遺伝子発現分析データの正規化のための参照遺伝子
本発明は、患者の血液試料からの遺伝子発現分析データの正規化のための参照遺伝子、プライマー、およびプローブに関する。本発明はさらに、参照遺伝子、プライマー、またはプローブを活用する遺伝子発現分析データの正規化のための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子、特に、遺伝子発現分析データの正規化（normalization）のための請求項１に記載される参照遺伝子のセット、参照遺伝子から導かれたＰＣＲプライマー、特に、請求項２に記載されるＰＣＲプライマーのセット、参照遺伝子から導かれたプローブ、特に、請求項３に記載されるプローブのセット、ならびに請求項４に記載される遺伝子発現分析の正規化のための方法に関する。
【０００２】
多様な条件下でも最小限の発現の変化しか示さない遺伝子を、特に、血球から特定することが求められている。これらの所謂「ハウスキーパー」または「ハウスキーピング」遺伝子は、遺伝子発現、ＲＮＡおよびｍＲＮＡの定量において参照、内部対照、および参照値として利用される。これらの利用は、ノーザンブロッティング、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、キャピラリー電気泳動、マイクロアレイ、および定量的リアルタイムＰＣＲのような方法や、さらに転写物からの直接測定および事前増幅後の測定のための方法において行われる。
【０００３】
以下においては、用語「ハウスキーパー」、「ハウスキーピング遺伝子」、および「発現制御遺伝子」は、用語「参照遺伝子」に包含されるものとする。この単純化は、本発明のいかなる制限をも意味するものではなく、判読の容易化のために行われるものである。
参照遺伝子を利用する定量データの正規化には、多数の応用の可能性がある。これらの参照遺伝子は、その活性が様々な病的状態において差次的に調節されている遺伝子の同定を可能にし、さらには、それに基づく診断の開発を可能にする。
参照遺伝子は、様々なＲＮＡ試料において発現および転写が最小限の変化を示す遺伝子であり、様々な試料の遺伝子活性測定の対照または参照として機能する。全ての組織の亘り不変の活性を示す遺伝子は存在しない。したがって、新しい参照遺伝子、特に血液の診断の為の参照遺伝子が、血液からの発現値が診断において使用されることから、強く求められている。
【０００４】
種々の対照遺伝子が後記の文献［１］で公知であるが、全血試料または血球による遺伝子発現および転写の正規化のための参照遺伝子およびそれらの転写物、また、それらの併用は知られていない。血球の中や、全血中の臓器や末梢組織由来の細胞の中に一定濃度で存在する転写物（また、ｍＲＮＡおよびmicroＲＮＡならびにadditionalＲＮＡ）は、遺伝子活性の正規化のため、および他の遺伝子活性変化の決定のための前提条件であり、血液に基づく診断のための前提条件である。同様に、ＳＩＲＳと敗血症の診断／予後診断のための遺伝子活性の測定についての多くの研究報告が既になされている（たとえば、文献［２］、［３］）。しかし、血液由来の参照遺伝子を用いる遺伝子活性シグナルの使用と定量化については、これまで報告されていない。
【０００５】
したがって、疾患特異的遺伝子または遺伝子クラスターの遺伝子発現の正規化および定量化を可能にするための、強く、安定性のある、血液および血球由来の参照遺伝子が求められている。
【０００６】
本発明は、敗血症の典型である病理学的現象（文献［４］の定義による）が検出された個体の試料中の血球中に存在している様々な遺伝子の遺伝子活性が、敗血症と診断されていない個体の同じ遺伝子の遺伝子活性と異なることがないこと、そして、血球由来の遺伝子活性の正規化や血液由来の転写物の濃度の決定のために、参照遺伝子として組み合わせてまたは単独で使用できることの発見に基づくものである。これにより、他の遺伝子の活性の正規化と相対的な定量化が可能となり、診断、予後診断、治療、および検証に利用することができる。
【０００７】
したがって、本発明は、医学的障害によってもたらされる遺伝子発現の変化の識別に対する基準点の提供、ひいては診断または治療検証の手段および方法を提供することを目的とする。
【０００８】
この目的は、複数の参照遺伝子を通じて、特に、請求項１により特徴付けられる参照遺伝子セットにより達成される。
【０００９】
本発明の目的はさらに、請求項１に記載される参照遺伝子セット由来のプライマー、特に請求項２に記載されるプライマーセット、ならびにプローブ、特に請求項３に記載されるプローブセットにより達成される。
【００１０】
方法に関する本発明の目的は、請求項４に記載される特徴により達成される。
【００１１】
本発明は、血液由来の新規の参照遺伝子の同定、適切なマイクロアレイプローブとＰＣＲプライマーに関する。また本発明は、それらを、血液および血球からの定量的発現データの正規化のために、マイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、増幅や決定のための様々な視覚化のオプションを伴う他のシステムにおいて、使用あるいは併用に関するものである。更に、本発明は、医学的障害に対する全身反応（たとえば、ＳＩＲＳ、敗血症、臓器不全を伴う重症敗血症）により生じる様々な位置での局所的炎症の変化診断のためのそれらの利用に関するものである。
【００１２】
これらの検討においては、遺伝子発現分析の正規化は極めて重要である。本発明の目的から、正規化とは以下のように理解されねばならない。
【００１３】
「正規化」は、検出技術上避けられない変動幅（誤差）を小さくし、または、除去することによって、様々なアレイもしくはＰＣＲ、特に、ＲＴ−ＰＣＲ実験の測定値を比較できるようにすると理解される。これらの実験には、測定値を歪めてしまう可能性がある原因が複数存在する。妨害の可能性のある技術的原因は、逆転写、標識、またはハイブリダイゼーション反応の効率が異なること、ならびに、アレイ、試薬のバッチ差（batch effect）、または実験室特有の条件に伴う問題が挙げられる。
【００１４】
本発明の方法は、個体の血液試料中で、１つまたはいくつかの被験遺伝子の活性を識別することができる点で特徴的である。それは、ＳＩＲＳと敗血症との参照遺伝子の遺伝子産物の量に対する被験遺伝子の遺伝子産物の存在と量を決定することにより行われる。
【００１５】
この目的のための、血液および血球に由来する参照遺伝子と遺伝子配列、ならびにそれらから導かれたプライマーおよびプローブが開示される。これらは、遺伝子活性および転写物の決定、視覚化、正規化、および定量のために使用することができる。好ましい実施態様でのオリゴヌクレオチドプローブの配列が表１に示され、これらは、付属の配列プロトコールの配列番号１から配列番号７の１つに対応する。表２のプライマー配列は、付属の配列プロトコールの配列番号８から配列番号２１の１つに対応する。オリゴヌクレオチドプローブの配列はまた他の配列とすることもでき、好ましい実施態様においては、５０から１００ヌクレオチドの長さを有しておりこれは、配列番号２２から配列番号９７の配列を有している表３−１及び表３−２に示される遺伝子の転写物に特異的に結合する。ＰＣＲのような増幅方法において使用される配列は、所望される酵素的操作および増幅をこれらがサポートする限りは、無作為な長さを有することができる。
【００１６】
【表１】
【００１７】
【表２】
【００１８】
【表３−１】
【表３−２】
【００１９】
表２のプライマーは、命名された遺伝子の所望される領域（配列）を含む増幅産物を作製するために使用することができる。通常の実施態様においては、生成物は１５０から２００ヌクレオチドの長さを有する。
【００２０】
参照遺伝子は単独またはいくつかの遺伝子と組み合わせて使用される。通常は、本明細書中に記載される参照遺伝子の活性は、マイクロアレイ用のハイブリダイゼーションプローブ、またはＰＣＲプライマーとリアルタイムＰＣＲを活用して決定することができる。但し、参照遺伝子とそれらの発現産物は、当業者に公知の他の方法による増幅の後に決めることも可能である。増幅の方法としては、例えば、ＮＡＳＢＡ (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)あるいはＮＡＳＢＡと他の種々の増幅法との組み合わせなどがある。これらはまた、モノクローナル抗体の活用等の多数の別の方法、または視覚化オプションを活用して、決定することもできる。プライマーおよびプローブは、遺伝子、発現産物（ｍＲＮＡ）、そしてｍＲＮＡまでには完全には処理されていない中間体発現産物について使用することができる。
【００２１】
他の実施形態においては、プライマーおよびプローブは、本発明によって開示される参照遺伝子またはその転写物の特異的領域に結合する。しかし、プローブおよびプライマーは本発明によって開示される遺伝子配列またはそれらから転写された配列の任意の領域と相互作用することができる。プライマーおよびプローブは連続的な塩基対合によって相互作用することができるが、完全に相補的な配列との相互作用は必ずしも必要ではない。緩衝液の組成、塩濃度、洗浄工程、および温度は、適宜選択することができる。
【００２２】
同様に、参照遺伝子と試験遺伝子のこれらの変化は、１つまたはいくつかの参照試料の発現値（または、たとえば平均値のようにそれらから導かれたデータ）と比較されるが、この参照試料は標的試料と同時には決定されるものではない。
【００２３】
本発明の実施形態の１つは、１つまたはいくつかの試験核酸に対して発現値を比較するため、および試験核酸と比較した定量化のための参照遺伝子として表３−１及び表３−２に記載される参照遺伝子ならびに血液および血球由来のこれらの参照遺伝子の核酸および転写物を使用することにより発現値を決定することを特徴とする。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、表１に記載される配列を有している核酸およびＤＮＡプローブ、ならびに、溶液中の、または表面もしくは粒子もしくはビーズ上に固定された、表３−１及び表３−２に記載される遺伝子の血液中または血球由来のＲＮＡ（マイクロＲＮＡを含む）および転写物（ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）へのそれらの結合体を特徴とする。また本発明の実施形態は、これらの遺伝子の結合した転写物が、プローブに結合した１つまたはいくつかの試験核酸に対する核酸の結合量（発現値）の比較による正規化のために、そして結合した試験核酸と比較した定量化のために使用されることを特徴とする。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、参照遺伝子由来のＲＮＡ量と試験遺伝子由来のＲＮＡ量との関係を確立することよるＳＩＲＳと敗血症（いずれも文献［４］に対応）のエキソビボ、インビトロ（試験管レベル）での識別方法を特徴とし、以下の工程を含むものである。
ａ）血液試料から参照遺伝子ＲＮＡと試験遺伝子ＲＮＡを単離する工程。
ｂ）参照遺伝子ＲＮＡと試験遺伝子ＲＮＡを検出マーカーでマーキングし、ハイブリダイゼーション条件下でＤＮＡと接触させる工程。ここに、前記ＤＮＡは、参照遺伝子の転写物、増幅産物、もしくはインビトロ転写物に特異的に結合する遺伝子断片またはオリゴヌクレオチドである。
ｃ）工程ｂ）による参照遺伝子ＲＮＡと試験遺伝子ＲＮＡのマーキングシグナルを定量的に検出する工程。ならびに、
ｄ）特定遺伝子または遺伝子断片が参照遺伝子のシグナルと比較してより強く発現されているか、またはより弱く発現されているかどうかの指示を出すためにマーキングシグナルの定量的データを比較する工程。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、参照遺伝子ＲＮＡが標的遺伝子ＲＮＡの測定前にＤＮＡとハイブリダイズさせられ、対照ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のマーキングシグナルが検出され、必要な場合にはさらに変換され、検量線または表の形式で保存されることを特徴とする。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、参照遺伝子のＲＮＡまたはその一部が、たとえば、ピロシーケンス（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による配列決定または部分的な配列決定によって同定され、定量されることを特徴とする。
本発明の別の実施形態は、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡが参照遺伝子ＲＮＡとして使用されることを特徴とする。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、マイクロアレイの形態を有している支持体上の予め決定された領域の中での参照遺伝子ＲＮＡまたはそのインビトロ転写物の特異的結合のために、ＤＮＡが配置される、具体的には、固定されることを特徴とする。
【００２９】
本発明の別の実施形態は、生物学的試料がヒトの試料であることを特徴とする。
【００３０】
配列番号１から配列番号９７を有しているこれらの配列は本発明の範囲に含まれ、それによる本発明の一部を構成する１０７の配列を含む付属の配列プロトコールの中に詳細に開示される。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、固定されたプローブまたは遊離のプローブが表１に対応する配列でマークされることを特徴とする。この実施形態については、自己相補的オリゴヌクレオチド、いわゆる分子ビーコンが、プローブとして使用される。それらの末端に、これらはフルオロフォア・消光剤対（fluorophore/quencher pair）を持っており、結果として、相補的配列が存在しない場合には、これらは折り畳まれたヘアピン構造で存在しており、対応する試料配列を伴う場合にのみ蛍光シグナルを提供する。分子ビーコンのヘアピン構造は、試料が特異的な捕捉（catcher）配列でハイブリダイズして立体構造の変化を生じ、それにより、レポーターの蛍光の放出を生じるまでは安定である。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１から１４の核酸プローブまたはそれらの相補物が、参照遺伝子の転写物、またはそれらの相補物の結合に使用されることを特徴とする。
【００３３】
本発明の別の実施形態は、参照遺伝子の合成アナログまたは参照遺伝子の転写物に結合する合成オリゴヌクレオチドに、具体的に、およそ６０の塩基対が含まれることを特徴とする。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、特許請求の範囲においてＤＮＡとして列挙される遺伝子が、それらのＲＮＡ、合成アナログ、アプタマー、およびペプチド核酸に由来する配列によって置き換えられることを特徴とする。
【００３５】
