりの導入したレプリコンＲＮＡのコピー数で示されるコロニー形成能で表すこともできる。すなわち、以下のような計算式に従って算出することができる。
コロニー形成能＝導入したレプリコンＲＮＡのコピー数［コピー］／コロニー形成数［個］
５．本発明の他の実施形態
本発明に係るレプリコンＲＮＡ複製細胞は、例えばＣ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングするための試験系として使用することもできる。具体的には例えば、被験物質の存在下で、レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製を検出し、その被験物質がレプリコンＲＮＡの複製を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。この場合、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製の検出は、レプリコンＲＮＡ複製細胞から抽出したＲＮＡ中のレプリコンＲＮＡの量又は有無を検出することによるものであってもよいし、培養物中または該培養物に含まれるレプリコンＲＮＡ複製細胞中のタンパク質に含まれるＨＣＶタンパク質の量又は有無を検出するものであってもよい。
このような本発明に係るレプリコンＲＮＡ複製細胞を用いる試験細胞系は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療のための治療剤若しくは診断剤の製造又は評価を目的とすることが考えられる。そのような目的としては、具体的には、以下のような例が挙げられる。
（１）遺伝子型２ａのＨＣＶの増殖を抑制する物質の探索
遺伝子型２ａのＨＣＶの増殖を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的に遺伝子型２ａのＨＣＶの増殖に影響を及ぼす有機化合物、あるいは遺伝子型２ａのＨＣＶゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりＨＣＶの増殖若しくはＨＣＶタンパク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
（２）細胞培養中で抗ウイルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、合理的ドラッグデザイン又はハイスループットスクリーニングを用いて得られた物質（例えば単離精製された酵素）等が挙げられる。
（３）遺伝子型２ａのＨＣＶに感染した患者の治療のための、新規攻撃標的の同定
例えばＨＣＶウイルス増殖のために重要な役割を果たす宿主細胞性タンパク質を同定するために、本発明に係るレプリコン複製細胞を使用することができる。
（４）ＨＣＶウイルスの薬剤等に対する耐性獲得能の評価及び該耐性に関わる変異の同定
（５）Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断薬又は治療薬の開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質の製造
（６）Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断薬又は治療薬の開発、製造及び評価のために使用しうるＨＣＶウイルス又はウイルス様粒子を製造するための、ウイルスゲノム複製系
（７）遺伝子型２ａのＨＣＶに対するワクチンとして使用可能なワクチン抗原の製造
（８）遺伝子治療用の外来遺伝子を組み込んで使用する、肝細胞指向性遺伝子ベクターの製造
６．実施例
本発明を、以下の実施例及び図面に基づいてさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１： レプリコンＲＮＡの作製
（Ａ）発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルスＪＦＨ−１株（遺伝子型２ａ）のウイルスゲノム全領域に対応するＤＮＡを、該ウイルス株のゲノム全長ｃＤＮＡを含むＪＦＨ−１クローンから取得して、ｐＵＣ１９プラスミドに挿入したＴ７ ＲＮＡプロモーター配列の下流に挿入した。このようにして構築されたプラスミドＤＮＡを、以下、ｐＪＦＨ１と称する。同様に、慢性肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルスＪＣＨ−１株（遺伝子型２ａ）のウイルスゲノム全領域に対応するＤＮＡを、該ウイルス株のゲノム全長ｃＤＮＡを含むＪＣＨ−１クローンから取得して、ｐＵＣ１９プラスミドに挿入したＴ７ ＲＮＡプロモーター配列の下流に挿入した。このようにして構築されたプラスミドＤＮＡを、以下、ｐＪＣＨ１と称する。なお、上記ＪＦＨ−１クローン及びＪＣＨ−１クローンの作製については、特開２００２−１７１９７８号公報及びＫａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００１）６４（３）ｐ．３３４−３３９に記載されている。またＪＦＨ−１クローンの全長ｃＤＮＡの塩基配列は、国際ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）のアクセッション番号：ＡＢ０４７６３９に、ＪＣＨ−１クローンの全長ｃＤＮＡの塩基配列はアクセッション番号：ＡＢ０４７６４０に登録されている。
このようにして構築したプラスミドＤＮＡ ｐＪＦＨ１及びｐＪＣＨ１の構造を、図１の上段に示す。「Ｔ７」はＴ７ ＲＮＡプロモーター、「Ｇ」は、挿入したＪＦＨ−１又はＪＣＨ−１由来ＤＮＡの５’端の上流かつＴ７ ＲＮＡプロモーター配列の３’端の下流に挿入したｄＧＴＰ、を示す。「５’ＮＴＲ」から「３’ＮＴＲ」までがＣ型肝炎ウイルスのゲノム全領域に対応するＤＮＡである。
次に、プラスミドＤＮＡ ｐＪＦＨ１及びｐＪＣＨ１の構造領域と非構造領域の一部を、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とも称する）及びＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）で置換して、プラスミドＤＮＡ ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１及びｐＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１をそれぞれ構築した（図１の下段）。この構築手順は、既報（Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９）２８５，ｐ．１１０−１１３）に従った。具体的には、プラスミドｐＪＦＨ１及びｐＪＣＨ１を制限酵素ＡｇｅＩ及びＣｌａＩで切断し、その切断部位に、ｐＪＦＨ−１由来の５’ＮＴＲからＣｏｒｅ領域におよぶ配列とｐＲＳＶ５ＮＥＯ由来のネオマイシン耐性遺伝子とをＰＣＲ増幅により結合し制限酵素ＡｇｅＩとＰｍｅＩで切断した断片、及びＥＭＣＶ ＩＲＥＳからＮＳ３領域におよぶ配列をＰＣＲ増幅により結合し制限酵素ＰｍｅＩとＣｌａＩで切断した断片を、挿入し連結した。
また、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１中のＮＳ５Ｂ領域について、該領域にコードされるＲＮＡポリメラーゼの活性中心に相当するアミノ酸モチーフＧＤＤをＧＮＤに変異させる突然変異を導入して、突然変異プラスミドクローンｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤを作製した。
さらに、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１中のＮＳ５Ｂ領域について、該領域にコードされるＲＮＡポリメラーゼの活性中心に相当するアミノ酸モチーフＧＤＤを含む連続した１０アミノ酸配列を欠失させる突然変異を導入して、突然変異プラスミドクローンｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤを作製した。
なお上記で作製した突然変異クローンｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤ及びｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤは、それらにコードされているＮＳ５Ｂタンパク質の活性部位のアミノ酸配列が変異しているため、レプリコンＲＮＡを複製するのに必要な活性ＮＳ５Ｂタンパク質を発現することができない。
（Ｂ）レプリコンＲＮＡの作製
レプリコンＲＮＡ合成に用いる鋳型ＤＮＡを作製するために、上記のとおり構築した発現ベクターｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤを、それぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断した。
次いで、これらのＸｂａＩ切断断片のそれぞれについて、１０〜２０μｇを５０μｌの反応液中に含有させ、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ ２０Ｕを用いて３０℃で３０分間インキュベートすることにより、さらに処理した。Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅは、二本鎖ＤＮＡ中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記ＸｂａＩ切断断片をそのまま鋳型として用いてＲＮＡ合成を行うと、ＸｂａＩの認識配列の一部であるＣＵＧＡの４塩基が３’末端に余分に付加されたレプリコンＲＮＡが合成されてしまう。そこで本実施例では、ＸｂａＩ切断断片をＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅで処理することにより、ＸｂａＩ切断断片からＣＵＧＡの４塩基を除去した。この後、ＸｂａＩ切断断片を含むＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理後の溶液について、通常法に従ったタンパク質除去処理により、ＣＵＧＡの４塩基が除去されたＸｂａＩ切断断片を精製して、これを鋳型ＤＮＡとした。
次に、この鋳型ＤＮＡから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ合成した。このＲＮＡ合成にはＡｍｂｉｏｎ社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔを用いた。鋳型ＤＮＡを０．５〜１．０マイクログラム含む反応液２０μｌを製造業者の使用説明書に従って反応させた。
ＲＮＡ合成終了後、反応溶液にＤＮａｓｅ（２Ｕ）を添加して３７℃で１５分間反応させた後、さらに酸性フェノールによるＲＮＡ抽出を行って、鋳型ＤＮＡを除去した。このようにしてｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤに由来する上述の鋳型ＤＮＡから合成したＲＮＡ（レプリコンＲＮＡ）を、それぞれｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤと命名した。これらのレプリコンＲＮＡの塩基配列を、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１については配列番号１及び図２Ａ〜Ｆ、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１については配列番号２及び図３Ａ〜Ｆ、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤについては配列番号７、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤについては配列番号８に示す。
実施例２： レプリコン複製細胞クローンの樹立
（Ｃ）レプリコンＲＮＡのトランスフェクション、トランスフェクション細胞のコロニー形成能の測定、及び細胞クローンの樹立
上記の合成レプリコンＲＮＡ（ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤ）のそれぞれについて、様々な量のレプリコンＲＮＡをＨｕｈ７細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して、ＲＮＡ総量が１０μｇとなるように調製した。次いでその混合ＲＮＡをエレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、１６時間から２４時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を様々な濃度で添加した。その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続した。播種時から２１日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。染色されたコロニー数を計測し、トランスフェクションしたレプリコンＲＮＡ量１μｇ当たりに得られたコロニー数を計算した。
コロニー形成が認められたｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１又はｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１トランスフェクション細胞については、上記の培養２１日後の培養ディッシュからさらに生存細胞のコロニーをクローン化し、培養を継続した。このようなコロニーのクローニングにより、細胞クローンを複数株樹立することができた。
樹立した細胞クローンについては、後述の実施例４と同様にして、複製レプリコンＲＮＡの検出、ネオマイシン耐性遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認、及びＨＣＶタンパク質の発現の確認を行った。細胞中でのレプリコンの複製が確認された細胞クローンを、レプリコン複製細胞クローンとした。
（Ｄ）各トランスフェクション細胞におけるコロニー形成能
上記のトランスフェクションの結果、トランスフェクションしたレプリコンＲＮＡ １μｇ当たりのコロニー形成能は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞では、Ｇ４１８濃度が１．０ｍｇ／ｍｌの場合、９４７００ ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ；コロニー形成単位）／μｇ・ＲＮＡであった（図４の左列）。これに対して、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤ、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤをそれぞれトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞では、コロニー形成が認められなかった（図４の中央列及び右列）。このことは、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１レプリコンＲＮＡをトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞のコロニー形成能は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１から発現されるＮＳ５Ｂ（ＲＮＡポリメラーゼ）の活性に依存していることを示す。つまり、コロニーを形成した細胞では、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１から発現されるＮＳ５ＢのはたらきによりｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１レプリコンＲＮＡが自律複製することによって、ネオマイシン耐性遺伝子が持続的に発現されＧ４１８耐性が維持される結果、細胞増殖が可能になったものと考えられた。
一方、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１をトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞では、Ｇ４１８濃度が１〜０．５ｍｇ／ｍｌの場合にはコロニー形成が認められなかった（図５）。Ｇ４１８濃度を０．２５ｍｇ／ｍｌに下げた場合には、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１をトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞でもコロニー形成が認められた。
さらに、上記（Ｂ）で得られた発現ベクターｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＸｂａＩ切断断片をＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅで処理せずにＲＮＡ合成の鋳型ＤＮＡとして用いてレプリコンＲＮＡを合成し、それを上記（Ｃ）と同様にしてＨｕｈ７細胞にトランスフェクションした。Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理を行わずに作製したこのレプリコンＲＮＡには、ＣＵＧＡの４塩基が３’末端に余分に付加されていた。
この結果、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅで処理せずに作製したレプリコンＲＮＡをトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞のコロニー形成能は、５１２ ＣＦＵ／μｇ・ＲＮＡに低下した（図６の左側）。このことから、レプリコンＲＮＡの３’末端の配列がトランスフェクションした細胞のコロニー形成能に影響を及ぼすことが明らかになった。
【実施例３】
（Ｅ）レプリコン複製細胞由来の複製レプリコンＲＮＡの再トランスフェクション
実施例２に従ってｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＨｕｈ７細胞へのトランスフェクションにより樹立したレプリコン複製細胞クローンから、常法により全ＲＮＡ（トータルＲＮＡ）を抽出した。この細胞性ＲＮＡに含まれる複製レプリコンＲＮＡのコピー数を、ノーザンブロット解析及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により決定した。
ノーザンブロット解析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）の記載に従って行った。細胞から抽出したＲＮＡを変性アガロース電気泳動に供し、泳動終了後に該ＲＮＡをポジティブチャージナイロン膜に転写した。ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１から作製した３２ＰラベルしたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、前記のとおり膜に転写したＲＮＡに対しハイブリダイゼーションさせ、次いでその膜を洗浄し、それをフィルムに感光させることにより、レプリコン特異的なＲＮＡバンドを検出した。
レプリコンＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる検出は、Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｔ，Ｋａｔｓｕｍｅ Ａ，Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ａｂｅ Ａ，Ｉｎｏｕｅ Ｋ，Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ Ｋ，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｒ，Ｔａｎａｋａ Ｓ，Ｋｏｈａｒａ Ｍ．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１６：６３６−６４２（１９９９）に従いＨＣＶ ＲＮＡの５’非翻訳領域のＲＮＡを検出することによりおこなった。具体的には、細胞から抽出したＲＮＡに含まれるレプリコンＲＮＡを、合成プライマー、Ｒ６−１３０−Ｓ１７，５’−ＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧ−３’（配列番号１３）、Ｒ６−２９０−Ｒ１９，５’−ＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧ−３’（配列番号１４）、ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ，Ｒ６−１４８−Ｓ２１ＦＴ，５’−ＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣ−３’（配列番号１５）とＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔを用いてＰＣＲ増幅し、次いでＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍにより検出した。
次に、上記レプリコン複製細胞クローンのうちのクローン６、及びプールクローン（コロニー形成したレプリコン複製細胞を１ディッシュ分集めて培養した細胞）から抽出したトータル細胞性ＲＮＡの一部を、再トランスフェクションにより新たなＨｕｈ７細胞へ導入した。トランスフェクションに用いたトータル細胞性ＲＮＡは、上記で測定したレプリコンＲＮＡのコピー数に基づき、１×１０７コピーのレプリコンＲＮＡを含むように調製した。トランスフェクションを上記（Ｃ）と同様の手法で行い、次いでＧ４１８濃度が１ｍｇ／ｍｌの条件下で選択培養したところ、レプリコン複製細胞のコロニー形成がみとめられた（図７）。この場合のコロニー形成能は、得られたコロニー数から計算すると、トランスフェクションに用いたレプリコンＲＮＡの１×１０６コピー当たり１コロニー以上であった。
一方、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を鋳型としてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより試験管内で合成したｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ＲＮＡのコピー数は、ＲＮＡの重量とＲＮＡの長さから計算すると約２×１０１１コピー／μｇ・ＲＮＡであり、このｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ＲＮＡを上記と同様にしてトランスフェクションに用いた場合のコロニー形成能は、５×１０７コピー当たり１コロニーであった。このような結果から、レプリコン複製細胞から抽出した細胞由来ＲＮＡとｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ＲＮＡを同じコピー数のレプリコンＲＮＡとしてＨｕｈ７細胞にトランスフェクションした場合、Ｈｕｈ７細胞内で複製されたレプリコンＲＮＡを用いると、コロニー形成能がｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ＲＮＡと比べて５０倍程度高いことが明らかになった。
