遺伝子定量装置及び定量方法
【課題】
ＰＣＲ法により遺伝子増幅を極めて簡単に行うことができると同時に、リアルタイムＰＣＲと同様に広範囲にわたって定量可能で、且つ、信頼性の高い定量データを得られるようにする。
【解決手段】
長手方向（Ｘ）に沿って変性温度領域（Ａ１）及びアニーリング温度領域（Ａ２）が並列形成されると共に、両側の温度領域（Ａ１、Ａ２）の間を移動しながら長手方向に進行する毛細管流路（２）が蛇行形成されたＰＣＲプレート（３）にサンプル液を流しながらＰＣＲサイクルを繰り返し行なわせ、蛍光強度を測定する光学ヘッド（５）を長手方向に移動させることにより、各毛細管流路（２）における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に対応させて測定するようにした。
ＰＣＲ法により遺伝子増幅を極めて簡単に行うことができると同時に、リアルタイムＰＣＲと同様に広範囲にわたって定量可能で、且つ、信頼性の高い定量データを得られるようにする。
【解決手段】
長手方向（Ｘ）に沿って変性温度領域（Ａ１）及びアニーリング温度領域（Ａ２）が並列形成されると共に、両側の温度領域（Ａ１、Ａ２）の間を移動しながら長手方向に進行する毛細管流路（２）が蛇行形成されたＰＣＲプレート（３）にサンプル液を流しながらＰＣＲサイクルを繰り返し行なわせ、蛍光強度を測定する光学ヘッド（５）を長手方向に移動させることにより、各毛細管流路（２）における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に対応させて測定するようにした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル液に含まれる特定のＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）法により増幅させ、その増幅量を定量する遺伝子定量装置及び定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、農薬や病害虫に対する耐性遺伝子を導入した遺伝子組換作物（Genetically Modified Organisms ;ＧＭＯ）が米国、カナダを中心に栽培され、国際市場で流通している。米国の農家では、一つの作物につき数百ヘクタールの規模で複数の品種を栽培しており、放任受粉による栽培段階やまたは収穫段階、流通段階で非意図的にｎｏｎ−ＧＭＯにＧＭＯが混入することが考えられる。
これに伴い、我が国では輸送する場合に混入してくるＧＭＯの非意図的な許容限度を最大５％として、それ以上含まれている場合はＧＭＯの表示が義務付けられており、これにより、ＧＭＯの検知技術が必須となってきている。
【０００３】
ＧＭＯを検知するため、サンプル液に含まれる特定のＤＮＡを短時間で増幅させることのできるＰＣＲ法を利用することが一般的であり、従来より、サンプル液を流すだけで高温の変性温度（９４℃前後）と中温の伸長温度（７２℃前後）と低温のアニーリング温度（４５〜６０℃前後）の間で加熱冷却を繰り返すＰＣＲサイクルを所定回数行なうことのできるＰＣＲプレートが提案されている。
【特許文献１】特開２００５−１３０７９５号公報
【０００４】
このＰＣＲプレート２１には、図４に示すように、プレート２１を左右に横切る毛細管流路２２が形成されており、これを夫々の温度に制御される四つの金属ブロックからなるヒータＨ１１〜Ｈ１４に載せることにより、中央の長手方向に沿って形成された伸長温度領域Ａ１２を挟んで、その幅方向両側に変性温度領域Ａ１１及びアニーリング温度領域Ａ１３が形成され、長手方向端部にハイブリダイゼーション領域Ａ１４が形成されるようになされている。
各ヒータＨ１１〜Ｈ１４のうち、変性温度領域Ａ１１に対応するヒータＨ１１は９０℃に、伸長温度領域Ａ１２に対応するヒータＨ１２は７２℃に、アニーリング温度領域Ａ１３に対応するヒータＨ１３は５５℃に、ハイブリダイゼーション領域Ａ１４に対応するヒータＨ１４は５０℃に、それぞれ維持されている（特許文献１［００８０］参照）。
また、毛細管流路２２がハイブリダイゼーション領域Ａ１４を通過する部分には、検出用ポリヌクレオチドが固定された多孔質層が形成されている（同［００７４］参照）。
【０００５】
このプレート２１を用いてＰＣＲを行わせる場合、予めＰＣＲ用に調整したサンプル液を毛細管流路２２に送液すると、サンプル液に含まれるＤＮＡが、毛細管流路２２を流れながら各領域Ａ１１〜Ａ１３を通過し、変性温度領域Ａ１１（９０℃）−伸長温度領域Ａ１２（７２℃）−アニーリング温度領域Ａ１３（５５℃）−伸長温度領域Ａ１２（７２℃）−変性温度領域Ａ１１（９０℃）のＰＣＲサイクルを繰り返しながら増幅されていく。
そして、例えば３０回のＰＣＲサイクルを繰り返した後、最終的に変性温度領域Ａ１１で一本鎖化され、そのうち蛍光物質が結合している鎖がハイブリダイゼーション領域Ａ１４に固定された検出用ポリヌクレオチドとハイブリダイズされたときに、蛍光を発する。
したがって、サンプル液を流し終えたＰＣＲプレート２１を共焦点レーザ顕微鏡などにセットし、ハイブリダイゼーション領域Ａ１４を通過する毛細管流路２２を観察することにより、その蛍光強度を測定することができる（同［００８１］［００８２］参照）。
【０００６】
この場合に、ＰＣＲプレート２１を用いて、予め、ＤＮＡの濃度が既知の複数のサンプル液について３０回のＰＣＲサイクルを繰り返した後、サイクル経過後の蛍光強度を測定し、その蛍光強度とＤＮＡ濃度の検量線を求めておけば、濃度が未知のサンプル液について３０回のＰＣＲサイクルを繰り返した後に測定された蛍光強度に基づいて、サンプル液に含まれていたＤＮＡ濃度を定量することができる。
【０００７】
図５は、ＤＮＡ濃度に応じたＰＣＲカーブを示すグラフである。ＰＣＲカーブＤｎは、ＰＣＲサイクルの回数と蛍光強度の関係を示す線図であり、所定回数経過した時点で蛍光強度が上昇し、その後、さらに所定回数繰り返すと増幅が安定し、ある蛍光強度に達するとそれ以上蛍光強度が頭打ちになるカーブを描く。そして、ＤＮＡ濃度が高ければ蛍光強度が立上るまでの回数及び頭打ちになるまでの回数が少なくなっており、ＤＮＡ濃度が低ければ夫々の回数が多くなっていることがわかる。
【０００８】
ところで、ＰＣＲプレート２１はハイブリダイゼーション領域Ａ１４に達するまでのＰＣＲサイクルの回数が３０回と決まっているので、これを図５のグラフに当てはめると、鎖線Ｓ３０に示すように、３０回のＰＣＲサイクルを繰り返した時点での蛍光強度を測定することとなる。
図６は、ＤＮＡ濃度と蛍光強度の関係を示す検量線Ｋ３０を示し、ＤＮＡ濃度が中程度の場合は蛍光強度と濃度の関係がほぼ比例するが、高濃度及び低濃度の場合は、濃度変化に対する蛍光強度の変化が減少して比例関係が崩れるだけでなく、ＰＣＲカーブが重なる部分も生ずるため、その蛍光強度に基づいてＤＮＡ濃度を定量することができない。
【０００９】
このため従来より、例えば、２０回、３０回、４０回の蛍光強度を測定してＧＭＯ特定遺伝子三点検定という手法がとられている。
