遺伝子操作された定常領域を含む、抗体および融合タンパク質
抗体および/または融合タンパク質は、IgG2由来部分およびIgG4由来部分を含む領域を含む。好ましくは、上記IgG2由来部分は、少なくとも重鎖定常領域1およびヒンジ領域を含み、そして上記IgG4由来部分は、重鎖定常領域2のほとんどおよび重鎖定常領域3の全体を含む。本開示に従う遺伝子操作された重鎖定常領域を有する、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する抗体は、所望されない抗体媒介性の細胞活性化および炎症事象を減少し(補体活性化の低下を含む)、これは、Fcレセプター抗体の関与の結果としてもたらされる。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
(関連出願)
本出願は、それぞれ、2003年5月30日および2004年4月19日に出願された、米国仮出願60/475,202および60/563,500に対する優先権を主張し、これらの開示全体が、本明細書中でこの参考として援用される。
【0002】
(背景)
(1.技術分野)
本開示は、遺伝的に操作された抗体および融合タンパク質の分野に関する。より詳細には、本開示は、IgG2由来部分およびIgG4由来部分を含む領域を含む、抗体および/または融合タンパク質に関する。
【0003】
(2.関連分野の背景)
抗体は、Bリンパ球によって産生され、そして感染から防御する。抗体の基本構造は、ジスルフィド結合によって一緒に連結された2つの同一の軽ペプチド鎖および2つの同一の重ペプチド鎖からなる。各鎖のアミノ末端に位置する第1のドメインは、アミノ酸配列が変化可能であり、各個体において見出される抗体結合特異性の広範な幅を提供する。これらは、可変重領域(VH)および可変軽領域(VL)として公知である。各鎖の残りのドメインは、アミノ酸配列が比較的変化せず、そして定常重領域(CH)および定常軽領域(CL)として公知である。抗体の主なクラスは、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMであり;そしてこれらのクラスは、サブクラス(アイソタイプ)にさらに分割され得る。例えば、上記IgGクラスは、4つのサブクラス(すなわち、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4)を有する。上記種々のヒト抗体クラスのうち、ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgMのみが、補体系を有効に活性化することが公知である。
【0004】
抗体クラス間の違いは、上記重鎖の違いに由来する。抗体の成熟の間にクラススイッチが生じることが、公知である。上記基本的な抗体分子は、二機能性構造であり、ここで、上記可変領域が抗原に結合し、他方、残りの定常領域は、特定のエフェクター機能を惹起する。上記ヒンジ領域は、タンパク分解性の切断に対して特に感受性であり;このようなタンパク分解は、切断の正確な部位に依存して、2つまたは3つのフラグメントを与える。上記ヒンジ領域は、上記抗原結合領域(各々は、軽鎖および重鎖の最初の2つのドメインからなる)が、抗体の残部に対して自由に移動または回転できるようにし、この抗体の残部は、残りの重鎖ドメインを含む。上記定常領域は、抗原結合部位を形成しないが、上記定常ドメインおよびヒンジドメインの配置は、それが上記抗原と結合できるようにする分子に対して、セグメント柔軟性を与える。
【0005】
上記抗原と上記抗体との間の相互作用は、複数の結合および引力(例えば、水素結合、静電力およびファン・デル・ワールス力)の形成によってなされる。これらは一緒になってかなりの結合エネルギーを形成し、このエネルギーは、上記抗体が上記抗原に結合することを可能にする。抗体結合の親和性およびアビディティは、抗体の生理学的特性および病理学的特性に影響を与えることが見出されている。
【0006】
遺伝子操作技術の出現は、均一な抗体(モノクローナル抗体)の非限定量を生成する種々の手段をもたらし、これらの抗体は、アイソタイプに依存して、種々の程度のエフェクター効果を示す。例えば、特定のマウスアイソタイプ(IgG1、IgG2)およびヒトアイソタイプ(特に、IgG1)は、細胞(例えば、単球、B細胞およびNK細胞)上のFcレセプターに結合し得、従って、上記細胞を活性化してサイトカインを放出する;このような抗体アイソタイプはまた、局所的または全身的な炎症結果を伴う補体活性化においても強力である。これらのFcレセプター結合定常領域を有する抗体が、インビボで注射される場合、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターフェロンγ(IFN−γ)、インターロイキン2(IL−2)および/または他のサイトカインの一時的ではあるが著しい全身性の放出は、Fcレセプター−抗体結合を介した複数の細胞型(リンパ球または単球を含む)の活性化の結果として、放出され得る。上記サイトカイン放出は、通常、高熱、悪寒および頭痛を伴うが、稀に、より深刻でかつ生命を脅かし得る症状(例えば、肺水腫、髄膜炎、神経毒性、低血圧および呼吸窮迫(サイトカイン放出症候群すなわちCRS))に進行し得る。マウス抗体OKT3は、CRSを生じる重大なサイトカイン放出を引き起こすことが観察されている抗体の1つである。ヒトCD3部分は、少なくとも4つの不変ポリペプチド鎖からなっており、このポリペプチド鎖は、T細胞表面上でT細胞レセプター(TCR)と非共有結合的に会合し、これは、代表的に、T細胞レセプター複合体と呼ばれる。上記T細胞レセプター複合体は、上記T細胞レセプターへの抗原結合の際に、T細胞活性化において重要な役割を担う。いくつかの抗CD3抗体(例えば、OKT3)は、抗原−TCR結合の非存在下で、T細胞を活性化し得る。このような活性化は、mAbのFc部分とアクセサリー細胞上のFcレセプターとの間の相互作用に依存して、T細胞上のCD3複合体の架橋を可能にする。可溶性抗CD3mAbは、それらが(人工的にCD3架橋を促進する)プラスチックに結合されるか、またはFcレセプターを有する細胞に結合されなければ、T細胞を刺激してインビトロで増殖することをしない。
【0007】
これらの事象が許容されないかおよび/または有害である環境における、抗体媒介性の細胞活性化事象(例えば、サイトカイン放出)を減少することが、所望される。多くの実験室は、減少したFcレセプター結合、補体活性化の欠如などのような特徴を示す種々の定常領域を有する抗体を遺伝子操作することにより、強力なエフェクター機能(例えば、OKT3によって観察されるエフェクター機能)に関連する、負の効果を減少することを試みている。
【0008】
従って、独自の定常領域の組み込みによって、遺伝子操作された抗体においてエフェクター機能を低下することは、本明細書中の目的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0009】
(要旨)
遺伝子操作された重鎖定常領域を有する組み換え抗体が、本明細書中に記載される。上記遺伝子操作された定常領域は、IgG2由来部分およびIgG4由来部分を含む。好ましくは、上記IgG2由来部分は、少なくとも重鎖定常領域1およびヒンジ領域を含み、そして上記IgG4由来部分は、重鎖定常領域2のほとんどおよび重鎖定常領域3の全体を含む。本開示に従う遺伝子操作された重鎖定常領域を有する、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する抗体は、所望されない抗体媒介性の細胞活性化および炎症事象を減少し(補体活性化の低下を含む)、これは、Fcレセプター抗体の関与の結果としてもたらされる。
【0010】
別の局面において、本開示は、抗体重鎖を生成するためのプロセスに関し、このプロセスは、以下の工程を包含する:(a)可変領域および定常領域を含む抗体重鎖をコードする配列を含むDNA配列を有する発現ベクターを生成する工程;(b)上記定常領域を、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分から構成する工程;(c)宿主細胞に上記ベクターをトランスフェクションする工程;および(d)上記トランスフェクションされた細胞株を培養して、遺伝子操作された抗体重鎖分子を生成する工程であって、この抗体重鎖分子は、抗体軽鎖と会合して、機能的抗体分子を生成する、工程。
【0011】
別の局面において、本開示は、軽鎖に結合して機能性抗体分子を生成する1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を有する抗体を使用し、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子を介して、抗体媒介性の細胞活性化および炎症性事象を減少するための方法に関する。
【0012】
別の実施形態において、本開示によるIgG2由来の部分およびIgG4由来の部分を含む遺伝子操作された定常領域は、融合タンパク質のFc領域として使用される。その融合タンパク質は、IgG2由来の部分およびIgG4由来の部分を含むように遺伝子操作されたFc領域に融合する非Fc成分を含む。好ましくは、IgG2由来の部分は、少なくとも重鎖定常領域1およびヒンジ領域を含み、そしてIgG4由来の部分は、重鎖定常領域2のほとんど、および重鎖定常領域3の全体を含む。好ましくは、本開示によるその融合タンパク質は、非Fc成分の機能を維持し、および/または非Fc成分単独と比較して半減期を増大し、ならびに/またはFcレセプター抗体結合および補体活性化より生じる事象を含む所望されない抗体Fc媒介性の細胞活性化および炎症性性質を欠く。
【0013】
そのような融合タンパク質をコードする組換えDNA分子がまた、提供される。トランスフェクトされた哺乳類細胞における異種発現の際に、その融合タンパク質は、安定な形態で強力に分泌され、抗体および非Fc成分前分子(predecessor molecule)に特徴的な所望の性質を示す。これらの融合タンパク質は、モノクローナル抗体に関連する従来の適用(フローサイトメトリー、免疫組織化学、細胞ベースのアッセイおよび免疫沈降を含む)において使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【0014】
(好ましい実施形態の詳細な説明)
組み換え抗体は、抗体−Fcレセプター相互作用より生じる抗体媒介性の細胞活性化および炎症性事象を減少するのに役立つ、遺伝子操作された重鎖定常領域とともに記載される。遺伝子操作された重鎖定常領域は、1つ以上のヒト抗体のIgG2サブクラス由来の部分および1つ以上のヒト抗体のIgG4サブクラス由来の部分を含む。当業者は、抗体重鎖が、可変領域および定常領域を含むことを理解する。重鎖定常領域は、重鎖定常領域1(CH1)、ヒンジ領域、重鎖定常領域2(CH2)、および重鎖定常領域3(CH3)を含むCH1、ヒンジ領域、CH2、またはCH3のうちの1つの少なくとも一部は、現在の遺伝子操作された重鎖中のヒトIgG2抗体由来であり、遺伝子操作された重鎖の残りの少なくとも一部は、ヒトIgG4抗体由来である。好ましくは、遺伝子操作された重鎖全体は、ヒトIgG2部分およびヒトIgG4部分の組み合わせ由来である。
【0015】
重鎖定常領域の2つ以上の不連続な部分が、IgG2抗体由来であり得ることが理解されるべきである。そのような環境において、その部分は、IgG2サブクラス内の同じ抗体か、または異なる抗体(すなわち、異なるアロタイプを有する抗体)由来であり得る。同様に、重鎖定常領域の2つ以上の不連続な部分は、IgG4抗体由来であり得る(公知のIgG4アロタイプは1つのみであることに留意)。
【0016】
図1に図式的に示される特定の有用な実施形態において、遺伝子操作された重鎖定常領域は、IgG2サブクラスの1つ以上のヒト抗体由来のCH1領域およびヒンジ領域、ならびに主にIgG4サブクラスの抗体由来のCH2領域およびCH3領域を含む。遺伝子操作された抗体は、マウス−ヒトキメラ抗体(図1A);ヒト化抗体(図1B);または完全なヒト抗体(図1C)の形態であり得る。
【0017】
ヒトIgG2抗体由来の部分およびヒトIgG4抗体由来の部分は、定常領域および/またはヒンジ領域の間の接合部において、正確に終結する必要はない。例えば、以下に示される使用した実施例において(図2を参照のこと)、IgG2抗体由来の部分は、2,3のアミノ酸までヒンジ領域をこえて定常領域2に伸び、重鎖定常領域の残りの部分は、IgG4抗体由来の部分である。
【0018】
本開示による、遺伝子操作された重鎖定常領域の1例は、図2に示される配列(配列番号1)を有する。図2はまた、遺伝子操作された重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号2)を示す。
【0019】
重鎖定常領域のIgG2部分およびIgG4部分は、過剰なサイトカイン放出を生じ、強力にサイトカイン放出症候群(CRS)を誘導し得る細胞相互作用を軽減するように選択される。本開示による、遺伝子操作された重鎖定常領域はまた、炎症性事象(例えば、細胞活性化、サイトカイン放出、および補体の活性化)を誘発する抗体の能力を、減少する。
【0020】
抗体の重鎖定常領域は、その結合特異性について選択され、そして任意の型(例えば、非ヒト、ヒト化、または完全なヒト)であり得る。その抗体の重鎖可変領域が非ヒト(例えば、マウス)であり、本開示による遺伝子操作された重鎖定常領域と組換え結合される場合に、生じた組換え抗体は、キメラ抗体と称される(図1Aを参照のこと)。抗体の重鎖可変領域が、ヒト化され、本開示による遺伝子操作された重鎖定常領域と組換え結合される場合、生じた組換え抗体は、ヒト化抗体と称される(図1Bを参照のこと)。抗体の重鎖可変領域がヒトであり、本開示による遺伝子操作された重鎖定常領域と組換え結合される場合に、生じた組換え抗体は、完全なヒト抗体と称される(図1Cを参照のこと)。図1Bに示される実施形態において、その重鎖の可変領域は、ヒト化され、ヒトフレームワーク領域および非ヒト(この場合はマウス)相補性決定領域(CDR)を含む。そのフレームワーク領域が、1つ以上の供給源由来であり得、CDRが、1つ以上の供給源由来であり得ることが理解されるべきである。抗体のヒト化の方法は、当業者に公知であり、例えば、米国特許第6,479,284号;同第6,407,213号;同第6,350,861号;同第6,180,370号;6,548,640号;および2002年12月3日に出願された係争中の米国特許出願番号PCT/US02/38450に開示される。これらの特許および特許出願の各々の開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【0021】
抗体の軽鎖は、ヒト、非ヒト、またはヒト化であり得る。図1Bに示される実施形態において、その軽鎖は、ヒト化され、ヒトフレームワーク領域、非ヒト(この場合マウス)のCDRおよびヒト定常領域を含む。そのフレームワーク領域は、1つ以上の供給源由来であり得、そのCDR領域は、1つ以上の供給源由来であり得ることが理解されるべきである。
【0022】
操作された重鎖定常領域を含む上記抗体は、細胞表面分子、または細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する能力に基づいて選択される。従って、例えば、上記抗体は、サイトカインレセプター(例えば、IL−2R、TNF−αR、IL−15Rなど);接着分子(E−セレクチン、P−セレクチン、L−セレクチン、VCAM、ICAMなど);細胞分化抗原または活性化抗原(例えば、CD3、CD4、CD8、CD20、CD25、CD40など)およびその他のような細胞表面分子に結合する、その能力に基づいて選択され得る。あるいは、上記抗体は、細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する、その能力に基づいて選択され得る。そのような可溶性分子としては、サイトカインおよびケモカイン(例えば、インターロイキン−1(IL−1)、IL−2、IL−3、IL−5、IL−6など);成長因子(例えば、EGF、PGDF、GM−CSF、HGF、IGFなど);細胞分化を誘導する分子(例えば、EPO、TPO、SCF、PTNなど)およびその他が挙げられるが、これに限られない。
【0023】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、完全な抗体およびCH1、ヒンジ領域、CH2またはCH3の少なくとも2つを含む抗体フラグメントを含む。完全なモノクローナル抗体が、好ましい。
【0024】
一般的に、本明細書中に開示される上記抗体の構築は、遺伝子工学技術において利用される、認められた操作を使用して行われる。例えば、DNAの単離、DNAの発現のための、ベクターの作製および選択、核酸の精製および核酸の分析、組換えベクターDNAを作製するための特定の方法、制限酵素を用いたDNAの切断、DNAのライゲーション、安定なまたは過渡的な手段による、ベクターDNAを含むDNAの宿主細胞への導入、DNAを発現する細胞を選択および維持するための、選択培地または非選択培地における宿主細胞の培養に関する技術は概して、当該分野において公知である。
【0025】
本明細書に開示される上記モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ法(Kohlerら,Nature,256:495,1975)、または当業者にとって周知である、他の組換えDNA法を用いて得ることができる。ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物は、リンパ球による抗体の産生を誘発するタンパク質によって、免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロにおいて免疫化され得る。上記抗原に応じて作製された上記リンパ球は、その後、ハイブリドーマ細胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59−103(Academic Press,1986))を形成する適切な融合剤(例えば、ポリエチレングリコール)を使用して、骨髄腫細胞と融合される。上記ハイブリドーマ細胞は、その後、好ましくは、融合していない、親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する1つ以上の物質を含む適切な培養培地中に播種され、および増殖させられる。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、上記選択された抗体産生細胞による、抗体の安定した産生を支持し、そしてHAT培地(Sigma Chemical Company,St.Louis,Mo.,Catalog No.H−0262)のような培地に対して非感受性である骨髄腫細胞である。これらの内で、好ましい骨髄腫細胞株は、マウスの骨髄腫株(例えば、Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USAより入手可能なMOPC−21マウス腫瘍およびMPC−11マウス腫瘍ならびにAmerican Type Culture Collection,Rockville,Md.USAより入手可能なSP−20、NS0またはX63−Ag8−653細胞に由来するマウス骨髄腫株)である。
【0026】
上記ハイブリドーマ細胞は、選択培養培地(例えば、HAT)中で増殖させられ、そして生存する細胞は、上記抗原に対するモノクロナール抗体の産生のために、増やされおよびアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクロナール抗体の結合特異性は、アッセイ(例えば、免疫沈降剤、放射免疫アッセイ(RIA)、フローサイトメトリー、細胞活性化アッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって決定され得る。
【0027】
ハイブリドーマ細胞が所望の、特異性、親和性および/または活性を有する抗体を産生することが確認された後に、そのクローンは、限界希釈手順によってサブクローン化され得、そして標準的な方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59−103(Academic Press,1986))によって増殖され得る。さらに、上記ハイブリドーマ細胞は、インビボにおいて、動物の腹水腫瘍として増殖され得る。上記サブクローンによって分泌されたモノクロナール抗体は、例えば、プロテインA−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。モノクロナール抗体をコードするDNAは、通常の方法を使用して(例えば、モノクロナール抗体の、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に、特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブの使用によって)、容易に単離され、配列決定される。上記ハイブリドーマ細胞は、好ましくはそのようなDNAの供給源として機能する。一旦単離されると、上記DNAは発現ベクターの中に配置され得、この発現ベクターは、その後、他の免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞(例えば、E.coli細胞、または哺乳動物細胞)にトランスフェクトされ、上記組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成する。抗体または抗体フラグメントはまた、McCaffertyら,Nature,348:552−554(1990)に記載される技術を使用して作製される抗体ファージライブラリーから単離され得る。他の刊行物は、チェーンシャッフリング(chain shuffling)による高親和性(nM領域)ヒト抗体の産生(Marksら,Bio/Technology,10:779−783(1992))、ならびに非常に大きいファージライブラリーを構築するためのストラテジーとして、感染およびインビボにおける組換えの組み合わせを記載する(Waterhouseら,Nuc.Acid.Res.,21:2265−2266(1993))。従って、これらの技術は、モノクロナール抗体における代表的なモノクロナール抗体ハイブリドーマ技術についての実行可能な代替技術である。