本発明の別の実施形態は、放射性マーカー、具体的には、32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、33Ｐ、または3Ｈが検出マーカーとして使用されることを特徴とする。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、非放射性マーカー、具体的には、色素または蛍光マーカー、酵素マーカー、または免疫マーカー、および／または量子ドット、あるいは、電気的測定が可能なシグナル、具体的には、ハイブリダイゼーションにおける電位および／または伝導率および／または容量の変化が検出マーカーとして使用されることを特徴とする。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、試料ＲＮＡと参照遺伝子ＲＮＡおよび／または酵素的もしくは化学的誘導体が同じマーキングを持つことを特徴とする。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、試験遺伝子ＲＮＡと参照遺伝子ＲＮＡおよび／または酵素的もしくは化学的誘導体が異なるマーキングを持つことを特徴とする。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、ＤＮＡプローブがガラスまたはプラスチック上に固定されることを特徴とする。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、１種類のＤＮＡ分子が支持体材料への共有結合により固定されることを特徴とする。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、１種類のＤＮＡ分子が、静電気相互作用および／または双極子−双極子相互作用および／または疎水性相互作用、ならびに／あるいは水素結合によって支持体材料に固定されることを特徴とする。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、敗血症アッセイにおける較正器としての使用方法がある。すなわち、組み換え配列の使用、あるいは、人工的に合成された特異的参照遺伝子核酸配列の使用やその部分的配列の単独使用または特定量での使用の際に、これらの使用を較正器として機能させることが可能である。これらの使用は、ＳＩＲＳと敗血症の予防および処置のために、有効成分のスクリーニングにおける作用と毒性の評価、もしくは、治療薬の生成、治療薬として用いることを意図する物質または複数物質の混合物の生成に資する。
【００４３】
当業者は、特許請求の範囲に示される本発明の各特徴が全く制限なく任意に組み合わせられ得ることを理解するであろう。
【００４４】
本発明に含まれる参照遺伝子の意味は、任意の誘導されたＤＮＡ配列、部分的な配列、および合成アナログ（たとえば、ペプチド核酸、ＰＮＡ）であると理解されるべきである。ＲＮＡレベルでの遺伝子発現の決定に関する本発明の記述は、限定的なものではなく、むしろ例示的な適用にすぎない。
【００４５】
本発明に係る方法の応用例の一つとして、全血から取り出した、相互に異なる遺伝子発現に関する測定データの正規化がある。この正規化は、例えば、ＳＩＲＳと敗血症との識別並びにそれらの重篤度（何れも参考文献［４］に対応する）の識別のためのものである。この目的のため、対象となる患者の全血から、さらには、健常な被験者または非感染患者の比較サンプルから、参照遺伝子のＲＮＡを単離する。次いで、このＲＮＡをマーキングする。このマーキングは、例えば、32Ｐを用いた放射性元素により、あるいは、着色用分子（蛍光分子）を用いて行われる。従来、この目的のために知られているあらゆる分子または検出シグナルをマーキング用分子として用いることができる。この目的のために使用される分子または方法は当業者には公知である。
【００４６】
このようにマークされたＲＮＡはその後、マイクロアレイ上に固定されたＤＮＡ分子とハイブリダイズさせられる。マイクロアレイ上に固定されたＤＮＡ分子は、ＳＩＲＳと敗血症との識別における遺伝子発現データの正規化のための遺伝子の特異的選択を示す。
【００４７】
次いで、ハイブリッド分子（混成分子）のシグナル強度が適当な測定装置（フォスホリメージャー（Ｐｈｏｓｐｏｒｉｍａｇｅｒ）、マイクロアレイスキャナーなど）を用いて測定され、さらに、ソフトウェアを内蔵した評価装置により解析される。測定されたシグナル強度に基づいて、患者のサンプルの試験遺伝子と参照遺伝子との間の発現比が求められる。過少に、または、過大に調整された遺伝子の発現比に基づいて、以下に述べるような実験において、ＳＩＲＳと敗血症との識別に関する結論を引き出すことができる。
【００４８】
遺伝子活性のもう一つの適用例は、これはマイクロアレイの分析及びこれに続いて行われる遺伝子表現データの正規化のための数量化を伴うものであるが、ＳＩＲＳと敗血症との識別に対する適用例である。これは、診断目的（例えば、炎症を局地的に抑え、特に感染を伴う固体の免疫応答の重篤度(severity of affliction)を測定するため、あるいは、患者のデータ管理システムまたは専門家用システムのフレームワークにおいて）あるいは細胞シグナルの伝達経路のモデル化を行うためのソフトウェアを作成するための電子的処理に有用である。
【００４９】
以下は、本特許出願の目的のためのマイクロアレイの評価の実施態様にあたる。
【００５０】
「マイクロアレイ実験の説明」
（ブラズマ Ａら、ミニマムインフォーメーションアバウトアマイクロアレイエクスペリメント（ＭＩＡＭＥ）−トワードスタンダーズフォーマイクロアレイデータ，ネイチャー ジェネテックス２９，３６５−３７１（２０００）（New edition January 2005, based on Brazma A et al., Minimum information about a microarray experiment (MIAME)−toward standards for microarray data, Nature Genetics 29, 365 - 371 (2001)） Minimum Information About a Microarray Experiment(MIMAE)文献［１７］に基づく２００５年１月の新版であるミニマムインフォーメーションアバウトアマイクロアレイエクスペリメント［ＭＩＡＭＥ］のチェックリストにしたがう。これらの内容は全体が引用により本明細書中に組み入れられる）
【００５１】
（スライドの読み取り／スキャナ技術の詳細）
ａ）スキャナ：ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ共焦点落射式蛍光スキャナ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）
ｂ）スキャニングソフトウェア：ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ４．０
ｃ）スキャニングパラメーター：レーザー出力：Ｃｙ３チャンネル−１００％
Ｃｙ５チャンネル−１００％
ＰＭＴ電圧： Ｃｙ３チャンネル−７００Ｖ
Ｃｙ５チャンネル−８００Ｖ
ｄ）空間分析能（画素空間）−１０μｍ
【００５２】
（データの読み取りと処理）
実験の構成においては、１０００を超える患者の血液試料をハイブリダイズさせた。個々のＲＮＡ対（患者対比較用ＲＮＡ）をマイクロアレイ上で同時にハイブリダイズさせた。患者のＲＮＡを赤色蛍光色素でマークし、比較用ＲＮＡを緑色蛍光色素でマークした。ハイブリダイズしたアレイのデジタル画像を、Ａｘｏｎ機器によってＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ４．０または５．０ソフトウェアを用いて評価した。スポットの検出、シグナルの定量、およびスポットの質の評価のためには、ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）分析ソフトウェアを使用した。スポットをＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）ソフトウェアの設定にしたがって、１００＝「良好」、０＝「見られる」、−５０＝「見られない」、−７５＝「存在しない」、−１００＝「不良」と記した。生のデータは、対応する *ｇｐｒファイルに保存した。
【００５３】
（正規化、変換、およびデータ選択方法）
ｅ）シグナルデータの変換と正規化
生データの正規化および偏差安定化変換のために、ヒューバーら文献［５］の方法を使用した。ここでは、加算的および乗算的エラーがブロックごとに予測される。全てのスポットのうちの約７５％がこのために利用される。その後、シグナルは、ａｒｓｉｎｈ関数によって変換される。（したがって、変換された±０．４の比は、１．５倍の変化にほぼ対応する（大きな数については、ａｒｓｉｎｈ（ｘ）はＬｎ（２ｘ）とほぼ同じである）。
【００５４】
ロック ＤＭ、ダービン Ｂの遺伝子発現アレイについての測定誤差のモデル、Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．；２００１，８（６）：５５７−６９（文献［１８］）では、発現レベルの関数として遺伝子発現アレイの測定誤差を予測するためのモデルが開発された。その内容は引用により本明細書中に完全に組み入れられる。さらなる分析方法、データ変換と重み付け（ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）とを組み合わせたこの誤差モデルにより、すでに、遺伝子発現データのより正確な比較が可能であり、バックグラウンド分析のための指針、信頼区間の決定、およびさらなる処理または分析のためのそれらの多変量についての分析データの処理が、それぞれ提供される。
【００５５】
ロックおよびダービンの文献［１８］による上記誤差モデルに基づいて、フーバー Ｗ、ハイドブレック Ａ、およびシュルツマン Ｈの、マイクロアレイデータの較正、および差次的発現の定量に適応された偏差安定化、バイオインフォーマテックス、２００２；１８（文献［１９］），補遣１：９６−１０４頁は、マイクロアレイ遺伝子発現データについての統計学的モデルを開発した。その内容は引用により本明細書中に完全に組み入れられる。このモデルには、データの較正、異なる発現デレベルの定量、ならびに測定誤差の定量が含まれる。これに関して、フーバーらの文献［１９］ではシグナル強度の測定と異なる統計値についてのデータ変換を導き、これにより、逆関数ａｒｓｉｎｈを使用することによるその強度範囲全体にわたってシグナルデータのセットの偏差安定化と正規化がもたらされる。この方法は、マイクロアレイ遺伝子発現データについて具体的に明らかにされているが、本発明の構成における遺伝子発現の測定のための他の方法に置き換えることもできる。
【００５６】
これにより、シグナルの評価において頻繁に観察されるシグナル強度に対する偏差の依存性は、逆関数を用い上記変換により補正される。
【００５７】
ｆ）フィルトレーション（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
マイクロアレイ上での技術の複製（同じ試料の複数のスポット）が、それらのスポットの質に応じて修正され変換されたシグナル強度から除外される（ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｏｕｔ）。個々のスポットについて最も高い特徴を有している複製が選択され、関連するシグナル強度が平均される。測定不可能な複製しか有していないスポットの発現は「ＮＡ」（該当なし）と記載される。
【００５８】
本発明の方法の別の応用は、差次的遺伝子発現の測定にある。本発明は、患者が計画された治療に対応する可能性を治療と同時に決定するため、また、特定の治療に対する対応の決定のため、また、ＳＩＲＳと敗血症の患者とその重篤度について「薬物モニタリング」の意味での治療終了の特定のために応用される。この目的のためは、任意の時間間隔で回収された患者の血液試料からＲＮＡ（試験ＲＮＡと対照ＲＮＡ）が単離される。様々なＲＮＡ試料が一緒にマークされ、選択された試験遺伝子やマイクロアレイ上に固定された参照遺伝子とハイブリダイズさせられる。１つまたはいくつかの参照遺伝子と、たとえばＴＮＦαのような試験遺伝子との間での発現比から、患者が計画された治療に対応するであろう可能性、開始された治療が有効であるかどうか、また、どれほど長い間患者が対応して治療されるか、そして、使用された用量および期間によってすでに最大治療効果に達しているかどうかを評価することができる。
【００５９】
本発明の方法の別の応用は、ハイブリダイゼーションには依存しない方法、具体的には、酵素的または化学的加水分解、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、その後の核酸ならびに／あるいはこれらの誘導体および／または断片の定量を通じて定量的情報を得るための、本発明の遺伝子のＲＮＡの使用にある。
【００６０】
ＰＣＲ（そしてまた、ＮＡＳＢＡのような付加的増幅方法）により増幅させられ、定量された参照遺伝子の転写物は、ＳＩＲＳと敗血症、およびそれらの重篤度の識別における遺伝子発現データの正規化のための、本発明の別の実施形態を構成する。増幅された転写物のシグナル強度が、その後、適切な測定装置（ＰＣＲ蛍光検出器）によって測定され、ソフトウェアによって支援される評価を活用して分析される。測定されたシグナル強度から、患者試料の試験遺伝子と参照遺伝子との間の発現比が決定される。過小に、または、過大に調整された遺伝子の発現比に基づいて、以下に述べるような実験において、ＳＩＲＳと敗血症、およびそれらの重篤度を識別するための結論を引き出すことができる。
【００６１】
本発明に係る方法のもう一つの適用例は遺伝子活動性の使用方法にある。この使用方法は、ＰＣＲまたはその他の増幅方法とこれに続いて行われる遺伝子表現データの正規化のための定量化とを伴い、ＳＩＲＳと敗血症及びそれらの重篤度の識別を求めるためのものであり、診断目的（例えば、炎症の中心を見つけ、特に細菌感染を伴う固体の免疫応答の重篤度を測定するため、あるいは、患者のデータ管理システムまたは専門家用システムのフレームワークにおいて）あるいは細胞シグナルの伝達経路のモデル化を行うためのソフトウェアを作成するための電子的処理に有用である。
【００６２】
本発明の方法の別の応用は、試料中のｍＲＮＡ量の決定にある。即ち、ａ）核酸の単離、ｂ）配列番号２２から配列番号９７より選択された１つまたはいくつかの核酸の発現値の測定、ｃ）ｍＲＮＡの全量中の核酸の公知の割合値に対する、選択された核酸の発現値の比較、ｄ）ｍＲＮＡの全量に対する、配列番号２２から配列番号９７より選択される１つまたはいくつかの核酸の発現値の外挿、およびｄ）試料中のｍＲＮＡの全量の決定を含むものである。
【００６３】
本発明の方法の別の応用は、いくつかの試料中の、所定の場合には増幅させられた、ｍＲＮＡ量の正規化にある。即ち、ａ）様々な試料の間での配列番号２２から配列番号９７より選択される１つまたはいくつかの核酸の発現値の比較、ｂ）いくつかの試料の間での配列番号２２から配列番号９７より選択される１つまたはいくつかの核酸の発現値の正規化のための値を導くこと、およびｃ）工程ｂ）に基づく、いくつかの試料から単離された他の核酸の発現の正規化を含むものである。
【００６４】
本発明はさらに、参照遺伝子として使用される、患者試料中の遺伝子発現プロフィールのインビトロ（試験管レベル）での決定のための、少なくとも１から１００、好ましい実施形態においては１から５および１から１０ヌクレオチドを含む、配列番号２２から配列番号９７に記載される配列、および／またはそれらの遺伝子断片の選択を含むキットに関係する。
【００６５】
本発明はさらに、参照遺伝子として使用される、患者試料中の遺伝子発現プロフィールのインビトロ（試験管レベル）での決定のための、少なくとも５０ヌクレオチドを含む、配列番号１から配列番号７に記載されるハイブリダイゼーションプローブ、および／またはそれらの遺伝子断片の選択を含むキットに関係するものである。
