本発明は、標的ポリヌクレオチドのコピー数の相違を検出するための組成物および方法を提供する。いくつかの場合では、本明細書中に提供した方法および組成物は、出発サンプルが母体組織（例えば、血液、血漿）である場合の胎児の遺伝子異常の診断に有用である。記載の方法および材料は、小さいが、統計的に有意なポリヌクレオチドコピー数の相違の検出技術に適用される。本明細書中に提供した方法は、さらに、線状ポリヌクレオチドまたは一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドを除去するための酵素反応を行う工程を含むことができる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００９年１１月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／９１６，８８３号；２００９年１１月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／２６４，５９１；２０１０年３月２日に出願された米国仮特許出願第６１／３０９，８３７；２０１０年３月２日に出願された米国仮特許出願第６１／３０９，８４５；２０１０年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／３１７，６３５；２０１０年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／３１７，６３９；２０１０年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／３１７，６８４；２０１０年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／３４１，０６５；２０１０年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／３４１，２１８；２０１０年９月８日に出願された米国仮特許出願第６１／３８０，９８１；２０１０年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６１／４０９，１０６２０１０年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／４０９，４７３；および２０１０年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６１／４１０，７６９号の利益を主張し、この米国仮特許出願の各々は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
胎児異数性は染色体数の異常であり、一般に、卵子形成または精子形成中の減数分裂の不分離の結果として起こる。しかし、一定の異数性（８トリソミーなど）は、より頻繁には、接合後の有糸分裂時の分離に起因する（Ｎｉｃｏｌａｉｄｉｓ ＆ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ（１９９８）Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １３：３１３−３１９）。かかる異常には正常な染色体数の減少および増加の両方が含まれ、常染色体および性染色体が関与し得る。減少異数性の例はターナー症候群であり、単一のＸ性染色体の存在を特徴とする。染色体数の増加の例には、ダウン症候群（２１番染色体のトリソミー）、パトー症候群（１３番染色体のトリソミー）、エドワーズ症候群（１８番染色体のトリソミー）、およびクラインフェルター（Ｋｌｅｉｎｆｅｌｔｅｒ’ｓ）症候群（性染色体のＸＸＹトリソミー）が含まれる。異数性は、一般に、重要な身体障害および神経学的障害を引き起こし、それにより、罹患個体の大部分が成人に到達しない。実際、１３、１８、または２１番染色体以外の染色体に関与する常染色体異数性を有する胎児は、一般に、子宮内で死亡する。しかし、一定の異数性（クラインフェルター（Ｋｌｅｉｎｆｅｌｔｅｒ’ｓ）症候群など）は明白な表現型を示すことが非常に稀であり、他のトリソミー（ＸＸＹおよびＸＸＸなど）に罹患した者は、しばしば、生殖力のある成人に成熟する。いくつかの場合では、染色体の一部のコピー数が異常になる部分的異数性は、不均衡な不分離に起因し得る。
【０００３】
羊水穿刺または絨毛膜絨毛採取（ＣＶＳ）による侵襲的検査を使用した胎児異数性の出生前診断は、０．５％〜２％の手順に関連する妊娠損失リスクに関連する（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００４】
胎児異数性の正確なスクリーニングの際の別の障壁は、特により早期の妊娠期間における母体血漿中の胎児ＤＮＡ濃度の低さである。単一または低多重のアッセイアプローチでは異数体（ａｎｅｕｐｏｌｏｉｄ）胎児（例えば、２１番染色体のトリソミー）と正倍数性胎児を区別するのに十分な標的カウントが得られる可能性が低い。一般に、必ずしも母体血に由来しない生物学的サンプル中のコピー数変動の検出のための方法および組成物も当該分野で必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄ’Ａｌｔｏｎ，Ｍ．Ｅ．，（１９９４）Ｓｅｍｉｎ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ １８：１４０−６２
【非特許文献２】Ｃａｕｇｈｅｙ ＡＢ（２００６）Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １０８：６１２−６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出するための方法および組成物を提供する。区画を使用することにより、標的ポリヌクレオチドを複数の反応体積に細分割することができる。いくつかの場合では、標的ポリヌクレオチドに対するプローブを複数の反応体積に細分割する。
【０００７】
いくつかの場合では、本方法は、以下の工程を含む：ａ．第１のライゲーションプローブを第１の標的ポリヌクレオチドに結合する工程、ｂ．第２のライゲーションプローブを第２の標的ポリヌクレオチドに結合する工程、ｃ．前記第１および第２のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して１つ以上のライゲーションした産物を得る工程、ｄ．前記１つ以上のライゲーションした産物を２つ以上の区分に分割する工程、ｅ．前記１つ以上のライゲーションした産物内の配列を増幅して増幅された産物を得る工程、ｆ．前記増幅された産物を含む前記区分の数を決定する工程、およびｇ．前記第１の標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程。いくつかの場合では、標的ポリヌクレオチドを、前記２つ以上の区分に分割しない。
【０００８】
区分には、広範な種々の区分型（固体区分（例えば、ウェル、管など）および流体区分（例えば、油相（連続油相など）内の水滴または少なくとも２つの不混和性流体の混合物内の水滴）が含まれる）が含まれ得る。区分はまた、安定でも不安定でもよい。例えば、いくつかの場合では、増幅過程中、前記２つ以上の区分は実質的にインタクトなままである。いくつかの場合では、区分は油相内の水滴であり、前記水滴は本発明の方法の増幅反応中に実質的にインタクトなままである。区分（例えば、前記水滴）はまた、１つ以上の標的ポリヌクレオチド（または前記ポリヌクレオチドに対するプローブ）の存在について区分を評価する場合、決定工程中に実質的にインタクトなままである。区分は、前記ライゲーションした産物から開始される増幅反応を含むことができる。
【０００９】
第１および第２のライゲーションプローブは、種々の標的ポリヌクレオチドに結合する（または結合するようにデザインする）ことができ、しばしば、第１のライゲーションプローブは第１の標的ポリヌクレオチドに結合し、第２のライゲーションプローブは第２のポリヌクレオチドに結合する。いくつかの場合では、第１および第２のライゲーションプローブを、それぞれ、前記第１の標的ポリヌクレオチドに結合するようにデザインする。他の場合では、前記第１のライゲーションプローブは、前記第２の標的ポリヌクレオチド（ｐｏｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の配列と異なる配列を有する第１の標的ポリヌクレオチドに結合する。いくつかの場合では、第１のライゲーションプローブを、種内の個体間で保存されるポリヌクレオチド配列に結合するようにデザインする。いくつかの場合では、第１のライゲーションプローブを、２つ以上の異なる種の間で保存されるポリヌクレオチド配列に結合するようにデザインする。いくつかの場合では、ライゲーションプローブは、染色体の非多型領域に結合する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本方法は、複数のライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチドにライゲーションする工程を含む。例えば、本方法は、少なくとも４つのライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチドに結合する工程を含むことができる。他の場合では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、１００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００、または１０，０００，０００個のライゲーションプローブを、本明細書中に提供した方法で使用する。しばしば、１つ以上の前記ライゲーションプローブは、異なるポリヌクレオチド（例えば、異なる染色体、同一染色体内の異なる領域）に結合する。いくつかの場合では、本発明の方法および組成物において、複数の第１のライゲーションプローブ（例えば、標的ライゲーションプローブ）を使用し、複数の第２のライゲーションプローブ（例えば、基準ライゲーションプローブ）を使用する。本方法は、さらに、少なくとも４つのライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチドに結合させ、少なくとも４つのライゲーションプローブを前記第２の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程を含むことができる。いくつかの場合では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、１００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００、または１０，０００，０００個のライゲーションプローブを、前記第１または前記第２の標的ポリヌクレオチドに結合させる。
【００１１】
第１のライゲーションプローブは、前記第１の標的ポリヌクレオチド内の第１の領域に結合する（または結合するようにデザインする）ことができ、前記第２のライゲーションプローブは前記第１の標的ポリヌクレオチド内の第２の領域に結合する（または結合するようにデザインする）ことができ、前記第１および第２の領域は同一の配列を有さない。
【００１２】
しばしば、第１の標的ポリヌクレオチドは、前記第２の標的ポリヌクレオチドと同一ではない。いくつかの場合では、第１の標的ポリヌクレオチドは第２の標的ポリヌクレオチドと同一である。いくつかの例では、前記第１の標的ポリヌクレオチドは試験染色体であり、前記第２の標的ポリヌクレオチドは基準染色体である。試験染色体の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：２１番染色体、１３番染色体、１８番染色体、およびＸ染色体。前記試験染色体はまた、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２番染色体、Ｘ、およびＹ染色体からなる群に由来し得る。第１の標的ポリヌクレオチドは、染色体のセグメント（胎児異数性に関連する（染色体またはセグメントのいずれかが胎児異数性に関連し得る）染色体のセグメントなど）であり得る。
【００１３】
本明細書中に提供した方法および組成物は、しばしば、プローブ自体へのライゲーション、２つのプローブの相互のライゲーション、および／または前記ライゲーション反応のライゲーション産物に関する。前記ライゲーション反応によって前記第１のライゲーションプローブの５’領域を前記第１のライゲーションプローブの３’領域にライゲーションして環状のライゲーションした産物を得ることができる。いくつかの場合では、ライゲーション反応によって前記第１のライゲーションプローブの５’領域を前記第２のライゲーションプローブの３’領域にライゲーションして前記第１および第２のライゲーションプローブの少なくとも一部を含む線状のライゲーションした産物を得る。前記第１のライゲーションプローブの前記５’領域および前記３’領域は、それぞれ、前記第１の標的ポリヌクレオチド内の近接配列に結合する（または結合するようにデザインする）ことができる。前記近接配列は０個のヌクレオチドによって分離される。前記第１のライゲーションプローブの５’領域および３’領域は、前記第１の標的ポリヌクレオチド内の隣接配列に結合するか、結合するようにデザインすることができる。前記隣接配列を、少なくとも１つのヌクレオチドによって分離することができる。いくつかの場合では、隣接配列は、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、または５００個のヌクレオチドのギャップによって分離される。
【００１４】
ライゲーション反応は、さらに、前記第１のライゲーションプローブの（または前記第２のライゲーションプローブの）前記５’領域と前記３’領域の間のギャップ中にヌクレオチドを組み込むためのテンプレート駆動ギャップ充填反応を含むことができる。
【００１５】
ライゲーションプローブは、酵素によって切断可能な部位を含むことができる。例えば、酵素によって切断可能な部位は、１つ以上のウラシルを含むことができる。ウラシルを、いくつかの場合、他のヌクレオチドによって分離することができる。酵素によって切断可能な部位は制限部位を含むことができる。第１のライゲーションプローブは、特異的型（分子反転プローブ、パッドロックプローブ、線状ライゲーションプローブなど）のものであり得る。
【００１６】
本明細書中に提供した方法は、さらに、線状ポリヌクレオチドまたは一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドを除去するための酵素反応を行う工程を含むことができる。例えば、エキソヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＩ、ＩＩ、および／またはＩＩＩ）を、本明細書中に記載の方法で使用することができる。しばしば、エキソヌクレアーゼ処理により、全量または相当量の非結合ライゲーションプローブをサンプル体積から除去する。
【００１７】
本明細書中に提供したプローブを、シグナル伝達因子にコンジュゲートすることができる。前記第１のライゲーションプローブを第１のシグナル伝達因子にコンジュゲートすることができ、第２のライゲーションプローブを第２のシグナル伝達因子にコンジュゲートする。しばしば、複数のかかる第１および第２のライゲーションプローブを本明細書中の方法および組成物で使用し、ここでは、前記プローブを同一のシグナル伝達因子（例えば、同一のフルオロフォア）または異なるシグナル伝達因子（例えば、異なる色調のフルオロフォア）にコンジュゲートする。前記第１のシグナル伝達因子は第１の色調の蛍光マーカーであり得、前記第２のシグナル伝達因子は第２の色調の蛍光マーカーであり得る。
【００１８】
ライゲーションプローブの検出はまた、しばしば、本明細書中に提供した方法中の工程である。本方法は、前記第１のライゲーションプローブの第１のシグナル伝達因子での検出および前記第２のライゲーションプローブの第２のシグナル伝達因子での検出を含むことができる。前記第１のライゲーションプローブは第１の複数のライゲーションプローブを含むことができ、前記複数内の各プローブは第１の染色体の異なる領域へ向けられ、前記第２のライゲーションプローブは第２の複数のライゲーションプローブを含み、前記複数内の各プローブは第２の染色体の異なる領域へ向けられる。いくつかの場合では、前記第１の標的ポリヌクレオチドは試験染色体であり、前記第２の標的ポリヌクレオチドは基準染色体である。いくつかの場合では、前記第１および第２のライゲーションプローブを同一の色素にコンジュゲートする。
【００１９】
本明細書中に提供した方法および組成物はまた、遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出する方法であって、ａ．第１のライゲーションプローブを第１の標的ポリヌクレオチドに結合する工程、ｂ．第２のライゲーションプローブを第２の標的ポリヌクレオチドに結合する工程、ｃ．前記第１および第２のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して１つ以上のライゲーションした産物を得る工程、ｄ．前記１つ以上のライゲーションした産物を連続油相内の２つ以上の水滴に分割する工程、前記１つ以上のライゲーションした産物内の配列を増幅して増幅された産物を得る工程、前記増幅された産物を含む前記２つ以上の水滴の数を決定する工程、およびｇ．前記数に基づいて前記標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程を含む、方法を含むことができる。いくつかの場合では、前記標的ポリヌクレオチドを前記２つ以上の水滴に分割しない。いくつかの場合では、前記標的ポリヌクレオチドを増幅しない。いくつかの場合では、または前記増幅工程または決定工程中に、前記２つ以上の水滴は実質的にインタクトなままである。
【００２０】
いくつかの場合では、前記２つ以上の水滴は平均して１つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法は、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む。前記２つ以上の水滴は４，０００滴超であり得る。いくつかの場合では、前記２つ以上の水滴は、１，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、または５，０００，０００滴を超え得る。
【００２１】
いくつかの場合では、前記液滴は、単一チャンバー中に高液滴数／ｍｌの密度で存在する。密度は１００，０００水滴／ｍｌ超であり得る。単一チャンバー中の液滴の密度の例には、以下が含まれる：１０，０００滴／ｍＬ、１００，０００滴／ｍＬ、２００，０００滴／ｍＬ、３００，０００滴／ｍＬ、４００，０００滴／ｍＬ、５００，０００滴／ｍＬ、６００，０００滴／ｍＬ、７００，０００滴／ｍＬ、８００，０００滴／ｍＬ、９００，０００滴／ｍＬ、または１，０００，０００滴／ｍＬ。本明細書中に提供した任意の方法または組成物で使用した液滴は、単分散液滴であり得る。液滴の直径は、平均して、５０ｎｍと３００μｍとの間であり得る。いくつかの実施形態では、液滴の直径は、平均して、約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、または５００ミクロンであり得る。いくつかの場合では、液滴は、相当数のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたビーズを含まない。
【００２２】
水滴は油流体または油相内に存在し得る。油相は、陰イオン性フルオロ界面活性剤（ｆｌｏｕｒｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）陰イオン性フルオロ界面活性剤のアンモニウム塩（クライトックス（商標）など）を含むことができる。クライトックスは、クライトックスＡＳ、クライトックスＦＳＨ、およびクライトックスＦＳＨのモルホリノ誘導体からなる群から選択され得る。油相はフッ素化油を含むことができる。
【００２３】
本明細書中に提供した方法（例えば、液滴を使用したコピー数の検出）を使用して、１，０００コピー未満の前記第１の標的ポリヌクレオチドを含む遺伝子材料集団内の前記第１の標的ポリヌクレオチドを検出することができる。いくつかの場合では、前記２つ以上の水滴は平均して１つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法は、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む。
【００２４】
液滴は、遺伝子障害に関連する染色体セグメントである第１の標的ポリヌクレオチドを含むことができる。液滴は、特異的型のライゲーションプローブ（例えば、パッドロックプローブ、分子反転プローブ、ライゲーション検出反応（ＬＤＲ）プローブなど）を含むことができる。ライゲーションプローブを、ライゲーションプローブの５’領域をライゲーションプローブの３’領域にライゲーションするライゲーション反応に供することができる。
【００２５】
本明細書中に提供した方法および組成物はまた、胎児の遺伝子状態を検出する方法であって、ａ．標的ポリヌクレオチドを含む母体および胎児の遺伝子材料の混合物を得る工程、ｂ．前記混合物を前記標的ポリヌクレオチドに結合するターゲティングオリゴヌクレオチドと組み合わせる工程、ｃ．前記ターゲティングオリゴヌクレオチドを反応体積に細分割する工程であって、前記反応体積の少なくとも１つが標的ポリヌクレオチドやターゲティングオリゴヌクレオチドを含まない、細分割する工程、ｄ．前記反応体積内で増幅反応を行う工程、ｅ．前記反応体積内の前記標的ポリヌクレオチドまたは前記ターゲティングオリゴヌクレオチドの存在を検出する工程、および
ｆ．前記混合物中の前記標的ポリヌクレオチドの相対レベルを決定して、胎児の遺伝子状態を検出する工程を含む方法に関し得る。
【００２６】
反応体積は連続油相内の水滴であり得る。ターゲティングオリゴヌクレオチドは、１つ以上のプライマー対、ライゲーションプローブ、分子反転プローブ、ライゲーション検出反応（ＬＤＲ）プローブ、パッドロックプローブ、およびその任意の組み合わせを含むことができる。反応体積は、平均して、１コピーを超えるターゲティングオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ）および／または、平均して、１コピーを超える標的ポリヌクレオチドを含むことができる。前記反応体積は、さらに、基準ポリヌクレオチドに対するプライマーを含むことができる。いくつかの場合では、前記反応体積は、さらに、基準ポリヌクレオチドに対するライゲーションプローブを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ライゲーションプローブを前記反応体積内で増幅する。
【００２８】
胎児の遺伝子状態の検出方法で使用される胎児の遺伝子材料は、胎児の遺伝子材料を選択的に予め富化させた細胞サンプルに由来し得る。しかし、いくつかの実施形態では、胎児の遺伝子状態の検出方法で使用される胎児の遺伝子材料は、胎児の遺伝子材料を選択的に予め富化させた細胞サンプルに由来しない。
【００２９】
標的ポリヌクレオチドは、１８、１３、２１番染色体、およびＸ染色体からなる群から選択されるか、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０，１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９，２０、２１、２２番染色体、Ｘ、またはＹ染色体からなる群から選択される染色体内に存在し得る。
【００３０】
いくつかの場合では、前記反応体積は油相内の水滴であり、前記ターゲティングオリゴヌクレオチドはライゲーションプローブであり、前記決定工程は、前記ライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数を基準ポリヌクレオチドに向けられるライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数と比較することを含む。いくつかの場合では、前記基準ポリヌクレオチドは、胎児の遺伝子異常に関連しない染色体領域である。
【００３１】
本明細書中に提供した方法および組成物で使用する場合、前記ターゲティングオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成後のライゲーションの際に環状になるライゲーションプローブであり得る。
【００３２】
本開示はまた、組成物（マイクロカプセル組成物など）ならびに前記マイクロカプセル組成物の使用方法を提供する。いくつかの場合では、組成物はライゲーションされたプローブを含むマイクロカプセルであり、前記マイクロカプセルは、以下：ａ．複数のライゲーションプローブを遺伝子サンプル内の標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させる工程、ｂ．少なくとも１つの前記結合したライゲーションプローブの５’末端を同一または異なる結合したライゲーションプローブの３’末端にライゲーションし、それにより、少なくとも１つのライゲーション産物を得る工程、ｃ．前記少なくとも１つのライゲーション産物を含む水溶液を液滴生成デバイスに導入する工程、ｄ．前記少なくとも１つのライゲーション産物を含む水滴を産生するためのデバイスを使用する工程であって、前記水滴が不混和性流体内に存在する、使用する工程、および
ｅ．前記液滴を、固相外面を含むマイクロカプセルに変換する工程によって得られる。いくつかの場合では、前記変換は、５０℃超での加熱または７０℃超での加熱を含む。不混和性液体（例えば、油）はフッ素化界面活性剤を含むことができる。いくつかの場合では、水相はフッ素化界面活性剤を含む。油はフッ化炭素油であり得る。油相は陰イオン性界面活性剤を含むことができる。油相は、アンモニウムクライトックスを含むことができる。いくつかの場合では、前記マイクロカプセルは、オリゴヌクレオチドに結合したビーズを含まない。前記マイクロカプセルは、７０℃超の温度で実質的にインタクトなままであり得る。マイクロカプセルは、遺伝子障害に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合することができるライゲーションプローブを含むことができる。いくつかの場合では、前記ライゲーションプローブは、胎児異数性に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合することができる。いくつかの場合では、前記遺伝子標的は、２１番染色体、１３番染色体、１８番染色体、およびＸ染色体からなる群から選択される染色体内に存在する。いくつかの場合では、遺伝子標的は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０，１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９，２０、２１、２２番染色体、Ｘ、またはＹ染色体内に存在する。
【００３３】
マイクロカプセルは、１つ以上の前記ライゲーションプローブ（例えば、パッドロックプローブ、分子反転プローブ、ライゲーション検出反応（ＬＤＲ）プローブ、環状プローブなど）を含むことができる。マイクロカプセルは、ライゲーション反応後の事前に環状化したプローブの線状化によって得られる線状プローブを含むことができる。いくつかの場合では、マイクロカプセルは環状化ライゲーションプローブを含む。いくつかの場合では、マイクロカプセルは、ライゲーション検出反応（ＬＤＲ）の線状産物を含む。
【００３４】
本明細書中に提供した組成物および方法はまた、２つ以上の水滴を含む油中水混合物であって、前記２つ以上の水滴のうちの少なくとも１つが第１の標的ポリヌクレオチドに向けられる第１のライゲーションプローブを含み、前記２つ以上の水滴のうちの少なくとも１つが第２の標的ポリヌクレオチドに向けられる第２のライゲーションプローブを含む、油中水混合物に関し得る。前記第１の標的ポリヌクレオチドおよび前記第２の標的ポリヌクレオチドは、同一の分子、または同一の配列もしくは構造物を有する異なる分子、または異なる配列もしくは構造物を有する異なる分子であり得る。いくつかの場合では、前記第１の標的ポリヌクレオチドは、前記第２の標的ポリヌクレオチドの配列と異なる配列を有する。いくつかの例では、前記第１の標的ポリヌクレオチドは、前記第２の標的ポリヌクレオチドと同一の配列を有する。前記第１の標的ポリヌクレオチドはゲノムセグメント内に第１の領域を含むことができ、前記第２の標的ポリヌクレオチドは前記ゲノムセグメント内に第２の領域を含むことができ、前記第１の領域は前記第２の領域と同一の配列を有さない。
【００３５】
いくつかの場合では、前記油中水混合物は、さらに、アンモニウムクライトックス界面活性剤を含む。前記クライトックス界面活性剤は、前記混合物の油相中に少なくとも０．０１％の濃度で存在し得る。
【００３６】
いくつかの場合では、前記混合物は、酵素切断に供した環状プローブの線状化産物であるライゲーションプローブを含む。いくつかの場合では、前記混合物は環状化プローブ自体を含む。いくつかの場合では、ライゲーションプローブは、酵素切断部位を含むことができる（酵素切断がウラシル−Ｎ−グリコシラーゼまたは制限酵素によって触媒される場合など）。
【００３７】