【0028】
本明細書中に記載される上記抗体は、その後、本発明の操作されたIgG2/IgG4由来のヒト重鎖定常ドメインについてのコード配列と、重鎖可変ドメインについてのコード配列とを組み合わせることによって改変され得る。本発明の組換え抗体が、特定のマウス抗体に基づく場合、例えば、この開示による操作された重鎖定常領域は、上記相同なマウス配列の位置に置換され得る。あるいは、機能的抗体フラグメントが(例えば、ヒトファージライブラリー、scFvライブラリーまたはFabライブラリーのパニング(panning)によって)同定され得、ここで本発明の操作されたIgG2/IgG4由来のヒト重鎖定常ドメインが、操作され得る。
【0029】
別の局面において、この開示は、上記操作された重鎖定常領域を作製するために必要な、合成の核酸フラグメント、ゲノム由来の核酸フラグメントまたはcDNA由来の核酸フラグメントを含む、組換え発現ベクターを提供する。任意の上記操作された重鎖定常領域、またはこの開示による上記操作された重鎖定常領域を含む抗体をコードするヌクレオチド配列は、上記挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含む適切なベクター内に挿入され得る。任意の適切な宿主細胞ベクターは、キメラ重鎖およびキメラ軽鎖、またはCDR移植重鎖およびCDR移植軽鎖をコードするDNA配列の発現に使用され得る。細菌(例えば、E.coli)系および他の微生物系が、使用され得る。真核生物(例えば、哺乳動物)宿主細胞発現系もまた、本発明の抗体を得るために使用され得る。適切な哺乳動物宿主細胞としては、COS細胞およびCHO細胞(Bebbington C R(1991)Methods 2 136−145);および骨髄腫細胞系およびハイブリドーマ細胞系(例えば、NSO細胞(Bebbingtonら,Bio Techology,10:169−175(1992))が挙げられる。
【0030】
上記操作された重鎖定常領域を含む抗体はまた、治療薬とともに与えられる別々に投与される組成物として使用され得る。診断目的のため、上記抗体は、標識されても、または標識されなくともどちらでもよい。非標識抗体は、上記操作された抗体と反応する他の標識抗体(第2抗体)(例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域に特異的な抗体)と組み合わせて使用され得る。あるいは、上記抗体は、直接標識され得る。多様な標識(例えば、放射性核種、蛍光、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、リガンド(特に、ハプテン)など)が、利用され得る。免疫学的アッセイの多くの型が利用可能であり、これらは、当業者に周知である。
【0031】
本発明の操作された抗体は、薬学的キャリアーを含む組成物中で、患者に投与され得る。薬学的キャリアーは、患者への上記抗体の送達に適した任意の適合性のある、非毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂質、ワックス、および不活性な固体が、上記キャリアーに含まれ得る。薬学的に受容された補助剤(緩衝剤、分散剤)もまた、上記薬学的組成物中に組み込まれ得る。
【0032】
上記抗体組成物は、多くの経路によって、患者に投与され得る。好ましくは、上記薬学的組成物は、非経口的に(例えば、皮下に、筋肉内に、または静脈内に)投与され得る。従って、非経口投与における組成物としては、抗体の溶液、抗体フラグメントの溶液、または受容可能なキャリアー、好ましくは水溶性のキャリアーに溶解したこれらの反応混液が挙げられ得る。多くの水溶性のキャリアーが使用され得る(例えば、水、緩衝化された水、0.4%食塩水、0.3%グリシンなど)。これらの溶液は、無菌であり、そして概して粒子状物質を含まない。これらの組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌され得る。上記組成物は、pH調整剤および緩衝剤、毒性調整剤などのような適切な生理的条件のために必要とされる薬学的に受容可能な補助的物質(例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酪酸ナトリウムなど)を含み得る。これらの処方物における、抗体または抗体フラグメントの濃度は、大きく変動し得、例えば、約0.5重量%未満(通常は、約1重量%または少なくとも約1重量%)から15重量%または20重量%であり、そして選択された特定の投与形態に従い、主として流体容量、流体粘度などに基づいて選択される。
【0033】
被験者への投与に必要な、非経口的に投与可能な組成物および調整剤を調製するための実際の方法は、当業者にとって公知であるか、または明白であり、そして、例えば、参考として本明細書中に援用されるRemington’s Pharmaceutical Science,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa(1985)中に、より詳細に記載される。
【0034】
別の実施形態において、本開示は、IgG2由来部分およびIgG4由来部分を含むために操作されたFc領域に融合する非Fc成分を含む融合タンパク質を提供する。上記Fc領域は、抗体に関して上述した多様な実施形態のいずれかに従って操作された定常領域であり得る。上記Fc領域は、CH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインの全てまたは任意の部分を含み得、ただしFc領域は少なくとも1つのIgG2由来部分および少なくとも1つのIgG4由来部分を含む。好ましくは、上記IgG2由来部分は、少なくとも重鎖定常領域1およびヒンジ領域を含み、そして上記IgG4由来部分は、上記重鎖定常領域2の大部分および重鎖定常領域3全体を含む。リンカーは必要に応じて、上記非Fc成分と上記Fc成分との間に提供され得る。存在する場合、上記リンカーは、3〜25アミノ酸長であり得る。特に有用な実施形態において、上記リンカーは、適切なフォールディングおよびそれによる上記非Fc成分の機能の維持に役立つ。
【0035】
本開示に従う好ましい融合タンパク質は、好ましくは上記タンパク質の非Fc部分の機能を維持しおよび/または上記非Fc部分単独に比べて、延長した半減期を有する。さらに、本開示に従う上記融合タンパク質は、好ましくは、不要な、抗体Fc媒介性の細胞活性化ならびにFcレセプターと抗体の結合および補体活性化により生じる事象を含む炎症特性を欠く。上記ヒンジ領域を含む本開示の特定の実施形態に従う融合タンパク質はまた、他の融合タンパク質分子とジスルフィド結合を形成する能力を有し、これにより、非Fc部分が結合する分子に対する結合力が向上し得る二量体形成を生じる。
【0036】
本開示に従う融合タンパク質は、上記分子をコードしたDNAをトランスフェクトした哺乳動物細胞によって、安定した形態で容易に分泌され得る。さらに、それらは、迅速で、効率的な精製(例えば、プロテインAを使用する)をうけて均質になる。従って、これらの分子は、商業的に有用な量および形態で得ることが可能なため、本文中におけるモノクロナール抗体(例えば、流動細胞計測法、免疫組織化学、免疫沈降、細胞ベースのアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA))についての有利な代用品である。
【0037】
有用な特性を示す任意のペプチドまたはタンパク質は、上記融合タンパク質を調製する本発明の操作された抗体定常領域と結合される、上記非Fc成分としての使用に適している。ペプチド活性またはタンパク質活性およびペプチドの使用またはタンパク質の使用としては、タンパク質アゴニストまたはタンパク質アンタゴニストとしての働き、レセプターへの結合、表面分子が結合した膜への結合、可溶性タンパク質への結合、リガンドへの結合、酵素もしくは構造タンパク質への結合、レセプターの活性化または阻害、標的薬物の送達、または任意の酵素活性が挙げられるが、これらに限られない。Fcドメインとの組み合わせで存在する場合に、そのペプチドまたはタンパク質に与えられる向上した安定性および向上した半減期からその有用性が増加し得るペプチドまたはタンパク質が、通常選択される。本明細書中で使用される「生物学的活性」としては、生物系における活性を有する分子に関連した任意の活性が挙げられ、活性は、タンパク質−タンパク質相互作用によって誘発される、促進的な活性または抑制的な活性、ならびにタンパク質−タンパク質複合体の安定性を含むそのような相互作用を取り巻く動態を含むが、これに限られない。従って、非Fc成分としての使用に適する分子の非限定的な例としては、サイトカイン、ホルモン、酵素、リガンド、成長因子、レセプターおよび抗体フラグメントが挙げられる。
【0038】
本発明の融合タンパク質の調製に使用するのに適切な、適切な非Fc成分としては、以下が挙げられる:リガンド誘導性ホモ二量体化によって活性化されるレセプターに結合するペプチド(WhittyおよびBorysenko,Chem Biol.,(1999)Apr 6(4):R107−18に記載されるような、G−CSF活性、GHR活性およびプロラクチン活性を示す活性フラグメントが挙げられる);適切なペプチド他の例としては、Zaccaroら,Med.Chem.(2000)43(19);3530−40に記載されるようなCDループ由来の神経成長因子模倣体;Eckenbergら,J.Immunol.(2000)165(8):4312−8に記載されるようなIL−2模倣体;Evansら,Drugs R.D.(1999)2(2):75−94に記載されるような、グルカゴン様ペプチド−1;Gagnonら,Vaccine(2000)18(18):1886−92に記載されるような、マイトジェン活性化B細胞増殖を刺激する、テトラペプチドI(D−リジン−L−アスパラギニル−L−プロリル−L−チロシン);ヒト細胞障害性Tリンパ球関連抗原4の結合ドメイン。レセプター拮抗性活性を示すペプチドもまた、企図される。例えば、Luoら,Biochemistry(2000)39(44):13545−50に記載されるような、HIV治療のためのCXCR4のアンタゴニストとしての、vMIP−IIのN−末端ペプチド;Pakalaら,Thromb.Res.(2000)100(1):89−96に記載されるような、抗血栓治療のための、トロンビンレセプターのアンタゴニストペプチドリガンド(AFLARAA);Powellら,Br.J.Pharmacol.(2000)131(5):875−84に記載されるような、麻酔薬への耐性を減弱させるための、ペプチドCGRPレセプターアンタゴニストCGRP(8−37);Hoareら,J.Pharmacol.Exp.Ther.(2000)295(2):761−70に記載されるような、灰白隆起漏斗ペプチド(7−39)として公知の副甲状腺ホルモン(PTH)−1レセプターアンタゴニスト;Zagonら,Int.J.Oncol.(2000)17(5):1053−61に記載されるような、オピオイド増殖因子;Yanofskyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.93,pp.7381−7386,July 1996およびVigersら,J.Biol.Chem.,Vol 275,No 47,36927−36933頁,2000に開示されるような、高親和性I型インターロイキン1レセプターアンタゴニスト;ならびに、Fanら,IUBMB Life(2000)49(6)545−48に記載されるような、酸性線維芽細胞増殖因子結合ペプチド。本開示に従う、Fc領域に融合し得る生物学的に活性なペプチドのさらなる例としては、うっ血性心不全に対する身体の応答の一部として、心臓によって分泌されるタンパク質(例えば、Mukoyamaら,J.Clin.Invest.87(4):1402−12(1991)およびClemensら,J.Pharmacol.Exp.Ther.287(1):67−71(1998)に記載されるような、ヒト脳ナトリウム排泄増加性ペプチド(hBNP)など)が挙げられる。本開示にしたがって使用され得る、生物学的に活性なペプチドのさらなる例としては、(例えば、グルコース依存性インシュリン分泌作用によって)β細胞機能を保存もしくは改善する潜在能力を有するタンパク質(例えば、エキセンジン(exendin)−4、GLP−1(7−36)、GPL−2(1−34)、グルカゴンもしくはPACAP−38など)が挙げられる(Raufmanら,J.Biol.Chem.267(30):21432−7(1992)を参照のこと)。抗体フラグメントもまた、上記融合タンパク質の非Fc成分として利用され得ることが理解されるべきである。したがって、例えば、この非Fc成分は、sc−Fv、F(ab)もしくはF(ab)12であり得る。別の例として、この非Fc成分は、WO 02/46238 A2(この開示は、本明細書においてその全体が参考として援用される)に記載されるような、模倣ペプチドが挿入されているかまたは1つ以上のCDR領域と置き換えられている、抗体の可変領域であり得る。
【0039】
したがって、例えば、上記融合タンパク質の作製のために使用される上記非Fc成分は、増殖因子であり得る。増殖因子の例としては、血小板由来増殖因子(PDGF)、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、上皮増殖因子(EGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、インシュリン、神経成長因子(NGF)、インシュリン様増殖因子(IGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、肝性増殖因子(HGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、Wnt−2プロトオンコジーンの産物(wnt−2)が挙げられる。Aaronson(上述);Normanら,HORMONES,pp.719−748(Academic Press 1987)。全般的には、Heath(編),GROWTH FACTORS,IRL Press(1990)もまた参照のこと。
【0040】
(1.融合タンパク質の作製)
(A.融合タンパク質発現ベクターの構築)
IgG2由来部分およびIgG4由来部分、ならびに非Fc部分を含む融合タンパク質を作製するために、当業者の範囲内である任意の技術が使用され得る。適切な技術としては、米国特許第5,670,625号;同第5,726,044号;および同第6,403,769号に開示される方法が挙げられるが、これらに限定されない。このような技術の1つにおいて、上記融合タンパク質は、哺乳動物細胞によって、適切な形態で分泌され、この融合タンパク質をコードするDNA配列は、哺乳動物細胞をトランスフェクトするのに使用される発現ベクターにサブクローニングされる。抗体配列を含む融合タンパク質の作製のための一般的技術は、Coliganら(編),CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,pp.10.19.1−10.19.11(Wiley Interscience 1992)に記載される(この内容は、本明細書において参考として援用される)。METHODS:A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY,Volume 2(No.2),Academic Press(1991),およびANTIBODY ENGINEERING:A PRACTICAL GUIDE,W.H.FreemanおよびCompany(1992)もまた参照のこと(これらにおいて、融合タンパク質の作製に関する記録は、それぞれの教科書全体にわたって散見される)。本発明の方法は、何らかの特定の発現方法に限定されない。したがって、発現は、真核生物(例えば、哺乳動物、昆虫)細胞または原核生物(例えば、細菌)細胞を用いて達成され得、そして上記融合タンパク質は、細胞によって分泌され得るか、または細胞内ペリプラズムもしくは細胞内封入体から回収され得る。
【0041】
したがって、融合タンパク質の構築工程の1つは、融合タンパク質の一部をクローニングベクターにサブクローニングすることである。ここで、「クローニングベクター」は、宿主原核生物細胞中で自己複製し得るDNA分子(例えば、プラスミド、コスミドもいくはバクテリオファージ)である。クローニングベクターは、代表的に、1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。この部位においては、このベクターならびにクローニングベクターによって形質転換された細胞の同定および選別に使用するのに適切なマーカー遺伝子の本質的な生物学的機能を失うことなく、確定的な様式で外来DNA配列が挿入され得る。マーカー遺伝子は、代表的に、テトラサイクリン抵抗性もしくはアンピシリン抵抗性を提供する遺伝子を含む。適切なクローニングベクターは、Sambrookら(編),MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第2版(Cold Spring Harbor Press 1989)(本明細書においては今後「Sambrook」とする);Ausubelら(編),CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Wiley Interscience 1987)(本明細書においては今後「Ausubel」とする);およびBrown(編),MOLECULAR BIOLOGY LABFAX(Academic Press 1991)によって記載されている。適切なクローニングベクターは、市販されている。
【0042】
上記融合タンパク質のFc領域をコードするDNA配列は、当業者の範囲内である任意の技術を用いて得ることができる。この融合タンパク質の非Fc部分をコードするDNA配列はまた、当業者の範囲内である技術(例えば、非抗体タンパク質を産生する細胞から単離されたRNAを用いたPCR)を用いて合成され得る。このDNAは、イントロンを含み得るか、またはイントロンの一部もしくは全部を除去するように操作され得る。
【0043】
上記融合タンパク質の非Fc成分をコードするDNA配列は、上記融合タンパク質のFc領域部分のN末端を用いてインフレームにサブクローニングされる。サブクローニングは、当業者の範囲内である技術(例えば、適切な末端を提供するための制限酵素消化の使用、望ましくないDNA分子の結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理の使用、および適切なリガーゼによるライゲーション)によって行われる。このような操作に関する技術は、SambrookおよびAusubelに記載されており、かつ当該分野で周知である。細菌宿主中でクローニングされたDNAを増幅するため、および細菌宿主からのクローニングされたDNAの単離のための技術は、周知である。
【0044】
Fc領域が、所望される場合、非Fc成分のアミノ末端上にクローニングされ得ることは、当然理解されるべきである。
【0045】
クローニングされた融合タンパク質は、クローニングベクターから切断され、発現ベクターに挿入される。適切な発現ベクターは、代表的に、以下を含む:(1)細菌の複製起点をコードする原核生物DNA要素、ならびに細菌宿主中での発現ベクターの増殖および選別を提供するための抗生物質耐性マーカー;(2)転写の開始を制御する真核生物DNA要素(例えば、プロモーター);そして(3)転写産物のプロセシングを制御するDNA要素(例えば、転写終止配列/ポリアデニル化配列)。
【0046】
本開示による融合タンパク質は、真核生物細胞(例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および酵母細胞)中で発現され得る。哺乳動物細胞は、特に好ましい真核生物宿主である。なぜなら、哺乳動物細胞は、適切な翻訳後改変(例えば、グリコシル化)を提供する。哺乳動物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO−K1;ATCC CCL61)、ラット下垂体細胞(GH1;ATCC CCL82)、HeLa S3細胞(ATCC CCL2.2)、ラットヘパトーム細胞(H−4−II−E;ATCC CRL 1548)、SV40形質転換サル腎臓細胞(COS−1;ATCC CRL 1650)およびマウス胚性細胞(NIH−3T3;ATCC CRL 1658)が挙げられる。
【0047】
哺乳動物宿主に関して、転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、ウイルス源(例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、シミアンウイルスなど)に由来し得る。ここで、その調節シグナルは、高い発現レベルを有する特定の遺伝子に関連する。適切な転写調節配列および翻訳調節配列はまた、哺乳動物遺伝子(例えば、アクチン遺伝子、コラーゲン遺伝子、ミオシン遺伝子、およびメタロチオネイン遺伝子)からも得ることができる。
【0048】
転写調節配列としては、RNA合成の開始を指示するに十分なプロモーター領域が挙げられる。適切な真核生物プロモーターとしては、以下が挙げられる:マウス メタロチオネインI遺伝子のプロモーター(Hamerら,J.Molec.Appl.Genet.1:273(1982))];ヘルペスウイルスのTKプロモーター(McKnight,Cell 31:355(1982));SV40初期プロモーター(Benoistら,Nature 290:304(1981));ラウス肉腫ウイルスプロモーター(Gormanら,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 79:6777(1982));およびサイトメガロウイルスプロモーター(Foeckingら,Gene 45:101(1980))。
【0049】