【００６６】
本発明は同様に、参照遺伝子として使用される、患者試料中の遺伝子発現プロフィールのインビトロ（試験管レベル）での決定のための、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、配列番号８から配列番号２１に記載されるプライマープローブ、および／またはそれらの遺伝子断片の選択を含むキットに関係する。
【００６７】
また、本発明は、その最も広く最も一般的な構成において、以下の実施形態に関するものである。
【００６８】
Ａ）患者の血液試料からの遺伝子発現分析データの正規化のための少なくとも１つの参照遺伝子。ここで、上記参照遺伝子は以下のＲＮＡ配列より選択される：配列番号２２から配列番号９７、特に、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、および配列番号９６。
【００６９】
Ｂ）患者の血液試料からの、核酸の増幅に基づく遺伝子発現分析データの正規化のためにＡ）に記載された参照遺伝子から導かれた少なくとも１つのプライマー。ここで、上記プライマーは以下のＤＮＡ配列より選択される：配列番号８から配列番号２１。
【００７０】
Ｃ）患者の血液試料からの遺伝子発現分析データの正規化のための、Ｂ）に記載された参照遺伝子から導かれた、少なくとも１つのプローブ。ここで、上記プローブセットには以下のＤＮＡ配列が含まれる：配列番号１から配列番号７、ならびにそれらの相補的核酸配列。
【００７１】
Ｄ）Ａ）に記載された参照遺伝子、またはＢ）に記載されたプライマーセット、またはＣ）に記載されたプローブセットより選択される少なくとも１つの対照核酸を活用する遺伝子発現分析データの正規化のための方法。この方法は、以下の工程を含む。
ａ）少なくとも１回の遺伝子発現分析アッセイが患者の血液試料についてインビトロ（試験管レベル）で行われる工程。
ｂ）少なくとも１つの対照核酸が、試験される試料（被験試料）の遺伝子発現分析データの正規化のための基準として同じアッセイにおいて一緒に試験される工程。
ｃ）遺伝子発現分析により、複数の遺伝子、および少なくとも１つの対照核酸の遺伝子発現の程度を反映するシグナルが検出される工程。
ｄ）工程ｃ）で得られたシグナルデータを、シグナルデータの検出技術上不可避の変動幅を少なくとも小さくするために、数学的に変換される工程。そしてそれにより、
ｅ）被験試料のシグナルデータが正規化される工程。
【００７２】
Ｅ）Ｄ）に記載された方法の好ましい実施形態は以下の通りである。
シグナルデータの数学的変換がａｒｓｉｎｈにより、または対数的アプローチにより行われるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
遺伝子発現アッセイが、以下から選択されるＤ）に記載の方法。
f）血液試料からの核酸の単離；
g）必要に応じて行われる、対照核酸のセットと試験される核酸のセットの同時増幅；および
h）プローブのハイブリダイゼーション；
ならびに／あるいは
核酸にはｍＲＮＡとマイクロＲＮＡが含まれるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
核酸が、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、またはＳＤＡによって増幅されるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
対照核酸と試験核酸の発現値が、ハイブリダイゼーション方法によって決定されるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
対照核酸および／または試験核酸の発現値の測定が、溶液中、または支持体上に固定された核酸上で行われるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
支持体が、マイクロアレイ、粒子、ビーズ、硝子、金属、または膜であるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
対照核酸および／または試験核酸が、抗体、抗原、オリゴヌクレオチド、分子ビーコン、または酵素のような他の結合パートナーを介して支持体に間接的に結合させられるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
患者の試料からインビトロ（試験管レベル）で決定された対照核酸と試験核酸の発現値が、患者の個体の予後診断の説明、診断目的、治療の決定、および／または患者データの管理システムのためのソフトウェアの開発のための入力パラメーターとして利用されるＤ）に記載の方法。
【００７３】
Ｆ）全身的免疫反応を含む障害の診断のための遺伝子発現分析方法の正規化を行うための、Ａ）に記載された参照遺伝子、またはＢ）に記載されたプライマー、またはＣ）に記載されたプローブから選択される少なくとも１つの対照核酸の使用。
【００７４】
Ｇ）Ｆ）に記載された対照核酸使用の好ましい実施形態は以下の通りである。
上記障害が敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全からなる群より選択される、Ｆ）に記載された対照核酸の使用。
ならびに／あるいは
以下の工程を含む、対照核酸のセットと、その発現がＳＩＲＳまたは敗血症に特異的である試験核酸のセットを使用することにより、個体のＳＩＲＳ、敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全のインビトロ（試験管レベル）での診断のための方法。
ａ）個体の試料からの対照核酸と試験核酸の同時単離
ｂ）必要に応じ、対照核酸と試験核酸の増幅
ｃ）対照核酸と試験核酸の発現値の決定
ｄ）対照核酸の発現値に基づく試験核酸の遺伝子発現の正規化
ｅ）正規化された試験核酸の発現値が、ＳＩＲＳ、敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全についての特有な値に達しているかどうかの決定
【００７５】
以下もまた、本発明の構成におけるデータ変換／正規化に基本的に適用される。
【００７６】
第一の変形例（1st Variant)（ＰＣＲ実験または診断用小アレイにおける正規化に使用されるもの）
参照遺伝子のシグナルが集められ、次いで、集められた参照遺伝子のシグナルに対する試験遺伝子のシグナルの比率が計算される。シグナルが対数化されている場合には、この比率はＳＩＲＳと敗血症との差異を示す。
【００７７】
第二の変形例（2nd Variant)（フーバー等の参照文献［１９］における「全ゲノム」式アプローチまたは大アレイ）
参照遺伝子のシグナルを用いて、適切な変換のパラメーターあるいは変換それ自体が予測される。この変換は、その後、試験遺伝子に適用される。
【実施例】
【００７８】
本発明のさらなる利点と特徴は、実施例の記載から明らかとなろう。
【００７９】
［実施例１］
「血液からおよび血球からの参照遺伝子の同定」
遺伝子発現の測定：
３７２人の集中治療室にいる患者（ＩＴＵ患者）の遺伝子発現を測定した。患者は全て、集中治療による医学的治療中（ｕｎｄｅｒ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ−ｃａｒｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）であった。最長７日間のＩＴＵ日数をそれぞれの患者について検討した。７日間よりも長いＩＴＵ日数があった患者については、７日間を無作為に選択した。全部で１２６１のマイクロアレイ実験のデータを分析に入力した。
患者の選択した特徴を表４および５に示す。年齢、性別、およびＡＣＣＰ／ＳＣＣＭカテゴリーに関する情報が提供される。細胞株ＳＩＧ−Ｍ５由来の全ＲＮＡを参照試料とした。患者試料を全て、１つの個々のマイクロアレイ上の参照試料とそれぞれ同時にハイブリダイズさせた。表４に患者の一般的データを、表５に被験者の適応症を夫々示した。
【００８０】
【表４】
【００８１】
【表５】
【００８２】
実験の説明：
（血液の採取とＲＮＡの単離）
患者の全血を、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）の説明書にしたがってＰＡＸＧｅｎｅキット（ＰＡＸＧｅｎｅ Ｋｉｔ）を利用して集中治療室にいる患者から採取した。全血の採取後、試料の全ＲＮＡを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）の説明書にしたがってＰＡＸＧｅｎｅ血液ＲＮＡキット（ＰＡＸＧｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ）を使用することによって単離した。
【００８３】
（細胞培養）
細胞培養（対照試料）には、１９の細胞冷凍保存（ＳＩＧＭ５）（液体窒素の中で凍結させた）を利用した。細胞をそれぞれ、２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した２ｍｌのイスコヴ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（バイオクロムＡＧ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ））に接種した。その後、細胞培養物を１２ウェルプレートの中で、５％ＣＯ2、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、１８個のウェルの内容物をそれぞれ同じ容量を有している２つに分け、結果として、最終的には同じ形式の３つのプレート（全部で３６ウェル）を利用した。その後、培養を、同じ条件下で２４時間続けた。
この後、それぞれのプレートの１１個のウェルの得られた培養物を１つにし、遠心分離した（１０００×ｇ、５分間、室温）。上清を廃棄し、細胞ペレットを４０ｍｌの上記培地中に溶解させた。これらの４０ｍｌの溶解させた細胞を、２つの２５０ｍｌの試験管に等しく分け、４８時間インキュベーション、および５ｍｌの上記培地の添加後にもう一度インキュベートした。残りの２つのプレートの残っている２ｍｌのうち、８０μｌを、１ｍｌの上記培地を用いてあらかじめ準備しておいた同じプレートの空のウェルに入れた。４８時間のインキュベーションの後、１２ウェルプレートを１つだけ、以下のように処理した。
それぞれのウェルから５００μｌを取り出し、１つにした。得られた６ｍｌを、およそ１０ｍｌの新しい培地を含む２５０ｍｌの試験管に入れた。この混合物を、室温で５分間、１０００×ｇで遠心分離し、１０ｍｌの上記培地の中に溶解させた。その後の細胞の計数により以下の結果が得られた：１．５×１０7細胞／ｍｌ、１０ｍｌの全量、細胞の総数：１．５×１０8。細胞数がまだ十分ではなかったので、２．５ｍｌの上記細胞懸濁液を、２５０ｍｌ（７５ｃｍ2）の試験管（全部で４つの試験管）中の３０ｍｌの上記培地の中に入れた。
７２時間のインキュベーションの後、それぞれ２０ｍｌの新しい培地を試験管に入れた。２４時間のインキュベーション後、細胞の計数を上記にしたがって行い、３．８×１０8細胞の全細胞数を得た。２×１０6細胞の所望される細胞数を得るために、細胞を、４つの試験管の中の４７．５ｍｌの上記培地に再懸濁した。２４時間のインキュベーション期間の後に細胞を遠心分離し、Ｃａ2+もＭｇ2+も含まないリン酸緩衝液（バイオクロムＡＧ）で２回洗浄した。
【００８４】
全ＲＮＡの単離は、説明書にしたがってヌクレオスピンＲＮＡ Ｌキット（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ Ｌ Ｋｉｔ）（マシェリーアンドナゲル（Ｍａｃｈｅｒｙ ＆ Ｎａｇｅｌ））によって行った。上記手順を、必要な細胞数が得られるまで繰り返した。これは、１０8細胞あたり６００μｇのＲＮＡの効率にほぼ相当する、６ｍｇの全ＲＮＡの必要量を得るために不可欠であった。
【００８５】
（逆転写／マーキング／ハイブリダイゼーション）
全血の採取後、試料の全ＲＮＡを単離し、説明書にしたがってＰＡＸＧｅｎｅ血液ＲＮＡキット（ＰＡＸＧｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ）（プレアナリティＸ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ））を使用することによってその性質を試験した。それぞれの試料から１０μｇの全ＲＮＡをアリコートし、参照ＲＮＡとしてのＳＩＧＭ５細胞由来の１０μｇの全ＲＮＡとともに、逆転写酵素スーパースクリプトＩＩ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に作り直し、その後、ＲＮＡをアルカリ加水分解によってバッチ（回分）から除去した。反応バッチの中で、ｄＴＴＰの部分を、あとでｃＤＮＡに対して蛍光色素を結合させることができるように、アミノアリル−ｄＵＴＰ（ＡＡ−ｄＵＴＰ）で置き換えた。
【００８６】
反応バッチの精製後、試料のｃＤＮＡと対照のｃＤＮＡを蛍光色素Ａｌｅｘａ ６４７およびＡｌｅｘａ ５５５で共有結合によってマークし、ＳＩＲＳ−Ｌａｂ社のマイクロアレイ上にハイブリダイズさせた。使用したマイクロアレイ上には、それぞれが１つのヒト遺伝子と、品質保証のための対照スポットを提示する５５から７０塩基対の長さを有している５３０８種類のポリヌクレオチドが固定されている。１つのマイクロアレイを、１５×１５スポットのラスターを有している２８のサブアレイに分けた。
【００８７】
ハイブリダイゼーションとその後の洗浄および乾燥は、それぞれ、説明書にしたがって、４２℃で１０．５時間以内に、ハイブリダイゼーションステーションＨＳ４００（テカン（Ｔｅｃａｎ））の中で行った。使用したハイブリダイゼーション溶液は、個々のマークされたｃＤＮＡ試料、３．５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭの塩化ナトリウムと１５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む）、０．３％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｖ／Ｖ）、２５％のホルムアミド（Ｖ／Ｖ）、および０．８μｇ・μｌ-1ｃｏｔ-1のＤＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、そして各ポリ−Ａ ＲＮＡから構成されている。続いて、マイクロアレイの洗浄を以下の手順にて室温で行った：洗浄緩衝液１（２×ＳＳＣ、０．０３％のドデシル硫酸ナトリウム）、洗浄緩衝液２（１×ＳＳＣ）、最後に洗浄緩衝液３（０．２×ＳＳＣ）でそれぞれ９０秒間のすすぎ。次いで、マイクロアレイを、３０℃で１５０秒間、２．５ｂａｒの圧力の窒素フロー下で乾燥させた。
【００８８】
ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナルを、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂスキャナ（アキソン（Ａｘｏｎ））を利用して読み取り、差次的に発現された遺伝子の発現比を、ソフトウェアＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ４．０（アキソン）を利用して決定した。
