酵素処理ローヤルゼリーの製造方法
【課題】 高い活性を有するアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの工業的な大量生産に適した酵素処理ローヤルゼリーの製造方法を提供する。
【解決手段】 酵素処理ローヤルゼリーは、ローヤルゼリーにバチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを用いたタンパク質分解酵素処理を施すことにより製造され、イソロイシル・チロシン（ＩＹ）、バリル・チロシン（ＶＹ）、イソロイシル・バリル・チロシン（ＩＶＹ）等のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害ペプチドを高い割合で含有する。タンパク質分解酵素処理は５０℃、ｐＨ７の条件で１〜５時間、好ましくは２〜５時間、最も好ましくは４時間実施される。図１（ａ）はタンパク質分解酵素処理の処理時間とＡＣＥ阻害ペプチド含量との関係を示し、図１（ｂ）は該処理時間とＡＣＥ阻害活性（ＡＣＥ活性を５０％阻害する試料濃度（ＩＣ５０））との関係を示す。
【解決手段】 酵素処理ローヤルゼリーは、ローヤルゼリーにバチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを用いたタンパク質分解酵素処理を施すことにより製造され、イソロイシル・チロシン（ＩＹ）、バリル・チロシン（ＶＹ）、イソロイシル・バリル・チロシン（ＩＶＹ）等のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害ペプチドを高い割合で含有する。タンパク質分解酵素処理は５０℃、ｐＨ７の条件で１〜５時間、好ましくは２〜５時間、最も好ましくは４時間実施される。図１（ａ）はタンパク質分解酵素処理の処理時間とＡＣＥ阻害ペプチド含量との関係を示し、図１（ｂ）は該処理時間とＡＣＥ阻害活性（ＡＣＥ活性を５０％阻害する試料濃度（ＩＣ５０））との関係を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血圧降下作用を有するアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを含む酵素処理ローヤルゼリーを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１〜３には、ローヤルゼリーに含まれるタンパク質をタンパク質分解酵素処理することにより、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するローヤルゼリー分解物（酵素処理ローヤルゼリー）を製造する方法が開示されている。この製造方法では、中国産生ローヤルゼリー（固形分３２．７％（ｗ／ｗ））８ｇに水４５ｍｌを加えて５分間撹拌後、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のエンド型中性プロテアーゼを２５ｍｇ添加し、至適ｐＨである７．０に調整して５０℃で１４時間反応させるタンパク質分解酵素処理が施される。その結果、得られた酵素処理ローヤルゼリーには、イソロイシル・チロシン（Ｉｌｅ−Ｔｙｒ）、バリル・チロシン（Ｖａｌ−Ｔｙｒ）及びイソロイシル・バリル・チロシン（Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ）を含むアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドが生成されていたことが報告されている。なお、前記エンド型中性プロテアーゼの特徴や性質については、非特許文献４に公開されているカタログを参照可能である。
【非特許文献１】鈴木和道、外６名、"プロテアーゼによるローヤルゼリー分解物のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性"、食科工、２００３、５０，２８６−２８８
【非特許文献２】丸山広恵、外６名、"プロテアーゼ処理ローヤルゼリー中に含まれるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドの単離同定"、食科工、２００３、５０，３１０−３１５
【非特許文献３】徳永勝彦、外６名、"高血圧自然発症ラットに対するタンパク質分解酵素処理ローヤルゼリーの血圧調節作用"、食科工、２００３、５０，４５７−４６２
【非特許文献４】天野エンザイム株式会社 マーケティング本部 食品事業部、“プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ”、[online]、［平成１７年５月２０日検索］、インターネット＜URL : http://www.amano-enzyme.co.jp/pdf/food_j/cat_food_PR-NG_f_j.pdf＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドは、高血圧症の予防や治療に有用であるため、低いコストで大量生産する技術の開発が待望されている。本発明者らは、酵素処理ローヤルゼリーを安価に大量生産するために、前記従来の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法をさらに改良する試みを行ったところ、タンパク質分解酵素処理の処理時間に大幅なロスがあったことを突き止めた。そして、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を低下させることなく、工業的な大量生産に適した製造条件を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００４】
本発明の目的とするところは、高い活性を有するアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの工業的な大量生産に適した酵素処理ローヤルゼリーの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを含む酵素処理ローヤルゼリーを製造する方法であって、該方法は、ローヤルゼリーにバチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを用いたタンパク質分解酵素処理を施す工程を備え、該タンパク質分解酵素処理は、５０℃、ｐＨ７の条件で、１〜５時間実施されることを要旨とする。
【０００６】
この方法において、タンパク質分解酵素処理は、エンド型中性プロテアーゼの至適ｐＨであるｐＨ７で実施される。さらに、同タンパク質分解酵素処理は、前記プロテアーゼの至適温度に近く、かつ該プロテアーゼの活性を長時間に亘って高く維持可能な温度である５０℃で実施される。よって、タンパク質分解酵素処理におけるｐＨ及び温度が最適化されている。
【０００７】
一方、この方法においては、タンパク質分解酵素処理を１時間実施すれば、ほぼ最大に近い量のアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドが酵素処理ローヤルゼリー中に生成される。そして、４時間までは僅かずつではあるが徐々にアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの生成量が増加傾向となる。逆に、５時間を超えてタンパク質分解酵素処理を実施すると、僅かずつではあるが徐々にアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの含量が減少する傾向にある。従って、タンパク質分解酵素処理を１〜５時間実施することにより、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを短時間で効率的に生成させることができるため、工業的な大量生産に適している。