【実施例４】
（Ｆ）レプリコンＲＮＡの検出
上記（Ｅ）に従ってｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＨｕｈ７細胞へのトランスフェクションにより樹立したレプリコン複製細胞クローンから取得したトータルＲＮＡを新たなＨｕｈ７細胞に再トランスフェクションして樹立した細胞クローン［クローン１〜１１］及びそれらのプールクローン（コロニー形成した細胞クローンを１ディッシュ分集めて培養した細胞）から、酸性フェノール抽出法によりトータルＲＮＡを抽出した。次いでこのトータルＲＮＡをノーザンブロット法により解析した。プローブとしてはｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブを用いた。対照としては、トランスフェクションを行っていないＨｕｈ７細胞から同様に抽出したトータルＲＮＡ（図８中、「Ｈｕｈ７」として示す）、Ｈｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の７乗コピー加えたサンプル（図８中、「１０７」として示す）、及びＨｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の８乗コピー加えたサンプル（図８中、「１０８」として示す）を用いた。図８中、１〜１１は細胞クローンの番号である。
この結果、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１と同程度の大きさのＲＮＡがｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブにより検出された（図８）。これにより、最初にトランスフェクションしたｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１に由来するレプリコンＲＮＡが細胞クローン内で複製増殖していることが確認された。また細胞クローン間で、複製レプリコンＲＮＡの量に差があることが示された。図８中、例えば、クローン２、６，９、１０は複製レプリコンＲＮＡの量が多く、クローン４、８，１１は複製レプリコンＲＮＡの量が少なかった。
（Ｇ）ネオマイシン耐性遺伝子のゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認
実施例３の手順と同様にして作製した、レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローンについて、その細胞クローンのＧ４１８に対する耐性がネオマイシン耐性遺伝子のゲノムへの組み込みによるものでないことを確認するために、ネオマイシン耐性遺伝子特異的プライマー（センスプライマー、ＮＥＯ−Ｓ３：５’−ＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡ−３’（配列番号１６），アンチセンスプライマー、ＮＥＯ−Ｒ：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号１７））を用いて、細胞クローンから抽出した宿主細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅を行った。用いた細胞クローンは、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン１〜８（ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来細胞クローン１〜８）、及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン１〜６（ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン１〜６）であった。この結果、図９に示すとおり、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来細胞クローンについては、調べた８クローン中、ネオマイシン耐性遺伝子の増幅が示された陽性クローンは認められなかった。ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローンについては、調べた６クローン中１クローンのみが陽性であった（図９中、右側写真のレーン３）。この陽性クローンは、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡ中のネオマイシン耐性遺伝子が宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれたことにより、Ｇ４１８耐性を獲得したと考えられた。この陽性クローンにおいては、他のクローンとは異なり、レプリコンＲＮＡ自体は細胞内で自律複製していないものと考えられた。このことは、次の（Ｈ）に示す実験で、この陽性クローンからＨＣＶタンパク質が検出されなかったことにより確認された。
（Ｈ）ＨＣＶタンパク質の検出
ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１トランスフェクション細胞クローンから常法によりタンパク質を抽出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法により解析した（図１０）。調べた細胞クローンは、上記（Ｇ）で用いたものと同じであり、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来細胞クローン１〜８、及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン１〜６である。また、ＮＳ３遺伝子を含む発現プラスミドＤＮＡをＨｕｈ７細胞にトランジエントにトランスフェクションして得られた細胞抽出液を陽性対照（ＮＳ３タンパク質）とした。さらに、トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞から抽出したタンパク質を陰性対照として用いた。それぞれの細胞クローンから抽出したタンパク質試料をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にブロッティングし、抗ＮＳ３特異的抗体（Ｄｒ．Ｍｏｒａｄｐｏｕｒより分与されたもの；Ｗｏｌｋ Ｂ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０００；７４：２２９３−２３０４）を用いて複製レプリコンＲＮＡにコードされているＮＳ３タンパク質を検出した。図１０に示されるとおり、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来細胞クローン１〜８及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン１、２、４〜６では、陽性対照と同じ大きさのタンパク質が検出された。なおｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン３（上記（Ｇ）で陽性クローンとして検出されたクローン）では、ＮＳ３タンパク質の発現は検出されなかった。すなわち、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン３では、レプリコンＲＮＡの複製は確認されなかった。トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞でＮＳ３タンパク質が検出されなかったため、ＮＳ３タンパク質が検出された細胞クローンでは、トランスフェクションされたレプリコンＲＮＡが自律複製することによりＮＳ３タンパク質が発現されていることが判明した。
なお、Ｃ型肝炎患者の血清を抗体として用いることにより、上記でＮＳ３タンパク質の発現が確認された各細胞クローンについて、レプリコンＲＮＡからのＮＳ５ａタンパク質の発現も確認した。
以上の（Ｇ）及び（Ｈ）の結果から、レプリコンＲＮＡをトランスフェクションして樹立した細胞クローンでは、レプリコンＲＮＡが複製されていることが確認された。
【実施例５】
（Ｉ）適合変異の解析
実施例３に従って、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＨｕｈ７細胞へのトランスフェクションを経て樹立したレプリコン複製細胞クローンから取得したトータルＲＮＡを新たなＨｕｈ７細胞に再トランスフェクションして、２１の細胞クローンを樹立した。これらの細胞クローンから、常法によりトータルＲＮＡをそれぞれ抽出した。このトータルＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とプライマー９６４１Ｒ−ＩＨ（５’−ＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＣ−３’（配列番号１８））によりレプリコンＲＮＡに対応するｃＤＮＡを合成した。逆転写反応によるｃＤＮＡ合成のための反応液組成を以下に示す。
ｃＤＮＡ合成反応としては、まず上記のＲＮａｓｉｎとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ以外の試薬を混合して最初の反応液を調製し、それを９０℃で３分間加熱した後、氷上で冷却した。その後、この反応液にＲＮａｓｉｎとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを添加して４２℃で１時間反応させた後、さらに７０℃で１５分間反応させた。
さらに、このようにして得られたｃＤＮＡについて、以下の手順により５組のプライマーセットを用いるＰＣＲ増幅を行って、レプリコンＲＮＡのほぼ全領域にわたるＤＮＡ増幅断片を得た。用いたプライマーセット及びその各々により増幅される領域を下記の表１及び表２に示す。
なお表１中、増幅領域はｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１（配列番号１）において対応する塩基番号で示した。
このＰＣＲ反応における反応液組成は以下のとおりである。
また、ＰＣＲ反応の条件は、以下のとおりであった：９５℃で２分間；９８℃で１０秒間に続き６８℃で８分間を３５サイクル；７２℃で７分間；４℃で保持。
以上のようにして得られた各ＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、そのＤＮＡ配列対応するＲＮＡ配列とｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の配列との比較を行った。その結果を表３に示す。
表３のとおり、２１の細胞クローンにおいて認められた塩基変異は全部で２５個あったが、そのうち２２個はアミノ酸の変異を引き起こす非同義置換であった。これらの変異の種類を、表４に示す。またこれらの変異の非構造領域における位置を図１１に示す。
表４及び図１１において、「Ｃ１〜Ｃ６」は、変異が見出されたレプリコンＲＮＡを有するレプリコン複製細胞クローンＣ１〜Ｃ６を示す。「塩基番号」はレプリコンＲＮＡ ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の塩基配列（配列番号１）中の対応する塩基の番号として示している。「アミノ酸番号」は、ＪＦＨ−１クローンにコードされるアミノ酸配列（配列番号４）中の対応するアミノ酸の番号として示している。変異部位の塩基及びアミノ酸の種類は、通常の表記法に従って記載されている。表４に示されるとおり、クローンＣ２では、レプリコンＲＮＡ上の配列番号１の塩基番号４９５５に相当する塩基がＣ（シトシン）からＵ（ウラシル）へ変異し、その結果、配列番号４のアミノ酸番号２０９０に相当するアミノ酸がＡ（アラニン）からＶ（バリン）へ変異した。
また図１１に示した変異の位置は、表４に示す塩基番号を付記した縦線で示している。太い縦線は非同義置換、細い縦線は同義置換を表す。
なお、アミノ酸の変異を引き起こす塩基変異を全く有しないクローンも２クローンあった。この２クローンについてノーザンブロット解析を行ったところ、これらの２クローンにおいては、レプリコンＲＮＡの複製量が、アミノ酸変異を生じる塩基変異を有するレプリコンＲＮＡを複製している細胞クローンよりも少ないことが示された。つまり、レプリコンＲＮＡにおけるアミノ酸変異を引き起こす塩基変異は、Ｈｕｈ７細胞においてレプリコンＲＮＡの複製効率を増大させる適合変異であると考えられた。
【実施例６】
（Ｊ）Ｈｕｈ７細胞以外の細胞を用いたレプリコン複製細胞クローンの樹立
実施例１に記載した方法に従って、Ｈｕｈ７細胞以外の肝癌細胞及び非肝臓由来細胞に、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションし、培養ディッシュ中に播種して培養して、コロニー形成の観察とコロニー数の計測を行った。使用した細胞は、以下のとおりである。
（１）ＨｅｐＧ２細胞（Ｈｕｈ７細胞と共に代表的な肝癌細胞である）
（２）ＩＭＹ−Ｎ９細胞（Ｉｔｏらにより樹立された。ＨｅｐＧ２細胞とヒト初代培養肝細胞との融合細胞；Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００１；３４：５６６−５７２）
（３）Ｈｅｌａ細胞（ヒト子宮頸癌由来細胞；Ｃａｎ Ｃｅｒ Ｒｅｓ．１９５２；１２：２６４−２６５）
（４）２９３細胞（ヒト胎児腎由来細胞；Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９７７；３６：５９−７２）
ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、Ｈｅｌａ細胞、又は２９３細胞を用いたトランスフェクションの結果を、それぞれ図１２Ａ〜Ｄに示す。図１２Ａ〜Ｄに示すとおり、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、Ｈｅｌａ細胞、及び２９３細胞はともに、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１トランスフェクション細胞におけるコロニー形成を示した。
樹立した細胞クローンは、後述の（Ｌ）、（Ｍ）と同様にして、複製レプリコンＲＮＡの検出、ネオマイシン耐性遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認、及びＨＣＶタンパク質の発現の確認を行った。こうして細胞中でのレプリコンの複製が確認された細胞クローンを、レプリコン複製細胞クローンとした。すなわち、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を用いることにより、今まで、ＨＣＶレプリコン複製細胞の作出に成功していなかった（Ｂｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０００）２９０，１９７２−１９７４）、Ｈｕｈ７以外の肝癌細胞、及び非肝細胞でのＨＣＶレプリコン複製細胞の作製が可能であることが示された。
（Ｋ）Ｈｕｈ７細胞以外の細胞を用いたレプリコン複製細胞におけるレプリコンＲＮＡの検出
ノーザンブロット解析は、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））の記載に従って行った。前項（Ｊ）に従い、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をＨｅｐＧ２、ＩＭＹ−Ｎ９あるいはＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションにより樹立したレプリコン複製細胞クローン、及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を２３９細胞へのトランスフェクションにより樹立したレプリコン複製細胞のプールクローン（コロニー形成した細胞クローンを１ディッシュ分集めて培養した細胞）から、酸性フェノール抽出法によりトータルＲＮＡを抽出した。次いでこのトータルＲＮＡをノーザンブロット法により解析した。プローブとしてはｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブを用いた。対照としては、トランスフェクションを行っていないＨｕｈ７細胞及び、ＨｅｐＧ２細胞から同様に抽出したトータルＲＮＡ（図１３中、レーン１及び１７）、Ｈｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の７乗コピーあるいは、１０の８乗コピー加えたもの（図１３中、レーン２及び３）を用いた。この結果、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１と同程度の大きさのＲＮＡがｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブにより検出された（図１３）。これにより、最初にトランスフェクションしたｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１に由来するレプリコンＲＮＡが細胞クローン内で複製増殖していることが確認された。また細胞の種類により、複製レプリコンＲＮＡの量に差があり、ＩＭＹ−Ｎ９細胞は極めて効率よくレプリコンＲＮＡを複製することが明らかになった。また、クローン間で複製レプリコンＲＮＡの量に差があることが明らかになった。
（Ｌ）ネオマイシン耐性遺伝子のゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認
樹立したレプリコンＲＮＡ複製細胞クローンについて、その細胞クローンのＧ４１８に対する耐性がネオマイシン耐性遺伝子のゲノムへの組み込みによるものでないことを確認するために、ネオマイシン耐性遺伝子特異的プライマー（センスプライマー、ＮＥＯ−Ｓ３：５’−ＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡ−３’（配列番号２９）、アンチセンスプライマー、ＮＥＯ−Ｒ：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号３０））を用いて、細胞クローンから抽出した宿主細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅を行った。用いた細胞クローンは、ＨｅｐＧ２細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン１、５、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３、ならびにＩＭＹ−Ｎ９細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１１であった。この結果、図１４に示すとおり、ＨｅｐＧ２細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１導入した細胞クローンについては、調べた９クローン中、ネオマイシン耐性遺伝子の増幅が示された陽性クローンは認められなかった。ＩＭＹ−Ｎ９細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１導入した細胞クローンについては、調べた９クローン中、ネオマイシン耐性遺伝子の増幅が示された陽性クローンは認められなかった。
同様に、Ｈｅｌａ細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン及び２９３細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローンについて、同様の検討を行ったところ、ネオマイシン耐性遺伝子の増幅が示された陽性クローンは認められなかった。
（Ｍ）ＨＣＶタンパク質の検出
樹立した細胞クローンから常法によりタンパク質を抽出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法により解析した（図１５）。調べた細胞クローンは、前項で用いたものと同じであり、ＨｅｐＧ２細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン１、５、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３、ならびにＩＭＹ−Ｎ９細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１１である。また、既報（Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９））に従って、ＨｕＨ７にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を導入して作製したＨＣＶ ＲＮＡレプリコン複製細胞クローンを陽性対照（図１５レーン４−１、Ｃ６）とした。さらに、トランスフェクションしていない細胞から抽出したタンパク質を陰性対照として用いた（図１５レーンＮ）。それぞれの細胞クローンから抽出したタンパク質試料をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にブロッティングし、抗ＮＳ３特異的抗体（Ｄｒ．Ｍｏｒａｄｐｏｕｒより分与されたもの；Ｗｏｌｋ Ｂ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０００；７４：２２９３−２３０４）を用いて複製レプリコンＲＮＡにコードされているＮＳ３タンパク質を検出した。図１５上段に示されるとおり、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン１、５、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３、ならびにＩＭＹ−Ｎ９細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１１では、陽性対照と同じ大きさのタンパク質が検出された。
また、Ｃ型肝炎患者の血清を抗体として用いることにより、上記でＮＳ３タンパク質の発現が確認された各細胞クローンについて、レプリコンＲＮＡからのＮＳ５ａタンパク質の発現の確認をおこなった。この実験では、患者血清を変更して抗ＮＳ５ａ抗体を用いたこと以外は、ＮＳ３タンパク質の発現と同様にして検討を行った。その結果、図１５下段に示すように、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン１、５、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３、ならびにＩＭＹ−Ｎ９細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１１では、陽性対照と同じ大きさのタンパク質が検出された。