【００８９】
評価：
評価のために、スポットの平均強度を、関連するスポット画素の中央値として決定した。
【００９０】
遺伝子試料の事前選択：
遺伝子プローブの最初の事前選択のために、システム誤差の補正を、フーバーら文献［５］のアプローチにしたがって行った。マイクロアレイの中での加算的および乗算的バイアスを、存在する遺伝子試料の７５％から推定した。
【００９１】
続いて、患者試料のシグナルの正規化された比と変換された比を、一般的な対照に対して計算した。すなわち、ｋ番目アレイのｊ番目遺伝子についての計算により以下の値が得られた。
Ｇj、k＝ａｒｓｉｎｈ（Ｓｃｙ５（ｊ，ｋ））−ａｒｓｉｎｈ（Ｓｃｙ３（ｊ，ｋ））
式中、［Ｓｃｙ３（ｊ，ｋ）、Ｓｃｙ５（ｊ，ｋ）］は、関連する蛍光シグナルの対を示す。全ての遺伝子プローブについて、中央値からの絶対偏差の中央値（ＭＡＤ）、すなわち、ＭＡＤ（Ｇj、1、．．．、Ｇj、1261）を続いて計算し、最も低いＭＡＤを有している１０％の遺伝子プローブを選択した。事前選択の第２の基準として、平均シグナル強度ａｒｓｉｎｈ（Ｓｃｙ５（ｊ，ｋ））＋ａｒｓｉｎｈ（Ｓｃｙ３（ｊ，ｋ））を使用した。さらなる分析においては、いわゆるダイナミックシグナルレンジの中、好ましくは（対数目盛で）６と８の間に平均シグナル強度の中央値を有している遺伝子プローブだけを、考慮に入れた。
【００９２】
参照遺伝子の選択：
前もって選択した遺伝子プローブについて、相対的な量を最も高い発現値を１に設定することによって計算した。続いて、ヴァンデソンペールら文献［６］の遺伝子安定性の測定値Ｍを計算した。ヴァンデソンペールらに記載されたものと同じ段階的手順（ここでは、最も低い安定性を有している遺伝子がそれぞれの工程において除外される）により、遺伝子プローブをそれらの安定性にしたがって並べた。遺伝子プローブの選択のための上限値は、安定性の測定値Ｍの平均値についての（おおよその）値０．６に基づいた（表６−１、表６−２参照）。
【００９３】
ヴァンデソンペールらに従う遺伝子安定性の測定値Ｍの数学的定義は以下のとおりである。
２つの内部参照遺伝子ｊとｋのそれぞれの組み合わせについて、要素ｍのアレイＡjkが提供され、これは、ｌｏｇ2に変換された発現比ａij／ａjkからなる（方程式１）。参照遺伝子ｊとｋについての対となる変分Ｖjkは、要素Ａjkの標準偏差としてさらに定義され（方程式２）、ＳＤは標準偏差である。次いで、参照遺伝子ｊについての遺伝子安定性の測定値Ｍjは、全ての対となる変分Ｖjkの算術平均である（方程式３）：
（それぞれのｊ、ｋについて、［１，ｎ］とｊ ｋ）：
【数１】
【数２】
【数３】
【００９４】
クラスターを、付属の配列プロトコールの一部である配列番号２２から配列番号９７に対応する不変の遺伝子活性を有している７６個の特異的配列について決定した。表６−１、表６−２に決定した参照遺伝子（ＲＮＡ塩基）とそれらの安定性値を示す。
【００９５】
【表６−１】
【表６−２】
【００９６】
［実施例２］
「敗血症患者と敗血症に罹患していない患者の遺伝子発現試験による参照遺伝子の安定性の試験」
本実施例において、本発明者らは、第１の実施例において決定した参照遺伝子がまた、集中治療を受けている敗血症患者および敗血症に罹患していない患者の場合にも安定であることを示す。この目的のために、本発明者らは、１１８人の患者のマイクロアレイデータを検討した。全部で３９４日ののべ入院日数（マイクロアレイ）を分析し、１人の患者について最長７日間を考慮に入れた。表７に患者の一般的データ、表８にACCP/SCCMカテゴリーによるのべ入院日数の分類ならびに付加的な診断パラメーターを夫々示す。
【００９７】
【表７】
【００９８】
【表８】
【００９９】
ＳＩＲＳ患者と敗血症患者の比較による参照遺伝子の適用性を明らかにするために、以下の試験遺伝子を選択した。表９にSIRS患者と敗血症患者の比較のための試験遺伝子を示す。
【０１００】
【表９】
【０１０１】
これらの試験遺伝子は、敗血症と関連して科学学術文献に記載されている。
【０１０２】
統計分析のために、６人の重症ＳＩＲＳ患者（ＳＩＲＳ＋臓器不全）と、９人の重症敗血症患者（敗血症＋臓器不全）を選択した。表１０に、ＳＩＲＳ患者と敗血症患者についての選択した特性を示す。
【０１０３】
【表１０】
【０１０４】
１０個の試験遺伝子の正規化を、以下の５個の無作為に選択した参照遺伝子によって行った。ヴァンデソンペールら文献［６］の方法を使用した。表１１に、選択した参照遺伝子(セット１)を示す。
【０１０５】
【表１１】
【０１０６】
２つの試料のｔ検定による比較によって以下の結果を得た。表１２に、参照遺伝子セット１を用いて正規化した試験遺伝子活性を示す。
【０１０７】
【表１２】
【０１０８】
結果の再現性を明らかにするために、統計比較を、再び無作為に選択した参照遺伝子（セット２）を用いて繰り返した。表１３に、参照遺伝子（セット２）を示す。
【０１０９】
【表１３】
【０１１０】
ヴァンデソンペールらの方法による正規化の後、本発明者らは、２つの試料のｔ検定について以下の結果を得た。表１４に、参照遺伝子のセット２を用いて正規化した試験遺伝子の遺伝子活性を示す。
【０１１１】
【表１４】
【０１１２】
結果は、結果の極めて優れた再現性を示している。いずれの比較においても、それぞれ５％または１０％のレベルで同じマーカーが有意であった。
【０１１３】
［実施例３］
リアルタイムＰＣＲによるそれらの特異的プライマーを通じた選択した参照遺伝子の安定性値の決定
【０１１４】
（ＲＮＡの単離）
ＲＮＡを、説明書にしたがってＰＡＸｇｅｎｅキット（プレアナリティＸ）を活用して全血から単離した。
【０１１５】
（定量的逆転写酵素−ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）（ＲＴ−ＰＣＲ））
逆転写により、ｍＲＮＡをその配列とは無関係なオリゴｄＴプライマーを利用してｃＤＮＡに作り直した。使用したｍＲＮＡに対する相補性のプロセスにおいて形成されたｃＤＮＡ鎖を、続いて、様々なＰＣＲ反応の鋳型として使用した。
ａ）バッチについては、次の成分をまとめてピペットで採取した。
− ５μｇの濃縮したＲＮＡ
− １０μｌのＨ2Ｏ
− １μｌのｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）
− １μｌのオリゴｄＴ（０．５μｇ／μｌ）
ｂ）７０℃で５分間、その後、氷上で５分間処理した。
ｃ）次の混合物をその後添加した。
− ４μｌのＲＴ緩衝液
− ２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ
− １μｌのＲＮａｓｅアウト（ＲＮａｓｅ阻害剤）
− １μｌのスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）逆転写酵素
ｄ）４２℃で１時間インキュベートした。
ｅ）７０℃で１５分間インキュベートした。
【０１１６】
（ポリメラーゼ連鎖反応）
選択したＤＮＡ部分を、ＰＣＲを活用して増幅させ、その後に定量し参照遺伝子の遺伝子発現の強度を決定した。
ＰＣＲには、インビトロジェンによるアッキュプライムタックＤＮＡポリメラーゼシステム（ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用した。
【０１１７】
２５μｌのバッチについて、次の成分を２００μｌのチューブにまとめてピペット採取した：
２．５μｌの１０×アキュプライムＰＣＲ緩衝液Ｉ（ＡｃｃＰｒｉｍｅ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ Ｉ）
２０μｌのＲＮａｓｅを含まないＨ2Ｏ
１μｌの１：１０希釈された鋳型ＤＮＡ（およそ０．８２ｎｇ／μｌ）
１μｌのプライマー混合物（表２に対応する、それぞれ０．５μｌの正方向プライマー／逆方向プライマー）
０．５μｌのアキュプライムタックＤＮＡポリメラーゼ（ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）。
次いで、以下のプログラムを、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー（コルベットリサーチ（ｃｏｒｂｅｔｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ）ＲＧ３０００）の中で行った。
９４℃ ２分間
９４℃ ３０秒間
５８℃ ３０秒間 ３０サイクル
６８℃ １分間
６８℃ ２分間
最初に、鋳型ＤＮＡを９４℃で完全に変性させ、酵素を活性化させた。この後、９４℃での変性、５８℃でのアニーリング、そして６８℃での伸長からなる増幅を３０サイクル行った。ＰＣＲ後、試料を、断片の大きさによって生成物の正確性を試験するために、１．５％のアガロースゲル上に移した。表１５に、特異的プライマーとリアルタイムPCRによって決定した選択された参照遺伝子（RNA塩基）の安定性値を示す。
【０１１８】
【表１５】
【０１１９】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子、特に、遺伝子発現分析データの正規化（normalization）のための請求項１に記載される参照遺伝子のセット、参照遺伝子から導かれたＰＣＲプライマー、特に、請求項２に記載されるＰＣＲプライマーのセット、参照遺伝子から導かれたプローブ、特に、請求項３に記載されるプローブのセット、ならびに請求項４に記載される遺伝子発現分析の正規化のための方法に関する。
【０００２】
多様な条件下でも最小限の発現の変化しか示さない遺伝子を、特に、血球から特定することが求められている。これらの所謂「ハウスキーパー」または「ハウスキーピング」遺伝子は、遺伝子発現、ＲＮＡおよびｍＲＮＡの定量において参照、内部対照、および参照値として利用される。これらの利用は、ノーザンブロッティング、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、キャピラリー電気泳動、マイクロアレイ、および定量的リアルタイムＰＣＲのような方法や、さらに転写物からの直接測定および事前増幅後の測定のための方法において行われる。
【０００３】
以下においては、用語「ハウスキーパー」、「ハウスキーピング遺伝子」、および「発現制御遺伝子」は、用語「参照遺伝子」に包含されるものとする。この単純化は、本発明のいかなる制限をも意味するものではなく、判読の容易化のために行われるものである。
参照遺伝子を利用する定量データの正規化には、多数の応用の可能性がある。これらの参照遺伝子は、その活性が様々な病的状態において差次的に調節されている遺伝子の同定を可能にし、さらには、それに基づく診断の開発を可能にする。
参照遺伝子は、様々なＲＮＡ試料において発現および転写が最小限の変化を示す遺伝子であり、様々な試料の遺伝子活性測定の対照または参照として機能する。全ての組織の亘り不変の活性を示す遺伝子は存在しない。したがって、新しい参照遺伝子、特に血液の診断の為の参照遺伝子が、血液からの発現値が診断において使用されることから、強く求められている。
【０００４】
種々の対照遺伝子が後記の文献［１］で公知であるが、全血試料または血球による遺伝子発現および転写の正規化のための参照遺伝子およびそれらの転写物、また、それらの併用は知られていない。血球の中や、全血中の臓器や末梢組織由来の細胞の中に一定濃度で存在する転写物（また、ｍＲＮＡおよびmicroＲＮＡならびにadditionalＲＮＡ）は、遺伝子活性の正規化のため、および他の遺伝子活性変化の決定のための前提条件であり、血液に基づく診断のための前提条件である。同様に、ＳＩＲＳと敗血症の診断／予後診断のための遺伝子活性の測定についての多くの研究報告が既になされている（たとえば、文献［２］、［３］）。しかし、血液由来の参照遺伝子を用いる遺伝子活性シグナルの使用と定量化については、これまで報告されていない。
【０００５】
したがって、疾患特異的遺伝子または遺伝子クラスターの遺伝子発現の正規化および定量化を可能にするための、強く、安定性のある、血液および血球由来の参照遺伝子が求められている。
【０００６】
本発明は、敗血症の典型である病理学的現象（文献［４］の定義による）が検出された個体の試料中の血球中に存在している様々な遺伝子の遺伝子活性が、敗血症と診断されていない個体の同じ遺伝子の遺伝子活性と異なることがないこと、そして、血球由来の遺伝子活性の正規化や血液由来の転写物の濃度の決定のために、参照遺伝子として組み合わせてまたは単独で使用できることの発見に基づくものである。これにより、他の遺伝子の活性の正規化と相対的な定量化が可能となり、診断、予後診断、治療、および検証に利用することができる。
【０００７】
したがって、本発明は、医学的障害によってもたらされる遺伝子発現の変化の識別に対する基準点の提供、ひいては診断または治療検証の手段および方法を提供することを目的とする。
【０００８】
この目的は、複数の参照遺伝子を通じて、特に、請求項１により特徴付けられる参照遺伝子セットにより達成される。
【０００９】
本発明の目的はさらに、請求項１に記載される参照遺伝子セット由来のプライマー、特に請求項２に記載されるプライマーセット、ならびにプローブ、特に請求項３に記載されるプローブセットにより達成される。
【００１０】
方法に関する本発明の目的は、請求項４に記載される特徴により達成される。
【００１１】
本発明は、血液由来の新規の参照遺伝子の同定、適切なマイクロアレイプローブとＰＣＲプライマーに関する。また本発明は、それらを、血液および血球からの定量的発現データの正規化のために、マイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、増幅や決定のための様々な視覚化のオプションを伴う他のシステムにおいて、使用あるいは併用に関するものである。更に、本発明は、医学的障害に対する全身反応（たとえば、ＳＩＲＳ、敗血症、臓器不全を伴う重症敗血症）により生じる様々な位置での局所的炎症の変化診断のためのそれらの利用に関するものである。
【００１２】
これらの検討においては、遺伝子発現分析の正規化は極めて重要である。本発明の目的から、正規化とは以下のように理解されねばならない。
【００１３】
「正規化」は、検出技術上避けられない変動幅（誤差）を小さくし、または、除去することによって、様々なアレイもしくはＰＣＲ、特に、ＲＴ−ＰＣＲ実験の測定値を比較できるようにすると理解される。これらの実験には、測定値を歪めてしまう可能性がある原因が複数存在する。妨害の可能性のある技術的原因は、逆転写、標識、またはハイブリダイゼーション反応の効率が異なること、ならびに、アレイ、試薬のバッチ差（batch effect）、または実験室特有の条件に伴う問題が挙げられる。
【００１４】
本発明の方法は、個体の血液試料中で、１つまたはいくつかの被験遺伝子の活性を識別することができる点で特徴的である。それは、ＳＩＲＳと敗血症との参照遺伝子の遺伝子産物の量に対する被験遺伝子の遺伝子産物の存在と量を決定することにより行われる。
【００１５】