これは、図５の鎖線Ｓ２０、Ｓ３０、Ｓ４０に対応する蛍光強度を測定し、図６に示すようにその蛍光強度とＤＮＡ濃度の関係を示す検量線Ｋ２０、Ｋ３０、Ｋ４０を求めて、定量可能な濃度の幅を広げる手法であるが、上述したＰＣＲプレート２１は、流路に固定したオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによる二本鎖ヌクレオチドに蛍光物質をインターカレートさせて、その蛍光強度を測定するようにしているため、任意の回数のＰＣＲサイクルで蛍光強度を計測することができない。
【００１０】
このため、サンプル液をチューブに入れて、そのチューブを所定のＰＣＲサイクルで所定回数（２０回、３０回、４０回）加熱冷却した後、電気泳動法により定量を行う方法がある。
しかしながら、この場合は少なくとも三本のチューブを用意しなければならないだけでなく、チューブを加熱するヒータ温度を時間経過に伴い昇温・降温させる熱制御が必要となり、加熱冷却に時間がかかる。また、その制御が複雑で面倒なだけでなく、制御装置などのコストが嵩み、測定精度も高くないという問題がある。
さらに、予め設定された回数のＰＣＲサイクルを経過した時点で定量するようにしているため、ＤＮＡの増幅が他の要因で阻害されたり、ＤＮＡ増幅操作中に異常が生じても、これを検知することができない。
例えば、ＤＮＡ濃度が測定されたときに、ＤＮＡが正常に増幅された結果としての測定値であるのか、あるいは、温度制御装置の故障やＰＣＲ用サンプル液を調整するときのピペット誤差等によりＤＮＡが正常に増幅されなかったときの測定値であるのか判断することができない。
【００１１】
このため最近では、さらに検出精度を向上させるため、リアルタイムＰＣＲ法が提案されている。
これは、インターカレーターやＴａｑｍａｎプローブを含んだサンプル液を入れたチューブからの蛍光強度を継続的にモニタしながら、そのチューブを所定のＰＣＲサイクルで加熱冷却することにより、蛍光強度が所定の値に達するまでの回数からＤＮＡの濃度を定量するものである。
この場合、図５で示すように、ＤＮＡ濃度が既知の複数のサンプル液について測定された夫々のＰＣＲカーブの所定の蛍光強度（鎖線ＳＲＴ）に対応するＰＣＲサイクルの回数を予め測定しておき、図７に示すようにそのＰＣＲサイクルの回数とＤＮＡ濃度の検量線ＫＲＴを求めておけばＤＮＡの濃度を定量することができ、０．０１％程度のわずかの量でも正確に検出できる。
また，ＰＣＲカーブが得られることから、ＤＮＡの増幅が他の要因で阻害されたり、ＤＮＡ増幅操作中に異常が生じた場合もこれを検知することができる。
【００１２】
この場合、チューブを加熱冷却装置から外して蛍光強度を測定しなければならない面倒は解消されるが、サンプル液を加熱冷却するための熱制御は依然として必要となり、制御装置などのコストが嵩み、加熱冷却の時間がかかるという問題は解消されず、個々のチューブにサンプル液を入れたりする作業の煩わしさも解消されない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そこで本発明は、ＰＣＲ法による遺伝子増幅を極めて簡単に行うことができると同時に、リアルタイムＰＣＲと同様に広範囲のＤＮＡ濃度を定量可能で、且つ、信頼性の高い定量データを得られるようにすることを技術的課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この課題を解決するため、本発明は、ＤＮＡの二本鎖を変性させる高温の変性温度と、変性された一本鎖がアニーリングを開始する低温のアニーリング温度との間で加熱冷却を繰り返すＰＣＲサイクルを繰り返しながら、サンプル液に含まれる特定のＤＮＡを増幅させ、その増幅量をサンプル液の蛍光強度に基づいて定量する遺伝子定量装置であって、長手方向に沿って変性温度領域及びアニーリング温度領域が並列形成されると共に、前記変性温度領域及びアニーリング温度領域の間を移動しながら長手方向に進行する毛細管流路が蛇行形成されたＰＣＲプレートと、前記毛細管流路の流入口からサンプル液を送液する送液装置と、前記各毛細管流路を横切るように長手方向に沿って移動させることにより各流路における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に対応させて測定する光学ヘッドを備えたことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の遺伝子定量装置によれば、長手方向に沿って並列形成された変性温度領域及びアニーリング温度領域の間を移動しながら長手方向に進行する毛細管流路が蛇行形成されたＰＣＲプレートを用いて、その毛細管流路にサンプル液を流すだけで、サンプルは変性温度とアニーリング温度の間で加熱冷却されるＰＣＲサイクルが繰り返され遺伝子増幅される。
その後、蛇行形成された毛細管流路を次々と横切るように、蛍光強度を測定する光学ヘッドを長手方向に移動させれば、各流路における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に対応させて測定することができるので、ＰＣＲサイクルをある特定の回数付与したときの蛍光強度ではなく、０回からＰＣＲサイクル終了に至るまでの蛍光強度に基づいてＰＣＲカーブを描かせることができる。
【００１６】
この場合に、光学ヘッドは毛細管流路があるところと毛細管流路のないところを交互に横切るので、蛍光強度がノイズを含んだ信号として出力されるが、請求項２及び請求項７のように光学ヘッドで読み取られた蛍光強度のデータをスムージングすることにより、そのノイズを除去することができる。
したがって、スムージングされたＰＣＲカーブに基づいて、リアルタイムＰＣＲと同様、所定の蛍光強度（鎖線Ｓ４）に対応するＰＣＲサイクルの回数に基づいて、ＤＮＡ濃度を定量することができるだけでなく、ＰＣＲカーブの形状に基づいて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅が正常に行なわれたか否かを判定することができる。
【００１７】
また、請求項３及び請求項８のように、ＰＣＲプレートに連続的に同一サンプル液を供給しながら、所定時間間隔をおいて、光学ヘッドを長手方向に沿って往復移動して測定し、夫々のデータをスムージングすると共に、所定の統計処理を行えば、例えば平均化した場合には複数回測定したと同じ結果が得られ、さらに、偏差値などから著しく不適当なデータを排除することにより信頼性の高いデータのみで平均化して測定精度を向上させることができる。
この場合に、従来、複数の同一サンプル液を別々に測定するのと同じ効果が得られ、データ信頼性が向上するだけでなく、その作業の手間が軽減されると共に測定時間が著しく短縮される。
【００１８】
さらに、請求項４及び請求項９のように、ＰＣＲプレートに供給した一のサンプル液について蛍光強度の測定が終了した後、洗浄液を供給して前記毛細管流路の残るＤＮＡを除去した後、他のサンプル液について蛍光強度の測定を行うことにより、同一のＰＣＲプレートに異種のサンプル液を順次供給するだけで、それぞれ個別に遺伝子の定量を行なうことができる。