あるいは、原核生物プロモーターが真核生物プロモーターによって調節される場合、原核生物プロモーター(例えば、バクテリオファージT3 RNAポリメラーゼプロモーター)が、融合遺伝子の発現を制御するために使用され得る。Zhouら,Mol.Cell.Biol.10:4529(1990);Kaufmanら,Nucl.Acids Res.19:4485(1991)。
【0050】
発現ベクターは、種々の技術を用いて宿主細胞に導入され得る(リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、電気穿孔法などが挙げられる)。好ましくは、トランスフェクトされた細胞は、選別および増殖される(ここで、この発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに安定に組込まれて安定な形質転換体を産生する)。ベクターを真核生物細胞に導入するための技術、および有力な選択マーカーを用いて安定な形質転換体を選別するための技術は、Sambrook、Ausubel、Bebbington「Expression of Antibody Genes in Nonlymphoid Mammalian Cells」(2 METHODS:A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY 136(1991))、およびMurray(編),GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS(Humana Press 1991)によって記載されている。
【0051】
融合タンパク質を産生する適切な形質転換体は、種々の方法を用いて同定され得る。例えば、適切な形質転換体は、上記融合タンパク質の非抗体部分もしくはその融合タンパク質の抗体部分のいずれかに結合する抗体を用いてスクリーニングされ得る。細胞を同定するための免疫沈降の使用は、当業者に周知の技術である。
【0052】
融合タンパク質産生細胞が同定された後、その細胞は培養され、そして融合タンパク質が培養上清から単離される。適切な単離技術としては、プロテインAセファロースアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。プロテインAは、融合タンパク質を上清から分離するために、特に有用である。
【0053】
慣習的アッセイが実施されて、融合タンパク質の非Fc成分が、その機能性を保持しているか否かを決定し得る。
【0054】
融合タンパク質は、任意の適切なマーカー部分(例えば、放射性同位体、酵素、蛍光色素、化学発光標識、生物発光標識、もしくは常磁性標識)によって、検出可能に標識され得る。このような検出可能に標識された融合タンパク質を作製および検出する方法は、当業者に周知である。
【0055】
インビトロおよびインサイチュ検出法が使用されて、病的状態の診断および病期分類を補助するのに使用され得る。本開示はまた、インビボ診断のための融合タンパク質の使用を企図する。
【0056】
本開示による融合タンパク質は、薬学的に受容可能な組成物へと処方され得、そして抗体の実施形態に関して先に記載された様式で投与され得る。
【実施例】
【0057】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図するものであり、限定することを意図しない。それが代表的に使用され得るものである限り、当業者に公知の他の手順が代替的に使用され得る。
【0058】
(実施例1)
(操作された重鎖定常領域を有する抗CD3抗体)
OKT3の可変長鎖を、標準的組み換えDNA法を介して、ヒトIgG2由来の、第1重鎖定常領域(CH1)、ヒンジリンカー領域、および第2重鎖定常領域(CH2)由来の最初の数個のアミノ酸を含むゲノムDNAカセットに結合した。次いで、ヒトIgG4由来の第2重鎖定常領域(CH2)の残りおよび第3重鎖定常領域(CH3)のを含むカセットを添加した。IgG2ヒンジ領域およびそれに続くアミノ酸を、Fc−γレセプターへの抗体結合を最小限にするように選択し、そしてIgG4領域を、抗体媒介性補体活性を防ぐように選択した。
【0059】
(操作された重鎖定常領域の調製)
ヒトIgG2重鎖定常領域(GenBank登録番号V00554;図3A参照)をコードするゲノムDNA、またはヒトIgG4重鎖定常領域(GenBank登録番号K01316;図3B参照)をコードするゲノムDNAを、FDAのEd Max博士による細菌キャリアプラスミドpBR322におけるインサートとして提供した(図3C参照)。制限酵素分析および完全DNA配列決定により、ヒトIgG4およびIgG2定常領域の正しい配列が得られたことを確認した。上記IgG4由来インサートを、HindIIIおよびXhoIを用いた制限酵素消化によって、プラスミドから分離した。このインサートを精製し、切断し、そしてさらなる制限酵素分析に供して、公開されるヒトIgG4ゲノムDNAの配列を確認した。ゲノムIgG4インサート(HindIII/SmaI制限酵素切断フラグメント;SmaI部位は、翻訳終止部位のおよそ30bp 3’側の、3’未翻訳領域にある)を次いで、発現カセットAPEX−1にライゲーションすることによってサブクローニングした(図4Aおよび図4B参照、APEX−1 3F4VHHuGamma4)。DNA配列分を行い、ヒトIgG4の所望の領域の正しい配列を確認した。
【0060】
ヒトIgG2をコードするゲノムDNAを含むpBR322プラスミドを、IgG2 CH1、ヒンジ領域およびCH2の第一部分の源として使用した。これらは、PmIIおよびBst EIIで切断され、APEX−1 3F4VHGamma4へとサブクローニングされて、対応するIgG4由来配列と置き換えられる(図5A参照)。得られたキメラIgG2/IgG4ヒト定常領域の配列を、図5Bに示す(APEX1−3F4VHHuG2/G4)。
【0061】
(マウスOKT3可変領域およびヒトG2/G4重鎖定常領域に基づくキメラ抗体の調製)
マウスmAbのOKT3の重鎖および軽鎖の可変配列は、すでに決定され、そしてGenBankデータベースに委託されている(受入番号は、それぞれ、A22261(図6)およびA22259(図7)である)。キメラ抗体を、2つの別個の発現系を用いて、OKT3可変領域およびHuG2/G4定常領域を用いて生成した。重鎖および軽鎖の可変領域を、重複40マーオリゴヌクレオチドおよびPUC19クローニングベクター中への挿入のためのリガーゼ連鎖反応を用いて、遺伝子合成により構築した。発現系#1に関して、マウス免疫グロブリンプロモーターおよびリーダーイントロンを有するマウスリーダー配列を含む配列を、5’末端に、そしてスプライスドナー部位を含む配列を3’末端に、PCRによりつけ加え、HindIIIからBamHIまでのフラグメントとして重鎖および軽鎖(κ)可変領域のための発現カセットを形成した。発現系#1において使用される、構築されたマウスOKT3重鎖可変領域およびマウスOKT3軽鎖可変領域の全DNA配列および全アミノ酸配列を、それぞれ図8および図9に示す。
【0062】
次に、前述の遺伝子操作された重鎖定常領域を、別個のPUC19クローニングベクター中へ以下のようにして挿入して、改変した:5’末端にBamHI部位を有する、ネイティブなヒトIgG4由来の5’未翻訳イントロン配列を、5’末端に加え、そして3’末端にEcoRI部位およびBglII部位を有する天然のヒトIgG4由来の3’未翻訳配列を、3’末端に加えた。このHuG2/G4定常領域を、BamHIからBglIIフラグメントとしてPuc19から切除し、重鎖発現ベクターpSVgpt.HuG2G4の固有のBamHI部位に、正しい向きが選択されるように挿入した。BamHIからBglIIのHuG2/G4フラグメントのこの全核酸配列を、図10に示す。
【0063】
同様に、構築されたマウスOKT3重鎖可変領域を、HindIIIからBamHIのフラグメントとしてPUC19から切除し、そしてHuG2/G4挿入物を含むpSVgpt.HuG2G4発現ベクター中に移した。このDNA配列が正しいことを確かめた。重鎖発現ベクターpSVgpt.HuG2G4の模式的なマップを、図11に示し、そしてこのベクター内に含まれる構築されたOKT3可変重領域に対するHuG2/G4定常領域の位置を示す。
【0064】
この構築されたマウスOKT3軽鎖可変領域をまた、HindIIIからBamHIのフラグメントとしてPUC19から切除し、そしてヒトκ定常領域(HuCk)を含む発現ベクターpSVhygHuCκに、図12に示されるように移した。
【0065】
ヒトG2/G4定常領域に連結されたマウスOKT3可変重鎖領域の改変バージョンを含む第二の発現系をまた、生成した。このバージョン(発現系#2)は、オリジナルなOKT3シグナル配列を含み、そして前の構築物中において記載された免疫グロブリンプロモーターおよびイントロン配列を含まなかった。キメラ抗体を、遺伝子合成により構築し、そして以前に記載されたG2/G4定常領域を含むPUC19クローニングベクター中に連結した。OKT3 VHおよびヒトG2/G4挿入物(発現システム#2)の配列を、図13に示す。
【0066】
このG2/G4定常領域を、BamHI/BglIIを用いた消化によりPuc19から切除し、そしてゲルで単離した。次いで、このフラグメントを、BamHI部位にて発現ベクターAPEX−3P中に連結し、APEX−3PG2/G4を生成する(図14を参照のこと)。このマウスOKT3VHを、上記pUC19ベクターよりBsiWI/BamHI消化を用いて単離し、そして5’末端にBamHI−BsiWIアダプターを有するBamHI部位をつけ加えることにより改変した。BamHI/BsiWIを産生するために使用される突出末端アダプター二重鎖は、以下の配列:
【0067】
【化1】
を有する。次いで、このAPEX−3PG2/G4ベクターを、BamHIで開き、そしてこの改変OKT3 VH領域を挿入し、発現ベクターAPEX−3PmOKT3VhG2G4を生成した(図15)。同様に、元のマウスOKT3 VKシグナル配列および可変κ配列(イントロンを含まず)を含む代替のOKT3軽鎖カセットを、ヒトκ軽鎖定常領域に連結した。遺伝子合成によりOKT3 VK遺伝子配列を構築し、そしてこの配列を、HindIII−BamHIフラグメントとして、前もってPUC19クローニングベクターに挿入されたヒトκ定常領域に連結することにより、これを達成した。生じたプラスミド配列を、図16に示す。次に、このOKT3VK配列を、BsiWI/EcoRIでこのベクターから切り出し、そしてhCKを、BsgI/EcoRIで、同一のベクターから切り出した。この2つのフラグメントを、発現ベクターAPEX−3Pに移すために、市販されているシャトルベクターであるLITMUS28(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA)を使用した。LITMUS28を、BsiWI/EcoRI消化で開き、そしてOKT3 VKフラグメントと連結し、LITMUS28mOKT3(ベクターは示さず)を生成し、次いでEcoRI/BsgI消化で開き、そして上記hCKフラグメントに連結して、LITMUS28mOKT3VKhCKを生成した(図17)。次いで、この構築物を、BglII/BamHIを用いて消化し、mOKT3VKhCKフラグメント全体を単離した。この発現ベクターAPEX−3Pを、BamHIで開き、そしてmOKT3VKhCKフラグメントと連結し、APEX−3OKT3VK+CKを生成した(図18)。
【0068】
(ヒトG2/G4定常領域を含むキメラ抗体の、IgG(FcγRI)に対するヒトのレセプターに結合する能力の評価)
T細胞レセプター複合体のCD3ε成分に対する抗体(例えば、OKT3)は、TCRを架橋することにより、ヒトのT細胞を活性化し得る。しかし、架橋は補助細胞を必要とすることが示されており、この補助細胞は、高親和性Fcレセプターおよび低親和性Fcレセプターを介して、抗体のFc部分を結合する。この実施例に従って生成される抗体を試験し、そしてIgG(FcγRI)に対して高親和性のヒトのレセプターへの結合を評価した。U937系統の細胞を、指示濃度のビオチン化hIgG(Sigma)と一緒に、4℃で15分間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリスリン(SA−PE)と共に、4℃で15分間インキュベートし、洗浄し、次いで、Becton Dickenson FACS Caliburフローサイトメーターを用いて、フローサイトメトリーにより分析した。図19Aにおいて観察されるように、生じた結合曲線は、約2〜4ng/mLの濃度のビオチン化hIgGが、さらなる競合研究のために適切であることを示した。U937細胞を、指示濃度の競合抗体と一緒に、3.0ng/mLのビオチン化hIgGと、氷上で30分間インキュベートし、洗浄し、SA−PEと一緒に15分間インキュベートし、洗浄し、そしてフローサイトメトリーにより分析した(図19B)。mOKT3、hIgG1およびhIgG4の調製物は、ビオチン化hIgGの標的細胞への結合を効率的にブロックし、これらが、FcγRIレセプターに結合することを示す。しかし、この実施例の組換えキメラ抗体(遺伝子操作されたIgG2/IgG4ヒト定常領域を含む)は、これらの細胞上のFcγRIレセプターへの結合に関して競合しなかった。これは、この改変定常領域を含む抗体がFcγRIに結合しないことを示している。
【0069】
(IgG(FcγRII)に対する低親和性ヒトレセプターへの結合の評価)
この実施例に従って産生された遺伝子操作されたIgG2/IgG4のヒトの定常領域を含むキメラ抗体を、IgG(FcγRII)に対するヒト低親和性−レセプターに結合する能力に関して試験した。低親和性Fcレセプターへの結合を明らかにするために、まず抗体調製物を、当量モル濃度のフルオロセインイソチオシアネート(FITC)標識化ウサギFab’2抗ヒトFab’2抗体と一緒に、4℃で一晩インキュベートすることにより、複合体形成した。K562系統の細胞(IgG(FcγRII)に対して低親和性のヒトのレセプターのアロタイプの両方を保有する)を、指示濃度の抗体複合体と一緒に30分間氷上でインキュベートし、洗浄し、そしてBecton Dickenson FACS Caliburフローサイトメーターを用いて、結合された抗体についてフローサイトメトリーにより分析した。図20に見られるように、ヒトIgG1抗体複合体は、K562細胞への効果的な結合を示し、その一方、hIgG2抗体複合体は、ずっと低レベルの結合を示した。ヒトIgG4およびキメラOKT3 hG2/G4組換え抗体は、これらの細胞上の低親和性FcγRIIレセプターに結合し得ない抗体複合体を形成した。FITC−ウサギFab’2抗ヒトFab’2抗体単独の結合もまた示す。
【0070】
(PBLにおいてサイトカイン産生を誘導するための能力の評価)
ヒトCD3に対し、そして遺伝子操作されたIgG2/IgG4ヒト定常領域を含む実施例1のキメラ抗体を、末梢血白血球(PBL)においてサイトカイン産生を誘導する能力について評価した。ドナーのパネルから新たに単離したヒト末梢血を、白血球画分について、Ficoll−Hypaque密度沈降により濃縮した。このPBLを、マウスIgG2a定常領域(OKT3)またはヒトIgGG2/G4定常領域(OKT3 hG2/G4)のいずれかを保有する、指示濃度の抗CD3抗体と一緒にインキュベートした(図21を参照のこと)。上清を、24時間および36時間に収集し、そしてTNF−α(A)およびIL−2(B)の蓄積についてサンドウィッチELISAにより評価した。図21に示されるグラフは、所定のサイトカインの弱いピークが観察された時点(例えば、IL−2については24時間、TNF−αについては36時間)を示す。このOKT3抗体(ヒトFcγRIレセプターおよびFcγRIIレセプターの両方を結合する)は、両サイトカインの高いレベルを誘導した。しかし、キメラ組換え抗体OKT3 hG2/G4(これは、同一のCD3εエピトープをOKT3として結合するが、Fcレセプターを結合する能力を喪失している)は、有意なレベルの任意の試験サイトカインの産生を刺激し得なかった。
【0071】
(ヒトPBLからの標的T細胞を活性化する能力の評価)
ヒトCD3に対し、そして遺伝子操作されたIgG2/IgG4ヒト定常領域を含む実施例1のキメラ抗体を、ヒトPBLからの標的T細胞を活性化する能力について評価した。CD25は、インターロイキン−2(IL−2)に対するレセプターであり、そしてCD25の発現は、T細胞レセプター複合体を介して活性化されたT細胞の表面上でアップレギュレートされる。同様に、CD69はまた、初期のT細胞活性化マーカーであり、CD69の発現レベルは、T細胞レセプターの関与の際に増加する。その結果、両マーカーは、T細胞活性化の高感度の測定器具として役立つ。ドナーのパネルから新たに単離されたヒトの末梢血を、Ficoll−Hypaque濃度沈降により、この白血球画分について濃縮した。このPBLを、マウスIgG2a定常領域(OKT3)またはヒトIgGG2/G4定常領域(OKT3 hG2/G4)のいずれかを保有する、指示濃度の抗CD3抗体の存在下または非存在下でインキュベートした;図22を参照のこと。24時間の時点で、細胞を収集し、洗浄し、そしてヒトCD25およびヒトCD69に特異的なFITC−結合モノクローナル抗体と共に、氷上で30分間インキュベートした。この細胞を洗浄し、Becton Dickenson FACS Caliburフローサイトメーターを用いて、フローサイトメトリーにより抗体結合について分析した。代表的な一人のドナーについてのデータを、図22Aおよび図22Bに示し、そしてCD25(A)またはCD69(B)を発現している細胞の百分率を示す。
【0072】
(ヒトL−SIGN−Fc融合タンパク質およびヒトG2G4 Fc部分の産生および発現)
ヒトL−SIGN−ヒトG2G4融合タンパク質を、ヒトL−SIGN(非Fc成分として)をコードするcDNAおよびヒト免疫グロブリンHuG2G4のFc部分をコードするcDNAに由来する2つのPCRフラグメントを融合させることにより生成する。オリゴヌクレオチドP1、cagatgtgatatcTCCAAGGTCCCCAGCTCCCTAAG(配列番号52)、およびP2、tgggctcgagTTCGTCTCTGAAGCAGGCTGCG(配列番号53)を使用して、ヒト脾臓cDNAライブラリーからhL−SIGNの細胞外部分を増幅させる(ヒトL−SIGNに対して相補的なプライマーの領域を、大文字で示す)。P1は、リーダー配列(KLV56)と融合するための、上流のEcoRV制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。P2では、下流のXhoI制限エンドヌクレアーゼ部位を使用して、これをhG2G4 Fc領域と融合させる。プライマーP3、agacgaactcGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGT(配列番号54)、およびP4、cggccctggcactcaTTTACCCAGAGACAGGGAGAGGCT(配列番号55)を用いて、ヒンジドメインのGlu99からカルボキシ末端までのヒトG2G4ハイブリッドFc領域をヒトG2G4定常領域を含むプラスミドを用いることにより増幅させる。大文字は、ヒトG2G4配列と相補的な領域を示す。P3では、上流のXhoI制限エンドヌクレアーゼ部位を設計し、hL−SIGNと連結させる。P4は、一つの終止コドンの下流の配列およびNgoMIV制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。このPCR増幅されたヒトL−SIGNおよびヒトG2G4 Fc領域のフラグメントを、pCR2.1ベクター中にTAクローン化し、そして配列が正しいことを確かめる。生じたプラスミドpCR2.1hL−SIGNを、EcRV/XhoIで消化し、そしてプラスミドpCR2.1hG2G4を、XhoINgoMIVで消化する。生じたL−SIGNおよびhG2G4フラグメントを、改変Apex3Pプラスミド(Alexion Pharmaceuticals,Inc.)中に連結する。EcoRV/NgoMIVは、Kozak配列および開始メチオニンのためのコドンに相当するATGを有するKLV56リーダー(5’−−CGCCCTTCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGT−−3’(配列番号56))を含む。
【0073】
(細胞培養およびタンパク質精製)
Apex3P−hL−SIGNhG2G4を用いてトランスフェクションした293EBNAヒト胚腎細胞を、10%熱不活化FBS、100IU/mlペニシリン、100 g/mlストレプトマイシン、2mMのグルタミンおよび250ug/mlのG418硫酸塩、および1ug/mlのピュ−ロマイシンを含むDMEM(Cellgro #10−013−CV)中で増殖させる。細胞を、37℃、5%のCO2にて増殖させ、選別を行う。血清タンパク質を除去するために、コンフルエントなT−175フラスコの選別された細胞を、15mlのHBSSで洗浄し、その後、L−グルタミン(ボトルに量が記載されている)およびペニシリン/ストレプトマイシンを各フラスコに補充されたIS Pro無血清培地(Irvine Scientific,Santa Ana,CA,Catalog #91103)30mLを添加する。二日から三日、上清を濃縮し、そしてプロテインAクロマトグラフィーにより精製する。
【0074】
本明細書を通して、種々の刊行物および特許の開示が参照される。これらの教示および開示は、その全体が、本発明に関する分野の現状をより十分に記載するために、本出願中に参考として援用される。
【0075】
本発明の好ましい実施形態および他の実施形態が、本明細書中に記載されているが、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を逸脱することなくさらなる実施形態が、当業者により理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0076】
【図1A】図1Aは、本開示による、遺伝子操作された重鎖の定常領域を有する、キメラ組換え抗体の例を図式的に示す。
【図1B】図1Bは、本開示による、遺伝子操作された重鎖の定常領域を有する、ヒト化組換え抗体の例を図式的に示す。