本発明は、母体および胎児の遺伝子材料の混合物中の標的配列の差分検出（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）方法であって、ａ）母体および胎児の遺伝子材料の両方を含む母体組織を得る工程；ｂ）遺伝子材料を個別のサンプルに分配する工程であって、各サンプルが、平均して、サンプルあたり約１つ以下の標的配列を含み、個別のサンプルが既知の標的配列に対するプライマー組および／または既知の基準配列に対する基準プライマー組を含む、分配する工程、ｃ）増幅反応を行う工程、ｄ）個別のサンプル中の標的配列または基準配列の存在を検出する工程、およびｅ）検出された標的配列の検出された基準配列に対する比を比較して、差分量の標的配列を決定する工程を含む、方法を含む。前記方法は、さらに、検出された標的配列の検出された基準配列に対する比を比較して差分量の標的配列を決定する工程であって、検出された標的配列の検出された基準配列に対する相違が胎児の遺伝子異常を示す、決定する工程を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は胎児異数性の検出方法である。いくつかの場合では、標的配列は異数性のマーカーであり、基準配列は母体および胎児の遺伝子材料中の二倍体である。母体組織は、母体の末梢血、血漿、もしくは血清、または本明細書中に記載の他の組織であり得る。いくつかの実施形態では、反応サンプルは、乳濁液中の水相中に存在する。いくつかの場合では、標的配列または基準配列の存在の検出は、さらに、ｉｎ ｓｉｔｕでの蛍光標識を有する核酸とのハイブリッド形成を含む。いくつかの場合では、反応サンプル数は少なくとも約１０，０００である。いくつかの場合では、工程ｂ）〜ｅ）を、異なる標的配列に対するプライマー組を使用して繰り返す。いくつかの場合では、反応体積は、特定の標的配列に対する各プライマー組を有する１つを超えるプライマー組を含む。いくつかの場合では、反応体積は、特定の基準配列に対する各プライマー組を有する１つを超える基準プライマー組を含む。使用することができるプライマー組の例には、ヒト２１番染色体、ヒト１８番染色体、ヒト１３番染色体、またはヒトＸ染色体に特異的なプライマー組が含まれる。いくつかの場合では、異数性は、検出された標的配列の基準配列に対する比が１を超える場合に検出される。いくつかの場合では、異数性は、検出された標的配列の基準配列に対する比が１未満の場合に検出される。いくつかの場合では、標的配列は、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８遺伝子）、βグロビン、血色素症、Ｇ６ＰＤ、神経線維腫症、ＧＡＰＤＨ、βアミロイド、またはピルビン酸キナーゼ遺伝子の少なくとも一部である。
参照による引用
本明細書中で言及された全ての刊行物および特許出願は、その全体および各刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参考として援用されることが示されるのと同一の範囲に参考として援用される。
【００３８】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲中に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点は、本発明の原理を利用した例示的実施形態を説明している以下の詳細な説明および添付の図面を参照してさらに理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、液滴デジタルＰＣＲおよびライゲーションプローブの使用によって患者サンプル中のコピー数変動の検出のために取ることができる工程を示した概略図である。
【図２】図２は、サンプル中の染色体（またはその一部）の数の変化を検出するために従うことができる工程の例の略図である。
【図３】図３は、例示的な胎児異数性の診断方法のワークフローを示す。
【図４】図４は、２つの遺伝子標的を検出するための分子反転プローブ（ＭＩＰ）の使用の略図である。
【図５】図５は、遺伝子標的の検出感度を増大させるためのＭＩＰアプローチの多重化を示す。
【図６】図６は、切断せずにユニバーサルプライマーおよびユニバーサルプローブを使用した液滴中の核酸検出のための２色系を示す。
【図７】図７は、ライゲーション検出反応（ＬＤＲ）およびその後の液滴中でのＰＣＲを使用した２つの色調を用いた２つの遺伝子標的検出のためのスキームを示す。
【図８】図８は、検出感度を増強するための液滴中のＬＤＲ−ＰＣＲのための多重化オリゴヌクレオチドの使用を示す。
【図９】図９は、本明細書中に記載の方法および組成物によって得られるデータまたは結果の表示、保存、検索、または計算に有用なコンピュータを示す。
【図１０】図１０は、試験サンプルについてのテンプレートＤＮＡの投入コピー数と陽性液滴数（またはカウント）との間の相関関係および３重ＭＩＰ（上のパネル）と比較して１２重ＭＩＰ（下のパネル）を使用した場合の感度の増加を示す。
【図１１】図１１は、基準サンプルについての陽性液滴数（またはカウント）対テンプレートコピー数を示す。
【図１２】図１２は、異なるテンプレートコピー数および異なるＭＩＰ多重化レベルでのハイブリッド形成効率を示す。
【図１３】図１３は、１番染色体内の異なる領域に向けられる２４個のＭＩＰを示す（配列番号１〜２４）。
【図１４】図１４は、２１番染色体内の異なる領域に向けられる２４個のＭＩＰを示す（配列番号２５〜４８）。
【図１５】図１５は、１番染色体内の異なる領域に向けられるＭＩＰの３重組（配列番号４９〜５１）および１番染色体内の異なる領域に向けられるＭＩＰの１２重組（配列番号５２〜６３）を示す。
【図１６】図１６は、２１番染色体内の異なる領域に向けられるＭＩＰの３重組（配列番号６４〜６６）および２１番染色体内の異なる領域に向けられるＭＩＰの１２重組（配列番号６７〜７８）を示す。
【図１７】図１７は、ＭＩＰ検出のための例示的なユニバーサルプライマーおよびプローブを示す（配列番号７９〜８２）。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
総括
本開示は、生物学的サンプル中の遺伝子変動の検出のための方法および組成物を提供する。いくつかの場合では、本開示は、生物学的サンプル内の標的ポリヌクレオチド（例えば、染色体、染色体フラグメント、遺伝子など）のコピー数の検出のための方法および組成物を提供する。いくつかの場合では、生物学的サンプル内の遺伝子の変異および／または一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するための方法および組成物も提供する。
【００４１】
本開示はまた、母体組織由来の生物学的サンプルにおける胎児異数性または他の遺伝子異常の検出のための組成物および方法を提供する。しばしば、かかる生物学的サンプルは、母体および胎児の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の混合物を含む。異数性は染色体異常であり、染色体またはそのフラグメントもしくはその一部のコピー数の逸脱をいう。本明細書中に記載の方法および材料は、母体および胎児の両方由来のＤＮＡ（および／またはＤＮＡフラグメント）の混合物を含む組織サンプル（血液（全血または末梢血）、血清、または血漿など）中に含まれる多数の核酸の分析技術に適用され、胎児異数性を示し得る標的ＤＮＡレベルと基準ＤＮＡレベルとの間の小さな相違を検出可能である。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、コピー数変動（ＣＮＶ）は、遺伝子材料セグメントの増加または損失をいう。ヒトには多数のＣＮＶ領域が存在し、一般集団の間で広範な遺伝的多様性が存在する。ＣＮＶはまた、多数のヒト遺伝子障害で役割を果たす。本方法は、転座、付加、増幅、転換、反転、異数性、倍数性、モノソミー、トリソミー、２１トリソミー、１３トリソミー、１４トリソミー、１５トリソミー、１６トリソミー、１８トリソミー、２２トリソミー、三倍性、四倍性、および性染色体異常（ＸＯ、ＸＸＹ、ＸＹＹ、およびＸＸＸが含まれるが、これらに限定されない）の検出に特に有用である。本方法はまた、胎児ＤＮＡ配列の決定および胎児ＤＮＡ内の変異の同定のための非侵襲的技術を提供する。
【００４３】
本開示は、例えば、デジタルＰＣＲ（例えば、液滴デジタルＰＣＲ）および標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成した場合に直接または間接的に共にライゲーションされ得る特殊化プローブ（しばしば、本明細書中でライゲーションプローブ（例えば、分子反転プローブおよび他のプローブ）という）の使用によるＣＮＶ、遺伝子変動、および／または胎児異数性の検出手段を提供する。本明細書中に提供した方法では、標的ヌクレオチドまたは前記標的ヌクレオチドのプローブを含むサンプルを、複数の区画（例えば、液滴）に分割する。次いで、区画（例えば、液滴）をサーモサイクリング反応に供して標的ヌクレオチドまたは前記標的ヌクレオチドのプローブのいずれかを含む区画内のＰＣＲ反応を増強し、それにより、増幅された産物（例えば、増幅されたＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸）を得る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、単一プローブを、標的ポリヌクレオチド（例えば、分子反転プローブ）へのハイブリッド形成後にその末端にライゲーションする。他の実施形態では、ライゲーションプローブは、標的ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成後に相互にライゲーションすることができる２つの個別の分子を含む。
【００４５】
本明細書中に記載の組成物には、核酸プローブ型（例えば、分子反転プローブ、ライゲーションプローブなど）を含む２つ以上の不混和性流体（油および水など）の混合物を含む組成物が含まれる。他の場合では、本明細書中に記載の組成物は、核酸プローブ型（例えば、分子反転プローブ、ライゲーションプローブなど）を含むマイクロカプセルを含む。かかるマイクロカプセルは、特に高温での癒着に抵抗することができ、それゆえ、非常に高密度（例えば、単位体積あたりの反応数）で増幅反応を起こすことができる。
【００４６】
図１は、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）およびライゲーションプローブの使用によって患者由来のサンプル中のコピー数変動を検出するために取ることができる工程を示す概略図を提供する。ゲノム核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）のサンプルを、患者から得たサンプル（１０１）から抽出する（１０１）。プローブ（本明細書中に記載のライゲーションプローブなど）を、患者サンプル内の標的ヌクレオチド配列へハイブリッド形成させ（１０３）、ハイブリッド形成後、プローブを共にライゲーションし（１０４）、次いで、サンプルを、必要に応じて、酵素処理（例えば、エキソヌクレアーゼ）に供してゲノム核酸および残存する非ライゲーションプローブを分解する（１０５）。次いで、ＰＣＲ反応成分（例えば、プライマー、蛍光検出プローブ、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰなど）をサンプルに添加し（１０６）、次いで、複数の液滴に分割する（１０７）。液滴形成後、液滴をサーモサイクリングに供してサンプル内のプローブを増幅させる（１０８）。次いで、陽性および陰性の液滴数を決定し（１０９）、これを使用して標的ポリヌクレオチドの相対コピー数を決定する。図１は分割手段である液滴を示しているが、当該分野で公知の他の分割手段を同様に使用することができる（例えば、ナノ流体デバイスまたはマイクロ流体デバイス内のウェルの間での分割など）。また、図１はコピー数変動の検出を示しているが、他の遺伝子状態を同様に検出することができる。
【００４７】
サンプル内のコピー数の検出は、染色体異常（異数性が含まれる）の検出を含むことができる。図２は、母体サンプル中の胎児異数性を同定するために取ることができる工程の概要である。出発組織サンプル（２０１）は、母体および胎児のＤＮＡの混合物を含む。ＤＮＡを抽出し、１番染色体（２０２）（基準染色体）および２１番染色体（試験染色体）（２０３）のプローブと混合する。プローブを遺伝子標的に結合させ、次いで、複数の区画（２０４）に分割する。区画内のプローブを検出し、試験染色体（例えば、２１番染色体）を含む区画の数を、基準染色体（例えば、１番染色体）を含む区画の数と比較し（２０５）、その後、２１番染色体の相対コピー数を計算する。
【００４８】
本開示は、母体組織（例えば、血液、血清、または血漿）の遺伝子状態についての分析であって、母体組織中の胎児および母体のＤＮＡの混合物を胎児変異または遺伝子異常を母体ＤＮＡのバックグラウンドと区別するために分析する、分析を提供する。工程の組み合わせを使用して、母体および胎児由来のＤＮＡ（またはＲＮＡ）を含むＤＮＡサンプルを分析して無細胞の末梢循環ＤＮＡ配列の相対濃度を測定することができる。かかる濃度の相違を使用して、胎児ＤＮＡを示すＤＮＡの微量画分中に存在する遺伝子状態を区別することができる。
【００４９】
本方法は、デジタル分析を使用することができる。このデジタル分析では、サンプル中のＤＮＡを複数のライゲーションしたプローブに変換し、これを反応体積中の名目上の単一のライゲーションしたプローブ分子に分割してサンプル混合物を作製する。例えば、反応体積は、液滴（不混和性液体中に分散した水層の液滴（米国特許第７，０４１，４８１号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のものなど）など）であり得る。各反応体積は、１つ未満の標的（例えば、標的ポリヌクレオチド、ターゲティングプローブ、または他の標的分子）または１つ以上の標的（例えば、標的ポリヌクレオチド、ターゲティングプローブ、または他のターゲティング分子）中に分布している可能性がある。標的分子を、各反応体積中で、好ましくは、増幅される標的配列として検出することができ、この検出は、標的配列の出発コピー数（すなわち、０、１、２、３など）の量子化（または定量化）を含むことができる。基準配列を使用して、標的配列中の異常な増加（例えば、トリソミー）を区別することができる。したがって、胎児異数性の存在を示す基準配列に対する標的配列の差分検出が存在し得る。基準配列が母体配列である必要はない。
【００５０】
さらに、本方法は、直接または間接的な胎児の遺伝子材料を捕捉および検出のための広範なアプローチを使用することができる。本明細書中に記載の１つの方法は、ゲノムＤＮＡに結合させるためのプライマー対の代わりの分子反転プローブ（ＭＩＰ）（または他のオリゴヌクレオチドプローブ）の使用の組み合わせ、その後のＭＩＰプローブを標的ポリヌクレオチド内の相補配列に結合させるためのハイブリッド形成工程、結合したプローブを環状化するためのライゲーション反応工程、残存する非環状化ＭＩＰプローブを消化するためのエキソヌクレアーゼ処理工程、酵素（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼなど）を使用して環状化したプローブを線状化する必要に応じた処理工程；環状化したプローブまたは線状化したプローブ（前は環状であった）を２つ以上の区分（例えば、液滴）に分割または細分割する分割工程を含む工程、その後の液滴デジタルＰＣＲによるオリゴヌクレオチドプローブに固有の配列の増幅を含む増幅工程を含む。
【００５１】
いくつかの場合では、多重化ＭＩＰ（または他のオリゴヌクレオチド）を、本明細書中で、検出感度を改善するために使用する。例えば、かかる各ＭＩＰが同一染色体（例えば、２１番染色体）上の異なる配列に結合する２つ以上のＭＩＰ群を使用することができる。いくつかの場合では、例えば、標的配列および基準配列を認識する複数のＭＩＰを、異なる色調のフルオロフォアを使用して、増幅中に差分的に検出することができる。いくつかの場合では、単一の線状プローブのゲノムＤＮＡへの結合およびその後のライゲーション反応により、環状分子が産生される。他の場合では、２つの線状プローブがゲノムＤＮＡの近接領域に結合し、その後のライゲーション反応によってライゲーション検出反応（ＬＤＲ）で検出することができるライゲーション依存性分子が産生される。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、ライゲーションという用語は、２つ以上の核酸（例えば、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド）の間の共有結合または連結をいう。しばしば、ライゲーションは、ポリヌクレオチド（例えば、ライゲーションプローブ）の５’末端の別のポリヌクレオチド（例えば、ライゲーションプローブ）または同一ポリヌクレオチドの３’末端へのライゲーションを含むことができる。結合または連結の性質は大きく異なり得、ライゲーションを酵素的または化学的に行うことができる。ライゲーションを通常は酵素的に行って、一方のオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの５’炭素と別のオリゴヌクレオチドの３’炭素との間にホスホジエステル結合を形成する。種々の結合駆動ライゲーション反応は、以下のリファレンスに記載されている：Ｗｈｉｔｅｌｙ ｅｔ ａｌ，米国特許第４，８８３，７５０号；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，米国特許第５，４７６，９３０号；Ｆｕｎｇ ｅｔ ａｌ，米国特許第５，５９３，８２６号；Ｋｏｏｌ，米国特許第５，４２６，１８０号。
【００５３】
本開示は、望ましくない材料（非結合ゲノムＤＮＡおよび非ライゲーションプローブが含まれる）の除去および望ましい材料（ライゲーション産物が含まれる）の選択または単離のための方法および組成物を提供する。ライゲーション産物が環状であるいくつかの場合（ＭＩＰを含む反応など）、エキソヌクレアーゼ処理を使用して非結合ゲノムＤＮＡおよび非ライゲーションプローブを除去する。いくつかの場合では、次いで、環状ライゲーション産物を、プローブ中のウラシル残基を脱プリン化する酵素（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼなど）での処理を使用して放出させる。これらの場合、加熱の際に脱塩基部位が切断され、線状化したライゲーション産物が得られる。
【００５４】
種々の方法を使用して検出することができる。いくつかの場合では、ライゲーション産物を、単一分子内の蛍光剤−消光剤対を含む少なくとも１つの検出プローブの伸長によってＤＮＡ合成が進行する液滴デジタルＰＣＲ反応を使用して検出する。蛍光剤は、光または他の電磁放射線の吸収後に検出可能な光を放射する分子（例えば、フルオロフォア）をいう。消光剤は、物質の蛍光強度を減少させる分子をいい、蛍光剤−消光剤対の場合、消光剤は、放射する検出可能な光の吸収によって共有結合した蛍光剤の検出を減少させることができる。ＤＮＡ合成過程中、ポリメラーゼ酵素（Ｔａｑポリメラーゼなど）の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって検出プローブが切断され、それにより、消光剤から蛍光剤が放出される。種々の蛍光検出法が放出された蛍光剤を検出することができるが、蛍光剤−消光剤対を検出できない。いくつかの実施形態では、ライゲーション産物の検出により、胎児または母体の遺伝子材料中の特異的配列（標的配列または基準配列など）の存在が定量的に測定される。
【００５５】
本開示は、さらに、サンプルが液滴デジタルＰＣＲを使用して検出される任意の生物由来のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡを含み得る、目的の核酸分子の検出のための組成物および方法を提供することができる。いくつかの場合では、サンプルを、ライゲーション反応を使用して単離し、いくつかの場合、その後にエキソヌクレアーゼ処理を行って望ましくない材料を除去する。いくつかの実施形態では、液滴が乳濁液中の水相に懸濁されたＰＣＲ用試薬およびＰＣＲ反応によって検出可能な１つ以上のライゲーション産物を含む、液滴デジタルＰＣＲの蛍光モニタリングによって検出する。
【００５６】
組織の取得および調製
本開示の方法および組成物は、胎児または母体の遺伝子材料を得るための手段を提供する。本方法および組成物は、侵襲的な外科手順、羊水穿刺、絨毛膜絨毛サンプリングなどを必要としない標的ポリヌクレオチドのコピー数の相違の検出を提供する。他の場合では、本方法および組成物は、より侵襲的な試験（外科的手順など）に付加するか、補助するか、予備工程であるか、または付随して使用すべきサンプル（例えば、血液サンプル）由来の標的ポリヌクレオチドのコピー数の相違の検出を提供する。しばしば、胎児／母体遺伝子材料を、採血または本明細書中に提供した他の方法によって得る。いくつかの好ましい実施形態では、出発物質は、母体血漿または末梢血（母体の末梢静脈血など）である。末梢血球の特定の細胞型（例えば、単核球、赤血球、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞など）を富化させることができる。末梢血球の特定の細胞型（例えば、単核球、赤血球、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞）を選択的に枯渇させることもできる。出発物質はまた、骨髄由来単核球であり得る。出発物質はまた、胎盤（例えば、胎盤細胞）または臍帯（例えば、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈平滑筋細胞、臍帯血細胞）から直接抽出した組織を含むことができる。出発物質はまた、例えば、胎児組織（例えば、胎児の線維芽細胞または血球）の形態で胎児に直接由来し得る。出発物質はまた、乳児または小児（新生児組織が含まれる）に由来し得る。
【００５７】
この出発物質を、いくつかの場合、病院、研究所、臨床検査室、または医学研究所から入手することができる。いくつかの実施形態では、サンプルを、少なくとも妊娠４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６週の被験体（例えば、妊婦）から取る。いくつかの実施形態では、被験体は、遺伝的疾患を罹患しているか、遺伝的疾患のキャリアであるか、遺伝的疾患の発症または遺伝のリスクがあり、遺伝的疾患は、遺伝子変動（変異、挿入、付加、欠失、転座、点変異、トリヌクレオチド反復障害、および／または一塩基多型（ＳＮＰ）など）に関連し得る任意の疾患である。他の実施形態では、妊娠可能年齢の女性患者からサンプルを採取し、いくつかの場合では、女性患者は、妊娠していないか、妊娠状態であるか未知である。さらに他の場合では、被験体は、男性患者、妊婦の夫、または特定の遺伝子異常のリスクがあるか、診断されたか、有する男性患者である。いくつかの場合では、女性患者は、遺伝的疾患または遺伝子変動に苦しんでいるか、キャリアであるか、特定の遺伝子異常のリスクがあるか、診断されたか、有することが公知である。いくつかの場合では、遺伝的疾患または遺伝子変動に関する女性患者の状態は未知であってよい。さらなる実施形態では、遺伝子配列のコピー数変動に関して公知または未知の状態の任意の小児または成人の患者からサンプルを採取する。いくつかの場合では、小児または成人の患者は、遺伝的疾患または遺伝子変動に苦しんでいるか、キャリアであることが公知である。
【００５８】
本明細書中に提供した方法および組成物の利点は、妊娠期間の比較的早期に、および母体血漿中の胎児核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の総濃度が低い段階での胎児核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の検出が可能な点である。出発物質の胎児濃度は、母体サンプル中の総母体ゲノムＤＮＡ負荷量の少なくとも０．１％、０．２％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２０．５％、２１％、２１．５％、２２％、２２．５％、２３％、２３．５％、２４％、２４．５％、または２５％、好ましくは総母体ゲノムＤＮＡ負荷量の少なくとも３％であり得る。いくつかの場合では、胎児ＤＮＡ濃度は、母体サンプル中の総母体ゲノムＤＮＡ負荷量の約０．１％、０．２％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２０．５％、２１％、２１．５％、２２％、２２．５％、２３％、２３．５％、２４％、２４．５％、または２５％未満であり得る。出発物質が１つの量（Ｈ）で存在するポリヌクレオチド型（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）およびＨと比較して少量で存在するポリヌクレオチド型（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を含む場合、出発物質のＬ濃度は、サンプル中の総Ｈ濃度の少なくとも０．１％、０．２％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２０．５％、２１％、２１．５％、２２％、２２．５％、２３％、２３．５％、２４％、２４．５％、または２５％、好ましくはＨの少なくとも３％であり得る。いくつかの場合では、Ｌは、サンプル中の総Ｈ量の約０．１％、０．２％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２０．５％、２１％、２１．５％、２２％、２２．５％、２３％、２３．５％、２４％、２４．５％、または２５％未満であり得る。
【００５９】
いくつかの場合では、試験用の十分な核酸を得るために、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍＬを採血する。この血液量から、総ＤＮＡの少なくとも１，０００ゲノム当量（ＧＥ）を得ることができる。総ＤＮＡは、妊娠初期でおよそ１，０００ＧＥ／ｍＬ母体血漿および総血漿ＤＮＡの約３．５％の胎児ＤＮＡ濃度で存在する。しかし、あまり統計的有意性を必要としない遺伝子スクリーニングにはより少なく採血することができるか、またはＤＮＡサンプルは胎児ＤＮＡについて富化する。また、胎児ＤＮＡ濃度は、在胎期間に応じて変動し得る。いくつかの実施形態では、胎児のＤＮＡまたはＲＮＡを、下記のように、無核成人赤血球と異なる赤血球、特に胎児有核赤血球の単離によって富化することができる。他の実施形態では、赤血球を母体血サンプルから取り出し、遺伝子材料を母体血漿から得ることができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、出発物質は、固形組織（非限定的な例には、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節（扁桃腺が含まれる）、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道、および胃が含まれる）を含む組織サンプルであり得る。他の実施形態では、出発物質は、核酸を含む細胞（結合組織、筋組織、神経組織、および上皮細胞、特に露出した上皮細胞（皮膚細胞および毛髪細胞など）が含まれる）であり得る。さらに他の実施形態では、出発物質は、任意の生物由来の核酸を含むサンプルであり得る。本明細書中に概説のように、出発物質から遺伝子材料を得て液滴デジタルＰＣＲによって検出することができる。
【００６１】
胎児材料の富化
胎児細胞を、胎児細胞および母体細胞の混合物を含む母体サンプルから富化することができる。かかる富化は、いくつかの場合では、胎児濃度が総母体ゲノムＤＮＡ（またはＲＮＡ）負荷量の少なくとも０．１％、０．２％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２０．５％、２１％、２１．５％、２２％、２２．５％、２３％、２３．５％、２４％、２４．５％、または２５％である場合に起こり得る。かかる富化は、いくつかの場合では、胎児濃度が総母体ゲノムＤＮＡ（またはＲＮＡ）負荷量の０．１％、０．２％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２０．５％、２１％、２１．５％、２２％、２２．５％、２３％、２３．５％、２４％、２４．５％、または２５％超である場合に起こり得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、胎児細胞をアフィニティ法によって富化する。この方法は、非胎児細胞と比較して胎児細胞に対してより高い親和性を有する分子（胎児特異的抗体など）とコンジュゲートした固体構造物上の胎児細胞集団（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を含むことができる。固体構造物の非限定的な例には、ポリマー表面、磁性ビーズ、ポリマービーズ、およびマイクロ流体チャネルの表面が含まれる。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルの胎児細胞を、本明細書中に記載の方法または組成物の前にもその一部としても富化しない。いくつかの実施形態では、胎児細胞をアフィニティ法によって富化しない。いくつかの実施形態では、胎児細胞を、胎児特異的抗体の使用によって富化しない。いくつかの場合では、胎児細胞を、マイクロ流体デバイスへのサンプルの導入によって富化しない。
【００６３】
フローサイトメトリー技術を使用して、胎児細胞を富化することもできる（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ７６：１４５３−１４５５（１９７９）；Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８７：３２７９−３２８３（１９９０）；Ｂｒｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ １１：７８７−７９８（１９９１））。米国特許第５，４３２，０５４号はまた、ポリエチレン製の広い上部と狭い毛管下部を有する管を使用した胎児有核赤血球の分離技術を記載している。いくつかの場合では、本方法または組成物を使用して分析したサンプル中の胎児細胞を富化するためにフローサイトメトリーを使用しない。可変速度プログラムを使用した遠心分離により、分子密度に基づいて毛管中に赤血球が積み重なる。低密度赤血球（胎児赤血球が含まれる）を含む密度画分を回収し、次いで、母体赤血球が優先的に破壊されるように差分的に溶血させる。高浸透圧媒体における密度勾配を使用して赤血球を分離し、この時点でリンパ球由来の胎児赤血球を富化し、母体細胞を破壊する。高張液の使用によって赤血球が収縮し、その密度が増加し、より高密度のリンパ球からの精製が容易になる。胎児細胞を単離した後、本明細書中に詳述した標準的技術を使用して、胎児ＤＮＡを精製することができる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２９３：８４３−８４９に記載のように、母体血を総ＤＮＡ中の胎児ＤＮＡ濃度が富化されるように処理することができる。簡潔に述べれば、真空ポンプと組み合わせた市販のカラムテクノロジー（例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｈｉｇｈ ＰｕｒｅテンプレートＤＮＡ精製キット；Ｒｏｃｈｅ）を使用して、循環ＤＮＡを５〜１０ｍＬの母体血漿から抽出することができる。抽出後、ＤＮＡをアガロースゲル（１％）電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分離することができ、サイズがおよそ３００ヌクレオチドの循環ＤＮＡを含むゲル画分を慎重に切り出すことができる。抽出キット（ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ）の使用によってＤＮＡをこのゲルスライスから抽出し、最終体積が４０μＬの滅菌１０ｍＭ ＴＲＩＳ−塩酸（ｐＨ８．０）（Ｒｏｃｈｅ）に溶出することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、遊離胎児ＤＮＡを、全細胞を含む母体血サンプルから単離する。好ましい実施形態では、遊離胎児ＤＮＡを母体血漿サンプルから単離する。いくつかの実施形態では、血漿サンプルは、インタクトな細胞の少なくとも５０％、７５％、または９５％を含まない。いくつかの実施形態では、血漿は、インタクトな細胞を完全に含まない。