さらにまた、請求項５及び請求項１０のように、光学ヘッドを、ＰＣＲプレートに対して傾斜可能に形成しておけば、励起光の直接反射光が入射されるなどの影響があるときに、光学ヘッドをＰＣＲプレートに対して傾斜させることにより、その影響を排除することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本例では、ＰＣＲ法により遺伝子増幅を極めて簡単に行うことができると同時に、リアルタイムＰＣＲと同様に広範囲にわたって定量可能で、且つ、信頼性の高い定量データを得られるようにするという目的を達成するため、長手方向に沿って変性温度領域及びアニーリング温度領域が並列形成されると共に、変性温度領域及びアニーリング温度領域の間を移動しながら長手方向に進行する毛細管流路が蛇行形成されたＰＣＲプレートにサンプル液を流しながらＰＣＲサイクルを繰り返し行なわせ、蛍光強度を測定する光学ヘッドを長手方向に移動させることにより、各毛細管流路における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に対応させて測定するようにした。
【００２０】
図１は本発明に係る遺伝子定量装置の要部を示す説明図、図２はその全体構成を示すフローシート、図３は測定結果を示すグラフである。
【００２１】
図１に示す遺伝子定量装置１は、ＤＮＡの二本鎖を解離させる変性温度と、変性された一本鎖がアニーリングを開始すると共に伸長する低温のアニーリング温度との間で加熱冷却を繰り返すＰＣＲサイクルを繰り返しながら、サンプル液に含まれる特定のＤＮＡを増幅させ、その増幅量を定量する装置であって、定量しようとするＤＮＡを含んだサンプル液を流しながら前記ＰＣＲサイクルを行わせる毛細管流路２が形成されたＰＣＲプレート３と、サンプル液を所定の流量で送液する送液装置４と、毛細管流路２における蛍光強度を測定する光学ヘッド５を備えている。
【００２２】
ＰＣＲプレート３は、長手方向Ｘに沿って変性温度領域Ａ１及びアニーリング温度領域Ａ２が並列形成されると共に、その裏面側に、各領域Ａ１及びＡ２の温度を夫々９５℃及び５９℃に維持するヒータＨ１及びＨ２が設けられている。
このヒータＨ１及びＨ２としては、ブロックヒータ、薄膜状ヒーター、ペルチェ素子などが用いられ、ＰＣＲプレート３と各領域Ａ１及びＡ２とヒーター部Ｈ１及びＨ２の間には、伝熱効率を上げるためにシリコングリースなどの伝熱性の材質が設けられている。
また、ＰＣＲプレート３は、ベースプレート３Ａと、底面側に毛細管流路２となる溝が形成されたカバープレート３Ｂを貼り合わせて形成されている。
毛細管流路２は、変性温度領域Ａ１及びアニーリング温度領域Ａ２の間を移動しながら長手方向に進行し、流入口２inから流出口２outに至るまでに例えば５０回のＰＣＲサイクルを繰り返すように蛇行形成されている。
これにより、サンプル液に含まれるＤＮＡは、変性温度領域Ａ１で変性温度まで加熱されることにより変性されて一本鎖化され、一本鎖化されたＤＮＡがアニーリング温度領域Ａ２でアニーリング及び伸長される。
【００２３】
送液装置４は、流路切換弁６に、ＰＣＲ用に調整されたサンプル液を０.５〜６μｌ／ｍｉｎで送液する複数のマイクロシリンジポンプＰ１〜Ｐ４が接続されると共に、サンプル液を交換するときに毛細管流路２内を洗浄するＤＮＡ−ＯＦＦ（タカラバイオ株式会社の商品名）などのＤＮＡコンタミネーション除去溶液を供給する洗浄液供給ポート７が接続されている。
なお、サンプル液にはあらかじめ定量しようとしているＤＮＡと蛍光試薬Ｃｙ５をＴａｑｍａｎプローブにより標識した蛍光標識とＰＣＲ試薬が調整されている。このため、ＰＣＲ反応の過程でＤＮＡ量が増加するに伴いサンプル液の蛍光強度が増加する。
【００２４】
光学ヘッド５は、上下に伸縮するシリンダ８の先端に取り付けられ、そのシリンダ８がＸＹ移動テーブル９により水平方向に移動可能に取り付けられると共に、Ｘ軸回りのθｘ方向及びＹ軸回りのθｙ方向に傾斜可能に配されて、ＰＣＲプレート３上で自由に位置調整及び角度調整可能に配されている。
そして、光学ヘッド５をＹ軸方向に移動させてＰＣＲプレート３上の任意の位置で位置決めした状態でＸ方向に往復移動させることにより、蛇行形成された毛細管流路２を次々と横切って蛍光強度が測定される。
本例では、変性温度領域Ａ１とアニーリング温度領域Ａ２の間に設定した観察領域Ａ０で毛細管流路２を横切るように光学ヘッド５が往復移動される。
また、その上面及び側面に入力用及び出力用の光ファイバコネクタ５in及び５outが形成され、例えば波長６４０ｎｍの励起光照射用半導体レーザ１０が光ファイバ１１inを介して入力用光ファイバコネクタ５inに接続され、励起光が、ダイクロイックミラー１２を透過して底面に設けられた観察孔１３からＰＣＲプレート３上に照射されるようになっている。
そして、出力用の光ファイバコネクタ５outが光ファイバ１１outを介して光電変換素子１４に接続されており、観察孔１３から入射された光は、ダイクロイックミラー１２で反射されて光ファイバ１１outを介して光電変換素子１４に入力されるように形成されている。
なお、光ファイバ１１inの入射端側には励起波長以外の光をカットする励起フィルタＦ１が配され、光ファイバ１１outの出射端には蛍光波長以外の光をカットする蛍光フィルタＦ２が配されている。
このとき、励起光の直接反射光が入射されるなどの影響があるときは、光学ヘッドをＰＣＲプレートに対してθｘ方向及びθｙ方向に例えば１０〜１５°傾斜させることによりその影響を排除することができる。
【００２５】
これにより、ＰＣＲプレート３の毛細管流路２に励起光が照射されたときに生じる蛍光強度が光電変換素子１４で測定される。
このとき、光学ヘッド５を長手方向に例えばＰＣＲサイクルの０回から５０回まで走査すると、毛細管流路２と流路でない部分を交互に横断して蛍光強度が測定されるので、その出力データはノイズが重畳されることとなる。
そこで、その出力データを演算処理装置１５に入力してノイズを除去する処理を行う。
【００２６】
演算処理装置１５では、まず、光学ヘッド５を長手方向に例えばＰＣＲサイクルの０回から５０回まで走査することにより測定された蛍光強度の変化をスムージングし、次いで、光学ヘッド５の長手方向の位置と蛍光強度の関係を求める。
光学ヘッド５の長手方向の位置はＰＣＲサイクル数に対応しているので、このデータに基づき、ＰＣＲサイクル−蛍光強度の関係を求め、必要に応じてグラフ化する演算処理を行う。
【００２７】
同一のサンプル液について複数回測定する場合は、サンプル液を送液しながら、光学ヘッド５を所定時間間隔をおいて長手方向に所定回数（例えば１００回）往復移動させることにより、光学ヘッド５が走査されるたびに測定された蛍光強度の変化をスムージングした後、所定の統計処理を行ったり、測定されたデータを積算した後スムージング処理する演算処理を行えばよい。
この場合の統計処理としては、例えば、単純に平均処理をしたり、偏差値などから著しく不適当なデータを排除することにより信頼性の高いデータのみで平均処理するなど、従来公知の任意の統計処理を採用しうる。
【００２８】
以上が本発明の一例構成であって、次に本発明方法について説明する。
まず、ＰＣＲプレート３の各ヒータＨ１及びＨ２を夫々９５℃及び５９℃に維持し、ＤＮＡ濃度が既知（０％、５％、１０％、１００％）のサンプル液を用いて、順次、蛍光強度の測定を行う。
そして、マイクロシリンジポンプＰ１からＰＣＲプレート３の毛細管流路２を通り、ＰＣＲサイクルを５０回繰り返すまでに約４０分かかる流量で０％のサンプル液を送液した後、励起光を照射しながら光学ヘッド５を長手方向に沿ってＰＣＲサイクル０回から５０回まで走査して蛍光強度を測定すると、図３の波形データＷ１が得られ、この波形データＷ１を６次関数で近似することによりスムージングして、０％のＰＣＲカーブＣ１が得られる。