【図1C】図1Cは、本開示による、遺伝子操作された重鎖の定常領域を有する、完全ヒト化組換え抗体の例を図式的に示す。
【図2】図2は、本開示による遺伝子操作された重鎖定常領域のアミノ酸配列(配列番号1)、およびその遺伝子操作された重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号2)を示す。
【図3A】図3Aは、ヒトIgG2(GenBank 受諾番号 V00554)のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図3B】図3Bは、ヒトIgG4(GenBank 受諾番号 K01316)のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図3C】図3Cは、プラスミドpBR322(GenBank 受諾番号 J01749)の図示的マップを示す。
【図4A】図4Aは、APEX−1 3F4VHHuγ4ベクターの図式マップを示す。
【図4B】図4Bは、そのベクターの完全なヌクレオチド配列(配列番号3)を示し、無関係のVH領域(3F4VH表示)に隣接するhlgG4インサートのアミノ酸配列(配列番号4)およびヌクレオチド配列を示す。シグナル配列、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域の位置が、示されている。
【図5A】図5Aは、APEX−1 3F4VHHu G2/G4ベクターの図解マップを示す。
【図5B】図5Bは、そのベクターのヌクレオチド配列(配列番号5)、G2/G4インサートのアミノ酸配列(配列番号6)、および核酸配列を示し、そしてシグナル配列、無関係のVh(本明細書中で3F4Vh表示)、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域の位置を示す。
【図6】図6は、OKT3重鎖可変領域(GenBank 受諾番号 A22261)の完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図7】図7は、OKT3軽鎖可変領域(GenBank 受諾番号 A22259)の完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図8】図8は、発現ストラテジー#1を使用して構築された、マウスOKT3重鎖可変領域の完全ヌクレオチド配列(配列番号7)およびアミノ酸配列(配列番号8)を示し、この配列は、マウス免疫グロブリンプロ−モーター、5’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列、および3’末端にスプライス供与部位(Bam HI)を含む。制限酵素部位が、示される。
【図9】図9は、発現ストラテジー#1を使用して構築された、マウスOKT3軽鎖可変領域の完全ヌクレオチド配列(配列番号9)およびアミノ酸配列(配列番号10)を示し、この配列は、マウス免疫グロブリンプロモーター、5’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列、および3’末端にスプライス供与部位(Bam HI)を含む。制限酵素部位が、示される。
【図10】図10は、APEX−1 3F4VHHuG2/G4ベクターから切断され、5’末端において、Bam H1部位および天然のヒトIgG4からの5’の翻訳されないイントロン配列を添加し、3’末端において、Bgl II部位および天然のヒトIgG4からの3’の翻訳されない配列を付加することによりPUC19クローニングベクターにインサートして改変されたHuG2/G4フラグメントの完全ヌクレオチド配列(配列番号11)を示す。
【図11】図11は、発現系#1において使用される重鎖発現ベクターpSVgptHuG2/G4の図解マップを示す。
【図12】図12は、発現系#1において使用される発現ベクターpSVgptHuCkの図解マップを示す。
【図13A】図13Aは、発現ストラテジー#2を使用して構築されたOKT3重鎖可変領域およびhuG2/G4定常領域のヌクレオチド配列(配列番号12)およびアミノ酸配列(配列番号13)を示す。その構築物は、5’のリーダーイントロンを欠き、原形のOKT3シグナル配列(示される)を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図13B】図13Bは、発現ストラテジー#2を使用して構築されたOKT3重鎖可変領域およびhuG2/G4定常領域のヌクレオチド配列(配列番号12)およびアミノ酸配列(配列番号13)を示す。その構築物は、5’のリーダーイントロンを欠き、原形のOKT3シグナル配列(示される)を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図13C】図13Cは、発現ストラテジー#2を使用して構築されたOKT3重鎖可変領域およびhuG2/G4定常領域のヌクレオチド配列(配列番号12)およびアミノ酸配列(配列番号13)を示す。その構築物は、5’のリーダーイントロンを欠き、原形のOKT3シグナル配列(示される)を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図14A】図14Aは、G2/G4のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列(配列番号15)を含む、発現系#2において使用されるAPEX−3P G2/G4発現ベクターの全体の核酸配列(配列番号14)を示す。
【図14B】図14Bは、G2/G4のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列(配列番号15)を含む、発現系#2において使用されるAPEX−3P G2/G4発現ベクターの全体の核酸配列(配列番号14)を示す。
【図14C】図14Cは、G2/G4のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列(配列番号15)を含む、発現系#2において使用されるAPEX−3P G2/G4発現ベクターの全体の核酸配列(配列番号14)を示す。
【図14D】図14Dは、G2/G4のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列(配列番号15)を含む、発現系#2において使用されるAPEX−3P G2/G4発現ベクターの全体の核酸配列(配列番号14)を示す。
【図15A】図15Aは、OKT3可変重鎖領域およびG2/G4インサートのアミノ酸配列(配列番号17)を含む、発現系#2において使用されるAPEX−3PmOKT3VhG2G4発現ベクターの全体の核酸配列(配列番号16)を示す。制限酵素部位が示される。
【図15B】図15Bは、OKT3可変重鎖領域およびG2/G4インサートのアミノ酸配列(配列番号17)を含む、発現系#2において使用されるAPEX−3PmOKT3VhG2G4発現ベクターの全体の核酸配列(配列番号16)を示す。制限酵素部位が示される。
【図16A】図16Aは、発現系#2において使用される、PUC19の全体の核酸配列(配列番号18)、およびOKT3Vkのアミノ酸配列(配列番号19)、ならびにヒトCk発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図16B】図16Bは、発現系#2において使用される、PUC19の全体の核酸配列(配列番号18)、およびOKT3Vkのアミノ酸配列(配列番号19)、ならびにヒトCk発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図16C】図16Cは、発現系#2において使用される、PUC19の全体の核酸配列、およびOKT3Vkのアミノ酸配列(配列番号19)、ならびにヒトCk発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図16D】図16Dは、発現系#2において使用される、PUC19の全体の核酸配列(配列番号18)、およびOKT3Vkのアミノ酸配列(配列番号19)、ならびにヒトCk発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図16E】図16Eは、発現系#2において使用される、PUC19の全体の核酸配列(配列番号18)、およびOKT3Vkのアミノ酸配列(配列番号19)、ならびにヒトCk発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図16F】図16Fは、発現系#2において使用される、PUC19の全体の核酸配列(配列番号18)、およびOKT3Vkのアミノ酸配列(配列番号19)、ならびにヒトCk発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図17】図17は、発現系#2において使用される、シャトルベクターLITMUS28の全体の核酸配列(配列番号20)およびOKT3VkhCkインサートのアミノ酸配列(配列番号21)を示す。
【図18A】図18Aは、発現系#2において使用されるAPEX−3 OKT3Vk+Ckの全体の核酸配列(配列番号22)ならびにOKT3VkおよびCkインサートのアミノ酸配列(配列番号23)を示す。制限酵素部位が示される。
【図18B】図18Bは、発現系#2において使用されるAPEX−3 OKT3Vk+Ckの全体の核酸配列(配列番号22)ならびにOKT3VkおよびCkインサートのアミノ酸配列(配列番号23)を示す。制限酵素部位が示される。
【図19】図19Aおよび図19Bは、U937細胞のFcγRIレセプターに結合するG2/G4重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価する試験の結果を示す。
【図20】図20は、K562細胞のFcγRIIレセプターに結合するG2/G4重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価する試験の結果を示す。
【図21】図21は、ヒトPBL中のサイトカイン産生を誘導するG2/G4重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価するために設計された試験の結果を示す。
【図22】図22は、ヒトT細胞の活性マーカーのアップレギュレートを誘導するG2/G4重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価するために設計された試験の結果を示す。
【背景技術】
【0001】
(関連出願)
本出願は、それぞれ、2003年5月30日および2004年4月19日に出願された、米国仮出願60/475,202および60/563,500に対する優先権を主張し、これらの開示全体が、本明細書中でこの参考として援用される。
【0002】
(背景)
(1.技術分野)
本開示は、遺伝的に操作された抗体および融合タンパク質の分野に関する。より詳細には、本開示は、IgG2由来部分およびIgG4由来部分を含む領域を含む、抗体および/または融合タンパク質に関する。
【0003】
(2.関連分野の背景)
抗体は、Bリンパ球によって産生され、そして感染から防御する。抗体の基本構造は、ジスルフィド結合によって一緒に連結された2つの同一の軽ペプチド鎖および2つの同一の重ペプチド鎖からなる。各鎖のアミノ末端に位置する第1のドメインは、アミノ酸配列が変化可能であり、各個体において見出される抗体結合特異性の広範な幅を提供する。これらは、可変重領域(VH)および可変軽領域(VL)として公知である。各鎖の残りのドメインは、アミノ酸配列が比較的変化せず、そして定常重領域(CH)および定常軽領域(CL)として公知である。抗体の主なクラスは、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMであり;そしてこれらのクラスは、サブクラス(アイソタイプ)にさらに分割され得る。例えば、上記IgGクラスは、4つのサブクラス(すなわち、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4)を有する。上記種々のヒト抗体クラスのうち、ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgMのみが、補体系を有効に活性化することが公知である。
【0004】
抗体クラス間の違いは、上記重鎖の違いに由来する。抗体の成熟の間にクラススイッチが生じることが、公知である。上記基本的な抗体分子は、二機能性構造であり、ここで、上記可変領域が抗原に結合し、他方、残りの定常領域は、特定のエフェクター機能を惹起する。上記ヒンジ領域は、タンパク分解性の切断に対して特に感受性であり;このようなタンパク分解は、切断の正確な部位に依存して、2つまたは3つのフラグメントを与える。上記ヒンジ領域は、上記抗原結合領域(各々は、軽鎖および重鎖の最初の2つのドメインからなる)が、抗体の残部に対して自由に移動または回転できるようにし、この抗体の残部は、残りの重鎖ドメインを含む。上記定常領域は、抗原結合部位を形成しないが、上記定常ドメインおよびヒンジドメインの配置は、それが上記抗原と結合できるようにする分子に対して、セグメント柔軟性を与える。
【0005】
上記抗原と上記抗体との間の相互作用は、複数の結合および引力(例えば、水素結合、静電力およびファン・デル・ワールス力)の形成によってなされる。これらは一緒になってかなりの結合エネルギーを形成し、このエネルギーは、上記抗体が上記抗原に結合することを可能にする。抗体結合の親和性およびアビディティは、抗体の生理学的特性および病理学的特性に影響を与えることが見出されている。
【0006】
遺伝子操作技術の出現は、均一な抗体(モノクローナル抗体)の非限定量を生成する種々の手段をもたらし、これらの抗体は、アイソタイプに依存して、種々の程度のエフェクター効果を示す。例えば、特定のマウスアイソタイプ(IgG1、IgG2)およびヒトアイソタイプ(特に、IgG1)は、細胞(例えば、単球、B細胞およびNK細胞)上のFcレセプターに結合し得、従って、上記細胞を活性化してサイトカインを放出する;このような抗体アイソタイプはまた、局所的または全身的な炎症結果を伴う補体活性化においても強力である。これらのFcレセプター結合定常領域を有する抗体が、インビボで注射される場合、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターフェロンγ(IFN−γ)、インターロイキン2(IL−2)および/または他のサイトカインの一時的ではあるが著しい全身性の放出は、Fcレセプター−抗体結合を介した複数の細胞型(リンパ球または単球を含む)の活性化の結果として、放出され得る。上記サイトカイン放出は、通常、高熱、悪寒および頭痛を伴うが、稀に、より深刻でかつ生命を脅かし得る症状(例えば、肺水腫、髄膜炎、神経毒性、低血圧および呼吸窮迫(サイトカイン放出症候群すなわちCRS))に進行し得る。マウス抗体OKT3は、CRSを生じる重大なサイトカイン放出を引き起こすことが観察されている抗体の1つである。ヒトCD3部分は、少なくとも4つの不変ポリペプチド鎖からなっており、このポリペプチド鎖は、T細胞表面上でT細胞レセプター(TCR)と非共有結合的に会合し、これは、代表的に、T細胞レセプター複合体と呼ばれる。上記T細胞レセプター複合体は、上記T細胞レセプターへの抗原結合の際に、T細胞活性化において重要な役割を担う。いくつかの抗CD3抗体(例えば、OKT3)は、抗原−TCR結合の非存在下で、T細胞を活性化し得る。このような活性化は、mAbのFc部分とアクセサリー細胞上のFcレセプターとの間の相互作用に依存して、T細胞上のCD3複合体の架橋を可能にする。可溶性抗CD3mAbは、それらが(人工的にCD3架橋を促進する)プラスチックに結合されるか、またはFcレセプターを有する細胞に結合されなければ、T細胞を刺激してインビトロで増殖することをしない。
【0007】
これらの事象が許容されないかおよび/または有害である環境における、抗体媒介性の細胞活性化事象(例えば、サイトカイン放出)を減少することが、所望される。多くの実験室は、減少したFcレセプター結合、補体活性化の欠如などのような特徴を示す種々の定常領域を有する抗体を遺伝子操作することにより、強力なエフェクター機能(例えば、OKT3によって観察されるエフェクター機能)に関連する、負の効果を減少することを試みている。
【0008】
従って、独自の定常領域の組み込みによって、遺伝子操作された抗体においてエフェクター機能を低下することは、本明細書中の目的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0009】
(要旨)
遺伝子操作された重鎖定常領域を有する組み換え抗体が、本明細書中に記載される。上記遺伝子操作された定常領域は、IgG2由来部分およびIgG4由来部分を含む。好ましくは、上記IgG2由来部分は、少なくとも重鎖定常領域1およびヒンジ領域を含み、そして上記IgG4由来部分は、重鎖定常領域2のほとんどおよび重鎖定常領域3の全体を含む。本開示に従う遺伝子操作された重鎖定常領域を有する、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する抗体は、所望されない抗体媒介性の細胞活性化および炎症事象を減少し(補体活性化の低下を含む)、これは、Fcレセプター抗体の関与の結果としてもたらされる。
【0010】
別の局面において、本開示は、抗体重鎖を生成するためのプロセスに関し、このプロセスは、以下の工程を包含する:(a)可変領域および定常領域を含む抗体重鎖をコードする配列を含むDNA配列を有する発現ベクターを生成する工程;(b)上記定常領域を、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分から構成する工程;(c)宿主細胞に上記ベクターをトランスフェクションする工程;および(d)上記トランスフェクションされた細胞株を培養して、遺伝子操作された抗体重鎖分子を生成する工程であって、この抗体重鎖分子は、抗体軽鎖と会合して、機能的抗体分子を生成する、工程。
【0011】
別の局面において、本開示は、軽鎖に結合して機能性抗体分子を生成する1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を有する抗体を使用し、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子を介して、抗体媒介性の細胞活性化および炎症性事象を減少するための方法に関する。
【0012】
別の実施形態において、本開示によるIgG2由来の部分およびIgG4由来の部分を含む遺伝子操作された定常領域は、融合タンパク質のFc領域として使用される。その融合タンパク質は、IgG2由来の部分およびIgG4由来の部分を含むように遺伝子操作されたFc領域に融合する非Fc成分を含む。好ましくは、IgG2由来の部分は、少なくとも重鎖定常領域1およびヒンジ領域を含み、そしてIgG4由来の部分は、重鎖定常領域2のほとんど、および重鎖定常領域3の全体を含む。好ましくは、本開示によるその融合タンパク質は、非Fc成分の機能を維持し、および/または非Fc成分単独と比較して半減期を増大し、ならびに/またはFcレセプター抗体結合および補体活性化より生じる事象を含む所望されない抗体Fc媒介性の細胞活性化および炎症性性質を欠く。
【0013】
そのような融合タンパク質をコードする組換えDNA分子がまた、提供される。トランスフェクトされた哺乳類細胞における異種発現の際に、その融合タンパク質は、安定な形態で強力に分泌され、抗体および非Fc成分前分子(predecessor molecule)に特徴的な所望の性質を示す。これらの融合タンパク質は、モノクローナル抗体に関連する従来の適用(フローサイトメトリー、免疫組織化学、細胞ベースのアッセイおよび免疫沈降を含む)において使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【0014】
(好ましい実施形態の詳細な説明)
組み換え抗体は、抗体−Fcレセプター相互作用より生じる抗体媒介性の細胞活性化および炎症性事象を減少するのに役立つ、遺伝子操作された重鎖定常領域とともに記載される。遺伝子操作された重鎖定常領域は、1つ以上のヒト抗体のIgG2サブクラス由来の部分および1つ以上のヒト抗体のIgG4サブクラス由来の部分を含む。当業者は、抗体重鎖が、可変領域および定常領域を含むことを理解する。重鎖定常領域は、重鎖定常領域1(CH1)、ヒンジ領域、重鎖定常領域2(CH2)、および重鎖定常領域3(CH3)を含むCH1、ヒンジ領域、CH2、またはCH3のうちの1つの少なくとも一部は、現在の遺伝子操作された重鎖中のヒトIgG2抗体由来であり、遺伝子操作された重鎖の残りの少なくとも一部は、ヒトIgG4抗体由来である。好ましくは、遺伝子操作された重鎖全体は、ヒトIgG2部分およびヒトIgG4部分の組み合わせ由来である。
【0015】
重鎖定常領域の2つ以上の不連続な部分が、IgG2抗体由来であり得ることが理解されるべきである。そのような環境において、その部分は、IgG2サブクラス内の同じ抗体か、または異なる抗体(すなわち、異なるアロタイプを有する抗体)由来であり得る。同様に、重鎖定常領域の2つ以上の不連続な部分は、IgG4抗体由来であり得る(公知のIgG4アロタイプは1つのみであることに留意)。
【0016】
図1に図式的に示される特定の有用な実施形態において、遺伝子操作された重鎖定常領域は、IgG2サブクラスの1つ以上のヒト抗体由来のCH1領域およびヒンジ領域、ならびに主にIgG4サブクラスの抗体由来のCH2領域およびCH3領域を含む。遺伝子操作された抗体は、マウス−ヒトキメラ抗体(図1A);ヒト化抗体(図1B);または完全なヒト抗体(図1C)の形態であり得る。
【0017】
ヒトIgG2抗体由来の部分およびヒトIgG4抗体由来の部分は、定常領域および/またはヒンジ領域の間の接合部において、正確に終結する必要はない。例えば、以下に示される使用した実施例において(図2を参照のこと)、IgG2抗体由来の部分は、2,3のアミノ酸までヒンジ領域をこえて定常領域2に伸び、重鎖定常領域の残りの部分は、IgG4抗体由来の部分である。