【０００８】
請求項２に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法は、請求項１に記載の発明において、前記タンパク質分解酵素処理は、２〜５時間実施されることを要旨とする。
この方法においては、タンパク質分解酵素処理を２時間以上実施することにより、酵素処理ローヤルゼリーにより発揮されるアンジオテンシン変換酵素阻害活性が極めて安定して推移するようになるため、高度に安定した品質の酵素処理ローヤルゼリーを提供することが容易となる。
【０００９】
請求項３に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法は、請求項１に記載の発明において、前記タンパク質分解酵素処理は、４時間実施されることを要旨とする。
この方法においては、タンパク質分解酵素処理を４時間実施することにより、酵素処理ローヤルゼリー中に生成されるアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの量が最大となるため、処理時間を含めてタンパク質分解酵素処理に関する諸条件を極めて適切に最適化することが可能となる。
【００１０】
請求項４に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法は、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の発明において、前記タンパク質分解酵素処理は、前記ローヤルゼリー、前記エンド型中性プロテアーゼ及び水を含む反応液をインキュベートすることにより実施され、前記反応液には、前記ローヤルゼリーの固形分が該反応液の重量に対して５〜１０％含有されていることを要旨とする。
【００１１】
請求項５に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法は、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の発明において、前記タンパク質分解酵素処理は、前記ローヤルゼリーの固形分１ｇあたり、１．４×１０３ユニット以上のタンパク質分解活性を有する前記エンド型中性プロテアーゼを用いて実施されることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高い活性を有するアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの工業的な大量生産に適した酵素処理ローヤルゼリーの製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法を具体化した一実施形態について説明する。以下、アンジオテンシン変換酵素をＡＣＥ、ローヤルゼリーをＲＪと略記する。
本実施形態の酵素処理ＲＪには、イソロイシル・チロシン（ＩＹ）、バリル・チロシン（ＶＹ）及びイソロイシル・バリル・チロシン（ＩＶＹ）を含むＡＣＥ阻害ペプチドがそれぞれ高い割合で含有されている。また、この酵素処理ＲＪには、配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列からなるＡＣＥ阻害ペプチドに加え、その他の未同定のＡＣＥ阻害ペプチドもそれぞれ含有されている。
【００１４】
これらのＡＣＥ阻害ペプチドはいずれも、生体内における血圧の調節や体内電解質の維持に重要な役割を果たすレニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）に作用して血圧降下活性を発揮する。即ち、ＲＡＳにおいて、アンジオテンシノーゲンより生成するアンジオテンシンＩは、ＡＣＥにより、強い昇圧活性を有するアンジオテンシンＩＩに変換されるが、本実施形態のＡＣＥ阻害ペプチドは、前記ＡＣＥを阻害してアンジオテンシンＩＩの生成を抑える。アンジオテンシンＩＩは、強い昇圧活性を有するとともに、副腎球状層からのアルドステロンの分泌を上昇させる。そして、本実施形態のＡＣＥ阻害ペプチドは、主として、前記アンジオテンシンＩＩの生成抑制を介して、副腎球状層からのアルドステロンの分泌を阻害し、腎遠位尿細管からのナトリウム再吸収を抑え、結果的に循環血漿量を低下させて血圧を降下させる。これらのＡＣＥ阻害ペプチドを含む酵素処理ＲＪは、血圧が高めの人に対する健康食品素材として主に利用される。
【００１５】
本実施形態の酵素処理ＲＪの製造方法は、ＲＪにバチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを用いたタンパク質分解酵素処理を施す工程を備えている。
ＲＪは、蜜蜂のうち日齢３〜１２日の働き蜂の下咽頭腺及び大腮腺から分泌される分泌物を混合して作られる乳白色のゼリー状物質であり、古くから健康食品として利用されてきた。ＲＪは、人体に対して好ましい生理活性を持つことが知られている。ＲＪ中の主な生理活性成分としては、タンパク質、糖類、ＲＪに特有な１０−ハイドロキシデセン酸等の脂肪酸類、脂質、ビタミンＢ類や葉酸、ニコチン酸、パントテン酸等のビタミン類、各種ミネラル類等が挙げられる。本実施形態の製造方法に用いられるＲＪとしては、生ＲＪ及び生ＲＪを乾燥させて粉末化したＲＪ粉末のいずれであってもよい。また、ＲＪの産地は、中国、ブラジル、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国、アメリカ等いずれであってもよい。
【００１６】
タンパク質分解酵素処理は、バチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを用いて、ＲＪに含有されるタンパク質のペプチド結合を加水分解し、ＩＹ、ＶＹ、ＩＶＹ等のＡＣＥ阻害ペプチドを生成させる処理である。バチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼは、金属プロテイナーゼに属しており、７．０の至適ｐＨ及び５５℃の至適温度を有している（例えば非特許文献４参照）。
【００１７】
タンパク質分解酵素処理は、ＲＪ、前記エンド型中性プロテアーゼ及び水を含む反応液を、５０℃、ｐＨ７の条件で、１〜５時間インキュベートすることにより実施される。
なお、このタンパク質分解酵素処理は、通常、前記インキュベート後の反応液を直ちに７５〜１００℃で５〜６０分間加熱して前記プロテアーゼを失活させることにより終了する。また、タンパク質分解酵素処理終了後の反応液（酵素処理ＲＪ）は、そのままドリンク剤に添加する等して利用されても構わないが、凍結乾燥等の公知の粉末化方法により粉末化して利用されることが望ましい。
【００１８】
前記反応液には、ＲＪに起因する粘度上昇を抑えてタンパク質分解酵素処理を迅速に進行させるための溶媒として、水又は緩衝液が含有されている。例えば生ＲＪを用いる場合、反応液には、生ＲＪの重量に対して２〜１０倍量、好ましくは２〜６倍量、より好ましくは２〜３倍量の水又は緩衝液が含有されていることが望ましい。生ＲＪの重量に対して２倍量未満の溶媒が加えられる場合、生ＲＪに起因する反応液の粘度上昇を十分に抑えることができないため、タンパク質分解酵素処理を迅速に進行させることが困難になる。逆に、生ＲＪの重量に対して１０倍量を超える溶媒が加えられる場合、反応液の全量が必要以上に大きくなるため、該反応液中の全てのエンド型中性プロテアーゼを同じタイミングで失活させることが困難になる。さらにこのとき、得られた酵素処理ＲＪの粉末化に多くの時間を要するという不都合も発生する。
【００１９】