次いで、洗浄液供給ポート７からＤＮＡコンタミネーション除去溶液を供給して毛細管流路を洗浄した後、マイクロシリンジポンプＰ２から５％のサンプル液を同様に送液し、光学ヘッド５を長手方向に沿ってＰＣＲサイクル０回から５０回まで走査して蛍光強度を測定すると、図３の波形データＷ２が得られ、この波形データＷ２を同様にスムージングして、５％のＰＣＲカーブＣ２が得られる。
同様の操作を繰り返して、１０％及び１００％のサンプル液を順次供給し、光学ヘッド５により蛍光強度を測定すると、図３の波形データＷ３及びＷ４が得られ、これらの波形データＷ３及びＷ４を同様にスムージングすることにより、１０％及び１００％のＰＣＲカーブＣ３及びＣ４が得られる。
【００２９】
このようにして、ＤＮＡ濃度が既知の他のサンプル液についても同様にＰＣＲカーブのデータを蓄積しておく。
また、リアルタイムＰＣＲと同様に、一定の蛍光強度（例えば１.１０）が得られるまでのＰＣＲサイクルの回数に対応するＤＮＡ濃度の検量線を求めておく。
【００３０】
そして、ＤＮＡ濃度が未知のサンプル液についてその濃度を定量するときは、同様の手順で光学ヘッド５により蛍光強度を測定し、ＰＣＲカーブを得る。
ここで、ＰＣＲカーブの形状が、予め測定したデータと著しく異なれば、ＰＣＲサイクルによるＤＮＡ増幅に異常があったと考えられるので、そのデータは廃棄する。
また、ＰＣＲカーブの形状が、予め測定したデータと略重なれば、ＰＣＲサイクルによるＤＮＡ増幅が正常に行なわれていると判定でき、この場合は、検量線を求める際に設定した蛍光強度（例えば１.１０）が得られるまでのＰＣＲサイクル数に基づいて、ＤＮＡ濃度を定量することができる。
【００３１】
次いで、ＤＮＡ濃度が未知の他のサンプル液についてその濃度を定量するときは、洗浄液供給ポート７からＤＮＡコンタミネーション除去溶液を供給して、毛細管流路２内に残存するＤＮＡを洗浄除去した後、同様の手順で当該他のサンプル液を流し、光学ヘッド５により蛍光強度を測定し、ＰＣＲカーブを得ればよい。
【００３２】
なお上述の説明では、アニーリング温度領域Ａ２でアニーリングと伸長を行なわせることにより、変性温度領域Ａ１とアニーリング温度領域Ａ２の２つの温度領域でＰＣＲ反応を行なわせる２ステップＰＣＲについて説明したが、変性温度領域Ａ１とアニーリング温度領域Ａ２の間に中温のヒータを配した伸長温度領域を形成し、この３つの温度領域を用いてＰＣＲ反応を行わせる３ステップＰＣＲにも適用できることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
以上述べたように、本発明は、加工食品などに含まれる組換遺伝子の濃度や、検体に含まれる特定病原体などの遺伝子の濃度を定量する用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明に係る遺伝子定量装置の要部を示す斜視図。
【図２】その全体構成を示すフローシート。
【図３】測定結果を示すグラフ。
【図４】従来装置を示す斜視図。
【図５】ＰＣＲサイクル数と蛍光強度の関係を示すグラフ。
【図６】蛍光強度とＤＮＡ濃度の検量線を示すグラフ。
【図７】ＰＣＲサイクル数とＤＮＡ濃度の検量線を示すグラフ。
【符号の説明】
【００３５】
１ 遺伝子定量装置
２ 毛細管流路
３ ＰＣＲプレート
４ 送液装置
５ 光学ヘッド
Ａ０ 蛍光観察領域
Ａ１ 変性温度領域
Ａ２ アニーリング温度領域
１５ 演算処理装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル液に含まれる特定のＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）法により増幅させ、その増幅量を定量する遺伝子定量装置及び定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、農薬や病害虫に対する耐性遺伝子を導入した遺伝子組換作物（Genetically Modified Organisms ;ＧＭＯ）が米国、カナダを中心に栽培され、国際市場で流通している。米国の農家では、一つの作物につき数百ヘクタールの規模で複数の品種を栽培しており、放任受粉による栽培段階やまたは収穫段階、流通段階で非意図的にｎｏｎ−ＧＭＯにＧＭＯが混入することが考えられる。
これに伴い、我が国では輸送する場合に混入してくるＧＭＯの非意図的な許容限度を最大５％として、それ以上含まれている場合はＧＭＯの表示が義務付けられており、これにより、ＧＭＯの検知技術が必須となってきている。
【０００３】
ＧＭＯを検知するため、サンプル液に含まれる特定のＤＮＡを短時間で増幅させることのできるＰＣＲ法を利用することが一般的であり、従来より、サンプル液を流すだけで高温の変性温度（９４℃前後）と中温の伸長温度（７２℃前後）と低温のアニーリング温度（４５〜６０℃前後）の間で加熱冷却を繰り返すＰＣＲサイクルを所定回数行なうことのできるＰＣＲプレートが提案されている。
【特許文献１】特開２００５−１３０７９５号公報
【０００４】
このＰＣＲプレート２１には、図４に示すように、プレート２１を左右に横切る毛細管流路２２が形成されており、これを夫々の温度に制御される四つの金属ブロックからなるヒータＨ１１〜Ｈ１４に載せることにより、中央の長手方向に沿って形成された伸長温度領域Ａ１２を挟んで、その幅方向両側に変性温度領域Ａ１１及びアニーリング温度領域Ａ１３が形成され、長手方向端部にハイブリダイゼーション領域Ａ１４が形成されるようになされている。
各ヒータＨ１１〜Ｈ１４のうち、変性温度領域Ａ１１に対応するヒータＨ１１は９０℃に、伸長温度領域Ａ１２に対応するヒータＨ１２は７２℃に、アニーリング温度領域Ａ１３に対応するヒータＨ１３は５５℃に、ハイブリダイゼーション領域Ａ１４に対応するヒータＨ１４は５０℃に、それぞれ維持されている（特許文献１［００８０］参照）。
また、毛細管流路２２がハイブリダイゼーション領域Ａ１４を通過する部分には、検出用ポリヌクレオチドが固定された多孔質層が形成されている（同［００７４］参照）。
【０００５】
このプレート２１を用いてＰＣＲを行わせる場合、予めＰＣＲ用に調整したサンプル液を毛細管流路２２に送液すると、サンプル液に含まれるＤＮＡが、毛細管流路２２を流れながら各領域Ａ１１〜Ａ１３を通過し、変性温度領域Ａ１１（９０℃）−伸長温度領域Ａ１２（７２℃）−アニーリング温度領域Ａ１３（５５℃）−伸長温度領域Ａ１２（７２℃）−変性温度領域Ａ１１（９０℃）のＰＣＲサイクルを繰り返しながら増幅されていく。
そして、例えば３０回のＰＣＲサイクルを繰り返した後、最終的に変性温度領域Ａ１１で一本鎖化され、そのうち蛍光物質が結合している鎖がハイブリダイゼーション領域Ａ１４に固定された検出用ポリヌクレオチドとハイブリダイズされたときに、蛍光を発する。
したがって、サンプル液を流し終えたＰＣＲプレート２１を共焦点レーザ顕微鏡などにセットし、ハイブリダイゼーション領域Ａ１４を通過する毛細管流路２２を観察することにより、その蛍光強度を測定することができる（同［００８１］［００８２］参照）。
【０００６】