【００６６】
２００４年７月１５日公開で発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」であるＤｈａｌｌａｎ，Ｒａｖｉｎｄｅｒ Ｓに対する米国特許出願公開第２００４０１３７４７０号は、血液を９ｍｌのＥＤＴＡを含むＶａｃｕｅｔｔｅ管（カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に回収し、ホルムアルデヒド（４％ｗ／ｖ）を含む０．２２５ｍｌの１０％中性緩衝液を各管に添加し、各管を穏やかに反転させるという胎児ＤＮＡの富化手順を記載している。処理の準備が整うまで管を４℃で保存する。細胞溶解を妨害するか細胞膜を安定化する薬剤を管に添加することができる（ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒドの誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒドの誘導体、架橋剤、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加またはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、分解性架橋剤などが含まれるが、これらに限定されない）。任意の濃度の細胞膜を安定化させるか細胞溶解を妨害する薬剤を添加することができる。好ましい実施形態では、細胞膜を安定化させるか細胞溶解を妨害する薬剤を、その後の反応を妨害も遅延もしない濃度で添加する。
【００６７】
別の実施形態では、サンプル中の母体ＤＮＡ量を実質的に減少させる技術および／またはプロトコール（遠心機のブレーキ出力を０に設定した（遠心機のブレーキを使用しない）サンプルの遠心分離、「バフィコート」の妨害が最小であるか全くない新規の管への上清の移動、および上清の一部のみの新規の管への移動が含まれるが、これらに限定されない）を使用してＤＮＡを単離する。好ましい実施形態では、遠心機の加速力および制動力の両方を０に設定する。別の実施形態では、サンプル中の母体ＤＮＡ量を実質的に減少させる技術および／またはプロトコール（遠心機の加速力を０に設定したサンプルの遠心分離、「バフィコート」の妨害が最小であるか全くない新規の管への上清の移動、および上清の一部のみの新規の管への移動が含まれるが、これらに限定されない）を使用してＤＮＡを単離する。別の実施形態では、「バフィコート」を、任意の適用可能な方法を使用して（「バフィコート」を取り出すためのシリンジまたはニードルの使用が含まれるが、これらに限定されない）上清の取り出し前に管から取り出す。別の実施形態では、遠心機の制動力を、最大制動力の１〜５％、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％を含むが、これらに限定されないパーセンテージに設定する。
【００６８】
別の実施形態では、遠心機の加速力を、最大加速力の１〜５％、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％を含むが、これらに限定されないパーセンテージに設定する。別の実施形態では、本発明は、遊離胎児ＤＮＡおよび遊離母体ＤＮＡを含む組成物であって、この組成物は、遊離胎児ＤＮＡの遊離母体ＤＮＡに対する関係（少なくとも約１５％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約２０％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約３０％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約４０％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約５０％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約６０％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約７０％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約８０％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約９０％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約９１％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約９２％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約９３％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約９４％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約９５％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約９６％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約９７％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約９８％の遊離胎児ＤＮＡ、少なくとも約９９％の遊離胎児ＤＮＡ、および少なくとも約９９．５％の遊離胎児ＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない）を含む、組成物に関する。
【００６９】
さらに、細胞膜を安定化させる薬剤（アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノエタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度のマグネシウム、ビタミンＥ、およびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ビモクロモル、スクロース、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン，異性体Ａホパンテトラルフェニルアセタート、異性体Ｂホパンテトラルフェニルアセタート、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、コレステロールヘミスクシナート、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ペルフトラン、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、二ナトリウムクロモグリカート（ｃｒｏｍｇｌｙｃａｔｅ）、ネドクロミルナトリウム、フェニロイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロクサマー（ｐｏｌａｘａｍｅｒ）１８８が含まれるが、これらに限定されない）を母体血に添加して母体細胞溶解を減少させることができる。別の実施形態では、細胞の構造完全性を保存するか安定化させる薬剤を使用して、細胞溶解量を減少させることができる。別の実施形態では、母体血中の遊離母体ＤＮＡ量を減少させる任意のプロトコールを、サンプルを得る前に使用することができる。別の実施形態では、サンプルを得る前に、妊婦は、０〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜１２０、１２０〜１８０、１８０〜２４０、２４０〜３００、３００〜３６０、３６０〜４２０、４２０〜４８０、４８０〜５４０、５４０〜６００、６００〜６６０、６６０〜７２０、７２０〜７８０、７８０〜８４０、８４０〜９００、９００〜１２００、１２００〜１５００、１５００〜１８００、１８００〜２１００、２１００〜２４００、２４００〜２７００、２７００〜３０００、３０００〜３３００、３０００〜３６００、３６００〜３９００、３９００〜４２００、４２００〜４５００分間、および４５００分間超が含まれるが、これらに限定されない期間、身体活動を行わずに休憩する。別の実施形態では、妊婦がリラックスした状態に到達した後に、妊婦からサンプルを得る。サンプルを得る前の休憩期間により、サンプル中の母体核酸量を減少させることができる。別の実施形態では、午前中に（４〜５ａｍ、５〜６ａｍ、６〜７ａｍ、７〜８ａｍ、８〜９ａｍ、９〜１０ａｍ、１０〜１１ａｍ、および１１〜１２ａｍが含まれるが、これらに限定されない）、妊婦からサンプルを得る。別の実施形態では、妊婦が、０〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、９〜１０、１０〜１１、１１〜１２時間、または１２時間超が含まれるが、これらに限定されない期間、眠った後に、妊婦からサンプルを得る。別の実施形態では、サンプルを得る前に、妊婦は一定期間運動し、その後に休憩する。別の実施形態では、運動期間には、０〜１５、１５〜３０、３０〜４５、４５〜６０、６０〜１２０、１２０〜２４０分間、または２４０分間超が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、ＤＮＡの破壊を防止する薬剤（ＤＮアーゼインヒビター、塩化亜鉛、エチレンジアミン四酢酸、グアニジン−ＨＣ１、グアニジンイソチオシアナート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびドデシル硫酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない）を、血液サンプルに添加することができる。別の実施形態では、胎児ＤＮＡを胎児細胞から得る。前記胎児細胞を、供給源（母体血、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚組織、および母体の子宮頸部または膣から得た粘膜が含まれるが、これらに限定されない）から単離することができる。
【００７０】
別の実施形態では、細胞溶解量を減少させる任意の採血の技術、方法、プロトコール、または装置を使用することができる（ラージボアニードル、より短い針、層流を増加させるためのニードルコーティング（例えば、テフロン（登録商標））、層流を増加させるための針の斜端の改変、または血流の速度を減少させる技術が含まれるが、これらに限定されない）。胎児細胞は、母体の免疫系によって母体血中で破壊される可能性がある。しかし、母体細胞溶解の大部分は採血または血液サンプルの処理の結果として起こる可能性がある。したがって、細胞溶解を防止または減少させる方法は、サンプル中の母体ＤＮＡ量を減少させ、遊離胎児ＤＮＡの相対比率を増加させる。
【００７１】
この試薬の使用プロトコールの例を以下に示す。処理するまで血液を４℃で保存する。制動力を０に設定した遠心機にて管を１０００ｒｐｍで１０分間回転する。管を１０００ｒｐｍで１０分間という第２の時間で回転する。各サンプルの上清（血漿）を新規の管に移し、ブレーキを０に設定して３０００ｒｐｍで１０分間回転する。上清を新規の管に移し、−８０℃で保存する。母体細胞を含む約２ミリリットルのバフィコートを個別の管に入れ、−８０℃で保存する。
【００７２】
ＤＮＡまたはＲＮＡの抽出
ゲノムＤＮＡを、当該分野で公知の技術を使用して（血球からのＤＮＡの精製のためのＱｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉキットの使用など）血漿（例えば、母体血漿）から単離することができる。ＤＮＡを、１００μｌの蒸留水中で溶離することができる。Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉキットも使用して、バフィコート中に含まれる母体細胞からＤＮＡを単離する。かかる目的のためにＱＩＡａｍｐ循環核酸キットも使用することができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｑｉａａｍｐｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｋｉｔ．ａｓｐｘを参照のこと）。
【００７３】
ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）の抽出方法はまた、液体抽出（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ、ＤＮＡｚｏｌ）技術の使用を含むことができる。
【００７４】
例えば、出発サンプル（例えば、血液または血漿）の出発体積は１５〜３０ｍｌであり得、これから約１００〜２００μｌのＤＮＡまたは他のポリヌクレオチドを抽出することができる。次いで、２００μｌの抽出サンプルのＤＮＡを、より小さな体積（例えば、５μｌ、１０μｌ）の最終サンプルに変換する（または濃縮する）ことができる。いくつかの場合では、出発サンプルの体積は、最終サンプルの体積の２、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、または１，０００，０００倍超であり得る。最終サンプルはまた、液滴生成用デバイスに導入されるサンプルであり得る。
【００７５】
最終サンプルは、１〜２０μｌの体積であり得る。いくつかの実施形態では、最終サンプルは、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、または１００μｌを超える。いくつかの実施形態では、最終サンプルは、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、または１００μｌ未満である。いくつかの実施形態では、最終サンプルは、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、または１００ｎｌを超える。いくつかの実施形態では、最終サンプルは、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、または１００ｎｌ未満である。いくつかの実施形態では、最終サンプルは、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、または１００ｐｌを超える。いくつかの実施形態では、最終サンプルは、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、または１００ｐｌ未満である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡを、公知の方法（遠心分離および種々の酵素インヒビター（例えば、ＤＮアーゼ用）の使用が含まれる）によって濃縮することができる。ＤＮＡを選択膜（例えば、シリカ）に結合させてＤＮＡを夾雑物から分離することができる。１０００、５００、４００、３００、２００、または１００塩基対長未満である血漿中に循環するフラグメントについてＤＮＡを富化させることもできる。このサイズ選択を、ＤＮＡサイズ分離媒体（電気泳動ゲルまたはクロマトグラフィ材料（Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１０６１−６）、ゲル濾過クロマトグラフィ、ＴＳＫゲル（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、９５：８３−８６）など）にて行うことができる。いくつかの場合では、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を、選択的に沈殿させるか、濃縮するか（例えば、サンプルを蒸発に供することができる）、固相媒体を使用して選択的に捕捉することができる。沈殿後、ＤＮＡまたは他のポリヌクレオチドを、少しのの体積に再構成または溶解することができる。少しの体積であることにより、プローブの標的ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成が可能であり得るか、ハイブリッド形成の改善が可能であり得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、出発物質は、細胞または組織（結合組織、筋組織、神経組織、血球、または上皮細胞が含まれる）を含むことができる。いくつかの場合では、非核酸材料を、酵素処理（プロテアーゼ消化など）を使用して出発物質から除去することができる。他の非核酸物質を、いくつかの場合、膜破壊界面活性剤での処理および／または溶解方法（例えば、超音波処理、フレンチプレス、凍結融解、ダウンス）によって除去し、その後に遠心分離して核酸含有画分を核酸を含有しない画分から分離することができる。抽出された核酸は、当該分野内で十分に確立されているプロトコールを使用した任意の適切なサンプル（以下の核酸含有サンプル：組織、体液（例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、腹腔液、腹水、膣分泌物、乳汁、母乳、リンパ液、脳脊髄液、または粘膜分泌物）、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚、２細胞期の胚、４細胞期の胚、８細胞期の胚、１６細胞期の胚、３２細胞期の胚、６４細胞期の胚、１２８細胞期の胚、２５６細胞期の胚、５１２細胞期の胚、１０２４細胞期の胚、胚組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、または他の身体滲出物、糞便、核酸を含むかかる供給源の個別の細胞または抽出物、および細胞内構造物（ミトコンドリアなど）が含まれるが、これらに限定されない）に由来し得る。
【００７８】
好ましい実施形態では、血液を、マグネシウムキレート剤（ＥＤＴＡが含まれるが、これらに限定されない）を含む装置に回収することができ、そしてそれは４℃で保存される。必要に応じて、カルシウムキレート剤（ＥＧＴＡが含まれるが、これらに限定されない）を添加することができる。別の実施形態では、細胞溶解インヒビター（ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒド誘導体、タンパク質架橋剤、核酸架橋剤、タンパク質および核酸架橋剤、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル（ｓｕｌｔｙｄｒｙｌ）付加またはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、分解性架橋剤が含まれるが、これらに限定されない）を母体血に添加する。
【００７９】
血漿ＲＮＡ抽出は、Ｅｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９：７２７−７３１に記載されている。簡潔に述べれば、遠心分離工程後に採取された血漿を、Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびクロロホルムと混合することができる。混合物を遠心分離し、水層を新規の管に移すことができる。エタノールを水層に添加する。次いで、製造者の推奨にしたがって混合物をＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライし、処理する。
【００８０】
抽出した材料が一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含むいくつかの場合、これらの分子を、当該分野で公知の技術を使用して二本鎖ＤＮＡに変換することができる。例えば、逆転写酵素を使用して、ＲＮＡ分子からＤＮＡを合成することができる。いくつかの場合では、ＲＮＡのＤＮＡへの変換にはリンカーフラグメントをＲＮＡにライゲーションするための事前のライゲーション工程が必要であり得、それにより、ユニバーサルプライマーを使用して逆転写を開始することが可能である。他の場合では、例えば、ｍＲＮＡ分子のポリＡテールを使用して、逆転写を開始させることができる。ＤＮＡへの変換後、本明細書中に詳述の方法を使用して、いくつかの場合では、所望の配列をさらに捕捉、選択、タグ化、または単離することができる。
【００８１】
本説明は胎児ＤＮＡの全体に至るまで言及しているが、母体血中で見出される胎児ＲＮＡ（通常はＲＮＡも）を同様に分析することができる。以前に記載のように（「胎盤起源のｍＲＮＡは母体血漿中で容易に検出可能である」）（Ｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：４７４８−４７５３）、各リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して分析した場合、ｈＰＬ（ヒト胎盤性ラクトゲン）およびｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）ｍＲＮＡ転写物は母体血漿中で検出可能である。本方法では、胎盤中で発現し、かつ目的の染色体上に存在する遺伝子をコードするｍＲＮＡを使用することができる。例えば、ＤＳＣＲ４（ダウン症候群必要不可欠領域４）は２１番染色体上に見出され、胎盤中でおもに発現される。そのｍＲＮＡ配列を、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００５８６７で見出すことができる。この場合、検出用ｃＤＮＡを調製するためにＲＮアーゼＨマイナス（ＲＮアーゼ^Ｈ−）逆転写酵素（ＲＴ）を使用することが好ましい。ＲＮアーゼ^Ｈ−ＲＴはいくつかの製造者（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ）ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など）から入手可能である。逆転写酵素ＰＣＲを、染色体ＤＮＡについて本明細書中に記載のように使用することができる。ＲＮＡには、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、または任意の他のＲＮＡ型が含まれ得る。
【００８２】
ライゲーションプローブ
いくつかの好ましい実施形態では、標的ポリヌクレオチドを、１つ以上のライゲーションプローブ（時折、本明細書中で「ライゲーション可能プローブ」ともいう）の使用によってタグ化、選択、捕捉、単離、および／または処理する。ライゲーションプローブは、以下のいずれかを含む：（１）「環状化可能プローブ」（単一のポリヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド）の各末端（５’および３’）が標的ポリヌクレオチドの近接領域または隣接領域に結合し、かかる結合後、ライゲーション反応によってプローブの５’末端を３’末端に連結し、それにより、プローブを環状化することができる）、または（２）２つのポリヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド）プローブ（２つのプローブの標的ポリヌクレオチド内の領域への結合後、一方のプローブの５’末端を異なるプローブの３’末端にライゲーションすることができる）。２つのかかるプローブの標的ポリヌクレオチドの隣接配列または近接配列へのハイブリッド形成後、ライゲーション反応によって２つのプローブが共に１つの線状プローブに連結される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ライゲーションプローブはまた、以下を含むことができる：酵素切断部位、ユニバーサルプライマー部位、および／またはユニバーサルプローブ結合部位。いくつかの実施形態では、ライゲーションプローブはその５’末端でリン酸化されている。他の実施形態では、ライゲーションプローブはその５’末端でリン酸化されていない。かかる５’末端でのリン酸化により、ギャップ充填反応を必要とすることなく標的ポリヌクレオチドの近接領域に結合する同一の（または異なる）ライゲーションプローブの５’末端の３’末端へのライゲーションが可能となり得る。他の場合では、５’末端のリン酸化を用いずにプローブを合成する。かかる場合、５’末端が同一の（または異なる）プローブの３’末端の結合部位に隣接するが直接近接しない領域に結合するようにプローブをデザインする。かかるプローブのライゲーションは、ギャップ充填または伸長反応をさらに必要とする場合もある。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ライゲーションプローブは分子反転プローブである。米国特許第７，３６８，２４２号は、分子反転プローブおよびサンプル中の標的ポリヌクレオチドとの相互作用後にアンプリコンを生成するための使用方法を記載している。遺伝子標的中の隣接領域が分子反転プローブ（または他のライゲーションプローブ）の相補領域と安定な二重鎖を形成することが可能な条件下でプローブの線状バージョンを、標的ポリヌクレオチドを含むサンプルと組み合わせる。一般に、プローブの５’末端は標的配列の１つに結合し、プローブの３’末端は近接配列に結合し、それにより、ループ構造物が形成される。標的特異的領域の末端は相互に隣接し得るか（ニックによって分離されている）、その間にいくつかの（例えば、１〜１０ヌクレオチド）ギャップが存在し得る。いくつかの実施形態では、ギャップは、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドを超える。いくつかの好ましい実施形態では、標的特異的領域は直接近接している（例えば、０個のヌクレオチドによって分離されている）。いずれかの場合、標的特異的領域のハイブリッド形成後、２つの標的特異的領域の末端をライゲーション反応または多伸長反応によって共有結合し、その後にギャップ充填反応を使用してライゲーション反応を行う。
【００８５】
図４は、２つの遺伝子標的を検出するための分子反転プローブ（ＭＩＰ）の使用の略図である。１つの遺伝子標的は１つのプローブ（ＭＩＰ１−１）によって認識され、第２の遺伝子標的は第２のプローブ（ＭＩＰ２−１）によって認識される。ＭＩＰの遺伝子標的への結合後、ライゲーション反応を行って結合したＭＩＰプローブの５末端を３末端にライゲーションし、それにより、環状ＭＩＰを形成する。いくつかの場合では、ＭＩＰプローブは、１つ以上のヌクレオチドによって分離された隣接ＤＮＡの２つの配列に結合する。かかる場合、ギャップ充填（または伸長）反応を行ってテンプレートとして標的ＤＮＡを使用してギャップ中に充填する。ＭＩＰのその標的配列への結合後、ＭＩＰはループを形成し、プローブ配列を反転させることができる（図４を参照のこと）。この反転の後にライゲーション反応を行い、反転した分子の末端をライゲーションして環状化したプローブを形成することができる。
【００８６】
ＭＩＰプローブのＤＮＡへの結合（および必要に応じたギャップ充填反応）後、リガーゼ酵素を使用してライゲーション反応を行ってＭＩＰプローブを環状化する。次いで、環状ＭＩＰプローブを、未使用の線状一本鎖プローブ、一本鎖線状ゲノムＤＮＡ、および二本鎖線状ゲノムＤＮＡを消化するエキソヌクレアーゼ消化中で保持する。次いで、液滴デジタルＰＣＲによる分析のための液滴中で環状ＭＩＰをＰＣＲ試薬と合わせる。いくつかの実施形態では、環状プローブを、ＰＣＲ反応前またはＰＣＲ反応中に線状化する。図４に示すように、プローブは、酵素切断部位（例えば、ウラシルＮ−グリコシラーゼ酵素による酵素切断に感受性を示す一連のウラシル残基）を含む部位を含むことができる。いくつかの場合では、ポリヌクレオチドを切断して線状分子を形成する酵素切断工程が存在する。他の場合では、この工程で酵素切断工程が存在せず、ポリヌクレオチドが環状のままである。次に、ライゲーションしたＭＩＰプローブ（環状化されているか、線状であるか、その両方の混合物であるかのいずれか）を、１つ以上の区分の間で細分割する。好ましくは、区分は液滴（例えば、油相内の水滴）である。次いで、液滴をサーマルサイクリング反応に供する。サーマルサイクリング反応中に、線状化されたＭＩＰ（またはいくつかの場合では、環状ＭＩＰ）は、ユニバーサル順方向プライマー（ＵＦ１またはＵＦ２）およびユニバーサル逆方向プライマー（ＵＲ１またはＵＲ２）によってプライミングされる反応のためのテンプレートとして働く。増幅中に、各ＭＩＰ中の配列にハイブリッド形成するユニバーサルプローブ（ＵＰ１またはＵＰ２）を、プローブの蛍光側がプローブの消光剤側から分離されるように切断する。この切断の結果として、プローブの蛍光剤側由来の蛍光が増加する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ギャップ充填反応を５’→３’重合活性を有するポリメラーゼによって行う。この方法で有用なポリメラーゼには、ニック部位で５’−３’重合を開始するポリメラーゼが含まれる。ポリメラーゼはまた、ニックから下流側の重合鎖を置換することもできる。いくつかの実施形態では、ギャップ充填反応のために使用されるポリメラーゼは、いかなる５’→３’エキソヌクレアーゼ活性も欠く。通常はかかるエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、この活性がブロッキング剤の添加によってブロッキングされる場合、ポリメラーゼのドメインまたはフラグメント（かかるドメインまたはフラグメントが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を行う）が欠失、変異、そうでなければ修飾される場合、ポリメラーゼが化学修飾される場合、または当該分野で公知の任意の他の方法による場合にかかる活性を欠き得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ギャップ充填反応のために使用されるポリメラーゼは、３’→５’エディティングエキソヌクレアーゼ活性を含む。適切なポリメラーゼの例には、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損クレノウフラグメント、およびＢｓｔポリメラーゼ由来の類似のフラグメント（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼのシュトッフェルフラグメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と同様に、シーケナーゼ１．０およびシーケナーゼ２．０（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼも作用する。