また、この反応液には、ＲＪの固形分が該反応液の総重量に対して、２〜１５％、好ましくは４〜１２％、より好ましくは５％（非特許文献１〜３参照）〜１０％、特に好ましくは１０％程度（下記実施例１，２参照）含有されていることが望ましい。ＲＪの固形分が反応液の総重量の２％未満の場合、反応液の全量が必要以上に大きくなるため、該反応液中の全てのエンド型中性プロテアーゼを同じタイミングで失活させることが困難になる。さらにこのとき、得られた酵素処理ＲＪの粉末化に多くの時間を要するという不都合も発生する。逆に、ＲＪの固形分が反応液の総重量の１５％を超える場合、生ＲＪに起因する反応液の粘度上昇を十分に抑えることができない。
【００２０】
反応液中に添加されるエンド型中性プロテアーゼの量は、ＲＪ中の成分が前記プロテアーゼに対して阻害的に働く可能性を考慮して、通常の基質に対して酵素処理を行う場合の１０倍量以上に設定されていることが好ましい。具体的には、ＲＪの固形分１ｇあたり、１．４×１０３ユニット以上のタンパク質分解活性を有する酵素量であることが好ましく（非特許文献１〜３参照）、１．５×１０３ユニット以上のタンパク質分解活性を有する酵素量であることが特に好ましい（下記実施例１，２参照）。
【００２１】
反応液のｐＨは、タンパク質分解酵素処理を迅速に進行させるために、エンド型中性プロテアーゼの至適ｐＨであるｐＨ７に設定されている。
タンパク質分解酵素処理の処理温度は、５０℃に設定されている。エンド型中性プロテアーゼの熱安定性を調べた文献（例えば非特許文献４参照）によれば、至適温度である５５℃で１５分間反応させた場合の残存活性（％）は、５０℃以下の温度で１５分間反応させた場合の残存活性よりも低下している。即ち、前記文献によれば、５０℃以下の温度では残存活性の変化はほとんど見られないが、５０℃を超えると急激に残存活性が低下する傾向が見て取れる。よって、本実施形態の製造方法では、タンパク質分解酵素処理を少なくとも１時間以上実施する必要があるため、処理温度を５５℃に設定することは好ましくなく、むしろエンド型中性プロテアーゼの至適温度に近く、かつ長時間の反応でも活性の低下を抑制可能な温度である５０℃が採用されている。
【００２２】
タンパク質分解酵素処理の処理時間は、１〜５時間である必要があるが、好ましくは２〜５時間、より好ましくは３〜５時間、最も好ましくは４時間である。処理時間が１時間未満の場合、酵素処理ＲＪ中に十分な量のＡＣＥ阻害ペプチドが生成されないため、血圧降下作用を十分に発揮させることができない。逆に、処理時間が５時間を越える場合、酵素処理ＲＪ中に十分な量のＡＣＥ阻害ペプチドが生成されるが、酵素処理ＲＪの製造に要する時間が著しく浪費されるため不経済である。またこのとき、酵素処理ＲＪ中に生成されたＡＣＥ阻害ペプチドが僅かずつではあるが徐々に減少する傾向を示すため好ましくない。
【００２３】
前記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 本実施形態の酵素処理ＲＪの製造方法では、タンパク質分解酵素処理がエンド型中性プロテアーゼの至適ｐＨであるｐＨ７で実施される。さらに、同タンパク質分解酵素処理は、前記プロテアーゼの至適温度に近く、かつ該プロテアーゼの活性を長時間に亘って高く維持可能な温度である５０℃で実施される。よって、タンパク質分解酵素処理におけるｐＨ及び温度が最適化されているため、高い活性を有するＡＣＥ阻害ペプチドを短時間で効率よく生成させることを可能にする。
【００２４】
・ 本実施形態の酵素処理ＲＪの製造方法では、タンパク質分解酵素処理が１〜５時間実施される。タンパク質分解酵素処理を１時間実施すれば、ほぼ最大に近い量のＡＣＥ阻害ペプチドが酵素処理ＲＪ中に生成される。そして、４時間までは僅かずつではあるが徐々にＡＣＥ阻害ペプチドの生成量が増加傾向となる。逆に、５時間を超えてタンパク質分解酵素処理を実施すると、僅かずつではあるが徐々にＡＣＥ阻害ペプチドの含量が減少する傾向にある。従って、タンパク質分解酵素処理を１〜５時間実施することにより、ＡＣＥ阻害ペプチドを短時間で効率的に生成させることができるため、工業的な大量生産に適している。特に、非特許文献１〜３の製造方法におけるタンパク質分解酵素処理の処理時間（１４時間）に対して、３分の１程度から十数分の１の時間で同等以上の品質の酵素処理ＲＪを製造可能である点は、工業的には極めて重要である。
【００２５】
・ 本実施形態の酵素処理ＲＪの製造方法では、タンパク質分解酵素処理を２時間以上実施することにより、酵素処理ＲＪにより発揮されるＡＣＥ阻害活性が極めて安定して推移するようになるため、高度に安定した品質の酵素処理ＲＪを提供することが容易となる。さらに、タンパク質分解酵素処理を４時間実施することにより、酵素処理ＲＪ中に生成されるＡＣＥ阻害ペプチドの量が最大となるため、処理時間を含めてタンパク質分解酵素処理に関する諸条件を極めて適切に最適化することが可能となる。
【実施例１】
【００２６】
＜酵素処理ＲＪの調製＞
中国産生ＲＪ（固形分３５％（ｗ／ｗ））１ｋｇに水２．５ｋｇを加えて攪拌しながら５０℃に昇温した後、ｐＨ７に調整することにより、ＲＪ希釈液を調製した。次に、前記ＲＪ希釈液に、バチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを３．５ｇ添加することにより、反応液を調製した。なお、前記エンド型中性プロテアーゼは、非特許文献４のカタログに掲載された天野エンザイム社製のプロテアーゼＮであり、ｐＨ７．０において１．５×１０５ユニット／ｇ以上のタンパク質分解活性を有している。よって、前記反応液中には、ＲＪの固形分１ｇあたり、１．４×１０３ユニット以上（計算上では１．５×１０３ユニット以上）のタンパク質分解活性を有するエンド型中性プロテアーゼが添加されていることになる。また、同反応液には、ＲＪの固形分が該反応液の重量に対して１０％含有されていることになる。
【００２７】
続いて、前記反応液を５０℃でインキュベートすることにより、タンパク質分解酵素処理を実施した。タンパク質分解酵素処理の開始から、０時間後、５分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、３時間４５分後、４時間後、４時間１５分後、５時間後、８時間後及び１４時間後にそれぞれ反応液を少量ずつ採取した。採取直後の各反応液をそれぞれ９８℃で５分間加熱して酵素を失活させることにより、タンパク質分解酵素処理の処理時間がそれぞれ異なる酵素処理ＲＪをそれぞれ調製した。ちなみに、前記タンパク質分解酵素処理の開始から終了までの反応液の温度及びｐＨを不定期に測定したところ、温度管理上の誤差や実験上の誤差の範囲内で、概ね５０℃及びｐＨ７の条件が継続的に維持されていたことを確認した。
【００２８】
＜電気泳動法によるタンパク質分解度の検討＞
タンパク質分解酵素処理の処理時間が５分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、３時間４５分、４時間、及び４時間１５分となるように調製された各酵素処理ＲＪを、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した後、クマシー染色を行った。その結果、処理時間が２時間以下の酵素処理ＲＪでは、処理時間の経過に伴って染色されたタンパク質バンドの低分子化の進行が見られたが、処理時間が３時間以上の酵素処理ＲＪではいずれも、染色されたタンパク質バンドが十分に低分子化されているうえ、ほぼ同様な染色パターンとなっていた。
【００２９】
＜酵素処理ＲＪ中に含まれるＡＣＥ阻害ペプチド含量の定量＞