この場合に、ＰＣＲプレート２１を用いて、予め、ＤＮＡの濃度が既知の複数のサンプル液について３０回のＰＣＲサイクルを繰り返した後、サイクル経過後の蛍光強度を測定し、その蛍光強度とＤＮＡ濃度の検量線を求めておけば、濃度が未知のサンプル液について３０回のＰＣＲサイクルを繰り返した後に測定された蛍光強度に基づいて、サンプル液に含まれていたＤＮＡ濃度を定量することができる。
【０００７】
図５は、ＤＮＡ濃度に応じたＰＣＲカーブを示すグラフである。ＰＣＲカーブＤｎは、ＰＣＲサイクルの回数と蛍光強度の関係を示す線図であり、所定回数経過した時点で蛍光強度が上昇し、その後、さらに所定回数繰り返すと増幅が安定し、ある蛍光強度に達するとそれ以上蛍光強度が頭打ちになるカーブを描く。そして、ＤＮＡ濃度が高ければ蛍光強度が立上るまでの回数及び頭打ちになるまでの回数が少なくなっており、ＤＮＡ濃度が低ければ夫々の回数が多くなっていることがわかる。
【０００８】
ところで、ＰＣＲプレート２１はハイブリダイゼーション領域Ａ１４に達するまでのＰＣＲサイクルの回数が３０回と決まっているので、これを図５のグラフに当てはめると、鎖線Ｓ３０に示すように、３０回のＰＣＲサイクルを繰り返した時点での蛍光強度を測定することとなる。
図６は、ＤＮＡ濃度と蛍光強度の関係を示す検量線Ｋ３０を示し、ＤＮＡ濃度が中程度の場合は蛍光強度と濃度の関係がほぼ比例するが、高濃度及び低濃度の場合は、濃度変化に対する蛍光強度の変化が減少して比例関係が崩れるだけでなく、ＰＣＲカーブが重なる部分も生ずるため、その蛍光強度に基づいてＤＮＡ濃度を定量することができない。
【０００９】
このため従来より、例えば、２０回、３０回、４０回の蛍光強度を測定してＧＭＯ特定遺伝子三点検定という手法がとられている。
これは、図５の鎖線Ｓ２０、Ｓ３０、Ｓ４０に対応する蛍光強度を測定し、図６に示すようにその蛍光強度とＤＮＡ濃度の関係を示す検量線Ｋ２０、Ｋ３０、Ｋ４０を求めて、定量可能な濃度の幅を広げる手法であるが、上述したＰＣＲプレート２１は、流路に固定したオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによる二本鎖ヌクレオチドに蛍光物質をインターカレートさせて、その蛍光強度を測定するようにしているため、任意の回数のＰＣＲサイクルで蛍光強度を計測することができない。
【００１０】
このため、サンプル液をチューブに入れて、そのチューブを所定のＰＣＲサイクルで所定回数（２０回、３０回、４０回）加熱冷却した後、電気泳動法により定量を行う方法がある。
しかしながら、この場合は少なくとも三本のチューブを用意しなければならないだけでなく、チューブを加熱するヒータ温度を時間経過に伴い昇温・降温させる熱制御が必要となり、加熱冷却に時間がかかる。また、その制御が複雑で面倒なだけでなく、制御装置などのコストが嵩み、測定精度も高くないという問題がある。
さらに、予め設定された回数のＰＣＲサイクルを経過した時点で定量するようにしているため、ＤＮＡの増幅が他の要因で阻害されたり、ＤＮＡ増幅操作中に異常が生じても、これを検知することができない。
例えば、ＤＮＡ濃度が測定されたときに、ＤＮＡが正常に増幅された結果としての測定値であるのか、あるいは、温度制御装置の故障やＰＣＲ用サンプル液を調整するときのピペット誤差等によりＤＮＡが正常に増幅されなかったときの測定値であるのか判断することができない。
【００１１】
このため最近では、さらに検出精度を向上させるため、リアルタイムＰＣＲ法が提案されている。
これは、インターカレーターやＴａｑｍａｎプローブを含んだサンプル液を入れたチューブからの蛍光強度を継続的にモニタしながら、そのチューブを所定のＰＣＲサイクルで加熱冷却することにより、蛍光強度が所定の値に達するまでの回数からＤＮＡの濃度を定量するものである。
この場合、図５で示すように、ＤＮＡ濃度が既知の複数のサンプル液について測定された夫々のＰＣＲカーブの所定の蛍光強度（鎖線ＳＲＴ）に対応するＰＣＲサイクルの回数を予め測定しておき、図７に示すようにそのＰＣＲサイクルの回数とＤＮＡ濃度の検量線ＫＲＴを求めておけばＤＮＡの濃度を定量することができ、０．０１％程度のわずかの量でも正確に検出できる。
また，ＰＣＲカーブが得られることから、ＤＮＡの増幅が他の要因で阻害されたり、ＤＮＡ増幅操作中に異常が生じた場合もこれを検知することができる。
【００１２】
この場合、チューブを加熱冷却装置から外して蛍光強度を測定しなければならない面倒は解消されるが、サンプル液を加熱冷却するための熱制御は依然として必要となり、制御装置などのコストが嵩み、加熱冷却の時間がかかるという問題は解消されず、個々のチューブにサンプル液を入れたりする作業の煩わしさも解消されない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そこで本発明は、ＰＣＲ法による遺伝子増幅を極めて簡単に行うことができると同時に、リアルタイムＰＣＲと同様に広範囲のＤＮＡ濃度を定量可能で、且つ、信頼性の高い定量データを得られるようにすることを技術的課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この課題を解決するため、本発明は、ＤＮＡの二本鎖を変性させる高温の変性温度と、変性された一本鎖がアニーリングを開始する低温のアニーリング温度との間で加熱冷却を繰り返すＰＣＲサイクルを繰り返しながら、サンプル液に含まれる特定のＤＮＡを増幅させ、その増幅量をサンプル液の蛍光強度に基づいて定量する遺伝子定量装置であって、長手方向に沿って変性温度領域及びアニーリング温度領域が並列形成されると共に、前記変性温度領域及びアニーリング温度領域の間を移動しながら長手方向に進行する毛細管流路が蛇行形成されたＰＣＲプレートと、前記毛細管流路の流入口からサンプル液を送液する送液装置と、前記各毛細管流路を横切るように長手方向に沿って移動させることにより各流路における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に対応させて測定する光学ヘッドを備えたことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の遺伝子定量装置によれば、長手方向に沿って並列形成された変性温度領域及びアニーリング温度領域の間を移動しながら長手方向に進行する毛細管流路が蛇行形成されたＰＣＲプレートを用いて、その毛細管流路にサンプル液を流すだけで、サンプルは変性温度とアニーリング温度の間で加熱冷却されるＰＣＲサイクルが繰り返され遺伝子増幅される。
その後、蛇行形成された毛細管流路を次々と横切るように、蛍光強度を測定する光学ヘッドを長手方向に移動させれば、各流路における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に対応させて測定することができるので、ＰＣＲサイクルをある特定の回数付与したときの蛍光強度ではなく、０回からＰＣＲサイクル終了に至るまでの蛍光強度に基づいてＰＣＲカーブを描かせることができる。
【００１６】
この場合に、光学ヘッドは毛細管流路があるところと毛細管流路のないところを交互に横切るので、蛍光強度がノイズを含んだ信号として出力されるが、請求項２及び請求項７のように光学ヘッドで読み取られた蛍光強度のデータをスムージングすることにより、そのノイズを除去することができる。