【0018】
本開示による、遺伝子操作された重鎖定常領域の1例は、図2に示される配列(配列番号1)を有する。図2はまた、遺伝子操作された重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号2)を示す。
【0019】
重鎖定常領域のIgG2部分およびIgG4部分は、過剰なサイトカイン放出を生じ、強力にサイトカイン放出症候群(CRS)を誘導し得る細胞相互作用を軽減するように選択される。本開示による、遺伝子操作された重鎖定常領域はまた、炎症性事象(例えば、細胞活性化、サイトカイン放出、および補体の活性化)を誘発する抗体の能力を、減少する。
【0020】
抗体の重鎖定常領域は、その結合特異性について選択され、そして任意の型(例えば、非ヒト、ヒト化、または完全なヒト)であり得る。その抗体の重鎖可変領域が非ヒト(例えば、マウス)であり、本開示による遺伝子操作された重鎖定常領域と組換え結合される場合に、生じた組換え抗体は、キメラ抗体と称される(図1Aを参照のこと)。抗体の重鎖可変領域が、ヒト化され、本開示による遺伝子操作された重鎖定常領域と組換え結合される場合、生じた組換え抗体は、ヒト化抗体と称される(図1Bを参照のこと)。抗体の重鎖可変領域がヒトであり、本開示による遺伝子操作された重鎖定常領域と組換え結合される場合に、生じた組換え抗体は、完全なヒト抗体と称される(図1Cを参照のこと)。図1Bに示される実施形態において、その重鎖の可変領域は、ヒト化され、ヒトフレームワーク領域および非ヒト(この場合はマウス)相補性決定領域(CDR)を含む。そのフレームワーク領域が、1つ以上の供給源由来であり得、CDRが、1つ以上の供給源由来であり得ることが理解されるべきである。抗体のヒト化の方法は、当業者に公知であり、例えば、米国特許第6,479,284号;同第6,407,213号;同第6,350,861号;同第6,180,370号;6,548,640号;および2002年12月3日に出願された係争中の米国特許出願番号PCT/US02/38450に開示される。これらの特許および特許出願の各々の開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【0021】
抗体の軽鎖は、ヒト、非ヒト、またはヒト化であり得る。図1Bに示される実施形態において、その軽鎖は、ヒト化され、ヒトフレームワーク領域、非ヒト(この場合マウス)のCDRおよびヒト定常領域を含む。そのフレームワーク領域は、1つ以上の供給源由来であり得、そのCDR領域は、1つ以上の供給源由来であり得ることが理解されるべきである。
【0022】
操作された重鎖定常領域を含む上記抗体は、細胞表面分子、または細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する能力に基づいて選択される。従って、例えば、上記抗体は、サイトカインレセプター(例えば、IL−2R、TNF−αR、IL−15Rなど);接着分子(E−セレクチン、P−セレクチン、L−セレクチン、VCAM、ICAMなど);細胞分化抗原または活性化抗原(例えば、CD3、CD4、CD8、CD20、CD25、CD40など)およびその他のような細胞表面分子に結合する、その能力に基づいて選択され得る。あるいは、上記抗体は、細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する、その能力に基づいて選択され得る。そのような可溶性分子としては、サイトカインおよびケモカイン(例えば、インターロイキン−1(IL−1)、IL−2、IL−3、IL−5、IL−6など);成長因子(例えば、EGF、PGDF、GM−CSF、HGF、IGFなど);細胞分化を誘導する分子(例えば、EPO、TPO、SCF、PTNなど)およびその他が挙げられるが、これに限られない。
【0023】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、完全な抗体およびCH1、ヒンジ領域、CH2またはCH3の少なくとも2つを含む抗体フラグメントを含む。完全なモノクローナル抗体が、好ましい。
【0024】
一般的に、本明細書中に開示される上記抗体の構築は、遺伝子工学技術において利用される、認められた操作を使用して行われる。例えば、DNAの単離、DNAの発現のための、ベクターの作製および選択、核酸の精製および核酸の分析、組換えベクターDNAを作製するための特定の方法、制限酵素を用いたDNAの切断、DNAのライゲーション、安定なまたは過渡的な手段による、ベクターDNAを含むDNAの宿主細胞への導入、DNAを発現する細胞を選択および維持するための、選択培地または非選択培地における宿主細胞の培養に関する技術は概して、当該分野において公知である。
【0025】
本明細書に開示される上記モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ法(Kohlerら,Nature,256:495,1975)、または当業者にとって周知である、他の組換えDNA法を用いて得ることができる。ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物は、リンパ球による抗体の産生を誘発するタンパク質によって、免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロにおいて免疫化され得る。上記抗原に応じて作製された上記リンパ球は、その後、ハイブリドーマ細胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59−103(Academic Press,1986))を形成する適切な融合剤(例えば、ポリエチレングリコール)を使用して、骨髄腫細胞と融合される。上記ハイブリドーマ細胞は、その後、好ましくは、融合していない、親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する1つ以上の物質を含む適切な培養培地中に播種され、および増殖させられる。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、上記選択された抗体産生細胞による、抗体の安定した産生を支持し、そしてHAT培地(Sigma Chemical Company,St.Louis,Mo.,Catalog No.H−0262)のような培地に対して非感受性である骨髄腫細胞である。これらの内で、好ましい骨髄腫細胞株は、マウスの骨髄腫株(例えば、Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USAより入手可能なMOPC−21マウス腫瘍およびMPC−11マウス腫瘍ならびにAmerican Type Culture Collection,Rockville,Md.USAより入手可能なSP−20、NS0またはX63−Ag8−653細胞に由来するマウス骨髄腫株)である。
【0026】
上記ハイブリドーマ細胞は、選択培養培地(例えば、HAT)中で増殖させられ、そして生存する細胞は、上記抗原に対するモノクロナール抗体の産生のために、増やされおよびアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクロナール抗体の結合特異性は、アッセイ(例えば、免疫沈降剤、放射免疫アッセイ(RIA)、フローサイトメトリー、細胞活性化アッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって決定され得る。
【0027】
ハイブリドーマ細胞が所望の、特異性、親和性および/または活性を有する抗体を産生することが確認された後に、そのクローンは、限界希釈手順によってサブクローン化され得、そして標準的な方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59−103(Academic Press,1986))によって増殖され得る。さらに、上記ハイブリドーマ細胞は、インビボにおいて、動物の腹水腫瘍として増殖され得る。上記サブクローンによって分泌されたモノクロナール抗体は、例えば、プロテインA−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。モノクロナール抗体をコードするDNAは、通常の方法を使用して(例えば、モノクロナール抗体の、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に、特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブの使用によって)、容易に単離され、配列決定される。上記ハイブリドーマ細胞は、好ましくはそのようなDNAの供給源として機能する。一旦単離されると、上記DNAは発現ベクターの中に配置され得、この発現ベクターは、その後、他の免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞(例えば、E.coli細胞、または哺乳動物細胞)にトランスフェクトされ、上記組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成する。抗体または抗体フラグメントはまた、McCaffertyら,Nature,348:552−554(1990)に記載される技術を使用して作製される抗体ファージライブラリーから単離され得る。他の刊行物は、チェーンシャッフリング(chain shuffling)による高親和性(nM領域)ヒト抗体の産生(Marksら,Bio/Technology,10:779−783(1992))、ならびに非常に大きいファージライブラリーを構築するためのストラテジーとして、感染およびインビボにおける組換えの組み合わせを記載する(Waterhouseら,Nuc.Acid.Res.,21:2265−2266(1993))。従って、これらの技術は、モノクロナール抗体における代表的なモノクロナール抗体ハイブリドーマ技術についての実行可能な代替技術である。
【0028】
本明細書中に記載される上記抗体は、その後、本発明の操作されたIgG2/IgG4由来のヒト重鎖定常ドメインについてのコード配列と、重鎖可変ドメインについてのコード配列とを組み合わせることによって改変され得る。本発明の組換え抗体が、特定のマウス抗体に基づく場合、例えば、この開示による操作された重鎖定常領域は、上記相同なマウス配列の位置に置換され得る。あるいは、機能的抗体フラグメントが(例えば、ヒトファージライブラリー、scFvライブラリーまたはFabライブラリーのパニング(panning)によって)同定され得、ここで本発明の操作されたIgG2/IgG4由来のヒト重鎖定常ドメインが、操作され得る。
【0029】
別の局面において、この開示は、上記操作された重鎖定常領域を作製するために必要な、合成の核酸フラグメント、ゲノム由来の核酸フラグメントまたはcDNA由来の核酸フラグメントを含む、組換え発現ベクターを提供する。任意の上記操作された重鎖定常領域、またはこの開示による上記操作された重鎖定常領域を含む抗体をコードするヌクレオチド配列は、上記挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含む適切なベクター内に挿入され得る。任意の適切な宿主細胞ベクターは、キメラ重鎖およびキメラ軽鎖、またはCDR移植重鎖およびCDR移植軽鎖をコードするDNA配列の発現に使用され得る。細菌(例えば、E.coli)系および他の微生物系が、使用され得る。真核生物(例えば、哺乳動物)宿主細胞発現系もまた、本発明の抗体を得るために使用され得る。適切な哺乳動物宿主細胞としては、COS細胞およびCHO細胞(Bebbington C R(1991)Methods 2 136−145);および骨髄腫細胞系およびハイブリドーマ細胞系(例えば、NSO細胞(Bebbingtonら,Bio Techology,10:169−175(1992))が挙げられる。
【0030】
上記操作された重鎖定常領域を含む抗体はまた、治療薬とともに与えられる別々に投与される組成物として使用され得る。診断目的のため、上記抗体は、標識されても、または標識されなくともどちらでもよい。非標識抗体は、上記操作された抗体と反応する他の標識抗体(第2抗体)(例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域に特異的な抗体)と組み合わせて使用され得る。あるいは、上記抗体は、直接標識され得る。多様な標識(例えば、放射性核種、蛍光、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、リガンド(特に、ハプテン)など)が、利用され得る。免疫学的アッセイの多くの型が利用可能であり、これらは、当業者に周知である。
【0031】
本発明の操作された抗体は、薬学的キャリアーを含む組成物中で、患者に投与され得る。薬学的キャリアーは、患者への上記抗体の送達に適した任意の適合性のある、非毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂質、ワックス、および不活性な固体が、上記キャリアーに含まれ得る。薬学的に受容された補助剤(緩衝剤、分散剤)もまた、上記薬学的組成物中に組み込まれ得る。
【0032】
上記抗体組成物は、多くの経路によって、患者に投与され得る。好ましくは、上記薬学的組成物は、非経口的に(例えば、皮下に、筋肉内に、または静脈内に)投与され得る。従って、非経口投与における組成物としては、抗体の溶液、抗体フラグメントの溶液、または受容可能なキャリアー、好ましくは水溶性のキャリアーに溶解したこれらの反応混液が挙げられ得る。多くの水溶性のキャリアーが使用され得る(例えば、水、緩衝化された水、0.4%食塩水、0.3%グリシンなど)。これらの溶液は、無菌であり、そして概して粒子状物質を含まない。これらの組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌され得る。上記組成物は、pH調整剤および緩衝剤、毒性調整剤などのような適切な生理的条件のために必要とされる薬学的に受容可能な補助的物質(例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酪酸ナトリウムなど)を含み得る。これらの処方物における、抗体または抗体フラグメントの濃度は、大きく変動し得、例えば、約0.5重量%未満(通常は、約1重量%または少なくとも約1重量%)から15重量%または20重量%であり、そして選択された特定の投与形態に従い、主として流体容量、流体粘度などに基づいて選択される。
【0033】
被験者への投与に必要な、非経口的に投与可能な組成物および調整剤を調製するための実際の方法は、当業者にとって公知であるか、または明白であり、そして、例えば、参考として本明細書中に援用されるRemington’s Pharmaceutical Science,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa(1985)中に、より詳細に記載される。
【0034】
別の実施形態において、本開示は、IgG2由来部分およびIgG4由来部分を含むために操作されたFc領域に融合する非Fc成分を含む融合タンパク質を提供する。上記Fc領域は、抗体に関して上述した多様な実施形態のいずれかに従って操作された定常領域であり得る。上記Fc領域は、CH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインの全てまたは任意の部分を含み得、ただしFc領域は少なくとも1つのIgG2由来部分および少なくとも1つのIgG4由来部分を含む。好ましくは、上記IgG2由来部分は、少なくとも重鎖定常領域1およびヒンジ領域を含み、そして上記IgG4由来部分は、上記重鎖定常領域2の大部分および重鎖定常領域3全体を含む。リンカーは必要に応じて、上記非Fc成分と上記Fc成分との間に提供され得る。存在する場合、上記リンカーは、3〜25アミノ酸長であり得る。特に有用な実施形態において、上記リンカーは、適切なフォールディングおよびそれによる上記非Fc成分の機能の維持に役立つ。
【0035】
本開示に従う好ましい融合タンパク質は、好ましくは上記タンパク質の非Fc部分の機能を維持しおよび/または上記非Fc部分単独に比べて、延長した半減期を有する。さらに、本開示に従う上記融合タンパク質は、好ましくは、不要な、抗体Fc媒介性の細胞活性化ならびにFcレセプターと抗体の結合および補体活性化により生じる事象を含む炎症特性を欠く。上記ヒンジ領域を含む本開示の特定の実施形態に従う融合タンパク質はまた、他の融合タンパク質分子とジスルフィド結合を形成する能力を有し、これにより、非Fc部分が結合する分子に対する結合力が向上し得る二量体形成を生じる。
【0036】
本開示に従う融合タンパク質は、上記分子をコードしたDNAをトランスフェクトした哺乳動物細胞によって、安定した形態で容易に分泌され得る。さらに、それらは、迅速で、効率的な精製(例えば、プロテインAを使用する)をうけて均質になる。従って、これらの分子は、商業的に有用な量および形態で得ることが可能なため、本文中におけるモノクロナール抗体(例えば、流動細胞計測法、免疫組織化学、免疫沈降、細胞ベースのアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA))についての有利な代用品である。
【0037】
有用な特性を示す任意のペプチドまたはタンパク質は、上記融合タンパク質を調製する本発明の操作された抗体定常領域と結合される、上記非Fc成分としての使用に適している。ペプチド活性またはタンパク質活性およびペプチドの使用またはタンパク質の使用としては、タンパク質アゴニストまたはタンパク質アンタゴニストとしての働き、レセプターへの結合、表面分子が結合した膜への結合、可溶性タンパク質への結合、リガンドへの結合、酵素もしくは構造タンパク質への結合、レセプターの活性化または阻害、標的薬物の送達、または任意の酵素活性が挙げられるが、これらに限られない。Fcドメインとの組み合わせで存在する場合に、そのペプチドまたはタンパク質に与えられる向上した安定性および向上した半減期からその有用性が増加し得るペプチドまたはタンパク質が、通常選択される。本明細書中で使用される「生物学的活性」としては、生物系における活性を有する分子に関連した任意の活性が挙げられ、活性は、タンパク質−タンパク質相互作用によって誘発される、促進的な活性または抑制的な活性、ならびにタンパク質−タンパク質複合体の安定性を含むそのような相互作用を取り巻く動態を含むが、これに限られない。従って、非Fc成分としての使用に適する分子の非限定的な例としては、サイトカイン、ホルモン、酵素、リガンド、成長因子、レセプターおよび抗体フラグメントが挙げられる。
【0038】
本発明の融合タンパク質の調製に使用するのに適切な、適切な非Fc成分としては、以下が挙げられる:リガンド誘導性ホモ二量体化によって活性化されるレセプターに結合するペプチド(WhittyおよびBorysenko,Chem Biol.,(1999)Apr 6(4):R107−18に記載されるような、G−CSF活性、GHR活性およびプロラクチン活性を示す活性フラグメントが挙げられる);適切なペプチド他の例としては、Zaccaroら,Med.Chem.(2000)43(19);3530−40に記載されるようなCDループ由来の神経成長因子模倣体;Eckenbergら,J.Immunol.(2000)165(8):4312−8に記載されるようなIL−2模倣体;Evansら,Drugs R.D.(1999)2(2):75−94に記載されるような、グルカゴン様ペプチド−1;Gagnonら,Vaccine(2000)18(18):1886−92に記載されるような、マイトジェン活性化B細胞増殖を刺激する、テトラペプチドI(D−リジン−L−アスパラギニル−L−プロリル−L−チロシン);ヒト細胞障害性Tリンパ球関連抗原4の結合ドメイン。レセプター拮抗性活性を示すペプチドもまた、企図される。例えば、Luoら,Biochemistry(2000)39(44):13545−50に記載されるような、HIV治療のためのCXCR4のアンタゴニストとしての、vMIP−IIのN−末端ペプチド;Pakalaら,Thromb.Res.(2000)100(1):89−96に記載されるような、抗血栓治療のための、トロンビンレセプターのアンタゴニストペプチドリガンド(AFLARAA);Powellら,Br.J.Pharmacol.(2000)131(5):875−84に記載されるような、麻酔薬への耐性を減弱させるための、ペプチドCGRPレセプターアンタゴニストCGRP(8−37);Hoareら,J.Pharmacol.Exp.Ther.(2000)295(2):761−70に記載されるような、灰白隆起漏斗ペプチド(7−39)として公知の副甲状腺ホルモン(PTH)−1レセプターアンタゴニスト;Zagonら,Int.J.Oncol.(2000)17(5):1053−61に記載されるような、オピオイド増殖因子;Yanofskyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.93,pp.7381−7386,July 1996およびVigersら,J.Biol.Chem.,Vol 275,No 47,36927−36933頁,2000に開示されるような、高親和性I型インターロイキン1レセプターアンタゴニスト;ならびに、Fanら,IUBMB Life(2000)49(6)545−48に記載されるような、酸性線維芽細胞増殖因子結合ペプチド。本開示に従う、Fc領域に融合し得る生物学的に活性なペプチドのさらなる例としては、うっ血性心不全に対する身体の応答の一部として、心臓によって分泌されるタンパク質(例えば、Mukoyamaら,J.Clin.Invest.87(4):1402−12(1991)およびClemensら,J.Pharmacol.Exp.Ther.287(1):67−71(1998)に記載されるような、ヒト脳ナトリウム排泄増加性ペプチド(hBNP)など)が挙げられる。本開示にしたがって使用され得る、生物学的に活性なペプチドのさらなる例としては、(例えば、グルコース依存性インシュリン分泌作用によって)β細胞機能を保存もしくは改善する潜在能力を有するタンパク質(例えば、エキセンジン(exendin)−4、GLP−1(7−36)、GPL−2(1−34)、グルカゴンもしくはPACAP−38など)が挙げられる(Raufmanら,J.Biol.Chem.267(30):21432−7(1992)を参照のこと)。抗体フラグメントもまた、上記融合タンパク質の非Fc成分として利用され得ることが理解されるべきである。したがって、例えば、この非Fc成分は、sc−Fv、F(ab)もしくはF(ab)12であり得る。別の例として、この非Fc成分は、WO 02/46238 A2(この開示は、本明細書においてその全体が参考として援用される)に記載されるような、模倣ペプチドが挿入されているかまたは1つ以上のCDR領域と置き換えられている、抗体の可変領域であり得る。
