本発明は、式Ｉのスフィンゴイド塩基、またはその塩もしくはエステルをＣＤＷ１ｇあたり少なくとも０．５ｍｇ生産する遺伝的に操作された微生物株、詳細には遺伝的に操作された酵母株を提供する。本発明は、式Ｉのスフィンゴイド塩基またはその塩もしくはエステルをＣＤＷ１ｇあたり少なくとも０．５ｍｇ生産する遺伝的に操作された微生物株を得る方法を提供する。この方法は、ａ）セラミドシンターゼ活性を有する酵素および／またはセラミダーゼ活性を有する酵素であって、後者の酵素が式Ｉのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を増大させるステップ、および／またはｂ）スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ活性を有する酵素および／またはセラミダーゼ活性を有する酵素であって、後者の酵素がスフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンもしくはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を低減させるステップ、および所望の生産性を有する株を単離するステップを含む。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】

のスフィンゴイド塩基またはその塩もしくはエステル
［式中、ＲはＸ−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｙ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３であり、
ａ．ＸはＨ_２またはＣＨＯＨであり、
ｂ．ｍは０〜４の間であり、好ましくはｍは１であり、
ｃ．ＹはＣＨ_２−ＣＨ_２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ＝ＣＣＨ_３であり、
ｄ．ｎは４〜１４の間であり、好ましくはｎは８または１０である］
をＣＤＷ１ｇあたり少なくとも０．５ｍｇ生産する微生物株。
【請求項２】
ａ．セラミドシンターゼ活性を有する酵素および／またはセラミダーゼ活性を有する酵素であって、後者の酵素が式Ｉのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を増大させるステップ、および／または
ｂ．スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ活性を有する酵素および／またはセラミダーゼ活性を有する酵素であって、後者の酵素がスフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を低減させるステップ、および
ｃ．請求項１に定義される生産性を有する株を単離するステップ
によって請求項１に記載の微生物株を得る方法。
【請求項３】
ジヒドロセラミドデサチュラーゼ活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を増大させるステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項２または３に定義される酵素をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを用いたＤＮＡ媒介の形質転換を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記セラミドシンターゼ活性を有する酵素が、
ａ．配列番号２および／または配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも４５％、および／または配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｃ．配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｄ．配列番号９のアミノ酸に少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｅ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｆ．配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記セラミダーゼ活性を有する酵素であって、該セラミダーゼが、式Ｉのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを選択的にまたはさらには特異的に加水分解できる酵素が、
ｄ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
ｅ．配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ活性を有する酵素が、
ｆ．配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｇ．配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドと
からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記セラミダーゼ活性を有する酵素であって、該セラミダーゼが、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンもしくはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素が、
ｈ．配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ジヒドロセラミドデサチュラーゼ活性を有する酵素が、
ｊ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｋ．配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項１０】
前記スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ活性を有する酵素をコードするか、またはセラミダーゼ活性を有する酵素であって、該セラミダーゼが、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンもしくはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドが、真菌または酵母から、好ましくは酵母サッカロミセス・セレヴィジエ、クリュイベロミセス・ラクティス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ピキア・パストリス、ピキア・シフェリイ、イエロビア・リポリティカ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ユチリスまたはアシュビア・ゴシッピーから、より好ましくは酵母ピキア・シフェリイ、アシュビア・ゴシッピーまたはイエロビア・リポリティカから入手可能である、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記セラミドシンターゼ活性を有する酵素をコードするか、またはジヒドロセラミドデサチュラーゼ活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドが、ウイルス、真菌、植物または動物から、より好ましくは藻類ウイルス、酵母、または哺乳動物から、最も好ましくはコッコリスウイルス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、デバリオマイセス属、クリュイベロミセス属、ピキア属、イエロビア属、カンジダ属、アシュビア属、マウス、ラットまたはヒトから入手可能である、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記セラミダーゼ活性を有する酵素であって、該セラミダーゼが、式Ｉのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドが、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒトから入手可能である、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
式Ｉのスフィンゴイド塩基またはその塩もしくはエステルを生産する方法であって、該スフィンゴイド塩基の生産に資する条件下での請求項１に記載の微生物株の発酵と、該発酵ブロスからの該スフィンゴイド塩基の回収とを含む方法。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる群から選択される、セラミドシンターゼ活性を示すポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる群から選択される、スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ活性を示すポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる群から選択される、セラミダーゼ活性を示すポリペプチドであって、該セラミダーゼが、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンを有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解するポリペプチド。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図７Ｃ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図９Ｄ】

【図９Ｅ】

【図９Ｆ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１０Ｄ】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【公表番号】特表２００９−５３６５２１（Ｐ２００９−５３６５２１Ａ）
【公表日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０８２５６（Ｐ２００９−５０８２５６）
【出願日】平成１９年５月１１日（２００７．５．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００４１９２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３１７２０
【国際公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５０３００１５５１）コスモフェルム　ビー．ブイ． (1)
【Ｆターム（参考）】