したがって、スムージングされたＰＣＲカーブに基づいて、リアルタイムＰＣＲと同様、所定の蛍光強度（鎖線Ｓ４）に対応するＰＣＲサイクルの回数に基づいて、ＤＮＡ濃度を定量することができるだけでなく、ＰＣＲカーブの形状に基づいて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅が正常に行なわれたか否かを判定することができる。
【００１７】
また、請求項３及び請求項８のように、ＰＣＲプレートに連続的に同一サンプル液を供給しながら、所定時間間隔をおいて、光学ヘッドを長手方向に沿って往復移動して測定し、夫々のデータをスムージングすると共に、所定の統計処理を行えば、例えば平均化した場合には複数回測定したと同じ結果が得られ、さらに、偏差値などから著しく不適当なデータを排除することにより信頼性の高いデータのみで平均化して測定精度を向上させることができる。
この場合に、従来、複数の同一サンプル液を別々に測定するのと同じ効果が得られ、データ信頼性が向上するだけでなく、その作業の手間が軽減されると共に測定時間が著しく短縮される。
【００１８】
さらに、請求項４及び請求項９のように、ＰＣＲプレートに供給した一のサンプル液について蛍光強度の測定が終了した後、洗浄液を供給して前記毛細管流路の残るＤＮＡを除去した後、他のサンプル液について蛍光強度の測定を行うことにより、同一のＰＣＲプレートに異種のサンプル液を順次供給するだけで、それぞれ個別に遺伝子の定量を行なうことができる。
さらにまた、請求項５及び請求項１０のように、光学ヘッドを、ＰＣＲプレートに対して傾斜可能に形成しておけば、励起光の直接反射光が入射されるなどの影響があるときに、光学ヘッドをＰＣＲプレートに対して傾斜させることにより、その影響を排除することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本例では、ＰＣＲ法により遺伝子増幅を極めて簡単に行うことができると同時に、リアルタイムＰＣＲと同様に広範囲にわたって定量可能で、且つ、信頼性の高い定量データを得られるようにするという目的を達成するため、長手方向に沿って変性温度領域及びアニーリング温度領域が並列形成されると共に、変性温度領域及びアニーリング温度領域の間を移動しながら長手方向に進行する毛細管流路が蛇行形成されたＰＣＲプレートにサンプル液を流しながらＰＣＲサイクルを繰り返し行なわせ、蛍光強度を測定する光学ヘッドを長手方向に移動させることにより、各毛細管流路における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に対応させて測定するようにした。
【００２０】
図１は本発明に係る遺伝子定量装置の要部を示す説明図、図２はその全体構成を示すフローシート、図３は測定結果を示すグラフである。
【００２１】
図１に示す遺伝子定量装置１は、ＤＮＡの二本鎖を解離させる変性温度と、変性された一本鎖がアニーリングを開始すると共に伸長する低温のアニーリング温度との間で加熱冷却を繰り返すＰＣＲサイクルを繰り返しながら、サンプル液に含まれる特定のＤＮＡを増幅させ、その増幅量を定量する装置であって、定量しようとするＤＮＡを含んだサンプル液を流しながら前記ＰＣＲサイクルを行わせる毛細管流路２が形成されたＰＣＲプレート３と、サンプル液を所定の流量で送液する送液装置４と、毛細管流路２における蛍光強度を測定する光学ヘッド５を備えている。
【００２２】
ＰＣＲプレート３は、長手方向Ｘに沿って変性温度領域Ａ１及びアニーリング温度領域Ａ２が並列形成されると共に、その裏面側に、各領域Ａ１及びＡ２の温度を夫々９５℃及び５９℃に維持するヒータＨ１及びＨ２が設けられている。
このヒータＨ１及びＨ２としては、ブロックヒータ、薄膜状ヒーター、ペルチェ素子などが用いられ、ＰＣＲプレート３と各領域Ａ１及びＡ２とヒーター部Ｈ１及びＨ２の間には、伝熱効率を上げるためにシリコングリースなどの伝熱性の材質が設けられている。
また、ＰＣＲプレート３は、ベースプレート３Ａと、底面側に毛細管流路２となる溝が形成されたカバープレート３Ｂを貼り合わせて形成されている。
毛細管流路２は、変性温度領域Ａ１及びアニーリング温度領域Ａ２の間を移動しながら長手方向に進行し、流入口２inから流出口２outに至るまでに例えば５０回のＰＣＲサイクルを繰り返すように蛇行形成されている。
これにより、サンプル液に含まれるＤＮＡは、変性温度領域Ａ１で変性温度まで加熱されることにより変性されて一本鎖化され、一本鎖化されたＤＮＡがアニーリング温度領域Ａ２でアニーリング及び伸長される。
【００２３】
送液装置４は、流路切換弁６に、ＰＣＲ用に調整されたサンプル液を０.５〜６μｌ／ｍｉｎで送液する複数のマイクロシリンジポンプＰ１〜Ｐ４が接続されると共に、サンプル液を交換するときに毛細管流路２内を洗浄するＤＮＡ−ＯＦＦ（タカラバイオ株式会社の商品名）などのＤＮＡコンタミネーション除去溶液を供給する洗浄液供給ポート７が接続されている。
なお、サンプル液にはあらかじめ定量しようとしているＤＮＡと蛍光試薬Ｃｙ５をＴａｑｍａｎプローブにより標識した蛍光標識とＰＣＲ試薬が調整されている。このため、ＰＣＲ反応の過程でＤＮＡ量が増加するに伴いサンプル液の蛍光強度が増加する。
【００２４】
光学ヘッド５は、上下に伸縮するシリンダ８の先端に取り付けられ、そのシリンダ８がＸＹ移動テーブル９により水平方向に移動可能に取り付けられると共に、Ｘ軸回りのθｘ方向及びＹ軸回りのθｙ方向に傾斜可能に配されて、ＰＣＲプレート３上で自由に位置調整及び角度調整可能に配されている。
そして、光学ヘッド５をＹ軸方向に移動させてＰＣＲプレート３上の任意の位置で位置決めした状態でＸ方向に往復移動させることにより、蛇行形成された毛細管流路２を次々と横切って蛍光強度が測定される。
本例では、変性温度領域Ａ１とアニーリング温度領域Ａ２の間に設定した観察領域Ａ０で毛細管流路２を横切るように光学ヘッド５が往復移動される。
また、その上面及び側面に入力用及び出力用の光ファイバコネクタ５in及び５outが形成され、例えば波長６４０ｎｍの励起光照射用半導体レーザ１０が光ファイバ１１inを介して入力用光ファイバコネクタ５inに接続され、励起光が、ダイクロイックミラー１２を透過して底面に設けられた観察孔１３からＰＣＲプレート３上に照射されるようになっている。
そして、出力用の光ファイバコネクタ５outが光ファイバ１１outを介して光電変換素子１４に接続されており、観察孔１３から入射された光は、ダイクロイックミラー１２で反射されて光ファイバ１１outを介して光電変換素子１４に入力されるように形成されている。
なお、光ファイバ１１inの入射端側には励起波長以外の光をカットする励起フィルタＦ１が配され、光ファイバ１１outの出射端には蛍光波長以外の光をカットする蛍光フィルタＦ２が配されている。
このとき、励起光の直接反射光が入射されるなどの影響があるときは、光学ヘッドをＰＣＲプレートに対してθｘ方向及びθｙ方向に例えば１０〜１５°傾斜させることによりその影響を排除することができる。
【００２５】
これにより、ＰＣＲプレート３の毛細管流路２に励起光が照射されたときに生じる蛍光強度が光電変換素子１４で測定される。
このとき、光学ヘッド５を長手方向に例えばＰＣＲサイクルの０回から５０回まで走査すると、毛細管流路２と流路でない部分を交互に横断して蛍光強度が測定されるので、その出力データはノイズが重畳されることとなる。
そこで、その出力データを演算処理装置１５に入力してノイズを除去する処理を行う。