【００８９】
本開示がＤＮＡを含むライゲーションプローブ（例えば、ＭＩＰプローブ）を記載しているにもかかわらず、本明細書中に記載のライゲーションプローブは、任意の他の核酸（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、ポリペプチド、合成核酸、または合成ポリペプチドを含むことができる。いくつかの場合では、ライゲーションプローブは２つ以上の異なるポリヌクレオチド型を含むことができるか（例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む）、ライゲーションプローブはポリヌクレオチドおよびポリペプチド（例えば、ＲＮＡ＋ポリペプチド；ＤＮＡ＋ポリペプチド）を含むことができる。一定の他の適用では、ライゲーションプローブ（例えば、ＭＩＰプローブ）を、本明細書中に記載の方法において蛍光色素、固体支持体、またはビーズにコンジュゲートすることができる。
【００９０】
核酸は、天然に存在する核酸および天然に存在しない核酸、ならびに天然に存在する核酸に類似の様式で機能する核酸アナログをいう。核酸を、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または核酸アナログ分子（糖または骨格修飾リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドなど）から選択することができる。他の核酸アナログ（ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）など）も適切である。天然に存在しない核酸の例には、以下が含まれる：ハロゲン置換塩基、アルキル置換塩基、ヒドロキシ置換塩基、およびチオール置換塩基、ならびに５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、イソグアニン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、４−チオウラシル、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、イノシン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）、２−アミノ−６−”ｈ”−プリン、６−アミノ−２−”ｈ”−プリン、６−オキソ−２−”ｈ”−プリン、２−オキソ−４−”ｈ”−ピリミジン、２−オキソ６−”ｈ”−プリン、４−オキソ−２−”ｈ”−ピリミジン。これらは、非チオール化およびチオール化塩基を有する２つの水素結合塩基対を形成する（それぞれ、２，４ジオキソおよび４−オキソ−２−チオキソピリミジン、２，４ジオキソおよび２−オキソ−４−チオキソピリミジン、４−アミノ−２−オキソおよび４−アミノ−２−チオキソピリミジン、６−オキソ−２−アミノおよび６−チオキソ−２−アミノプリン、２−アミノ−４−オキソおよび２−アミノ−４−チオキソピリミジン、および６−オキソ−２−アミノおよび６−チオキソ−２−アミノプリン）。
【００９１】
いくつかの好ましい実施形態では、本方法は、酵素消化（エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼなどの酵素から）からの所望の配列の選択的保護によるゲノムＤＮＡ由来の所望の配列の選択、タグ化、捕捉、および／または単離を含む。例えば、（その標的への結合後の）ＭＩＰプローブの環状化により、特定の酵素（例えば、ｅｘｏＩ、ｅｘｏＩＩＩ）による消化からプローブを保護する。その標的への結合後のプローブの他の保護方法も使用することができる。
【００９２】
いくつかの場合では、次いで、ライゲーション反応後に酵素消化（エキソヌクレアーゼ処理（例えば、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）など）を行って、非結合ゲノムＤＮＡおよび非結合プローブを消化することができるが環状ＤＮＡを消化せず、それにより、所望の配列を示す環状ＭＩＰを単離することができる。いくつかの場合では、１つを超えるプローブが所望の遺伝子標的に結合し、ライゲーションされて環状ＭＩＰを形成する場合、ＭＩＰは多重化可能である。それにより、複数のＭＩＰは所与の遺伝子標的を示し、検出感度を増強することができる。
【００９３】
目的の配列を示すために環状ＭＩＰを生成するいくつかの場合、これらの環状ＭＩＰを、ＰＣＲ反応による検出前（または検出中）に線状化することができる。いくつかの場合では、ＭＩＰは、酵素（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼなど）での処理によって脱プリン化することができるウラシル塩基を含み、環状分子は、加熱の際に脱塩基部位で線状化されるようになり得る。他の場合では、ＭＩＰは部位特異的制限酵素によってターゲティングされる制限酵素部位を含み、環状プローブを切断して線状ＤＮＡ分子を形成することができる。環状ＭＩＰが線状化されるいくつかの実施形態では、ＭＩＰを含む溶液を占める酵素（エキソヌクレアーゼが含まれる）を、ＭＩＰ線状化前の熱不活化、ｐＨ変性、または物理的分離などの方法によって不活化する。いくつかの場合では、ＤＮＡをゲル精製またはエタノール沈殿を使用してタンパク質から精製することができるか、タンパク質をトリクロロ酢酸などの有機溶液での沈殿を使用して溶液から除去することができる。
【００９４】
制限酵素の例には、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｃｕＩ、ＡｆｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｈｄＩ、ＡｌｅＩ、ＡｌｕＩ、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｐｅＫＩ、ＡｐｏＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｅＧＩ、ＢａｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｌＩ、ＢｆａＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｐＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｍｔＩ、ＢｐｍＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｏＢＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｓｔＹＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｔｇＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＣｖｉＱＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＥｃｏＮＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦａｔＩ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＡＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｌＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＮｓｐＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｃＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｃｉＩ、ＰｆｌＦＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｈｏＩ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｐｕＭＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、ＰｓｐＧＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｂｆＩ、ＳｃａＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｃＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｌＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＳｔｙＩ、ＳｗａＩ、Ｔ、ＴａｑαＩ、ＴｆｉＩ、ＴｌｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴｓｐＭＩ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＸｂａＩ、ＸｃｍＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩ、ＸｍｎＩ、およびＺｒａＩが含まれる。
【００９５】
他のプローブ型および遺伝子プローブの他の選択方法を、本明細書中に記載の方法および組成物で使用することもできる。例えば、ＭＩＰプローブの使用が一般に単一のライゲーションプローブの環状化を含むにもかかわらず、環状化工程は常に必要であるというわけではない。例えば、ライゲーション検出ＰＣＲ技術を使用することができる。この技術では、２つの異なるプローブ（それぞれ隣接ＤＮＡ（または近接ＤＮＡ）にハイブリッド形成する）を共にライゲーションし、その後にユニバーサルプライマーおよびプローブを添加してライゲーションしたフラグメントを検出する。
【００９６】
図７は、ライゲーション検出反応（ＬＤＲ）およびその後の液滴中でのＰＣＲを用いた２つの色調を使用した２つの遺伝子標的の検出スキームを示す。２つの線状オリゴヌクレオチドは、遺伝子標的の近接領域または隣接領域に結合する。これらの領域は、直接近接するか、ギャップによって分離され得る。あるいは、これらの領域を、ポリメラーゼ反応を使用して充填することができ、その３’末端が第２のプローブの５’末端に直接近接するように第１のプローブの３’末端長を伸長するギャップによって分離することができる。次いで、２つのプローブを相互にライゲーションする（図７に記載のように）。ライゲーション中に、２つの線状オリゴヌクレオチドがライゲーションされて単一のテンプレートオリゴヌクレオチド（ＬＤＲ１−１またはＬＤＲ２−１）が形成される。この単一のテンプレートオリゴヌクレオチド（これらから形成されたオリゴヌクレオチド対ではない）は、ユニバーサル順方向プライマー（ＵＦ１またはＵＦ２）および逆方向プライマー（ＵＲ１またはＵＲ２）を使用したＰＣＲ反応において産物を産生することができる。さらに、ＰＣＲ反応は、テンプレートオリゴヌクレオチドの一部にハイブリッド形成する蛍光剤−消光剤対を含むユニバーサルプローブ（ＵＰ１またはＵＰ２）を含む。ＰＣＲ反応中に、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑなど）の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブが切断され、分子の消光剤末端から蛍光剤末端が脱離する。蛍光剤プローブと消光剤プローブとの間のこの分離の結果として、反応中に蛍光強度が増大し、以後の工程で検出することができる。この分析を、検出中に区別することができる２つの異なる色調の蛍光剤を含む２つのユニバーサルプローブ（ＵＰ１およびＵＰ２）を使用して行うことができる。例えば、ＬＤＲ１−１が標的配列（疑われる異数体染色体など）を認識することができる一方で、ＬＤＲ２−１は基準配列（推定二倍体染色体など）を認識し、異数性を検出可能である。
【００９７】
本明細書中に記載のライゲーション検出反応で使用されるライゲーションプローブは、一旦これらのライゲーションプローブが標的ポリヌクレオチドに結合すると、エキソヌクレアーゼ処理から保護することができる。例えば、保護基（化学的ブロッキング単位）の付加（すなわち、ホスホロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）修飾）により、非結合プローブおよび／または非結合標的ポリヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡ）を消化することができる特定のエキソヌクレアーゼによる消化からハイブリッド形成したライゲーションプローブを保護することができる。ホスホロチオアート修飾により、ライゲーションプローブをｅｘｏＩＩＩ（３’→５’エキソヌクレアーゼ）の活性から保護することができる。同様に、ホスホロチオアート修飾により、ライゲーションプローブをｅｘｏＴ７（５’→３’エキソヌクレアーゼ）の活性から保護することができる。いくつかの場合では、ｅｘｏＴ（３’→５’エキソヌクレアーゼ）およびＲｅｃＪｆ（５’→３’エキソヌクレアーゼ）を使用することができる。ｅｘｏＴ活性から保護するホスホロチオアートは、Ｐｕｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８１）ＰＮＡＳ ７８（１２）：７３５０−５４に開示されている。ＲｅｃＪｆについては、Ｔｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｊ．ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ：Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ ６１（２００７）１２４１-１２４５；ｄｏｉ：１０．１０８８／１７４２−６５９６／６１／１／２４５ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＣＮ＆Ｔ ２００６）も参照のこと。ｅｘｏＴおよびＲｅｃＪＦの両方はｓｓＤＮＡを消化し、ホスホロチオアートによってブロッキングされる。ホスホロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｒａｔｅ）修飾を、プローブ中のユニバーサルＰＣＲプライマー配列の末端またはユニバーサルＰＣＲプライマー配列の上流のテールに配置することができる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、プローブは、各プローブの標的ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成後に一方の線状オリゴヌクレオチドの５’領域を異なる線状オリゴヌクレオチドの３’領域にライゲーションすることができる異なる線状オリゴヌクレオチドの混合物を含む。いくつかの実施形態では、２つの同一の（または実質的に同一の）オリゴヌクレオチドは、それぞれ、次に一方のかかるプローブの５’末端を別のかかるプローブの３’末端にライゲーションすることができるような様式で、近接または隣接する標的ポリヌクレオチドの領域に結合することができる。かかるライゲーションは、各プローブの標的ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成後に起こる。
【００９９】
他の実施形態では、本方法は、その後の単離なしに所望の配列を捕捉することを含む。いくつかの場合では、１つを超える線状プローブが所望の配列を認識し、それに結合する。プローブの結合後、ライゲーション反応を行って、１つ以上のプローブを相互にライゲーションすることができる。いくつかの場合では、所望の配列は、ライゲーションの結果として捕捉され、その後の工程においてライゲーションされたプローブをＰＣＲ検出することが可能である一方で（リガーゼ検出反応ＰＣＲ、またはＬＤＲ−ＰＣＲとして公知）、ライゲーションされていないプローブはＰＣＲによって検出できない。いくつかの場合では、複数のプローブが遺伝子標的に結合してライゲーションすることができ、それにより、ＬＤＲ−ＰＣＲによる遺伝子標的の検出感度を増強することができる。
【０１００】
ライゲーションプローブ（例えば、ＭＩＰプローブ）を、アッセイ性能におけるサンプル毎の変動を最小にするか、さもなければ、アッセイを最適にするために一定の基準を満たすようにデザインすることができる。ライゲーションプローブのデザインにおけるいくつかの使用基準には、以下が含まれる：（１）いかなる公知のＳＮＰ（例えば、ｄｂＳＮＰ中の全てのＳＮＰ）を含まない標的配列；２）ゲノムＤＮＡの保存領域内の標的配列；（３）いかなる公知のＣＮＶ領域（例えば、ＵＣＳＣゲノムデータベース中のＣＮＶトラック中に存在する全てのＣＮＶ）とも重複しない標的配列；４）（例えば、ＵＣＳＣゲノムデータベース中の保存トラックによって評価した場合に）種間で保存されている標的ポリヌクレオチド領域（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ）中の標的配列。さらに、プローブの普遍的かつ安定した性能を最適にするために、いくつかの基準を標的配列の選択に適用することができる。標的配列がヒトゲノム中で固有であるように標的配列を選択することができる。ＭＩＰプローブの両末端がＧ／Ｃヌクレオチドを含み、これらがおよそ４０ヌクレオチド長であり、合わせたホーマーアームが類似の融解温度を有し（例えば、プライマー３ソフトウェア由来のデフォルトパラメーターを使用して６７℃から２℃以内）、各ホーマーアームが類似の融解温度を有する（例えば、プライマー３ソフトウェア由来のデフォルトパラメーターを使用して５０℃から２℃以内）ように、標的配列を選択することができる。（ゲノムＤＮＡに相補的なプローブの５’末端および３’末端をホーマーアーム（それぞれ、Ｈ２およびＨ１）と呼ぶ）。
【０１０１】
その対応物に十分に結合できないので、ＭＩＰおよび標的をスクリーニングして二次構造を形成するＭＩＰおよび標的を破棄することもできる。さらに、ＭＩＰを相互に比較して、溶液中のＭＩＰプローブ間の反応の可能性を低下させることができる。二次構造を回避するためのいくつかの一般的規則を、Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７６：３９０４−３９１０に見出すことができる。二次構造スクリーニングを、ｄＧスコア分布の構築および域外値の除去によって補助することができる。
【０１０２】
本明細書中に提供した方法には、例えば、１３、１８、および２１番染色体上の複数の異常を同時に評価する方法が含まれる。かかる研究のために、染色体を相互の基準として使用することができ、したがって、外部の基準サンプルまたは基準プローブ（例えば、１番染色体に対する）は不要であり得る。
【０１０３】
遺伝子標的を含むサンプルは、全染色体、染色体フラグメント、または非染色体フラグメントの形態のゲノムＤＮＡを含むことができる。いくつかの場合では、ゲノムＤＮＡフラグメントの平均長は、約１００、２００、３００、４００、５００、または８００塩基対未満、または約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチド未満、あるいは約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００キロベース未満であり得る。いくつかの場合では、フラグメントは、１０〜５００、１０〜１０００、または１００〜１５０塩基（またはヌクレオチド）長の範囲であり、いくつかの実施形態では、１００〜１５０塩基が好ましい。
【０１０４】
母体ＤＮＡと比較して胎児ゲノムＤＮＡを富化するいくつかの場合、フラグメントサイズは、平均して約３００塩基対または１００もしくは１５０塩基対であり得る。いくつかの場合では、サンプルは、少なくとも１つのゲノム当量を含む。他の場合では、サンプルは、１ゲノム当量未満を含むが、胎児または母体のサンプル中の標的配列および基準配列の比率の決定に十分なゲノムＤＮＡを含む。さらに他の場合では、サンプルは、１ゲノム当量の約半分を含む。用語「ゲノム当量」を、ゲノムサイズおよびＤＮＡ重量の計算値（一倍体ゲノムの重量は約３．３ｐｇであり、二倍体正常細胞（４６番染色体）のゲノム含有量は約６．６ｐｇであり、これは２ゲノミック当量（ＧＥ）（「ゲノミック当量」および「ゲノム当量」を、本明細書中で交換可能に使用する）に対応する）に基づいたサンプルＤＮＡ分布の計算値をいうために使用する。実際に、ＤＮＡサンプルサイズはいくらか変動し得る。また、無作為なフラグメント分布のために、所与のゲノム当量は、単一の完全な二倍体ゲノムのみに対応するＤＮＡフラグメントを正確に含まない場合もある。
【０１０５】
多重化
本明細書中に記載され、かつ当該分野で公知の増幅法（例えば、ＰＣＲ）を多重化することができる（すなわち、各反応体積中で複数のプライマーおよびプローブを使用して実行することができる）。本明細書中に提供した方法および組成物のいくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、１００，０００、２，０００，０００、３、０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００、または１０，０００，０００個、またはそれを超える異なるプローブが所与のサンプル体積中に存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、１００，０００、２，０００，０００、３、０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００、または１０，０００，０００個、またはそれを超えるプライマーが所与のサンプル体積中に存在する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、複数のプローブ（またはプライマー組）を使用し、プローブ（またはプライマー組）は１つ以上の態様に関して異なる。プローブは、同一の標的ポリヌクレオチドまたは異なる標的ポリヌクレオチド（例えば、異なる染色体または同一の染色体であるが、前記染色体内の異なる領域）に結合することができる。例えば、異なる標的に向けられる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０を超えるプローブを使用することができる。いくつかの場合では、異なる標的に向けられる２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５００００、１０００００、５０００００、１００００００、またはそれを超えるプローブを使用する。他の場合では、プローブは、前記プローブ内に存在する切断部位の型に関して異なる。いくつかの場合では、複数のプローブは、複数の異なるプローブ型（例えば、ライゲーションプローブ、ＭＩＰ、パッドロックプローブ、ＰＣＲプライマー組、ユニバーサルプライマー、ユニバーサルプローブ、およびその任意の組み合わせ）を含む。いくつかの場合では、前記複数の異なるプローブ型は、各プローブを異なるシグナル伝達因子（例えば、緑色フルオロフォア対赤色フルオロフォアなど）にコンジュゲートするという点で異なる。いくつかの場合では、プローブは、プローブが異なるプライマー結合部位を含むという点で異なる。他の場合では、同一のユニバーサルプライマー組を使用して、複数のプローブ内のプローブの全てまたは大部分に結合することができる。
【０１０７】
反応体積（液滴など）の多重化により、二倍体配列についての１：１の推定比から標的配列と基準配列との間のＤＮＡ比のわずかな変化を検出することが可能である。多重化により、ＧＥ／ｍＬが低い（例えば、１０００ＧＥ／ｍＬ）（母体血漿中など）場合のサンプルにもかかわらず、多数の配列を標的配列および基準配列の任意の組について計数することが可能である。インタクトな標的染色体および基準染色体は巨大分子であり、特異的プライマー組によって認識および増幅することができる複数の保存された固有の領域を有する。血漿中、循環ＤＮＡは小フラグメント（約３００ｂｐ）として存在し得る。小さな産物（例えば、１００塩基対）を産生する多重化プライマーのデザインにより、標的配列または基準配列の小さなフラグメント（例えば、３００塩基対）を効率よく増幅することができる。
【０１０８】
多重化により、反応体積（液滴など）中で単離された標的を多重化プライマーの１つによって認識することができる可能性が増大し得る。多重化はまた、増幅が起こり、一重アッセイで陰性として計数される標的配列を陽性として測定することができる可能性が増大し得る。これを基準配列について行うことができる。いくつかの実施形態では、多重度は、標的配列に対して１プライマー組超（特定の標的配列に対してそれぞれ少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、または２５プライマー組など）を含むことができる。いくつかの実施形態では、多重度は、基準配列に対して１基準プライマー組超（特定の基準配列に対してそれぞれ少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、または２５プライマー組など）を含むことができる。いくつかの実施形態では、多重度は、標的配列に対して１プライマー組超および基準配列に対して１基準プライマー組超（特定の標的配列または基準配列に対して少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、または２５プライマー組など）を含むことができる。いくつかの実施形態では、標的配列に対するプライマー組の数は、基準配列に対するプライマー組の数と同一ではない。いくつかの実施形態では、多重度は、各標的配列および基準配列について５００、２５０、２００、１５０、または１００プライマー組未満であり得る。標的配列および基準配列の多重度を、単一の反応体積に組み合わせることができる。
【０１０９】
異なるプライマー対増幅配列を、スペクトルで識別可能なプローブ（例えば、２つの異なる色素標識したプローブ（Ｔａｑｍａｎまたはロックド核酸プローブ（ユニバーサルプローブ Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｒｏｃｈｅ）など））に基づいて区別することができる。かかるアプローチでは、全プローブを単一の反応体積に合わせ、各プローブによって放射された色調の相違に基づいて区別する。例えば、１つのポリヌクレオチド（例えば、試験染色体、２１番染色体）をターゲティングするプローブを第１の色調の色素にコンジュゲートすることができ、反応中の第２のポリヌクレオチド（例えば、基準染色体、１番染色体）をターゲティングするプローブを第２の色調の色素にコンジュゲートすることができる。次いで、色調の比を、試験染色体と基準染色体との間の比に反映させる。
【０１１０】
プローブ組（例えば、試験染色体（例えば、２１番染色体）をターゲティングするプローブ組）が標的ポリヌクレオチドの異なる領域をターゲティングすることができるいくつかの場合、依然として組内の各プローブは同一のユニバーサルプライマー結合部位を有する。いくつかの場合では、各プローブは、同一のプローブ結合部位を有する。いくつかの場合では、反応物中の２つ以上のプローブは、異なるプローブ結合部位を有し得る。いくつかの場合では、かかる反応物に添加するプローブを、同一のシグナル因子（例えば、同色のフルオロフォア）にコンジュゲートする。いくつかの場合では、異なるシグナル因子（例えば、２つの異なる色調）を１つ以上のプローブにコンジュゲートする。
【０１１１】
あるいは、反応体積組（例えば、液滴）を２つのサンプル組に分割し、一方の組中の標的配列および他方の組中の基準配列を増幅することができる。次いで、標的遺伝子および基準遺伝子を、相互に独立して測定する。これにより、単一の蛍光プローブ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなど）を使用することが可能である。いくつかの例では、これには、等価な感度を達成するためにサンプルを分割し、各多重組中のプライマー数を潜在的に倍増させることが必要である。いくつかの場合では、サンプルを分割し、試験染色体に対する複数のライゲーションプローブをサンプルの半分に添加し、基準染色体に対する複数のライゲーションプローブをサンプルの第２の半分に添加する。かかる例では、次いで、ライゲーションプローブを、同一のシグナル伝達因子（例えば、同一の色スペクトルのフルオロフォア）にコンジュゲートしたユニバーサルプローブとハイブリッド形成することができる。
【０１１２】