同様に、Ｈｅｌａ細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン及び２９３細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローンについて、同様の検討を行ったところ、ＮＳ３及びＮＳ５ａタンパク質の発現が確認できた。
以上のとおり、レプリコンＲＮＡをトランスフェクションして樹立した細胞クローンでは、レプリコンＲＮＡが複製されていることが確認された。
【実施例７】
（Ｎ）適合変異の解析
実施例３に従って、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＨｅｐＧ２及びＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションを経て樹立したレプリコン複製細胞クローンから取得したトータルＲＮＡを新たな各々の細胞に再トランスフェクションすることにより、ＨｅｐＧ２細胞については１４の細胞クローンを、ＨｅＬａ細胞については８の細胞クローンを樹立した。これらの細胞クローンから、常法によりトータルＲＮＡをそれぞれ抽出した。このトータルＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓＣｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とプライマー９６４１Ｒ−ＩＨ（５’−ＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＣ−３’（配列番号３１）によりレプリコンＲＮＡに対応するｃＤＮＡを合成した。逆転写反応によるｃＤＮＡ合成のための反応液組成を以下に示す。
ｃＤＮＡ合成反応としては、まず上記のＲＮＡｓｉｎとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ以外の試薬を混合して最初の反応液を調製し、それを９０℃で３分間加熱した後、氷上で冷却した。その後、この反応液にＲＮＡｓｉｎとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを添加して４２℃で１時間反応させた後、さらに７０℃で１５分間反応させた。
さらに、このようにして得られたｃＤＮＡについて、以下の手順により５組のプライマーセットを用いるＰＣＲ増幅を行って、レプリコンＲＮＡのほぼ全領域にわたるＤＮＡ増幅断片を得た。用いたプライマーセット及びその各々により増幅される領域を下記の表５及び表６に示す。
なお表中、増幅領域は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１（配列番号１）において対応する塩基番号で示した。
このＰＣＲ反応における反応液組成は以下のとおりである。
また、ＰＣＲ反応の条件は、以下のとおりであった：９５℃で２分間；９８℃で１０秒間に続き６８℃で８分間を３５サイクル；７２℃で７分間；４℃で保持。
以上のようにして得られた各ＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、そのＤＮＡ配列対応するＲＮＡ配列とｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の配列との比較を行った。その結果を表７及び８に示す。
表７のとおり、ＨｅｐＧ２細胞については８の細胞クローンにおいて認められた塩基変異は全部で１３個あったが、そのうち８個はアミノ酸の変異を引き起こす非同義置換であった。これらの変異の種類を、表８に示す。一方、ＨｅＬａ細胞については３の細胞クローンにおいて認められた塩基変異は全部で７個あったが、そのうち５個はアミノ酸の変異を引き起こす非同義置換であった。これらの変異の種類を、表８に示す。
表７において、「ＨｅｐＩＨ Ｎｏ．」は、ＨｅｐＧ２細胞を用いてクローン化したレプリコンＲＮＡを有するレプリコン複製細胞クローン番号を示す。「塩基番号」はレプリコンＲＮＡ ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の塩基配列（配列番号１）中の対応する塩基の番号として示している。「アミノ酸番号」は、ＪＦＨ−１クローンにコードされるアミノ酸配列（配列番号４）中の対応するアミノ酸の番号として示している。変異部位の塩基及びアミノ酸の種類は、通常の表記法に従って記載されている。表７に示されるとおり、例えば、クローンＨｅｐＩＨ１では、レプリコンＲＮＡ上の配列番号の塩基番号６８２６に相当する塩基がＣからＡへ変異し、その結果、配列番号のアミノ酸番号２７１４に相当するアミノ酸がＱからＥへ変異したことを示している。同様に表８において、「ＨｅＬａＩＨ Ｎｏ．」は、ＨｅＬａ細胞を用いて、クローン化したレプリコンＲＮＡを有するレプリコン複製細胞クローン番号を示す。
なお、アミノ酸の変異を引き起こす塩基変異を全く有しないクローンについてノーザンブロット解析を行ったところ、レプリコンＲＮＡの複製量は、アミノ酸変異を生じる塩基変異を有するレプリコンＲＮＡを複製している細胞クローンよりも少ないことが示された。つまり、レプリコンＲＮＡにおけるアミノ酸変異を引き起こす塩基変異は、細胞においてレプリコンＲＮＡの複製効率を増大させる適合変異であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
本発明に係るレプリコン複製細胞は、遺伝子型２ａのＨＣＶ由来のＲＮＡ及びＨＣＶタンパク質を持続的に産生させるための培養系として利用することができる。さらに本発明に係るレプリコン複製細胞は、ＨＣＶの複製及び／又はＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として有用である。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−人工配列の説明：レプリコン
配列番号２−人工配列の説明：レプリコン
配列番号７−人工配列の説明：レプリコン
配列番号８〜１２−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１３〜４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【技術分野】
本発明は、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡ、該レプリコンＲＮＡを導入したレプリコン複製細胞、及び該レプリコンＲＮＡの複製効率を増大させる方法に関する。
【背景技術】
Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ、ＨＣＶ）は、フラビウイルス科に属する、一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡをゲノムとするウイルスであり、Ｃ型肝炎の原因となることが知られている。近年の研究により、Ｃ型肝炎ウイルスは遺伝子型又は血清型により多数の型に分類されることが分かってきた。現在主流であるＨＣＶ遺伝子型の分類法である、ＳｉｍｍｏｎｄｓらによるＨＣＶ株の塩基配列を用いた系統解析法ではＨＣＶは遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型３ａ、遺伝子型３ｂの６タイプに分類され（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，（１９９４）１０，ｐ．１３２１−１３２４を参照）、さらにそれらの各タイプがいくつかのサブタイプに分類されている。現在では、ＨＣＶの複数の遺伝子型についてゲノム全長の塩基配列が決定されている（特開２００２−１７１９７８号公報、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８９）２４４，ｐ．３５９−３６２、Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００１）６４（３）ｐ．３３４−３３９、Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，（１９９２）７３ ｐ．６７３−６７９、及びＭｏｒｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｉｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，（１９９２）１８３，ｐ．３３４−３４２を参照）。
ＨＣＶは持続的に感染することにより慢性肝炎を引き起こす。現在、世界的規模で認められる慢性肝炎の主たる原因がＨＣＶ持続感染である。実際、持続感染者の５０％程度が慢性肝炎を発症し、そのうち約２０％の患者が１０年〜２０年を経て肝硬変に移行し、さらにその一部は肝癌といった致死的な病態へと進展する。
Ｃ型肝炎に対する現在の主な治療は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、及びインターフェロン−αとプリン−ヌクレオシド誘導体であるリバビリンとの併用療法により行われている。しかしながら、これらの治療を行っても、全治療者の約６０％に治療効果が認められるだけであり、効果が出た後に治療を中止すると半分以上の患者が再燃する。インターフェロンの治療効果は、ＨＣＶの遺伝子型と関連することが知られており、遺伝子型１ｂに対しては効果が低く、遺伝子型２ａに対してはより効果が高いと言われている（Ｙｏｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，（１９９２）１６（２）：ｐ．２９３−２９９を参照）。
工業国において罹患率が高く、最終的に深刻な結果を招き、かつ現在は原因治療法が存在しないＣ型肝炎に対する効果的な治療薬又は予防薬の開発は重要な目標である。そのため、ＨＣＶ特異的な化学療法、ワクチン療法の発展が切望されている。抗ＨＣＶ薬開発のターゲットとしては、ＨＣＶの複製抑制やＨＣＶの細胞感染の抑制が考えられる。
最近まで、ＨＣＶを細胞培養系で増やすこと、培養細胞に感染させることは困難であり、また、ＨＣＶに感染可能かつ実験可能な動物はチンパンジーしかなかったため、ＨＣＶの複製機構や感染機構の研究は困難であった。しかし最近になって、ＨＣＶ由来の自律複製能を有するＲＮＡとして、ＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンが作製されたことにより（特開２００１−１７１８７号公報、Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９）２８５，ｐ．１１０−１１３、Ｂｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０００）２９０，ｐ．１９７２−１９７４、Ｆｒｉｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００１）７５（２４）：ｐ．１２０４７−１２０５７、及びＩｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００２）７６（６）：ｐ．２９９７−３００６を参照）、培養細胞を用いてＨＣＶの複製機構を解析することが可能となった。これらのＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンは、遺伝子型１ｂのＨＣＶゲノムＲＮＡの５’非翻訳領域中のＨＣＶ ＩＲＥＳの下流に存在する構造タンパク質を、ネオマイシン耐性遺伝子及びその下流に連結したＥＭＣＶ ＩＲＥＳによって置換したものである。このＲＮＡレプリコンは、ヒト肝癌細胞Ｈｕｈ７に導入してネオマイシン存在下で培養することにより、Ｈｕｈ７細胞内で自律複製することが証明された。
しかしながら、このようなＨＣＶの細胞内ＲＮＡ複製系は、未だ遺伝子型１ｂのＨＣＶのゲノムＲＮＡを用いたものしか作製されていない。異なる遺伝子型のＨＣＶではコードされるウイルスタンパク質にも違いがあることが報告されていることから、遺伝子型１ｂのＨＣＶ由来のサブゲノムＲＮＡレプリコンの解析だけでは、ＨＣＶの複製機構を十分に解明することは難しいと考えられる。さらに、インターフェロンの治療効果がＨＣＶの遺伝子型によって異なることから、遺伝子型１ｂのＨＣＶのサブゲノムＲＮＡレプリコンを含むＨＣＶ複製系のみを用いて色々なタイプのＨＣＶに効果を及ぼす抗ＨＣＶ薬を開発することは特に難しいと考えられる。
【発明の開示】
本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる特願２００３−１４８２４２号及び特願２００３−３２９１１５号に記載された内容を包含する。
本発明は、未だレプリコンＲＮＡが作製されていない遺伝子型のＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、遺伝子型２ａのＨＣＶのレプリコンＲＮＡを作製することに成功した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上の、５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡ。このレプリコンＲＮＡは、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子、及び少なくとも１つのＩＲＥＳ配列をさらに含むことが好ましい。
［２］ 配列番号９又は１０のいずれか１つで示される塩基配列からなる５’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、配列番号１１又は１２のいずれか１つで示される塩基配列からなる３’非翻訳領域とを含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡ。
［３］ 遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡが、配列番号３又は５で示される塩基配列からなるＲＮＡである、上記［１］又は［２］記載のレプリコンＲＮＡ。
［４］ 以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡ。
（ａ）配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＲＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２で示される塩基配列において１〜１０個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ、自律複製能を有するＲＮＡ
［５］ 上記［１］〜［４］記載のいずれかのレプリコンＲＮＡを細胞に導入することにより作製された、レプリコン複製細胞。このレプリコン複製細胞において、レプリコンＲＮＡを導入する細胞は、真核細胞であることが好ましく、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがより好ましく、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、及び２９３細胞からなる群より選ばれるいずれかの細胞であることがさらに好ましい。
［６］ Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療剤若しくは診断剤の製造、又は評価のための、上記［１］〜［４］記載のレプリコンＲＮＡ。
［７］ Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療剤若しくは診断剤の製造、又は評価のための、上記［５］記載のレプリコン複製細胞。
［８］ Ｃ型肝炎ウイルス感染に対するワクチンの製造のための、上記［１］〜［４］記載のレプリコンＲＮＡ。
［９］ Ｃ型肝炎ウイルス感染に対するワクチンの製造のための、上記［５］記載のレプリコン複製細胞。
［１０］ 上記［５］記載のレプリコン複製細胞からレプリコンＲＮＡを抽出することを含む、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡの製造方法。
［１１］ 上記［５］記載のレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物からウイルスタンパク質を取得することを含む、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのウイルスタンパク質の製造方法。
［１２］ 被験物質の存在下で、上記［５］記載のレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製を検出することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングする方法。
［１３］ 上記［５］記載のレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得し、取得した複製レプリコンＲＮＡを該レプリコン複製細胞とは別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うことを含む、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡの複製効率を増大させる方法。この方法においては、複製効率の増大が、レプリコン複製細胞に最初に導入されたレプリコンＲＮＡの複製効率と比較して、少なくとも２倍の増大であることがより好ましい。
［１４］ 上記［５］記載のレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得し、取得した複製レプリコンＲＮＡを該レプリコン複製細胞とは別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うこと、及び最終的に得られたレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得することを含む、複製効率が増大した遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造する方法。
［１５］ 上記［１４］記載の方法によって製造された複製効率が増大したレプリコンＲＮＡについて、レプリコン複製細胞に最初に導入されたレプリコンＲＮＡとの間の塩基変異又はアミノ酸変異を検出すること、及び複製効率を増大させようとするレプリコンＲＮＡにその検出された塩基変異又はアミノ酸変異を導入することを含む、複製効率が増大した遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造する方法。
［１６］ 配列番号１で示される塩基配列上において、以下の（ａ）〜（ｕ）：
（ａ）塩基番号７１５７の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｂ）塩基番号４９５５の部位におけるＣからＵへの変異、
（ｃ）塩基番号４９３６の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｄ）塩基番号５０００の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｅ）塩基番号７２８８の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｆ）塩基番号５９０１の部位におけるＧからＵへの変異、
（ｇ）塩基番号６１１３の部位におけるＡからＵへの変異、
（ｈ）塩基番号２８９０の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｉ）塩基番号６８２６の部位におけるＣからＡへの変異、
（ｊ）塩基番号６８８７の部位におけるＣからＡへの変異、
（ｋ）塩基番号６５８０の部位におけるＵからＡへの変異、
（ｌ）塩基番号７１５９の部位におけるＵからＣへの変異、
（ｍ）塩基番号７２３０の部位におけるＵからＡへの変異、
（ｎ）塩基番号６９４３の部位におけるＣからＡへの変異、
（ｏ）塩基番号５６８７の部位におけるＧからＡへの変異、
（ｐ）塩基番号６１１０の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｑ）塩基番号５５５０の部位におけるＵからＣへの変異、
（ｒ）塩基番号７２１７の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｓ）塩基番号３６４３の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｔ）塩基番号５８５１の部位におけるＧからＡへの変異、及び
（ｕ）塩基番号５９１４の部位におけるＧからＡへの変異、
からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する塩基配列からなるレプリコンＲＮＡ。
本発明により、遺伝子型２ａのＨＣＶ株に由来するＨＣＶ−ＲＮＡレプリコンが初めて提供された。本発明に係るレプリコン複製細胞は、遺伝子型２ａのＨＣＶ由来のＲＮＡ及びＨＣＶタンパク質を持続的に産生させるための培養系として用いることができる。さらに本発明に係るレプリコン複製細胞は、ＨＣＶの複製及び／又はＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に係るＨＣＶ−ＲＮＡレプリコンを作製するための鋳型ＤＮＡの構築手順を示す概略図である。図１の上段は、ｐＪＦＨ１及びｐＪＣＨ１のウイルスゲノム挿入領域の構造を示す。図１の下段は、ｐＪＦＨ１及びｐＪＣＨ１のウイルスゲノム挿入領域の一部をネオマイシン耐性遺伝子とＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含むＤＮＡ断片で置換することにより構築したプラスミドＤＮＡ ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１及びｐＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１のウイルスゲノム挿入領域の構造を示す。図中の記号は以下のとおりである。Ｔ７：Ｔ７ ＲＮＡプロモーター、Ｇ：挿入したＪＦＨ−１又はＪＣＨ−１由来ＤＮＡの５’端の上流かつＴ７ ＲＮＡプロモーター配列の３’端の下流に挿入したｄＧＴＰ、５’ＮＴＲ：５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅ：コアタンパク質、３’ＮＴＲ：３’非翻訳領域。Ｅ１、Ｅ２：エンベロープタンパク質。ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ：非構造タンパク質。Ａｇｅ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ：制限酵素Ａｇｅ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ及びＸｂａ Ｉの切断部位。ＧＤＤ：ＮＳ５Ｂタンパク質の活性中心に相当するアミノ酸モチーフＧＤＤの位置。ｎｅｏ：ネオマイシン耐性遺伝子、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位）。