この目的のための、血液および血球に由来する参照遺伝子と遺伝子配列、ならびにそれらから導かれたプライマーおよびプローブが開示される。これらは、遺伝子活性および転写物の決定、視覚化、正規化、および定量のために使用することができる。好ましい実施態様でのオリゴヌクレオチドプローブの配列が表１に示され、これらは、付属の配列プロトコールの配列番号１から配列番号７の１つに対応する。表２のプライマー配列は、付属の配列プロトコールの配列番号８から配列番号２１の１つに対応する。オリゴヌクレオチドプローブの配列はまた他の配列とすることもでき、好ましい実施態様においては、５０から１００ヌクレオチドの長さを有しておりこれは、配列番号２２から配列番号９７の配列を有している表３−１及び表３−２に示される遺伝子の転写物に特異的に結合する。ＰＣＲのような増幅方法において使用される配列は、所望される酵素的操作および増幅をこれらがサポートする限りは、無作為な長さを有することができる。
【００１６】
【表１】
【００１７】
【表２】
【００１８】
【表３−１】
【表３−２】
【００１９】
表２のプライマーは、命名された遺伝子の所望される領域（配列）を含む増幅産物を作製するために使用することができる。通常の実施態様においては、生成物は１５０から２００ヌクレオチドの長さを有する。
【００２０】
参照遺伝子は単独またはいくつかの遺伝子と組み合わせて使用される。通常は、本明細書中に記載される参照遺伝子の活性は、マイクロアレイ用のハイブリダイゼーションプローブ、またはＰＣＲプライマーとリアルタイムＰＣＲを活用して決定することができる。但し、参照遺伝子とそれらの発現産物は、当業者に公知の他の方法による増幅の後に決めることも可能である。増幅の方法としては、例えば、ＮＡＳＢＡ (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)あるいはＮＡＳＢＡと他の種々の増幅法との組み合わせなどがある。これらはまた、モノクローナル抗体の活用等の多数の別の方法、または視覚化オプションを活用して、決定することもできる。プライマーおよびプローブは、遺伝子、発現産物（ｍＲＮＡ）、そしてｍＲＮＡまでには完全には処理されていない中間体発現産物について使用することができる。
【００２１】
他の実施形態においては、プライマーおよびプローブは、本発明によって開示される参照遺伝子またはその転写物の特異的領域に結合する。しかし、プローブおよびプライマーは本発明によって開示される遺伝子配列またはそれらから転写された配列の任意の領域と相互作用することができる。プライマーおよびプローブは連続的な塩基対合によって相互作用することができるが、完全に相補的な配列との相互作用は必ずしも必要ではない。緩衝液の組成、塩濃度、洗浄工程、および温度は、適宜選択することができる。
【００２２】
同様に、参照遺伝子と試験遺伝子のこれらの変化は、１つまたはいくつかの参照試料の発現値（または、たとえば平均値のようにそれらから導かれたデータ）と比較されるが、この参照試料は標的試料と同時には決定されるものではない。
【００２３】
本発明の実施形態の１つは、１つまたはいくつかの試験核酸に対して発現値を比較するため、および試験核酸と比較した定量化のための参照遺伝子として表３−１及び表３−２に記載される参照遺伝子ならびに血液および血球由来のこれらの参照遺伝子の核酸および転写物を使用することにより発現値を決定することを特徴とする。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、表１に記載される配列を有している核酸およびＤＮＡプローブ、ならびに、溶液中の、または表面もしくは粒子もしくはビーズ上に固定された、表３−１及び表３−２に記載される遺伝子の血液中または血球由来のＲＮＡ（マイクロＲＮＡを含む）および転写物（ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）へのそれらの結合体を特徴とする。また本発明の実施形態は、これらの遺伝子の結合した転写物が、プローブに結合した１つまたはいくつかの試験核酸に対する核酸の結合量（発現値）の比較による正規化のために、そして結合した試験核酸と比較した定量化のために使用されることを特徴とする。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、参照遺伝子由来のＲＮＡ量と試験遺伝子由来のＲＮＡ量との関係を確立することよるＳＩＲＳと敗血症（いずれも文献［４］に対応）のエキソビボ、インビトロ（試験管レベル）での識別方法を特徴とし、以下の工程を含むものである。
ａ）血液試料から参照遺伝子ＲＮＡと試験遺伝子ＲＮＡを単離する工程。
ｂ）参照遺伝子ＲＮＡと試験遺伝子ＲＮＡを検出マーカーでマーキングし、ハイブリダイゼーション条件下でＤＮＡと接触させる工程。ここに、前記ＤＮＡは、参照遺伝子の転写物、増幅産物、もしくはインビトロ転写物に特異的に結合する遺伝子断片またはオリゴヌクレオチドである。
ｃ）工程ｂ）による参照遺伝子ＲＮＡと試験遺伝子ＲＮＡのマーキングシグナルを定量的に検出する工程。ならびに、
ｄ）特定遺伝子または遺伝子断片が参照遺伝子のシグナルと比較してより強く発現されているか、またはより弱く発現されているかどうかの指示を出すためにマーキングシグナルの定量的データを比較する工程。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、参照遺伝子ＲＮＡが標的遺伝子ＲＮＡの測定前にＤＮＡとハイブリダイズさせられ、対照ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のマーキングシグナルが検出され、必要な場合にはさらに変換され、検量線または表の形式で保存されることを特徴とする。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、参照遺伝子のＲＮＡまたはその一部が、たとえば、ピロシーケンス（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による配列決定または部分的な配列決定によって同定され、定量されることを特徴とする。
本発明の別の実施形態は、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡが参照遺伝子ＲＮＡとして使用されることを特徴とする。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、マイクロアレイの形態を有している支持体上の予め決定された領域の中での参照遺伝子ＲＮＡまたはそのインビトロ転写物の特異的結合のために、ＤＮＡが配置される、具体的には、固定されることを特徴とする。
【００２９】
本発明の別の実施形態は、生物学的試料がヒトの試料であることを特徴とする。
【００３０】
配列番号１から配列番号９７を有しているこれらの配列は本発明の範囲に含まれ、それによる本発明の一部を構成する１０７の配列を含む付属の配列プロトコールの中に詳細に開示される。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、固定されたプローブまたは遊離のプローブが表１に対応する配列でマークされることを特徴とする。この実施形態については、自己相補的オリゴヌクレオチド、いわゆる分子ビーコンが、プローブとして使用される。それらの末端に、これらはフルオロフォア・消光剤対（fluorophore/quencher pair）を持っており、結果として、相補的配列が存在しない場合には、これらは折り畳まれたヘアピン構造で存在しており、対応する試料配列を伴う場合にのみ蛍光シグナルを提供する。分子ビーコンのヘアピン構造は、試料が特異的な捕捉（catcher）配列でハイブリダイズして立体構造の変化を生じ、それにより、レポーターの蛍光の放出を生じるまでは安定である。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１から１４の核酸プローブまたはそれらの相補物が、参照遺伝子の転写物、またはそれらの相補物の結合に使用されることを特徴とする。
【００３３】
本発明の別の実施形態は、参照遺伝子の合成アナログまたは参照遺伝子の転写物に結合する合成オリゴヌクレオチドに、具体的に、およそ６０の塩基対が含まれることを特徴とする。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、特許請求の範囲においてＤＮＡとして列挙される遺伝子が、それらのＲＮＡ、合成アナログ、アプタマー、およびペプチド核酸に由来する配列によって置き換えられることを特徴とする。
【００３５】
本発明の別の実施形態は、放射性マーカー、具体的には、32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、33Ｐ、または3Ｈが検出マーカーとして使用されることを特徴とする。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、非放射性マーカー、具体的には、色素または蛍光マーカー、酵素マーカー、または免疫マーカー、および／または量子ドット、あるいは、電気的測定が可能なシグナル、具体的には、ハイブリダイゼーションにおける電位および／または伝導率および／または容量の変化が検出マーカーとして使用されることを特徴とする。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、試料ＲＮＡと参照遺伝子ＲＮＡおよび／または酵素的もしくは化学的誘導体が同じマーキングを持つことを特徴とする。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、試験遺伝子ＲＮＡと参照遺伝子ＲＮＡおよび／または酵素的もしくは化学的誘導体が異なるマーキングを持つことを特徴とする。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、ＤＮＡプローブがガラスまたはプラスチック上に固定されることを特徴とする。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、１種類のＤＮＡ分子が支持体材料への共有結合により固定されることを特徴とする。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、１種類のＤＮＡ分子が、静電気相互作用および／または双極子−双極子相互作用および／または疎水性相互作用、ならびに／あるいは水素結合によって支持体材料に固定されることを特徴とする。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、敗血症アッセイにおける較正器としての使用方法がある。すなわち、組み換え配列の使用、あるいは、人工的に合成された特異的参照遺伝子核酸配列の使用やその部分的配列の単独使用または特定量での使用の際に、これらの使用を較正器として機能させることが可能である。これらの使用は、ＳＩＲＳと敗血症の予防および処置のために、有効成分のスクリーニングにおける作用と毒性の評価、もしくは、治療薬の生成、治療薬として用いることを意図する物質または複数物質の混合物の生成に資する。
【００４３】
当業者は、特許請求の範囲に示される本発明の各特徴が全く制限なく任意に組み合わせられ得ることを理解するであろう。
【００４４】
本発明に含まれる参照遺伝子の意味は、任意の誘導されたＤＮＡ配列、部分的な配列、および合成アナログ（たとえば、ペプチド核酸、ＰＮＡ）であると理解されるべきである。ＲＮＡレベルでの遺伝子発現の決定に関する本発明の記述は、限定的なものではなく、むしろ例示的な適用にすぎない。
【００４５】
本発明に係る方法の応用例の一つとして、全血から取り出した、相互に異なる遺伝子発現に関する測定データの正規化がある。この正規化は、例えば、ＳＩＲＳと敗血症との識別並びにそれらの重篤度（何れも参考文献［４］に対応する）の識別のためのものである。この目的のため、対象となる患者の全血から、さらには、健常な被験者または非感染患者の比較サンプルから、参照遺伝子のＲＮＡを単離する。次いで、このＲＮＡをマーキングする。このマーキングは、例えば、32Ｐを用いた放射性元素により、あるいは、着色用分子（蛍光分子）を用いて行われる。従来、この目的のために知られているあらゆる分子または検出シグナルをマーキング用分子として用いることができる。この目的のために使用される分子または方法は当業者には公知である。
【００４６】
このようにマークされたＲＮＡはその後、マイクロアレイ上に固定されたＤＮＡ分子とハイブリダイズさせられる。マイクロアレイ上に固定されたＤＮＡ分子は、ＳＩＲＳと敗血症との識別における遺伝子発現データの正規化のための遺伝子の特異的選択を示す。
【００４７】
次いで、ハイブリッド分子（混成分子）のシグナル強度が適当な測定装置（フォスホリメージャー（Ｐｈｏｓｐｏｒｉｍａｇｅｒ）、マイクロアレイスキャナーなど）を用いて測定され、さらに、ソフトウェアを内蔵した評価装置により解析される。測定されたシグナル強度に基づいて、患者のサンプルの試験遺伝子と参照遺伝子との間の発現比が求められる。過少に、または、過大に調整された遺伝子の発現比に基づいて、以下に述べるような実験において、ＳＩＲＳと敗血症との識別に関する結論を引き出すことができる。
【００４８】
遺伝子活性のもう一つの適用例は、これはマイクロアレイの分析及びこれに続いて行われる遺伝子表現データの正規化のための数量化を伴うものであるが、ＳＩＲＳと敗血症との識別に対する適用例である。これは、診断目的（例えば、炎症を局地的に抑え、特に感染を伴う固体の免疫応答の重篤度(severity of affliction)を測定するため、あるいは、患者のデータ管理システムまたは専門家用システムのフレームワークにおいて）あるいは細胞シグナルの伝達経路のモデル化を行うためのソフトウェアを作成するための電子的処理に有用である。
【００４９】
以下は、本特許出願の目的のためのマイクロアレイの評価の実施態様にあたる。
【００５０】
「マイクロアレイ実験の説明」
（ブラズマ Ａら、ミニマムインフォーメーションアバウトアマイクロアレイエクスペリメント（ＭＩＡＭＥ）−トワードスタンダーズフォーマイクロアレイデータ，ネイチャー ジェネテックス２９，３６５−３７１（２０００）（New edition January 2005, based on Brazma A et al., Minimum information about a microarray experiment (MIAME)−toward standards for microarray data, Nature Genetics 29, 365 - 371 (2001)） Minimum Information About a Microarray Experiment(MIMAE)文献［１７］に基づく２００５年１月の新版であるミニマムインフォーメーションアバウトアマイクロアレイエクスペリメント［ＭＩＡＭＥ］のチェックリストにしたがう。これらの内容は全体が引用により本明細書中に組み入れられる）
【００５１】
（スライドの読み取り／スキャナ技術の詳細）
ａ）スキャナ：ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ共焦点落射式蛍光スキャナ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）
ｂ）スキャニングソフトウェア：ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ４．０
ｃ）スキャニングパラメーター：レーザー出力：Ｃｙ３チャンネル−１００％
Ｃｙ５チャンネル−１００％
ＰＭＴ電圧： Ｃｙ３チャンネル−７００Ｖ
Ｃｙ５チャンネル−８００Ｖ
ｄ）空間分析能（画素空間）−１０μｍ
【００５２】