本開示によって提供された多重化を、初期段階でプライマー対を使用する代わりに標的のプローブを使用して行うこともできる。使用することができるプローブの例は、標的ポリヌクレオチド内の近接するか隣接する配列とハイブリッド形成するように特異的にデザインされた２つの末端を有する線状オリゴヌクレオチドである。かかるプローブの非限定的な例は、近接標的配列とハイブリッド形成するように特異的にデザインされた２つの末端を有する線状オリゴヌクレオチドであるパッドロックプローブである。一旦ハイブリッド形成されると、２つの末端をライゲーションによって連結することができ、パッドロックプローブは環状化するようになる。パッドロックプローブは、例えば、Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：２２５−２３２； 米国特許第５，８７１，９２１号；同第６，２３５，４７２号；および同第５，８６６，３３７号に開示されている。いくつかの場合では、プローブ（例えば、オリゴヌクレオチド）はゲノムＤＮＡの近接配列に結合し、次いで、末端を、リガーゼ反応によって直接ライゲーションすることができる。他の場合では、２つの末端の間に１つ以上の塩基のギャップが存在する。かかる場合、伸長反応またはギャップ充填反応を行うことができる。ギャップ充填反応について、当該分野の任意の公知の方法で十分である。例えば、ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ）の混合物を、反応混合物ならびにポリメラーゼ、リガーゼ、および他の反応成分に添加し、約６０℃で約１０分間インキュベートし、その後に３７℃で約１分間インキュベートすることができる。標的ポリヌクレオチドへの結合およびライゲーション後、ライゲーションプローブ（例えば、分子反転プローブ、パッドロックプローブなど）が環状化するようになり得る。
【０１１３】
いくつかの場合では、プローブは、本明細書中に記載のように、遺伝子標的に結合するオリゴヌクレオチドプローブである。他の場合では、プローブは、基準標的に結合するオリゴヌクレオチドプローブである。基準標的の例は、１番染色体または胎児異数性に関連する可能性が低い他の染色体である。いくつかの場合では、オリゴヌクレオチドまたは基準オリゴヌクレオチドは、酵素によって切断可能な部位を含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、一連の１つ以上のウラシル残基（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、または２０個のウラシル残基）を含み、かつ酵素（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）など）によって切断可能であり得るＤＮＡオリゴヌクレオチドであり得る。他の場合では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の制限部位を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、１つ以上の同一の制限部位または１つ以上の異なる制限部位を含むことができる。制限部位の例は、文献中で周知である。一般に、制限酵素によって切断可能な部位を使用することができる。制限酵素は、特異的部位を切断することができる任意の制限酵素（またはエンドヌクレアーゼ）であり得る。いくつかの場合では、制限酵素は平滑末端カッターであり、他の場合では、制限酵素は非対称部位で切断してオーバーハングを作製する。制限酵素の非限定的な例を本明細書中に示す。
【０１１４】
オリゴヌクレオチドプローブは、さらに、順方向および逆方向プライマー（例えば、ユニバーサルプライマー）とハイブリッド形成する部位を含むことができる。本明細書中で使用する場合、ユニバーサルプライマーは、増幅すべき領域にフランキングする配列を認識してハイブリッド形成する５’プライマーおよび３’プライマーの１つ以上の対を含む。増幅すべき領域は、遺伝子標的（疑われる胎児異数体染色体（かかる染色体の非限定的な例には、２１番染色体、１３番染色体、１８番染色体、およびＸ染色体が含まれる）など）内に存在し得る。いくつかの場合では、増幅すべき領域は、推定二倍体染色体の遺伝子標的内に存在する。
【０１１５】
いくつかの場合では、増幅すべき領域は、遺伝子標的内ではなく、遺伝子標的に対するプローブ（分子反転プローブなど）内に存在する。プライマー対は、遺伝子標的に向けられることができるか、多数の増幅標的にフランキングする配列を認識するユニバーサルプライマーであり得る。例えば、遺伝子標的に対するプローブは、遺伝子標的中の特異的配列を認識して結合する１つ以上のセグメントを含むことができ、プローブは、さらに、全プローブ組に共通のユニバーサル配列を含むことができる。したがって、単一のユニバーサルプライマー対を使用して、かかる組内の任意のプローブを増幅させることができる。いくつかの場合では、ユニバーサルプライマー対は、分子反転プローブが反転された場合のみで、検出可能なＰＣＲ産物を産生する。分子反転プローブの反転を環状分子反転プローブ内の部位の切断によって誘導し、そのプライマー対に関するプライマーの配向を反転することができる。いくつかの場合では、ユニバーサルプライマー対は、（ライゲーション検出反応などにおいて）ライゲーション反応の産物を増幅する場合のみで検出可能なＰＣＲ産物を産生する。
【０１１６】
オリゴヌクレオチドプローブはまた、マーカー（色素または蛍光色素（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）など）に結合したプローブに相補的な配列を含むことができる。いくつかの場合では、ＴａｑＭａｎプローブは、１つの色素型（例えば、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ）に結合する。他の場合では、オリゴヌクレオチド上の１つを超えるＴａｑＭａｎプローブ部位が存在し、各部位は異なるＴａｑＭａｎプローブ（例えば、異なる色素型を有するＴａｑＭａｎプローブ）に結合することができる。本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドプローブの同一の配列を有する複数のＴａｑＭａｎプローブ部位も存在し得る。しばしば、ＴａｑＭａｎプローブは、本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドプローブ上の部位のみに結合することができ、ゲノムＤＮＡに結合することができないが、いくつかの場合、ＴａｑＭａｎプローブはゲノムＤＮＡに結合することができる。
【０１１７】
本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドプローブ使用の利点は、シグナルのバックグランドノイズに対する比が従来のＰＣＲ技術（プライマー組を使用する技術など）を使用した場合の１、２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、または１００倍を超えて改良されるという点である。１つの理由は、潜在的に、特異的標的（例えば、染色体）に対する全オリゴヌクレオチドプローブについてたった１つのプローブしか必要としないことである。例えば、多数のオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、５０個超）が存在し得る。これらは、それぞれ染色体上の個別の部位に結合するが、それぞれユニバーサルであるか同一であるＴａｑＭａｎ部位も含み、したがって、特異的蛍光色素に結合したＴａｑＭａｎプローブがプローブにアニーリングする場合に同一の波長で蛍光を発する。
【０１１８】
本明細書中に提供した方法には、以下の工程を使用した方法が含まれる：１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブをゲノムＤＮＡとハイブリッド形成させるための変性およびアニーリング工程。プローブの５’末端および３’末端がゲノムＤＮＡの近接配列を直接ターゲティングしない場合、必要に応じたギャップ充填反応の後にリガーゼ反応を行ってプローブを環状化させる。本方法は、さらに、サンプルをエキソヌクレアーゼ酵素（例えば、エキソヌクレアーゼＩおよび／またはＩＩＩ）で処理して線状プローブ（言い換えれば、首尾よくハイブリッド形成しなかったプローブ）ならびにｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を消化するエキソヌクレアーゼ処理工程およびその後の反転工程を含むことができる。本方法は、さらに、ＰＣＲ試薬をサンプル（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ユニバーサルプライマー、蛍光プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）、および他のＰＣＲ反応成分）に添加してオリゴヌクレオチドプローブ上の１つ以上の部位を増幅する増幅工程を含むことができる。本方法は、さらに、単分散の油中水型液滴（例えば、１，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００超、またはそれを超える油中水型液滴（本明細書中で反応体積ともいう）に乳化し、その後にサーマルサイクリングを行う分割工程および使用した蛍光プローブに対応する波長での各液滴の蛍光の検出工程を含むことができる。いくつかの場合では、平均して、約１、２、３、４、または５コピーのＤＮＡが各液滴中に存在する。いくつかの場合では、平均して約０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、または５個のオリゴヌクレオチドプローブが各液滴中に存在する。本明細書中に記載の方法は、高多重深度で機能することができる。高多重深度をｄｄＰＣＲ数と組み合わせる場合、多数の標的カウントを得ることができ、それにより、相対染色体量の分析能を高くすることができる。この多重アプローチを父性遺伝したＳＮＰ、Ｙ染色体標的、または胎児特異的メチル化マーカーを使用したｄｄＰＣＲ胎児負荷量定量化と組み合わせて、偽陰性から防御することができる。胎児負荷量測定を、抽出サンプルのアリコートに対して個別に行うことができるか、２つの直交性アッセイ（ユニバーサルＭＩＰ ＰＣＲ＋胎児特異的定量アッセイ）の多重化によるアッセイの反転工程後に行うことができる。
【０１１９】
いくつかの場合では、ライゲーションをユニバーサルＰＣＲ法と組み合わせて多重化する。例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：分子反転プローブ（ＭＩＰ）ストラテジー（Ｈａｒｄｅｎｂｏｌ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（６）：６７３−７８；米国特許出願公開第２００４／０１０１８３５号を参照のこと）；多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）（Ｓｃｈｏｕｔｅｎ ＪＰ，ＭｃＥｌｇｕｎｎ ＣＪ，Ｗａａｉｊｅｒ Ｒ，Ｚｗｉｊｎｅｎｂｕｒｇ Ｄ，Ｄｉｅｐｖｅｎｓ Ｆ，Ｐａｌｓ Ｇ（２００２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（１２）を参照のこと）；ライゲーション検出反応（ＬＤＲ）；およびリガーゼ連鎖反応。本明細書の図は、異なるプローブ型またはプローブ／プライマー組み合わせを使用した異なる多重ストラテジーのまとめを示す。
【０１２０】
図５は、遺伝子標的の検出感度を増大させるためのＭＩＰアプローチの多重化を示す。特定の遺伝子標的を認識するＭＩＰ（ＭＩＰ１−１）を、同一の遺伝子標的の異なる部分を認識する第２のＭＩＰ（ＭＩＰ１−２）と組み合わせることができる。この過程を繰り返して、同一の遺伝子標的を認識するための多数のＭＩＰ（示したＭＩＰ１−５０）を生成することができる。同様に、第２の遺伝子標的を認識するためのＭＩＰ群を生成することができる（ＭＩＰ２−５０）。これらのＭＩＰを、分析（図３に示す分析など）で使用して２つの遺伝子標的を比較することができる。
【０１２１】
本明細書中に記載のライゲーションプローブ、パッドロックプローブ、または他のオリゴヌクレオチドプローブを、ゲノムＤＮＡと組み合わせることができる。いくつかの場合では、染色体または異なる染色体上の特異的部位に対する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、または１０，０００個を超えるオリゴヌクレオチドプローブを含む複数のオリゴヌクレオチドプローブを使用する。
【０１２２】
図８は、このアプローチの液滴中の遺伝子標的の検出感度を増大させるための液滴中のＬＤＲ−ＰＣＲのための多重化オリゴヌクレオチドの使用を示す。図７に記載するように、単一の線状オリゴヌクレオチド対（ＬＤＲ１−１）を、遺伝子標的の隣接領域を認識するようにデザインする。異なる対（ＬＤＲ２−１）は、第２の遺伝子標的を認識する。複数のオリゴヌクレオチド対（ＬＤＲ１−５０およびＬＤＲ２−５０）を、遺伝子標的の異なる部分を認識するようにデザインすることができる。これらのオリゴヌクレオチド対は、遺伝子標的の一部に結合し、図７に記載のライゲーションを受ける。２つの異なる色調を使用して、示した２つの異なる遺伝子標的を検出する。例えば、ＬＤＲプローブの半分は標的配列（疑われる異数体染色体など）を認識することができる一方で、他方の半分は基準配列（推定二倍体染色体など）を認識し、改善された感度で異数性を検出可能である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、標的配列および基準配列を、デジタル液滴検出を使用した分析前に予め増幅することができる。増幅方法は当該分野で公知であり、自立配列反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応、Ｑ−βファージ増幅、鎖置換増幅、等温増幅、またはスプライス重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応が含まれる。次いで、前増幅産物を、本発明に記載の方法で使用することができる。
【０１２４】
遺伝子標的
いくつかの実施形態では、抽出したＤＮＡまたはＲＮＡを処理して、標的配列ポリヌクレオチド（特に本明細書中に記載の遺伝子標的が含まれ得る）を選択、タグ化、捕捉、および／または単離することができる。いくつかの場合では、捕捉および単離は、大量の遺伝子材料からの標的配列の物理的分離および望ましくない遺伝子材料の除去を含む。いくつかの場合では、物理的分離を、固体構造物（ポリマー表面、ポリマービーズ、磁性ビーズ、またはマイクロ流体チャネルの表面など）上に固定した相補配列への所望の配列のハイブリッド形成によって行うことができる。他の場合では、物理的分離を、アフィニティ法（アフィニティタグとコンジュゲートした相補配列のプローブを使用した所望の配列の捕捉など）によって行い、アフィニティ相互作用の非限定的な例には、マイクロモル、ナノモル、ピコモル、フェムトモル、またはフェムトモルを超える強度の結合親和性を有するストレプトアビジン−ビオチン相互作用、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、受容体−リガンド相互作用、およびタンパク質−小分子相互作用が含まれる。捕捉後、所望の配列を、いくつかの場合、当該分野で周知の洗浄方法（穏やかなイオン性または非イオン性の界面活性剤、プロテアーゼインヒビター、およびＤＮアーゼインヒビターを含む緩衝化生理食塩水での洗浄が含まれる）を使用して大量の遺伝子材料から単離することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の液滴は、ビーズ、ポリマービーズ、または磁性ビーズを含まない。
【０１２５】
本明細書中に記載のアッセイおよびプローブの標的は、胎児の遺伝子異常（異数性が含まれる）および他の遺伝子変動（変異、挿入、付加、欠失、転座、点変異、トリヌクレオチド反復障害、および／または一塩基多型（ＳＮＰ）など）に関連する任意の遺伝子標的、ならびに胎児の遺伝子異常に関連しないコントロール標的であり得る。胎児異数性に関連しない他のアッセイも本明細書中に記載する。
【０１２６】
しばしば、本明細書中に記載の方法および組成物は、余剰または喪失した染色体（特に、典型的には出生時欠損または流産に関連する染色体）を検出することができる。例えば、本明細書中に記載の方法および組成物は、常染色体トリソミー（例えば、１３、１５、１６、１８、２１、または２２トリソミー）を検出することができる。いくつかの場合、トリソミーは、流産の機会の増加に関連し得る（例えば、１５、１６、または２２トリソミー）。他の場合では、検出されるトリソミーは、乳児が出生時に欠損を伴って生まれることを示し得る生産児トリソミー（例えば、１３トリソミー（パトー症候群）、１８トリソミー（エドワーズ症候群）、および２１トリソミー（ダウン症候群））である。異常はまた、性染色体の異常であり得る（例えば、ＸＸＹ（クラインフェルター症候群）、ＸＹＹ（ヤコブ症候群）、またはＸＸＸ（Ｘトリソミー）。特定の好ましい実施形態では、遺伝子標的は、１つ以上の以下の染色体上の１つ以上の標的である：１３、１８、２１、Ｘ、またはＹ。例えば、遺伝子標的は、２１番染色体上に５０部位、および／または１８番染色体上に５０部位、および／または１３番染色体上に５０部位であり得る。
【０１２７】
本明細書中の方法および系に基づいて決定することができるさらなる胎児の状態には、１つ以上の染色体のモノソミー（Ｘ染色体モノソミー、ターナー症候群としても公知）、１つ以上の染色体のトリソミー（１３、１８、２１、およびＸ）、１つ以上の染色体のテトラソミーおよびペンタソミー（ヒトでは、性染色体で最も一般的に認められる（例えば、ＸＸＸＸ、ＸＸＹＹ、ＸＸＸＹ、ＸＹＹＹ、ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＹ、ＸＸＸＹＹ、ＸＹＹＹＹ、およびＸＸＹＹＹ））、一倍性、三倍性（各染色体が３つ（例えば、ヒトにおいて６９番染色体））、四倍性（各染色体が４つ（例えば、ヒトにおいて９２番染色体））、五倍性、および多倍性が含まれる。
【０１２８】
いくつかの場合では、遺伝子標的は、特異的染色体上に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、または１００，０００超の部位を含む。いくつかの場合では、遺伝子標的は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個超の異なる染色体上に標的を含む。いくつかの場合、遺伝子標的は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３個未満の染色体上に標的を含む。いくつかの場合では、遺伝子標的は、遺伝した遺伝子障害（常染色体優性および劣性障害ならびに伴性優性および劣性障害が含まれる）で変異することが公知の遺伝子を含む。非限定的な例には、自己免疫疾患、神経変性疾患、癌、および代謝障害を生じる遺伝子変異が含まれる。いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子異常に関連しない遺伝子標的（正常な二倍体染色体上に存在する遺伝子など）を参照した比較によって遺伝子異常（トリソミーなど）に関連する遺伝子標的の存在を検出する。
【０１２９】
本明細書中の方法または組成物はまた、染色体の個別の領域をターゲティングするプライマー組および／またはプローブを含むことができる。例えば、複数のプローブ（例えば、ＭＩＰプローブ、ライゲーションプローブ）は、染色体の第１の特異的領域をターゲティングする少なくとも１つの第１のプローブおよび染色体の第２の特異的領域をターゲティングする少なくとも１つの第２のプローブを含むことができる。いくつかの場合では、第１のプローブを、シグナルを発する分子または因子（例えば、フルオロフォア）でタグ化し、第２のプローブを、第２のシグナルを発する分子（例えば、第１のプローブにコンジュゲートしたフルオロフォアと区別することができる色調／波長のフルオロフォア）でタグ化する。次いで、複数のプローブは、標的ポリヌクレオチドに結合することができる。選択プロトコール（例えば、ライゲーション、環状化、およびその後のエキソヌクレアーゼなど）の後、選択されたプローブを、複数の区分（例えば、液滴）に分割し、その後に選択されたプローブを含む区分（例えば、液滴）の数を分析する。次いで、第１のプローブ数と第２のプローブ数との間の比を使用して、標的ポリヌクレオチドが部分的な欠失、転座、または増幅を含むかどうかを評価することができる。例えば、かかる方法を使用して、プローブ１がインタクトな染色体に向けられ、プローブ２が染色体の欠失部分内の配列に向けられる場合に染色体の部分的欠失を検出することができる。いくつかの実施形態では、異なる標的に向けられる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個超のプローブを使用することができる。いくつかの場合、この数は、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５００００、１０００００、５０００００、１００００００、またはそれを超え得る。
【０１３０】
非限定的な例では、一方のライゲーションプローブ（またはプライマー組）は２１番染色体のｑアームをターゲティングし、第２のライゲーションプローブ（またはプライマー組）はｐアームをターゲティングする。これらが共に相互に合理的に近い（例えば、いくつかの前定義された信頼区間内）という答えが得られる場合、２１番染色体濃度の測定値を検証することができる。他方では、ｐアーム上の標的を使用した測定値がｑアーム上の標的を使用した測定値と有意に異なる場合、これは、部分的異数性（染色体のフラグメント）を示し得るか、このアッセイがさらなる至適化または検証を必要とすることを示し得る。
【０１３１】
標的組の実際の測定を、２１ｑ標的の一方の色調および２１ｐ標的の別の色調の使用によって同時に行うことができる。あるいは、サンプルを、２１ｑが一方の部分で測定され、かつ２１ｐが他方の部分で測定されるように分割することができる。また、染色体を２つ以上のプライマー組（またはオリゴヌクレオチドプローブ）に分割して、染色体コピー数をより詳細に評価することができる。
【０１３２】
用語「ポリヌクレオチド」は、１つを超えるヌクレオチドを含む任意の核酸分子をいい、２、３、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくは９００ヌクレオチド、または１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくは９００キロベース、または１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくは９００メガベースの長さが含まれ得るが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドはまた、遺伝子のコード領域、ＤＮＡの非コード領域、または全染色体をいうことができる。
【０１３３】
本明細書中で使用する場合、対立遺伝子は、染色体上の同一の位置を占める遺伝子またはＤＮＡの非コード領域のいくつかの代替形態のうちの１つである。用語「対立遺伝子」を、任意の生物（細菌、ウイルス、真菌、原虫、カビ、酵母、植物、ヒト、非ヒト、動物、および古細菌が含まれ得るが、これらに限定されない）由来のＤＮＡを説明するために使用することができる。例えば、細菌は、典型的には、１つの巨大なＤＮＡ鎖を有する。細菌ＤＮＡに関する用語「対立遺伝子」は、同種の異なる細菌細胞中の同一の遺伝子形態と比較して１つの細胞中に見出される遺伝子の形態をいう。
【０１３４】
遺伝子の代替形態（例えば、対立遺伝子）は、単一のヌクレオチドが代替形態間で変動する１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を含むことができる。遺伝子または非コード領域の代替形態は、短い縦列反復（ＳＴＲ）（２つ以上のヌクレオチドの近接反復パターン）を含むことができる。
【０１３５】
対立遺伝子は、同一の配列を有し得るか、単一のヌクレオチドまたは１つを超えるヌクレオチドが異なり得る。２コピーの各染色体を有する生物に関して、両染色体が同一の対立遺伝子を有する場合、この状態をホモ接合性という。対立遺伝子２つの染色体が異なる場合、この状態をヘテロ接合性という。
【０１３６】
標的配列が胎児（ホモ接合性）中の母体ＤＮＡ（ヘテロ接合性）疾患中の１つのコピーに存在する疾患の例には、鎌状細胞嚢胞性線維症、血友病、およびテイ・サックス病が含まれる。したがって、本明細書中に記載の方法を使用して、一定の部位に１つの特異的変異を有するゲノムを一定の部位に２つの特異的変異を有するゲノムと区別することができる。
【０１３７】
鎌状細胞貧血は、常染色体劣性疾患である。米国黒人の９％がヘテロ接合性である一方で、０．２％がホモ接合劣性である。劣性対立遺伝子により、ヘモグロビンのβ鎖にアミノ酸置換が生じる。
【０１３８】
テイ・サックス病は、神経系が変性する常染色体劣性である。出生後に症状が現れる。この対立遺伝子の小児ホモ接合劣性は、５歳まで生存することは稀である。患者は、ＧＭ２ガングリオシド脂質を分解する酵素Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼを作製する能力を欠く。
【０１３９】
別の例はフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）（患者がアミノ酸フェニルアラニンをチロシンに変換する酵素を合成する能力を欠く劣性遺伝障害）である。この対立遺伝子がホモ接合劣性の個体は、尿中および血液中にフェニルアラニンおよび異常な分解産物を蓄積する。
【０１４０】
血友病は、血液が正常に凝固しない疾患群である。血液中の因子は凝固に関与する。正常な第ＶＩＩＩ因子を欠く血友病は血友病Ａを有するといい、第ＩＸ因子を欠く血友病は血友病Ｂを有する。これらの遺伝子はＸ染色体上に保持され、したがって、本方法でプライマーおよびプローブを使用して、胎児が母親の欠損Ｘ染色体または父親の正常な対立遺伝子を遺伝したかどうかを検出することができる。
【０１４１】
いくつかの場合では、遺伝子標的は、遺伝子または遺伝子の一部（例えば、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８遺伝子）、βグロビン、ヘモクロマトーシス（ｈｅｍａｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、Ｇ６ＰＤ、神経線維腫症、ＧＡＰＤＨ、βアミロイド、またはピルビン酸キナーゼ遺伝子）である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、遺伝子標的は、コピー数変動が疾患または障害に関連し得る任意の配列である。遺伝子異常から生じる他の疾患には、軟骨無形性症、副腎脳白質ジストロフィ（Ｘ連鎖性）、無ガンマグロブリン血症（Ｘ連鎖性）、アラジール症候群、αサラセミアＸ連鎖性精神遅滞症候群、アルツハイマー病、アルツハイマー病（早期発症家族型）、筋萎縮性側索硬化症（概説）、アンドロゲン不応症候群、アンジェルマン症候群、運動失調症（概説、遺伝性）、毛細管拡張性失調症、ベッカー型筋ジストロフィ（ジストロフィン異常症（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｏｐａｔｈｙ）とも呼ばれる））、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、βサラセミア、ビオチニダーゼ欠損症、鰓弓耳腎症候群、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝性乳癌／卵巣癌、乳癌、ＣＡＤＡＳＩＬ、カナヴァン病、癌、シャルコー・マリー・トゥース遺伝性神経症、シャルコー・マリー・トゥース神経症１型、シャルコー・マリー・トゥース神経症２型、シャルコー・マリー・トゥース神経症４型、シャルコー・マリー・トゥース神経症Ｘ型、コケイン症候群、結腸癌、拘縮性クモ指症（先天性）、頭蓋骨癒合症候群（ＦＧＦＲ関連）、嚢胞性線維症、シスチン蓄積症、聴覚消失および遺伝性聴力損失、ＤＲＰＬＡ（歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒａｌ−ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ ａｔｒｏｐｈｙ））、ディジョージ症候群（２２ｑｌ１欠失症候群ともいう）、拡張型心筋症（Ｘ連鎖性）、ダウン症候群（２１トリソミー）、デュシェンヌ型筋ジストロフィ（ジストロフィン異常症とも呼ばれる）、ジストニア（早期発症原発性）（ＤＹＴ１）、ジストロフィン異常症、エーラース・ダンロス症候群（脊柱後側湾型）、エーラース・ダンロス症候群（血管型）、単純型先天性表皮水疱症、外骨腫（遺伝性多発性）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィ、第Ｖ因子ライデン血栓形成傾向、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭型認知症（パーキンソニズム−１７を伴う）、ガラクトース血症、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス（遺伝性）、血友病Ａ、血友病Ｂ、出血性毛細血管拡張症、遺伝性５５、聴力損失および聴覚消失（非症候性）、ＤＦＮＡ（コネキシン２６）、聴力損失および聴覚消失（非症候性）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６）、遺伝性痙性対麻痺、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ヘキソサミニダーゼＡ欠損症（テイ・サックスとも呼ばれる）、ハンチントン病、低軟骨形成症、魚鱗癬（先天性）（常染色体劣性）、色素失調症、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症とも呼ばれる）、クラッベ病、レーバー遺伝性視神経症、レッシュ・ナイハン症候群白血病、リー・フラウメニ症候群、肢帯型筋ジストロフィ、リポタンパク質リパーゼ欠損症（家族型）、滑脳症、マルファン症候群、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および卒中様発作）、モノソミー、多発性内分泌腫瘍症２型、多発性外骨腫、遺伝性筋ジストロフィ（先天性）、筋緊張性ジストロフィ、腎性尿崩症、神経線維腫症１、神経線維腫症２、圧迫性麻痺傾向のあるニューロパチー（遺伝性）、ニーマン−ピック病Ｃ型、ナイミーヘン染色体不安定症候群 ノリエ病、眼皮膚白皮症１型、眼咽頭型筋ジストロフィ、卵巣癌、パリスター・ホール症候群、若年性パーキンソン病（パーキン型）、ペリツェーウス・メルバッハー病、ペンドレッド症候群、ポイツ・ジェガーズ症候群 フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、プラダー・ウィリ症候群、ＰＲＯＰ１関連複合型下垂体ホルモン欠乏症（ＣＰＨＤ）、前立腺癌、網膜色素変性、網膜芽細胞腫、ロートムント・トムソン（Ｒｏｔｈｍｕｎｄ−Ｔｈｏｒｎｓ）症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、痙性対麻痺（遺伝性）、球脊髄性筋萎縮症（ケネディ病とも呼ばれる）、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳性運動失調１型、脊髄小脳性運動失調２型、脊髄小脳性運動失調３型、脊髄小脳性運動失調６型、脊髄小脳性運動失調７型、スティックラー症候群（遺伝性関節眼症）、テイ・サックス（ＧＭ２ガングリオシドーシス（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｅｓ）とも呼ばれる）、トリソミー、結節性硬化症複合体、アッシャー症候群Ｉ型、アッシャー症候群ＩＩ型、口蓋心顔面症候群（２２ｑｌ１欠失症候群とも呼ばれる）、フォン・ヒッペル・リンダウ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィ、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖性拡張型心筋症（ジストロフィン異常症とも呼ばれる）、およびＸ連鎖性低緊張性顔貌精神遅滞症候群が含まれる。