図２Ａ〜Ｆは、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の塩基配列を示す。
図３Ａ〜Ｆは、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１の塩基配列を示す。
図４は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤ及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤをそれぞれトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞のコロニー形成を示した写真である。トランスフェクションしたＲＮＡの量は、上段の３つはいずれも１００ｎｇ、下段の３つはいずれも３００ｎｇである。各培養ディッシュには、１．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した。
図５は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１をそれぞれトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞の、培地中のＧ４１８の濃度が０．５ｍｇ／ｍｌである場合のコロニー形成を示した写真である。トランスフェクションしたＲＮＡの量は、いずれも１００ｎｇである。
図６は、トランスフェクション細胞のコロニー形成能に対する、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理の影響を示した写真である。トランスフェクションしたｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１ ＲＮＡの量は、いずれも１００ｎｇである。いずれも培地中のＧ４１８の濃度は１．０ｍｇ／ｍｌである。
図７は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションして樹立したレプリコン複製細胞クローン由来のトータル細胞性ＲＮＡを新たなＨｕｈ７細胞に再トランスフェクションした場合に示されるコロニー形成を示す写真である。左側写真は、レプリコン複製細胞クローン６由来のトータル細胞性ＲＮＡを用いて９６コロニーの形成がみとめられた結果、右側写真：プールクローン由来のトータル細胞性ＲＮＡを用いて７７コロニーの形成がみとめられた結果を示す。いずれもレプリコンＲＮＡを１×１０７コピー含む量を再トランスフェクションした。
図８は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションして樹立したレプリコン複製細胞クローン由来のトータル細胞性ＲＮＡを新たなＨｕｈ７細胞に再トランスフェクションして得た細胞クローン由来のトータルＲＮＡに対して、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブを用いてノーザンブロット法による検出を行った結果を示す写真である。レーンの説明は以下のとおりである。１０８：Ｈｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の８乗コピー加えたサンプル、１０７：Ｈｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の７乗コピー加えたサンプル、Ｈｕｈ７：トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡ、プールクローン：プールクローンから抽出したトータルＲＮＡ、１〜１１：細胞クローン１〜１１のそれぞれから抽出したトータルＲＮＡ。「レプリコンＲＮＡ」は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の分子量サイズを示すマーカー、「２８Ｓ」は４．５ｋｂの分子量サイズを示すリボソームＲＮＡマーカー、「１８Ｓ」は１．９ｋｂの分子量サイズを示すリボソームＲＮＡマーカーの泳動位置を示す。
図９は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１又はｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来複製レプリコンＲＮＡが再トランスフェクションされた細胞クローンにおける、ネオマイシン耐性遺伝子の宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みの有無を示す写真である。左側写真のレーンの説明は以下のとおりである。Ｍ：ＤＮＡ分子量マーカー、１〜８：ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来細胞クローン１〜８、Ｎ：トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞、Ｐ：陽性対照（ネオマイシン耐性遺伝子のＰＣＲ増幅産物）。一方、右側写真のレーンの説明は以下のとおりである。Ｍ：ＤＮＡ分子量マーカー、１〜６：ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン１〜６。
図１０は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１又はｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来複製レプリコンＲＮＡが再トランスフェクションされた細胞クローンにおいて、発現されたＮＳ３タンパク質の検出結果を示す写真である。左側写真のレーン１〜８：ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来細胞クローン１〜８。右側写真のレーン１〜６：ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン１〜６。右側写真のレーンのＰ：ＮＳ３タンパク質（陽性対照）、Ｎ：トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞から抽出したタンパク質（陰性対照）。
図１１は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡのＨｕｈ７細胞への再トランスフェクションを経て樹立した２１の細胞クローンから取得したレプリコンＲＮＡ中の塩基変異の位置を示す図である。変異の位置は、表４に示す塩基番号を付記した縦線で示している。太い縦線は非同義置換、細い縦線は同義置換を表す。
図１２は、Ａ：ＨｅｐＧ２細胞、Ｂ：ＩＭＹ−Ｎ９細胞、Ｃ：２９３細胞、又はＤ：Ｈｅｌａ細胞を用いたｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１トランスフェクションの結果を示す写真である。各培養ディッシュには、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した。
図１３は、レプリコン複製細胞クローンのノーザンブロッティングの結果を示す写真である。レーン１：ＨｅｐＧ２（陰性対照）、レーン２：合成ＲＮＡ １０８コピー、レーン３：合成ＲＮＡ １０７コピー、レーン４：Ｈｅｐ−ＩＨ−１（ＨｅｐＧ２細胞由来）、レーン５：Ｈｅｐ−ＩＨ−３（ＨｅｐＧ２細胞由来）、レーン６：Ｈｅｐ−ＩＨ−５（ＨｅｐＧ２細胞由来）、レーン７：Ｈｅｐ−ＩＨ−１１（ＨｅｐＧ２細胞由来）、レーン８：Ｈｅｐ−ＩＨ−１３（ＨｅｐＧ２細胞由来）、レーン９：ＩＭＹ−ＩＨ−３（ＩＭＹ−Ｎ９細胞由来）、レーン１０：ＩＭＹ−ＩＨ−４（ＩＭＹ−Ｎ９細胞由来）、レーン１１：ＩＭＹ−ＩＨ−７（ＩＭＹ−Ｎ９細胞由来）、レーン１２：ＩＭＹ−ＩＨ−１０（ＩＭＹ−Ｎ９細胞由来）、レーン１３：２９３−ＩＨをトランスフェクトした細胞プール（２９３細胞由来）、レーン１４：ＨｅＬａ−ＩＨ−９（ＨｅＬａ細胞由来）、レーン１５：ＨｅＬａ−ＩＨ−１２（ＨｅＬａ細胞由来）、レーン１６：ＨｅＬａ−ＩＨ−１３（ＨｅＬａ細胞由来）、レーン１７：ＨｅＬａ（陰性対照）。
図１４は、ネオマイシン耐性遺伝子のゲノムＤＮＡへの組み込みを確認するための電気泳動の結果を示す写真である。ＨｅｐＧ２レプリコン細胞（上段）及びＩＭＹ−Ｎ９レプリコン細胞（下段）のそれぞれのゲノムＤＮＡについて、ＰＣＲ解析によりネオマイシン耐性遺伝子を検出した。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー、Ｐ：陽性対照、Ｈ：
図１５は、レプリコン複製細胞クローン由来のタンパク質ＮＳ３及びＮＳ５ａをウエスタンブロット法により解析した結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明に係るＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡ
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のゲノムは、約９６００ヌクレオチドからなる（＋）鎖の一本鎖ＲＮＡである。このゲノムＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ又は５’ＵＴＲとも表記する）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、及び３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ又は３’ＵＴＲとも表記する）からなる。その構造領域にはＨＣＶの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。
このようなＨＣＶの構造タンパク質と非構造タンパク質は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによって限定分解を受けて構造タンパク質（Ｃｏｒｅ、Ｅ１、及びＥ２）と非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ）とが各タンパク質として遊離することにより、生成される。これらの構造タンパク質及び非構造タンパク質（すなわち、ＨＣＶのウイルスタンパク質）のうち、Ｃｏｒｅはコアタンパク質であり、Ｅ１及びＥ２はエンベロープタンパク質であり、非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ）はウイルス自身の複製に関与するタンパク質である。ＮＳ２はメタロプロテアーゼ活性、ＮＳ３はセリンプロテアーゼ活性（Ｎ末端側の３分の１）とヘリカーゼ活性（Ｃ末端側の３分の２）を有することが知られている。またＮＳ４ＡはＮＳ３のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有することも報告されている。そして、遺伝子型２ａのＨＣＶのゲノムも同様の遺伝子構造を有することがすでに報告されている（特開２００２−１７１９７８号公報を参照）。
本発明者らは、このような遺伝子型２ａのＨＣＶゲノムを用いて、自律的に複製することが可能なＲＮＡを構築した。すなわち本発明のＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡは、遺伝子型２ａのＨＣＶゲノムの全体又は部分ＲＮＡを含む自律複製能を有するＲＮＡ構築物である。
本明細書では、自律複製能を有しておりＨＣＶウイルスゲノムを改変して作製されたＲＮＡを、「レプリコンＲＮＡ」又は「ＲＮＡレプリコン」と呼び、遺伝子型２ａのＨＣＶから人為的に作製される自律複製能を有するＲＮＡを、遺伝子型２ａのＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡと称する。本明細書においてＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡは、ＨＣＶ−ＲＮＡレプリコンとも称する。
本発明において、「遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルス」「遺伝子型２ａのＨＣＶ」とは、Ｓｉｍｍｏｎｄｓらによる国際分類に従って遺伝子型２ａと同定されるＣ型肝炎ウイルスを意味する。本発明における「遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルス」「遺伝子型２ａのＨＣＶ」には、天然由来のＨＣＶゲノムＲＮＡを有するウイルスだけでなく、天然由来のＨＣＶゲノム配列に人為的な改変を加えたゲノムＲＮＡを有するウイルスも包含する。遺伝子型２ａのＨＣＶの具体例としては、ＪＦＨ−１株及びＪＣＨ−１株（特開２００２−１７１９７８号公報を参照）等のウイルスが挙げられる。
さらに「遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ」とは、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスの一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡからなるゲノムの全領域にわたる塩基配列を有するＲＮＡを意味する。限定するものではないが、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡは、好ましくは配列番号３又は５で示される塩基配列からなるＲＮＡである。
本願明細書において、「５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ又は５’ＵＴＲ）」、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」、「Ｃｏｒｅタンパク質をコードする配列（Ｃｏｒｅ領域又はＣ領域）」、「Ｅ１タンパク質をコードする配列（Ｅ１領域）」、「Ｅ２タンパク質をコードする配列（Ｅ２領域）」、「Ｎ２タンパク質をコードする配列（ＮＳ２領域）」、「ＮＳ３タンパク質をコードする配列（ＮＳ３領域）」、「ＮＳ４Ａタンパク質をコードする配列（ＮＳ４Ａ領域）」、「ＮＳ４Ｂタンパク質をコードする配列（ＮＳ４Ｂ領域）」、「ＮＳ５Ａタンパク質をコードする配列（ＮＳ５Ａ領域）」、「ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列（ＮＳ５Ｂ領域）」、及び「３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ又は３’ＵＴＲ）」、並びにその他の特定の領域若しくは部位は、遺伝子型２ａのＨＣＶであるＪＦＨ−１株のゲノム全領域をコードする全長ｃＤＮＡ（ＪＦＨ−１クローン）の塩基配列（配列番号３）を基準として、定めるものとする。配列番号３の塩基配列は、国際ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）からアクセッション番号ＡＢ０４７６３９により取得可能である。具体的には、配列番号３で示される塩基配列に対して特定のＨＣＶのＲＮＡ配列をアラインメントしたときに、配列番号３で示される塩基配列上の塩基番号１〜３４０にアラインメントされる配列がそのＲＮＡの「５’非翻訳領域」、同塩基番号３４３１〜９４４２にアラインメントされる配列が「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」、同塩基番号３４３１〜５３２３にアラインメントされる配列が「ＮＳ３タンパク質をコードする配列」、塩基番号５３２４〜５４８５にアラインメントされる配列が「ＮＳ４Ａタンパク質をコードする配列」、同塩基番号５４８６〜６２６８にアラインメントされる配列が「ＮＳ４Ｂタンパク質をコードする配列」、同塩基番号６２６９〜７６６６にアラインメントされる配列が「ＮＳ５Ａタンパク質をコードする配列」、塩基番号７６６７〜９４４２にアラインメントされる配列が「ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」、同塩基番号９４４３〜９６７８にアラインメントされる配列が「３’非翻訳領域」である。また、この場合「アラインメント」される配列にはギャップ、付加、欠失、置換等が存在していてもよい。さらに上記の「特定のＨＣＶ」は、限定するものではないが、ＪＦＨ−１株若しくはＪＣＨ−１株又はそれらの誘導体であるウイルス株を包含する。
本発明に係るＨＣＶ ＲＮＡ−レプリコンの一つの実施形態は、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上の、５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、３’非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡである。このレプリコンＲＮＡは、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子、及び少なくとも１つのＩＲＥＳ配列をさらに含んでもよい。さらにこのレプリコンＲＮＡは、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上の、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂタンパク質以外のウイルスタンパク質をコードする配列を、含んでもよい。
本発明に係るＨＣＶ ＲＮＡ−レプリコンの別の好適な実施形態は、配列番号９又は１０で示される塩基配列からなる５’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、配列番号１１又は１２で示される塩基配列からなる３’非翻訳領域とを含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡである。ここで配列番号９及び１０で示される塩基配列は、それぞれ、本発明に係るレプリコンＲＮＡであるｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１（配列番号１）及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１（配列番号２）の５’非翻訳領域の配列である。また配列番号１１及び１２で示される塩基配列は、それぞれ、本発明に係るレプリコンＲＮＡであるｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１（配列番号１）及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１（配列番号２）の３’非翻訳領域の配列である。
本発明に係るＨＣＶ ＲＮＡ−レプリコンのさらに好ましい１つの実施形態は、配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡである。さらに、この配列番号１又は２で示される塩基配列において、１〜５０個、１〜３０個、１〜１０個、１〜６個、１〜数個（２〜５個）の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるレプリコンＲＮＡであって、かつ、自律複製能を有するＲＮＡも、好適な実施形態として本発明の範囲に含まれる。本発明において「自律複製能を有する」とは、レプリコンＲＮＡを細胞中に導入したときに、そのレプリコンＲＮＡが細胞内でそのレプリコンＲＮＡ自身の全長を複製することができることを意味する。限定するものではないが、この自律複製能は、例えば、レプリコンＲＮＡをＨｕｈ７細胞中にトランスフェクションし、Ｈｕｈ７細胞を培養し、得られる培養物中の細胞から抽出したＲＮＡについて、導入したレプリコンＲＮＡを特異的に検出可能なプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションを行ってレプリコンＲＮＡの存在を検出することにより、確認することができる。自律複製能を確認するための具体的な操作は、本明細書の実施例に記載されたコロニー形成能の測定、ＨＣＶタンパク質の発現確認、レプリコンＲＮＡの検出等の記載に従って行うことができる。
本発明において「選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子が発現された細胞だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられるが、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましい。但し本発明における選択マーカー遺伝子はこれらに限定されるものではない。
また本発明において「リポーター遺伝子」とは、その遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。リポーター遺伝子の一般的な例としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、トランスポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ若しくはβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のイクリオン遺伝子、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子等が挙げられる。但し本発明におけるリポーター遺伝子はこれらに限定されるものではない。
上記の選択マーカー遺伝子及びリポーター遺伝子は、レプリコンＲＮＡ中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。
本発明における「ＩＲＥＳ配列」とは、ＲＮＡの内部にリボソームを結合させて翻訳を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。本発明におけるＩＲＥＳ配列の好適な例としては、以下に限定するものではないがＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、ＦＭＤＶ ＩＲＥＳ、ＨＣＶ ＩＲＥＳ等が挙げられるが、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及びＨＣＶ ＩＲＥＳがより好ましく、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳが最も好ましい。