タンパク質分解酵素処理の処理時間が０時間、１時間、２時間、３時間、３時間４５分、４時間、４時間１５分、５時間、８時間及び１４時間となるように調製された各酵素処理ＲＪを、液体クロマトグラフ／タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）でそれぞれ分析した。分析条件を以下に示す。
【００３０】
（液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）条件）
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００（ＨＰ１１００）システム
カラム ；NOMURA Develosil ODS-HG-5 (2.0×100mm)
温度 ；３５℃
サンプル；１０μｌ
流速 ；２００μｌ／分
溶媒 ；水（0.1%TFA）及びＣＨ３ＣＮ（0.1%TFA）の混合溶媒
溶出条件；０ → 0.5分 １０％ ＣＨ３ＣＮ
0.5 →１８分 １０％→９０％ ＣＨ３ＣＮのグラジエント溶出
１８→２３分 ９０％ ＣＨ３ＣＮ
２３→３３分 ９０％→１０％ ＣＨ３ＣＮのグラジエント溶出
（質量分析計（ＭＳ）条件）
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＰＩ３６５システム
イオン化法 ；ＥＳＩ＋
イオン源 ；ターボイオンスプレー
ネブライザーガス流量；１３
カーテンガス流量 ；１３
イオンスプレー電圧 ；５０００度
オリフィス電圧 ；７６Ｖ
検出法MRM（VY＝Q1/Q3＝281/71、IY＝295/86、IVY＝394/212）
前記ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて各酵素処理ＲＪ中に含まれるＩＹ、ＶＹ及びＩＶＹの含量をそれぞれ測定した結果と、これら３種のＡＣＥ阻害ペプチドの含量の合計とを、下記表１及び図１（ａ）に示す。また、処理時間が３時間、４時間及び５時間の各酵素処理ＲＪについて、３種のＡＣＥ阻害ペプチドの含量の合計を４回ずつ測定し、それぞれ有意差検定を行った結果も表１及び図１（ａ）に併記する。
【００３１】
【表１】
表１及び図１（ａ）より、タンパク質分解酵素処理を１〜５時間実施した各酵素処理ＲＪには、図１（ａ）の点線で示すように、１４時間実施した酵素処理ＲＪより多量のＡＣＥ阻害ペプチドが生成されていた。即ち、タンパク質分解酵素処理を１４時間もの長い時間かけて実施する必要は全くなく、少なくとも１時間実施すれば十分であり、好ましくは３〜５時間、より好ましくは３〜４時間、最も好ましくは４時間実施するとよいことが確認された。特に、タンパク質分解酵素処理を４時間実施した酵素処理ＲＪは、３時間及び５時間実施したものよりも、ＡＣＥ阻害ペプチドの生成量が有意に増加している点は重要である。また、処理時間が４時間を超えると、各ＡＣＥ阻害ペプチドが僅かずつではあるが徐々に減少したことも確認された。
【００３２】
＜酵素処理ＲＪによるＡＣＥ阻害活性＞
タンパク質分解酵素処理の処理時間が０時間、１時間、２時間、３時間、３時間４５分、４時間、４時間１５分、５時間、８時間及び１４時間となるように調製された各酵素処理ＲＪについて、非特許文献１に記載の方法に従って、インビトロでＡＣＥ阻害活性を定量した。ＡＣＥ阻害活性の定量は、基質（Hippuryl-His-Leu）に対するＡＣＥ活性の阻害率（％）を、各酵素処理ＲＪの希釈系列に関してそれぞれ測定し、各希釈系列に含まれる試料濃度と得られたＡＣＥ阻害率との関係から、ＡＣＥ活性を５０％阻害するときの試料濃度（ＩＣ５０）を求める方法を用いた。結果を上記表１及び図１（ｂ）に示す。
【００３３】
その結果、タンパク質分解酵素処理を１〜５時間実施した酵素処理ＲＪはいずれも、図１（ｂ）の点線で示すように、１４時間実施した酵素処理ＲＪとほぼ同等又は該酵素処理ＲＪよりも高いＡＣＥ阻害活性を有していた。即ち、タンパク質分解酵素処理を１４時間もの長い時間かけて実施する必要は全くなく、少なくとも１時間実施すれば十分であり、好ましくは２時間以上、特に好ましくは４時間実施するとよいことが確認された。特に、図１（ｂ）に示すように、タンパク質分解酵素処理を２時間以上実施した各酵素処理ＲＪでは、１時間以下のものと比べて、ＡＣＥ阻害活性が極めて安定に推移していることが明確に把握され得る。また、処理時間が４時間の酵素処理ＲＪは、上記表１及び図１（ａ）においてＡＣＥ阻害ペプチド含量の最大値を示したことと一致して、最も高いＡＣＥ阻害活性を示した。
【実施例２】
【００３４】
＜酵素処理ＲＪの大量生産＞
上記実施例１の製造方法を５０倍にスケールアップした。即ち、中国産生ＲＪ（固形分３５％（ｗ／ｗ））５０ｋｇに水１２５ｋｇを加えて攪拌しながら５０℃に昇温した後、ｐＨ７に調整することにより、ＲＪ希釈液を調製した。次に、前記ＲＪ希釈液に、バチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを１７５ｇ添加することにより、反応液を調製した。続いて、前記反応液を５０℃でインキュベートすることにより、タンパク質分解酵素処理を実施した。
【００３５】
タンパク質分解酵素処理の開始から、０．５時間後、１時間後、４時間後及び１４時間後にそれぞれ反応液を少量ずつ採取した。採取直後の各反応液をそれぞれ９８℃で５分間加熱して酵素を失活させることにより、タンパク質分解酵素処理の処理時間がそれぞれ異なる酵素処理ＲＪをそれぞれ調製した。ちなみに、前記タンパク質分解酵素処理の開始から終了までの反応液の温度及びｐＨを不定期に測定したところ、温度管理上の誤差や実験上の誤差の範囲内で、概ね５０℃及びｐＨ７の条件が継続的に維持されていたことを確認した。得られた各酵素処理ＲＪを、上記実施例１と同様に、ＡＣＥ阻害ペプチド含量の定量及びＡＣＥ阻害活性の測定に供した。結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
表２より、実施例１の製造方法を５０倍にスケールアップした本実施例においても、該実施例１と全く同様の結果が得られた。つまり、本実施例の方法は、スケールの大小に関わらず、極めて再現性の高い方法であると言える。従って、本実施例の製造方法は、高い活性を有するＡＣＥ阻害ペプチドの工業的な大量生産に適したものであると結論づけられる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】（ａ）は、実施例１の結果を示すグラフであって、タンパク質分解酵素処理の処理時間とＡＣＥ阻害ペプチド含量との関係を示すグラフ、（ｂ）は、実施例１の結果を示すグラフであって、タンパク質分解酵素処理の処理時間とＡＣＥ阻害活性との関係を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血圧降下作用を有するアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを含む酵素処理ローヤルゼリーを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１〜３には、ローヤルゼリーに含まれるタンパク質をタンパク質分解酵素処理することにより、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するローヤルゼリー分解物（酵素処理ローヤルゼリー）を製造する方法が開示されている。この製造方法では、中国産生ローヤルゼリー（固形分３２．７％（ｗ／ｗ））８ｇに水４５ｍｌを加えて５分間撹拌後、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のエンド型中性プロテアーゼを２５ｍｇ添加し、至適ｐＨである７．０に調整して５０℃で１４時間反応させるタンパク質分解酵素処理が施される。その結果、得られた酵素処理ローヤルゼリーには、イソロイシル・チロシン（Ｉｌｅ−Ｔｙｒ）、バリル・チロシン（Ｖａｌ−Ｔｙｒ）及びイソロイシル・バリル・チロシン（Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ）を含むアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドが生成されていたことが報告されている。なお、前記エンド型中性プロテアーゼの特徴や性質については、非特許文献４に公開されているカタログを参照可能である。