【0039】
したがって、例えば、上記融合タンパク質の作製のために使用される上記非Fc成分は、増殖因子であり得る。増殖因子の例としては、血小板由来増殖因子(PDGF)、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、上皮増殖因子(EGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、インシュリン、神経成長因子(NGF)、インシュリン様増殖因子(IGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、肝性増殖因子(HGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、Wnt−2プロトオンコジーンの産物(wnt−2)が挙げられる。Aaronson(上述);Normanら,HORMONES,pp.719−748(Academic Press 1987)。全般的には、Heath(編),GROWTH FACTORS,IRL Press(1990)もまた参照のこと。
【0040】
(1.融合タンパク質の作製)
(A.融合タンパク質発現ベクターの構築)
IgG2由来部分およびIgG4由来部分、ならびに非Fc部分を含む融合タンパク質を作製するために、当業者の範囲内である任意の技術が使用され得る。適切な技術としては、米国特許第5,670,625号;同第5,726,044号;および同第6,403,769号に開示される方法が挙げられるが、これらに限定されない。このような技術の1つにおいて、上記融合タンパク質は、哺乳動物細胞によって、適切な形態で分泌され、この融合タンパク質をコードするDNA配列は、哺乳動物細胞をトランスフェクトするのに使用される発現ベクターにサブクローニングされる。抗体配列を含む融合タンパク質の作製のための一般的技術は、Coliganら(編),CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,pp.10.19.1−10.19.11(Wiley Interscience 1992)に記載される(この内容は、本明細書において参考として援用される)。METHODS:A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY,Volume 2(No.2),Academic Press(1991),およびANTIBODY ENGINEERING:A PRACTICAL GUIDE,W.H.FreemanおよびCompany(1992)もまた参照のこと(これらにおいて、融合タンパク質の作製に関する記録は、それぞれの教科書全体にわたって散見される)。本発明の方法は、何らかの特定の発現方法に限定されない。したがって、発現は、真核生物(例えば、哺乳動物、昆虫)細胞または原核生物(例えば、細菌)細胞を用いて達成され得、そして上記融合タンパク質は、細胞によって分泌され得るか、または細胞内ペリプラズムもしくは細胞内封入体から回収され得る。
【0041】
したがって、融合タンパク質の構築工程の1つは、融合タンパク質の一部をクローニングベクターにサブクローニングすることである。ここで、「クローニングベクター」は、宿主原核生物細胞中で自己複製し得るDNA分子(例えば、プラスミド、コスミドもいくはバクテリオファージ)である。クローニングベクターは、代表的に、1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。この部位においては、このベクターならびにクローニングベクターによって形質転換された細胞の同定および選別に使用するのに適切なマーカー遺伝子の本質的な生物学的機能を失うことなく、確定的な様式で外来DNA配列が挿入され得る。マーカー遺伝子は、代表的に、テトラサイクリン抵抗性もしくはアンピシリン抵抗性を提供する遺伝子を含む。適切なクローニングベクターは、Sambrookら(編),MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第2版(Cold Spring Harbor Press 1989)(本明細書においては今後「Sambrook」とする);Ausubelら(編),CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Wiley Interscience 1987)(本明細書においては今後「Ausubel」とする);およびBrown(編),MOLECULAR BIOLOGY LABFAX(Academic Press 1991)によって記載されている。適切なクローニングベクターは、市販されている。
【0042】
上記融合タンパク質のFc領域をコードするDNA配列は、当業者の範囲内である任意の技術を用いて得ることができる。この融合タンパク質の非Fc部分をコードするDNA配列はまた、当業者の範囲内である技術(例えば、非抗体タンパク質を産生する細胞から単離されたRNAを用いたPCR)を用いて合成され得る。このDNAは、イントロンを含み得るか、またはイントロンの一部もしくは全部を除去するように操作され得る。
【0043】
上記融合タンパク質の非Fc成分をコードするDNA配列は、上記融合タンパク質のFc領域部分のN末端を用いてインフレームにサブクローニングされる。サブクローニングは、当業者の範囲内である技術(例えば、適切な末端を提供するための制限酵素消化の使用、望ましくないDNA分子の結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理の使用、および適切なリガーゼによるライゲーション)によって行われる。このような操作に関する技術は、SambrookおよびAusubelに記載されており、かつ当該分野で周知である。細菌宿主中でクローニングされたDNAを増幅するため、および細菌宿主からのクローニングされたDNAの単離のための技術は、周知である。
【0044】
Fc領域が、所望される場合、非Fc成分のアミノ末端上にクローニングされ得ることは、当然理解されるべきである。
【0045】
クローニングされた融合タンパク質は、クローニングベクターから切断され、発現ベクターに挿入される。適切な発現ベクターは、代表的に、以下を含む:(1)細菌の複製起点をコードする原核生物DNA要素、ならびに細菌宿主中での発現ベクターの増殖および選別を提供するための抗生物質耐性マーカー;(2)転写の開始を制御する真核生物DNA要素(例えば、プロモーター);そして(3)転写産物のプロセシングを制御するDNA要素(例えば、転写終止配列/ポリアデニル化配列)。
【0046】
本開示による融合タンパク質は、真核生物細胞(例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および酵母細胞)中で発現され得る。哺乳動物細胞は、特に好ましい真核生物宿主である。なぜなら、哺乳動物細胞は、適切な翻訳後改変(例えば、グリコシル化)を提供する。哺乳動物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO−K1;ATCC CCL61)、ラット下垂体細胞(GH1;ATCC CCL82)、HeLa S3細胞(ATCC CCL2.2)、ラットヘパトーム細胞(H−4−II−E;ATCC CRL 1548)、SV40形質転換サル腎臓細胞(COS−1;ATCC CRL 1650)およびマウス胚性細胞(NIH−3T3;ATCC CRL 1658)が挙げられる。
【0047】
哺乳動物宿主に関して、転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、ウイルス源(例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、シミアンウイルスなど)に由来し得る。ここで、その調節シグナルは、高い発現レベルを有する特定の遺伝子に関連する。適切な転写調節配列および翻訳調節配列はまた、哺乳動物遺伝子(例えば、アクチン遺伝子、コラーゲン遺伝子、ミオシン遺伝子、およびメタロチオネイン遺伝子)からも得ることができる。
【0048】
転写調節配列としては、RNA合成の開始を指示するに十分なプロモーター領域が挙げられる。適切な真核生物プロモーターとしては、以下が挙げられる:マウス メタロチオネインI遺伝子のプロモーター(Hamerら,J.Molec.Appl.Genet.1:273(1982))];ヘルペスウイルスのTKプロモーター(McKnight,Cell 31:355(1982));SV40初期プロモーター(Benoistら,Nature 290:304(1981));ラウス肉腫ウイルスプロモーター(Gormanら,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 79:6777(1982));およびサイトメガロウイルスプロモーター(Foeckingら,Gene 45:101(1980))。
【0049】
あるいは、原核生物プロモーターが真核生物プロモーターによって調節される場合、原核生物プロモーター(例えば、バクテリオファージT3 RNAポリメラーゼプロモーター)が、融合遺伝子の発現を制御するために使用され得る。Zhouら,Mol.Cell.Biol.10:4529(1990);Kaufmanら,Nucl.Acids Res.19:4485(1991)。
【0050】
発現ベクターは、種々の技術を用いて宿主細胞に導入され得る(リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、電気穿孔法などが挙げられる)。好ましくは、トランスフェクトされた細胞は、選別および増殖される(ここで、この発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに安定に組込まれて安定な形質転換体を産生する)。ベクターを真核生物細胞に導入するための技術、および有力な選択マーカーを用いて安定な形質転換体を選別するための技術は、Sambrook、Ausubel、Bebbington「Expression of Antibody Genes in Nonlymphoid Mammalian Cells」(2 METHODS:A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY 136(1991))、およびMurray(編),GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS(Humana Press 1991)によって記載されている。
【0051】
融合タンパク質を産生する適切な形質転換体は、種々の方法を用いて同定され得る。例えば、適切な形質転換体は、上記融合タンパク質の非抗体部分もしくはその融合タンパク質の抗体部分のいずれかに結合する抗体を用いてスクリーニングされ得る。細胞を同定するための免疫沈降の使用は、当業者に周知の技術である。
【0052】
融合タンパク質産生細胞が同定された後、その細胞は培養され、そして融合タンパク質が培養上清から単離される。適切な単離技術としては、プロテインAセファロースアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。プロテインAは、融合タンパク質を上清から分離するために、特に有用である。
【0053】
慣習的アッセイが実施されて、融合タンパク質の非Fc成分が、その機能性を保持しているか否かを決定し得る。
【0054】
融合タンパク質は、任意の適切なマーカー部分(例えば、放射性同位体、酵素、蛍光色素、化学発光標識、生物発光標識、もしくは常磁性標識)によって、検出可能に標識され得る。このような検出可能に標識された融合タンパク質を作製および検出する方法は、当業者に周知である。
【0055】
インビトロおよびインサイチュ検出法が使用されて、病的状態の診断および病期分類を補助するのに使用され得る。本開示はまた、インビボ診断のための融合タンパク質の使用を企図する。
【0056】
本開示による融合タンパク質は、薬学的に受容可能な組成物へと処方され得、そして抗体の実施形態に関して先に記載された様式で投与され得る。
【実施例】
【0057】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図するものであり、限定することを意図しない。それが代表的に使用され得るものである限り、当業者に公知の他の手順が代替的に使用され得る。
【0058】
(実施例1)
(操作された重鎖定常領域を有する抗CD3抗体)
OKT3の可変長鎖を、標準的組み換えDNA法を介して、ヒトIgG2由来の、第1重鎖定常領域(CH1)、ヒンジリンカー領域、および第2重鎖定常領域(CH2)由来の最初の数個のアミノ酸を含むゲノムDNAカセットに結合した。次いで、ヒトIgG4由来の第2重鎖定常領域(CH2)の残りおよび第3重鎖定常領域(CH3)のを含むカセットを添加した。IgG2ヒンジ領域およびそれに続くアミノ酸を、Fc−γレセプターへの抗体結合を最小限にするように選択し、そしてIgG4領域を、抗体媒介性補体活性を防ぐように選択した。
【0059】
(操作された重鎖定常領域の調製)
ヒトIgG2重鎖定常領域(GenBank登録番号V00554;図3A参照)をコードするゲノムDNA、またはヒトIgG4重鎖定常領域(GenBank登録番号K01316;図3B参照)をコードするゲノムDNAを、FDAのEd Max博士による細菌キャリアプラスミドpBR322におけるインサートとして提供した(図3C参照)。制限酵素分析および完全DNA配列決定により、ヒトIgG4およびIgG2定常領域の正しい配列が得られたことを確認した。上記IgG4由来インサートを、HindIIIおよびXhoIを用いた制限酵素消化によって、プラスミドから分離した。このインサートを精製し、切断し、そしてさらなる制限酵素分析に供して、公開されるヒトIgG4ゲノムDNAの配列を確認した。ゲノムIgG4インサート(HindIII/SmaI制限酵素切断フラグメント;SmaI部位は、翻訳終止部位のおよそ30bp 3’側の、3’未翻訳領域にある)を次いで、発現カセットAPEX−1にライゲーションすることによってサブクローニングした(図4Aおよび図4B参照、APEX−1 3F4VHHuGamma4)。DNA配列分を行い、ヒトIgG4の所望の領域の正しい配列を確認した。
【0060】
ヒトIgG2をコードするゲノムDNAを含むpBR322プラスミドを、IgG2 CH1、ヒンジ領域およびCH2の第一部分の源として使用した。これらは、PmIIおよびBst EIIで切断され、APEX−1 3F4VHGamma4へとサブクローニングされて、対応するIgG4由来配列と置き換えられる(図5A参照)。得られたキメラIgG2/IgG4ヒト定常領域の配列を、図5Bに示す(APEX1−3F4VHHuG2/G4)。
【0061】
(マウスOKT3可変領域およびヒトG2/G4重鎖定常領域に基づくキメラ抗体の調製)
マウスmAbのOKT3の重鎖および軽鎖の可変配列は、すでに決定され、そしてGenBankデータベースに委託されている(受入番号は、それぞれ、A22261(図6)およびA22259(図7)である)。キメラ抗体を、2つの別個の発現系を用いて、OKT3可変領域およびHuG2/G4定常領域を用いて生成した。重鎖および軽鎖の可変領域を、重複40マーオリゴヌクレオチドおよびPUC19クローニングベクター中への挿入のためのリガーゼ連鎖反応を用いて、遺伝子合成により構築した。発現系#1に関して、マウス免疫グロブリンプロモーターおよびリーダーイントロンを有するマウスリーダー配列を含む配列を、5’末端に、そしてスプライスドナー部位を含む配列を3’末端に、PCRによりつけ加え、HindIIIからBamHIまでのフラグメントとして重鎖および軽鎖(κ)可変領域のための発現カセットを形成した。発現系#1において使用される、構築されたマウスOKT3重鎖可変領域およびマウスOKT3軽鎖可変領域の全DNA配列および全アミノ酸配列を、それぞれ図8および図9に示す。
【0062】
次に、前述の遺伝子操作された重鎖定常領域を、別個のPUC19クローニングベクター中へ以下のようにして挿入して、改変した:5’末端にBamHI部位を有する、ネイティブなヒトIgG4由来の5’未翻訳イントロン配列を、5’末端に加え、そして3’末端にEcoRI部位およびBglII部位を有する天然のヒトIgG4由来の3’未翻訳配列を、3’末端に加えた。このHuG2/G4定常領域を、BamHIからBglIIフラグメントとしてPuc19から切除し、重鎖発現ベクターpSVgpt.HuG2G4の固有のBamHI部位に、正しい向きが選択されるように挿入した。BamHIからBglIIのHuG2/G4フラグメントのこの全核酸配列を、図10に示す。
【0063】
同様に、構築されたマウスOKT3重鎖可変領域を、HindIIIからBamHIのフラグメントとしてPUC19から切除し、そしてHuG2/G4挿入物を含むpSVgpt.HuG2G4発現ベクター中に移した。このDNA配列が正しいことを確かめた。重鎖発現ベクターpSVgpt.HuG2G4の模式的なマップを、図11に示し、そしてこのベクター内に含まれる構築されたOKT3可変重領域に対するHuG2/G4定常領域の位置を示す。
【0064】
この構築されたマウスOKT3軽鎖可変領域をまた、HindIIIからBamHIのフラグメントとしてPUC19から切除し、そしてヒトκ定常領域(HuCk)を含む発現ベクターpSVhygHuCκに、図12に示されるように移した。
【0065】
ヒトG2/G4定常領域に連結されたマウスOKT3可変重鎖領域の改変バージョンを含む第二の発現系をまた、生成した。このバージョン(発現系#2)は、オリジナルなOKT3シグナル配列を含み、そして前の構築物中において記載された免疫グロブリンプロモーターおよびイントロン配列を含まなかった。キメラ抗体を、遺伝子合成により構築し、そして以前に記載されたG2/G4定常領域を含むPUC19クローニングベクター中に連結した。OKT3 VHおよびヒトG2/G4挿入物(発現システム#2)の配列を、図13に示す。
【0066】
このG2/G4定常領域を、BamHI/BglIIを用いた消化によりPuc19から切除し、そしてゲルで単離した。次いで、このフラグメントを、BamHI部位にて発現ベクターAPEX−3P中に連結し、APEX−3PG2/G4を生成する(図14を参照のこと)。このマウスOKT3VHを、上記pUC19ベクターよりBsiWI/BamHI消化を用いて単離し、そして5’末端にBamHI−BsiWIアダプターを有するBamHI部位をつけ加えることにより改変した。BamHI/BsiWIを産生するために使用される突出末端アダプター二重鎖は、以下の配列:
【0067】
【化1】
を有する。次いで、このAPEX−3PG2/G4ベクターを、BamHIで開き、そしてこの改変OKT3 VH領域を挿入し、発現ベクターAPEX−3PmOKT3VhG2G4を生成した(図15)。同様に、元のマウスOKT3 VKシグナル配列および可変κ配列(イントロンを含まず)を含む代替のOKT3軽鎖カセットを、ヒトκ軽鎖定常領域に連結した。遺伝子合成によりOKT3 VK遺伝子配列を構築し、そしてこの配列を、HindIII−BamHIフラグメントとして、前もってPUC19クローニングベクターに挿入されたヒトκ定常領域に連結することにより、これを達成した。生じたプラスミド配列を、図16に示す。次に、このOKT3VK配列を、BsiWI/EcoRIでこのベクターから切り出し、そしてhCKを、BsgI/EcoRIで、同一のベクターから切り出した。この2つのフラグメントを、発現ベクターAPEX−3Pに移すために、市販されているシャトルベクターであるLITMUS28(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA)を使用した。LITMUS28を、BsiWI/EcoRI消化で開き、そしてOKT3 VKフラグメントと連結し、LITMUS28mOKT3(ベクターは示さず)を生成し、次いでEcoRI/BsgI消化で開き、そして上記hCKフラグメントに連結して、LITMUS28mOKT3VKhCKを生成した(図17)。次いで、この構築物を、BglII/BamHIを用いて消化し、mOKT3VKhCKフラグメント全体を単離した。この発現ベクターAPEX−3Pを、BamHIで開き、そしてmOKT3VKhCKフラグメントと連結し、APEX−3OKT3VK+CKを生成した(図18)。
【0068】
(ヒトG2/G4定常領域を含むキメラ抗体の、IgG(FcγRI)に対するヒトのレセプターに結合する能力の評価)