（データの読み取りと処理）
実験の構成においては、１０００を超える患者の血液試料をハイブリダイズさせた。個々のＲＮＡ対（患者対比較用ＲＮＡ）をマイクロアレイ上で同時にハイブリダイズさせた。患者のＲＮＡを赤色蛍光色素でマークし、比較用ＲＮＡを緑色蛍光色素でマークした。ハイブリダイズしたアレイのデジタル画像を、Ａｘｏｎ機器によってＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ４．０または５．０ソフトウェアを用いて評価した。スポットの検出、シグナルの定量、およびスポットの質の評価のためには、ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）分析ソフトウェアを使用した。スポットをＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）ソフトウェアの設定にしたがって、１００＝「良好」、０＝「見られる」、−５０＝「見られない」、−７５＝「存在しない」、−１００＝「不良」と記した。生のデータは、対応する *ｇｐｒファイルに保存した。
【００５３】
（正規化、変換、およびデータ選択方法）
ｅ）シグナルデータの変換と正規化
生データの正規化および偏差安定化変換のために、ヒューバーら文献［５］の方法を使用した。ここでは、加算的および乗算的エラーがブロックごとに予測される。全てのスポットのうちの約７５％がこのために利用される。その後、シグナルは、ａｒｓｉｎｈ関数によって変換される。（したがって、変換された±０．４の比は、１．５倍の変化にほぼ対応する（大きな数については、ａｒｓｉｎｈ（ｘ）はＬｎ（２ｘ）とほぼ同じである）。
【００５４】
ロック ＤＭ、ダービン Ｂの遺伝子発現アレイについての測定誤差のモデル、Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．；２００１，８（６）：５５７−６９（文献［１８］）では、発現レベルの関数として遺伝子発現アレイの測定誤差を予測するためのモデルが開発された。その内容は引用により本明細書中に完全に組み入れられる。さらなる分析方法、データ変換と重み付け（ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）とを組み合わせたこの誤差モデルにより、すでに、遺伝子発現データのより正確な比較が可能であり、バックグラウンド分析のための指針、信頼区間の決定、およびさらなる処理または分析のためのそれらの多変量についての分析データの処理が、それぞれ提供される。
【００５５】
ロックおよびダービンの文献［１８］による上記誤差モデルに基づいて、フーバー Ｗ、ハイドブレック Ａ、およびシュルツマン Ｈの、マイクロアレイデータの較正、および差次的発現の定量に適応された偏差安定化、バイオインフォーマテックス、２００２；１８（文献［１９］），補遣１：９６−１０４頁は、マイクロアレイ遺伝子発現データについての統計学的モデルを開発した。その内容は引用により本明細書中に完全に組み入れられる。このモデルには、データの較正、異なる発現デレベルの定量、ならびに測定誤差の定量が含まれる。これに関して、フーバーらの文献［１９］ではシグナル強度の測定と異なる統計値についてのデータ変換を導き、これにより、逆関数ａｒｓｉｎｈを使用することによるその強度範囲全体にわたってシグナルデータのセットの偏差安定化と正規化がもたらされる。この方法は、マイクロアレイ遺伝子発現データについて具体的に明らかにされているが、本発明の構成における遺伝子発現の測定のための他の方法に置き換えることもできる。
【００５６】
これにより、シグナルの評価において頻繁に観察されるシグナル強度に対する偏差の依存性は、逆関数を用い上記変換により補正される。
【００５７】
ｆ）フィルトレーション（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
マイクロアレイ上での技術の複製（同じ試料の複数のスポット）が、それらのスポットの質に応じて修正され変換されたシグナル強度から除外される（ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｏｕｔ）。個々のスポットについて最も高い特徴を有している複製が選択され、関連するシグナル強度が平均される。測定不可能な複製しか有していないスポットの発現は「ＮＡ」（該当なし）と記載される。
【００５８】
本発明の方法の別の応用は、差次的遺伝子発現の測定にある。本発明は、患者が計画された治療に対応する可能性を治療と同時に決定するため、また、特定の治療に対する対応の決定のため、また、ＳＩＲＳと敗血症の患者とその重篤度について「薬物モニタリング」の意味での治療終了の特定のために応用される。この目的のためは、任意の時間間隔で回収された患者の血液試料からＲＮＡ（試験ＲＮＡと対照ＲＮＡ）が単離される。様々なＲＮＡ試料が一緒にマークされ、選択された試験遺伝子やマイクロアレイ上に固定された参照遺伝子とハイブリダイズさせられる。１つまたはいくつかの参照遺伝子と、たとえばＴＮＦαのような試験遺伝子との間での発現比から、患者が計画された治療に対応するであろう可能性、開始された治療が有効であるかどうか、また、どれほど長い間患者が対応して治療されるか、そして、使用された用量および期間によってすでに最大治療効果に達しているかどうかを評価することができる。
【００５９】
本発明の方法の別の応用は、ハイブリダイゼーションには依存しない方法、具体的には、酵素的または化学的加水分解、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、その後の核酸ならびに／あるいはこれらの誘導体および／または断片の定量を通じて定量的情報を得るための、本発明の遺伝子のＲＮＡの使用にある。
【００６０】
ＰＣＲ（そしてまた、ＮＡＳＢＡのような付加的増幅方法）により増幅させられ、定量された参照遺伝子の転写物は、ＳＩＲＳと敗血症、およびそれらの重篤度の識別における遺伝子発現データの正規化のための、本発明の別の実施形態を構成する。増幅された転写物のシグナル強度が、その後、適切な測定装置（ＰＣＲ蛍光検出器）によって測定され、ソフトウェアによって支援される評価を活用して分析される。測定されたシグナル強度から、患者試料の試験遺伝子と参照遺伝子との間の発現比が決定される。過小に、または、過大に調整された遺伝子の発現比に基づいて、以下に述べるような実験において、ＳＩＲＳと敗血症、およびそれらの重篤度を識別するための結論を引き出すことができる。
【００６１】
本発明に係る方法のもう一つの適用例は遺伝子活動性の使用方法にある。この使用方法は、ＰＣＲまたはその他の増幅方法とこれに続いて行われる遺伝子表現データの正規化のための定量化とを伴い、ＳＩＲＳと敗血症及びそれらの重篤度の識別を求めるためのものであり、診断目的（例えば、炎症の中心を見つけ、特に細菌感染を伴う固体の免疫応答の重篤度を測定するため、あるいは、患者のデータ管理システムまたは専門家用システムのフレームワークにおいて）あるいは細胞シグナルの伝達経路のモデル化を行うためのソフトウェアを作成するための電子的処理に有用である。
【００６２】
本発明の方法の別の応用は、試料中のｍＲＮＡ量の決定にある。即ち、ａ）核酸の単離、ｂ）配列番号２２から配列番号９７より選択された１つまたはいくつかの核酸の発現値の測定、ｃ）ｍＲＮＡの全量中の核酸の公知の割合値に対する、選択された核酸の発現値の比較、ｄ）ｍＲＮＡの全量に対する、配列番号２２から配列番号９７より選択される１つまたはいくつかの核酸の発現値の外挿、およびｄ）試料中のｍＲＮＡの全量の決定を含むものである。
【００６３】
本発明の方法の別の応用は、いくつかの試料中の、所定の場合には増幅させられた、ｍＲＮＡ量の正規化にある。即ち、ａ）様々な試料の間での配列番号２２から配列番号９７より選択される１つまたはいくつかの核酸の発現値の比較、ｂ）いくつかの試料の間での配列番号２２から配列番号９７より選択される１つまたはいくつかの核酸の発現値の正規化のための値を導くこと、およびｃ）工程ｂ）に基づく、いくつかの試料から単離された他の核酸の発現の正規化を含むものである。
【００６４】
本発明はさらに、参照遺伝子として使用される、患者試料中の遺伝子発現プロフィールのインビトロ（試験管レベル）での決定のための、少なくとも１から１００、好ましい実施形態においては１から５および１から１０ヌクレオチドを含む、配列番号２２から配列番号９７に記載される配列、および／またはそれらの遺伝子断片の選択を含むキットに関係する。
【００６５】
本発明はさらに、参照遺伝子として使用される、患者試料中の遺伝子発現プロフィールのインビトロ（試験管レベル）での決定のための、少なくとも５０ヌクレオチドを含む、配列番号１から配列番号７に記載されるハイブリダイゼーションプローブ、および／またはそれらの遺伝子断片の選択を含むキットに関係するものである。
【００６６】
本発明は同様に、参照遺伝子として使用される、患者試料中の遺伝子発現プロフィールのインビトロ（試験管レベル）での決定のための、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、配列番号８から配列番号２１に記載されるプライマープローブ、および／またはそれらの遺伝子断片の選択を含むキットに関係する。
【００６７】
また、本発明は、その最も広く最も一般的な構成において、以下の実施形態に関するものである。
【００６８】
Ａ）患者の血液試料からの遺伝子発現分析データの正規化のための少なくとも１つの参照遺伝子。ここで、上記参照遺伝子は以下のＲＮＡ配列より選択される：配列番号２２から配列番号９７、特に、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、および配列番号９６。
【００６９】
Ｂ）患者の血液試料からの、核酸の増幅に基づく遺伝子発現分析データの正規化のためにＡ）に記載された参照遺伝子から導かれた少なくとも１つのプライマー。ここで、上記プライマーは以下のＤＮＡ配列より選択される：配列番号８から配列番号２１。
【００７０】
Ｃ）患者の血液試料からの遺伝子発現分析データの正規化のための、Ｂ）に記載された参照遺伝子から導かれた、少なくとも１つのプローブ。ここで、上記プローブセットには以下のＤＮＡ配列が含まれる：配列番号１から配列番号７、ならびにそれらの相補的核酸配列。
【００７１】
Ｄ）Ａ）に記載された参照遺伝子、またはＢ）に記載されたプライマーセット、またはＣ）に記載されたプローブセットより選択される少なくとも１つの対照核酸を活用する遺伝子発現分析データの正規化のための方法。この方法は、以下の工程を含む。
ａ）少なくとも１回の遺伝子発現分析アッセイが患者の血液試料についてインビトロ（試験管レベル）で行われる工程。
ｂ）少なくとも１つの対照核酸が、試験される試料（被験試料）の遺伝子発現分析データの正規化のための基準として同じアッセイにおいて一緒に試験される工程。
ｃ）遺伝子発現分析により、複数の遺伝子、および少なくとも１つの対照核酸の遺伝子発現の程度を反映するシグナルが検出される工程。
ｄ）工程ｃ）で得られたシグナルデータを、シグナルデータの検出技術上不可避の変動幅を少なくとも小さくするために、数学的に変換される工程。そしてそれにより、
ｅ）被験試料のシグナルデータが正規化される工程。
【００７２】
Ｅ）Ｄ）に記載された方法の好ましい実施形態は以下の通りである。
シグナルデータの数学的変換がａｒｓｉｎｈにより、または対数的アプローチにより行われるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
遺伝子発現アッセイが、以下から選択されるＤ）に記載の方法。
f）血液試料からの核酸の単離；
g）必要に応じて行われる、対照核酸のセットと試験される核酸のセットの同時増幅；および
h）プローブのハイブリダイゼーション；
ならびに／あるいは
核酸にはｍＲＮＡとマイクロＲＮＡが含まれるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
核酸が、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、またはＳＤＡによって増幅されるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
対照核酸と試験核酸の発現値が、ハイブリダイゼーション方法によって決定されるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
対照核酸および／または試験核酸の発現値の測定が、溶液中、または支持体上に固定された核酸上で行われるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
支持体が、マイクロアレイ、粒子、ビーズ、硝子、金属、または膜であるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
対照核酸および／または試験核酸が、抗体、抗原、オリゴヌクレオチド、分子ビーコン、または酵素のような他の結合パートナーを介して支持体に間接的に結合させられるＤ）に記載の方法。
ならびに／あるいは
患者の試料からインビトロ（試験管レベル）で決定された対照核酸と試験核酸の発現値が、患者の個体の予後診断の説明、診断目的、治療の決定、および／または患者データの管理システムのためのソフトウェアの開発のための入力パラメーターとして利用されるＤ）に記載の方法。
【００７３】
Ｆ）全身的免疫反応を含む障害の診断のための遺伝子発現分析方法の正規化を行うための、Ａ）に記載された参照遺伝子、またはＢ）に記載されたプライマー、またはＣ）に記載されたプローブから選択される少なくとも１つの対照核酸の使用。
【００７４】
Ｇ）Ｆ）に記載された対照核酸使用の好ましい実施形態は以下の通りである。
上記障害が敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全からなる群より選択される、Ｆ）に記載された対照核酸の使用。
ならびに／あるいは
以下の工程を含む、対照核酸のセットと、その発現がＳＩＲＳまたは敗血症に特異的である試験核酸のセットを使用することにより、個体のＳＩＲＳ、敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全のインビトロ（試験管レベル）での診断のための方法。
ａ）個体の試料からの対照核酸と試験核酸の同時単離
ｂ）必要に応じ、対照核酸と試験核酸の増幅
ｃ）対照核酸と試験核酸の発現値の決定
ｄ）対照核酸の発現値に基づく試験核酸の遺伝子発現の正規化
ｅ）正規化された試験核酸の発現値が、ＳＩＲＳ、敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全についての特有な値に達しているかどうかの決定
【００７５】
以下もまた、本発明の構成におけるデータ変換／正規化に基本的に適用される。
【００７６】
第一の変形例（1st Variant)（ＰＣＲ実験または診断用小アレイにおける正規化に使用されるもの）
参照遺伝子のシグナルが集められ、次いで、集められた参照遺伝子のシグナルに対する試験遺伝子のシグナルの比率が計算される。シグナルが対数化されている場合には、この比率はＳＩＲＳと敗血症との差異を示す。
【００７７】
第二の変形例（2nd Variant)（フーバー等の参照文献［１９］における「全ゲノム」式アプローチまたは大アレイ）