【非特許文献１】鈴木和道、外６名、"プロテアーゼによるローヤルゼリー分解物のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性"、食科工、２００３、５０，２８６−２８８
【非特許文献２】丸山広恵、外６名、"プロテアーゼ処理ローヤルゼリー中に含まれるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドの単離同定"、食科工、２００３、５０，３１０−３１５
【非特許文献３】徳永勝彦、外６名、"高血圧自然発症ラットに対するタンパク質分解酵素処理ローヤルゼリーの血圧調節作用"、食科工、２００３、５０，４５７−４６２
【非特許文献４】天野エンザイム株式会社 マーケティング本部 食品事業部、“プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ”、[online]、［平成１７年５月２０日検索］、インターネット＜URL : http://www.amano-enzyme.co.jp/pdf/food_j/cat_food_PR-NG_f_j.pdf＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドは、高血圧症の予防や治療に有用であるため、低いコストで大量生産する技術の開発が待望されている。本発明者らは、酵素処理ローヤルゼリーを安価に大量生産するために、前記従来の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法をさらに改良する試みを行ったところ、タンパク質分解酵素処理の処理時間に大幅なロスがあったことを突き止めた。そして、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を低下させることなく、工業的な大量生産に適した製造条件を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００４】
本発明の目的とするところは、高い活性を有するアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの工業的な大量生産に適した酵素処理ローヤルゼリーの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを含む酵素処理ローヤルゼリーを製造する方法であって、該方法は、ローヤルゼリーにバチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを用いたタンパク質分解酵素処理を施す工程を備え、該タンパク質分解酵素処理は、５０℃、ｐＨ７の条件で、１〜５時間実施されることを要旨とする。
【０００６】
この方法において、タンパク質分解酵素処理は、エンド型中性プロテアーゼの至適ｐＨであるｐＨ７で実施される。さらに、同タンパク質分解酵素処理は、前記プロテアーゼの至適温度に近く、かつ該プロテアーゼの活性を長時間に亘って高く維持可能な温度である５０℃で実施される。よって、タンパク質分解酵素処理におけるｐＨ及び温度が最適化されている。
【０００７】
一方、この方法においては、タンパク質分解酵素処理を１時間実施すれば、ほぼ最大に近い量のアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドが酵素処理ローヤルゼリー中に生成される。そして、４時間までは僅かずつではあるが徐々にアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの生成量が増加傾向となる。逆に、５時間を超えてタンパク質分解酵素処理を実施すると、僅かずつではあるが徐々にアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの含量が減少する傾向にある。従って、タンパク質分解酵素処理を１〜５時間実施することにより、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを短時間で効率的に生成させることができるため、工業的な大量生産に適している。
【０００８】
請求項２に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法は、請求項１に記載の発明において、前記タンパク質分解酵素処理は、２〜５時間実施されることを要旨とする。
この方法においては、タンパク質分解酵素処理を２時間以上実施することにより、酵素処理ローヤルゼリーにより発揮されるアンジオテンシン変換酵素阻害活性が極めて安定して推移するようになるため、高度に安定した品質の酵素処理ローヤルゼリーを提供することが容易となる。
【０００９】
請求項３に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法は、請求項１に記載の発明において、前記タンパク質分解酵素処理は、４時間実施されることを要旨とする。
この方法においては、タンパク質分解酵素処理を４時間実施することにより、酵素処理ローヤルゼリー中に生成されるアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの量が最大となるため、処理時間を含めてタンパク質分解酵素処理に関する諸条件を極めて適切に最適化することが可能となる。
【００１０】
請求項４に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法は、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の発明において、前記タンパク質分解酵素処理は、前記ローヤルゼリー、前記エンド型中性プロテアーゼ及び水を含む反応液をインキュベートすることにより実施され、前記反応液には、前記ローヤルゼリーの固形分が該反応液の重量に対して５〜１０％含有されていることを要旨とする。
【００１１】
請求項５に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法は、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の発明において、前記タンパク質分解酵素処理は、前記ローヤルゼリーの固形分１ｇあたり、１．４×１０３ユニット以上のタンパク質分解活性を有する前記エンド型中性プロテアーゼを用いて実施されることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高い活性を有するアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの工業的な大量生産に適した酵素処理ローヤルゼリーの製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法を具体化した一実施形態について説明する。以下、アンジオテンシン変換酵素をＡＣＥ、ローヤルゼリーをＲＪと略記する。