T細胞レセプター複合体のCD3ε成分に対する抗体(例えば、OKT3)は、TCRを架橋することにより、ヒトのT細胞を活性化し得る。しかし、架橋は補助細胞を必要とすることが示されており、この補助細胞は、高親和性Fcレセプターおよび低親和性Fcレセプターを介して、抗体のFc部分を結合する。この実施例に従って生成される抗体を試験し、そしてIgG(FcγRI)に対して高親和性のヒトのレセプターへの結合を評価した。U937系統の細胞を、指示濃度のビオチン化hIgG(Sigma)と一緒に、4℃で15分間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリスリン(SA−PE)と共に、4℃で15分間インキュベートし、洗浄し、次いで、Becton Dickenson FACS Caliburフローサイトメーターを用いて、フローサイトメトリーにより分析した。図19Aにおいて観察されるように、生じた結合曲線は、約2〜4ng/mLの濃度のビオチン化hIgGが、さらなる競合研究のために適切であることを示した。U937細胞を、指示濃度の競合抗体と一緒に、3.0ng/mLのビオチン化hIgGと、氷上で30分間インキュベートし、洗浄し、SA−PEと一緒に15分間インキュベートし、洗浄し、そしてフローサイトメトリーにより分析した(図19B)。mOKT3、hIgG1およびhIgG4の調製物は、ビオチン化hIgGの標的細胞への結合を効率的にブロックし、これらが、FcγRIレセプターに結合することを示す。しかし、この実施例の組換えキメラ抗体(遺伝子操作されたIgG2/IgG4ヒト定常領域を含む)は、これらの細胞上のFcγRIレセプターへの結合に関して競合しなかった。これは、この改変定常領域を含む抗体がFcγRIに結合しないことを示している。
【0069】
(IgG(FcγRII)に対する低親和性ヒトレセプターへの結合の評価)
この実施例に従って産生された遺伝子操作されたIgG2/IgG4のヒトの定常領域を含むキメラ抗体を、IgG(FcγRII)に対するヒト低親和性−レセプターに結合する能力に関して試験した。低親和性Fcレセプターへの結合を明らかにするために、まず抗体調製物を、当量モル濃度のフルオロセインイソチオシアネート(FITC)標識化ウサギFab’2抗ヒトFab’2抗体と一緒に、4℃で一晩インキュベートすることにより、複合体形成した。K562系統の細胞(IgG(FcγRII)に対して低親和性のヒトのレセプターのアロタイプの両方を保有する)を、指示濃度の抗体複合体と一緒に30分間氷上でインキュベートし、洗浄し、そしてBecton Dickenson FACS Caliburフローサイトメーターを用いて、結合された抗体についてフローサイトメトリーにより分析した。図20に見られるように、ヒトIgG1抗体複合体は、K562細胞への効果的な結合を示し、その一方、hIgG2抗体複合体は、ずっと低レベルの結合を示した。ヒトIgG4およびキメラOKT3 hG2/G4組換え抗体は、これらの細胞上の低親和性FcγRIIレセプターに結合し得ない抗体複合体を形成した。FITC−ウサギFab’2抗ヒトFab’2抗体単独の結合もまた示す。
【0070】
(PBLにおいてサイトカイン産生を誘導するための能力の評価)
ヒトCD3に対し、そして遺伝子操作されたIgG2/IgG4ヒト定常領域を含む実施例1のキメラ抗体を、末梢血白血球(PBL)においてサイトカイン産生を誘導する能力について評価した。ドナーのパネルから新たに単離したヒト末梢血を、白血球画分について、Ficoll−Hypaque密度沈降により濃縮した。このPBLを、マウスIgG2a定常領域(OKT3)またはヒトIgGG2/G4定常領域(OKT3 hG2/G4)のいずれかを保有する、指示濃度の抗CD3抗体と一緒にインキュベートした(図21を参照のこと)。上清を、24時間および36時間に収集し、そしてTNF−α(A)およびIL−2(B)の蓄積についてサンドウィッチELISAにより評価した。図21に示されるグラフは、所定のサイトカインの弱いピークが観察された時点(例えば、IL−2については24時間、TNF−αについては36時間)を示す。このOKT3抗体(ヒトFcγRIレセプターおよびFcγRIIレセプターの両方を結合する)は、両サイトカインの高いレベルを誘導した。しかし、キメラ組換え抗体OKT3 hG2/G4(これは、同一のCD3εエピトープをOKT3として結合するが、Fcレセプターを結合する能力を喪失している)は、有意なレベルの任意の試験サイトカインの産生を刺激し得なかった。
【0071】
(ヒトPBLからの標的T細胞を活性化する能力の評価)
ヒトCD3に対し、そして遺伝子操作されたIgG2/IgG4ヒト定常領域を含む実施例1のキメラ抗体を、ヒトPBLからの標的T細胞を活性化する能力について評価した。CD25は、インターロイキン−2(IL−2)に対するレセプターであり、そしてCD25の発現は、T細胞レセプター複合体を介して活性化されたT細胞の表面上でアップレギュレートされる。同様に、CD69はまた、初期のT細胞活性化マーカーであり、CD69の発現レベルは、T細胞レセプターの関与の際に増加する。その結果、両マーカーは、T細胞活性化の高感度の測定器具として役立つ。ドナーのパネルから新たに単離されたヒトの末梢血を、Ficoll−Hypaque濃度沈降により、この白血球画分について濃縮した。このPBLを、マウスIgG2a定常領域(OKT3)またはヒトIgGG2/G4定常領域(OKT3 hG2/G4)のいずれかを保有する、指示濃度の抗CD3抗体の存在下または非存在下でインキュベートした;図22を参照のこと。24時間の時点で、細胞を収集し、洗浄し、そしてヒトCD25およびヒトCD69に特異的なFITC−結合モノクローナル抗体と共に、氷上で30分間インキュベートした。この細胞を洗浄し、Becton Dickenson FACS Caliburフローサイトメーターを用いて、フローサイトメトリーにより抗体結合について分析した。代表的な一人のドナーについてのデータを、図22Aおよび図22Bに示し、そしてCD25(A)またはCD69(B)を発現している細胞の百分率を示す。
【0072】
(ヒトL−SIGN−Fc融合タンパク質およびヒトG2G4 Fc部分の産生および発現)
ヒトL−SIGN−ヒトG2G4融合タンパク質を、ヒトL−SIGN(非Fc成分として)をコードするcDNAおよびヒト免疫グロブリンHuG2G4のFc部分をコードするcDNAに由来する2つのPCRフラグメントを融合させることにより生成する。オリゴヌクレオチドP1、cagatgtgatatcTCCAAGGTCCCCAGCTCCCTAAG(配列番号52)、およびP2、tgggctcgagTTCGTCTCTGAAGCAGGCTGCG(配列番号53)を使用して、ヒト脾臓cDNAライブラリーからhL−SIGNの細胞外部分を増幅させる(ヒトL−SIGNに対して相補的なプライマーの領域を、大文字で示す)。P1は、リーダー配列(KLV56)と融合するための、上流のEcoRV制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。P2では、下流のXhoI制限エンドヌクレアーゼ部位を使用して、これをhG2G4 Fc領域と融合させる。プライマーP3、agacgaactcGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGT(配列番号54)、およびP4、cggccctggcactcaTTTACCCAGAGACAGGGAGAGGCT(配列番号55)を用いて、ヒンジドメインのGlu99からカルボキシ末端までのヒトG2G4ハイブリッドFc領域をヒトG2G4定常領域を含むプラスミドを用いることにより増幅させる。大文字は、ヒトG2G4配列と相補的な領域を示す。P3では、上流のXhoI制限エンドヌクレアーゼ部位を設計し、hL−SIGNと連結させる。P4は、一つの終止コドンの下流の配列およびNgoMIV制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。このPCR増幅されたヒトL−SIGNおよびヒトG2G4 Fc領域のフラグメントを、pCR2.1ベクター中にTAクローン化し、そして配列が正しいことを確かめる。生じたプラスミドpCR2.1hL−SIGNを、EcRV/XhoIで消化し、そしてプラスミドpCR2.1hG2G4を、XhoINgoMIVで消化する。生じたL−SIGNおよびhG2G4フラグメントを、改変Apex3Pプラスミド(Alexion Pharmaceuticals,Inc.)中に連結する。EcoRV/NgoMIVは、Kozak配列および開始メチオニンのためのコドンに相当するATGを有するKLV56リーダー(5’−−CGCCCTTCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGT−−3’(配列番号56))を含む。
【0073】
(細胞培養およびタンパク質精製)
Apex3P−hL−SIGNhG2G4を用いてトランスフェクションした293EBNAヒト胚腎細胞を、10%熱不活化FBS、100IU/mlペニシリン、100 g/mlストレプトマイシン、2mMのグルタミンおよび250ug/mlのG418硫酸塩、および1ug/mlのピュ−ロマイシンを含むDMEM(Cellgro #10−013−CV)中で増殖させる。細胞を、37℃、5%のCO2にて増殖させ、選別を行う。血清タンパク質を除去するために、コンフルエントなT−175フラスコの選別された細胞を、15mlのHBSSで洗浄し、その後、L−グルタミン(ボトルに量が記載されている)およびペニシリン/ストレプトマイシンを各フラスコに補充されたIS Pro無血清培地(Irvine Scientific,Santa Ana,CA,Catalog #91103)30mLを添加する。二日から三日、上清を濃縮し、そしてプロテインAクロマトグラフィーにより精製する。
【0074】
本明細書を通して、種々の刊行物および特許の開示が参照される。これらの教示および開示は、その全体が、本発明に関する分野の現状をより十分に記載するために、本出願中に参考として援用される。
【0075】
本発明の好ましい実施形態および他の実施形態が、本明細書中に記載されているが、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を逸脱することなくさらなる実施形態が、当業者により理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0076】
【図1A】図1Aは、本開示による、遺伝子操作された重鎖の定常領域を有する、キメラ組換え抗体の例を図式的に示す。
【図1B】図1Bは、本開示による、遺伝子操作された重鎖の定常領域を有する、ヒト化組換え抗体の例を図式的に示す。
【図1C】図1Cは、本開示による、遺伝子操作された重鎖の定常領域を有する、完全ヒト化組換え抗体の例を図式的に示す。
【図2】図2は、本開示による遺伝子操作された重鎖定常領域のアミノ酸配列(配列番号1)、およびその遺伝子操作された重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列(配列番号2)を示す。
【図3A】図3Aは、ヒトIgG2(GenBank 受諾番号 V00554)のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図3B】図3Bは、ヒトIgG4(GenBank 受諾番号 K01316)のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図3C】図3Cは、プラスミドpBR322(GenBank 受諾番号 J01749)の図示的マップを示す。
【図4A】図4Aは、APEX−1 3F4VHHuγ4ベクターの図式マップを示す。
【図4B】図4Bは、そのベクターの完全なヌクレオチド配列(配列番号3)を示し、無関係のVH領域(3F4VH表示)に隣接するhlgG4インサートのアミノ酸配列(配列番号4)およびヌクレオチド配列を示す。シグナル配列、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域の位置が、示されている。
【図5A】図5Aは、APEX−1 3F4VHHu G2/G4ベクターの図解マップを示す。
【図5B】図5Bは、そのベクターのヌクレオチド配列(配列番号5)、G2/G4インサートのアミノ酸配列(配列番号6)、および核酸配列を示し、そしてシグナル配列、無関係のVh(本明細書中で3F4Vh表示)、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域の位置を示す。
【図6】図6は、OKT3重鎖可変領域(GenBank 受諾番号 A22261)の完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図7】図7は、OKT3軽鎖可変領域(GenBank 受諾番号 A22259)の完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図8】図8は、発現ストラテジー#1を使用して構築された、マウスOKT3重鎖可変領域の完全ヌクレオチド配列(配列番号7)およびアミノ酸配列(配列番号8)を示し、この配列は、マウス免疫グロブリンプロ−モーター、5’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列、および3’末端にスプライス供与部位(Bam HI)を含む。制限酵素部位が、示される。
【図9】図9は、発現ストラテジー#1を使用して構築された、マウスOKT3軽鎖可変領域の完全ヌクレオチド配列(配列番号9)およびアミノ酸配列(配列番号10)を示し、この配列は、マウス免疫グロブリンプロモーター、5’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列、および3’末端にスプライス供与部位(Bam HI)を含む。制限酵素部位が、示される。
【図10】図10は、APEX−1 3F4VHHuG2/G4ベクターから切断され、5’末端において、Bam H1部位および天然のヒトIgG4からの5’の翻訳されないイントロン配列を添加し、3’末端において、Bgl II部位および天然のヒトIgG4からの3’の翻訳されない配列を付加することによりPUC19クローニングベクターにインサートして改変されたHuG2/G4フラグメントの完全ヌクレオチド配列(配列番号11)を示す。
【図11】図11は、発現系#1において使用される重鎖発現ベクターpSVgptHuG2/G4の図解マップを示す。
【図12】図12は、発現系#1において使用される発現ベクターpSVgptHuCkの図解マップを示す。
【図13A】図13Aは、発現ストラテジー#2を使用して構築されたOKT3重鎖可変領域およびhuG2/G4定常領域のヌクレオチド配列(配列番号12)およびアミノ酸配列(配列番号13)を示す。その構築物は、5’のリーダーイントロンを欠き、原形のOKT3シグナル配列(示される)を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図13B】図13Bは、発現ストラテジー#2を使用して構築されたOKT3重鎖可変領域およびhuG2/G4定常領域のヌクレオチド配列(配列番号12)およびアミノ酸配列(配列番号13)を示す。その構築物は、5’のリーダーイントロンを欠き、原形のOKT3シグナル配列(示される)を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図13C】図13Cは、発現ストラテジー#2を使用して構築されたOKT3重鎖可変領域およびhuG2/G4定常領域のヌクレオチド配列(配列番号12)およびアミノ酸配列(配列番号13)を示す。その構築物は、5’のリーダーイントロンを欠き、原形のOKT3シグナル配列(示される)を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図14A】図14Aは、G2/G4のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列(配列番号15)を含む、発現系#2において使用されるAPEX−3P G2/G4発現ベクターの全体の核酸配列(配列番号14)を示す。
【図14B】図14Bは、G2/G4のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列(配列番号15)を含む、発現系#2において使用されるAPEX−3P G2/G4発現ベクターの全体の核酸配列(配列番号14)を示す。
【図14C】図14Cは、G2/G4のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列(配列番号15)を含む、発現系#2において使用されるAPEX−3P G2/G4発現ベクターの全体の核酸配列(配列番号14)を示す。
【図14D】図14Dは、G2/G4のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列(配列番号15)を含む、発現系#2において使用されるAPEX−3P G2/G4発現ベクターの全体の核酸配列(配列番号14)を示す。
【図15A】図15Aは、OKT3可変重鎖領域およびG2/G4インサートのアミノ酸配列(配列番号17)を含む、発現系#2において使用されるAPEX−3PmOKT3VhG2G4発現ベクターの全体の核酸配列(配列番号16)を示す。制限酵素部位が示される。
【図15B】図15Bは、OKT3可変重鎖領域およびG2/G4インサートのアミノ酸配列(配列番号17)を含む、発現系#2において使用されるAPEX−3PmOKT3VhG2G4発現ベクターの全体の核酸配列(配列番号16)を示す。制限酵素部位が示される。
【図16A】図16Aは、発現系#2において使用される、PUC19の全体の核酸配列(配列番号18)、およびOKT3Vkのアミノ酸配列(配列番号19)、ならびにヒトCk発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図16B】図16Bは、発現系#2において使用される、PUC19の全体の核酸配列(配列番号18)、およびOKT3Vkのアミノ酸配列(配列番号19)、ならびにヒトCk発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図16C】図16Cは、発現系#2において使用される、PUC19の全体の核酸配列、およびOKT3Vkのアミノ酸配列(配列番号19)、ならびにヒトCk発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図16D】図16Dは、発現系#2において使用される、PUC19の全体の核酸配列(配列番号18)、およびOKT3Vkのアミノ酸配列(配列番号19)、ならびにヒトCk発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図16E】図16Eは、発現系#2において使用される、PUC19の全体の核酸配列(配列番号18)、およびOKT3Vkのアミノ酸配列(配列番号19)、ならびにヒトCk発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図16F】図16Fは、発現系#2において使用される、PUC19の全体の核酸配列(配列番号18)、およびOKT3Vkのアミノ酸配列(配列番号19)、ならびにヒトCk発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図17】図17は、発現系#2において使用される、シャトルベクターLITMUS28の全体の核酸配列(配列番号20)およびOKT3VkhCkインサートのアミノ酸配列(配列番号21)を示す。
【図18A】図18Aは、発現系#2において使用されるAPEX−3 OKT3Vk+Ckの全体の核酸配列(配列番号22)ならびにOKT3VkおよびCkインサートのアミノ酸配列(配列番号23)を示す。制限酵素部位が示される。
【図18B】図18Bは、発現系#2において使用されるAPEX−3 OKT3Vk+Ckの全体の核酸配列(配列番号22)ならびにOKT3VkおよびCkインサートのアミノ酸配列(配列番号23)を示す。制限酵素部位が示される。
【図19】図19Aおよび図19Bは、U937細胞のFcγRIレセプターに結合するG2/G4重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価する試験の結果を示す。
【図20】図20は、K562細胞のFcγRIIレセプターに結合するG2/G4重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価する試験の結果を示す。
【図21】図21は、ヒトPBL中のサイトカイン産生を誘導するG2/G4重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価するために設計された試験の結果を示す。
【図22】図22は、ヒトT細胞の活性マーカーのアップレギュレートを誘導するG2/G4重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価するために設計された試験の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体媒介性の細胞活性化または炎症事象を減少するための方法であって、該方法は、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子のいずれかに結合する抗体を投与する工程を包含し、該抗体は、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を含む、方法。
【請求項2】
請求項1に記載の方法であって、少なくともCH1領域およびヒンジ領域は、1つ以上のヒトIgG2抗体由来であり、そしてCH2領域の少なくとも部分およびCH3領域の少なくとも部分は、1つ以上のヒトIgG4抗体由来である、方法。
【請求項3】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、ヒト補体成分に結合する、方法。
【請求項4】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、サイトカインレセプターに結合する、方法。
【請求項5】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、接着分子に結合する、方法。
【請求項6】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、細胞分化抗原に結合する、方法。
【請求項7】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、細胞活性化抗原に結合する、方法。
【請求項8】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する、方法。