参照遺伝子のシグナルを用いて、適切な変換のパラメーターあるいは変換それ自体が予測される。この変換は、その後、試験遺伝子に適用される。
【実施例】
【００７８】
本発明のさらなる利点と特徴は、実施例の記載から明らかとなろう。
【００７９】
［実施例１］
「血液からおよび血球からの参照遺伝子の同定」
遺伝子発現の測定：
３７２人の集中治療室にいる患者（ＩＴＵ患者）の遺伝子発現を測定した。患者は全て、集中治療による医学的治療中（ｕｎｄｅｒ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ−ｃａｒｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）であった。最長７日間のＩＴＵ日数をそれぞれの患者について検討した。７日間よりも長いＩＴＵ日数があった患者については、７日間を無作為に選択した。全部で１２６１のマイクロアレイ実験のデータを分析に入力した。
患者の選択した特徴を表４および５に示す。年齢、性別、およびＡＣＣＰ／ＳＣＣＭカテゴリーに関する情報が提供される。細胞株ＳＩＧ−Ｍ５由来の全ＲＮＡを参照試料とした。患者試料を全て、１つの個々のマイクロアレイ上の参照試料とそれぞれ同時にハイブリダイズさせた。表４に患者の一般的データを、表５に被験者の適応症を夫々示した。
【００８０】
【表４】
【００８１】
【表５】
【００８２】
実験の説明：
（血液の採取とＲＮＡの単離）
患者の全血を、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）の説明書にしたがってＰＡＸＧｅｎｅキット（ＰＡＸＧｅｎｅ Ｋｉｔ）を利用して集中治療室にいる患者から採取した。全血の採取後、試料の全ＲＮＡを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）の説明書にしたがってＰＡＸＧｅｎｅ血液ＲＮＡキット（ＰＡＸＧｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ）を使用することによって単離した。
【００８３】
（細胞培養）
細胞培養（対照試料）には、１９の細胞冷凍保存（ＳＩＧＭ５）（液体窒素の中で凍結させた）を利用した。細胞をそれぞれ、２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した２ｍｌのイスコヴ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（バイオクロムＡＧ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ））に接種した。その後、細胞培養物を１２ウェルプレートの中で、５％ＣＯ2、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、１８個のウェルの内容物をそれぞれ同じ容量を有している２つに分け、結果として、最終的には同じ形式の３つのプレート（全部で３６ウェル）を利用した。その後、培養を、同じ条件下で２４時間続けた。
この後、それぞれのプレートの１１個のウェルの得られた培養物を１つにし、遠心分離した（１０００×ｇ、５分間、室温）。上清を廃棄し、細胞ペレットを４０ｍｌの上記培地中に溶解させた。これらの４０ｍｌの溶解させた細胞を、２つの２５０ｍｌの試験管に等しく分け、４８時間インキュベーション、および５ｍｌの上記培地の添加後にもう一度インキュベートした。残りの２つのプレートの残っている２ｍｌのうち、８０μｌを、１ｍｌの上記培地を用いてあらかじめ準備しておいた同じプレートの空のウェルに入れた。４８時間のインキュベーションの後、１２ウェルプレートを１つだけ、以下のように処理した。
それぞれのウェルから５００μｌを取り出し、１つにした。得られた６ｍｌを、およそ１０ｍｌの新しい培地を含む２５０ｍｌの試験管に入れた。この混合物を、室温で５分間、１０００×ｇで遠心分離し、１０ｍｌの上記培地の中に溶解させた。その後の細胞の計数により以下の結果が得られた：１．５×１０7細胞／ｍｌ、１０ｍｌの全量、細胞の総数：１．５×１０8。細胞数がまだ十分ではなかったので、２．５ｍｌの上記細胞懸濁液を、２５０ｍｌ（７５ｃｍ2）の試験管（全部で４つの試験管）中の３０ｍｌの上記培地の中に入れた。
７２時間のインキュベーションの後、それぞれ２０ｍｌの新しい培地を試験管に入れた。２４時間のインキュベーション後、細胞の計数を上記にしたがって行い、３．８×１０8細胞の全細胞数を得た。２×１０6細胞の所望される細胞数を得るために、細胞を、４つの試験管の中の４７．５ｍｌの上記培地に再懸濁した。２４時間のインキュベーション期間の後に細胞を遠心分離し、Ｃａ2+もＭｇ2+も含まないリン酸緩衝液（バイオクロムＡＧ）で２回洗浄した。
【００８４】
全ＲＮＡの単離は、説明書にしたがってヌクレオスピンＲＮＡ Ｌキット（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ Ｌ Ｋｉｔ）（マシェリーアンドナゲル（Ｍａｃｈｅｒｙ ＆ Ｎａｇｅｌ））によって行った。上記手順を、必要な細胞数が得られるまで繰り返した。これは、１０8細胞あたり６００μｇのＲＮＡの効率にほぼ相当する、６ｍｇの全ＲＮＡの必要量を得るために不可欠であった。
【００８５】
（逆転写／マーキング／ハイブリダイゼーション）
全血の採取後、試料の全ＲＮＡを単離し、説明書にしたがってＰＡＸＧｅｎｅ血液ＲＮＡキット（ＰＡＸＧｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ）（プレアナリティＸ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ））を使用することによってその性質を試験した。それぞれの試料から１０μｇの全ＲＮＡをアリコートし、参照ＲＮＡとしてのＳＩＧＭ５細胞由来の１０μｇの全ＲＮＡとともに、逆転写酵素スーパースクリプトＩＩ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に作り直し、その後、ＲＮＡをアルカリ加水分解によってバッチ（回分）から除去した。反応バッチの中で、ｄＴＴＰの部分を、あとでｃＤＮＡに対して蛍光色素を結合させることができるように、アミノアリル−ｄＵＴＰ（ＡＡ−ｄＵＴＰ）で置き換えた。
【００８６】
反応バッチの精製後、試料のｃＤＮＡと対照のｃＤＮＡを蛍光色素Ａｌｅｘａ ６４７およびＡｌｅｘａ ５５５で共有結合によってマークし、ＳＩＲＳ−Ｌａｂ社のマイクロアレイ上にハイブリダイズさせた。使用したマイクロアレイ上には、それぞれが１つのヒト遺伝子と、品質保証のための対照スポットを提示する５５から７０塩基対の長さを有している５３０８種類のポリヌクレオチドが固定されている。１つのマイクロアレイを、１５×１５スポットのラスターを有している２８のサブアレイに分けた。
【００８７】
ハイブリダイゼーションとその後の洗浄および乾燥は、それぞれ、説明書にしたがって、４２℃で１０．５時間以内に、ハイブリダイゼーションステーションＨＳ４００（テカン（Ｔｅｃａｎ））の中で行った。使用したハイブリダイゼーション溶液は、個々のマークされたｃＤＮＡ試料、３．５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭの塩化ナトリウムと１５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む）、０．３％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｖ／Ｖ）、２５％のホルムアミド（Ｖ／Ｖ）、および０．８μｇ・μｌ-1ｃｏｔ-1のＤＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、そして各ポリ−Ａ ＲＮＡから構成されている。続いて、マイクロアレイの洗浄を以下の手順にて室温で行った：洗浄緩衝液１（２×ＳＳＣ、０．０３％のドデシル硫酸ナトリウム）、洗浄緩衝液２（１×ＳＳＣ）、最後に洗浄緩衝液３（０．２×ＳＳＣ）でそれぞれ９０秒間のすすぎ。次いで、マイクロアレイを、３０℃で１５０秒間、２．５ｂａｒの圧力の窒素フロー下で乾燥させた。
【００８８】
ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナルを、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂスキャナ（アキソン（Ａｘｏｎ））を利用して読み取り、差次的に発現された遺伝子の発現比を、ソフトウェアＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ４．０（アキソン）を利用して決定した。
【００８９】
評価：
評価のために、スポットの平均強度を、関連するスポット画素の中央値として決定した。
【００９０】
遺伝子試料の事前選択：
遺伝子プローブの最初の事前選択のために、システム誤差の補正を、フーバーら文献［５］のアプローチにしたがって行った。マイクロアレイの中での加算的および乗算的バイアスを、存在する遺伝子試料の７５％から推定した。
【００９１】
続いて、患者試料のシグナルの正規化された比と変換された比を、一般的な対照に対して計算した。すなわち、ｋ番目アレイのｊ番目遺伝子についての計算により以下の値が得られた。
Ｇj、k＝ａｒｓｉｎｈ（Ｓｃｙ５（ｊ，ｋ））−ａｒｓｉｎｈ（Ｓｃｙ３（ｊ，ｋ））
式中、［Ｓｃｙ３（ｊ，ｋ）、Ｓｃｙ５（ｊ，ｋ）］は、関連する蛍光シグナルの対を示す。全ての遺伝子プローブについて、中央値からの絶対偏差の中央値（ＭＡＤ）、すなわち、ＭＡＤ（Ｇj、1、．．．、Ｇj、1261）を続いて計算し、最も低いＭＡＤを有している１０％の遺伝子プローブを選択した。事前選択の第２の基準として、平均シグナル強度ａｒｓｉｎｈ（Ｓｃｙ５（ｊ，ｋ））＋ａｒｓｉｎｈ（Ｓｃｙ３（ｊ，ｋ））を使用した。さらなる分析においては、いわゆるダイナミックシグナルレンジの中、好ましくは（対数目盛で）６と８の間に平均シグナル強度の中央値を有している遺伝子プローブだけを、考慮に入れた。
【００９２】
参照遺伝子の選択：
前もって選択した遺伝子プローブについて、相対的な量を最も高い発現値を１に設定することによって計算した。続いて、ヴァンデソンペールら文献［６］の遺伝子安定性の測定値Ｍを計算した。ヴァンデソンペールらに記載されたものと同じ段階的手順（ここでは、最も低い安定性を有している遺伝子がそれぞれの工程において除外される）により、遺伝子プローブをそれらの安定性にしたがって並べた。遺伝子プローブの選択のための上限値は、安定性の測定値Ｍの平均値についての（おおよその）値０．６に基づいた（表６−１、表６−２参照）。
【００９３】
ヴァンデソンペールらに従う遺伝子安定性の測定値Ｍの数学的定義は以下のとおりである。
２つの内部参照遺伝子ｊとｋのそれぞれの組み合わせについて、要素ｍのアレイＡjkが提供され、これは、ｌｏｇ2に変換された発現比ａij／ａjkからなる（方程式１）。参照遺伝子ｊとｋについての対となる変分Ｖjkは、要素Ａjkの標準偏差としてさらに定義され（方程式２）、ＳＤは標準偏差である。次いで、参照遺伝子ｊについての遺伝子安定性の測定値Ｍjは、全ての対となる変分Ｖjkの算術平均である（方程式３）：
（それぞれのｊ、ｋについて、［１，ｎ］とｊ ｋ）：
【数１】
【数２】
【数３】
【００９４】
クラスターを、付属の配列プロトコールの一部である配列番号２２から配列番号９７に対応する不変の遺伝子活性を有している７６個の特異的配列について決定した。表６−１、表６−２に決定した参照遺伝子（ＲＮＡ塩基）とそれらの安定性値を示す。
【００９５】
【表６−１】
【表６−２】
【００９６】
［実施例２］
「敗血症患者と敗血症に罹患していない患者の遺伝子発現試験による参照遺伝子の安定性の試験」
本実施例において、本発明者らは、第１の実施例において決定した参照遺伝子がまた、集中治療を受けている敗血症患者および敗血症に罹患していない患者の場合にも安定であることを示す。この目的のために、本発明者らは、１１８人の患者のマイクロアレイデータを検討した。全部で３９４日ののべ入院日数（マイクロアレイ）を分析し、１人の患者について最長７日間を考慮に入れた。表７に患者の一般的データ、表８にACCP/SCCMカテゴリーによるのべ入院日数の分類ならびに付加的な診断パラメーターを夫々示す。
【００９７】
【表７】
【００９８】
【表８】
【００９９】
ＳＩＲＳ患者と敗血症患者の比較による参照遺伝子の適用性を明らかにするために、以下の試験遺伝子を選択した。表９にSIRS患者と敗血症患者の比較のための試験遺伝子を示す。
【０１００】
【表９】
【０１０１】
これらの試験遺伝子は、敗血症と関連して科学学術文献に記載されている。
【０１０２】
統計分析のために、６人の重症ＳＩＲＳ患者（ＳＩＲＳ＋臓器不全）と、９人の重症敗血症患者（敗血症＋臓器不全）を選択した。表１０に、ＳＩＲＳ患者と敗血症患者についての選択した特性を示す。
【０１０３】
【表１０】
【０１０４】
１０個の試験遺伝子の正規化を、以下の５個の無作為に選択した参照遺伝子によって行った。ヴァンデソンペールら文献［６］の方法を使用した。表１１に、選択した参照遺伝子(セット１)を示す。
【０１０５】
【表１１】
【０１０６】
２つの試料のｔ検定による比較によって以下の結果を得た。表１２に、参照遺伝子セット１を用いて正規化した試験遺伝子活性を示す。
【０１０７】
【表１２】
【０１０８】
結果の再現性を明らかにするために、統計比較を、再び無作為に選択した参照遺伝子（セット２）を用いて繰り返した。表１３に、参照遺伝子（セット２）を示す。
【０１０９】
【表１３】
【０１１０】
ヴァンデソンペールらの方法による正規化の後、本発明者らは、２つの試料のｔ検定について以下の結果を得た。表１４に、参照遺伝子のセット２を用いて正規化した試験遺伝子の遺伝子活性を示す。
【０１１１】
【表１４】
【０１１２】
結果は、結果の極めて優れた再現性を示している。いずれの比較においても、それぞれ５％または１０％のレベルで同じマーカーが有意であった。
【０１１３】
［実施例３］
リアルタイムＰＣＲによるそれらの特異的プライマーを通じた選択した参照遺伝子の安定性値の決定
【０１１４】
（ＲＮＡの単離）
ＲＮＡを、説明書にしたがってＰＡＸｇｅｎｅキット（プレアナリティＸ）を活用して全血から単離した。
【０１１５】
（定量的逆転写酵素−ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）（ＲＴ−ＰＣＲ））
逆転写により、ｍＲＮＡをその配列とは無関係なオリゴｄＴプライマーを利用してｃＤＮＡに作り直した。使用したｍＲＮＡに対する相補性のプロセスにおいて形成されたｃＤＮＡ鎖を、続いて、様々なＰＣＲ反応の鋳型として使用した。
ａ）バッチについては、次の成分をまとめてピペットで採取した。
− ５μｇの濃縮したＲＮＡ
− １０μｌのＨ2Ｏ
− １μｌのｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）
− １μｌのオリゴｄＴ（０．５μｇ／μｌ）
ｂ）７０℃で５分間、その後、氷上で５分間処理した。
ｃ）次の混合物をその後添加した。
− ４μｌのＲＴ緩衝液
− ２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ
− １μｌのＲＮａｓｅアウト（ＲＮａｓｅ阻害剤）
− １μｌのスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）逆転写酵素