【０１４３】
液滴の生成
本開示は、液滴デジタルＰＣＲを使用した胎児の遺伝子材料の検出のための組成物および方法を含む。本明細書中に記載の液滴には、米国特許第７，６２２，２８０号に記載の乳濁液組成物（または２つ以上の不混和性流体の混合物）および２００９年９月２３日に最初の発明者Ｃｏｌｓｔｏｎによって出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５３１７号に記載のデバイスによって生成された液滴が含まれる。用語「乳濁液」は、本明細書中で使用する場合、不混和性液体（油および水など）の混合物をいう。油相および／または油中水型乳濁液により、水滴内の反応混合物を区画化することが可能である。好ましい実施形態では、乳濁液は連続油相内に水滴を含む。他の場合では、本明細書中に提供した乳濁液は、連続水相内の液滴が油滴である水中油型乳濁液である。本明細書中に提供した液滴を、区画間の混合を防止し、それにより各区画の成分の蒸発および他の区画の成分との融合から保護するようにデザインする。
【０１４４】
本明細書中に記載の混合物または乳濁液は安定または不安定であり得る。好ましい実施形態では、乳濁液は比較的安定であり、融合は最小である。小滴が組み合わされて段階的により大きな液滴を形成する場合に融合が起こる。いくつかの場合では、液滴発生器から生成された０．００００１％，０．００００５％，０．０００１０％，０．０００５０％，０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％．２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％未満の液滴が他の液滴と融合する。乳濁液はまた、綿状沈殿（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）（分散相がフレークの懸濁液から得られる過程）が限定的であり得る。
【０１４５】
本明細書中に記載のサンプルの小反応体積への分割により、試薬の使用量を減少させることができ、それにより、分析における材料の費用を削減することができる。分割によるサンプル多重性の減少により、検出のダイナミックレンジも改善される。何故なら、より大量の分子を異なる区画中の少量の分子と分離し、それにより、より少量の分子がより高い比率で反応試薬に接触可能となり、より少量の分子の検出が増強されるからである。
【０１４６】
いくつかの場合では、平均直径が約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、または５００ミクロンの液滴を生成することができる。単分散または多分散の乳濁液のいずれかを生成するためのマイクロチャネルクロスフロー集束または物理的撹拌を使用した乳濁液の液滴のマイクロ流体法は公知である。いくつかの実施形態では、液滴は単分散液滴である。いくつかの場合では、前記液滴のサイズが前記液滴の平均サイズの±５％を超えて変動しないように液滴を生成する。いくつかの場合では、前記液滴の平均サイズの±２％を超えて変動しないように液滴を生成する。いくつかの場合では、液滴発生器は、単一のサンプルから液滴集団を生成する。ここで、液滴のサイズは液滴の全集団の平均サイズの±．１％、．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％を超えて変動しない。
【０１４７】
マイクロ流体操作およびより高い剪断性の流体処理（例えば、マイクロ流体毛管中または流路中での９０℃回転（弁など）による）のためにより高い機械的安定性が有用である。熱処理前後の液滴またはカプセルは、標準的なピペット操作および遠心分離に対して機械的に安定である。
【０１４８】
いくつかの場合では、液滴を、水性サンプルに油相を流すことによって形成する。いくつかの好ましい実施形態では、水相は、ＰＣＲ反応実施のための緩衝液および試薬（ヌクレオチド、プライマー、蛍光検出ためのプローブ（複数可）、テンプレート核酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、および必要に応じた逆転写酵素が含まれる）を含む。
【０１４９】
いくつかの場合では、水相は、固体状態ビーズ（磁性ビーズなど）なしのＰＣＲ反応実施のための緩衝液および試薬を含む。いくつかの場合では、緩衝液は、約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、または２００ｍＭのＴｒｉｓを含むことができる。いくつかの場合では、塩化カリウム濃度は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭであり得る。１つの好ましい実施形態では、緩衝液は、１５ｍＭのＴｒｉｓおよび５０ｍＭのＫＣｌを含む。いくつかの場合では、ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸分子（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰが含まれる）を、それぞれ約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、または７００μＭの濃度で含む。いくつかの場合、ｄＵＴＰを水相内に約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、または７００、８００、９００、または１０００μＭの濃度まで添加する。いくつかの場合では、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を、水相に約１．０、２．０、３．０、４．０、または５．０ｍＭの濃度で添加する。１つの好ましい実施形態では、ＭｇＣｌ２濃度は３．２ｍＭである。
【０１５０】
非特異的ブロッキング剤（ＢＳＡまたはウシ皮膚由来のゼラチンなど）を使用することができる。このブロッキング剤は、ゼラチンまたはＢＳＡがおよそ０．１〜０．９％ｗ／ｖの濃度範囲で存在する。他の可能なブロッキング剤には、βラクトグロブリン、カゼイン、粉乳、または他の一般的なブロッキング剤が含まれ得る。いくつかの場合では、ＢＳＡおよびゼラチンの好ましい濃度は０．１％ｗ／ｖである。
【０１５１】
水相内の増幅用のプライマーの濃度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０μＭであり得る。１つの好ましい実施形態では、プライマー濃度は０．５μＭである。いくつかの場合では、水相は、蛍光検出用の１つ以上のプローブを約０．１、０．２、０．３、０．４、または０．５μＭの濃度で含む。１つの好ましい実施形態では、蛍光検出用プローブの濃度は、０．２５μＭである。ＰＣＲ中の標的核酸濃度の許容範囲は、約１ｐｇと約５００ｎｇとの間である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、水相はまた、添加物（非特異的バックグラウンド／ブロッキング核酸（例えば、サケ精子ＤＮＡ）、生物防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム）、ＰＣＲエンハンサー（例えば、ベタイン、トレハロースなど）、およびインヒビター（例えば、ＲＮアーゼインヒビター）が含まれるが、これらに限定されない）を含むことができる。
【０１５３】
いくつかの場合では、非イオン性エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマーを、水相に約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、または１．０％の濃度で添加する。一般的な生物界面活性剤には、非イオン性界面活性剤（プルロニックＦ−６８、テトロニクス、ゾニルＦＳＮなど）が含まれる。１つの好ましい実施形態では、プルロニックＦ−６８は、濃度０．５％ｗ／ｖで存在する。
【０１５４】
いくつかの場合、硫酸マグネシウムを、塩化マグネシウムの代わりに類似の濃度で使用することができる。種々の販売者による広範な一般的な市販のＰＣＲ緩衝液を、緩衝液の代わりに使用することができる。
【０１５５】
油相はフッ素化基剤を含むことができ、このフッ素化基剤をフッ素化界面活性剤（全フッ素置換ポリエーテルなど）との組み合わせによってさらに安定化することができる。いくつかの場合では、基油は、１つ以上のＨＦＥ７５００、ＦＣ−４０、ＦＣ−４３、ＦＣ−７０、または別の一般的なフッ素化油であり得る。いくつかの場合では、陰イオン性界面活性剤は、アンモニウムクライトックス（クライトックス−ＡＭ）、クライトックスＦＳＨのアンモニウム塩、またはクライトックス−ＦＳＨのモルホリノ誘導体である。クライトックス−ＡＳは、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％、または４．０％ｗ／ｗの濃度で存在し得る。いくつかの好ましい実施形態では、クライトックス−ＡＳ濃度は１．８％である。他の好ましい実施形態では、クライトックス−ＡＳ濃度は１．６２％である。クライトックス−ＦＳＨのモルホリノ誘導体は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％、または４．０％ｗ／ｗの濃度で存在し得る。いくつかの好ましい実施形態では、クライトックス−ＦＳＨのモルホリノ誘導体の濃度は１．８％である。いくつかの好ましい実施形態では、クライトックス−ＦＳＨのモルホリノ誘導体の濃度は１．６２％である。
【０１５６】
油相は、さらに、油の性質（蒸気圧、もしくは粘度、または表面張力など）を調整するための添加物を含むことができる。非限定的な例には、ペルフルオロ−オクタノールおよび１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカノールが含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカノールを、約０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、１．００％、１．２５％、１．５０％、１．７５％、２．００％、２．２５％、２．５０％、２．７５％、または３．００％ｗ／ｗの濃度まで添加する。いくつかの好ましい実施形態では、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデカノールを０．１８％ｗ／ｗの濃度まで添加する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、加熱によって固体様界面膜を有するマイクロカプセルに変換することができる液体様界面膜を有する高度に単分散の液滴が生成されるように乳濁液を処方する。かかるマイクロカプセルは、反応過程（ＰＣＲ増幅など）によってその成分を保持することができるバイオリアクターとして作用することができる。マイクロカプセル形態への変換は、加熱の際に起こり得る。例えば、かかる変換は、約５０、６０、７０、８０、９０、または９５℃超の温度で生じ得る。いくつかの場合、この加熱は、サーモサイクラーを使用して起こる。加熱処理中、流体または鉱物油の重層を使用して、蒸発を防止することができる。過剰な連続相の油を加熱前に除去しても除去しなくても良い。生体適合性カプセルは、広範な熱処理および機械的処理にわたって融合および／または綿状沈殿に耐性を示し得る。
【０１５８】
変換後、カプセルを、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０℃で保存することができ、１つの好ましい実施形態は、約２５℃未満でのカプセルの保存を含む。いくつかの実施形態では、これらのカプセルは、生物医学的適用（高分子（特に核酸もしくはタンパク質またはその両方の混合物を含む水性の流体）の安定なデジタル化されたカプセル化、薬物およびワクチンの送達、生体分子ライブラリー、および臨床画像化への適用など）で有用である。
【０１５９】
マイクロカプセルは、１つ以上の核酸プローブ（例えば、分子反転プローブ、ライゲーションプローブなど）を含むことができ、特に高温での融合に耐性を示し得る。したがって、ＰＣＲ増幅反応は、非常に高密度で（例えば、単位体積あたりの反応数）で起こり得る。いくつかの場合では、ｍｌあたり１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、２，０００，０００、２，５００，０００、５，０００，０００、または１０，０００，０００を超える個別の反応が起こり得る。いくつかの場合では、反応は、反応体積間の混合を用いない単一のウェル（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）で起こる。マイクロカプセルはまた、ＰＣＲ反応を可能にするのに必要な他の成分（例えば、プライマー、プローブ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼなど）を含むことができる。これらのカプセルは、広範な熱処理および機械的処理にわたる融合および綿状沈殿に耐性を示す。
【０１６０】
デバイスの役割
種々のデバイスを使用して、本明細書中に記載の方法を実現することができる。図３は、胎児異数性の例示的診断方法のワークフローを示し、本明細書中の方法で使用することができるいくつかのデバイスを強調している。母体および胎児の遺伝子材料を含む母体組織サンプル（２０１）を得る。ＤＮＡをサンプルから抽出し、１番染色体（２０２）および２１番染色体（２０３）を認識するプローブに結合させ、次いで、ライゲーション反応を起こす。ライゲーションしたプローブ（およびＰＣＲ反応に必要な成分）を含むサンプルを液滴発生器（３０１）に導入し、油中水型乳濁液内の複数の液滴にプローブを分割する。本開示で有用ないくつかの液滴発生器の例は、２００９年９月２３日に最初の発明者Ｃｏｌｓｔｏｎによって出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５３１７号に記載されている。次いで、液滴をサーモサイクラー（３０２）中でインキュベートして、プローブを増幅させる。増幅反応中、増幅したプローブを含む液滴は、増幅したプローブを含まない液滴と比較して蛍光が増加する。次いで、液滴を液滴リーダー（３０３）によって個別に処理し、データを収集して蛍光を検出する。本開示に有用ないくつかの液滴リーダーの例は、２００９年９月２３日に最初の発明者Ｃｏｌｓｔｏｎによって出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５３１７号に記載されている。
【０１６１】
図３に示すように、次いで、１番染色体および２１番染色体のコピー数に関するデータを比較して、胎児異数性を検出する。しばしば、コンピュータなどのデバイスによって適用されるアルゴリズムを使用してデータを分析する。いくつかの場合では、液滴発生器、サーモサイクラー、液滴リーダー、およびコンピュータは、それぞれ、個別のデバイスである。他の場合では、１つのデバイスは、２つ以上のかかるデバイスを任意の組み合わせで含む。例えば、１つのデバイスは、サーモサイクラーと連携した液滴発生器を含むことができる。他の場合では、デバイスは、液滴発生器、サーモサイクラー、および液滴リーダーを含むことができる。
【０１６２】
本開示は、迅速、効率的、かつ高感度のコピー数の検出および／またはコピー数変動（例えば、胎児異数性）の検出のための手段を提供する。本開示は、遺伝子サンプル内に少量で存在するポリヌクレオチド（例えば、母体血サンプル内の胎児ポリヌクレオチド）のコピー数の変化の同定に特に有用である。いくつかの場合では、０．００００１、０．００００５、０．０００１０、０．０００５０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、または１０コピー未満の標的ポリヌクレオチドを検出する。いくつかの場合では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００コピー未満の標的ポリヌクレオチドを検出する。いくつかの場合では、本明細書中に記載の液滴を、１、２、３、４、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００滴／秒を超える速度で生成する。
【０１６３】
増幅
標的配列および基準配列（ならびにライゲーションプローブ内の配列）の増幅技術は当該分野で公知であり、米国特許第７，０４８，４８１号に記載の方法が含まれる。簡潔に述べれば、本技術は、サンプルを小液滴（いくつかの場合、それぞれ平均して液滴あたり１つ未満の核酸分子を含む）に分離し、各液滴中で核酸配列を増幅し、特定の標的配列の存在を検出する方法および組成物を含む。いくつかの場合では、増幅される配列は、ゲノムＤＮＡ自体よりもむしろゲノムＤＮＡに対するプローブ上に存在する。
【０１６４】
二次構造物および自己ハイブリッド形成の回避のための公知のパラメータにしたがって、プライマーをデザインする。いくつかの実施形態では、異なるプライマー対は、ほぼ同一の温度（例えば、別のプライマー対の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０℃以内）でアニーリングし、融解する。いくつかの場合では、ライゲーション可能プローブのみ（プライマーなし）を最初にゲノムＤＮＡに添加し、その後にライゲーションしたプローブを分割し、その後に、例えば、ユニバーサルプライマーを使用して各区分内のプローブ上の１つ以上の配列を増幅する。いくつかの場合では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１０，０００個超、またはそれを超えるプローブを最初に使用する。かかるプローブは、本明細書中に記載の遺伝子標的とハイブリッド形成することができる。例えば、プローブの混合物を使用することができる。この混合物では、少なくとも１つのプローブが染色体上の特異的部位をターゲティングし、第２のプローブが同一の染色体または異なる染色上の異なる部位をターゲティングする。各ライゲーション可能プローブ組は、そのユニバーサルプローブ組を有することができ、各組のための対応するＴａｑＭａｎプローブによって区別することができる。あるいは、全てのライゲーション可能プローブ組は、同一のユニバーサルプライマー組を使用することができ、各組のための対応するＴａｑＭａｎプローブによって区別することができる。ヒトゲノムＤＮＡに対して相同性を示さないユニバーサルプライマーの例示的配列には、配列番号７９および８０（図１７）が含まれる。
【０１６５】
本発明の好ましい実施形態をＰＣＲに関して記載しているが、本発明は、おもに、複数の個別の遺伝子配列検出の使用に関する。いくつかの実施形態では、増幅方法は、例えば、自立配列反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅、およびポリメラーゼ連鎖反応、Ｑ−βファージ増幅、鎖置換増幅、等温増幅、またはスプライス重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応であり得る。
【０１６６】
プライマーを、種々の方法（当該分野で周知の方法を使用した適切な配列のクローニングおよび直接化学合成が含まれるが、これらに限定されない）によって調製することができる（Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０（１９７９）；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９（１９７９））。プライマーを、商業的供給元（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｉｇｍａ、およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど）から得ることもできる。プライマーは、同一の融解温度を有し得る。プライマーの長さを５’末端または３’末端で伸長または短縮して、所望の融解温度を有するプライマーを産生することができる。好ましい実施形態では、プライマー（ｐｒｉｍｅ）対のプライマーのうちの１つは、他のプライマーより長い。好ましい実施形態では、プライマー対内のプライマーの３’アニーリング長は異なる。また、各プライマー対のアニーリングの位置を、プライマー対の配列および長さによって所望の融解温度が得られるようにデザインすることができる。２５塩基対未満のプライマーの融解温度決定のための最も簡潔な式は、ウォレス則（Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。コンピュータプログラムを使用してプライマーをデザインすることもできる（Ａｒｒａｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア（Ａｒｒａｙｉｔ Ｉｎｃ．）、遺伝子分析のためのオリゴヌクレオチドプローブ配列デザインソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏ．）、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒ、およびＨｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇのＤＮＡｓｉｓが含まれるが、これらに限定されない）。各プライマーのＴＭ（融解温度またはアニーリング温度）を、ソフトウェアプログラム（Ｎｅｔ プライマー（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏ ｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｎｅｔｐｒｉｍｅｒ／ｎｅｔｐｒｌａｕｎｃｈ／ｎｅｔｐｒｌａｕｎｃｈ．ｈｔｍｌ（２００２年４月１７日時点でのインターネットアドレス）の無料のウェブベースのプログラム）など）を使用して計算する。別の実施形態では、プライマーのアニーリング温度を再計算し、任意の増幅サイクル（サイクル１、２、３、４、５、サイクル６〜１０、サイクル１０〜１５、サイクル１５〜２０、サイクル２０〜２５、サイクル２５〜３０、サイクル３０〜３５、またはサイクル３５〜４０が含まれるが、これらに限定されない）後に増加させることができる。最初の増幅サイクル後、プライマーの５’側の半分を目的の各遺伝子座由来の産物に組み込み、したがって、ＴＭを、各プライマーの５’側の半分および３’側の半分の配列の両方に基づいて再計算することができる。
【０１６７】
いくつかの好ましい実施形態では、標的配列および基準配列を含み得る所望の配列を、上記のように単離および線状化されている以前に環状化したＭＩＰであるテンプレートＭＩＰによって示す。テンプレートＭＩＰは、ＰＣＲにおいてテンプレート分子として働く。いくつかの場合では、テンプレートＭＩＰを液滴生成前に産生し、他の場合では、テンプレートＭＩＰを液滴生成中または生成後に産生する。最後の場合の一例では、ウラシル塩基のウラシル−Ｎ−デグリコシラーゼ処理に起因する脱塩基部位を含む環状ＭＩＰは、サーモサイクラーでのＰＣＲ反応の融解工程での加熱の際に自発的開環反応を受ける。いくつかの場合では、テンプレートＭＩＰは液滴デジタルＰＣＲのためのＤＮＡテンプレートとして働き、ここで、テンプレートＭＩＰの増幅は、ＭＩＰが示す所望の配列（例えば、標的配列または基準配列）の検出に対応する。いくつかの実施形態では、本方法は、サンプル流体中に不混和性液体を流すことによって液滴デジタルＰＣＲ反応のための液滴を生成する工程であって、サンプル流体が１つ以上のＭＩＰまたは１つ以上のテンプレートＭＩＰおよびＰＣＲに必要な試薬を含むマスターミックスを含む、工程を含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＰＣＲ用のマスターミックスは、熱安定性ポリメラーゼ酵素、テンプレートＭＩＰ増幅のためのユニバーサルプライマー、組み込みのための遊離ＤＮＡヌクレオチド、および反応用の緩衝液成分を含む。熱安定性ポリメラーゼ酵素は、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８０、７０℃前後の温度に曝露した場合に活性を保持することができる。いくつかの場合では、サンプル流体は、さらに、消化したゲノムＤＮＡまたは不活化した酵素（ＭＩＰテンプレート生成から保持されたエンドヌクレアーゼおよび／またはデグリコシラーゼなど）を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＭＩＰまたはＭＩＰテンプレートによって示された１つ未満、１つ、または１つを超えるゲノム当量のＤＮＡを含む液滴の生成を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、標的配列および基準配列を含み得る所望の配列は、望ましくないバックグラウンドゲノムＤＮＡを含む混合物の一部として存在する。いくつかの場合では、所望の配列のみ（バックグラウンドゲノムＤＮＡ配列ではない）を、ライゲーション検出反応および液滴デジタルＰＣＲを使用して検出する（例えば、ライゲーション産物のみがユニバーサルプライマーを含むマスターミックスを使用したＰＣＲにおいて検出可能な産物を形成する能力を有する場合）。他の場合では、所望の配列を、配列特異的プライマーを使用した液滴デジタルＰＣＲで検出する。
【０１６９】
いくつかの好ましい実施形態では、本開示は、胎児の遺伝子材料を検出するために使用することができる平均して約１ゲノム当量のＤＮＡを含む乳濁液を含む組成物を含む。いくつかの場合では、１つ以上のＭＩＰまたはＭＩＰテンプレートは目的の配列（２１番染色体領域など）を示し、その検出によって胎児異数性を決定することが可能である。いくつかの場合では、遺伝子異常（トリソミーなど）に関連し得る遺伝子標的を示す目的の配列を含む組成物を、遺伝子異常に関連し得ない基準配列を示す配列を含む組成物と比較することができる。いくつかの場合では、検出感度を、遺伝子標的に向けられるプローブの多重化によって増強することができる。さらに、複数の遺伝子標的を、複数の同時検出様式（以下に詳述の蛍光検出方法における異なる色調など）を使用して並行して試験することができる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、遺伝子標的には、ライゲーション産物（ＭＩＰ、ＭＩＰテンプレート、またはライゲーションしたプローブなど）によって示すことができる任意の核酸分子が含まれ得る。これらのライゲーション産物は、不混和性液体を流して液滴を生成するサンプル流体中に存在する。ＰＣＲに必要な試薬を、その後の液滴デジタルＰＣＲのために液滴中に含めることもできる。本明細書中で分析することができる遺伝子標的の例には、胎児の遺伝子異常に関連し得ない遺伝子変動（異数性、変異、挿入、付加、欠失、転座、点変異、トリヌクレオチド反復障害、および／または一塩基多型（ＳＮＰ）など）が含まれる。
【０１７１】
プライマーのアニーリング温度を、任意の増幅サイクル後（サイクル１、２、３、４、５、サイクル６〜１０、サイクル１０〜１５、サイクル１５〜２０、サイクル２０〜２５、サイクル２５〜３０、サイクル３０〜３５、またはサイクル３５〜４０が含まれるが、これらに限定されない）に再計算し、上昇させることができる。最初の増幅サイクル後、プライマーの５’側の半分を目的の各遺伝子座由来の産物に組み込み、したがって、ＴＭを、各プライマーの５’側の半分および３’側の半分の両配列に基づいて再計算することができる。プライマー伸長を触媒する任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウフラグメント、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、ＲＥＤＴａｑ（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシーケナーゼが含まれるが、これらに限定されない）。好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。反応物をポリメラーゼ添加前に９５℃に２分間加熱するホットスタートＰＣＲも行うことができるか、サイクル１での第１の加熱工程までポリメラーゼを不活性に保持することができる。ホットスタートＰＣＲを使用して、非特異的増幅を最小にすることができる。任意のＰＣＲサイクル数を使用して、ＤＮＡを増幅することができる（２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５サイクルが含まれるが、これらに限定されない）。
【０１７２】