さらに本発明に係るレプリコンＲＮＡは、他のＨＣＶ株又は他の遺伝子型のＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の配列を含んでもよい。例えば、遺伝子型１ｂのＨＣＶゲノムの断片を含んでもよい。他のＨＣＶ株としては、例えばＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｈ、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣＴ−１８、Ｈ７７、ＤＫ−７、ＵＳ１１、Ｓ１４、ＨＣＴ２３、ＨＣＶ−Ｔｈ、ＤＲ１、ＤＲ４、ＨＣＴ２７、Ｓ１８、ＳＷ１、ＤＫ９、Ｈ９０、ＴＤ−６Ｅ１、Ｓ９、ＨＣＶ−ＢＫ、Ｔ１０、ＤＫ１、ＨＣ−Ｊ４、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＫ３、ＨＫ８、ＨＫ５、ＨＣＶ−Ｇ３、ＩＮＤ５、ＩＮＤ８、Ｐ１０、Ｄ１、Ｄ３、ＳＷ２、Ｔ３、Ｓ４５、ＳＡ１０、ＵＳ６、ＨＣＶ−ＪＫ１、ＨＣＶ−ＪＫ４、ＨＣＶ−ＪＫ３、ＨＣＶ−ＪＫ２、ＨＣＶ−ＪＴ、ＨＣ−Ｊ２、ＨＣＶ−Ｔ、ＨＫ４、ＨＣ−Ｇ９、Ｚ１、Ｂｉ，Ｓ．Ｉ．、Ｃｈｏ，Ｊ．Ｍ．、ＨＣＶ−Ｊ６、Ｔ４、Ｔ９、ＵＳ１０、ＨＣ−Ｊ５、Ｔ２、ＨＣ−Ｊ７、ＤＫ１１、ＳＷ３、ＤＫ８、Ｔ８、ＨＣ−Ｊ８、Ｓ８３、ＨＫ２、ＨＣ−Ｊ６、ＨＣ−Ｊ８、ＢＥＢＥ１、ＨＣＶ−Ｊ６、ＨＣＶ−Ｊ８、ＨＤ１０−２、ＢＲ３６−９、Ｓ５２、Ｓ５４、Ｓ２、ＢＲ３３−１、ＨＫ１０、ＤＫ１２、ＨＣＶ−ＴＲ、ＢＡ−１、ＢＡ−２、ＤＫ１３、Ｚ１、Ｚ４、Ｚ６、Ｚ７、ＨＫ２、ＳＡ１、ＳＡ４、ＳＡ５、ＳＡ７、ＳＡ１３、ＳＡ６、ＮＺＬ１、ＳＡ３０、ＥＧ−１３、ＨＣＶ−Ｋ３ａ／６５０、ＥＤ４３、ＥＵＨ１４８０、ＥＵＨＫ２、Ｔｈ５８０、ＶＮ２３５、ＶＮ４０５、ＶＮ００４、ＪＫ０４９、ＪＫ０４６、ＪＦＨ−１、ＪＣＨ−１、ＪＣＨ−２、ＪＣＨ−３、ＪＣＨ−４、ＪＣＨ−５、ＪＣＨ−６、Ｊ６ＣＦ、Ｈ７７等が挙げられるが、これらに限定するものではない。
本発明に係るレプリコンＲＮＡは、好ましくは、最も５’側に遺伝子型２ａのＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の５’非翻訳領域を、最も３’側に遺伝子型２ａのＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の３’非翻訳領域を有する。選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子は、ＩＲＥＳ配列の上流に連結されてもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の上流又は下流に連結されてもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の中に挿入されてもよい。
本発明に係るレプリコンＲＮＡは、より好ましくは、最も５’側に遺伝子型２ａのＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の５’非翻訳領域を有し、それよりも下流に選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」とをこの順番で有し、さらに最も３’側に遺伝子型２ａのＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の３’非翻訳領域を有する。
本発明に係るレプリコンＲＮＡには、上記したような配列の他に、レプリコンＲＮＡを導入する細胞内で発現させたい任意の外来遺伝子を含むＲＮＡを含んでもよい。外来遺伝子は、５’非翻訳領域の下流に連結してもよいし、選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子の上流又は下流に連結させてもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の上流又は下流に連結してもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の中に挿入してもよい。外来遺伝子を含むレプリコンＲＮＡは、導入された細胞内で翻訳される際に、該外来遺伝子にコードされたタンパク質を発現することができる。従って外来遺伝子を含むレプリコンＲＮＡは、遺伝子治療などの、特定の遺伝子産物を細胞内で生成させることを目的とする場合にも、好適に使用することができる。
また本発明に係るレプリコンＲＮＡには、さらにリボザイムを含んでいてもよい。リボザイムは、５’側のレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子又は外来遺伝子と、それより３’側のＩＲＥＳ配列及び「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」とを連結するように挿入し、リボザイムの自己切断活性により両者が切断されて分離するようにすることができる。
本発明に係るレプリコンＲＮＡにおいては、上述したような選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上のウイルスタンパク質をコードする配列、遺伝子型２ａ以外のＨＣＶのウイルスタンパク質コード配列、及び外来遺伝子等が、レプリコンＲＮＡから正しい読み枠で翻訳されるように連結される。それらの配列のうちでタンパク質をコードする配列は、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスの「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」から翻訳されるポリタンパク質とともに融合タンパク質として発現させた後で、プロテアーゼによって各タンパク質へと分離するように、プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させてもよい。
２．本発明に係るレプリコンＲＮＡの作製
本発明に係るＨＣＶ ＲＮＡ−レプリコンは、当業者に公知である任意の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。限定するものではないが、ＨＣＶ ＲＮＡ−レプリコンは、例えば以下のような方法で作製することができる。
まず、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡの全領域に対応するＤＮＡを、常法によりＲＮＡプロモーターの下流に連結し、ＤＮＡクローンを作製する。ここで、「ＲＮＡに対応するＤＮＡ」とは、当該ＲＮＡの塩基配列のＵ（ウラシル）をＴ（チミン）に置き換えた塩基配列を有するＤＮＡを意味する。前記ＲＮＡプロモーターは、プラスミドクローン中に含まれるものであることが好ましい。ＲＮＡプロモーターとしては、限定するものではないが、Ｔ７ ＲＮＡプロモーターが特に好ましい。
次に、作製したＤＮＡクローンについて、例えば、５’非翻訳領域の下流に位置する構造領域（Ｃｏｒｅ配列、Ｅ１配列、Ｅ２配列）及びＮＳ２タンパク質をコードする配列を、選択マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子とその下流に連結したＩＲＥＳ配列とを含むＤＮＡ断片によって置換する。この置換においては、構造領域以外の部分、例えば５’非翻訳領域の３’末端側の断片及びＮＳ３タンパク質をコードする配列の一部が、別の遺伝子型のＨＣＶに由来する配列に置換されてもよい。
次いで、その置換したＤＮＡクローンを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。ＲＮＡ合成は、５’非翻訳領域及びＩＲＥＳ配列から、常法により開始させることができる。鋳型ＤＮＡがプラスミドクローンの場合には、そのプラスミドクローンから、ＲＮＡプロモーターの下流に連結された上記ＤＮＡ領域を制限酵素によって切り出して、そのＤＮＡ断片を鋳型として用いてＲＮＡを合成することもできる。なお、好ましくは合成されるＲＮＡの３’末端がウイルスゲノムＲＮＡの３’非翻訳領域と一致し、他の配列が付加されたり削除されたりしないことが好ましい。このようにして合成されたＲＮＡが、本発明に係るレプリコンＲＮＡである。
３．遺伝子型２ａのＨＣＶのレプリコンＲＮＡを導入したレプリコン複製細胞の作製
上記のようにして作製されるレプリコンＲＮＡを、レプリコンＲＮＡを複製させるべき細胞に導入することにより、レプリコンＲＮＡが持続的に複製されている細胞を得ることができる。本明細書では、レプリコンＲＮＡが持続的に増幅されている細胞を「レプリコン複製細胞」と称する。
レプリコンＲＮＡを導入する細胞としては、継代培養することが可能な細胞であれば任意の細胞を用いることができるが、真核細胞であることが好ましく、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがより好ましく、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、及び２９３細胞からなる群より選ばれるいずれかの細胞であることがさらに好ましい。これらの細胞は、市販のものを利用してもよいし、細胞寄託機関から入手して使用してもよいし、任意の細胞（例えば癌細胞又は幹細胞）から株化した細胞を使用してもよい。
前記細胞は、ワクチン製造のようにＨＣＶタンパクの大量製造を目的とする場合には、大量培養が可能な細胞を用いることが望ましい。そのような観点からは、Ｈｕｈ７細胞以外の細胞であることが好ましい。
レプリコンＲＮＡの細胞内への導入は、当業者には公知の任意の技術を使用して行うことができる。そのような導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥセファロース法等が挙げられるが、エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。
レプリコンＲＮＡは、目的のレプリコンＲＮＡを単独で導入してもよいし、他の核酸と混合させたものを導入してもよい。導入するＲＮＡ量を一定にしてレプリコンＲＮＡの量を変化させたい場合には、目的のレプリコンＲＮＡを、導入する細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して、細胞内導入に用いればよい。細胞内導入に用いるレプリコンＲＮＡの量は、使用する導入法に応じて決めればよいが、好ましくは１ピコグラム〜１００マイクログラム、より好ましくは１０ピコグラム〜１０マイクログラムの量を使用する。
細胞内導入のために選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含有するレプリコンＲＮＡを用いる場合には、そのレプリコンＲＮＡが導入され持続的に複製している細胞を、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現を利用して、選択することができる。具体的には、例えば、そのようなレプリコンＲＮＡの細胞内導入処理を施した細胞を、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現により選択可能となる培地において培養すればよい。一例として、レプリコンＲＮＡにネオマイシン耐性遺伝子が選択マーカー遺伝子として含まれる場合には、そのレプリコンＲＮＡを用いて細胞内導入処理した細胞を培養ディッシュに播種し、１６〜２４時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を０．０５ミリグラム／ミリリットル〜３．０ミリグラム／ミリリットルの濃度で添加し、その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続し、播種時から好ましくは１０日間〜４０日間、より好ましくは１４日間〜２８日間培養した後にクリスタルバイオレットで生存細胞を染色することにより、レプリコンＲＮＡが導入され持続的に複製されている細胞を、形成されたコロニーとして選択することができる。
形成されたコロニーからは、常法により生存細胞をクローン化し、培養を継続することにより、細胞をクローン化することができる。このようにして得られる目的のレプリコンＲＮＡが持続的に複製されている細胞クローンを、本明細書では「レプリコン複製細胞クローン」と称する。
樹立した細胞クローンについては、導入されたレプリコンＲＮＡから該細胞クローン中で複製されているレプリコンＲＮＡの検出、導入されたレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認、及びＨＣＶタンパク質の発現の確認を行って、実際に目的のレプリコンＲＮＡが持続的に複製されていることを確認することが好ましい。
導入されたレプリコンＲＮＡから該細胞クローン中で複製されたレプリコンＲＮＡ（本明細書中では、以下便宜的に、「複製レプリコンＲＮＡ」と称する）の検出は、当業者には公知の任意のＲＮＡ検出法に従って行えばよいが、例えば、細胞クローンから抽出したトータルＲＮＡについて、導入されたレプリコンＲＮＡに対して特異的なＤＮＡ断片をプローブとして用いるノーザンハイブリダイゼーション法を実施することにより検出することができる。
また導入されたレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認は、限定するものではないが、例えば、細胞クローンから抽出した宿主ゲノムＤＮＡについて該選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の少なくとも一部を増幅するＰＣＲを行い、その増幅産物の有無を確認することによって行うことができる。増幅産物が確認された細胞クローンでは、宿主ゲノム中に選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子が組み込まれていると判断されることから、レプリコンＲＮＡ自体は該細胞内で持続的に複製されていない可能性がある。この場合、レプリコンＲＮＡが持続的に複製されているか否かを、次に示すＨＣＶタンパク質の発現の確認実験によって、確認することができる。
ＨＣＶタンパク質の発現の確認は、例えば、導入されたレプリコンＲＮＡから発現されるべきＨＣＶタンパク質に対する抗体を、細胞クローンから抽出したタンパク質と反応させることによって行うことができる。この方法は、当業者には公知の任意のタンパク質検出法によって行うことができるが、具体的には例えば、細胞クローンから抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗ＨＣＶタンパク質抗体（例えば、抗ＮＳ３特異的抗体、又はＣ型肝炎患者から採取した抗血清）を反応させ、さらにその抗ＨＣＶタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。細胞クローンから抽出したタンパク質中からＨＣＶタンパク質が検出されれば、その細胞クローンは、ＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡが持続的に複製してＨＣＶタンパク質を発現しているものと判断することができる。
以上のようにして、目的のレプリコンＲＮＡを持続的に複製していることが確認された細胞クローン（レプリコン複製細胞クローン）を得ることができる。また本発明においては、このレプリコン複製細胞から、例えばＲＮＡを抽出しその中からレプリコンＲＮＡを電気泳動法により分離する等の当業者には公知の任意の方法により、レプリコンＲＮＡを取得することができる。本発明はそのようなレプリコンＲＮＡの製造方法にも関する。さらに本発明に係るレプリコン複製細胞は、ＨＣＶタンパク質を製造するために好適に使用することができる。レプリコン複製細胞からのＨＣＶタンパク質の取得は、当業者であれば常法に従って行うことができる。具体的には例えば、レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞及び培養培地を含む）から常法によりタンパク質を採取し、さらにそのタンパク質から、抗ＨＣＶタンパク質抗体を用いた検出等によりウイルスタンパク質を選択的に得ることにより、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのウイルスタンパク質を製造することができる。
また本発明に係るレプリコン複製細胞が、外来遺伝子を含有するレプリコンＲＮＡを持続的に複製している場合には、そのレプリコン複製細胞を用いて外来遺伝子にコードされるタンパク質を発現させて取得することができる。具体的には例えば、レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞及び培養培地を含む）から常法によりタンパク質を採取し、さらにそのタンパク質から、目的のタンパク質に対する抗体を用いた検出等によりタンパク質を選択的に得ることにより、外来遺伝子にコードされたタンパク質を取得することができる。
４．遺伝子型２ａのＨＣＶのレプリコンＲＮＡへの複製効率を増大させる突然変異の導入
本発明に係るレプリコン複製細胞において複製され生成されたレプリコンＲＮＡ（複製レプリコンＲＮＡ）には、複製効率を向上させる突然変異が頻繁に生ずる。このような突然変異は適合変異であると思われる。
本発明では、このことを利用して、本発明に係るレプリコンＲＮＡに複製効率を向上させる突然変異の導入を促進することができる。
具体的には、第１のレプリコン複製細胞（好ましくは本発明に係るレプリコンＲＮＡを導入したレプリコン複製細胞）から、第１の複製レプリコンＲＮＡを抽出等により取得し、第１の複製レプリコンＲＮＡをさらに別の細胞に再導入して第２のレプリコン複製細胞を作製するという工程を、１回以上、好ましくは１〜１０回、より好ましくは１〜５回、さらに好ましくは１〜２回反復的に行うことにより、レプリコン複製細胞中で、レプリコンＲＮＡに複製効率を増大させる突然変異を高頻度に導入することができる。
複製レプリコンＲＮＡを再導入する細胞としては、任意の細胞を用いることができるが、最初にレプリコンＲＮＡを導入した細胞と同じ生物種由来の細胞であることが好ましく、最初にレプリコンＲＮＡを導入した細胞と同じ生物種由来の同じ組織由来の細胞であることが好ましく、最初にレプリコンＲＮＡを導入した細胞と同じ細胞株の細胞であることがさらに好ましい。
従って本発明では、上記の方法を用いて、複製効率を増大させる突然変異を導入したレプリコンＲＮＡを製造することができる。すなわち、まず第１のレプリコン複製細胞（好ましくは本発明に係るレプリコンＲＮＡを導入したレプリコン複製細胞）から、第１の複製レプリコンＲＮＡを抽出等により取得し、さらにこの第１の複製レプリコンＲＮＡをさらに別の細胞に再導入して第２のレプリコン複製細胞を作製する工程を、１回以上、好ましくは１〜１０回、より好ましくは１〜５回、さらに好ましくは１〜２回反復的に行った後、この反復工程の最後に得られる最終的なレプリコン複製細胞から、複製レプリコンＲＮＡを抽出等によって取得することにより、複製効率が増大したレプリコンＲＮＡを製造することができる。
本発明では、以上のような方法により、レプリコンＲＮＡの複製効率を少なくとも２倍、好ましくは１０〜１００倍、より好ましくは１００〜１００００倍に増大させることができる。
このような方法により製造した複製効率が増大したレプリコンＲＮＡについては、逆転写ＰＣＲによってｃＤＮＡを得てそれを塩基配列決定に供するなどの公知の方法により、塩基配列を決定することが好ましい。さらに、決定された塩基配列又はそれにコードされるアミノ酸配列を、最初に細胞に導入されたレプリコンＲＮＡの塩基配列と比較することにより、適合変異を同定することができる。複製効率を増大させる適合変異としては、特に、レプリコンＲＮＡにコードされたウイルスタンパク質のアミノ酸を変異させる非同義置換が好ましい。
また本発明は、そのようにして同定した適合変異を、複製効率を増大させようとするレプリコンＲＮＡに常法により導入することによって、複製効率が増大した遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造することができる方法も提供する。
以上のようにして製造された複製効率が増大したレプリコンＲＮＡは、その方法に使用した細胞中においてレプリコンＲＮＡを大量に製造するために使用することができる。
本発明に係るレプリコンＲＮＡの複製効率は、当業者に公知の方法により決定することができるが、例えば次のような方法に従って決定すればよい。たとえばＨｕｈ７細胞に０．０００１、０．０００３、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１．０マイクログラムの量のレプリコンＲＮＡをトランスフェクションして、前述の実験手法と同様の方法でＧ４１８による選択培養を２１日間行った後にコロニー形成数（コロニー数）を測定する。導入したＲＮＡ量とコロニー形成数とを比較して容量依存的にコロニー形成が増加するレプリコンＲＮＡ導入量の範囲を決定し、その範囲内でのコロニー形成数を、導入したＲＮＡ量で除算して得られる値を、１マイクログラムあたりのコロニー形成率とする。この計算式は、以下のとおりである。
コロニー形成率［（Ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ；ＣＦＵ）／マイクログラム］＝コロニー形成数［個］／導入したＲＮＡ量［マイクログラム］
こうして算出されたコロニー形成率を、導入したレプリコンＲＮＡの複製効率を示す値とする。すなわち、コロニー形成率が高いほど、そのレプリコンＲＮＡの複製効率は高い。またレプリコンＲＮＡの複製効率は、形成されたコロニー１個あたりの導入したレプリコンＲＮＡのコピー数で示されるコロニー形成能で表すこともできる。すなわち、以下のような計算式に従って算出することができる。
コロニー形成能＝導入したレプリコンＲＮＡのコピー数［コピー］／コロニー形成数［個］
５．本発明の他の実施形態
本発明に係るレプリコンＲＮＡ複製細胞は、例えばＣ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングするための試験系として使用することもできる。具体的には例えば、被験物質の存在下で、レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製を検出し、その被験物質がレプリコンＲＮＡの複製を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。この場合、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製の検出は、レプリコンＲＮＡ複製細胞から抽出したＲＮＡ中のレプリコンＲＮＡの量又は有無を検出することによるものであってもよいし、培養物中または該培養物に含まれるレプリコンＲＮＡ複製細胞中のタンパク質に含まれるＨＣＶタンパク質の量又は有無を検出するものであってもよい。
このような本発明に係るレプリコンＲＮＡ複製細胞を用いる試験細胞系は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療のための治療剤若しくは診断剤の製造又は評価を目的とすることが考えられる。そのような目的としては、具体的には、以下のような例が挙げられる。
（１）遺伝子型２ａのＨＣＶの増殖を抑制する物質の探索
遺伝子型２ａのＨＣＶの増殖を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的に遺伝子型２ａのＨＣＶの増殖に影響を及ぼす有機化合物、あるいは遺伝子型２ａのＨＣＶゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりＨＣＶの増殖若しくはＨＣＶタンパク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
（２）細胞培養中で抗ウイルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、合理的ドラッグデザイン又はハイスループットスクリーニングを用いて得られた物質（例えば単離精製された酵素）等が挙げられる。