本実施形態の酵素処理ＲＪには、イソロイシル・チロシン（ＩＹ）、バリル・チロシン（ＶＹ）及びイソロイシル・バリル・チロシン（ＩＶＹ）を含むＡＣＥ阻害ペプチドがそれぞれ高い割合で含有されている。また、この酵素処理ＲＪには、配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列からなるＡＣＥ阻害ペプチドに加え、その他の未同定のＡＣＥ阻害ペプチドもそれぞれ含有されている。
【００１４】
これらのＡＣＥ阻害ペプチドはいずれも、生体内における血圧の調節や体内電解質の維持に重要な役割を果たすレニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）に作用して血圧降下活性を発揮する。即ち、ＲＡＳにおいて、アンジオテンシノーゲンより生成するアンジオテンシンＩは、ＡＣＥにより、強い昇圧活性を有するアンジオテンシンＩＩに変換されるが、本実施形態のＡＣＥ阻害ペプチドは、前記ＡＣＥを阻害してアンジオテンシンＩＩの生成を抑える。アンジオテンシンＩＩは、強い昇圧活性を有するとともに、副腎球状層からのアルドステロンの分泌を上昇させる。そして、本実施形態のＡＣＥ阻害ペプチドは、主として、前記アンジオテンシンＩＩの生成抑制を介して、副腎球状層からのアルドステロンの分泌を阻害し、腎遠位尿細管からのナトリウム再吸収を抑え、結果的に循環血漿量を低下させて血圧を降下させる。これらのＡＣＥ阻害ペプチドを含む酵素処理ＲＪは、血圧が高めの人に対する健康食品素材として主に利用される。
【００１５】
本実施形態の酵素処理ＲＪの製造方法は、ＲＪにバチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを用いたタンパク質分解酵素処理を施す工程を備えている。
ＲＪは、蜜蜂のうち日齢３〜１２日の働き蜂の下咽頭腺及び大腮腺から分泌される分泌物を混合して作られる乳白色のゼリー状物質であり、古くから健康食品として利用されてきた。ＲＪは、人体に対して好ましい生理活性を持つことが知られている。ＲＪ中の主な生理活性成分としては、タンパク質、糖類、ＲＪに特有な１０−ハイドロキシデセン酸等の脂肪酸類、脂質、ビタミンＢ類や葉酸、ニコチン酸、パントテン酸等のビタミン類、各種ミネラル類等が挙げられる。本実施形態の製造方法に用いられるＲＪとしては、生ＲＪ及び生ＲＪを乾燥させて粉末化したＲＪ粉末のいずれであってもよい。また、ＲＪの産地は、中国、ブラジル、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国、アメリカ等いずれであってもよい。
【００１６】
タンパク質分解酵素処理は、バチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを用いて、ＲＪに含有されるタンパク質のペプチド結合を加水分解し、ＩＹ、ＶＹ、ＩＶＹ等のＡＣＥ阻害ペプチドを生成させる処理である。バチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼは、金属プロテイナーゼに属しており、７．０の至適ｐＨ及び５５℃の至適温度を有している（例えば非特許文献４参照）。
【００１７】
タンパク質分解酵素処理は、ＲＪ、前記エンド型中性プロテアーゼ及び水を含む反応液を、５０℃、ｐＨ７の条件で、１〜５時間インキュベートすることにより実施される。
なお、このタンパク質分解酵素処理は、通常、前記インキュベート後の反応液を直ちに７５〜１００℃で５〜６０分間加熱して前記プロテアーゼを失活させることにより終了する。また、タンパク質分解酵素処理終了後の反応液（酵素処理ＲＪ）は、そのままドリンク剤に添加する等して利用されても構わないが、凍結乾燥等の公知の粉末化方法により粉末化して利用されることが望ましい。
【００１８】
前記反応液には、ＲＪに起因する粘度上昇を抑えてタンパク質分解酵素処理を迅速に進行させるための溶媒として、水又は緩衝液が含有されている。例えば生ＲＪを用いる場合、反応液には、生ＲＪの重量に対して２〜１０倍量、好ましくは２〜６倍量、より好ましくは２〜３倍量の水又は緩衝液が含有されていることが望ましい。生ＲＪの重量に対して２倍量未満の溶媒が加えられる場合、生ＲＪに起因する反応液の粘度上昇を十分に抑えることができないため、タンパク質分解酵素処理を迅速に進行させることが困難になる。逆に、生ＲＪの重量に対して１０倍量を超える溶媒が加えられる場合、反応液の全量が必要以上に大きくなるため、該反応液中の全てのエンド型中性プロテアーゼを同じタイミングで失活させることが困難になる。さらにこのとき、得られた酵素処理ＲＪの粉末化に多くの時間を要するという不都合も発生する。
【００１９】
また、この反応液には、ＲＪの固形分が該反応液の総重量に対して、２〜１５％、好ましくは４〜１２％、より好ましくは５％（非特許文献１〜３参照）〜１０％、特に好ましくは１０％程度（下記実施例１，２参照）含有されていることが望ましい。ＲＪの固形分が反応液の総重量の２％未満の場合、反応液の全量が必要以上に大きくなるため、該反応液中の全てのエンド型中性プロテアーゼを同じタイミングで失活させることが困難になる。さらにこのとき、得られた酵素処理ＲＪの粉末化に多くの時間を要するという不都合も発生する。逆に、ＲＪの固形分が反応液の総重量の１５％を超える場合、生ＲＪに起因する反応液の粘度上昇を十分に抑えることができない。
【００２０】
反応液中に添加されるエンド型中性プロテアーゼの量は、ＲＪ中の成分が前記プロテアーゼに対して阻害的に働く可能性を考慮して、通常の基質に対して酵素処理を行う場合の１０倍量以上に設定されていることが好ましい。具体的には、ＲＪの固形分１ｇあたり、１．４×１０３ユニット以上のタンパク質分解活性を有する酵素量であることが好ましく（非特許文献１〜３参照）、１．５×１０３ユニット以上のタンパク質分解活性を有する酵素量であることが特に好ましい（下記実施例１，２参照）。
【００２１】
反応液のｐＨは、タンパク質分解酵素処理を迅速に進行させるために、エンド型中性プロテアーゼの至適ｐＨであるｐＨ７に設定されている。
タンパク質分解酵素処理の処理温度は、５０℃に設定されている。エンド型中性プロテアーゼの熱安定性を調べた文献（例えば非特許文献４参照）によれば、至適温度である５５℃で１５分間反応させた場合の残存活性（％）は、５０℃以下の温度で１５分間反応させた場合の残存活性よりも低下している。即ち、前記文献によれば、５０℃以下の温度では残存活性の変化はほとんど見られないが、５０℃を超えると急激に残存活性が低下する傾向が見て取れる。よって、本実施形態の製造方法では、タンパク質分解酵素処理を少なくとも１時間以上実施する必要があるため、処理温度を５５℃に設定することは好ましくなく、むしろエンド型中性プロテアーゼの至適温度に近く、かつ長時間の反応でも活性の低下を抑制可能な温度である５０℃が採用されている。
【００２２】
タンパク質分解酵素処理の処理時間は、１〜５時間である必要があるが、好ましくは２〜５時間、より好ましくは３〜５時間、最も好ましくは４時間である。処理時間が１時間未満の場合、酵素処理ＲＪ中に十分な量のＡＣＥ阻害ペプチドが生成されないため、血圧降下作用を十分に発揮させることができない。逆に、処理時間が５時間を越える場合、酵素処理ＲＪ中に十分な量のＡＣＥ阻害ペプチドが生成されるが、酵素処理ＲＪの製造に要する時間が著しく浪費されるため不経済である。またこのとき、酵素処理ＲＪ中に生成されたＡＣＥ阻害ペプチドが僅かずつではあるが徐々に減少する傾向を示すため好ましくない。
【００２３】
前記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 本実施形態の酵素処理ＲＪの製造方法では、タンパク質分解酵素処理がエンド型中性プロテアーゼの至適ｐＨであるｐＨ７で実施される。さらに、同タンパク質分解酵素処理は、前記プロテアーゼの至適温度に近く、かつ該プロテアーゼの活性を長時間に亘って高く維持可能な温度である５０℃で実施される。よって、タンパク質分解酵素処理におけるｐＨ及び温度が最適化されているため、高い活性を有するＡＣＥ阻害ペプチドを短時間で効率よく生成させることを可能にする。