【００２６】
演算処理装置１５では、まず、光学ヘッド５を長手方向に例えばＰＣＲサイクルの０回から５０回まで走査することにより測定された蛍光強度の変化をスムージングし、次いで、光学ヘッド５の長手方向の位置と蛍光強度の関係を求める。
光学ヘッド５の長手方向の位置はＰＣＲサイクル数に対応しているので、このデータに基づき、ＰＣＲサイクル−蛍光強度の関係を求め、必要に応じてグラフ化する演算処理を行う。
【００２７】
同一のサンプル液について複数回測定する場合は、サンプル液を送液しながら、光学ヘッド５を所定時間間隔をおいて長手方向に所定回数（例えば１００回）往復移動させることにより、光学ヘッド５が走査されるたびに測定された蛍光強度の変化をスムージングした後、所定の統計処理を行ったり、測定されたデータを積算した後スムージング処理する演算処理を行えばよい。
この場合の統計処理としては、例えば、単純に平均処理をしたり、偏差値などから著しく不適当なデータを排除することにより信頼性の高いデータのみで平均処理するなど、従来公知の任意の統計処理を採用しうる。
【００２８】
以上が本発明の一例構成であって、次に本発明方法について説明する。
まず、ＰＣＲプレート３の各ヒータＨ１及びＨ２を夫々９５℃及び５９℃に維持し、ＤＮＡ濃度が既知（０％、５％、１０％、１００％）のサンプル液を用いて、順次、蛍光強度の測定を行う。
そして、マイクロシリンジポンプＰ１からＰＣＲプレート３の毛細管流路２を通り、ＰＣＲサイクルを５０回繰り返すまでに約４０分かかる流量で０％のサンプル液を送液した後、励起光を照射しながら光学ヘッド５を長手方向に沿ってＰＣＲサイクル０回から５０回まで走査して蛍光強度を測定すると、図３の波形データＷ１が得られ、この波形データＷ１を６次関数で近似することによりスムージングして、０％のＰＣＲカーブＣ１が得られる。
次いで、洗浄液供給ポート７からＤＮＡコンタミネーション除去溶液を供給して毛細管流路を洗浄した後、マイクロシリンジポンプＰ２から５％のサンプル液を同様に送液し、光学ヘッド５を長手方向に沿ってＰＣＲサイクル０回から５０回まで走査して蛍光強度を測定すると、図３の波形データＷ２が得られ、この波形データＷ２を同様にスムージングして、５％のＰＣＲカーブＣ２が得られる。
同様の操作を繰り返して、１０％及び１００％のサンプル液を順次供給し、光学ヘッド５により蛍光強度を測定すると、図３の波形データＷ３及びＷ４が得られ、これらの波形データＷ３及びＷ４を同様にスムージングすることにより、１０％及び１００％のＰＣＲカーブＣ３及びＣ４が得られる。
【００２９】
このようにして、ＤＮＡ濃度が既知の他のサンプル液についても同様にＰＣＲカーブのデータを蓄積しておく。
また、リアルタイムＰＣＲと同様に、一定の蛍光強度（例えば１.１０）が得られるまでのＰＣＲサイクルの回数に対応するＤＮＡ濃度の検量線を求めておく。
【００３０】
そして、ＤＮＡ濃度が未知のサンプル液についてその濃度を定量するときは、同様の手順で光学ヘッド５により蛍光強度を測定し、ＰＣＲカーブを得る。
ここで、ＰＣＲカーブの形状が、予め測定したデータと著しく異なれば、ＰＣＲサイクルによるＤＮＡ増幅に異常があったと考えられるので、そのデータは廃棄する。
また、ＰＣＲカーブの形状が、予め測定したデータと略重なれば、ＰＣＲサイクルによるＤＮＡ増幅が正常に行なわれていると判定でき、この場合は、検量線を求める際に設定した蛍光強度（例えば１.１０）が得られるまでのＰＣＲサイクル数に基づいて、ＤＮＡ濃度を定量することができる。
【００３１】
次いで、ＤＮＡ濃度が未知の他のサンプル液についてその濃度を定量するときは、洗浄液供給ポート７からＤＮＡコンタミネーション除去溶液を供給して、毛細管流路２内に残存するＤＮＡを洗浄除去した後、同様の手順で当該他のサンプル液を流し、光学ヘッド５により蛍光強度を測定し、ＰＣＲカーブを得ればよい。
【００３２】
なお上述の説明では、アニーリング温度領域Ａ２でアニーリングと伸長を行なわせることにより、変性温度領域Ａ１とアニーリング温度領域Ａ２の２つの温度領域でＰＣＲ反応を行なわせる２ステップＰＣＲについて説明したが、変性温度領域Ａ１とアニーリング温度領域Ａ２の間に中温のヒータを配した伸長温度領域を形成し、この３つの温度領域を用いてＰＣＲ反応を行わせる３ステップＰＣＲにも適用できることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
以上述べたように、本発明は、加工食品などに含まれる組換遺伝子の濃度や、検体に含まれる特定病原体などの遺伝子の濃度を定量する用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明に係る遺伝子定量装置の要部を示す斜視図。
【図２】その全体構成を示すフローシート。
【図３】測定結果を示すグラフ。
【図４】従来装置を示す斜視図。
【図５】ＰＣＲサイクル数と蛍光強度の関係を示すグラフ。
【図６】蛍光強度とＤＮＡ濃度の検量線を示すグラフ。
【図７】ＰＣＲサイクル数とＤＮＡ濃度の検量線を示すグラフ。
【符号の説明】
【００３５】
１ 遺伝子定量装置
２ 毛細管流路
３ ＰＣＲプレート
４ 送液装置
５ 光学ヘッド
Ａ０ 蛍光観察領域
Ａ１ 変性温度領域
Ａ２ アニーリング温度領域
１５ 演算処理装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡの二本鎖を変性させる高温の変性温度と、変性された一本鎖がアニーリングを開始する低温のアニーリング温度との間で加熱冷却を繰り返すＰＣＲサイクルを繰り返しながら、サンプル液に含まれる特定のＤＮＡを増幅させ、その増幅量をサンプル液の蛍光強度に基づいて定量する遺伝子定量装置であって、
長手方向に沿って変性温度領域及びアニーリング温度領域が並列形成されると共に、前記変性温度領域及びアニーリング温度領域の間を移動しながら長手方向に進行する毛細管流路が蛇行形成されたＰＣＲプレートと、
前記毛細管流路の流入口からサンプル液を送液する送液装置と、
前記各毛細管流路を横切るように長手方向に沿って移動させることにより各流路における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に対応させて測定する光学ヘッドを備えたことを特徴とする遺伝子定量装置。
【請求項２】
前記光学ヘッドから出力されたＰＣＲサイクルの回数に対する蛍光強度のデータをスムージングする演算処理装置を備えた請求項１記載の遺伝子定量装置。
【請求項３】
前記光学ヘッドを長手方向に沿って所定時間間隔をおいて所定回数往復移動させることにより測定された夫々のデータをスムージングすると共に、所定の統計処理を行う演算処理装置を備えた請求項１記載の遺伝子定量装置。
【請求項４】
前記ＰＣＲプレートの前記毛細管流路にＤＮＡを除去する洗浄液の供給手段を備えた請求項１記載の遺伝子定量装置。
【請求項５】
前記光学ヘッドが、ＰＣＲプレートに対して傾斜可能に形成された請求項１記載の遺伝子定量装置。
【請求項６】
ＤＮＡの二本鎖が変性する高温の変性温度と、変性された一本鎖がアニーリングを開始する低温のアニーリング温度との間で加熱冷却を繰り返すＰＣＲサイクルを繰り返しながら、サンプル液に含まれる特定のＤＮＡを増幅させて、その増幅量をサンプル液の蛍光強度に基づいて定量する遺伝子定量方法であって、