標的核酸（例えば、ライゲーションプローブ、ＭＩＰプローブ）の増幅を、当該分野で公知の任意の手段によって行うことができる。いくつかの場合では、標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する。使用することができるＰＣＲ技術の例には、定量的ＰＣＲ、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、多重蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、シングルセルＰＣＲ、制限酵素切断断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ／ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕポロノニーＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲ、およびエマルジョンＰＣＲが含まれるが、これらに限定されない。他の適切な増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自立配列複製、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライミングＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）、および核酸ベースの配列増幅（ＮＡＢＳＡ）が含まれる。本明細書中で使用することができる他の増幅方法には、米国特許第５，２４２，７９４号；同第５，４９４，８１０号；同第４，９８８，６１７号；および同第６，５８２，９３８号に記載の増幅方法が含まれる。いくつかの実施形態では、標的核酸の増幅をビーズ上で行うことができる。他の実施形態では、増幅はビーズ上で起こらない。
【０１７３】
いくつかの場合では、サーモサイクリング反応を、液滴中に含まれるサンプル上で行う。いくつかの好ましい場合、液滴は、サーモサイクリング中にインタクトなままである。液滴は、約１０，０００滴／ｍＬ、１００，０００滴／ｍＬ、２００，０００滴／ｍＬ、３００，０００滴／ｍＬ、４００，０００滴／ｍＬ、５００，０００滴／ｍＬ、６００，０００滴／ｍＬ、７００，０００滴／ｍＬ、８００，０００滴／ｍＬ、９００，０００滴／ｍＬ、または１，０００，０００滴／ｍＬを超える密度でサーモサイクリング中にインタクトなままであり得る。他の場合では、２つ以上の液滴は、サーモサイクリング中に融合し得る。他の場合では、１００滴超または１，０００滴超がサーモサイクリング中に融合し得る。
【０１７４】
検出および分析
ＰＣＲ産物の検出を、蛍光技術を使用して行うことができる。ＤＮＡ結合時に蛍光が増加するＤＮＡ挿入色素（臭化エチジウムまたはＳＹＢＲグリーンなど）により、反応体積中のＤＮＡの存在量を定量的に読み取ることができる。このＤＮＡ量が反応中に増加するにつれて、蛍光強度が増加する。ＤＮＡ挿入色素を含む方法は、バックグラウンド蛍光の影響を受けやすい。何故なら、これらの方法は、配列特異的様式でＤＮＡを測定せず、反応産物と他の分子（プライマー二量体など）とを区別しないからである。配列特異性が得られるＰＣＲ産物の検出方法は、蛍光剤−消光剤対を含み、かつ特異的配列とハイブリッド形成するプローブを含む。蛍光剤は検出可能な光を放射する任意の分子（フルオロフォアなど）であり得、消光剤は、この放射を吸収して蛍光剤による放射の強度を減少させる任意の分子であり得る。相補配列を含む溶液中に存在する場合、蛍光剤−消光剤プローブは配列に結合する。ＰＣＲ反応中、ポリメラーゼ（Ｔａｑなど）はプライマーとしてこのプローブを使用することができ、プローブは細胞中でＲＮＡプライマーを切り出すように機能する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって切断される。プライマーとして合成蛍光剤−消光剤プローブを使用したＰＣＲ反応の場合、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブが切断され、それにより、消光剤から蛍光剤が分離される。一旦消光剤にもはや共有結合しなくなると、蛍光剤からの蛍光放射を検出することができる。
【０１７５】
本開示の好ましい実施形態は、ＭＩＰテンプレートを使用して産生した液滴デジタルＰＣＲ産物の検出を含む。いくつかの場合では、遺伝子標的と異なるＭＩＰに特異的な配列に結合する蛍光剤−消光剤プローブの切断によって検出される。このストラテジーにより、ＭＩＰによって示される遺伝子標的に対する配列特異性を必要とせずにＭＩＰを検出するユニバーサル蛍光剤−消光剤プローブが使用可能である。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、標的配列への結合の際に蛍光を発するようになる分子指標（ＭＢ）プローブを使用することができる。ＭＢプローブは、５’末端に蛍光剤を含み、かつ３’末端に消光剤を含むステム−ループ構造を有するオリゴヌクレオチドである。蛍光共鳴エネルギー移動による消光度は、消光剤と蛍光剤との間の距離の６乗に反比例する。加熱および冷却後、ＭＢプローブは、蛍光剤からの蛍光シグナルを消光するステム−ループ構造物を再編成する。その配列がループ配列に相補的なＰＣＲ産物が加熱／冷却サイクル中に存在する場合、ＰＣＲ産物の１つの鎖へのＭＢのハイブリッド形成により、消光剤と蛍光剤との間の距離が増加し、それにより、蛍光が増加する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ユニバーサルプローブの使用によって検出する。ユニバーサル蛍光剤プローブ（ＵＦＰ）は、一定範囲の波長の電磁放射線の吸収の際に検出可能な電磁放射線を放射する蛍光分子を含む。ユニバーサル消光剤プローブ（ＵＱＰ）は、近位蛍光剤プローブの蛍光放射の強度を減少させる消光剤分子を含む。１つの場合、ユニバーサル蛍光剤プローブは、ユニバーサル消光剤プローブ上の相補核酸セグメントまたは標的配列内の相補核酸セグメント（ＭＩＰなど）とハイブリッド形成する核酸セグメントを含む。ＰＣＲ中、かかる標的配列の増幅により、消光剤プローブと比較してユニバーサル蛍光剤プローブの標的配列への結合が増加し、それにより、検出可能な蛍光が増加する。いくつかの場合では、ユニバーサル蛍光剤プローブとユニバーサル消光剤プローブとの間の相補配列の長さを変化させて、ユニバーサル消光剤プローブに結合したユニバーサル蛍光剤プローブの複合体の融解温度を調整することができる。いくつかの場合では、相補配列の長さは１５塩基対であり得る。いくつかの場合では、相補配列の長さは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、または８０塩基対超であり得る。ユニバーサル消光剤プローブに結合したユニバーサル蛍光剤プローブの複合体の融解温度は、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５℃超であり得る。
【０１７８】
図６は、切断することなくユニバーサルプライマーおよびユニバーサルプローブを使用した液滴中の核酸検出のための２色系を示す。ユニバーサルプローブは、２つの相補オリゴヌクレオチド（一方は蛍光分子を含む蛍光剤プローブ（ＵＦＰ１またはＵＦＰ２）であり、他方は消光分子を含む消光剤プローブ（ＵＱＰ１またはＵＱＰ２）を含む。異なる色調のＵＦＰ１およびＵＦＰ２の蛍光を、検出時に区別可能である。消光剤プローブに結合する場合、蛍光剤プローブの蛍光強度は実質的に減少する。さらに、２対のユニバーサル順方向および逆方向プライマーは、蛍光剤プローブに相補的な領域を含み、標的配列のＰＣＲ増幅を促進する。第１の増幅ラウンドでは、蛍光剤プローブに相補的な領域を、ユニバーサルプライマーを介してテンプレートに組み込む。その後の増幅ラウンドでは、蛍光剤プローブＵＦＰ１またはＵＦＰ２は、したがって、その各消光剤プローブよりもむしろこのテンプレートとハイブリッド形成することができる。いっそう多くのこれらのテンプレートが増幅反応によって指数関数的に生成されるにつれて、ＵＦＰ１−ＵＱＰ１およびＵＦＰ２−ＵＱＰ２複合体は、競合的結合によってＵＦＰ１−テンプレートおよびＵＦＰ２−テンプレート複合体に置換される。蛍光剤プローブと消光剤プローブとの間のこの分離の結果として、蛍光強度が反応中に増加し、その後の工程で検出することができる。
【０１７９】
ユニバーサルプローブを、当該分野で公知の方法によってデザインすることができる。いくつかの実施形態では、プローブはランダム配列である。ユニバーサルプローブを、アッセイ中の標的ポリヌクレオチドやサンプル中に存在する可能性が高い他の非標的ポリヌクレオチド（例えば、標的ポリヌクレオチドによって占められる領域の外側のゲノムＤＮＡ）に確実に結合しないように選択することができる。ユニバーサルプローブの配列の例には、配列番号８１および８２が含まれる。
【０１８０】
蛍光剤によって吸収することができる励起光を発生するためのモジュールおよび蛍光剤によって放射された光を検出するためのモジュールを備えた種々の検出デバイスを使用して、蛍光を検出することができる。いくつかの場合では、サンプル（液滴など）を、大量に検出することができる。例えば、サンプルを検出器中に配置したプラスチックチューブに割り当て、プラスチックチューブからの大量の蛍光を測定することができる。いくつかの場合では、１つ以上のサンプル（液滴など）をプレートの１つ以上のウェル（９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートなど）に分割することができ、蛍光プレートリーダーを使用して各ウェルの蛍光を検出することができる。
【０１８１】
いくつかの場合では、検出器は、さらに、液滴サンプルを取り扱う能力（各液滴を検出器に入れ、検出し、次いで、検出器から出す）を有する。例えば、フローサイトメトリーデバイスを、液滴サンプルからの蛍光の検出で使用されるように適合することができる。いくつかの場合では、液滴の移動を調節するためのポンプを備えたマイクロ流体デバイスを使用して、一列の液滴由来の蛍光を検出する。いくつかの場合では、液滴を二次元表面上に整列させ、検出器を表面に対して移動させ、単一の液滴を含む各位置での蛍光を検出する。
【０１８２】
蛍光検出データの収集後、いくつかの場合にコンピュータを使用して、データを保存および処理する。コンピュータ実行可能ロジックを使用して、バックグラウンド蛍光のサブトラクション、標的および／または基準配列の割り当て、およびデータの定量化などの関数を実行することができる。例えば、サンプル中の疑われる異数体染色体（２１番染色体など）の存在に対応する蛍光を含む液滴数を計数し、異数性が疑われない染色体（１番染色体など）の存在に対応する蛍光を含む液滴数と比較することができる。図９は、分子プロファイリング由来の診断結果の表示、保存、回収、または計算、ゲノムまたは核酸発現分析由来の生データの表示、保存、回収、または計算、または本発明の方法で有用な任意のサンプルまたは患者の情報の表示、保存、回収、または計算に有用なコンピュータを示す。
【０１８３】
標的配列および基準配列の増幅のためのプライマーを含むサンプルのデジタルＰＣＲ後、標的配列を有する陽性サンプル数および基準配列を有する陽性サンプル数を比較することができる。これは母体組織中に存在する配列の比較であるので、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとを区別する必要はない。標的配列が二倍体であることが公知の基準配列と同数のコピーを含む場合、サンプルを同様に二倍体であると決定することができる。標的配列が基準配列と異なる場合、サンプルはおそらく異数性を含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、上記のように母体組織から得たゲノムＤＮＡを、平均して液滴あたり１ゲノム当量（ＧＥ）未満であるように複数の反応体積（例えば、液滴）に分割する。いくつかの場合では、液滴は、平均して１ＧＥ／液滴をはるかに超えて含む（平均して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、３０、４５、または５０ＧＥ／液滴など）。いくつかの場合では、サンプルは平均して１、５、または１０ＧＥ／液滴を超えて産生するが、それにもかかわらず、いくつかの液滴はＧＥを含まないか、標的ポリヌクレオチドを含まない。かかる場合、特定の遺伝子標的の平均コピー／液滴数を計算するためのアルゴリズムを適用する必要があり得る。いくつかの場合では、遺伝子標的は、実際に、その後に断片化される全染色体（またはフラグメント）であり、したがって、複数の液滴中に１コピーが出現し得る。
【０１８５】
しばしば、個別の反応体積を試験すべき遺伝子異常の存在について分析する場合、分析すべきＤＮＡ（染色体）は、平均して、存在しても存在しなくても良く、いわゆるデジタル分析が可能である。特定の標的配列を含む反応体積の集合数を、基準配列と数の相違について比較することができる。標的配列と二倍体配列であることが公知の基準配列との間の正常（例えば、１：１）以外の比は、異数性を示す。例えば、サンプルを、各液滴が名目上の１ゲノム当量未満のＤＮＡを含むように反応体積（液滴など）に分割することができる。目的の標的（例えば、２１番染色体トリソミーの遺伝子マーカーまたは関連プローブ）の基準配列（例えば、１番染色体上の公知の二倍体配列または関連プローブ）に対する相対比を、多数の反応体積（例えば、液滴）（１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、またはそれを超える数など）の試験によって決定することができる。他の場合では、反応体積（液滴など）は、液滴あたり平均して１つ以上の標的ヌクレオチド（またはゲノミック当量）を含む。かかる場合、標的ヌクレオチドの平均コピー数を、アルゴリズム（Ｄｕｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ３（８）：ｅ２８７６に記載のアルゴリズムなど）の適用によって計算することができる。
【０１８６】
多数の反応体積の分析により、胎児異数性に起因する１：１からの相対比の変化を、胎児ＤＮＡの相対濃度が母体ＤＮＡと比較して低い場合に出発サンプル中の胎児および母体のＤＮＡの混合物から測定することができる。これをデジタル分析という。なぜなら、各反応体積が、反応体積あたり平均して１ゲノム当量を有し、したがって、希釈物を、計数すべき配列（例えば、標的または基準）の存在に関して二進法の「イエス−ノー」の結果として読み取ることができるからである。
【０１８７】
本明細書中に記載の方法および組成物を、広範な適用で使用することができる。いくつかの実施形態では、方法および組成物は、遺伝子障害に関連する状態の診断、検出、同定、予測、評価、または診断のための方法に関連する。かかる状態は、特異的遺伝子座（本明細書中に提供した任意の遺伝子座が含まれる）内の遺伝的要因（遺伝子障害、変動、変異、ＳＮＰ、欠失、増幅、転座、反転、または任意の他の異常が含まれる）に起因し得る。
【０１８８】
本明細書中に提供した方法および組成物を使用して、胎児が遺伝子異常（例えば、ダウン症候群、胎児異数性など）を有するリスクを診断、検出、予測、同定、または評価することができる。本方法を使用して、妊婦が妊娠中の問題（第一期、第二期、または第三期内の流産、死産、乳児の出生時欠損、早産または分娩に伴う他の問題、および妊娠、分娩、または出産に関連する他の任意の他の状態が含まれる）を経験するリスクを同定、定量、診断、予後診断、評価、または分析することもできる。
【０１８９】
本明細書中に提供した方法および組成物を使用して、第２のポリヌクレオチドと比較した第１のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｃＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）の相対コピー数を評価することができる。本方法を使用して、溶液中の合成プラスミド量を分析し、被験体から得たサンプル内の病原性生物（例えば、細菌、ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、インフルエンザウイルスなど）の配列を検出することができる。本方法を、ポリヌクレオチドの小集団がポリヌクレオチドのより大きな集団内に存在する他の適用で使用することもできる。
【０１９０】
方法のいくつかの例
いくつかの実施形態では、本方法は、一般に、以下の工程を含む。
【０１９１】
１．妊娠した被験体由来のＤＮＡを含む組織を得る工程。いくつかの実施形態では、組織は、母体血（全血または末梢血）、血漿、または血清であり得る。この材料を採血し、循環ＤＮＡを細胞中よりもむしろ血漿中で見出すことができる。いくつかの実施形態では、母体組織（血液または血漿など）を、公知の方法（約３００ヌクレオチド未満のＤＮＡフラグメントを選択するためのサイズ分画など）によって胎児ＤＮＡを富化させることができる。いくつかの実施形態では、約５００ヌクレオチドよりも巨大である傾向がある母体ＤＮＡを排除することができる。他の実施形態では、Ｄｈａｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ Ｆｒｅｅ Ｆｅｔａｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍａｔｅｒｎａｌ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，”（２００４）Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ｓｏｃ．２９１：１１１４−１１１９に記載のように、別の富化工程を使用して、血液サンプルをホルムアルデヒドで処置することができる。さらに他の実施形態では、当該分野で周知の方法（エタノール沈殿など）を使用して、サンプル中の他の材料からＤＮＡを精製する。
【０１９２】
必要に応じて、ゲノムＤＮＡ中の目的の配列を、１つ以上のオリゴヌクレオチド（すなわち、プローブ）への特異的結合によって捕捉することができる。いくつかの場合では、ゲノムＤＮＡとプローブとの混合物をリガーゼ反応に供し、それにより、ゲノムＤＮＡに結合するプローブが選択的にライゲーションされる。いくつかの場合では、ＤＮＡへの結合によって反転および線状プローブ（ＭＩＰなど）の環状化が起こり、ライゲーション反応によって環状産物が産生される。これらの場合のいくつかでは、ゲノムＤＮＡおよび非結合プローブを、エキソヌクレアーゼ処理を使用してサンプルから除去することができる。
【０１９３】
２．このサンプル由来の単一のＤＮＡ分子を出発サンプルから分割される多数の個別の反応体積（例えば、水相液滴）に分布させる工程。いくつかの実施形態では、反応体積数を、出発サンプルＤＮＡ分子中の標的のコピー数について統計的に有意な結果が得られるように選択することができる。反応体積を、反応分子が接近するように少量に制限し、それにより、反応時間を減少させることができる。反応体積あたりのＤＮＡ分子量は、反応体積あたり約０．５、１、２、３、４、またはそれを超えるＤＮＡ分子であり得る。いくつかの場合では、反応体積あたりのＤＮＡ分子数は、平均して、反応体積あたり約１ＤＮＡ分子である。いくつかの場合では、単一の液滴の反応体積は、１００ｐＬ、５００ｐＬ、１ｎＬ、１０ｎＬ、または１００ｎＬまでであり得る。
【０１９４】
３．核酸増幅技術（ＰＣＲ反応など）を使用してＤＮＡ中の標的配列の存在を検出する工程。各反応体積（例えば、液滴）は、当該分野で周知のＰＣＲ実施に必要な全ての試薬を含むことができる。１つの実施形態では、母体組織サンプルを、液滴に分割し、これを連続フローＰＣＲ増幅（米国特許第７，０４８，４８１号および米国特許出願第６１／１９４，０４３号（その両方の全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のものなど）で増幅する。いくつかの場合では、増幅は、ゲノムＤＮＡ自体よりもむしろゲノムＤＮＡに結合するプローブ内の配列の増幅である。他の実施形態では、母体組織サンプルを液滴に分割し、サーモサイクラーのウェル中で増幅させる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ産物を探索するか、従来の定量的読み取りを行うために標識することができる。例えば、各反応体積中の１つ以上の配列の蛍光シグナルを読み取ることができる（蛍光標識、プローブ、または挿入色素の使用などによる）。検出工程を本明細書中でデジタルＰＣＲといい、種々の方法（（ａ）流れまたはストップトフロー中のＰＣＲ産物を含む各液滴；（ｂ）マイクロタイタープレートの各ウェルに希釈したサンプル由来のＰＣＲ産物；（ｃ）乳濁液に希釈したサンプル由来のＰＣＲ産物；または（ｄ）マイクロ流体チャンバー中に捕捉したサンプル由来のＰＣＲ産物の蛍光の測定など）によって行うことができる。
【０１９５】
４．母体および胎児の標的配列検出の定量的分析工程。いくつかの場合、これは異なる領域に対する標的を含むことができる（正常な二倍体染色体上の配列（基準として使用される）と比較して異常なコピー数（トリソミーなど）で存在すると疑われる染色体上の標的に対するプローブなど）。分析はまた、ライゲーション産物（（例えば、エキソヌクレアーゼ処理を使用して）ゲノムＤＮＡおよび非結合プローブから単離し、酵素処理を使用して線状化した環状ＭＩＰなど）の検出を含むことができる。いくつかの場合では、各区分の蛍光強度の測定によって定量的決定を行う一方で、他の場合、検出可能なシグナルを含む区分数の計数によって測定する。いくつかの実施形態では、バックグラウンド蛍光を計上するために全測定値から引くことができるバックグラウンド測定値が得られるようにコントロールサンプルを含めることができる。他の実施形態では、１、２、３、４、または４つを超える異なる色調を使用して、異なる配列を測定することができる（異なる配列を認識するプローブに適合した異なるＰＣＲプライマー上の異なる色調のフルオロフォアの使用などによる）。
【実施例】
【０１９６】
実施例１．２色検出スキームを使用した胎児ＤＮＡの検出
この実施例では、母体血漿サンプル中に３％の胎児ＤＮＡが存在する場合の２１トリソミー胎児異数性の検出を記載する。母体血漿１ｍＬ中に１０００ゲノム当量（ＧＥ）が存在し、２０ｍＬの母体血体積を採取する。
【０１９７】
血漿を遠心分離によって母体血サンプルから単離し、核酸を精製し、５０μＬの体積まで濃縮する。サンプルを、多重化アッセイ成分を含む同体積のＰＣＲ試薬と混合する。全部で１００μＬのサンプルを、液滴あたり１ｎＬの体積を有する１００，０００水滴に分割する。理想的な陽性液滴の比率７５％を定量するために、これはポアソン分布に基づいて液滴あたり１．４７コピーの標的配列を意味する。これは、１００，０００滴の１ｎＬ液滴に区画化される必要がある１４７，０００標的に変換される。これに到達するために必要なプライマー組の数は１４７，０００ＧＥ／１０，０００ＧＥであり、これは１５重である。したがって、各液滴では、各標的配列および基準配列について１５重であるか、液滴あたり全部で３０プライマー組である。サンプルを、２色検出スキームを使用して分析する。このスキームでは、標的配列が緑色放出体を使用して蛍光を探索し、基準配列が黄色、橙色、または赤色の放出体を使用して蛍光を探索する。１００，０００滴にわたって検出を行い、標的配列（緑色）の基準配列（黄色、橙色、または赤色）に対する比を計算する。
【０１９８】
実施例２．１色検出スキームを使用した胎児ＤＮＡの検出
異なる有色の標的プローブおよび基準プローブを使用するよりもむしろ、サンプルを分割し（例えば、半分）、次いで、２組の液滴を生成し、増幅し、個別に分析し、一方の半分は標的プローブを使用し、他方の半分は基準プローブを使用することを除いて、ここでは実施例１の条件を使用する。
【０１９９】
実施例３．ＭＩＰ−ｄｄＰＣＲを使用した胎児ＤＮＡの検出
無細胞血漿を、遠心分離によって母体血サンプルから単離する。次いで、無細胞ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して核酸を精製し、濃縮する。次いで、精製したゲノムＤＮＡを、２１番染色体に対する１０００染色体配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＭＩＰプローブ）（ＭＩＰ−２１Ｃｈｒ）および１番染色体に対する１０００染色体配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＭＩＰプローブ）（ＭＩＰ−１Ｃｈｒ）と混合する。リパーゼ、ポリメラーゼ、および他の反応成分を混合物に添加する。サンプルを２０℃で４分間インキュベートする。次いで、サンプルを９５℃で５分間インキュベートして変性を促進し、次いで、６０℃で１５分間インキュベートしてゲノムＤＮＡへのＭＩＰプローブのアニーリングを促進する。次いで、ギャップ充填反応を行ってＭＩＰプローブを環状化する。（いくつかの場合では、ギャップ充填反応を使用せずに末端を直接ライゲーションすることができる）。ヌクレオチドをサンプルに添加し、次いで、６０℃で１０分間インキュベートして、リガーゼおよびポリメラーゼをＭＩＰプローブ中のギャップに結合させる。次いで、サンプルを３７℃で１分間インキュベートする。次に、サンプルをエキソヌクレアーゼＩおよびＩＩＩで処理して残存する線状プローブおよびｓｓＤＮＡ（プローブとハイブリッド形成しないゲノムＤＮＡなど）を消化し、その後に３７℃で１４分間インキュベートしてエキソヌクレアーゼ活性を促進し、９５℃で２分間インキュベートしてエキソヌクレアーゼを不活化し、最後に、３７℃で１分間インキュベートする。次に、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼをサンプルに添加し、３７℃で１０分間インキュベートして酵素による脱プリン化を促進し、その後に９５℃で２０分間インキュベートしてＭＩＰプローブ中の脱塩基脱プリン化ウラシル残基を切断する。線状化したプローブは、ここで、逆のプライマー方向を有する。
【０２００】
次に、サンプルに対して液滴デジタルＰＣＲを行う。Ｔａｑポリメラーゼ、ユニバーサルプライマー、Ｔａｑｍａｎ蛍光プローブ、およびＰＣＲ反応成分をサンプルに添加する。ＭＩＰ−２１Ｃｈｒプローブ上のユニバーサルプローブ結合配列に相補的なＴａｑｍａｎ蛍光プローブをＦＡＭ色素でタグ化し、ＭＩＰ−１Ｃｈｒプローブ上のユニバーサルプローブ結合配列に相補的なＴａｑｍａｎ蛍光プローブをＶＩＣ色素でタグ化する。次いで、サンプルを、乳化油相および／または水性ＰＣＲ反応相への界面活性剤の添加物によって安定化した１００，０００単分散−油中水型液滴に乳化する。結果として、サンプルを１００，０００滴に分割する。次いで、サンプルを、各液滴中での各ＰＣＲ反応を終点まで駆動するための条件下で１５〜５０熱サイクルに供する。次いで、液滴を、２色検出スキームの使用によって分析して、ＦＡＭおよびＶＩＣ色素の放出を検出する。Ｃｈ２１について計数した標的数を、ＦＡＭ蛍光について陽性および陰性の液滴の画分の同定によって決定する。同様に、基準サンプル（Ｃｈ１）について計数した標的数を、ＶＩＣ蛍光について陽性および陰性の液滴の画分の同定によって決定する。次いで、陽性および陰性の液滴数を、ポアソン分布の投入として使用して標的染色体および基準染色体の両方についての液滴あたりのコピー数（λ）を決定する。次いで、Ｃｈ２１の相対コピー数を、例えば、Ｄｕｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｌｏｓ ＯＮＥ ３（８）：ｅ２８７６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００２８７６に記載の当該分野で公知の式を使用して決定する。かかる式を使用して推定値の信頼度も決定する。
【０２０１】
実施例４．陽性および陰性の液滴シグナルの分離ならびに
ＭＩＰ反応におけるテンプレートコピー数に対するｄｄＰＣＲの感度
環状化反応
多重化ＭＩＰ環状化産物を、１０μＬアニーリング混合物あたり多重中に１００アトモル（ａｍｏｌ）の各ＭＩＰ種を含む３重または１２重プローブプールのいずれかを使用して生成した。１アトモルは、１０^−１８モルと等しい。１００ａｍｏｌは、およそ６０Ｍコピーの各ＭＩＰプローブ配列に等しい。アニーリング反応物の体積は２０μｌであった。
【０２０２】
（本実験では、本プロトコールで引用した全ての体積は２０μｌアニーリング反応から開始して倍にしたが、全てのＤＮＡ、緩衝液、および酵素の濃度を、標準的な１０μｌアニーリング反応プロトコールと同一に維持したことに留意のこと）。プローブプールを、２４核酸の１番染色体の基準組（配列番号１〜２４）（配列番号８１によって検出）または２４核酸の２１番染色体の試験組（配列番号２５〜４８）（配列番号８２によって検出）のいずれか由来の選択したＭＩＰプローブ（ＩＤＴ Ｕｌｔｒａｍｅｒｓ、ＰＡＧＥによって精製）の集合希釈物から処方した。
【０２０３】
ＭＩＰプローブを、１×アンプリガーゼ緩衝液を含む９６ウェルＰＣＲプレート中で種々のコピー数のＲａｊｉヒトｇＤＮＡ（０；１００；１，０００；または１０，０００コピー、３ｐｇ ｇＤＮＡ／コピー）と合わせ、サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｐｒｏ．ＳまたはＡＢＩ９７００）中にて９５℃で５分間変性させ、次いで、５８℃に冷却し、この温度で１２時間超インキュベートおよびアニーリングした。
【０２０４】
アニーリング後、サーモサイクラー中を５８℃に維持しながら、０．７５Ｕのアンプリガーゼを、５μＬの１×アンプリガーゼ緩衝液中の各反応物に混合しながら添加して全体積１５μＬの混合物を得て、プレートを再度シールし、５８℃でさらに１５分間インキュベートした。
【０２０５】
非環状化材料の消化
環状化反応の直後に、サーモサイクラーの温度を一様な割合でで４℃まで低下させ、非環状化した過剰なＭＩＰプローブおよびｇＤＮＡのエキソヌクレアーゼ消化を、１×ＥｘｏＩＩＩ緩衝液（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ）中に６ＵのＥｘｏＩおよび３０ＵのＥｘｏＩＩＩを含む５μＬの混合物を各反応ウェルに混合しながら添加することによって行い、プレートを再度シールした（総反応体積＝２０μＬ）。消化をサーモサイクラーにて３７℃で２０分間進行させ、その後に９５℃で１０分間熱変性させた。
【０２０６】
ＭＩＰ反応産物を、ｑＰＣＲ（２０μＬのｑＰＣＲ反応あたり４μＬの環状化反応混合物）によって分析し、その後に−２０℃で凍結し、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）実験で使用するために保存した。
一般的な２×保存液の調製
一般的な保存液（１０ｍＬ）を以下のように処方した。
【０２０７】
【表１】

一般的な保存液を４℃で保存し、複数の実験のために使用した。
２×Ｈｂ＿ｐｒ１ ｄｄＰＣＲ保存液の調製
２×Ｈｂ＿ｐｒ１ ｄｄＰＣＲ保存液（５２０．５μＬ）を以下のように処方した。
【０２０８】
【表２】

１．２５×Ｈｂ＿ｐｒ１ ｄｄＰＣＲ保存液の調製
１．２５×ＨＢ＿ＰＲ１ ｄｄＰＣＲ保存液（８００μＬ）を以下のように処方した。
【０２０９】
【表３】