【００２４】
・ 本実施形態の酵素処理ＲＪの製造方法では、タンパク質分解酵素処理が１〜５時間実施される。タンパク質分解酵素処理を１時間実施すれば、ほぼ最大に近い量のＡＣＥ阻害ペプチドが酵素処理ＲＪ中に生成される。そして、４時間までは僅かずつではあるが徐々にＡＣＥ阻害ペプチドの生成量が増加傾向となる。逆に、５時間を超えてタンパク質分解酵素処理を実施すると、僅かずつではあるが徐々にＡＣＥ阻害ペプチドの含量が減少する傾向にある。従って、タンパク質分解酵素処理を１〜５時間実施することにより、ＡＣＥ阻害ペプチドを短時間で効率的に生成させることができるため、工業的な大量生産に適している。特に、非特許文献１〜３の製造方法におけるタンパク質分解酵素処理の処理時間（１４時間）に対して、３分の１程度から十数分の１の時間で同等以上の品質の酵素処理ＲＪを製造可能である点は、工業的には極めて重要である。
【００２５】
・ 本実施形態の酵素処理ＲＪの製造方法では、タンパク質分解酵素処理を２時間以上実施することにより、酵素処理ＲＪにより発揮されるＡＣＥ阻害活性が極めて安定して推移するようになるため、高度に安定した品質の酵素処理ＲＪを提供することが容易となる。さらに、タンパク質分解酵素処理を４時間実施することにより、酵素処理ＲＪ中に生成されるＡＣＥ阻害ペプチドの量が最大となるため、処理時間を含めてタンパク質分解酵素処理に関する諸条件を極めて適切に最適化することが可能となる。
【実施例１】
【００２６】
＜酵素処理ＲＪの調製＞
中国産生ＲＪ（固形分３５％（ｗ／ｗ））１ｋｇに水２．５ｋｇを加えて攪拌しながら５０℃に昇温した後、ｐＨ７に調整することにより、ＲＪ希釈液を調製した。次に、前記ＲＪ希釈液に、バチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを３．５ｇ添加することにより、反応液を調製した。なお、前記エンド型中性プロテアーゼは、非特許文献４のカタログに掲載された天野エンザイム社製のプロテアーゼＮであり、ｐＨ７．０において１．５×１０５ユニット／ｇ以上のタンパク質分解活性を有している。よって、前記反応液中には、ＲＪの固形分１ｇあたり、１．４×１０３ユニット以上（計算上では１．５×１０３ユニット以上）のタンパク質分解活性を有するエンド型中性プロテアーゼが添加されていることになる。また、同反応液には、ＲＪの固形分が該反応液の重量に対して１０％含有されていることになる。
【００２７】
続いて、前記反応液を５０℃でインキュベートすることにより、タンパク質分解酵素処理を実施した。タンパク質分解酵素処理の開始から、０時間後、５分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、３時間４５分後、４時間後、４時間１５分後、５時間後、８時間後及び１４時間後にそれぞれ反応液を少量ずつ採取した。採取直後の各反応液をそれぞれ９８℃で５分間加熱して酵素を失活させることにより、タンパク質分解酵素処理の処理時間がそれぞれ異なる酵素処理ＲＪをそれぞれ調製した。ちなみに、前記タンパク質分解酵素処理の開始から終了までの反応液の温度及びｐＨを不定期に測定したところ、温度管理上の誤差や実験上の誤差の範囲内で、概ね５０℃及びｐＨ７の条件が継続的に維持されていたことを確認した。
【００２８】
＜電気泳動法によるタンパク質分解度の検討＞
タンパク質分解酵素処理の処理時間が５分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、３時間４５分、４時間、及び４時間１５分となるように調製された各酵素処理ＲＪを、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した後、クマシー染色を行った。その結果、処理時間が２時間以下の酵素処理ＲＪでは、処理時間の経過に伴って染色されたタンパク質バンドの低分子化の進行が見られたが、処理時間が３時間以上の酵素処理ＲＪではいずれも、染色されたタンパク質バンドが十分に低分子化されているうえ、ほぼ同様な染色パターンとなっていた。
【００２９】
＜酵素処理ＲＪ中に含まれるＡＣＥ阻害ペプチド含量の定量＞
タンパク質分解酵素処理の処理時間が０時間、１時間、２時間、３時間、３時間４５分、４時間、４時間１５分、５時間、８時間及び１４時間となるように調製された各酵素処理ＲＪを、液体クロマトグラフ／タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）でそれぞれ分析した。分析条件を以下に示す。
【００３０】
（液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）条件）
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００（ＨＰ１１００）システム
カラム ；NOMURA Develosil ODS-HG-5 (2.0×100mm)
温度 ；３５℃
サンプル；１０μｌ
流速 ；２００μｌ／分
溶媒 ；水（0.1%TFA）及びＣＨ３ＣＮ（0.1%TFA）の混合溶媒
溶出条件；０ → 0.5分 １０％ ＣＨ３ＣＮ
0.5 →１８分 １０％→９０％ ＣＨ３ＣＮのグラジエント溶出
１８→２３分 ９０％ ＣＨ３ＣＮ
２３→３３分 ９０％→１０％ ＣＨ３ＣＮのグラジエント溶出
（質量分析計（ＭＳ）条件）
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＰＩ３６５システム
イオン化法 ；ＥＳＩ＋
イオン源 ；ターボイオンスプレー
ネブライザーガス流量；１３
カーテンガス流量 ；１３
イオンスプレー電圧 ；５０００度
オリフィス電圧 ；７６Ｖ
検出法MRM（VY＝Q1/Q3＝281/71、IY＝295/86、IVY＝394/212）
前記ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて各酵素処理ＲＪ中に含まれるＩＹ、ＶＹ及びＩＶＹの含量をそれぞれ測定した結果と、これら３種のＡＣＥ阻害ペプチドの含量の合計とを、下記表１及び図１（ａ）に示す。また、処理時間が３時間、４時間及び５時間の各酵素処理ＲＪについて、３種のＡＣＥ阻害ペプチドの含量の合計を４回ずつ測定し、それぞれ有意差検定を行った結果も表１及び図１（ａ）に併記する。
【００３１】
【表１】
表１及び図１（ａ）より、タンパク質分解酵素処理を１〜５時間実施した各酵素処理ＲＪには、図１（ａ）の点線で示すように、１４時間実施した酵素処理ＲＪより多量のＡＣＥ阻害ペプチドが生成されていた。即ち、タンパク質分解酵素処理を１４時間もの長い時間かけて実施する必要は全くなく、少なくとも１時間実施すれば十分であり、好ましくは３〜５時間、より好ましくは３〜４時間、最も好ましくは４時間実施するとよいことが確認された。特に、タンパク質分解酵素処理を４時間実施した酵素処理ＲＪは、３時間及び５時間実施したものよりも、ＡＣＥ阻害ペプチドの生成量が有意に増加している点は重要である。また、処理時間が４時間を超えると、各ＡＣＥ阻害ペプチドが僅かずつではあるが徐々に減少したことも確認された。
【００３２】
＜酵素処理ＲＪによるＡＣＥ阻害活性＞