【請求項9】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、サイトカインに結合する、方法。
【請求項10】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、ケモカインに結合する、方法。
【請求項11】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、増殖因子に結合する、方法。
【請求項12】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、細胞分化を誘導する分子に結合する、方法。
【請求項13】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、細胞活性化を誘導する分子に結合する、方法。
【請求項14】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、細胞表面分子に結合する、方法。
【請求項15】
サイトカイン放出を防止または減少するための方法であって、該方法は、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子のいずれかに結合する抗体を投与する工程を包含し、該抗体は、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を含む、方法。
【請求項16】
サイトカイン放出症候群の重篤化を防止または減少するための方法であって、該方法は、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子のいずれかに結合する抗体を投与する工程を包含し、該抗体は、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を含む、方法。
【請求項17】
非Fc成分およびFc領域を含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質は、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有する、融合タンパク質。
【請求項18】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記Fc領域は、少なくともCH1領域の部分を含む、融合タンパク質。
【請求項19】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記Fc領域は、CH1領域のどの部分も含まない、融合タンパク質。
【請求項20】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記Fc領域は、少なくともヒンジ領域の一部を含む、融合タンパク質。
【請求項21】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、抗体フラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項22】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、単鎖、scFv、f(ab)およびF(ab)’2からなる群より選択されるメンバーである、融合タンパク質。
【請求項23】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、少なくとも1つのCDRの少なくとも部分内に挿入されるかまたはその代わりに挿入される模倣ペプチドを有する抗体の可変領域を含む、融合タンパク質。
【請求項24】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、ペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項25】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、タンパク質またはそのフラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項26】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、サイトカイン、ホルモン、酵素、リガンド、増殖因子、レセプターおよび抗体フラグメントからなる群より選択されるメンバーを含む、融合タンパク質。
【請求項27】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、G−CSF活性を示すペプチド、GHR活性を示すペプチド、プロラクチン活性を示すペプチド、神経増殖因子模倣物、IL−2模倣物、グリコーゲン様ペプチド−1、テトラペプチドI(D−リシン−L−アスパラギニル−L−プロリル−L−トリシン)、vMIP−IIのN−末端ペプチド、トロンビンレセプターのアンタゴニストペプチドリガンド(AFLARAA)、ペプチドCGRP、レセプターアンタゴニストCGRP、副甲状腺ホルモン(PTH)−1レセプターアンタゴニスト、酸性繊維芽細胞増殖因子結合ペプチド、ヒト脳ナトリウム排泄増加性ペプチド(hBNP)、エキセンディン4、GLP−1(7−36)、GPL−2(1−34)、グルカゴン、PACAP−38、血小板由来増殖因子(PDGF)、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、上皮増殖因子(EGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、インスリン、神経増殖因子(NGF)、インスリン様増殖因子(IGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、肝増殖因子(HGF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、Wnt−2癌原遺伝子(wnt−2)の産物およびヒト細胞傷害性T−リンパ球関連抗原4の結合ドメインからなる群より選択されるメンバーを含む、融合タンパク質。
【請求項28】
非Fc成分の半減期を上昇する方法であって、該方法は、該非Fc成分と、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有するFc領域とを融合することによる、方法。
【請求項29】
非Fc成分の、該非Fc成分が結合する分子に対するアビディティを上昇する方法であって、該方法は、該非Fc成分と、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有するFc領域とを融合することによる、方法。
【請求項30】
非Fc成分の二量体を形成する方法であって、該方法は、該非Fc成分と、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有するFc領域とを融合することによる、方法。
【請求項31】
非Fc成分の精製を容易にする方法であって、該方法は、該非Fc成分と、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有するFc領域とを融合することによる、方法。
【請求項32】
Fcレセプター結合およびFc融合タンパク質と関連する補体活性化を減少または除去する方法であって、該方法は、非Fc成分と、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有するFc領域とを融合する工程を包含する、方法。
【請求項33】
請求項32に記載の方法であって、前記Fcレセプター結合および補体活性化は、インビトロで減少または除去される、方法。
【請求項34】
哺乳動物細胞において、非Fc成分の発現を改善する方法であって、該方法は、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有するFc領域に融合された、該非Fc成分を有するFc融合タンパク質を生成することによる、方法。
【請求項35】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記Fc領域は、前記非Fc成分のアミノ末端に結合される、融合タンパク質。
【請求項36】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記Fc領域は、前記非Fc成分のカルボキシ末端に結合される、融合タンパク質。
【請求項37】
請求項17に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項38】
イントロンを含む、請求項37に記載の核酸。
【請求項39】
イントロンを含まない、請求項37に記載の核酸。
【請求項40】
請求項37に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項41】
請求項39に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項42】
請求項17に記載の融合タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【請求項1】
抗体媒介性の細胞活性化または炎症事象を減少するための方法であって、該方法は、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子のいずれかに結合する抗体を投与する工程を包含し、該抗体は、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を含む、方法。
【請求項2】
請求項1に記載の方法であって、少なくともCH1領域およびヒンジ領域は、1つ以上のヒトIgG2抗体由来であり、そしてCH2領域の少なくとも部分およびCH3領域の少なくとも部分は、1つ以上のヒトIgG4抗体由来である、方法。
【請求項3】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、ヒト補体成分に結合する、方法。
【請求項4】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、サイトカインレセプターに結合する、方法。
【請求項5】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、接着分子に結合する、方法。
【請求項6】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、細胞分化抗原に結合する、方法。
【請求項7】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、細胞活性化抗原に結合する、方法。
【請求項8】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する、方法。
【請求項9】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、サイトカインに結合する、方法。
【請求項10】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、ケモカインに結合する、方法。
【請求項11】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、増殖因子に結合する、方法。
【請求項12】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、細胞分化を誘導する分子に結合する、方法。
【請求項13】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、細胞活性化を誘導する分子に結合する、方法。
【請求項14】
請求項1に記載の方法であって、前記抗体は、細胞表面分子に結合する、方法。
【請求項15】
サイトカイン放出を防止または減少するための方法であって、該方法は、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子のいずれかに結合する抗体を投与する工程を包含し、該抗体は、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を含む、方法。
【請求項16】
サイトカイン放出症候群の重篤化を防止または減少するための方法であって、該方法は、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子のいずれかに結合する抗体を投与する工程を包含し、該抗体は、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を含む、方法。
【請求項17】
非Fc成分およびFc領域を含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質は、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有する、融合タンパク質。
【請求項18】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記Fc領域は、少なくともCH1領域の部分を含む、融合タンパク質。
【請求項19】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記Fc領域は、CH1領域のどの部分も含まない、融合タンパク質。
【請求項20】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記Fc領域は、少なくともヒンジ領域の一部を含む、融合タンパク質。
【請求項21】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、抗体フラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項22】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、単鎖、scFv、f(ab)およびF(ab)’2からなる群より選択されるメンバーである、融合タンパク質。
【請求項23】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、少なくとも1つのCDRの少なくとも部分内に挿入されるかまたはその代わりに挿入される模倣ペプチドを有する抗体の可変領域を含む、融合タンパク質。
【請求項24】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、ペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項25】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、タンパク質またはそのフラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項26】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、サイトカイン、ホルモン、酵素、リガンド、増殖因子、レセプターおよび抗体フラグメントからなる群より選択されるメンバーを含む、融合タンパク質。
【請求項27】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記非Fc成分は、G−CSF活性を示すペプチド、GHR活性を示すペプチド、プロラクチン活性を示すペプチド、神経増殖因子模倣物、IL−2模倣物、グリコーゲン様ペプチド−1、テトラペプチドI(D−リシン−L−アスパラギニル−L−プロリル−L−トリシン)、vMIP−IIのN−末端ペプチド、トロンビンレセプターのアンタゴニストペプチドリガンド(AFLARAA)、ペプチドCGRP、レセプターアンタゴニストCGRP、副甲状腺ホルモン(PTH)−1レセプターアンタゴニスト、酸性繊維芽細胞増殖因子結合ペプチド、ヒト脳ナトリウム排泄増加性ペプチド(hBNP)、エキセンディン4、GLP−1(7−36)、GPL−2(1−34)、グルカゴン、PACAP−38、血小板由来増殖因子(PDGF)、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、上皮増殖因子(EGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、インスリン、神経増殖因子(NGF)、インスリン様増殖因子(IGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、肝増殖因子(HGF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、Wnt−2癌原遺伝子(wnt−2)の産物およびヒト細胞傷害性T−リンパ球関連抗原4の結合ドメインからなる群より選択されるメンバーを含む、融合タンパク質。
【請求項28】
非Fc成分の半減期を上昇する方法であって、該方法は、該非Fc成分と、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有するFc領域とを融合することによる、方法。
【請求項29】
非Fc成分の、該非Fc成分が結合する分子に対するアビディティを上昇する方法であって、該方法は、該非Fc成分と、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有するFc領域とを融合することによる、方法。
【請求項30】
非Fc成分の二量体を形成する方法であって、該方法は、該非Fc成分と、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有するFc領域とを融合することによる、方法。
【請求項31】
非Fc成分の精製を容易にする方法であって、該方法は、該非Fc成分と、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有するFc領域とを融合することによる、方法。
【請求項32】
Fcレセプター結合およびFc融合タンパク質と関連する補体活性化を減少または除去する方法であって、該方法は、非Fc成分と、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有するFc領域とを融合する工程を包含する、方法。
【請求項33】
請求項32に記載の方法であって、前記Fcレセプター結合および補体活性化は、インビトロで減少または除去される、方法。
【請求項34】
哺乳動物細胞において、非Fc成分の発現を改善する方法であって、該方法は、1つ以上のヒトIgG2抗体由来の第1の部分および1つ以上のヒトIgG4抗体由来の第2の部分を有するFc領域に融合された、該非Fc成分を有するFc融合タンパク質を生成することによる、方法。
【請求項35】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記Fc領域は、前記非Fc成分のアミノ末端に結合される、融合タンパク質。
【請求項36】
請求項17に記載の融合タンパク質であって、前記Fc領域は、前記非Fc成分のカルボキシ末端に結合される、融合タンパク質。
【請求項37】
請求項17に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項38】
イントロンを含む、請求項37に記載の核酸。
【請求項39】
イントロンを含まない、請求項37に記載の核酸。
【請求項40】
請求項37に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項41】
請求項39に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項42】
請求項17に記載の融合タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図13B】
【図13C】
【図14】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図16F】
【図17】
【図18】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図21】
【図22】
【図22】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図13B】
【図13C】
【図14】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図16F】
【図17】
【図18】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図21】
【図22】
【図22】
【公表番号】特表2007−501021(P2007−501021A)
【公表日】平成19年1月25日(2007.1.25)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−533509(P2006−533509)
【出願日】平成16年5月28日(2004.5.28)
【国際出願番号】PCT/US2004/017005
【国際公開番号】WO2005/007809
【国際公開日】平成17年1月27日(2005.1.27)
【出願人】(503102674)アレクシオン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド (51)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成19年1月25日(2007.1.25)
【国際特許分類】
【出願日】平成16年5月28日(2004.5.28)
【国際出願番号】PCT/US2004/017005
【国際公開番号】WO2005/007809
【国際公開日】平成17年1月27日(2005.1.27)
【出願人】(503102674)アレクシオン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド (51)
【Fターム(参考)】
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