（３）遺伝子型２ａのＨＣＶに感染した患者の治療のための、新規攻撃標的の同定
例えばＨＣＶウイルス増殖のために重要な役割を果たす宿主細胞性タンパク質を同定するために、本発明に係るレプリコン複製細胞を使用することができる。
（４）ＨＣＶウイルスの薬剤等に対する耐性獲得能の評価及び該耐性に関わる変異の同定
（５）Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断薬又は治療薬の開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質の製造
（６）Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断薬又は治療薬の開発、製造及び評価のために使用しうるＨＣＶウイルス又はウイルス様粒子を製造するための、ウイルスゲノム複製系
（７）遺伝子型２ａのＨＣＶに対するワクチンとして使用可能なワクチン抗原の製造
（８）遺伝子治療用の外来遺伝子を組み込んで使用する、肝細胞指向性遺伝子ベクターの製造
６．実施例
本発明を、以下の実施例及び図面に基づいてさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１： レプリコンＲＮＡの作製
（Ａ）発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルスＪＦＨ−１株（遺伝子型２ａ）のウイルスゲノム全領域に対応するＤＮＡを、該ウイルス株のゲノム全長ｃＤＮＡを含むＪＦＨ−１クローンから取得して、ｐＵＣ１９プラスミドに挿入したＴ７ ＲＮＡプロモーター配列の下流に挿入した。このようにして構築されたプラスミドＤＮＡを、以下、ｐＪＦＨ１と称する。同様に、慢性肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルスＪＣＨ−１株（遺伝子型２ａ）のウイルスゲノム全領域に対応するＤＮＡを、該ウイルス株のゲノム全長ｃＤＮＡを含むＪＣＨ−１クローンから取得して、ｐＵＣ１９プラスミドに挿入したＴ７ ＲＮＡプロモーター配列の下流に挿入した。このようにして構築されたプラスミドＤＮＡを、以下、ｐＪＣＨ１と称する。なお、上記ＪＦＨ−１クローン及びＪＣＨ−１クローンの作製については、特開２００２−１７１９７８号公報及びＫａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００１）６４（３）ｐ．３３４−３３９に記載されている。またＪＦＨ−１クローンの全長ｃＤＮＡの塩基配列は、国際ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）のアクセッション番号：ＡＢ０４７６３９に、ＪＣＨ−１クローンの全長ｃＤＮＡの塩基配列はアクセッション番号：ＡＢ０４７６４０に登録されている。
このようにして構築したプラスミドＤＮＡ ｐＪＦＨ１及びｐＪＣＨ１の構造を、図１の上段に示す。「Ｔ７」はＴ７ ＲＮＡプロモーター、「Ｇ」は、挿入したＪＦＨ−１又はＪＣＨ−１由来ＤＮＡの５’端の上流かつＴ７ ＲＮＡプロモーター配列の３’端の下流に挿入したｄＧＴＰ、を示す。「５’ＮＴＲ」から「３’ＮＴＲ」までがＣ型肝炎ウイルスのゲノム全領域に対応するＤＮＡである。
次に、プラスミドＤＮＡ ｐＪＦＨ１及びｐＪＣＨ１の構造領域と非構造領域の一部を、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とも称する）及びＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）で置換して、プラスミドＤＮＡ ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１及びｐＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１をそれぞれ構築した（図１の下段）。この構築手順は、既報（Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９）２８５，ｐ．１１０−１１３）に従った。具体的には、プラスミドｐＪＦＨ１及びｐＪＣＨ１を制限酵素ＡｇｅＩ及びＣｌａＩで切断し、その切断部位に、ｐＪＦＨ−１由来の５’ＮＴＲからＣｏｒｅ領域におよぶ配列とｐＲＳＶ５ＮＥＯ由来のネオマイシン耐性遺伝子とをＰＣＲ増幅により結合し制限酵素ＡｇｅＩとＰｍｅＩで切断した断片、及びＥＭＣＶ ＩＲＥＳからＮＳ３領域におよぶ配列をＰＣＲ増幅により結合し制限酵素ＰｍｅＩとＣｌａＩで切断した断片を、挿入し連結した。
また、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１中のＮＳ５Ｂ領域について、該領域にコードされるＲＮＡポリメラーゼの活性中心に相当するアミノ酸モチーフＧＤＤをＧＮＤに変異させる突然変異を導入して、突然変異プラスミドクローンｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤを作製した。
さらに、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１中のＮＳ５Ｂ領域について、該領域にコードされるＲＮＡポリメラーゼの活性中心に相当するアミノ酸モチーフＧＤＤを含む連続した１０アミノ酸配列を欠失させる突然変異を導入して、突然変異プラスミドクローンｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤを作製した。
なお上記で作製した突然変異クローンｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤ及びｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤは、それらにコードされているＮＳ５Ｂタンパク質の活性部位のアミノ酸配列が変異しているため、レプリコンＲＮＡを複製するのに必要な活性ＮＳ５Ｂタンパク質を発現することができない。
（Ｂ）レプリコンＲＮＡの作製
レプリコンＲＮＡ合成に用いる鋳型ＤＮＡを作製するために、上記のとおり構築した発現ベクターｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤを、それぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断した。
次いで、これらのＸｂａＩ切断断片のそれぞれについて、１０〜２０μｇを５０μｌの反応液中に含有させ、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ ２０Ｕを用いて３０℃で３０分間インキュベートすることにより、さらに処理した。Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅは、二本鎖ＤＮＡ中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記ＸｂａＩ切断断片をそのまま鋳型として用いてＲＮＡ合成を行うと、ＸｂａＩの認識配列の一部であるＣＵＧＡの４塩基が３’末端に余分に付加されたレプリコンＲＮＡが合成されてしまう。そこで本実施例では、ＸｂａＩ切断断片をＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅで処理することにより、ＸｂａＩ切断断片からＣＵＧＡの４塩基を除去した。この後、ＸｂａＩ切断断片を含むＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理後の溶液について、通常法に従ったタンパク質除去処理により、ＣＵＧＡの４塩基が除去されたＸｂａＩ切断断片を精製して、これを鋳型ＤＮＡとした。
次に、この鋳型ＤＮＡから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ合成した。このＲＮＡ合成にはＡｍｂｉｏｎ社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔを用いた。鋳型ＤＮＡを０．５〜１．０マイクログラム含む反応液２０μｌを製造業者の使用説明書に従って反応させた。
ＲＮＡ合成終了後、反応溶液にＤＮａｓｅ（２Ｕ）を添加して３７℃で１５分間反応させた後、さらに酸性フェノールによるＲＮＡ抽出を行って、鋳型ＤＮＡを除去した。このようにしてｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤに由来する上述の鋳型ＤＮＡから合成したＲＮＡ（レプリコンＲＮＡ）を、それぞれｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤと命名した。これらのレプリコンＲＮＡの塩基配列を、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１については配列番号１及び図２Ａ〜Ｆ、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１については配列番号２及び図３Ａ〜Ｆ、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤについては配列番号７、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤについては配列番号８に示す。
実施例２： レプリコン複製細胞クローンの樹立
（Ｃ）レプリコンＲＮＡのトランスフェクション、トランスフェクション細胞のコロニー形成能の測定、及び細胞クローンの樹立
上記の合成レプリコンＲＮＡ（ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤ）のそれぞれについて、様々な量のレプリコンＲＮＡをＨｕｈ７細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して、ＲＮＡ総量が１０μｇとなるように調製した。次いでその混合ＲＮＡをエレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、１６時間から２４時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を様々な濃度で添加した。その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続した。播種時から２１日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。染色されたコロニー数を計測し、トランスフェクションしたレプリコンＲＮＡ量１μｇ当たりに得られたコロニー数を計算した。
コロニー形成が認められたｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１又はｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１トランスフェクション細胞については、上記の培養２１日後の培養ディッシュからさらに生存細胞のコロニーをクローン化し、培養を継続した。このようなコロニーのクローニングにより、細胞クローンを複数株樹立することができた。
樹立した細胞クローンについては、後述の実施例４と同様にして、複製レプリコンＲＮＡの検出、ネオマイシン耐性遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認、及びＨＣＶタンパク質の発現の確認を行った。細胞中でのレプリコンの複製が確認された細胞クローンを、レプリコン複製細胞クローンとした。
（Ｄ）各トランスフェクション細胞におけるコロニー形成能
上記のトランスフェクションの結果、トランスフェクションしたレプリコンＲＮＡ １μｇ当たりのコロニー形成能は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞では、Ｇ４１８濃度が１．０ｍｇ／ｍｌの場合、９４７００ ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ；コロニー形成単位）／μｇ・ＲＮＡであった（図４の左列）。これに対して、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ｄＧＤＤ、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤをそれぞれトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞では、コロニー形成が認められなかった（図４の中央列及び右列）。このことは、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１レプリコンＲＮＡをトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞のコロニー形成能は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１から発現されるＮＳ５Ｂ（ＲＮＡポリメラーゼ）の活性に依存していることを示す。つまり、コロニーを形成した細胞では、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１から発現されるＮＳ５ＢのはたらきによりｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１レプリコンＲＮＡが自律複製することによって、ネオマイシン耐性遺伝子が持続的に発現されＧ４１８耐性が維持される結果、細胞増殖が可能になったものと考えられた。
一方、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１をトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞では、Ｇ４１８濃度が１〜０．５ｍｇ／ｍｌの場合にはコロニー形成が認められなかった（図５）。Ｇ４１８濃度を０．２５ｍｇ／ｍｌに下げた場合には、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１をトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞でもコロニー形成が認められた。
さらに、上記（Ｂ）で得られた発現ベクターｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＸｂａＩ切断断片をＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅで処理せずにＲＮＡ合成の鋳型ＤＮＡとして用いてレプリコンＲＮＡを合成し、それを上記（Ｃ）と同様にしてＨｕｈ７細胞にトランスフェクションした。Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理を行わずに作製したこのレプリコンＲＮＡには、ＣＵＧＡの４塩基が３’末端に余分に付加されていた。
この結果、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅで処理せずに作製したレプリコンＲＮＡをトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞のコロニー形成能は、５１２ ＣＦＵ／μｇ・ＲＮＡに低下した（図６の左側）。このことから、レプリコンＲＮＡの３’末端の配列がトランスフェクションした細胞のコロニー形成能に影響を及ぼすことが明らかになった。
【実施例３】
（Ｅ）レプリコン複製細胞由来の複製レプリコンＲＮＡの再トランスフェクション
実施例２に従ってｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＨｕｈ７細胞へのトランスフェクションにより樹立したレプリコン複製細胞クローンから、常法により全ＲＮＡ（トータルＲＮＡ）を抽出した。この細胞性ＲＮＡに含まれる複製レプリコンＲＮＡのコピー数を、ノーザンブロット解析及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により決定した。
ノーザンブロット解析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）の記載に従って行った。細胞から抽出したＲＮＡを変性アガロース電気泳動に供し、泳動終了後に該ＲＮＡをポジティブチャージナイロン膜に転写した。ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１から作製した３２ＰラベルしたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、前記のとおり膜に転写したＲＮＡに対しハイブリダイゼーションさせ、次いでその膜を洗浄し、それをフィルムに感光させることにより、レプリコン特異的なＲＮＡバンドを検出した。
レプリコンＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる検出は、Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｔ，Ｋａｔｓｕｍｅ Ａ，Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ａｂｅ Ａ，Ｉｎｏｕｅ Ｋ，Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ Ｋ，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｒ，Ｔａｎａｋａ Ｓ，Ｋｏｈａｒａ Ｍ．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１６：６３６−６４２（１９９９）に従いＨＣＶ ＲＮＡの５’非翻訳領域のＲＮＡを検出することによりおこなった。具体的には、細胞から抽出したＲＮＡに含まれるレプリコンＲＮＡを、合成プライマー、Ｒ６−１３０−Ｓ１７，５’−ＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧ−３’（配列番号１３）、Ｒ６−２９０−Ｒ１９，５’−ＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧ−３’（配列番号１４）、ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ，Ｒ６−１４８−Ｓ２１ＦＴ，５’−ＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣ−３’（配列番号１５）とＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔを用いてＰＣＲ増幅し、次いでＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍにより検出した。
次に、上記レプリコン複製細胞クローンのうちのクローン６、及びプールクローン（コロニー形成したレプリコン複製細胞を１ディッシュ分集めて培養した細胞）から抽出したトータル細胞性ＲＮＡの一部を、再トランスフェクションにより新たなＨｕｈ７細胞へ導入した。トランスフェクションに用いたトータル細胞性ＲＮＡは、上記で測定したレプリコンＲＮＡのコピー数に基づき、１×１０７コピーのレプリコンＲＮＡを含むように調製した。トランスフェクションを上記（Ｃ）と同様の手法で行い、次いでＧ４１８濃度が１ｍｇ／ｍｌの条件下で選択培養したところ、レプリコン複製細胞のコロニー形成がみとめられた（図７）。この場合のコロニー形成能は、得られたコロニー数から計算すると、トランスフェクションに用いたレプリコンＲＮＡの１×１０６コピー当たり１コロニー以上であった。
一方、ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を鋳型としてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより試験管内で合成したｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ＲＮＡのコピー数は、ＲＮＡの重量とＲＮＡの長さから計算すると約２×１０１１コピー／μｇ・ＲＮＡであり、このｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ＲＮＡを上記と同様にしてトランスフェクションに用いた場合のコロニー形成能は、５×１０７コピー当たり１コロニーであった。このような結果から、レプリコン複製細胞から抽出した細胞由来ＲＮＡとｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ＲＮＡを同じコピー数のレプリコンＲＮＡとしてＨｕｈ７細胞にトランスフェクションした場合、Ｈｕｈ７細胞内で複製されたレプリコンＲＮＡを用いると、コロニー形成能がｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ＲＮＡと比べて５０倍程度高いことが明らかになった。
【実施例４】
（Ｆ）レプリコンＲＮＡの検出
上記（Ｅ）に従ってｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＨｕｈ７細胞へのトランスフェクションにより樹立したレプリコン複製細胞クローンから取得したトータルＲＮＡを新たなＨｕｈ７細胞に再トランスフェクションして樹立した細胞クローン［クローン１〜１１］及びそれらのプールクローン（コロニー形成した細胞クローンを１ディッシュ分集めて培養した細胞）から、酸性フェノール抽出法によりトータルＲＮＡを抽出した。次いでこのトータルＲＮＡをノーザンブロット法により解析した。プローブとしてはｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブを用いた。対照としては、トランスフェクションを行っていないＨｕｈ７細胞から同様に抽出したトータルＲＮＡ（図８中、「Ｈｕｈ７」として示す）、Ｈｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の７乗コピー加えたサンプル（図８中、「１０７」として示す）、及びＨｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の８乗コピー加えたサンプル（図８中、「１０８」として示す）を用いた。図８中、１〜１１は細胞クローンの番号である。
この結果、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１と同程度の大きさのＲＮＡがｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブにより検出された（図８）。これにより、最初にトランスフェクションしたｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１に由来するレプリコンＲＮＡが細胞クローン内で複製増殖していることが確認された。また細胞クローン間で、複製レプリコンＲＮＡの量に差があることが示された。図８中、例えば、クローン２、６，９、１０は複製レプリコンＲＮＡの量が多く、クローン４、８，１１は複製レプリコンＲＮＡの量が少なかった。