長手方向に沿って変性温度領域及びアニーリング温度領域が並列形成されると共に、前記変性温度領域及びアニーリング温度領域の間を移動しながら長手方向に進行する毛細管流路が蛇行形成されたＰＣＲプレートにサンプル液を流してＰＣＲサイクルを繰り返し行なわせ、
蛍光強度を測定する光学ヘッドを長手方向に沿って前記各毛細管流路を横切るように移動させることにより、各流路における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に対応させて測定することを特徴とする遺伝子定量方法。
【請求項７】
前記光学ヘッドから出力された蛍光強度のデータをスムージングして、各毛細管流路における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に応じて測定する請求項６記載の遺伝子定量方法。
【請求項８】
前記ＰＣＲプレートに連続的に同一サンプル液を供給しながら、所定時間間隔をおいて、前記光学ヘッドを長手方向に沿って往復移動させることにより測定された夫々のデータをスムージングすると共に、所定の統計処理を行って、蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に応じて測定する請求項６記載の遺伝子定量方法。
【請求項９】
前記ＰＣＲプレートに供給した一のサンプル液について蛍光強度の測定が終了した後、洗浄液を供給して前記毛細管流路に残るＤＮＡを除去した後、他のサンプル液について蛍光強度の測定を行う請求項６記載の遺伝子定量方法。
【請求項１０】
前記光学ヘッドをＰＣＲプレートに対して傾斜させて励起光の影響を排除する請求項６記載の遺伝子定量方法
【請求項１】
ＤＮＡの二本鎖を変性させる高温の変性温度と、変性された一本鎖がアニーリングを開始する低温のアニーリング温度との間で加熱冷却を繰り返すＰＣＲサイクルを繰り返しながら、サンプル液に含まれる特定のＤＮＡを増幅させ、その増幅量をサンプル液の蛍光強度に基づいて定量する遺伝子定量装置であって、
長手方向に沿って変性温度領域及びアニーリング温度領域が並列形成されると共に、前記変性温度領域及びアニーリング温度領域の間を移動しながら長手方向に進行する毛細管流路が蛇行形成されたＰＣＲプレートと、
前記毛細管流路の流入口からサンプル液を送液する送液装置と、
前記各毛細管流路を横切るように長手方向に沿って移動させることにより各流路における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に対応させて測定する光学ヘッドを備えたことを特徴とする遺伝子定量装置。
【請求項２】
前記光学ヘッドから出力されたＰＣＲサイクルの回数に対する蛍光強度のデータをスムージングする演算処理装置を備えた請求項１記載の遺伝子定量装置。
【請求項３】
前記光学ヘッドを長手方向に沿って所定時間間隔をおいて所定回数往復移動させることにより測定された夫々のデータをスムージングすると共に、所定の統計処理を行う演算処理装置を備えた請求項１記載の遺伝子定量装置。
【請求項４】
前記ＰＣＲプレートの前記毛細管流路にＤＮＡを除去する洗浄液の供給手段を備えた請求項１記載の遺伝子定量装置。
【請求項５】
前記光学ヘッドが、ＰＣＲプレートに対して傾斜可能に形成された請求項１記載の遺伝子定量装置。
【請求項６】
ＤＮＡの二本鎖が変性する高温の変性温度と、変性された一本鎖がアニーリングを開始する低温のアニーリング温度との間で加熱冷却を繰り返すＰＣＲサイクルを繰り返しながら、サンプル液に含まれる特定のＤＮＡを増幅させて、その増幅量をサンプル液の蛍光強度に基づいて定量する遺伝子定量方法であって、
長手方向に沿って変性温度領域及びアニーリング温度領域が並列形成されると共に、前記変性温度領域及びアニーリング温度領域の間を移動しながら長手方向に進行する毛細管流路が蛇行形成されたＰＣＲプレートにサンプル液を流してＰＣＲサイクルを繰り返し行なわせ、
蛍光強度を測定する光学ヘッドを長手方向に沿って前記各毛細管流路を横切るように移動させることにより、各流路における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に対応させて測定することを特徴とする遺伝子定量方法。
【請求項７】
前記光学ヘッドから出力された蛍光強度のデータをスムージングして、各毛細管流路における蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に応じて測定する請求項６記載の遺伝子定量方法。
【請求項８】
前記ＰＣＲプレートに連続的に同一サンプル液を供給しながら、所定時間間隔をおいて、前記光学ヘッドを長手方向に沿って往復移動させることにより測定された夫々のデータをスムージングすると共に、所定の統計処理を行って、蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に応じて測定する請求項６記載の遺伝子定量方法。
【請求項９】
前記ＰＣＲプレートに供給した一のサンプル液について蛍光強度の測定が終了した後、洗浄液を供給して前記毛細管流路に残るＤＮＡを除去した後、他のサンプル液について蛍光強度の測定を行う請求項６記載の遺伝子定量方法。
【請求項１０】
前記光学ヘッドをＰＣＲプレートに対して傾斜させて励起光の影響を排除する請求項６記載の遺伝子定量方法
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００７−３００８９６（Ｐ２００７−３００８９６Ａ）
【公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１３５５１６（Ｐ２００６−１３５５１６）
【出願日】平成１８年５月１５日（２００６．５．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度、知的創造による地域産学官連携強化プログラム「文部科学省 知的クラスター創成事業」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１０４０２３６）石川県 (70)
【出願人】（３０４０２４４３０）国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 (169)
【出願人】（０００１３８２００）株式会社モリテックス (120)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月１５日（２００６．５．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度、知的創造による地域産学官連携強化プログラム「文部科学省 知的クラスター創成事業」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１０４０２３６）石川県 (70)
【出願人】（３０４０２４４３０）国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 (169)
【出願人】（０００１３８２００）株式会社モリテックス (120)
【Ｆターム（参考）】
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