ｄ）４２℃で１時間インキュベートした。
ｅ）７０℃で１５分間インキュベートした。
【０１１６】
（ポリメラーゼ連鎖反応）
選択したＤＮＡ部分を、ＰＣＲを活用して増幅させ、その後に定量し参照遺伝子の遺伝子発現の強度を決定した。
ＰＣＲには、インビトロジェンによるアッキュプライムタックＤＮＡポリメラーゼシステム（ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用した。
【０１１７】
２５μｌのバッチについて、次の成分を２００μｌのチューブにまとめてピペット採取した：
２．５μｌの１０×アキュプライムＰＣＲ緩衝液Ｉ（ＡｃｃＰｒｉｍｅ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ Ｉ）
２０μｌのＲＮａｓｅを含まないＨ2Ｏ
１μｌの１：１０希釈された鋳型ＤＮＡ（およそ０．８２ｎｇ／μｌ）
１μｌのプライマー混合物（表２に対応する、それぞれ０．５μｌの正方向プライマー／逆方向プライマー）
０．５μｌのアキュプライムタックＤＮＡポリメラーゼ（ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）。
次いで、以下のプログラムを、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー（コルベットリサーチ（ｃｏｒｂｅｔｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ）ＲＧ３０００）の中で行った。
９４℃ ２分間
９４℃ ３０秒間
５８℃ ３０秒間 ３０サイクル
６８℃ １分間
６８℃ ２分間
最初に、鋳型ＤＮＡを９４℃で完全に変性させ、酵素を活性化させた。この後、９４℃での変性、５８℃でのアニーリング、そして６８℃での伸長からなる増幅を３０サイクル行った。ＰＣＲ後、試料を、断片の大きさによって生成物の正確性を試験するために、１．５％のアガロースゲル上に移した。表１５に、特異的プライマーとリアルタイムPCRによって決定した選択された参照遺伝子（RNA塩基）の安定性値を示す。
【０１１８】
【表１５】
【０１１９】
参考文献
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の血液試料から採取した遺伝子発現分析データの正規化のための参照遺伝子セットであって、前記参照遺伝子セットが配列番号８７、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、および配列番号９６のＲＮＡ配列を含むことを特徴とする参照遺伝子セット。
【請求項２】
患者の血液試料から採取した、核酸の増幅に基づく遺伝子発現分析データの正規化のために用いられる、請求項１に記載の参照遺伝子セットに由来するプライマーセットであって、前記プライマーセットが、配列番号８から配列番号２１のＤＮＡ配列を含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項３】
患者の血液試料から採取した遺伝子発現分析データの正規化のために用いられる、請求項１に記載の参照遺伝子セットに由来するプローブセットであって、前記プローブセットが配列番号１から配列番号７、ならびにそれらの相補的核酸配列のＤＮＡ配列を含むことを特徴とするプローブセット。
【請求項４】
請求項１に記載の参照遺伝子セット、請求項２に記載のプライマーセット、または請求項３に記載のプローブセットから選択された対照核酸セットを用いる遺伝子発現分析データの正規化のための方法であって、前記方法が下記a)からe)の工程を含むことを特徴とする遺伝子発現分析データの正規化のための方法。
ａ）少なくとも１回の遺伝子発現分析アッセイを、患者の血液試料についてインビトロで行う工程
ｂ）対照核酸の１つのセットを、被験試料の遺伝子発現分析データの正規化のための基準として、同じアッセイにおいて一緒に試験する工程
ｃ）遺伝子発現分析の結果として得られたシグナルであって、複数の遺伝子および前記対照核酸のセットの遺伝子発現の程度を反映するシグナルを検出する工程
ｄ）工程ｃ）で得られたシグナルデータを、シグナルデータの検出技術上不可避の変動幅を少なくとも小さくするために、数学的に変換する工程、そして
ｅ）それにより、被験試料の数学的に変換されたシグナルデータを正規化する工程
【請求項５】
シグナルデータの数学的変換が、逆関数ａｒｓｉｎｈにより、または対数的アプローチにより行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子発現アッセイが、以下から選択されることを特徴とする請求項４または５に記載の方法。
ａ）血液試料からの核酸の単離
ｂ）必要に応じて行われる、対照核酸のセットと試験される核酸との同時増幅、および
ｃ）プローブのハイブリダイゼーション
【請求項７】
前記核酸にｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡが含まれることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸が、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、またはＳＤＡによって増幅されることを特徴とする請求項４から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記対照核酸の発現値と試験核酸の発現値が、ハイブリダイゼーション方法によって決定されることを特徴とする請求項６から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対照核酸および／または前記試験核酸の発現値の測定が、溶液中、または支持体上に固定された核酸上で行われることを特徴とする請求項４から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記支持体が、マイクロアレイ、粒子、ビーズ、硝子、金属、または膜であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対照核酸および／または前記試験核酸が、抗体、抗原、オリゴヌクレオチド、分子ビーコン、または酵素のような他の結合パートナーを介して支持体に間接的に結合させられることを特徴とする請求項４から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
患者の試料からインビトロで決定された前記対照核酸と前記試験核酸の発現値が、患者の個体の予後診断の説明、診断目的、治療の決定のためのソフトウェアの開発、および／または患者データの管理システムの入力パラメーターとして利用されることを特徴とする請求項４から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
全身的免疫反応を含む障害の診断のための遺伝子発現分析方法の正規化を行うための、請求項１に記載の参照遺伝子セット、請求項２に記載のプライマーセット、または請求項３に記載プローブのセットから選択される対照核酸セットの使用。
【請求項１５】
前記障害が敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全からなる群より選択される、請求項１４に記載の対照核酸セットの使用。
【請求項１６】
次の工程を含む、対照核酸のセットと、ＳＩＲＳまたは敗血症に特異的な発現を有している試験核酸とを使用することにより、個体のＳＩＲＳ、敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全のインビトロでの診断のための方法における、請求項１４または１５に記載の対照核酸の使用。
ａ）個体の試料からの対照核酸と試験核酸の同時単離
ｂ）必要に応じ、対照核酸と試験核酸の増幅
ｃ）対照核酸と試験核酸の発現値の決定
ｄ）対照核酸の発現値に基づく試験核酸の遺伝子発現の正規化、および
ｅ）正規化された試験核酸の発現値が、ＳＩＲＳ、敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全に特有な値に達しているかどうかの決定
【請求項１】
患者の血液試料から採取した遺伝子発現分析データの正規化のための参照遺伝子セットであって、前記参照遺伝子セットが配列番号８７、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、および配列番号９６のＲＮＡ配列を含むことを特徴とする参照遺伝子セット。
【請求項２】
患者の血液試料から採取した、核酸の増幅に基づく遺伝子発現分析データの正規化のために用いられる、請求項１に記載の参照遺伝子セットに由来するプライマーセットであって、前記プライマーセットが、配列番号８から配列番号２１のＤＮＡ配列を含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項３】
患者の血液試料から採取した遺伝子発現分析データの正規化のために用いられる、請求項１に記載の参照遺伝子セットに由来するプローブセットであって、前記プローブセットが配列番号１から配列番号７、ならびにそれらの相補的核酸配列のＤＮＡ配列を含むことを特徴とするプローブセット。
【請求項４】
請求項１に記載の参照遺伝子セット、請求項２に記載のプライマーセット、または請求項３に記載のプローブセットから選択された対照核酸セットを用いる遺伝子発現分析データの正規化のための方法であって、前記方法が下記a)からe)の工程を含むことを特徴とする遺伝子発現分析データの正規化のための方法。
ａ）少なくとも１回の遺伝子発現分析アッセイを、患者の血液試料についてインビトロで行う工程
ｂ）対照核酸の１つのセットを、被験試料の遺伝子発現分析データの正規化のための基準として、同じアッセイにおいて一緒に試験する工程
ｃ）遺伝子発現分析の結果として得られたシグナルであって、複数の遺伝子および前記対照核酸のセットの遺伝子発現の程度を反映するシグナルを検出する工程
ｄ）工程ｃ）で得られたシグナルデータを、シグナルデータの検出技術上不可避の変動幅を少なくとも小さくするために、数学的に変換する工程、そして
ｅ）それにより、被験試料の数学的に変換されたシグナルデータを正規化する工程
【請求項５】
シグナルデータの数学的変換が、逆関数ａｒｓｉｎｈにより、または対数的アプローチにより行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子発現アッセイが、以下から選択されることを特徴とする請求項４または５に記載の方法。
ａ）血液試料からの核酸の単離
ｂ）必要に応じて行われる、対照核酸のセットと試験される核酸との同時増幅、および
ｃ）プローブのハイブリダイゼーション
【請求項７】
前記核酸にｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡが含まれることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸が、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、またはＳＤＡによって増幅されることを特徴とする請求項４から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記対照核酸の発現値と試験核酸の発現値が、ハイブリダイゼーション方法によって決定されることを特徴とする請求項６から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対照核酸および／または前記試験核酸の発現値の測定が、溶液中、または支持体上に固定された核酸上で行われることを特徴とする請求項４から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記支持体が、マイクロアレイ、粒子、ビーズ、硝子、金属、または膜であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対照核酸および／または前記試験核酸が、抗体、抗原、オリゴヌクレオチド、分子ビーコン、または酵素のような他の結合パートナーを介して支持体に間接的に結合させられることを特徴とする請求項４から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
患者の試料からインビトロで決定された前記対照核酸と前記試験核酸の発現値が、患者の個体の予後診断の説明、診断目的、治療の決定のためのソフトウェアの開発、および／または患者データの管理システムの入力パラメーターとして利用されることを特徴とする請求項４から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
全身的免疫反応を含む障害の診断のための遺伝子発現分析方法の正規化を行うための、請求項１に記載の参照遺伝子セット、請求項２に記載のプライマーセット、または請求項３に記載プローブのセットから選択される対照核酸セットの使用。
【請求項１５】
前記障害が敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全からなる群より選択される、請求項１４に記載の対照核酸セットの使用。
【請求項１６】
次の工程を含む、対照核酸のセットと、ＳＩＲＳまたは敗血症に特異的な発現を有している試験核酸とを使用することにより、個体のＳＩＲＳ、敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全のインビトロでの診断のための方法における、請求項１４または１５に記載の対照核酸の使用。
ａ）個体の試料からの対照核酸と試験核酸の同時単離
ｂ）必要に応じ、対照核酸と試験核酸の増幅
ｃ）対照核酸と試験核酸の発現値の決定
ｄ）対照核酸の発現値に基づく試験核酸の遺伝子発現の正規化、および
ｅ）正規化された試験核酸の発現値が、ＳＩＲＳ、敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全に特有な値に達しているかどうかの決定
【公表番号】特表２０１０−５１９８９３（Ｐ２０１０−５１９８９３Ａ）
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５１１３７（Ｐ２００９−５５１１３７）
【出願日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１５８２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０７１１４
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０７１２３３０５）エスアイアールエス‐ラブ ゲーエムベーハー (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１５８２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０７１１４
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０７１２３３０５）エスアイアールエス‐ラブ ゲーエムベーハー (5)
【Ｆターム（参考）】
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