１．２５×Ｈｂ＿ｐｒ１ ｄｄＰＣＲ保存液を、４つの遠心管（容量１．５ｍＬ）に１６０μＬアリコートで分割した。
２×Ｈｂ＿ｐｒ２ ｄｄＰＣＲ保存液の調製
２×Ｈｂ＿ｐｒ２ ｄｄＰＣＲ保存液（９３６．９μＬ）を以下のように処方した。
【０２１０】
【表４】

１．２５×Ｈｂ＿ｐｒ２ ｄｄＰＣＲ保存液の調製
１．２５×Ｈｂ＿ｐｒ２ ｄｄＰＣＲ保存液（１４４０μＬ）を以下のように処方した。
【０２１１】
【表５】

１．２５×Ｈｂ＿ｐｒ２ ｄｄＰＣＲ保存液を、８つの遠心管（容量１．５ｍＬ）に１６０μＬアリコートで分割した。
ｄｄＰＣＲ手順
ＭＩＰ環状化実験産物を解凍し、遠心分離した（２，０００ｒｐｍで２分間）。ＭＩＰ産物の２連のアッセイ反応由来の４０μＬアリコート（すなわち、２×２０μＬアリコート）を、ＴａｑｍａｎアッセイＨｂ＿ｐｒ１を含むようにデザインされたＭＩＰのための１．２５×Ｈｂ＿ｐｒ１ ｄｄＰＣＲ保存液またはＴａｑｍａｎアッセイＨｂ＿ｐｒ２を含むようにデザインされたＭＩＰのための１．２５×Ｈｂ２ ｄｄＰＣＲ保存液のいずれか１６０μＬと合わせた。反応混合物を、シリンジポンプシステムを備えたＣｈｉｐＳｈｏｐ液滴生成システムを使用して、反応混合物を１ｎＬ液滴に分割した。
【０２１２】
液滴サンプルを、サーモサイクラープレート（３×３０μＬアリコート／液滴サンプル）に移し、ホイルシールでシールし、約１．２５時間サーモサイクリングを行った。サーモサイクリングを、９４℃で１０分間プレートを保持することによって開始し、その後にプレートを３５または４０サイクル（９４℃、２０秒／６５℃、６０秒）のサイクリングに供し、最後にプレートを４℃に冷却し、保持した。サーモサイクリングを行ったプレートを、この温度で保存した。
【０２１３】
残りの液滴アリコートを、Ｎｉｋｏｎ光学顕微鏡下で観察して、均一性および適切なサイズを評価した。
【０２１４】
サーモサイクリングを行ったサンプルを、ＱｕａｎｔａＬｉｆｅ Ｂｏｘ ２α検出システムに配置した。このシステムでは、液滴サンプルを自動的に１つのウェルから一度に取り出し、検出器によってシングルファイルを通過させ、これを使用して反応したＦＡＭ Ｔａｑｍａｎプローブ由来の液滴サイズおよび蛍光強度の両方を評価した。
【０２１５】
適切なサイズの各ウェル中の液滴を、その蛍光振幅に応じて陽性または陰性の液滴のいずれかとしてスコアリングし、これらの分布を使用して、ポアソン統計にしたがってアッセイしたサンプル標的の濃度をコンピュータで計算した。
【０２１６】
図１０の上のパネルは、陽性液滴数（またはカウント）の増加がテンプレートＤＮＡの投入コピーの増加と相関することを示す。ここで、ＲａｊｉゲノムＤＮＡ（Ｒａｊｉ癌細胞由来）を実験のために使用した。これらの実験のために、最初の３列（上のパネルのＤ４〜６、下のパネルのＦ４〜６）で示したサンプルの０コピー（またはテンプレートコントロールなし「ＮＴＣ」）のＤＮＡの投入コピーを使用し、次の３列の組で１００コピー（上のＤ７〜９、下のＦ７〜９）、次の３列の組で１０００コピー（上のＥ４〜６、下のＧ４〜６）、および最後の３列で１０，０００コピー（上のＥ７〜Ｅ９および下のＧ７〜Ｇ９）を使用した。上のパネルでは、全てのＭＩＰ反応を、３つの異なるＭＩＰプローブ（それぞれ、試験染色体（２１番染色体（ｈｂ＿ｐｒ２にも対応する）である）上の異なる部位に向けられる）を使用してＭＩＰ３重を用いて行った。上のパネルについて、左パネル上の１０６０５ＲＦＵ（相対蛍光単位）の横線および右パネル上の１０６０５ＲＦＵの縦線は、陽性液滴と陰性液滴との間の閾値の境界を定めている。示した実験を三回行う。
【０２１７】
下のパネルは、より大きなＭＩＰプローブ組を使用して行った同一実験である。下のパネルでは、１２個の各ＭＩＰプローブが２１番染色体内の異なる領域に向けられるＭＩＰ１２重を使用した。図１０に示すように、下のパネルは、所与の投入数（例えば、ＮＴＣ、１００、１０００、１００００）のＤＮＡテンプレートでおよそ４倍の陽性液滴数を示す。ｙ軸は、各液滴から放射されたＦＡＭシグナル（またはＴａｑｍａｎプローブ）についての相対蛍光単位を示す。上および下の両パネルについて、右のパネルは、液滴の種々の蛍光振幅を示す度数ヒストグラムを提供し、左パネルに示した全１２レーン由来のデータを合わせている。ここで、Ｘ軸は、ＦＡＭシグナルの相対蛍光単位を提供する。下のパネルについて、左パネル上の１０，４３１ＲＦＵの横線（相対蛍光単位）および右パネル上の１０，４３１ＲＦＵでの縦線は、陽性液滴と陰性液滴との間の閾値の境界を定めている。
【０２１８】
図１１は、ＭＩＰプローブプールが基準ポリヌクレオチド（ｈｂ＿ｐｒ１、すなわち１番染色体）に対するプローブに由来する場合に図１０に示す結果に類似の結果が得られることを示す。パネルの左側のボックスで囲ったカウントは、１０，０００コピーのテンプレートＤＮＡを使用した３重ＭＩＰプローブプールの使用によって得たカウント数を反映する一方で、グラフの右側のボックスで囲ったカウントは、１０，０００コピーのテンプレートＤＮＡを使用した１２重ＭＩＰプローブプールの使用によって得たカウント数を反映する。示した実験を三回行う。
【０２１９】
図１２は、１，０００〜１０，０００コピーのテンプレートで行った場合のカウント数の１０倍増加によって示されるように、１０００コピーまたは１０，０００コピーのテンプレートが反応物中に存在するかどうかと無関係にハイブリッド形成効率が類似することを示す。図１２はまた、ゲノムＤＮＡの所与のコピー数について、ＭＩＰプローブの多重度の増加によってカウント数を増加させることができることを示す。ＭＩＰプローブは所与の染色体にわたって多重化することができ、それにより少数のゲノミック当量から多数のカウントが得られる。このことは、標的と基準との間の小さなコピー数の変化の区別に重要である。示した実験を三回行う。
【０２２０】
本発明の別の実施形態を本明細書中に示し、説明しているが、かかる実施形態を例示のみのために提供していることが当業者に明らかである。本発明を逸脱することなく、当業者は、多数の変形形態、変更形態、代替形態を想到する。本明細書中に記載の発明の実施形態の種々の代替形態を本発明の実施で使用することができると理解すべきである。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲およびその等価物の範囲内の方法および構造物がこれらによって対象とされることを意図する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出する方法であって、
ａ．第１のライゲーションプローブを第１の標的ポリヌクレオチドに結合する工程、
ｂ．第２のライゲーションプローブを第２の標的ポリヌクレオチドに結合する工程、
ｃ．前記第１および第２のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して１つ以上のライゲーションした産物を得る工程、
ｄ．前記１つ以上のライゲーションした産物を２つ以上の区分に分割する工程、
ｅ．前記１つ以上のライゲーションした産物内の領域を増幅して増幅された産物を得る工程、
ｆ．前記増幅された産物を含む前記区分の数を決定する工程、および
ｇ．前記区分の前記数に基づいて前記第１の標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記標的ポリヌクレオチドを前記２つ以上の区分に分割しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅過程中に前記２つ以上の区分が実質的にインタクトなままである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記決定工程（ｆ）中に前記２つ以上の区分が実質的にインタクトなままである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１および第２のライゲーションプローブをそれぞれ前記第１の標的ポリヌクレオチドに結合するようにデザインする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記分割工程（ｄ）が前記標的ポリヌクレオチド分子の分割を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記２つ以上の区分が前記ライゲーションした産物から開始される増幅反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のライゲーションプローブを種内の個体間で保存されているポリヌクレオチド配列に結合するようにデザインする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記区分が少なくとも２つの不混和性流体の混合物内に存在する水滴である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
連続油相が前記水滴を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも４つのライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチドに結合する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも４つのライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチドに結合し、少なくとも４つのライゲーションプローブを前記第２の標的ポリヌクレオチドに結合する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチド内の第１の領域に結合するようにデザインし、前記第２のライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチド内の第２の領域に結合するようにデザインし、前記第１および第２の領域が同一の配列を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが前記第２の標的ポリヌクレオチドと同一ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが試験染色体であり、前記第２の標的ポリヌクレオチドが基準染色体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試験染色体が２１番染色体、１３番染色体、１８番染色体、およびＸ染色体からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２番染色体、Ｘ、およびＹ染色体からなる群から選択される染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが染色体のセグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記染色体のセグメントが胎児異数性に関連する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ライゲーション反応によって前記第１のライゲーションプローブの５’領域を前記第１のライゲーションプローブの３’領域にライゲーションして環状のライゲーションした産物を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ライゲーション反応によって前記第１のライゲーションプローブの５’領域を前記第２のライゲーションプローブの３’領域にライゲーションして前記第１および第２のライゲーションプローブの少なくとも一部を含む線状のライゲーションした産物を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のライゲーションプローブの前記５’領域および前記３’領域を、それぞれ、前記第１の標的ポリヌクレオチド内の近接配列に結合するようにデザインする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のライゲーションプローブの前記５’領域および前記３’領域を、それぞれ、前記第１の標的ポリヌクレオチド内の隣接配列に結合するようにデザインする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記隣接配列が少なくとも１つのヌクレオチドによって分離される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ライゲーション反応が、前記第１のライゲーションプローブの前記５’領域と前記３’領域との間の領域中にヌクレオチドを組み込むためのテンプレート駆動ギャップ充填反応をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のライゲーションプローブが酵素によって切断可能な部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
酵素によって切断可能な前記部位が１つ以上のウラシルを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
酵素によって切断可能な前記部位が制限部位を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のライゲーションプローブがパッドロックプローブである、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１のライゲーションプローブが分子反転プローブである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
酵素反応を行って線状ポリヌクレオチドを除去する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
酵素反応を行って一本鎖ポリヌクレオチドを除去する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１のライゲーションプローブを第１のシグナル伝達因子にコンジュゲートし、前記第２のライゲーションプローブを第２のシグナル伝達因子にコンジュゲートする、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１のシグナル伝達因子が第１の色調の蛍光マーカーであり、前記第２のシグナル伝達因子が第２の色調の蛍光マーカーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記決定工程（ｆ）が、前記第１のライゲーションプローブを第１のシグナル伝達因子で検出する工程および前記第２のライゲーションプローブを第２のシグナル伝達因子で検出する工程を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１のライゲーションプローブが複数のライゲーションプローブを含み、各プローブが第１の染色体の異なる領域に向けられ、前記第２のライゲーションプローブが複数のライゲーションプローブを含み、各プローブが第２の染色体の異なる領域に向けられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが試験染色体であり、前記第２の標的ポリヌクレオチドが基準染色体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１および第２のライゲーションプローブを同一のシグナル伝達色を有するシグナル伝達因子とコンジュゲートする、請求項１４に記載の方法。
【請求項４０】
遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出する方法であって、
ａ．第１のライゲーションプローブを第１の標的ポリヌクレオチドに結合する工程、
ｂ．第２のライゲーションプローブを第２の標的ポリヌクレオチドに結合する工程、
ｃ．前記第１および第２のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して１つ以上のライゲーションした産物を得る工程、
ｄ．前記１つ以上のライゲーションした産物を連続油相内の２つ以上の水滴に分割する工程、
ｅ．前記１つ以上のライゲーションした産物内の配列を増幅して増幅された産物を得る工程、
ｆ．前記増幅された産物を含む２つ以上の水滴の数を決定する工程、および
ｇ．前記第１の標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程
を含む、方法。
【請求項４１】
前記標的ポリヌクレオチドを前記２つ以上の水滴に分割しない、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記増幅工程（ｅ）中または前記決定工程（ｆ）中に、前記２つ以上の水滴が実質的にインタクトなままである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記２つ以上の水滴が平均して１つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法が、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
工程（ｄ）の前記２つ以上の水滴が４，０００滴超を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記４，０００滴超を１００，０００水滴／ｍｌ超の密度で単一のチャンバー内で互いに合わせる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記液滴は単分散液滴である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法は、１，０００コピー未満の前記第１の標的ポリヌクレオチドを含む遺伝子材料集団内の前記第１の標的ポリヌクレオチドを検出することができる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記２つ以上の水滴が平均して１つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法が、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記２つ以上の水滴の直径は、それぞれ、平均して、５０ｎｍと３００μｍとの間である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが遺伝子障害に関連する染色体セグメントである、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記ライゲーション反応によって前記第１のライゲーションプローブの５’領域を前記第１のライゲーションプローブの３’領域にライゲーションする、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１のライゲーションプローブがパッドロックプローブである、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１のライゲーションプローブが分子反転プローブである、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
前記２つ以上の水滴が相当数のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたビーズを含まない、請求項４０に記載の方法。
【請求項５５】
前記連続油相が陰イオン性フルオロ界面活性剤を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５６】
前記陰イオン性フルオロ界面活性剤が陰イオン性フルオロ界面活性剤のアンモニウム塩であるクライトックス（商標）である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記クライトックスが、クライトックスＡＳ、クライトックスＦＳＨ、およびクライトックスＦＳＨのモルホリノ誘導体からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記油相がフッ素化油を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５９】
前記２つ以上の水滴がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたマイクロビーズを含まない、請求項４０に記載の方法。
【請求項６０】
胎児の遺伝子状態を検出する方法であって、
ａ．標的ポリヌクレオチドを含む母体および胎児の遺伝子材料の混合物を得る工程、
ｂ．前記混合物を前記標的ポリヌクレオチドに結合するターゲティングオリゴヌクレオチドと組み合わせる工程、
ｃ．前記ターゲティングオリゴヌクレオチドを反応体積に細分割する工程であって、前記反応体積の少なくとも１つが前記標的ポリヌクレオチドや前記ターゲティングオリゴヌクレオチドを含まない、細分割する工程、
ｄ．前記反応体積内で増幅反応を行う工程、
ｅ．前記反応体積内の前記標的ポリヌクレオチドまたは前記ターゲティングオリゴヌクレオチドの存在を検出する工程、および
ｆ．前記混合物中の前記標的ポリヌクレオチドの相対レベルを決定して、胎児の遺伝子状態を検出する工程
を含む、方法。
【請求項６１】
前記反応体積が連続油相内の水滴である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがプライマー対を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがライゲーションプローブを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドが分子反転プローブを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがパッドロックプローブを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記反応体積が、平均して、１コピーを超えるターゲティングオリゴヌクレオチドを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記反応体積が、平均して、１コピーを超える標的ポリヌクレオチドを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
前記反応体積が基準ポリヌクレオチドに対するプライマーをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
前記反応体積が基準ポリヌクレオチドに対するライゲーションプローブをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７０】
前記ライゲーションプローブを前記反応体積内で増幅する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記遺伝子材料が胎児の遺伝子材料を選択的に予め富化させた細胞サンプルに由来しない、請求項６０に記載の方法。
【請求項７２】
前記標的ポリヌクレオチドは、１８、１３、２１番染色体、およびＸ染色体からなる群から選択される染色体内に存在する、請求項６０に記載の方法。
【請求項７３】
前記反応体積が油相内の水滴であり、前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがライゲーションプローブであり、工程（ｆ）中の前記決定が前記ライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数を基準ポリヌクレオチドに向けられるライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数と比較することを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７４】
前記基準ポリヌクレオチドが、胎児の遺伝子異常に関連しない染色体領域である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成後のライゲーションの際に環状になるライゲーションプローブである、請求項６０に記載の方法。
【請求項７６】
ライゲーションしたプローブを含むマイクロカプセルであって、前記マイクロカプセルが、以下：
ａ．複数のライゲーションプローブを遺伝子サンプル内の標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させる工程、
ｂ．少なくとも１つの前記結合したライゲーションプローブの５’末端を同一または異なる結合したライゲーションプローブの３’末端にライゲーションし、それにより、少なくとも１つのライゲーション産物を得る工程、
ｃ．前記少なくとも１つのライゲーション産物を含む水溶液を液滴生成デバイスに導入する工程、
ｄ．前記少なくとも１つのライゲーション産物を含む水滴を産生するためのデバイスを使用する工程であって、前記水滴が不混和性流体内に存在する、工程、および
ｅ．前記液滴を固相外面を含むマイクロカプセルに変換する工程
によって得られる、マイクロカプセル。
【請求項７７】
前記変換が５０℃超での加熱を含む、請求項７６に記載のマイクロカプセル。
【請求項７８】
前記不混和性流体がフッ素化界面活性剤を含む、請求項７６に記載のマイクロカプセル。
【請求項７９】
前記不混和性流体がフッ化炭素油を含む、請求項７６に記載のマイクロカプセル。
【請求項８０】
前記不混和性流体が陰イオン性フルオロ界面活性剤を含む、請求項７６に記載のマイクロカプセル。
【請求項８１】
前記不混和性流体がアンモニウムクライトックスを含む、請求項７６に記載のマイクロカプセル。
【請求項８２】
前記マイクロカプセルが、オリゴヌクレオチドに結合したビーズを含まない、請求項７６に記載のマイクロカプセル。
【請求項８３】
前記マイクロカプセルが７０℃超の温度で実質的にインタクトなままである、請求項７６に記載のマイクロカプセル。
【請求項８４】
前記ライゲーションプローブが、遺伝子障害に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合することができる、請求項７６に記載のマイクロカプセル。
【請求項８５】
前記ライゲーションプローブが、胎児異数性に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合することができる、請求項７６に記載のマイクロカプセル。
【請求項８６】
前記遺伝子標的が、２１番染色体、１３番染色体、１８番染色体、およびＸ染色体からなる群から選択される染色体内に存在する、請求項７６に記載のマイクロカプセル。
【請求項８７】
１つ以上の前記ライゲーションプローブがパッドロックプローブである、請求項７６に記載のマイクロカプセル。
【請求項８８】
１つ以上の前記ライゲーション産物が環状化プローブである、請求項７６に記載のマイクロカプセル。
【請求項８９】
１つ以上の前記ライゲーションプローブが分子反転プローブである、請求項７６に記載のマイクロカプセル。
【請求項９０】
２つ以上の水滴を含む油中水混合物であって、前記２つ以上の水滴のうちの少なくとも１つが第１の標的ポリヌクレオチドに向けられる第１のライゲーションプローブを含み、前記２つ以上の水滴のうちの少なくとも１つが第２の標的ポリヌクレオチドに向けられる第２のライゲーションプローブを含む、油中水混合物。
【請求項９１】
前記第１の標的ポリヌクレオチドおよび前記第２の標的ポリヌクレオチドが同一の分子である、請求項９０に記載の油中水混合物。
【請求項９２】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが前記第２の標的ポリヌクレオチドの配列と異なる配列を有する、請求項９０に記載の油中水混合物。
【請求項９３】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが前記第２の標的ポリヌクレオチドと同一の配列を有する、請求項９０に記載の油中水混合物。
【請求項９４】
前記第１の標的ポリヌクレオチドがゲノムセグメント内に第１の領域を含み、前記第２の標的ポリヌクレオチドが前記ゲノムセグメント内に第２の領域を含み、前記第１の領域が前記第２の領域と同一の配列を有さない、請求項９０に記載の油中水混合物。
【請求項９５】
前記油中水混合物がアンモニウムクライトックス界面活性剤をさらに含む、請求項９０に記載の油中水混合物。
【請求項９６】
前記アンモニウムクライトックス界面活性剤が前記混合物の油相中に少なくとも０．０１％の濃度で存在する、請求項９０に記載の油中水混合物。
【請求項９７】
前記油中水混合物が前記第１の標的ヌクレオチドの増幅された産物を含まない、請求項９０に記載の油中水混合物。
【請求項９８】
前記第１のライゲーションプローブが分子反転プローブである、請求項９０に記載の油中水混合物。
【請求項９９】
前記第１のライゲーションプローブが環状プローブである、請求項９０に記載の油中水混合物。
【請求項１００】
前記第１のライゲーションプローブが、酵素切断に供した環状化プローブの線状化産物である、請求項９０に記載の油中水混合物。
【請求項１０１】
前記酵素切断がウラシル−Ｎ−グリコシラーゼまたは制限酵素によって触媒される、請求項１００に記載の油中水混合物。

【図１】

【図２】

【図３】

【図５】

【図６】

【図８】

【図９】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図４】

【図７】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【公表番号】特表２０１３−５１１９９１（Ｐ２０１３−５１１９９１Ａ）
【公表日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４１２１２（Ｐ２０１２−５４１２１２）
【出願日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８１２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６６４７６
【国際公開日】平成２３年６月３日（２０１１．６．３）
【出願人】（５１２００３６５２）クアンタライフ，　インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】