タンパク質分解酵素処理の処理時間が０時間、１時間、２時間、３時間、３時間４５分、４時間、４時間１５分、５時間、８時間及び１４時間となるように調製された各酵素処理ＲＪについて、非特許文献１に記載の方法に従って、インビトロでＡＣＥ阻害活性を定量した。ＡＣＥ阻害活性の定量は、基質（Hippuryl-His-Leu）に対するＡＣＥ活性の阻害率（％）を、各酵素処理ＲＪの希釈系列に関してそれぞれ測定し、各希釈系列に含まれる試料濃度と得られたＡＣＥ阻害率との関係から、ＡＣＥ活性を５０％阻害するときの試料濃度（ＩＣ５０）を求める方法を用いた。結果を上記表１及び図１（ｂ）に示す。
【００３３】
その結果、タンパク質分解酵素処理を１〜５時間実施した酵素処理ＲＪはいずれも、図１（ｂ）の点線で示すように、１４時間実施した酵素処理ＲＪとほぼ同等又は該酵素処理ＲＪよりも高いＡＣＥ阻害活性を有していた。即ち、タンパク質分解酵素処理を１４時間もの長い時間かけて実施する必要は全くなく、少なくとも１時間実施すれば十分であり、好ましくは２時間以上、特に好ましくは４時間実施するとよいことが確認された。特に、図１（ｂ）に示すように、タンパク質分解酵素処理を２時間以上実施した各酵素処理ＲＪでは、１時間以下のものと比べて、ＡＣＥ阻害活性が極めて安定に推移していることが明確に把握され得る。また、処理時間が４時間の酵素処理ＲＪは、上記表１及び図１（ａ）においてＡＣＥ阻害ペプチド含量の最大値を示したことと一致して、最も高いＡＣＥ阻害活性を示した。
【実施例２】
【００３４】
＜酵素処理ＲＪの大量生産＞
上記実施例１の製造方法を５０倍にスケールアップした。即ち、中国産生ＲＪ（固形分３５％（ｗ／ｗ））５０ｋｇに水１２５ｋｇを加えて攪拌しながら５０℃に昇温した後、ｐＨ７に調整することにより、ＲＪ希釈液を調製した。次に、前記ＲＪ希釈液に、バチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを１７５ｇ添加することにより、反応液を調製した。続いて、前記反応液を５０℃でインキュベートすることにより、タンパク質分解酵素処理を実施した。
【００３５】
タンパク質分解酵素処理の開始から、０．５時間後、１時間後、４時間後及び１４時間後にそれぞれ反応液を少量ずつ採取した。採取直後の各反応液をそれぞれ９８℃で５分間加熱して酵素を失活させることにより、タンパク質分解酵素処理の処理時間がそれぞれ異なる酵素処理ＲＪをそれぞれ調製した。ちなみに、前記タンパク質分解酵素処理の開始から終了までの反応液の温度及びｐＨを不定期に測定したところ、温度管理上の誤差や実験上の誤差の範囲内で、概ね５０℃及びｐＨ７の条件が継続的に維持されていたことを確認した。得られた各酵素処理ＲＪを、上記実施例１と同様に、ＡＣＥ阻害ペプチド含量の定量及びＡＣＥ阻害活性の測定に供した。結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
表２より、実施例１の製造方法を５０倍にスケールアップした本実施例においても、該実施例１と全く同様の結果が得られた。つまり、本実施例の方法は、スケールの大小に関わらず、極めて再現性の高い方法であると言える。従って、本実施例の製造方法は、高い活性を有するＡＣＥ阻害ペプチドの工業的な大量生産に適したものであると結論づけられる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】（ａ）は、実施例１の結果を示すグラフであって、タンパク質分解酵素処理の処理時間とＡＣＥ阻害ペプチド含量との関係を示すグラフ、（ｂ）は、実施例１の結果を示すグラフであって、タンパク質分解酵素処理の処理時間とＡＣＥ阻害活性との関係を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを含む酵素処理ローヤルゼリーを製造する方法であって、
該方法は、ローヤルゼリーにバチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを用いたタンパク質分解酵素処理を施す工程を備え、
該タンパク質分解酵素処理は、５０℃、ｐＨ７の条件で、１〜５時間実施されることを特徴とする酵素処理ローヤルゼリーの製造方法。
【請求項２】
前記タンパク質分解酵素処理は、２〜５時間実施されることを特徴とする請求項１に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法。
【請求項３】
前記タンパク質分解酵素処理は、４時間実施されることを特徴とする請求項１に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法。
【請求項４】
前記タンパク質分解酵素処理は、前記ローヤルゼリー、前記エンド型中性プロテアーゼ及び水を含む反応液をインキュベートすることにより実施され、
前記反応液には、前記ローヤルゼリーの固形分が該反応液の重量に対して５〜１０％含有されていることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法。
【請求項５】
前記タンパク質分解酵素処理は、前記ローヤルゼリーの固形分１ｇあたり、１．４×１０３ユニット以上のタンパク質分解活性を有する前記エンド型中性プロテアーゼを用いて実施されることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法。
【請求項１】
アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを含む酵素処理ローヤルゼリーを製造する方法であって、
該方法は、ローヤルゼリーにバチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを用いたタンパク質分解酵素処理を施す工程を備え、
該タンパク質分解酵素処理は、５０℃、ｐＨ７の条件で、１〜５時間実施されることを特徴とする酵素処理ローヤルゼリーの製造方法。
【請求項２】
前記タンパク質分解酵素処理は、２〜５時間実施されることを特徴とする請求項１に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法。
【請求項３】
前記タンパク質分解酵素処理は、４時間実施されることを特徴とする請求項１に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法。
【請求項４】
前記タンパク質分解酵素処理は、前記ローヤルゼリー、前記エンド型中性プロテアーゼ及び水を含む反応液をインキュベートすることにより実施され、
前記反応液には、前記ローヤルゼリーの固形分が該反応液の重量に対して５〜１０％含有されていることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法。
【請求項５】
前記タンパク質分解酵素処理は、前記ローヤルゼリーの固形分１ｇあたり、１．４×１０３ユニット以上のタンパク質分解活性を有する前記エンド型中性プロテアーゼを用いて実施されることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の酵素処理ローヤルゼリーの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−７８（Ｐ２００７−７８Ａ）
【公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１８３８３５（Ｐ２００５−１８３８３５）
【出願日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５９１０４５４７１）アピ株式会社 (59)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５９１０４５４７１）アピ株式会社 (59)
【Ｆターム（参考）】
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