（Ｇ）ネオマイシン耐性遺伝子のゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認
実施例３の手順と同様にして作製した、レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローンについて、その細胞クローンのＧ４１８に対する耐性がネオマイシン耐性遺伝子のゲノムへの組み込みによるものでないことを確認するために、ネオマイシン耐性遺伝子特異的プライマー（センスプライマー、ＮＥＯ−Ｓ３：５’−ＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡ−３’（配列番号１６），アンチセンスプライマー、ＮＥＯ−Ｒ：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号１７））を用いて、細胞クローンから抽出した宿主細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅を行った。用いた細胞クローンは、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン１〜８（ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来細胞クローン１〜８）、及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン１〜６（ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン１〜６）であった。この結果、図９に示すとおり、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来細胞クローンについては、調べた８クローン中、ネオマイシン耐性遺伝子の増幅が示された陽性クローンは認められなかった。ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローンについては、調べた６クローン中１クローンのみが陽性であった（図９中、右側写真のレーン３）。この陽性クローンは、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡ中のネオマイシン耐性遺伝子が宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれたことにより、Ｇ４１８耐性を獲得したと考えられた。この陽性クローンにおいては、他のクローンとは異なり、レプリコンＲＮＡ自体は細胞内で自律複製していないものと考えられた。このことは、次の（Ｈ）に示す実験で、この陽性クローンからＨＣＶタンパク質が検出されなかったことにより確認された。
（Ｈ）ＨＣＶタンパク質の検出
ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１トランスフェクション細胞クローンから常法によりタンパク質を抽出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法により解析した（図１０）。調べた細胞クローンは、上記（Ｇ）で用いたものと同じであり、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来細胞クローン１〜８、及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン１〜６である。また、ＮＳ３遺伝子を含む発現プラスミドＤＮＡをＨｕｈ７細胞にトランジエントにトランスフェクションして得られた細胞抽出液を陽性対照（ＮＳ３タンパク質）とした。さらに、トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞から抽出したタンパク質を陰性対照として用いた。それぞれの細胞クローンから抽出したタンパク質試料をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にブロッティングし、抗ＮＳ３特異的抗体（Ｄｒ．Ｍｏｒａｄｐｏｕｒより分与されたもの；Ｗｏｌｋ Ｂ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０００；７４：２２９３−２３０４）を用いて複製レプリコンＲＮＡにコードされているＮＳ３タンパク質を検出した。図１０に示されるとおり、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来細胞クローン１〜８及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン１、２、４〜６では、陽性対照と同じ大きさのタンパク質が検出された。なおｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン３（上記（Ｇ）で陽性クローンとして検出されたクローン）では、ＮＳ３タンパク質の発現は検出されなかった。すなわち、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＣＨ１由来細胞クローン３では、レプリコンＲＮＡの複製は確認されなかった。トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞でＮＳ３タンパク質が検出されなかったため、ＮＳ３タンパク質が検出された細胞クローンでは、トランスフェクションされたレプリコンＲＮＡが自律複製することによりＮＳ３タンパク質が発現されていることが判明した。
なお、Ｃ型肝炎患者の血清を抗体として用いることにより、上記でＮＳ３タンパク質の発現が確認された各細胞クローンについて、レプリコンＲＮＡからのＮＳ５ａタンパク質の発現も確認した。
以上の（Ｇ）及び（Ｈ）の結果から、レプリコンＲＮＡをトランスフェクションして樹立した細胞クローンでは、レプリコンＲＮＡが複製されていることが確認された。
【実施例５】
（Ｉ）適合変異の解析
実施例３に従って、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＨｕｈ７細胞へのトランスフェクションを経て樹立したレプリコン複製細胞クローンから取得したトータルＲＮＡを新たなＨｕｈ７細胞に再トランスフェクションして、２１の細胞クローンを樹立した。これらの細胞クローンから、常法によりトータルＲＮＡをそれぞれ抽出した。このトータルＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とプライマー９６４１Ｒ−ＩＨ（５’−ＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＣ−３’（配列番号１８））によりレプリコンＲＮＡに対応するｃＤＮＡを合成した。逆転写反応によるｃＤＮＡ合成のための反応液組成を以下に示す。
ｃＤＮＡ合成反応としては、まず上記のＲＮａｓｉｎとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ以外の試薬を混合して最初の反応液を調製し、それを９０℃で３分間加熱した後、氷上で冷却した。その後、この反応液にＲＮａｓｉｎとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを添加して４２℃で１時間反応させた後、さらに７０℃で１５分間反応させた。
さらに、このようにして得られたｃＤＮＡについて、以下の手順により５組のプライマーセットを用いるＰＣＲ増幅を行って、レプリコンＲＮＡのほぼ全領域にわたるＤＮＡ増幅断片を得た。用いたプライマーセット及びその各々により増幅される領域を下記の表１及び表２に示す。
なお表１中、増幅領域はｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１（配列番号１）において対応する塩基番号で示した。
このＰＣＲ反応における反応液組成は以下のとおりである。
また、ＰＣＲ反応の条件は、以下のとおりであった：９５℃で２分間；９８℃で１０秒間に続き６８℃で８分間を３５サイクル；７２℃で７分間；４℃で保持。
以上のようにして得られた各ＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、そのＤＮＡ配列対応するＲＮＡ配列とｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の配列との比較を行った。その結果を表３に示す。
表３のとおり、２１の細胞クローンにおいて認められた塩基変異は全部で２５個あったが、そのうち２２個はアミノ酸の変異を引き起こす非同義置換であった。これらの変異の種類を、表４に示す。またこれらの変異の非構造領域における位置を図１１に示す。
表４及び図１１において、「Ｃ１〜Ｃ６」は、変異が見出されたレプリコンＲＮＡを有するレプリコン複製細胞クローンＣ１〜Ｃ６を示す。「塩基番号」はレプリコンＲＮＡ ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の塩基配列（配列番号１）中の対応する塩基の番号として示している。「アミノ酸番号」は、ＪＦＨ−１クローンにコードされるアミノ酸配列（配列番号４）中の対応するアミノ酸の番号として示している。変異部位の塩基及びアミノ酸の種類は、通常の表記法に従って記載されている。表４に示されるとおり、クローンＣ２では、レプリコンＲＮＡ上の配列番号１の塩基番号４９５５に相当する塩基がＣ（シトシン）からＵ（ウラシル）へ変異し、その結果、配列番号４のアミノ酸番号２０９０に相当するアミノ酸がＡ（アラニン）からＶ（バリン）へ変異した。
また図１１に示した変異の位置は、表４に示す塩基番号を付記した縦線で示している。太い縦線は非同義置換、細い縦線は同義置換を表す。
なお、アミノ酸の変異を引き起こす塩基変異を全く有しないクローンも２クローンあった。この２クローンについてノーザンブロット解析を行ったところ、これらの２クローンにおいては、レプリコンＲＮＡの複製量が、アミノ酸変異を生じる塩基変異を有するレプリコンＲＮＡを複製している細胞クローンよりも少ないことが示された。つまり、レプリコンＲＮＡにおけるアミノ酸変異を引き起こす塩基変異は、Ｈｕｈ７細胞においてレプリコンＲＮＡの複製効率を増大させる適合変異であると考えられた。
【実施例６】
（Ｊ）Ｈｕｈ７細胞以外の細胞を用いたレプリコン複製細胞クローンの樹立
実施例１に記載した方法に従って、Ｈｕｈ７細胞以外の肝癌細胞及び非肝臓由来細胞に、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションし、培養ディッシュ中に播種して培養して、コロニー形成の観察とコロニー数の計測を行った。使用した細胞は、以下のとおりである。
（１）ＨｅｐＧ２細胞（Ｈｕｈ７細胞と共に代表的な肝癌細胞である）
（２）ＩＭＹ−Ｎ９細胞（Ｉｔｏらにより樹立された。ＨｅｐＧ２細胞とヒト初代培養肝細胞との融合細胞；Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００１；３４：５６６−５７２）
（３）Ｈｅｌａ細胞（ヒト子宮頸癌由来細胞；Ｃａｎ Ｃｅｒ Ｒｅｓ．１９５２；１２：２６４−２６５）
（４）２９３細胞（ヒト胎児腎由来細胞；Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９７７；３６：５９−７２）
ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、Ｈｅｌａ細胞、又は２９３細胞を用いたトランスフェクションの結果を、それぞれ図１２Ａ〜Ｄに示す。図１２Ａ〜Ｄに示すとおり、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、Ｈｅｌａ細胞、及び２９３細胞はともに、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１トランスフェクション細胞におけるコロニー形成を示した。
樹立した細胞クローンは、後述の（Ｌ）、（Ｍ）と同様にして、複製レプリコンＲＮＡの検出、ネオマイシン耐性遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認、及びＨＣＶタンパク質の発現の確認を行った。こうして細胞中でのレプリコンの複製が確認された細胞クローンを、レプリコン複製細胞クローンとした。すなわち、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を用いることにより、今まで、ＨＣＶレプリコン複製細胞の作出に成功していなかった（Ｂｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０００）２９０，１９７２−１９７４）、Ｈｕｈ７以外の肝癌細胞、及び非肝細胞でのＨＣＶレプリコン複製細胞の作製が可能であることが示された。
（Ｋ）Ｈｕｈ７細胞以外の細胞を用いたレプリコン複製細胞におけるレプリコンＲＮＡの検出
ノーザンブロット解析は、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））の記載に従って行った。前項（Ｊ）に従い、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をＨｅｐＧ２、ＩＭＹ−Ｎ９あるいはＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションにより樹立したレプリコン複製細胞クローン、及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を２３９細胞へのトランスフェクションにより樹立したレプリコン複製細胞のプールクローン（コロニー形成した細胞クローンを１ディッシュ分集めて培養した細胞）から、酸性フェノール抽出法によりトータルＲＮＡを抽出した。次いでこのトータルＲＮＡをノーザンブロット法により解析した。プローブとしてはｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブを用いた。対照としては、トランスフェクションを行っていないＨｕｈ７細胞及び、ＨｅｐＧ２細胞から同様に抽出したトータルＲＮＡ（図１３中、レーン１及び１７）、Ｈｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の７乗コピーあるいは、１０の８乗コピー加えたもの（図１３中、レーン２及び３）を用いた。この結果、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１と同程度の大きさのＲＮＡがｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブにより検出された（図１３）。これにより、最初にトランスフェクションしたｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１に由来するレプリコンＲＮＡが細胞クローン内で複製増殖していることが確認された。また細胞の種類により、複製レプリコンＲＮＡの量に差があり、ＩＭＹ−Ｎ９細胞は極めて効率よくレプリコンＲＮＡを複製することが明らかになった。また、クローン間で複製レプリコンＲＮＡの量に差があることが明らかになった。
（Ｌ）ネオマイシン耐性遺伝子のゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認
樹立したレプリコンＲＮＡ複製細胞クローンについて、その細胞クローンのＧ４１８に対する耐性がネオマイシン耐性遺伝子のゲノムへの組み込みによるものでないことを確認するために、ネオマイシン耐性遺伝子特異的プライマー（センスプライマー、ＮＥＯ−Ｓ３：５’−ＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡ−３’（配列番号２９）、アンチセンスプライマー、ＮＥＯ−Ｒ：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号３０））を用いて、細胞クローンから抽出した宿主細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅を行った。用いた細胞クローンは、ＨｅｐＧ２細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン１、５、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３、ならびにＩＭＹ−Ｎ９細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１１であった。この結果、図１４に示すとおり、ＨｅｐＧ２細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１導入した細胞クローンについては、調べた９クローン中、ネオマイシン耐性遺伝子の増幅が示された陽性クローンは認められなかった。ＩＭＹ−Ｎ９細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１導入した細胞クローンについては、調べた９クローン中、ネオマイシン耐性遺伝子の増幅が示された陽性クローンは認められなかった。
同様に、Ｈｅｌａ細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン及び２９３細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローンについて、同様の検討を行ったところ、ネオマイシン耐性遺伝子の増幅が示された陽性クローンは認められなかった。
（Ｍ）ＨＣＶタンパク質の検出
樹立した細胞クローンから常法によりタンパク質を抽出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法により解析した（図１５）。調べた細胞クローンは、前項で用いたものと同じであり、ＨｅｐＧ２細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン１、５、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３、ならびにＩＭＹ−Ｎ９細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１１である。また、既報（Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９））に従って、ＨｕＨ７にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を導入して作製したＨＣＶ ＲＮＡレプリコン複製細胞クローンを陽性対照（図１５レーン４−１、Ｃ６）とした。さらに、トランスフェクションしていない細胞から抽出したタンパク質を陰性対照として用いた（図１５レーンＮ）。それぞれの細胞クローンから抽出したタンパク質試料をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にブロッティングし、抗ＮＳ３特異的抗体（Ｄｒ．Ｍｏｒａｄｐｏｕｒより分与されたもの；Ｗｏｌｋ Ｂ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０００；７４：２２９３−２３０４）を用いて複製レプリコンＲＮＡにコードされているＮＳ３タンパク質を検出した。図１５上段に示されるとおり、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン１、５、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３、ならびにＩＭＹ−Ｎ９細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１１では、陽性対照と同じ大きさのタンパク質が検出された。
また、Ｃ型肝炎患者の血清を抗体として用いることにより、上記でＮＳ３タンパク質の発現が確認された各細胞クローンについて、レプリコンＲＮＡからのＮＳ５ａタンパク質の発現の確認をおこなった。この実験では、患者血清を変更して抗ＮＳ５ａ抗体を用いたこと以外は、ＮＳ３タンパク質の発現と同様にして検討を行った。その結果、図１５下段に示すように、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン１、５、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３、ならびにＩＭＹ−Ｎ９細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１１では、陽性対照と同じ大きさのタンパク質が検出された。
同様に、Ｈｅｌａ細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローン及び２９３細胞にｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１由来の複製レプリコンＲＮＡを再トランスフェクションして得られた細胞クローンについて、同様の検討を行ったところ、ＮＳ３及びＮＳ５ａタンパク質の発現が確認できた。
以上のとおり、レプリコンＲＮＡをトランスフェクションして樹立した細胞クローンでは、レプリコンＲＮＡが複製されていることが確認された。
【実施例７】
（Ｎ）適合変異の解析
実施例３に従って、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＨｅｐＧ２及びＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションを経て樹立したレプリコン複製細胞クローンから取得したトータルＲＮＡを新たな各々の細胞に再トランスフェクションすることにより、ＨｅｐＧ２細胞については１４の細胞クローンを、ＨｅＬａ細胞については８の細胞クローンを樹立した。これらの細胞クローンから、常法によりトータルＲＮＡをそれぞれ抽出した。このトータルＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓＣｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とプライマー９６４１Ｒ−ＩＨ（５’−ＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＣ−３’（配列番号３１）によりレプリコンＲＮＡに対応するｃＤＮＡを合成した。逆転写反応によるｃＤＮＡ合成のための反応液組成を以下に示す。
ｃＤＮＡ合成反応としては、まず上記のＲＮＡｓｉｎとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ以外の試薬を混合して最初の反応液を調製し、それを９０℃で３分間加熱した後、氷上で冷却した。その後、この反応液にＲＮＡｓｉｎとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを添加して４２℃で１時間反応させた後、さらに７０℃で１５分間反応させた。
さらに、このようにして得られたｃＤＮＡについて、以下の手順により５組のプライマーセットを用いるＰＣＲ増幅を行って、レプリコンＲＮＡのほぼ全領域にわたるＤＮＡ増幅断片を得た。用いたプライマーセット及びその各々により増幅される領域を下記の表５及び表６に示す。
なお表中、増幅領域は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１（配列番号１）において対応する塩基番号で示した。
このＰＣＲ反応における反応液組成は以下のとおりである。
また、ＰＣＲ反応の条件は、以下のとおりであった：９５℃で２分間；９８℃で１０秒間に続き６８℃で８分間を３５サイクル；７２℃で７分間；４℃で保持。
以上のようにして得られた各ＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、そのＤＮＡ配列対応するＲＮＡ配列とｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の配列との比較を行った。その結果を表７及び８に示す。
表７のとおり、ＨｅｐＧ２細胞については８の細胞クローンにおいて認められた塩基変異は全部で１３個あったが、そのうち８個はアミノ酸の変異を引き起こす非同義置換であった。これらの変異の種類を、表８に示す。一方、ＨｅＬａ細胞については３の細胞クローンにおいて認められた塩基変異は全部で７個あったが、そのうち５個はアミノ酸の変異を引き起こす非同義置換であった。これらの変異の種類を、表８に示す。
表７において、「ＨｅｐＩＨ Ｎｏ．」は、ＨｅｐＧ２細胞を用いてクローン化したレプリコンＲＮＡを有するレプリコン複製細胞クローン番号を示す。「塩基番号」はレプリコンＲＮＡ ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の塩基配列（配列番号１）中の対応する塩基の番号として示している。「アミノ酸番号」は、ＪＦＨ−１クローンにコードされるアミノ酸配列（配列番号４）中の対応するアミノ酸の番号として示している。変異部位の塩基及びアミノ酸の種類は、通常の表記法に従って記載されている。表７に示されるとおり、例えば、クローンＨｅｐＩＨ１では、レプリコンＲＮＡ上の配列番号の塩基番号６８２６に相当する塩基がＣからＡへ変異し、その結果、配列番号のアミノ酸番号２７１４に相当するアミノ酸がＱからＥへ変異したことを示している。同様に表８において、「ＨｅＬａＩＨ Ｎｏ．」は、ＨｅＬａ細胞を用いて、クローン化したレプリコンＲＮＡを有するレプリコン複製細胞クローン番号を示す。
なお、アミノ酸の変異を引き起こす塩基変異を全く有しないクローンについてノーザンブロット解析を行ったところ、レプリコンＲＮＡの複製量は、アミノ酸変異を生じる塩基変異を有するレプリコンＲＮＡを複製している細胞クローンよりも少ないことが示された。つまり、レプリコンＲＮＡにおけるアミノ酸変異を引き起こす塩基変異は、細胞においてレプリコンＲＮＡの複製効率を増大させる適合変異であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
本発明に係るレプリコン複製細胞は、遺伝子型２ａのＨＣＶ由来のＲＮＡ及びＨＣＶタンパク質を持続的に産生させるための培養系として利用することができる。さらに本発明に係るレプリコン複製細胞は、ＨＣＶの複製及び／又はＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として有用である。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−人工配列の説明：レプリコン
配列番号２−人工配列の説明：レプリコン
配列番号７−人工配列の説明：レプリコン
配列番号８〜１２−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１３〜４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上の、５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡ。
【請求項２】
少なくとも１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子、及び少なくとも１つのＩＲＥＳ配列を含む、請求項１記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項３】
配列番号９又は１０で示される塩基配列からなる５’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、配列番号１１又は１２で示される塩基配列からなる３’非翻訳領域とを含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡ。
【請求項４】
遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡが、配列番号３又は５で示される塩基配列からなるＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡ。
（ａ）配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＲＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２で示される塩基配列において１〜１０個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ、自律複製能を有するＲＮＡ
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡを細胞に導入することにより作製された、レプリコン複製細胞。
【請求項７】
細胞が真核細胞である、請求項６記載のレプリコン複製細胞。
【請求項８】
真核細胞がヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞である、請求項７記載のレプリコン複製細胞。
【請求項９】
真核細胞が、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、及び２９３細胞からなる群より選ばれるいずれかの細胞である、請求項７記載のレプリコン複製細胞。
【請求項１０】
Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療剤若しくは診断剤の製造、又は評価のための、請求項１〜５のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項１１】
Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療剤若しくは診断剤の製造、又は評価のための、請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞。
【請求項１２】
Ｃ型肝炎ウイルス感染に対するワクチンの製造のための、請求項１〜５のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項１３】
Ｃ型肝炎ウイルス感染に対するワクチンの製造のための、請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞。
【請求項１４】
請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞からレプリコンＲＮＡを抽出することを含む、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡの製造方法。
【請求項１５】
請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物からウイルスタンパク質を取得することを含む、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのウイルスタンパク質の製造方法。
【請求項１６】
被験物質の存在下で、請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製を検出することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得し、取得した複製レプリコンＲＮＡを該レプリコン複製細胞とは別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うことを含む、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡの複製効率を増大させる方法。
【請求項１８】
複製効率の増大が、レプリコン複製細胞に最初に導入されたレプリコンＲＮＡの複製効率と比較して、少なくとも２倍の増大である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得し、取得した複製レプリコンＲＮＡを該レプリコン複製細胞とは別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うこと、及び最終的に得られたレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得することを含む、複製効率が増大した遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造する方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法によって製造された複製効率が増大したレプリコンＲＮＡについて、レプリコン複製細胞に最初に導入されたレプリコンＲＮＡとの間の塩基変異又はアミノ酸変異を検出すること、及び複製効率を増大させようとするレプリコンＲＮＡにその検出された塩基変異又はアミノ酸変異を導入することを含む、複製効率が増大した遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造する方法。
【請求項２１】
配列番号１で示される塩基配列上において、以下の（ａ）〜（ｕ）：
（ａ）塩基番号７１５７の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｂ）塩基番号４９５５の部位におけるＣからＵへの変異、
（ｃ）塩基番号４９３６の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｄ）塩基番号５０００の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｅ）塩基番号７２８８の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｆ）塩基番号５９０１の部位におけるＧからＵへの変異、
（ｇ）塩基番号６１１３の部位におけるＡからＵへの変異、
（ｈ）塩基番号２８９０の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｉ）塩基番号６８２６の部位におけるＣからＡへの変異、
（ｊ）塩基番号６８８７の部位におけるＣからＡへの変異、
（ｋ）塩基番号６５８０の部位におけるＵからＡへの変異、
（ｌ）塩基番号７１５９の部位におけるＵからＣへの変異、
（ｍ）塩基番号７２３０の部位におけるＵからＡへの変異、
（ｎ）塩基番号６９４３の部位におけるＣからＡへの変異、
（ｏ）塩基番号５６８７の部位におけるＧからＡへの変異、
（ｐ）塩基番号６１１０の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｑ）塩基番号５５５０の部位におけるＵからＣへの変異、
（ｒ）塩基番号７２１７の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｓ）塩基番号３６４３の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｔ）塩基番号５８５１の部位におけるＧからＡへの変異、及び
（ｕ）塩基番号５９１４の部位におけるＧからＡへの変異、
からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する塩基配列からなるレプリコンＲＮＡ。
【請求項１】
遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上の、５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡ。
【請求項２】
少なくとも１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子、及び少なくとも１つのＩＲＥＳ配列を含む、請求項１記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項３】
配列番号９又は１０で示される塩基配列からなる５’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、配列番号１１又は１２で示される塩基配列からなる３’非翻訳領域とを含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡ。
【請求項４】
遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡが、配列番号３又は５で示される塩基配列からなるＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡ。
（ａ）配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＲＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２で示される塩基配列において１〜１０個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ、自律複製能を有するＲＮＡ
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡを細胞に導入することにより作製された、レプリコン複製細胞。
【請求項７】
細胞が真核細胞である、請求項６記載のレプリコン複製細胞。
【請求項８】
真核細胞がヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞である、請求項７記載のレプリコン複製細胞。
【請求項９】
真核細胞が、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、及び２９３細胞からなる群より選ばれるいずれかの細胞である、請求項７記載のレプリコン複製細胞。
【請求項１０】
Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療剤若しくは診断剤の製造、又は評価のための、請求項１〜５のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項１１】
Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療剤若しくは診断剤の製造、又は評価のための、請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞。
【請求項１２】
Ｃ型肝炎ウイルス感染に対するワクチンの製造のための、請求項１〜５のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項１３】
Ｃ型肝炎ウイルス感染に対するワクチンの製造のための、請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞。
【請求項１４】
請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞からレプリコンＲＮＡを抽出することを含む、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡの製造方法。
【請求項１５】
請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物からウイルスタンパク質を取得することを含む、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのウイルスタンパク質の製造方法。
【請求項１６】
被験物質の存在下で、請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製を検出することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得し、取得した複製レプリコンＲＮＡを該レプリコン複製細胞とは別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うことを含む、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡの複製効率を増大させる方法。
【請求項１８】
複製効率の増大が、レプリコン複製細胞に最初に導入されたレプリコンＲＮＡの複製効率と比較して、少なくとも２倍の増大である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項６〜９のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得し、取得した複製レプリコンＲＮＡを該レプリコン複製細胞とは別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うこと、及び最終的に得られたレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得することを含む、複製効率が増大した遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造する方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法によって製造された複製効率が増大したレプリコンＲＮＡについて、レプリコン複製細胞に最初に導入されたレプリコンＲＮＡとの間の塩基変異又はアミノ酸変異を検出すること、及び複製効率を増大させようとするレプリコンＲＮＡにその検出された塩基変異又はアミノ酸変異を導入することを含む、複製効率が増大した遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造する方法。
【請求項２１】
配列番号１で示される塩基配列上において、以下の（ａ）〜（ｕ）：
（ａ）塩基番号７１５７の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｂ）塩基番号４９５５の部位におけるＣからＵへの変異、
（ｃ）塩基番号４９３６の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｄ）塩基番号５０００の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｅ）塩基番号７２８８の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｆ）塩基番号５９０１の部位におけるＧからＵへの変異、
（ｇ）塩基番号６１１３の部位におけるＡからＵへの変異、
（ｈ）塩基番号２８９０の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｉ）塩基番号６８２６の部位におけるＣからＡへの変異、
（ｊ）塩基番号６８８７の部位におけるＣからＡへの変異、
（ｋ）塩基番号６５８０の部位におけるＵからＡへの変異、
（ｌ）塩基番号７１５９の部位におけるＵからＣへの変異、
（ｍ）塩基番号７２３０の部位におけるＵからＡへの変異、
（ｎ）塩基番号６９４３の部位におけるＣからＡへの変異、
（ｏ）塩基番号５６８７の部位におけるＧからＡへの変異、
（ｐ）塩基番号６１１０の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｑ）塩基番号５５５０の部位におけるＵからＣへの変異、
（ｒ）塩基番号７２１７の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｓ）塩基番号３６４３の部位におけるＡからＧへの変異、
（ｔ）塩基番号５８５１の部位におけるＧからＡへの変異、及び
（ｕ）塩基番号５９１４の部位におけるＧからＡへの変異、
からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する塩基配列からなるレプリコンＲＮＡ。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４１９８
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５７２１３８（Ｐ２００４−５７２１３８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５０３８
【国際出願日】平成１５年１１月２５日（２００３．１１．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者：第２５回 日本分子生物学会年会 組織委員会 刊行物名：第２５回日本分子生物学会年会 プログラム・講演要旨集 掲載頁：３８６頁 刊行物発行日：２００２年１１月２５日
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【出願人】（５９１０６３３９４）財団法人 東京都医学研究機構 (69)
【出願人】（５０３１８９２６２）
【氏名又は名称原語表記】Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｍａｉｎｚ
【住所又は居所原語表記】５５０９９ Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５０３８
【国際出願日】平成１５年１１月２５日（２００３．１１．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者：第２５回 日本分子生物学会年会 組織委員会 刊行物名：第２５回日本分子生物学会年会 プログラム・講演要旨集 掲載頁：３８６頁 刊行物発行日：２００２年１１月２５日
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【出願人】（５９１０６３３９４）財団法人 東京都医学研究機構 (69)
【出願人】（５０３１８９２６２）
【氏名又は名称原語表記】Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｍａｉｎｚ
【住所又は居所原語表記】５５０９９ Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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